CA2202066A1 - Lignees immortalisees de cellules endotheliales cerebrales et leurs applications therapeutiques - Google Patents

Abstract

The invention relates to optionally modified immortalized lines of endothelial brain cells of mammalians, as well as applications as preventive or curative drug and particularly for the treatment of primary and secondary, neurologic or psychiatric diseases, including brain tumors, and for stimulating the growth and reproduction of breeding animals. The invention also relates to the method for preparing said cell lines. The endothelial cell lines of mammalians disclosed are comprised of immortalized endothelial brain cells presenting at least one of the following characteristics of differentiated endothelial brain cells, in a stable way: the expression of endothelial markers, the secretion of vasoactive substances, the expression of molecules of the major histocompatilility complex (MHC), the expression of hormonal receptors, and the existence of tight junctions; said cell lines comprise a nucleic acid fragment having at least one immortalizing fragment of a viral or cellular oncogene, optionally associated with at least one selection gene, and an expression vector comprising a sequence coding for a polypeptide, a protein or a viral vector, optionally associated with at least one selection gene and optionally at least one marker gene, and they are capable in vivo to integrate brain vessels of a host mammalian and produce said polypeptide, said protein or said viral vector.

Description

CA 02202066 l997-04-07 WO 96/11278 ' 1 PCT/1~9S/01313 L~gnées i~mortalisées de cellules endothéliales cérébrales et leurs applications thérapeutiques La présente invention est relative à des li-gnées immortalisées de cellules endothéliales cérébrales de m~mm; fères, éventuellement modifiées, ainsi qu'à leurs applications comme médicament à visée préventive ou cura-tive et not~mm~nt pour le traitement de différents trou-bles ou maladies primaires et secondaires, neurologiques ou psychiatriques, y compris les tumeurs cérébrales.
Depuis quelques années, de nouvelles méthodes de traitement d'un certain nombre de troubles neurologi-ques, antérieurement considérés comme réfractaires à tous les traitements conventionnels, font appel à la thérapie génique. Ces nouvelles méthodes sont liées not~mm~nt aux progrès réalisés dans le domaine de la construction de vecteurs d'expression efficaces, de transporteurs de transgènes viraux et cellulaires et dans la caractérisa-tion de cellules cibles appropriées à la thérapie géniquedu système nerveux.
Deux approches différentes sont essentielle-ment proposées pour réaliser le transfert de gènes dans le système nerveux : une approche dite in vivo qui est

2~ concentrée sur le transfert direct du matériel génétique aux cellules in vivo, en utilisant des agents viraux et chimiques et une approche ex vivo, qui se caractérise en ce que le transfert génique est effectué dans des cellu-les en culture, qui sont ensuite implantées dans l~organisme hôte. Cette dernière approche comprend des étapes de manipulations moléculaires, de clonage et d'implantation des cellules, de manière à permettre la distribution des substances actives chez 1'hôte (SUHR
S.T. et al., Arch. Neurol., 1993, 50, 1252-1268).
De nombreux troubles neurologiques sont en rapport avec des lésions ou dysfonctions focalisées du système nerveux et ont donc été choisis pour tester ces techniques.

Wo96/11278 ~ 2 PCTQ~95/01313 Wo96/11278 ~ 4 PCT~95/01313 WO96/11278 6 PCT~S/01313 réseau vasculaire de l'hôte. Cette localisation non vas-culaire n'entraîne pas une exacerbation de la mort cellu-laire et ceci encore à 1 an après l'implantation.
Conformément à l'invention, le vecteur viral est avantageusement un cytomégalovirus (CMV) modifié
(vecteur viral intégratif).
La présente invention a également pour objet des compositions, caractérisées en ce qu'elles compren-nent au moins une lignée de cellules endothéliales céré-brales conformes à l'invention, associée à au moins unvéhicule pharmaceutiquement acceptable.
De telles compositions contiennent de préfé-rence entre 10~ et 105 cellules endothéliales/~l.
De telles compositions peuvent être avantageu-lS sement administrées par voie intracrânienne, voie sous-cutanée, voie intra-cérébroventriculaire, voie subdurale, voie veineuse ou artérielle (intracarotide, par exemple), voie intramusculaire, voie intrathécale.
Conform~ment à l'invention, lesdites cellules endothéliales peuvent être des cellules de même espèce que l'hôte (allogreffe ou homogreffe) ou d'espèce diffé-rente (xénogreffe).
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une lignée cellulaire modifiée conforme à l'invention, lequel procédé est caractérisé en ce que:
(1) on réalise une première transfection par :
- culture de cellules endothéliales céré-brales, de préférence de microvaisseaux cérébraux, dans un milieu de culture convenable, supplémenté en sérum et en facteurs de croissance, - transfection desdites cellules entre le 2ème et le 6ème passage avec un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un onco-t éventuellement au moins un CA 02202066 l997-04-07 WO96/11278 ~ ~ PCT~5/01313 - sélection des cellules transfectées sur un milieu de sélection adapté audit gène de sélection, si nécessaire, - (2) puis on réali~e une transfection des cel-lules obtenues en (l) avec un vecteur contenant la séquence de polypeptide ou de protéine à produire ou un vecteur viral à exprimer.
De manière préférée, la transfection de l'étape (2 ) est réalisée avec un vecteur rétroviral dans le~uel la séquence codant pour la protéine à exprimer a été préalablement incorporée.
De manière préférée, l'étape (l) permet d'obtenir des cellules RBE4, immortalisées par transfec-tion avec un plasmide contenant la région précoce ElA du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine sous contrôle du promoteur SV40, qui sont dépo-sées sous le n~ I-1142 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) tenue par l~Institut Pasteur.
La présente invention a également pour objet un modèle d'étude de l'intégration cérébrale de cellules vectrices de substances actives, au niveau du cerveau, caractérisé en ce qu'il comprend une lignée cellulaire REBZ, conforme à l'invention.
La présente invention a également pour objet un modèle d'étude et d'identification des systèmes bio-chimiques et cellulaires de la barrière hémato-encépha-lique in vitro, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire conforme à l'invention.
La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de production d'un polypeptide ou d'une pro-téine, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre d'au moins une lignée de cellules endothéliales conforme à l'invention, dans un bioréacteur convenable.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se ré-fère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 illustre l'étude in vitro de l'expression du transgène NGF dans les cellules RBE/NGF, par hybridation in situ ;
- les figures 2 et 3 illustrent la stimulation du bourgeonnement axonal de cellules PC12, obtenue à
partir du surnageant des cellules RBE/NGF, in vitro ;
- la figure 4 illustre le prémarquage des cel-lules RBE4 avant la transplantation, par le colorant nu-cléaire HOECHST 33342 (bisbenzimide) ;
- la figure 5 illustre la visualisation des cellules prémarquées au colorant Hoechst, après trans-plantation dans le cerveau de rat adulte ;
- la figure 6 illustre l'étude de l~intégration morphologique et fonctionnelle des cellules RBEZ par visualisation de 1'expression du transgène nls-lacZ et du marqueur antigénique d'intégrité de la bar-rière hémato-encéphalique (BHE), l'EBA (endothelial bar-rier antigen) ;
- la figure 7 illustre l'étude ultrastructu-rale en microscopie électronique, démontrant l'intégra-tion morphologique et fonctionnelle des cellules RBEZ
après greffe intracérébrale par visualisation de l'ex-pression du transgène nls-lacZ ;
- la figure 8 illustre l'étude de l'intégra-tion morphologique et fonctionnelle des cellules RBEZ
après greffe dans une tumeur intracérébrale, par visuali-sation de l'expression du transgène nls-lacZ ;
- la figure 9 illustre l'identification du gène nls-LacZ dans des tumeurs implantées avec des cellu-les RBEZ, par PCR .
- la figure 10 illustre l~étude in vivo de 1'expression du transgène NGF dans les cellules RBE/NGF, trois semaines après transplantation dans le nucleus ba-salis (noyau basal) ;

