FR2726005A1 - Lignees immortalisees de cellules endotheliales cerebrales et leurs applications au traitement de differents troubles ou maladies primaires et secondaires neurologiques ou psychiatriques - Google Patents

Abstract

Lignées immortalisées de cellules endothéliales cérébrales de mammifères, éventuellement modifiées, ainsi que leurs applications comme médicament à visée préventive ou curative et notamment pour le traitement de différents troubles ou maladies primaires et secondaires, neurologiques ou psychiatriques, y compris les tumeurs cérébrales et pour la stimulation de la croissance et la reproduction des animaux d'élevage. Procédé de préparation desdites lignées. Lesdites lignées de cellules endothéliales de mammifères, sont constituées par des cellules endothéliales cérébrales immortalisées, présentant au moins l'une des caractéristiques suivantes des cellules endothéliales cérébrales différenciées, de manière stable: l'expression de marqueurs endothéliaux, la sécrétion de substances vasoactives, l'expression de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), l'expression de récepteurs hormonaux, et l'existence de jonctions serrées, comprennent un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène de sélection, et un vecteur d'expression comprenant une séquence codant pour un polypeptide, une protéine ou un vecteur viral, éventuellement associé à au moins un gène de sélection et éventuellement au moins un gène marqueur et sont capables in vivo de s'intégrer aux vaisseaux cérébraux d'un mammifère hôte et de produire ledit polypeptide, ladite protéine ou ledit vecteur viral.

Description

La présente invention est relative à des li- gnées immortalisées de cellules endothéliales cérébrales de mammifères, éventuellement modifiées, ainsi qu'à leurs applications comme médicament à visée préventive ou curative et notamment pour le traitement de différents troubles ou maladies primaires et secondaires, neurologiques ou psychiatriques, y compris les tumeurs cérébrales.

Depuis quelques années, de nouvelles méthodes de traitement d'un certain nombre de troubles neurologiques, antérieurement considérés comme réfractaires à tous les traitements conventionnels, font appel à la thérapie génique. Ces nouvelles méthodes sont liées notamment aux progrès réalisés dans le domaine de la construction de vecteurs d'expression efficaces, de transporteurs de transgènes viraux et cellulaires et dans la caractérisation de cellules cibles appropriées à la thérapie génique du système nerveux.

Deux approches différentes sont essentiellement proposées, pour réaliser le transfert de gènes dans le système nerveux : une approche dite in vivo qui est concentrée sur le transfert direct du matériel génétique aux cellules in vivo, en utilisant des agents viraux et chimiques et une approche ex vivo, qui se caractérise en ce que le transfert génique est effectué dans des cellules en culture, qui sont ensuite implantées dans l'organisme hôte. Cette dernière approche comprend des étapes de manipulations moléculaires, de clonage et d'implantation des cellules, de manière à permettre la distribution des substances actives chez l'hôte (SUHR S.T. et al., Arch. Neurol., 1993, 50, 1252-1268).

De nombreux troubles neurologiques sont en rapport avec des lésions ou dysfonctions focalisées du système nerveux et ont donc été choisis pour tester ces techniques.

Les premiers essais, dans ce domaine ont essentiellement concernés des maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer ou la maladie de
Parkinson et comprennent la greffe intracérébrale de tissu neural foetal ou de tissu médullo-surrénalien dans le cerveau (BJÔRKLUND A., TINS, 1991, 14, 8, 319-322).

L'utilisation de tissus nerveux primaires d'origine foetale, pour la transplantation cellulaire en thérapie humaine est une source de nombreux problèmes éthiques et pratiques ; une alternative à ce problème est l'utilisation de lignées cellulaires primaires d'origine neurale (neurones, cellules gliales, astrocytes par exemple) ou de lignées cellulaires non neurales (fibroblastes, myoblastes, cellules chromaffines de la médulo-surrénale, hépatocytes, par exemple) (GAGE FH et al., Trends Neurosci., 1991, 14, 328-333). Bien que les lignées cellulaires de médullo-surrénale, de fibroblastes ou de myoblastes puissent effectivement libérer des substances actives in vivo, elles ne sont pas normalement présentes dans le système nerveux, peuvent modifier la fonction normale du système nerveux et entraîner une réaction de rejet.

Or, dans le but de traiter des troubles ou maladies neurologiques ou psychiatriques, y compris des tumeurs cérébrales, délimités ou non à une zone spécifique du cerveau, il est nécessaire de disposer d'un vecteur cellulaire qui puisse parfaitement s'intégrer au tissu nerveux, tout en exprimant, de manière stable, une substance bioactive, notamment une protéine.

En conséquence, les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à un vecteur cellulaire qui réponde mieux aux besoins de la pratique, notamment en ce qu'il exprime, de manière stable et in vivo, au moins un polypeptide ou une protéine, préalablement sélectionné ou un vecteur viral, en ce qu'il soit d'origine cérébrale, ca pable de s'intégrer à la vascularisation cérébrale normale et en ce qu'il soit bien toléré.

La présente invention a pour objet des lignées de cellules endothéliales de mammifères, caractérisées
en ce qu'elles sont constituées par des cellules endothéliales cérébrales immortalisées, présentant au moins l'une des caractéristiques suivantes des cellules endothéliales cérébrales différenciées, de manière stable
- l'expression de marqueurs endothéliaux,
- la sécrétion de substances vasoactives,
- l'expression de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH),
- l'expression de récepteurs hormonaux, et
- l'existence de jonctions serrées,
en ce qu'elles comprennent un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène de sélection, et un vecteur comprenant une séquence codant pour un polypeptide, une protéine ou un vecteur viral, éventuellement associé à au moins un gène de sélection et éventuellement au moins un gène marqueur et
en ce qu'elles sont capables in vivo de s'intégrer aux vaisseaux cérébraux d'un mammifère hôte et de produire ledit polypeptide, ladite protéine ou ledit vecteur viral.

Selon un mode de réalisation avantageux desdites lignées, le fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène contient le gène de la résistance à la néomycine et un fragment de l'oncogène T de SV40.

Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites lignées, le fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène contient la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine.

Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites lignées, le vecteur est un vecteur rétroviral, notamment un vecteur MFG.

De manière préférée, le vecteur rétroviral est un vecteur MFG-NB défectif pour la réplication.

Lesdits vecteurs sont notamment décrits dans
MULLIGAN et al. (Proc. Nat. Ac. Sci. USA, 1984, 81, 63496353) et Ferry et al. (Proc Natl Acad.Sci. USA, 1990, 88, 8377-8381).

Egalement de manière préférée, lesdites cellules endothéliales sont des cellules de capillaires cérébraux.

Des essais mettant en oeuvre des cellules endothéliales primaires vasculaires non immortalisées périphériques ont été décrits, mais ne constituent pas un vecteur approprié, en ce qu'elles ne constituent pas une source pure, homogène et suffisante, en vue d'une application reproductible aux transplantations et en ce qu'elles ne présentent pas le phénotype endothélial cérébral.

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux desdites lignées cellulaires, la séquence codant pour un polypeptide ou une protéine est sélectionnée parmi les séquences codant pour : des enzymes, telles que des protéases, des inhibiteurs d'enzymes, tels que des inhibiteurs de protéases, des cytokines, des neurotransmetteurs, des neurotrophines, des facteurs de croissance, des toxines, des antimétabolites, des neurohormones, des gangliosides, des antibiotiques, des facteurs thrombolytiques, des facteurs coagulants, des facteurs vasodilatateurs ou vasoconstricteurs, des facteurs hypo- ou hypercholestérolémiants, des facteurs hyper- ou hypoglycémiants ou toute autre substance d'intérêt.

