JP2006063033A

JP2006063033A - 細胞移動促進活性ポリペプチドを含有する組成物

Info

Publication number: JP2006063033A
Application number: JP2004248634A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Utani; 厚志宇谷; Kiyoshi Nomizu; 基義野水
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-08-27
Filing date: 2004-08-27
Publication date: 2006-03-09

Abstract

【課題】ラミニン５分子内に存在する生理学的活性を有する配列を含む細胞移動促進組成物、ひいては損傷部位機能向上および改善用医薬組成物を提供することが、本発明の課題である。
【解決手段】発明者等は、ラミニン５のα３鎖のＧ４ドメイン（ＬＧ４）内の配列：ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲまたはＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲＬＶＦＡＬＧによる、細胞移動を促進することによる、皮膚疾患の治療可能性その他の、損傷部位の機能向上および改善の可能性を見出し、前記配列を有するポリペプチドもしくはその誘導体またはその生理学上許容される塩類を含む、細胞移動促進組成物および組成物製品を開発した。（図６（下）は、ペプチドを添加した溶液(＋)と添加していない溶液(−）をマウスの皮膚に適用した後８日目の創傷面積の比較を、創傷作製時の面積を１００％として示す。）
【選択図】図６

Description

本発明は、細胞移動促進活性を有するポリペプチドを含有する組成物に関する。

皮膚表皮の機能の調節には、基底膜を介しての表皮−真皮間のコミュニケーションが重要であり、皮膚における表皮の増殖と分化は、基底膜と真皮によって調節されている。基底膜成分は、構造的機構のみならず、細胞の分化、増殖、アポトーシス、器官形成に、重要な役割を果たしている。ラミニンは、皮膚表皮、肺胞上皮、内外分泌腺、消化管上皮、血管内皮、神経、または筋肉細胞と、間質成分を境する網様構造物である基底膜の構成成分である。例えば、ラミニンは、上皮と、間質を境して上皮の発達をコントロールし、上皮の機能の発現に必須である。ラミニン５は、表皮と真皮の安定した結合を提供することにより、表皮の機能調節に寄与していることが知られている。ここで、細胞外マトリックスとして他にファイブロネクチン、コラーゲンなどが知られているが、これらは、ラミニンが関与する上皮-間質の関係とは無関係に存在する分子である。

ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖の種々の組み合わせより成り、現在のところ１５種類が知られている。α鎖(約４００kDa)とβ鎖、γ鎖(約２００kDa)が長鎖(Long arm)と呼ばれる部位でコイル状３本鎖構造を形成し、巨大なラミニン分子(約８００kDa)を構成している。ラミニン５(α３β３γ２)は、皮膚、消化器、腎臓、肺などの上皮組織の基底膜に多量に存在する。ラミニンを欠損する遺伝子疾患(Herlitz junctional epidermolysis bullosa)では、全身の表皮が剥離する致死性の症状を示すことが知られている。ラミニン５は他の細胞外マトリックス分子と比べ、強度に細胞を接着させ（細胞接着活性が高い）、細胞運動を強く促進する(細胞運動活性が高い)ことが明らかになっている。（非特許文献１）

ラミニンは、創傷端において表皮細胞により発現誘導される。未だプロセシングを受けていないラミニン５分子の蓄積が創傷領域にのみ観察されるが、これは、成熟した無傷の皮膚では認められない。表皮細胞の移動が始まると、表皮細胞の先導による創傷の暫定的な基底膜に、プロセシングを受けていないラミニン５分子が現れる。そして、ラミニンα３鎖のＣ末端が切断されることにより、細胞の移動が止むというシステムが考えられる。プロセシングを受けていないラミニン５のＬＧ４−５モジュールが、創傷治癒中の細胞移動に重要な役割を果たし得る可能性が高い。（非特許文献２）

発明者により、ラミニンα３ＬＧ４モジュール内の特定の配列が細胞接着の原因であること、シンデガン−２および−４がこの活性を媒介すること、ラミニンα３ＬＧ４モジュールが、表皮細胞にマトリックスメタロプロテイナーゼ−１(ＭＭＰ-１)の発現を誘導することにより、組織の再構築に重要な役割を果たし得ることが予想され、また、当該特定配列が同定されている(非特許文献２および３)。
「細胞接着分子ラミニン５の機能解析と応用」、http://www.yokohama-cu.ac.jp/sangaku/seminar3/summary_miyazaki.pdf The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, No. 31, Issue of August 3, pp. 28779-28788, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 278, No. 36, Issue of September 5, pp. 34483-34490, 2003

前記のごとく、未だプロセシングを受けていないラミニン５分子が細胞移動において重要な役割を果たし得、例えば皮膚疾患（特に創傷治癒）等における等、損傷部位の機能の向上および改善に有用たり得ることは予想し得るが、未だプロセシングを受けていないラミニン５分子は巨大分子であるため、生理学的に許容される担体等との混合が容易でなく、ラミニン５分子を含有する組成物製品はこれまで作製されていない。また、ラミニン５分子のプロセシングにより生ずるラミニン５の一部のドメインが細胞移動促進活性を有することは、これまで全く予想されておらず、ラミニン５の部分を含有する組成物製品も、これまで作製されていない。プロセシングを受けていないラミニン５分子と同等の生理学的活性を有するラミニン５の部分を含む細胞移動促進組成物および組成物製品を提供することが、本発明の課題である。