WO 96/11278 e 9 PCTn~5/01313 ~, ~
- la figure 11 illustre les structures céré-brales témoins utilisées comme contrôle interne de l'hybridation in si tu du messager NGF, in vivo ;
- la figure 12 illustre l'effet biologique du NGF sécrété par les cellules RBE/NGF, trois semaines après la greffe, au niveau du nucleus basalis;
- la figure 13 illustre l'effet biologique du NGF sécrété par les cellules RBE/NGF, trois semaines après la greffe, à distance du nucleus basalis;
- la figure 14 illustre la quantification de 1'effet biologique induit par l'expression du transgène NGF à 3 et 8 semaines post-greffe et ceci est traduit par la surface occupée par 1~immunomarquage p75LNGFR par rapport à la surface du greffon.
lS Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de i'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
~L~LE 1 : Preparation des cellules endothél; A les cére-~rales i = ortalisées RBE4.
Des cellules endothéliales de microvaisseaux de cerveaux de rats (culture primaire) sont immortalisées par transfection avec le plasmide pElA-néo, contenant la séquence codant pour l'adénovirus ElA, suivie par le gène de résistance à la néomycine.
Un clone, dénommé RBE4, a été ainsi obtenu et ses caractéristiques sont en particulier décrites dans la D~m~n~ PCT WO 93/06222 ainsi que dans les articles parus dans J. Cell. Physiol., 1993, 155, 104-111 et J. Cell.
Physiol., 1994, 159, 101-113. Ce clone a été déposé sous le n~ I-1142 à la Collection Nationale de Cultures de - Micro-organismes (CNCM~.
Pour réaliser la transfection, la technique de co-précipitation au phosphate de calcium a été utilisée, comme décrit dans la Demande PCT WO 93/06222 et rappelé
ci-après : la transfection desdites cellules est réalisée au 5ème passage avec le plasmide précité (10 ~g) conte-WO96/11278 10 PCT~R95/01313 nant, outre la région précoce ElA du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine, le promoteur SV40.
Cette transfection a lieu après mise en cul-ture de ces cellules dans des boîtes recouvertes de col-lagène, contenant un milieu a-MEM/FlO (2/3 ; l/3), sup-plémenté en sérum de veau foetal (SVF) à lO %, en FGFb1 ng/ml, en glutamine (2 mM) et en péni-cilline/streptomycine. La lignée cellulaire obtenue possède certaines des caractéristiques des cellules endo-théliales cérébrales ; elle possède not~mm~nt un phéno-type non transformé : inhibition de contact, proliféra-tion dépendant des facteurs de croissance et d'adhérence, expression de marqueurs de différenciation endothéliales (antigène apparenté au facteur VIII), site de liaison à
l'agglutinine de Griffonia simplicifolia et non-tumorigénicité chez les souris Nude.
De plus, ces cellules sont stimulées par les astrocytes pour exprimer les marqueurs enzymatiques spé-cifiques de la barrière hémato-encéphalique, à savoir, la ~-glutamine transférase et la phosphatase alcaline.
~ E 2 : Préparation des cellules endoths-;~les céré-brales RsEz~
Les cellules RBE4 obtenues à 1'exemple l sont soumises à deux passages par semaine, sur un milieu a-MEM/FlO (l/l ; Seromed, France), supplémenté en glutamine2 mM, sérum de veau foetal à lO %, FGFb l ng/ml et G418 300 ~g/ml.
Elles sont étalées à une densité de 104 cellules/cm2 sur des bo~tes recouvertes de collagène et utilisées entre les passages 30 et 60.
l) Préparat;on du vecteur rétrovir~l :
Un vecteur MFG-NB, défectif pour la réplica-tion, et contenant le gène lacZ est obtenu par insertion de la séquence codant pour la ~-galactosidase d'E. coli, fusionnée à une séquence codant pour la séquence de loca-lisation nucléaire (nls) de 21 aminoacides, issue de WO96/11278 11 PCTn~5/01313 l'antigène T de SV40 (Kalderon D. et al., Cell, 1984, 39, 499-509). Ce vecteur MFG-NB nls-lacZ est introduit dans des cellules productrices de rétrovirus ~-2 (Mulligan et al., précité)(infection rétrovirale recombinante de ~-2) et permet d'obtenir des lignées cellulaires ~-2-MFG-NB.
Ces cellules productrices de rétrovirus sont étalées en bolte à une densité de 10 cellules pour des bo~tes de 100 mm de diamètre, dans 7 ml d'un milieu RPMI
1640, supplémenté en sérum de veau foetal à 10 %.
Après 24 h, un volume de 6 ml de milieu conte-nant le virus est filtré et utilisé pour l'infection ou bien stocké à -80~C jusqu'à son utilisation.
2) Infection des celll~les endothéliales ~R~4 Les cellules R~3E4 sont étalées sur boîte à une densité de 10~ cellules/cm2 et après 24 h, le virus (3 ml) est ajouté en présence de polybrène (10 ~g/ml) pendant 2 h.
Après une autre période de 24 h dans un milieu complet, les cellules RBE4 sont repiquées et réinfectées dans les mêmes conditions.

3) Sélection des cellules endothéliales expr;-m~nt le tr~nsgène :
Les cellules exprimant la ~-galactosidase (cellules RBEZ) sont triées par FACS (fluorescent activa-ted cell sorting ; NOLAN et al., PNAS, 1988, 85, 2603-2607), en utilisant, comme substrat de l'enzyme, la ~-D-galactopyranoside fluorescéine (FDG).
Conform~m~nt à cette technique, 106 cellulesRBEZ dans 100 ~1, sont incubées à 37~C pendant 5 min, dans un tube en polystyrène de 5 ml, avant l'addition de 100 ~1 de FDG (2 mM).
Après mélange, les cellules sont placées à
nouveau à 37~C pendant 1 min, puis sur de la glace, et le volume est ajusté à 2 ml.

CA 02202066 lsg7-04-07 WO96/11278 12 PCTA~95/01313

4) Détection de l'ex~ression du transgène ~ar visllAlisation de l'activité ~n7~mati~ue de la ~-aalacto-s;~A~e. à l'aide d'u~ substrat ~hromogène~ le X-aAl.
. Protocole :
L'activité enzymatique est détectée par incu-bation des cellules à 37~C, dans un tampon PBS contenant du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-~-D-galactopyranoside (X-gal) 2 mM, du ferricyanure de potassium 20 mM, du ferro-cyanure de potassium 20 mM et du MgCl2 2 mM.
. Résultats :
La présence d'une activité enzymatique ~-ga-lactosidase se révèle par la formation d'une coloration bleue. Environ 50-80% des cellules endothéliales RBE4 in-fectées par le rétrovirus se colorent en bleu lors de l'histochimie, mais le niveau de coloration varie d'une cellule à l'autre. Les cellules RBE4 témoins (non infec-tées) ne sont pas colorées, dans les mêmes conditions.

5) Propr;étés des cellules ~R~7 i n Vi tr~ :
- Les cellules RBEZ obtenues sont cultivées sur un support recouvert de collagène dans un milieu a-MEM/F10, supplémenté en sérum de veau foetal à 10 %, glu-t~minP 2mM, FGFb 1 ng/ml et G418 300 ~g/ml.
Ces cellules présentent une inhibition de con-tact et une prolifération dépendant des facteurs de croissance et d'a&érence i elles expriment, en outre, des marqueurs de différenciation endothéliale.
~:x,- vLE 3 : Préparation des cellules endothéli Al es céré-brales RBE~NGF.
Les cellules RBE4 obtenues à l'exemple 1 sont soumises à deux passages par semaine, sur un milieu ~-MEM/F10 (1/1 ; Seromed, France), supplémenté en glutAmine2 mM, sérum de veau foetal à 10 % et FGFb 1 ng/ml et G418 300 ~g/ml.
Elles sont étalées à une densité de 10~ cellules/cm2 sur des boîtes recouvertes de collagène et utilisées entre les passages 30 et 60.

