CN114949224A - Nrp2激动剂在制备复发性流产治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及NRP2激动剂在制备复发性流产治疗药物中的应用。本发明证实了NRP2蛋白能够提高滋养细胞的迁移、侵袭能力及血管新生能力，有助于改善复发性流产等病理妊娠行为，提供了NRP2及其激动剂在制备复发性流产治疗药物中的应用前景。进一步的，本发明还证实了，M2exos中高表达NRP2蛋白，可能通过PI3K‑Akt信号通路调节滋养细胞的生物学行为，有望作为一种NRP2自体来源应用于RSA的治疗。

Description

NRP2激动剂在制备复发性流产治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于复发性流产治疗技术领域，具体涉及NRP2激动剂在制备复发性流产治疗药物中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

妊娠过程的建立和顺利进行受到多种因素的影响，其中母-胎界面免疫耐受状态的形成和维持是正常妊娠的关键因素，一旦免疫耐受微环境出现失调，则可能使胚胎遭受母体免疫细胞的攻击，从而导致不良妊娠甚至复发性流产(recurrent spontaneousabortion，RSA)的发生。在妊娠早期的母-胎界面存在大量来自母体的蜕膜免疫细胞，包括蜕膜自然杀伤细胞(dNK，70％)、蜕膜巨噬细胞(dMФ，20％-30％)、T细胞(10％-20％)及少量的树突状细胞等，这些免疫细胞在胚胎的发育和母胎局部免疫耐受微环境的建立和维持中发挥着重要的调控作用。dNK在妊娠早期呈现明显高表达，但在后期滋养层浸润发生时表现为广泛的凋亡。dMФ作为母-胎界面第二大类免疫细胞，其表达水平则在整个妊娠过程中一直维持着较为稳定的高表达。蜕膜巨噬细胞根据其功能和分泌的相关细胞因子主要分为经典活化型和选择性活化型。M1型巨噬细胞主要发挥促炎作用，可表达较高水平的IL-12和IL-23以及较低水平的IL-10，并诱导Th1免疫。而M2型巨噬细胞则表达较高水平的IL-10，较低水平的IL-12和IL-23，发挥抗炎作用。而母-胎界面的dMФ以M2型巨噬细胞为主，母胎免疫耐受状态的维持依赖于蜕膜M1、M2型巨噬细胞比例保持动态平衡，蜕膜巨噬细胞的异常极化则可能影响滋养细胞的侵袭及子宫血管重构等，最终导致流产的发生。

外泌体(exosome)作为细胞间交流的重要媒介，而且有研究发现，外泌体也可在母胎之间传递重要的信号分子，为胚胎的着床及发育造就适宜的宫内环境，但其中具体的调节机制目前还知之甚少。此外也有许多研究发现，巨噬细胞来源的外泌体可以通过传递生物分子至肿瘤细胞调控靶细胞基因的表达，进而影响肿瘤细胞侵袭、迁移及转移能力。鉴于蜕膜M2型巨噬细胞和滋养细胞在维持正常妊娠中的重要作用，以及外泌体可以作为独特的生物分子转运载体参与母体与胚胎间的信息交流。在母-胎界面微环境当中，外泌体也在胚胎植入及正常妊娠的维持中发挥重要作用。

神经纤毛蛋白2(neuropilins 2，NRP2)是NRP家族(NRPs)中的一个亚型，作为一种非酪氨酸激酶受体，在免疫系统及细胞迁移中具有重要作用，可介导肿瘤的淋巴管生成及肿瘤细胞淋巴管转移。同时NRP2作为内皮生长因子(VEGF)的受体，可参与调控新生血管的形成过程。研究显示，在肝癌、肺癌、结直肠癌等多种肿瘤细胞中NRP2呈现高水平表达，发挥促进肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移的作用。因此NRP2的表达水平往往与机体的疾病状态相关。然而NRP2在母胎调控中的作用尚鲜有报导，有待于进一步的探究。

发明内容

本发明通过体外研究手段，分析NRP2蛋白对滋养细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成的影响，进一步验证了M2型巨噬细胞的外泌体(M2 exos)通过补充NRP2蛋白从而实现对复发性流产的治疗作用。随后进一步采用高通量测序技术、生物信息学分析、qRT-PCR等实验技术重点探究NRP2调控滋养细胞生物学功能的具体分子机制，利用自然流产模型孕鼠验证了M2 exos对小鼠胚胎生长发育的影响。初步明确了NRP2能够促进滋养细胞中PODXL、SERPINE1、ANGPTL4等基因的表达从而调控滋养细胞的迁移、侵袭及血管生成。本研究为阐明独特的母胎调节和耐受机制提供了新的研究思路，并为复发性流产的诊疗方案的开发提供了新的靶点。

