KR102213890B1 - 엑소좀 기반의 면역세포의 교차분화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분화가 완료된 제2면역세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 상기 면역세포와 공통의 선조세포를 가지며 다른 유형으로 분화가 완료된 제1면역세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계를 포함하는, 상기 제1면역세포의 상기 제2면역세포로의 교차분화 방법을 제공한다.

Description

엑소좀 기반의 면역세포의 교차분화 방법{A method for inducing transdifferentiation of immune cell based on exosome}
본 발명은 2018년 4월 10일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/655,313에 대한 우선권을 주장한다. 상기 문서는 전체로 본 출원에 참조로 삽입된다.
본 발명은 교차분화 방법에 관한 것으로 더 상세하게는 엑소좀 기반의 면역세포 교차분화 유도방법에 관한 것이다.
직접교차분화 기술(direct cell conversion technique)은 분화가 완료된 세포간의 전환을 유도하는 기술로 최근 이를 이용하여 인슐린을 생산하는 내분비 세포, 뉴런, 심근세포의 기능을 가지는 치료용 세포로 전환하는 연구들이 보고되었다. 특히, 간세포(hepatocyte)의 직접교차 분화 연구의 경우, 미국의 UCSF 대학의 Milad Rezavani 연구팀과 독일의 하노버 대학의 Guangqi Song 연구팀에서 바이러스를 이용하여 4~6개 리프로그래밍 인자를 in vivo에서 마우스 근섬유아세포(myofibroblast)에 전달하여 간세포로 직접교차분화를 유도한 연구가 보고되었으나 세포 전환율이 ~1% 정도로 매우 낮을 뿐 아니라, 바이러스를 이용하였기 때문에 임상으로 적용에는 한계가 있다. 또한, 역분화줄기세포(iPS)의 연구는 분화 완료된 세포를 역분화기술을 이용하여 줄기세포로 역분화시킨 후 이를 원하는 유형의 세포로 재분화시키는 방법을 사용하였는데 이와 같은 재분화 방법은 유전자 조작이 필요하고 효율성이 떨어진다. 따라서 분화가 완료된 세포를 선조를 공통으로 하는 다른 세포 유형으로 교차분화시키는 방법의 개발이 요구되고 있다.
한편, 직접교차분화(direct conversion)를 통한 치료제 개발에 필수적인 요소이나 현재의 in vivo 세포 리프로그래밍 기술의 경우, 세포전환 효율이 매우 낮아 만족할 만한 치료효과를 얻기가 어려운 실정이다. 더욱이 대부분이 바이러스 전달체를 이용하여 리프로그래밍 인자를 세포에 전달하고 있는 실정이며, 바이러스의 체내 염색체로의 무작위 삽입으로 인한 안정성의 문제가 있어 임상에서 치료제로 활용하기에는 한계가 있다. 따라서 직접교차분화 기술의 임상적용을 위해서는 표적세포를 높은 효율로 전환할 수 있는 세포 리프로그래밍 기술개발이 필수적이다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2012-0124282호는 체세포에서 배반엽 상피 세포의 줄기세포로의 직접 교차분화 방법에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 유전자 조작에 따른 세포 전환 효율성이 감소하는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 종래의 항암면역치료 효율이 낮은 문제점을 해결하고자 종양 지지형 세포를 암조직에서 직접교차분화시켜 종양 공격형 면역 세포로 리프로그래밍이 가능한 엑소좀 기반의 면역세포 교차분화 유도방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 제1면역세포의 제2면역세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 제2면역세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 상기 제2면역세포와 공통의 선조세포를 가지며 다른 유형으로 분화가 완료된 제1면역세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 M1 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 M2 대식세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 M1 대식세포의 M2 대식세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 M2 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 M1 대식세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포의 수지상 세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 수지상 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 개체에서 M1 매크로파지-매개 면역반응을 강화시키는 방법이 제공된다:
M1 대식세포 배양물로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
치료적으로 유효한 양의 분리된 엑소좀을 개체에게 투여하는 단계
(여기서, 상기 엑소좀은 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 분화를 유도하고, 증가된 M1 대식세포의 기능에 의해 개체에서 M1 대식세포-매개 면역반응이 향상됨).
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 하기를 포함하는 개체에서의 상처 치유 방법이 제공된다:
분화가 완료된 M2 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
치료적으로 유효한 양의 분리된 엑소좀을 개체에게 투여하는 단계
(여기서, 상기 엑소좀은 상기 개체에서 M1 대식세포의 M2 대식세포로의 분화를 유도하고, 증가된 M2 대식세포의 기능에 의해 상기 개체의 상처 치유가 향상됨).
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 유효성분으로 M1 대식세포로부터 단리 된 엑소좀 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약학 적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 유효성분으로 M2 대식세포로부터 단리 된 엑소좀 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 상처 치료용 약학 적 조성물이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 엑소좀 기반의 면역세포 교차분화 유도방법은 종양 지지형 세포를 암조직에서 직접교차분화시켜 종양 공격형 면역 세포로 리프로그래밍이 가능하므로 신규 항암면역 치료제 또는 창상 치유를 위한 세포 치료제로 활용할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 Raw 264.7 대식세포주로부터 M1 및 M2 타입의 대식세포로의 분화를 각 세포 유형에 특이적인 세포 표지자에 대한 웨스턴블랏 분석으로 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 Raw 264.7 대식세포로부터 분화된 M0, M1 및 M2 유래 엑소좀의 표현형을 관찰한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 Raw 264.7 대식세포로부터 분화된 M0, M1 및 M2 유래 엑소좀의 크기를 분석한 그래프이다.
도 4는 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)의 분화 조건을 확립하기 위한 조건 및 스케줄을 도식화한 개요도이다.
도 5는 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)를 M1 및 M2 대식세포로 분화시킨 후 형태를 관찰한 현미경 사진이다.
도 6은 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 분화된 M0, M1 및 M2 대식세포의 마커의 발현을 관찰한 겔 사진이다.
도 7은 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 분화된 M0, M1 및 M2 대식세포로부터 엑소좀의 형태를 관찰한 현미경 사진이다.
도 8은 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 분화된 M0, M1 및 M2 대식세포로부터 분리한 엑소좀의 크기를 분석한 그래프이다.
도 9는 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 분화된 M0, M1 및 M2 대식세포로부터 분리한 엑소좀의 마커의 발현을 관찰한 겔 사진이다.
도 10은 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 분화시킨 M1 및 M2 대식세포로부터 추출한 엑소좀에 포함되어 있는 MIG과 RANTES의 발현을 측정한 사이토카인 어레이 키트 사진이다.
도 11은 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 분화된 M1 및 M2 대식세포로부터 추출한 엑소좀에 포함되어 있는 사이토카인의 상대적인 발현을 분석한 그래프이다.