_ _ _ _ _ _ _ WO96/11278 13 pcTn~5lol3l3 l) Préparation du vectellr rétrov;r~l :
On procède comme à l'exemple 2, en utilisant un vecteur rétroviral pMoMI1T,VisisNGF, déficient pour la réplication et dans le~uel la séquence codant pour le ~-NGF de souris est insérée (Scott J et al., Nature, 1983, 302, 538-540). Ce vecteur, introduit dans des cellules productrices ~-2, permet d'obtenir des lignées cellulai-res ~-2-MoMuLVisisNGF.
2) Infecti~n des celll~les ~n~othél;~les RRE4 :
On procède comme à l'exemple 2.
3) Sélection des cellules e~dothéliales ex~ri-m~nt le tr~n~g~ne par llne métho~e ~TT,~ bi-site :
A la suite de sous-clonages des cellules RBE4 infectées par la méthode des dilutions limites, les sous-clones sécrétant du ~NGF (cellules RBE/NGF) sont identi-fiés en utilisant un ELISA bi-site (LADENHEIM et al., J.
Neurochem., l993, 60, 260-266).
De manière plus précise, un anticorps monoclo-nal anti-~NGF, dénommé 27/21 (0,l mg/ml dans un tampon carbonate 0,05 M pH 9,6), est appliqué sur des plaques EIA/RIA Costar pendant 2 heures à 37~C. Les plaques sont lavées 3 fois avec un mélange de Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 200 mM, CaCl2 l0 mM, Triton X-l00 à 0,l %, et azoture de sodium à 0,05% et incubées à 4~C pendant une nuit dans un milieu conditionné ou des st~n~rds ~NGF (30-l000 pg/ml) dans le même tampon supplémenté avec de lasérum albumine bovine à 1%.
Après lavages, le ~NGF est détecté à l'aide du même anticorps conjugué à la ~-D-galactosidase (400 mU/ml), après incubation pendant 4 heures à 37~C. Le substrat chromogénigue est du chlorophénol-rouge-~-galac-topyranoside (l mg/ml dans un milieu Hepes l00 mM, pH 7,NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM, azoture de sodium 0,1%).
L'absorbance à 570 nm est lue après 2 heures à 37~C. Deux 3~ sous-clones hautement positifs dénommés RBE/NGF-2 et -4 WO96/11278 14 PCT~5101313 sont sélectionnés, ainsi que deux sous-clones moins posi-tifs, et ce parmi 94 clones testés.
4) D~tection cellulaire de la synthèse de NGF
par hybridation in si tu de la sé~uence nucléotidique (ARNm) codant pour le NGF.
Une hybridation in situ est réalisée avec une sonde de 48 mers, antisens et spécifique de la séquence nucléotidique (ARNm) codant pour le ~NGF, correspondant aux positions 897-944 de la séquence d'ADNc du ~NGF de souris (SCOTT et al, 1983, Nature 302, 538-540), de for-mule suivante :
48 mer antisens 5' - 3' NGF mature 5' CTG CTT CTC ATC TGT TGT CAA CGC CTT GAC GAA
GGT GTG AGT CGT GGT 3', de manière à visualiser le transcrit ~NGF dans les cellu-les infectées, en culture. Ces résultats montrent une ex-pression importante d'ARNm du ~NGF dans les cellules infectées, à un niveau variable, d'une cellule à l'autre.
La figure l illustre l'étude in vitro de l'expression du transgène NGF dans les cellules R~3E/NGF, par hybridation in situ.
La visualisation immuno-enzymatique de l'expression du transgène NGF est réalisée à l'aide d'une sonde oligonucléotidique antisens spécifi~ue du NGF
2~ murin, marquée à la digoxigénine. Dans ces conditions, les hybrides ARNm/sonde NGF sont révélés par un anticorps anti-digoxigénine couplé à la phosphatase alcaline, dont la réaction enzymatique avec le complexe de substrats NBT-BCIP, produit un précipité noirâtre. La figure lA
montre un signal intense dans les cellules RBE/NGF en culture, indiquant un fort niveau d'expression du trans-gène NGF. En lB, l'absence de positivité dans les cellu-les R~3E4 témoins, non-infectées est observée (x300 en lA
et lB) (lB en contraste de phase).

WO 96/11278 ' 15 PCT/FR95/01313 4) Act;v;té in vitro du NGF sécrété :
L'activité biologique du NGF sécrété dans le surnageant des cellules RBE/NGF est mise en évidence par la propriété de promouvoir un bourgeonnement des neurites des cellules PC12 de phéochromocytome de rat. Pour réali-ser ce test, les cellules R~3E/NGF sont étalées sur boîtes à une densité de 10/cm2 dans des boîtes de 100 mm de dia-mètre et la croissance est réalisée pendant 3 à 4 jours jusqu'à confluence (10 cellules/boîte). Le milieu est changé (10 ml) et les surnageants sont collectés après 24 heures. Les résultats sont illustrés aux figures 2 et 3, qui montrent que le surnageant cellulaire de 24 heures se comporte de la même manière que du NGF purifié (0,1-50 ng/ml), utilisé comme st~n~rd interne et conduit à une stimulation du bourgeonnement neuritique chez environ 65%
des cellules PC12. En outre, une dilution au 1:40 dudit surnageant présente une activité biologique comparable à
du NGF à 0,4 ng/ml (40% de cellules porteuses de neuri-tes). En conséquence, la capacité de sécrétion de NGF
biologiquement actif par les cellules RBE/NGF peut être estimée à 16 ng/106cellules/24 heures.
Ces figures 2 et 3 comportent en abscisse, la concentration en NGF (ng/ml) (figure 2) ou le taux de dilution (figure 3 ; courbe 1 : cellules RBE/NGF et courbe 2 : cellules RBE4) et en ordonnée, le pourcentage de cellules portant des neurites.
~:X~ LE 4 : Imrl~t~tion cérébrale des cellules RBE4, RBEZ ct RBE-NGF.
I. Celll~les ~R~4 : survie et intégrat;on.
Pour la caractérisation des lignées cellulai-res RBE4 transplantées dans le cerveau de rat adulte, une méthode de prémarquage au bisbenzimide Hoechst est utili-sée, pour suivre les cellules greffées (GANSMULLER et al., GLIA, 1991, 4, 580-590).
La figure 4 illustre le prémarquage des cel-lules RBE4, avant la transplantation, par le colorant nu-cléaire HOECHST 33342 (bisbenzimide). Les cellules en suspension sont visualisées en microscopie à fluores-CA 02202066 lsg7-04-07 WO96/11278 ~ 16 PCT~95/01313 cence, sous lumière ultra-violette. La fluorescence du colorant définit clairement les noyaux cellulaires posi-tivement marqués (x270).
Trois à huit semaines après implantation des s cellules RBE4 marquées, dans différentes régions du cer-veau (substance grise et substance blanche), le greffon a un aspect compact avec un étalement faible et constant de certaines celluies RBE4, autour de sa masse. Cette migration se fait essentiellement le long du réseau vas-culaire de l'hôte, suggérant une interaction préféren-tielle entre les cellules endothéliales implantées et les éléments vasculaires de l'hôte.
Les colorations histologiques des cerveaux ainsi greffés montrent un m;n;mllm de signes de cellules nécrotique, et ce essentiellement durant la première se-maine qui suit le traumatisme chirurgical dû à la trans-plantation.
A l'intérieur du greffon, la densité cellu-laire est homogène (peu ou absence de cellules pycnoti-ques). L'immunoréactivité GFAP ( glial fibrillary acidicprotein), caractéristique des astrocytes, est importante, dès 1 semaine après l'implantation, aussi bien autour du greffon que dans le greffon lui-même, indiquant une infiltration d'astrocytes dans ce dernier.
2~ De manière inattendue, les cellules RBE4 im-plantées migrent et s'intègrent à l'environn~m~nt vascu-laire avec quelquefois une participation directe au ré-seau vasculaire de l'hôte.
Les figures 5A, 5B et 5C montrent les cellules prémarquées au colorant Hoechst, après transplantation dans le cerveau de rat adulte. La figure 5A montre une vue générale de la zone de greffe dans le parenchyme cérébral. Les cellules endothéliales greffées fluorescen-tes se-m--blent s~accumuler préférentiellement autour d'éléments vasculaires du cerveau hôte. Les astérisques matérialisent le trajet d'un vaisseau sanguin (x250). Les figures 5B et 5C montrent un vaisseau sanguin à fort grossissement, situé dans la zone d'implantation du gref-___ ___ . . _ _ _ . _ . .. .