ラミニン５分子のα３鎖のＬＧ４-５ドメインが、創傷治癒の場で表皮細胞が移動する先端部にのみ発現しているのは、既知である。発明者らは、ラミニン５のα３鎖のＧ４ドメイン（ＬＧ４）内の配列：ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲＬＶＦＡＬＧを有するポリペプチドが細胞移動促進活性を有することを、今回初めて見出した。加えて、当該ペプチドの内の左端のＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲは、シンデカン受容体に認識されることによりその活性を現すことにより、さらにシンデカン結合には、右端から３番目のＫと右端のＲが必須であることを確認した。当該配列右端のＬＶＦＡＬＧは、水溶性を高めるのに必要であることを確認した。さらに、当該発明者は、ラミニン５分子の部分たる上記配列による、細胞移動を促進することによる、皮膚疾患の治療可能性その他の、損傷部位の機能向上および改善の可能性を見出した。発明者は、前記配列を有するポリペプチドもしくはその誘導体またはその生理学上許容される塩類を含む、細胞移動促進組成物および組成物製品を開発した。

即ち、本発明は、ラミニンのＬＧ４モジュール中のアミノ酸配列：ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲまたはその配列を含むより長いＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲＬＶＦＡＬＧペプチドに関し、当該ポリペプチドもしくはその誘導体またはその生理学上許容される塩類を含む細胞移動促進組成物または組成物製品、皮膚疾患の治療を含む損傷部位の機能向上および改善のための当該組成物および組成物製品に関する。

本発明に係る配列は、ラミニン５のＬＧ４モジュール中の細胞接着に必須の箇所であり、シンデガン依存性細胞接着活性を保持している。驚くべきことに、以下の実施例に示すように、当該配列を有するポリペプチドは細胞移動促進活性を有する。当該ポリペプチドは、従来細胞移動促進効果を有することが公知であったプロセシングを受けたラミニン５分子そのもの(約8000アミノ酸)よりも鎖が圧倒的に短く（分子量が小さく）、操作(使用、製造等)が容易で、優れた安定性および保存性を有し得る。また、前記の両端のアミノ酸（右端ＬＶＦＡＬＧ配列）により、優れた水溶性を有し得る。かかる本発明のポリペプチドもしくはその誘導体またはその生理学上許容される塩類を用いて、細胞移動を促進することによる、皮膚疾患の治療を含む損傷部位の機能向上および改善に有効な、産業上極めて有用な組成物および組成物製品が提供される。

本発明のポリペプチドは、ペプチド合成の常套手段により作製することができる。そのようなペプチド合成の手段は、任意の公知の方法に従えばよい。本発明のポリペプチドの作製は、液相合成法、固相合成法のいずれによってもよいが、本発明においては、固相合成法、特にFmoc合成固相合成法を用いる。
詳細には、Fmocで末端のアミノ基が保護されているリンクアミド樹脂上で、末端のアミノ基が保護されているFmoc-アミノ酸を以下のように、１つずつ縮合していく。具体的には、まず、リンクアミド樹脂を２０％ピペリジンDMF溶液で処理し、Fmocを外した後、Fmocアミノ酸をHOBt入りＤＭＦに溶かし、DICと反応させて、活性化させる。アミノ末端を遊離形態とした樹脂と混ぜ、縮合させる。Fmocアミノ酸を２０％ピペリジンDMF溶液で処理し、Fmocを外す。以上の操作を２〜４回繰り返した後、TFAで脱保護し、ポリペプチドを樹脂から分離し、スカベンジャーを用いて副生成物のトラップや酸化を防ぎつつ、各アミノ酸の側鎖保護基を外す。ジエチルエーテルで沈殿および洗浄する。適当な溶媒（酢酸等）に溶解し、HPLCにて精製後、凍結乾燥する。

保護アミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる。Fmocアミノ酸は、反応の促進、アミノ酸の安定化、ラセミ体の抑制のために、N-ヒドロキシルベンゾトリアゾール(HOBt)入りのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解して用いる。保護基の除去(脱離)方法としては、例えば、Pd炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、酸処理などが挙げられる。

本発明のポリペプチドの誘導体は、ペプチド誘導体の作製のための常套法により作製することができる。即ち、本発明のポリペプチドは、キトサンの誘導体として得てもよい。

本発明のポリペプチドの生理学上許容される塩類は、公知の方法により、金属塩(例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩など）、塩基または塩基性化合物との塩(例えば、アンモニウム塩、アルギニン塩など)、酸付加塩、特に生理学上許容される酸付加塩として得ることができる。当該塩類には、例えば、無機酸(例えば、塩酸、硫酸、リン酸)あるいは有機酸(例えば、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、蓚酸、メタンスルホン酸)などの塩が挙げられる。

本発明のポリペプチドもしくはその誘導体またはその生理学上許容される塩類は、哺乳動物(例えば、ラット、ヒト、イヌ、ネコなど)において、細胞移動促進剤として、または皮膚疾患治療用を含む損傷部位の機能向上および改善用組成物として、例えば医薬的もしくは化粧用に使用することができる。

本発明のポリペプチドもしくはその誘導体またはその生理学上許容される塩類を医薬的に用いる場合には、ポリペプチドを有効成分として配合する以外には、通常の医薬品と同様にして、投与形態は特に限定されず、必要に応じて一般的な医薬製剤の形態を適宜選択して使用される。経口剤の投与形態の具体例としては、錠剤、丸剤、散財、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤があげられる。非経口剤の投与形態の具体例としては、注射剤、坐剤、膣坐剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤、含嗽剤、トローチ（舌下錠）剤、経口スプレー、懸濁液、歯科用ゲルなどがあげられる。外用剤の投与形態の具体例としては、軟膏、クリーム、ローション（液剤）、ゲル剤、パック剤、パップ剤、パスタ剤、などの貼布剤、湿布剤、エアゾール（噴霧）剤、泡状エアゾール（噴霧）剤、粉末剤、リンス液、フィルム形態などがあげられる。

