CN108004206A - 一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法及外泌体的应用 - Google Patents

一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法及外泌体的应用 Download PDF

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CN108004206A CN201711318656.8A CN201711318656A CN108004206A CN 108004206 A CN108004206 A CN 108004206A CN 201711318656 A CN201711318656 A CN 201711318656A CN 108004206 A CN108004206 A CN 108004206A
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Abstract

本发明提供了一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，属于干细胞技术领域，当P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，将培养物进行第一离心分离，将得到的第一上清液进行第二离心分离，将得到的第二上清液进行第三离心分离，将得到的第三上清液过滤，将得到的滤液与聚乙二醇溶液混合，静置孵育8～10h后进行第四离心分离，将得到的第四沉淀经生理盐水洗涤，第五离心分离后，得到的沉淀物为外泌体。采用本发明的方法，不会损伤外泌体的囊泡，保证外泌体获取的量，而且得到的外泌体能够促进人脑微血管上皮细胞的增殖和提高细胞的迁移率。

Description

一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法及外泌 体的应用
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法及外泌体的应用。
背景技术
嗅黏膜间充质干细胞(olfactory mucosa mesenchymal stem cells，OM-MSCs)也称为外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells,OE-MSC)，又因为定位于嗅黏膜固有层中，也称嗅黏膜固有层间充质干细胞(laminapropriamesenchymal stem cell,LP-MSCs)。OM-MSCs广泛存在于鼻中隔或侧壁的上、中、下鼻甲的鼻黏膜内。作为新发现的一类间充质干细胞，OM-MSCs不仅具有间充质干细胞的一般特性，还具有：①来源稳定，嗅黏膜终生可更新；②细胞提取步骤简单有效；③安全性高，染色体核组分析和肿瘤基因分析显示体外无限传代后没有基因变异；④避免了伦理和法律问题；⑤自体移植，无免疫排斥反应。最为重要的是其发生起源为外胚层，与神经发源具有同源性，也为细胞分化提供更为有效的自然途径。
外泌体是细胞内的多囊泡体与细胞质膜融合后主动分泌到细胞外的一种大小在30～140nm的小囊泡。外泌体内含有脂质、蛋白质、miRNA等活性物质，可通过与靶细胞受体结合或水平转移内含物发挥生物学功能。外泌体作为一种新型的细胞间交流方式在细胞间交流中起重要作用。最近的研究发现，干细胞分泌的外泌体可以有效转运mRNA、microRNA和蛋白质，在调控组织再生方面发挥重要作用。至今为止，OM-MSCs被认为是增殖能力最强的MSCs，而MSCs则被认为是产生外泌体能力最强的细胞。
目前常用的提取外泌体的方法有单纯超速离心法，但是采用该方法所获取的外泌体分离效果稳定性差，可损伤囊泡，不能保证外泌体所获取量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，不损伤囊泡，能够保证外泌体的获取量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
1)当P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，得到细胞培养物；
2)将所述步骤1)得到的细胞培养物进行第一离心分离，得到第一上清液和第一沉淀，所述第一离心分离的速度为200～400rpm；
3)将所述步骤2)得到的第一上清液进行第二离心分离，得到第二上清液和第二沉淀，所述第二离心分离的速度为2,000～3,000rpm；
4)将所述步骤3)得到的第二上清液进行第三离心分离，得到第三上清液和第三沉淀，所述第三离心分离的重力加速度为9,000～11,000g；
5)将所述步骤4)得到的第三上清液过滤除去大囊泡，得到滤液；