WO 96/11278 ' 17 PCT/FR95/01313 fon. En 5B, de nombreuses cellules RBE4 Hoechst positives intégrées en position ll~m;n~le (flèches) et péri-vasculaire peuvent être observées. En 5C, ce même vais-- seau est immunomar~ué par un anticorps anti-l~m; n; ne (marqueur spécifique des vaisseaux sanguins) (x600).
II. Celll~les ~R~7 : survie ;ntéaration et ex-press;on du tr~n~aène.
1) Prémarquage des cellules au bisbenzimide Hoechst.
Voir I.
2) Préparation des cellules avant leur implan-tation.
Juste avant la procédure de greffe, les cellu-les sont rincées trois fois dans une solution de greffe 1~ comprenant du PBS supplémenté en MgCl2 et CaCl2 à 1 ~g/ml et en glucose à 0,1%, de manière à éliminer le milieu DMEM-SVF.
3) Chirurgie et implantation des cellules.
Des rats adultes mâles, appartenant à la sou-che Lewis et pesant 300 g, reçoivent une greffe de cellu-les RBEZ prémarquées, comme précisé en 1), sous anesthé-sie profonde, dans des conditions stéréotaxiques (cadre stéréotaxique Kopf~, atlas du cerveau de rat de Paxinos).
Vingt animaux reçoivent respectivement une implantation stéréotaxique, dans le noyau basal, de cellules RBEZ
(hémisphère cérébral droit) et de cellules contrôles RBE4 (hémisphère cérébral gauche).
Un total de 300.000 cellules mises en suspen-sion dans une solution de greffe (3 ~1) est injecté par site à l'aide d'une micro seringue de 10 ~1 Exmire~ ayant un diamètre externe d'aiguille de 0,5 mm.
4) Révélation histochimique X-gal pour la microscopie optique.
Les rats anesthésiés sont sacrifiés par perfu-3~ sion avec 150 ml de PBS puis avec 300 ml de PFA à 4%,dans une solution de PBS (0,1 M, pH 7,4) à 4~C.

WO96/11278 18 PCT~5/01313 Pour la révélation de la présence de ~-galac-tosidase, les cerveaux sont cryoprotégés et congelés par inclusion dans un composé OCT une coupe au cryostat.
Après coupe, l'activité enzymatique du transgène nls-lacZ
est détectée par incubation à 37~C du tissu dans un tam-pon PBS contenant 2 mM de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ~-D-galactoside (X-gal, Sigma), du ferricyanure de potassium (20 mM), du ferrocyanure de potassium (20mM) et du MgCl2 (2mM). Ces conditions de réaction n'entra~nent pas de coloration chez les animaux contrôles et pour les cellu-les RBE4 non modifiées greffées (cellules greffées du côté gauche). La localisation cellulaire et la morpho-logie dans les coupes de tissu est augmentée si néces-saire à l'aide d'une optique Nomarski, qui permet une 15 identification du type cellulaire fiable, dans la struc-ture vasculaire. Cette révélation est associée si néces-saire avec une immunohistochimie EBA, pour une caracté-risation cellulaire plus profonde.
La figure 6 illustre l'étude de l'intégration morphologique et fonctionnelle des cellules RBEZ par vi-sualisation de l'expression du transgène nls-lacZ et du marqueur antigénique d'intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE), l'EBA (endothelial barrier antigen).
Les figures 6A, 6B, 6C et 6D montrent des vaisseaux san-guins situés à distance de la zone de greffe, surlesquels des cellules RBEZ ont migré après transplanta-tion. Sur ces figures, des noyaux de cellules endothélia-les, exprimant le transgène nls-lacZ, en position lumi-nale (flèches) (6A, 6C), peuvent être observées. Ces mêmes vaisseaux, en lumière fluorescente (6B, 6D), expriment l'antigène EBA (têtes de flèches), indiquant ainsi que l'insertion vasculaire des cellules greffées n'a pas altéré l'intégrité de la BHE (x750 en 6A et 6B) ;
(x1500 en 6C et 6D) ; (6A et 6C, en contraste interféren-35 tiel transmis). Le calcul du pourcentage de cellulesgreffées exprimant le transgène a été entrepris. Ainsi, à

WO 96111278 ' 19 PCT/FR95/01313 une semaine post-greffe, 6,9 + 0,6% des cellules Hoechst positives greffées exprime la ~-galactosidase.
L'expression du transgène est importante jusqu'à 5 semaines après l'implantation, mais décroit après. La présence de cellules implantées reste pourtant détectable à l'aide du colorant Hoechst précité.
L'absence de -changements majeurs spécifiques dans la réaction ; mml1n; taire de l'hôte vis-à-vis de la présence du transgène lacZ montre la bonne intégration de ces cel-lules RBEZ.
En outre, les cellules RBE4 et RBEZ ne déve-loppent jamais de tumeurs in vivo, car elles présentent une stabilité importante de leur phénotype.
5) Révélation histochimique X-gal pour la microscopie électronique.
Des animaux (n=10) ont été traités pour une étude ultrastructurale de l'intégration des cellules RBEZ
en microscopie électronique. Dans ce cas, les animaux ont été perfusés par une solution de PBS contenant 2,5% de PFA et 0,5% de glutaraldéhyde. Les cerveaux sont prélevés et laissés dans le même fixateur pendant une nuit. Après rinçage, ils sont coupés au vibratome en sections d'épaisseur 75 ~m.
Pour la visualisation des cellules exprimant le gène lacZ, le substrat X-Gal a été utilisé comme pour la microscopie optique, qui, sous l'action de la ~-galactosidase, forme un précipité dense aux électrons, visible au microscope électronique.
Un pré-repérage du greffon est effectué sur coupe avant traitement au OsO~ à 1%. Ces coupes épaisses sont ensuite déshydratées, puis incluses dans l'épon.
Les blocs de tissus sont ensuite sectionnés avec un ultramicrotome en coupes semi-fines et ultra-fines qui sont contre-colorées ou non à l'acétate d'ura-3S nyle et au citrate de plomb, puis examinées sur un appa-reil JEOL CX100.

WO96/11278 20 PCT~5/01313 La figure 7 illustre l'étude de l'intégration morphologique et fonctionnelle des cellules RBEZ par visualisation de l'expression du transgène nls-lacz en microscopie électronique. La figure 7A montre, en optique Nomarski, le marquage ~-galactosidase peri-nucléaire dans les cellules greffées sur une coupe semi-fine de cerveau (2 um) (x1660~. A l'examen en microscopie électronique, les cellules sont observées soit dans le parenchyme (figure 7B), soit en position vasculaire (fi~ure 7C), formant des vaisseaux sanguins de l'hôte. Les têtes de flèche pointent sur les précipités X-gal péri-nucléaires, denses aux électrons. Même intégrées dans le parenchyme cérébral, en absence de contacts directs avec le compar-timent sanguin, ces cellules endothéliales cérébrales sont capables de survivre pendant de longues périodes.
Les cellules greffées apparaissent métaboliquement acti-ves et capables d'établir des connections spécialisées entre elles et avec les cellules de l'hate (présence de desmosomes et de jonctions serrées). En position vascu-laire, les cellules RBEZ présentent un phénotype normal, dès la première semaine post-greffe (jonction serrée et peu de vésicules de pinocytose) (x160 000 en 7B et 7C) (L
: lumière vasculaire).
III. Celll~les ~R~7 et tumel~rs cérébrales :
1) Implantation :
Les cellules RBEZ à confluence sont trypsini-sées et remises en suspension dans du DMEM sans sérum, immédiatement avant leur implantation dans les animaux hôtes.
- Pour une ;m~l antation intracrfin;~nne, les cellules RBEZ ( 5 .10 cellules) sont injectées stéréotaxi-quement avec une seringue (Hamilton, gauge 26, en biseau), au niveau du noyau caudé et du putamen de rats Fischer 344 (200 à 250 g), après anesthésie.
Les cellules sont injectées dans un volume de 5 ~l et l'aiguille est laissée en place 2 min après l'injection pour limiter les fuites.

CA 02202066 l997-04-07 WO96111278 ~ 21 PCTn~5/01313 - Dans le cadre d'une im~lantation sous-cuta-nee, les rats Fischer anesthésiés reçoivent 100 ~1 conte-nant 106 cellules RBEZ.
~ Pour montrer que de telles cellules s'implantent de préférence dans des régions hypervascula-~ risées telles que des tumeurs, un essai est réalisé en faisant les mêmes implantations (intracrânienne et sous-cutanée) avec un mélange de cellules de gliomes 9L, F98 OU C6 (105 cellules) et de cellules RBEZ, dans les mêmes conditions que ci-dessus.
Après implantation, les tissus sont préparés de manière à faire une étude immunohistochimique et his-tologi~ue.
2) Préparation des tissus :
1~ Les rats sont anesthésiés avec de l'éther et après une thoracotomie, l'oreillette droite est incisée et une canule est insérée dans le ventricule gauche qui est alors perfusé séquentiellement avec un tampon conte-nant NaCl 120 mM, KCl 2,7mM dans un tampon phosphate pH
7,4 (1 ml/g de poids) puis du paraformaldéhyde à 3,7%
(fixateur). Les cerveaux sont placés dans le même fixa-teur, pendant 30 minutes, cryoprotégés avec du saccharose à 30% dans du PBS et congelés. Les tissus sont coupés (12 ~m d'épaisseur) et montés sur lames gélatinées.
3) Mise Qn évidence de la 8ur~ie des cellules et ae l'expression du transgene a) Protocole histochimique et immunoh;sto~
m; que pour la détect;on des cellules RR~ ex~rimant le gène re~orter nls-lacZ :
* Etude histochimique Les préparations sur lames sont rincées trois fois dans un tampon PBS, puis incubées à 37~C pendant 1 à
2 heures dans du PBS contenant 0,5 mg/ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-~-D-galactopyranoside (X-gal), du ferri-3~ cyanure de potassium 20 mM, du ferrocyanure de potassium 20 mM et du MgCl, 2 mM. Les coupes incubées en l'absence de substrat X-gal sont utilisées comme contrôle négati~.

