JPH06329559A - 遺伝子的に修飾された細胞を移植して中枢神経系における欠陥、疾病、あるいは損傷を治療するための方法 - Google Patents

遺伝子的に修飾された細胞を移植して中枢神経系における欠陥、疾病、あるいは損傷を治療するための方法

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JPH06329559A
JPH06329559A JP5136554A JP13655493A JPH06329559A JP H06329559 A JPH06329559 A JP H06329559A JP 5136554 A JP5136554 A JP 5136554A JP 13655493 A JP13655493 A JP 13655493A JP H06329559 A JPH06329559 A JP H06329559A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 遺伝子的に修飾された細胞を移植して、中枢
神経系の欠陥、疾病、あるいは損傷を治療するための方
法を提供する。 【構成】 中枢神経系において細胞の機能を回復するか
あるいは改善する効果を有する機能性分子を生産するこ
とができる修飾されたドナー細胞を、遺伝子操作によっ
て生成する。そして生成されたドナー細胞は、中枢神経
系の欠陥、疾病、あるいは損傷を治療するために注入し
て移植される。移植された細胞からは、細胞を修復する
のに充分量の機能性分子が発現する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ナーバルリサーチ省
（the Office of Naval Reserch）によって認可されて
いるグラント コンタクト Ｎｏ．Ｎ０００１４−８６
−Ｋ−０３４７（Grant contact No. N00014-86-K-034
7）の基において、また、ＮＩＨ及びＮｉＡ Ｒ０１
ＡＧ０８５１４によって認可されるとともに、ヘルス
アンドヒューマン サービス省（the Department of He
alth nd Human Services）によって認可されているグラ
ント コンタクト Ｎｏ．ＨＤ−２００３４、Ｎｏ．Ｎ
ＩＡ−０６０８８、Ｎｏ．ＨＤ−００６６９（Grant co
ntact Nos. HD-20034, NIA-06088, HD-00669）の基にお
いて、政府の援助を受けてなされた。政府はこの発明に
関して確固たる権利を有している。
【０００２】この出願は、１９８８年１２月１５日に提
出されていて共に出願中である出願番号Ｎｏ．２８５，
１９６号の一部継続出願である。尚、１９８８年１２月
１５日に提出された出願における記載は、すべて本発明
に参照として包含される。
【０００３】本発明は、検体の中枢神経系（ＣＮＳ）に
移植することによって、ＣＮＳの欠陥、疾病、あるいは
損傷を治療するために、ドナー細胞の遺伝子的修飾を行
う再組替え手段を用いることに関する。更に特定すると
本発明は、ＣＮＳの細胞を改善する効果を有する分子を
コードしているドナー細胞に遺伝子を挿入することに関
する。この場合ＣＮＳには、ドナー細胞がＣＮＳに移植
された場合に分子が発現し、疾病あるいは損傷を受けた
細胞に対してそれらの分子の効果が有用であるようなド
ナー細胞内にはいる神経が含まれている。
【０００４】
【従来の技術】ＣＮＳの欠陥に起因し、または疾病もし
くは傷害の結果として起きる哺乳動物の脳の修復または
ＣＮＳ機能の取り替えに対する試みは、ＣＮＳにおける
複雑な構造と機能の関係の不十分な理解によって妨げら
れている。近年になって脳における細胞機能のいくつか
の基本的原理の知識は大いに前進したが、脳の異なった
領域における細胞のクラスターまたはシステムと細胞回
路との間の相互作用および行動と神経学的機能の外への
表れのこれらとの関係に関する理解は、ずっと遅れてい
る。これらの問題へのアプローチの困難は、一部は哺乳
動物ＣＮＳにおける多数の異なった細胞タイプとその連
結の数と複雑性によってひき起されている。これに加え
て、血液-脳関門が、診断、処置および新規な治療の設
計に対し脳へのアクセスをさらに困難にしている。
【０００５】たいていの正常または異常な脳機能に関す
る病理生理学の高度の知識がないのにもかかわらず、Ｃ
ＮＳ機能障害に対する薬理学的治療へのいくつかの試み
がすでに有用かつ有効となってきている。これらには、
精神医学的障害、例えば精神分裂病に対する精神に作用
する薬剤の使用や、ＣＮＳ障害の生化学的細胞的基礎が
比較的よく理解されている例えばパーキンソン病のよう
なまれなケースにおける特異的取り換え治療が含まれ
る。たいていの治療上のアプローチの中心にあるのは、
疾病または傷害の結果として失われた脳の特異的化学的
機能の取り替え、または復活という目的である。
【０００６】脳内神経の移植は、最近になってＣＮＳ治
療への付加的な可能性のあるアプローチとして浮かび上
がった。治療上有用な代謝物を産生し分泌することがで
きる細胞の取り替えまたはCNSへの付加は、反復した投
薬を避け、また血液-脳関門による薬剤供給合併症(drug
delivery complication)を避けるという利点を提供で
きる(Rosenstein, Science 235:772-774 (1987))。脳内
移植の概念と基礎的手法については数十年来知られてい
るが、移植された細胞の生存を最高にするための因子の
大部分は、最近になって研究され部分的に理解されるよ
うになったばかりである(Bjorklund et al., in Neural
Grafting in the Mammalian CNS, p. 709, Elsevier,
Amsterdam (1985); Sladek et al., in Neural Transpl
ants: Development and Fuction, Plenum Press, NY (1
984))。信頼でき、かつ有効な移植生存に対して決定的
ないくつかの因子が確認されているが、このなかには次
のものが含まれる。
【０００７】（１）ドナーの年齢：移植の効率はドナー
細胞の年齢が増加するほど減少する。 （２）ホストの年齢：若い受容体は年とったものよりも
よりたやすく移植を受け入れる。 （３）ホストおよびドナー組織における神経栄養因子の
利用可能性：創傷誘発神経栄養因子は移植生存を高め
る。 （４）免疫学的応答：脳は全く免疫学的に特権のある部
位であるということではない。 （５）標的-ドナーマッチングの重要性：ニューロンは
それらが正常に分布するような部位に移植されたときに
よりよく生存する。 （６）血管新生：移植は迅速に血管新生されるべきであ
り、または周囲から十分によく栄養を与えることが重要
である。
【０００８】これらの決定的な因子が認識され、完全に
なるにつれて、脳内移植は、神経生理学者に対してＣＮ
Ｓ機能の研究に、また可能性として臨床医にはＣＮＳ疾
病の治療の設計に対して有効で信頼性のある道具となっ
てきた。このアプローチは、パーキンソン病においては
実験的臨床的適用の水準まで到達している。
【０００９】パーキンソン病は、年齢関連の傷害であっ
て、主要な標的器官としての基底神経節を有する中脳の
黒質中におけるドーパミンニューロンの欠失によって特
徴付けられる。症状としては、震え、硬縮および運動失
調を含む。この疾病は進行性であるが、ドーパミンに対
する前駆体であるＬ−ドーパの薬理学的用量の投与を介
しドーパミンの取り替えによって処置することができる
が(Marsden, Trends Neurosci. 9:512 (1986); Vinken
et al., in Handbook of Clinical Neurologyp. 185, E
lsevier, Amsterdam (1986))、薬物療法の慢性使用によ
って患者はしばしばＬ−ドーパの継続的効果に対して無
反応になる。この無反応状態の進展に対しては多くのメ
カニズムが示唆されているが、最も簡単なものは患者が
細胞欠失の閾値に達するということで、この場合には残
った細胞は前駆体から十分なドーパミンを合成すること
ができない。パーキンソン病は、治療的脳内移植がヒト
に使用された脳の最初の疾病である。患者の脳へ副腎髄
質細胞を同種移植することによって、パーキンソン患者
の病んだ基底神経節細胞へ神経伝達物質ドーパミンを供
給するためにいくつかの試みが行われた(Backlund et a
l., J. Neurosurg. 62:169-173 (1985); Madrazo et a
l. New Eng. J. Med. 316:831-836 (1987))。
【００１０】他のドナー細胞、例えば黒質からの胎児脳
細胞、これはドーパミン含有細胞体に富む脳の領域であ
り、またパーキンソン病において最も冒される脳の領域
であるが、この細胞の移植によって、選択的ドーパミン
神経毒によって誘発された行動的欠損を戻すのに効果的
であることが示された(Bjorklund et al., Ann. N.Y.Ac
ad. Sci. 457:53-81 (1986); Dunnett et al., Trends
Neurosci. 6:266-270(1983))。これらの実験は、シナプ
ス連接度は機能的移植に対する要件ではないこと、およ
び欠陥細胞の近傍においてドーパミンを構成的に産生し
分泌する細胞を有することで十分であることを示唆して
いる。
【００１１】この背景において、パーキンソン病は、遺
伝子工学的に加工された細胞の移植に対して候補となる
疾病である、というのは、（１）化学的欠損がよく知ら
れている(ドーパミン)、（２）ドーパミン産生における
速度制限酵素に対するヒトおよびラット遺伝子がクロー
ニングされている(チロジン ヒドロキシラーゼ)、
（３）冒されている領域の解剖学的位置が確認されてい
る(基底神経節)、（４）完全な機能的修復に対してシナ
プス連接度は要求されていないように思われるからであ
る。
【００１２】他のＣＮＳ疾病、このなかにはハンチング
トン病(Gusella et al., Nature 306:234-238 (198
3))、アルツハイマー病(Delabar et al., Science, N.
Y. 235, 1390-1392 (1987); Goldgaber et al., Scienc
e, N.Y. 235:877-880 (1987); St.George-Hyslop et a
l., Science, N.Y. 235:885-890 (1987); Tanzi et a
l., Science, N.Y. 235:880-884 (1987)、バイポーラ(b
ipolar)病(Baron et al., Nature 326:289-292 (198
7))、精神分裂症(Sherrington et al., Nature 336:164
-167 (1988))、およびその他多くのヒトの疾病が含まれ
るが、これらの疾病の急速に増しているリスト中におけ
る遺伝子成分の最近の実証によれば、遺伝子治療はこれ
らのＣＮＳ疾病を取り扱う有用なアプローチであること
を示唆している。
【００１３】過去数十年間の精神生物学の進歩と平行し
て、分子生物学の理解における進歩と、高度の分子遺伝
子手法の発展は、ヒトの疾病一般への新規な洞察を提供
している。結果として、医学者と遺伝学者は生化学と遺
伝子レベルにおいて多くのヒトの疾病の深遠な理解を発
展させた。多くのヒトの遺伝子的疾患の正常および異常
な生化学的特徴が理解され、関連した遺伝子が単離され
特徴付けられ、また早期のモデルシステムが機能的野生
型遺伝子を突然変異細胞中へ導入して疾病表現型を修正
するために開発された(Anderson, Science 226:401-409
(1984))。このアプローチの全動物への拡張、すなわち
機能遺伝子の薬理学的薬剤としての使用を介してのイン
ビボでの疾病表現型の修正は、”遺伝子療法”と呼ばれ
るようになった(Friedmann et al., Science 175:949-9
55 (1972); Friedmann, GeneTherapy Fact and Fictio
n, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (198
3))。遺伝子療法は、疾病表現型の修正は内在する突然
変異遺伝子の表現型の修飾により、またはインビボの欠
陥のある、もしくは傷害を受けた細胞への新規な遺伝子
情報の導入によって達成できるという仮定に基づいてい
る。
【００１４】現在においては、遺伝子療法の理想的なバ
ージョンに対する技術、すなわち部位特異的遺伝子配列
を介してのインビボでの修正または取り替えは、ちょう
ど考え始められたところで、まだよく発展していない。
したがって、遺伝子療法の現在のモデルの多くは、取り
替えモデルよりも実際には遺伝子の増量であり、効率的
な遺伝子トランスファーシステムの開発に依存して、機
能的野生型遺伝子情報をインビトロおよびインビボで遺
伝子的に欠陥のある細胞内に導入することである。臨床
的に有用とするためには、機能的ＤＮＡ配列(トランス
ジーン)に対する効率的なデリバリーベクターの利用可
能性は、適当な疾病関連標的細胞または器官に近づきや
すいこと、およびこれらの標的細胞へ安定かつ安全にベ
クターを導入するための技術の開発と結合されなければ
ならない。
【００１５】単純な酵素欠損の遺伝子的表現型的修正に
対するモデルシステムが、特異的な代謝的遺伝子的疾病
と関連した適当な可能性のある受容細胞および器官の確
認と同様に現在開発研究の途上にある。授精したマウス
の卵子へ導入された異種遺伝子が疾病表現型を修正でき
るということを示す証拠が最近得られた(Constantiniet
al., Science 233:1192-1394 (1986); Mason et al.,S
cience 234:1372-1378 (1986); and Readhead et al.,
Cell 48:703-712 (1987))。
【００１６】最近多大の注意が、遺伝子トランスファー
に対するネズミ科レトロウイルスから誘導された遺伝子
デリバリーベクターの使用に注がれてきている(Anderso
n, Science 226:401-409 (1984); Gilboa et al., Biot
echniques 4:504-512 (1986))。このようなレトロウイ
ルスベクターを使用するインビトロのトランスファーは
広範囲の受容細胞に対して極めて効率的であり、このベ
クターは加えられる遺伝子に対して適当に大きな容量を
有し、またこれらによる感染は受容細胞に対して僅かな
代謝的または遺伝子的損害を与えるにすぎない(Shimoto
hno et al., Cell 26:67-77 (1981); Wei et al., J. V
irol. 39:934-944 (1981); Tabin et al., Molec. Cel
l. Biol. 2:426-436 (1982))。いくつかの有用なシステ
ムによって、レトロウイルスベクターによって細胞内へ
導入された遺伝子の発現は、単一遺伝子酵素欠乏と関連
したいくつかのヒト遺伝子疾病において代謝異常をイン
ビトロで修正できることを証明した(Willis et al., J.
Biol. Chem. 259:7842-7849 (1984); Kantoff et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6563-6567 (1986))。
遺伝子療法へのこのアプローチに対して可能性のある標
的器官として骨髄に特に興味が持たれている。これは、
地中海貧血、鎌状赤血球性貧血、ゴーシェー病、慢性肉
芽腫病(ＣＧＤ)、ならびにプリン経路酵素、アデノシン
デアミナーゼ(ＡＤＡ)およびプリン ヌクレオシド ホ
スホリラーゼ(ＰＮＰ)欠乏の結果である免疫欠乏病を含
む種々の主要なヒトの疾病における骨髄誘導細胞系の傷
害の普及と重要性のためである(Kantoff, supra; McIvo
r et al., Molec. Cell. Biol.7:838-846 (1987); Sori
ano et al., Science 234:1409-1413 (1986); Williset
al., supra))。その他の代謝的に重要な標的器官、例
えば肝臓もまた最近これらの器官からの細胞のウイルス
性ベクターによる感染の証明を介して遺伝子的処置に対
して理論的に受け入れられるようになった(Wolff et a
l., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 84:3344-3348 (198
7))。さらに、多くの細胞特異的調整シグナル、例えば
シス-アクティング エンハンサー、組織特異的プロモー
ター、およびその他の配列の発見は、インビボでの一般
的非特異的感染および遺伝子トランスファーの後でさえ
も、他の多くの器官において組織特異的遺伝子発現を提
供できるであろう(Khoury et al., Cell 33:313-314 (1
983); Serflin et al., TrendsGenet. 1:224-230 (198
5))。
【００１７】遺伝子療法の最近開発されたモデルは、患
者から採った標的細胞を用い、これを培養し、インビト
ロで遺伝子的に修飾してから患者に再移植する(Wolff e
t al., Rheumatic Dis. Clin. N. Amer. 14(2) 459-477
(1988); Eglitis et al., Biotechniques 6:608-614
(1988))。標的細胞には、骨髄幹細胞(Joyner et al.,Na
ture 305:556-558 (1983); Miller et al., Science 22
5:630-632 (1984); Williams et al., Nature 310:476-
480 (1984))、線維芽細胞(Selden et al., Science 23
6:714-718 (1982); Garver et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84:1050-1054 (1987) and St. Louis et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3150-3154 (198
8))、ケラチン細胞(Morgan et al., Science 237:1476-
1479 (1987))、および肝細胞(Wolff et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 84:3344-3348 (1987))が含まれる。
このインビボ遺伝子トランスファーの間接アプローチ
は、遺伝子を細胞へインビボで効率よく直接にトランス
ファーできないことによって必要とされている。ニュー
ロンを培養によって遺伝子的に修飾することに向けての
最近の進歩はいくらか見られるが(Geller et al., Scie
nce 241:1667-1669 (1988))、インビボ遺伝子トランス
ファーのこの間接的アプローチはＣＮＳにはまだ適用さ
れていない。
【００１８】新しい機能をＣＮＳ中の標的細胞に表現型
的に有用なやり方で導入する、すなわち欠陥、疾病、ま
たは機能障害を処置するためにはいくつかの方法がある
（図１）。最も直接的なアプローチ、これは細胞移植に
対する必要を全く回避するものであるが、機能が発育的
または遺伝子的欠陥の結果として異常な細胞、すなわち
テー-ザックス病、またおそらくレッシュ-ニハン病、お
よびパーキンソン病の場合においては神経細胞内へのト
ランスジーンの直接的導入である（図１中の１）。ある
いは、標的細胞とギャップ結合またはその他の接触を築
くことができる遺伝子的に修飾されたドナー細胞を導入
することによって、欠陥のある標的細胞において新しい
機能が発現される（図１中の２）。このような接触のい
くつかは、代謝的に重要な小さな分子の１つの細胞から
他の細胞への効率的な拡散を許して、受容細胞における
表現型的変化へ導くことが知られている(Lowenstein, B
iochem. Biophys. Acta. 560:1-66 (1979))。このプロ
セスは”代謝協同”と呼ばれ、線維芽細胞と神経膠細胞
の間で起こることが知られているが(Gruber et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6662-6666 (1985))、結
論的にニューロンにおいてはまだ証明されていない。な
おその他のドナー細胞が、近傍の欠陥のある標的細胞に
取り上げられ使用されるような拡散可能な遺伝子産生物
を発現し分泌することができる（図１中の３）。ドナー
細胞はインビトロで遺伝子的に修飾され、または直接的
にインビボで感染させられる（図１中の４）。このタイ
プの”協同性”は、ＣＮＳ傷害に続くコリン作動性神経
死のNGF-仲介保護の場合のようにＣＮＳ細胞について証
明された。(Hefti, J. Neurosci. 6:2155 (1986); Will
iams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9231-92
35 (1986)) 最後に、複製-欠陥ベクターばかりでなく
複製-コンピテント ヘルパー ウイルスによっても感染
させられた導入されたドナー細胞は、局所的に高い力価
の子孫ウイルスを産生し、これが順に近傍の標的細胞に
感染して、機能的な新しいトランスジーンを産生するこ
とが可能となるであろう（図１中の５）。
【００１９】哺乳動物の脳内にはいくつかのタイプのニ
ューロンがある。コリン作動性ニューロンは、哺乳動物
の脳内に見出され、ブローカの対角帯の中間隔膜(media
l septum)と垂直肢から基底前脳の海馬体に突出してい
る。対角帯の中間隔膜および垂直肢と海馬体とを結ぶ脳
の短い神経様部分は”フィンブリエの円蓋(fimbria for
nix)”と呼ばれている。脳弓采は中間隔膜と対角帯に位
置するニューロンの軸索を含む。インビボでのニューロ
ン生存の一般的に認められたモデルは、脳弓采のトラン
セクション(transection)または病変（”アクソトミ(ax
otomy)”とも呼ばれる）後における隔膜のコリン作動性
ニューロンの生存である。アクソトミは隔膜と対角帯中
のコリン作動性ニューロンを切断し、結果としてコリン
作動性ニューロンの半分までを死なせる(Gage et al.,
Neuroscience 19:241-256 (1986))。この退行的応答
は、神経成長因子（ＮＧＦ）からの栄養的支持の欠失に
帰せられるが、このＮＧＦは正常では海馬から隔膜コリ
ン作動性細胞体へと無傷の脳に逆行的に運ばれる(Korsc
hing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3513(19
83); Whittemore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:817 (1986); Shelton et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 83:2714 (1986); Larkfors et al.,J. Neuros
ci. Res. 18:525 (1987); and Seilor et al., Brain R
es. 300:33 (1984))。
【００２０】研究によって、アクソトミ前のNGFの慢性
的室内投与が隔膜におけるコリン作動性ニューロンの死
を防止するであろうということが示された(Hefti, J. N
eurosci. 8:2155-2162 (1986); Williams et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 83:9231 (1986); Kromer, Sc
ience 235:214 (1987); Gage et al., J. Comp. Neuro
l. 269:147 (1988))。このように、アクソトミは逆行的
ニューロン死を防止するために時間の種々の点において
種々の療法の能力を決定するための一つのインビボモデ
ルを提供する。
【００２１】成体哺乳動物ＣＮＳの特性の一つは、摂動
に続いて生成される新しい軸索は脳内において比較的短
い距離だけ成長できるということである(Cajal, in Deg
eneration and Regeneration of the Nervous System,
Oxford University Press, London, England, (192
8))。成体ニューロンの傷害に対応した再生がこのよう
に不可能なことは、次のような理由によるであろう。
１）星状細胞の活性化であって、これはＣＮＳ全体に見
出される支持、栄養的細胞で、傷害に続いて結果として
瘢痕組織を形成し、これが軸索の再生に対して物理的関
門として作用し、線維は瘢痕組織を横切ることができな
い、かくして星状細胞による瘢痕は軸索の伸長に対して
助けとなる基質を提供することができない(Cajal, supr
a; Brown, J. Comp. Neurol. 87:131 (1947); Clement
e, in Regeneration in the Central Nervous System,
ed. Windle, pp. 147-161, Thomas, Springfield, (195
5); Windle, Physiol. Rev. 36:426 (1956); and Reier
et al., in Spinal Cord Reconstruction, eds. Kao e
t al., pp. 163-195, Raven, New York, (1983))。他方
において、未熟なＣＮＳ中の星状細胞は軸索伸長の先導
において重要な役割を演じる(Silver et al., J. Comp.
Neurol. 210:10-29 (1982))。２）脳への傷害に続いて
放出されるミエリン-関連の物質が軸索の成長をインビ
トロで抑制することが示された(Schwab and Croni, J.
Neurosci. 8:2381-2393 (1988))。３）成体ＣＮＳにお
ける軸索再生の欠如は一部はそれぞれニューロンの再生
を誘発し、軸索の成長を促進する栄養性分子の不適当な
水準によるであろう(Reier et al., in Neural Regener
ation and Transplantation, pp. 183-209, Alan R. Li
ss, New York, (1989) and Schwartz et al., FASEB J.
3:2371-2378 (1989))。
【００２２】成体脳中での軸索再成長を妨げる多くの因
子にもかかわらず、ラットＣＮＳ中のあるニューロン、
特に網膜神経節ニューロンおよび隔膜コリン作動性ニュ
ーロンは、種々のタイプの基質への新しい軸索の伸長に
対して顕著な可能性を発揮する。これらはいわゆる”神
経橋(neural bridge)”であって、オートローガス(auto
logous)末梢神経のセグメント(David and Aguayo, Scie
nce 214:931 (1981);Benfry and Aguayo, Nature 296:1
50 (1982); Wendt et al., Exp. Neurol. 79:452 (198
3); and Hagg et al., Exp. Neurol. 109:153 (199
0))、コラーゲン マトリックス中の培養シュワン細胞(K
romer and Cornbrooks, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 8
2:6330 (1985))、胚ラット海馬(Kromer et al., Brain
Res. 210:153(1981))、およびヒト羊膜(Gage et al., E
xp. Brain Res. 72:371 (1988))が含まれる。脳の隔膜
と海馬との連結度もニューロンの末梢ホモジネートの移
植組織片を用いて証明された(Wendt, Brain Res. Bull.
15:13-18 (1985))。
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】したがって、効率的な
ベクターを介して遺伝子をトランスファーし、続いて遺
伝子的に修飾された細胞をインビボで脳内移植する療法
を開発し、これによって神経細胞の疾病、欠陥または機
能異常を改善し、もって軸索の再生を促進して、ＣＮＳ
の傷害、たとえばアルツハイマー病、パーキンソン病お
よびハンチングトン病を治療することは有益であるであ
ろう。
【００２４】
【課題を解決するための手段】本発明は、哺乳動物の中
枢神経系における欠陥、疾病、あるいは損傷を被ってい
る細胞を治療するための方法を提供するものであり、そ
の方法は、中枢神経系に遺伝子的に修飾されたドナー細
胞を移植することによって、中枢神経系における前記欠
陥、疾病、あるいは損傷をこうむっている細胞を修復す
るのに充分量の機能性分子を生産することができるよう
にするものである。この細胞は、ｐＬＮ．８ＲＮＬ及び
ｐＬＴｈＲＮＬを含むウイルス性あるいはレトロウイル
ス性のベクター、即ち、その細胞に直接的あるいは非直
接的に作用する一個あるいはそれ以上の生産物をエンコ
ードしている挿入された治療性の一個またはそれ以上の
トランス遺伝子を含んでいるベクターを用いて操作され
るか、あるいは細胞に機能性ＤＮＡを導入する他の方法
によって操作される。その細胞は、培養されて、中枢神
経系に懸濁液として注入される。また、中枢神経系にお
ける欠陥、疾病、あるいは損傷を受けている細胞を治療
するための治療薬とともに投与される。本発明の方法
は、ドナー細胞の選択と調整、トランスフェクション、
及び移植を行うものである。
【００２５】本発明のドナー細胞は、異なる解剖学的構
造領域から得られる細胞タイプの混合細胞であり、ま
た、プライマリー細胞あるいは不滅化された細胞である
ことができる。
【００２６】ドナー細胞の移植は、哺乳動物のＣＮＳ内
における数種の異なる部位に、ドナー細胞を複合的に移
植することによって行われる。複合的に移植するための
細胞は、異なるタイプのドナー細胞の混合物であっても
よいし、また、同一のトランス遺伝子あるいは異なるト
ランス遺伝子を含有する同一タイプの細胞あるいは異な
るタイプの細胞であってもよい。
【００２７】移植は、例えばコラーゲンマトリックスの
ような基質物質内に細胞を植え付けて移植種を生存させ
ることによって行うことができるし、あるいはそのよう
な材料を用いることによって損傷した神経間の連結ある
いは相互関係の改善を容易にすることができる。
【００２８】本発明に用いられるベクターは、一個のト
ランス遺伝子あるいはそれ以上のトランス遺伝子の発現
を高めることのできる例えばコラーゲンプロモーターの
ようなプロモーターを運搬するベクターを含む。
【００２９】機能性分子の分泌は、前記分子に対する前
駆体を用いることによって調節される。本発明の方法で
は、アセチルコリンを発現するように修飾された繊維芽
細胞をＣＮＳに移植する段階と、移植された繊維芽細胞
からアセチルコリンの分泌を維持しかつ高めるためのコ
リンクロライドの経口投与段階とを含む。
【００３０】本発明は、哺乳動物の中枢神経系に移植さ
れた休止しているドナー細胞からの治療性のトランス遺
伝子生産物の発現を高めることを含む。それは遺伝子的
にドナー細胞を修飾するのに用いられるベクターに、休
止しているプロモーターを挿入することによって行われ
る。そのプロモーターは、例えばコラーゲンプロモータ
ー等の非−ウイルス性のプロモーターであることができ
る。サイトカイン（Cytokines）は、トランス遺伝子の
発現を高めるためのプロモーターの活性を調節するため
に投与することができる。
【００３１】免疫抑制剤は、インターフェロン−γの生
産を抑制して、トランス遺伝子の発現を高めるために用
いられるであろう。別法として、抗−炎症性の薬物は、
治療性のトランス遺伝子の発現を高めるためにサイトカ
インの生産を減少させる目的で用いられる。また、成長
因子をＣＮＳに移植されたドナー細胞の生存を維持する
ために用いることができる。
【００３２】
【発明の作用・効果】本発明は、哺乳動物の中枢神経系
（ＣＮＳ）に遺伝子的に修飾されたドナー細胞を移植す
ることによって、ＣＮＳに生じた疾病あるいは損傷を治
療することができる方法に関する。更に特定すると本発
明は、欠陥、疾病あるいは障害部分からから得られる細
胞によってこうむる損傷を修復するために、ＣＮＳ内に
ある細胞に対する直接的あるいは非直接的な効果を有す
る分子を生産できるように修飾されたドナー細胞に挿入
されている機能的遺伝子（トランス遺伝子）を運搬する
ベクターを使用することに関する。好ましくは、ＣＮＳ
における細胞の欠陥、疾病あるいは損傷を治療するため
に、例えば繊維芽細胞等のドナー細胞が、例えば神経成
長因子（ＮＧＦ）をコードする遺伝子等の一種のトラン
ス遺伝子またはそれ以上のトランス遺伝子を含有するレ
トロウイルスベクターを導入することによって修飾され
る。遺伝子的に修飾された繊維芽細胞は、例えば脳等の
中枢神経系に移植され、その結果、欠陥やアルツハイマ
ー病やパーキンソン病などの疾病、あるいは身体的な障
害から生じる損傷を治療することができる。この治療
は、その遺伝子的に修飾されたドナー細胞から発現する
ことのできるトランス遺伝子生産物を発現させた結果と
して、損傷を受けている神経内における機能の回復、改
善がなされることによるものである。ドナー細胞はま
た、ＣＮＳ内に一個またはそれ以上のトランス遺伝子生
産物を導入するのに用いられるものであり、そのトラン
ス遺伝子生産物はインビボで改善された効果を有するよ
うな内生の分子の生産を高めるものである。
【００３３】ここで用いられているように、”トランス
遺伝子”あるいは”治療生のトランス遺伝子”という用
語は、機能性プロテインに対応するアミノ酸配列をコー
ドしているドナー細胞に挿入されたＤＮＡを意味する。
この機能性プロテインは、ＣＮＳの細胞に対して治療上
の効果を発揮することができ、かつＣＮＳの細胞におけ
る機能の発現に対して調節できる効果を有している。
【００３４】
【実施例】
（ドナー細胞インビトロでの遺伝子導入）ドナー細胞イ
ンビトロでの導入する遺伝子の戦略は、図２に概略され
ており、以下の基本的な段階を含んでいる。（１）適切
なトランス遺伝子またはＣＮＳ病や機能不全に関連して
発現するトランス遺伝子の選択する段階。（２）遺伝子
導入のための適当、効率的なベクターの選択と発展の段
階。（３）プライマリー培養または確立された細胞培養
系からのドナー細胞の調整する段階。（４）新しい機能
を発現する移植されたドナー細胞が生存能力があり、安
定的かつ効率的にトランス遺伝子産物を生産することが
できることの証明する段階。（５）移植が心身に有害な
影響を引き起こさないことを証明し、（６）ホスト（ho
st）内での望ましい表現系の効果が現れること。
【００３５】この発明中で有用なトランス遺伝子によっ
て生産された機能的な分子は、限定されたものではな
く、成長因子、酵素、ガングリオシド、抗生物質、神経
伝達物質、神経ホルモン、毒素、神経突起成長促進分
子、代謝拮抗物質、これらの分子のプリカーサーを含
む。特に、ドナー細胞に挿入したトランス遺伝子は、限
定されたものではなく、チロシン水酸化酵素、トリプト
ファン水酸化酵素、ＮＧＦ，ＣｈＡＴ、ＧＡＢＡ−脱炭
酸酵素、ドーパ脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）、エンケファリ
ン、毛様体神経・栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経・
栄養因子、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、ＮＴ−
４、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む。
【００３６】（ドナー細胞の遺伝学的な修飾）レトロウ
イルスベクターを用い、ＣＮＳに融合させることでドナ
ー細胞を修飾する以下に書かれた方法は、単に実例の目
的と既に用いられてきた典型例でしかない。しかしなが
ら、他の手順もその技術として理解され、用いられてき
たものである。
【００３７】細胞をトランスフォーメーションし、ベク
ターや類似の物を作ることに用いられてきた技術のほと
んどは、技術として広く実行されており、多くの従業者
は、特別な状態と手順を記述するような標準的な原料に
ついて熟知している。しかし、便宜上、以下に続く段落
は指標として役立つだろう。
【００３８】（ドナー細胞の選択）移植に用いるドナー
細胞の選択は、発現される遺伝子、ベクターの特色、望
まれる表現系の結果の特性にかなり依存する。レトロウ
イルスベクターが効率的な感染、組込み、遺伝子発現に
関して、細胞分裂とＤＮＡ合成を必要とするので(Weiss
et al., RNA Tumor viruses, 2nd Ed., Weiss et al.,
eds., Cold SpringHarbor Press, New York (1985))、
もしそのようなベクターを用いるなら、ドナー細胞は、
プライマリー繊維芽細胞系か確立された培養細胞系のよ
うに、嗅粘膜や発生中や再活動しているグリアのような
選ばれた領域から初期の神経細胞を複製したり、成長し
た神経細胞を複製する、かなり活動的に成長する細胞系
である。
【００３９】プライマリー細胞、すなわち繊維芽細胞の
ような生体から新鮮に得られるような細胞や、トランス
フォーメーションされた状態にない細胞は、現在の発明
に用いるのに適している。他の適当なドナー細胞は、不
死化した（細胞分裂を繰り返すトランスフォーメーショ
ンした細胞）繊維芽細胞、グリア細胞、副腎の細胞、海
馬の細胞、ケラチン生成細胞、肝細胞、結合組織細胞、
上衣の細胞、骨髄の細胞、幹細胞、白血球、クロム親和
性細胞、遺伝学的手法や現在発明されている方法でつな
ぐことが可能な他の哺乳類細胞を含んでいる。
【００４０】停止し、複製を行わない標的細胞の感染性
を誘導する方法の応用は、他の多くの細胞型をウイルス
による形質導入に適した状態に変える。例えば、そのよ
うなベクター感染に通常免疫性があるラットの成体肝細
胞のプライマリー培養に完全なレトロウイルスベクター
を感染させる方法が発達してきた。類似の方法が他の多
くの細胞に役立つかも知れない(Wolff et al., Proc. N
atl. Acad/ Sci. USA84:3344-3348 (1987))。付け加え
るならば、エレクトロポレーション（electroporatio
n）(Toneguezzo et al., Molec. Cell. Biol. 6:703-70
6 (1986))やリポフェクション（lipofection）、直接的
に遺伝子を挿入するような、ドナー細胞にＤＮＡを導入
する効率的な非ウイルス的方法と同様に、ヘルペス（he
rpes)、種痘疹、アデノウイルス由来の他の多くのベク
ターの発達が、現在のところレトロウイルス感染に感染
性が無い他の多くの細胞に遺伝子を導入するために用い
られるだろう。
【００４１】移植の成功、不成功に関連するドナー細胞
のもう一つの特徴は、ドナー細胞の継代数である。ここ
に現れた結果は、継代培養を重ねたヒトの細胞が移植に
関してトランス遺伝子を伴うトランスフェクションに用
いられる可能性を示している。
【００４２】（ベクターの選択）他のベクターが用いら
れるのだけれども、現在発明された方法に用いられる最
適のベクターは、レトロウイルスを含むウイルスベクタ
ーである。選ばれたウイルスベクターは以下の基準に当
てはまるべきである。１）ベクターはドナー細胞に感染
できなくてはならない。すなわち、適切なホスト（host）
を持つウイルスベクターが選ばれなければならない。
２）導入される遺伝子は、細胞内での安定的な維持と発
現の点で、細胞内にとどまる能力があり、細胞死が起き
ない限り細胞内で発現される。３）ベクターは、できる
ことなら、標的細胞にほとんど損傷を与えないべきであ
る。ネズミのレトロウイルスベクターは、哺乳類の細胞
の効率的な外来遺伝子の導入と発現にとっては最良の手
法となっている。これらのベクターは、非常に広いホス
トと細胞型の範囲を持ち、充分理解されたメカニズムで
ホストゲノムのランダムな部位に結合し、遺伝子を安定
的にかつ効率的に発現させ、ほとんどの環境下でホスト
細胞を殺したり、損傷を与えない。
【００４３】（ベクター構築の一般的手法）望ましい治
療上の遺伝子コードと制御配列を含む適切なベクターの
構築には、技術的には充分理解されている(see Maniati
s et al., in Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor Laboratory, New york (1982))
標準的な結合と再構築の技術を用いる。単離されたプラ
スミド、ＤＮＡ配列、合成されたオリゴヌクレオチド
は、望ましい形態に切断され、調整され、再結合され
る。
【００４４】部位特異性ＤＮＡ切断は、技術的には広く
理解されている条件下で適切な制限酵素、または商業的
に利用できるように制限酵素の製造者によって特殊化さ
れた特別なもの(see, e.g. New England Biolabs Produ
ct Catalog.)によって執り行われる。一般に、およそ１
μｇのプラスミドやＤＮＡ配列はおよそ２０μｌの緩衝
液中に１ユニットの酵素によって切断される。典型的に
は、超過の制限酵素を用いると、ＤＮＡ基質の完全な切
断を保障される。
【００４５】変異を大目にみるならば、切断は３７℃で
１−２時間インキュベートすることでなされる。インキ
ュベートののち、蛋白はフェノール／クロロホルム抽出
液で抽出され、エーテル抽出液により再度抽出される。
核酸は、エーテルにより沈澱にされ水層に保護される。
もし望むのなら、標準的なテクニックだが、切断された
フラグメントの大きさによる分離をポリアクリルアミド
ゲルまたはアガロースゲル電気泳動により行う。大きさ
による分離の一般的な記述は、Methods of Enzymology
65:499-560 (1980)に見られる。
【００４６】制限酵素によるフラグメントは、４種類の
デオキシヌクレオチド三燐酸（ｄＮＴＰｓ）存在下で、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ７．６） ５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、６ｍＭ ＤＴＴ，５−１０
μＭ ｄＮＴＰｓ、２０℃−２５℃で１５−２０分のイ
ンキュベート時間で扱われ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（Ｋｌｅｎｏｗ）の大きなフラグメントによって扱わ
れる平滑断片であるかもしれない。Ｋｌｅｎｏｗのフラ
グメントは５’末端が付着末端ばかりであり、たとえ４
種類のｄＮＴＰ存在下でも１本鎖が突き出ている３’末
端と噛み合う。もし望むのなら、選択的な対合はｄＮＴ
Ｐｓが一つだけ、付着末端の性質に見つけられない制限
内で選択されたｄＮＴＰｓを与えられることでなされ
る。Ｋｌｅｎｏｗ処理後、混合液はフェノール／クロロ
ホルムで抽出され、エタノール沈澱される。Ｓ１ヌクレ
アーゼやＢａｌ−３１で適切な環境下で処理すると、ど
の１本鎖の部分も加水分解される。
【００４７】結合は、以下に示される標準的な条件また
は温度で、１５−５０μｌの容積でなされる。２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、３３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１
０ｍＭ−５０ｍＭ ＮａＣｌの反応液の他、４０μＭ
ＡＴＰ，０．０１−０．０２（Ｗｅｉｓｓ）ユニット
Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼを１５℃で反応させるか（付着
末端を結合するとき）、１ｍＭ ＡＴＰ，０．３−０．
６（Ｗｅｉｓｓ）ユニット Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼを
２５℃で反応させる（平滑末端を結合するとき）。分子
間の付着末端結合は、通常全ＤＮＡ濃度が３３−１００
μｇ／ｍｌ（５−１００ｎＭ全末端濃度）で行われる。
分子間の平滑末端結合は、（通常リンカーの１０−３０
倍）全末端濃度が１μＭでなされる。
【００４８】ベクターフラグメントを用いるベクター構
築で、ベクターフラグメントは、通常５’末端の燐酸を
取り去り、ベクターの再結合を阻害するために、バクテ
リア由来のアルカリフォスファターゼ（alkaline phosp
hatase）（ＢＡＰ）かコウシの腸由来のアルカリフォス
ファターゼ（ＣＩＰ）で処理される。切断は、ｐＨ８、
Ｎａ＋，Ｍｇ＋２ｓ存在下で、ベクター１ｍｇ当りおよ
そ１ユニットのＢＡＰかＣＩＰ、３７℃、約１時間でな
される。核酸フラグメントを回収するために、フェノー
ル／クロロホルム混合液での抽出と、エタノール沈澱に
よって調整される。代わりに、ベクターの再結合は、必
要としないフラグメントを切断するために付加した制限
酵素の切断によって阻害されうる。
【００４９】レトロウイルスベクターの調整の方法は、
既に記述されている(Yee et al., Cold Spring Harbor
Symp. on Quant. Biol. Vol. LI, pp. 1021-1026 (198
6); Wolff et al., Proc. Natl. Sci. USA 84:3344-334
8 (1987); Jolly et al., Meth. in Enzymol. 149:10-2
5 (1987); Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5:431-43
7 (1985); and Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:28
95-2902 (1986) and Eglitis et al., Biotechniques
6:608-614 (1988))し、今や多くの研究室で広く利用さ
れている。レトロウイルスは、バクテリアの複製のため
のプラスミド配列を含むのと同様に、レトロウイルスの
長い終末反復配列（ＬＴＲｓ）とパッケージング（プサ
イ、ψ）配列を含んでおり、真核細胞の複製のためのＳ
Ｖ４０の早期プロモーターやエンハンサーのような他の
配列も含んでいる。ベクターは、ウイルス内にＲＮＡと
して収納されており、細胞系の中にＤＮＡ構成物をトラ
ンスフェクションする。これらは、げっし類の細胞に感
染できるウイルスの外膜を作るプサイ（ψ）２、広範囲
の種に感染できる外膜を作るプサイＡＭとＰＡ１２を含
む。
【００５０】好まれるウイルスベクターにおいて、トラ
ンス遺伝子は、ウイルスのＬＴＲプロモーター−エンハ
ンサーシグナルか、内部のプロモーターの制御下で扱わ
れる。そして、レトロウイルスのＬＴＲ内で保持された
シグナルはホスト細胞のゲノムに効率よく結合される。
遺伝性のウイルスを調整するために、不完全なベクター
の組替えＤＮＡ分子が、ウイルスの転写産物を遺伝性の
ウイルス外膜に包むために必要なレトロウイルスの機能
の全てを発現するが、しかしＲＮＡ転写産物を成熟した
ウイルス外膜で包み込むために必要な決定的なシグナル
を欠いているようなプロウイルス（ｐｒｏｖｉｒｕｓ）
を含む”プロデューサー”細胞系にトランスフェクショ
ンされる。これらは、グループ特異性抗体（ＧＡＧ）
と、キャップシド（ｃａｐｓｉｄ）蛋白と逆転写酵素
（ＰＯＬ）をコードするエンベロープ（ＥＮＶ）遺伝子
を含む。この欠如のために、ヘルパーからの転写産物
は、ウイルス外膜に包まれることができず、それゆえプ
ロデューサー細胞は空のウイルスのみを作り出す。しか
し、ＧＡＧ，ＥＮＶやＰＯＬ遺伝子が完全なプサイ配列
を伴うトランス遺伝子によって移動させられた方法であ
る、カルシウム燐酸調整トランスフェクションを用いて
同じ細胞内に導入された、結合された欠陥のあるレトロ
ウイルスベクターは、それらがパッケージング配列を持
つので、トランスに包まれた転写産物を生産する。その
細胞は、ホスト細胞ゲノムの別の部位で結合された２つ
のプロウイルス配列を含む。新しく導入されたプロウイ
ルスからのＲＮＡ転写産物がパッケージング配列を持つ
ので、それらは、トランスで作られたウイルス機能によ
ってウイルス外膜に効率よく包み込まれた。理想的に
は、その結果は、トランス遺伝子を複製拮抗形の野性株
ヘルパーウイルスから自由にする感染性した細胞による
生産である。たいていの場合、遺伝子治療の全てのモデ
ルに必要と言うわけでもないが、ヘルパーウイルスの生
産は、とうてい望まれたものではない。なぜならば、ホ
スト動物のリンパ球やほかの組織への感染や病気を広げ
ることに通じるかもしれないからである。
【００５１】ヘルペスウイルスは潜在的な感染と、ある
神経細胞との間に明らかに発病しない関係を確立させる
能力を持つことから、ヘルペス由来のベクター、すなわ
ち、ＨＳＶ−ＨＳＶ−１が用いられる。よく似たことだ
が、有用な輸送、発現ベクターをかいりょうすること
は、狂犬病ウイルス、麻疹、他のパラミクソウイルス、
ヒトの免疫不全レトロウイルス（ＨＩＶ）のような、Ｃ
ＮＳの細胞に効率的に感染する、他の人や動物ウイルス
を最終的に理解する上で利点を得ることになるだろう。
ほとんどの場合、狂犬病ウイルスを例外とするが、これ
らのウイルスの感染は真の意味での神経・栄養性ではな
い。むしろ、ホスト細胞の感染性がかなり高いことによ
る。それらは、感染の代謝的、生理学的効果が，ＣＮＳ
の細胞中で表れるので、神経・栄養性のようである。そ
れ故、これらのウイルス由来の多くのベクターが細胞領
域で様々な細胞と関係を結ぶようであり、発現に対する
ＣＮＳ特異性は、ＪＣウイルスのオリゴデンドログリア
（oligodendroglia）特異性発現、脂質蛋白複合体とグ
リア細胞繊維酸性蛋白（ＧＦＡＰ）遺伝子のグリア細胞
特異性発現、マウスの他のＣＮＳ特異的機能を制御する
ような、適切な細胞特異性のエンハンサー、プロモータ
ー、他の配列を与えられなければならない。
【００５２】ＣＮＳ疾患を修飾するために細胞に遺伝子
導入するのに用いられる他のウイルスベクターは、モロ
ニー（MOloney）マウス白血病ウイルス（ＭＯＭｕＬ
Ｖ）のようなレトロウイルス，ＪＣ、ＳＶ４０、ポリオ
ーマウイルス（polyoma）、アデノウイルスのようなパ
ポーバウイルス(papovavirus）、エスプタイン−バール
ウイルス（Esptein-Barr）（ＥＢＶ）、乳頭腫ウイル
ス、すなわちウシのウイルスｔｙｐｅ Ｉ（ＢＰＶ）、
種痘疹やポリオウイルス、他のヒトや動物ウイルスを含
む。
【００５３】欠陥のあるウイルスベクターを用いること
で生まれてきた問題は、細胞内のウイルス様または他の
配列の再配列によって、発病性、複製拮抗性、野性株ウ
イルスの最終的な出現や”救済”の可能性である。この
可能性は、ベクターの感染、安定化、発現に必要でない
全てのウイルス制御配列の除去により減少される。
【００５４】ドナー細胞に機能のあるＤＮＡトランス遺
伝子を導入する以上述べてきた方法に付け加えるなら
ば、他の方法も使えるだろう。例えば、ベクターを用い
ない方法は、非ウイルス的に細胞にＤＮＡを物理的にト
ランスフェクションする方法を含んでいる。例えば、マ
イクロインジェクション（microinjection）(DePamphil
is et al., BioTechnique 6:662-680 (1988))、エレク
トロポレーション(Toneguzz et al., Molec. Cell. Bio
l. 6:703-706 (1986), Potter, Anal. Biochem. 174:36
1-373 (1988))、カルシウム燐酸トランスフェクション
法(Graham and vander EB, 同上、Chen and Okayama, M
ol. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987), Chen and Okaya
ma, Biotechnique. 6:632-638 (1988)) 、ＤＥＡＥ−デ
キストラン修整転移(McCutchan and Pagano, J. Natl.