本発明の細胞移動促進剤は、将来の使用のために貯蔵するか、または有効な量において医薬的に許容し得る担体中で処方して広範囲な種々の医薬組成物を製造することができる。本明細書で使用するときの「担体」なる用語は、含有させた活性成分と反応しないあるいは活性成分の有効性を低下させない１種以上の無毒の賦形剤の許容し得るベヒクルを意味する。

医薬的に許容し得る担体の例は、経口的(経口剤)、非経口的（非経口剤）または外用的（外用剤）に用いられる医薬的に許容し得る担体であり、医薬器具および摂取可能なベヒクルもこれに含まれる。非経口的とは、体腔に用いるものであり、外用的とは皮膚または粘膜に用いるものである。医薬器具の例は、縫合せ糸、ステープル、ガーゼ、包帯、火傷包帯、人工皮膚、リポソームまたはミセル処方、マイクロカプセル、ガーゼ包帯を浸漬するための親水性基剤などおよびこれらの組み合わせなどである。摂取可能な組成物は、摂取可能なまたは部分的に摂取可能な担体、例えば菓子増量剤、例えばロゼンジ、錠剤、タフィー、ヌガー、懸濁液、かみケーキおよびチューインガムを使用できる。本発明の一形態においては、本発明の細胞移動促進組成物を、例えば縫合せ糸、ステープル、ガーゼ、包帯、火傷包帯、人工皮膚、リポソームまたはミセル処方、マイクロカプセル、ガーゼ包帯を浸漬するための親水性基剤などおよびこれらの組み合わせの形態の医薬器具中に塗布、貼布あるいは混入することができる。

経口剤として用いる場合には、この分野で従来公知の各種賦形剤、希釈剤、カプセル剤、シロップ剤などを適宜使用して、常法に従って製造される。賦形剤の具体例としては、ゼラチン、澱粉、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、アラビアゴムなどの製剤学的賦形剤と混合して製造される。カプセル剤は、ポリペプチドの活性に影響を与えない製剤充填剤もしくは希釈剤と混合し、硬質ゼラチンカプセル、軟質ゼラチンカプセルなどに充填して製造される。経口用液剤のシロップ剤は、ポリペプチドを蔗糖などの甘味料、パラオキシ安息香酸メチルなどの防腐剤、着色剤、調味料などと混合して製造される。前記経口剤は、ポリペプチドの活性に影響を与えない条件であれば、必要に応じて各種ビタミン剤、スクロースなどのエネルギー源としての炭水化物、カゼインなどのタンパク源、メチオニンなどのアミノ酸、食塩などの電解質、各種薬効剤などを配合することができる。また、その安定性の観点から、使用直前にポリペプチドの凍結乾燥粉末に適当な担体を加えて前記段落(００１５)に記載の形態として調製することもできる。

非経口剤として用いる場合には、ポリペプチドを液状担体、例えば、水または食塩水に溶解して製造される。透明度、安定性、非経口剤使用の適応性を有する目的で、ポリエチレングリコールなどの溶剤、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどの潤滑剤、ビタミン剤、局所麻酔剤、各種薬効剤、食塩などの電解質などを配合することができる。さらに必要に応じて、ベンジルアルコール、フェノールなどの殺菌・防かび剤、安定剤、緩衝剤などの添加剤を配合することができる。また、その安定性の観点から、使用直前にポリペプチドの凍結乾燥粉末に適当な担体を加えて前記段落(００１５)に記載の形態として調製することもできる。

外用剤として用いる場合には、この分野で従来公知の親油性基剤、親水性基剤または親油性および親水性両方の性質を持っている基剤を広く使用して、常法に従って行えばよい。親油性基剤の具体例としては、白色ワセリン、流動パラフィン、スクワランなどの炭化水素油、オリーブ油、ゴマ油、牛脂、豚脂などの油脂類、イソプロピルミリステート、イソオクタン酸セチル、セチルアルコール、ステアリルアルコール、サラシミツロウ、鯨ロウなどの高級脂肪酸エステル、高級脂肪族長鎖アルコールおよびワックス類、オレイン酸、ステアリン酸などの高級脂肪酸、親油型モノグリセリン、トリオクタン酸グリセリンなどの炭素数１２〜２０の飽和または不飽和脂肪酸のモノ、ジ、トリグリセリドおよびこれらの混合物などがあげられる。親水性基剤としては、グリセリン、ソルビトール、エリスリトール、アルチトール、キシリトール、蔗糖、オリゴ糖、ポリエチレングリコールなどの多価アルコール類、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウムなどの増粘剤（ガム質および高分子）、ヒアルロン酸およびその塩、水などがあげられる。親油性および親水性両方の性質を持っている基剤としては、炭素数１２〜２０の飽和または不飽和脂肪酸のモノ、ジ、トリ、テトラ、ペンタ、ヘキサなどのエステル、蔗糖脂肪酸エステル、高級脂肪酸グリセリンエステルなどの多価アルコール脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびこれらの混合物が挙げられる。前記外用剤には、必要に応じて創傷治癒剤、抗炎症剤、局所麻酔剤、ビタミン剤、ホルモン剤、アミノ酸などの薬効剤、動・植物抽出剤、通常添加される添加剤、例えば、安定剤、防腐剤、殺菌剤、保湿剤、香料、着色料、酸化防止剤、金属封鎖剤、界面活性剤などを配合することができる。

