EP0787197A1 - Lignees immortalisees de cellules endotheliales cerebrales et leurs applications therapeutiques - Google Patents

Lignees immortalisees de cellules endotheliales cerebrales et leurs applications therapeutiques

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EP0787197A1
EP0787197A1 EP95934188A EP95934188A EP0787197A1 EP 0787197 A1 EP0787197 A1 EP 0787197A1 EP 95934188 A EP95934188 A EP 95934188A EP 95934188 A EP95934188 A EP 95934188A EP 0787197 A1 EP0787197 A1 EP 0787197A1
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EP
European Patent Office
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cells
endothelial
vector
cell lines
expression
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95934188A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nathalie Chaverot
Pierre-Olivier Couraud
John Laterra
Jérôme QUINONERO
Françoise ROUX
Arthur Donny Strosberg
Jean-Léon TCHELINGERIAN
Lionel Vignais
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Neurotech SA
Original Assignee
Neurotech SA France
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Filing date
Publication date
Application filed by Neurotech SA France filed Critical Neurotech SA France
Publication of EP0787197A1 publication Critical patent/EP0787197A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to immortalized lines of mammalian cerebral endothelial cells, possibly modified, as well as to their applications as a drug for preventive or curative aim and in particular for the treatment of various troubled or primary and secondary, neurological or psychiatric diseases, including brain tumors.
  • the first trials in this area mainly concerned neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease or Parkinson's disease, and included intracerebral transplantation of fetal neural tissue or medullo-adrenal tissue into the brain (BJ ⁇ RKLUND A., TINS , 1991, 14, 8, 319-322).
  • primary nervous tissue of fetal origin for cell transplantation in human therapy is a source of many ethical and practical problems; an alternative to this problem is the use of primary cell lines of neural origin (neurons, glial cells, astrocytes for example) or of non-neural cell lines (fibroblasts, myoblasts, chromaffin cells of the medulo-adrenal gland, hepatocytes for example ) (GAGE FH et al., Trends Neurosci., 1991, 14, 328-333). Although adrenal, fibroblast or myoblast cell lines can effectively release active substances in vivo, they are not normally present in the nervous system, can alter the normal function of the nervous system and cause a rejection reaction.
  • the present invention relates to mammalian endothelial cell lines, characterized:
  • MHC major histocompatibility complex
  • tight junctions in that they comprise a nucleic acid fragment comprising at least one immortalizing fragment of a viral or cellular oncogene, optionally associated with at least one selection gene, and an expression vector comprising a sequence coding for a polypeptide, a protein or a viral vector, optionally associated with at least one selection gene and optionally at least one marker gene and
  • the expression vector is understood to mean any fragment of nucleic acid integrated into the genome or present at the cytoplasmic level, and capable of allowing the expression of said polypeptide, protein or viral vector.
  • the nucleic acid fragment comprising at least one immortalizing fragment of an oncogene contains the neomycin resistance gene and a fragment of the SV40 oncogene T.
  • the nucleic acid fragment comprising at least one immortalizing fragment of an oncogene contains the early E1A region of the adenovirus 2 genome and the neomycin resistance gene.
  • said expression vector is a retroviral vector, in particular an MFG vector.
  • the retroviral vector is an MFG-NB vector defective for replication.
  • Said vectors are notably described in MULLIGAN et al. (Proc. Nat. Ac. Sci. USA, 1984, 81, 6349 ⁇ 6353) and FERRY et al. (Proc Natl Acad. Sci. USA, 1990, 88, 8377-8381).
  • said endothelial cells are brain capillary cells.
  • peripheral non-immortalized peripheral vascular endothelial cells have been described, but do not constitute an appropriate vector, in that they do not constitute a pure, homogeneous and sufficient source, with a view to a reproducible application to transplants. and in that they do not exhibit the cerebral endothelial phenotype.
  • the sequence coding for a polypeptide or a protein is selected from the sequences coding for: enzymes, such as proteases, enzyme inhibitors, such as protease inhibitors, cytokines, neurotransmitters, neurotrophins, growth factors, toxins, antimetabolites, neurohormones, gangliosides, antibiotics, thrombolytic factors, coagulating factors, vasodilator or vasoconstrictor factors, hypo or hypercholesterolemic factors, factors hyper- or hypoglycemic agents or any other substance of interest.
  • enzymes such as proteases
  • enzyme inhibitors such as protease inhibitors, cytokines, neurotransmitters, neurotrophins, growth factors, toxins, antimetabolites, neurohormones, gangliosides, antibiotics, thrombolytic factors, coagulating factors, vasodilator or vasoconstrictor factors, hypo or hypercholesterolemic factors, factors hyper- or hypoglycemic agents or any other substance of interest
  • said endothelial cells advantageously comprise, as immortalizing fragment, the early E1A region of the genome of adenovirus 2 and the neomycin resistance gene and as an expression vector, a retroviral vector MFG-NB containing the nls-lacZ gene coding for ⁇ -galactosidase.
  • This cell line was named RBEZ by the inventors.
  • said line was deposited under the number I-1481 on October 10, 1994 with the National Collection of Cultures of Microorganisms held by the Institut Pasteur.
  • said endothelial cells advantageously comprise, as immortalizing fragment, the early region E1A of the genome of adenovirus 2 and the resistance gene to neomycin and as vector, a retroviral vector pMoMuLVisisNGF coding for murine ⁇ -NGF.
  • This cell line was named RBE / NGF-4 by the inventors.
  • said line was deposited under No. 1-1482 on October 10, 1994 with the National Collection of Cultures of Microorganisms held by the Institut Pasteur.
  • endothelial cells of cerebral capillaries integrate well with cerebral vascularization, are very well tolerated and release, in vivo, over a long period, the active substance which they express and find application in the preparation of a composition for the treatment of primary and secondary neurological or psychiatric disorders or diseases, including cerebral tumors or for stimulating the growth and reproduction of farm animals (poultry, sheep, cattle, pigs, equines, lagomorphs, rodents etc. ..).
  • grafted endothelial cells in accordance with the invention adopt a vascular localization.
  • vascular localization does not lead to an exacerbation of cell death and this again at 1 year after implantation.
  • the viral vector is advantageously a modified cytomegalovirus (CMV) (integrative viral vector).
  • CMV modified cytomegalovirus
  • the present invention also relates to compositions, characterized in that they comprise at least one line of cerebral endothelial cells in accordance with the invention, associated with at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
  • compositions preferably contain between 10 4 and 10 5 endothelial cells / ⁇ l.
  • compositions can be advantageously administered intracranially, subcutaneously, intracerebroventricular route, subdural route, venous or arterial route (intracarotide, for example), intramuscular route, intrathecal route.
  • said endothelial cells can be cells of the same species as the host (allograft or homograft) or of a different species (xenograft).
  • the present invention also relates to a process for obtaining a modified cell line according to the invention, which process is characterized in that:
  • a first transfection is carried out by: culture of cerebral endothelial cells, preferably of cerebral microvessels, in a suitable culture medium, supplemented with serum and growth factors,
  • a nucleic acid fragment comprising at least one immortalizing fragment of a viral or cellular oncogene and optionally at least one selection gene, in particular a gene coding for resistance to an antibiotic , - selection of the transfected cells on a selection medium adapted to said selection gene, if necessary,
  • the transfection of step (2) is carried out with a retroviral vector in which the sequence coding for the protein to be expressed has been previously incorporated.
  • step (1) makes it possible to obtain RBE4 cells, immortalized by transfection with a plasmid containing the early region E1A of the genome of adenovirus 2 and the gene for resistance to neomycin under the control of the promoter SV40, which are deposited under the number 1-1142 with the National Collection of Cultures of Micro-organisms (CNCM) held by the Institut Pasteur.
  • CNCM National Collection of Cultures of Micro-organisms
  • the present invention also relates to a model for studying the cerebral integration of vector cells of active substances, in the brain, characterized in that it comprises a REBZ cell line, in accordance with the invention.
  • the present invention also relates to a model for studying and identifying biochemical and cellular systems of the blood-brain barrier in vitro, characterized in that it comprises at least one cell line in accordance with the invention.
  • the present invention further relates to a process for the production of a polypeptide or a protein, characterized in that it comprises the use of at least one endothelial cell line according to the invention, in a suitable bioreactor.
  • FIG. 1 illustrates the in vitro study of the expression of the NGF transgene in RBE / NGF cells, by in si tu hybridization
  • FIGS. 2 and 3 illustrate the stimulation of axonal budding of PC12 cells, obtained from the supernatant of RBE / NGF cells, in vi tro;
  • FIG. 4 illustrates the premarking of RBE4 cells before transplantation, with the nuclear dye HOECHST 33342 (bisbenzimide);
  • FIG. 5 illustrates the visualization of the cells premarked with the Hoechst dye, after transplantation into the brain of an adult rat
  • FIG. 6 illustrates the study of the morphological and functional integration of the RBEZ cells by visualizing the expression of the nlslacZ transgene and of the antigenic marker of integrity of the blood-brain barrier (BBB), the EBA (endothelial barrier). antigen);
  • FIG. 7 illustrates the ultrastructural study in electron microscopy, demonstrating the morphological and functional integration of RBEZ cells after intracerebral graft by visualization of the expression of the nls-lacZ transgene;
  • FIG. 8 illustrates the study of the morphological and functional integration of the RBEZ cells after grafting into an intracerebral tumor, by visualization of the expression of the nls-lacZ transgene;
  • FIG. 9 illustrates the identification of the nls-LacZ gene in tumors implanted with RBEZ cells, by PCR.
  • FIG. 10 illustrates the in vivo study of the expression of the NGF transgene in RBE / NGF cells, three weeks after transplantation into the nucleus basalis (basal nucleus);
  • FIG 11 illustrates the control brain structures used as internal control of hybridization in si tu of the NGF messenger, in vivo;
  • FIG. 12 illustrates the biological effect of NGF secreted by RBE / NGF cells, three weeks after grafting, at the level of the nucleus basalis;
  • FIG. 13 illustrates the biological effect of NGF secreted by RBE / NGF cells, three weeks after grafting, away from the nucleus basalis;
  • FIG. 14 illustrates the quantification of the biological effect induced by the expression of the NGF transgene at 3 and 8 weeks post-grafting and this is reflected by the surface occupied by the immunostaining p75LNGFR relative to the surface of the graft.
  • Endothelial cells of microvessels of rat brains are immortalized by transfection with the plasmid pElA-neo, containing the sequence coding for the adenovirus E1A, followed by the gene for resistance to neomycin.
  • RBE4 A clone, called RBE4, was thus obtained and its characteristics are in particular described in PCT application WO 93/06222 as well as in the articles published in J. Cell. Physiol., 1993, 155, 104-111 and J. Cell. Physiol., 1994, 159, 101-113. This clone was deposited under the number 1-1142 at the National Collection of Cultures of Micro-organisms (CNCM).
  • the calcium phosphate co-precipitation technique was used, as described in PCT application WO 93/06222 and recalled below: the transfection of said cells is carried out on the 5th passage with the abovementioned plasmid (10 ⁇ g) tale
  • the promoter SV40 in addition to the early E1A region of the adenovirus 2 genome and the neomycin resistance gene, the promoter SV40.
  • the cell line obtained has some of the characteristics of brain endothelial cells; in particular, it has an untransformed phenotype: contact inhibition, proliferation dependent on growth and adhesion factors, expression of endothelial differentiation markers (antigen related to factor VIII), agglutinin-binding site of Griffonia simplicifolia and nontumorigenicity in Nude mice.
  • these cells are stimulated by astrocytes to express the specific enzyme markers of the blood-brain barrier, namely, ⁇ -glutamine transferase and alkaline phosphatase.
  • Example 1 The RBE4 cells obtained in Example 1 are subjected to two passages per week, on an ⁇ -MEM / F10 medium (1/1; Seromed, France), supplemented with glutamine
  • a vector MFG-NB, defective for replication, and containing the lacZ gene is obtained by insertion of the sequence coding for the ⁇ -galactosidase of E. coli, fused with a sequence coding for the nuclear localization sequence (nls) of 21 amino acids, from the SV40 T antigen (Kalderon D. et al., Cell, 1984, 39, 499-509).
  • This vector MFG-NB nls-lacZ is introduced into cells producing ov-2 retroviruses (Mulligan et al., Cited above) (recombinant ov-2 retroviral infection) and makes it possible to obtain ⁇ -2-MFG- cell lines. NB.
  • retrovirus producing cells are spread in boxes at a density of 10 6 cells for boxes of 100 mm in diameter, in 7 ml of RPMI 1640 medium, supplemented with 10% fetal calf serum.
  • a volume of 6 ml of medium containing the virus is filtered and used for infection or else stored at -80 ° C. until it is used.