Conformément à l'invention, lesdites cellules endothéliales comprennent avantageusement, en tant que fragment immortalisant, la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine et en tant que vecteur d'expression, un vecteur rétroviral MFG-NB contenant le gène nls-lacZ codant pour la -ga- lactosidase. Cette lignée cellulaire a été dénommée RBEZ par les Inventeurs.

Conformément à l'invention, ladite lignée a été déposée sous le nO I--1481 en date du 10 octobre 1994 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.

Egalement conformément à l'invention, lesdites cellules endothéliales comprennent avantageusement, en tant que fragment immortalisant, la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine et en tant que vecteur, un vecteur rétroviral pMoMuLVisisNGF codant pour le 5-NGF murin.

Cette lignée cellulaire a été dénommée
RBE/NGF-4 par les Inventeurs.

Conformément à l'invention, ladite lignée a été déposée sous le nO I-1482 en date du 10 octobre 1994 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.

De manière inattendue, de telles cellules endothéliales de capillaires cérébraux s'intègrent bien à la vascularisation cérébrale, sont très bien tolérées et libèrent, in vivo, sur une longue période, la substance active qu'elles expriment et trouvent application à la préparation d'une composition pour le traitement des troubles ou maladies primaires et secondaires neurologiques ou psychiatriques, y compris les tumeurs cérébrales ou pour stimuler la croissance et la reproduction des animaux d'élevage (volailles, ovins, bovins, porcins, équidés, lagomorphes, rongeurs etc...).

En particulier, dans le noyau basal et dans le striatum, de nombreuses cellules endothéliales greffées conformes à l'invention adoptent une localisation vasculaire. Dans les deux sites d'implantation un nombre non négligeable de cellules greffées ne sont pas associées au réseau vasculaire de l'hôte. Cette localisation non vasculaire n' entraîne pas une exacerbation de la mort cellulaire et ceci encore à 8 semaines après l'implantation.

Conformément à l'invention, le vecteur viral est avantageusement un cytomégalovirus (CMV) modifié (vecteur viral intégratif).

La présente invention a également pour objet des compositions, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une lignée de cellules endothéliales cérébrales conformes à l'invention, associée à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

De telles compositions contiennent de préférence entre 104 et 105 cellules endothéliales/l.

De telles compositions peuvent être avantageusement administrées par voie intracrânienne, voie souscutanée, voie intra-cérébroventriculaire, voie subdurale, voie veineuse ou artérielle (intracarotide, par exemple), voie intramusculaire, voie intrathécale.

Conformément à l'invention, lesdites cellules endothéliales peuvent être des cellules de même espèce que l'hôte (allogreffe ou homogreffe) ou d'espèce différente (xénogreffe).

La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une lignée cellulaire modifiée conforme à l'invention, lequel procédé est caractérisé en ce que:
(1) on réalise une première transfection par
- culture de cellules endothéliales cérébrales, de préférence de microvaisseaux cérébraux, dans un milieu de culture convenable, supplémenté en sérum et en facteurs de croissance,
- transfection desdites cellules entre le 2ème et le 6ème passage avec un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire et éventuellement au moins un gène de sélection, notamment un gène codant pour la résistance à un antibiotique,
- sélection des cellules transfectées sur un milieu de sélection adapté audit gène de sélection, si nécessaire,
(2) puis on réalise une transfection des cellules obtenues en (1) avec un vecteur contenant la séquence de polypeptide ou de protéine à produire ou un vecteur viral à exprimer.

De manière préférée, la transfection de l'étape (2) est réalisée avec un vecteur rétroviral dans lequel la séquence codant pour la protéine à exprimer a été préalablement incorporée.

De manière préférée, l'étape (1) permet d'obtenir des cellules RBE4, immortalisées par transfection avec un plasmide contenant la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine sous contrôle du promoteur SV40, qui sont déposées sous le nO I-1142 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) tenue par l'Institut Pasteur.

La présente invention a également pour objet un modèle d'étude de l'intégration cérébrale de cellules vectrices de substances actives, au niveau du cerveau, caractérisé en ce qu'il comprend une lignée cellulaire
REBZ, conforme à l'invention.

La présente invention a également pour objet un modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques et cellulaires de la barrière hémato encéphalique in vitro, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire conforme à l'invention.

La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de production d'un polypeptide ou d'une protéine, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre d'au moins une lignée de cellules endothéliales conforme à l'invetion, dans un bioréacteur convenable.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels
- la figure 1 illustre le prémarquage des cellules RBE4, avant la transplantation par le colorant nucléaire HOECHST 33342 (bisbenzimide)
- la figure 2 illustre la visualisation des cellules prémarquées au colorant Hoechst, après transplantation dans le cerveau de rat adulte
- la figure 3 illustre l'étude de l'intégration morphologique et fonctionnelle des cellules
RBEZ par visualisation de l'expression du transgène nls- lacZ et du marqueur antigénique d'intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE), 1'EBA (endothelial barrier antigen)
- la figure 4 illustre l'étude in vitro de l'expression du transgène NGF dans les cellules RBE/NGF, par hybridation in situ
- la figure 5 illustre l'étude in vivo de l'expression du transgène NGF dans les cellules RBE/NGF, trois semaines après transplantation dans le nucleus basalis (noyau basal)
- la figure 6 illustre les structures cérébrales témoins utilisées comme contrôle interne de l'hybridation in situ du messager NGF, in vivo
- la figure 7 illustre l'effet biologique du
NGF sécrété par les cellules RBE/NGF, trois semaines après la greffe, au niveau du nucleus basalis ;;
- la figure 8 illustre l'effet biologique du
NGF sécrété par les cellules RBE/NGF, trois semaines après la greffe, à distance du nucleus basalis
- les figures 9 et 10 illustrent la stimulation du bourgeonnement axonal de cellules PC12, obtenue à partir du surnageant des cellules RBE/NGF, in vitro
- la figure 11 illustre l'identification du gène nls-LacZ dans des tumeurs implantées avec des cellules RBEZ, par PCR
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Préparation des cellules endothéliales cérébrales inortalisées RBE4.

Des cellules endothéliales de microvaisseaux de cerveaux de rats (culture primaire) sont immortalisées par transfection avec le plasmide pElA-néo, contenant la séquence codant pour l'adénovirus E1A, suivie par le gène de résistance à la néomycine.

Un clone, dénommé RBE4, a été ainsi obtenu et ses caractéristiques sont en particulier décrites dans la
Demande PCT WO 93/06222 ainsi que dans les articles parus dans J. Cell. Physiol., 1993, 155, 104-111 et J. Cell.

Physiol., 1994, 159, 101-113. Ce clone a été déposé sous le nO I-1142 à la Collection Nationale de Cultures de
Micro-organismes (CNCM).

Pour réaliser la transfection, la technique de co-précipitation au phosphate de calcium a été utilisée, comme décrit dans la Demande PCT WO 93/06222 et rappelé ci-après : la transfection desdites cellules est réalisée au 5ème passage avec le plasmide précité (10 Rg) conte nant, outre la région précoce E1A du génome de ladénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine, le promoteur SV40.

Cette transfection a lieu après mise en culture de ces cellules dans des boîtes recouvertes de collagène, contenant un milieu a-MEM/F10 (2/3 ; 1/3), supplémenté en sérum de veau foetal (SVF) à 10 %, en FGFb 1 ng/ml, en glutamine (2 mM) et en pénicilline/streptomycine. La lignée cellulaire obtenue possède certaines des caractéristiques des cellules endothéliales cérébrales ; elle possède notamment un phénotype non transformé . inhibition de contact, prolifération dépendant des facteurs de croissance et d'adhérence, expression de marqueurs de différenciation endothéliales (antigène apparenté au facteur VIII), site de liaison à l'agglutinine de Griffonia simplicifolia et non-tumorigénicité chez les souris Nude.

