CN111297898A - 间充质干细胞来源的细胞外囊泡在脑缺血再灌注损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供间充质干细胞来源的细胞外囊泡在脑缺血再灌注损伤中的应用。本发明研究发现并证实源自间充质干细胞的细胞外囊泡(MSCs‑EVs)可通过脑卒中后的神经发生和血管生成来治疗脑功能障碍和神经保护作用。研究结果表明，MSCs‑EVs可以显著减轻大鼠MCAO后24h和48h的神经功能缺损，减少脑梗死的体积和脑含水量，改善大脑组织皮层的病理损伤以及减弱皮层神经元凋亡并显著上调了p‑AMPK，而下调了p‑JAK2，p‑STAT3和p‑NF‑κB。本发明为将MSCs‑EVs用作MCAO治疗的潜在治疗策略提供必要支持。

Description

间充质干细胞来源的细胞外囊泡在脑缺血再灌注损伤中的 应用

技术领域

本发明属于生药医药技术领域，具体涉及间充质干细胞来源的细胞外囊泡在脑缺血再灌注损伤中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

脑血管疾病是世界上第三大死亡原因，也是中国居民最主要的死亡原因之一。其患病率和死亡率逐年上升，给社会和经济带来沉重的负担。缺血性脑卒中占所有脑卒中的75-80％，发病率明显高于出血性脑卒中。缺血性脑卒中的病理类型和发病机理复杂，主要包括细胞凋亡、炎性介质的释放、炎性细胞的浸润、血脑屏障的破坏、炎症因子的分泌和黏附分子的上调。研究表明，脑缺血后细胞凋亡是继发性脑损伤的原因之一，在脑缺血再灌注损伤(CIRI)中起重要作用。尽管缺血性脑卒中后血管内机械取栓或溶栓的时间窗已不同程度的延长，但因手术导致的出血性不良事件仍是困扰临床医师的主要问题。由于缺血性脑卒中的病理生理过程的复杂性，目前尚无彻底有效的治疗方法。因此，探索并发现与CIRI相关的分子机制对于脑缺血后的早期干预具有重要的临床应用价值。

细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是一种直径30-150nm的膜性囊泡，可由细胞分泌并介导细胞间的信息传递。由于其循环稳定性和低于干细胞的免疫原性，EVs在生物治疗领域具有巨大潜力。由间充质干细胞(MSCs)分泌的EVs称为MSCs-EVs，在心肌梗死，肝纤维化，伤口愈合，阿尔茨海默氏症和脊髓损伤等中均显示出明显的治疗或保护作用。同样，研究证明，MSCs-EVs对脑缺血-再灌注损伤的大鼠具有神经保护作用。

腺苷-5'-单磷酸(AMP)依赖的蛋白激酶(AMPK)，作为一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，经常被称为“代谢主开关”。当细胞能量供应减少时，可以激活AMPK以增加能量产生。激活AMPK可以通过减少能量消耗和增加能量利用来维持细胞代谢稳态，从而促进脑卒中后神经和损伤的修复。

凋亡是导致缺血性脑卒中不良预后的主要因素，这其中涉及到几个重要的信号通路。而酪氨酸蛋白激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)信号传导途径家族是大多数细胞因子发挥其生物学功能的重要途径，通常在大脑中广泛表达并在神经细胞凋亡中发挥重要作用。在JAK/STAT家族中，JAK2/STAT3途径是最保守的且与中枢神经系统氧化应激的病理生理密切相关。现已发现JAK2/STAT3信号通路对创伤性脑损伤的神经功能预后和脑缺血有重要影响。此外，核因子-κB(NF-κB)作为典型的促炎信号转导途径，它是炎症介质诱导的关键转录因子，通过靶向该途径减少炎症细胞的浸润和凋亡。然而，发明人发现，在缺血-再灌注模型中，MSCs-EVs通过AMPK和JAK2/STAT3/NF-κB信号通路发挥神经保护作用的机制尚不完全清楚。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供充质干细胞来源的细胞外囊泡在脑缺血再灌注损伤中的应用。同时本发明还研究了由MSCs-EVs介导的AMPK与JAK2/STAT3/NF-κB信号之间的关系。本发明证明MSCs-EVs具有神经保护作用，可减轻脑缺血-再灌注导致的神经功能损伤，因此具有重要的临床应用价值。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供MSCs-EVs在制备预防/或治疗脑缺血再灌注损伤产品中的应用。