WO96/11278 22 PCT~95/01313 Les coupes sont ensuite rincées dans un tampon PBS et montées en glycérol à 90% dans du PBS, contenant de l'azoture de sodium à 0,02%.
Les conditions de réaction n'entra~nent aucune 5 coloration chez les animaux-contrôle qui n'ont reçu au-cune cellule RBEZ. f * Etude immunohistochimique Quelques coupes présentent une réaction posi-tive à la l~m; n;ne dans la tumeur (détection des micro-10 vaisseaux tumoraux), à l'antigène de prolifération nu-cléaire Ki67 et à l'expression de marqueurs de la bar-rière hématoencéphalique, tel que le transporteur de glu-cose endothélial de type I (glut-l), après coloration avec le X-gal. Pour la coloration à la l~m; n;ne/ les 15 coupes sont digérées pendant 15 minutes à 37~C avec de la pepsine 0,2% dans de l'HCl 0,Ol N avant l'incubation avec les réactifs immunologiques.
Les coupes sont séquentiellement incubées avec du sérum de chèvre normal à 1%, puis soit avec des anti-20 corps de lapin anti-l~m;n;ne, des anticorps de lapin anti-glutl ou des anticorps de lapin anti-Ki67, puis de l~immunoglobuline biotinylée de chèvre anti-lapin est ajoutée (1:200 dans du PBS).
Les coupes sont alors incubées avec un 25 complexe avidine-biotine-peroxydase (l:50 dans du PBS), suivi d'une incubation dans un tampon Tris 50 mM conte-nant 0,5 mg/ml de 3-3'-diaminobenzidine (Sigma) et 0,Ol %
de peroxyde d'hydrogène.
Les lames-contrôle sont incubées avec du sérum 30 de lapin normal à la place du sérum immun. Les sections sont montées en glycérol à 90% dans du PBS.
b) Résult~ts l) Visualisation des cellules RBEZ implantées Après coloration avec le substrat chromogéni-35 que X-Gal, le produit bleu de la réaction avec le ~-ga-lactosidase est identifié dans des coupes histologiques des tumeurs intracrâniennes et sous-cutanées après greffe de cellules tumorales et RBEZ (tableaux I et II).

WO 96/11278 ' 23 PCTIFR95/01313 Aucun produit de réac~ion bleu n'est détecté
dans les tumeurs implantées sans cellule RBEZ. De manière surprenante, les cellules endothéliales gre~ées sont distribuées à travers toutes les tumeurs intracrâniennes, y compris les infiltrations marginales, mais n'apparaissent pas migrer dans les tissus normaux.
2) Intégration des cellules RBEZ implantées Essentiellement toutes les cellules ~-galacto-sidase positives, quelle que soit leur localisation, se10 colorent avec les anticorps antil~m;n;ne, ceci étant en accord avec leur phénotype endothélial. De manière inté-ressante, quelques cellules RBEZ greffées sont associées avec des profils micro-vasculaires tumoraux.
La figure 8 illustre l'intégration de cellules RBEZ dans le tissu tumoral (cellules C6) et son réseau vasculaire (tête de flèche) sur une coupe de tissu cérébral contre-colorée au rouge neutre et en optique Nomarski.
Ceci suggère que les cellules RBEZ implantées de cette façon ont la capacité de s'intégrer d'une manière anatomiquement correcte dans la vascularisation tumorale.
3) Fonctionnalités des cellules RBEZ inté-grées.
2~ Une des caractéristiques les plus importantes de ces cellules endothéliales cérébrales est leur expres-sion élevée du transporteur de type l du glucose (Glut-l), exprimé au niveau de la barrière hémato-encéphalique.
Ceci est important pour le transport trans-endothéliale du D-glucose, le substrat énergëtique essentiel du cer-veau. Les cellules endothéliales dans les gliomes intra-crâniens 9L ou autres expriment également ce transpor-teur. Par contre, l'expression du Glut-l diminue rapide-ment dans les cellules endothéliales cérébrales en cul-ture.
De nombreuses cellules ~-gal positives sont marquées avec les anticorps anti-Glut-l. Ces différents WO96111278 24 PCT~5/01313 essais montrent que des cellules endothéliales cérébrales génétiquement modifiées ex vivo survivent, s'intègrent dans les gliomes intracrâniens et expriment le transgène.
4) Prolifération des cellules RBEZ implantées L'expression de l'antigène Ki67 de proliféra-tion par les cellules RBEZ implantées dans les tumeurs 9L
intracrâniennes est examinée.
De nom~breuses cellules exprimant à la fois le ~-galactosidase nucléaire et l'antigène Ki67 sont obser-vées.
Le nombre de cellules RBEZ implantées par sec-tion tumorale est quantifié par analyse d'images assistéepar ordinateur en utilisant le dispositif d'imagerie (MCID) fourni par la Société Imagine Research Inc.
(Brock. University St Catherines, Ontario, C~n~), une caméra CCD à haute résolution ~m~m~tsu et un ordinateur Compaq DeskPro 486/33.
Le nombre total de cellules RBEZ par tumeur est estimé à partir du nombre de cellules RBEZ par volume tumoral (coupe adjacente de 12 ~m) et le volume tumoral total est estimé à partir des limites de la tumeur, selon deux plans de coupe orthogonaux.
Les Tableaux I et II illustrent les résultats obtenus lors de l'implantation des cellules endothéliales cérébrales modifiées, conform~m~nt à l'invention, dans des gliomes 9L.
TABLEAU I
Nombre de tumeurs Nombre de tumeurs Nombre de jours examinées ~-Gal +après implantation des cellules RBEZ

WO96/11278 '2~ PCT~5/01313 T~RT.~U II

Nombre de cellules Type de tumeurRBEZ/Tumeur (jours) (moyenne + SEM) Intracrânien 9L (J12) 166 440 i 19 550 C6 (J12) 145 840 + 42 160 Sous-cutané 9L (J14) 494 560 + 422 ~00 9L (J21) 5 252 160+ 611 380 5) Identification du gène nls~lacZ dans les tumeurs implantées avec des cellules RBEZ, par PCR.
Des oligonucléotides complémentaires de sé-quences d'ADN, localisées sur le gène nls-lacZ (5'-CGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATC-3') et sur le vecteur, en aval de la séquence 3'LTR (5'-GACCACTGATATCCTGTCTTTAAC-3'), sont utilisés comme amorces. La PCR est réalisée sur de 1~ADN génomique isolé de tumeurs contrôles (tumeur 9L ;
figure 9, lignes 2 et 3)), de tumeurs expérimentales (tumeurs ayant intégré des cellules RBEZ : implantation 14 jours avant l'isolement de l'ADN ; figure 9, lignes 4-1~ 6) et des lignées cellulaires RBEZ (figure 9, ligne 7) et RBE4 (figure 9, ligne 8). 35 cycles d'amplification avec de la Taq polymérase sont réalisées dans les conditions suivantes : dénaturation à 95~C, hybridation à 60~C et élongation à 72~C.
La figure 9 montre les résultats obtenus : le produit de la PCR (400pb) n'est présent que dans les échantillons contenant les cellules RBEZ.
IV. Cellules R~/NGF :
1) Prémarquage au bisbenzimide Hoechst, voir I.
2) I~l~nt~tion :
Juste avant la procédure de greffe, les cellu-les sont rincées trois fois dans une solution de greffe comprenant du PBS supplémenté avec MgClz et CaCl2 à 1 ~g/ml et avec du glucose à 0,1%, de manière à éliminer le milieu DMEM-SVF.