Cancer Inst. 41:351-357 (1968))など、化学的に修整
してトランスフェクションする方法、陽イオンでリポソ
ーム修整することによるトランスフェクション(Felgner
et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 84:7413-7417
(1987),Felgner and Holm, Focus 11:21-25 (1989) and
Felgner et al., Proc. West. Pharmacol. Soc. 32:11
5-121 (1989))、他にも技術的に知られている方法があ
る。
【００５５】（ドナー細胞による表現型修正のメカニズ
ム） （ドナー細胞の調整）ドナー細胞は移植のために適正な
処理をせねばならない。例えば、この発明による遺伝的
に修飾されたドナー細胞の注入のために、皮膚サンプル
より得た繊維芽細胞の様な細胞は細胞の増殖や保存のた
めに適した培養培地、例えば接触したまま増殖できるよ
うに牛胎児血清（ＦＣＳ）、中に置く。０．０５％トリ
プシンを含む、リン酸で緩衝した食塩水（ＰＢＳ）のよ
うな培養基培養することにより細胞を遊離させ、グルコ
ース１ｍｇ／ｍｌ；ＭｇＣｌ０．１ｍｇ／ｍｌ；ＣａＣ
ｌ2 ０．１ｍｇ／ｍｌとトリプシンを不活性化するた
めの５％の血清を加えたＰＢＳのような緩衝液で保存す
る。細胞をＰＢＳを用いて遠心分離によって洗浄し、そ
の後トリプシンを除いたＰＢＳだけで再懸濁して注入に
適した濃度にする。ＰＢＳに加えて、宿主の持つ物質に
対して生理的に不活性な浸透圧平衡溶液を、懸濁や宿主
へのドナー細胞の注入に用いてもよい。
【００５６】移植細胞の長期生存は、細胞へのウイルス
の感染、培養条件によって起こる細胞の損傷、細胞の移
植や適切な血管新生(vascularization）の定着の方法、
外来の細胞や導入遺伝子の生成物に対する免疫応答の効
果、に依存する。哺乳動物の脳は伝統的に免疫学的に特
別な器官と考えられてきたが、最近の研究によりラット
の脳における外来の抗原に対する免疫反応が最終的に分
かってきた。拒絶反応や移植細胞による移植細胞と宿主
との反応の可能性を、表現型修正に関係する以上には細
胞表面の抗原を変化させないベクターの使用や、胎児期
のような、宿主細胞が免疫的に耐性のある時期の細胞を
導入することが可能な場合にも、自己由来の細胞の使用
により最小限にすることが重要である。
【００５７】本発明における、患者のＣＮＳ中の疾病や
外傷や損傷を処理するための、変異遺伝子をもつドナー
細胞の移植における最も効果的な方法と時期は、ＣＮＳ
中の神経単位のような細胞に対する損傷のひどさや疾病
や外傷のひどさや経過、患者の健康と処理に対する応
答、そして処理をする健康の専門家による判断に依存す
る。
【００５８】もちろん、他の全ての遺伝子移植システム
と同様に、正確な遺伝子発現は、遺伝子発現の程度が期
待された表現型の効果を達成するに充分で、細胞に毒性
を示すほど高くないことが確実となることに決定され
る。
【００５９】遺伝子治療のために移植されるような遺伝
的強化(ENGINEERED）細胞を用いることに関連する問題
は、細胞が静止期（分裂しない）になることによって遺
伝子の発現（遺伝子転移を含む）が減少することが観察
されることである（”ダウンレギュレーション”）（Pa
lmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1330-13
34 (1991)）。最初に脳に移植された繊維芽細胞は、そ
れらが形質転換を受けて腫瘍形成性になっていないまま
移植された場合には、分裂を続けない。だから、それら
は脳内で静止期のまま存在する。従って、変異遺伝子の
維持または発現を増加させるための手段を提供すること
は、細胞分裂することなく、遺伝子治療のための繊維芽
細胞中の治療遺伝子の長期間安定した発現を促進するた
めに有用である。
【００６０】遺伝子の発現は、転写、翻訳、転写後の段
階で調節される。転写開始は、遺伝子発現において初期
の重要な出来事である。これはプロモーターとエンハン
サーの配列に依存し、これらの配列と相互作用する細胞
の特別な因子に影響を受ける。多くの原核遺伝子の転写
単位は、プロモーターと、ある場合にはエンハンサーや
レギュレーターといった成分とからなる(Banerrji et a
l.,Cell 27:299 (1981);Corden et al.,Science 209:14
06(1980);and Breathnach and Chambon,Ann.Rev.Bioche
m.50:349(1981))。レトロウイルスの場合は、レトロウ
イルスのゲノムの複製に必要な調節因子は、長い範囲の
反復（ＬＴＲ）に存在する(Weiss et al., eds., In:Th
e molecular biology of tumor viruses: RNA tumor vi
ruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New York(1982))。モロニー（Molony)ネズミ白
血病ウイルス（ＭＬＶ）とル−（Rous）肉腫ウイルス
（ＲＳＶ）はプロモーターとエンハンサーの配列を含む
(Jolly et al. Nucleic Asid Res. 11:1855 (1983); Ca
pecchi et al., In:Enhancer and eukaryotic geneexpr
ession, Gulzman and Shenk,eds., pp.101-102, Cold S
pring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor,New
York)。いくつかの非ウイルス性のプロモーターのプロ
モーターとエンハンサー領域も記載されている（Schmid
t et al., Nature 314:285(1985)Rossi and de Crombru
gghe, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5590-5594(198
7)）。
【００６１】本発明は、コラーゲン・タイプＩ（α１と
α２）(Prockop and Kivirikko, N.Eng. J. Med. 311:3
76 (1984);Smith and Niles,Biochem. 19:1820 (1980);
deWet et al.,J.Biol.Chem. 258:14385 (1983)),ＳＶ４
０およびＬＴＲプロモーターを含むプロモーターを用い
て、静止期細胞中のトランス遺伝子の発現を維持し、増
加させるための方法を提案した。
【００６２】プライマリーな繊維芽細胞のようなドナー
細胞中での、トランス遺伝子の発現を調節するためのウ
イルス及び非ウイルスプロモーター使用に加えて、エン
ハンサー配列トランス遺伝子発現のレベルを上げるため
に用いられてきた。エンハンサーは、それら本来の遺伝
子だけでなく、いくつかの外来遺伝子の転写活性をも増
加することができる(Armelor,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
70:2702(1973))。たとえば、この発明において、コラー
ゲンのエンハンサー配列は、トランス遺伝子の発現を増
加させるために、コラーゲンプロモーターα２（Ｉ）と
共に用いられた。
【００６３】加えて、ＳＶ４０ウイルスに見いだされる
エンハンサー配列要素はトランス遺伝子の発現を増加さ
せるために用いられてきた。このエンハンサー配列は、
Grusset al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:943(1981);Be
noist and Chambon,Nature 290:304 (1981),そして Fro
mm and Berg,J.Mol.Appl/Genetics,1:457(1982)に記載
されたように反復する７２塩基対から成り、それらのす
べてはこのリファレンスに入っている。この反復配列
は、いろいろなプロモーターと連続して存在する場合
に、多くの異なるウイルスや細胞性の遺伝子の転写を増
加することができる（Moreau et al.,Nucleic Asid Re
s. 9:6047 (1981)）。ほとんどの場合に、ＳＶ４０エン
ハンサー要素は、プラスミドＤＮＡ中に、配向していて
もいろいろな方向を向いていても、または、配向してい
るかいろいろな方向を向いているかどちらかで 存在す
る場合に、完全に機能する（Fromm and Berg,supra)．
ＳＶ４０エンハンサーが、α２（Ｉ）コラーゲンプロモ
ーター（Ｃｏｌｌ）からの転写をアップレギュレーショ
ンする能力は、ニワトリ繊維芽細胞とサル腎臓ＣＶ−１
細胞において確認されている(Xu et al.,In Enhancer a
nd Eukaryotic Gene Expression,Gulzman ane Shenk,ed
s.,Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Har
bor,New York,pp. 51-54(1983))。これらの細胞では、
α２（Ｉ）コラーゲンプロモーターの下流にあるＳＶ４
０エンハンサー領域を含むベクターは、クロラムフェニ
コールのアセチル基転移酵素の活性を、レポーター遺伝
子を用いて、ＣＶ−１とＣＥＦ細胞においてそれぞれ６
４倍と１８倍に増加した。
【００６４】トランス遺伝子の発現も、プロモーター活
性を調節するためにサイトカインを用いた場合、移植後
の長期間安定な発現が増進されるようである。数種のサ
イトカインが、コラーゲンα２（Ｉ）とＬＴＲプロモー
ターからのトランス遺伝子の発現を調節すると報告され
ている(Chua et al.,Connective Tissue Res. 25:161-1
70(1990);Elias et al.,Annals N.Y.Acad.Sci. 580:233
-244(1990);Seliger et al.,J.Immunol.141:2138-2144
(1988) and Seliger et al.,J.Virology 62:619-621(19
88))。例えば、形質転換成長因子（ＴＧＦ）β、インタ
ーロイキン（ＩＬ）−１β、インターフェロン（Ｉｎ
ｆ）αまたはγは、ＬＴＲのようなウイルスプロモータ
ーによって制御されるトランス遺伝子の発現をダウンレ
ギュレートする。α２（Ｉ）コラーゲンプロモーター
（Ｃｏｌｌ）により制御されるトランス遺伝子の発現
を、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＧＦβ１、そしてＩ
Ｆ−１βがアップレギュレートする。ここに登場した結
果は、ＴＮＦα，ＴＧＦβ、そしてＩＬ−１βのような
いくつかのサイトカインが、繊維芽細胞のようなドナー
細胞中のプロモーターによって制御されるトランス遺伝
子の発現を調節するために用いられてきたことを示す。
有用性が証明されている他のサイトカインには、塩基性
繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）や表皮増殖因子（ＥＧ
Ｆ）がある。
【００６５】コラーゲンエンハンサー配列を伴ったコラ
ーゲンプロモーター（Ｃｏｌｌ(Ｅ)）は、移植後に脳内
に存在する、修飾されたドナー細胞においてトランス遺
伝子の発現を増加するための高濃度のサイトカインを利
用するために用いることができる。加えて、デクサメタ
ゾーンのような、ステロイドを含む抗炎症剤を、繊維芽
細胞の移植後すぐに、そして引き続いて、サイトカイン
によって炎症反応が治まるまで、移植された患者に投与
してよい。ある場合には、シクロスポリンのような免疫
抑制剤を、ＬＴＲプロモーターやＣｏｌｌ（Ｅ）プロモ
ーター−エンハンサーをダウンレギュレートしてトラン
ス遺伝子の発現を抑えるインターフェロン−γの生成を
減少させるために投与してもよい。
【００６６】インビボ での使用においては、コラーゲ
ンプロモーターによって制御されるトランス遺伝子は、
細胞に導入してその後直接脳に移植し、他からの影響を
受けないようにする。患者の自然な応答として移植後に
放出されたサイトカインは、選択されたトランス遺伝子
の転写によって制御されるコラーゲンプロモーターを刺
激する。
【００６７】成長因子ｂＦＧＦとＥＧＦをふくむサイト
カインもまた、ＣＮＳ中に移植されたドナー細胞の生存
を高めるために、移植前、移植中又は移植後に投与して
よい。
【００６８】移植後の遺伝的に高められた遺伝子の産物
の分泌を調節できることは有用である。ここで示した具
体例と同様に、伝達物質アセチルコリン（Ａｃｈ）のよ
うな遺伝子産物の放出は、アルツハイマー病では非常に
少ない。ＭＬＶベクターに感染した培養細胞コリンのア
セチル基転移酵素ｃＤＮＡの発現は、アセチルコリンの
前駆体コリンを用いて増加できた。このことは、大脳内
の遺伝子療法の食事制限の方法を示唆する。
【００６９】いくつかの、あるいは多くのＣＮＳ疾患遺
伝的修正は、正しい細胞間のシナプス連結の構成または
再構成を必要とするようだ。これらの可能性を研究する
ためのモデル系はまだ開発されていない。複製して(rep
licating)形質転換されていない細胞培養系が少なく、
複製しない神経細胞でもレトロウイルスの感染に対して
応答がないためである。しかし、最近の研究によれば、
胚の海馬神経細胞の永続性を必要とするものを含むが、
複製する神経細胞培養系は、インビボでの遺伝子転移や
さらにインビボでの移植のためにすぐに利用できるよう
になるようである。
【００７０】(Caettano and MacKay, Nature 347:762-7
65 (1990))。そのようなニューロンはレトロウイルスや
他のウイルスからのベクターによる有効な導入を可能に
し、またもしそれらが神経細胞としての特徴を保持でき
るなら、それらは脳内に移植された後他の細胞とシナプ
ス接合を形成できるだろう。代わりになるものとして、
ＣＮＳ中に存在する細胞で、海馬の歯状回腹葉のように
発達の遅いものや 、嗅覚粘膜や歯状回のように生体に
おいても分裂を続ける ものがある。
【００７１】移植に非神経細胞を用いることは、宿主内
部の標的細胞との特異的な神経接合の発達を妨げる。だ
から、繊維芽細胞や他の非神経性のドナー細胞や、イン
ビボの標的細胞の表現型に及ぼす効果は、必要とされる
遺伝子産物や代謝産物の拡散か、、ギャップ結合（”代
謝的共同作用”）か、ドナー細胞から分泌された遺伝産
物や代謝産物の標的細胞による取り込みか、による。ド
ナー細胞はまた、新しい遺伝子産物や代謝産物が発現す
ることによって、毒物の”シンク”となって神経毒を除
去する。
【００７２】代わりとして、神経ブリッジは、損傷を受
けたＣＮＳ組織中のニューロン間の再結合を促進する。
上部に記したように、コラーゲンマトリクスのような培
養基物質に懸濁して移植されたドナー細胞は神経ブリッ
ジとして軸索の再生や損傷したニューロンの再接合を促
進し、合成または生体内物質、例えば神経細胞や胎盤の
破砕懸濁液あるいは神経突起を伸長させる細胞外マトリ
クス、から形成される神経ブリッジとの連絡に用いられ
るようだ。
【００７３】（移植）本発明の方法は、欠陥、疾病及び
外傷を受けたＣＮＳの領域に挿入するトランス遺伝子を
含有するドナー細胞の脳内移植を企図するものである。
【００７４】神経トランス植え付け、または”移植”
は、中枢神経系内への細胞植え付け、または脳室腔内へ
の細胞植え付けや宿主脳の表面の硬膜下への細胞植え付
けを含むものである。好結果を得る植え付けに対する条
件は（１）移植の生存率（２）植え付け部位における移
植片の保持力（３）植え付け部位における病理学的な反
応の最小量、である。
【００７５】例えば胎児の脳組織のような多種の神経組
織を宿主脳へ植え付ける方法は、Neural Grafting in t
he Mammalian CNS の中に記述されてきた。Bjorklund a
nd Stenevi,eds.,(1985) Das,Ch.3 pp.23-30;Freed ,C
h.4,pp.31-40;Stenevi et al.,Ch.5,pp.41-50;Brundin
et al.,Ch.6,pp.51-60;David et al.,Ch.7 ,pp.61-70;S
eiger,Ch.8,pp.71-77(1985)これらはここで参照文献と
して編入されている。これらの手順は内実質（intrapar
enchymal）の植え付けを含んでいる。つまり、植え付け
の時に脳実質へ置くために、宿主脳ないへ注入したり置
換したりすることによって達せられる宿主脳内のことで
ある（これは、脳外または外実質(extraparenchymal)植
え付けと比較される）（Das,同上文献参照）。
【００７６】内実質植え付けの主要な２つの手順は
（１）宿主脳実質内へドナー細胞を注入すること（２）
宿主脳実質を露出するために外科的手段で腔を準備し、
腔内へ移植片を置換することである。（Das,同上文献参
照）両方法によって、移植の時に移植片と宿主脳組織間
の実質並置がなされ、また、両方法は移植片と宿主脳組
織間の解剖的統合を容易にする。移植片が宿主脳の統合
的部分になることが必要なときや、宿主の生命を生きの
ばすためには、これが重要である。
【００７７】代わりに、移植片は脳室内に設置されるで
あろう。例えば、大脳脳室や硬膜へ設けられたり、軟膜
及び蜘蛛膜と軟膜とを組み込ませることによって宿主脳
から離されたところの宿主脳の表面へ設けられる。脳室
への移植は、ドナー細胞の注入によって達せられたり、
また、固形組織の栓を形成するために３％コラーゲンの
ような培養基で細胞を成長させることによって達成させ
られる。この、固形組織栓は移植片の転移を防ぐために
脳室内に移植される。軟膜下の移植に対しては、細胞
は、硬膜内にスリットを作成後に脳表面の周囲に注入さ
れる。宿主脳の選択された領域への注入は、挿入される
マイクロシリンジの針を許容するために穴を開け、硬膜
に突き通すことによってなされる。このマイクロシリン
ジは好適に定位の枠にのせられており、３次元的な定位
(stereotaxic)座標は、脳の望ましい位置及び脊髄の中
に針を設置するように選ばれている。
【００７８】ドナー細胞は、また、脊髄だけでなく脳の
核、核質、海馬皮質、線条体、及び尾形領域内に供給さ
れる。
【００７９】継代接種されたドナー細胞に対しては、好
適に、細胞は約２から約２０の継代接種によって受け継
がれる。
【００８０】移植に対して、細胞懸濁液は、シリンジ内
に引き上げられ、麻酔をかけられた移植受容者に投与さ
れる。多数の注入はこの手順を使ってなされる。ドナー
組織の世代、すなわち発展段階は移植後の細胞生存のよ
い結果に影響する。
【００８１】このように細胞の懸濁手順は、相対的に傷
のない脳内及び脊髄内の所定の部位へ遺伝子的に修飾さ
れたドナー細胞の移植を許容し、また、数種の異なった
部位や、同じ細胞懸濁液を使う同種の部位に於ける同時
複合移植も可能にし、また、異なった解剖学的領域から
の細胞の混合物をも可能にする。複合移植は細胞型の混
合物から成り、または、細胞内へ挿入されるトランス遺
伝子の混合物から成る。好適には、約１０4 から約１０
8 個の細胞が単位移植に対して供給される。脊髄移植に
都合のよい腔への植え付けに対して、組織は植え付け腔
を形成するためにＣＮＳの外表面に近い領域から取り除
かれる。これは、例えば、同上文献のSteneviらによっ
て記されているように、脳上にある骨を取り除き、泡状
のゲルの様なもので出血をとめることによってなされ
る。吸い込みは腔をつくるために使用される。一つ以上
の移植は、細胞や固形組織移植の注入を用いて同じ腔に
おいてなされる。
【００８２】外傷を受けた脳内へのドナー細胞の移植は
異なる手順を必要とする。例えば、移植を試行する前
に、損傷部位を清潔にし、出血は止めなければならな
い。加えて、ドナー細胞は、外傷を受けた脳の病理学的
な環境において移植の転位を防ぐために、宿主脳の損傷
及び腔を満たすような十分な生長可能力を持っていなけ
ればならない。
【００８３】よって、本発明は、ＣＮＳの、欠陥を受け
た、疾病を持つ、または損傷した細胞を取り扱うため
に、移植脊髄への遺伝子的に修飾されたドナー細胞に対
する方法を提供するものである。
【００８４】本発明の方法は、また、ＣＮＳ内の疾病や
外傷を取り扱うために、他の治療学的手順と結び付け
て、トランス遺伝子ドナーの移植の使用をも意図してい
る。こうして、本発明の遺伝子的に修飾されたドナー細
胞は、他の細胞と共に共同移植され、有益に働いている
遺伝子的に修飾された細胞と遺伝子的に修飾されていな
い細胞の両方は、副腎からのクロム親和性細胞や胎児の
脳細胞、及び胎盤細胞のようなＣＮＳ内の細胞に影響を
及ぼす。この遺伝子的に修飾されたドナー細胞は、共同
移植された遺伝子的に修飾されていない細胞の生存率や
機能を支えるために提供される。例えば、下記の実施例
に記述されたようなインビボでの神経生長因子（ＮＧ
Ｆ）を供給するために修飾された繊維芽細胞がある。
【００８５】さらに、本発明の遺伝子的に修飾されたド
ナー細胞は、ＣＮＳの欠陥や損傷及び疾病の取扱におい
て治療学的薬物とともに有効に共同投与される。このＣ
ＮＳは生長因子のようなもので、つまり、神経生長因
子；ガングリオシド；抗生物質、神経伝達物質、神経ホ
ルモン、毒物、代謝拮抗物質、軸索プロモーティング分
子（neurite promoting molecules）、及びドーパミン
の前駆体のＬ−ドーパのようなこれらの薬物の前駆体で
ある。
【００８６】本発明の方法は好ましい実施例によって例
証される。そこでは、治療学的トランス遺伝子を運ぶベ
クターを含むドナー細胞は検体内の皮質内に移植され
る。最初の好ましい実施例では、確定したＨＰＲＴ欠損
ラット繊維芽細胞ライン２０８Ｆ、プライマリーラット
繊維芽細胞及び出生後１日が経過したプライマリーラッ
トの星状細胞が、レトロウイルスベクターを用いた遺伝
子的に修飾された培養細胞が哺乳類の脳内の移植の際に
生き残るをいうことと、トランス遺伝子生成物を発現し
続けることを示すために使用されてきた。
【００８７】２つめの好ましい実施例では、繊維芽細胞
はレトロウイルスベクターとの感染によってＮＧＦを分
泌するために遺伝子的に修飾され、また、修飾された繊
維芽細胞はフィンブリエ円蓋領域の外科的な損傷をもつ
ラットの脳内へ移植される。移植された細胞は生き残
り、処理無しでは死んでしまうコリン作動性ニューロン
の変質を防ぐために十分なＮＧＦを供給した。加えて、
保護されたコリン作動性細胞は軸索を発芽する。これ
は、ＮＧＦの産生細胞の方向に突き出た。
【００８８】３つめの好ましい実施例では、繊維芽細胞
はレトロウイルスベクターとの感染によってＬ−ドーパ
を発現したり分泌するために遺伝子的に修飾された。ま
た、修飾された繊維芽細胞は、片側のドーパミン涸渇の
結果としてのパーキンソン病をモデルするラットの尾形
内に移植された。細胞は生き残ってドーパミンの涸渇に
よって引き起こされた循環運動を減少させるほど十分な
Ｌ−ドーパを供給する。
【００８９】４つめの好ましい実施例では、皮膚生検か
ら分離され培養地で維持された皮膚のプライマリー繊維
芽細胞は、成体ラット線条体内への皮質内移植に対して
自己細胞として用いられた。繊維芽細胞は一度コンフル
エントすると増殖を終え、インビトロで抑制された接触
をもつ。繊維芽細胞は以下の皮質内移植で少なくとも８
週間生存し、インビボでコラーゲンやフィボロネクチン
を合成し続ける。移植はまた、３週間から８週間同じ体
積を維持する。このことは、皮膚プライマリー繊維芽細
胞が腫れあがったり死んでいないことを示している。食
細胞移動や星状細胞肥大や移植への湿潤を含む動的な宿
主−移植相互作用は、成体ラットＣＮＳにおいて皮膚プ
ライマリー繊維芽細胞の移植の構造的統合を示している
ことが観察された。
【００９０】５つめの好ましい実施例では、ラットの同
系交配の系統からの皮膚生検から得られた皮膚プライマ
リー繊維芽細胞は遺伝的な修飾や移植に対してドナー細
胞として使用された。ドナーラットとして同遺伝的系統
のラットの脳内に移植したところ、チロシンハイドロキ
ナーゼ（ＴＨ）またはβ−ガラクトシダーゼのどちらか
に対するトランス遺伝子を含む繊維芽細胞は１０週間生
き残り、トランス遺伝子を発現し続けた。移植された繊
維芽細胞によって合成されたＴＨは、インビトロで観察
されるようにチロシンをＬ−ドーパに変換し、行動的測
定を通して評定されるような宿主脳に影響を及ぼすよう
に見えた。線条体へ局所的にＬ−ドーパを供給すること
は線条体のドーパミン作用性の入力の損失に対して部分
的に補うのに十分であることが示された。
【００９１】６つめの好ましい実施例では、ヒトＮＧＦ
に対してドナー細胞として供給される老人繊維芽細胞の
能力が示された。
【００９２】７つめの好ましい実施例では、ラット繊維
芽細胞は遺伝子的に修飾されて、コリンアセチルトラン
スフェラーゼ（ｄＣｈＡＴ）を発現し、分泌する。ＡＣ
ｈの皮質内及び皮質外レベルが外因のコリンクロライド
を付加することによって増加することが示された。加え
て、血清欠乏や誘導されて休止するコンフルエントによ
って再結合ＣｈＡＴ活性は８０％減少した。（活性な生
長細胞と比較して）ＡＣｈ遊離はまた、休止繊維芽細胞
培養地において抑えられた。外因コリンはＡＣｈ分泌に
おける減少を和らげる。これらの結果は、繊維芽細胞が
ＡＣｈを供給するように遺伝子的に修飾でき、また、Ａ
Ｃｈ遊離が規制できること、例えば、培養培地内へコリ
ンを供給することによって増加することを示している。
【００９３】９つめの好ましい実施例では、サイトカイ
ン、抗炎症性薬物及びデクサメタゾーンは、ＬＴＲプロ
モーター活性へのそれらの効力に対して評価され皮膚プ
ライマリー繊維芽細胞内でのＣＡＴ及びｄＣｈＡＴ遺伝
子の発現を高める。加えて、コラーゲンエンハンサー
（Ｃｏｌｌ（Ｅ））をもつコラーゲンプロモーターα２
（Ｉ）は、休止繊維芽細胞でのＣＡＴの発現におけるサ
イトカインの効力の評価に用いられた。
【００９４】１０番目の好ましい実施例では、皮膚プラ
イマリー繊維芽細胞はＮＧＦを発現し分泌するために修
飾され、また、成体の雌ラットの線条体へ移植された。
１週間から３週間で、下記の線条体植え込み、及びＮＧ
Ｆレセプター−免疫反応性軸索はＮＧＦ−供給繊維芽細
胞の移植片を取り囲んだ。３週間から８週間では、ＮＧ
Ｆレセプター−ポジティブプロフィール(NGF receptor-
positive profiles)が移植片内部に見つかった。正常な
プライマリー繊維芽細胞の移植制御は免疫反応性軸索を
欠乏させる。超微細構造的試験によって、移植片の細胞
外マトリックス内部の髄鞘のない軸索は活性星状細胞の
進行過程で取り囲まれ、また、異なった基底層は軸索グ
リアルバンドル(bundles)を取り囲んだことが示され
た。活性星状細胞の進行過程は遺伝子的に修飾されたプ
ライマリー繊維芽細胞を含む制御と移植の両方で明白で
あった。この実施例によってインビボでのモデルが説明
され、これは、移植片からのＮＧＦの遊離がＮＧＦレセ
プター−ポジティブ軸索の成長方向性を誘発し、成熟活
性星状細胞が軸索が移動する上での許容される基質を供
給することを示している。この実施例において、遺伝子
的に修飾された繊維芽細胞はまた、コラーゲンマトリッ
クス移植片に置かれ、成体ラットの培地隔膜の再生殖性
容量を評定した。移植片はＮＧＦを供給し、また、隔膜
軸索の再生殖を促進した；移植片は繊維芽細胞移植を制
御するために比較される髄鞘のない軸索の多数を所有し
た。再生殖される隔膜軸索は求心路遮断された海馬に神
経分配をした；海馬歯状回内の隔膜入力の地形学的及び
シナプス組織化は、隔膜核から引き起こされる正常なコ
リン作動性神経分布のものと同様であった。
【００９５】ここに説明されている本発明をよりよく理
解する目的で、以下の実験例が記載されている。これら
の実験例は例示の目的で単に示されているものであっ
て、その実験例によってこの発明の範囲が限定されるも
のではないことを理解すべきである。
【００９６】［実験例Ｉ］ 「ＨＰＲＴトランス遺伝子を発現するように遺伝子修飾
を施した細胞の脳への脳内移植」 （細胞への感染）ドナー ヒポキサンチン グアニン
ホスホリボシル トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）に欠
陥をもつ２０８Ｆラットの繊維芽細胞(Jolly et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci,USA 80:477-481 (1983))に、ＨＰＲ
Ｔ ｃＤＮＡを発現するプロトタイプＨＰＲＴベクター
ｐＬＳ Ｐ ＬＭ(Miller et al.,Science 225:630-6
32(1984);Yee et al.,Gene 53:97-104(1987))またはＴ
ｎ５トランスポゾン ネオマイシン−耐性遺伝子（ｎｅ
ｏR、）及びホタルのルチフェラーゼｃＤＮＡ(de Wet e
t al.,Molec.Cell.Biol. 7:725-737(1987))の双方を発
現するｎｅｏR−ルチフェラーゼベクター ｐＬＮＨＬ
２(Eglitis et al., Sience 230:1395-1398(1985);Wolf
f et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)) を感染させた
（図４）。ｐＬＳＰ ＬＭベクターはベクター ｐＬＰ
Ｌ２(Miller et al.,Molec,Cell.Biol.6:2895-2902(198
6))に由来し、翻訳終止コドンのイン−ビトロ突然変異
誘発により付加された新たなＣ末端ヘキサペプチドを持
つプロテインをコードしているヒトＨＰＲＴ ｃＤＮＡ
を含んでいる。ベクター ｐＬｐＬＭ(Yee et al.,Gene
53:97-104(1987))はＸｈｏｌ及びＢａｍＨｌにより
１．３Ｋｂの長さの断片に切断し、すでにＸｈｏｌ及び
ＢａｍＨｌで切断されたプラスミド ｐＬｐＬ２(Mille
r,同上文献参照)の中へ組み入れた。得られたベクター
は ｐＬＳ Ｐ ＬＭである。
【００９７】ベクター ｐＬＮＨＬ２は、ホタルのルチ
フェラーゼ（ＬＵＸ）をコードしているｃＤＮＡと、Ｔ
ｎ５ネオマイシン−耐性遺伝子（ｎｅｏR）及びヒトサ
イトメガロウイルス即時初期遺伝子（ＨＣＭＶ）のプロ
モーターとエンハンサーとを保持している。５’及び
３’ＬＴＲｓは、Ｍａｓｏｎらにより述べられた(Scien
ce 234:1372-1378(1986))複製ハツカネズミ白血病遺伝
子（ＭＬＶ）から得られた。ベクター ｐＬＮＨＬ２は
以下のように調製した：プラスミド ｐＬＮＨＰＬ２
（ＹｅｅらによりＰＮＨＰ−１としても知られている、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5197-5209(1987)）をＢａ
ｍＨＩで切断しＨＰＲＴ ＤＮＡ配列を取り除く。末端
はＫｌｅｎｏｗ ポリメラーゼにより修復した。プラス
ミド ｐＬＶ２Ａ(deWet et al.,Molec.Cell.Biol.,上
述)（Ｄｒ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉから提供された，Unive
rsity of California,San Diego,CA）はＨｉｎｄＩＩＩ
及びＳｓｐｌにより切断され、ルチフェラーゼ断片を単
離した。末端は前述の手順により修復した。ＢａｍＨｌ
で切断されたｐＬＮＨＬ２とＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓｓｐｌ
で切断されたｐＳＶ２Ａを結合してベクター ｐＬＮＨ
Ｌ２を合成した（図５）。
【００９８】確実に感染細胞のみを用いるために、細胞
は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（Ｈ
ＡＴ）を含んだＨＰＲＴを発現する細胞のための選択培
地と、ネオマイシン類似体Ｇ４１８を含んだｎｅｏRを
発現する細胞のための選択培地との双方でインキュベー
トした。
【００９９】プライマリーの繊維芽細胞と星状細胞には
ｎｅｏR−ルチフェラーゼベクターのみを感染させた。
続いてＨＡＴ耐性及びＧ４１８耐性細胞は、無血清培地
か、またはラットの脳内に於ける免疫応答を抑制するた
めにラットの血清を含む培地で一晩インキュベートし
た。
【０１００】（移植）細胞は平衡にあるグルコース−食
塩水溶液中で再攪拌し、滅菌シリンジを用いてラットの
脳の数カ所の領域中へ定位に注入した。１μｌ当り１
０，０００から１００，０００個の細胞を含む液を１μ
ｌ／ｍｉｎの速度で総量３−５μｌ注入した。１週間な
いし３カ月後に動物は死に、移植細胞を含む領域を特定
して切り取ったあと、組織学的および生化学的に調査し
た。
【０１０１】（組織学的分析）移植細胞を組織学的に評
価するために、一般形態学的特徴を記述するためＮｉｓ
ｓｌ着色剤及びクレジルバイオレットで、また特定細胞
の抗原マーカー（繊維芽細胞に対してフィブロネクチ
ン、膠細胞に対して膠繊維酸性蛋白（ＧＦＡＰ））の存
在を確立するために免疫化学的方法を用いてラットの体
内に各試薬を潅流させることにより脳を着色し区分し
た。要約して述べると、切断片を０．２５％トリトン−
Ｘを含んだトリス−バッファー食塩水（ｐＨ７．４）中
ですすいだ。切断片はフィブロネクチンに対するうさぎ
のポリクローナル抗体（１：２０００に希釈；baralle,
University of Oxford,England）及びＧＦＡＰ(Gage et
al.,Exp.Neurol.102:2-13(1989);Dakopatt,Glostryp,D
enmarkから入手可能)の０．２５％トリトン−Ｘ及び３
％ヤギ血清を含んだＴＢＳによる１：１０００希釈溶
液、またはラット マクロファージの膜ポリペプチド、
顆粒性白血球および樹状細胞（MRC OX-42,Serotec）に
対するモノクローナル抗体であるマウスＩｇＧ２ａの
０．２５％トリトン−Ｘ及び１％ウシ血清を含んだ０．
１Ｍ ＴＢＳによる１：１００希釈溶液中で４℃で２４
時間インキュベートした。完全にすすいだ後、切断片は
ビオチン化されたヤギの抗−ウサギＩｇＧ（Vectastai
n）の０．２５％トリトン−Ｘ及び１５％ウマ血清を含
んだ０．１Ｍ ＴＢＳによる１：２００希釈溶液中でイ
ンキュベートし、続いて０．２５％トリトン−Ｘと１％
ヤギ血清または１％ウマ血清を含んだＴＢＳ中ですすい
だ。この切断片はアビジンとビオチン化したセイヨウワ
サビペルオキシダーゼ（Vectastain,ABCkit,Vector Lab
s,Burlingame,CA）とのコンプレックスの０．２５％ト
リトン−Ｘ及び１％ヤギ血清または１％ウマ血清を含ん
だ０．１Ｍ ＴＢＳによる１：１００希釈溶液中で室温
で１時間インキュベートし、続いて完全にすすいだ。ペ
ルオキシダーゼは０．０５％３，３−ジアミノベンジジ
ン テトラヒドロクロリド（ＤＢＡ）（SigmaChemical
Co.,St.Louis,MO）、０．０５％ＮｉＣｌ2及び０．０１
％Ｈ2Ｏ2のＴＢＳ溶液中で室温で１５分間反応させて明
視化した。
【０１０２】７週間前にラットのネオ線条体（neostria
tum）に移植したプライマリーのラット繊維芽細胞を図
６に示す。一続きの４０μｍの厚さの切断片はアンチフ
ィブロネクチン（図６（ａ），図６（ｄ））、クレジー
ルバイオレット(cresyl violet:Disbrey et al.,Histor
ogical Laboratory Methods,E.&S.Livingstone,Edinbur
gh and London(1970))（図６（ｂ），図６（ｅ））及び
抗−ＧＦＡＰ（図６（ｃ），図６（ｆ））により着色し
た。生き残っている細胞は無傷で、注入領域の周辺に凝
集または集合しているように見えた。カニューレ管にお
いてのみ見られるものと同様に、細胞は移植片の中心部
ではフィブロネクチンによる強い着色を示し、移植片の
周辺部では反応性神経膠質腫症のためにはっきりとした
ＧＦＡＰ−着色剤による着色を示した。しかし移植片自
身においてもわずかなＧＦＡＰ着色が観察された。クレ
ジルバイオレットによって濃く着色された小さな丸い細
胞が移植片の領域中において観察されたが、これは傷つ
いたことにより浸透した小膠細胞またはリンパ球であろ
う。マクロファージは多くの移植片においても観察され
た。繊維芽細胞の多くにおいて、クレジルバイオレット
の着色により見られる細長い形や、細胞を囲んでいるコ
ラーゲン物質のシートにより編まれた桃色によって同定
することができた。２０８Ｆ繊維芽細胞の外観はプライ
マリー繊維芽細胞と同様である（提示せず）。星状細胞
移植片もまた同じ外観を示すが、フィブロネクチン陽性
ではなく、移植片の中心を通じてＧＦＡＰにより染色さ
れた。これら三つの細胞型について、レトロウイルス感
染細胞とコントロール細胞で違いは認められなかった。
これらの細胞懸濁移植片の重要な性質としては、大抵の
細胞が注入部位の周辺に集まって残留し、このような環
境においては注入部位から宿主の脳のなかの遠方まで移
動するといった様子はなかった。この明らかな移動性の
欠如は他のドナー細胞型や移植部位とはかなり異なって
おり、それゆえ細胞が移植される脳内の領域、ドナー細
胞の性質、トランス遺伝子に対する標的細胞の表現型な
どがドナー細胞を選択する際の重要な要因であろう。
【０１０３】（移植細胞の特徴付け）移植細胞を解剖し
て再培養の準備をし、またトリプシンにより細胞を融解
して生化学的、分子的特徴付けを行うための準備を整え
た。ヒトＨＰＲＴ活性の検出のために、以前に示した手
順により細胞抽出液は各試料の大部分から用意し、ポリ
アクリルアミドゲルの等電点に焦点を合わせたＨＰＲＴ
分析(Jolly et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)80:477-4
81(1983);Miller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci(USA)80:4
709-4713(1983);Willis et al.,J.Biol.Chem.259:7842-
7849(1984);Miller et al.,Sience 255:630-632(1984);
Gruber et al.,Science 230:1057-1061(1985),and Yee
et al.,Gene 53:97-104(1987)). 各試料の残渣は培地上
に載せた。ＨＰＲＴベクターに感染後のラット２０８Ｆ
細胞ＨＡＴ耐性のＨＰＲＴゲル分析の結果は、ラットの
脳幹神経節の一方に移植した。移植後３及び７週間後の
様子と分析前の様子は図７に示した。
【０１０４】ヒトＨＰＲＴ酵素活性の存在は、脳に移植
された、感染して遺伝的に変更を受けたラット２０８Ｆ
細胞は生き残り、少なくても７週間に渡って容易に検出
できるレベルのＨＰＲＴトランス遺伝子を発現し続ける
ことを示している。さらに移植細胞は首尾よく再培養さ
れ、初めの培養組織と形態学的に同一の細胞を産生し
た。これらの細胞へヘルパーウイルスを感染させた結果
ＨＰＲＴウイルスが産生されたが、これは細胞の同一性
を確立し、プロウイルスが無傷であることを示してい
る。ｎｅｏR−ルチフェラーゼベクターを用いた研究
は、ルチフェラーゼ感染細胞の生存と発現とを確立す
る。
【０１０５】［実験例ＩＩ］ 「損傷を受けた脳へのＮＧＦを発現するよう遺伝学的に
修飾された細胞の移植」上記の実験例はレトロウィルス
ベクターを使って遺伝学的に修飾した培養細胞が哺乳動
物の脳に移植したとき生きつずけること及びトランス遺
伝子産物が発現することを実証している。この実験例は
遺伝学的に修飾された細胞によってインビボで欠損し、
または以前に損傷を受けた脳の機能を補いあるいは修復
しうるかどうかを決定するために行われた。
【０１０６】（ＮＧＦベクターｐＬＮ．８ＲＮＬの構
築）既に報告されている方法（Wolfら、Mol.Biol.Med.