其中，所述MSCs-EVs为间充质干细胞来源的细胞外囊泡；

所述细胞外囊泡直径为30-150nm；

更进一步的，所述MSCs-EVs为骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡。

根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗脑缺血再灌注损伤相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

本发明的第二个方面，提供一种产品，所述产品活性成分包括MSCs-EVs；所述产品具有预防/或治疗脑缺血再灌注损伤的作用，更具体的，其具有如下任意一种或多种用途：

(a)减轻大脑中动脉梗塞导致的神经功能缺损；

(b)减轻大脑中动脉梗塞导致的脑水含量增加；

(c)减少大脑中动脉梗塞导致的脑梗死面积；

(d)促进p-AMPK的上调表达；

(e)抑制p-JAK2，p-STAT3和p-NF-κB的上调表达；

(f)减轻大脑中动脉梗塞导致的病理损伤；

(g)减少大脑中动脉梗塞导致的细胞凋亡；

(h)促进血管的生长和修复；

(i)刺激神经细胞的生长、修复和再生。

所述MSCs-EVs为骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡。

需要说明的是，所述药物可以是任何适宜的剂型，如悬浮剂、乳化剂等。

本发明的第三个方面，提供MSCs-EVs在如下任意一种或多种产品中的应用：

(1)p-AMPK促进剂；

(2)p-JAK2抑制剂；

(3)p-STAT3抑制剂；

(4)p-NF-κB抑制剂。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

研究发现并证实MSCs-EVs对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用。具体的，利用大脑中动脉梗塞(MCAO)模型进行研究表明，MSCs-EVs的保护机制可通过AMPK和JAK2/STAT3/NF-κB信号通路来调节。具体的，MSCs-EVs减少脑组织中神经细胞的凋亡，减轻了大脑中动脉梗塞诱导的大鼠组织损伤，同时还具有减轻神经功能缺损、脑水含量增加等症状。

上述技术方案为MSCs-EVs开辟了新的药物用途，也为开发高效的防治脑缺血再灌注损伤相关药物奠定实验基础并提供新的视野。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中MSCs-EVs的特性相关图。(A)使用蛋白质印迹法分析EVs表面特异性标志物(TSG101和CD9)的表达。(B)通过透射电子显微镜观察MSCs-EVs的形态(比例尺＝100nm)。(C)通过使用NanoSight分析了MSCs-EVs的大小。

图2为本发明实施例中在MCAO后24h和48h大鼠神经功能缺损评分和脑水含量相关图。(A)MCAO和Sham组在MCAO后24h和48h的神经功能评分。(B)在24h和48h，MCAO和Sham组中大鼠脑的脑水含量。数据表示为平均值±SD(n＝3)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，根据ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较。

图3为本发明实施例中MSCs-EVs对MCAO后的脑梗死的影响相关图。(A)MCAO后24h和48h代表性的大鼠TTC染色冠状切片。(B)脑梗死体积的定量分析。数据表示为平均值±SD(n＝3)。根据ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较，***p<0.001。

图4为本发明实施例中MSCs-EVs对MCAO后神经元病理变化的影响相关图。(A)MCAO损伤后梗死皮层中的代表性HE，Nissl和TUNEL染色。(B)MSCs-EVs可显著降低MCAO后脑细胞的凋亡(比例尺＝50μm)。数据表示为平均值±SD(n＝3)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，根据ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较。

图5为本发明实施例中MSCs-EVs激活AMPK的磷酸化并下调JAK2/STAT3/NF-κB信号通路相关图。A和C分别为p-AMPK，AMPK，p-JAK2，JAK2，β-actin的Western blot分析和目标蛋白在脑组织匀浆中的相对表达图。B和D分别为p-STAT3，STAT3，p-NF-κB，NF-κB，β-actin的Western blot和目标蛋白在脑组织匀浆中的相对表达图。数据表示为平均值±SD(n＝3)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，根据ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较。

图6为本发明实施例中化合物C(CC)对MCAO后的脑梗塞的影响相关图。(A)MCAO后24h和48h代表性的大鼠TTC染色冠状切片。(B)脑梗死体积的定量分析。数据表示为平均值±SD(n＝3)。**p<0.01，***p<0.001，根据ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较。