6)将所述步骤5)得到的滤液与聚乙二醇溶液混合，静置孵育8～10h后进行第四离心分离，得到第四上清液和第四沉淀，使外泌体沉降在第四沉淀中，所述第四离心分离的重力加速度为90,000～110,000g；所述聚乙二醇的数均分子量为5000～7000；
7)将所述步骤6)得到的第四沉淀依次经生理盐水洗涤、第五离心分离，得到的沉淀物为外泌体；所述第五离心分离的重力加速度为90,000～110,000g。
优选的，所述步骤2)第一离心分离的温度为1～6℃，所述第一离心分离的时间为3～8min。
优选的，所述步骤3)第二离心分离的温度为1～6℃，所述第二离心分离的时间为20～40min。
优选的，所述步骤4)第三离心分离的温度为1～6℃，所述第三离心分离的时间为50～70min。
优选的，所述步骤5)过滤使用的滤膜的孔径为0.2～0.25μm。
优选的，所述步骤6)滤液与聚乙二醇溶液的体积比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)；所述聚乙二醇溶液中聚乙二醇的质量百分含量为15～25％。
优选的，所述步骤6)第四离心分离的温度为1～6℃，所述第四离心分离的时间为50～70min。
优选的，所述第五离心分离的条件包括：所述步骤7)第五离心分离的温度为1～6℃，所述第五离心分离的时间为60～80min。
本发明还提供了上述技术方案制备得到的外泌体在制备促进细胞增殖和/或提高细胞迁移药物中的应用。
本发明提供了一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：1)当P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，得到细胞培养物；2)将所述步骤1)得到的细胞培养物进行第一离心分离，得到第一上清液和第一沉淀，所述第一离心分离的速度为200～400rpm；3)将所述步骤2)得到的第一上清液进行第二离心分离，得到第二上清液和第二沉淀，所述第二离心分离的速度为2,000～3,000rpm；4)将所述步骤3)得到的第二上清液进行第三离心分离，得到第三上清液和第三沉淀，所述第三离心分离的重力加速度为9,000～11,000g；5)将所述步骤4)得到的第三上清液过滤除去大囊泡，得到滤液；6)将所述步骤5)得到的滤液与聚乙二醇溶液混合，静置孵育8～10h后进行第四离心分离，得到第四上清液和第四沉淀，使外泌体沉降在第四沉淀中，所述第四离心分离的重力加速度为90,000～110,000g；所述聚乙二醇的数均分子量为5000～7000；7)将所述步骤6)得到的第四沉淀依次经生理盐水洗涤、第五离心分离，得到的沉淀物为外泌体；所述第五离心分离的重力加速度为90,000～110,000g。
在本发明中，细胞培养物经第一离心分离后除去死细胞，经过第二次离心分离后除去细胞碎片，经过第三次离心分离后除去凋亡小体等大囊泡，经过滤后进一步除去大囊泡，得到的滤液与聚乙二醇溶液混合后，聚乙二醇与滤液静置孵育时能形成网状结构，能够聚集捕获滤液中的外泌体，通过第四离心分离，使得外泌体沉降，经过生理盐水洗涤和第五离心分离后，能够除去蛋白和聚乙二醇，得到外泌体，并且不会损伤外泌体的囊泡，保证外泌体获取的量。
本发明实施例的结果显示：采用本发明的方法，不会损伤外泌体的囊泡，保证外泌体获取的量，而且得到的外泌体能够促进人脑微血管上皮细胞的增殖和提高细胞的迁移率。
附图说明
图1为培养第7天，嗅黏膜间充质干细胞光镜结果(200×)；
图2为P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞光镜结果(40×)；
图3为嗅黏膜间充质干细胞的流式细胞结果；
图4为嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体透射电镜结果；
图5为嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体NTA粒径结果；
图6为嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体westernblot结果；
图7为P4和/或P5嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体对人脑微血管内皮细胞增殖作用结果；
图8为P4和/或P5嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体对人脑微血管内皮细胞迁移作用对比结果。
具体实施方式