도 12는 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포로부터 추출한 M1 엑소좀(종양 공격형)을 M2 대식세포(종양 지지형)에 처리하여 M1으로의 리프로그래밍 여부를 분석한 것으로 M1 마커인 iNOS와 M2 마커인 Arginase의 발현을 관찰한 겔 사진이다.
도 13는 L929로 분화시킨 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포로부터 추출한 M1 엑소좀(종양 공격형)을 M2 대식세포(종양 지지형)에 처리하여 M1으로의 리프로그래밍 여부를 분석한 것으로 M1 마커인 iNOS의 발현을 관찰한 형광 현미경 사진이다.
도 14는 M-CSF로 분화시킨 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포로부터 추출한 M1 엑소좀(종양 공격형)을 M2 대식세포(종양 지지형)에 처리하여 M1으로의 리프로그래밍 여부를 분석한 것으로 M1 마커인 iNOS의 발현을 관찰한 형광 현미경 사진이다.
도 15는 M1 엑소좀(종양 공격형)을 M2 대식세포(종양 지지형)에 처리하여 M1으로의 리프로그래밍 여부를 분석한 것으로 M1 마커인 CD86, MHCⅡ의 발현을 측정한 유세포 분석 그래프이다.
도 16은 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포 유래 엑소좀을 종양에 처리하여 항-종양 효과를 관찰한 것으로 M1 엑소좀을 투여한 실험군의 종양 성장을 분석한 그래프이다.
도 17은 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포 유래 엑소좀을 종양에 처리하여 항-종양 효과를 관찰한 것으로 대조군과 실험군의 몸무게를 분석한 그래프이다.
도 18은 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포 유래 엑소좀을 종양에 처리하여 항-종양 효과를 관찰한 것으로 M1 엑소좀을 투여한 실험군의 종양 무게를 분석한 그래프이다.
도 19은 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포 유래 엑소좀을 종양에 처리하여 항-종양 효과를 관찰한 것으로 M1 엑소좀을 투여한 실험군의 종양의 크기를 나타내는 사진이다.
도 20은 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포 유래 엑소좀을 종양에 처리하여 항-종양 효과를 관찰한 것으로 M1 엑소좀을 처리한 종양 조직에서 iNOS 발현을 관찰한 면역조직화학염색 사진이다.
도 21은 M1 대식세포에 M2 엑소좀을 농도별로 처리한 후 흡수(uptake) 조건을 관찰한 형광 사진이다.
도 22은 M1 대식세포에 M2 엑소좀을 농도별로 처리한 후 상대적 형광 세기를 분석한 그래프이다.
도 23는 M1 대식세포에 M2 대식세포의 엑소좀을 처리한 후 시간에 따라 해당 마커의 발현을 관찰한 겔 사진이다. 1 : M1 macrophage(BMDM), 2 : M1 macrophage(BMDM) + M2 Exosome 50 μg 24h 1번, 3 : M1 macrophage(BMDM) + M2 Exosome 50 μg 48h 1번, 4 : M1 macrophage(BMDM) + M2 Exosome 50 μg 72h 1번, 5 : M1 macrophage(BMDM) + M2 Exosome 50 μg 96h 1번, 6 : M1 macrophage(BMDM) + M2 Exosome 50 μg 96 h(48+48) 2번.
도 24은 상처 치유(wound healing) 동물모델을 이용하여 M1 및 M2 대식세포 유래 엑소좀 처리에 따른 상처 치유 효과를 관찰한 사진이다.
도 25는 상처 치유(wound healing) 동물모델을 이용하여 M1 및 M2 대식세포 유래 엑소좀 처리에 따른 상처 치유 효과를 분석한 그래프이다.
도 26는 PBS, M1 유래 엑소좀, M2 유래 엑소좀을 상처에 피하주사 한 후 24일 후의 대표적인 면역조직화학염색 사진이다.
도 27은 대식세포와 함께 배양된 스크래치 입은 섬유 아세포의 대표적인 위상 - 대조 사진이다.
도 28은 대식세포와 함께 배양된 스크래치 입은 섬유아세포의 상처봉합 정도를 정량화 한 그래프이다.
도 29은 상처 입은 후 24 시간후에 대식세포 / 섬유아세포 공동배양 상층액에서 MMP2의 발현수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 사진이다.
도 30는 내피 세포와 대식세포 서브 세트의 공 배양에 대한 튜브 형성 분석의 대표적인 사진이다.
도 31은 내피 세포와 대식 세포를 함께 배양 한 후 24 시간 후에 튜브 가지 수와 길이를 정량적으로 평가한 그래프이다.
도 32은 상처 입은 후 24 시간후에 대식세포/섬유아세포 공배양 상층액에서 VEGF의 발현수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 사진이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "엑소좀(exosome)"은 많은 어쩌면 혈액, 소변, 및 세포배양의 배양배지를 포함하는 모든 생물학적 액체에 존재할지 모르는 세포-유래의 소포(vesicle)로 세포외 소포(extracellular vesicle) 또는 소수포(microvesicle)라고도 불리운다. 엑소좀이 크기는 50 및 150 nm 사이인 것으로 알려지고 있으며, 다소포체(multivesicular body)가 세포막과 융합할 때 세포로부터 분비되거나 세포막을 통해 직접 분비된다. 엑소좀은 응고, 세포간 신호전달, 및 대사폐기물의 관리와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "면역세포 리프로그래밍(immunocyte reprogramming)"은 종양 미세환경을 이루고 있는 구성성분 중 과도하게 축적되어서 암세포로의 항암제 접근을 방해하는 암 유관 섬유아세포(CAF) 및 암의 전이·성장을 돕는 종양 관련 대식세포(TAM)를 엑소좀을 활용하여 변형, 제어함으로써 암세포 친화적인 종양 미세환경을 조성하고 항암면역효과가 극대화된 종양 미세환경으로 리모델링하는 새로운 접근법을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "직접 교차분화기술(direct cell conversion technique)"은 고등생물에서 전혀 다른 세포타입을 갖는 성숙한(분화가 끝난) 세포간의 전환을 유도하는 과정으로 이미 분화가 끝난 세포의 운명을 다시 바꾸어 다른 종류의 체세포로 직접 분화시키는 기술이다. 이는 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)로 리프로그래밍하고 이를 재분화하여 목적하는 세포로 만들어야 하는 과정과 달리, 유도만능줄기세포단계를 거치지 않고 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도한다는 점에서 차이가 있다. 현재 직접교차분화는 질병모델링과 신약 발굴 등에 이용될 가능성을 인정받고 있으며, 미래에는 유전자 치료 그리고 재생의학 등에도 응용될 수 있을 것이라 기대된다. 최근 들어 섬유아세포(fibroblast)에서 부터 뇌, 심장 세포 등 조직 재생이 불가능한 장기들뿐 아니라, 혈액, 혈관, 근육, 등의 다양한 세포로 리프로그래밍이 가능하다는 연구들이 발표되고 있어, 치료제로서의 응용 가능성이 점차 높아지고 있는 현실이다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 제1면역세포의 제2면역세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 제2면역세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 상기 제2면역세포와 공통의 선조세포를 가지며 다른 유형으로 분화가 완료된 제1면역세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계.