图7为本发明实施例中化合物C(CC)对AMPK和p-AMPK表达的影响相关图。MCAO组术前无须预处理；MCAO+MSCs-EVs组(MCAO后10min内，通过尾静脉注射含有100μg MSCs-EVs的PBS悬液)；MCAO+MSCs-EVs+CC组(在MCAO手术前30min通过脑室内注射10μl CC，在MCAO之后10min内通过尾静脉注射含有100μg MSCs-EVs的PBS悬液)。每组治疗3只大鼠。(A)Westernblot分析表明，MSCs-EVs组的p-AMPK显著高于Sham组。CC可部分抵消这种差异。(B)脑梗死体积的定量分析。数据表示为平均值±SD(n＝3)。**p<0.05，***p<0.001，根据ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

如前所述，针对间充质干细胞中提取的细胞外囊泡对脑缺血再灌注损伤导致的生理病理性变化能否发挥作用及相关作用机制尚缺乏研究。

有鉴于此，本发明以大脑中动脉梗塞(MCAO)作为脑缺血再灌注损伤模型进行研究，发现了MSCs-EVs介导的AMPK与JAK2/STAT3/NF-κB信号之间的关系，为将来治疗MCAO提供一种更好的治疗思路。

本发明的一个典型实施方式中，提供MSCs-EVs在制备预防/或治疗脑缺血再灌注损伤产品中的应用。

其中，所述MSCs-EVs为间充质干细胞来源的细胞外囊泡；

本发明的又一具体实施方式中，所述MSCs-EVs为骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡。

本发明的又一具体实施方式中，所述细胞外囊泡直径为30-150nm。

根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗脑缺血再灌注损伤相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品活性成分包括MSCs-EVs；所述产品具有预防/或治疗大脑中动脉梗塞的作用，更具体的，其具有如下任意一种或多种用途：

(a)减轻大脑中动脉梗塞导致的神经功能缺损；

(b)减轻大脑中动脉梗塞导致的脑水含量增加；

(c)减少大脑中动脉梗塞梗死体积；

(d)促进p-AMPK的上调表达；

(e)抑制p-JAK2，p-STAT3和p-NF-κB的上调表达；

(f)减轻大脑中动脉梗塞导致的病理损伤；

(g)减少大脑中动脉梗塞导致的细胞凋亡；

(h)促进血管的生长和修复；

(i)刺激神经细胞的生长、修复和再生。

所述MSCs-EVs为骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡。

本发明的又一具体实施方式中，所述产品可以为药物。所述药物的活性成分包含MSCs-EVs；或者包含其它至少一种用于具有预防/或治疗大脑中动脉梗塞作用的物质；需要说明的是，MSCs-EVs不仅可以作为所述药物的活性成分，还可以作为其他药物活性成分的递送载体。因此任意一种含有MSCs-EVs的药物均在本发明的保护范围之内。

所述药物进一步还包含药学上可接受的载体。

本发明中，药学上可接受的载体在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

在本发明的又一具体实施方式中，药学上可接受的载体包括稀释剂和赋形剂。

在本发明的又一具体实施方式中，合适的药学上可接受的载体的实例包括但不限于：(1)Dulbecco磷酸缓冲盐溶液，pH约7.4，包含或不包含大约1mg/ml到25mg/ml人血清白蛋白；(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠)，和(3)5％(w/v)葡萄糖；也可以包含抗氧化剂例如色胺和稳定剂例如Tween20。

在本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可以是任何适宜的剂型。例如，悬浮剂、乳化剂等。本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

在本发明的又一具体实施方式中，提供MSCs-EVs在如下任意一种或多种产品中的应用：

(1)p-AMPK促进剂；

(2)p-JAK2抑制剂；

(3)p-STAT3抑制剂；

(4)p-NF-κB抑制剂。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

1.实验动物

选取体重280-320g的成年健康雄性SPF级SD大鼠用于本研究，实验动物购自济南朋悦实验动物繁育有限公司(许可号：SCXK(LU)2019-0003)。饲养于山东大学动物中心SPF级动物饲养房，温度(24±1℃)，湿度为45％-55％，以自然光/暗(≈12h-12h)循环。所有大鼠均可自由饮食和饮水。适应性喂食7天后开始实验。所有动物实验程序均按照中国护理和使用法的指导原则进行，并获得山东大学医学部动物伦理委员会的批准。