De plus, ces cellules sont stimulées par les astrocytes pour exprimer les marqueurs enzymatiques spécifiques de la barrière hémato-encéphalique, à savoir, la 7-glutamine transférase et la phosphatase alcaline.

ZXzMPLI 2 : Préparation des cellules endothéliales cérébrales RBEZ.

Les cellules RBE4 obtenues à l'exemple 1 sont soumises à deux passages par semaine, sur un milieu a
MEM/F10 (1/1 ; Seromed, France), supplémenté en glutamine 2 mM, sérum de veau foetal à 10 %, FGFb 1 ng/ml et G418 300 Rg/ml.

Elles sont étalées à une densité de 10' cellules/cm2 sur des boîtes recouvertes de collagène et utilisées entre les passages 30 et 60.

1) Préparation du vecteur rétroviral
Un vecteur MFG-NB, défectif pour la réplication, et contenant le gène lacZ est obtenu par insertion de la séquence codant pour la ss-galactosidase d'E. coli, fusionnée à une séquence codant pour la séquence de localisation nucléaire (nls) de 21 aminoacides, issue de l'antigène T de SV40 (Kalderon D. et al., Cell, 1984, 39, 499-509). Ce vecteur MFG-NB nls-lacZ est introduit dans des cellules productrices de rétrovirus W-2 (Mulligan et al., précité) (infection rétrovirale recombinante de -2) et permet d'obtenir des lignées cellulaires -2-MFG-NB.

Ces cellules productrices de rétrovirus sont étalées en boîte à une densité de 106 cellules pour des boîtes de 100 mm de diamètre, dans 7 ml d'un milieu RPMI 1640, supplémenté en sérum de veau foetal à 10 %.

Après 24 h, un volume de 6 ml de milieu contenant le virus est filtré et utilisé pour l'infection ou bien stocké à 800C jusqu'à son utilisation.

2) Infection des cellules endothéliales RBE4
Les cellules RBE4 sont étalées sur boîte à une densité de 10' cellules/cm2 et après 24 h, le virus (3 ml) est ajouté en présence de polybrène (10 Fg/ml) pendant 2 h.

Après une autre période de 24 h dans un milieu complet, les cellules RBE4 sont repiquées et réinfectées dans les mêmes conditions.

3) Sélection des cellules endothéliales expri- mant le transaène
Les cellules exprimant la ss-galactosidase (cellules RBEZ) sont triées par FACS (fluorescent activated cell sorting ; NOLAN et al., PNAS, 1988, 85, 26032607), en utilisant, comme substrat de l'enzyme, la ss-D- galactopyranoside fluorescéine (FDG).

Conformément à cette technique, 106 cellules
RBEZ dans 100 Fl, sont incubées à 370C pendant 5 min, dans un tube en polystyrène de 5 ml, avant l'addition de 100 Fl de FDG (2 mM).

Après mélange, les cellules sont placées à nouveau à 370C pendant 1 min, puis sur de la glace, et le volume est ajusté à 2 ml.

4) Détection de l'expression du transgène par visualisation de l'activité enzymatique de la ss-aalacto- sidas à l'aide d'un substrat chromogène le X-gal.

Protocole
L'activité enzymatique est détectée par incubation des cellules à 370C, dans un tampon PBS contenant du 5-bromo- 4 -chloro-3-indolyl-ss-D-galactopyranoside (X- gal) 2 mM, du ferricyanure de potassium 20 mM, du ferrocyanure de potassium 20 mM et du MgCl 2 mM.

Résultats
La présence d'une activité enzymatique B-ga- lactosidase se révèle par la formation d'une coloration bleue. Environ 50-80% des cellules endothéliales RBE4 infectées par le rétrovirus se colorent en bleu lors de l'histochimie, mais le niveau de coloration varie d'une cellule à l'autre. Les cellules RBE4 témoins (non infectées) ne sont pas colorées, dans les mêmes conditions.

5) ProDriétés des cellules RBEZ in vitro
- Les cellules RBEZ obtenues sont cultivées sur un support recouvert de collagène dans un milieu a
MEM/F10, supplémenté en sérum de veau foetal à 10 %, glutamine 2mM, FGFb 1 ng/ml et G418 300 Rg/ml.

Ces cellules présentent une inhibition de contact et une prolifération dépendant des facteurs de croissance et d'adhérence ; elles expriment, en outre, des marqueurs de différenciation endothéliale.

EXEMPLE 3 : Préparation des cellules endothéliales cérébrales RBE/NGF.

Les cellules RBE4 obtenues à l'exemple 1 sont soumises à deux passages par semaine, sur un milieu a
MEM/F10 (1/1 ; Seromed, France), supplémenté en glutamine 2 mM, sérum de veau foetal à 10 % et FGFb 1 ng/ml et G418 300 Rg/ml.

Elles sont étalées à une densité de 10' cellules/cm2 sur des boîtes recouvertes de collagène et utilisées entre les passages 30 et 60.

1) PréDaration du vecteur rétroviral
On procède comme à l'exemple 2, en utilisant un vecteur rétroviral pMoMuLVisisNGF, déficient pour la réplication et dans lequel la séquence codant pour le B-
NGF de souris est insérée (Scott J et al., Nature, 1983, 302, 538-540) . Ce vecteur, introduit dans des cellules productrices -2, permet d'obtenir des lignées cellulaires -2-MoMuLVisisNGF.

2) Infection des cellules endothéliales RBE4
On procède comme à l'exemple 2.

3) Sélection des cellules endothéliales exprimant le transaène par une méthode ELISA bi-site
A la suite de sous-clonages des cellules RBE4 infectées par la méthode des dilutions limites, les sousclones sécrétant du BNGF (cellules RBE/NGF) sont identifiés en utilisant un ELISA bi-site (KORSCHING et THOENEN, 1983 ; LADENHEIM et al., 1993).

De manière plus précise, un anticorps monoclonal anti-ssNGF, dénommé 27/21 (0,1 mg/ml dans un tampon carbonate 0,05 M pH 9,6), est appliqué sur des plaques
EIA/RIA Costar pendant 2 heures à 370C. Les plaques sont lavées 3 fois avec un mélange de Tris HCl 50 mM, pH 7,4,
NaCl 200 mM, CaCl2 10 mM, Triton X-100 à 0,1 %, et azoture de sodium à 0,05% et incubées à 40C pendant une nuit dans un milieu conditionné ou des standards pNGF (30-1000 pg/ml) dans le même tampon supplémenté avec de la sérum albumine bovine à 1%.

Après lavages, le NGF est détecté à l'aide du même anticorps conjugué à la -D-galactosidase (400 mU/ml), après incubation pendant 4 heures à 370C. Le substrat chromogénique est du chlorophénol-rouge-ss-galac- topyranoside (1 mg/ml dans un milieu Hepes 100 mM, pH 7,
NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM, azoture de sodium 0,1%).

L'absorbance à 570 nm est lue après 2 heures à 370C. Deux sous-clones hautement positifs dénommés RBE/NGF-2 et -4 sont sélectionnés, ainsi que deux sous-clones moins positifs, et ce parmi 94 clones testés.

4) Détection cellulaire de la synthèse de NGF par hybridation in situ du NGF.

Une hybridation in situ est réalisée avec une sonde de 48 mers, antisens et spécifique du BNGF, correspondant aux positions 897-944 de la séquence d'ADNc du ssNGF de souris (SCOTT et al, 1983, Nature 302, 538-540), de formule suivante
48 mer antisens 5' - 3' NGF mature
5' CTG CTT CTC ATC TGT TGT CAA CGC CTT GAC GAA
GGT GTG AGT CGT GGT 3', de manière à visualiser le transcrit NGF dans les cellules infectées, en culture. Ces résultats montrent une expression importante d'ARNm du ssNGF dans les cellules infectées, à un niveau variable, d'une cellule à l'autre.