5:43ー59(1988)）によってレトロウィルスはモロニー（m
oloney）ネズミ白血病ウィルス(MoMuLV)(Varmusら,RNAT
umorViruses;Weissら、Cold Spring Harbor, NY, p. 23
3 (1982))からつくられた。pLN.8RNLベクターはマウス
ＮＧＦ ｃＤＮＡ (Scott et al., Nature 302; 538 (1
983); Ullrich et al., Nature 303:821 (1983))の７７
７塩基対Ｈｇａｌ−Ｐｓｔｌフラグメントをウィルスの
５’末端ＬＴＲの制限下に含む。この挿入は交換神経抑
制を受けたマウス組織に多いより短いＮＧＦトランスク
リプト(Edwards et al., Nature 319:784 (1986))に対
応し、構成的に分泌されるNGF前駆体をコードすると信
じられる。ベクターはまた内部ラウス サルコマ ウィ
ルスプロモターの制限下、トランスポゾンＴｎ５のネオ
マイシン抵抗性機能(Southern et al., J. Mol. Appl.
Genet. 1:327 (1982))をコードする支配的な選択的マー
カーを含んでいた。
【０１０７】プラスミドｐＳＰＮ１５’（Wolf et al.,
Mol. Biol. Med. 5:43-59(1988)Harvard Medical Scho
ol Boston, MA ブレイクフィールド博士より供与）は
公知の方法（Maniatis et al., Cold Spring Harbor Pr
ess, Cold Spring Harbor, NewYork, (1982)）により制
限酵素ＰｓｔｌとＨｇａｌを使って消化され、ＮＧＦシ
ーケンスを含む７７７塩基対（ｂｐ）ＤＮＡフラグメン
トは標準的な精製方法（Maniatis, et al.,上記文献）
によって単離された。そして７７７ｂｐはＹｅｅらによ
ってpro. Natl. Aca. Sci. (USA)84: 5197-5201 (1987)
に記載された方法によってプラスミドｐＬＭＴＰＬに平
滑末端でつながれた。プラスミドｐＬＭＴＰＬはメタロ
チオネイン プロモターを除くためＨｉｎｄＩＩＩを使
って消化され、ほとんどのＨＰＲＴｃＤＮＡ及びオーバ
ーハンギング５’末端はＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを使
ってマニアテス（Maniatis）ら（上記文献）の方法で修
復された。上記のようにして単離された７７７ｂｐフラ
グメントのオーバーハンギング末端は同様に修復され
た。７７７ｂｐフラグメントはそれから消化されたプラ
スミドｐＬＭＴＰＬに平滑末端でつながれた。その結果
生成するプラスミドはＰＬＮ．８Ｌと呼ばれ、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＤＨ１株にトランスフェクトされ、培養され、塩
化セシウム遠心法を含むプラスミド精製のための確立さ
れた方法(Maniatisら、上記文献）によって精製され
た。精製されたプラスミドｐＬＮ．８Ｌは制限酵素Ｂａ
ｍＨＩとＣｌａｌを使って消化され、生成する６．１キ
ロ塩基フラグメントはプラスミドｐＬＬＲＮＬより単離
された２．１ｋ塩基ＢａｍＨｌ−Ｃｌａｌにつながれ
た。プラスミドｐＬＬＲＮＬは以下のようにde Wet et
al., Mol. Cell. Biol. 7:725-737 (1987)に記載された
プラスミドＪＤ２０４から由来する：プラスミドＪＤ２
０４に由来するホタルルシフェラーゼ遺伝子からの１７
１７ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓｓｐ１フラグメントとSo
uthernとBergによりMol.Appl. Genet. 1:327-341 (198
2)に記載されたプラスミドｐＳＶ２ＮｅｏＲ の１３２
１ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓｍａｌフラグメントはプラ
スミドｐＵＣＲＨからの３００ｂｐＢａｍＨＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩフラグメント中の変異ＲＳＶプロモターを含む
フラグメントとつながれた。プラスミドｐＬＬＲＮＬは
図８に描かれている。
【０１０８】プラスミドｐＵＣＲＨ以下のようにして生
成された。プラスミドｐＲＳＶｎｅｏＲはＨｉｎｄＩＩ
Ｉを使って制限され、直線化されたプラスミドはＨＰＲ
Ｔシーケンスを除くためにＨｉｎｄＩＩＩを使って制限
することによって得られたプラスミドｐＰＲ１（図９）
(Universityof Carifornia, San Diego, CA Dr. Fried
mannから供与)からの残りのフラグメントとつながれ
た。プラスミドｐＰＲ１はＰｓｔとＲｓａを使ってｐ４
ａＡ８(Jolly et al., Pro. Natl. Acad. Sci. 80:477-
481 (1983))から得られた。生成したプラスミドはｐＲ
ＨＮと呼ばれＰｖｕＩＩによって制限され、再結合され
てプラスミドＰＮ（＋）とＰＡＣ（−）を形成する。Ｐ
Ｎ（＋）はＢａｍＨｌを使って制限される。生成した直
線化されたプラスミドはＢａｍＨＩを使って制限された
ｐＳＶｏｒｉプラスミドから得られたフラグメントとつ
ながれた。プラスミドｐＳＶｏｒｉはプラスミドｐ４ａ
Ａ８をＳａｌｌとＰｓｔｌを使って制限し、生成するフ
ラグメントをＳａｌｌとＰｓｔｌで制限されたプラスミ
ドｐＵＣｌ８(Bethesda Research Laboratories, Gaith
ersburg, MD)へサブクローニングすることによって得ら
れた。生成するプラスミドはｐＳＶｏｒｉと呼ばれる。
【０１０９】ＢａｍＨＬ制限プラスミドＰＮ（＋）とＢ
ａｍＨｌ制限プラスミドｐＳＶｏｒｉをつなぐことによ
って得られるプラスミドｐＲＨ＋Ｓ＋はＭｓｔＩＩによ
って制限され、オーバーハンギング５’末端はＫｌｅｎ
ｏｗポリメラーゼを使って上記のようにして修復され
た。このフラグメントはＳｍａｌによって直線化された
Ｍ１３ｍｐ１８(Bethesda Research Laboratories)に
つながれ、仔牛小腸のアルカリホスファターゼ(Boering
er Mannheim, Mannheim, W. Germany)によってリン酸加
水分解された。生成するプラスミドはｐｍｐＲＨと呼ば
れ、ＲＳＶプロモーターから発現したＨＰＲＴｃＤＮＡ
を含んでいた。
【０１１０】プラスミドｐｍｐＲＨはポリアデニレーシ
ョンシグナルをＡＡＴＡＡＡからＡＧＣＡＡＡに変える
ためKunkel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:48
8-492によって位置指向的ミュータジェネシスに付され
た。ミュータジェネシスの後、生成するプラスミドはＨ
ｉｎｄＩＩＩによって制限され、生じるフラグメントは
プラスミドｐＵＣ１９(Bethesda Research Laboratorie
s)を制限して得られるＨｉｎｄＩＩＩフラグメントにつ
ながれてプラスミドｐＵＣＲＳＶを生じた。プラスミド
ＣＲＳＶはＢａｍＨｌとＰｓｔｌを使って制限されＲＳ
Ｖプロモーターを含むフラグメントを生じた。このフラ
グメントは上記実験例Ｉに記載されたような方法でプラ
スミドｐＬＳ Ｐ ＬＭの制限によって得られたプラス
ミドＨＰＲＴをコードする遺伝子を含むＰｓｔｌ−Ｓｓ
ｔｌフラグメントと、プラスミドｐＵＣ１９から得られ
たＢａｍＨ１−Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントにつながれ
てプラスミドｐＵＣＲＣを生じた。ｐＵＣＲＨからのＢ
ａｍＨｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントと、ｐＪＤ２０
４からの１７１７ｂｐ Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｓｓｐｌフラ
グメントと、ｐＳＶ２ＮｅｏＲからの１３２１ｂｐ Ｈ
ｉｎｄｌｌｌ−Ｓｍａｌｌフラグメントの間の結合生成
物はトランスフェクトされ、既に記載した確立された方
法で精製され、プラスミドｐＬＬＲＮＬと呼ばれた(図
８)。
【０１１１】トランスフェクトし、精製した後、プラス
ミドｐＬＮ．８Ｌからの６．１ ＢａｍＨｌ−Ｃｌａｌ
キロ塩基フラグメントとプラスミドｐＬＬＲＮＬからの
２．１キロ塩基ＢａｍＨｌ−Ｃｌａｌフラグメントの結
合から生じるプラスミドはｐＬＮ．８ＲＮＬと呼ばれ
る。
【０１１２】（伝染性レトロウィルスの調整）伝染性レ
トロウィルスはｐＬＮ．８ＲＮＬをＰＡ３１７アンフォ
トロフィック生産細胞(Miller et al., Mol. Cell. Bio
l. 6:2895 (1986)、Dr.Miller, FredHutchinson Cancer
Research Centerより供与）に、カルシウムホスフェー
ト共沈澱法(Graham et al., Virology 52:456 (1973))
により、これらの細胞の培地を使って、Ψ-2エコトロピ
ック生産細胞(Mann et al., Cell 33: 153 (1983))に、
４μg/mlのpolybrane(Sigma Chemical, St. Louis, Mo)
存在下に感染させることによって作られた。最高力価
４ｘ１０５ コロニー生産ｕｎｉｔｓ／ｍｌを示すΨ−
２クローンからのウィルスが、確立されたラット フィ
ブロブラストセルライン ２０８Ｆ(Quade, Virology 9
8:461 (1979)に、ミヤノハラ（miyanohara）らによって
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)に報告された方法
で、感染させるために使われた。
【０１１３】（ＮＧＦ産生と分泌のアッセイ）ネオマイ
シン類縁体G418を含む培地から選ばれた個々のネオマイ
シン抵抗性２０８Ｆコロニーは増殖され、２部位（ＥＬ
ＩＳＡ）エンザイム イムノアッセイ(Korsching et a
l.,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)80:3513-3516(1983))
によって、市販の試薬を製造業者(Boehringer Mannhei
m)のプロトコールに従って使用し、ＮＧＦ産生と分泌が
テストされた。最高レベルのＮＧＦを産生するクローン
は１ｍｇの総細胞タンパク当り１．７ｎｇのＮＧＦを含
んでおり、５０ｐｇ／ｈｒ１０５細胞の速度で培地中に
ＮＧＦを分泌した。このクローンによって分泌されるＮ
ＧＦは、ｐｃ１２ラット好クローム性細胞腫(Greene, e
t al, Pro. Natl.Acad. Sci. USA 73:2424 (1976))から
の軸索派生を誘導する活性によって決定されるように、
生物学的に活性である。感染していない２０８Ｆ細胞
は、対照的に、いずれのアッセイにおいても検出可能な
レベルのＮＧＦを産生しなかった。
【０１１４】（卵管のフィンブリエの円蓋の切断）卵管
フィンブリエの円蓋の切断(axotomy)はGage et al., Br
ain Res. 268:27-37 (1983)及びNeuroscience 19(1) 24
1-255 (1986)に記載の方法で行われた。簡潔に記述すれ
ば、実験開始時において体重２００ｇ−２２５ｇの雌の
成人したSprague-Dawleyラット(Bantin and Kingman, S
an Francisco, CA)が使用された。動物はケタミン-キシ
ラジン混合物（１０μｇ／ｋｇ Ketalar, Parke-Davis
AnnArbor, MIと５μｇ／ｋｇ Rompun, Hoechst, Frnn
kfurt, W. Germany）を腹腔内に注射することによって
麻酔された。偏側吸収病巣はGage et al, Brain Res.26
8:27-37 (1983)に記載されているような方法で、帯状皮
質を通した吸引と、卵管のフィンブリエ円蓋を片側だけ
完全に切断し、そして、海馬及びその上に横たわる帯状
皮質の背側の尖端を除去することによって作られ、海馬
ターゲット上の部分的神経支配除去が行われた。個々の
実験グループ中の全ての動物が同じ片側だけの吸引病巣
を受けた。卵管フィンブリエ円蓋病巣は上記のようにし
て１６匹のラットに作られた；８匹のラットは感染細胞
の移植を受け、残る８匹のラットは感染していないコン
トロールのラットである。
【０１１５】フィブロネクチンで染まる部分はフィブロ
ブラスト特異的マーカーであるが、両グループにおいて
同程度の移植生存性を示すことが分かった（図１３
（ａ）、図１３（ｂ））。コリン作動性細胞体の生存率
を評価するためのコリンアセチルトランスフェラーゼ
（ＣｈＡＴ）に染まる部分は、感染細胞を移植された動
物の内側隔壁の病巣部位にはコントロールの移植を受け
た動物におけるよりも多くのニューロンが残っているこ
とが分かった（図１３（ｃ）、図１３（ｆ））。
【０１１６】レトロウィルスに感染した細胞（ＮＧＦ分
泌）とコントロールの２０８Ｆ細胞は０．０５％トリプ
シンと１ｍＭＥＤＴＡを含むダルベッコ（Dulbecco）の
ホスフェートバッファーセーライン（ＰＢＳ）を使って
コンフルエントプレートから除去され、１ｍｇ／ｍｌの
ＭｇＣｌとＣａＣｌ2(complete ＰＢＳ)及び５％ラット
セーラムを使って抽出され、トリプシンは不活性化され
た。細胞は４℃で４分１０００ｘｇで遠心分離によって
ペレット化され、完全ＰＢＳによって２回洗浄され、完
全ＰＢＳに１０５ｃｅｌｌｓ／μｌで再懸濁された。４
μｌの懸濁細胞はフリーハンドでハミルトンシリンジを
使って動物の体腔と体腔と同側の側方脳室に注射され
た。１個のゲラチン泡は体腔の表面にそっと置かれ、動
物は縫合された。
【０１１７】（免疫組織化学）外科的手術から２週間目
にラットは潅流され、脳が取り出され、１夜間固定さ
れ、ホスフェートバッファーを含む３０％スクロース中
に２４時間４℃で置かれた。４０μｍ厚の部分は凍結ス
ライドミクロトーム上で切断され、クリオプロテクタン
ト（ホスフェートバッファーグリセロールとエチレング
リコール）中ー２０℃で保存された。すべての５番目の
部分はフィブロブラスト生存率を評価するためにフィブ
ロネクチンに対してポリクローナル抗体を使って標準的
方法によって免疫組織化学的にラベルされた。コリンア
セチルトランスフェラーゼに対するポリクローナル抗体
（抗−ＣｈＡＴ 抗血清（antiserum））が作られ、コリ
ン作動性細胞体の生存率がGage et al., J. of Compara
tive Neurol. 269:147-155に記載されたようにして評価
された。組織部分はHsu et al.,29:1349-1353 (1981)と
そこに引用された文献のアビジン−ビオチン（avidin-b
iotin）ラベル化法の変法に従って免疫組織学的にプロ
セスされた。この方法は以下のステップからなる：１）
ＣｈＡＴの抗体またはコントロール抗体（即ち前免疫シ
ーラムまたは吸収アンチシーラム）との１夜間インキュ
ベーション。ＣｈＡＴ抗体は１％山羊シーラムと０．２
５％トリトンＸー１００を含む０．１Ｍトリスセーライ
ンを使って１：１５００に希釈された；２）１％山羊セ
ーラムを含むトリスーセーラインで１：２００に希釈さ
れたビオチン化された山羊抗うさぎ抗体ＩｇＧ(Vector
Laboratories, Burlingame, CA)との1時間インキュベー
ション；３）１％山羊セーラムを含むトリスーセーラム
で１：１００に希釈されたＡＢＣコンプレックス(Vecto
r Laboratories)との1時間インキュベーション；４）
０．０５％３、３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と
０．０１％過酸化水素と０．１Ｍトリスバッファー中の
０．０４％塩化ニッケルで１５分間処理。免疫学的にラ
ベルされた組織部分はガラススライドに乗せられ、風乾
され、パーマウントとガラスカバースリップで覆われ
た。セプタムで２００μｍ隔てられたＣｈＡＴに染まる
二つの部分はコリン作動性細胞生存率の程度を評価する
ために使われた。同側および反対側隔壁の全てのＣｈＡ
Ｔ陽性細胞はオリンパスＱｕｅ−２イメージ分析システ
ムを使って平面の面積にしたがって分類され、それぞれ
数えられた。また組織はHerdreen et al., J. Histoche
m. 33:134-140 (1985)とそこに引用された文献の方法に
したがってアセチルコリンエステラーゼに染色され、卵
管フィンブリエ円蓋の切断が完全に行われたかどうかを
評価された。
【０１１８】ニューロンの生存率は定量され（図１
４）、何もしていない反対側のセプタムに比べて病巣の
ある側のセプタムにおける残っているコリン作動性細胞
のパーセンテージとして表現される場合には、ＮＧＦ分
泌細胞を移植された動物の場合には９２％であったが、
コントロールの細胞を移植された動物の場合には４９％
しかなかった。コントロールグループの結果は、移植は
受けなかったが病巣を持つ動物における以前の観察に相
当するものであった(Gage et al., Neurosci. 8:2155
(1986); Williams et al., Proc. Natl. ACad. Sci. US
A 83:9231 (1986); Kromer, Science 235:214 (1987);
Gage et al., J. Comp. Neurol. 369:147 (1988))。
【０１１９】ＮＧＦグループにおけるＣｈＡＴ陽性細胞
のパーセンテージの著しい増加に加えて、ＡＣｈＥ陽性
ファイバーと細胞の染色も増加していることが示された
（図１５）。最も際だった発見はセプタムの背側に偏っ
た四分の一円における強力で急激な生長反応であり、移
植細胞を含む腔と隣接する部分が最も強く染まることで
ある（図１５）。
【０１２０】上記の結果はＣＮＳに移植された細胞によ
るトランス遺伝子発現の容易さをものがたるものであ
り、また遺伝学的に修飾された細胞の移植によってもた
らされた動物全体における表現型の矯正をはじめて示し
たものである。
【０１２１】［実験例III］ 「パーキンソン病に感染したラットのＣＮＳにＬ−ドー
パを発現するように遺伝的に修飾した繊維芽細胞の移
植」この実験例は、ドナー細胞を遺伝的に修飾し、細胞
をＣＮＳに移植する現在の発明された方法が、パーキン
ソン病のラットのモデルのように、動物のモデルでの病
気の症状を意味ありげに改善することが実証され、受け
入れられてきた。
【０１２２】この実験例で用いられた繊維芽細胞にＬ−
ドーパを生産する能力を与える方法は、チロシン水酸化
酵素（ＴＨ）に、カテコールアミン合成の反応速度を限
定する段階である、チロシンがＬ−ドーパに転化する作
用を触媒する能力があることに基づいている。ＴＨの補
因子であるテトラヒドロビオプテリン（tetrahydrobiop
terine（Ｈ4−Ｂ）は、ＴＨ酵素活性を必要とする。脳
はビオプテリンを高いレベルで保持しており、また繊維
芽細胞はビオプテリンをＨ2−ビオプテリンに減少させ
るので、ＴＨは脳内に位置する繊維芽細胞に対し働きか
けているようだ。
【０１２３】（レトロウイルスベクターｐＬＴｈＲＮＬ
の構築）ベクターｐＬＴｈＲＮＬは、モロニー白血病ウ
イルス由来レトロウイルスベクターだが、５’ＬＴＲ配
列由来のチロシン水酸化酵素（ＴＨ）のラットｃＤＮＡ
を発現するように構築され、細胞内のＲＳＶプロモータ
ーの位置から転写されるネオマイオシン−耐性遺伝子を
含んでいた。これら３種類のプラスミドからのフラグメ
ント，ｐＬＲｂＬ，ｐＴＨ５４，ｐＬＨＲＮＬは、ｐＬ
ＭＴＰＬから一緒に結合された。プラスミドｐＬＲｂＬ
は、（実験例IIに既に記述されたのと同様に）プラスミ
ドｐＬＭＴＰＬを制限酵素Ｈｉｎｄ IIIとＨｐａｌで
切断し、ＨＰＲＴ遺伝子を含むフラグメントを取り去る
ことによって得られた。残ったプラスミドＤＮＡは，プ
ラスミドｐＧＥＭ１−４．５ｋｂ（ｐＧＥＭ１−４は、
網膜芽腫遺伝子（Ｒｂ）をコードするＤＮＡを、ウィス
コンシン州マジソンのプロメガから入手したプラスミド
ｐＧＥＭ１に挿入することで構築され、カリフォルニア
州サンジエゴにあるカリフォルニア大学のリー博士から
提供を受けた。）をＨｉｎｄ IIIとＳｃａ２の制限酵
素で切断した後得られた３．５ｋｂのフラグメントと結
合された。結果的に得られたプラスミドはｐＬＲｂＬと
名付けられた。
【０１２４】ラットのＴＨ ｃＤＮＡを含む１６８８個
のｂｐフラグメントは、プラスミドｐＴＨ５４を制限酵
素ＢａｍIIIとＳｐｈ１で切断することで得られた(O'Ma
lley, J. Neurosci. Res. 60:3-10 (1986), suppied by
Dr. O'Malley, WashingtonUniversity, St. Louis, M
o) 。プラスミドｐＴＨ５４とプラスミドｐＬＲｂＬ由
来のフラグメントと、プラスミドｐＬ２ＲＮＬ（実験例
Ｉに書かれている）から得られたＣｌａｉ１とＳｍａ１
のフラグメントと結合ことで、チロシン水酸化酵素をコ
ードする遺伝子を運ぶウイルスを作るプロデューサー細
胞にトランスフェクションするためにレトロウイルスの
プロウイルスを含むベクターｐＬＴｈＲＮＬが得られ
た。ｐＬＴｈＲＮＬの由来と円形制限酵素マップは、図
１７に示してある。
【０１２５】実験例IIに示されているようにヘルパー−
フリーのレトロウイルスが作られ、レトロウイルスの感
染がなされた。上のＬＴｈＲＮＬプロウイルスを含むプ
ラスミドＤＮＡは、ここではリファランスで紹介する
が、Wigler et al., Cell 11:223-232 (1977)によって
書かれている様に、ワシントン州シアトルにあるフレッ
ド ハッチントン癌研究センターのミラーによって供給
されるアンフォトロピックなＰＡ３１７ヘルパー細胞株
にＣａＳＯ4トランスフェクションされた。トランスフ
ェクションして２日後、これらの細胞の培地は濾過さ
れ、エコトロピックψ２ヘルパー細胞株(Miller et a
l., Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902 (1986), supplied
by Dr. Miller)に感染させるのに用いられた。最も高い
レベルでＴＨ活性を含み、最も多くのウイルス量（５×
１０5／ｍｌ）を生産したＧ４１８−耐性ψ２クローン
（ψ２／ＴＨ）を選んだ。不死化したラットの繊維芽細
胞（２０８Ｆ）(Quade, Virology 98:461-465 (1979))
が、ψ２／ＴＨプロデューサー細胞によって作られたＬ
ＴｈＲＮＬウイルスの１０ー4以下の感染多重度（ＭＯ
Ｉ）で感染した．Ｇ４１８耐性クローンはさらなる研究
で確立された。全てのレトロウイルス感染は、４μｇ／
ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）存在下でなされた。細
胞は、ネオマイシン−耐性遺伝子の発現ためにＧ−４１
８が４００μｇ／ｍｌに増えることによって選び出し
た。
【０１２６】（チロシン水酸化酵素活性定量分析）１０
ｃｍのプレートにコンフルエントになった細胞を２回カ
ルシウム・マグネシウムフリーのダルベルコの燐酸緩衝
液（ＰＢＳ）で洗い、その後、プレートから剥す。細胞
を、氷冷し、酢酸でｐＨ８．４に調整した０．１５ｍｌ
の５０ｍＭトリス／５０ｍＭ ピロ燐酸ナトリウム／
０．２％ トリトン Ｘ−１００でホモジェネートし
た。その後、２−４℃で１５分関３２０００ｇで遠心分
離した。その上澄みをＴＨと蛋白測定の両方に用いた。
ＴＨ活性は、以前に記述された(Iuvone et al., J. Neu
rochem, 43:1359-1368 (1986))ように、14Ｃでラベルし
た２０μＭチロシン、１ｍＭ ６−メチル−５，６，
７，８−テトラヒドロプテリン（６ＭＰＨ4）（Ｃａｌ
ｂｉｏｃｈｅｍ，カリフォルニア州のラ・ジョラ）マグ
ンシウム燐酸緩衝液（ｐＨ６）を用いて、脱炭酸酵素共
役反応で測定した。蛋白は、標準的な方法だがウシ血清
アルブミンを用いてロウリー（Lowry）(J. Biol. Chem.
193:265(1951))の方法で決定した。
【０１２７】（カテコールアミンとその代謝産物の定量
分析）培養細胞は、（最終濃度が５０ｎＭになるよう
に）アスコルビン酸を凍らせる前の細胞ペレットに添加
することを除けば、チロシン水酸化酵素活性の定量分析
のようにプレートから剥した。細胞はＤＭＥに１０％の
ウシ胎児血清を加えた培地で培養した。培養にはプレー
トから剥す１６時間前から０．１ｍＭ ６ＭＰＨ4を付
加した。細胞は、２５０μｌの５ｎｇ／ｍｌの３，４−
ジヒドロオキシベンジルアミン（ＤＨＢＡ）を含む０．
１Ｎ ＨＣｌ／０．１％ メタ重亜硫酸ナトリウム／
０．２％ Ｎａ2ＥＤＴＡ中でホモジェネートした。ド
ーパミン、ドーパ，３，４−ヒドロキシフェニル酢酸
（ＤＯＰＡＣ）、ＤＨＢＡ，３−メトキシ−４−ヒソロ
キシフェニルグリコール（ＭＨＰＧ）は、アルミナ吸収
の上澄みから抽出され(Anton et al., J. Pharmacol. E
xp. Ther. 138:360-375 (1962))、１５０μｌの０．１
Ｎ Ｈ3ＰＯ4で溶出した。それらは、Iovone et al., B
rain Res. 418:314-324 (1987)に示されてるように、高
濃度の硫酸オクチルナトリウム（０．４５ｍＭ）と低い
ｐＨ（２．８）を含むように調整した移動相を使う、電
気化学的検出法であるＨＰＬＣによって解析した。ホモ
バニリック酸（ＨＶＡ）はＨＰＬＣによって解析され
た。培地中のカテコールアミンと代謝産物の濃度もま
た、別な方法であるＨＰＬＣ−ＥＣによって決定され
た。上述のアルミナ抽出液の手順は省略します。培地
は、０．１過塩素酸／０．０１Ｍ ＥＤＴＡに調整さ
れ、沈澱する物質を除去し、ＨＰＬＣ−ＥＣに直接用い
ることができるように１００００ｇで１０分間遠心分離
された。この系において、２つの相は、０．１３７％
ＳＤＳを含むｐＨ３．２の０．１Ｍ燐酸緩衝液（緩衝液
Ａ）と４０％エタノールを含むｐＨ３．３５の燐酸緩衝
液（緩衝液Ｂ）から成り立っている。サンプルの複合体
は、１２分間緩衝液Ａ１００％の状態で溶出した後、緩
衝液Ｂをリニアーな勾配で徐々に混合して、３０分かけ
て緩衝液Ｂが１００％の状態になるように溶出した。そ
のとき溶出液は、６０ｍＶの電圧をかけた１６対の電量
分析の電極の間を通過した。
【０１２８】（パーキンソン病のラットモデル）雌のス
プラーグ−ドーレイ（Sprague-Dawley）ラットの前脳束
中央（座標で言うところのＡＰ＝−４．４，ＭＬ＝１．
１，ＤＶ＝７．５の位置）に生理食塩水１２μｌに対し
２μｇのアスコルビック酸 ６−ヒドロキシドーパミン
（６−ＯＨＤＡ）を片側注射した。作られた障害の完成
は、１０〜２０日後転回行動を引き起こすアポモルフィ
ン（apomorphine）の注射（０．１ｍｇ／ｋｇ、皮下注
射）またはアンフェタミン（ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ）
の注射（５ｍｇ／ｋｇ、皮下注射）で評価した(Ungerst
edt and Arbuthnott, Brain Res. 24:485-493 (197
0))。移植の前に、どの動物も少なくとも１日２回はア
ポモルフィンかアンフェタミンの判断基準である転回行
動が確立していることを試験された。１分間に７回以上
転回するようになった動物は(Schmidt et al., J. Neur
ochem. 38:737-748 (1982))、研究に用いられた（アポ
モルフィンを投与した後逆側に１分間当り少なくとも７
回転回するものと、アンフェタミンを投与した後障害と
は同じ側に１分間当り少なくとも７回転回するもの。ア
ポモルフィンは１９回、アンフェタミンは１４回試験し
た。）。基準から後移植に平均転回数の変化は、４種類
の動物グループで比較された。
【０１２９】（繊維芽細胞の移植）１０ｃｍのプレート
にコンフルエントになったＴＨ感染した繊維芽細胞と感
染していないものを０．０５％ トリプシンを含むＰＢ
Ｓでトリプシン処理した後、トリプシンの活性を抑えた
まま１ｍｇ／ｍｌ グルコース、０．１ｍｇ／ｍｌＭｇ
Ｃｌ2，０．１ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ2、そして５％ ラ
ット血清を含むＰＢＳでピペッティングした。細胞を２
回ＰＢＳ中で１０００ｇで遠心分離することで洗い、１
μｌ中に８００００個の密度になるようにＰＢＳ中に懸
濁した。移植位置は転回非対称から回復する決定的だと
思われるところだから(Herrera etal., Brain Res. 29
7:53-61 (1984); Dunnett et al., Scand. Suppl. 522:
29-37 (1983))、懸濁した細胞を神経をまひさせた脳内
の最前部のくちばし状部位（座標で言うところのＡＰ＝
１．４、ＭＬ＝２．０、ＤＶ＝３．５−５．５からＡＰ
＝２．５、ＭＬ＝１．５，ＤＶ＝３．５／４．５の位
置）と後部に尾状部位（ＡＰ＝０．４、ＭＬ＝１．５、
ＤＶ＝３．５／４．５）の２、３箇所各々離れた位置に
定位に注射した。どの位置にも１〜２ｍｍの範囲に２回
に分けて、トータルで４μｌ注射した。コントロールに
あたる障害を受けた動物には感染していない繊維芽細胞
を注射した。
【０１３０】（移植後の行動テスト）移植したラットは
移植後１〜２週間後転回非対称性を試験した。
【０１３１】（組織学的手法）最終的な行動試験の後、
ラットは麻酔をし、１０％ホルマリンを噴霧した。脳は
一夜かけて固定し、４８時間３０％サッカロース中に置
き、フリージングミクロトームで切片（４０μｍ）にし
た。それぞれの切片は、クレゾールバイオレット（cres
yl violet）、フィブロネクチン（fibronectin）（Ｆ
Ｂ）、ＴＨをポリクローナルアンチチロシン水酸化酵素
抗体（Eugenetech、ＮＪ）で染色した。手短に解説する
と、切片は０．２５％ トリトン−Ｘを含むトリス緩衝
液（ＴＢＳ）（ｐＨ７．４）でリンスした。切片は２４
時間４℃で０．２５％ トリトン−Ｘと３％ヤギ血清を
含むＴＢＳに６００分の一に希釈したウサギのチロシン
水酸化酵素のポリクローナル抗体か、同じくＴＢＳに２
０００分の一に希釈したポリクローナルアンチフィブロ
ネクチンとインキュベートした。リンス後、切片は、１
時間、０．２５％トリトン−Ｘと１％ヤギ血清を含む
０．１Ｍ ＴＢＳに２００倍に希釈したビオチニレート
されたヤギのアンチウサギＩｇＧ（ベクタスタイン（Ve
ctastain）とインキュベートした。その後、０．２５％
トリトン−Ｘと１％ヤギ血清を含む０．１Ｍ ＴＢＳで
何回かリンスした。切片は、それから、０．２５％トリ
トン−Ｘと１％ヤギ血清を含む０．１Ｍ ＴＢＳで１０
０倍に希釈されたアビジン（avidin）とビオチレートさ
れたセイヨウワサビペルオキシダーゼ（peroxidase）
（カリフォルニア州バーリンガムにあるベクター研究所
のＡＢＣキットのベクタスタイン）の複合体と１時間室
温でインキュベートし、その後リンスした。ペルオキシ
ダーゼは、０．０５％ ３，３−ジアミノベンジンテト
ラヒドロキシクロライド（ＤＡＢ）（ミズーリ州セント
ルイスにあるＳｉｇｍａ化学より入手）、０．０５％
ＮｉＣｌ2、０．０１％ Ｈ2Ｏ2を含むＴＢＳ中で室温
で１５分反応させることによって目に見えるようにな
る。据え付けられた切片は、繊維芽細胞の積極的な移植
の大きさと位置を評価された。
【０１３２】（高レベルにＴＨを発現する繊維芽細胞ク
ローンの確立）不滅化したラットの繊維芽細胞（２０８
Ｆ）は、ψ２／ＴＨプロデューサー細胞によって作られ
たＬＴｈＲＮＬウイルスによって感染を受け、１２個の
Ｇ４１８耐性クローンが確立した。表１は、これら１２
個のＧ４１８耐性クローンのうちで最も高い活性を持つ
３種類のＴＨ活性と、ψ２プロデューサー細胞株のＴＨ
活性を示している。
【０１３３】
【表１】 最も高い活性を持つクローン（クローン ２０８Ｆ／Ｔ
Ｈ−８と２０８Ｆ／ＴＨ−１１）のＴＨ活性は、ラット
の線条体のＴＨ活性のおよそ４分の１である。最も高い
活性を有するクローン ２０８Ｆ／ＴＨ−８は、今後の
研究に用いるために選択された。
【０１３４】（ＴＨを発現する繊維芽細胞はＬ−ドーパ
を生産し、分泌する。）ＴＨを発現する繊維芽細胞２０
８Ｆ／ＴＨ−８とコントロールの２０８Ｆの細胞抽出液
は、Ｌ−ドーパの定量に用いられた（表２）。６ＭＰＨ
4を添加した培地中で培養した２０８Ｆ／ＴＨ−８細胞
のみがＬ−ドーパを生産した。コントロールの細胞はＬ
−ドーパを検出できるほど生産しなかった。ドーパミン
とその代謝産物であるＤＯＰＡＣとＨＶＡは、２０８Ｆ
／ＴＨ−８細胞と２０８Ｆコントロール細胞のどちらで
も検出できなかった。
【０１３５】
【表２】 表２で示されるように、Ｌ−ドーパは、２０８Ｆ／ＴＨ
−８細胞の培地中でも、コントロール２０８Ｆ培地中で
６３ｎｇ／ｈ／１０6ｃｅｌｌｓ、ＴＨ感染した培地中
で２３９ｎｇ／ｈ／１０6ｃｅｌｌｓ検出された。２０
８Ｆ／ＴＨ−８またはコントロールの繊維芽細胞に含ま
れるか放出されたＬ−ドーパ代謝産物は検出できないレ
ベルではなかった。
【０１３６】（移植の組織学的試験）移植した繊維芽細
胞は、神経まひした尾状内の多くの位置の実質組織中で
生き延びた。フィブロネクチンの積極的な移植で生き残
るために、おおむね位置にかかわらず移植片が適当な大
きさであることが必要らしい（図１８（ａ）と
（ｂ））。シリンジ管でのフィブロネクチン染色という
限定された条件に基づいても、生き延びることができな
かったのは、３１の移植例のうちわずか４例だけだった
（図１８（ｃ）と（ｄ））。移植片が生き延びることが
できなかったラットの行動のデータは、統計処理から除
外された。繊維芽細胞のＴＨ免疫活性は、インビトロで
もインビボでも観察されなかった。
【０１３７】（転回非対称性に対する移植効果）薬物誘
導による個々の動物の転回数を、移植前と移植後２週間
の時点で比較した。アポモルフィンで試験したラットと
アンフェタミンで試験したラットの間に相違はみられな
いので、それぞれの転回数を同じように扱うことにし
た。
【０１３８】転回非対称性の改善は、移植位置に依存し
ていた。尾状器官の尾状部位に繊維芽細胞移植片を持つ
ラット（図１９最上部）（ＡＰ＝０〜０．４）には、転
回行動にあまり変化が無かった。くちばし状部位の実質
組織にＴＨ感染し、生き延びている繊維芽細胞を持つラ
ット（ＡＰ＝１．４〜２．２）は、移植後２週間で平均
３３％薬物誘導による転回が減少した（図１９最下
部）。
【０１３９】これらの結果から、ＴＨ遺伝子をコードす
るラットｃＤＮＡは、繊維芽細胞に安定的に形質転換さ
れるとき、機能のあるＴＨ酵素活性を示したことがわか
る。ＴＨ遺伝子を発現する繊維芽細胞は、インビトロで
Ｌ−ドーパを生産し、分泌することができる。これらの
ドーパ生産性繊維芽細胞がくちばし状部位に移植された
とき、パーキンソン病のラットモデルの転回非対称性を
かなり減少させた。コントロールの繊維芽細胞はインビ
トロでＬ−ドーパを余り生産せず、これらのラットの転
回非対称性を減少させないことから、これらのドーパ生
産性細胞がラットの転回非対称性を減少させる能力は、
単に細胞内のＴＨ遺伝子の存在に依存しなければならな
い。これらのデータは、少なくとも２週間の転回行動の
効果を示している。
【０１４０】ドーパ生産性繊維芽細胞の転回行動に対す
る効果は、くちばし状部位の位置に依存している。胎児
の神経をラットに移植する以前の研究データは、移植が
くちばし状部位に行われたとき、転回非対称性が最も効
率的に減少することを示している(Dunnett, 同上)。実
験に用いられた繊維芽細胞は軸索を伸ばすことができな
いので、移植の位置は適切な移植位置決定にかなり依存
する。
【０１４１】ドーパ生産性繊維芽細胞が転回非対称性を
減少させる正確なメカニズムは、決定されている。たぶ
ん、ひとたびドーパが分泌されると、全身神経麻酔した
動物体内でさえ、尾状部位のドーパ脱炭酸酵素活性が充
分なまま残される(Lloyd etal., Science 170: 1212-12
13 (1970); Hornykiewicz, British Med. J. 29:172-17
8 (1973))。その結果、Ｌ−ドーパが薬物誘導された転
回行動を修整するドーパミンに変換される。これらのド
ーパ生産性細胞の活動に対するこの仮定のメカニズム
は、パーキンソン病に対するＬ−ドーパの治療系の非常
に確定した効果に一致するだろう(Calne, N. Eng. J. M
ed. 310: 523-524 (1984))。これらのドーパ生産性繊維
芽細胞は実質的にはＬ−ドーパの局所的に小さなポンプ
の役割を担う。
【０１４２】この実験例で示されているように、細胞を
Ｌ−ドーパを生産するように修飾する能力は、パーキン
ソン病の移植治療にとって理想的な細胞を探す研究に発
展している。ＴＨ遺伝子を発現するように修飾され、腫
瘍に変化したり、他の疾病を引き起こすことなしに脳内
に長く生き残ることができる細胞ならどんな細胞でも、
用いられる可能性がある。これらの特殊に不死化したラ
ットの繊維芽細胞は３カ月経っても腫瘍に変化すること
はなく、プライマリー繊維芽細胞やプライマリーグリア
細胞のようなプライマリー細胞は、腫瘍化の傾向が理論
的にも低く、ある実例では移植に好ましいとされてい
る。付け加えると、自家組織移植のために患者自身のプ
ライマリー細胞を利用して、移植による拒絶反応を減少
させることができるだろう。しかし、この実験例で用い
られた２０８Ｆ細胞のような不死化した細胞の利用は、
たやすく利用されている、よく特性を知られている細胞
をたくさん用意することが有利であることを示してい
る。
【０１４３】これらの結果は、繊維芽細胞が通常神経に
よって与えられるような機能を与えることができるよう
に遺伝学的に修飾されうること、それ故神経移植のため
に胎児の組織を利用する必要が無いことを示している。
移植という物理的な治療法と遺伝子導入を組み合わせる
ことが、ＣＮＳ機能不全の処置に力強い方法となる。現
在発明された方法は動物やヒトの脳内疾患の他のモデル
の処置にも用いられるかも知れない。
【０１４４】［実験例ＩＶ］ 「培養した自己のプライマリーの皮膚繊維芽細胞の移
植」前述のとおり、大脳内への移植の際の拒絶を最小限
にし、プライマリーの繊維芽細胞などの自己の細胞を用
いて腫瘍の形成を防ぐことは、確実な環境においては望
ましいことである。この実験例において、プライマリー
の繊維芽細胞は、細胞のインビトロおよびインビボにお
ける成長の評価、および移植細胞のドナー線条体への定
着の評価によって、大脳内移植に対するこの細胞集団の
評価をおこなった。
【０１４５】これらの実験において、培地内でのプライ
マリーの皮膚繊維芽細胞の成長速度が測定された。成長
と培地内での細胞の特徴が、それらについての以下の移
植を予言できるかどうかを決めるために，この成長型
は、インビトロにおいて固定したラット−１繊維芽細胞
のものと比較した。移植前に培地で細胞が受け得る継代
接種の数や移植細胞の密度を含む、プライマリーの繊維
芽細胞の生存に影響すると思われる変数もまた試験され
た。培養細胞への新たな遺伝物質の導入には、変更を受
けた個体群の選択と拡張に対するいくつかの経路が要求
されるため、前者の評価が重要となる。移植細胞の密度
は、最適な移植サイズの決定に際し変更された。移植片
の形態学的および神経化学的特徴付けもまた行われ、自
己繊維芽細胞移植片とホスト線条体間の細胞相互作用が
示された。
【０１４６】皮膚バイオプシー（biopsies）は、２３匹
のメスのスプレージ−ドウレイ（Sprague-Dawley）ラッ
ト（２００−２５０ｇ）の腹部の壁（ventral abdomina
l wall）から採取した。各バイオプシーからの純粋な繊
維芽細胞は通常の条件下で維持し、１０％ウシ胎児血清
を含んだＤＭＥＭを週に３度与えた。集合体に成長した
繊維芽細胞を１：２に分割した。プライマリーの皮膚繊
維芽細胞の成長速度はコールターカウンター（Coulter
Counter：Coulter Electronics Inc）を用いて決定し
た。これらの細胞の３部分からなる試料を毎日測定し、
同条件下で成長させ採取した固定したラット−１繊維芽
細胞のものと比較した。
【０１４７】大脳内移植にとって、各動物からのプライ
マリーの皮膚繊維芽細胞は１回あるいは４回の継代接種
を行った（継代接種１代から４代の間におよそ５回の細
胞分裂が起こった）。これらの細胞は集合体に成長し休
止状態において採取された。培養した繊維芽細胞は１ｍ
ｇ／ｋｇのＭｇＣｌ2およびＣａＣｌ2と０．１％のグル
コースを加えた移植用リン酸緩衝食塩水に懸濁した。懸
濁液の密度は、１０4から１０5個の細胞／μｌの範囲で
あった。その動物にケタミン−キシラジン（ketamine-x
ylazine：１０ｍｇ／ｋｇのケタミン、パルケ−デイビ
ス、アンアーバー、ＭＩ（Ketarar, Parke-Davis, Ann
Arbor, MI）；５ｍｇ／ｋｇのランパン、ヘキスト、フ
ランクフルト、ジャーマニー（Rumpun, Hoechst, Frank
furt, Germany）；及び６ｍｇ／ｋｇのアセプロマジン
マレート（acepromazine maleate,TechAmerica）を血管