  • RBE4 endothelial cells are spread on a dish at a density of 10 4 cells / cm 2 and after 24 h, the virus (3 ml) is added in the presence of polybrene (10 ⁇ g / ml) for
  • the RBE4 cells are subcultured and reinfected under the same conditions.
  • RBEZ cells are sorted by FACS (fluorescent activated cell sorting; NOLAN et al., PNAS, 1988, 85, 2603-2607), using, as enzyme substrate, ⁇ -D-galactopyranoside fluorescein (FDG) .
  • FACS fluorescent activated cell sorting
  • 10 * RBEZ cells in 100 ⁇ l are incubated at 37 ° C. for 5 min, in a 5 ml polystyrene tube, before the addition of 100 ⁇ l of FDG (2 mM).
  • the cells are placed again at 37 ° C for 1 min, then on ice, and the volume is adjusted to 2 ml. 4) Detection of the expression of the transgene by visualization of the enzymatic activity of ⁇ -galartosidase, using a chromogenic substrate, X-gal.
  • the enzymatic activity is detected by incubation of the cells at 37 ° C. in a PBS buffer containing 2 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside (X-gal), potassium ferricyanide. 20 mM, 20 mM potassium ferrocyanide and MgCl. 2 mM.
  • X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside
  • ⁇ -galactosidase enzyme activity is revealed by the formation of a blue coloration. About 50-80% of RBE4 endothelial cells infected with the retrovirus stain blue during histochemistry, but the level of staining varies from cell to cell. Control (non-infected) RBE4 cells are not stained, under the same conditions.
  • the RBEZ cells obtained are cultured on a support covered with collagen in an ⁇ -MEM / F10 medium, supplemented with 10% fetal calf serum, 2mM glutamine, FGFb 1 ng / ml and G418 300 ⁇ g / ml.
  • the RBE4 cells obtained in Example 1 are subjected to two passages per week, on an ⁇ -MEM / F10 medium (1/1; Seromed, France), supplemented with 2 mM glutamine, 10% fetal calf serum and FGFb 1 ng / ml and G418
  • Example 2 The procedure is as in Example 2, using a retroviral vector pMoMuLVisisNGF, deficient for replication and in which the sequence coding for mouse ⁇ -NGF is inserted (Scott J et al., Nature, 1983, 302, 538- 540).
  • This vector introduced into ⁇ -2 producer cells, makes it possible to obtain ⁇ -2-MoMuLVisisNGF cell lines.
  • the subclones secreting ⁇ NGF are identified using a bi-site ELISA (LADENHEIM et al., J. Neurochem., 1993 , 60, 260-266).
  • a monoclonal anti- ⁇ NGF antibody called 27/21 (0.1 mg / ml in 0.05 M carbonate buffer pH 9.6), is applied to EIA / RIA Costar plates for 2 hours at 37 ° C. The plates are washed 3 times with a mixture of 50 mM Tris HCl, pH 7.4, 200 mM NaCl, CaCl. 10 mM, 0.1% Triton X-100, and 0.05% sodium azide and incubated at 4 ° C overnight in conditioned medium or ⁇ NGF standards (30-1000 pg / ml) in the same buffer supplemented with 1% bovine serum albumin.
  • ⁇ NGF is detected using the same antibody conjugated to ⁇ -D-galactosidase (400 mU / ml), after incubation for 4 hours at 37 ° C.
  • the chromogenic substrate is chlorophenol-red- ⁇ -galac-topyranoside (1 mg / ml in 100 mM Hepes medium, pH 7, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl, 0.1% sodium azide).
  • the absorbance at 570 nm is read after 2 hours at 37 ° C.
  • Two highly positive subclones named RBE / NGF-2 and -4 are selected, as well as two less positive subclones, and this among 94 clones tested.
  • FIG. 1 illustrates the in vitro study of the expression of the NGF transgene in RBE / NGF cells, by in si tu hybridization.
  • FIG. 1A shows an intense signal in the RBE / NGF cells in culture, indicating a high level of expression of the NGF transgene.
  • FIG. 1B the absence of positivity in the non-infected RBE4 control cells is observed (x300 in 1A and 1B) (1B in phase contrast). 4) In vi tro activity of the secreted NGF:
  • the biological activity of NGF secreted in the supernatant of RBE / NGF cells is demonstrated by the property of promoting budding of neurites of rat pheochromocytoma PC12 cells.
  • the RBE / NGF cells are spread out on boxes at a density of 10 4 / cm 2 in boxes 100 mm in diameter and growth is carried out for 3 to 4 days until confluence (10 7 cells /box).
  • the medium is changed (10 ml) and the supernatants are collected after 24 hours. The results are illustrated in FIGS.
  • Figures 2 and 3 have on the abscissa the concentration of NGF (ng / ml) ( Figure 2) or the dilution rate (Figure 3; curve 1: RBE / NGF cells and curve 2: RBE4 cells) and on the ordinate, the percentage of cells carrying neurites.
  • EXAMPLE 4 Cerebral implantation of the RBE4, RBEZ and RBE-NGF cells.
  • RBE4 cells survival and integration.
  • FIG. 4 illustrates the premarking of RBE4 cells, before transplantation, with the nuclear dye HOECHST 33342 (bisbenzimide). Suspended cells are visualized under fluorine microscopy cence, under ultra-violet light. The fluorescence of the dye clearly defines the positively labeled cell nuclei (x270).
  • HOECHST 33342 bisbenzimide
  • the graft has a compact appearance with a weak and constant spreading of certain RBE4 cells, around its mass. This migration takes place essentially along the vascular network of the host, suggesting a preferential interaction between the implanted endothelial cells and the vascular elements of the host.
  • the histological colorings of the brains thus grafted show a minimum of signs of necrotic cells, and this essentially during the first week following the surgical trauma due to the transplant.
  • the cell density is homogeneous (few or no pycnotic cells).
  • the immunoreactivity GFAP glial fibrillary acidic protein
  • characteristic of astrocytes is significant, from 1 week after implantation, both around the graft and in the graft itself, indicating an infiltration of astrocytes in the latter.
  • the implanted RBE4 cells migrate and integrate into the vascular environment with sometimes a direct participation in the vascular network of the host.
  • FIGS. 5A, 5B and 5C show the cells premarked with the Hoechst dye, after transplantation into the brain of an adult rat.
  • Figure 5A shows a general view of the graft area in the brain parenchyma. Fluorescent grafted endothelial cells preferentially accumulate around vascular elements of the host brain. The asterisks mark the path of a blood vessel (x250).
  • Figures 5B and 5C show a high magnification blood vessel located in the implantation area of the graft fon. In 5B, many Hoechst positive RBE4 cells integrated in the luminal (arrows) and perivascular position can be observed. In 5C, this same vessel is immunolabelled by an anti-laminin antibody (specific marker for blood vessels) (x600).
  • an anti-laminin antibody specific marker for blood vessels
  • RBEZ cells survival, integration and expression of the transgene.
  • the cells are rinsed three times in a grafting solution comprising PBS supplemented with MgCl 2 and CaCl. at 1 ⁇ g / ml and in 0.1% glucose, so as to eliminate the DMEM-SVF medium.
  • a total of 300,000 cells suspended in a grafting solution (3 .mu.l) is injected per site using a micro syringe 10 .mu.l Exmire ® having a diameter of 0.5 mm external needle.
  • the anesthetized rats are sacrificed by infusion with 150 ml of PBS and then with 300 ml of 4% PFA in a solution of PBS (0.1 M, pH 7.4) at 4 ° C.
  • the brains were cryoprotected and frozen by embedding in OCT compound ® a cut cryostat.
  • the enzymatic activity of the nls-lacZ transgene is detected by incubation at 37 ° C of the tissue in a PBS buffer containing 2 mM of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ⁇ -D-galactoside (X-gal , Sigma), potassium ferricyanide (20 mM), potassium ferrocyanide (20 mM) and MgCl. (2mM).
  • X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ⁇ -D-galactoside
  • FIG. 6 illustrates the study of the morphological and functional integration of the RBEZ cells by visualization of the expression of the nls-lacZ transgene and of the antigenic marker of integrity of the blood-brain barrier (BBB), the EBA (endothelial barrier antigen ).
  • FIGS. 6A, 6B, 6C and 6D show blood vessels located at a distance from the graft area, on which RBEZ cells have migrated after transplantation.
  • nuclei of endothelial cells, expressing the nls-lacZ transgene, in luminal position (arrows) (6A, 6C) can be observed.
  • the expression of the transgene is important up to 5 weeks after implantation, but decreases afterwards.
  • the presence of implanted cells remains detectable using the aforementioned Hoechst dye.
  • the absence of specific major changes in the host's immune response to the presence of the lacZ transgene shows the good integration of these RBEZ cells.
  • RBE4 and RBEZ cells never develop tumors in vivo, because they exhibit significant stability in their phenotype.
  • Animals (n 10) were treated for an ultrastructural study of the integration of RBEZ cells in electron microscopy.
  • the animals were perfused with a PBS solution containing 2.5% PFA and 0.5% glutaraldehyde.
  • the brains are removed and left in the same fixative overnight. After rinsing, they are cut with a vibratome into sections of thickness 75 ⁇ m.
  • the X-Gal substrate was used as for optical microscopy, which, under the action of ⁇ -galactosidase, forms a dense precipitate with electrons, visible under the electron microscope.
  • a pre-identification of the graft is performed on a section before treatment with OsO 4 at 1%. These thick cups are then dehydrated and then included in the spon.
  • FIG. 7 illustrates the study of the morphological and functional integration of the RBEZ cells by visualization of the expression of the nls-lacZ transgene by electron microscopy.
  • FIG. 7A shows, in Nomarski optics, the peri-nuclear ⁇ -galactosidase labeling in the cells grafted on a semi-thin section of the brain (2 ⁇ m) (x1660). On examination by electron microscopy, the cells are observed either in the parenchyma (FIG.
  • the RBEZ cells present a normal phenotype, from the first week post-transplant (tight junction and few pinocytosis vesicles) (xl60,000 in 7B and 7C) (L: vascular light).
  • the RBEZ cells at confluence are trypsinized and resuspended in DMEM without serum, immediately before their implantation in the host animals.
  • the RBEZ cells (5,105 cells) are injected stereotaxically with a syringe (Hamilton, gauge 26, in bevel), at the level of the caudate nucleus and the putamen of Fischer 344 rats (200 to 250 g), after anesthesia .
  • the cells are injected in a volume of
  • the anesthetized Fischer rats receive 100 ⁇ l containing 10 6 RBEZ cells.
  • a test is carried out by making the same implantations (intracranial and subcutaneous) with a mixture of 9L, F98 or C6 glioma cells (10 5 cells ) and RBEZ cells, under the same conditions as above.
  • the tissues are prepared so as to make an immunohistochemical and histological study.
  • the rats are anesthetized with ether and after a thoracotomy, the right atrium is incised and a cannula is inserted into the left ventricle which is then sequentially perfused with a buffer containing 120 mM NaCl, C1 2.7 mM in a buffer phosphate pH 7.4 (1 ml / g of weight) then paraformaldehyde at 3.7% (fixer).
  • the brains are placed in the same fixative, for 30 minutes, cryoprotected with 30% sucrose in PBS and frozen. The tissues are cut (12 ⁇ m thick) and mounted on gelatinized slides.
  • the preparations on slides are rinsed three times in PBS buffer, then incubated at 37 ° C for 1 to 2 hours in PBS containing 0.5 mg / ml of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D -galactopyranoside (X-gal), 20 mM potassium ferric cyanide, 20 mM potassium ferrocyanide and 2 mM MgCl 2 .
  • X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D -galactopyranoside
  • 20 mM potassium ferric cyanide 20 mM potassium ferrocyanide
  • 2 mM MgCl 2 The sections incubated in the absence of X-gal substrate are used as a negative control.
  • the sections are then rinsed in PBS buffer and mounted to 90% glycerol in PBS, containing 0.02% sodium azide.
  • reaction conditions do not cause any coloration in the control animals which have not received any RBEZ cells.
  • Some sections show a positive reaction to laminin in the tumor (detection of tumor micro-vessels), to the nuclear proliferation antigen Ki67 and to the expression of markers of the blood-brain barrier, such as the endothelial glucose transporter of the type I (glut-1), after staining with X-gal.
  • the sections are digested for 15 minutes at 37 ° C. with 0.2% pepsin in 0.01 N HCl before incubation with the immunological reagents.
  • the sections are sequentially incubated with normal 1% goat serum, then either with anti-laminin rabbit antibodies, anti-glutl rabbit antibodies or anti-Ki67 rabbit antibodies, then biotinylated immunoglobulin anti-rabbit goat is added (1: 200 in PBS).