基于上述技术背景，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供NRP2激动剂在制备复发性流产治疗药物中的应用。

上述第一方面的应用中，所述NRP2激动剂为促进病灶部位NRP2表达含量提升的活性药物、酶或激素，还包括通过基因工程手段提升病灶部位NRP2表达量所涉及的试剂、试剂盒，所述基因工程手段包括但不限于质粒转染、慢病毒转染或工程菌株移植等。

另外，NRP2是一种多功能非酪氨酸激酶受体，可高表达于MФ、树突状细胞等多种免疫细胞中，第一方面又一种优选的实施方式中，还包括通过外源补充NRP2的方式提高病灶组织中NRP2的含量，所述外源补充方式包括但不限于获取MФ、树突状细胞等多种免疫细胞中的NRP2，通过口服、注射或介入等方式递送至病灶部位。

基于该技术思路，本发明进一步研究发现M2型巨噬细胞的外泌体中高表达NRP2，可作为NRP2的一种优质来源，即通过外源补充M2型巨噬细胞外泌体的方式提高病灶组织中NRP2的表达含量，因此，上述第一方面优选的技术方案中，还提供M2型蜕膜巨噬细胞和/或其外泌体在制备复发性流产治疗药物中的应用。在该优选的实施方式中，所述M2型巨噬细胞的外泌体可从血清样本或细胞培养液进行提取，所述提取方式包括但不限于聚乙二醇沉淀、磁珠免疫、超滤离心或试剂盒提取方式。

进一步的，所述病灶部位包括但不限于复发性流产患者的生殖细胞、组织或器官；更进一步的，所述病灶部位为胚胎外滋养层或滋养细胞。

本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中包括NRP2和/或NRP2激动剂。

优选的，所述药物组合物中，还包括药物上所必须的辅料；所述NRP2和/或NRP2激动剂作为药物组合物中的主要活性成分，其剂量占药物组合物总量的1％～99％；进一步的，为10％～90％。

优选的，所述药物组合物中，还包括其他复发性流产治疗药物，包括但不限于激素类或小分子化合物，具体的实例如黄体酮类药物、二甲双胍或溴隐亭等；上述活性药物联合使用的用药剂量，可通过本领域常规方式进行确定。

本发明第三方面，提供一种病理性妊娠治疗药物，所述药物中，NRP2和/或NRP2激动剂作为活性成分。

滋养细胞的迁移、侵袭及血管新生能力的不足会显著影响胚胎的着床及生长发育，导致病理性妊娠；本发明证实了，通过提高NRP2的含量可以有效提高滋养细胞的生物学功能，改善不良妊娠行为。第三方面优选的方案中，所述病理性妊娠包括但不限于复发性流产、子痫前期、妊娠期高血压、胎儿生长受限等。

本发明第四方面，提供一种复发性流产的治疗方法，所述治疗方法包括采用药物治疗或介入治疗等方式提高患者病灶组织中NRP2的含量。

优选的方案中，所述治疗方法包括提取患者自身血液、唾液、尿液、脑脊液或乳汁中的M2巨噬细胞来源的外泌体进行回输。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为NRP2蛋白表达的检测；