内注入して麻酔がかけられ、フレームの定位置に置かれ
た。それぞれの動物には、それ自身の皮膚のバイオプシ
ー（biopsies）から得られた培養された皮膚の繊維芽細
胞の移植片が移植された。４個の細胞懸濁液（３μｌ／
部位）の全てが、ハミルトンシリンジ（Hamilton syrin
ge）に入っていて、２個の吻側と２個の尾側で線条体の
定位に注入された。移植の後、３週間から８週間、その
動物は生存した。
【０１４８】大脳内のプライマリー皮膚の生きている繊
維芽細胞移植片を感染するパラメーターを評価するため
に、２種の実験が細胞の継代接種（ｎ＝１２）及び細胞
の密度（ｎ＝９）の結果を示すことができるように計画
された。第１番目の実験では、３匹のラットのグループ
に、１代から４代の継代接種が行われた自己のプライマ
リー皮膚の繊維芽細胞（１０5個の細胞／μｌ）が注入
された。；これらの動物は手術を施された後、３週間か
ら８週間で殺されて潅流された。第２番目の実験では３
匹の動物のグループに、１０4、２．５×１０4、５．０
×１０4、あるいは１０5個の細胞／μｌの懸濁液が注入
された。；継代接種（４代）の回数及び生存期間（８週
間）は一定であった。
【０１４９】（組織の準備と組織学）光学顕微鏡を用い
るために、動物に対し４％パラホルムアルデヒドを含ん
だリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を心臓を通して潅流させ
た。脳を取り出し、一晩固定し、３０％スクロースの中
に３日放置した。線条体の通った頭頂部分は凍らせたミ
クロトームの上で４０μｍの厚さに切り出し凍結防止剤
の中へ集めた。一続きの切断片はクレジルバイオレット
により着色した。残りの切断片はフィブロネクチン、膠
繊維酸性蛋白（ＧＦＡＰ）、および小膠細胞および／ま
たはマクロファージの免疫組織化学的検出のため３つの
組に分けられた。この切断片は内生ペルオキシダーゼ活
性を食い止めるため、初めに０．６％過酸化水素を含む
トリス緩衝液（ｐＨ７．４）中で３０分間処理した。切
断片は緩衝液で洗浄し、ウサギの抗−ヒト繊維芽細胞免
疫グロブリン（ＩｇＧ）（１：２０００に希釈）または
ウサギの抗−ヒトＧＦＡＰＩｇＧ（１：１０００に希
釈）中で、３％標準ヤギ血清および０．２５％トリトン
−Ｘとともにトリス緩衝液中において室温で一晩培養し
た。つぎにこれらを緩衝液ですすぎ、ビオチン化された
ヤギの抗−ウサギＩｇＧ（１：２５０に希釈）中で１時
間培養した。さらに洗浄後、それらをアビジン−ビオチ
ン複合体（Vector Laboratories）中で１時間培養し、
洗浄した。これらを０．０２５％ジアミノベンジジン
（ＤＡＢ）テトラヒドロクロリド、０．５％ニッケルク
ロリドおよび０．０３％過酸化水素とともにトリス緩衝
液中で５分間処理した。
【０１５０】反応性小膠細胞および／またはマクロファ
ージの免疫組織化学的局在化はマウス モノクローナル
抗体 ＭＲＣ ＯＸ−４２（Serotec）を用いて行われ
た。切断片は緩衝液で洗浄しＭＲＣ ＯＸ−４２（１０
μｌ／ｍｌの濃度で）、３％標準ウマ血清および０．２
５％トリトン−Ｘとともにトリス緩衝液中で室温で一晩
培養した。これらを洗浄してビオチン化したウマ抗−マ
ウスＩｇＧ（１：１６０に希釈）中で１時間培養した。
切断片を洗浄しアビジン−ビオチン複合体中で培養し、
再び洗浄しＤＡＢ溶液中で反応させた（前述のよう
に）。免疫ペルオキシダーゼ反応の後すべての切断片を
トリス緩衝液で、続いてリン酸緩衝液で洗浄した。これ
らはクロームアルム−ゼラチン（chrome alum-gelati
n）を塗ったスライドに載せ、エタノールで脱水した後
カバーグラスを装着した。
【０１５１】電子顕微鏡をもちいるために、動物（ｎ＝
２、細胞密度研究から得られた）に対し、４％パラホル
ムアルデヒドおよび０．１％グルタルアルデヒドを含ん
だトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を心臓を通して潅流させ
た。脳を取り出して３時間固定した後、線条体の通った
頭頂部分をオックスフォードビブラトーメ（Oxford vib
ratome）上で５０μｍの厚さに切り出しトリス緩衝液中
に集めた。切断片はフィブロネクチン（fibronectin）
により免疫組織化学的に着色かまたは緩衝剤で処理した
１％オスミウムテトラオキシド中で１時間固定した。後
者の切断片をすすぎメタノールにより脱水し、プロピレ
ンオキシド中で明確化し、ポリ／ベッド（Poly/Bed）お
よびアラルダイト（Araldite）の混合液中に固定した。
移植片を評価するために、やや薄い切断片（１−２μ
ｍ）を集めて１％トルイジンブルーで着色した。ごく薄
い切断片はＲｅｉｃｈｅｒｔ Ｏｍ Ｕ３超ミクロトー
ム上で切断し、銅のグリッド上に集めて酢酸ウラニルお
よびクエン酸鉛で着色した。切断片はＪＥＯＬ １００
ＣＸＩＩ透過型電子顕微鏡で観察した。
【０１５２】（移植片の分析）フィブロネクチンは、通
常ラットの脳においては検出されないため、繊維芽細胞
移植片はフィブロネクチンで免疫組織化学的に着色され
た領域によって規定される。免疫反応性を示す切断片
は、Ｃｕｅ−２画像分析システム（Olympus Corp）を用
いて解析した。免疫着色はマニュアルに沿って追跡し
（倍率（mag.）＝４Ｘ）、移植片の領域は与えられた系
列の中で各切断片について計算された。移植片の体積
（ｍｍ3）はウィリンジ（Uylings）らによってこの系列
から計算され(J.Neurosci.Meth.18:18-37(1986))この参
考文献中に記述されている。尚この文献は参照としてこ
こに組み入れられる。切断片は、電子顕微鏡で観察した
試料と同様にクレジルバイオレット，ＧＦＡＰおよびＭ
ＲＣ ＯＸ−４２で着色し、定量的に評価された。
【０１５３】（ラット−１繊維芽細胞およびプライマリ
ーの繊維芽細胞に対する成長曲線）接触阻害を受けたと
推定される固定された繊維芽細胞であるラット−１細胞
の成長速度は、同様の条件下で培養されたプライマリー
の繊維芽細胞のものと比較した。初めの１週間はいずれ
の細胞型の成長曲線も同様であったが、１０日後には劇
的に異なる成長様式が観察された（図２０）。ラット−
１細胞は一旦コンフルエントに到達した後も成長し続け
たため、接触阻害されていないように思われた。一方、
プライマリーの皮膚繊維芽細胞の成長は、細胞が一旦コ
ンフルエントに到達した後は安定した。これらの成長の
持続（ラット−１繊維芽細胞）対静止（プライマリーの
皮膚繊維芽細胞）という様式は３週間継続した。
【０１５４】（細胞の継代接種）線条体におけるプライ
マリーの繊維芽細胞の大きさに影響を与えると思われる
パラメーターは、移植に先立って行われたインビトロで
の継代接種の数である。この研究では、移植片の細胞の
密度は一定で１μｌあたり１０5個である。繊維芽細胞
の懸濁液を注入された６匹の動物は、培地において１度
の継代接種そ受け、繊維芽細胞の注入を受けた他の６匹
の動物は４度の継代接種そ受けた。各グループからの３
匹の動物は殺され、移植を受けた後３ないし８週間潅流
した。２−ファクターＡＮＯＶＡは継代接種１回および
４回の移植片の体積の違いを評価するために移植後３な
いし８週間に渡って使用した（図２１）。フィブロネク
チン免疫着色により決定した移植片の体積は、移植に先
立って行われた培地上での継代接種の回数の関数として
異ならなかった（１対４）。脳へ移植した培養自己繊維
芽細胞は、腫瘍を形成したり衰退および死滅することは
ないことも明かであった。実際、移植片の大きさはイン
ビボで３週間および８週間生存したものでは明らかに違
いは見られなかった。
【０１５５】（細胞の密度）測定された、移植片の大き
さのもう一つのパラメーターは、線条体に移植した細胞
の密度である。４つの密度（１μｌあたり１０4、２．
５×１０4、５．０×１０4または１０5個）が評価さ
れ、移植片の体積はフィブロネクチンを用いて免疫組織
化学的に決定された。大脳内への移植のための繊維芽細
胞は培地での４回の継代接種の後に採取され、動物は移
植から８週間後に殺した．２−ファクターＡＮＯＶＡを
用いて、４つのグループの間で移植片の体積の明かな違
いが観察された；高い細胞密度の懸濁移植片のほうが低
い細胞密度のものより大きい移植片を産生した（図２
２）。これより、移植片の体積と移植細胞の密度との関
係は明らかである。
【０１５６】（組織学）構造的に関連した糖蛋白の仲間
であるフィブロネクチンによる免疫着色は、大脳内移植
の大きさと範囲を示した。３週間目に線条体の神経網
（neuropil）への幾分わずかの拡張をしめし、他方８週
間後では移植片はより縮小し突起が少なくなった様子で
あった（図２３）。しかしながらフィブロネクチンによ
る免疫着色は、移植片の内部や近くの個々の繊維芽細胞
や他の細胞成分を分離することができなかった。クレジ
ルバイオレットによる着色では、繊維芽細胞に特徴的な
長い核が移植片において観察された（図２４（ａ）、
（ｂ））。移植片を通っている血管も見られ、残骸が含
まれている（debris-filled）細胞が中心部に優先的に
存在していた。ＧＦＡＰにより免疫組織化学的に着色さ
れた星状細胞は、３週間目では移植片を囲むホスト線条
体中で顕著であったが、移植片内の免疫着色は希薄であ
った。ＧＦＡＰ−免疫反応作用は、８週間目の移植片の
内部および周囲の両方で観察された（図２４（ｃ）、
（ｄ））。ＭＲＣ ＯＸ−４２免疫反応性によって視覚
化した反応性の小膠細胞および／またはマクロファージ
は、３週目では移植片を取り囲んでいたが、８週目では
勢力が衰え、より変異していた（図２４（ｅ）、
（ｆ））。
【０１５７】（原形質超微細構造）移植後８週目におけ
るプライマリーの繊維芽細胞自己移植片の構造組織化は
電子顕微鏡レベルで調査された。移植片の最も顕著な特
徴は、多量の繊維芽細胞およびコラーゲンの存在であ
る。繊維芽細胞はしばしば凝集している楕円の核をもっ
ていた；核小体はめったに観測されなかった（図２５
（ａ）、（ｂ））。これらの細胞の細胞質は内部原形質
の粗い網状組織、長く延びたミトコンドリア、および分
泌性小胞をふくんでいた。少量のゴルジ体は明らかであ
った。移植片の至るところで見られた細長い繊維芽細胞
の突起は、内部原形質の粗い網状組織と分泌性小胞をも
また含んでいた（図２５（ｃ））。繊維芽細胞体とその
突起をコラーゲンがびっしりと取り囲んでいた。繊維芽
細胞とコラーゲンのいずれもが、線条体神経網において
は観察されなかった。移植片の細胞外基質中において、
コラーゲンの束の間を通って、肥大した星状細胞が拡張
するのが観察された；星状細胞の細胞体は繊維芽細胞移
植組織の中には見られなかった（図２６（ａ））。移植
片の食細胞の形態学は変わりやすい；サイトプラズマは
わずかな細胞小器官をもち、大抵は電子の詰まった小片
で満たされている（図２６（ｂ））。これらの細胞の核
は不規則で、染色質はしばしば核の包膜に凝集してい
る。移植して８週間後、移植片の周辺および内部にわず
かのリンパ球もまた観測された。
【０１５８】プライマリーの繊維芽細胞の他の著しい特
徴は、連続型毛細管の存在であった；管くうの内皮の内
面は連続しており、穿孔（fenestrations）は明確では
なかった（図２７（ａ））。これらの管を囲んでいる基
底層が存在していた。管腔を取り囲んでいる内皮細胞
は、核膜内で凝縮した染色質をもつ核をもっていた。内
皮細胞の管状および非管状双方の原形質膜における多く
の小嚢の陥入は明らかで、細胞質中の小嚢もどうように
明確だった（図２７（ｂ））。細胞間接合は内皮細胞間
の極近接した部位で観察された（図２７（ｃ））。コラ
ーゲンおよび／または反応性星状細胞は、移植片の毛細
管と近く結合していた。毛細管に近接したこれらの反応
生星状細胞の性質は、単繊維で満たされ正常な大脳の管
を包むこれらの無髄神経の末端球（endfeet）の星状細
胞とは似ていなかった（図２７（ｄ））。ある毛細管は
また、管を完全に囲むいくつかの反応性の星状細胞の突
起をもっていた；内皮と星状細胞の間の空間には通常コ
ラーゲンが存在し、その大きさは変化した。
【０１５９】プライマリーの繊維芽細胞は、一度それら
同士が接触してコンフルエントに達すると増殖を停止し
た。このことはインビトロでの接触阻害を示している。
ここに示したように線条体への移植後、プライマリーの
皮膚繊維芽細胞の移植片の体積は３ないし８週間のあい
だ一定であった；これより腫瘍形成や死滅といった傾向
はインビボでのプライマリーの皮膚繊維芽細胞では特徴
的ではなかった。たとえば接触阻害といった培地におけ
るプライマリーの繊維芽細胞の特徴は、ＣＮＳへ移植後
の移植片の成長および生存に反映されているであろう。
この研究論文からのデータはまた、細胞懸濁液の密度が
プライマリーの皮膚繊維芽細胞の移植片の大きさを決定
するもう一つの因子であることを示している：高密度の
細胞懸濁液は低密度のものより大きな移植片を産生す
る。移植に先立って行われた培地での細胞継代接種の数
と移植後の期間は移植片の大きさに影響する因子とは思
われない。
【０１６０】プライマリーの皮膚繊維芽細胞を移植に用
いるもう一つの利点は、自己細胞の免疫拒絶反応の可能
性を低減できることである。同種移植片に対する免疫学
的応答は、特に２０８Ｆ繊維芽細胞において、移植後の
細胞を死滅させる一つの要因であろう。この実験例で
は、皮膚バイオプシーからの繊維芽細胞は培養条件下で
育てられドナーの線条体へ移植された。この実験例では
皮膚バイオプシーからの繊維芽細胞は培養条件下で育て
られドナー線条体に移植された。繊維芽細胞を線条体に
定位に設置した後、血液−脳関門が破壊されリンパ球を
含んだいくつかの細胞個体群が傷ついた部位から侵入す
る。移植片の近くにリンパ球が存在するにもかかわらず
これらの自己細胞に対する免疫反応は最小限であるよう
に見えた。それゆえ、プライマリーの繊維芽細胞の組織
適合性はまたインビボでの移植片の生存を促進するであ
ろう。
【０１６１】この実験例は成長したラットＣＮＳプライ
マリーの皮膚繊維芽細胞の生存の維持の直接の証拠を提
供する。原形質超微細構造の分析はこれらの移植片が他
の細胞個体群（たとえば食細胞やリンパ球など）に加え
て、はじめは繊維芽細胞とコラーゲンから構成されてい
ることを示している。線条細胞に移植して８週間後の繊
維芽細胞の形態学的特徴は、皮膚において通常見られる
ものと同じであり、凝集した染色質をもつ楕円の核、延
びたミトコンドリアおよび２、３のゴルジ体をもつ。サ
イトプラズマと繊維芽細胞の突起との内部における、内
部原形質の網状組織や分泌性小嚢の存在は、活発なプロ
テインの産生を強く示唆している。さらに、おびただし
いフィブロネクチンによる免疫着色とコラーゲンの存在
は、移植片において繊維芽細胞が２つの異なる細胞産生
物を合成していることの証拠を提供している。コラーゲ
ンが産生されているにもかかわらず、移植後３ないし８
週間にわたりほぼ同じ大きさを保ち続ける。この観察結
果に対する１つのもっともらしい説明は、培養繊維芽細
胞はコラーゲン分解酵素（コラーゲナーゼ）を産生する
ことが知られており(Millis et al.,Exp.Geront. 24:55
9-575(1989))それゆえ移植片中において繊維芽細胞がコ
ラーゲンの産生および抑制のレベルを調節しているかも
知れない。光学および電子顕微鏡の観察結果からラット
の線条体へ移植したプライマリーの繊維芽細胞はその形
態学的特徴を維持し、コラーゲンとフィブロネクチンと
を産生、分泌し、８週間まで生き延びることが結論され
た。生存細胞の総数あるいは生き残った細胞の比率は決
定されなかったが、移植後８週間では移植片において高
い比率で細胞が生存している見込みは少ない。繊維芽細
胞成長因子（ＦＧＦ）などの栄養物質はラットＣＮＳ中
へ移植したプライマリーの皮膚繊維芽細胞の生存率を増
加させるであろう。
【０１６２】（ホスト−移植片相互作用）培養した自己
の繊維芽細胞の移植の重要な問題は、これらの移植片が
ホストの神経系に結合するかどうかである。ラットの線
条体に培養したプライマリーの皮膚繊維芽細胞を移植し
た後、ホストと移植片との動的相互作用による３つの顕
著な細胞の事象が観察された。これらは一時的な出来事
で、以下のように起こった；１）活性化、および移植片
への小膠細胞および／あるいはマクロファージの移動；
２）新血管新生；３）星状細胞突起の肥大および移植片
への侵入。血液−脳関門の傷への浸み込みにおけるＣＮ
Ｓへの初期応答の以前の調査のデータに基づいて、ここ
に記述したモデル系はここに組み入れられる。単核食細
胞はＣＮＳの中で傷に対して最初に応答した細胞である
ことが示されている(Imamoto and Leblond,J.Comp.Neur
ol.174:225-280(1977))。マクロファージ、小膠細胞お
よび顆粒性白血球は、ヒトおよびマウスの補体型３(Rob
inson et al.,Immunol.57:239-247(1986))のラット相同
物を認識するＭＲＣ ＯＸ−４２を用いて免疫組織化学
的に示されるであろう。ここに示した結果は、ここに示
した結果は、ＯＸ−４２免疫応答性を保持した細胞は、
３ないし８週間後に移植片の周辺に存在していることを
示している。８週間目の組織の電子顕微鏡による調査
は、移植片と無傷の神経網との間の境界領域での食細胞
の存在を確実にし、またこれらの細胞はＯＸ−４２によ
り免疫組織化学的に着色されているだろう。食細胞はま
た、移植細胞中至るところに存在するが、移植片自身の
内部ではＯＸ−４２免疫反応性は明らかではなかった。
それゆえ非免疫反応性食細胞は他の細胞個体群あるいは
マクロファージ、小膠細胞および補体の欠如した顆粒性
白血球を構成する。細胞は傷ついた部位に移動し、移植
片に侵入する。
【０１６３】移植後の繊維芽細胞の運命を決定する重要
なホスト−移植片細胞相互作用は、移植片の中への脈管
系の構築である。移植片の中への脈管系の構築歯、ある
部分、繊維芽細胞成長因子のような血管生成物質に依存
している。移植された皮膚繊維芽細胞による繊維芽細胞
成長因子の産生および放出は血管生成を促進する。移植
片における新血管新生は、インターロイキン−１を産生
および放出する反応性の小膠細胞およびマクロファージ
によっても促進される。
【０１６４】ＣＮＳへの管組織の移植は、新たな毛細管
の生成について周囲のホスト組織に完全に依存する。皮
膚繊維芽細胞移植片の内部の毛細管は、一続きの管くう
を形成しまた細胞が並列に位置した部位の細胞間接合
（必ずしも強い接合でない）を保持した窓のない内皮細
胞からなりたっている；これらの管は結合および神経組
織の双方で見つかる管を暗示している；しかしいくつか
の特徴により移植片の毛細管は近接した線条体のそれと
区別される。第一に、移植片内の内皮細胞は多くの細胞
内小嚢と原形質膜への小嚢の陥入があり、他方神経毛細
管では管くうおよび反管くう側でわずかの小嚢の陥入が
認められた。第二に、移植片の管と会合した反応性星状
細胞は、神経毛細管を取り囲んでいる無髄神経の末端球
の星状細胞とは似ておらず、ここで前者の様子は線条で
覆われ肥大していつも移植片の毛細管を包んでいるわけ
ではない。第三に、内皮と、移植片の毛細管の反応性星
状細胞の側面との間の管の近くの空間は変わりやすく、
しばしば介在要素（コラーゲンをふくむ）が存在してい
る。神経管は基底層を含むせまい管に近接した空間をも
つ。
【０１６５】線条神経網とプライマリーの繊維芽細胞の
間で観察された３つ目の相互作用は自家移植片への星状
細胞の応答性であった。大脳内移植はふつう、反応性星
状細胞の突起の移動および／あるいは膠の境界膜（limi
tans）の生成を含む膠反応を引き起こす。これらの研究
は、ＧＦＡＰ−免疫反応性星状細胞ペルカルヤ（perkar
aya）は、３および８週間の移植片の周囲に多く存在
し、免疫反応性突起は８週間目の移植片の内部で見つか
った。原形質超微細構造のデータは後者の観察を確証
し、反応性星状細胞の突起は移植片の至るところに存在
するが細胞本体は移植片自身の外部に残ったままである
ことを示している。本研究および他の研究で観察された
星状細胞の応答は、ある部分傷ついた部位の近くに存在
する反応性小膠細胞およびマクロファージ（これらの細
胞はインビトロでインターロイキン−１を産生し放出す
ることがしられている）の存在のためであろう。
【０１６６】これらの結果は、成長したラットのＣＮＳ
へ移植した培養した繊維芽細胞の生存の直接の証拠を提
示している。これらの移植片は線条体中に腫瘍を形成せ
ず、起こり得る免疫学的応答はこれらの細胞の自己組織
の特性のため細最小限のようにみえた。さらに、繊維芽
細胞移植片は構造的にも機能的にもホスト脳に結合し
た。繊維芽細胞の成長したラットＣＮＳ細胞への構造的
および機能的結合を示すホスト線条体と繊維芽細胞との
間の動的相互作用は、移植片中の管系の構築、食細胞の
移動、そして反応性星状細胞突起の移植片への浸入およ
び肥大を含む。まとめとして、これらの特色は、プライ
マリーの繊維芽細胞は大脳への移植に対するふさわしい
ドナー細胞の候補者であり、それゆえ病気や損傷を受け
たＣＮＳの遺伝子治療のために遺伝子に変更を施した細
胞として用いられるだろうことを示している。
【０１６７】［実験例Ｖ］ 「Ｌ−ドーパ産生プライマリー繊維芽細胞の移植」この
実験例は遺伝学的に修飾されたプライマリー繊維芽細胞
が脳に移植された後長期間生き残ることを確かめるもの
である。上記の実験を発展させ、ラットＴＨ遺伝子がフ
ィッシャーラットの皮膚バイオプシーによって得られた
プライマリー繊維芽細胞に挿入された。ＴＨ−含有プラ
イマリー繊維芽細胞の生存率はフィッシャーラットの脳
への移植後、黒質線条体経路の前６−ＯＨＤＡ病巣を使
って二ヶ月間にわたって調べられた。さらに、移植され
た繊維芽細胞内ＴＨ−トランス遺伝子及びトランス遺伝
子産物の存在が調べられた。最後に、遺伝学的に修飾さ
れた繊維芽細胞のインビボにおける延長された機能は、
移植を受けたラットの転回行動を移植後八週間にわたっ
て二週間ごとに評価することによって研究された。
【０１６８】（レトロウィルスベクターの調製）本実験
で使われるベクターｐＬＴｈＲＮＬの調製は上記実験例
IIIのようにして行われた（図１６及び図１７参照）。
【０１６９】（繊維芽細胞の調製）プライマリー繊維芽
細胞はスライ（Sly）とグラブ（Grubb）(Methods in En
zymology, Vol. LVIII, Colowick and Kaplan, Eds., A
cademic Press, New York,pp. 444-450 (1979))の方法
で同系交配フィッシャー３４４ラットの腹皮膚生検から
えられた。簡単にはラットはケタミン（Ketamine）、ア
セプトマジン（Aceptomazine）、ロンパン（Rompun）の
混合物で麻酔された。腹部は毛をそられ、アルコールで
現れた。約１ー２平方センチの皮膚が取られ、簡単にア
ルコールですすがれ、すぐに滅菌したＤＭＥＭ／Ｓを入
れたバイアル瓶の中に置かれた。生検は通常採取後二次
間以内にカバーガラスに移され、２１日間ＤＭＥＭ／Ｓ
中で培養された。細胞はポリブレン（４μｇ／ｍｌ）存
在下感染の多重度１０でエコトロピックＬＴｈＲＮＬま
たはＢＡＧウィルス(Price et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84:156-160 (1987))に感染させられた。Ｇ−
４１８抵抗性細胞はコンフルエントになるまで増殖させ
られ、ＴＨ活性の発現をデカルボキシラーゼ結合アッセ
イ法(Iuvone, J. Neurochem. 43:1359-1368 (1984))に
よって試験された。ＴＨ−活性とＴＨ−免疫反応性をイ
ンビトロで示すサブクローン（ＦＦ２／ＴＨ）が移植の
ために選ばれた。ＢＡＧウィルスに感染し、βガラクト
シダーゼ活性（β−Ｇａｌ）をインビトロで発現してい
る繊維芽細胞コントロール細胞（ＦＦ２／βＧａｌ）と
して使われた。
【０１７０】（インビトロ生化学分析）Ｌ−ドーパ及び
その代謝物の産生と感染細胞からの分泌は２４時間１０
０μｍのテテトラヒドロビオプテリン、ＴＨの活性コフ
ァクターを補われたＤＭＥＭ／Ｓ中で細胞を増殖させて
から調べられた。条件を設定された培地と細胞は集めら
れ、０．１Ｍ 過塩素酸（ＰＣＡ）と０．０５ ＭのＥ
ＤＴＡに対して調整され、４℃１５分１００００Ｘｇで
遠心分離され、沈澱物を除かれた。サンプルはカテコー
ルアミン及びカテコールアミン代謝物の存在を上記実験
例ＩＩのようにしてＰＣＡ抽出物を１６個の電気化学セ
ンサー（Matson et al., Clin. Chem. 30:1477-1488 (1
984); Langlais et al., Monitoring Neurotransmitter
Release During Behavior, Fillenz, et al., eds., H
orwood, Chichester, U. K., pp. 224-232 (1986); Mat
son et al., Life Sci. 41:905-908 (1987)）を備えた
クーロメトリックエレクトロードアレイ、グラヂエント
液体クロマトグラフィー（CEAS model 55-0650, ESA, B
edfore, MA）に注入することによって分析された。
【０１７１】（レジョン（Lesions））ドーパミン作動
性黒質線条質経路はニューロトキシン６−ヒドロキシド
ーパミン（６−ＯＨＤＡ）によって片側に偏って傷つけ
られた。６−ＯＨＤＡは６μｇ／μｌの濃度でセーライ
ンに溶解され、０．１％アスコルビンサンを加えられ、
酸化を遅らされた。雌のフィッシャー３４４ラット（１
３０−１６０ｇ）は上記のようにして麻酔され、接触走
性フレームに入れられた。２μｌの６−ＯＨＤＡが前脳
束左中央（ＡＰ＝−４．４ｍｍ， ＭＬ＝１．１ｍｍ，
ＤＶ＝７．５ｍｍ）へ毎分１μｌでパキノス（Paxino
s）とワトソン（Watson）のThe Rat BraininStereotaxi
c Coordinates, San Diego, Academic Press,(1986)に
従って注入された。注射後２ｍｍ持ち上げられ、２分間
ニューロトキシンを拡散させるために休んだ。１０ー１
４日間のリカバリー期間の後、障害を受けたラットはア
ポモルフィンを使って障害の程度を計られた。
【０１７２】非特異的な線条体の損傷が転回行動の変化
に与える寄与を計るため、線条体の片側だけカイニン酸
（ＫＡ）障害を受けた６−ＯＨＤＡ障害ラットを用いて
上記実験例IIIの方法が行われた。この実験のために雌
のスプレイジ−ドーレイ（Sprague-Dawley）ラットが麻
酔され、上記のようにして６−ＯＨＤＡを使って障害を
与えられた。アポモルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）に
対して１分間に７回以上の転回行動を示したラットはＫ
Ａ障害のために選ばれた。カイニン酸は５μｇ／μｌの
濃度でセーラインに溶解され、麻酔されたラットの線条
体（ＡＰ＝０．３ｍｍ， ＭＬ＝２ｍｍ， ＤＶ＝４ｍ
ｍ）にいろいろなドースで注射された。３匹のラットは
１．０μｇ、別の３匹は２．０μｇ、３匹は４．０μ
ｇ、２匹は５．０μｇ注射された。ＫＡは０．１μｌ／
ｍｉｎで加えられ、それからシリンジはゆっくり２ｍｍ
持ち上げられ、２分間ニューロトキシンを拡散させるた
め、そのままおかれた。注射後すぐにジアゼパム（２ｍ
ｇ／ｋｇ）が与えられ、ＫＡを与えたことで起こる恐れ
のある発作が抑えられた。
【０１７３】（挙動試験）神経を切断され麻酔された線
条体の中の後神経ドーパミン受容体の感受性はアポモル
フィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）投与による６−ＯＨＤＡ障
害の７−１０日後実験例IIIのようにして評価された。
ラットは自動ロートメターボールの中に入れられ、総転
回数が１０分ごとに６０分間計測された。２回のアポモ
ルフィン試験の後に、毎分最低７回転以上したラットが
つぎのテストのために選ばれた。ラットは最低３回アポ
モルフィンを使って試験されるか、または前回の測定か
ら転回数の変化がみられなくなるまで試験された(Beva
n, Neurosci. Letter 35:185-189 (1983); Castro et a
l., Psychopharm. 85:333-339 (1985))。各アポモルフ
ィン試験の後１０日が経過した。移植後８週間の間、２
週間毎にアポモルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を使って
試験された。ＫＡ障害を持つラットは障害を与えられて
から２、４、６週目にアポモルフィン（０．０５ｍｇ／
ｋｇ）を使って評価された。統計的な比較のために、６
０分間における正味の毎分の回転数が移植後決定され、
最小二乗法を使って移植前の値と比べられた。
【０１７４】（移植）繊維芽細胞は上記実験例IIのよう
にして移植のために調製された。簡単には細胞はＤｕｌ
ｂｅｃｃｏのＰＢＳ中の０．０５％トリプシンと１ｍｇ
ＥＤＴＡによって組織培養プレートから取り出され、Ｍ
ｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、０．１％ グルコース（完全Ｐ
ＢＳ）及び５％ラットセーラムを加えたＰＢＳ中に懸濁
された。細胞は遠心法によって集められ、完全ＰＢＳで
２回洗浄され、完全ＰＢＳ中に１０００００細胞／μｌ
の濃度で再懸濁された。
【０１７５】計１０μｌのＦＦ２／ＴＨ （Ｎ＝１０）
またはＦＦ２／βＧａｌ（Ｎ＝５）を投与された１５匹
の麻酔されたラットは繊維芽細胞を線条体内（ＡＰ＝
０．３ｍｍｍ， ＭＬ＝２．０ｍｍ， ＤＶ＝４．５ｍ
ｍ， ＡＰ＝１．５ｍｍ，ＭＬ＝２．０， ＤＶ＝４．
５ｍｍ）の２箇所に注射された。それぞれの箇所では
２．５μｌの細胞が分配され、シリンジは１ｍｍ持ち上
げられ、さらに２．５μｌの細胞がカニューラ管から押
し出された。細胞は毎分１μｌの速度で加えられた。最
も背側に注射した後シリンジはそのままの位置に２分間
おかれ、細胞が拡散するようにした。移植を受けていな
いほかの５匹のラットはコントロールとして使った。
【０１７６】（解剖の方法）インビトロにおける免疫組
織化学的分析のためには感染した繊維芽細胞が４％パラ
ホルムアルデヒドでスライド上に固定され、０．２％ト
リトンＸ−１００を使って浸透化され、TH(Boehringer
Mannheim Biochemicals)に対するモノクローナル抗体と
1夜間インキュベートされた。染色はアビジンービオチ
ン法(Vector Laboratories, Elite Kit)によりニッケル
強化３、３’−ジエチルアミノベンジジン（ＤＡＢ）を
クロマゲンとして行われた。
【０１７７】インビボ分析のためには移植された繊維芽
細胞が移植後１０週後ＴＨ−及びフィブロネクチン免疫
反応性に対して調べられた。ラットは深く麻酔され、簡
単にセーラインですすいだ後、４％パラホルムアルデヒ
ドで潅流された。脳は取り出され、同じ固定液の中に１
夜間置かれ、３０％スクロース中に移されて平衡に達せ
られた。凍結部分はスライドミクロソーム（４０μｍ）
上で切断され、クリオプロテクタント中に集められプロ
セッシングのために保存された。自由浮動部位は１夜間
フィブロブラストマーカー(Organon Technica)に対する
抗体かまたはＴＨに対するモノクローナル抗体とともに
インキュベートされた。フィブロネクチン染色はアビジ
ン−ビオチンとそれに続くニッケル強化ＤＡＢを使って
行われた。ＴＨでラベルされた部分はマウス抗原に対す
る蛍光マイクロスコピー(JacksonImmunoResearch Rab
s., Inc., Bar Harbor, Main)のためにローダミンと結
合した二次抗体とインキュベートされた。いくつかの部
分はミクログリアまたは単球／マクロファージを同定す
るためにＯＸ−４２(Serotec)抗体またはＥＤ−１(Chem
icon)抗体を使ってプロセスされた。部分はＯＸ−４２
抗体と４８時間またはＥＤ−１抗体と２４時間４℃でイ
ンキュベートされた。後日ＯＸ−４２はアビジンービオ
チン及びニッケル強化ＤＡＢを使って発展させられ、Ｅ
Ｄ−１ラベルされた部分はローダミンでラベルされた二
次抗体と上記のようにしてインキュベートされた。
【０１７８】（インシトゥでのハイブリダイゼーショ
ン）ＴＨ ｍＲＮＡに対するインシトゥでのハイブリダ
イゼーションは、［35Ｓ］でラベルされたプローブを用
いて行われた。その方法については、Higgins et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:1297-1301 (1988)に
記載されており、その文献の記載は参照としてここに組
み入れられる。ＴＨプローブの６３個の塩基対からなる
鋳型は、ラットのＴＨ ｍＲＮＡ（Dr. Dona Chikarais
hi, Tufts Medical School, Boston, MA から提供を受
けた。）に相補的な３１１個のヌクレオチドからなるｃ
ＤＮＡを含有するプラスミドｐＳＰ６５を、ＡｖａＩＩ
を用いて切断することによって生成され、ＳＰ６ポリメ
ラーゼによって転写された。スライドにマウントされた
部分は、４％のパラホルムアルデヒドを用いて１分間で
固定化され、プロテイナーゼＫを用いて５分間、切断さ
れた後、トリエタノールアミン（０．１Ｍの０．９％Ｎ
ａＣｌ及び０．１％のアセチックアンハイドライド）中
で室温にて１０分間インキュベートされた。その部分
は、つづいてアルコールで脱水されてから室温にて５分
間クロロホルムによる処理が行われ、１００％のエタノ
ールに２分間戻されてから、あと２分間９５％のエタノ
ールでの処理が行われ、空気乾燥がなされた。脱水され
た部分は、５０％ホルムアミド、０．７５ＭのＮａＣ
ｌ、２０ｍＭのパイプス（Pipes）（ｐＨ６．８）、１
０ｍＭのＥＤＴＡ、２５０ｍＭのＤＴＴ、５Ｘのデンハ
ルト溶液（０．０２％のＢＳＡ、０．０２％のフィコー
ル(Ficoll)、０．０２％のポリビニルピロリドン）、
０．２％のＳＤＳ、１０％のデキストランサルフェー
ト、及び５００μｇ／ｍｌの変性されたイーストのｔＲ
ＮＡを含有する緩衝液中で、１−３時間プレハイブリダ
イゼーションされた。そのプレハイブリダイゼーション
の後で、過剰の緩衝液が除去され、その部分は５５℃で
１８時間、全容量が７５μｌであるハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液中に含まれている１０−１５ｎｇのラベルさ
れたプローブを用いてハイブリダイゼーションされた。
そのスライドは、リンスされた後で、ＲＮａｓｅがある
状態あるいはない状態で、０．６ＭのＮａＣｌ、０．０
６Ｍのクエン酸Ｎａを含有する溶液中でハイブリダイゼ
ーションが行われた。後で行ったハイブリダイゼーショ
ンのリンスを行った後、その部分は空気乾燥され、２４
時間Ｘ−線フィルム（Kodak XAR）が照射された。つづ
いてその部分はコダックのＮＴＢ−２エマルジョンに浸
漬され、４日間、４℃で放置され、増殖させた。
【０１７９】大量のＴＨ−発現型繊維芽細胞がＴＨ−免
疫反応性に対して染色された場合、ＴＨ−ラベルの強度
の違いが観察された。高レベルのＴＨを安定に発現する
クローンを単離しようとして、ＴＨ−発現型細胞がサブ
クローン化された。選択されたクローンであるＦＦ／Ｔ
Ｈは、比較的均一なＴＨ−免疫活性（図２８参照）を示
した。このクローンは、明白な形態学上の形態が、感染
されていない繊維芽細胞あるいはβｇａｌを運搬するベ
クターで感染された繊維芽細胞に似ている。細胞は、通
常、本体（soma）から広がる多角的な過程で延長され
た。βＧａｌを発現する細胞は、インビトロではＴＨ−
免疫活性が現れなかった。
【０１８０】（インビトロでの分析）ＴＨあるいはβＧ
ａｌ（ＦＦ２／βＧａｌ）に対する遺伝子を運搬するベ
クターを注入したプライマリー繊維芽細胞は、デカルボ
キシラーゼ−結合型の分析を用いてＴＨ活性について試
験がおこなわれた。ＴＨ活性はＦＦ２／ＴＨ細胞におい
てのみ見いだされ、そのレベルは１．１±０．４ピコモ
ル（pmole）のＬ−ドーパ／分／ｍｇタンパク質であっ
た。ＦＦ２／ＴＨのプライマリー繊維芽細胞内における
このＴＨのレベルは、同じＬＴｈＲＮＬベクター（上記
実験例III参照）で感染された免疫済みの２０８Ｆ繊維
芽細胞に対して前に観察されたレベルと比較された。
【０１８１】感染された繊維芽細胞は、１００μＭのＢ
Ｈ4、即ちＴＨに対する天然の共同因子に接触させて２
４時間たった時点において、Ｌ−ドーパ及び他のカテコ
ールアミンの生産及び放出に対して分析が行われた。Ｔ
Ｈ遺伝子を含有する細胞から集められた培地には、１０
6個の細胞あたり１７．２μｇのＬ−ドーパが含まれる
ことがわかった。ＦＦ２／ＴＨ細胞ペレットの分析を通
して評価されたように、Ｌ−ドーパの細胞内での定量
は、１０6個の細胞あたり０．２μｇのＬ−ドーパであ
った。コントロールのＦＦ２／βＧａｌ細胞では、Ｌ−
ドーパが含まれないかあるいはＬ−ドーパは放出されな
かった。検出可能なＬ−ドーパの代謝産物、たとえばド
ーパミン、３，４−ジハイドロキシフェニルアセティッ
クアシッド、あるいはホモバニリックアシッド等の代謝
産物も、ＦＦ２／ＴＨやＦＦ２／βＧａｌ細胞のいずれ
かの細胞の培地、あるいはいずれかの細胞のペレットか
ら集められたサンプル中にはなかった。
【０１８２】（繊維芽細胞を移植されたラットの行動分
析）ＦＦ２／ＴＨ細胞あるいはＦＦ２／βＧａｌ細胞が
移植された全ての６−ＯＨＤＡレジョン化されたラット
は、移植手術を行った２４時間以内に普通に食べたり飲
んだりしており、移植後、２カ月のテスト期間の間、体
重は変わらないかあるいはわずかに増加することが分か
った。移植されたラットの自発的な行動には明かな変化
が見られず、身の回りや運動能力の行動は、移植されな
かったレジョン化されたコントロールラットで現れるそ
れらの行動と比較された。
【０１８３】インビボで移植された細胞からのＬ−ドー
パの生産及び放出を評価するために、行動テストが行わ
れた。ラットはアポモルフィンが投与された。アポモル
フィンは、ドーパミン−涸渇の状態にある線条体の受容
体の活性化を引き起こす薬物である。このこの薬物で誘
導される興奮は、定量可能な巡回あるいは転回パターン
で歩行する行動にラットを導く（Ungerstedt and Arbut
hnott, Brain Res. 24:485-493 (1970)）。移植後、ア
ポモルフィンを投与した後６０分間での１分間あたりの
転回回数の平均が、移植されたラット及びコントロール
である移植されていないラットについて測定され、統計
学上の分析が行われている移植前の転回回数と比較され
た。コントロールの動物では、移植後の転回回数にわず
かなレベルの増加が見られた（図２９のコントロール参
照）が、それは、移植する以前に観察された転回回数レ
ベル（ｐ＞０．０５）と比べて統計学的な差異はなかっ
た。βＧａｌを含有する細胞を移植されたラットが起こ
すアポモルフィンで誘導される転回回数もまた、移植後
２カ月の期間を通じて移植前の転回回数（ｐ＞０．０
５；図２９、ＦＦ２／βＧａｌ）との間に違いは見られ
なかった。対照的に、ＦＦ２／ＴＨラットでは、移植後
２週間の転回運動に意味あるほどの減少が現れ、その減
少は移植後８週間を通して認められた（図２９、ＦＦ２
／ＴＨ参照）。ＦＦ２／ＴＨラットの転回において、最
初の６５％の減少、即ち１１．７±３．０から４．１±
２．９（平均値±標準誤差の平均）の減少がおこり、移
植後６及び８週間では、移植前のレベルよりもほぼ３０
％以下のプラトーに縮小された。
【０１８４】（解剖学上の分析）繊維芽細胞の移植片
は、移植後１０週間めの全てのラットの脳内に存在して
いた。しかしながら、２匹の動物からは移植片がその期
間の間に消失していた。一般的には、ＦＦ２／ＴＨ細胞
及びＦＦ２／βＧａｌ細胞の移植片の配置は、比較的吻
側−尾側に沿って広がっている部位及び中央側の部位の
両方の部位と同等に見いだされた。しかしながら典型的
には、ＦＦ２／ＴＨの移植片は、ＦＦ２／βＧａｌの移
植片よりも大きかった。ＦＦ２／ＴＨのグループのうち
には、移植片の大きさと、転回行動の減少との間に相関
関係はなかった。
【０１８５】全ての移植片は、大量のコラーゲン繊維の
中に散在して、延長している繊維芽細胞様の細胞を含ん
でいた。典型的な繊維芽細胞に加えて、大きくて黄色の
細胞が明らかにヘマシデリン（hemasiderin）で満たさ
れた状態でその移植片のコア内に見いだされた。これら
の細胞にはしばしば残骸が含まれているので、小神経膠
細胞及びモノサイト／マクロファージに対して特異的に
染色されるマーカーであるＯＸ−４２及びＥＤ−１を用
いてその移植片を通過する領域が染色される。しかしな
がら、免疫反応性のマクロファージはその移植片の周辺
で見いだされるが、大量の残骸で満たされている細胞の
コア部分はＯＸ−４２あるいはＥＤ−１でラベルされな
かった。
【０１８６】トランス遺伝子が移植された繊維芽細胞中
で発現し続けるかどうかを評価するために、その移植片
を通過する領域は、ＴＨ ｍＲＮＡにインシトゥでハイ
ブリダイゼーションするために処理された。ＴＨ ｍＲ
ＮＡに対する積極的なハイブリダイゼーションは、ＦＦ
２／ＴＨ繊維芽細胞を含有する移植片中の細胞に存在し
ていることが分かったのみであった（図３０（ａ）参
照）。ＦＦ２／ＴＨ細胞及びＦＦ２／βＧａｌ細胞の移