La figure 4 illustre l'étude in vitro de l'expression du transgène NGF dans les cellules RBE/NGF, par hybridation in situ.

La visualisation immuno-enzymatique de l'expression du transgène NGF est réalisée à l'aide d'une sonde oligonucléotidique antisens spécifique du NGF murin, marquée à la digoxigénine. Dans ces conditions, les hybrides ARNm/sonde NGF sont révélés par un anticorps anti-digoxigénine couplé à la phosphatase alcaline, dont la réaction enzymatique avec le complexe de substrats
NBT-BCIP, produit un précipité noirâtre. La figure 4A montre un signal intense dans les cellules RBE/NGF en culture, indiquant un fort niveau d'expression du transgène NGF. En 4B, l'absence de positivité dans les cellules RBE4 témoins, non-infectées est observée (x300 en 4A et 4B) (4B en contraste de phase).

4) Activité in vitro du NGF sécrété
L'activité biologique du NGF sécrété dans le surnageant des cellules RBE/NGF est mise en évidence par la propriété de promouvoir un bourgeonnement des neurites des cellules PC12 de phéochromocytome de rat. Pour réaliser ce test, les cellules RBE/NGF sont étalées sur boîtes à une densité de 10'/cm2 dans des boîtes de 100 mm de diamètre et la croissance est réalisée pendant 3 à 4 jours jusqu'à confluence (10 cellules/boîte). Le milieu est changé (10 ml) et les surnageants sont collectés après 24 heures.Les résultats sont illustrés aux figures 9 et 10, qui montrent que le surnageant cellulaire de 24 heures se comporte de la même manière que du NGF purifié (0,1-50 ng/ml), utilisé comme standard interne et conduit à une stimulation du bourgeonnement neuritique chez environ 65% des cellules PC12. En outre, une dilution au 1:40 dudit surnageant présente une activité biologique comparable à du NGF à 0,4 ng/ml (40% de cellules porteuses de neurites). En conséquence, la capacité de sécrétion de NGF biologiquement actif par les cellules RBE/NGF peut être estimée à 16 ng/106cellules/24 heures.

Ces figures 9 et 10 comportent en abscisse, la concentration en NGF (ng/ml) (figure 9) ou le taux de dilution (figure 10 ; courbe 1 : cellules RBE/NGF et courbe 2 : cellules RBE4) et en ordonnée, le pourcentage de cellules portant des neurites.

exemple 4 Implantation cérébrale des cellules
RBE4, RBEZ et RBE-NGF.

I. Cellules RBE4 : survie et intéaration.

Pour la caractérisation des lignées cellulaires RBE4 transplantées dans le cerveau de rat adulte, une méthode de prémarquage au bisbenzimide Hoechst est utili sée, pour suivre les cellules greffées (GANSMULLER et al., 1991, 4, 580-590).

La figure 1 illustre le prémarquage des cellules RBE4, avant la transplantation, par le colorant nucléaire HOECHST 33342 (bisbenzimide). Les cellules en suspension sont visualisées en microscopie à fluorescence, sous lumière ultra-violette. La fluorescence du colorant définit clairement les noyaux cellulaires positivement marqués (x270).

Trois à huit semaines après implantation des cellules RBE4 marquées, dans différentes régions du cerveau (substance grise et substance blanche), le greffon a un aspect compact avec un étalement faible et constant de certaines cellules RBE4, autour de sa masse.

Cette migration se fait essentiellement le long du réseau vasculaire de l'hôte, suggérant une interaction préférentielle entre les cellules endothéliales implantées et les éléments vasculaires de l'hôte.

Les colorations histologiques des cerveaux ainsi greffés montrent un minimum de signes de cellules nécrotique, et ce essentiellement durant la première semaine qui suit le traumatisme chirurgical dû à la transplantation.

A l'intérieur du greffon, la densité cellulaire est homogène (peu ou absence de cellules pycnotiques). L'immunoréactivité GFAP (glial fibrillary acidic protein), caractéristique des astrocytes, est importante, même 8 semaines après l'implantation, aussi bien autour du greffon que dans le greffon lui-même, indiquant une infiltration d'astrocytes dans ce dernier.

De manière inattendue, les cellules RBE4 implantées migrent et s'intègrent à l'environnement vasculaire avec quelquefois une participation directe au réseau vasculaire de l'hôte.

Les figures 2A, 2B et 2C montrent les cellules prémarquées au colorant Hoechst, après transplantation dans le cerveau de rat adulte. La figure 2A montre une vue générale de la zone de greffe dans le parenchyme cérébral. Les cellules endothéliales greffées fluorescentes semblent s'accumuler préférentiellement autour d'éléments vasculaires du cerveau hôte. Les astérisques matérialisent le trajet d'un vaisseau sanguin (x250). Les figures 2B et 2C montrent un vaisseau sanguin à fort grossissement, situé dans la zone d'implantation du greffon. En 2B, de nombreuses cellules RBE4 Hoechst positives intégrées en position luminale (flèches) et périvasculaire peuvent être observées. En 2C, ce même vaisseau est immunomarqué par un anticorps anti-laminine (marqueur spécifique des vaisseaux sanguins) (x600).

II. Cellules RBEZ : survie. intégration et ex expression du transaène.

1) Prémarquage des cellules au bisbenzimide
Hoechst.

Voir I.

2) Préparation des cellules avant leur implantation.

Juste avant la procédure de greffe, les cellules sont rincées trois fois dans une solution de greffe comprenant du PBS supplémenté en MgCl2 et CaCl à 1 Rg/ml et en glucose à 0,1%, de manière à éliminer le milieu
DMEM-SVF.

3) Chirurgie et implantation des cellules.

Des rats adultes mâles, appartenant à la souche Lewis et pesant 300 g, reçoivent une greffe de cellules RBEZ prémarquées, comme précisé en 1), sous anesthésie profonde, dans des conditions stéréotaxiques (cadre stéréotaxique Kopf atlas du cerveau de rat de Paxinos).

Vingt animaux reçoivent respectivement une implantation stéréotaxique, dans le noyau basal, de cellules RBEZ (hémisphère cérébral droit) et de cellules contrôles RBE4 (hémisphère cérébral gauche).

Un total de 300.000 cellules mises en suspen sion dans une solution de greffe (3 1) ) est injecté par site à l'aide d'une micro seringue de 10 pl Expires ayant un diamètre externe d'aiguille de 0,5 mm.

4) Révélation histochimique X-gal (microscopie optique)
Les rats anesthésiés sont sacrifiés par perfusion avec 150 ml de PBS puis avec 300 ml de PFA à 4%, dans une solution de PBS (0,1 M, pH 7,4) à 40C.

Pour la révélation de la présence de ss-galac- tosidase, les cerveaux sont cryoprotégés et congelés par inclusion dans un composé OCT une coupe au cryostat.

Après coupe, l'activité enzymatique du transgène nls-lacZ est détectée par incubation à 370c du tissu dans un tampon PBS contenant 2 mM de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ss-D-galactoside (X-gal, Sigma), du ferricyanure de potassium (20 mM), du ferrocyanure de potassium (20mM) et du MgCl2 (2mM). Ces conditions de réaction n'entraînent pas de coloration chez les animaux contrôles et pour les cellules RBE4 non modifiées greffées (cellules greffées du côté gauche). La localisation cellulaire et la morphologie dans les coupes de tissu est augmentée si nécessaire à l'aide d'une optique Nomarski, qui permet une identification du type cellulaire fiable, dans la structure vasculaire. Cette révélation est associée si nécessaire avec une immunohistochimie EBA, pour une caractérisation cellulaire plus profonde.

La figure 3 illustre l'étude de l'intégration morphologique et fonctionnelle des cellules RBEZ par visualisation de l'expression du transgène nls-lacZ et du marqueur antigénique d'intégrité de la barrière hématoencéphalique (BHE), 1'EBA (endothelial barrier antigen).