其中，图1A为M1、M2型巨噬细胞中NRP2的表达；

图1B为M1、M2型巨噬细胞外泌体对NRP2的表达的促进作用；

图1C为外泌体共培养的HTR-8、JAR细胞中NRP2的表达；

图2为NRP2敲除细胞模型的构建；

其中，图2A为NRP2敲除的THP-1细胞中，NRP2的表达情况；

图2B为M2型巨噬细胞相关标志物CD163、IL-10、TGF-β的表达；

图2C为Western blot实验检测提取的M2 exos和NRP2^KO-M2 exos中NRP2的表达；

图3为NRP2促进滋养细胞的迁移、侵袭及血管生成；

其中，图3A为Western blot实验检测M2 exos和NRP2^KO-M2 exos作用后的HTR-8和JAR细胞中NRP2的表达；

图3B为M2 exos和NRP2^KO-M2 exos作用后对HTR-8细胞迁移与侵袭能力的影响；

图3C为M2 exos和NRP2^KO-M2 exos作用后对JAR细胞迁移与侵袭能力的影响；

图3D为检测M2 exos和NRP2^KO-M2 exos作用后对HTR-8细胞血管生成能力的影响；

图4为M2 exos在孕鼠胎盘组织富集效果的检测；

其中，图4A为流式细胞术检测经IL-4+IL-13诱导的M2型巨噬细胞中CD206⁺的细胞比例；

图4B为Western blot检测外泌体表面标志蛋白CD9、CD63和TSG101的表达；

图4C为将小鼠M2 exos用DiI标记后经尾静脉注射至孕鼠；

图4D为荧光显微镜观察M2 exos在小鼠胎盘内的表达情况；

其中***代表P＜0.001；

图5为M2 exos对自然流产孕鼠的治疗作用；

其中，图5A为不同组孕鼠胚胎大小、重量和胚胎吸收的差异；

图5B为不同组小鼠胎盘组织中NRP2的表达；

数据统计为3次以上重复实验结果的均数±标准差；其中*代表P＜0.05；

图6为正常妊娠者及RSA患者绒毛组织NRP2表达的检测；

图7为M2 exos和NRP2^KO-M2 exos作用后HTR-8细胞的RNA-seq分析；

其中，图7A为差异基因火山图；

图7B为差异基因热图；其中横坐标为样本名称，纵坐标为筛选出来的差异表达基因；

图8为差异基因的功能富集及信号通路分析；

其中，图8A为GO功能富集分析结果图；

图8B为KEGG信号通路分析结果图；气泡颜色表示p值，p值越小，气泡颜色越近于黄色，表示富集越显著；气泡大小表示差异基因数量，气泡越大，差异基因数量越多；

图9为差异基因的验证；

其中，图9A为M2 exos和NRP2^KO-M2 exos作用后的HTR-8细胞中差异基因的表达情况；

图9B为M2 exos和NRP2^KO-M2 exos作用后的JAR细胞中差异基因的表达情况。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

一、实验材料

1.1标本采集

收集2019年9月至2021年9月于山东大学第二医院进行治疗的年龄在22岁-28岁之间的正常妊娠者与RSA患者绒毛组织。RSA患者纳入标准为发生连续不少于两次的自然流产，且排除染色体异常、子宫解剖结构异常、内分泌失调、血栓前状态、自身免疫性疾病、感染及恶性肿瘤等明确病因。所有组织样本取回后于液氮中速冻30分钟左右后置于-150℃冰箱中保存待用。本研究中的标本收集均已获得每个研究对象的知情同意且符合山东大学第二医院伦理委员会的标准。

1.2实验动物

本实施例中使用DBA/2雄鼠、CBA/J雌鼠和BALB/c雄鼠，均为8周龄。动物实验已经过山东大学第二医院伦理委员会批准。

二、实验方法

2.实验方法

2.1细胞培养

人滋养细胞系包括HTR-8/SVneo(HTR-8)、JAR，其中HTR-8细胞培养于含有10％FBS和1％青-链霉素混合液(含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的DMEM-F12培养基，JAR细胞培养于含有10％FBS和1％青-链霉素混合液的RPMI 1640培养基，人单核细胞THP-1和小鼠巨噬细胞RAW264.7(RAW)细胞培养于含有10％FBS的RPMI 1640培养基，HEK293T(293T)细胞培养于含有10％FBS和1％青-链霉素混合液的DMEM高糖培养基。细胞均培养于37℃含5％CO₂的细胞培养箱中。

2.2无外泌体血清制备

血清在4℃过夜融化后，置于超速离心管中并配平。使用超速离心的方法，4℃条件下，100000g离心4小时，将上清在无菌条件下经0.22μm滤器过滤，分装后放置于-20℃冰箱待用。

2.3巨噬细胞的诱导与培养

将THP-1细胞以5×10⁵/mL的密度接种于细胞培养板中，把50ng/mL佛波酯(PMA)加入THP-1细胞中培养24小时，获得未分化巨噬细胞(M0)。将M0进一步诱导，加入20ng/mLIFN-γ和50ng/mL LPS继续培养24小时，即诱导为M1型巨噬细胞；采用20ng/mL IL-4和20ng/mL IL-13继续培养24小时，即诱导为M2型巨噬细胞。