상기 방법에 있어서, 상기 제1면역세포는 M1 대식세포, M2 대식세포 또는 수지상 세포일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제2면역세포는 M1 대식세포, M2 대식세포 또는 수지상 세포일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제1면역세포는 M1 대식세포이고, 상기 제2면역세포는 M2 대식세포일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제1면역세포는 M2 대식세포이고, 상기 제2면역세포는 M1 대식세포일 수 있다.
상기 방법 중 어느 하나에 있어서, 상기 M1 대식세포 또는 상기 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 상기 대식세포는 비극화(non-polarized) 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것일 수 있다. 이 경우, 비극화 대식세포주는 THP-1, U937, J774A.1 또는 Raw 264.7일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2면역세포는 상기 제1면역세포를 투여할 필요가 있는 개체로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 제1면역세포의 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 세포 배양물의 배양 배지로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 10㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 또는 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 농도로 처리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1면역세포는 M1 대식세포일 수 있고 상기 개체는 항암 요법을 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1면역세포는 M2 대식세포일 수 있고, 상기 개체는 상처(또는 창상) 치유를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 M1 대식세포 또는 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 상기 대식세포는 비극화 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것일 수 있다. 상기 비극화 대식세포주는 THP-1, U937, J774A.1 또는 Raw 264.7일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2면역세포는 M1 대식세포를 투여 할 필요가 있는 개체로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑조좀은 상기 제1면역세포의 세포 배양물으로부터 분리될 수 있다. 또한, 상기 세포 배양물의 배양액으로부터 상기 엑소좀을 분리 할 수도 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 10㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 또는 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 농도로 처리될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 M1 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관내 조건에서 M2 대식세포를 상기 분리된 엑소좀으로 처리하는 단계.
상기 방법에 있어서, 상기 M1 대식세포 또는 상기 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 상기 대식세포는 비극화(non-polarized) 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것일 수 있다. 이 경우, 비극화 대식세포주는 THP-1, U937, J774A.1 또는 Raw 264.7일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 M2 대식세포는 M1 대식세포의 투여를 필요로 하는 개체로부터 분리될 수 있다. 이 경우 상기 개체는 항암 치료가 필요한 개체일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 M1 대식세포의 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 세포 배양물의 배양액으로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 10㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 또는 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 농도로 처리될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 M1 대식세포의 M2 대식세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 M2 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 M1 대식세포에 처리하는 단계.
상기 방법에 있어서, 상기 M1 대식세포 또는 상기 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 상기 대식세포는 비극화(non-polarized) 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것일 수 있다. 이 경우, 비극화 대식세포주는 THP-1, U937, J774A.1 또는 Raw 264.7일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 M1 대식세포는 M2 대식세포의 투여를 필요로 하는 개체로부터 분리될 수 있다. 이 경우 상기 개체는 상처의 치료가 필요한 개체일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 M2 대식세포의 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 세포 배양물의 배양액으로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 10㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 또는 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 농도로 처리될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포의 수지상 세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 수지상 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계.
상기 방법에 있어서, 상기 수지상 세포는 골수 또는 단핵구로부터 유래된 것일 수 있다. 선택적으로, 상기 수지상 세포는 수지상 세포-유사 세포주(dentritic cell-like cell line)일 수 있는데, 상기 수지상 세포-유사 세포주 DC2.4, JAWSII, Thp-1, HL-60, U937, KG-1, 또는 MUTZ-3일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포는 수지상 세포의 투여를 필요로 하는 개체로부터 분리될 수 있다. 이 경우 상기 개체는 항암 치료를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 수지상 세포의 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 세포 배양물의 배양액으로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 10㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 또는 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 농도로 처리될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 개체에서 M1 매크로파지-매개 면역반응을 강화시키는 방법이 제공된다:
M1 대식세포 배양물로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
치료적으로 유효한 양의 분리된 엑소좀을 개체에게 투여하는 단계
(여기서, 상기 엑소좀은 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 분화를 유도하고, 증가된 M1 대식세포의 기능에 의해 개체에서 M1 대식세포-매개 면역반응이 향상됨).
상기 방법에 있어서, 상기 개체는 항암 치료를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 M1 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 상기 대식세포는 비극화(non-polarized) 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것일 수 있다. 이 경우, 비극화 대식세포주는 THP-1, U937, J774A.1 또는 Raw 264.7일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 M1 대식세포의 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 세포 배양물의 배양액으로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 μg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중, 5 μg/kg 체중 내지 50 mg/kg 체중, 20 μg/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중, 또는 100 μg/kg 체중 내지 10 mg/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 전신 또는 국소 투여될 수 있다. 전신 투여의 경우, 상기 엑소좀은 정맥 내, 근육 내 또는 복강 내 투여될 수 있다. 국소 투여의 경우, 상기 엑소좀은 종양 내, 경피 또는 피하로 투여될 수 있다. 그러나, 투여 방법은 이에 한정되는 것은 아니며, 치료에 적합한 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 하기를 포함하는 개체에서의 상처 치유 방법이 제공된다:
분화가 완료된 M2 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
치료적으로 유효한 양의 분리된 엑소좀을 개체에게 투여하는 단계
(여기서, 상기 엑소좀은 상기 개체에서 M1 대식세포의 M2 대식세포로의 분화를 유도하고, 증가된 M2 대식세포의 기능에 의해 상기 개체의 상처 치유가 향상됨).
상기 방법에 있어서, 상기 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 상기 대식세포는 비극화(non-polarized) 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것일 수 있다. 이 경우, 비극화 대식세포주는 THP-1, U937, J774A.1 또는 Raw 264.7일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 M2 대식세포의 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 세포 배양물의 배양액으로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 μg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중, 5 μg/kg 체중 내지 50 mg/kg 체중, 20 μg/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중, 또는 100 μg/kg 체중 내지 10 mg/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 전신 또는 국소 투여될 수 있다. 전신 투여의 경우, 상기 엑소좀은 정맥 내, 근육 내 또는 복강 내 투여될 수 있다. 국소 투여의 경우, 상기 엑소좀은 종양 내, 경피 또는 피하로 투여될 수 있다. 그러나, 투여 방법은 이에 한정되는 것은 아니며, 치료에 적합한 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 유효성분으로 M1 대식세포로부터 단리 된 엑소좀 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약학 적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 유효성분으로 M2 대식세포로부터 단리 된 엑소좀 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 상처 치료용 약학 적 조성물이 제공된다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 의미한다. 담체의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 검, 알긴산 염, 젤라틴, 인산 칼슘, 규산 칼슘, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 생리 식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항-응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 통상적인 방법에 따라 임의의 제형으로 제조될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어 경구 투여형(예: 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 환제 및 과립) 또는 비경구 제형(예: 주사제형)으로 제제화될 수 있다. 상기 조성물은 또한 전신 투여제형 또는 국소 제형으로 제제화될 수 있다.