本発明のポリペプチドを化粧品的に用いる場合には、ポリペプチドを有効成分として配合する以外は、通常の化粧品と同様にして、各種の形態で調製される。投与形態は特に限定されず、必要に応じて一般的な化粧品の形態を適宜選択して使用される。例えば、クリーム、乳液、化粧水などの形態とすることができ、それぞれ常法に従って製造される。化粧品に用いる場合には、本発明の効果を損なわない範囲で、化粧品の分野で公知の親油性基剤、親水性基剤または親油性および親水性両方の性質を持っている基剤を広く使用できる。親油性基剤の具体例としては、白色ワセリン、流動パラフィン、スクワランなどの炭化水素油、オリーブ油、ゴマ油、牛脂、豚脂などの油脂類、イソプロピルミリステート、イソオクタン酸セチル、セチルアルコール、ステアリルアルコール、サラシミツロウ、鯨ロウなどの高級脂肪酸エステル、高級脂肪族長鎖アルコールおよびワックス類、オレイン酸、ステアリン酸などの高級脂肪酸、親油型モノグリセリン、トリオクタン酸グリセリンなどの炭素数１２〜２０の飽和または不飽和脂肪酸のモノ、ジ、トリグリセライドおよびこれらの混合物などがあげられる。親水性基剤としては、グリセリン、ソルビトール、エリスリトール、アルチトール、キシリトール、蔗糖、オリゴ糖、ポリエチレングリコールなどの多価アルコール類、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウムなどの増粘剤、ヒアルロン酸およびその塩、水などがあげられる。親油性および親水性両方の性質を持っている基剤としては、炭素数１２〜２０の飽和または不飽和脂肪酸のモノ、ジ、トリ、テトラ、ペンタ、ヘキサなどのエステル、蔗糖脂肪酸エステル、高級脂肪酸グリセリンエステルなどの多価アルコール脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびこれらの混合物が挙げられる。上記の化粧品には、必要に応じて抗炎症剤、創傷治癒剤、ビタミン剤、アミノ酸などの薬効剤、動・植物抽出剤、通常添加される添加剤、例えば、安定剤、防腐剤、殺菌剤、保湿剤、香料、着色料、酸化防止剤、金属封鎖剤、増粘剤（ガム質および高分子）、界面活性剤などを配合することができる。

なお、担体基剤等は、上記例に特に限定されず、例えば、外用剤に適するものを他の形態の剤において適宜用いることは、もちろん可能である。

本発明のポリペプチド含有細胞移動促進組成物の適用量および適用方法は、該製剤の形態、製剤中のポリペプチド含有量、これを適用される患者の年齢、性別、その他の条件、皮膚病変の程度などに応じて決定することができ、例えば本外用剤を患部全体に行きわたる量で、１日に１回または複数回、患部に散布、塗布、貼布などの方法により適用することができる。

本発明の細胞移動促進組成物および組成物製品中の有効成分の含有量は、用いるポリペプチドまたはポリペプチド誘導体によって異なるが、１×１０^−９以上１００重量％以下、好ましくは１×１０^−７以上９９．５重量％以下、より好ましくは１×１０^−４以上９９重量％以下配合するのがよい。本発明の細胞移動促進組成物は、使用時に希釈して用いることができ、凍結乾燥粉末などの１００％純度のものを、生理食塩水などで希釈して、前記の濃度で使用することもできる。

本発明のポリペプチドもしくはその誘導体またはその生理学上許容される塩類を含む細胞移動促進組成物および組成物製品を使用することができるｐＨは、当該組成物の生理機能を発揮し得る範囲であれば特に限定されず、例えば、３以上、好ましくは４．０以上、より好ましくは４．５以上であり、９．０以下であり、好ましくは８．５以下であり、より好ましくは８．０以下であること望ましい。

本発明のポリペプチドもしくはその誘導体またはその生理学上許容される塩類は、損傷部位の機能向上および改善に用いることができ、例えば、糖尿病を始めとする血行障害による皮膚潰瘍、熱傷、外傷、褥瘡などによる難治性皮膚潰瘍、外力により皮膚、粘膜または消化器にできた開口や亀裂などの損傷（切り傷、擦り傷、刺し傷など）、十二指腸潰瘍、肝硬変、脊髄損傷の治癒（この場合は、カテーテル等の医療器具を用いて挿入して適用する）および角膜剥離などの眼科領域での創傷治癒（この場合は、点眼薬に配合して適用する）等に有効であるが、特に、糖尿病を始めとする血行障害による皮膚潰瘍、熱傷、外傷、褥瘡などによる難治性皮膚潰瘍に有効である。さらに、化粧品として適用し、ピーリングによって生じた皮膚の損傷回復促進、剃毛後の皮膚の損傷回復促進等を改善することができる。

さらに本発明の細胞移動促進組成物は、損傷部位の機能向上および改善が必要な動物にも適用できる。例えば、イヌ、ネコなどのペットや、ウシ、ウマなどの家畜、その他の皮膚の創傷面での治療にも、前記のヒトにおける医薬的、化粧品的適用形態に準じて使用できる。