本发明提供了一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：1)当P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，得到细胞培养物；2)将所述步骤1)得到的细胞培养物进行第一离心分离，得到第一上清液和第一沉淀，所述第一离心分离的速度为200～400rpm；3)将所述步骤2)得到的第一上清液进行第二离心分离，得到第二上清液和第二沉淀，所述第二离心分离的速度为2,000～3,000rpm；4)将所述步骤3)得到的第二上清液进行第三离心分离，得到第三上清液和第三沉淀，所述第三离心分离的重力加速度为9,000～11,000g；5)将所述步骤4)得到的第三上清液过滤除去大囊泡，得到滤液；6)将所述步骤5)得到的滤液与聚乙二醇溶液混合，静置孵育8～10h后进行第四离心分离，得到第四上清液和第四沉淀，使外泌体沉降在第四沉淀中，所述第四离心分离的重力加速度为90,000～110,000g；所述聚乙二醇的数均分子量为5000～7000；7)将所述步骤6)得到的第四沉淀依次经生理盐水洗涤、第五离心分离，得到的沉淀物为外泌体；所述第五离心分离的重力加速度为90,000～110,000g。
在本发明中，当P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，得到细胞培养物。
在本发明中，所述P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的纯度可达到98％以上，而且P4和/或P5代干细胞的活力强，分泌量旺盛。
本发明对所述P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的制备方法没有特殊限定，在本发明实施例中优选包括以下步骤：
a、将嗅黏膜经青霉素溶液清洗后，处理为0.5～1.5mm3的组织块；
b、将步骤a得到的组织块与完全培养基混合后，在37℃、5％CO2的条件下培养14～16天，得到P0代嗅黏膜间充质干细胞；
c、将步骤b得到的P0代嗅黏膜间充质干细胞经PBS缓冲液冲洗，弃去PBS缓冲液后，与胰酶溶液混合，当长梭形细胞变圆变亮时，与完全培养基混合，终止胰酶溶液消化，得到含有完全培养基的培养物；
d、将步骤c得到的含有完全培养基的培养物离心分离，将得到的沉淀与完全培养基混合，按照1:(2～3)、嗅黏膜间充质干细胞的密度为0.5～1.5×105个进行传代培养，得到P1代嗅黏膜间充质干细胞，传代培养在37℃、5％CO2的条件下培养14～16天；
e、重复步骤b～d，直至得到P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞。
本发明对所述步骤a嗅黏膜的获取方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规获取的方法即可。在本发明中，所述嗅黏膜的规格优选为(1.5～2.5)×(2.5～3.5)mm，更优选为2×3mm；所述嗅黏膜的数量优选为1块。
在本发明中，所述步骤a青霉素溶液中青霉素的质量体积百分含量优选为0.5～1.5％，更优选为1.0％。在本发明中，所述嗅黏膜经青霉素溶液清洗的次数优选为3次。在本发明中，所述青霉素溶液能够除去嗅黏膜上残留的血迹。
在本发明中，所述组织块的规格优选为0.5～1.5mm3，更优选为1.0mm3。
在本发明中，所述步骤b组织块的数量与完全培养基的体积比的优选为：4～6块:2ml。
本发明优选在步骤b培养过程中的第7天观察培养的细胞，之后每3天更换一次完全培养基。
本发明对所述完全培养基的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可，在本发明实施例中具体购买于美国的Gibco公司销售的产品，产品的代码为11330032。
本发明将得到的P0代嗅黏膜间充质干细胞经PBS缓冲液冲洗，弃去PBS缓冲液后，与胰酶溶液混合，当长梭形细胞变圆变亮时，与完全培养基混合，终止胰酶溶液消化，得到含有完全培养基的培养物。
本发明将得到的P0代嗅黏膜间充质干细胞经PBS缓冲液冲洗，所述PBS缓冲液与胰酶溶液的体积比优选为(1.5～2.5):(0.5～1.5)，更优选为2:1。在本发明中，所述PBS缓冲液冲洗嗅黏膜间充质干细胞，清洗细胞间存在的血清(完全培养基内含有血清)。在本发明中，所述PBS缓冲液的pH值优选为pH7.2～7.4。
弃去PBS缓冲液后，本发明将得到的P0代嗅黏膜间充质干细胞与胰酶溶液混合；所述胰酶溶液与完全培养基的体积比优选为1:2。在本发明中，所述胰酶溶液中胰酶的质量体积百分含量优选为0.2～0.3％，更优选为0.25％。在本发明中，所述胰酶溶液消化嗅黏膜间充质干细胞。
在本发明中，当长梭形细胞变圆变亮时，与完全培养基混合，终止胰酶溶液消化，得到含有完全培养基的培养物。本发明优选在显微镜下观察细胞的变化。在本发明中，所述完全培养基与胰酶溶液的体积比优选为1:2。在本发明中，加入完全培养基后能够终止胰酶溶液的消化，完全培养基中含有血清，血清中含有的蛋白和胰酶结合，消耗胰酶的量，进而使得胰酶不能够消化细胞蛋白。