유효물질의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약물 형태, 투여 경로 및 투여 간격에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택 될 수있다. 미술. 이러한 투여량은 예를 들어 약 0.001 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 0.01 mg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중 또는 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 1 mg/kg 체중의 범위일 수 있다. 투여는 하루에 한 번, 하루에 여러 번, 일주일에 한 번, 2 주에 한 번, 3 주에 한 번, 4 주에 한 번 또는 일 년에 한 번 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 M1 대식세포 유래의 엑소좀은 시험관내 조건에서 환자로부터 분리된 M2 대식세포 또는 상기 M2 대식세포를 포함한 세포군집에 처리되어 상기 M2 대식세포를 M1 대식세포 교차분화 시키는데 사용될 수 있다. 이렇게 교차분화된 M1 대식세포 또는 상기 M1 대식세포를 포함하는 세포군집은 세포치료제로 상기 환자에게 재투여되는 일종의 엑스 비보(ex vivo) 치료법에 사용될 수 있다. 환자 유래의 대식세포를 이용한 치료법은 면역거부 반응과 같은 타가 유래 세포치료제 사용 시 발생할 수 있는 부작용을 최소화할 수 있는 매우 효과적인 방법이다.
일반적으로 엑소좀(exosome)은 세포가 분비하는 50-150 nm 크기의 소포체(extracellular vesicles)로서, 세포 내 단백질, 세포막 단백질, 지질 및 RNA, miRNA, DNA 등 핵산 등이 포함되어 있고 세포의 분화, 성장, 이동 및 신호전달에 관련된 여러 인자들을 복합적으로 포함하고 있으므로 특히 세포 리프로그래밍 유도 인자 및 이를 포함한 전달체로 활용 가능한 무한한 잠재력을 가지고 있다. 더욱이 엑소좀은 세포에서 유래한 물질로서 생체 적합성이 매우 우수하며, 세포와 같은 지질 이중층으로 구성되어 있기 때문에 다양한 활성물질(약물, 유전자, 단백질)을 안전하고 효율적으로 전달 가능하다. 그러나 엑소좀 내에는 다양한 기능을 지닌 여러 인자들이 혼재되어 있어 특정 방향으로 세포를 리프로그래밍 하기에는 어려움이 있어 원하는 방향으로 세포의 거동 및 운명을 유도하기 위해서는 특정 기능을 특화 및 강화 시킬 수 있는 엑소좀 엔지니어링 기술이 요구되었다. 이에 본 발명자들은 종래 암 치료에 있어서 암의 성장을 돕는 종양친화 세포로 인해 항암면역치료 효율이 매우 낮은 문제점을 근본적으로 해결하고자, 예의노력한 결과 종양 지지형 세포를 암조직에서 직접교차분화시켜 종양 공격형 면역세포로 리프로그래밍이 가능한 엑소좀 기반 세포교차분화기술을 활용한 직접 교차분화 방법을 개발하였다. 대식세포 유래 엑소좀을 이용한 직접 교차분화를 이용한 면역세포 리프로그래밍(reprogramming) 기술은 면역반응을 획기적으로 조절·통제할 수 있는 신기술로 현재까지 보고된 바가 없으며, 특히 생체 내에서 세포를 전환시켜 치료에 적용하고자 하는 기술은 근본적인 치료를 위한 것으로 암치료 외에 다른 난치성 질환에 신개념의 생체 내 세포치료 플랫폼 기술을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
일반적 방법
세포배양
골수 유래 대식세포(BMDM)를 제조하기 위해, 먼저 BALB/c 마우스를 희생시키고 다리뼈에서 골수세포(myelocyte)를 분리하였다. 상기 분리된 골수세포를 10% 우태아 혈청 및 1% 항생제가 보충된 RPMI 배지에 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF) 또는 L929 세포 배양액을 첨가하여 7일 동안 배양하였고 Raw 264.7 대식세포주는 10% 우태아 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 성장시켰다.
엑소좀의 분리
엑소좀은 공지된 방법으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 세포배양 배지 내의 엑소 좀은 연속 원심분리(예: 300 xg 10분, 2000 xg 10분, 10,000 xg 30분, 0.22 μm 필터로 여과하고 150,000 xg에서 추가로 초원심분리 3시간)에 의해 분리될 수 있다. 선택적으로, 엑소좀은 세포 스트레이너와 바틀탑(bottle-top) 필터(예: 2,000 xg, 4℃에서 원심 분리, 셀 스트레이너(40 ㎛)를 사용한 첫 번째 여과, 바틀탑 필터(0.22 ㎛)를 사용한 두 번째 여과)를 이용하여 분리될 수 있다. 여과된 엑소좀은 TFP(Tangential Flow Filtration)로 농축될 수 있다. 선택적으로, 엑소좀은 선행문헌(한국 특허공개공보 제10-2016-0116802호; Pin Li 등, Theranostics, 7(3): 789-804, 2017; Coumans 등, Circ. Res., 120: 1632-1648, 2017)에 기재된 방식으로 분리될 수도 있다.
웨스턴 블랏 분석
총 단백질의 양은 BCA 분석키트에 의해 결정되었고, 동량(20 μg)의 세포 용해물 및 엑소좀 단백질은 웨스턴 블랏 분석에 사용되었다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스막으로 옮겼다. 그 후 상기 막을 1X TBST(Tris-buffered saline, 0.05% tween 20)에서 1시간 동안 5% 탈지분유로 차단하였다. 상기 블롯을 밤새 4℃에서 1차 항체(항-iNOS 항체, 1:500, Abcam, ab15323; 항-CD206 항체, 1:500, Santacruz, sc34577; 항-Arginase 항체, 1:500, Santacruz, sc18355; 또는 항-Actin 항체, 1:2000, Merck Millipore, MABT219; 항-GAPDH 항체, 1:2000, Merck Millipore, AB2302)와 반응시켰다. 이어서, 막을 HRP-접합 항-마우스 또는 -토끼 이차항체(Sigma-Aldrich)와 반응시키고, 결과를 화학발광(Bio-Rad)에 의해 시각화하였다.