実際の治療に用いる場合、本発明のポリペプチドもしくはその誘導体またはその生理学上許容される塩類を含む細胞移動促進組成物および組成物製品の投与量は、対象疾患、症状、投与対象、投与方法によって異なるが、例えば、成人の患者に対して、ポリペプチドの遊離体、誘導体またはその生理学上許容される塩類ともに、遊離体の量として、一般に、１日当たり０．１ng/cm²以上１mg/cm²以下の投与量範囲が適量である。例えば、軟膏にて投与する場合、通常薬効成分（ポリペプチド）1回量として０．０１ng/cm²以上１００μg/cm²以下程度、より好ましくは０．０１ng/cm²以上１μg/cm²以下程度を1日1回〜回程度投与するのが好都合である。本ポリペプチドもしくはその誘導体またはその生理学上許容される塩類は、特に、細菌や発熱物質が存在することのないよう、活性を失わない適切な方法、例えばエタノール、メタノールなどによる滅菌処理などの処理を追加して精製してもよい。なお、精製された本発明のポリペプチドもしくはその誘導体またはその生理学上許容される塩類に副作用はない。

本発明のポリペプチドは、細胞移動を促進することにより損傷部位の機能を向上および改善する効果を有する。当該ポリペプチドは、ラミニン５分子に比べて圧倒的に短い（従って、低分子量）が、明確な生理学的活性を保持し、そして生理学上許容される担体などの所望の他の基質および添加剤等との混合が容易である。総じて、本発明により、他の賦形剤との混合が容易である、安定性、保存性を高めることができるといった有利性の他、低分子量であることに依拠する作製される組成物の滑らかな皮膚塗布性および接着安定性が得られる。また、本発明のポリペプチドはラミニン５分子の活性のエッセンスと言える部分のみを含み、かつラミニン５分子に比べて、水への溶解性が圧倒的に高いことから(特に配列：ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲＬＶＦＡＬＧを有するもの)、賦形剤、増粘剤などの添加剤を配合した様々な形態の製剤中に高濃度の配合が可能であるといったさらなる有利性も得られ、産業上有用な組成物が提供される。

以下の実施例により、本発明をさらに詳細に記載するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

[実施例１]
本発明のポリペプチドを、以下の実施例に記載するように調製した。
１．本発明のポリペプチドの合成
全ペプチドは、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)を用いて固相法に基づきマニュアル通りに合成し、Ｃ−末端アミド形態にて調製した。アミノ酸誘導体および樹脂は、Novabiochem, La Jolla, CAより購入した。各アミノ酸は、4-(2',4'-ジメトキシフェニル-Fmoc-アミノメチル)-フェノキシまたはNovaSyn(登録商標)TGR樹脂(Novabiochem)を用いて、マニュアル通りに段階を追って縮合させた。ジメチルホルムアミド(DMF)を合成中溶媒として用いた。縮合のためには、ジイソプロピルカルボジイミド/N-ヒドロキシベンゾトリアゾールを用い、Na-Fmoc基の脱保護のためには、２０%ピペリジンDMF溶液を用いた。以下の側鎖保護基を用いた: Asn、Gln、およびHis、トリチル; Asp、Glu、Ser、Thr、およびTyr、t-ブチル; Arg、2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル; およびLys、t-ブトキシカルボニル。生じた保護されたペプチド樹脂を脱保護し、トリフルオロ酢酸(TFA)-チオアニソール-m-クレゾール-エタンジチオール-H2(80:5:5:5:5、v/v)を２０℃にて３時間用いて樹脂から分離した。粗ペプチドをエチルエーテルにて沈殿および洗浄し、mightysil RP-18カラム(Kanto Chemical Co., Inc, Tokyo, Japan)および０．１% TFAを含んでいる水/アセトニトリルの勾配を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により精製した。ペプチドの精製および同定は、分析HPLCおよび高速原子衝撃マススペクトロメーター(GC-MS & NMR Laboratory, Gfaduate School of Agriculture, Hokkaido Univeersity)により確認した。本発明の、アミノ酸配列ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲを有するポリペプチド（非特許文献２のP28780のTable Iの「A3G75aR」と同じもの）およびアミノ酸配列ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲＬＶＦＡＬＧを有するポリペプチドを得た。(図１)。

[実施例２]
１．合成ポリペプチドの創傷治癒促進活性
作製した合成ラミニンポリペプチド(配列：ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲＬＶＦＡＬＧ)の創傷治癒促進活性を、以下のごとく、当該ポリペプチドの細胞遊走刺激効果を食動力学的追跡アッセイを用い、および、実際適用の例を示すことにより確認した。

（１）細胞遊走刺激効果の確認
ａ)材料
１．培養角化細胞
２．金コロイド
３．顕微鏡(CCDカメラ（Model VB-6010, KEYENCE CORPORATION, Osaka, Japan）付、遊走の判定のため)