Les figures 3A, 3B, 3C et 3D montrent des vaisseaux sanguins situés à distance de la zone de greffe, sur lesquels des cellules RBEZ ont migré après transplantation. Sur ces figures, des noyaux de cellules endothéliales, exprimant le transgène nls-lacZ, en position luminale (flèches) (3A, 3C), peuvent être observées. Ces mêmes vaisseaux, en lumière fluorescente (3B, 3D), expriment l'antigène EBA (têtes de flèches), indiquant ainsi que l'insertion vasculaire des cellules greffées n'a pas altéré l'intégrité de la EHE (x750 en 3A et 3B) ; (x1500 en 3C et 3D) ; (3A et 3C, en contraste interférentiel transmis).

L'expression du transgène est importante jusqu'à 5 semaines après l'implantation, mais décroît après. La présence de cellules implantées reste pourtant détectable à l'aide du colorant Hoechst précité.

L'absence de changements majeurs spécifiques dans la réaction immunitaire de l'hôte vis-à-vis de la présence du transgène lacZ montre la bonne intégration de ces cellules RBEZ.

En outre, les cellules RBE4 et RBEZ ne développent jamais de tumeurs in vi vo, car elles présentent une stabilité importante de leur phénotype.

III. Cellules RBEZ et tumeurs cérébrales
1) Implantation
Les cellules RBEZ à confluence sont trypsinisées et remises en suspension dans du DMEM sans sérum, immédiatement avant leur implantation dans les animaux hôtes.

- Pour une implantation intracrânienne, les cellules RBEZ (5.105 cellules) sont injectées stéréotaxiquement avec une seringue (Hamilton, gauge 26, en biseau), au niveau du noyau caudé et du putamen de rats Fischer 344 (200 à 250 g), après anesthésie.

Les cellules sont injectées dans un volume de 5 Fl et l'aiguille est laissée en place 2 min après l'injection pour limiter les fuites.

- Dans le cadre d'une implantation sous-cuta nee, les rats Fischer anesthésiés reçoivent 100 1 contenant 106 cellules RBEZ.

Pour montrer que de telles cellules s'implantent de préférence dans des régions hypervascularisées telles que des tumeurs, un essai est réalisé en faisant les mêmes implantations (intracrânienne et souscutanée) avec un mélange de cellules de gliomes 9L, F98 ou C6 (10 cellules) et de cellules RBEZ, dans les mêmes conditions que ci-dessus.

Après implantation, les tissus sont préparés de manière à faire une étude immunohistochimique et histologique.

2) Préparation des tissus
Les rats sont anesthésiés avec de l'éther et après une thoracotomie, l'oreillette droite est incisée et une canule est insérée dans le ventricule gauche qui est alors perfusé séquentiellement avec un tampon contenant NaC1 120 mM, KC1 2,7mM dans un tampon phosphate pH 7,4 (1 ml/g de poids) puis du paraformaldéhyde à 3,7% (fixateur). Les cerveaux sont placés dans le même fixateur, pendant 30 minutes, cryoprotégés avec du saccharose à 30% dans du PBS et congelés. Les tissus sont coupés (12 gm d'épaisseur) et montés sur lames gélatinées.

3) Mise en évidence de la survie des cellules et de l'expression du transgène
a) Protocole histochimique et immunohistochi micrue pour la détection des cellules RBEZ exprimant le gène reporter nls-lacZ
* Etude histochimique
Les préparations sur lames sont rincées trois fois dans un tampon PBS, puis incubées à 370C pendant 1 à 2 heures dans du PBS contenant 0,5 mg/ml de 5-bromo-4 chloro-3-indolyl-ss-D-galactopyranoside (X-gal), du ferricyanure de potassium 20 mM, du ferrocyanure de potassium 20 mM et du MgCl2 2 mM. Les coupes incubées en l'absence de substrat X-gal sont utilisées comme contrôle négatif. Les coupes sont ensuite rincées dans un tampon
PBS et montées en glycérol à 90% dans du PBS, contenant de l'azoture de sodium à 0,02%.

Les conditions de réaction n'entraînent aucune coloration chez les animaux-contrôle qui n'ont reçu aucune cellule RBEZ.

* Etude immunohistochimique
Quelques coupes présentent une réaction positive à la laminine dans la tumeur (détection des microvaisseaux tumoraux), à l'antigène de prolifération nucléaire Ki67 et à l'expression de marqueurs de la barrière hématoencéphalique, tel que le transporteur de glucose endothélial de type I (glut-l), après coloration avec le X-gal. Pour la coloration à la laminine, les coupes sont digérées pendant 15 minutes à 370C avec de la pepsine 0,2% dans de 1'HC1 0,01 N avant l'incubation avec les réactifs immunologiques.

Les coupes sont séquentiellement incubées avec du sérum de chèvre normal à 1%, puis soit avec des anticorps de lapin anti-laminine, des anticorps de lapin anti-glutl ou des anticorps de lapin anti-Ki67, puis de l'immunoglobuline biotinylée de chèvre anti-lapin est ajoutée (1:200 dans du PBS).

Les coupes sont alors incubées avec un complexe avidine-biotine-peroxydase (1:50 dans du PBS), suivi d'une incubation dans un tampon Tris 50 mM contenant 0,5 mg/ml de 3-3'-diaminobenzidine (Sigma) et 0,01 % de peroxyde d'hydrogène.

Les lames-contrôle sont incubées avec du sérum de lapin normal à la place du sérum immun. Les sections sont montées en glycérol à 90% dans du PBS.

b) Résultats
1) Visualisation des cellules RBEZ implantées
Après coloration avec le substrat chromogénique X-Gal, le produit bleu de la réaction avec le B-ga- lactosidase est identifié dans des coupes histologiques des tumeurs intracrâniennes, alors qu'il n'est identifié que 21-35 jours après implantation sous-cutanée des cellules tumorales et des cellules RBEZ (tableaux I et II).

Aucun produit de réaction bleu n'est détecté dans les tumeurs implantées sans cellule RBEZ. De manière surprenante, les cellules endothéliales greffées sont distribuées à travers toutes les tumeurs intracrâniennes, y compris les infiltrations marginales, mais n'apparaissent pas migrer dans les tissus normaux.

2) Intégration des cellules R3EZ implantées
Essentiellement toutes les cellules P-galactosidase positives, quelle que soit leur localisation, se colorent avec les anticorps antilaminine, ceci étant en accord avec leur phénotype endothélial. De manière intéressante, quelques cellules RBEZ greffées sont associées avec des profils micro-vasculaires tumoraux. Ceci suggère que les cellules RBEZ implantées de cette façon ont la capacité de s'intégrer d'une manière anatomiquement correcte dans la vascularisation tumorale.

3) Fonctionnalités des cellules RBEZ intégrées.

Une des caractéristiques les plus importantes de ces cellules endothéliales cérébrales est leur expression élevée du transporteur de type 1 du glucose (Glut1), exprimé au niveau de la barrière hémato-encéphalique.

Ceci est important pour le transport trans-endothéliale du D-glucose, le substrat énergétique essentiel du cerveau. Les cellules endothéliales dans les gliomes intracrâniens 9L ou autres expriment également ce transporteur. Par contre, l'expression du Glut-l diminue rapidement dans les cellules endothéliales cérébrales en culture.

De nombreuses cellules P-gal positives sont marquées avec les anticorps anti-Glut-l. Ces différents essais montrent que des cellules endothéliales cérébrales génétiquement modifiées ex vivo survivent, s'intègrent dans les gliomes intracrâniens et expriment le transgène.

4) Prolifération des cellules RBEZ implantées
L'expression de l'antigène Ki67 de prolifération par les cellules RBEZ implantées dans les tumeurs 9L intracrâniennes est examinée.