2.4流式细胞术验证巨噬细胞表型

(1)收集经IFN-γ和LPS、IL-4和IL-13处理后的M0巨噬细胞至流式管中，确保每管细胞悬液中的细胞数不少于2×10⁶。

(2)加入FITC标记的HLA-DR抗体5μL/管，混匀之后，于室温下避光孵育30分钟。

(3)向孵育完成后的流式管中加入3-4mL PBS充分混匀，1000rpm离心5分钟，弃上清。重复洗涤一次。

(4)加入100μL Fixation Buffer充分重悬细胞，于室温下避光孵育30分钟。

(5)孵育结束后，加入预先配好的2mL 1×Permeabilization Buffer，充分混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清。重复一次。

(6)用100μL 1×Permeabilization Buffer重悬细胞，充分混匀后，加入PE标记的CD206抗体5μL/管，于室温下避光孵育30分钟。

(7)孵育完成后，1mL 1×Permeabilization Buffer重悬细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清。重复洗涤2遍。

(8)加入300μL PBS完全重悬细胞，使用400目铜网对细胞悬液进行过滤后，流式细胞仪进行检测。

2.5外泌体提取

(1)将细胞于不含有外泌体的血清制备的完全培养基中培养2-3天，然后收集培养上清，3000g离心15分钟，以去除细胞碎片。

(2)将上清分多次加入100KD浓缩管中，每次在4℃条件下，5000g离心5分钟，反复离心至上清全部被浓缩。

(3)将获得的浓缩液转移到15mL离心管中，加入等体积的buffer XBP并混匀。

(4)将混合液转移至分离柱中，500g离心1分钟，待混合液全部通过分离柱后，5000g离心1分钟，去除分离柱膜上残留的液体。

(5)将8mL的buffer XWP加入到分离柱中，5000g离心5分钟。

(6)把分离柱中的内套管转移至新的50mL离心管中，加入300μL的buffer XE，室温孵育1分钟，500g离心5分钟，此时的液体即为外泌体悬液。

(7)再次将外泌体悬液经5000g离心5分钟，收集的液体即为最终所得的外泌体悬液。

(8)用BCA试剂盒检测提出来的外泌体浓度。分装后置于-80℃储存待用。

2.6外泌体鉴定

将获得的外泌体分别经透射电子显微镜及纳米粒度分析对其形态以及大小进行检测，Western blot检测外泌体标志物CD63、TSG101、CD9的表达。

2.7外泌体示踪实验

(1)将准备好的DiI染料与提取好的外泌体室温条件下避光孵育20分钟。

(2)孵育结束后，加入等体积的1％BSA溶液孵育5分钟，终止染色反应。

(3)将以上混合液经110000g离心2小时使外泌体浓缩，弃上清，用1mL PBS重悬沉淀将标记的外泌体洗一遍，再次110000g离心2小时对外泌体进行浓缩，弃上清，PBS重悬外泌体并用0.22μm滤器过滤。

(4)提前将HTR-8细胞接种于细胞爬片上。

(5)将DiI标记好的外泌体与HTR-8细胞共培养12小时后，加入多聚甲醛对细胞进行固定，避光固定20分钟。

(6)固定结束后弃去液体，用PBS洗两遍。并用DAPI标记细胞核，避光染5-8分钟。染色结束后用PBS洗两遍。

(7)用防荧光淬灭剂进行封片，使用激光共聚焦显微镜观察并拍照。

2.8细胞增殖实验

2.8.1 CCK8实验

(1)将细胞用胰酶消化下来，1000rpm离心5分钟，获得细胞沉淀，适量培养基重悬细胞。

(2)用细胞计数板对所制备的细胞悬液进行计数，然后每孔接种3000个细胞到96孔细胞培养板内，并加完全培养基补足至100μL，放入孵箱中继续培养。

(3)在培养一定的时间后(0、24、48、72小时)，吸去培养基，向每孔加入90μL PBS和10μL CCK-8试剂，注意避免在孔内产生气泡，否则会影响OD值的检测。