WO96/11278 26 PCT~R95/01313 Chirurgie et implantation des cellules :
Un total de 50 rats mâles adultes, répartis en 2 groupes, appartenant à la souche Lewis, pesant environ 300 g reçoivent une greffe de cellules RBE/NGF prémar-guées au colorant Hoechst, sous anesthésie profonde dansdes conditions stéréotaxiques.
Dix animaux recoivent une implantation stéréo-taxique de cellules RBE/NGF dans le noyau basal droit. Un autre groupe (n = 40) est soumis à une procédure d'injections en sites multiples de cellules RBE/NGF (côté
droit), de manière à réaliser une colonne cellulaire de 2 mm de hauteur entre le noyau basal et le striatum dorsal.
Un total de 300.000 cellules, mises en suspension dans une solution de greffe (3 ~1), est injecté par site à
l'aide d'une micro-seringue de 10 ~1 Exmire~ avec un diamètre d'aiguille externe de 0,5 mm.
Comme procédure de contrôle, des cellules RBE4 non modifiées et marquées au colorant Hoechst sont égale-ment greffées en même temps, de manière controlatérale (côté gauche) et en utilisant les mêmes niveaux stéréo-taxiques. Des coupes coronales et horizontales des cer-veaux greffés sont collectées, entre 1 semaine et 12 mois après la transplantation. Les greffes examinées, visualisées par la fluorescence obtenue à l'aide du colo-rant Hoechst montrent un aspect compact avec un étalementcellulaire faible. Aucune tumorisation des cellules greffées RBE/NGF n'a été observée.
3) Prépar~tion des tissus pour l'immunohistochimie:
1 semaine, 3 s~m~; nes, 5 semaines, 8 semaines et 1 an après implantation, les animaux sont anesthésiés et perfusés en intracardiaque, avec une solution de PBS
0,1 M, pH 7,4 à 4~C, suivi par une perfusion de paraformaldehyde à 4% dans le même tampon. Les cerveaux sont retirés et stockés dans le même tampon pendant une nuit à 4~C. Les cerveaux sont alors stockés dans un tampon PBS comprenant du saccharose à 30% pendant 2 jours WO 96/11278 ' 27 PCT/~95/01313 à 4~C et congelés dans de l'isopentane à -60~C. Les coupes coronales et horizontales (30 ~m d'épaisseur) sont réalisées à l'aide d'un cryostat et collectées dans des puits remplis de PBS à 4~C. Les coupes sont divisées en différents groupes, pour réaliser une analyse immuno-histochimique, ainsi qu'une coloration au bleu de toluidine.
Pour l'analyse immunohistochimique, les coupes sont initialement traitées avec du PBS contenant du H202 0,4 %, pendant 30 minutes, et rincées dans le même tam-pon. Elles sont alors incubées dans un sérum normal à
10%, du même ~n;mAl que celui utilisé pour produire les anticorps secondaires et du Triton X-100 0,1% dans du PBS
pendant 1 heure, puis avec l'un des anticorps primaires suivant :
- Anticorps primaire polyclonal :
anticorps de lapin anti-Glut-l (transporteur de glucose spécifique du cerveau), (1:5000, Biogenesis) ;
anticorps de lapin anti-GFAP (1:6000, Dako); anticorps de chèvre anti-ChAT (1:100, Chemicon), anticorps de lapin anti-l~m;n;ne (1:5000, Sigma).
- Anticorps primaire monoclonal :
anticorps de souris anti-p75 LNGFR (Low affinity NGF receptor) (1:150, clone 192, Boehringer) anticorps de souris anti-CDllb (macrophages de rat) (1:1000, clone MRC OX-42, Serotec) ; anticorps de souris anti-lymphocytes T de rat (1:2000, clone MRC OX-52, Serotec); anticorps de souris anti-complexe majeur d'his-tocompatibilité I de rat (1:1000, clone MRC OX-18, Serotec) ; anticorps de souris anti-CMH classe II (Ia) de rat (1:1000, clone MRC OX-6, Serotec); anticorps de ~ souris anti-EBA (antigène de barrière hémato-encéphali-que, spécifique du rat) (1:1000, clone SMI71, Affiniti).
Tous les anticorps sont dilués dans un tampon PBS contenant 5% de sérum normal (sérum d'âne pour les anticorps polyclonaux, et sérum de mouton pour les anti-corps monoclonaux) et du Triton X-100 à 0,1~ et incubés pendant 36 heures sous agitation à 4~C. Les coupes sont WO96/11278 28 PCT~95/01313 rincées et incubées avec des anticorps biotinylés d'âne anti-IgG de lapin ~1:2000, Amersham), anti-IgG de chèvre (1:1000, Jackson Laboratories) ou des anticorps biotiny-lés de mouton anti-IgG de souris (1:600, Amersham) dans un tampon PBS contenant 5% de sérum normal et 0,1% de Triton X-lO0, pendant une nuit sous agitation à 4~C.
Elles sont rincées, puis incubées avec un complexe biotine-avidine-peroxydase (Vector Laboratories) pendant 30 minutes et rincées à nouveau avec un tampon Tris (TBS
0,l M, pH 7,6). Les coupes sont alors incubées dans une solution de tétrahydrochlorure de diaminobenzidine, avec du chlorure de nickel et du peroxyde d'hydrogène (~~2) dans le tampon TBS ( O, 05 M, pH 7,3). La réaction enzymatique est arrêtée par lavage des coupes dans le tampon. Lesdites coupes sont ensuite contrecolorées et déshydratées, montées sur lames et observées au micro-scope. Un contrôle est systématiquement réalisé en omettant les anticorps primaires et dans ces conditions, les coupes sont toujours non-marquées.
4) Préparation des tissus et détection par hybridation in situ du transgène NGF.
La détection cellulaire des transcrits ~NGF in vivo est mise en évidence par hybridation in situ du NGF
~ARNm) dans le greffon, une semaine après l'implantation dans le cerveau de rat adulte, ainsi qu'à 3 et 8 semaines, dans les conditions suivantes :
Après anesthésie profonde avec de la kétamine (lS0 mg.kg~1, Imalgene) les rats sont perfusés avec du pa-raformaldéhyde à 2~ dans du tampon PBS O, 1 M (pH 7,4, 4~C). Les cerveaux prélevés sont placés dans ce tampon pendant 60 minutes à 4~C. Après une cryoprotection pen-dant une nuit dans une solution de saccharose à 15% dans du PBS 0,1 M à 4~C, une congélation rapide des échan-tillons est réalisée par immersion dans de l'isopentane à
-60~C. Les cerveaux congelés sont coupés horizontalement (10-14 ~m), à l'aide d'un cryostat Microm~, puis montés sur des lames gélatinées et séchées à température ambiante. Les coupes sont pré-hybridées pendant une heure _ _ _ _ _ _ _ _ _ à 40~C dans un tampon 4XSSC, lX Denhardt. L'hybridation est réalisée en chambre humide à 37~C pendant 16 heures, en utilisant comme tampon d'hybridation un mélange 4XSSC, formamide à 50%, sulfate de dextran à 10~, lX Denhardt, 500 ~g/ml d'ADN fragmenté et dénaturé de sperme de saumon et 100 ~g/ml d'ARNt de lewre, contenant la sonde NGF
pr~citée à un~ concentration finale de 2 ~g/ml. Les lames sont lavées séquentiellement dans du 2XSSC pendant une heure à 20~C, puis dans du lxSSC pendant une heure à
20~C, puis dans du lXSSC pendant une demi-heure à 37~C et dans du 0,5XSSC pendant une demi-heure à 20~C. La sonde hybridée, marquée à la digoxigénine, est détectée en utilisant un kit de détection immunoenzymatique (Boehringer-~nnheim), selon les instructions du fabri-cant. Des procédures de contr~le sont réalisées parallè-lement, soit par digestion des ARNms avec de la RNase A
(20 ~g/ml pendant 30 minutes à 37~C), soit par compéti-tion avec un excès de sonde non marquée, (excès de l'or-dre de 40) dans le mélange d'hybridation. Une dilution de la sonde à 0,5 ~g/ml donne un signal faible mais spécifi-que. L'absence de signal est observée lorsque l'on ne met pas la sonde NGF pendant l'hybridation.
Dans ce cas, une présence importante de trans-crits NGF est détectée dans les greffons RBE/NGF, reflé-tant une expression constitutive contrôlée par le LTR dece transgène.
La figure 10 illustre l'étude in vivo de 1~expression du transgène NGF dans les cellules RBE/NGF, trois semaines après transplantation dans le nucleus ba-salis (noyau basal) et la figure 11 illustre les struc-tures cérébrales témoins utilisées comme contrôle interne de l'hybridation in si tu du messager NGF, in vivo .
Les figures lOA et lOB montrent un greffon (G) de cellules RBE/NGF exprimant fortement le transgène NGF
détecté par hybridation in si tu. Cette expression du transgène reste toujours aussi forte 3 semaines après la greffe intra-cérébrale. La figure lOC visualise un gref-fon témoin (G) de cellules RBE4 non infectées, greffé