  • the sections are then incubated with an avidin-biotin-peroxidase complex (1:50 in PBS), followed by an incubation in a 50 mM Tris buffer containing 0.5 mg / ml of 3-3'-diaminobenzidine (Sigma) and 0.01% hydrogen peroxide.
  • control slides are incubated with normal rabbit serum in place of the immune serum.
  • the sections are mounted in 90% glycerol in PBS.
  • the blue product of the reaction with ⁇ -galactosidase is identified in histological sections of intracranial and subcutaneous tumors after grafting of tumor cells and RBEZ (Tables I and II). No blue reaction product is detected in tumors implanted without an RBEZ cell. Surprisingly, the grafted endothelial cells are distributed across all intracranial tumors, including marginal infiltrations, but do not appear to migrate into normal tissue.
  • FIG. 8 illustrates the integration of RBEZ cells into the tumor tissue (C6 cells) and its vascular network (arrowhead) on a section of brain tissue counter-colored with neutral red and in Nomarski optics.
  • RBEZ cells implanted in this way have the ability to integrate in an anatomically correct manner into the tumor vasculature.
  • Glut-1 type 1 glucose transporter
  • the number of RBEZ cells implanted per tumor section is quantified by computer-assisted image analysis using the imaging device (MCID) supplied by the company Imagine Research Inc. (Brock. University St Catherines, Ontario, Canada), a Hamamatsu high resolution CCD camera and a Compaq DeskPro 486/33 computer.
  • MCID imaging device
  • the total number of RBEZ cells per tumor is estimated from the number of RBEZ cells per tumor volume (adjacent section of 12 ⁇ m) and the total tumor volume is estimated from the limits of the tumor, according to two orthogonal cross-sections.
  • Tables I and II illustrate the results obtained during the implantation of the cerebral endothelial cells modified, according to the invention, in 9L gliomas.
  • Oligonucleotides complementary to DNA sequences, located on the nls-lacZ gene (5'- CGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATC-3 ') and on the vector, downstream of the sequence 3'LTR (5'-GACCACTGATATCCTGTCTTTAAC-3'), are used as primers.
  • the PCR is carried out on genomic DNA isolated from control tumors (tumor 9L; FIG. 9, lines 2 and 3)), from experimental tumors (tumors having integrated RBEZ cells: implantation 14 days before the isolation of DNA ; Figure 9, lines 4- 6) and cell lines RBEZ ( Figure 9, line 7) and RBE4 ( Figure 9, line 8).
  • 35 amplification cycles with Taq polymerase are carried out under the following conditions: denaturation at 95 ° C, hybridization at 60 ° C and elongation at 72 ° C.
  • FIG. 9 shows the results obtained: the PCR product (400 bp) is only present in the samples containing the RBEZ cells.
  • the cells are rinsed three times in a grafting solution comprising PBS supplemented with MgCl. and CaCl 2 at 1 ⁇ g / ml and with 0.1% glucose, so as to eliminate the DMEM-SVF medium.
  • a grafting solution comprising PBS supplemented with MgCl. and CaCl 2 at 1 ⁇ g / ml and with 0.1% glucose, so as to eliminate the DMEM-SVF medium.
  • 300 g receive a transplant of RBE / NGF cells premarked with Hoechst dye, under deep anesthesia under stereotaxic conditions.
  • Ten animals receive stereotaxic implantation of RBE / NGF cells in the right basal nucleus.
  • a total of 300,000 cells, suspended in a graft solution (3 ⁇ l), is injected per site using a 10 ⁇ l Exmire ® micro-syringe with an external needle diameter of 0.5 mm .
  • unmodified RBE4 cells labeled with Hoechst dye are also grafted at the same time, contralateral (left side) and using the same stereotaxic levels. Coronal and horizontal sections of the transplanted brains are collected between 1 week and 12 months after transplantation. The grafts examined, visualized by the fluorescence obtained using the Hoechst dye, show a compact appearance with low cell spreading. No tumors of the RBE / NGF transplanted cells were observed.
  • the animals are anesthetized and perfused intracardiac, with a 0.1 M PBS solution, pH 7.4 at 4 ° C, followed by an infusion of paraformaldehyde at 4% in the same buffer.
  • the brains are removed and stored in the same buffer overnight at 4 ° C.
  • the brains are then stored in a PBS buffer comprising 30% sucrose for 2 days. at 4 ° C and frozen in isopentane at -60 ° C.
  • the coronal and horizontal sections (30 ⁇ m thick) are produced using a cryostat and collected in wells filled with PBS at 4 ° C. The sections are divided into different groups, to perform an immunohistochemical analysis, as well as staining with toluidine blue.
  • the sections are initially treated with PBS containing 0.4% H 2 O 2 , for 30 minutes, and rinsed in the same buffer. They are then incubated in a normal 10% serum, from the same animal as that used to produce the secondary antibodies and 0.1% Triton X-100 in PBS for 1 hour, then with one of the following primary antibodies:
  • rabbit anti-Glut-1 antibody (brain-specific glucose transporter), (1: 5000, Biogenesis); rabbit anti-GFAP antibody (1: 6000, Dako); goat anti-ChAT antibody (1: 100, Chemicon), rabbit anti-laminin antibody (1: 5000, Sigma).
  • mouse anti-p75 antibody LNGFR Low affini ty NGF receptor
  • mouse anti-CD11b antibody rat macrophages
  • mouse antibodies against rat T lymphocytes (1: 2000, clone MRC OX-52, Serotec
  • mouse anti major rat histocompatibility complex I (1: 1000, MRC clone OX-18, Serotec)
  • rat aiiti-MHC class II la) mouse antibody (1: 1000, clone MRC OX-6, Serotec
  • mouse anti-EBA antibody blood-brain barrier antigen, rat specific
  • All antibodies are diluted in PBS buffer containing 5% normal serum (donkey serum for polyclonal antibodies, and sheep serum for monoclonal antibodies) and 0.1% Triton X-100 and incubated for 36 hours with stirring at 4 ° C.
  • the cuts are rinsed and incubated with biotinylated donkey antibodies against rabbit IgG (1: 2000, Amersham), anti-goat IgG (1: 1000, Jackson Laboratories) or biotinylated sheep antibodies against mouse IgG (1: 600, Amersham) in PBS buffer containing 5% normal serum and 0.1% Triton X-100, overnight with stirring at 4 ° C.
  • NGF NGF
  • the rats are perfused with 2% paraformaldehyde in 0.1 M PBS buffer (pH 7.4, 4 ° C).
  • the collected brains are placed in this buffer for 60 minutes at 4 ° C.
  • rapid freezing of the samples is carried out by immersion in isopentane at -60 ° C.
  • the frozen brains are cut horizontally (10-14 ⁇ m), using a Microm ® cryostat, then mounted on gelatinized slides and dried at room temperature.
  • the sections are pre-hybridized for one hour at 40 ° C in a 4XSSC buffer, lX Denhardt. Hybridization is carried out in a humid chamber at 37 ° C. for 16 hours, using as a hybridization buffer a mixture of 4XSSC, 50% formamide, 10% dextran sulfate, IX Denhardt, 500 ⁇ g / ml of fragmented DNA. and denatured with salmon sperm and 100 ⁇ g / ml of yeast tRNA, containing the above-mentioned NGF probe at a final concentration of 2 ⁇ g / ml.
  • the slides are washed sequentially in 2XSSC for one hour at 20 ° C, then in IXSSC for one hour at 20 ° C, then in IXSSC for half an hour at 37 ° C and in 0.5XSSC for half -time at 20 ° C.
  • the hybridized probe labeled with digoxigenin, is detected using an immunoenzymatic detection kit (Boehringer-Mannheim), according to the manufacturer's instructions. Control procedures are carried out in parallel, either by digestion of the mRNAs with RNase A (20 ⁇ g / ml for 30 minutes at 37 ° C.), or by competition with an excess of unlabeled probe (excess of the order of 40) in the hybridization mixture. Diluting the probe to 0.5 ⁇ g / ml gives a weak but specific signal. The absence of a signal is observed when the NGF probe is not put on during hybridization.
  • FIG. 10 illustrates the in vivo study of the expression of the NGF transgene in RBE / NGF cells, three weeks after transplantation into the nucleus basalis (basal nucleus) and
  • FIG. 11 illustrates the control brain structures used as internal control of the in situ hybridization of the NGF messenger, in vivo.
  • FIGS. 10A and 10B show a graft (G) of RBE / NGF cells strongly expressing the NGF transgene detected by in situ hybridization. This expression of the transgene remains as strong 3 weeks after the intra-cerebral transplant.
  • FIG. 10C visualizes a control graft (G) of uninfected RBE4 cells, grafted in the contralateral hemisphere, which shows no positive NGF signal (xl30 in 10A); (x270 in 10B and 10C, with transmitted interference contrast).
  • FIG. 11A illustrates the neuronal detection of NGF, in the fronto-parietal cortex and FIG. 11B illustrates the detection of NGF in the hippocampus (x260 in 11A); (x65 in 11B).
  • the modified cell line is grafted as specified above in the basal nucleus, in which the cholinergic neurons exhibit a very sensitive response to NGF .
  • These cholinergic neurons in addition to their expression of the enzyme ChAT, can also be characterized by significant immunoreactivity to the p75LNGFR receptor. The latter makes it possible to visualize the cholinergic fibers as well as their cellular somas, especially during studies of axonal regeneration.
  • the reaction budding detected by immunoreactivity p75LNGFR is observed at least up to three weeks, at the level of the RBE / NGF grafts.
  • the biological effect of NGF produced by grafts on cholinergic neurons of the basal nucleus is localized in this region and does not exceed the limits of the latter.
  • FIG. 12 illustrates the biological effect of the NGF secreted by the RBE / NGF cells, three weeks after the graft, at the level of the nucleus basalis (NB) (action on the promotion and maintenance of the reactive axonal regrowth of the cholinergic neurons damaged after transplantation).
  • NB nucleus basalis
  • FIG. 12A a general view of the form of an RBE / NGF graft, placed in the NB, is displayed, using the Hoechst premarking.
  • 12B, 12D and 12F the effect of NGF produced by endothelial cells on axonal regrowth is visualized by the strong immunoreactivity of these axonal processes for the p75 receptor for NGF. This axonal regrowth takes place all along the graft (G) and has a strong reactivity around certain blood vessels (arrows).
  • non-infected control RBE4 grafts not infected with the NGF retroviral construct, placed in the NB of the contralateral hemisphere, are unable to promote and maintain reactive axonal regrowth of NB cholinergic neurons (x65 in A, B, C, D, E and F, horizontal plane).
  • FIG. 13 illustrates the biological effect of the NGF secreted by the RBE / NGF cells, three weeks after the graft, at a distance from the nucleus basalis and illustrates the directional growth of the growing extensions of the NB cholinergic neurons, along the graft up to at the level of the dorsal striatum.
  • FIGS. 13 illustrates the biological effect of the NGF secreted by the RBE / NGF cells, three weeks after the graft, at a distance from the nucleus basalis and illustrates the directional growth of the growing extensions of the NB cholinergic neurons, along the graft up to at the level of the dorsal striatum.
  • 13A and 13B illustrate a horizontal section passing through the dorsal part of the graft in the striatum.
  • the RBE / NGF cells are visualized by the Hoechst nuclear dye.
  • 13B the same section was made in transmitted light, showing a reactive axonal regrowth visualized by the anti-p75 NGF receptor antibody (x100 in 13A and 13B).
  • a quantification of the biological effect induced by the expression of the NGF transgene was undertaken according to the method described by Gundersen HJG et al. (APMIS, 1988, 96, 379-394), by calculating the area occupied by the p75LNGFR immunostaining at the implantation sites of the RBE / NGF and RBE4 cells. The ratio of this area to that of the graft was calculated at 3 and 8 weeks post-implantation and presented in Figure 14 where the area occupied by positive p75LNGFR structures (expressed as a percentage relative to that of the graft) is plotted on the ordinate.
  • immunohistochemical labeling was carried out, using macrophage markers, the major histocompatibility complex and lymphocytes.
  • the above data show that both RBE4 cells alone, RBEZ cells and RBE / NGF cells survive and integrate after transplants.
  • the RBEZ and RBE / NGF cells are capable of expressing and / or secreting the product of said transgene which, in the case of NGF, has the capacity to induce a biological effect in the brain.