(4)将培养板在孵箱中避光孵育1小时后，使用酶标仪测定在450nm处的吸光度值。

(5)使用Graphpad软件对测得的OD值进行统计学分析，并绘制细胞生长曲线。

2.8.2 EdU实验

(1)在细胞生长至所需密度后，用胰酶消化细胞，进行计数后接种于96孔细胞培养板，每组至少设3个重复孔。

(2)用细胞完全培养基稀释EdU试剂(培养基：EdU试剂＝1000：1)，制成50μM的EdU工作液。

(3)每孔加入100μL 50μM的EdU工作液，孵箱中继续孵育2小时。

(4)孵育完后弃去培养基，用PBS洗涤孔中的细胞5分钟，重复三遍。注意动作轻柔，避免冲洗掉细胞。

(5)向每孔中加入100μL 4％多聚甲醛固定，室温孵育30分钟。

(6)弃去固定液，每孔加入100μL的甘氨酸(2mg/mL)，孵育5分钟。

(7)弃甘氨酸溶液，每孔加入100μL PBS，洗5分钟，弃PBS。

(8)向每孔中加入100μL 5％TritonX-100，增强细胞膜的通透性，孵育10分钟后，用PBS洗一次。

(9)配制染色反应液(现用现配)，并于30分钟内用完，配置的体系如下：

(10)每孔中加100μL染色反应液，在室温下避光孵育30分钟。

(11)弃去反应液，每孔中加100μL 5％TritonX-100，洗10分钟，重复三遍。

(12)每孔加入100μL DAPI染液进行核染色，室温下避光染10分钟。

(13)每孔加入100μL PBS，洗5分钟，重复两遍。

(14)用荧光显微镜进行观察拍照，建议染色完成后，立即进行观察；如果条件限制，应避光在4℃湿润环境下保存，但不应超过3天。

(15)使用Graphpad软件对所得实验结果进行统计分析。

2.9 Transwell实验

2.9.1细胞迁移实验

(1)将处于对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，1000rpm离心5分钟，PBS洗涤细胞沉淀，离心并弃上清。

(2)用无血清培养基重悬细胞，并进行计数。

(3)取含5×10⁴个细胞的细胞悬液加入Transwell的上层小室，并用无血清培养基补足至200μL。

(4)将500μL含10％FBS的完全培养基及相应的处理(上清或外泌体)加入下层小室，每组设3个复孔。

(5)将细胞培养板放入细胞孵箱中24小时后，将小室取出，用PBS清洗小室3次。加入甲醇固定30分钟。

(6)固定完成后用PBS洗3遍，再加入配置好的0.1％结晶紫染液染色30分钟。

(7)染色完成后，将染液弃掉，用棉签把上室擦干净并晾干。

(8)在显微镜下观察并随机至少选3个视野拍照，计数并进行统计分析。

2.9.2细胞侵袭实验

(1)进行实验之前，把基质胶置于4℃冰箱中充分融化待用。

(2)将液态的基质胶与无血清的纯培养基按照1：8的比例进行稀释，均匀铺至预冷的Transwell小室的上室中，注意此过程不要产生气泡。

(3)将铺好基质胶的小室放入细胞孵箱中静置1小时使其凝固。

(4)每个上层小室加5×10⁴个细胞，并用无血清培养基补足至200μL。

(5)下层小室加入500μL含10％FBS的完全培养基及相应的处理(上清或外泌体)。放入细胞孵箱培养48小时。后续步骤与细胞迁移实验一致。

2.10血管生成实验

(1)取50μL提前于4℃冰箱中融化好的基质胶，加入预冷的96孔板中，注意不要产生气泡。

(2)轻轻晃动使基质胶均匀的铺开，放入细胞孵箱中1小时左右待其凝固。

(3)将不同处理组的细胞经胰酶消化后，吹打制成细胞悬液。

(4)将细胞以2×10⁴个/孔加入96孔板中，每组设3个复孔。

(5)将细胞培养板放入细胞孵箱中继续培养，4-6小时后在显微镜下进行观察并拍照。并使用ImagJ软件对结果进行统计分析。

2.11 Western blot实验

2.11.1蛋白提取

(1)依据细胞量配制蛋白裂解液(RIPA：PMSF：PI＝100：1：1)。

(2)将待处理的细胞弃去培养基，PBS洗3遍，加入预先配好的蛋白裂解液，冰上裂解30分钟。

(3)待充分裂解后用细胞刮刀刮下细胞，移入1.5mL EP管中。

(4)于4℃离心机中，13000rpm离心30分钟。

(5)吸取上清液移至新的EP管中。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度后，加入一定体积的loading buffer，吹打混匀，在100℃金属浴加热10分钟。将制备好的蛋白样品置于-80℃储存备用。