WO96/11278 ' 30 PCT~5/01313 dans l'hémisphère controlatéral,.qui ne présente aucun signal NGF positif (x130 en lOA~ ; (x270 en lOB et lOC, avec contraste interférentiel transmis). La figure llA
illustre la détection neuronale de NGF, au niveau du cortex fronto-pariétal et la figure llB illustre la détection de NGF au niveau de l'hippocampe (x260 en llA) ; (x65 en llB). Ces figures sont en accord avec la description établie de la synthèse endogène de NGF par les neurones du cortex cérébral et de l'hippocampe chez le rat adulte.
5) effet biologique du NGF produit par le greffon, sur les neurones cholinergiques du noyau basal (effet de bourgeonnement axonal) Pour explorer l'effet biologique du produit du transgène NGF sécrété in ~ivo, le test fonctionnel sui-vant est réalisé : la lignée cellulaire modifiée est greffée comme précisé ci-dessus dans le noyau basal, dans lequel les neurones cholinergiques présentent une réponse très sensible au NGF. Ces neurones cholinergiques, outre leur expression de l'enzyme ChAT, peuvent également etre caractérisés par une immunoréactivité importante au ré-cepteur p75LNGFR. Ce dernier permet de visualiser les fi-bres cholinergiques ainsi que leurs somas cellulaires, spécialement lors des études de régénération axonale. Le bourgeonnement réactionnel détecté par immunoréactivité
p75LNGFR est observé au moins jusqu'à trois semaines, au niveau des greffons RBE/NGF.
Dans le premier groupe greffé, l'effet biolo-gique du NGF produit par les greffons sur les neurones cholinergiques du noyau basal (bourgeonnement ~xo~l) est localisé dans cette région et n'excède pas les limites de cette dernière.
La figure 12 illustre l'effet biologique du NGF sécrété par les cellules RBE/NGF, trois semaines après la greffe, au niveau du nucleus basalis (NB) (action sur la promotion et le maintien de la repousse axonale réactive des neurones cholinergiques lésés après la transplantation). En 12A, une vue générale de la forme CA 02202066 lgg7-o4-o7 WO96tll278 31 PCT~R95/01313 d~un greffon RBE/NGF, placé dans le NB, est visualisée, à
l'aide du prémarquage Hoechst. En 12B, 12D et 12F, l'effet du NGF produit par les cellules endothéliales sur - la repousse axonale est visualisé par la forte 5 immunoréactivité de ces processus axonaux pour le récepteur p75 du NGF. Cette repousse axonale a lieu tout le long du greffon (G) et présente une forte réactivité
autour de certains vaisseaux sanguins (flèches).
En 12C et 12E, 3 semaines après la greffe, des 10 greffons RBE4 témoins non-infectés avec la construction rétrovirale NGF, placés dans le NB de l'hémisphère con-trolatéral, sont incapables de promouvoir et de maintenir une repousse axonale réactive des neurones cholinergiques du NB (x65 en A, B, C, D, E et F, plan horizontal).
Cependant, dans le second groupe, le bourgeon-nement dû au NGF sécrété par les cellules greffées est plus étendu dans l'axe ventro-dorsal, le long de la greffe, liant le noyau basal au striatum dorsal, montrant ainsi les effets trophiques et tropiques du NGF. La fi-20 gure 13 illustre l'effet biologique du NGF sécrété par les cellules RBE/NGF, trois semaines après la greffe, à
distance du nucleus basalis et illustre la croissance di-rectionnelle des prolongements en croissance des neurones cholinergiques du NB, le long du greffon jusqu~au niveau 25 du striatum dorsal. Les figures 13A et 13B illustrent une coupe horizontale passant par la partie dorsale du gref-- fon dans le striatum. En 13A, les cellules RBE/NGF sont visualisées par le colorant nucléaire Hoechst. En 13B, la même coupe a été réalisée en lumière transmise, montrant 30 une repousse axonale réactive visualisée par l'anticorps anti-p75 NGF récepteur (xlO0 en 13A et 13B).
Une quantification de l'effet biologique induit par l'expression du transgène NGF, a été entre-prise selon la méthode décrite par Gundersen H.J.G. et 3~ al. (APMIS, 1988, 96, 379-394), en calculant la surface occupé par l'immunomarquage p75LNGFR au niveau des sites d'implantation des cellules RBE/NGF et RBE4. Le rapport de cette surface et de celle occupée par le greffon a été

WO96/11278 ~ 32 PCTA~5/01313 calculée à 3 et 8 semaines post-implantation et présenté
dans la figure 14 où la surface occupée par les structures p75LNGFR positives (exprimée en pourcentage par rapport à celle du greffon) est portée en ordonnée.
Parmis les différents clones testés in vivo, seuls les deux plus producteurs de NGF in vitro (clones RBE/NGF-2 et -4, précités) ont entraîné un effet biologi-que in vivo, comme résumé dans le Tableau III ci-dessous:
TABLEAU III
Délais p~st-greffe clones 1 3 8 12 semaine s~m~; nes s~m~; nes mois NGF4 effet 0/5 5/5 l/5 0/2 biologique NGF mRNA 2/2 2/2 0/2 Hoechst+/n 5/5 5/5 5/5 2/2 NGF4 effet 0/4 (Thalamus)biologique NGF2 effet 0/5 4/5 0/5 0/5 biologique NGF mRNA 2/2 2/2 0/2 Hoechst+/n 5/5 5/5 5/5 3/3 ~ effet biologique: nombre de cerveaux où une croisance neuritique a été observée autour du greffon RBE/NGF par rapport au nombre total de cerveaux greffés.
~ NGF mRNA: nombre de cerveaux où les transcripts du NGF
ont pu être détectés par hybridation in situ par rapport au nombre total de cerveaux traités.
~ Hoechst+/n: nombre d'animaux où des cellules endothé-liales prémarquées au Hoechst ont été détectées par rapport au nombre total d'animaux traités.

6) Tolérance immunologique.
Pour pouvoir étudier la réaction ;mml-nologique de l'hôte vis-à-vis des lignées de cellules endothéliales greffées, des marquages immunohistochimiques ont été réa-lisées, utilisant des marqueurs de macrophages, du complexe majeur d'histocompatibilité et des lymphocytes.
A une semaine, on obser~e une infiltration de macrophages au niveau du site de transplantation, avec une diminution de leur présence avec le temps.
Cette infiltration est liée au traumatisme chirurgical dû à la transplantation.
Cependant, aucune infiltration par des lympho-cytes n'est observée, même un mois après la transplanta-tion.
Ces données suggèrent que de telles greffes sont bien tolérées par l'hôte, qui ne développe pas de réaction de rejet aiguë vis-à-vis des différentes lignées de cellules endothéliales greffées.
Les données ci-dessus montrent qu~aussi bien les cellules RBE4 seules que les cellules RBEZ et les cellules RBE/NGF, survivent et s'intègrent après greffes.
Les cellules RBEZ et RBE/NGF sont capables d'exprimer et/ou de sécréter le produit dudit transgène qui, dans le cas du NGF, a la capacité d';n~ re un effet biologique dans le cerveau.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l~invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien-nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em-brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve-nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente in-vention.