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Abstract

Lignées immortalisées de cellules endothéliales cérébrales de mammifères, éventuellement modifiées, ainsi que leurs applications comme médicament à visée préventive ou curative et notamment pourle traitement de différents troubles ou maladies primaires et secondaires, neurologiques ou psychiatriques, y compris les tumeurs cérébrales et pour la stimulation de la croissance et la reproduction des animaux d'élevage. Procédé de préparation desdites lignées. Lesdites lignées de cellules endothéliales de mammifères, sont constituées par des cellules endothéliales cérébrales immortalisées, présentant au moins l'une des caractéristiques suivantes des cellules endothéliales cérébrales différenciées, de manière stable: l'expression de marqueurs endothéliaux, la sécrétion de substances vasoactives, l'expression de molécules du complexe majeur d'histocompatiblité (CMH), l'expression de récepteurs hormonaux, et l'existence de jonctions serrées, comprennent un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène de sélection, et un vecteur d'expression comprenant une séquence codant pour un polypeptide, une protéine ou un vecteur viral, éventuellement associé à au moins un gène de sélection et éventuellement au moins un gène marqueur et sont capables in vivo de s'intégrer aux vaisseaux cérébraux d'un mammifère hôte et de produire ledit polypeptide, ladite protéine ou ledit vecteur viral.

Description

Lignées Immortalisées de cellules endothéliales cérébrales et leurs applications thérapeutiques
La présente invention est relative à des lignées immortalisées de cellules endothéliales cérébrales de mammifères, éventuellement modifiées, ainsi qu'à leurs applications comme médicament à visée préventive ou curative et notamment pour le traitement de différents troublés ou maladies primaires et secondaires, neurologiques ou psychiatriques, y compris les tumeurs cérébrales.
Depuis quelques années, de nouvelles méthodes de traitement d'un certain nombre de troubles neurologiques, antérieurement considérés comme réfractaires à tous les traitements conventionnels, font appel à la thérapie génique. Ces nouvelles méthodes sont liées notamment aux progrès réalisés dans le domaine de la construction de vecteurs d'expression efficaces, de transporteurs de transgènes viraux et cellulaires et dans la caractérisation de cellules cibles appropriées à la thérapie génique du système nerveux.
Deux approches différentes sont essentiellement proposées pour réaliser le transfert de gènes dans le système nerveux : une approche dite in vivo qui est concentrée sur le transfert direct du matériel génétique aux cellules in vivo, en utilisant des agents viraux et chimiques et une approche ex vivo, qui se caractérise en ce que le transfert génique est effectué dans des cellules en culture, qui sont ensuite implantées dans l'organisme hôte. Cette dernière approche comprend des étapes de manipulations moléculaires, de clonage et d'implantation des cellules, de manière à permettre la distribution des substances actives chez l'hôte (SUHR S. T. et al., Arch. Neurol., 1993, 50, 1252-1268).
De nombreux troubles neurologiques sont en rapport avec des lésions ou dysfonctions focalisées du système nerveux et ont donc été choisis pour tester ces techniques. Les premiers essais, dans ce domaine ont essentiellement concernés des maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer ou la maladie de Parkinson et comprennent la greffe intracérébrale de tissu neural foetal ou de tissu médullo-surrénalien dans le cerveau (BJÔRKLUND A., TINS, 1991, 14, 8, 319-322).
L'utilisation de tissus nerveux primaires d'origine foetale, pour la transplantation cellulaire en thérapie humaine est une source de nombreux problèmes éthiques et pratiques ; une alternative à ce problème est l'utilisation de lignées cellulaires primaires d'origine neurale (neurones, cellules gliales, astrocytes par exemple) ou de lignées cellulaires non neurales (fibroblastes, myoblastes, cellules chromaffines de la médulo-surrénale, hepatocytes, par exemple) (GAGE FH et al., Trends Neurosci., 1991, 14, 328-333). Bien que les lignées cellulaires de médullo-surrénale, de fibroblastes ou de myoblastes puissent effectivement libérer des substances actives in vivo, elles ne sont pas normalement présentes dans le système nerveux, peuvent modifier la fonction normale du système nerveux et entraîner une réaction de rejet.
Or, dans le but de traiter des troubles ou maladies neurologiques ou psychiatriques, y compris des tumeurs cérébrales, délimités ou non à une zone spécifique du cerveau, il est nécessaire de disposer d'un vecteur cellulaire qui puisse parfaitement s'intégrer au tissu nerveux, tout en exprimant, de manière stable, une substance bioactive, notamment une protéine.
En conséquence, les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à un vecteur cellulaire qui répond mieux aux besoins de la pratique, notamment en ce qu'il exprime, de manière stable et in vivo, au moins un polypeptide ou une protéine, préalablement sélectionné ou un vecteur viral, en ce qu'il soit d'origine cérébrale, capable de s'intégrer à la vascularisation cérébrale normale et en ce qu'il soit bien toléré. La présente invention a pour objet des lignées de cellules endothéliales de mammifères, caractérisées :
. en ce qu'elles sont constituées par des cellules endothéliales cérébrales immortalisées, présentant au moins l'une des caractéristiques suivantes des cellules endothéliales cérébrales différenciées, de manière stable :
- l'expression de marqueurs endothéliaux,
- la sécrétion de substances vasoactives, - l'expression de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH),
- l'expression de récepteurs hormonaux, et
- l'existence de jonctions serrées, en ce qu'elles comprennent un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène de sélection, et un vecteur d'expression comprenant une séquence codant pour un polypeptide, une protéine ou un vecteur viral, éventuel- lement associé à au moins un gène de sélection et éventuellement au moins un gène marqueur et
en ce qu'elles sont capables in vivo de s'intégrer aux vaisseaux cérébraux d'un mammifère hôte et de produire ledit polypeptide, ladite protéine ou ledit vecteur viral.
On entend, au sens de la présente invention, par vecteur d'expression, tout fragment d'acide nucléique intégré dans le génome ou présent au niveau cytoplasmique, et capable de permettre l'expression desdits polypeptide, protéine ou vecteur viral.
Selon un mode de réalisation avantageux desdites lignées, le fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène contient le gène de la résistance à la néomycine et un fragment de l'oncogène T de SV40.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites lignées, le fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène contient la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites lignées, ledit vecteur d'expression est un vecteur rétroviral, notamment un vecteur MFG.
De manière préférée, le vecteur rétroviral est un vecteur MFG-NB défectif pour la réplication.
Lesdits vecteurs sont notamment décrits dans MULLIGAN et al. (Proc. Nat. Ac. Sci. USA, 1984, 81, 6349¬6353) et FERRY et al. (Proc Natl Acad.Sci. USA, 1990, 88, 8377-8381).
Egalement de manière préférée, lesdites cellules endothéliales sont des cellules de capillaires cérébraux.
Des essais mettant en oeuvre des cellules endothéliales primaires vasculaires non immortalisées périphériques ont été décrits, mais ne constituent pas un vecteur approprié, en ce qu'elles ne constituent pas une source pure, homogène et suffisante, en vue d'une application reproductible aux transplantations et en ce qu'elles ne présentent pas le phénotype endothelial cérébral.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux desdites lignées cellulaires, la séquence codant pour un polypeptide ou une protéine est sélectionnée parmi les séquences codant pour : des enzymes, telles que des protéases, des inhibiteurs d'enzymes, tels que des inhibiteurs de protéases, des cytokines, des neurotransmetteurs, des neurotrophines, des facteurs de croissance, des toxines, des antimétabolites, des neurohormones, des gangliosides, des antibiotiques, des facteurs thrombolytiques, des facteurs coagulants, des facteurs vasodilatateurs ou vasoconstricteurs, des facteurs hypoou hypercholestérolémiants, des facteurs hyper- ou hypoglycémiants ou toute autre substance d'intérêt.
Conformément à l'invention, lesdites cellules endothéliales comprennent avantageusement, en tant que fragment immortalisant, la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine et en tant que vecteur d'expression, un vecteur rétroviral MFG-NB contenant le gène nls-lacZ codant pour la β-galactosidase. Cette lignée cellulaire a été dénommée RBEZ par les Inventeurs.
Conformément à l'invention, ladite lignée a été déposée sous le n° I-1481 en date du 10 octobre 1994 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
Egalement conformément à l'invention, lesdites cellules endothéliales comprennent avantageusement, en tant que fragment immortalisant, la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine et en tant que vecteur, un vecteur rétroviral pMoMuLVisisNGF codant pour le β-NGF murin.
Cette lignée cellulaire a été dénommée RBE/NGF-4 par les Inventeurs.
Conformément à l'invention, ladite lignée a été déposée sous le n° 1-1482 en date du 10 octobre 1994 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
De manière inattendue, de telles cellules endothéliales de capillaires cérébraux s'intègrent bien à la vascularisation cérébrale, sont très bien tolérées et libèrent, in vivo, sur une longue période, la substance active qu'elles expriment et trouvent application à la préparation d'une composition pour le traitement des troubles ou maladies primaires et secondaires neurologiques ou psychiatriques, y compris les tumeurs cérébraies ou pour stimuler la croissance et la reproduction des animaux d'élevage (volailles, ovins, bovins, porcins, équidés, lagomorphes, rongeurs etc ...).
En particulier, dans le noyau basai et dans le striatum, de nombreuses cellules endothéliales greffées conformes à l'invention adoptent une localisation vasculaire. Dans les deux sites d'implantation un nombre non négligeable de cellules greffées ne sont pas associées au réseau vasculaire de l'hôte. Cette localisation non vasculaire n'entraîne pas une exacerbation de la mort cellulaire et ceci encore à 1 an après l'implantation.
Conformément à l'invention, le vecteur viral est avantageusement un cytomégalovirus (CMV) modifié (vecteur viral intégratif).
La présente invention a également pour objet des compositions, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une lignée de cellules endothéliales cérébraies conformes à l'invention, associée à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
De telles compositions contiennent de préférence entre 104 et 105 cellules endothéliales/μl.
De telles compositions peuvent être avantageusèment administrées par voie intracrânienne, voie souscutanée, voie intra-cérébroventriculaire, voie subdurale, voie veineuse ou artérielle (intracarotide, par exemple), voie intramusculaire, voie intrathécale.
Conformément à l'invention, lesdites cellules endothéliales peuvent être des cellules de même espèce que l'hôte (allogreffe ou homogreffe) ou d'espèce différente (xénogreffe).
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une lignée cellulaire modifiée conforme à l'invention, lequel procédé est caractérisé en ce que:
(1) on réalise une première transfection par : culture de cellules endothéliales cérébrales, de préférence de microvaisseaux cérébraux, dans un milieu de culture convenable, supplémenté en sérum et en facteurs de croissance,
- transfection desdites cellules entre le 2ème et le 6ème passage avec un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire et éventuellement au moins un gène de sélection, notamment un gène codant pour la résistance à un antibiotique, - sélection des cellules transfectées sur un milieu de sélection adapté audit gène de sélection, si nécessaire,
(2) puis on réalise une transfection des celIules obtenues en (1) avec un vecteur contenant la séquence de polypeptide ou de protéine à produire ou un vecteur viral à exprimer.
De manière préférée, la transfection de l'étape (2) est réalisée avec un vecteur rétroviral dans lequel la séquence codant pour la protéine à exprimer a été préalablement incorporée.
De manière préférée, l'étape (1) permet d'obtenir des cellules RBE4, immortalisées par transfection avec un plasmide contenant la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine sous contrôle du promoteur SV40, qui sont déposées sous le n° 1-1142 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) tenue par l'Institut Pasteur.
La présente invention a également pour objet un modèle d'étude de l'intégration cérébrale de cellules vectrices de substances actives, au niveau du cerveau, caractérisé en ce qu'il comprend une lignée cellulaire REBZ, conforme à l'invention.
La présente invention a également pour objet un modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques et cellulaires de la barrière hémato-encéphalique in vitro, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire conforme à l'invention.
La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de production d'un polypeptide ou d'une protéine, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre d'au moins une lignée de cellules endothéliales conforme à l'invention, dans un bioréacteur convenable.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 illustre l'étude in vi tro de l'expression du transgène NGF dans les cellules RBE/NGF, par hybridation in si tu ;
- les figures 2 et 3 illustrent la stimulation du bourgeonnement axonal de cellules PC12, obtenue à partir du surnageant des cellules RBE/NGF, in vi tro ;
- la figure 4 illustre le prémarquage des celIules RBE4 avant la transplantation, par le colorant nucléaire HOECHST 33342 (bisbenzimide) ;
- la figure 5 illustre la visualisation des cellules prémarquées au colorant Hoechst, après transplantation dans le cerveau de rat adulte ;
- la figure 6 illustre l'étude de l'intégration morphologique et fonctionnelle des cellules RBEZ par visualisation de l'expression du transgène nlslacZ et du marqueur antigénique d'intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE), l'EBA (endothelial barrier antigen) ;
- la figure 7 illustre l'étude ultrastructurale en microscopie électronique, démontrant l'intégration morphologique et fonctionnelle des cellules RBEZ après greffe intracérébrale par visualisation de l'expression du transgène nls-lacZ ;
- la figure 8 illustre l'étude de l'intégration morphologique et fonctionnelle des cellules RBEZ après greffe dans une tumeur intracérébrale, par visualisation de l'expression du transgène nls-lacZ ;
- la figure 9 illustre l'identification du gène nls-LacZ dans des tumeurs implantées avec des cellules RBEZ, par PCR .