2.11.2蛋白浓度测定

(1)将试剂A和试剂B按照50：1的比例进行混合，即为BCA工作液，注意需要现用现配。

(2)按照试剂盒步骤稀释标准蛋白液，分别稀释成浓度为0.5μg/μL、0.25μg/μL、0.125μg/μL、0.0625μg/μL加入到96孔板中，并用PBS补足至20μL。

(3)每孔分别加入200μL BCA混合液，置于37℃孵育30分钟。

(4)使用酶标仪检测在562nm波长下，各个孔的吸光度。

(5)依据标准品每个孔的吸光度值与已知的蛋白浓度，绘制拟合曲线，并将测得的样本孔的吸光度值代入，计算出相应的蛋白浓度。

2.11.3电泳

(1)将预先配好的SDS-PAGE凝胶固定在电泳槽中，把新配制的电泳液加入到电泳槽中，垂直将梳子拔掉。

(2)准备好蛋白样品。按照分组将蛋白样品加入相应孔中，在两侧加入4μL蛋白预染marker进行指示。

(3)在80V恒压下，电泳约20-30分钟后，观察到蛋白样品与蛋白预染marker进入分离胶时，将电压调整为120V，待蛋白样品与蛋白预染marker接近胶底部时终止电泳。

(4)根据目的蛋白分子的分子量大小，将PVDF膜裁剪成相应尺寸，并放入甲醇中浸泡1分钟激活。同时，准备好海绵、滤纸、转膜夹等。

(5)取出SDS-PAGE凝胶，按照白色夹板—海绵—滤纸—PVDF膜—凝胶—滤纸—海绵—黑色夹板的顺序固定好。注意避免并驱赶气泡。

(6)把转膜夹插入转膜装置内，倒入转膜液使转膜液没过凝胶。转膜的过程于冰上进行。

(7)转膜条件为200mA，根据不同蛋白的分子量差异确定转膜时间。

(8)转膜完成后，将PVDF膜放入5％脱脂奶粉或者5％BSA的封闭液中进行封闭，封闭1-2小时。

(9)将一抗和二抗按照抗体说明书进行相应的稀释。将封闭好的PVDF膜孵育上相应的一抗，4℃过夜。

(10)孵育结束后，用TBST洗3遍，每遍洗10分钟。

(11)洗完之后将膜放入相应的二抗中进行孵育，室温下孵育1小时。

(12)将孵育完二抗后的膜用TBST洗3遍，每遍洗10分钟。

(13)配制新鲜的ECL发光液(试剂A：试剂B＝1：1，注意避光且现用现配)，将膜的蛋白面朝上，用ECL发光液充分将膜覆盖，进行曝光并保存，以进行后续的分析。

2.12动物实验

2.12.1实验动物饲养

DBA/2雄鼠、CBA/J雌鼠和BALB/c雄鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养在山东大学第二医院无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级动物房中，饲养环境温度为25℃左右。雄性BALB/c与雌性CBA/J小鼠交配建立正常妊娠小鼠模型(normalpregnant mice，NP)，雄性DBA/2与雌雄CBA/J小鼠交配建立自然流产小鼠模型(abortionprone pregnant mice，AP)。4只雌性小鼠与1只雄性小鼠交配，每次实验确认2-3只雌性小鼠怀孕。在阴道栓出现后，即为妊娠第0.5天。妊娠第13天孕鼠被安乐死。通过小鼠胚胎大小，重量和坏死吸收外观确定胚胎流产的情况。

2.12.2 M2 exos处理孕鼠

经预实验确定好M2 exos的最适浓度后，将出现阴道栓的AP组孕鼠随机分成2组，一组孕鼠从妊娠第2天到第13天，每隔一天给予尾静脉注射M2 exos(20ng/天，溶于500μL的PBS)，对照组孕鼠同样经尾静脉注射PBS 500μL。于妊娠第13天处死孕鼠。根据小鼠胚胎大小，重量和坏死吸收外观统计胚胎流产的情况，并检测胎盘中NRP2的表达。具体分组如下：

①NP+PBS(500μL)组

②AP+PBS(500μL)组

③AP+M2 exos(20ng/天，溶于500μL的PBS)组

2.13统计分析

本实验数据使用GraphPad Prism 5.0软件进行分析与绘图统计图，计量资料以均数±标准差(mean±SD)来表示。组间差异使用独立样本t检验，P＜0.05时，代表差异有统计学意义。