植片（図３０（ｂ）、コントロール参照）においては、
コラーゲン繊維であらかじめ占拠されて構成されている
移植片領域では、周辺の背景よりも有意にグレインの密
度が小さいことが判明した。グレイン密度の増加を示し
ている形態学上の細胞はさまざまであり、それらの細胞
は伸長した繊維芽細胞の形態特徴を数多く示していた
（図３１（ｃ））。しかしながら、積極的なＴＨのハイ
ブリダイゼーションを伴ういくつかの細胞は、大きくて
丸いものとして観察され、時としてヘマシデリンや顆粒
状の微粒子で満たされていた。ＴＨ ｍＲＮＡへの特異
的なハイブリダイゼーションが行われたβＧａｌ移植片
内には、細胞の存在は認められなかった（図３１（ｄ）
参照）。
【０１８７】トランス遺伝子の生産物が繊維芽細胞内で
合成され、その細胞内に存在しているかどうかを調べる
ために、移植片に対して、ＴＨ−免疫反応性及びβＧａ
ｌ組織化学について実験が行われた。ＦＦ２／ＴＨの移
植片内には、伸長された形状の繊維芽細胞でＴＨ−ラベ
ルされた細胞が、コラーゲン繊維の中に散在しているこ
とが観察された（図３２（ａ）参照）。自己蛍光物質は
その移植片中に存在していたが、物質の形及び５２８ｎ
ｍを通るブロードな蛍光（図３２（ａ）及び（ｂ）、星
印）により、ローダミン−特異性ラベリング（５８２ｎ
ｍで発光）から容易に識別可能な形であった。インビト
ロで観察されたように、ＴＨラベリングの強度には不均
一性があった。自己蛍光細胞はＦＦ２／βＧａｌ移植片
内に存在したが、識別可能なＴＨ−免疫反応性繊維芽細
胞はなかった。βＧａｌ組織化学について染色された部
分は、ＦＦ２／βＧａｌ移植片内の細胞の拡散した細胞
質ラベリングを明らかにした。ＦＦ２／βＧａｌ染色が
移植片のコア内の大円形細胞内及び繊維芽細胞に典型的
な延びた形の細胞内に認められた（図３１（ｂ））。Ｆ
Ｆ２／ＴＨ移植片内のβＧａｌ反応性は、先に内因性の
マクロファージについて述べた青い粒状の染色を有する
小数の円形細胞に限られた（Shimohara rt al., Mol. B
rain Res. 5:271-278 (1989)）。
【０１８８】これらの結果は、皮膚生検から得られたプ
ライマリー繊維芽細胞はトランス遺伝子を発現するため
にカルチャー内で増殖することができ遺伝子的に操作で
きることを確認している。挿入されたＴＨ遺伝子産生が
インビトロで合成され生物学的に活性化されているとい
う証拠は、組織学的及び生化学的計測により提供され
た。ＴＨ遺伝子を含む細胞は、インビトロでＴＨに対す
る正の免疫反応性を示した。そして、ＴＨに対するプテ
リンコファクターの存在のもとで、細胞培養基中におけ
るチロシンの存在は、ＴＨ酵素活性を通じてＬ−ドーパ
に転換された。
【０１８９】遺伝子操作についてのプライマリー繊維芽
細胞の本質的な利点は、これらの変性された細胞を自己
移植のためのドナー物質として使用し、従って宿主から
の免疫学的応答の問題を最小にすることについての可能
性である。本研究で使用されたプライマリー繊維芽細胞
は、同一のドナー動物には移植されず、むしろ遺伝学的
に同系交配のフィッシャー３４４ラット（Fischer 344
rat）が、神経芽細胞のドナーと変性された細胞の両方
として使用された。この同種移植的アプローチは、イン
ビトロでの細胞の維持を簡単にする一方、自己移植のそ
れらを近づけた条件を与えるので選択された。ラットの
脳への６−ＯＨＤＡレジョンの移植に続いて、βＧａｌ
またはＴＨについての遺伝子を含むプライマリー繊維芽
細胞は少なくとも１０週間生存することが発見された。
更に、移植された繊維芽細胞はβＧａｌ及びＴＨトラン
ス遺伝子を、毎２カ月の移植後の生存期間中、発現し続
けた。ＴＨを含む細胞がインビボでＬ−ドーパを産生し
分泌し続ける証拠は、行動に関する観察測定、即ちＴＨ
を含む繊維芽細胞の移植片を有するラットについてのみ
転回の非対称性における少なからぬ減少が観察されたこ
とから提供された。
【０１９０】（脳内における繊維芽細胞の生存）２カ月
間での実験期間の後、ＦＦ２／ＴＨ移植片はＦＦ２／β
Ｇａｌ移植片よりも大きいことが観察された。この違い
が生じる理由はわかっていない。脳内にプライマリーの
繊維芽細胞が生存し続けるためのファクターはたくさん
あるが、それには植え付けの前の細胞の状態、及び細胞
が移植の前に培地に維持されている時間が含まれる。現
在の研究で用いられているＦＦ２／ＴＨは、ＴＨ−発現
性の繊維芽細胞のサブクローンであり、一方ＦＦ２／β
Ｇａｌ細胞はβＧａｌ−発現性の繊維芽細胞の大量集団
であった。大量のＦＦ２／βＧａｌ細胞よりも更に二量
化を経てＦＦ２／ＴＨ細胞を合成するサブクローニング
法は、インビボで生存している繊維芽細胞の能力に影響
を与える可能性がある。早期の継代接種では、繊維芽細
胞の移植片の大きさと実験例ＩＶにおいて示されている
ような移植の前の培養物における細胞の分割回数との間
に相関関係は認められなかった。培養物中でより長期間
維持された繊維芽細胞は、例えば今日の研究で用いられ
ているのはＦＦ２細胞であり、このような繊維芽細胞
は、４−６週間後の移植片の大きさあるいは構成に本質
的な変化はみられず、６カ月間もの間脳内にうまく生存
していた。
【０１９１】脳内に生存している繊維芽細胞に影響を与
える他のファクターとしては、適切な栄養素を供給する
ために移植された細胞を利用できることを含む。血管の
生成は、ＦＦ２／ＴＨ移植片内では明白であるが、小さ
い方のＦＦ２／βＧａｌ移植片内ではあまり明白ではな
かった。移植片に血管供給を確立するための時間経過
も、繊維芽細胞の長期間の生存に影響を与える。他の細
胞タイプ、例えば胎児の神経細胞などの細胞タイプを含
有する移植片は、移植後の生存のためには迅速な血管の
新生にかかっていることが判明している（Stenevi et a
l., Brain Res. 114:1-20 (1976)参照）。移植片内の血
管が、典型的な脳の血管のように巨大分子に対する障壁
を確立しているか、あるいは典型的な移植片周辺のもと
の組織に見られるような漏出が残っている（Rosenstein
and Brightman, J. Comp. Neurol250:339-351 (1986)
参照）かどうかも、移植された繊維芽細胞の生存に影響
を与える。移植後に脳内血管を切開することは、脳内の
細胞に対して典型的には薬に立たないファクターに対
し、脳に”窓（window ）”を開けることを示唆してい
る（Rosenstein and Bridhtman, 同上文献；Sandberg e
t al., Exp. Neurol. 102:149-152 (1988)参照）。この
ようなファクターは、血清が強化された培養培地（Gibb
s et al., Brain Res. 382:409-415 (1986); Ezerman,
Brain Res. 469:253-261 (1988)参照）に維持されてい
る細胞にとって好適であるであろう。逆に血管の入口
は、傷つき易い位置に移植された細胞が配されることに
よって、循環しているマクロファージから攻撃される。
【０１９２】（移植片の構築）移植された細胞は、２カ
月間生存することがわかっているが、全ての移植片は大
きい、ヘマシデリン（hemasiderin）及び残骸が含まれ
ている細胞のコア部分に特徴を有しており、それは最初
にマクロファージの攻撃を受けたことが示唆されてい
る。しかしながら、ＥＤ−１−ポジティブなマクロファ
ージの数には限りがあるので、いくつかの移植片の周辺
では散在していることが観察されたが、移植片のコア部
分内の細胞は、ＥＤ−１あるいはＯＸ−４２のいずれ
か、即ち小膠細胞及び単核細胞／マクロファージに対し
て特異的なマーカーであるＥＤ−１あるいはＯＸ−４２
のいずれかとも免疫反応が起きなかった。更に、移植片
がβＧａｌで染色された場合には、あらかじめ持ってい
た酵素が外来のマクロファージ内にはっきりとした顆粒
の出現を示すことがわかり（Shimohara et al., 同上文
献, 1989）、ＦＦ２／ＴＨあるいはＦＦ２／βＧａｌ移
植片のいずれかの中ではその大きなコア細胞がどれも顆
粒の染色を示さなかった。しかしながら、ＦＦ２／βＧ
ａｌ移植片内のいくつかのコア細胞はそれぞれ拡散と細
胞質のβＧａｌを明白に示しており、あらかじめラベル
することによって、βＧａｌトランス遺伝子を含有する
免疫化された繊維芽細胞の特徴であることが示されてい
る（Shimohara et al., 同上文献, 1989）。最後に、Ｆ
Ｆ２／ＴＨ移植片内の大きなコア細胞は、ＴＨ ｍＲＮ
Ａに対してポジティブにハイブリダイゼーションするこ
とを示していた。これらの観察から、繊維芽細胞の移植
片のコア部分内にある食細胞が、もとのドナー細胞の懸
濁液からもたらされることが強く示唆された。
【０１９３】（移植片の機能のメカニズム）繊維芽細胞
の植え付けが、ポストシナプスドーパミンレセプター関
連した欠乏及び、線条体の組織の損失による行動におけ
る人工産物的”回復”を生産する可能性は考えられてき
た。しかしながら、これが見込みがないことを示唆する
２つの証拠がある。第一には、ＦＦ２／ＴＨラットと同
じ容量及び同じ細胞数で移植されたＦＦ２／βＧａｌラ
ットは、移植の後の転回行動が有意に変化をすることを
示していなかった。第２には、カイニン酸で内在性の神
経とレセプターの破壊することは損傷後の転回行動を引
き起こし、その転回行動はＦＦ２／ＴＨラットで観察さ
れた転回行動とは明らかに異なっていた。最小のＫＡレ
ジョンを持つラット、あるいは移植によって包囲される
領域よりもずっと小さい領域に影響を与えるレジョンを
持つラットは、損傷後２週間の時点の１９％から、損傷
後６週間の時点の５０％以上にまでの転回に確実な減少
を示しており、それはＫＡ投与の後に線条体内に起こる
ことが知られている変性的な変化と一致している（Coyl
eand Schwarcz, Nature 263:244-246 (1976)参照）。対
照的に、ＦＦ２／ＴＨに対して観察された転回行動にお
ける明白な減少は、移植後２週間で起こり（６５％）、
続いて徐々に増加して安定になるが、６−８週間の間で
はより高くて転回の数は徐々に増加する（ベースライン
以下の３０％）。２週間から８週間の間の移植の効力の
明かな減少は、数種の異なるメカニズムから生じるであ
ろう。第１番目としては、いくつかの移植された細胞
が、移植後最初の１週間内でなくなるであろう。他の研
究では繊維芽細胞移植片は、植え付け後３週間を経ると
脳内での大きさの萎縮が見られた。この時よりも後で
は、安定な移植片の大きさが、少なくとも６カ月間は持
続された。移植後の期間が長い場合には、移植の効果を
減少させる第２番目の理由としては、繊維芽細胞の代謝
における性質の変化が関連している。構築された繊維芽
細胞は、代謝活性が低下している静止期の細胞の性質を
有しているであろう（Dean et al., J. Biol. Chem. 26
1:9161-9166 (1986); Rao and Church Exp. Cell Res.
178:449-456 (1988)参照）。また、その繊維芽細胞は、
Ｌ−ドーパの生産を減少させる性質も有しているであろ
う。最後に、移植片の効果は、繊維芽細胞に挿入された
ＴＨ ｃＤＮＡの欠失あるいは再配列等の遺伝子的な事
象によって、あるいはＴＨ ｃＤＮＡの転写を進行させ
るＬＴＲプロモーターからの転写の後成の停止によって
譲歩的に解釈される。このような事実は、他のレトロウ
イルスベクターについても記録されている（Xu et al.,
同上文献, 1989）。
【０１９４】ＦＦ２／ＴＨ−移植ラットのアポモルフィ
ン転回の減少を説明する最後の可能性は、移植片が皮質
組織への非特異的な損傷を通して皮質−線条体相互作用
を中断するであろう、ということである。このような損
傷は、６−ＯＨＤＡ−レジョン化（lesioned）ラットの
転回行動を減少させるということが報告されている（Fr
eed and Canon-Spoor,Behav.Brain Res.32:279-288(198
9)参照）。しかしながら、脳内での非制御的な生長を示
す不滅化されたラットの繊維芽細胞を用いる我々の以前
の研究では、皮質組織に制限された大規模な損傷はアポ
モルフィン誘導された転回行動でのドロップ（drop）と
は関連していなかった。現在の研究で試験された移植片
は、ラット−１の移植片で見られるものより皮質組織へ
の移植拡張がかなり制限されていることを示しているの
で、ＦＦ２／ＴＨラットの減少した転回行動が、皮質−
線条体経路への非特異的損傷を反映して起こっていると
は思われない。
【０１９５】現在では、Ｌ−ドーパがパーキンソン病
（ＰＤ）の症状の最も効果的な治療薬である。しかしな
がらＬ−ドーパの長期の計画的投与は、望ましくない副
作用を引き起こす。その副作用とは、随意運動障害や”
オン−オフ”現象である（Marsden amd Parks, Lancet
7: 292-296 (1976)参照）。これらの問題のいくつか
は、Ｌ−ドーパの経口投与の後の細胞質内のＬ−ドーパ
のレベルの変動から生じることが示唆されており、それ
はＬ−ドーパの連続的な注入によって軽減されうる（Nu
tt et al., New Eng. J. Med. 310:483-488 (1984)参
照）。Ｌ−ドーパあるいはドーパミンを生産するように
遺伝子的に修飾された細胞を脳内に移植することは、Ｐ
Ｄの症状をコントロールするための別法を提供するもの
であり、そしてそれは、脳内の適当な標的領域に直接ド
ーパミンを連続的、局所的注入をすることによって、Ｌ
−ドーパの広範囲の投与による副作用を小さくするする
ための別法を提供するものでもある。
【０１９６】これらの結果は、トランス遺伝子を発現す
るように遺伝子的に修飾されたプライマリー繊維芽細胞
が、脳内移植のための生育能力があるドナー細胞を提供
し、かつＰＤなどのヒトの神経学的な疾病を治療するた
めの有効な攻略法を提供できることを示している。
【０１９７】［実験例ＶＩ］ 「ドナー細胞として供給される老化繊維芽細胞の能力」
この実験例では老人繊維芽細胞が皮質内移植に対してド
ナー細胞として有効であるかを説明した。
【０１９８】（ヒト神経生長因子（ＮＧＦ）に対するレ
トロウイルス構築）ヒトＮＧＦｃＤＮＡ(Syntex Resear
ch,Palo Alto,CAから入手した) を含むモロニーネズミ
白血病ウイルス、ｐＬｈＮＲＮＬが用いられた。このベ
クターはｄＣｈＡＴ遺伝子の場所でのプラスミドｐＬＣ
ｈＲＮＬ内にＮＧＦｃＤＮＡを挿入することによって準
備された。（実験例ＶＩＩ、図３４参照）５’長末端反
復配列（ＬＴＲ）はヒトＮＧＦ（ｈＮＧＦ）ｃＤＮＡの
発現を進行させた。内部のロウスサルコーマウイルスＬ
ＴＲプロモーター(Internal Rous sarcoma virus LTRpr
omoter)は選択できるバクテリアルネオマイシン耐性遺
伝子(selectable bacterial neomycin resistant gene)
（ｎｅｏR ）の発現を進行させた。
【０１９９】（ウイルスストックの生産）感染ウイルス
ストックの生産は、カルシウムフォスフェイト共沈によ
ってプラスミドＤＮＡをもつアンフォトロピック細胞ラ
インＰＡ３１７を最初のトランスフェトすることによっ
て達成され、これは、Miller and Buttimore,Mol.Cell.
Biol.6:2895-2902(1986)に記されている。(Miller,Fred
Hutchinson Cancer Research Center,Seattle,WAから
供給された)これらの細胞からの条件づけられた培地
は、集められ、濾過され、エコトロッピックヘルパー細
胞ラインプサイ（ψ）２を感染するために用いられた。
これは、ＭａｎｎらによってCell33:153-159(1983)に記
されている。これらの細胞からの条件づけられた培地は
そのときアンフォトロピックヘルパー細胞ＰＡ３１７を
感染するために用いられた。このラインからの生産細胞
(producer cells)は、ネオマイシンアナログＧ４１８(G
ibco/BRL,Gaithersburg,MD)の４００μｇ／ｍｌを含む
培地内の細胞を生長させることによってｎｅｏR遺伝子
のそれらの発現のために選択された。最高力価（約４×
１０4c.f.u./ml）を生産するＰＡ３１７クローンからの
ウイルスは以下に記されるように多種の細胞ラインを感
染するために用いられた。
【０２００】（細胞の感染）皮膚生検から得られた、及
び細胞ラインとして確定したプライマリー繊維芽細胞は
アンフォトロピックレトロウイルスに感染された。若い
ラット（約３カ月）のプライマリー繊維芽細胞はマウス
ＮＧＦを発現するエコトロピックウイルスまたは、ヒト
ＮＧＦを発現するアンフォトロピックウイルスに感染さ
れた。老人の（アルツハイマー病の６６歳の男性及びア
ルツハイマー病でない６９歳の男性）からの皮膚プライ
マリー繊維芽細胞はＤｒ．Ｒ．Ｋａｔｚｍａｎ,Univers
ity ofCalifornia,San Diego,CAによって皮膚生検より
得られた。若い（新生児の）ヒト皮膚繊維芽細胞はUniv
ersity of Cakifornia,SAn Diego,CAのCore Tissue Cul
ture Facilityより得られた。アカゲザルの皮膚繊維芽
細胞（１０歳の雄及び１１歳の雌）はUniversity of Ca
lifornia,Davis,CAのPrimate Centerから生検より得ら
れた。
【０２０１】７０％から８０％までコンフルエントにな
るまで生長した繊維芽細胞は、レトロウイルス及びポリ
ブレン４μｇ／ｍｌを含む培地の１０ｍｌとともに夜通
し培養された。この感染は１列に３日間で達成された。
結果的に、培地は吸引され、Ｇ４１８の４００μｇ／ｍ
ｌを含む新鮮な培地に置換された。感染後に、細胞は培
地を補ったＧ４１８で断続的に維持された。
【０２０２】（ＮＧＦ活性の検定）感染された繊維芽細
胞によるＮＧＦ生産及び分泌は、抗−βＮＧＦ抗体(Boe
hringer-Mnmmheim,Germany)を用いた２部位ＥＬＩＳＡ
分析によって検定された。これは、上述の実験例ＩＩに
記述してある。ＮＧＦ活性は図３３に示されているその
日に培地内で測定された。図３３は、ＮＧＦ量がヒトＮ
ＧＦ（ｈＮＧＦ）またはマウスＮＧＦ（ラット繊維芽細
胞）のどちらかを発現する異なる起源の繊維芽細胞か
ら、異なるコンフルエントで分泌したことを示してい
る。すべての場合に、ＮＧＦの生産は、コンフルエント
間で増加するか、少なくとも定常を維持する（モンキー
細胞に対して）。対数期またはコンフルエント期間にお
いては、ヒト繊維芽細胞の若さ、老化によってＮＧＦの
生産での違いはほとんどなかった。
【０２０３】これらの結果は、ヒトの疾病のヒトでない
霊長類（例えば、モンキー）が遺伝子的に修飾されたト
ランス遺伝子の移植の効力をテストするために利用でき
ることを示している。加えて、これらの結果によって、
老人繊維芽細胞がトランス遺伝子を運ぶベクターに好結
果的に感染されることが示され、また、老人繊維芽細胞
がドナー細胞として用いることができることを提案して
いる。
【０２０４】［実験例ＶＩＩ］ 「ドナー細胞から生じるトランス遺伝子生産物の遊離の
調節」この実験例は、トランス遺伝子生産物であるアセ
チルコリン（ＡＣｈ）の分泌の調節について示してい
る。なお、アセチルコリンは、コリンを用いてトランス
フェクトされた細胞から得られる。
【０２０５】（細胞の培養）ラット−１の繊維芽細胞
を、０．１％のグルタミンと１０％のＦＢＳで懸濁させ
たＤＭＥＭ中で生育させた。培養物を、１０％のＣＯ
2 、３７℃の条件下でインキュベートさせた。
【０２０６】（レトロウイルスの構築）ドロソフィラ
（Drosophila）ＣｈＡＴ ｃＤＮＡを有するモロニーネ
ズミの白血病ウイルスベクター（a Moloney murine leu
kemia viral vector：ＭｏＭＬＶ）（Dr. P. Salvaterr
a, Duarte, CAから入手される。）、ｐＬＣｈＲＮＬ
は、図３４にに示されているように構築された。プラス
ミドｐＣｈａ−２（Itoh etal., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 83:4081-4085 (1986)）から得られるｄＣｈＡＴ
ｃＤＮＡを含む２５１９個の塩基対（base pair：ｂ
ｐ）からなるＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメン
ト、ｐＢＲ３２２から得られる３７７個のｂｐからなる
ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメント、及びレトロウイ
ルス構築体であるｐＬＬＲＮＬ（Xu et al., Virology
171:331-341 (1989)）である６５００個のｂｐからなる
フラグメントが、公知の方法（Sambrook et al., In: M
olecularCloning, A Laboratory Manual, ed. C. Nola
n, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sprin
g Harbor, NY(1989)参照）によって組み入れられた。ｐ
ＬＬＲＮＬ内の５’ＬＴＲは、ｄＣｈＡＴ遺伝子の発現
を進行させる。同様に、内部のＲＳＶプロモーターは、
特異性のあるバクテリアのネオマイシン抵抗性の遺伝子
（ｎｅｏR）の発現を進行させる。
【０２０７】（感染（infection））感染することので
きるベクター株の生産は、アンホトロピック（amphotro
pic）なヘルパー細胞ライン ＰＡ３１７（Miller and
Buttimore, Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902 (1986)）を
プラスミドＤＮＡを用いてまず、トランスフェクトする
ことによって行われた。これらの細胞によって条件付け
られている培地が集められて、フィルーターがかけられ
てからエコトロピック（ecotropic）なヘルパー細胞ラ
インΨ−２（Mann et al., Cell 33:153-159 (1983)）
を感染するために用いられた。このラインを形成する生
産細胞は、４００μｇ／ｍｌのネオマイシンアナログ
Ｇ４１８（Gibco）を含有する培養培地中で細胞を生育
させることによって、ｎｅｏRの発現がなされるように
選択された。全部で１６個のコロニーから選択される２
個のＧ４１８−抵抗性のコロニーであって、最高レベル
のＣｈＡＴ活性とウイルスに対する最も高いタイター
（力価）を発現しているコロニーが、ラット−１細胞を
感染するために用いられた。
【０２０８】１０ｃｍの組織培養プレート上でコンフル
エントするように生育させたラット−１の繊維芽細胞
を、１：５に分割し、１日間成長させた後、数種のレト
ロウイルスと４μｇ／ｍｌのポリブレン（polybrene）
を含有する５ｍｌの培地でインキュベートした。細胞は
この培地中で一晩インキュベートさせた。次に、培地を
アスピレートして４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有す
る新鮮な培地への植え変えを行った。感染させた後、そ
の細胞をＧ４１８の補充を行った培養培地中で引続き維
持した。
【０２０９】（ＣｈＡＴ活性の検定）ＣｈＡＴ活性の検
定を行うために用いられる方法は、Fonnumによる次の文
献J.Neurochem. 24:407-409 (1975)中に記載された方法
の変形法である。尚、この文献は、参考文献としてここ
に組み入れられる。繊維芽細胞は、３５ｍｍの組織培養
皿に植え付けられて、７０−８０％のコンフルエントに
なるまで培養された。続いてその細胞は、ＰＢＳで洗浄
され、ホモジェネートした緩衝液（０．１％のトリトン
Ｘ−１００を含有する０．８７ｍＭ ＥＤＴＡ溶液）
中にその細胞をスクラップすることによって集められ
た。その再懸濁液を１．５ｍｌのエッペンドルフ（Eppe
ndorf）管に移し、超音波処理（３Ｘ、１０分間）を行
った。超音波処理を行ったホモジェネートのうち、１０
マイクロリッターを別のエッペンドルフ管に移した。１
０マイクロリッターの放射線活性のある溶液（０．２ｍ
Ｍの14Ｃ−アセチルコエンザイムＡ、１ｍｇ／ｍｌのＢ
ＳＡ、０．２ｍＭのエゼリンサリチレート、４ｍＭのコ
リンクロライド、１８ｍＭのＥＤＴＡ、０．６ｍＭのＮ
ａＣｌ、及び０．１ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4）が添加され
た。この混合物は、３７℃で５分間インキュベートされ
た。その反応は、１００μｌの氷冷された蒸留水を添加
することによって止められた。サンプルは１．０ｍｌの
抽出緩衝液（８５０ｍｌのトルエン及び１５０ｍｌのア
セトニトリル中に、１５ｇのソジウムテトラフェニルボ
ロンを混合した溶液）で抽出が行われ、エッペンドルフ
マイクロ遠心分離管内で２分間遠心分離が行なわれ
た。その後、０．６５ｍｌの有機層が集められ、５．０
ｍｌのシンチレーションカクテル（scintillation cock
tail：National Diagnostics, Manville, NJ）に加えら
れた。サンプルは、１０分間、シンチレーションカウン
ターで計数された。培養物に対するプロテインの量は、
クマージー（Coomassie）のプロテイン分析（Pierce Ro
ckville, IL）によって測定された。
【０２１０】（ノーザンブロット分析）繊維芽細胞は、
１０ｃｍの組織培養プレートに植え付けられ、７０−８
０％のコンフルエントに達するまで培養された。ＰＢＳ
で洗浄された後、それぞれの培養物から全ＲＮＡが、
０．５ｍｌのグアニニジン イソチオシアネート溶液中
で細胞を抽出することによって単離された。（Chomczyn
ski and Sachhi, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)
の記載参照。尚、この文献は参照文献としてここに組み
入れられる。）ＲＮＡの量は、２６０ｎｍにおける吸光
度を測定することによって定量された。全ＲＮＡのうち
１０μｇ〜１５μｇが、１，２％のホルムアルデヒド−
アガロース ゲルに載せられた。分離されたＲＮＡが、
サンブロックらの文献（Sambrook et al., in "（分子
クローニング、実験操作）Molecular Cloning, A Labor
atory Manual", (Ed. Nolan), Cold Spring Harbor La
b. Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)： 尚この
文献は、参照文献としてここに組み入れられる。）に記
載されているような、ナイロン膜（ＭＳＩ）の上にブロ
ットされた。ブロットは、１〜４時間、４２℃でプレハ
イブリダイゼーション（５０％のホルムアミド、５Ｘ
ＳＳＰＥ、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性
されたヘリング精子（denatured herring sperm）のＤ
ＮＡ）が行われた。プローブは、ｐＬＣｈＲＮＬから得
られるほぼ２．５ＫｂのＥｃｏＲ１フラグメント、ある
いはｐＧＣｃから得られる９５３ｂｐのＢａｍＨＩフラ
グメント（H.Jinnah, University of California, San
Diego, CAから入手できる。）を活性化することによっ
て準備され、それぞれｄＣｈＡＴあるいはシクロフィリ
ンのｍＲＮＡを検出するために用いられる。そのフラグ
メントは、１．０％の低融解のアガロースゲル上で単離
され、ジーンクリーン（Gene Clean：Bio 101, San Die
go, CA）を用いて精製された後、32Ｐ−ｄＣＴＰを用い
てランダムプリミング（random priming： Boerhinger
Mannheim, indianapolis, IN）によってラベルされた。
ブロットあたり、約１×１０6 ｃｐｍ／１０ｍｌのハイ
ブリダイゼーション緩衝液が用いられた。放射活性ラベ
ルされたプローブは、プレハイブリダイゼーション溶液
に直接的に提供された。ハイブリダイゼーションは、４
２℃で１２−２０時間行われた。その後、ブロットは６
Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用い、室温の状態で二度
洗浄され、次に１Ｘ ＳＣＣ、０．１％ ＳＤＳを用い
て４２℃で二度洗浄され、最後に０．１Ｘ ＳＳＣ、
０．１％ ＳＤＳを用いて６５℃で一度洗浄された。す
べては１０分間で洗浄が行われた。その洗浄済みのブロ
ットは、プラスチックフィルムでラップされ、オートラ
ジオグラフィー（ＸＡＲフィルム、Kodak, Rochester,
NY）が行われた。そのプローブは、５０％のホルムアミ
ド、１０Ｘ ＳＳＰＥ中、６５℃以上で１時間、そのブ
ロットをインキュベートすることによって続いて起こる
ハイブリダイゼーションのために除去された。そのブロ
ットは、次のプレハイブリダイゼーション前にｓＸ Ｓ
ＳＰＥ中ですすがれた。オートラジオグラフの密度走査
は、ＬＫＢの高速走査 ＸＬレーザー濃度計上で管理さ
れた。
【０２１１】（免疫組織化学）繊維芽細胞は、２個のウ
ェルの組織培養スライド（Tissue Tek）に、１×１０4
個の細胞密度で植え付けられ、２日から３日間育成させ
て４％のＰＢＳ−緩衝液のパラホルムアルデヒドを用い
て固定化された。培養物は、０．２５％のトリトン−Ｐ
ＲＳで１５分間、透過され、ＰＢＳで二度洗浄され、そ
して室温で一晩、プライマリー抗体とともにインキュベ
ートされた。用いられたプライマリー抗体は、ウサギ−
抗−ｄＣｈＡＴ（１：１００、Dr. P. Salvaterra, Dua
rte, CAから入手した。）、マウス−抗−ビメンチン（m
ouse-anti-vimentin：１：２５０、Vector Laboratorie
sから入手した。）、あるいはウサギ−抗−ラットＣｈ
ＡＴ（１：７５００、Boehringer Mannheimから入手し
た。）であった。ほとんどの場合において培養は、ビメ
ンチン、及び一種のあるいは他のＣｈＡＴ抗体に対する
抗体を用いて同時にインキュベートされた。初めのイン
キュベートが行われた後、培養物は、再びＰＢＳで二度
洗浄され、更に３７℃で１時間、蛍光色素でラベルされ
たヤギ−抗−ウサギ（１：１００、Vector Laboratorie
sから入手した。）、及びヤギ−抗−マウス（１：１０
０、Chemicon, Temecular, CAから入手した。）、即ち
第２番目の抗体とともにインキュベートされた。スライ
ドは、ハイドロマウント（Hydromount：National Diagn
ostics）でマウントされ、オリンパスの蛍光顕微鏡で観
察された。
【０２１２】（血清の欠乏及びコンフルエント状態で生
じる静止期）ラット−１細胞は、６０ｍｍのプレートあ
たり２．５Ｘ１０5個の細胞密度でプレートにおかれ
た。血清を欠乏させた実験では、細胞を７０ー８０％の
コンフルエントに到達させた後、培養培地を吸引させて
新鮮なＤＭＥＭのみで置換した。コントロールの細胞
は、通常の血清を追加した培地に植え付けられた。イン
キュベートは２０時間行われた。
【０２１３】コンフルエント状態で生じる静止期では、
細胞は上記に記載したように植え付けられている。それ
から培養物はそれらがコンフルエントに到達した後、
３、７、及び１４日間維持された。これらの培養物を植
え付けるために、等量の培養培地が吸引されて、等量の
新鮮な培地で置き換えられた。最後の植え付けを行って
３日たった時点で、その細胞の分析が行われた。ノーザ
ンブロット分析では、細胞は１０ｃｍのプレートに植え
付けられて、上記に記載したのと同様の処理が行われ
た。
【０２１４】（［メチル］−3Ｈ−チミジンの導入）チ
ミジンの導入は、対数期あるいは静止期の成長段階にお
ける繊維芽細胞の増殖速度をモニターするのに用いられ
た。細胞は１０ｃｍの培養皿に植え付けられ、3Ｈ−チ
ミジン（２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ；０．５μＣｉ／ｍｌ；ボ
イハイガーマンハイム（Boehinger Mannheim））ととも
に５時間インキュベートされた。続いて培養物は、トリ
プシン化され、ヘマサイトメーター（血球計算器）を用
いて計数され、ペレット化されてから、続いて１ｍｌの
０．３ＭＮａＯＨ中に懸濁された。ＮａＯＨ溶液中で３
０分間、インキュベートされた。その後全溶解物は、１
０ｍｌのシンチレーション溶液を含有するシンチレーシ
ョンバイアルにピペットで滴下され、マークＩＩＩの液
相シンチレーションシステムの６８８１型（Tracer Ana
lytic, Austin, TX）にて計数された。
【０２１５】（ＨＰＬＣによるＡＣｈの測定）ＡＣｈ
は、電気化学的検定法を用いたＨＰＬＣによって測定さ
れた。ＡＣｈは、弱いカチオンが帯電しているカラム上
にてコリンから分離された。このカラムは、ラウリルサ
ルフェート（laurylsulphate）を用いる逆相クロムファ
ーカートリッジＣ１８カラム（Chrompher Cartridge C1
8 column：１００ｍｍ×３ｍｍ．Chompack）にかけるこ
とによって準備された。免疫化されたアセチルコリンエ
ステラーゼ（タイプＶＩ−Ｓ）及びコリンオキシダーゼ
（Sigma, St. Louis, MO）を含有する酵素的な次のカラ
ムのリアクター（１０×２．１ｍｍ、Bioanalytical Sy
stems, West Lafayette, IN）を用いることによって、
ＡＣｈはハイドロジェンパーオキサイド(hydrogen pero
xide)に変換された。続いてハイドロジェンパーオキサ
イドは、電気化学的な検出器（生物分析システム）で、
Ａｇ／ＡｇＣｌからなる参照電極に対して＋０．５Ｖの
伝委に保たれている白金電極を用いて測定された。０．
１Ｍの燐酸カルシウムと０．１ｍＭのテトラメチルアン
モニウム ヒドロキサイドを含み、ｐＨ８．１に調整さ
れた移動相が、アイソクラティックポンプ（isocratic
pump：Pharmacia, Piscataway, NJ）を用いて０．８ｍ
ｌ／分の流速が供給された。
【０２１６】繊維芽細胞によって条件づけられた培地
は、０．２２μｍのミリポアフィルター（Millipore fi
lter）を通して濾過され、更にサンプルの調整を行うこ
となくその分析用のカラムに直接注入された。細胞内部
のＡＣｈのレベルは、ペレットを再懸濁し、その懸濁液
を超音波処理して、次に遠心分離によって細胞の残渣を
除去し、つづいて０．２２μｍのミリポアフィルターで
濾過することによって測定された。そして、残った濾過
物は、分析カラムに注入された。
【０２１７】（ＡＣｈの生産におけるコリンクロライド
とアセチル−ｄｌ−カルニチンの影響）繊維芽細胞を、
３５ｍｍのプレートあたり１×１０5個の細胞数で植え
付け、７０−８０％のコンフルエントになるまで生育さ
せた。続いて培地を吸引した後、適当量のコリンクロラ
イド（Sigma）あるいはアセチル−ｄｌ−カルニチン（S
igma）を含有する新鮮な培地で置き換えた。細胞はこの
培地中にて２０時間インキュベートされた。繊維芽細胞
は採取されて、ＣｈＡＴ分析あるいはＨＰＬＣによるＡ
Ｃｈの測定のためのいずれかに用いるべく調製された。
ＨＰＬＣによって分析するための培養株は、培地中に含
まれている０．１ｍＭのエゼリンを有していた。
【０２１８】（統計学上の分析）学生らのｔ−テスト及
びＡＮＯＶＡ統計学上の分析法（STATView, Palo Alto,
CA）が実験間の差異を検出するために用いられた。ホッ
ク後のダンネットｔテスト（post-hoc Dunnet t test）
は、グループ間の個々の違いを調べるのに用いられた。
【０２１９】（ラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞によ
ってｄＣｈＡＴ発現の確認）ラット−１の繊維芽細胞
は、レトロウイルス（図３４）で感染されて、Ｇ４１８
−含有の培地で選択された。感染された細胞におけるｄ
ＣｈＡＴの存在は、免疫細胞化学によってまずは確認さ
れた。感染されていないラット−１（コントロール）及
びラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞は、ビメンチン
（vimentin）及びｄＣｈＡＴあるいはビメンチン及びラ
ット−ＣｈＡＴに対する抗体を用いて同時に染色された
（図３５（ａ）−（ｆ）参照）。ビメンチンの免疫活性
は繊維芽細胞の形態を効果的に現す（図３５（ａ）−
（ｃ）参照）。ほとんどのラット−ｄＣｈＡＴ細胞は、
形態学的にコントロールとは区別がつかず、平で上皮の
ような表現型を示していた。ラット−１／ｄＣｈＡＴ繊
維芽細胞は、形態学上はコントロールと区別して観察さ
れず、伸長された形態を現していた。
【０２２０】期待どおり抗−ｄＣｈＡＴ抗体は、ラット
−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞だけでラベルされた（図３
５（ａ）と図３５（ｅ）の比較参照）。ｄＣｈＡＴの染
色は、細胞質を通って平均的に分配された。しかしなが
ら核の周りに隣接して、より大きな強度の免疫活性をも
つ領域が存在していた。かく自体は染色されなかった。
再結合しているｄＣｈＡＴの存在に対して染色されるこ
とに加えて、ラット−１細胞及びラット−１／ｄＣｈＡ
Ｔ細胞はまた、ラット−ＣｈＡＴの存在に対して染色さ
れた。コントロールの細胞あるいはラット−１／ｄＣｈ
ＡＴ細胞のいずれにおいてもラット−ＣｈＡＴの免疫染
色がなされたことの兆候はなかった（図３５（ｆ）参
照）。ラット−ＣｈＡＴの免疫活性の欠乏は、ラット−
１細胞における内性の（endogenous）ＣｈＡＴ活性が、
あったとしても非常に少ないことを示している。更に、
これらの観察は、ｄＣｈＡＴ分子がラット−ＣｈＡＴと
免疫学上、区別されることを示している。従来の生化学
的及び分子的な研究では、ｄＣｈＡＴと他の哺乳動物の
クローン化されたＣｈＡＴとの間の配列が異なっている
ことが報告されている（Berrard et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:9280-9284 (1987); Itoh et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4081-4085 (1987)参
照）。これらのデータは、ｄＣｈＡＴがＡＣｈの形成を
触媒することに加えて、ラットのＣＮＳに移植されたｄ
ＣｈＡＴ−発現繊維芽細胞の特異的なマーカーとして用
いることができることを示している。
【０２２１】ラット−１の繊維芽細胞とラット−１／ｄ
ＣｈＡＴの繊維芽細胞から得られる全ＲＮＡもまた、ノ
ーザンブロット分析によって比較され、トランス遺伝子
の発現の特異性を調べることができる。この研究から得
られる結果は明らかに、ｄＣｈＡＴをコードするｍＲＮ
Ａがラット−１／ｄＣｈＡＴの繊維芽細胞においてのみ
存在していることを示している（図３６（ａ））。ラッ
ト−１／ｄＣｈＡＴから単離されたｄＣｈＡＴ ｍＲＮ
Ａの大きさは、約６ｋｂであった。ｍＲＮＡの大きさ
は、ｄＣｈＡＴシストロンとＲＳＶプロモーターとの間
に位置しているプリアデニル化配列の欠如に起因してい
る。このことは、５’ＬＴＲから３’ＬＴＲへの転写が
妨害を受けることなく進行できるようにしている。
【０２２２】最後に、コントロールとラット−１／ｄＣ
ｈＡＴの繊維芽細胞について、ＣｈＡＴ活性が分析され
た。ラット−１細胞で検出されたＣｈＡＴのレベルは、
広くさまざまであり、活性をもたないものから、約６．
４ｎｍｏｌＡＣｈ／時間／プロテインｍｇのレベルのも
のまであった。コントロール細胞によって示された平均
的な活性は、約１．９±１．１ｎｍｏｌＡＣｈ／時間／
プロテインｍｇであった（図３６（ｂ）参照）。ラット
−１細胞で検出されたＣｈＡＴが低レベルであるのに対
して、ラット−１／ｄＣｈＡＴ細胞のＣｈＡＴ活性は、
１２００倍以上の高さであった。ラット−１／ｄＣｈＡ
Ｔ培養株の平均的な活性は、２３９７±１４９ｎｍｏｌ
ＡＣｈ／時間／プロテインｍｇであった（図３６
（ｂ））。更に、形質変換された繊維芽細胞によってｄ
ＣｈＡＴを発現させると、安定であった。感染の後１年
間、続けて継代接種を行った繊維芽細胞におけるＣｈＡ
Ｔの活性は、感染の後、１週間で分析された繊維芽細胞
におけるＣｈＡＴの活性と同じであった。
【０２２３】（ラット−１／ｄＣｈＡＴ細胞のＡＣｈの
生産及び分泌）形質転換されたラット−１細胞がインビ
トロでの分析でコリンをアセチル化する能力を持つ活性
な再結合酵素を発現することを証明する実験では、細胞
がその細胞質からＡＣｈを製造し、放出する能力を持つ
ことについては証明されない。したがって、培養培地内
及び細胞内で見いだされたＡＣｈのレベルは、電気化学
的な検出を伴うＨＰＬＣによって分析された。細胞内、
あるいは感染されていないラット−１細胞の栄養培地内
のいずれにおいてもＡＣｈは見いだされなかった（図３
６（ｃ）参照）。この結果は、ラット−１細胞において
検出されたｃＤＮＡ活性が、コリンをアセチル化する能
力がある酵素で汚染されていることに起因していること
を示唆している。カルニチンアセチルトランスフェラー