本发明将得到的含有完全培养基的培养物离心分离，将得到的沉淀与完全培养基混合，按照1:(2～3)、嗅黏膜间充质干细胞的密度为0.5～1.5×105个进行传代培养，得到P1代嗅黏膜间充质干细胞，传代培养在37℃，5％CO2的条件下培养14～16天。在本发明中，所述按照1:(2～3)为1瓶细胞可传2～3瓶细胞；所述密度为种植密度，为1瓶含有细胞的数量为0.5～1.5×105个。在本发明中，传代培养的条件与培养P0代嗅黏膜间充质干细胞的培养条件相同，在此不再赘述。
在本发明中，所述步骤d离心分离的条件优选包括：所述离心分离的温度优选为20～30℃，更优选为22～28℃，最优选为24～26℃；所述离心分离的速度优选为1,000～2,000rpm，更优选为1,200～1,800rpm，最优选为1,500rpm；所述离心分离的时间优选为3～8min，更优选为4～7min，最优选为5min。
本发明重复步骤b～d，直至得到P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞。
在本发明中，所述P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，得到细胞培养物，优选为86～89％，更优选为87～88％。
本发明将得到的细胞培养物进行第一离心分离，得到第一上清液和第一沉淀，所述第一离心分离的速度为200～400rpm。
在本发明中，所述第一离心分离的的温度优选为1～6℃，更优选为2～5℃，最优选为4℃；所述第一离心分离的速度优选为200～400rpm，更优选为250～350rpm，更优选为300rpm；所述第一离心分离的时间优选为3～8min，更优选为4～7min，最优选为5min。在本发明中，所述第一离心分离能够除去死细胞。
本发明将得到的第一上清液进行第二离心分离，得到第二上清液和第二沉淀，所述第二离心分离的速度为2,000～3,000rpm。
在本发明中，所述第二离心分离的温度优选为1～6℃，更优选为2～5℃，最优选为4℃；所述第二离心分离的速度优选为2,000～3,000rpm，更优选为2,200～2,800rpm，最优选为2,500rpm；所述第二离心分离的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，最优选为30min。在本发明中，所述第二离心分离能够除去细胞碎片。
本发明将得到的第二上清液进行第三离心分离，得到第三上清液和第三沉淀，所述第三离心分离的重力加速度为9,000～11,000g。
在本发明中，所述第三离心分离的温度优选为1～6℃，更优选为2～5℃，最优选为4℃；所述第三离心分离的重力加速度优选为9,000～11,000g，更优选为9,500～10,500g，最优选为10,000g；所述第三离心分离的时间优选为50～70min，更优选为55～65min，最优选为60min。在本发明中，所述第三离心分离能够除去凋亡小体等大囊泡。
本发明将得到的第三上清液过滤除去大囊泡，得到滤液。
在本发明中，所述过滤使用的滤膜的孔径优选为0.2～0.25μm，更优选为0.22μm。在本发明中，所述过滤能够进一步除去大囊泡。
本发明将得到的滤液与聚乙二醇溶液混合，静置孵育8～10h后进行第四离心分离，得到外泌体。
在本发明中，所述滤液与聚乙二醇溶液的体积比优选为(0.5～1.5):(0.5～1.5)，更优选(0.8～1.2):(0.8～1.2)，最优选为1:1。在本发明中，所述聚乙二醇溶液中聚乙二醇的质量百分含量优选为15～25％，更优选为18～22％，最优选为20％。在本发明中，所述聚乙二醇的数均分子量为5000～7000，优选为5500～6500，更优选为6000。在本发明中，所述聚乙二醇与滤液静置孵育时能形成网状结构，能够聚集捕获滤液中的外泌体。
在本发明中，所述静置孵育的时间为8～10h，优选为8.5～9.5h，更优选为9h。
静置后将得到的体系进行第四离心分离，得到第四上清液和第四沉淀，使外泌体沉降在第四沉淀中；所述第四离心分离的温度优选为1～6℃，更优选为2～5℃，最优选为4℃；所述第四离心分离的重力加速度优选为90,000～110,000g，更优选为95,000～105,000g，最优选为100,000g；所述第四离心分离的时间优选为50～70min，更优选为55～65min，最优选为60min。在本发明中，所述第四离心分离能够使得外泌体沉降下来。
本发明得到的第四沉淀依次经生理盐水洗涤、第五离心分离，得到的沉淀物为外泌体；所述第五离心分离的重力加速度为90,000～110,000g。
在本发明中，所述第五离心分离的温度优选为1～6℃，更优选为2～5℃，最优选为4℃；所述第五离心分离的重力加速度优选为90,000～110,000g，更优选为95,000～105,000g，最优选为100,000g；所述第五离心分离的时间优选为60～80min，更优选为65～75min，最优选为68～72min。在本发明中，所述生理盐水洗涤和第五离心分离能够除去蛋白和聚乙二醇，得到外泌体。
本发明还提供了上述技术方案制备得到的外泌体在制备促进细胞增殖和/或提高细胞迁移药物中的应用。在本发明中，所述外泌体具有促进细胞增殖和提高细胞迁移的能力。