2.大鼠MCAO模型建立

通过改良的Longa方法用于建立大鼠MCAO(脑缺血-再灌注)模型。在手术前将大鼠禁食6h，以减少术中返流和误吸等并发症。然后，用异氟烷麻醉动物，并使用R500通用小型动物麻醉机(中国深圳瑞华德生命技术有限公司)控制异氟醚的使用剂量。将大鼠仰卧在手术台上，在颈部作一长约2cm的纵形手术切口。依次切开皮肤和筋膜，暴露下颌下腺，胸锁乳突肌和肩胛舌骨肌，然后用钩子钩住以固定。分离右颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，用迷你动脉夹临时夹闭ICA和CCA。然后将ECA在近端用5-0丝线结扎，并在距CCA分叉3.0mm处切断。后将ICA完全分离，并用显微镜用显微剪刀在距ECA近端动脉分叉3mm的动脉壁上切一口。从ECA破口处插入预先准备好的线栓(广州佳灵生物技术有限公司；产品型号：L3800)，调节线栓插入角度，使其与ICA成一直线，然后取下ICA上的动脉夹，顺着ICA向颅内插入线栓，直到术者感到阻力时可停止前进。此时，线栓的插入深度约为20mm(距CCA分叉处)。然后用5-0丝线打结并固定ECA。缺血2h后再次将大鼠麻醉，将线栓缓慢撤回至ECA主干内，恢复ICA血流开始再灌注。Sham组动物进行相同的手术操作，但未插入线栓。在再灌注后24h、48h后，获得脑组织样品用于后续研究。所有动物模型均由同一人完成以减少实验误差。手术后，将每只大鼠饲养在单笼中，自由进食和饮水。

3.实验设计

将大鼠随机分为八组：(1)Sham 24h组，(2)MCAO 24h组，(3)MCAO 24h+MSCs-EVs组，(4)抑制剂-治疗(化合物C，CC)组(MCAO 24h+MSCs-EVs+CC)，(5)Sham 48h组，(6)MCAO48h组，(7)MCAO 48h+MSCs-EVs组和(8)抑制剂治疗组(MCAO 48h+MSCs-EVs+CC)。MSCs-EVs组的每只大鼠在模型成功建立后10min内，通过尾静脉注射含有100μg MSCs-EVs的PBS悬液(0.5ml)。抑制剂组中每只大鼠在术前30min，通过立体定向技术缓慢地将CC(AMPK的特效抑制剂)注入其右侧侧脑室，以阻断AMPK的功能。而Sham组注射与对照相同体积的无菌PBS。实验至少重复3次。

具体方法为：将CC溶解到二甲亚砜(DMSO)中至0.1μM的浓度备用。将动物用异氟烷麻醉并固定在立体定位仪上。切开头皮暴露颅骨后，用25μl汉密尔顿微量注射器抽取10μl的CC溶液，然后将注射器固定在定位器上，标记动物前囟并以此为基准，标记颅骨钻孔点为前囟向后0.5mm，向右1.5mm，深度4.0mm，用电钻在此处钻一小孔，然后将微量注射器的针头移至此处，按预先设定好的数据进针注射，整个注射过程应保持缓慢、稳定，注射速度约为0.5μl/min。注射完毕后将针头滞留在脑内10min，以防止药液返流。然后缓慢拔出注射器，用骨蜡封闭颅骨小孔后逐层缝合组织。Sham组注射相同体积的无菌PBS作为对照。

4.神经功能评分

处死动物之前，在相应时间点，用改良的Longa评分法进行神经功能缺损评分，该评分等级为0-4。0分：正常，无神经功能缺损；1分：左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分：行走时，大鼠向左侧(瘫痪侧)转圈，中度神经功能缺损；3分：行走时，大鼠身体向左侧(瘫痪侧)倾倒。重度神经功能缺损；4分：不能自发行走，有意识丧失。本研究选择1-3分的动物进行实验。