ゼはほとんどの細胞内で見いだされる酵素であり、この
酵素は、アセチル−ＣｏＡからコリンへ、アセチル基を
移すことができる（White and Wu, Biochemistry 12:84
1-846 (1973)）。コントロールの培養物においてＡＣｈ
のない場合とは対照的に、意味を持つほどのレベルのＡ
Ｃｈが、細胞内及び細胞外のいずれにおいてもラット−
１／ｃＤＮＡ培養物中では測定された（図３６（ｃ）参
照）。ＡＣｈの平均的な細胞内容量は、０．７８±０．
２３ｎｍｏｌであった。これに匹敵して培養培地におい
ては、約１．７±０．１０ｎｍｏｌのＡＣｈが見いださ
れた。
【０２２４】これらの結果は、ＡＣｈがラット−１／ｄ
ＣｈＡＴ繊維芽細胞によって製造される活性を有するこ
と、また、ＡＣｈが細胞から周囲の培養培地内に放出さ
れることを示している。
【０２２５】（ＣｈＡＴ及びＡＣｈ発現におけるコリン
クロライド及びアセチル−ｄｌ−カルニチンの効果）コ
リンクロライド及びアセチルカルニチンは、種々のモデ
ルシステムの神経あるいはシナプトソーム（synaptosom
es）からのＡＣｈの分泌を高めることが報告されている
（Gibson and Shimada, Biochem. Pharmacol. 29:167-1
74 (1980); Imperato, neurosci. Lett. 107:251-255
(1989); Jenden et al., Science 19:635-637 (1976);
Tucek, J. Neurochem. 44:1-24 (1985)参照）。これら
の薬物は、ラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞における
ＡＣｈの分泌及びＣｈＡＴの活性を調節する能力につい
てテストされた。コリンクロライドは、０．２５−５０
０μＭの範囲の濃度で用いられた（図３７（ａ）参
照）。これらの濃度は培地内（約２８μＭ）及び血清内
（２μ以下）に通常含まれている濃度に添加して調整さ
れた。外因性のコリン濃度は０．２５−５．０μＭであ
り、ＡＣｈレベルに影響を与えなかった。１０μＭで
は、細胞内のＡＣｈ濃度及び分泌されたＡＣｈ濃度のど
ちらも増加した（図３７（ａ））。コリンの細胞内レベ
ルがほぼ２倍に増加した場合、培養培地内に見いだされ
たＡＣｈの濃度は約１．８倍増加した。コリンの濃度が
増加し続けるに従って、細胞内のＡＣｈレベルは増加し
続ける。５００μＭ以上の濃度にまでコリンを添加して
も、ＡＣｈ含有量が更に増加することはなかった。
【０２２６】細胞内のＡＣｈが確実に増加することとは
対照的に、分泌されたＡＣｈは、１０μＭのコリンで８
０％増加した後、５０μＭ及び１００μＭのコリンで基
底レベルに戻って減少した（図３７（ａ）参照）。２０
０μＭのコリンでは、放出されたＡＣｈのレベルは、ほ
ぼ２．０倍に増加した。ＡＣｈは、５００μＭのコリン
まで増加し続け、その場合、コントロール（コリンが加
えられていないもの）の培養物で観察されたレベルの
２．６倍に到達した。５００μＭ以上のコリンの濃度に
なると、ＡＣｈの放出が更に増加することはなかった。
感染されていないラット−１細胞の培地にコリン（１０
ｍＭに達するまで）を添加しても、ＨＰＬＣによって測
定されたようにＡＣｈの検出が結果として得られなかっ
た。
【０２２７】ＣｈＡＴ活性におけるコリンの効果も、測
定された（図３７（ｂ）参照）。１０，２００，及び５
００μＭのコリンの濃度がテストされた。培養培地への
コリンの添加は、ラット−１／ｄＣｈＡＴの繊維芽細胞
のＣｈＡＴ活性に、重大な影響を与えなかった。
【０２２８】ＡＣｈにおけるアセチル−ｄｌ−カルニチ
ンの影響についてもテストされた。アセチル−ｄｌ−カ
ルニチンは、ラット−１／ｄＣｈＡＴの繊維芽細胞から
生産されかつ放出されるＡＣｈの量に対して影響を与え
ず、またＣｈＡＴ活性に対しても影響を与えなかった。
【０２２９】（ｄＣｈＡＴの発現における血清の欠乏及
びコンフルエントの効果）ラット−１／ｄＣｈＡＴ細胞
の特徴のほとんどは、増殖している繊維芽細胞の培養物
に導かれている。しかしながら、最終目的は移植のため
に繊維芽細胞を用いることである。脳に移植された繊維
芽細胞は、ほとんど活動的に増殖することはない。した
がって、インビトロで静止期にある繊維芽細胞の活性
は、インビボで見い出されている条件をより正確に反映
でき、そのことは評価すべきである。この評価は、脳に
植え付けられた非−分割の繊維芽細胞の活性について、
予言的な情報を提供するものである。繊維芽細胞の培養
において静止期に導くために、ラット−１／ｄＣｈＡＴ
の繊維芽細胞は血清−フリーの培地あるいは高密度のい
ずれかの条件で数日間、維持される。しかしながら両者
の方法では、チミジンの導入は有意に減少し、それはコ
ンフルエント段階に達した後、チミジンの導入が結果的
にずっと低下することになるまでの延長された期間中、
繊維芽細胞が維持されたままであった（表３参照）。
【０２３０】
【表３】 図３８（ａ）には、ＣｈＡＴ活性における血清欠乏の効
果が示されている。この処置によって、繊維芽細胞の形
態（morphology）あるいは生育状態（health）に顕著に
影響を与えることはなかった。これに対して、血清が不
足している培地においてラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽
細胞を維持した場合、トランス遺伝子の発現に対して顕
著な減少が引き起こされた。血清の欠乏は、ＣｈＡＴ活
性においてほぼ８０％の減少を生じさせた。
【０２３１】ノーザンブロット分析は、ｄＣｈＡＴのｍ
ＲＮＡの定常状態のレベルが血清の欠乏状態とともに減
少するかどうかを調べるために行われた。血清が培養物
から除かれた場合、ｄＣｈＡＴのｍＲＮＡのレベルは、
有意に減少（約４６％）した（図３８（ｂ）参照）。同
様のブロットはまた、内部のコントロールとして用いら
れたシクロフィリンに対するｃＤＮＡプローブを用いて
も調べられた（McKinnon et al., Mol. Cell. Biol. 7:
2148-2154 (1987)参照）。期待に反して、シクロスフィ
リンのｍＲＮＡの定常状態レベルもまた、血清が欠乏し
た繊維芽細胞では減少（約４３％）していた。ｄＣｈＡ
Ｔのシクロフィリンに対する吸光度を、光濃度計で測定
することによって、ｄＣｈＡＴとシクロフィリンのｍＲ
ＮＡの定常状態のレベルで見られた減少が、比例条件に
あることが確信できた。実際に、ｄＣｈＡＴのシクロフ
ィリンに対する相対的な吸光度の比率は、コントロール
と血清を欠乏した培養物との比率と同様であった（図３
８（ｃ）参照）。アクチン（actin）とＨＰＲＴのｍＲ
ＮＡもまた、血清を欠乏した繊維芽細胞において減少し
ていた。
【０２３２】血清の欠乏状態が、繊維芽細胞の一般的な
代謝産物に影響を与えることが明かであるため、他の代
わりの方法が用いられた。その方法では、繊維芽細胞が
コンフルエントに到達（コンフルエント後の日数を、Ｄ
ＰＣとする）した後、３，７，及び１４日間その繊維芽
細胞を維持しつづけることによって、静止期が誘導され
た。３ＤＰＣでは、コントロールである成長中の培養物
で観察された活性の８０％にまでＣｈＡＴのレベルが減
少した（図３９（ａ）参照）。ＤＰＣを増加させるにつ
れて、ＣｈＡＴの活性は低下し続け、７ＤＰＣ及び１４
ＤＰＣではそれぞれ、コントロールのレベルの５０％か
ら２０％に減少した（図３９（ａ）参照）。１４ＤＰＣ
を越えて細胞を維持を行っても、ＣｈＡＴ活性が更に低
下することは結果として起こらなかった。
【０２３３】コンフルエントなラット−１／ｄＣｈＡＴ
におけるｄＣｈＡＴのｍＲＮＡの量は、ノーザンブロッ
ト分析によって測定された（図３９（ｂ）参照）。成長
期の培養物（コントロール）あるいはコンフルエントな
ラット−１の培養物から単離されたｄＣｈＡＴのｍＲＮ
Ａのレベルは、明かな減少は見られなかったが、光濃度
計での分析によれば、ｄＣｈＡＴのｍＲＮＡの定常状態
のレベルが、３ＤＰＣ及び１４ＤＰＣでそれぞれ約２９
％及び約３５％が減少することが明らかにされた。興味
深いことに、相対的にｄＣｈＡＴのｍＲＮＡのレベルが
減少するにつれて、シクロフィリンのｍＲＮＡのレベル
は増加した。コントロールに比較して、３ＤＰＣ及び１
４ＤＰＣ培養物から単離されたシクロフィリンのｍＲＮ
Ａの相対的な量は、ほぼ８４％増加していた。シクロフ
ィリンの比率に対するｄＣｈＡＴの測定は、６０．５％
の減少が３ＤＰＣで起こり、また６４％の減少が１４Ｄ
ＰＣで起こることを示していた（図３９（ｃ）参照）。
全ての数は、成長期の細胞に対して決定されたｄＣｈＡ
Ｔ／シクロフィリンの比率との間に相対関係を有してい
る。
【０２３４】（コンフルエントな繊維芽細胞からＡＣｈ
が遊離する場合のコリンの効果）コンフルエントな繊維
芽細胞からのＡＣｈの遊離をコリンが高めることができ
るかどうかについて評価する目的で、ラット−１／ｄＣ
ｈＡＴ細胞が、７ＤＰＣ（コンフルエント後の日数）の
期間中コンフルエントの培地、あるいはコリンを追加
（５００μＭ）した培地のうちのいずれかの培地で維持
された。図４０には、コンフルエント段階において、Ａ
Ｃｈの生産及び放出に関してラット−１／ｄＣｈＡＴの
繊維芽細胞を維持した場合の効果について示されてい
る。７ＤＰＣのラット−１／ｄＣｈＡＴ培養物における
ＡＣｈ（細胞内及び細胞外のもの）の全体の内容量は、
有糸核分裂をしている細胞を含有する培養物において測
定された内容物の１８．９％であった。全ＡＣｈの減少
は、分子内におけるＡＣｈの減少及び放出がそれぞれ５
０．１％及び８２．１％であることが明白であった。正
常な培地で維持されているコンフルエントな培養物と対
照すると、コリンが追加された培地に維持されている静
止期のラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞は、増殖中の
ラット−１／ｄＣｈＡＴ培養物において測定されたＡＣ
ｈのレベルに匹敵するほどのＡＣｈのレベルを示してい
た（図４０参照）。細胞内のＡＣｈレベルは、外部のコ
リンが栄養培地に加えられた場合、１３８％になるまで
増加し、それは正常の培地に維持されているコンフルエ
ントな繊維芽細胞に匹敵するほどであった。同様に、細
胞内部のＡＣｈの量は、４７３％まで増加した。
【０２３５】この実験例で述べた上記の結果は、ラット
−１の繊維芽細胞を、ｄＣｈＡＴをコードしているｃＤ
ＮＡを含有するレトロウイルスベクターを用いてうまく
感染することができることを示している。更に、これら
の細胞は工業生産することができ、更に重要なことは、
ＣｈＡＴ触媒、ＡＣｈの生産を自由に行うことができ
る。増殖している繊維芽細胞からのＡＣｈの生産及び分
泌は、追加のコリンクロライドがその培養培地に加えら
れているかどうかで調節することができる。これらのデ
ータはまた、トランス遺伝子の発現が静止期の繊維芽細
胞においては減少することを示しているが、コリンはこ
れらの細胞からのＡＣｈの放出を高めることができる。
【０２３６】ラット−１／ｄＣｈＡＴ細胞は、ＡＣｈ生
産に影響を与える可能性のあるいくつかの因子がインビ
トロで研究されることができたため、開発されてきた。
ラット−１の繊維芽細胞は、それらの遺伝子型あるいは
表現型においてかりに変化するとしてもほとんど変化す
ることなく培養株を維持し続けることができるという理
由から選択された。これらの細胞におけるトランス遺伝
子の発現における安定性は、ＣｈＡＴの活性がレトロウ
イルス感染の後、１週間あるいは１年後に分析された細
胞においても同じであるという観察結果から反映され
る。ＡＣｈ−分泌性の繊維芽細胞を開発するにあたって
の短期的な見方における目的は、これらの細胞のフラク
ションを分析して、ＣＮＳに移植することである。しか
しながら、ラットのＣＮＳに移植されたラット−１及び
他の繊維芽細胞の細胞ラインは、時として腫瘍を形成す
る（Horellou et al., Neuron 5:393-402 (1990); Wolf
f etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9011-9014
(1989)参照）。対照的に比較すると、プライマリーの皮
膚の繊維芽細胞は、腫瘍の形成を誘導することなく脳
（６ｍｏｓ．）に延長された期間生存することができる
（Fisher et al., Neuron 6:371-380 (1991); Kajiwa e
t al., J. Comp. Neurol. 308:2-13 (1991)参照）。こ
のように、かりにＡＣｈ−分泌性の繊維芽細胞が脳の典
型の移植に用いられるならば、プライマリー細胞が用い
られるべきである。プライマリーの皮膚の繊維芽細胞
は、コリンや静止期にかかわらず、ラット−１／ｄＣｈ
ＡＴ細胞と同様の方法で反応するように見える（即ち、
それぞれＡＣｈの分泌は増加し、ＣｈＡＴの活性は低下
する。）。したがって、この実験例で用いられているラ
ット−１の繊維芽細胞は、同様の培養条件下で生育させ
たプライマリーの繊維芽細胞の反応に対しての厳密なイ
ンビトロでの形式で用いられる。
【０２３７】ＣＮＳ内の体液性の環境を操作することに
よって、目的とする分子の分泌を調節することができる
ならば、機能的な効果を生じるようにＣＮＳに移植され
た細胞の能力を高めることができる点で有効である。こ
こに記載されているインビトロでの実験では、コリンが
ラット−１／ｄＣｈＡＴの繊維芽細胞によるＡＣｈの生
産及び分泌を増加させる。重要なことは、コリンはま
た、静止期（コンフルエント）の繊維芽細胞からのＡＣ
ｈの生産及び遊離の増加を誘導する。この後者の観察結
果によると、ＣＮＳに移植されたＣｈＡＴ生産性細胞か
らのＡＣｈの生産を調節することのできる手段を提供す
ることが可能となる。現時点では、外来性のコリンによ
って引き起こされる細胞内、及び細胞外のＡＣｈの増加
を裏付けるメカニズムについては知られていない。しか
しながら、ＣｈＡＴ活性を測定することによって評価さ
れたのと同様に、酵素の量はコリンの細胞外濃度を増加
させたことによって影響されない。これらの結果は、反
応速度、即ちＡＣｈの形成方向の反応であって酵素が関
与していない反応速度は、コリンが追加された繊維芽細
胞培養で観察されたＡＣｈのレベルの増加が原因となっ
ている。
【０２３８】これらの結果は、例えば食餌の追加として
コリンを投与することによって、脳に移植されたｄＣｈ
ＡＴ−発現性の繊維芽細胞におけるＡＣｈの遊離が増加
する可能性があることを示唆している。コリンは、血液
−脳関門をとおることが報告されている（Cohen and Wu
rtman, Life Sci. 16:1095-1102 (1975); Cohen andWur
tman, Science 191:561-562 (1976); Wecker and Schmi
dt, Brain Res. 184:234-238 (1980)参照）。
【０２３９】トランス遺伝子生産物の分泌の実行可能な
調節に加え、遺伝子的に修飾された細胞のもう一つの望
ましい性質としては、その修飾された細胞が移植された
後安定であって、再結合遺伝子が長期間発現することで
ある。脳に移植された繊維芽細胞は、コピーできる量の
コラーゲンでそれらのまわりを取り巻いており、明らか
に増殖を終える（Kawajaら、同上文献参照1991）。現在
の研究は、ＭｏＭＬＶＬＴＲからのトランス遺伝子の発
現が血清欠乏及び接触阻害された静止期繊維芽細胞にお
いて劇的に減少することを強く示唆している。血清欠乏
及びコンフルエント状態に誘導された静止期の背後の動
力学のメカニズムは明かでないが、それらは、明らかに
異なっている。これは、ｄＣｈＡＴ ｍＲＮＡ及びＣｈ
ＡＴ活性が接触阻害された細胞を含む倍地内より血清欠
乏繊維芽細胞内のほうでより速く減少するという観測に
よって証明されている。
【０２４０】現在のデータは、いったんプライマリー繊
維芽細胞が脳内に移植されると、これらの細胞内でプロ
ウイルス性トランス遺伝子からの発現が減少することを
示唆している。この仮説は以前の研究から支持される。
この研究は、ＴＨ発現性の２０８Ｆ繊維芽細胞が、イン
ビドロではＴＨに対して免疫ラベルされうるが、いった
ん脳に移植されると効果的には染色されないということ
を示したものである（Wolffら同上文献参照１９８
９）。ＧＡＤに対する遺伝子を発現するプライマリー繊
維芽細胞は、また、それらが脳内へ植え付けられる際
に、ＧＡＤ活性での際だった減少を示す。（Chenら、J.
Cell.Biochem.,45-252-257(1991)）ＴＨ ｍＲＮＡ及び
プロテインの残渣量が後のプライマリー繊維芽細胞の植
え付け後（１０週間）に見られることが、更に最近のイ
ンシトゥでのハイブリダイゼーション及び免疫細胞化学
的研究によって示されてきている（Fisherら、同上文献
参照１９９１）。この実験例で表されている成果を結び
付ける結果から、再結合生成物量が静止期繊維芽細胞で
減少するが、細胞内にはまだ、残渣量が存在するという
ことが示される。結果によって、ｄＣｈＡＴ活性の基準
線レベル（増殖している細胞内で見つかるものの約２０
％）が静止期ラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞に存在
する、ということが示される。この活性量は、１４ＤＰ
Ｃより長い周期のコンフルエント状態において、繊維芽
細胞を維持することによっては減少しない。このよう
に、もし、トランス遺伝子の活性が十分に高められてい
ても（インビトロでのコンフルエント細胞で測定された
ような）、いったん細胞が植え付けられて残った活性量
は機能的な効力を引き出すには十分であろう。この仮説
は、基質（コリン）の量が静止期ラット−１／ｄＣｈＡ
Ｔ繊維芽細胞からＡＣｈを遊離するのを高める、という
観測から支持される。それ故、あるトランス遺伝子の発
現でのその少量は、定義された後成的な要因によって補
われるであろう。
【０２４１】結論として、これらの結果によって、繊維
芽細胞はＡＣｈを生産し、分泌するように遺伝子学的に
変えられる、ということが示される。ＡＣｈ遊離は細胞
外コリン濃度を操作することによって増加させることが
でき、また、可能なら、食餌コリンを投与することによ
って増加させることができる。これらのデータはまた、
トランス遺伝子発現がインビトロでの増殖停止とともに
著しく減少することを示している。
【０２４２】［実験例VIII］ 「静止状態にある繊維芽細胞のプロモーターの利用」こ
の実験例では、成長期（ログ）とコンフルエント（静止
期）の繊維芽細胞のプロモーターの比較した。この研究
で用いられたレポータートランス遺伝子は、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（chlorampheni
col acetyltransferase）（ＣＡＴ）である。
【０２４３】（ベクターの発現）増殖中または静止中の
プライマリー繊維芽細胞内でのトランス遺伝子の発現を
決定する様々なプロモーターの制御条件下で、ＣＡＴ遺
伝子を含むベクターの発現は得られている。ＣＡＴ遺伝
子がＳＶ４０エンハンサー配列とＳＶ４０プロモーター
の制御のもとで発現されるプラスミドｐＳＶ２ＣＡＴ(G
orman et al., Mol. Cell. Biol. 2:1044-1051 (1982);
Subramani and Southern, Anal. Biochem. 135:1 (198
3); ATCC No. 37155)と、ｐＳＶ２３２ＡＣＡＴ（図４
１、カリフォルニア州サンジエゴにあるカリフォルニア
大学のＤ、ジョリー博士とセオドア、フリードマン博士
から提供を受け、フロムとベルグの方法によって構築し
たプラスミド。J. Mol. Appl. Genet. 2:127-135 (198
3))を用いた。プラスミドｐＲＳＶＣＡＴ(Rous sarcoma
virus long terminal repeat promoter and enhancer,
Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777
-6781 (1982); ATCC No. 37152)、ｐＭＬＶＣＡＴ（図
４２、ｐＳＶ２３２ＡＣＡＴとｐＧＥＭ−３（ウィスコ
ンシン州マジソンのプロメガから購入した）とｐＮ２(E
glitis et al., Science 230:1345-1398 (1985) カリフ
ォルニア州サンジエゴにあるカリフォルニア大学のロー
ゼンベルグ博士から提供を受けた、マウスのモローニー
白血病ウイルスの長い終末反復プロモーターとエンハン
サー）とｐＣＭＶＣＡＴ（図４３、ｐＳＶ２３２ＡＣＡ
ＴとｐＯＮ２４９（カリフォルニア州パロアルトにある
スタンフォード大学医学部のＥ．Ｓ．モカルスキーから
提供を受けた）からローゼンベルグ博士が構築した、ヒ
トのサイトメガロウイルスの初期プロモーターとエンハ
ンサー）は、（カリフォルニア州サンジエゴにあるカリ
フォルニア大学の）フリードマン博士から提供された。
コラーゲンプロモーターは、テキサス州ヒューストンの
Ｍ．Ｄ．アンダーソン癌センターのド・クロムブルッグ
博士より与えられた。プラスミドｐＧ１００とｐＡＺ１
００３(de Crombrugghe and Schmidt, Methods in Enzy
mology 266:61-76 (1987))はテキサス州ヒューストンの
ド・クロムブルッグ博士より与えられ、マウスのα１
（Ｉ）とα２（Ｉ）コラーゲンプロモーター(de Crombr
ugghe, 同上文献、α２（Ｉ）；Thompson et al., Anna
ls New York Acad. Sci. 580:454-458 (1990)) α１
（Ｉ））の制御下でＣＡＴ遺伝子を含む。
【０２４４】ＣＡＴは、哺乳類に類似のものが無いバク
テリアの遺伝子なので、トランスフェクションした細胞
で見つけられたＣＡＴ活性は、トランスフェクションし
たプラスミドの存在に依存する。トランスフェクション
した細胞のＣＡＴ酵素のレベルは、プロモーターの強度
と釣合がとれている(Gorman et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 79:6772 (1982))。
【０２４５】（繊維芽細胞培養系の確立）ラットの皮膚
のプライマリー繊維芽細胞をとるために、（２００〜２
５０ｇの）２０匹の若い麻酔したフィッシャー３４４ラ
ットの腹部を７０％エタノールで洗い、どのラットから
も２５×２５ｍｍの生体材料を取り、即座に７０％アル
コールに浸す。その組織からアルコールを除去するため
に燐酸緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）に移す。その後、
生体材料は、１０ｍｇ／ｍｌコラーゲネース（Collagen
ase）を含むＰＢＳに移され、１５分間３７℃でインキ
ュベートされた。皮膚層は、良質の毛抜と３０分間酵素
により切断することにより表皮層から剥された。細胞
は、ペレットにされ、３５ｍｍ2の培養皿に移され、１
０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ
（ニューヨーク州グランドアイランドのギブコから購入
した）の最小培地（ＤＭＥＭ）で維持した。全ての培養
は、３７℃で１０％ ＣＯ2下で維持され、分裂細胞の
比が全体の３分の１、またコンフルエントな状態に８０
〜９０％になるように培養した。トランスフェクション
した繊維芽細胞はコンフルエントな状態に７０〜８０％
に成長したログフェイズの段階でＣＡＴ活性を測定し
た。コンフルエントな状態でＣＡＴ活性を定量する場合
は、１００％コンフルエントに成長した細胞を定量まで
７日間そのままにしておいた。
【０２４６】（繊維芽細胞のトランスフェクション）繊
維芽細胞は，リポフェクチン試薬(BRL,Inc.,Gaithersbu
rg,MD)を用いて、Fergner et al.,Proc. Natl.Acad.Sc
i.USA 84:7413-7417(1987)及びFelgner andHolm,Focus
11:21-25(1988)に記された方法で、プラスミドＤＮＡ対
ｐＲＳＶｎｅｏRプラスミドが１０：１の比率で選択さ
れたプラスミドでトランスフェクションされた。そのど
ちらもリファレンスに組み込まれている。それぞれの６
０mm培養皿（５×１０5細胞／培養皿）に、異なる量の
ＤＮＡと３０μｇリポフェクチン試薬を含むＯｐｔｉ−
ＭＥＭ培地（ＢＲＬ，Ｉｎｃ．）３ｍｌをもちいた。
【０２４７】適切に形質転換したものを選択するため
に、ＲＳＶ／ＬＴＲのコントロール下におけるｎｅｏR
遺伝子を含んだプラスミドＤＮＡは、レポーター遺伝子
（ＣＡＴ）を含むベクターＤＮＡと、いろいろな種類の
プロモーターの制御下で、１：１０の比率で混合され
た。一旦Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄した後、繊維芽細胞は
ＤＮＡ／リポフェクチン混合液の存在下で５時間３７℃
で培養した。その後、培地を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥ
Ｍに替え、選択前に２４−３６時間インキュベートし
た。
【０２４８】安定した形質転換細胞は、２００μｇ／ｍ
ｌのＧ４１８の存在下で選択された。トランスフェクシ
ョンされた細胞は培養皿が少なくとも５０％コンフルエ
ントになったときに継代接種された。トランスフェクシ
ョンされた繊維芽細胞は８０％よりコンフルエントにな
ったとき、１：２の比率で分割した。
【０２４９】ＣＡＴを発現したトランスフェクションさ
れた細胞は、対数増殖期及びコンフルエントになった後
の両方において、下に示すように分析された。結果は、
安定して生存したＣＡＴトランス遺伝子の発現が、細胞
がコンフルエントになった後で減少するのか増加するの
かを決定するために比較された。
【０２５０】（ＣＡＴ活性の分析）ＣＡＴ活性はスレイ
らの方法（Sleigh, Anal. Biochem. 162: 156-159 (198
7)）の変形法を用いて分析が行われた。なお、この文献
の記載はここに組み入れられる。トランスフェクトが行
われた繊維芽細胞を含む皿は、ＰＢＳを用いて洗浄さ
れ、その細胞はスクラップすることによって集められ
た。細胞は、０．２５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８
の緩衝液（１００μｌ／プレート）中で再懸濁され、超
音波をあてて溶解させた後、細胞の残骸を取り除くため
に遠心分離がかけられた。溶解性のフラクションから得
られるプロテインの濃縮物は、クマージーのプロテイン
試薬（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）を用いて
検出された。分析するために、それぞれのトランスフェ
クションから得られた等量のプロテインを用いた。細胞
の抽出液に加えた場合、１００μｌの反応混合液には、
２０μｌの８ｍＭクロラムフェニコールと５μｌの０．
５ｍＭの冷たくて［14Ｃ］アセチル−ＣｏＡを含んでい
た。３７℃で１時間、インキュベートを行った後、クロ
ラムフェニコールとそのアセチル化体は、０．１２ｍｌ
のエチルアセテートで抽出が行われた。約８０μｌの有
機層が、室温で遠心分離（１０，０００×ｇ）した後で
集められた。続いて、反応混合物はエチルアセテートを
用いて再抽出された。約１００μｌの有機層が集めら
れ、前に集められた８０μｌの有機層と混合された。１
ｍｌのパッカード インスタジェル（Packard Instage
l: Packaard, Downers Grove, IL）を有機層に添加した
後、得られたサンプルは、シンチレーションカウンター
で計数された。
【０２５１】（ノーザン ブロット分析）繊維芽細胞の
成長の対数期あるいはコンフルエント期の間、トランス
遺伝子のさまざまな発現が転写レベルで起きているかど
うかを調べるためにノーザンブロット分析が行われ、以
下に説明したとおり、合成されたＲＮＡの量が定量され
た。１０ｃｍのプレートで生育させた細胞は、７０−８
０％のコンフルエント状態あるいは７日間コンフルエン
ト状態を維持した後のいずれかの段階で、ノーザンブロ
ット分析を行うことによって、全ＲＮＡの単離のための
工程が行われた。それぞれの培養物から得られた全ＲＮ
Ａは、０．５ｍｌのグアニジジンイソチオシアネート溶
液中でその細胞を抽出することによって単離された。こ
れは、コムチンスキーらの方法（Chomczynski and Sacc
hi, in the Anal. Biochem, 162: 156-159 (1987)）に
従っておこなわれ、この文献の記載はここに組み入れら
れる。プロテインとＤＮＡは、フェノール−クロロホル
ムを用いて抽出することによってＤＮＡから分離され
た。全ＲＮＡの量は２６０ｎｍにおける吸光度を測定す
ることによって定量された。続いて全ＲＮＡのうちの１
０から１５μｇが、１．２％のホルムアルデヒド−アガ
ロースゲルにかけられた。分離されたＲＮＡは、ナイロ
ン膜（Hybridization Transfer Membrane, MSI, Inc.）
上に、１０Ｘ ＳＳＣを用いてキャピラリーで散布する
ことによってブロットされた。このブロットのプレハイ
ブリダイゼーション（５０％ホルムアミド、５Ｘのデン
ハルト溶液（Denhardt's solution）、５ＸのＳＳＰ
Ｅ、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性させた
ヘリング精子のＤＮＡ）は、４２℃で１−２時間行われ
た。
【０２５２】プローブを得るために、ｄＣｈＡＴ ｃＤ
ＮＡは、ｐＬＣｈＲＮＬから得られるｐｓｔＩ酵素を用
いてｐｃＭＶＣＡＴから活性化され、そしてマニアチス
らの下記に記載した方法によって低融解のアガロースゲ
ル上で精製された。（Maniatis et al., in Molecular
Cloning-A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Lab
oratory, Cold Spring Harbor, New York, (1982)、尚
この文献の記載は参照としてここに組み入れられる。）
32Ｐを用いてランダムプリミング（random priming：
MAniatis et al., 同上文献）によってラベルされた。
変性された放射活性ラベルされたプローブ（２分間沸騰
した後で氷冷を行ったもの）が、そのプレハイブリダイ
ゼーション溶液に直接的に添加された。ハイブリダイゼ
ーションは、４２℃で１２−２０時間行われた。その
後、ブロットは６Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用い、
室温の状態で二度洗浄され、次に１Ｘ ＳＣＣ、０．１
％ＳＤＳを用いて４２℃で二度洗浄され、最後に０．１
Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて６５℃で一度洗
浄された。すべては１０分間で洗浄が行われた。その洗
浄済みのゲルは、プラスチック性のＸＡＲフィルムでラ
ップされ、オートラジオグラフィー（ＸＡＲフィルム、
Kodak, Rochester, NY）が行われた。それぞれのＲＮＡ
バンドの強度は、ＬＫＢの高速走査 ＸＬレーザー濃度
計上（LKB Sweden）で走査することによって測定され
た。ブロットは、洗浄されることによって全ての数が除
去され、内部標準として用いることができるようにシク
ロフィリンを用いて再プローブされた。プローブは、続
くハイブリダイゼーションを行うために、５０％のホル
ムアミド、６Ｘ ＳＳＰＥ中、６５℃以上で３０分間洗
浄することによって除去された。ブロットは、プレハイ
ブリダイゼーションがうまく行くように、２Ｘ ＳＳＰ
Ｅ中にてリンスされた。
【０２５３】この実験例では、ＳＶ４０とＬＴＲプロモ
ーター、及びα２（Ｉ）コラーゲンプロモーター、即ち
コラーゲンエンハンサーを有するプロモーターと有しな
いプロモーターの両方が、対数期の繊維芽細胞と静止期
の繊維芽細胞についてテストされた。その結果は図４４
に示されている。
【０２５４】ＳＶ４０プロモーター（ＳＶ４０）を含有
する繊維芽細胞におけるＣＡＴ活性のレベルは、成長細
胞及び静止細胞に対して、それぞれ約３２４７及び約２
７１２ ＤＰＭ／μｇのプロテイン量であった。このこ
とは、約１７％の減衰である。同様に、ＬＴＲを含有す
る繊維芽細胞におけるＣＡＴ活性は、約２４％のコンフ
ルエント（対数期の細胞については３２９１ ＤＰＭ／
μｇのプロテイン量であり、静止期の細胞については２
４９４ ＤＰＭ／μｇのプロテイン量であった。）にす
ることによって減少した。対照的に、α２（Ｉ）コラー
ゲンプロモーターを含有する繊維芽細胞で測定されたＣ
ＡＴのレベルは、静止期で増加したが、これらの細胞か
らの全体を通しての発現量は低下した。エンハンサーを
持たないα２（Ｉ）コラーゲンプロモーター（Ｃｏｌ
ｌ）を含有する繊維芽細胞のＣＡＴ活性は、対数期の細
胞及び静止期の細胞に対してそれぞれ約１３ＤＰＭ／μ
ｇのプロテイン量及び約７５ ＤＰＭ／μｇのプロテイ
ン量であった。このことは約５７６％の増加であること
を示している。コラーゲンエンハンサーを有するα２
（Ｉ）コラーゲンプロモーター（Ｃｏｌｌ（Ｅ）： Ros
si and de Crombrugghe,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
84: 5590-5594 (1981)）を含有する繊維芽細胞では、
ＣＡＴのレベルが、対数期の繊維芽細胞では４０５ＤＰ
Ｍ／μｇのプロテイン量、静止期の繊維芽細胞では６０
６ＤＰＭ／μｇのプロテイン量であることを示してい
た。このことは、約１４９％増加したということができ
る。
【０２５５】これらの結果から、ウイルス性のプロモー
ターから得られるトランス遺伝子の発現は、静止期の繊
維芽細胞においては減衰することが判明している。これ
に対して、α２（Ｉ）コラーゲンプロモーターからのト
ランス遺伝子の発現は、静止期の細胞で増加する。脳に
移植された繊維芽細胞が分裂することがないため、安定
なトランス遺伝子の発現を最大にする一つの方法とし
て、静止期の繊維芽細胞において通常の活性を有するプ
ロモーターを用いることによる方法があげられる。α２
（Ｉ）コラーゲンプロモーターは、そのようなプロモー
ターである。更に、Ｃｏｌｌ（Ｅ）プロモーターのエン
ハンサーは、好適な条件下でトランス遺伝子の発現を行
わせることにおいて、α２（Ｉ）プロモーターと同様の
効果を有している。
【０２５６】これらの結果は、分割が終了している細胞
が体内に移植された場合に、その細胞から生じるトラン
ス遺伝子の発現を増加することによって、治療性のトラ
ンス遺伝子の長期間にわたっての安定な発現を促進する
ことのできるような方法を示している。
【０２５７】［実験例ＩＸ］ 「サイトカイン及び抗−炎症性薬物によるプロモーター
の調整」たくさんの単核の食細胞及びリンパ球は、血液
−脳関門を通過した後、ＣＮＳを侵害する。これは、例
えば脳に細胞の移植を行った後などに起こる。これらの
細胞は、細胞外部の周りの領域にサイトカインを分泌す
ることが知られている。移植された材質周辺へのこれら
の細胞の侵入及び蓄積は、移植後１週間以内に観察され
た。繊維芽細胞は種々のサイトカインに反応することが
わかっているため、プライマリーラットの繊維芽細胞に
おいて、ＬＴＲ−作動性のトランス遺伝子の発現を調節
するサイトカインの役割を評価するためにこの実験例は
行われた。
【０２５８】この実験例は、次の２つの利用について説
明されている。１）ＬＴＲ−作動性のプロウイルスｍＲ
ＮＡの定常状態レベルにおいてサイトカインの効果を除
去するための抗−炎症薬物であるデキサメタゾン（dexa
methasone）を利用すること；及び、２）移植後の脳内
に存在する高レベルのサイトカインの利点を活用するた
めに、コラーゲンエンハンサー（Ｃｏｌｌ（Ｅ））を伴
うα２（Ｉ）コラーゲン（Ｃｏｌｌ）プロモーターを利
用すること、の２種である。この実験例において、利用
されるトランス遺伝子は、ドロソフィラ（Drosophila）
コリントランスフェラーゼ（ｄＣｈＡＴ）及びクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）で
あった。
【０２５９】（方法）この実験例で用いられる方法は、
上記の実験例VIIIで記載されているとおりであるが、以
下の例外が含まれている。
【０２６０】（リポフェクション（lipofection））リ
ポフェクションの方法は、前記の実験例VIIIに記載され
たとおりであった。この実験例で繊維が細胞をトランス
フェクトするのに用いられるプラスミドは、ｐＭＬＶＣ
ＡＴ（ＬＴＲプロモーターは、カリフォルニア州、サン
ジエゴ、ユニバーシティ オブ カリフォルニアのフリ
ーマン博士から提供を受けた。）、及びｐＲ４０（Ｃｏ
ｌｌ（Ｅ）プロモーター及びエンハンサー（Rossi and
de Chombrugghe, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5590
-5594 (1987),及びテキサス州、ハウストン、ＭＤアン
ダーソン癌センターのデ クロモバルジ（Dr. de Cromb
rugghe）博士から提供を受けた。）であった。ｄＣｈＡ
Ｔ−繊維芽細胞は、前記実験例VIIにおいて上記に記載
されたようなレトロウイルスで感染することによって形
質導入された。
【０２６１】（繊維芽細胞の培養物）プライマリー皮膚
の繊維芽細胞の培養物は、以下の点で異なっているが、
上記の実験例VIIIに記載されたように構築された。ｄＣ
ｈＡＴ−繊維芽細胞は、１０％のＦＢＳ及び２００μｇ
／ｍｌのＧ４１８が補充されたＤＭＥＭを用いた３５ｍ
ｍの組織培養皿中でコンフルエントになるまで生育させ
た。コンフルエントに到達した時点で、２％の血清を含
有する培地に移して、更に７日間維持させた。ｐＭＬＶ
ＣＡＴあるいはｐＲ４０プラスミドでリポフェクトされ
た繊維芽細胞は、ｄＣｈＡＴ−繊維芽細胞について記載
されているように、コンフルエントになるまで増殖し
た。しかしながら、コンフルエントに到達した後は、こ
れらの細胞は１０％の血清を含有する培地で４日間維持
させた。それらの細胞は続いて、最後の３日間は２％の
血清を含有する培地に移された（コンフルエントに達し
た後、全体では７日間であった。）。
【０２６２】（サイトカインあるいは抗−炎症性薬物を
用いるトランスフェトされた繊維芽細胞の処理）サイト
カインは、コンフルエントに達した後、７日目に加えら
れた。ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（３
０μ／ｍｌ）、及びＴＨＦα（１５０ｎｇ／ｍｌ）が、
２４時間培養物とともにインキュベートされた。更に、
抗−炎症性薬物であるデキサメタゾン（２５μＭ）が繊
維芽細胞にのみに、及びＴＧＦβ１及びＩＬ−１β１の
存在下で加えられた。その細胞はその後、ノーザンブロ
ット分析（ｄＣｈＡＴ−繊維芽細胞について）が行わ
れ、また、ＣＡＴ分析（ＬＴＲあるいはＣｏｌｌ（Ｅ）
プロモーターを含有する細胞について）が行われた。Ｉ
ｎｆγは、他のサイトカインに対して上記に記載された
ようにインキュベートされた。しかしながらいくつかの
実験においては、Ｉｎｆγを含有する培地が吸引され、
新鮮な２％の血清を含有する培地を用いて置き換えられ
た。細胞はこのように、更に４８時間維持され、その後
ノーザンブロット分析あるいはＣＡＴ分析が行われた。
この手法は、Ｉｎｆγが機能を発揮するこれだけの時間
を必要とすることを測定するために用いられた。
【０２６３】コンフルエントな状態にあるｄＣｈＡＴ発
現性の繊維芽細胞は、上記に記載されたＴＧＦβ１、Ｔ
ＮＦα、ＩＬ−１βあるいはＩｎｆγとともにインキュ
ベートされた。これらの培養物から得られる全ｍＲＮＡ
は、ノーザンブロット分析によってプロウイルス性のｍ
ＲＮＡを選択的に認識するｃＤＮＡフラグメントを用い
て単離され、プローブ操作された。図４５（ａ）は、Ｔ
ＧＦβ１（レーン２）及びＩＬ−１β（レーン３）の両
者が、プロウイルス性のｍＲＮＡの定常状態レベルを有
意に減少させることを示している。一方、ＴＮＦα（レ
ーン４）は、プロウイルス性のｍＲＮＡのレベルに対し
て有意の影響を生じさせなかった。図４５（ｂ）は、ｄ
ＣｈＡＴ ｍＲＮＡの容量に対するＩｎｆγの影響につ
いて示している。２４時間たった後、プロウイルス性の
ｍＲＮＡの定常状態においては変化が見られなかった
が、ｍＲＮＡのレベルはＩｎｆγが除去されて新鮮培地
で置き換えられた後４８時間後には顕著に減少してい
た。
【０２６４】これらの結果は、サイトカインがインビト
ロでのＬＴＲ作動性遺伝子ｄＣｈＡＴの発現に対して影
響を与えることを示している。
【０２６５】図４６はノーザンブロット分析の結果であ
り、そのブロット分析では、ＬＴＲ−作動性のｄＣｈＡ
Ｔ−生産性繊維芽細胞をコンフルエント状態に導くＴＧ
Ｆβ１及びＩＬ−１βの複合投与を行うことによってそ
の繊維芽細胞中に含まれるプロウイルス性のｍＲＮＡの
量を少なからず減少させることが示されている。これと
は対照的にデキサメタゾンは、ノーザンブロット分析に
よって検出されるｄＣｈＡＴのｍＲＮＡ量を増加させ
た。ｄＣｈＡＴ−繊維芽細胞をかりに、デキサメタゾ