三、研究结果

3.M2 exos通过NRP2调控滋养细胞功能

3.1 M2 exos中高表达NRP2并可将其传递至滋养细胞

通过蛋白质液相质谱技术分析M1 exos和M2 exos中的差异蛋白表达情况，并通过Western blot进行验证。检测结果如图1所示。根据Western blot实验验证结果，(A)M1、M2型巨噬细胞，(B)M1 exos、M2 exos，(C)与M1 exos/M2exos共培养的HTR-8、JAR细胞中差异蛋白NRP2的表达。从图1显示的结果中可以看出，M2 exos能够促进滋养细胞中NRP2的表达含量提升。

3.2 NRP2促进滋养细胞的迁移、侵袭及血管生成能力

为了验证了NRP2与滋养细胞生理活性之间是否存在相关性，该部分以THP-1巨噬细胞为研究模型，构建了NRP2敲除的THP-1细胞，通过图2A结果可以看出，NRP2敲除的巨噬细胞模型中，NRP2 mRNA水平显著降低。将NRP2敲除的THP-1细胞经IL-4+IL-13诱导极化为M2型巨噬细胞，qRT-PCR结果显示，经IL-4+IL-13诱导后仍能得到高表达CD163、IL-10和TGF-β的M2型巨噬细胞(图2B)。这证明敲除NRP2并不影响M2型巨噬细胞的极化。进一步提取NRP2敲除的M2型巨噬细胞外泌体(NRP2^KO-M2 exos)，Western blot实验验证NRP2蛋白的含量相比对照组显著降低(图2C)。

为了验证NRP2对滋养细胞中生理活性的影响，该部分分别采用M2 exos和NRP2^KO-M2 exos作用于HTR-8和JAR细胞，并检测上述细胞中NRP2的表达，及细胞迁移(图3B)、侵袭能力(图3C)、血管生成能力(图3D)的变化。

本实施例进一步通过设计NRP2的过表达质粒，转染滋养细胞系HTR-8和JAR细胞，成功构建NRP2过表达的细胞模型。在NRP2过表达的滋养细胞中，通过Transwell实验及血管生成实验结果同样发现，NRP2过表达的滋养细胞迁移、侵袭及血管生成能力明显增强。上述结果均表明，NRP2能够促进滋养细胞迁移、侵袭及血管生成。

4.动物体内实验验证M2 exos对小鼠胚胎发育的影响

4.1 M2 exos可富集于孕鼠胚胎及胎盘组织

将小鼠巨噬细胞样细胞系RAW264.7经IL-4+IL-13诱导为M2型巨噬细胞，流式细胞术检测诱导后的巨噬细胞中CD206+的细胞比例，结果显示CD206+的细胞比例显著增加，即说明鼠源M2型巨噬细胞诱导成功(图4A)。提取鼠源M2 exos，Western blot检测外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、TSG101均有表达，证明本实验成功提取出了鼠源M2 exos(图4B)。

将小鼠M2 exos用DiI标记后经尾静脉注射至孕鼠，通过活体动物成像观察M2exos在孕鼠体内的分布情况，如图4C所示，M2 exos可显著富集于孕鼠胚胎及胎盘组织中。取小鼠胎盘组织制作冰冻切片，经荧光显微镜观察M2 exos在小鼠胎盘内的表达情况，结果如附图4D所示。

4.2确定M2 exos和NRP2对自然流产孕鼠的治疗作用

建立自然流产小鼠CBA/J×DBA/2(abortion prone pregnant mice，AP)和正常妊娠小鼠CBA/J×BALB/c(normal pregnant mice，NP)模型。并设NP组、AP组及AP+M2 exos组。三组孕鼠在观察到阴道栓时记为妊娠第0.5天。从妊娠第2天开始，每两天一次经尾静脉注射M2 exos或PBS至孕鼠体内，于妊娠第13天处死孕鼠，取出胚胎。观察比较不同组胚胎大小及体重差异，计算胚胎吸收率。结果发现AP+M2 exos组小鼠胚胎吸收现象与AP组小鼠相比明显有所改善，胚胎丢失减少(图5A)。同时Western blot实验检测NP组、AP组及AP+M2 exos组小鼠胎盘中NRP2的表达。结果表明，与NP组小鼠相比，AP组小鼠胎盘NRP2的表达降低，而AP+M2 exos组小鼠胎盘中NRP2的表达较AP组小鼠胎盘明显升高(图5B)。以上结果说明，M2exos治疗后可以显著降低自然流产小鼠的胚胎吸收率，减少流产的发生，并且NRP2对于正常妊娠的维持也发挥了积极的作用。