下面结合实施例对本发明提供的一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法及外泌体的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
嗅黏膜间充质干细胞的培养及鉴定
嗅黏膜间充质干细胞原代培养：获取嗅黏膜组织块(大小2×3mm)1块，无菌条件下用1％青霉素反复冲洗3遍，去除残留血迹；在完全培养基中用无菌眼科剪将其剪成长约1mm3的组织块，组织块置于15ml离心管与2ml完全培养基混合震荡均匀种植于细胞培养皿中，并置于37℃，5％CO2培养箱中培养；培养第7天，细胞爬出，在显微镜下观察到贴壁的梭形或多边形的细胞(结果见图1)，之后每隔3天更换一次完全培养基；培养第15天，细胞约85％融合，即可传代。
嗅黏膜间充质干细胞传代培养：取可传代的P0代细胞，弃掉皿内原培养液，加入10mL PBS(pH7.2～7.4)缓冲液轻轻冲洗细胞生长面；弃去PBS洗液，加入1mL 0.25％胰蛋白酶，左右摇晃平皿使胰酶均匀覆盖于皿底，显微镜下观察可见细胞间隙增大，胞质回缩；当长梭形细胞变圆变亮时，立即加入2ml的完全培养基终止消化；反复吹打，直至细胞全部脱落成单细胞悬液，将悬液转移至离心管中，在1,500rpm的条件下室温离心5min；弃上清，再次加入完全培养基重悬细胞，按1:2～1:3比例、密度为1×105个细胞数进行传代培养，将培养瓶置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养；待细胞生长融合至90％时，重复上述传代步骤对细胞进行扩增培养；P4和/或P5代可见细胞成短梭形或多边形，细胞体积变大，成旋涡状或网状排列(结果见图2)。
重复上述操作进行P4和/或P5代细胞培养扩增，取培养P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞，首先用1ml 0.25％的胰蛋白酶消化细胞并通过室温离心1,500rpm/5min，弃上清，然后加入PBS，调整细胞浓度至1×106/ml；分别加入鼠抗人单克隆抗体：CD73-/CD90-/CD105-FITC、/CD34-/CD45-PE，并以鼠抗人的IgG1-FITC、IgG1-PE作为同型对照，室温避光孵育10min，利用流式细胞仪检测，FlowJo软件分析结果，结果见图3。结果显示分离制备所得细胞表达间充质干细胞表面抗原CD73、CD90和CD105均在95％以上，而不表达CD34和CD45等表面抗原。由图3可见，制备所得的嗅黏膜间充质干细胞纯度很高。
实施例2
嗅黏膜间充质干细胞外泌体获取及鉴定：
外泌体的获取：
收集实施例1得到的细胞培养上清液100ml，在4℃的环境下，初步离心(分为3次)排除杂质，第1次：离心速度300rpm，时间为5min；第2次：离心速度2,500rpm，时间为30min；第3次：离心温度4℃，离心重力加速度10,000g，时间为60min；收集离心后上清，通过0.22μm滤膜过滤；然后将收集的滤液按体积1:1比例加入20％数均分子量为6000的聚乙二醇溶液，充分混匀静置孵育8小时，离心温度4℃，重力加离心速度100,000g，时间为60min，所得沉淀用生理盐水重悬，混均后在离心重力加速度为100,000g的条件下离心75min，最后所制备的沉淀物即为外泌体。外泌体用BCA法定量后分装于eppendorf管内，置于-80℃冰箱内保存备用。
外泌体的鉴定：
(1)透射电镜：取分离纯化外泌体10uL，按体积比＝1:1加入4℃的PBS溶液稀释后滴加于2mm的载样铜网上，于室温静置1min后用滤纸将多余液体轻轻吸去，用3％(w/v)磷钨酸钠溶液(pH6.8)室温负染5分钟，用双蒸水轻轻洗一遍后室温晾干，于透射电镜观察并照相、测量其直径，结果见图4。结果显示，在透射电镜下观察，外泌体大小在30nm至100nm不等，呈形态基本一致的圆形或者椭圆形膜性囊泡样，染色后可见囊泡有膜状结构，上述特征均符合外泌体的特征。
(2)NTA(Nanosight检测外泌体粒径)：将收集的嗅黏膜间充质干细胞来源的外泌体用PBS稀释至可测颗粒浓度，用1mL注射器注入纳米颗粒跟踪分析仪进行分析，并保存分析数据，结果见5。由图5可见，MODE曲线线性流畅，表明所含杂质少，粒径峰值125nm与理论外泌体大小值相符；外泌体直径大小较为集中，大部分介于30～150nm之间。
(3)Westernblot检测外泌体特异标志蛋白：分别收集细胞和外泌体提取液，加入RIPA裂解液裂解，采用BCA法测定蛋白浓度，分别取30g蛋白行SDSPAGE电泳，蛋白分离后将其转移至硝酸纤维素膜上，室温下用含5％脱脂牛奶封闭液封闭处理1h，经1×TBST缓冲液洗脱后，分别加入一抗(CD81、CD63单克隆抗体)，于4℃条件下反应过夜，经再次洗脱后，室温下避光加入荧光标记的二抗反应1h，再用1×TBST缓冲液洗膜，在化学发光成像仪中扫描显像，结果见图6。由图6可以得出，外泌体提取液均表达CD81、CD63蛋白，完全符合外泌体特征。