ン、ＴＧＦβ１、及びＩＬ−１βと同時に２４時間接触
させた場合、プロウイルスのｍＲＮＡのレベルはコント
ロール培養物において検出されたレベルと同じであっ
た。これらの結果は、抗−炎症性薬物、即ちデキサメタ
ゾンなどのステロイドを含む抗−炎症性薬物が、インビ
トロでのプロウイルスのｍＲＮＡの定常状態レベルにお
いてＴＧＦβ１及びＩＬ−１βの否定的な影響が加わる
のを妨げることができることを示唆している。
【０２６６】上記に記載されているように、数種のサイ
トカインは、ＬＴＲからのトランス遺伝子の発現を低め
るように調節を行う。繊維芽細胞を脳に移植した後での
これらのサイトカインの効果を軽減するための一法とし
ては、例えばデキサメタゾンなどの抗−炎症性薬物を用
いて炎症性反応を抑えることが挙げられる。抗−炎症性
薬物の投与を必要としない別の方法としては、サイトカ
インの存在によって影響されないか、あるいはできるだ
け高められるような一種あるいはそれ以上のプロモータ
ーを使用することである。このようなプロモーターの一
つには、α２（Ｉ）コラーゲンプロモーターがある。こ
れらの実験例では、ＣＡＴ遺伝子がレセプターとして用
いられた。
【０２６７】図４７には、静止期の繊維芽細胞の培養物
において、ＣＡＴの発現に対してのＴＧＦβ１、ＴＮＦ
α、ＩＬ−１β及びＩｎｆγの効果が示されている。尚
そこではＣｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハンサーが
トランス遺伝子の発現（Ｃｏｌｌ（Ｅ）−繊維芽細胞）
を進行させるために使用された。これらの実験例におい
てその培養物は、コンフルエントな培養状態に達した後
の７日間のうち最後の３日間は、２％の血清を含有する
培地で維持された。驚くべきことに、２％の血清を含む
培地で維持されていたＣｏｌｌ（Ｅ）−繊維芽細胞の培
養物のＣＡＴ活性は、１０％の血清を含む培地で維持さ
れていた比較対照の培養物のＣＡＴ活性よりも４４０％
も大きかった（図４７（ａ））。この活性は、ＬＴＲに
対して測定された活性にまで達していた（図４４（実験
例ＶIII）及び図４７（ａ）と比較される。）。
【０２６８】サイトカインのテストを行った場合では、
ＴＧＦβ及びＩＬ−１βはＣＡＴ活性に有意の影響を与
えなかった（図４７（ｂ）参照）。一方、ＴＮＦαに接
触させた場合では、ＣＡＴ活性が約３２％増加するとい
う結果を示した。対照的に、ＩＮＦγとともにインキュ
ベートしたＣｏｌｌ（Ｅ）−繊維芽細胞では、ＣＡＴ活
性はほぼ５３％の減少を示していた。この測定は、Ｉｎ
ｆγが除かれて、２％の血清を含む新鮮な培地で置き換
えられた後の４８時間たった時点で行われた。
【０２６９】（Ｃｏｌｌ（Ｅ）を用いるインビボでの発
現）ＬＴＲ−ＣＡＴ細胞（繊維芽細胞であって、ここで
はＣＡＴ遺伝子がＬＴＲによって作動される。）及びＣ
ｏｌｌ（Ｅ）−ＣＡＴ細胞（繊維芽細胞であって、ここ
ではＣＡＴ遺伝子がα２（Ｉ）コラーゲンプロモーター
−コラーゲンエンハンサーによって作動される。）は、
上記実験例VIIIに記載されたような３４４匹の成体のフ
ィッシャーラットの線条体に移植された。３回の（３）
μｌのＬＴＲ−ＣＡＴあるいはＣｏｌｌ（Ｅ）−ＣＡＴ
細胞（２００，０００個の細胞／μｌ：全体では６０
０，０００個の細胞）が注入された。ＬＴＲ−ＣＡＴ繊
維芽細胞が右側に注入され、Ｃｏｌｌ（Ｅ）−ＣＡＴ細
胞が左側に注入された。移植から１週間から４週間の時
点で、その動物を潅流し、脳が切断されて免疫組織化学
的に調べるように加工された。抗体である抗−クロラム
フェニコールが１：２０００の希釈度で用いられ、５プ
ライム−３−プライム、ボルダー社（Boulder, Co.）か
ら購入された。
【０２７０】図４８において示されているように、強く
染色された多くのＣＡＴ−ポジティブな繊維芽細胞が、
ＬＴＲ−繊維芽細胞あるいはＣｏｌｌ（Ｅ）−ＣＡＴ繊
維芽細胞のいずれかを含有する移植後１週間の移植片に
おいて観察された（図４８（ａ）、図４８（ｂ）の白い
矢印参照）。染色の強度が、２種の移植タイプ間で比較
された。４週間の時点でのＣＡＴの染色は（図４８
（ｃ）及び４８（ｄ）における白い矢印参照）、Ｃｏｌ
ｌ（Ｅ）−ＣＡＴ繊維芽細胞の移植片ではより強く現れ
た。この時点では、全ての移植片に関連して更に多くの
食細胞が認められた（矢じりは、移植宿主の脳の界面(i
nterface)を示している。）これらの結果は、Ｃｏｌｌ
（Ｅ）プロモーター−エンハンサーが、脳へのドナー細
胞の移植の後でのトランス遺伝子の発現を、より安定で
かつより強くすることができることを示唆している。４
週間目の移植片の中心に食細胞が存在することは、サイ
トカインが高レベルでまだなお存在しているのであろう
ということを示している。このように、ＬＴＲに比較し
てＣｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハンサーからの方
がより強く発現することの理由の一つとしては、サイト
カインが発現を増加するように働くことが考えられる。
【０２７１】この実験例で得られたデータは、１）ある
サイトカイン（例えばＴＧＦβ１、ＩＬ−１β、及びＩ
ｎｆγ）は、プロウイルス性のｍＲＮＡのレベルに対し
て否定的な影響を及ぼすこと、２）デキサメタゾンは、
プロウイルス性のｍＲＮＡの定常状態レベルに対するＴ
ＧＦβ及びＩＬ−１βの否定的な影響を打ち消すことが
できること、３）Ｃｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハ
ンサーは、移植後の脳に見いだされるサイトカインのレ
ベルを高めるように利用することができること、を示し
ている。
【０２７２】サイトカインがＬＴＲからの発現を抑制的
に調節できるという観察結果は、脳に植え付けられた繊
維芽細胞がサイトカインによって影響される可能性があ
ることを示唆している。このサイトカインは、移植後に
脳に浸透して来る血液由来の単核細胞である食細胞及び
リンパ球によって生産される。小膠細胞（Microglial）
および内皮細胞(endothelial cells)は、脳内における
サイトカインのもう一つの源であり、このシナリオに寄
与できる。このように、移植された繊維芽細胞における
ＬＴＲ−作動性のトランス遺伝子の発現は、結果的に移
植後の経過時間で起こるであろう。ＬＴＲにおけるサイ
トカインの望ましくない抑制的な働きを打ち消すための
一つの方法として、サイトカインの生産を減少させる抗
−炎症性の薬物等の分子を用いる方法が挙げられる。こ
の手法は、移植された繊維芽細胞でのトランス遺伝子の
発現の安定性を増加させるだけでなく、免疫応答を減少
させることによって細胞の生き残りに対して貢献するこ
ともできる。
【０２７３】これに代わるアプローチとして、サイトカ
インによって効果を高めるように調節される機能を有す
るか、あるいはサイトカインによって少なくとも影響さ
れないプロモーターを用いることによって、サイトカイ
ンの効果を利用する方法が挙げられる。この実験例は、
ＴＧＦβ１及びＴＮＦαがＣｏｌｌ（Ｅ）−繊維芽細胞
におけるトランス遺伝子の発現に対して否定的な影響を
与えないこと（ＣＡＴの活性によって評価されたよう
な）を示している。対照的に、ＴＮＦαは発現を増加さ
せる。Ｉｎｆγは、ＬＴＲに対する影響（即ちトランス
遺伝子の発現を減少させること。）と同様に、Ｃｏｌｌ
（Ｅ）プロモーター−エンハンサーに対しても影響を及
ぼす。従って、シクロスポリン等の免疫抑制剤を用い
て、Ｔ−リンパ球から得られるＩｎｆγなどのサイトカ
インの遊離を調節することが更に必要とされる。
【０２７４】このデータはまた、Ｃｏｌｌ（Ｅ）プロモ
ーター−エンハンサーからの発現が、１０％の血清を含
有する培地に比較して、２％の血清を含有する培地に維
持されている細胞においての方が好くなからず増加する
ことを示している。発現レベルは、ＬＴＲを含む繊維芽
細胞で観察された観察レベルと比較される。体内に移植
された繊維芽細胞は、培養時よりも少ない血清要素にさ
らされるであろう。従って、ある条件下では、Ｃｏｌｌ
（Ｅ）プロモーター−エンハンサーからの発現を、トラ
ンス遺伝子の発現を進行させるのに現在用いられている
最強のウイルス性プロモーターと同等にすることができ
るであろう。
【０２７５】［実験例Ｘ］ 「成体の軸索切断された神経の再生」本実験例において
は、成体のラットのＣＮＳにおける栄養ファクターに応
答する異常の軸索の成長を維持する基質を評価する新し
いインビボ モデルが提供される。これに加えて、軸索
切断後のラットの中隔の神経の再生能力に関するNGFの
重要性が評価される。
【０２７６】本実験例は、成体の星状細胞が、遺伝学的
に修飾されたプライマリーの繊維芽細胞の線状体内の移
植片からＮＧＦにより供給される場合には、軸索成長の
ために許容すべき基質として供することができることを
指摘する。これに加えて、軸索切断後のラットの中隔の
神経の再生能力に関するＮＧＦを分泌する修飾されたプ
ライマリーの繊維芽細胞の移植片の効果が評価される。
【０２７７】上記した実験例ＩＩで詳述したごとき調製
されたＮＧＦを発現させかつ分泌する遺伝学的に修飾さ
れたプライマリーの皮膚繊維芽細胞からなる移植片は、
成体ラツトの線条体に移植された。プライマリーの繊維
芽細胞はフィメールフィシャー３４４ラツトの皮膚生検
から得られた。細胞は標準的な培養条件の下で養われ、
胎生小牛漿液を３％含むＤＭＥＭを週３回供給された。
プライマリーの細胞は上記実験例ＩＩで詳述したごと
く、マウスβ−ＮＧＦ、ｐＬＮ．８ＲＬＮに起因するｃ
ＤＮＡを含むミューラン レトロウィルス ベクターで感
染された。感染された細胞は、ネオマイオシン アナロ
グ Ｇ４１８で選択された。移植するための細胞を分離
する以前に、培養媒体のサンプルはコントロールおよび
感染された細胞から除かれた。感応的な２部位イムノア
ッセイ（ボーエルヒンガ−マンハイム）を採用して、感
染された細胞が１５４−１７３ｐｇ ＮＧＦ／ｈｒ／１
０５細胞を生成しかつ分泌したことを測定された。ＮＧ
Ｆのレベルは コントロール媒体では検出され得なかっ
た。フィメール フィッシャー ラット（重量約１７５
〜２００ｇ）は、ケタミン−キシラミンの混合物（ケタ
ミン２５ｍｇ／ｍｌ；ロンパン１．３ｍｇ／ｍｌ；アセ
プロマジン０．２５ｍｇ／ｍｌ）で麻酔された。頭部は
剃られ、定位のフレームに配置された。手術が開始され
る以前に、頭部に殺菌剤が付与された。各動物はグラフ
ティング液（ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２の１μｇ／ｍ
ｌと０．１％のグルコースを追加されたホスフェード
バッファーサリン）の３μｍ中の３×１０5細胞を線条
体内に受けた。：右側にはＮＧＦ−生産細胞、左側には
非感染細胞。１，３および８週間の生存期間の後、動物
は麻酔をかけられ、０．１Ｍホスフェート バッフアー
の４％パラフォルムアルデヒドおよび０．１％グルタル
アルデヒドを噴門を通して潅流された。移植片を通した
水平状または矢状縫合セクションは、フリージングミク
ロトームで切断されてＮＧＦ受容体の免疫反応のために
処理されるか、またはビブラトームで切断されて電子顕
微鏡実験のために処理された。
【０２７８】遺伝学的に修飾された細胞は右線条体に注
入され、また非感染のコントロール細胞は左線条体に注
入された。移植後１週間、ＮＧＦ受容体−免疫反応軸索
の集網はNGF生産繊維芽細胞を構成する線条体の移植片
の尾側極で明確であり、それ故僅かな数の大きくなりか
つ膨れた免疫反応軸索のプロフィルが非感染コントロー
ル細胞の移植片の近くで観察された（図４９（ａ）およ
び図４９（ｂ））。３週間でＮＧＦ生産移植片を取り巻
く免疫反応軸索の密度は劇的に増大した。わずかなＮＧ
Ｆ受容体−免疫反応プロフィルはＮＧＦ生産細胞を構成
する移植片を完全に満たし、また移植片を取り巻く軸索
プロフィルの集網はもはや存在しなかった（図４９
（ｄ））。これらの免疫反応プロフィルは単一軸索より
大きくて明瞭であり、通常縦形で広がった。非感染のプ
ライマリの繊維芽細胞の移植片は移植後３〜８週間で免
疫染色された軸索プロフィルのそのようなパターンを欠
くけれども、ＮＧＦ受容体免疫反応はわずかな血管に制
限された（図４９（ｃ））。
【０２７９】超微細構造の実験は、全ての線条体内の移
植片が広範囲のラフな内質細網をともなうプライマリの
繊維芽細胞およびコラーゲンで満たされた細胞外マトリ
ックスで構成されていることを示した（図５０）。毛細
血管は、これらの移植片内に広範囲な血管集網を与えた
非穿孔の内皮細胞を構成した（図５０）。移植後３およ
び８週間で、反応性星状細胞は移植片を完全に包み込ん
だ。これらの星状細胞のプロフィルは、移植片の周囲に
並列するこれらの表面に明瞭な基底ラミナをもった。Ｃ
ＮＳ神経網と非ＣＮＳの移植片間のこの関門は、神経網
の貫通している傷に続いて通常発見される「グリアル
スカア（gleal scar）」の特性を示した。反応性の星状
細胞の突起もまた移植片の物質内に広がり、しばしば毛
細血管に強く結合された。ＮＧＦ生産移植片の細胞外の
マトリックス内のみにおいて、無髄軸索の管束が移植片
のいたるところに散在された。明確で球形の小水庖がし
ばしばよく観察された。フィラメントを沢山もつ反応性
星状細胞の突起は、これらの軸索のプロフィルを回旋型
に包み込むことを発見された（図５１（ａ）、図５１
（ｂ））。基底ラミナは全体の軸索−神経膠の複合体を
取り巻き、軸索と星状細胞間の対向する形質膜では明確
でなかった。これらの軸索−神経膠配列の発生は、移植
後３週間より８週間において大きかった。軸索のプロフ
ィルは非感染のコントロール細胞の移植片内では発見さ
れなかった。
【０２８０】これらのデータは、ＮＧＦ受容体−陽性軸
索がＮＧＦ生産のプライマリの皮膚繊維芽細胞の移植片
に対して成長することを示す。他方、非感染細胞の移植
片は、同様の神経の応答を顕在化させない。しかしなが
ら、細胞の両タイプの移植組織は３週以前に反応性星状
細胞を、移植片を取り巻きかつカプセルに包み込むよう
に誘発する。この神経膠の関門の存在にもかかわらず、
反応性星状細胞の突起の精巧な配列に沿って広がる無髄
軸索は、ＮＧＦ生産移植片内でのみ発見された。これら
の軸索はもっぱら、明瞭な基底ラミナを欠く星状細胞の
表面に閉じ込められた。プライマリの繊維芽細胞の移植
組織の細胞外マトリックスは軸索の成長のための他の伝
導基質、例えばコラーゲン、ラミニンおよびフィブロネ
クチン等からなるけれども、移植片内で成長する軸索は
これらの成分とは結合しなかった。これらの全ては、イ
ンビトロでの軸索の成長のための伝導基質として予め指
摘された。従って、遺伝学的に修飾されたプライマリの
皮膚繊維芽細胞の移植片を浸透するＮＧＦ感受性の軸索
にとっては、反応性星状細胞は軸索の伸長のために好ま
しい基質である。
【０２８１】これらの結果は、成体ＣＮＳにおける成熟
した反応性星状細胞が、軸索の成長を阻止するよりむし
ろ促進する基質として作用することができることを示
す。ＮＧＦを生産する遺伝学的に修飾された細胞の内線
条体の移植片を採用するためには、好結果の軸索の伸長
は必要な屈性および栄養維持を要求することをこれらの
データは示している。従って、成長促進ファクターの有
効性は、成長のための基質ではなく、再配列に対して大
きく影響することが明かである。
【０２８２】軸索の再配列での移植片の効果を試験する
ために、インビボでNGFを発現させるべき遺伝学的に修
飾されたプライマリの細胞が確立され、また軸索切断さ
れたコリン作用性の中隔の神経の栄養維持を提供するた
めに示された。インビボでNGFの細胞源を提供するため
に、実験例ＩＩで詳述されたごとく調製されたＮＧＦを
発現させるべく遺伝学的に修飾されたプライマリの皮膚
繊維芽細胞はコラーゲンのマトリックスに懸濁され、吻
側の海馬状隆起に突出する中隔の軸索のための主要なル
ートである、フィンブリエ円蓋（ＦＦ）通路の片方だけ
の切除により形成された空洞に配置された。
【０２８３】麻酔の下で、プライマリの皮膚繊維芽細胞
はフィメル フィシャー３４４ラツトの腹部の腹壁の生
検から得られ、これらの細胞は標準の培養条件の下で維
持された。マウスβ−ＮＧＦ、ｐＬＮ．８ＲＮＬに起因
するｃＤＮＡを含むレトロウィルス ベクターを使用し
て、プライマリの細胞が培養中に感染され、これらの細
胞によるＮＧＦ生産物はその後２部位イムノアッセイ
（実験例ＩＩで詳述）を使用して評価された。細胞をコ
ラーゲンのマトリックス中に懸濁するために、ＮＧＦ生
産のプライマリの細胞およびコントロールの非感染のプ
ライマリ細胞の培養物がホスフェート−バッファド サ
リンで濯がれ、トリプシン化され、そしてＤＭＥＭ中に
懸濁された。細胞はその後計数されて、総量１０6の細
胞が媒体中で等分化された。ラットテール（シグマ）か
らのタイプＩコラーゲンはその最終濃度が３％となるよ
うに０．１％酢酸で溶解された。よりアルカリ性の媒体
を調製するために水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）が細胞
の懸濁液に添加され、その後コラーゲンが添加され（最
終濃度１％）、混合され、そして遠心分離器のチューブ
に等分化された。コラーゲン／繊維芽細胞のマトリック
スはその後３７℃で４８時間インキュベートされた。４
０個のフィメル フィシャー３４４ラット（重量約１７
５ｇ）が手術のために、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）、
ロンパス（４．０ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン
（５．６ｍｇ／ｋｇ）の混合物を使用して麻酔をかけら
れた。これらの頭部が剃られ、動物はコッフ定位フレー
ムに配置された。手術は実験例ＩＩで詳述しているよう
に２つのステップの手順であった。第１に、帯状皮質を
通じる片方だけの吸引の損傷およびＦＦ経路が立体鏡視
界の下で形成された。その後、コラーゲン／繊維芽細胞
のマトリックスは小片に切断され（約２〜３ｍｍ3）、
傷つけた空洞に配置された。他の動物はFFの損傷のみを
受けた。動物は手術から回復し、３，４または８週間生
存した。これらの生存期間の後、動物は上記したごとく
深く麻酔をかけられ、ホスフェートバッファー（超微細
構造の場合のために０．１％のグルタルアルデヒドが添
加された）の４％パラホルムアルデヒドを噴門を通して
潅流された。脳が除去され、ポストフィックス（post f
ixed）され、 フリージングミクロトームまたはビブラ
トームのいずれかで切断され、そして各片（厚み４０〜
５０μｍ）はアセチルクロリンエステラーゼ組織化学、
免疫組織化学および超ミクロトーミイのために処理され
た。
【０２８４】完全な片方だけのＦＦの損傷を受けかつ空
洞内に移植片を有する動物のみが、以下の評価を受け
た。
【０２８５】１）軸索切断に続く中隔の神経の救済 ２）移植片および海馬状隆起のアセチルクロリンエステ
ラーゼ（ＡＣｈＥ）組織化学的およびＮＧＦ受容体の免
疫化学的染色 ３）移植片のニツスル染色、およびチロシン ハイドロ
キシラーゼ（ＴＨ）、神経膠繊維のアシデック プロテ
イン（ＧＦＡＰ）およびラミナの免疫化学的染色 ４）損傷の同側の海馬状隆起およびＮＧＦ生産またはコ
ントロール非感染の繊維芽細胞のいずれかの移植片から
の蛍光マーカーの逆行性輸送 ５）移植片の超微細構造の組織 ６）ＮＧＦ生産移植片の移植片と同側の輸入路遮断され
た歯状脳回におけるＡＣｈＥ染色の超微細構造の分配。
【０２８６】組織化学的および免疫化学的検出は次のご
とくなされる。コラーゲン／繊維芽細胞の移植片に起因
する切片は０．５％チオニン水溶液を使用してニッスル
物質にて染色され、ヘドリーン等の修飾方法（J.Histoc
hem. Cytochem.33:134-140 1985）を使用してＡＣｈＥ
にて組織化学的に染色され、およびラミニン、神経膠繊
維アシデックプロテイン（ＧＦＡＰ）およびチロシン
ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）にて免疫組織化学的に染色さ
れた。中隔に起因する切片はＮＧＦ受容体にて免疫組織
化学的に染色され、海馬状隆起に起因する切断片はＡＣ
ｈＥにて組織化学的に、ＮＧＦ受容体およびＴＨにて免
疫組織化学的に染色された。
【０２８７】ＮＧＦ受容体、ＴＨおよびＧＦＡＰの免組
織化学的検出は同じプロトコルを使用した。切断片は初
めに０．６％ハイドロジェン パーオキサイドの水溶液
で３０分間処理され、ＴＢＳで簡単に濯ぐがれ、そして
ＴＢＳ、３％の規定のウマ血清および０．２５％トリト
ン−Ｘを含む溶液中で１時間インキュベートされた（こ
の溶液は全ての抗体を希釈するために使用された）。そ
の後、切片は以下の抗体の１つを含む溶液中、４℃で４
８時間インキュベートされた。ＮＧＦに対するモノクロ
ナール １９２ ＩｇＧ（Chandler et al.,J.Biol.Che
m.259:6882-6889 1984, 1:100 dilution）、ＴＨに対す
るモノクロナール ＩｇＧ（Boehringer-Mannheim; 1:2
50）、およびＧＦＡＰに対するモノクロナール ＩｇＧ
（Amersham,1:100）。コントロール切片はプライマリの
抗血清を欠いている溶液中でインキュベートされる。全
ての切片はその後バッファーで濯すがれ、ビオチン化さ
れたウマ抗−マウスＩｇＧ（1:167）中、室温で１時間
インキュベートされた。その他の濯すぎの後、切片はア
ビディン−ビオチン コンプレックス（ABC;VectorLabor
atories）中で１時間インキュベートされた。これらは
その後再度濯がれ、ＴＢＳ中に０．０２５％のジアミノ
ベンジジン テトラハイドロクロライド、０．５％のニ
ツケルクロライド、０．１８％のハイドロジェン パー
オキサイドを含む溶液中で５分間反応された。切片をバ
ッファー中で濯ぐことによって、その反応は停止され
た。
【０２８８】移植片に起因する切片はまた、ラミニンに
て免疫組織化学的に染色された。再び、切片は初めに
０．６％のハイドロジェン パーオキサイド水溶液で処
理され、濯がれ、そして３％の規定のヤギ血清および
０．２５％のトリトン−Ｘを含むＴＢＳの溶液中でイン
キュベートされた。切片はその後ウサギ抗−ヒト リミ
ニンＩｇＧ（１：８００希釈）の添加された上記と同様
の溶液中、４℃で４８時間インキュベートされた。コン
トロール切片はプライマリの抗血清を欠いている溶液中
でインキュベートされた。それらはその後濯がれ、ビオ
チン化されたヤギ抗−ウサギＩｇＧ（１：２２０）中、
室温で１時間インキュベートされた。その他の濯ぎの
後、切片はＡＢＣ中でインキュベートされ、上記と同様
に反応された。
【０２８９】FFの片方だけの切除、およびコラーゲンと
プライマリの繊維芽細胞を構成する移植片の配置の後３
週間および８週間、ＮＧＦ受容体−免疫反応性神経の個
体群において注目された減少が、同じ側の内側の中隔に
おいて明かであった（図５２ａおよび５２ｂ）。内側中
隔（ＭＳ）および移植片（Ｇ）および海馬状隆起の歯状
脳回（ＤＧ）を通して引かれたラインは、この図におけ
る顕微鏡写真の冠状セクションのレベルを表す。海馬状
隆起内での蛍光性のミクロスフェアのための注入位置も
また示されている。同じ側（右）の中隔におけるＮＧＦ
受容体−陽性神経の適度の救済はＮＧＦ生産移植片で明
白である（矢じりは中隔の中央ラインを示す）。
【０２９０】ＮＧＦ生産繊維芽細胞の移植片で救済され
るＮＧＦ受容体−免疫反応の中隔の神経の決定のために
は、ＮＧＦ受容体にて免疫組織化学的に染色された中隔
の領域による１２０μｍの５個の切片が神経を計数する
ために選択された。計数格子（０．５×０．５ｍｍ）が
同じ側および反対側の内側の中隔における全ての免疫反
応の神経を計数するために使用された。各動物群のため
の動物当りのNGF受容体−陽性生存細胞のパーセンテー
ジの間の相違がワン−ウェイアノバに（one-way ANOV
A）より評価された。片方だけのFF切除後３または４週
間、および８週間の、損傷空洞におけるＮＧＦ−生成繊
維芽細胞またはコントロール非感染の繊維芽細胞の移植
片で、または移植片の無い場合に救済された中隔の神経
のパーセンテージ（反対側対同じ側）を示す結果が、表
４に表示されている。中隔による冠状セクションは、中
隔の神経の生存の数値を求めるためにNGFにて免疫組織
化学的に染色された。繊維芽細胞の移植片に起因する切
片は、交換神経系軸索の内方への伸びを評価するために
THにて、移植片に対する星状細胞の応答性を評価するた
めにGFAPにて、また新血管発性を示すためにラミニンに
て免疫組織化学的に染色された。移植片および同じ側の
海馬状隆起に起因する切片は、中隔の軸索の再生を検査
するためにAChEおよびNGF受容体にて組織化学的に染色
された。
【０２９１】
【表４】 表４は、ＮＧＦ−生産プライマリ繊維芽細胞の移植片が
３（または４）週間および８週間において、同期間にお
けるコントロール非感染プライマリ繊維芽細胞をもつコ
ラーゲンの移植片よりも、ＮＧＦ受容体−陽性の中隔の
神経のより高いパーセンテージを有意的に維持したこと
を示している。ＮＧＦ受容体−免疫反応神経のパーセン
テージは、コントロール非感染移植片と移植片無しとを
比較される。従って、ＮＧＦ−生産細胞での救済の程度
は適度である一方、これらの結果は、遺伝学的に修飾さ
れたプライマリの繊維芽細胞によりＮＧＦのためのトラ
ンス遺伝子のインビボでの発現のための間接的な証明を
提供する。この発現は細胞を、軸索切断されたコリン作
用性の中隔の神経に対する栄養維持を提供することを可
能とする。
【０２９２】移植片および輸入路遮断された海馬状隆起
の歯状脳回内での中隔の軸索の再配列は、ＡＣｈＥおよ
びＮＧＦ受容体染色の検出により評価された。ＮＧＦ−
生産繊維芽細胞移植片はＡＣｈＥにて激しく適度に染色
した（図５２（ｃ））。他方、コントロール非感染のプ
ライマリ繊維芽細胞の移植片は、しばしばＡＣｈＥ反応
性を欠いた（図５２（ｄ））。ＮＧＦ−生産移植片は濃
厚に染色された周囲を有するために、コントロール移植
片はＡＣｈＥ反応性を欠くということに注目せよ（点線
は移植片の隣接した境界線を示す）。
【０２９３】片側に偏したＦＦの横切断および空洞内の
コントロール非−感染繊維芽細胞／コラーゲンの移植片
の配置の後３週間、輸入路遮断された歯状脳回はＡＣｈ
ＥおよびＮＧＦ受容体にて染色された軸索が全く無かっ
た。これは、正常な歯状脳回においてみられたＡＣｈＥ
（図５２（ｅ））およびＮＧＦ受容体による顕著な染色
とは全くの対照であった。ＡＣｈＥ染色の正常なパター
ンは、歯状脳回の全ての層に対して強いインプットを示
す。損傷／移植後８週間の間、輸入路遮断された歯状脳
回はなおＡＣｈＥ−陽性の軸索を欠くが（図５２
（ｇ））、いまやＮＧＦ受容体にて免疫組織化学的に染
色された大きな径の軸索を、特に歯状脳回の多形の層中
に備えた。これらの軸索は、ＦＦの損傷後の海馬状隆起
内で発生する交感神経系軸索を暗示している（Batchele
r et al.,J.Comp.Neurol.284:187 1989を参照）。２つ
のケースでは、ＡＣｈＥ−陽性の軸索は、反対側から輸
入路遮断された海馬状隆起までコントロール移植片の下
を横切って観察された。ＦＦの片側に偏した横切断およ
びＮＧＦ−生成繊維芽細胞のコラーゲン内への配置後３
週間、ＡＣｈＥ−陽性の軸索の適度の集網が輸入路遮断
された歯状脳回の内側および上側の形状に明白であっ
た。８週間の間、ＡＣｈＥ−陽性繊維は飛躍的に増大し
たが、なお多くの軸索は上内側の歯状脳回に制限され
た。しかしながら、あるケースの場合には、歯状脳回お
よびＣＡ２−３範囲で地形的に組織化されたＡＣｈＥ−
陽性の軸索が観察された（図５２（ｆ））。再神経支配
のパターンが正常な損傷の無い海馬状隆起（図５２
（ｅ））のＡＣｈＥ−陽性の中隔の軸索と比較されたけ
れども、軸索の密度は通常少なかった。ＮＧＦ−生成移
植片の場合には、ＮＧＦ受容体にて染色された大径の軸
索もまた、輸入路遮断された歯状脳回の多形の層で、通
常海馬状隆起の尾側の位置で観察された。
【０２９４】ＮＧＦ−生産移植片とコントロール移植片
でのＡＣｈＥ染色のパターンは著しく相違したけれど
も、両型の移植片は類似する細胞個体群とＴＨ、ＧＦＡ
Ｐおよびラミニンによる免疫染色を備えていた。ニッス
ル染色は、全ての移植片が繊維芽細胞、リンパ球、肥満
細胞、形質細胞、毛細血管の星状および内皮細胞を含む
移植片内またはその周囲に種々の異なる細胞型をもつコ
ラーゲンの濃密な管束で構成されていることを示した。
また、両型の移植片はわずかな数のＴＨ−免疫反応の軸
索を、特に濃密なコラーゲン管束の内に備えていた。Ｇ
ＦＡＰによる免疫組織化学的に染色された星状細胞の突
起は、損傷空洞の周囲の損傷された神経組織からの広が
り、および移植片の外側面内への浸透を認められた。と
きには、ＧＦＡＰ−陽性の細胞が移植片内で認められ
た。ＮＧＦ−生産および非感染のプライマリ繊維芽細胞
の移植片のラミニン免疫染色は、広範囲の宿主−誘導さ
れた血管の網状組織を示した。また、伸長されたラミニ
ン−免疫反応細胞体、多分シュワン細胞が、移植片の両
型の濃密なコラーゲン管束の内部および周囲で発見され
た。
【０２９５】ＦＦの切除後新しい軸索を再生し、また輸
入路遮断された海馬状隆起を神経支配を再支配するこれ
らの中隔の神経の起源を決定するため、蛍光ミクロスウ
ェアの定位配置が同じ側の歯状脳回およびＣＡ２−３領
域に行われた。ＮＧＦ−生産（ｎ＝５）またはコントロ
ール非感染（ｎ＝４）繊維芽細胞の移植片をもつ９個の
深く麻酔をかけられた動物は、損傷と同じ側の海馬状隆
起の歯状脳回およびＣＡ２−３領域内にローダミン−蛍
光ミクロスウェア（２００ｎｌ／領域）の２つの定位の
配置を受けた。４８時間の回復に続いて、動物は再度麻
酔をかけられ、4％のパラホルムアルデヒドで噴門を通
して潅流された。脳はフリージング ミクロトームで冠
状に切断され、中隔領域内で逆行的に標的された神経は
蛍光顕微鏡で認められた。図５２（ｈ）における概略図
は注入位置を示す。
【０２９６】最も多くの逆行的に蛍光標識された伸長し
た神経は、同じ側の内側の中隔および斜めの帯領域で発
見された。一方、わずかなものが中隔の中線および反対
側の中隔の核で観察された（図５３）。コントロール非
感染繊維芽細胞をもつ場合は、中隔の領域には逆行的に
標識された神経を有していなかった。
【０２９７】超微細構造のレベルでは、移植片は移植後
８週間で遊離した外側の細網配列をもつ濃密なコラーゲ
ンの管束からなっていた。繊維芽細胞は密集したコラー
ゲンと細網状コラーゲンの構成内で観察され、そしてこ
れらの細胞の弱められた突起は両領域のコラーゲンの密
集した集積を包んだ。基底ラミナにより取り巻かれた非
穿孔の内皮細胞を構成した毛細血管は、移植片のいたる
ところで発見された。リンパ球、形質細胞、肥満細胞、
および食細胞を含む幾多の型の細胞もまた、移植片内で
観察された。星状細胞およびそれらの突起は密集したコ
ラーゲンの中央部の周囲の遊離した細網内で広く発見さ
れた。ＮＧＦ−生成および非感染繊維芽細胞の移植片の
間での最も顕著な相違は、無髄軸索の数であった。すな
わち、９６０μｍ2の領域では１６２５の軸索がＮＧＦ
−生産移植片で発見され、これに対してコントロール移
植片では３２９の軸索であった。ＮＧＦ−生産（ｎ＝３
異なるケース）またはコントロール非感染（ｎ＝３ 異
なるケース）繊維芽細胞／コラーゲンの移植片の極薄の
切片が試験され、軸索の総数が１０格子ます目内で計数
された（５格子ます目の２並列カラム、総面積９６０μ
ｍ2、密集および遊離したコラーゲン領域の移植片組織
で）。ＮＧＦ−生産移植片の３つの場合では、コントロ
ー非感染移植片の３つの場合での３２９個に比較して、
１６２５個の軸索が発見された。
【０２９８】図５４（ａ）−図５４（ｃ）に示されたよ
うに、多数の軸索は中間フィラメントを含む星状細胞
（＊）の狭い突起を取り巻き、または同突起に入ってい
た。これらの星状細胞のプロフィルは、移植細胞外のマ
トリックスに面するこれらの細胞表面で基底ラミナ（矢
じり）を備えている。軸索は通常、基底ラミナを欠いて
いるこれらの星状細胞の表面に並んで発見される。この
ような軸索はまた、繊維芽細胞（Ｆ）（図５４
（ｄ））、他の星状細胞に類似する細胞、およびそれら
の突起を含んでいる、星状細胞またはその他の細胞の細
胞体の近くで発見される。なお、無髄軸索は毛細血管の
内皮細胞の基底ラミナに強く結合し（Ｃ）、またはＮＧ
Ｆ−生産移植片の細胞外のマトリックス内で発見され
た。コラーゲン原繊維は軸索の間に分配している（図５
４（ｅ））。ＮＧＦ−生産またはコントロール繊維芽細
胞の移植片の内には、スワン細胞（Ｓ）およびそれらの
突起により包まれたわずかな数の無髄軸索が細網領域で
観察された。（毛細血管のルーメン＝Ｌ）（図５４
（ｆ））。移植片の両型の密集したコラーゲンの領域内
で観察された軸索は、通常低減された神経膠内に覆われ
ている。ときには、コントロール移植片もまた、細胞外
のマトリックス内に軸索の非常に小さな個体群を備えて
いた。
【０２９９】ＮＧＦ−生産移植片の配置後の輸入路遮断
された海馬状隆起の超構造的な実験は、歯状神経膠内で
ＡＣｈＥ反応のまばらな分配を示す。電子密度反応(ele
ctron-dense reaction)は、小径の形質膜、無髄軸索、
および明確な球状小胞を含んでいる末端に集中された。
これらの染色された軸索のプロフィルは、歯状脳回の分
子層で広く発見された（図５５）。歯状神経網は、ＡＣ
ｈＥ−陽性の無髄軸索の集団をいたるところで分配さ
れ、またこれらの軸索の集合体は通常星状細胞近くで発
見された。ときには、ＡＣｈＥのために反応性を有して
いる軸索の末端は樹状突起のシャフトおよびスパインに
接するシナプスを形成した。しかしながら、ＡＣｈＥ−
陽性の末端と顆粒状の神経の樹状突起のプロフィルの間
の接触の対称は、近接の位置で反応生成物の局在性によ
り通常不明瞭であった。コントロール非感染細胞をもつ
これらの動物の輸入路遮断された歯状脳回の切片はＡＣ
ｈＥ反応性を欠くために、その後の分析は超微細構造の
レベルでは導けなかった。
【０３００】特に、図５５は、超微細構造のレベルで実
験したその組織の近くでただちに得られた、ＡＣｈＥに
より染色された歯状脳回のコントロール切片（４０μ
ｍ）を示す。ＡＣｈＥ−陽性の繊維は、内部（ＩＭ）お
よび外部（ＯＭ）の分子層、および顆粒状層（Ｇ）で明
確である。ＡＣｈＥ−陽性の全組織および繊維もまた、
多形の層（Ｐ）で発見される。図５５（ｂ）および５５
（ｃ）は、ＡＣｈＥ−陽性の無髄軸索の集団が顆粒状
（Ｂ）および分子（Ｃ）層のいたるところで発見され
る。図５５（ｄ）、５５（ｅ）および５５（ｆ）は、Ａ
ＣｈＥ−陽性の末端形成のスナプスが分子層における樹
状突起のシャフト（Ｓｈ）およびスパイン（Ｓｐ）に接
触（矢じり）することを示している。星状細胞の突起
（Ａｓ）は通常、歯状脳回におけるＡＣｈＥ−陽性の軸
索および末端の集団の近くで観察される。
【０３０１】これらの結果は、中隔のコリン作用性の神
経の再生能力におけるＮＧＦのごとき栄養／屈性の物質
の重要性を指摘する。これは、内側の中隔で救済された
ＮＧＦ受容体−陽性の神経のパーセンテージ、および片
側に偏したＦＦ損傷およびＮＧＦ−生産のプライマリの
繊維芽細胞をもつコラーゲンのマトリックスを構成する
移植片の配置後の海馬状隆起の歯状脳回の再神経支配に
より評価される。従って、ＮＧＦ−生産のプライマリ繊
維芽細胞の大脳内の移植片は、実験例ＩＩに示すように
ＮＧＦ−生産の不滅化された繊維芽細胞のような軸索切
断後、および側生の脳室内の外因性ＮＧＦの注入（Heft
i,J.Neurosci.6:2155(1986); Kromer,Science 235:214
(1987); Williams et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:
9231(1986)）後の、コリン作用性の中隔の神経の逆行す
る変性を阻止することができる。コラーゲン マトリッ
クスにおけるNGF−生産のプライマリの繊維芽細胞で救
済された細胞のパーセンテージは、しかしながら、ＮＧ
ＦまたはＮＧＦ−生産不滅化繊維芽細胞の移植組織の脳
室内への注入で達成されるそれよりも低い。これは、
１）ＮＧＦ生産物の低いレベルに起因するコラーゲン
マトリックス内に実際に移植された細胞の僅かな数；
２）移植後のトランス遺伝子の可能な抑制方向の調節(d
own-regulation)による。
【０３０２】これらの結果は、中隔の神経から新しい軸
索の成長を維持する組織の他の異なるタイプのごとく、
コラーゲン マトリックス内でのＮＧＦ−生産繊維芽細
胞の移植片もまた、中隔の繊維の成長を維持し、その結
果海馬状隆起のまばらな再神経支配が３週間で明かであ
る、ということを示している。しかしながら、８週間ま
では、海馬状隆起内での軸索の密度は３週間で見られる
よりも明らかに増大している。海馬状隆起に対する中隔
のＡＣｈＥ−陽性の繊維の内への伸びは極わずかで、標
識細胞は逆行性トレーサの配置の後で歯状脳回と同じ側
の中隔の領域では発見されないので、コラーゲン内のコ
ントロール細胞の移植は維持をほとんどまたは全く現さ
ない。同様に、細胞をもたない抹消神経（すなわち、シ
ュワン細胞を欠くもの）の移植片は、中隔の軸索の成長
を維持できない（Hagg et al.,Exp.Neurol.112:79(199
1)）。同時に、これらのデータは、中隔の軸索が成長の
ための細胞および細胞外の基質からなる多くの異なる移
植環境を使用することができることを示している。
【０３０３】これらのデータはまた、プライマリの皮膚
繊維芽細胞を含んでいるコラーゲン移植片は、プライマ
リの細胞がＮＧＦを生成するために遺伝学的に修飾され
ているか否かにかかわらず、基底ラミナ、星状細胞およ
びシュワン細胞をもつ毛細血管の同様の内への伸びを促
すことを示している。その上、移植片の両タイプの細胞
外のマトリックスは類似するので、ラミニンの免疫染色
のパターンおよびコラーゲンの分配が比較される。ＮＧ
Ｆ−生産移植片とコントロール移植片との間の実際の相
違は、ＡＣｈＥのための強い染色とＮＧＦ−生産移植片
内の無髄軸索の発生量にある。先づ第１に、著しいＡＣ
ｈＥ反応性がＮＧＦ−生産移植片で明かである。コント
ロール移植片は通常ＡＣｈＥ染色を欠いている。しかし
ながら、移植片の両タイプは、シュワン細胞およびそれ
らの突起内に伸長する軸索と同様に、TH−免疫反応繊維
のまばらな個体群を備えている。これらの神経膠のエレ
メントで結合された最多数の軸索は、ＴＨ−陽性の交感
神経の内への伸びを示す。第２に、ＮＧＦ−生産移植片
は、星状細胞の突起で覆われ、毛細血管を通過し、また
はコラーゲンのルーズな配列内に広がる多数の軸索を有
する。これに対して、コントロール移植片は、細胞外の
環境において軸索の非常の小さな個体群を有するのみで
ある。これらの収集データから、不安定にされた中隔の
神経から発生するＮＧＦ−感応の軸索は、ＮＧＦの効用
と、新しい成長のための許容すべき移植環境を必要とす
る。インビボでＮＧＦを生産する遺伝学的に修飾された
細胞の移植片を使用することにより、再配列している中
隔の軸索がここで種々の異なる基質上に、その存在にお
いてのみ成長することを示した。ＮＧＦのレベルを高め
ることなしに、軸索は、たとえ同じ細胞および細胞外基
質が役立つとしても、コラーゲンおよびコントロール非
感染繊維芽細胞からなる移植片に応答して再生しない。
【０３０４】軸索切断および移植にともなうラットにお
ける中隔のコリン作用性の神経の再配列の能力を実験す
る以前の研究は、ある橋絡する環境をもつ輸入路遮断さ
れた海馬状隆起の「再神経支配」に関したものであった
（Hagg et al.,Exp.Neurol.112:79(1991)）。しかしな
がら、今までの研究は、海馬状隆起内のＡＣｈＥ−陽性
の中隔の軸索がシナプス後部の標的を実際に神経支配す
る直接の形態学的証拠を提供しなかった。本実験例で提
供された超微細構造のデータは、ＡＣｈＥの活性のため
に染色された軸索が、ＦＦ損傷およびＮＧＦ−生産繊維
芽細胞の移植後８週間、輸入路遮断された脳回内に著し
く分配されることを示している。これらの軸索はたびた
び２またはそれ以上の集団において認められる。ＡＣｈ
Ｅ−陽性の中隔の軸索の超微細構造の組織は、ＮＧＦ受
容体により免疫組織化学的に染色された中隔の軸索もま
た正常なラットの歯状脳回内で小さな集合体を形成する
という最近の観察に類似する（Kawaja and Gage, J.Com
p.Neurol.307:517(1991)）。これに加えて、これらの新
しく形成されたAChE−陽性の中隔の軸索は、輸入路遮断
された歯状脳回において樹状突起のシャフトおよびスパ
インと接触するシナプスを形成する末端を生じさせる。
中隔のコリン作用性の軸索と顆粒の樹状突起のプロフィ
ルの間のシナプス接触物のパターンは、ラットの歯状脳
回で正常に発見されるものと比較される。コリン作用性
の軸索と顆粒の神経との間の軸索切断の接触物はまれで
ある（Shute and Lewis,Zellforsch.Mikrosk.69:334(19
66);and Clarke,Brain Res.360:349(1985)）。胎生の中
隔の移植片がFF切除後成体ラットの歯状脳回内に移植さ
れる場合には、移植片からのコリン作用性の軸索は顆粒
の神経の全組織を正常よりより高い頻度で刺激すること
は、価値のある言及である（Clarke et al.,Brain Res.