De nombreuses cellules exprimant à la fois le ss-galactosidase nucléaire et l'antigène Ki67 sont observées.

Le nombre de cellules RBEZ implantées par section tumorale est quantifié par analyse d'images assistée par ordinateur en utilisant le dispositif d'imagerie (MCID) fourni par la Société Imagine Research Inc.

(Brock. University St Catherines, Ontario, Canada), une caméra CCD à haute résolution Hamamatsu et un ordinateur
Compaq DeskPro 486/33.

Le nombre total de cellules RBEZ par tumeur est estimé à partir du nombre de cellules RBEZ par volume tumoral (coupe adjacente de 12 Clam) et le volume tumoral total est estimé à partir des limites de la tumeur, selon deux plans de coupe orthogonaux.

Les Tableaux I et II illustrent les résultats obtenus lors de l'implantation des cellules endothéliales cérébrales modifiées, conformément à l'invention, dans des gliomes 9L.

TABLEAU I

<tb> Nombre <SEP> de <SEP> tumeurs <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> tumeurs <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> jours
<tb> <SEP> examinées <SEP> B-Gal <SEP> + <SEP> après <SEP> implantation
<tb> <SEP> des <SEP> cellules <SEP> RBEZ
<tb> <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 7
<tb> <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 12
<tb> <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 14
<tb> <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 21
<tb> <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 28
<tb> <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 35
<tb>
TABLEAU II

<SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules
<tb> <SEP> Type <SEP> de <SEP> tumeur <SEP> RBEZ/Tumeur
<tb> <SEP> (jours) <SEP> (moyenne <SEP> # <SEP> SEM)
<tb> Intracrânien <SEP> 9L <SEP> (J12) <SEP> 166 <SEP> 440 <SEP> # <SEP> 19 <SEP> 550
<tb> <SEP> C6 <SEP> (J12) <SEP> 145 <SEP> 840 <SEP> # <SEP> 42 <SEP> 160
<tb> <SEP> F98 <SEP> (J12) <SEP> 232 <SEP> 560 <SEP> # <SEP> 69 <SEP> 070
<tb> Sous-cutané <SEP> 9L <SEP> (J14) <SEP> 494 <SEP> 560 <SEP> + <SEP> 422 <SEP> 500
<tb> <SEP> 9L <SEP> (J21) <SEP> 5 <SEP> 252 <SEP> 160+ <SEP> 611 <SEP> 380
<tb>
5) Identification du gène nls-lacZ dans les tumeurs implantées avec des cellules RBEZ, par PCR.

Des oligonucléotides complémentaires de séquences d'ADN, localisées sur le gène nls-lacZ (5'
CGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATC-3') et sur le vecteur, en aval de la séquence 3'LTR (5'-GACCACTGATATCCTGTCTTTAAC63'), sont utilisés comme amorces. La PCR est réalisée sur de 1'ADN génomique isolé de tumeurs contrôles (tumeur 9L figure 11, lignes 2 et 3)), de tumeurs expérimentales (tumeurs ayant intégré des cellules RBEZ implantation 14 jours avant l'isolement de l'ADN . figure 11, lignes 4-6) et des lignées cellulaires RBEZ (figure 11, ligne 7) et RBE4 (figure 11, ligne 8). 35 cycles d'amplification avec de la Taq polymérase sont réalisées dans les conditions suivantes : dénaturation à 950C, hybridation à 600C et élongation à 720C.

La figure 11 montre les résultats obtenus le produit de la PCR (400pb) n'est présent que dans les échantillons contenant les cellules RBEZ.

IV. Cellules RBE/NGF
1) Prémarquage au bisbenzimide Hoechst, voir
I.

2) Implantation
Juste avant la procédure de greffe, les cellules sont rincées trois fois dans une solution de greffe comprenant du PBS supplémenté avec MgCl2 et CaCl2 à 1 Fg/ml et avec du glucose à 0,1%, de manière à éliminer le milieu DMEM-SVF.

Chirurgie et implantation des cellules
Un total de 50 rats mâles adultes, répartis en 2 groupes, appartenant à la souche Lewis, pesant environ 300 g reçoivent une greffe de cellules RBE/NGF prémarquées au colorant Hoechst, sous anesthésie profonde dans des conditions stéréotaxiques.

Dix animaux reçoivent une implantation stéréotaxique de cellules RBE/NGF dans le noyau basal droit. Un autre groupe (n = 40) est soumis à une procédure d'injections en sites multiples de cellules
RBE/NGF (côté droit), de manière à réaliser une colonne cellulaire de 2 mm de hauteur entre le noyau basal et le striatum dorsal. Un total de 300.000 cellules, mises en suspension dans une solution de greffe (3 1), est injecté par site à l'aide d'une micro-seringue de 10 p1 Expires avec un diamètre d'aiguille externe de 0,5 mm.

Comme procédure de contrôle, des cellules RBE4 non modifiées et marquées au colorant Hoechst sont également greffées en même temps, de manière controlatérale (côté gauche) et en utilisant les mêmes niveaux stéréotaxiques. Des coupes coronales et horizontales des cerveaux greffés sont collectées, entre 1 semaine et 8 semaines après la transplantation. Les greffes examinées, visualisées par la fluorescence obtenue à l'aide du colorant Hoechst montrent un aspect compact avec un étalement cellulaire faible. Aucune tumorisation des cellules greffées RBE/NGF n'a été observée.

3) Préparation des tissus pour l'immunohistochimie:
1 semaine, 3 semaines, 5 semaines et 8 semaines après implantation, les animaux sont anesthésiés et perfusés en intracardiaque, avec une solution de PBS 0,1
M, pH 7,4 à 40C, suivi par une perfusion de paraformaldehyde à 4% dans le même tampon. Les cerveaux sont retirés et stockés dans le même tampon pendant une nuit à 40C.

Les cerveaux sont alors stockés dans un tampon PBS comprenant du saccharose à 30% pendant 2 jours à 40C et congelés dans de l'isopentane à -600C. Les coupes coronales et horizontales (30 Rm d'épaisseur) sont réalisées à l'aide d'un cryostat et collectées dans des puits remplis de PBS à 40C. Les coupes sont divisées en différents groupes, pour réaliser une analyse immunohistochimique, ainsi qu'une coloration au bleu de toluidine.

Pour l'analyse immunohistochimique, les coupes sont initialement traitées avec du PBS contenant du H202 0,4 %, pendant 30 minutes, et rincées dans le même tampon. Elles sont alors incubées dans un sérum normal à 10%, du même animal que celui utilisé pour produire les anticorps secondaires et du Triton X-100 0,1% dans du PBS pendant 1 heure, puis avec l'un des anticorps primaires suivant
- Anticorps primaire polyclonal
anticorps de lapin anti-Glut-l (transporteur de glucose spécifique du cerveau), (1:5000, Biogenesis) anticorps de lapin anti-GFAP (1:6000, Dako); anticorps de chèvre anti-ChAT (1:100, Chemicon), anticorps de lapin anti-laminine (1:5000, Sigma).

- Anticorps primaire monoclonal
anticorps de souris anti-p75 LNGFR (Low affinity NGF receptor) (1:150, clone 192, Boehringer) anticorps de souris anti-CDllb (macrophages de rat) (1:1000, clone MRC 0X-42, Serotec) ; anticorps de souris anti-lymphocytes T de rat (1:2000, clone MRC 0X-52,
Serotec); anticorps de souris anti-complexe majeur d'histocompatibilité I de rat (1:1000, clone MRC OX-18,
Serotec) ; anticorps de souris anti-CMH classe II (Ia) de rat (1:1000, clone MRC OX-6, Serotec); anticorps de souris anti-EBA (antigène de barrière hémato encéphalique, spécifique du rat) (1:1000, clone SMI71,
Affiniti).