实施例3
嗅黏膜间充质干细胞外泌体促进人脑微血管内皮细胞增殖作用的影响：
实施例2分离获得的P4和/或P5嗅黏膜间充质干细胞源外泌体，设置等体积生理盐水添加对照组、0.1g/ml添加组、0.2g/ml添加组、0.4g/ml添加组(终浓度)、并置于37℃、5％CO2培养箱中培养12h，分别采用CCK8法检测人脑微血管上皮细胞的增殖，结果参见图7。如图7所示，0.1g/ml添加组、0.2g/ml添加组、0.4g/ml添加组均能极显著的促进人脑微血管上皮细胞的增殖(0.1g/ml-0.2g/ml；P<0.01和0.4g/ml；P<0.001)，其中0.4g/ml添加组促进作用最优，说明了人脑微血管上皮细胞增殖跟加入外泌体的量存在正相关。
实施例4
嗅黏膜间充质干细胞外泌体促进人脑微血管内皮细胞迁移的影响：
上述分离获得的P4和/或P5嗅黏膜间充质干细胞源外泌体，采用Wound-healingassay(划痕实验)，测定OM-MSC外泌体对HBMEC细胞迁移的影响；分别设置了加入OM-MSC外泌体(终浓度0.4g/ml)的处理组和加入等体积生理盐水和EGF(终浓度10ng/ml)的阴性对照和阳性对照组，处理6h和12h后观察细胞迁移程度，结果见图8。如图8所示，OM-MSC外泌体(终浓度0.4g/ml)处理HBMEC细胞12h后，细胞的迁移率81.8％(P<0.01)，能极显著的提高细胞的迁移率，优于加入EGF的阳性对照组76.6％(P<0.01)的迁移率。
由以上实施例可知，采用本发明的方法，不会损伤外泌体的囊泡，保证外泌体获取的量，而且得到的外泌体能够促进人脑微血管上皮细胞的增殖和提高细胞的迁移率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
1)当P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，得到细胞培养物；
2)将所述步骤1)得到的细胞培养物进行第一离心分离，得到第一上清液和第一沉淀，所述第一离心分离的速度为200～400rpm；
3)将所述步骤2)得到的第一上清液进行第二离心分离，得到第二上清液和第二沉淀，所述第二离心分离的速度为2,000～3,000rpm；
4)将所述步骤3)得到的第二上清液进行第三离心分离，得到第三上清液和第三沉淀，所述第三离心分离的重力加速度为9,000～11,000g；
5)将所述步骤4)得到的第三上清液过滤除去大囊泡，得到滤液；
6)将所述步骤5)得到的滤液与聚乙二醇溶液混合，静置孵育8～10h后进行第四离心分离，得到第四上清液和第四沉淀，所述第四离心分离的重力加速度为90,000～110,000g；所述聚乙二醇的数均分子量为5000～7000；
7)将所述步骤6)得到的第四沉淀依次经生理盐水洗涤、第五离心分离，得到的沉淀物为外泌体；所述第五离心分离的重力加速度为90,000～110,000g。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)第一离心分离的温度为1～6℃，所述第一离心分离的时间为3～8min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)第二离心分离的温度为1～6℃，所述第二离心分离的时间为20～40min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)第三离心分离的温度为1～6℃，所述第三离心分离的时间为50～70min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5)过滤使用的滤膜的孔径为0.2～0.25μm。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6)滤液与聚乙二醇溶液的体积比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)；所述聚乙二醇溶液中聚乙二醇的质量百分含量为15～25％。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6)第四离心分离的温度为1～6℃，所述第四离心分离的时间为50～70min。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤7)中第五离心分离的温度为1～6℃，所述第五离心分离的时间为60～80min。
9.权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备得到的外泌体在制备促进细胞增殖和/或提高细胞迁移药物中的应用。
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