5.脑水含量测定

在相应的时间点对动物实施安乐死后，将脑组织分为左右两半球。在精确度为0.01mg分析天平上分别称量左右两半球(湿重)。然后将两半球分别在105℃的烤箱中烘干24h，再次称量左右两半球(干重)。脑含水量的计算公式为：

脑含水量(％)＝[(干重-干重)/湿重]×100％。

6.2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色和脑梗死体积的测量

在相应的时间点用致死剂量水合氯醛麻醉处死大鼠。将鼠脑完整取出后置于-20℃冰箱冷冻20min，然后用刀片从前额自前往后将脑组织逐层切片，层厚约2mm，总共为6片。然后脑组织切片组浸入到提前预热的2.0％TTC溶液中，在避光的37℃的温箱中浸泡30min观察并拍照。正常的脑组织被染成红色，缺血梗死区脑组织为白色。在4％福尔马林中固定24h后，通过Image J软件分析得出脑梗死体积百分比。根据以下公式计算脑组织梗死体积的百分比:

脑梗死体积＝{[完整的对侧半球体积-(完整的同侧半球体积-梗塞体积)]/完整的对侧半球体积}×100％。

7.石蜡切片的制备和苏木精-伊红(HE)染色

在相应的时间点用水合氯醛深度麻醉大鼠。剪开胸部暴露胸腔，在右心耳处用小剪刀剪一小口，灌注针穿入左心室，打开灌注系统，开始向左心室内缓慢灌注PBS，直到流出的液体变为透明，然后灌注多聚甲醛溶液，直至动物四肢及尾巴僵硬后将整个脑组织完整取出后制作石蜡切片。将切片在60℃下烘烤1h，然后用二甲苯和梯度乙醇脱蜡。用苏木精染色并用10％盐酸分化后，在显微镜下观察脑组织的病理形态变化。

8.尼氏染色

将脑组织的石蜡切片在55℃下烘烤30min，然后用二甲苯脱蜡并浸入梯度乙醇中。将切片置于Nissl染色溶液中，然后浸入58℃水浴中40min，以在分化溶液中迅速分化。用乙醇(100％)脱水后，用二甲苯清洗切片，并在显微镜下观察并拍照。

9.TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)

进行TUNEL染色以检测细胞凋亡率。将石蜡切片在二甲苯中脱蜡10min，然后用3％H₂O₂处理并在0.1M柠檬酸钠中孵育。用TUNEL反应混合物处理后，将切片用DAB染色。在荧光显微镜下随机选择五个视野进行拍照、分析。用Image J软件分析阳性细胞的比例。细胞凋亡指数＝TUNEL阳性细胞/总细胞×100％。在五个区域中，凋亡指数的平均值代表每只大鼠的细胞凋亡指数。

10.间充质干细胞培养

取体重约80g的SPF级雄性SD大鼠用以提取间充质干细胞培养，将大鼠处死后，剪断双侧股骨及胫骨末端后用无菌PBS冲洗髓腔中的骨髓，将冲洗液收集后用70μm细胞过滤器过滤后离心。将沉淀物重悬于含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中，接种到细胞培养瓶中。72h后除去未贴壁的细胞并更换培养基。当细胞密度达到80-90％时，用胰蛋白酶消化并以1：3的比例传代培养。培养至第三代的MSC可用于下一步实验。以上所有操作均在超净台中进行。

11.MSCs-EVs的提取

当细胞密度达到80-90％时，用PBS洗涤培养瓶3次，更换无EVs的培养基(120,000×g离心2h)继续培养48h后，从培养基中提取MSCs-EVs。在4℃、200×g下离心10min；20000×g下离心20min后收集上清液，以除去培养基中的细胞器和细胞碎片，然后将上清液通过0.2μm过滤器过滤，并在4℃、100,000×g下离心75min，用PBS洗涤沉淀后在100,000×g再离心75min。将沉淀重悬于PBS中，然后保存在-80℃冰箱备用。以上所有步骤均在超净平台中进行。

12.MSCs-EVs的鉴定

利用透射电镜(日立H7700，东京，日本)鉴定MSCs-EVs的形态。将5μl MSCs-EVs悬液滴至载体铜网(220目)上，静置2min，滤纸吸干周围后在铜网上滴入8μl 1％的磷钨酸负染液，室温复染2min，铜网放置白炽灯下烤干约10min。利用透射电镜下观察并拍照。利用qNano仪器(Malvern，Malvern，英国)鉴定MSCs-EVs直径和含量，MSCs-EVs标记蛋白(CD9和TSG101)通过Western blot测定。