- la figure 10 illustre l'étude in vivo de l'expression du transgène NGF dans les cellules RBE/NGF, trois semaines après transplantation dans le nucleus basalis (noyau basai) ; - la figure 11 illustre les structures cérébrales témoins utilisées comme contrôle interne de l'hybridation in si tu du messager NGF, in vivo ;
- la figure 12 illustre l'effet biologique du NGF sécrété par les cellules RBE/NGF, trois semaines après la greffe, au niveau du nucleus basalis ;
- la figure 13 illustre l'effet biologique du NGF sécrété par les cellules RBE/NGF, trois semaines après la greffe, à distance du nucleus basalis ;
- la figure 14 illustre la quantification de l'effet biologique induit par l'expression du transgène NGF à 3 et 8 semaines post-greffe et ceci est traduit par la surface occupée par l'immunomarquage p75LNGFR par rapport à la surface du greffon.
II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Préparation des cellules endothéliales cérébraies immortalisées RBE4.
Des cellules endothéliales de microvaisseaux de cerveaux de rats (culture primaire) sont immortalisées par transfection avec le plasmide pElA-néo, contenant la séquence codant pour l'adénovirus E1A, suivie par le gène de résistance à la néomycine.
Un clone, dénommé RBE4, a été ainsi obtenu et ses caractéristiques sont en particulier décrites dans la Demande PCT WO 93/06222 ainsi que dans les articles parus dans J. Cell. Physiol., 1993, 155, 104-111 et J. Cell. Physiol., 1994, 159, 101-113. Ce clone a été déposé sous le n° 1-1142 à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM).
Pour réaliser la transfection, la technique de co-précipitation au phosphate de calcium a été utilisée, comme décrit dans la Demande PCT WO 93/06222 et rappelé ci-après : la transfection desdites cellules est réalisée au 5ème passage avec le plasmide précité (10 μg) conte nant, outre la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine, le promoteur SV40.
Cette transfection a lieu après mise en culture de ces cellules dans des boîtes recouvertes de collagene, contenant un milieu α-MEM/FlO (2/3 ; 1/3), supplémenté en sérum de veau foetal (SVF) à 10 %, en FGFb
1 ng/ml, en glutamine (2 mM) et en pénicilline/streptomycine. La lignée cellulaire obtenue possède certaines des caractéristiques des cellules endothéliales cérébrales ; elle possède notamment un phénotype non transformé : inhibition de contact, prolifération dépendant des facteurs de croissance et d'adhérence, expression de marqueurs de différenciation endothéliales (antigène apparenté au facteur VIII), site de liaison à l'agglutinine de Griffonia simplicifolia et nontumorigénicité chez les souris Nude.
De plus, ces cellules sont stimulées par les astrocytes pour exprimer les marqueurs enzymatiques spécifiques de la barrière hémato-encéphalique, à savoir, la γ-glutamine transférase et la phosphatase alcaline.
EXEMPLE 2 : Préparation des cellules endothéliales cérébrales RBEZ.
Les cellules RBE4 obtenues à l'exemple 1 sont soumises à deux passages par semaine, sur un milieu α-MEM/F10 (1/1 ; Seromed, France), supplémenté en glutamine
2 mM, sérum de veau foetal à 10 %, FGFb 1 ng/ml et G418
300 μg/ml.
Elles sont étalées à une densité de 104 cellules/cm2 sur des boîtes recouvertes de collagene et utilisées entre les passages 30 et 60.
1) Préparation du vecteur rétroviral :
Un vecteur MFG-NB, défectif pour la réplication, et contenant le gène lacZ est obtenu par insertion de la séquence codant pour la β-galactosidase d' E. coli, fusionnée à une séquence codant pour la séquence de localisation nucléaire (nls) de 21 aminoacides, issue de l'antigène T de SV40 (Kalderon D. et al., Cell, 1984, 39, 499-509). Ce vecteur MFG-NB nls-lacZ est introduit dans des cellules productrices de rétrovirus ψ-2 (Mulligan et al., précité) (infection rétrovirale recombinante de ψ-2) et permet d'obtenir des lignées cellulaires ψ-2-MFG-NB.
Ces cellules productrices de rétrovirus sont étalées en boîte à une densité de 106 cellules pour des boîtes de 100 mm de diamètre, dans 7 ml d'un milieu RPMI 1640, supplémenté en sérum de veau foetal à 10 %.
Après 24 h, un volume de 6 ml de milieu contenant le virus est filtré et utilisé pour l'infection ou bien stocké à -80°C jusqu'à son utilisation.
2) Infection des cellules endothéliales RBE4 : Les cellules RBE4 sont étalées sur boîte à une densité de 104 cellules/cm2 et après 24 h, le virus (3 ml) est ajouté en présence de polybrène (10 μg/ml) pendant
2 h.
Après une autre période de 24 h dans un milieu complet, les cellules RBE4 sont repiquées et réinfectées dans les mêmes conditions.
3) Sélection des cellules endothéliales exprimant le transgène :
Les cellules exprimant la β-galactosidase
(cellules RBEZ) sont triées par FACS (fluorescent activated cell sorting ; NOLAN et al., PNAS, 1988, 85, 2603- 2607), en utilisant, comme substrat de l'enzyme, la β-D-galactopyranoside fluorescéine (FDG).
Conformément à cette technique, 10* cellules RBEZ dans 100 μl, sont incubées à 37°C pendant 5 min, dans un tube en polystyrène de 5 ml, avant l'addition de 100 μl de FDG (2 mM).
Après mélange, les cellules sont placées à nouveau à 37°C pendant 1 min, puis sur de la glace, et le volume est ajusté à 2 ml. 4) Détection de l'expression du transgène par visualisation de l'activité enzymatique de la β-galartosidase, à l'aide d'un substrat chromogène, le X-gal.
. Protocole :
L'activité enzymatique est détectée par incubation des cellules à 37°C, dans un tampon PBS contenant du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) 2 mM, du ferricyanure de potassium 20 mM, du ferrocyanure de potassium 20 mM et du MgCl. 2 mM.
. Résultats :
La présence d'une activité enzymatique β-galactosidase se révèle par la formation d'une coloration bleue. Environ 50-80% des cellules endothéliales RBE4 infectées par le rétrovirus se colorent en bleu lors de l'histochimie, mais le niveau de coloration varie d'une cellule à l'autre. Les cellules RBE4 témoins (non infectées) ne sont pas colorées, dans les mêmes conditions.
5) Propriétés des cellules RBEZ in vitro :
- Les cellules RBEZ obtenues sont cultivées sur un support recouvert de collagene dans un milieu α- MEM/F10, supplémenté en sérum de veau foetal à 10 %, glutamine 2mM, FGFb 1 ng/ml et G418 300 μg/ml.
Ces cellules présentent une inhibition de contact et une prolifération dépendant des facteurs de croissance et d'adhérence ; elles expriment, en outre, des marqueurs de différenciation endothéliale.
EXEMPLE 3 : Préparation des cellules endothéliales cérébrales RBE/NGF.
Les cellules RBE4 obtenues à l'exemple 1 sont soumises à deux passages par semaine, sur un milieu α-MEM/F10 (1/1 ; Seromed, France), supplémenté en glutamine 2 mM, sérum de veau foetal à 10 % et FGFb 1 ng/ml et G418
300 μg/ml.
Elles sont étalées à une densité de 104 cellules/cm2 sur des boîtes recouvertes de collagene et utilisées entre les passages 30 et 60. 1) Préparation du vecteur rétroviral :
On procède comme à l'exemple 2, en utilisant un vecteur rétroviral pMoMuLVisisNGF, déficient pour la réplication et dans lequel la séquence codant pour le β-NGF de souris est insérée (Scott J et al., Nature, 1983, 302, 538-540). Ce vecteur, introduit dans des cellules productrices ψ-2, permet d'obtenir des lignées cellulaires ψ-2-MoMuLVisisNGF.
2) Infection des cellules endothéliales RBE4 : On procède comme à l'exemple 2.
3) Sélection des cellules endothéliales exprimant le transgène par une méthode ELISA bi-site :
A la suite de sous-clonages des cellules RBE4 infectées par la méthode des dilutions limites, les sousclones sécrétant du βNGF (cellules RBE/NGF) sont identifiés en utilisant un ELISA bi-site (LADENHEIM et al., J. Neurochem., 1993, 60, 260-266).
De manière plus précise, un anticorps monoclonal anti-βNGF, dénommé 27/21 (0,1 mg/ml dans un tampon carbonate 0,05 M pH 9,6), est appliqué sur des plaques EIA/RIA Costar pendant 2 heures à 37°C. Les plaques sont lavées 3 fois avec un mélange de Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 200 mM, CaCl. 10 mM, Triton X-100 à 0,1 %, et azoture de sodium à 0,05% et incubées à 4°C pendant une nuit dans un milieu conditionné ou des standards βNGF (30-1000 pg/ml) dans le même tampon supplémenté avec de la sérum albumine bovine à 1% .
Après lavages, le βNGF est détecté à l'aide du même anticorps conjugué à la β-D-galactosidase (400 mU/ml), après incubation pendant 4 heures à 37°C. Le substrat chromogénique est du chlorophénol-rouge-β-galac- topyranoside (1 mg/ml dans un milieu Hepes 100 mM, pH 7, NaCl 150 mM, MgCl. 2 mM, azoture de sodium 0,1%). L'absorbance à 570 nm est lue après 2 heures à 37°C. Deux sous-clones hautement positifs dénommés RBE/NGF-2 et -4 sont sélectionnés, ainsi que deux sous-clones moins positifs, et ce parmi 94 clones testés.
4) Détection cellulaire de la synthèse de NGF par hybridation in si tu de la séquence nucléotidique (ARNm) codant pour le NGF.
Une hybridation in si tu est réalisée avec une sonde de 48 mers, antisens et spécifique de la séquence nucléotidique (ARNm) codant pour le βNGF, correspondant aux positions 897-944 de la séquence d'ADNc du βNGF de souris (SCOTT et al, 1983, Nature 302, 538-540), de formule suivante :
48 mer antisens 5' - 3' NGF mature
5' CTG CTT CTC ATC TGT TGT CAA CGC CTT GAC GAA GGT GTG AGT CGT GGT 3',
de manière à visualiser le transcrit βNGF dans les cellules infectées, en culture. Ces résultats montrent une expression importante d'ARNm du βNGF dans les cellules infectées, à un niveau variable, d'une cellule à l'autre.
La figure 1 illustre l'étude in vi tro de l'expression du transgène NGF dans les cellules RBE/NGF, par hybridation in si tu .
La visualisation immuno-enzymatique de l'expression du transgène NGF est réalisée à l'aide d'une sonde oligonucléotidique antisens spécifique du NGF murin, marquée à la digoxigénine. Dans ces conditions, les hybrides ARNm/sonde NGF sont révélés par un anticorps anti-digoxigénine couplé à la phosphatase alcaline, dont la réaction enzymatique avec le complexe de substrats NBT-BCIP, produit un précipité noirâtre. La figure 1A montre un signal intense dans les cellules RBE/NGF en culture, indiquant un fort niveau d'expression du transgène NGF. En 1B, l'absence de positivité dans les cellules RBE4 témoins, non-infectées est observée (x300 en 1A et 1B) (1B en contraste de phase). 4) Activité in vi tro du NGF sécrété :
L'activité biologique du NGF sécrété dans le surnageant des cellules RBE/NGF est mise en évidence par la propriété de promouvoir un bourgeonnement des neurites des cellules PC12 de phéochromocytome de rat. Pour réaliser ce test, les,cellules RBE/NGF sont étalées sur boîtes à une densité de 104/cm2 dans des boîtes de 100 mm de diamètre et la croissance est réalisée pendant 3 à 4 jours jusqu'à confluence (107 cellules/boîte). Le milieu est changé (10 ml) et les surnageants sont collectés après 24 heures. Les résultats sont illustrés aux figures 2 et 3, qui montrent que le surnageant cellulaire de 24 heures se comporte de la même manière que du NGF purifié (0,1-50 ng/ml), utilisé comme standard interne et conduit à une stimulation du bourgeonnement neuritique chez environ 65% des cellules PC12. En outre, une dilution au 1:40 dudit surnageant présente une activité biologique comparable à du NGF à 0,4 ng/ml (40% de cellules porteuses de neurites). En conséquence, la capacité de sécrétion de NGF biologiquement actif par les cellules RBE/NGF peut être estimée à 16 ng/106 cellules/24 heures.