ｂ)方法：細胞移動金コロイド食動力学的アッセイ
（ｉ）培養角化細胞の調製
ヒト角化細胞をClonetics, San Diego, CAから購入し、上皮細胞成長因子(EGF)およびウシ下垂体抽出物を添加した角化細胞−血清不含培地(SFM)(Invitrogen life technologies)中に維持した。角化細胞は、実施例において、第２〜第３継代にて用いた。
（ｉｉ）金コロイド被覆カバーグラスの調製
直径３５mmのカバーグラスを、５分間室温にて、１％の仔牛血清アルブミン（BSA)リン酸緩衝塩水（PBS)溶液に浸した。ついでカバーグラスを１００％エタノールに浸し、１分間ヘアードライアーですぐに乾燥した。それらを、ウェルごとに１枚、２４ウェルの組織培養プレートに入れた。金塩溶液（HAuCl₄・4H₂O (1.4 mM)、Na₂CO₃ (11.7 mM)）を５０mlのビーカー中で沸騰まで加熱した後、新鮮な０．１%ホルムアルデヒド(１．２ml)を撹はんしながらゆっくりと添加した。この混合液を、BSAコートしたカバーグラスを入れた２４ウェルのプレートに、ウェルあたり１mlにて迅速に添加した。プレートをカバーし、４５分間静置して、金塩粒子を定着させた。金塩溶液を除去した後、カバーグラスを１mlのPBSにて１回穏やかにすすぎ、使用まで４℃にて冷蔵庫にて保存した。

（ｉｉｉ）細胞移動の軌跡の測定
前記のごとく維持した細胞をトリプシン処理し、KC-SFM培地に再懸濁し、次いで細胞数を数えた。約３０００個の細胞をカバーグラスに載せ、カバーグラスに３０〜６０分間かけて接着させた。次いで、培地を本発明のポリペプチドを含んでいるKC-SFM培地および対照のＳ４ペプチドを含んでいるKC-SFM培地と取り替えた(ここで、本発明のポリペプチドを含んでいるKC-SFM培地濃度を、図４のごとく変化させた。）。細胞を、所定の期間移動させた。培地を除去し、細胞を１０％のホルムアルデヒドPBS溶液にて、１０分間固定した。

（ｉｖ）細胞遊走の判定
顕微鏡において５視野選択し、CCDカメラで写真撮影した。Adobe photo shopにて変換した後、NIH image1.6プログラムにて、細胞が移動した部分の面積をピクセルで表示した。
（ｖ）結果
本発明のポリペプチドにより、遊走が刺激された。（図２を参照されたい。）ペプチド(＋)において、黒く顆粒状に見えるところは金コロイド粒子で、細胞が動いた後はそこの金が細胞に貪食され、白く抜けて見えている。
図３は、弱拡大写真の白黒の反転させた図である。顕微鏡にて、５視野選んで、写真を撮影した。それをAdobe photo shopに変換した後、NIH imageにて、細胞が移動した部分の面積をピクセルで表示した（右）。

遊走は、ペプチドにより濃度依存性に刺激された。多すぎると、逆に遊走刺激効果は落ちていく（図４上）。
時間に関しては、遊走の程度は１２時間と２４時間では同じであり、１２時間までで効果がなくなると考えられる（図４下）。

[実施例３]
１．p38 MAPキナーゼ阻害剤 SB202190による細胞遊走刺激効果の阻害の確認
（ｉ）
前記[実施例２]（１）ｂ）(ｉｉｉ）において、細胞を、１５−６０分間、培地を置き換える前に、SB202190(３０μg/ml)で前もって処理した以外は、前記[実施例２]（１）ｂ）（ｉ）〜（ｉｖ）記載の細胞移動の軌跡の測定と同じ細胞移動軌跡測定を行った。ここで、SB202190は、P38MAPKの阻害剤である。
（ｉｉ）結果
遊走は、P38MARK阻害剤SB202190により完全に阻害された（図５）。

[実施例４]
１．創傷治癒促進効果の確認
本発明のポリペプチド(配列：ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲＬＶＦＡＬＧ)の創傷治癒促進効果を以下ごとく、ポリペプチドをマウスに実際適用することにより、確認した。

（１）
ａ）材料
８週のＣ５７ＢＬマウス（オス）
ｂ）方法
（ｉ）
マウスの背中の皮膚に直径６mmの全層性皮膚欠損創傷を作成し、そこへポリペプチド溶液（２μg/μl PBS溶液、１０μl）を直接滴下し、次いでテガダームにて被覆した。２日目、ポリペプチド溶液を再度滴下し、８日目に屠殺した。潰瘍部位を、メジャーと共に、デジタルカメラで撮り、画像データとする。NIH imageにて、潰瘍部位の大きさを定量化した。
（ｉｉ）結果
ポリペプチドの存在下では、創傷治癒が明らかに促進していた（図６を参照されたい。）

[実施例５]
１．創傷治癒促進効果の確認
本発明のポリペプチド(配列：ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲＬＶＦＡＬＧ)の創傷治癒促進効果を以下のごとく、ポリペプチドクリーム（Ａ）を実際に適用することにより、確認した。

ａ）材料
８週のICRマウス（オス）
ｂ）方法
（ｉ）ポリペプチドクリーム（Ａ）の製造方法
（１）ショ糖脂肪酸エステル２gを５０mLのビーカーに秤取し、８０〜８５℃に加温しながら、８５℃に加温した水を少量ずつ加え、均一相となるように混合した後、室温まで攪拌しながら冷却した。得られたペースト状の製剤に精製水を加え、全量１０gとした後、更に、均一相となるように十分攪拌し、クリーム基剤を得た。（２）ポリペプチド１mgを１．５mLのチューブに秤取し、これに滅菌精製水を加え、全量１gとした後、均一に撹拌し、溶解した。（３）前記（１）で得られたクリーム基剤５０mgと（２）で得られたポリペプチ水溶液５０mgを均一相となるように十分混和し、ポリペプチドクリーム（Ａ）を得た。