면역형광분석
마우스 골수 유래 대식세포주(BMDM)를 4-웰 챔버에 파종하였고, M2 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 IL-4(20 ng/ml)을 48시간 동안 처리하여 배양한 다음 37℃에서 24시간 동안 처리한 뒤, 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 7분간 고정하였다. 그 후 항-iNOS 항체(1:400, Abcam, ab15323) 및 Alexa fluor 488-결합된 2차 항체(1:800, Jackson ImmunoResearch)를 첨가하여 염색하였다. 잔류 비-특이성 신호(non-specific signals)의 제거 후에 상기 세포는 Hoechst 33258를 이용하여 25℃에서 10분 동안 핵 염색 후에 형광현미경(Nikon Eclipse Ti, Nikon)으로 관찰하였다.
유세포 분석
마우스 골수 유래 대식세포주(BMDM)를 35파이 페트리 디쉬에 파종하였고, M1 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 LPS(100 ng/ml)과 IFN-γ(20 ng/ml)을 24시간 동안 처리 또는 M2 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 IL-4(20 ng/ml)을 24시간 동안 처리하였다. M2 대식세포에 M1 대식세포 유래의 엑소좀을 24 시간 동안 처리한 뒤, APC 항-mouse F4/80 항체(BioLegend, 123116), PE 항-mouse CD86 항체(BioLegend, 105008), FITC 항-mouse MHCⅡ 항체(BioLegend, 107605) 를 첨가하여 1시간 동안 염색한 후에 AccuriTM C6 유세포 계측기로 분석하였다.
면역조직화학 분석
종양조직을 절제하고, 밤새 10% 중성 포름알데히드로 고정하고 파라핀 봉입처리하였다. 파라핀 봉입된 조직을 박편화하고 항원 인출 후, 박편을 항-iNOS 항체(1:200, Abcam, ab15323)와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 박편을 실온에서 2시간동안 2차 항체(1:200, GBILabs, D43-18)와 함께 항온 반응시키고 30초 동안 대조 염색시켰다. 이미지는 광학현미경(BX51, Olympus, USA)을 사용하여 수득하였다.
상처 스크래치 이동 분석
NIH-3T3 세포를 6 웰 플레이트(SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea)에 2x105 cells/well의 밀도로 새로운 배양 배지에 도말 하였다. 세포를 37℃ 및 5 % CO2에서 밤새 배양하여 70% 밀도를 형성시켰다. 이어서 M1, M2 또는 reporgrammed-M2 macrophages(RM2)를 웰 당 2.5x105 세포 밀도로 각 웰에 첨가 하였다. 추가로 12 시간 동안 공 배양 된 세포를 배양 한 후, 세포 층을 200 μL 피펫 팁으로 긁어 내고 0시간 및 24시간에 CK40 배양 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 현미경 이미지를 취하기 전에 PBS로주의 깊게 세척하였다. 모든 실험은 4배수로 수행되었다.
튜브 형성 분석
96-웰 플레이트에서, 50 μl의 Matrigel(BD Biosciences)을 첨가하고 37℃에서 30분 동안 고체화시켰다. 이어서, SVEC4-10 내피 세포(ATCC　 CRL-2181TM(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)를 2x104 cells/100 ㎕의 밀도로 접종하고, 각각의 대식세포를 밀도 24 시간 후 CK40 배양 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 튜브의 형성을 포착하고 튜브 가지 수와 튜브 길이를 ImageJ 소프트웨어(NIH)로 분석 하였다.
실시예 1: Raw cell 대식세포(macrophage) 표현형 확인
본 발명자들은 Raw 264.7 대식세포로부터 M1 및 M2 대식세포의 분화 조건을 확립하였다. 일반적으로 M1 대식세포는 종양 공격성을 나타내어 항암 효과가 있는 것으로 알려졌고(M1 마커: iNOS), M2 대식세포는 암에 친화적인 종양 지지형 대식세포이며, TAM(tumor associated macrophage)이 대표적이다(M2 마커: CD206, Arginase).
Raw 264.7 대식세포주를 종양 공격형 세포인 M1 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 IFN-γ(40 ng/ml)을 48시간 동안 처리하였고 종양 지지형 세포인 M2 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 IL-4(20 ng/ml) 및 IL-13(20 ng/ml)을 48시간 동안 처리하였다.
그 결과, Raw 264.7 대식세포주로부터 M1 및 M2 대식세포로의 분화를 확인하였다(도 1).
실시예 2: Raw cell M1 엑소좀의 표현형 확인
본 발명자들은 Raw 264.7 대식세포주에서 분화한 M0, M1 및 M2 유래 엑소좀의 표현형을 관찰하였다.
구체적으로, Raw 264.7 대식세포주에 IFN-γ(40 ng/ml)을 48시간 동안 처리하여 M1 대식세포로 분화 또는 IL-4(20 ng/ml) 및 IL-13(20 ng/ml)을 48시간 동안 처리하여 M2 대식세포로 분화시킨 후 무혈청배지(serum-free media)에서 48시간 배양하여 엑소좀을 추출하였고 이에 대한 마커를 분석하였다. 먼저, 엑소좀을 포함하는 배양액에서 300 xg으로 10분, 2000 xg으로 10분 및 10,000 xg으로 30분간 순차적으로 원심분리를 하였고 상기 배양액을 0.22 μm 필터로 여과 후 70 Ti rotor(Beckman Instruments)를 이용하여 150,000 xg에서 3 시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)를 수행하였다. 이후 수득한 M1 유래 엑소좀은 단백질 분해효소 억제제(Roche)를 포함하는 PBS에 재현탁하였고 BCA 단백질 분석키트(Bio-Rad)를 이용하여 상기 분리된 엑소좀의 단백질 농도를 측정하였다. 엑소좀 단백질 동량(20 μg)을 SDS-PAGE로 분석하였으며, 나이트로셀룰로스 막(membranes)으로 전사시켰다. 그 후, 블랏에 항-iNOS 항체(1:500, Abcam, ab15323), 항-CD206 항체(1:500, Santa Crus, sc-34577) 및 항-Arginase 항체(1:500, Santa Crus, sc-18355)를 첨가한 후 4℃의 조건으로 하룻밤 동안 방치하였고, 항-Alix 항체(1:500, Santa Crus, sc-99010)를 엑소좀 마커(exosome marker)로 사용하였다. 그 후 상기 막에 HRP-결합된 2차 항체(1:4000, Sigma-Aldrich)를 첨가하였고 화학발광(chemiluminescence)에 의해 시각화되었다. 또한, 엑소좀의 크기 분포는 Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Ltd., UK)이용한 동적 광산란 분석법(dynamic light scattering, DLS)을 통하여 분석하였고 엑소좀 크기는 장비에서 제공된 소프트웨어를 이용하여 25℃조건으로 173ㅀ의 고정된 각도에서 수 비율(z-average)을 통해 분석하였다.
그 결과, M2 마커인 CD206 및 arginase는 검출되지 않았으나 M1 마커인 iNOS가 검출되었다(도 2). DLS 측정 시, M1 및 M2 대식세포의 엑소좀은 약 70 - 80 nm 크기로 측정되었다(도 3).