5.检测正常妊娠者及RSA患者中NRP2的表达

收取正常妊娠者及RSA患者胎盘绒毛组织，提取蛋白后，经Western blot实验检测其中NRP2的表达情况(以β-actin为内参)，结果如图6所示。从图6中可以看出，RSA患者绒毛组织中NRP2含量相比正常妊娠者具有显著的降低。

6.NRP2影响滋养细胞功能的作用机制研究

6.1NRP2可影响滋养细胞中的基因表达

通过RNA-seq分析对M2 exos和NRP2^KO-M2 exos作用后的HTR-8细胞中相关基因的表达进行检测，检测结果如附图7所示。

6.2差异基因功能富集及相关信号通路分析

结合图7的分析，本实施例对M2 exos和NRP2^KO-M2 exos作用后的HTR-8细胞中差异基因进行了GO功能富集分析和KEGG信号通路分析，结果如图8所示。

6.3筛选及验证差异基因

以未经处理的HTR-8和JAR细胞为对照组，通过qRT-PCR检测M2 exos和NRP2^KO-M2exos作用后的HTR-8和JAR细胞中差异基因的表达情况，结果如附图9所示。实验至少重复3次，实验结果以均数±标准差表示。其中*代表P＜0.05,***代表P＜0.001，****代表P＜0.0001。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.NRP2激动剂在制备复发性流产治疗药物中的应用。

2.如权利要求1所述NRP2激动剂在制备复发性流产治疗药物中的应用，其特征在于，所述NRP2激动剂为促进病灶部位NRP2表达含量提升的活性药物、酶或激素，还包括通过基因工程手段提升病灶部位NRP2表达量所涉及的试剂、试剂盒，所述基因工程手段包括但不限于质粒转染、慢病毒转染或工程菌株移植等。

3.如权利要求1所述NRP2激动剂在制备复发性流产治疗药物中的应用，其特征在于，所述复发性流产治疗药物通过外源补充NRP2的方式提高病灶组织中NRP2的含量，所述外源补充方式包括但不限于获取MФ、树突状细胞等多种免疫细胞中的NRP2，通过口服、注射或介入等方式递送至病灶部位。

4.如权利要求3所述NRP2激动剂在制备复发性流产治疗药物中的应用，其特征在于，所述NRP2激动剂为M2型巨噬细胞的外泌体。

5.如权利要求4所述NRP2激动剂在制备复发性流产治疗药物中的应用，其特征在于，所述M2型巨噬细胞的外泌体从血清样本或细胞培养液进行提取，所述提取方式包括但不限于聚乙二醇沉淀、磁珠免疫、超滤离心或试剂盒提取方式。

6.如权利要求1所述NRP2激动剂在制备复发性流产治疗药物中的应用，其特征在于，所述病灶部位包括但不限于复发性流产患者的生殖细胞、组织或器官；更进一步的，所述病灶部位为胚胎外滋养层或滋养细胞。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括NRP2和/或NRP2激动剂。

8.如权利要求7所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中，还包括药物上所必须的辅料；所述NRP2和/或NRP2激动剂作为药物组合物中的主要活性成分，其剂量占药物组合物总量的1％～99％；进一步的，为10％～90％；

或，所述药物组合物中，还包括其他复发性流产治疗药物，包括但不限于激素类或小分子化合物，具体的实例如黄体酮类药物、二甲双胍或溴隐亭。

9.一种病理性妊娠治疗药物，其特征在于，所述药物中，NRP2和/或NRP2激动剂作为活性成分；

优选的，所述病理性妊娠包括但不限于复发性流产、子痫前期、妊娠期高血压、胎儿生长受限。

10.一种复发性流产的治疗方法，其特征在于，所述治疗方法包括采用药物治疗或介入治疗方式提高患者病灶组织中NRP2的含量；

优选的，所述治疗方法包括提取患者自身血液、唾液、尿液、脑脊液或乳汁中的M2巨噬细胞来源的外泌体进行回输。

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