Ces figures 2 et 3 comportent en abscisse, la concentration en NGF (ng/ml) (figure 2) ou le taux de dilution (figure 3 ; courbe 1 : cellules RBE/NGF et courbe 2 : cellules RBE4) et en ordonnée, le pourcentage de cellules portant des neurites.
EXEMPLE 4 : Implantation cérébrale des cellules RBE4, RBEZ et RBE-NGF.
I. Cellules RBE4 : survie et intégration.
Pour la caractérisation des lignées cellulaires RBE4 transplantées dans le cerveau de rat adulte, une méthode de prémarquage au bisbenzimide Hoechst est utilisée, pour suivre les cellules greffées (GANSMULLER et al., GLIA, 1991, 4, 580-590).
La figure 4 illustre le prémarquage des cellules RBE4, avant la transplantation, par le colorant nucléaire HOECHST 33342 (bisbenzimide). Les cellules en suspension sont visualisées en microscopie à fluorés cence, sous lumière ultra-violette. La fluorescence du colorant définit clairement les noyaux cellulaires positivement marqués (x270).
Trois à huit semaines après implantation des cellules RBE4 marquées, dans différentes régions du cerveau (substance grise et substance blanche), le greffon a un aspect compact avec un étalement faible et constant de certaines cellules RBE4, autour de sa masse. Cette migration se fait essentiellement le long du réseau vasculaire de l'hôte, suggérant une interaction préférentielle entre les cellules endothéliales implantées et les éléments vasculaires de l'hôte.
Les colorations histologiques des cerveaux ainsi greffés montrent un minimum de signes de cellules nécrotique, et ce essentiellement durant la première semaine qui suit le traumatisme chirurgical dû à la transplantation.
A l'intérieur du greffon, la densité cellulaire est homogène (peu ou absence de cellules pycnotiques). L'immunoréactivité GFAP (glial fibrillary acidic protein), caractéristique des astrocytes, est importante, dès 1 semaine après l'implantation, aussi bien autour du greffon que dans le greffon lui-même, indiquant une infiltration d' astrocytes dans ce dernier.
De manière inattendue, les cellules RBE4 implantées migrent et s'intègrent à l'environnement vasculaire avec quelquefois une participation directe au réseau vasculaire de l'hôte.
Les figures 5A, 5B et 5C montrent les cellules prémarquées au colorant Hoechst, après transplantation dans le cerveau de rat adulte. La figure 5A montre une vue générale de la zone de greffe dans le parenchyme cérébral. Les cellules endothéliales greffées fluorescentes semblent s'accumuler préférentiellement autour d'éléments vasculaires du cerveau hôte. Les astérisques matérialisent le trajet d'un vaisseau sanguin (x250). Les figures 5B et 5C montrent un vaisseau sanguin à fort grossissement, situé dans la zone d'implantation du gref fon. En 5B, de nombreuses cellules RBE4 Hoechst positives intégrées en position luminale (flèches) et périvasculaire peuvent être observées. En 5C, ce même vaisseau est immunomarqué par un anticorps anti-laminine (marqueur spécifique des vaisseaux sanguins) (x600).
II. Cellules RBEZ : survie, intégration et expression du transgène.
1) Prémarquage des cellules au bisbenzimide Hoechst.
Voir I.
2) Préparation des cellules avant leur implantation.
Juste avant la procédure de greffe, les cellules sont rincées trois fois dans une solution de greffe comprenant du PBS supplémenté en MgCl2 et CaCl. à 1 μg/ml et en glucose à 0,1%, de manière à éliminer le milieu DMEM-SVF.
3) Chirurgie et implantation des cellules.
Des rats adultes mâles, appartenant à la souche Lewis et pesant 300 g, reçoivent une greffe de cellules RBEZ prémarquées, comme précisé en 1), sous anesthésie profonde, dans des conditions stéréotaxiques (cadre stéréotaxique Kopf®, atlas du cerveau de rat de Paxinos). Vingt animaux reçoivent respectivement une implantation stéréotaxique, dans le noyau basai, de cellules RBEZ (hémisphère cérébral droit) et de cellules contrôles RBE4 (hémisphère cérébral gauche).
Un total de 300.000 cellules mises en suspension dans une solution de greffe (3 μl) est injecté par site à l'aide d'une micro seringue de 10 μl Exmire® ayant un diamètre externe d'aiguille de 0,5 mm.
4) Révélation histochimique X-gal pour la microscopie optique.
Les rats anesthésiés sont sacrifiés par perfusion avec 150 ml de PBS puis avec 300 ml de PFA à 4%, dans une solution de PBS (0,1 M, pH 7,4) à 4°C. Pour la révélation de la présence de β-galactosidase, les cerveaux sont cryoprotégés et congelés par inclusion dans un composé OCT® une coupe au cryostat. Après coupe, l'activité enzymatique du transgène nls-lacZ est détectée par incubation à 37°C du tissu dans un tampon PBS contenant 2 mM de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside (X-gal, Sigma), du ferricyanure de potassium (20 mM), du ferrocyanure de potassium (20mM) et du MgCl. (2mM). Ces conditions de réaction n'entraînent pas de coloration chez les animaux contrôles et pour les cellules RBE4 non modifiées greffées (cellules greffées du côté gauche). La localisation cellulaire et la morphologie dans les coupes de tissu est augmentée si nécessaire à l'aide d'une optique Nomarski, qui permet une identification du type cellulaire fiable, dans la structure vasculaire. Cette révélation est associée si nécessaire avec une immunohistochimie EBA, pour une caractérisation cellulaire plus profonde.
La figure 6 illustre l'étude de l'intégration morphologique et fonctionnelle des cellules RBEZ par visualisation de l'expression du transgène nls-lacZ et du marqueur antigénique d'intégrité de la barrière hématoencéphalique (BHE), l'EBA (endothelial barrier antigen). Les figures 6A, 6B, 6C et 6D montrent des vaisseaux sanguins situés à distance de la zone de greffe, sur lesquels des cellules RBEZ ont migré après transplantation. Sur ces figures, des noyaux de cellules endothéliales, exprimant le transgène nls-lacZ, en position luminale (flèches) (6A, 6C), peuvent être observées. Ces mêmes vaisseaux, en lumière fluorescente (6B, 6D), expriment l'antigène EBA (têtes de flèches), indiquant ainsi que l'insertion vasculaire des cellules greffées n'a pas altéré l'intégrité de la BHE (x750 en 6A et 6B) ; (x1500 en 6C et 6D) ; ( 6A et 6C, en contraste interférentiel transmis). Le calcul du pourcentage de cellules greffées exprimant le transgène a été entrepris. Ainsi, à une semaine post-greffe, 6,9 ± 0,.6% des cellules Hoechst positives greffées exprime la β-galactosidase.
L'expression du transgène est importante jusqu'à 5 semaines après l'implantation, mais décroît après. La présence de cellules implantées reste pourtant détectable à l'aide du colorant Hoechst précité. L'absence de - changements majeurs spécifiques dans la réaction immunitaire de l'hôte vis-à-vis de la présence du transgène lacZ montre la bonne intégration de ces celIules RBEZ.
En outre, les cellules RBE4 et RBEZ ne développent jamais de tumeurs in vivo, car elles présentent une stabilité importante de leur phénotype.
5) Révélation histochimique X-gal pour la microscopie électronique.
Des animaux (n=10) ont été traités pour une étude ultrastructurale de l'intégration des cellules RBEZ en microscopie électronique. Dans ce cas, les animaux ont été perfusés par une solution de PBS contenant 2,5% de PFA et 0,5% de glutaraldehyde. Les cerveaux sont prélevés et laissés dans le même fixateur pendant une nuit. Après rinçage, ils sont coupés au vibratome en sections d'épaisseur 75 μm.
Pour la visualisation des cellules exprimant le gène lacZ, le substrat X-Gal a été utilisé comme pour la microscopie optique, qui, sous l'action de la β-galactosidase, forme un précipité dense aux électrons, visible au microscope électronique.
Un pré-repérage du greffon est effectué sur coupe avant traitement au OsO4 à 1%. Ces coupes épaisses sont ensuite déshydratées, puis incluses dans l'épon.
Les blocs de tissus sont ensuite sectionnés avec un ultramicrotome en coupes semi-fines et ultrafines qui sont contre-colorées ou non à l'acétate d'uranyle et au citrate de plomb, puis examinées sur un appareil JEOL CX100. La figure 7 illustre l'étude de l'intégration morphologique et fonctionnelle des cellules RBEZ par visualisation de l'expression du transgène nls-lacZ en microscopie électronique. La figure 7A montre, en optique Nomarski, le marquage β-galactosidase peri-nucléaire dans les cellules greffées sur une coupe semi-fine de cerveau (2 μm) (x1660). A l'examen en microscopie électronique, les cellules sont observées soit dans le parenchyme (figure 7B), soit en position vasculaire (figure 7C), formant des vaisseaux sanguins de l'hôte. Les têtes de flèche pointent sur les précipités X-gal péri-nucléaires, denses aux électrons. Même intégrées dans le parenchyme cérébral, en absence de contacts directs avec le compartiment sanguin, ces cellules endothéliales cérébrales sont capables de survivre pendant de longues périodes. Les cellules greffées apparaissent métaboliquement actives et capables d'établir des connections spécialisées entre elles et avec les cellules de l'hôte (présence de desmosomes et de jonctions serrées). En position vasculaire, les cellules RBEZ présentent un phenotype normal, dès la première semaine post-greffe (jonction serrée et peu de vésicules de pinocytose) (xl60 000 en 7B et 7C) (L: lumière vasculaire).
III. Cellules RBEZ et tumeurs cérébrales :
1) Implantation :
Les cellules RBEZ à confluence sont trypsinisées et remises en suspension dans du DMEM sans sérum, immédiatement avant leur implantation dans les animaux hôtes.
- Pour une implantation intracrânienne, les cellules RBEZ (5.105 cellules) sont injectées stéréotaxiquement avec une seringue (Hamilton, gauge 26, en biseau), au niveau du noyau caudé et du putamen de rats Fischer 344 (200 à 250 g), après anesthésie.
Les cellules sont injectées dans un volume de
5 μl et l'aiguille est laissée en place 2 min après l'injection pour limiter les fuites. - Dans le cadre d'une implantation sous-cutanée, les rats Fischer anesthésiés reçoivent 100 μl contenant 106 cellules RBEZ.
Pour montrer que de telles cellules s'implantent de préférence dans des régions hypervascularisées telles que des tumeurs, un essai est réalisé en faisant les mêmes implantations (intracrânienne et souscutanée) avec un mélange de cellules de gliomes 9L, F98 ou C6 (105 cellules) et de cellules RBEZ, dans les mêmes conditions que ci-dessus.
Après implantation, les tissus sont préparés de manière à faire une étude immunohistochimique et histologique.
2 ) Préparation des tissus :
Les rats sont anesthésiés avec de l'éther et après une thoracotomie, l'oreillette droite est incisée et une canule est insérée dans le ventricule gauche qui est alors perfusé séquentiellement avec un tampon contenant NaCl 120 mM, C1 2,7 mM dans un tampon phosphate pH 7,4 (1 ml/g de poids) puis du paraformaldehyde à 3,7% (fixateur). Les cerveaux sont placés dans le même fixateur, pendant 30 minutes, cryoprotégés avec du saccharose à 30% dans du PBS et congelés. Les tissus sont coupés (12 μm d'épaisseur) et montés sur lames gélatinées.
3) Mise en évidence de la survie des cellules et de l'expression du transgène
a) Protocole histochimique et immunohistochimique pour la détection des cellules RBEZ exprimant le gène reporter nls-lacZ :
* Etude histochimique
Les préparations sur lames sont rincées trois fois dans un tampon PBS, puis incubées à 37°C pendant 1 à 2 heures dans du PBS contenant 0,5 mg/ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal), du ferri- cyanure de potassium 20 mM, du ferrocyanure de potassium 20 mM et du MgCl2 2 mM. Les coupes incubées en l'absence de substrat X-gal sont utilisées comme contrôle négatif. Les coupes sont ensuite rincées dans un tampon PBS et montées en glycérol à 90% dans du PBS, contenant de l' azoture de sodium à 0,02%.
Les conditions de réaction n'entraînent aucune coloration chez les animaux-contrôle qui n'ont reçu aucune cellule RBEZ.
* Etude immunohistochimique
Quelques coupes présentent une réaction positive à la laminine dans la tumeur (détection des micro- vaisseaux tumoraux), à l'antigène de prolifération nucléaire Ki67 et à l'expression de marqueurs de la barrière hématoencéphalique, tel que le transporteur de glucose endothelial de type I (glut-1), après coloration avec le X-gal. Pour la coloration à la laminine, les coupes sont digérées pendant 15 minutes à 37°C avec de la pepsine 0,2% dans de 1 'HCl 0,01 N avant l'incubation avec les réactifs immunologiques.