실시예 3: 마우스 골수 유래 대식세포(macrophage) 표현형 확인
본 발명자들은 BMDM(골수 유래 대식세포)으로부터 M1 및 M2 대식세포의 분화 조건을 확립하였다. 일반적으로 M1 대식세포는 종양 공격성을 나타내어 항암 효과가 있는 것으로 알려졌고(M1 마커: iNOS), M2 대식세포는 암에 친화적인 종양 지지형 대식세포이며, TAM(tumor associated macrophage)이 대표적이다(M2 마커: CD206, Arginase).
마우스 골수 유래 대식세포주(BMDM)의 M1 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 IFN-γ(20 ng/ml)와 LPS(100 ng/ml)을 48시간 동안 처리하였고 M2 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 IL-4(20 ng/ml)을 48시간 동안 처리하였다.
그 결과 BMDM(골수 유래 대식세포)으로부터 M1 및 M2 대식세포로의 분화를 확인하였다(도 2).
실시예 4: 마우스 골수 유래 대식세포 분화조건 확립 및 표현형 확인
본 발명자들은 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)의 분화 조건을 확립하기 위하여 도 4의 스케줄과 조건으로 M1 및 M2 대식세포로 분화시켰다. 상기 분화된 세포를 현미경으로 확인한 결과 M1 대식세포는 프라이드 에그(fried egg) 모양을 나타내었고 M2 대식세포는 프라이드 에그 형태 및 스핀들 형태 세포의 혼합군(mixed population)을 나타내었다(도 5). 또한, 상기 M1 및 M2 대식세포의 마커를 확인한 결과, 상처 치유(wound healing) 초기에 염증(inflammation)과 관련하여 세포외 기질(ECM)의 구축과 세포사멸(apoptosis)에 관여하며 종양 공격성을 나타내어 항암 효과가 있다고 알려진 M1 대식세포의 마커는 iNOS로 나타났고, 세포외 기질(ECM)의 재건과 세포 증식(proliferation) 및 혈관생성(angiogenesis)에 관여하며, 암에 친화적인 종양 지지형 대식세포로 알려진 M2 대식세포의 마커는 CD206 및 Arginase로 나타났다(도 6).
실시예 5: 마우스 골수 유래 대식세포 유래 엑소좀의 표현형 및 특성확인
본 발명자들은 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 분화한 M0, M1 및 M2 유래 엑소좀의 표현형을 관찰하였다.
구체적으로, 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)에 IFN-γ(20 ng/ml) 및 LPS(100 ng/ml)를 48시간 동안 처리하여 M1 대식세포로 분화 또는 IL-4(20 ng/ml)을 48시간 동안 처리하여 M2 대식세포로 분화시킨 후 무혈청배지(serum-free media)에서 48시간 배양하여 엑소좀을 추출하였고 이에 대한 마커를 분석하였다. 먼저, 엑소좀을 포함하는 배양액에서 300 xg으로 10분, 2000 xg으로 10분 및 10,000 xg으로 30분간 순차적으로 원심분리를 하였고 상기 배양액을 0.22 μm 필터로 여과 후 70 Ti rotor(Beckman Instruments)를 이용하여 150,000 xg에서 3시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)를 수행하였다. 이후 수득한 M0, M1 및 M2 유래 엑소좀은 단백질 분해효소 억제제(Roche)를 포함하는 PBS에 재현탁하였고 BCA 단백질 분석키트(Bio-Rad)를 이용하여 상기 분리된 엑소좀의 단백질 농도를 측정하였다. 엑소좀 단백질 동량(20 μg)을 SDS-PAGE로 분석하였으며, 나이트로셀룰로스 막(membranes)으로 전사시켰다. 그 후, 블랏에 항-iNOS 항체(1:500, Abcam, ab15323), 항-CD206 항체(1:500, Santa Crus, sc-34577) 및 항-Arginase 항체(1:500, Santa Crus, sc-18355)를 첨가한 후 4℃의 조건으로 하룻밤 동안 방치하였고, 항-Alix 항체(1:500, Santa Crus, sc-99010)를 엑소좀 마커(exosome marker)로 사용하였다. 그 후 상기 막에 HRP-결합된 2차 항체(1:4000, Sigma-Aldrich)를 첨가하였고 화학발광(chemiluminescence)에 의해 시각화되었다. 상기 엑소좀의 형태는 먼저, 샘플을 탄소 필름(Electron microscopy science)이 구비된 구리격자(copper grids)에 위치하였고, 아세트산 우라닐 용액을 이용하여 음성으로 염색하였으며, 투과전자현미경(Tecnai)을 이용하여 분석하였다. 또한, 엑소좀의 크기 분포는 Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Ltd., UK)이용한 동적 광산란 분석법(dynamic light scattering, DLS)을 통하여 분석하였고 엑소좀 크기는 장비에서 제공된 소프트웨어를 이용하여 25℃조건으로 173ㅀ의 고정된 각도에서 수 비율(z-average)을 통해 분석하였다.
그 결과, M1 및 M2 대식세포의 엑소좀에서 각각 M1 마커인 iNOS와 M2 마커인 arginase가 검출되었다(도 7). DLS 측정 시, M1 및 M2 대식세포의 엑소좀은 약 70 - 80 nm 크기의 구형으로 측정되었다(도 8 및 9).
실시예 6: 마우스 골수 유래 대식세포 유래 엑소좀의 사이토카인 분석
본 발명자들은 BMDM(골수 유래 대식세포)에서 분화시킨 M1 및 M2 대식세포로부터 엑소좀을 추출하였고 상기 엑소좀이 포함하고 있는 사이토카인(cytokine)을 분석하였다.
구체적으로 엑소좀이 포함하고 있는 사이토카인을 분석하기 위해, M1 및 M2 엑소좀 용해물(lysate) 30 ㎍을 사용하였으며, 사이토카인 어레이 키트(AAM-CYT-1)에서 제공된 실험방법을 활용하였다. 먼저, 여러 사이토카인에 대한 1차 항체가 결합되어 있는 막을 차단 완충액으로 상온에서 30분간 차단한 후, M1 및 M2 엑소좀 용해물 30 ㎍을 막에 처리하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 막에 바이오틴이 결합된 항체 칵테일을 처리하여 4℃에서 밤새 반응시킨 후, HRP-스트렙타비딘을 상온에서 2시간 반응시키고, 결과를 화학발광(Bio-Rad)에 의해 시각화하였다.
그 결과, 사이토카인 측정 결과, M1 엑소좀에서는 M1 대식세포가 T 세포를 충원(recruiting)할 때 관여하는 인자인 MIG과 RANTES의 발현이 M2 엑소좀에 비해 높은 것으로 나타났고(도 10), M2 엑소좀에서는 CXCL16, IL-2, IL-3β 등의 사이토카인의 발현이 M1 엑소좀과 비교하여 상대적으로 높게 나타났다(도 11).