Tous les anticorps sont dilués dans un tampon
PBS contenant 5% de sérum normal (sérum d'âne pour les anticorps polyclonaux, et sérum de mouton pour les anticorps monoclonaux) et du Triton X-100 à 0,1% et incubés pendant 36 heures sous agitation à 40C. Les coupes sont rincées et incubées avec des anticorps biotinylés d'âne anti-IgG de lapin (1:2000, Amersham), anti-IgG de chèvre (1:1000, Jackson Laboratories) ou des anticorps biotinylés de mouton anti-IgG de souris (1:600,
Amersham) dans un tampon PBS contenant 5% de sérum normal et 0,1% de Triton X-100, pendant une nuit sous agitation à 40C. Elles sont rincées, puis incubées avec un complexe biotine-avidine-peroxydase (Vector Laboratories) pendant 30 minutes et rincées à nouveau avec un tampon Tris (TBS 0,1 M, pH 7,6).Les coupes sont alors incubées dans une solution de tétrahydrochlorure de diaminobenzidine, avec du chlorure de nickel et du peroxyde d'hydrogène (H2O2) dans le tampon TBS (0,05 M, pH 7,3). La réaction enzymatique est arrêtée par lavage des coupes dans le tampon. Lesdites coupes sont ensuite contrecolorées et déshydratées, montées sur lames et observées au microscope. Un contrôle est systématiquement réalisé en omettant les anticorps primaires et dans ces conditions, les coupes sont toujours non-marquées.

4) Préparatin des tissus et détection par hybridation in situ du transgène NGF.

La détection cellulaire des transcrits ssNGF in vivo est mise en évidence par hybridation in situ du NGF (ARNm) dans le greffon, une semaine après l'implantation dans le cerveau de rat adulte, ainsi qu'à 3 semaines, dans les conditions suivantes
Après anesthésie profonde avec de la kétamine (150 mg.kg-l, Imalgene) les rats sont perfusés avec du pa raformaldéhyde à 2% dans du tampon PBS 0,1 M (pH 7,4, 40C). Les cerveaux prélevés sont placés dans ce tampon pendant 60 minutes à 40C. Après une cryoprotection pendant une nuit dans une solution de saccharose à 15% dans du PBS 0,1 M à 40C, une congélation rapide des échantillons est réalisée par immersion dans de l'isopentane à -600C.Les cerveaux congelés sont coupés horizontalement (10-14 Fm), à l'aide d'un cryostat Microm&commat;, puis montés sur des lames gélatinées et séchées à température ambiante. Les coupes sont pré-hybridées pendant une heure à 400C dans un tampon 4XSSC, 1X Denhardt.

L'hybridation est réalisée en chambre humide à 370C pendant 16 heures, en utilisant comme tampon d'hybridation un mélange 4XSSC, formamide à 50%, sulfate de dextran à 10%, 1X Denhardt, 500 Fg/ml d'ADN fragmenté et dénaturé de sperme de saumon et 100 Rg/ml d'ARNt de levure, contenant la sonde NGF précitée à une concentration finale de 2 Fg/ml. Les lames sont lavées séquentiellement dans du 2XSSC pendant une heure à 200C, puis dans du lXSSC pendant une heure à 200C, puis dans du 1XSSC pendant une demi-heure à 370C et dans du 0,5XSSC pendant une demiheure à 200C. La sonde hybridée, marquée à la digoxigénine, est détectée en utilisant un kit de détection immunoenzymatique (Boehringer-Mannheim), selon les instructions du fabricant. Des procédures de contrôle sont réalisées parallèlement, soit par digestion des
ARNms avec de la RNase A (20 Fg/ml pendant 30 minutes à 370C), soit par compétition avec un excès de sonde non marquée, (excès de l'ordre de 40) dans le mélange d'hybridation. Une dilution de la sonde à 0,5 Rg/ml donne un signal faible mais spécifique. L'absence de signal est observée lorsque l'on ne met pas la sonde NGF pendant 1 'hybridation.

Dans ce cas, une présence importante de transcrits NGF est détectée dans les greffons RBE/NGF, reflétant une expression constitutive contrôlée par le LTR de ce transgène.

La figure 5 illustre l'étude in vivo de l'expression du transgène NGF dans les cellules RBE/NGF, trois semaines après transplantation dans le nucleus basalis (noyau basal) et la figure 6 illustre les structures cérébrales témoins utilisées comme contrôle interne de l'hybridation in situ du messager NGF, in vivo
Les figures 5A et 5B montrent un greffon (G) de cellules RBE/NGF exprimant fortement le transgène NGF détecté par hybridation in situ. Cette expression du transgène reste toujours aussi forte 3 semaines après la greffe intra-cérébrale. La figure 5C visualise un greffon témoin (G) de cellules RBE4 non infectées, greffé dans l'hémisphère controlatéral, qui ne présente aucun signal
NGF positif (x130 en A) ; (x270 en 5B et 5C, avec contraste interférentiel transmis).La figure 6A illustre la détection neuronale de NGF, au niveau du cortex fronto-pariétal et la figure 6B illustre la détection de
NGF au niveau de l'hippocampe (x260 en 6A) ; (x65 en 6B).

Ces figures sont en accord avec la description établie de la synthèse endogène de NGF par les neurones du cortex cérébral et de l'hippocampe chez le rat adulte.

5) effet biologique du NGF produit par le greffon, sur les neurones cholinergiques du noyau basal (effet de bourgeonnement axonal)
Pour explorer l'effet biologique du produit du transgène NGF sécrété in vivo, le test fonctionnel suivant est réalisé la lignée cellulaire modifiée est greffée comme précisé ci-dessus dans le noyau basal, dans lequel les neurones cholinergiques présentent une réponse très sensible au NGF. Ces neurones cholinergiques, outre leur expression de l'enzyme ChAT, peuvent également être caractérisés par une immunoréactivité importante au ré cepteur p75LNGFR. Ce dernier permet de visualiser les fibres cholinergiques ainsi que leurs somas cellulaires, spécialement lors des études de régénération axonale. Le bourgeonnement réactionnel détecté par immunoréactivité p75LNGFR est observé au moins jusqu'à trois semaines, au niveau des greffons RBE/NGF.

Dans le premier groupe greffé, l'effet biologique du NGF produit par les greffons sur les neurones cholinergiques du noyau basal (bourgeonnement axonal) est localisé dans cette région et n'excède pas les limites de cette dernière.

La figure 7 illustre l'effet biologique du NGF sécrété par les cellules RBE/NGF, trois semaines après la greffe, au niveau du nucleus basalis (NB) (action sur la promotion et le maintien de la repousse axonale réactive des neurones cholinergiques lésés après la transplantation). En 7A, une vue générale de la forme d'un greffon
RBE/NGF, placé dans le NB, est visualisée, à l'aide du prémarquage Hoechst. En 7B, 7D et 7F, l'effet du NGF produit par les cellules endothéliales sur la repousse axonale est visualisé par la forte immunoréactivité de ces processus axonaux pour le récepteur p75 du NGF. Cette repousse axonale a lieu tout le long du greffon (G) et présente une forte réactivité autour de certains vaisseaux sanguins (flèches).

En 7C et 7E, 3 semaines après la greffe, des greffons RBE4 témoins non-infectés avec la construction rétrovirale NGF, placés dans le NB de l'hémisphère controlatéral, sont incapables de promouvoir et de maintenir une repousse axonale réactive des neurones cholinergiques du NB (x65 en A, B, C, D, E et F, plan horizontal).