（ｉｉ）マウスの背中の皮膚に直径１cmの全層性皮膚欠損創傷を作成し、そこへポリペプチドクリーム（Ａ）５０μg（ポリペプチドとして２５μg、約３２μg/cm²相当量）を塗布し、次いでデカダームにて被覆し、７日目に屠殺した。コントロールとして、スクランブルポリペプチド（アミノ酸の配列順序が異なる）を含有するクリームを塗布した群を設けた。塗布後に潰瘍部位をメジャーで測定し、コントロール群と比較した。

（ｉｉｉ）結果
ポリペプチドクリーム（Ａ）塗布前の潰瘍部位の大きさを１００％とした場合、軟膏塗布７日後では、コントロール群では、３０％であったのに対して、ポリペプチドクリーム（Ａ）塗布群では、１％以下であった。すなわち、ポリペプチド軟膏（Ａ）塗布群では、コントロール群と比較して、創傷治癒が明らかに促進していた。

[実施例６]
１．創傷治癒促進効果の確認
本発明のポリペプチド（配列：ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲ)の創傷治癒促進効果を以下のごとく、ポリペプチド軟膏（Ａ）を実際に適用することにより、確認した。

ａ）材料
８週のICRマウス（オス）
ｂ）方法
（ｉ）ポリペプチド軟膏（Ａ）の製造方法
ポリペプチド１mgを白色ワセリンの一部と混和し、十分研和したのち、残余の白色ワセリンを練り合わせて全量１０gとし、全質均等としてポリペプチド軟膏（Ａ）を得た。

（ｉｉ）マウス（２匹）の背中の皮膚に直径１cmの全層性皮膚欠損創傷を作成し、そこへポリペプチド軟膏（Ａ）３０μg（ポリペプチドとして３μg、約４μg/cm²相当量）を塗布し、次いでデカダームにて被覆し、８日目に屠殺した。コントロールとして、スクランブルポリペプチドを含有する軟膏を塗布した群（２匹）を設けた。塗布後に潰瘍部位をメジャーで測定し、コントロール群と比較した。

（ｉｉｉ）結果
軟膏塗布前の潰瘍部位の大きさを１００％とした場合、軟膏塗布８日後では、コントロール群では、３０％と３５％であったのに対して、ポリペプチド軟膏（Ａ）塗布群では、１０％と１０％であった。すなわち、ポリペプチド軟膏（Ａ）塗布群では、コントロール群と比較して、創傷治癒が明らかに促進していた。

[実施例７]
１．創傷治癒促進効果の確認
本発明のポリペプチド(配列：ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲＬＶＦＡＬＧ)の創傷治癒促進効果を以下のごとく、ポリペプチドゲル（Ａ）を実際に適用することにより、確認した。

ａ）材料
８週のICRマウス（オス）
ｂ）方法
（ｉ）ポリペプチドゲル（Ａ）の製造方法
ポリペプチド０．１mg、滅菌蒸留水１５mLを加えて均一に溶解した液に、ヒアルロン酸ナトリウム１gを液面に散布し、２４時間放置後、残りの滅菌蒸留水を加え、全量２０gとし、全質均等としてポリペプチドゲル（Ａ）を得た。

（ｉｉ）マウス（２匹）の背中の皮膚に直径１０mmの全層性皮膚欠損創傷を作成し、そこへポリペプチドゲル（Ａ）５０μg（ポリペプチドとして０．２５μg、約０．３μg/cm²相当量）を塗布し、次いでデカダームにて被覆した。３日および５日後に同量のポリペプチドゲル（Ａ）を塗布し、８日目に屠殺した。コントロールとして、スクランブルポリペプチドを含有するゲルを塗布した群（２匹）を設けた。塗布後に潰瘍部位をメジャーで測定し、コントロール群と比較した。

（ｉｉｉ）結果
ゲル塗布前の潰瘍部位の大きさを１００％とした場合、ゲル塗布８日後の潰瘍部位の大きさは、コントロール群では、２匹共に２５％であったのに対して、ポリペプチドゲル（Ａ）塗布群では１％と０．５％であった。すなわち、ポリペプチドゲル（Ａ）塗布群では、コントロール群と比較して、創傷治癒が明らかに促進していた。

[実施例８]
１．創傷治癒促進効果の確認
本発明のポリペプチド(配列：ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲＬＶＦＡＬＧ)の創傷治癒促進効果を以下のごとく、ポリペプチドクリーム（Ｂ）を実際に適用することにより、確認した。

ａ）材料
８週のICRマウス（オス）
ｂ）方法
（ｉ）ポリペプチドクリーム（Ｂ）の製造方法
（１）精製水９gを５０mLのビーカーに秤取し、８５℃に加温した後、パラオキシ安息香酸メチル０．０２g、グリセリン２gを加え、８０〜８５℃に加温しながら均一に攪拌し、溶解した。（２）ショ糖脂肪酸エステル２gを１００mLのビーカーに秤取し、前記（１）の水溶液を加え、８０〜８５℃に加温しながら、均一相となるように攪拌した後、室温まで攪拌しながら冷却した。（３）前記（２）に精製水を加え、全量１０gとした後、均一相となるように十分攪拌し、クリーム基剤を得た。（４）ポリペプチド１mgを１．５mLのチューブに秤取し、これに滅菌精製水を加え、全量１gとした後、均一に撹拌し、溶解した。（５）前記（３）で得られたクリーム基剤４５０mgと（４）で得られたポリペプチ水溶液５０mgを均一相となるように十分混和し、ポリペプチドクリーム（Ｂ）を得た。