13.Western blot分析

收集右侧大脑的梗死组织用于总蛋白提取，并使用BCA试剂盒测量蛋白浓度。变性的蛋白质样品用5×上样缓冲液稀释。然后，加等量的蛋白质提取物，并使用丙烯酰胺梯度通过SDS-PAGE分离。电泳后，通过湿转移法将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。然后与以下稀释的一抗在4℃摇床上孵育过夜：β-actin(1：1000)，p-AMPK(1：1000)，AMPK(1：1000)，p-JAK2(1：500))，JAK2(1：500)，p-STAT3(1：1000)，STAT3(1：1000)，p-NF-κB(1：1000)，NF-κB(1：1000)，CD9(1：500)和TSG101(1：1000)。二抗选用抗兔或抗小鼠辣根过氧化物酶偶联的免疫球蛋白IgG(1：10000)，在室温下孵育1h。PVDF膜用TBST溶液洗涤3次，每次5min。通过增强的化学发光(ECL)试剂观察免疫反应带3–5min，采用ECL发光试剂显色，并经Image J凝胶像系统进行显影检测，分析目标条带及内参的灰度值，计算出目标蛋白与内参β-actin的比值，分析相对蛋白量。

14.量化和统计分析

数据分析采用SPSS软件(版本22，IBM，纽约，美国)。数据以均数±标准差表示。使用单向方差分析和Bonferroni检验对多个组进行事后比较。p＜0.05认为差异有统计学意义。

实验结果

MSCs-EVs的特性

MSCs-EVs的Western blot分析表明，EVs含有丰富的的特异性是标志物蛋白CD9和TSG101。钙联蛋白(Calnexin)作为一种内质网标记蛋白，在MSCs-EVs中很少出现(图1A)。TEM显示为杯状均匀球形囊泡状结构，直径在50-200nm范围内(图1B)。Nanosight分析表明，该颗粒的平均直径约为120nm，这与EVs的基本特征一致(图1C)。

MSC-EVs可明显减轻神经功能缺损和脑水含量

神经功能缺损评分和脑含水量如图2所示。MCAO组的神经功能缺损评分在24h和48h均低于Sham组(p<0.001)，而MSCs-EVs可减轻神经功能缺损(24h：p<0.05，48h：p<0.01，图2A)。与Sham组相比，脑梗塞后24h大鼠脑水含量明显增加(p<0.001)，而MSCs-EVs可降低脑水含量(p<0.01；图2B)。这些结果表明，MSCs-EVs在CIRI后发挥神经保护作用。

MSCs-EVs可减少MCAO后脑梗死体积

代表性的TTC染色结果显示，正常脑组织为红色，脑缺血梗死的脑组织为白色。图3A显示了典型的脑梗死体积TTC图像。与Sham组相比，梗塞后24h和48h的脑梗死体积明显增加(p<0.001)，与MCAO组相比，MSCs-EVs的干预可显著减少MCAO后24h和48h的脑梗塞体积(p<0.001,图3B)。这些结果表明，MSCs-EVs可减少MCAO大鼠中CIRI诱导的脑梗死的体积，并发挥神经保护作用。

MSCs-EVs可减轻MCAO引起的神经元病理损伤

HE和Nissl染色用于评估MCAO后神经元的病理变化。如图4A所示，Sham组的大脑皮层神经元显示出清晰的轮廓和均匀的细胞质着色，核位于细胞中心。而MCAO组，梗死区的神经元表现出不同程度的损害，其神经元萎缩、轮廓模糊、细胞质深染、细胞核与细胞质之间的边界不清晰、尼氏体的数量明显减少等改变。Sham组中凋亡细胞(TUNEL阳性细胞)数量很少，MCAO组细胞凋亡指数明显升高。在显微镜下，TUNEL阳性细胞显示：胞体萎缩，核固缩。实验结果表明，与Sham组相比，脑梗塞后24h和48h TUNEL阳性细胞数量明显增加(p<0.001)，而MSCs-EVs在脑梗塞后可显著减少TUNEL阳性细胞数量(p<0.001)。这些结果表明，MSCs-EVs可显著降低CIRI后大鼠的神经元病理损伤和细胞凋亡相对数量。