실시예 7: M1 엑소좀을 이용한 M2 대식세포 리프로그래밍
본 발명자들은 M1 엑소좀(종양 공격형)을 M2 대식세포(종양 지지형)에 처리하여 M1으로의 리프로그래밍 여부를 분석하였다.
구체적으로, 무혈청배지에서 M1 엑소좀(40 ㎍)을 M2 대식세포에 처리 후 24, 48, 및 72시간 동안 배양하였다. 각 세포에서 용해 버퍼를 이용하여 세포 내 단백질을 추출하였으며, BCA 단백질 분석키트(Bio-Rad)를 이용하여 상기 추출된 세포의 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 동량(20 μg)을 SDS-PAGE로 분석하였으며, 나이트로셀룰로스 막(membranes)으로 전사시켰다. 그 후, 블랏에 항-iNOS 항체(1:500, Abcam, ab15323), 항-CD206 항체(1:500, Santa Crus, sc-34577) 및 항-Arginase 항체 1:500, Santa Crus, sc-18355)를 첨가한 후 4℃의 조건으로 하룻밤 동안 방치하였다. 그 후 상기 막에 HRP-결합된 2차 항체(1:4000, Sigma-Aldrich)를 첨가하였고, 이는 화학발광(chemiluminescence)에 의해 시각화되었다.
그 결과, M2 대식세포에 M1 엑소좀을 처리하면, 처리한 M1 엑소좀의 양이 증가함에 따라 M1 마커인 iNOS의 발현은 증가하고, M2 마커인 Arginase의 발현은 감소하는 것으로 나타났다(도 12). 또한, L929 세포 배양액으로 분화한 대식세포(M0) 및 M2 대식세포 미처리군에서는 M1 마커인 iNOS의 발현을 관찰하지 못했으나 L929 세포 배양액으로 분화한 대식세포 유래 M1 엑소좀을 24시간 동안 처리한 M2 대식세포 실험군의 iNOS 발현은 BMDM(M0) 실험군과 비교하여 급증한 것으로 나타났다(도 13). 뿐만 아니라, M-CSF로 분화한 대식세포에서 유래한 M2 대식세포 미처리군에서는 M1 마커인 iNOS의 발현을 관찰하지 못했으나 M-CSF로 분화한 대식세포에서 유래한 M1 엑소좀을 24시간 동안 처리한 M2 대식세포 실험군의 iNOS 발현은 급증한 것으로 나타났다(도 14).
구체적으로, 무혈청배지에서 M1 엑소좀(40 ㎍)을 M2 대식세포에 처리 후 24, 동안 배양하였다. 각 세포를 APC 항-mouse F4/80 항체(BioLegend, 123116), PE 항-mouse CD86 항체(BioLegend, 105008), FITC 항-mouse MHCⅡ 항체(BioLegend, 107605) 를 첨가한 후, 4℃에서 1시간 동안 염색하였고, 이는 AccuriTM C6 유세포 계측기로 분석하였다.
그 결과, M2 대식세포에 M1 엑소좀을 처리하면, M1 마커인 CD86, MHCⅡ의 발현이 M1 대식세포에서의 CD86, MHCⅡ의 발현량과 비슷한 수준으로 증가하는 것으로 나타났다(도 15).
실시예 8: 항 종양 효과
본 발명자들은 BMDM(골수 유래 대식세포)에서 분화시킨 M1 대식세포 유래 엑소좀을 종양에 처리하여 항-종양 효과를 관찰하였다.
구체적으로, 4T1 마우스 유방암 세포(1x106)를 면역 감응 BALB/c 마우스의 왼쪽 아래 유방에 이식한 후, 종양의 크기가 약 100 mm3에 도달한 시점(Day 7)에서 3일 간격으로 M1 엑소좀(100 ㎍)을 종양 내로 5번 주입하였고 대조군으로 PBS를 주입한 후 종양 성장을 관찰하였다. 또한, 상기 마우스 모델의 종양을 Day 25 시점에서 적출한 후 종양 무게 측정 및 면역조직화학염색(IHC)을 수행하였다.
그 결과, 종양의 성장은 대조군과 비교하여 M1 엑소좀을 투여한 실험군에서 감소하는 것으로 나타났으나(도 16), 대조군과 실험군의 몸무게는 시간에 따라 유사한 것으로 나타났다(도 17). 또한 종양의 무게도 M1 엑소좀을 투여한 실험군의 종양의 무게가 대조군과 비교하여 감소한 것으로 나타났다(도 18 및 19). 아울러, 면역조직화학분석(immunohistochemical assay)을 수행한 결과, M1 엑소좀을 처리한 종양 조직에서 상대적으로 iNOS(M1 마커, 갈색)의 발현이 높은 것을 확인하였다(도 20).
실시예 9: M1 대식세포 흡수 조건 확인
본 발명자들은 흡수(uptake)되는 엑소좀의 양과 세포 리프로그래밍과의 상관관계를 확인하기 위해 M1 대식세포에 M2 엑소좀을 농도별로(10, 25, 50, 100 ㎍/ml) 1 및 4시간 동안 처리한 후 흡수조건을 확인하였다. 그 결과, 엑소좀의 농도 및 처리 시간의 증가에 따라 흡수도 증가하는 것을 확인하였다(도 21 및 22).
실시예 10: M1 대식세포 리프로그래밍
본 발명자들은 상처 치유를 촉진하는 M2 대식세포의 엑소좀을 M1 대식세포에 처리하여 M2로 리프로그래밍 여부를 분석하였다. 먼저, 무혈청 배지(serum free media)에서 M1 대식세포에 상기 분리한 M2 대식세포의 엑소좀(50 ㎍)을 24, 48, 72, 및 96 시간 동안 1회 처리 그룹 및 48시간에 1회 추가 처리한 그룹으로 분류하였고 그 후 마커의 발현을 관찰하였다.
그 결과, M1 대식세포에 M2 대식세포의 엑소좀을 처리하면 M2 마커인 Arginase가 약 72시간 정도 유지되고 48시간에 1회 추가 처리한 그룹(2회 처리, 6 lane)은 96시간에도 발현이 유지 되는 것을 확인하였다(도 23).
실시예 11: 상처 치유 효과
본 발명자들은 상처 치유(wound healing) 동물모델을 이용하여 M1 및 M2 대식세포 유래 엑소좀 처리에 따른 상처 치유 효과를 관찰하였다. 먼저 마우스 상처 치유 모델을 제조한 후에 M1 또는 M2 대식세포 유래 엑소좀(100 ㎍/100 ㎕)을 처리한 그룹, PBS를 처리한 대조군, 아무것도 처리하지 않은 무처리군으로 분류하였고 4일 간격(4~20 day)으로 상처의 사이즈를 측정하였다. 또한, 상기 상처 치유 모델의 상처가 완전하게 치유된 마우스의 피부조직을 적출하여 면역조직화학(IHC) 분석을 수행하였다.