Les coupes sont séquentiellement incubées avec du sérum de chèvre normal à 1%, puis soit avec des anti-corps de lapin anti-laminine, des anticorps de lapin anti-glutl ou des anticorps de lapin anti-Ki67, puis de l'immunoglobuline biotinylée de chèvre anti-lapin est ajoutée (1:200 dans du PBS).
Les coupes sont alors incubées avec un complexe avidine-biotine-peroxydase (1:50 dans du PBS), suivi d'une incubation dans un tampon Tris 50 mM contenant 0,5 mg/ml de 3-3'-diaminobenzidine (Sigma) et 0,01 % de peroxyde d'hydrogène.
Les lames-contrôle sont incubées avec du sérum de lapin normal à la place du sérum immun. Les sections sont montées en glycérol à 90% dans du PBS.
b) Résultats
1) Visualisation des cellules RBEZ implantées
Après coloration avec le substrat chromogénique X-Gal, le produit bleu de la réaction avec le β-galactosidase est identifié dans des coupes histologiques des tumeurs intracrâniennes et sous-cutanées après greffe de cellules tumorales et RBEZ (tableaux I et II). Aucun produit de réaction bleu n'est détecté dans les tumeurs implantées sans cellule RBEZ. De manière surprenante, les cellules endothéliales greffées sont distribuées à travers toutes les tumeurs intracrâniennes, y compris les infiltrations marginales, mais n'apparaissent pas migrer dans les tissus normaux.
2) Intégration des cellules RBEZ implantées Essentiellement toutes les cellules β-galactosidase positives, quelle que soit leur localisation, se colorent avec les anticorps antilaminine, ceci étant en accord avec leur phenotype endothelial. De manière intéressante, quelques cellules RBEZ greffées sont associées avec des profils micro-vasculaires tumoraux.
La figure 8 illustre l'intégration de cellules RBEZ dans le tissu tumoral (cellules C6) et son réseau vasculaire (tête de flèche) sur une coupe de tissu cérébral contre-colorée au rouge neutre et en optique Nomarski.
Ceci suggère que les cellules RBEZ implantées de cette façon ont la capacité de s'intégrer d'une manière anatomiquement correcte dans la vascularisation tumorale.
3) Fonctionnalités des cellules RBEZ intégrées.
Une des caractéristiques les plus importantes de ces cellules endothéliales cérébrales est leur expression élevée du transporteur de type 1 du glucose (Glut-1), exprimé au niveau de la barrière hémato-encéphalique. Ceci est important pour le transport trans-endothéliale du D-glucose, le substrat énergétique essentiel du cerveau. Les cellules endothéliales dans les gliomes intracrâniens 9L ou autres expriment également ce transporteur. Par contre, l'expression du Glut-1 diminue rapidement dans les cellules endothéliales cérébrales en culture.
De nombreuses cellules β-gal positives sont marquées avec les anticorps anti-Glut-1. Ces différents essais montrent que des cellules endothéliales cérébrales génétiquement modifiées ex vivo survivent, s'intègrent dans les gliomes intracrâniens et expriment le transgène.
4) Prolifération des cellules RBEZ implantées L'expression de l'antigène Ki67 de prolifération par les cellules RBEZ implantées dans les tumeurs 9L intracrâniennes est examinée.
De nombreuses cellules exprimant à la fois le β-galactosidase nucléaire et l'antigène Ki67 sont observées.
Le nombre de cellules RBEZ implantées par section tumorale est quantifié par analyse d'images assistée par ordinateur en utilisant le dispositif d'imagerie (MCID) fourni par la Société Imagine Research Inc. (Brock. University St Catherines, Ontario, Canada), une caméra CCD à haute résolution Hamamatsu et un ordinateur Compaq DeskPro 486/33.
Le nombre total de cellules RBEZ par tumeur est estimé à partir du nombre de cellules RBEZ par volume tumoral (coupe adjacente de 12 μm) et le volume tumoral total est estimé à partir des limites de la tumeur, selon deux plans de coupe orthogonaux.
Les Tableaux I et II illustrent les résultats obtenus lors de l'implantation des cellules endothéliales cérébrales modifiées, conformément à l'invention, dans des gliomes 9L.
5) Identification du gène nls-lacZ dans les tumeurs implantées avec des cellules RBEZ, par PCR.
Des oligonucléotides complémentaires de séquences d'ADN, localisées sur le gène nls-lacZ (5'- CGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATC-3') et sur le vecteur, en aval de la séquence 3'LTR (5'-GACCACTGATATCCTGTCTTTAAC-3'), sont utilisés comme amorces. La PCR est réalisée sur de l'ADN génomique isolé de tumeurs contrôles (tumeur 9L ; figure 9, lignes 2 et 3)), de tumeurs expérimentales (tumeurs ayant intégré des cellules RBEZ : implantation 14 jours avant l'isolement de l'ADN ; figure 9, lignes 4- 6) et des lignées cellulaires RBEZ (figure 9, ligne 7) et RBE4 (figure 9, ligne 8). 35 cycles d'amplification avec de la Taq polymérase sont réalisées dans les conditions suivantes : dénaturation à 95°C, hybridation à 60°C et élongation à 72°C.
La figure 9 montre les résultats obtenus : le produit de la PCR (400pb) n'est présent que dans les échantillons contenant les cellules RBEZ.
IV. Cellules RBE/NGF :
1) Prémarquage au bisbenzimide Hoechst, voir I.
2 ) Implantation :
Juste avant la procédure de greffe, les cellules sont rincées trois fois dans une solution de greffe comprenant du PBS supplémenté avec MgCl. et CaCl2 à 1 μg/ml et avec du glucose à 0,1%, de manière à éliminer le milieu DMEM-SVF. Chirurgie et implantation des cellules :
Un total de 50 rats mâles adultes, répartis en
2 groupes, appartenant à la souche Lewis, pesant environ
300 g reçoivent une greffe de cellules RBE/NGF prémarquées au colorant Hoechst, sous anesthésie profonde dans des conditions stéréotaxiques.
Dix animaux reçoivent une implantation stéréotaxique de cellules RBE/NGF dans le noyau basai droit. Un autre groupe (n = 40) est soumis à une procédure d'injections en sites multiples de cellules RBE/NGF (côté droit), de manière à réaliser une colonne cellulaire de 2 mm de hauteur entre le noyau basai et le striatum dorsal. Un total de 300.000 cellules, mises en suspension dans une solution de greffe (3 μl), est injecté par site à l'aide d'une micro-seringue de 10 μl Exmire® avec un diamètre d'aiguille externe de 0,5 mm.
Comme procédure de contrôle, des cellules RBE4 non modifiées et marquées au colorant Hoechst sont également greffées en même temps, de manière controlatérale (côté gauche) et en utilisant les mêmes niveaux stéréotaxiques. Des coupes coronales et horizontales des cerveaux greffés sont collectées, entre 1 semaine et 12 mois après la transplantation. Les greffes examinées, visualisées par la fluorescence obtenue à l'aide du colorant Hoechst montrent un aspect compact avec un étalement cellulaire faible. Aucune tumorisation des cellules greffées RBE/NGF n'a été observée.
3 ) Préparation des tissus pour l'immunohistochimie:
1 semaine, 3 semaines, 5 semaines, 8 semaines et 1 an après implantation, les animaux sont anesthésiés et perfusés en intracardiaque, avec une solution de PBS 0,1 M, pH 7,4 à 4°C, suivi par une perfusion de paraformaldehyde à 4% dans le même tampon. Les cerveaux sont retirés et stockés dans le même tampon pendant une nuit à 4°C. Les cerveaux sont alors stockés dans un tampon PBS comprenant du saccharose à 30% %endant 2 jours à 4°C et congelés dans de l'isopentane à -60°C. Les coupes coronales et horizontales (30 μm d'épaisseur) sont réalisées à l'aide d'un cryostat et collectées dans des puits remplis de PBS à 4°C. Les coupes sont divisées en différents groupes, pour réaliser une analyse immunohistochimique, ainsi qu'une coloration au bleu de toluidine.
Pour l'analyse immunohistochimique, les coupes sont initialement traitées avec du PBS contenant du H2O2 0,4 %, pendant 30 minutes, et rincées dans le même tampon. Elles sont alors incubées dans un sérum normal à 10%, du même animal que celui utilisé pour produire les anticorps secondaires et du Triton X-100 0,1% dans du PBS pendant 1 heure, puis avec l'un des anticorps primaires suivant :
- Anticorps primaire polyclonal :
anticorps de lapin anti-Glut-1 (transporteur de glucose spécifique du cerveau), (1:5000, Biogenesis) ; anticorps de lapin anti-GFAP (1:6000, Dako); anticorps de chèvre anti-ChAT (1:100, Chemicon), anticorps de lapin anti-laminine (1:5000, Sigma).
- Anticorps primaire monoclonal :
anticorps de souris anti-p75 LNGFR (Low affini ty NGF receptor) (1:150, clone 192, Boehringer) ; anticorps de souris anti-CD11b (macrophages de rat) (1:1000, clone MRC OX-42, Serotec) ; anticorps de souris anti-lymphocytes T de rat (1:2000, clone MRC OX-52, Serotec); anticorps de souris anti-complexe majeur d'histocompatibilité I de rat (1:1000, clone MRC OX-18, Serotec) ; anticorps de souris aiiti-CMH classe II (la) de rat (1:1000, clone MRC OX-6, Serotec); anticorps de souris anti-EBA (antigène de barrière hémato-encéphalique, spécifique du rat) (1:1000, clone SMI71, Affiniti).
Tous les anticorps sont dilués dans un tampon PBS contenant 5% de sérum normal (sérum d'âne pour les anticorps polyclonaux, et sérum de mouton pour les anticorps monoclonaux) et du Triton X-100 à 0,1% et incubés pendant 36 heures sous agitation à 4°C. Les coupes sont rincées et incubées avec des anticorps biotinylés d'âne anti-IgG de lapin (1:2000, Amersham), anti-IgG de chèvre (1:1000, Jackson Laboratories) ou des anticorps biotinylés de mouton anti-IgG de souris (1:600, Amersham) dans un tampon PBS contenant 5% de sérum normal et 0,1% de Triton X-100, pendant une nuit sous agitation à 4°C. Elles sont rincées, puis incubées avec un complexe biotine-avidine-peroxydase (Vector Laboratories) pendant 30 minutes et rincées à nouveau avec un tampon Tris (TBS 0,1 M, pH 7,6). Les coupes sont alors incubées dans une solution de tétrahydrochlorure de diaminobenzidine, avec du chlorure de nickel et du peroxyde d'hydrogène (H2O2) dans le tampon TBS (0,05 M, pH 7,3). La réaction enzymatique est arrêtée par lavage des coupes dans le tampon. Lesdites coupes sont ensuite contrecolorées et déshydratées, montées sur lames et observées au microscope. Un contrôle est systématiquement réalisé en omettant les anticorps primaires et dans ces conditions, les coupes sont toujours non-marquées.
4) Préparation des tissus et détection par hybridation in situ du transgène NGF.
La détection cellulaire des transcrits βNGF in vivo est mise en évidence par hybridation in situ du NGF (ARNm) dans le greffon, une semaine après l'implantation dans le cerveau de rat adulte, ainsi qu'à 3 et 8 semaines, dans les conditions suivantes :
Après anesthésie profonde avec de la kétamine (150 mg.kg-1, Imalgene) les rats sont perfusés avec du paraformaldehyde à 2% dans du tampon PBS 0,1 M (pH 7,4, 4°C). Les cerveaux prélevés sont placés dans ce tampon pendant 60 minutes à 4°C. Après une cryoprotection pendant une nuit dans une solution de saccharose à 15% dans du PBS 0,1 M à 4°C, une congélation rapide des échantillons est réalisée par immersion dans de l'isopentane à -60°C. Les cerveaux congelés sont coupés horizontalement (10-14 μm), à l'aide d'un cryostat Microm®, puis montés sur des lames gélatinées et séchées à température ambiante. Les coupes sont pré-hybridées pendant une heure à 40°C dans un tampon 4XSSC, lX Denhardt. L'hybridation est réalisée en chambre humide à 37°C pendant 16 heures, en utilisant comme tampon d'hybridation un mélange 4XSSC, formamide à 50%, sulfate de dextran à 10%, IX Denhardt, 500 μg/ml d'ADN fragmenté et dénaturé de sperme de saumon et 100 μg/ml d'ARNt de levure, contenant la sonde NGF précitée à une concentration finale de 2 μg/ml. Les lames sont lavées séquentiellement dans du 2XSSC pendant une heure à 20°C, puis dans du IXSSC pendant une heure à 20°C, puis dans du IXSSC pendant une demi-heure à 37°C et dans du 0,5XSSC pendant une demi-heure à 20°C. La sonde hybridée, marquée à la digoxigénine, est détectée en utilisant un kit de détection immunoenzymatique (Boehringer-Mannheim), selon les instructions du fabricant. Des procédures de contrôle sont réalisées parallèlement, soit par digestion des ARNms avec de la RNase A (20 μg/ml pendant 30 minutes à 37°C), soit par compétition avec un excès de sonde non marquée, (excès de l'ordre de 40) dans le mélange d'hybridation. Une dilution de la sonde à 0,5 μg/ml donne un signal faible mais spécifique. L'absence de signal est observée lorsque l'on ne met pas la sonde NGF pendant l'hybridation.