脑缺血后大鼠脑组织中AMPK，p-AMPK，JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3，NF-κB和p-NF-κB表达的变化

与sham组相比，MCAO组中病变皮层中p-AMPK的表达增加，而与MCAO组相比，MSCs-EVs组24h后p-AMPK的表达上调(p<0.001；图5A；图5C)。与Sham组相比，MCAO组24h后梗塞皮层中p-JAK2的表达水平升高(p<0.001)，而MSCs-EVs组24h后梗塞皮层中p-JAK2的表达显著降低(p<0.001；图5A；图5C)。与Sham组相比，MCAO后24h和48h皮层中p-STAT3的表达水平均增加(p<0.001)。与MCAO组相比，MSCs-EVs干预后48h显著降低了梗塞皮层中p-STAT3的表达(p<0.001；图5B；图5D)。与Sham组相比，MCAO后24h和48h梗塞皮层中p-NF-κB的表达水平升高(p<0.05)，与MCAO组相比，MSCs-EVs干预后48h可显著降低梗塞皮层p-NF-κB的表达量(p<0.01；图5B；图5D)。这些结果表明，MSCs-EVs可能通过上调AMPK介导的JAK2/STAT3/NF-κB信号通路来减轻神经病理学损伤并减少细胞相对凋亡数量。

AMPK信号通路阻滞剂(化合物C，CC)逆转了MSCs-EVs对MCAO诱导的脑损伤的神经保护作用

在图6A中显示MCAO损伤后具有代表性的TTC染色图像。与MCAO组相比，MSCs-EVs组在24h和48h可显著减少脑梗死的体积(p<0.001,图6B)。加用CC阻断AMPK信号通路后，TTC染色显示CC的使用部分逆转了MSCs-EVs的神经保护作用，具体表现为增加了脑梗死的体积。与MSCs-EVs组相比，使用CC后第48h的脑梗塞体积增加(p<0.01,图6B)。

化合物C对AMPK和p-AMPK表达的影响

如图7A所示，与MCAO组相比，在MCAO后24h(p<0.05)和48h(p<0.001)时，MSCs-EVs组病变皮层中p-AMPK的表达明显增加。与MSCs-EVs组相比，使用CC后48h，p-AMPK的表达量增加(p<0.001,图7B)。结果证实，MSCs-EVs可通过激活AMPK信号通路来减少脑缺血-再灌注后炎症因子的释放。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.MSCs-EVs在制备预防/或治疗脑缺血再灌注损伤产品中的应用；

其中，所述MSCs-EVs为间充质干细胞来源的细胞外囊泡。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述细胞外囊泡直径为30-150nm。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述MSCs-EVs为骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡。

4.一种产品，其特征在于，所述产品活性成分包括权利要求1-3任一项所述MSCs-Evs；所述产品用于预防/或治疗脑缺血再灌注损伤。

5.如权利要求4所述产品，其特征在于，所述产品具有如下任意一种或多种用途：

(a)减轻大脑中动脉梗塞导致的神经功能缺损；

(b)减轻大脑中动脉梗塞导致的脑水含量增加；

(c)减少大脑中动脉梗塞梗死体积；

(d)促进p-AMPK的上调表达；

(e)抑制p-JAK2，p-STAT3和p-NF-κB的上调表达；

(f)减轻大脑中动脉梗塞导致的病理损伤；

(g)减少大脑中动脉梗塞导致的细胞凋亡；

(h)促进血管的生长和修复；

(i)刺激神经细胞的生长、修复和再生。

6.如权利要求4或5所述产品，其特征在于，所述产品为药物。

7.如权利要求6所述产品，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的载体。

8.如权利要求7所述产品，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括稀释剂和赋形剂。

9.如权利要求6所述产品，其特征在于，所述产品剂型为悬浮剂或乳化剂。

10.MSCs-EVs在如下任意一种或多种产品中的应用：

(1)p-AMPK促进剂；

(2)p-JAK2抑制剂；

(3)p-STAT3抑制剂；

(4)p-NF-κB抑制剂。

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