（ｉｉ）マウスの背中の皮膚に直径１０mmの全層性皮膚欠損創傷を作成し、そこへポリペプチドクリーム（Ａ）５０μg（ポリペプチドとして５μg、６μg/cm²相当量）を塗布し、次いでデカダームにて被覆した。３日目にポリペプチドクリーム（Ｂ）を同量塗布し、６日目に屠殺した。コントロールとして、スクランブルポリペプチドを含有するクリームを塗布した群を設けた。塗布後に潰瘍部位をメジャーで測定し、コントロール群と比較した。

（ｉｉｉ）結果
ポリペプチドクリーム（Ａ）塗布前の潰瘍部位の大きさを１００％とした場合、軟膏塗布８日後では、コントロール群では、２０％と２５％であったのに対して、ポリペプチドクリーム（Ｂ）塗布群では、２匹ともに１％以下であった。すなわち、ポリペプチド軟膏（Ｂ）塗布群では、コントロール群と比較して、創傷治癒が明らかに促進していた。

[実施例９]
１．創傷治癒促進効果の確認(比較例)
（ｉ）本発明のポリペプチド(配列：ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲＬＶＦＡＬＧ)の創傷治癒促進効果の従来品との比較を以下のごとく、ポリペプチドクリーム（Ｃ）とコラーゲン配合クリームを実際に適用することにより、確認した。
ａ）材料
８週のICRマウス（オス）

ｂ）方法
マウスの背中の皮膚に直径１cmの全層性皮膚欠損創傷を作成し、そこへポリペプチドクリーム（Ｃ）(ポリペプチド０．１mgを用いて、ポリペプチドクリームＡと同様の方法で製造した)５０μg（ポリペプチドとして２５μg、約３２μg/cm²相当量）を塗布し、次いでデカダームにて被覆した。７日目に屠殺した。コントロールとして、和光純薬工業株式会社製、コラーゲン溶液タイプＩをポリペプチドクリームＡと同じ基剤で、１０μg/mLに希釈した水溶液２５０μL（コラーゲンとして、２．５μg）を含有するクリームを塗布した群を設けた。塗布後に潰瘍部位をメジャーで測定し、コントロール群と比較した。

（ｉｉ）結果
ゲル塗布前の潰瘍部位の大きさを１００％とした場合、ゲル塗布７日後の潰瘍部位の大きさは、コントロール群では、２匹共に３５％であったのに対して、ポリペプチドゲル（Ａ）塗布群では１％と０．５％であった。すなわち、ポリペプチドゲル（Ａ）塗布群では、コントロール群と比較して、創傷治癒が明らかに促進していた。

[実施例１０]
１．創傷治癒促進効果が、皮膚における本発明のポリペプチドによる細胞遊走刺激効果によるものであることの確認
（ｉ）ポリペプチド溶液（２μg/μl PBS溶液、１０μl）にSB202190(３０μg/ml)を追加して、前記［実施例４］（１)ｂ）（ｉ）と同じ確認試験を行った。
（ｉｉ）結果
SB202190(３０μg/ml)の存在下では、創傷治癒促進効果が完全に阻害された（図７を参照されたい。）

本発明のポリペプチドの精製結果を示すHPCL図である。本発明のポリペプチドの遊走刺激効果を示す顕微鏡画像である。遊走刺激後、弱拡大にて写真を撮り、白黒反転したもの（左）およびNIH imageにより、細胞が移動した部分の面積を計算し、値を平均±S.D.表示してある。本発明のポリペプチドの遊走刺激効果のポリペプチド濃度（上）および時間との関係を示す図（下）である。データは、平均±S.D.で表示してある。遊走が、P38MARK阻害剤SB202190により完全に阻害されたことを示す図である。本発明のポリペプチドによる細胞の移動度を１００％として表示してある。ポリペプチドをマウスに実際に適用した場合の、本発明のポリペプチドの創傷治癒効果を示す、デジタルカメラの写真（上）および創傷治癒効果を創傷作製時の面積を１００％として、８日目の大きさを平均±S.D.で表している比較図（下）である。創傷治癒促進効果が、皮膚における本発明のポリペプチドによる細胞遊走刺激効果によるものであることを示す。SB202190(３０μg/ml)の存在下では、創傷治癒促進効果が完全に阻害された。

Claims

アミノ酸配列：ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲ
を有するポリペプチドもしくはその誘導体またはその生理学的に許容される塩類を含む、細胞移動促進組成物。
アミノ酸配列：ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲＬＶＦＡＬＧ
を有するポリペプチドもしくはその誘導体またはその生理学的に許容される塩類を含む、細胞移動促進組成物。
請求項１または２記載の細胞移動促進組成物および担体を含む、損傷部位機能向上および改善用組成物。
含まれるポリペプチドもしくはその誘導体またはその薬理学上許容される塩類の量が、ポリペプチドに換算して１×１０^−９重量％以上１００重量％以下である、前記請求項いずれか１項記載の組成物。
担体が、蔗糖、蔗糖脂肪酸エステルおよびヒアルロン酸である、請求項３または４いずれかに記載の組成物。
３．０以上９．０以下のｐＨ条件下で使用可能であることをさらに特徴とする、前記請求項いずれか１項記載の組成物。
１日当たり０．１ng/cm²以上１mg/cm²以下の投与量にて外用投与される、前記請求項いずれか１項記載の組成物。