그 결과, 대조군과 비교하여 M1 대식세포 유래 엑소좀을 처리한 그룹의 상처 봉합(closure) 정도는 느리게 진행되었으나 M2 대식세포 유래 엑소좀을 처리한 그룹은 상처가 빨리 치유되는 것을 확인하였다(도 24 및 25). 또한 면역조직화학(IHC) 분석 결과, M1 엑소좀을 처리한 그룹과 비교하여 M2 그룹에서 상피세포(epithelial cell, 보라색 점)가 많이 집중되어 있는 것을 관찰하였다(도 26). 따라서 M2 대식세포 유래 엑소좀은 우수한 상처 치유 효과가 있는 것을 확인하였다.
실시예 12: 섬유아세포 이동 촉진
상처 치유 특성에 대한 재프로그램 된 M2 대식세포의 영향을 조사하기 위해, 시험 관내 섬유아세포 상처 봉합 능을 상처를 가한 후 재 프로그래밍 된 M2 대식세포를 포함하는 M1, M2 대식 세포와 함께 배양하여 분석 하였다. M2 대식세포로 배양 한 군은 섬유아세포 만 배양 한 군에 비해 현저한 상처 봉합률을 보였고, 재 프로그램 된 M2 대식 세포(RM2) 군도 M2 대식세포와 동일한 상처 폐쇄 율을 나타냈다(도 27 및 28). 재프로그램 된 M2 macrophages(RM2)에 의한 상처 치유와 matrix metalloproteinase-2(MMP2)와 같은 pro-protective factors의 발현을 상호 연관시키기 위해, MMP2의 발현 수준을 대식세포와 섬유아세포가 함께 배양 된 배지에서 측정 하였다. 상처 스크래치 분석 결과와 유사하게, MMP2의 발현은 M2 대식세포로 배양 된 군에서 가장 높았으며, 재 프로그래밍 된 M2 대식 세포로 배양 된 군은 유사한 발현 양을 나타냈다(도 29).
실시예 13: 튜브 형성 효과
상처 치유에 매우 관여하는 혈관 신생에서의 대식세포의 역할을 연구하기 위해, Matrigel 매트릭스 상에 내피 세포와 대식세포를 함께 배양함으로써 in vitro 튜브 형성 검정을 수행했다. M2 대식 세포로 치료 한 군과 재프로그램 한 M2 대식세포로 치료 한 군에서 내피 세뇨관 형성이 현저히 증가한 것을 보여 주었다. 또한, M1 대식 세포 처리 군에서, 관 형성은 전혀 처리되지 않은 대조군보다는 감소하는 경향이 있었다(도 30 및 31). 이들 대식세포의 혈관 신생 효과를 조사하기 위해 혈관 신생과 관련된 분비 된 성장 인자 인 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 발현 수준을 비교 하였다. 튜브 형성 결과와 유사하게, VEGF는 M2 대식 세포와 공 배양 된 군 및 재조합 된 M2 재조합 대식세포 군에서 증가하였고, M1 대식 세포로 처리 된 군에서 대조군보다 증가 하였다(도 32).
결론적으로 본 발명의 엑소좀 기반의 면역세포 교차분화 유도방법은 엑소좀을 이용한 직접교차분화를 통한 세포 리프로그래밍 기술로 현재까지 보고된 바가 없는 면역반응을 획기적으로 조절·통제할 수 있는 신기술로 생체 내에서 세포를 전환시켜 치료에 적용하는 근본적인 치료방법이다. 따라서 암 치료 외에 다양한 난치성 및 면역성 질환에 신개념의 생체 내 세포치료 플랫폼 기술로 활용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (31)

  1. 분화가 완료된 M1 대식세포, M2 대식세포 및 수지상 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 제2면역세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 상기 제2면역세포와 공통의 선조세포를 가지며 다른 유형으로 분화가 완료된 M1 대식세포, M2 대식세포 및 수지상 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 제1면역세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계를 포함하는, 상기 제1면역세포의 상기 제2면역세포로의 교차분화 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1면역세포는 M1 대식세포이고, 상기 제2면역세포는 M2 대식세포인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1면역세포는 M2 대식세포이고, 상기 제2면역세포는 M1 대식세포인, 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 M1 대식세포 또는 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포 또는 골수 유래 대식세포로부터 유래한 것인, 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 M1 대식세포 또는 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포 또는 골수 유래 대식세포로부터 유래한 것인, 방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 대식세포는 비극화 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것인, 방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 대식세포는 비극화 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제1면역세포는 상기 제2면역세포의 투여를 필요로 하는 개체로부터 분리된 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 상기 제2면역세포의 세포 배양물로부터 분리되는, 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 제2면역세포는 M1 대식세포이고 상기 개체는 항암치료를 필요로 하는 개체인, 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 제2면역세포는 M2 대식세포이고 상기 개체는 상처 치료를 필요로 하는 개체인, 방법.
  14. 하기를 포함하는 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포의 수지상 세포로의 교차분화 방법:
    이미 분화가 완료된 수지상 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    시험관 내에서 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포를 포함하는 세포집단에 상기 분리된 엑소좀으로 처리하는 단계.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 수지상 세포가 골수 또는 단핵구로부터 유래된 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 수지상 세포가 수지상 세포-유사 세포주인 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 수지상 세포-유사 세포주는 DC2.4, JAWSII, Thp-1, HL-60, U937, KG-1 또는 MUTZ-3인 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포는 수지상 세포의 투여를 필요로 하는 개체로부터 분리된 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 개체는 항암 치료를 필요로 하는 개체인, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 엑소좀은 수지상 세포의 배양물로부터 분리된 것인, 방법.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 하기를 포함하는 인간을 제외한 포유동물 개체의 상처 치료 방법:
    분화가 완료된 M2 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    치료적으로 유효한 양의 상기 분리된 엑소좀을 상기 개체에게 투여하는 단계
    (여기서, 상기 엑소좀은 상기 개체에서 M1 대식세포의 M2 대식세포로의 분화를 유도하고, 증가된 M2 대식세포의 기능에 의해 상기 개체의 상처 치유가 향상됨).
  27. 제26항에 있어서, 상기 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래 된 것인, 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 대식세포는 비극화 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것인, 방법.
  29. 제26항에 있어서,
    상기 엑소좀은 M2 대식구 배양물로부터 분리되는, 방법.
  30. 유효성분으로 M1 대식세포로부터 분리된 엑소좀 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  31. 유효성분으로 M2 대식세포로부터 분리된 엑소좀 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물.
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