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10 octobre 1994 I-148~
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"En ce qui concerne leq déqignationq dan_ leqquelleq un brevet européen eat ,~-~ nri~ un échantillon du micro-organisme dépo~qé ne qera acceq3ible, ju_qu'à la publication de la mention de la délivrance du brevet européen ou ju~qu'à la date ~ laquelle la ~em~n~e qera rejetée, retirée ou réput~e retirée, que par ia remi~e d'un ~chantillon à un expert dé~igné par le requ~rant. (règle 28.4) de la CBE)".
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"En ce qui concerne les déaignation~ dan~ le~quelle~ un brevet européen e~t r~t,~Stntj~, un ~5chantillon du micro-orga~isme déposé ne tera acce~ible; ju~qu'c~ la publication de la mention de la délivrance du brevet européen ou jusqu'i~ la date à laquelle la demande -~era rejetée, retirée ou r~put~e retirée, que par la remise ~'un échantillon à un expert désigné par le requ~rant. ~règle 28.4) de la CBE)".
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(i) DEPOSANT:
(A) NOM: NEUROTECH SA
(B) RUE: 69 rue de Lourmel (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75015 (A) NOM: CHAVEROT Nathalie (B) RUE: 10 rue Jeanne d'Arc (C) VILLE: Paris (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75013 (A) NOM: COURAUD Pierre-Olivier (B) RUE: 9 rue du Perray (C) VILLE: AUFFARGIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 78610 (A) NOM: LATERRA John (B) RUE: 608 Hastings Road (C) VILLE: BALTIMORE
(D) ETAT OU PROVINCE: MARYLAND
(E) PAYS: U.S.A.
(F) CODE POSTAL: 21286 (A) NOM: ~D1NON~O Jerome (B) RUE: 5 cours du Luzard (C) VILLE: NOISIEL
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 77186 (A) NOM: ROUX Francoise (B) RUE: 27 avenue d'Italie (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 7S013 (A) NOM: STROSBERG Arthur Donny (B) RUE: 66 rue de Javel (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75015 (A) NON: T~TTN~-~RIAN Jean-Leon (B) RUE: 44 rue de la Butte aux Cailles (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75013 (A) NOM: VIGNAIS Lionel (B) RUE: 14 rue Domremy (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75013 (ii) TITRE DE L~ lNv~NllON: LIGNEES TMMOR~ATTSF~.~ DE ~TTUT,~
ENDOT~T~T~T~ CE~RR~T~ ET LEURS APPLICATIONS AU
TRAITEMENT DE DIFFERENTS TROUBLES OU NALADIES P~TMATR~ ET
SECONDAIRES, NEUROLOGIQUES OU PSYCHIATRIQUES.
(iii) NOMBRE DE s~uu~S: 3 W O96/11278 ' 3~ PCTAFR95/01313 (iv) FORME D~ KABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE ~U~POR~ Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #l.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: l:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~QU N~:
(A) L~N~U~UK: 48 paires de bases (B) TYPE: nucl,otide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lin,aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: l:
CTGCTTCTCA 'l'~'l'~'l"l'~'l'CA ACGCCTTGAC GAAGGTGTGA GTCGTGGT 48 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~Qu~:
(A) LON~u~uK: 24 paires de bases (B) TYPE: nucl,otide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lin,aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) L~N~u~u~: 24 paires de bases (B) TYPE: nucl,otide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lin,aire (ii) TYPE DE M~T.~CTJT~~: ADN (g,nomique) (xi) DESCRIPTION DE LA ~QU~N~: SEQ ID NO: 3:
GACCACTGAT A~l~C~l~l~ TAAC 24

Claims (20)

REVENDICATIONS

1°) Lignées de cellules endothéliales de mammifères, caractérisées :
. en ce qu'elles sont constituées par des cellules endothéliales cérébrales immortalisées, présentant au moins l'une des caractéristiques suivantes des cellules endothéliales cérébrales différenciées, de manière stable :
- l'expression de marqueurs endothéliaux, - la sécrétion de substances vasoactives, - l'expression de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), - l'expression de récepteurs hormonaux, et - l'existence de jonctions serrées, . en ce qu'elles comprennent un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à
au moins un gène de sélection, et un vecteur d'expression comprenant une séquence codant pour un polypeptide, une protéine ou un vecteur viral, éventuellement associé à au moins un gène de sélection et éventuellement au moins un gène marqueur et . en ce qu'elles sont capables in vivo de s'intégrer aux vaisseaux cérébraux d'un mammifère hôte et de produire ledit polypeptide, ladite protéine ou ledit vecteur viral.

2°) Lignées de cellules endothéliales selon la revendication 1, caractérisées en ce que le fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène contient le gène de la résistance à
la néomycine et un fragment de l'oncogène T de SV40.

3°) Lignées de cellules endothéliales selon la revendication 1, caractérisées en ce que le fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène contient la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine.

4°) Lignées de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que ledit vecteur d'expression est un vecteur rétroviral, notamment un vecteur MFG.

5°) Lignées de cellules endothéliales selon la revendications 4, caractérisées en ce que le vecteur rétroviral est un vecteur MFG-NB.

6°) Lignées de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que la séquence codant pour un polypeptide ou une protéine est sélectionnée parmi les séquences codant pour :
des enzymes, des inhibiteurs d'enzymes, des cytokines, des neurotrophines, des neurotransmetteurs, des facteurs de croissance, des toxines, des antimétabolites, des neuro-hormones, des gangliosides, des antibiotiques, des facteurs thrombolytiques, des facteurs coagulants, des facteurs vasodilatateurs ou vasoconstricteurs, des facteurs hypo- ou hypercholestérolémiants, des facteurs hyper- ou hypoglycémiants.

7°) Lignées de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'elles sont constituées de cellules endothéliales de capillaires cérébraux.

8°) Lignées de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisées en ce qu'elles comprennent avantageusement, en tant que fragment immortalisant, la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine et en tant que vecteur d'expression, un vecteur rétroviral MFG-NB contenant le gène nls-lacZ codant pour la .beta.-ga-lactosidase.

9°) Lignée de cellules endothéliales selon la revendications 8, caractérisée en ce qu'elle a été déposée sous le n° I-1481 en date du 10 octobre 1994 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur.

10°) Lignée de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elles comprennent avantageusement, en tant que fragment immortalisant, la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine et en tant que vecteur d'expression, un vecteur rétroviral pMMuLVisisNGF codant pour le .beta.NGF murin.

11°) Lignée de cellules endothéliales selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle a été déposée sous le n° I-1482 en date du 10 octobre 1994 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur.

12°) Compositions, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une lignée de cellules endothéliales cérébrales selon l'une quelconque des revendications 1 à
11, associée à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

13°) Compositions selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'elles contiennent de préférence entre 10 4 et 10 5 cellules endothéliales/µl.

14°) Procédé d'obtention d'une lignée cellulaire modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, lequel procédé est caractérisé en ce que:
(1) on réalise une première transfection par :
- culture de cellules endothéliales cérébrales, de préférence de microvaisseaux cérébraux dans un milieu de culture convenable, supplémenté en sérum et en facteurs de croissance, - transfection desdites cellules entre le 2ème et le 6ème passage avec un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire et éventuellement au moins un gène de sélection, notamment un gène codant pour la résistance à un antibiotique, - sélection des cellules transfectées sur un milieu de sélection adapté audit gène de sélection, si nécessaire, (2) puis on réalise une transfection des cellules obtenues en (1) avec un vecteur d'expression contenant la séquence de polypeptide ou de protéine à produire ou un vecteur viral à exprimer.

15°) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la transfection de l'étape (2) est réalisée avec un vecteur rétroviral, de préférence un vecteur MFG dans lequel la séquence codant pour la protéine à
exprimer a été préalablement incorporée.

16°) Utilisation des lignées de cellules endothéliales de mammifères, constituées par des cellules endothéliales cérébrales immortalisées, comprenant un fragment d'acide nucléique incluant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène de sélection, et éventuellement un vecteur d'expression comprenant une séquence codant pour un polypeptide, une protéine ou un vecteur viral, éventuellement associé à au moins un gène de sélection et éventuellement au moins un gène marqueur, pour l'obtention d'un médicament pour le traitement des troubles ou maladies primaires et secondaires neurologiques ou psychiatriques, y compris les tumeurs cérébrales.

17°) Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que ladite lignée de cellules endothéliales est la lignée de cellules endothéliales cérébrales immortalisées, déposées sous le n° I-1142, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes.

18°) Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que ladite lignée de cellules endothéliales est une des lignées de cellules endothéliales cérébrales selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.

19°) Application des lignées de cellules endothéliales de mammifères, constituées par des cellules endothéliales cérébrales immortalisées, comprenant un fragment d'acide nucléique incluant au moins un fragment immoralisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène de sélection, et éventuellement un vecteur d'expression comprenant une séquence codant pour un polypeptide, une protéine ou un vecteur viral, éventuellement associé à au moins un gène de sélection et éventuellement au moins un gène marqueur, pour l'obtention d'un médicament pour stimuler la croissance et la reproduction des animaux d'élevage.

20°) Modèle d'étude de l'intégration cérébrale de cellules vectrices de substances actives, au niveau du cerveau, caractérisé en ce qu'il comprend une lignée cellulaire selon la revendication 8 ou la revendication 9.