Cependant, dans le second groupe, le bourgeonnement dû au NGF sécrété par les cellules greffées est plus étendu dans l'axe ventro-dorsal, le long de la greffe, liant le noyau basal au striatum dorsal, montrant ainsi les effets trophiques et tropiques du NGF. La fi gure 8 illustre l'effet biologique du NGF sécrété par les cellules RBE/NGF, trois semaines après la greffe, à distance du nucleus basalis et illustre la croissance directionnelle des prolongements en croissance des neurones cholinergiques du NB, le long du greffon jusqu'au niveau du striatum dorsal. Les figures 8A et 8B illustrent une coupe horizontale passant par la partie dorsale du greffon dans le striatum. En 8A, les cellules RBE/NGF sont visualisées par le colorant nucléaire Hoechst.En 8B, la même coupe a été réalisée en lumière transmise, montrant une repousse axonale réactive visualisée par l'anticorps anti-p75 NGF récepteur (x100 en A et B).

6) Tolérance immunologique.

Pour pouvoir étudier la réaction immunologique de l'hôte vis-à-vis des lignées de cellules endothéliales greffées, des marquages immunohistochimiques ont été réalisées, utilisant des marqueurs de macrophages, du complexe majeur d'histocompatibilité et des lymphocytes.

A une semaine, on observe une infiltration de macrophages au niveau du site de transplantation, avec une diminution de leur présence avec le temps.

Cette infiltration est liée au traumatisme chirurgical dû à la transplantation.

Cependant, aucune infiltration par des lymphocytes n'est observée, même un mois après la transplantation.

Ces données suggèrent que de telles greffes sont bien tolérées par l'hôte, qui ne développe pas de réaction de rejet aiguë vis-à-vis des différentes lignées de cellules endothéliales greffées.

Les données ci-dessus montrent qu'aussi bien les cellules RBE4 seules que les cellules RBEZ et les cellules RBE/NGF, survivent et s'intègrent après greffes.

Les cellules RBEZ et RBE/NGF sont capables d'exprimer et/ou de sécréter le produit dudit transgène qui, dans le cas du NGF, a la capacité d'induire un effet biologique dans le cerveau.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims (21)

REVENDICATIONS 1 ) Lignées de cellules endothéliales de mammifères, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par des cellules endothéliales cérébrales immortalisées, présentant au moins l'une des caractéristiques suivantes des cellules endothéliales cérébrales différenciées, de manière stable - l'expression de marqueurs endothéliaux, - la sécrétion de substances vasoactives, - l'expression de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), - l'expression de récepteurs hormonaux, et - l'existence de jonctions serrées, en ce qu'elles comprennent un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène de sélection, et un vecteur d'expression comprenant une séquence codant pour un polypeptide, une protéine ou un vecteur viral, éventuellement associé à au moins un gène de sélection et éventuellement au moins un gène marqueur et en ce qu'elles sont capables in vivo de s'intégrer aux vaisseaux cérébraux d'un mammifère hôte et de produire ledit polypeptide, ladite protéine ou ledit vecteur viral.
1. 20) Lignées de cellules endothéliales selon la revendication 1, caractérisées en ce que le fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène contient le gène de la résistance à la néomycine et un fragment de l'oncogène T de SV40.
2. 30) Lignées de cellules endothéliales selon la revendication 1, caractérisées en ce que le fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène contient la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine.
3. 40) Lignées de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que ledit vecteur est un vecteur rétroviral, notamment un vecteur MFG.
4. 50) Lignées de cellules endothéliales selon la revendications 4, caractérisées en ce que le vecteur rétroviral est un vecteur MFG-NB.
5. 60) Lignées de cellules endothéliales selon lune quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que la séquence codant pour un polypeptide ou une protéine est sélectionnée parmi les séquences codant pour : des enzymes, des inhibiteurs d'enzymes, des cytokines, des neurotrophines, des neurotransmetteurs, des facteurs de croissance, des toxines, des antimétabolites, des neurohormones, des gangliosides, des antibiotiques, des facteurs thrombolytiques, des facteurs coagulants, des facteurs vasodilatateurs ou vasoconstricteurs, des facteurs hypo- ou hypercholestérolémiants, des facteurs hyper- ou hypoglycémiants.
6. 70) Lignées de cellules endothéliales selon lune quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'elles sont constituées de cellules endothéliales de capillaires cérébraux.
7. 80) Lignées de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisées en ce qu'elles comprennent avantageusement, en tant que fragment immortalisant, la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine et en tant que vecteur d'expression, un vecteur rétroviral MFG-NB contenant le gène nls-lacZ codant pour la ss-ga-
8. 90) Lignée de cellules endothéliales selon la revendications 8, caractérisée en ce qu'elle a été déposée sous le nO I-1481 en date du 10 octobre 1994 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
9. 100) Lignée de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elles comprennent avantageusement, en tant que fragment immortalisant, la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine et en tant que vecteur, un vecteur rétroviral pMMuLVisisNGF codant pour le ssNGF murin.
10. 110) Lignée de cellules endothéliales selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle a été déposée sous le nO I-1482 en date du 10 octobre 1994 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
11. 120) Compositions, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une lignée de cellules endothéliales cérébrales selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, associée à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
12. 130) Compositions selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'elles contiennent de préférence entre 10' et 105 cellules endothéliales/l.
13. 140) Procédé d'obtention d'une lignée cellulaire modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, lequel procédé est caractérisé en ce que:

    (1) on réalise une première transfection par

    - culture de cellules endothéliales cérébrales, de préférence de microvaisseaux cérébraux dans un milieu de culture convenable, supplémenté en sérum et en facteurs de croissance,

    - transfection desdites cellules entre le 2ème et le 6ème passage avec un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire et éventuellement au moins un gène de sélection, notamment un gène codant pour la résistance à un antibiotique,

    - sélection des cellules transfectées sur un milieu de sélection adapté audit gène de sélection, si nécessaire,

    (2) puis on réalise une transfection des cellules obtenues en (1) avec un vecteur contenant la séquence de polypeptide ou de protéine à produire ou un vecteur viral à exprimer.
14. 150) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la transfection de l'étape (2) est réalisée avec un vecteur rétroviral, de préférence un vecteur MFG dans lequel la séquence codant pour la protéine à exprimer a été préalablement incorporée.
15. 160) Application des lignées de cellules endothéliales de mammifères, constituées par des cellules endothéliales cérébrales immortalisées, comprenant un fragment d'acide nucléique incluant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène de sélection, et éventuellement un vecteur comprenant une séquence codant pour un polypeptide, une protéine ou un vecteur viral, éventuellement associé à au moins un gène de sélection et éventuellement au moins un gène marqueur, à la préparation d'une composition pour le traitement des troubles ou maladies primaires et secondaires neurologiques ou psychiatriques, y compris les tumeurs cérébrales.
16. 170) Application selon la revendication 16, caractérisée en ce que ladite lignée de cellules endothéliales est la lignée de cellules endothéliales cérébrales

    RBE4 (nO I-1142,CNCM).
17. 180) Application selon la revendication 16, caractérisée en ce que ladite lignée de cellules endothéliales est une des lignées de cellules endothéliales cé rébrales selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
18. 190) Application des lignées de cellules endothéliales de mammifères, constituées par des cellules endothéliales cérébrales immortalisées, comprenant un fragment d'acide nucléique incluant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène de sélection, et éventuellement un vecteur comprenant une séquence codant pour un polypeptide, une protéine ou un vecteur viral, éventuellement associé à au moins un gène de sélection et éventuellement au moins un gène marqueur, à la préparation d'une composition pour stimuler la croissance et la reproduction des animaux d'élevage.
19. 200) Modèle d'étude de l'intégration cérébrale de cellules vectrices de substances actives, au niveau du cerveau, caractérisé en ce qu'il comprend une lignée cellulaire selon la revendication 8 ou la revendication 9.
20. 210) Modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques et cellulaires de la barrière hémato-encéphalique in vitro, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
21. 220) Procédé de production d'un polypeptide ou d'une protéine, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre d'au moins une lignée de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans un bioréacteur convenable.