Dans ce cas, une présence importante de transcrits NGF est détectée dans les greffons RBE/NGF, reflétant une expression constitutive contrôlée par le LTR de ce transgène.
La figure 10 illustre l'étude in vivo de l'expression du transgène NGF dans les cellules RBE/NGF, trois semaines après transplantation dans le nucleus basalis (noyau basai) et la figure 11 illustre les structures cérébrales témoins utilisées comme contrôle interne de l'hybridation in situ du messager NGF, in vivo .
Les figures 10A et 10B montrent un greffon (G) de cellules RBE/NGF exprimant fortement le transgène NGF détecté par hybridation in situ . Cette expression du transgène reste toujours aussi forte 3 semaines après la greffe intra-cérébrale. La figure 10C visualise un greffon témoin (G) de cellules RBE4 non infectées, greffé dans l'hémisphère controlatéral, qui ne présente aucun signal NGF positif (xl30 en 10A) ; (x270 en 10B et 10C, avec contraste interférentiel transmis). La figure 11A illustre la détection neuronale de NGF, au niveau du cortex fronto-pariétal et la figure 11B illustre la détection de NGF au niveau de l'hippocampe (x260 en 11A) ; (x65 en 11B). Ces figures sont en accord avec la description établie de la synthèse endogène de NGF par les neurones du cortex cérébral et de l'hippocampe chez le rat adulte.
5) effet biologique du NGF produit par le greffon, sur les neurones cholinergiques du noyau basai (effet de bourgeonnement axonal)
Pour explorer l'effet biologique du produit du transgène NGF sécrété in vivo, le test fonctionnel suivant est réalisé : la lignée cellulaire modifiée est greffée comme précisé ci-dessus dans le noyau basai, dans lequel les neurones cholinergiques présentent une réponse très sensible au NGF. Ces neurones cholinergiques, outre leur expression de l'enzyme ChAT, peuvent également être caractérisés par une immunoreactivite importante au récepteur p75LNGFR. Ce dernier permet de visualiser les fibres cholinergiques ainsi que leurs somas cellulaires, spécialement lors des études de régénération axonale. Le bourgeonnement reactionnel détecté par immunoreactivite p75LNGFR est observé au moins jusqu'à trois semaines, au niveau des greffons RBE/NGF.
Dans le premier groupe greffé, l'effet biologique du NGF produit par les greffons sur les neurones cholinergiques du noyau basai (bourgeonnement axonal) est localisé dans cette région et n'excède pas les limites de cette dernière.
La figure 12 illustre l'effet biologique du NGF sécrété par les cellules RBE/NGF, trois semaines après la greffe, au niveau du nucleus basalis (NB) (action sur la promotion et le maintien de la repousse axonale réactive des neurones cholinergiques lésés après la transplantation). En 12A, une vue générale de la forme d'un greffon RBE/NGF, placé dans le NB, est visualisée, à l'aide du prémarquage Hoechst. En 12B, 12D et 12F, l'effet du NGF produit par les cellules endothéliales sur la repousse axonale est visualisé par la forte immunoreactivite de ces processus axonaux pour le récepteur p75 du NGF. Cette repousse axonale a lieu tout le long du greffon (G) et présente une forte réactivité autour de certains vaisseaux sanguins (flèches).
En 12C et 12E, 3 semaines après la greffe, des greffons RBE4 témoins non-infectés avec la construction rétrovirale NGF, placés dans le NB de l'hémisphère controlatéral, sont incapables de promouvoir et de maintenir une repousse axonale réactive des neurones cholinergiques du NB (x65 en A, B, C, D, E et F, plan horizontal).
Cependant, dans le second groupe, le bourgeonnement dû au NGF sécrété par les cellules greffées est plus étendu dans l'axe ventro-dorsal, le long de la greffe, liant le noyau basai au striatum dorsal, montrant ainsi les effets trophiques et tropiques du NGF. La figure 13 illustre l'effet biologique du NGF sécrété par les cellules RBE/NGF, trois semaines après la greffe, à distance du nucleus basalis et illustre la croissance directionnelle des prolongements en croissance des neurones cholinergiques du NB, le long du greffon jusqu'au niveau du striatum dorsal. Les figures 13A et 13B illustrent une coupe horizontale passant par la partie dorsale du greffon dans le striatum. En 13A, les cellules RBE/NGF sont visualisées par le colorant nucléaire Hoechst. En 13B, la même coupe a été réalisée en lumière transmise, montrant une repousse axonale réactive visualisée par l'anticorps anti-p75 NGF récepteur (x100 en 13A et 13B).
Une quantification de l'effet biologique induit par l'expression du transgène NGF, a été entreprise selon la méthode décrite par Gundersen H.J.G. et al. (APMIS, 1988, 96, 379-394), en calculant la surface occupé par l'immunomarquage p75LNGFR au niveau des sites d'implantation des cellules RBE/NGF et RBE4. Le rapport de cette surface et de celle occupée par le greffon a été calculée à 3 et 8 semaines post-implantation et présenté dans la figure 14 où la surface occupée par les structures p75LNGFR positives (exprimée en pourcentage par rapport à celle du greffon) est portée en ordonnée.
Parmis les différents clones testés in vivo, seuls les deux plus producteurs de NGF in vi tro (clones RBE/NGF-2 et -4, précités) ont entraîné un effet biologique in vivo, comme résumé dans le Tableau III ci-dessous:
6) Tolérance immunologique.
Pour pouvoir étudier la réaction immunologique de l'hôte vis-à-vis des lignées de cellules endothéliales greffées, des marquages immunohistochimiques ont été réalisées, utilisant des marqueurs de macrophages, du complexe majeur d'histocompatibilité et des lymphocytes.
A une semaine, on observe une infiltration de macrophages au niveau du site de transplantation, avec une diminution de leur présence avec le temps.
Cette infiltration est liée au traumatisme chirurgical dû à la transplantation.
Cependant, aucune infiltration par des lymphocytes n'est observée, même un mois après la transplantation.
Ces données suggèrent que de telles greffes sont bien tolérées par l'hôte, qui ne développe pas de réaction de rejet aiguë vis-à-vis des différentes lignées de cellules endothéliales greffées.
Les données ci-dessus montrent qu'aussi bien les cellules RBE4 seules que les cellules RBEZ et les cellules RBE/NGF, survivent et s'intègrent après greffes. Les cellules RBEZ et RBE/NGF sont capables d'exprimer et/ou de sécréter le produit dudit transgène qui, dans le cas du NGF, a la capacité d'induire un effet biologique dans le cerveau.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Lignées de cellules endothéliales de mammifères, caractérisées : . en ce qu'elles sont constituées par des celIules endothéliales cérébrales immortalisées, présentant au moins l'une des caractéristiques suivantes des cellules endothéliales cérébrales différenciées, de manière stable : - l'expression de marqueurs endothéliaux, - la sécrétion de substances vasoactives, - l'expression de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), - l'expression de récepteurs hormonaux, et - l'existence de jonctions serrées, . en ce qu'elles comprennent un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène de sélection, et un vecteur d'expression comprenant une séquence codant pour un polypeptide, une protéine ou un vecteur viral, éventuellement associé à au moins un gène de sélection et éventuellement au moins un gène marqueur et . en ce qu1 elles sont capables in vivo de s ' intégrer aux vaisseaux cérébraux d'un mammifère hôte et de produire ledit polypeptide, ladite protéine ou ledit vecteur viral. 2°) Lignées de cellules endothéliales selon la revendication 1, caractérisées en ce que le fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène contient le gène de la résistance à la néomycine et un fragment de l' oncogène T de SV40. 3°) Lignées de cellules endothéliales selon la revendication 1, caractérisées en ce que le fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène contient la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine. 4°) Lignées de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que ledit vecteur d'expression est un vecteur rétroviral, notamment un vecteur MFG. 5°) Lignées de cellules endothéliales selon la revendications 4, caractérisées en ce que le vecteur rétroviral est un vecteur MFG-NB. 6°) Lignées de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que la séquence codant pour un polypeptide ou une protéine est sélectionnée parmi les séquences codant pour : des enzymes, des inhibiteurs d'enzymes, des cytokines, des neurotrophines, des neurotransmetteurs, des facteurs de croissance, des toxines, des antimétabolites, des neurohormones, des gangliosides, des antibiotiques, des facteurs thrombolytiques, des facteurs coagulants, des facteurs vasodilatateurs ou vasoconstricteurs, des facteurs hypo- ou hypercholestérolémiants, des facteurs hyper- ou hypoglycémiants. 7°) Lignées de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'elles sont constituées de cellules endothéliales de capillaires cérébraux. 8°) Lignées de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisées en ce qu'elles comprennent avantageusement, en tant que fragment immortalisant, la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine et en tant que vecteur d'expression, un vecteur rétroviral MFG-NB contenant le gène nls-lacZ codant pour la β-galactosidase. 9°) Lignée de cellules endothéliales selon la revendications 8, caractérisée en ce qu'elle a été déposée sous le n° 1-1481 en date du 10 octobre 1994 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur. 10°) Lignée de cellules endothéliales selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elles comprennent avantageusement, en tant que fragment immortalisant, la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine et en tant que vecteur d'expression, un vecteur rétroviral pMMuLVisisNGF codant pour le βNGF murin. 11°) Lignée de cellules endothéliales selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle a été déposée sous le n° 1-1482 en date du 10 octobre 1994 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur. 12°) Compositions, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une lignée de cellules endothéliales cérébrales selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, associée à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 13°) Compositions selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'elles contiennent de préférence entre 104 et 105 cellules endothéliales/μl. 14°) Procédé d'obtention d'une lignée cellulaire modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, lequel procédé est caractérisé en ce que:
(1) on réalise une première transfection par :
- culture de cellules endothéliales cérébrales, de préférence de microvaisseaux cérébraux dans un milieu de culture convenable, supplémenté en sérum et en facteurs de croissance,
- transfection desdites cellules entre le 2ème et le 6ème passage avec un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire et éventuellement au moins un gène de sélection, notamment un gène codant pour la résistance à un antibiotique,
- sélection des cellules transfectées sur un milieu de sélection adapté audit gène de sélection, si nécessaire,
(2) puis on réalise une transfection des celIules obtenues en (1) avec un vecteur d'expression contenant la séquence de polypeptide ou de protéine à produire ou un vecteur viral à exprimer. 15°) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la transfection de l'étape (2) est réalisée avec un vecteur rétroviral, de préférence un vecteur MFG dans lequel la séquence codant pour la protéine à exprimer a été préalablement incorporée.
16°) Utilisation des lignées de cellules endothéliales de mammifères, constituées par des cellules endothéliales cérébrales immortalisées, comprenant un fragment d'acide nucléique incluant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène de sélection, et éventuellement un vecteur d'expression comprenant une séquence codant pour un polypeptide, une protéine ou un vecteur viral, éventuellement associé à au moins un gène de sélection et éventuellement au moins un gène marqueur, pour l'obtention d'un médicament pour le traitement des troubles ou maladies primaires et secondaires neurologiques ou psychiatriques, y compris les tumeurs cérébrales.
17°) Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que ladite lignée de cellules endothéliales est la lignée de cellules endothéliales cérébrales immortalisées, déposées sous le n° 1-1142, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes.
18°) Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que ladite lignée de cellules endothéliales est une des lignées de cellules endothéliales cérébrales selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
19°) Application des lignées de cellules endothéliales de mammifères, constituées par des cellules endothéliales cérébrales immortalisées, comprenant un fragment d'acide nucléique incluant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène de sélection, et éventuellement un vecteur d'expression comprenant une séquence codant pour un polypeptide, une protéine ou un vecteur viral, éventuellement associé à au moins un gène de sélection et éventuellement au moins un gène marqueur, pour l'obtention d'un médicament pour stimuler la croissance et la reproduction des animaux d'élevage.
20°) Modèle d'étude de l'intégration cérébrale de cellules vectrices de substances actives, au niveau du cerveau, caractérisé en ce qu'il comprend une lignée cellulaire selon la revendication 8 ou la revendication 9.
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