369:151(1986)）。さらに、樹状突起のプロフィルと接
触している移植−誘導のコリン作用性の軸索の数は劇的
に低減する（Ｉｄ）。これらのデータから、輸入路遮断
された歯状脳回内の胎生中隔の移植片からのコリン作用
性の軸索は顆粒の神経をもつユニークなシナプスの配列
を形成する一方、コラーゲンおよび繊維芽細胞のＮＧＦ
−高移植片(NGF−rich grafts)を横切って再生する軸索
は、歯状脳回内で正常なシナプスの組織化を繰り返す
（すなわち、ＡＣｈＥ−陽性の中隔の軸索は樹状突起の
シャフトおよびスパイン上で優先的に終結する）。
【０３０５】本実験例に提示された結果は、コラーゲン
のマトリツクスにおけるNGF−生産コリン作用性の神経
がラットの内側の中隔の損傷されたコリン作用性の神経
を維持し、これらの神経から発生するＮＧＦ−感応性の
軸索を再成することのために誘導された環境を提供し、
そして中隔の軸索による歯状脳回の輸入路遮断された顆
粒の神経の再神経支配に影響を及ぼす、ことを指摘す
る。特に、これらの移植片は軸索の伸長およびシナプス
の接触性を促す。ＮＧＦ−感応性の軸索を再成するため
には、ＮＧＦ−生産プライマリ繊維芽細胞およびコラー
ゲンからなる移植片内での成長のために、細胞およびマ
トリックスの両基質が使用される。NGFのレベルを高め
ることなしには（すなわち、コントロール繊維芽細胞／
コラーゲンの移植片を使用すること）、伝導基質の存在
にもかかわらず、中隔の神経のより高い割合が変性を被
り、そして軸索は成長するのに失敗する。
【０３０６】ＮＧＦに加えて、ニューロトロフィン（Ｎ
Ｔ）−３、ＮＴ−４、および繊毛状の栄養ファクター
（ＣＮＴＦ）のごとき他の神経栄養のファクターが、軸
索切断された神経を維持するために、またCNSにおける
他の神経の個体群の軸索の再成長を増進するために使用
される。
【０３０７】上記したごとき本発明の改良および変形
は、本発明の精神およびその範囲を逸脱することなくな
されることは明かである。詳述された特定の具体例は実
施例として与えられたものにすぎず、本発明は付随する
クレームの文言にのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 標的細胞においての新しい機能の作用を概説
しかつ分析するための様式を模式的に示した図である。
【図２】 遺伝子操作されたドナー細胞を用いてＣＮＳ
内の標的細胞に新しい機能を導入するための手法を示し
た概略図である。
【図３】 トランス遺伝子を含む遺伝性のレトロウイル
スベクターの合成を説明するための概略図である。（Ｇ
ＡＧ＝特異的抗原基；ＥＮＶ＝エンベロープ；ＰＯＬ＝
逆転写酵素（reverse transcriptase））
【図４】 実験例Ｉに記載されているような完全なベク
ターＬＳΔＰΔＬＭ及びｐＬＮＨＩ2 の線形の制限酵素
マップを示した概略図である。（矢印は、プロモーター
の位置と、転写の方向を示している。ＬＳΔＰΔＬＭの
斜線を施したボックスは、インビトロで突然変異を起こ
すことによって組み入れられた新規な末端ヘキサペプチ
ドを有するプロテインをコードしているヒトのＨＰＲＴ
ｃＤＮＡを現している。ＬＴＲ＝長末端反復配列）
【図５】 実験例Ｉに記載されているようなベクターｐ
ＬＮＨＬ2 の環状の制限酵素マップを示す図である。
【図６】 （ａ）〜（ｆ）は実験例Ｉに説明されている
ように、ラットの基底ガングリア（rat basal gangli
a）内に移植されたホスホリボシルトランスフェラーゼ
（ＨＰＲＴ）を用いて前もって感染させたプライマリー
ラットの繊維芽細胞の顕微鏡写真である。（図６
（ａ），（ｄ）＝抗−フィブロネクチン（anti-fibrone
ctin）；図６（ｂ），（ｅ）＝クレシールバイオレット
（cresyl violet）；図６（ｃ），（ｆ）＝ＧＦＡＰ；
倍率：図６（ａ）〜（ｃ）＝８８Ｘ；（ｄ）〜（ｆ）
＝４４０Ｘ）
【図７】 実験例Ｉに説明されているように、基底ガン
グリアからの脳抽出物のＨＰＲＴ酵素活性に対して行わ
れた等電点に焦点を合わせた時のゲルの写真である。
【図８】 実験例IIにおいて説明されているようなベク
ターｐＬＬＲＮＬの環状の制限酵素マップを示す図であ
る。
【図９】 実験例IIにおいて説明されているようなベク
ターｐＰＲｌの環状の制限酵素マップを示す図である。
【図１０】 実験例IIにおいて説明されているようなベ
クターｐＵＣＲＨの環状の制限酵素マップを示す図であ
る。
【図１１】 実験例IIにおいて示されているように、ウ
イルス性の５’長末端反復配列（ＬＴＲ）のコントロー
ルのもとにおかれている、マウスの神経成長因子（ＮＧ
Ｆ）ｃＤＮＡの７７７塩基対Ｈｇａｌ−Ｐｓｔｌフラグ
メントを含有する完全なＮＧＦレトロウイルスベクター
ＰＬＮ．８ＲＮＬの直線状の制限酵素マップを示す図で
ある。（矢印は、転写の開始部位を示している。；ｐｓ
ｉ（ψ）＝レトロウイルス性のパッケージされているシ
グナル；ＲＳＶ＝ルース サルコーマウイルスのプロモ
ーター(Rous sarcoma virus promoter)；ｎｅｏR＝ネオ
マイシン−耐性遺伝子のマーカー）
【図１２】 図１１及び実験例IIに示したようなベクタ
ーｐＬＮ．８ＲＮＬの環状の制限酵素マップを示す図で
ある。
【図１３】 実験例IIにおいて説明されているようなフ
ィブロネクチン及びＣｈＡＴに対して、免疫組織化学的
な染色を行った場合の顕微鏡写真である。（図１３
（ａ），（ｂ）＝卵管のフィンブリエの円蓋腔（the fi
mbria fornix cavity）； 図１３（ｃ）〜（ｆ）＝Ｃ
ｈＡＴに対して染色が行われている組織の内側の隔膜
（medial septum）を通して採取した頭頂部分(coronal
section)； 図１３図１３（ａ），（ｃ），（ｅ）＝レ
トロウイルス−感染した細胞を移植された動物； 図１
３（ｂ），（ｄ），（ｆ）＝コントロールの細胞を移植
された動物； 倍率（Ｍａｇ．）：図１３（ａ）及び
（ｂ）＝２０Ｘ； 図１３（ｃ）及び（ｄ）＝７０Ｘ；
図１３（ｅ）及び（ｆ）＝２２０Ｘ）
【図１４】 実験例IIにおいて説明したように、ラット
の隔膜内にあるＣｈＡＴ−免疫反応性の細胞の生存を、
ＮＧＦの存在する場合及び存在しない場合について調べ
た場合の結果を示すグラフである。
【図１５】 （ａ）〜（ｆ）は、実験例IIにおいて説明
したアセチルコリンエステラーゼの組織化学を示す顕微
鏡写真である。（図１５（ａ）＝ＮＧＦ−感染されたド
ナー細胞を移植された動物の低倍率のもの； 図１５
（ｃ）＝内側の隔膜を通した場合の（ａ）の高倍率のも
の； 図１５（ｅ）＝背側で側方の象限を通して（ａ）
を高倍率にしたもの； 図１５（ｂ），（ｄ），（ｆ）
＝コントロールの細胞を移植された動物で、図１５
（ａ），（ｃ），（ｅ）に対して記載したのと同じ条件
で行われたもの； 倍率（Ｍａｇ．）：図１５（ａ），
（ｂ）＝２０Ｘ； 図１５（ｃ）〜（ｆ）＝２２０Ｘ）
【図１６】 実験例IIIに記載されているように、ｐＬ
ＴｈＲＮＬレトロウイルス性の完全なベクターの線形状
の制限酵素マップを示す概略図である。（矢印は、プロ
モーターの位置と転写の方向を示している。； ＬＴＲ
＝長末端反復配列； ＲＳＶ＝修飾されたＲＳＶプロモ
ーター； ｎｅｏR ＝ネオマイシン−抵抗性の遺伝子）
【図１７】 図１６に示され、かつ実験例IIにおいて説
明されているように、ベクターｐＬＴｈＲＮＬの誘導を
説明するための図である。
【図１８】 （ａ）〜（ｄ）は、実験例IIIにおいて説
明されているとおり、フィブロネクチン免疫活性を示す
尾形への繊維芽細胞移植を示す顕微鏡写真である。（倍
率：図１８（ａ），（ｃ）＝１０Ｘ； 図１８（ｂ），
（ｄ）＝２０Ｘ）
【図１９】 実験例III に説明されているとおり、４群
の実験動物のグループについて、基準点から次の移植ま
でのローテーションの回数を調べた場合の平均的な変化
の割合を示すグラフである。（図面の上部：尾の線条体
においてコントロールによる移植及びＴＨ−感染物につ
いての移植による置き換え；下部：吻側の線条体におい
てコントロールによる移植及びＴＨ−感染物についての
移植による置き換え；横軸は標準偏差）
【図２０】 実験例ＩＶにおける記載に従って、プライ
マリースキン（primaryskin）の繊維芽細胞及びラット
−１の繊維芽細胞の成長曲線を示したグラフである。
【図２１】 実験例ＩＶにおいて記載されているよう
に、移植するに先立ち培地において一回あるいは４回の
継代接種を行った後、経過を観察しつつ３週間から８週
間生存させた後の自己の繊維芽細胞の容量（ｍｍ3）を
示すヒストグラムである。
【図２２】 実験例ＩＶに記載されているように、１μ
ｌあたり１０4個、２．５×１０4個、及び１０5個の細
胞を移植して得られた自己の繊維芽細胞移植片の容量
（ｍｍ3）を示すヒストグラムである。
【図２３】 （ａ）〜（ｄ）は、実験例ＩＶで説明した
とおり、移植後、３週間（図２３（ａ），（ｃ））及び
８週間（図２３（ｂ），（ｄ））たった時点で繊維芽細
胞を免疫組織化学的に染色し、得られた線条体プライマ
リー繊維芽細胞の移植片（Ｇ）を示す写真である。（倍
率：図２３（ａ），（ｂ）＝１２Ｘ； 図２３（ｃ），
（ｄ）＝１２０Ｘ）
【図２４】 （ａ）〜（ｆ）は、実験例ＩＶにおいて説
明されているように、移植後、３週間（図２４（ａ），
（ｃ），（ｅ））及び８週間（図２４（ｂ），（ｄ），
（ｆ））たった時点で、クレシルバイオレット（図２４
（ａ），（ｂ））で染色した線条体内のプライマリー繊
維芽細胞の写真、及び同時点で、ＧＦＡＰについて（図
２４（ｃ），（ｄ））、及びＯＸ−４２（図２４
（ｅ），（ｆ））について免疫学的に染色した線条体内
のプライマリー繊維芽細胞の写真、繊維芽細胞を免疫組
織化学的に染色し、得られた線条体プライマリー繊維芽
細胞の移植片（Ｇ）を示す写真である。（倍率＝１２０
Ｘ）
【図２５】 （ａ）〜（ｃ）は、実験例ＩＶにおいて説
明したように、移植（Ｆ＝繊維芽細胞自体； 固形点＝
繊維芽細胞の存在部分である。）した後８週間で自己移
植の超構造（ultrastructure）を示す写真である。（倍
率：図２５（ａ）＝６，６００Ｘ； 図２５（ｂ）＝
９，１００Ｘ； 図２５（ｃ）＝１６，６００Ｘ）
【図２６】 （ａ），（ｂ）は、実験例ＩＶに記載され
ているように、移植片に存在する星状細胞の存在部分及
び食細胞を示す写真である。（倍率：図２６（ａ）＝１
６，６００Ｘ； 図２６（ｂ）＝１５，０００Ｘ）
【図２７】 （ａ），（ｄ）は、実験例ＩＶにおいて記
載したように、移植血管を示す写真である。（図２７
（ａ）、Ｅ＝窓のない内皮細胞（fenestrated endothel
ial cells））； 図２７（ｂ）、矢じり部＝嵌入部
分； 図２７（ｃ）、矢印＝細胞内部への注入； 図２
７（ｄ）、Ａｓ＝星状細胞の存在部分； 倍率：図２７
（ａ）＝１３，２００Ｘ； 図２７（ｂ）＝２５，４０
０Ｘ； 図２７（ｃ）＝２５，０００Ｘ； 図２７
（ｄ）＝１６，６００Ｘ）
【図２８】 実験例Ｖにおいて説明したように、ＴＨト
ランス遺伝子を含有するプライマリー繊維芽細胞のチロ
シンヒドロキシラーゼに対して、インビトロでラベリン
グした結果を示す写真である。（倍率＝２５Ｘ）
【図２９】 実験例Ｖにおいて説明されているように、
アポモルフィンが導入された６−ＯＨＤＡ−障害を与え
られたラット（6-OHDA-lesioned rats）での転回行動に
対しての移植の結果を示すグラフである。
【図３０】 （ａ）〜（ｂ）は、実験例Ｖにおいて説明
したように、ラットの線条体に移植されたＴＨプライマ
リー繊維芽細胞に、インシトゥでハイブリダイゼーショ
ンした結果を示す顕微鏡写真である。（図３０（ａ）
は、ＦＦ２／ＴＨ細胞の移植片； 図３０（ｂ）は、Ｆ
Ｆ２／βＧａｌ細胞（コントロール）の移植片； Ｇ＝
移植片； Ｖ＝脳室）
【図３１】 （ａ）〜（ｄ）は、実験例Ｖに記載された
とおり、βＧａｌ組織化学的にあるいはＴＨｍＲＮＡに
インシトゥでハイブリダイゼーションのいずれかに対し
て、移植された細胞をインビボでラベリングした結果を
示す写真である。（図３１（ａ）は、βＧａｌを組織化
学的に染色したＦＦ２／βＧａｌの移植片； 図３１
（ｂ）は、ＦＦ２／Ｇａｌ移植片の高倍率としたもの；
図３１（ｃ）は、ＦＦ２／ＴＨ移植でのＴＨ ｍＲＮ
Ａに対するインシトゥでのハイブリダイゼーション、矢
印＝繊維芽細胞； 図３１（ｄ）は、ＦＦ２／βＧａｌ
移植でのＴＨ ｍＲＮＡに対するインシトゥでのハイブ
リダイゼーション； 倍率：（ａ）＝１０Ｘ、（ｂ），
（ｃ）及び（ｄ）＝４０Ｘ）
【図３２】 （ａ），（ｂ）は、実験例Ｖにおいて示さ
れているように、インビボにおけるＦＦ２／ＴＨ繊維芽
細胞のＴＨ−免疫活性を示す写真である。（アストリス
ク＝ロダミン蛍光色素； 倍率＝２０Ｘ）
【図３３】 実験例ＶＩに示され、かつ説明されている
ように、遺伝子及び細胞タイプから得られるヒトのＮＧ
Ｆの分泌を図示したグラフである。
【図３４】 実験例ＶＩＩに示されているように、ｐＬ
ＣｈＲＮＬベクターの模式図である。
【図３５】 実験例ＶＩＩにおいて記載されているよう
に、免疫染色された繊維芽細胞の写真である。
【図３６】 （ａ），（ｃ）は、実験例ＶＩＩにおける
記載に従うもので、次の結果を示している。：図３６
（ａ）は、繊維芽細胞から得られた全ＲＮＡのノーザン
ブロット分析； 図３６（ｂ）は、繊維芽細胞における
ＣｈＡＴ活性の分析であり、図３６（ｃ）は繊維芽細胞
によって培地に分泌されたＡＣｈの分析である。
【図３７】 （ａ）〜（ｂ）は、ＨＰＬＣによって測定
されているように、また、実験例ＶＩＩに記載されてい
るように、ラット−１／ｄＣｈＡＴの培養物にコリンク
ロライドを添加した結果を図示したグラフである。（図
３７（ａ）＝細胞内のＡＣｈ及び細胞外のＡＣｈにおけ
る効果； 図３７（ｂ）＝ＣｈＡＴ活性についての効
果）
【図３８】 （ａ）〜（ｃ）は、実験例ＶＩＩにて説明
したように、ＣｈＡＴ活性（図３８（ａ））； 定常レ
ベルのｄＣｈＡＴ ｍＲＮＡ（図３８（ｂ））；及びｄ
ＣｈＡＴ／シクロフィリン（ｃｙｃ．） ｍＲＮＡの比
（図３８（ｃ））についての効果によって解るように、
ｄＣｈＡＴの発現において血清を除去することによって
導かれる静止期の状態を結果的に示している。
【図３９】 （ａ）〜（ｃ）は、実験例ＶＩＩにて説明
したように、ＣｈＡＴ活性（図３９（ａ））； ｄＣｈ
ＡＴ ｍＲＮＡのレベル（図３９（ｂ））； 及びｄＣ
ｈＡＴ／シクロフィリン（ｃｙｃ．）の比（図３９
（ｃ））についての効果によって解るように、ｄＣｈＡ
Ｔの発現において阻害剤を接触されることによって導か
れる静止期の状態を結果的に示している。
【図４０】 実験例ＶＩＩにおいて記載されているよう
に、融合性の繊維芽細胞から得られるＡＣｈの遊離にお
けるコリンの効果を示す棒グラフである。
【図４１】 実験例ＶＩＩＩにおいて説明されているよ
うに、ベクターｐＳＶＳ３２ＡＣＡＴの環状の制限酵素
マップを示す図である。
【図４２】 実験例ＶＩＩＩにおいて説明されているよ
うに、ベクターｐＭＬＶＣＡＴの環状の制限酵素マップ
を示す図である。
【図４３】 実験例ＶＩＩＩにおいて説明されているよ
うに、ベクターｐＣＭＶＣＡＴの環状の制限酵素マップ
を示す図である。
【図４４】 実験例ＶＩＩＩにおいて説明されているよ
うに、ＳＶ ４０、ＬＴＲ及びコラーゲンプロモーター
（Ｃｏｌ１及びＣｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハン
サー）の相対的なＣＡＴ発現を示す棒状グラフである。
【図４５】 （ａ）〜（ｂ）は、実験例ＩＸにおいて説
明されているように、ｄＣｈＡＴ−発現性の繊維芽細胞
におけるＴＧＦβ、ＩＬ−１β及びＴＮＦαの効果を示
すノーザンブロットの写真である。（図４５（ａ）は、
ＴＧＦ−β（レーン２）及びＩＬ−１β（レーン３）の
効果を示す。図４５（ｂ）は、Ｉｎｆγの効果を示して
いる。レーン１＝コントロール； シクロフィリン（Ｃ
ｙｃ）＝実質的なコントロール； レーン２＝２４時間
後の効果； レーン３＝４８時間後の効果； ｄＣｈＡ
Ｔ＝ｄＣｈＡＴプロウイルス性（proviral）のｍＲＮＡ
を示している。）
【図４６】 実験例ＩＸにおいて説明されているよう
に、融合性のｄＣｈＡＴ−生産性の繊維芽細胞における
ＴＧＦγ及びＩＬ−１βの複合投与、更にデキサメタゾ
ンを加えた複合投与の効果を示すノーザンブロットの写
真である。（レーン１＝コントロール； レーン２＝Ｔ
ＧＦ−β／ＩＬ−１β； レーン３＝デキサメタゾンの
みの投与； レーン４＝ＴＧＦβ／ＩＬ−１β及びデキ
サメタゾン；強いシグナル＝ｄＣｈＡＴ ｍＲＮＡ；
弱いシグナル＝シクロフィリン ｍＲＮＡ）
【図４７】 （ａ）〜（ｂ）は、実験例ＩＸに記載され
ているように、２％の血清に対して１０％含まれている
コラーゲンプロモーターについての活性と、コラーゲン
プロモーター上の種々のサイトカインの効果について示
している棒状グラフである。
【図４８】 （ａ）〜（ｄ）は、実験例ＩＸにおいて記
載されているように、成体のフィッシャーラット（Fisc
her rats）の線条体に移植されたＬＴＲ−ＣＡＴ（図４
８（ａ），図４８（ｂ））細胞、あるいはＣｏｌｌ
（Ｅ）−ＣＡＴ（図４８（ｃ），図４８（ｄ））細胞の
移植片を示す顕微鏡写真である。（白い矢印＝繊維芽細
胞）
【図４９】 （ａ）〜（ｄ）は、実験例Ｘにおいて記載
されているように、移植（右の線条体に注入されて遺伝
子的に修飾された細胞、及び左の線条体に注入された感
染されていないコントロール）した後、１週間（図４９
（ａ），図４９（ｂ））及び８週間（図４９（ｃ），図
４９（ｄ））たった時点で、左と右の線条体を通過して
水平に断面した状態を示す顕微鏡写真である。（Ｇ＝移
植片； ＮＧ＝メイネルト（Meynert）の核の基底（nuc
leus basalis）； ＲＴ＝細網の視床核（reticular th
alamic nucleus）； スケールバー：図４９（ａ），
（ｂ）は０．４５ｍｍ； 図４９（ｃ），（ｄ）は、
０．２２ｍｍ）
【図５０】 実験例Ｘに記載されているように、移植
後、８週間のＮＧＦ−生産細胞が結合された移植片の電
子顕微鏡写真である。（Ｆ＝繊維芽細胞； Ｅ＝内皮細
胞； 矢印＝星状細胞の存在部分； スケールバー＝
１．０μｍ）
【図５１】 実験例Ｘにおいて記載されているように、
８週間たった時点でのＮＧＦ−生産細胞の移植片内での
軸索−膠の配列（axo-glial arrangement）を顕微鏡で
見た写真及びその模式図である。（Ａｘ＝髄鞘のない軸
索； Ａｓ＝反応性の星状細胞の存在部分； 矢じり＝
基底層（basal lamina）； スケールバー＝１．０μ
ｍ）
【図５２】 （ｈ）は、実験例Ｘにおいて記載されてい
るように、片側のフィンブリエ−円蓋（ＦＦ）を剥離
し、ＮＧＦ−生産性あるいはコントロールである非−感
染のプライマリー繊維芽細胞のいずれかを用いてコラー
ゲンを構成する移植片の置き換えを行った後の成体ラッ
トの前頭の矢状縫合部を概略的に示した図であり、
（ａ）〜（ｇ）は、その該当部分の写真である。（ＭＳ
＝培地の隔膜、Ｇ＝移植片、及びＤＧ＝海馬の有歯の脳
回、図５２（ａ），（ｂ）＝片側のＦＦの吸引障害（un
ilateral FF aspirative lesion））と、ＮＧＦ−生産
（図５２（ａ））あるいはコントロール（図５２
（ｂ））の移植片（矢じりは、中隔の中心線）のいずれ
かの置き換えを行った後に、ＮＧＦレセプターに対して
免疫組織化学的に染色された中隔を通して比較すること
のできるレベルで見た頭頂部分、；図５２（ｃ），
（ｄ）＝ＡＣｈＥで染色されたＮＧＦ−生産性あるいは
コントロールである非感染（図５２（ｄ））の繊維芽細
胞のいずれかの移植片を通して見た頭頂部分（点線は、
移植のほぼ境界線を示しており、スケールバーは、図５
２（ｂ），（ｃ）では１００μｍ； 図５２（ｄ）のス
ケールバーは２００μｍ）； 図５２（ｅ），（ｆ），
（ｇ））＝ＡＣｈＥで染色された海馬の有歯の脳回を通
して見た場合の頭頂部分（Ｇ＝顆粒層；， ＩＭ＝内側
の分子層； ＯＭ＝外側の分子層、及びＰ＝ポリモルフ
ォリン層）
【図５３】 （ａ）〜（ｄ）は実験例Ｘに記載されてい
るように、衰退してゆく蛍光で中隔神経がラベルされ、
続いてＮＧＦ−生産性の移植片を受け入れた動物に手術
を行った後の有歯の脳回内の蛍光ミクロスフェア（fluo
rescent microspheres）の定位置に配されることを示す
顕微鏡写真である。（図５３（ａ）＝同じ側の中心部分
の隔膜； 図５３（ｂ）＝反対側の斜めのバンド； 図
５３（ｃ）＝中隔の中心線； 及び図５３（ｄ）＝同じ
側の斜めのバンド； スケールバー＝５０μｍ）
【図５４】 （ａ）〜（ｆ）は、実験例Ｘに説明されて
いるとおり、手術を行った後のコラーゲン及びＮＧＦ−
生産性繊維芽細胞の移植片内にある髄鞘を有していない
軸索の超構造的分散配置を示す電子顕微鏡写真である。
（＊＝星状細胞の存在部分； Ｓ＝スワン細胞（Schwan
n cells）； Ｌ＝キャピラリーの管腔（ルーメン））
【図５５】 （ａ）〜（ｆ）は、実験例Ｘに説明されて
いるように、ＦＦを剥離してコラーゲンマトリックス中
にＮＧＦ−生産性の繊維芽細胞を移植した後においての
有歯の脳回中におけるＡＣｈＥ活性を、局所的な分配配
置として示した図（図５５（ａ））であり、またシナプ
スでの分配配置として示した図（図５５（ｂ）〜
（ｆ））である。（図５５（ａ）＝超構造的なレベルで
検出を行う組織にすぐに隣接している部分を採取し、Ａ
ＣｈＥで染色された有歯の脳回の頭頂部分（４０μ
ｍ）、ＩＭ＝内側の分子層、ＯＭ＝外側の分子層； Ｇ
＝顆粒層； Ｐ＝ポリモルフォリン層； 図５５（ｂ）
＝顆粒層； 図５５（ｃ）＝分子層；図５５（ｄ）、
（ｅ），（ｆ）の矢じり＝シナプスの接触部、Ｓｈ＝樹
状突起の形状； Ｓｐ＝脊髄、Ａｓ＝星状細胞の存在部
分、スケールバー：図５５（ａ）＝２５μｍ； 図５５
（ｂ）＝０．５μｍ、図５５（ｃ）及びそれぞれ図５５
（ｄ）〜（ｆ）＝０．２５μｍ）
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１０月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 標的細胞においての新しい機能の作用を概説
しかつ分析するための様式を模式的に示した図である。
【図２】 遺伝子操作されたドナー細胞を用いてＣＮＳ
内の標的細胞に新しい機能を導入するための手法を示し
た概略図である。
【図３】 トランス遺伝子を含む遺伝性のレトロウイル
スベクターの合成を説明するための概略図である。（Ｇ
ＡＧ＝特異的抗原基；ＥＮＶ＝エンベロープ；ＰＯＬ＝
逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａ
ｓｅ））
【図４】 実験例Ｉに記載されているような完全なベク
ターＬＳΔＰΔＬＭ及びｐＬＮＨＩ２の線形の制限酵素
マップを示した概略図である。（矢印は、プロモーター
の位置と、転写の方向を示している。ＬＳΔＰΔＬＭの
斜線を施したボックスは、インビトロで突然変異を起こ
すことによって組み入れられた新規な末端ヘキサペプチ
ドを有するタンパク質をコードしているヒトのＨＰＲＴ
ｃＤＮＡを現している。ＬＴＲ＝長末端反復配列）
【図５】 実験例Ｉに記載されているようなベクターｐ
ＬＮＨＬ２の環状の制限酵素マップを示す図である。
【図６】 （ａ）〜（ｆ）は実験例Ｉに説明されている
ように、ラットの基底ガングリア（ｒａｔ ｂａｓａｌ
ｇａｎｇｌｉａ）内に移植されたホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を用いて前もって感染させ
たプライマリーラットの繊維芽細胞の顕微鏡写真であ
る。（図６（ａ），（ｄ）＝抗−フィブロネクチン（ａ
ｎｔｉ−ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）；図６（ｂ），
（ｅ）＝クレシールバイオレット（ｃｒｅｓｙｌ ｖｉ
ｏｌｅｔ）；図６（ｃ），（ｆ）＝ＧＦＡＰ； 倍率：
図６（ａ）〜（ｃ）＝８８Ｘ；（ｄ）〜（ｆ）＝４４０
Ｘ）
【図７】 実験例Ｉに説明されているように、基底ガン
グリアからの脳抽出物のＨＰＲＴ酵素活性に対して行わ
れた等電点に焦点を合わせた時の電気泳動ゲルのパター
ンを示す写真である。
【図８】 実験例ＩＩにおいて説明されているようなベ
クターｐＬＬＲＮＬの環状の制限酵素マップを示す図で
ある。
【図９】 実験例ＩＩにおいて説明されているようなベ
クターｐＰＲ１の環状の制限酵素マップを示す図であ
る。
【図１０】 実験例ＩＩにおいて説明されているような
ベクターｐＵＣＲＨの環状の制限酵素マップを示す図で
ある。
【図１１】 実験例ＩＩにおいて示されているように、
ウイルス性の５’長末端反復配列（ＬＴＲ）のコントロ
ールのもとにおかれている、マウスの神経成長因子（Ｎ
ＧＦ）ｃＤＮＡの７７７塩基対Ｈｇａ１−Ｐｓｔ１フラ
グメントを含有する完全なＮＧＦレトロウイルスベクタ
ーＰＬＮ．８ＲＮＬの直線状の制限酵素マップを示す図
である。（矢印は、転写の開始部位を示している。；ｐ
ｓｉ（φ）＝レトロウイルス性のパッケージされている
シグナル；ＲＳＶ＝ルース サルコーマウイルスのプロ
モーター（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｐ
ｒｏｍｏｔｅｒ）；ｎｅｏＲ＝ネオマイシン−耐性遺伝
子のマーカー）
【図１２】 図１１及び実験例ＩＩに示したようなベク
ターｐＬＮ，８ＲＮＬの環状の制限酵素マップを示す図
である。
【図１３】 （ａ）〜（ｆ）は、実験例ＩＩにおいて説
明されているようなフィブロネクチン及びＣｈＡＴに対
して、免疫組織化学的な染色を行った場合の生物組織の
顕微鏡写真である。（図１３（ａ），（ｂ）＝卵管のフ
ィンブリエの円蓋腔（ｔｈｅ ｆｉｍｂｒｉａ ｆｏｒ
ｎｉｘ ｃａｖｉｔｙ）； 図１３（ｃ）〜（ｆ）＝Ｃ
ｈＡＴに対して染色が行われている組織の内側の隔膜
（ｍｅｄｉａｌ ｓｅｐｔｕｍ）を通して採取した頭頂
部分（ｃｏｒｏｎａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ）； 図１３図
１３（ａ），（ｃ），（ｅ）＝レトロウイルス−感染し
た細胞を移植された動物； 図１３（ｂ），（ｄ），
（ｆ）＝コントロールの細胞を移植された動物； 倍率
（Ｍａｇ．）：図１３（ａ）及び（ｂ）＝２０Ｘ； 図
１３（ｃ）及び（ｄ）＝７０Ｘ； 図１３（ｅ）及び
（ｆ）＝２２０Ｘ）
【図１４】 実験例ＩＩにおいて説明したように、ラッ
トの隔膜内にあるＣｈＡＴ−免疫反応性の細胞の生存
を、ＮＧＦの存在する場合及び存在しない場合について
調べた場合の結果を示すグラフである。
【図１５】 （ａ）〜（ｆ）は、実験例ＩＩにおいて説
明したアセチルコリンエステラーゼの組織化学を示す生
物組織の顕微鏡写真である。（図１５（ａ）＝ＮＧＦ−
感染されたドナー細胞を移植された動物の低倍率のも
の； 図１５（ｃ）＝内側の隔膜を通した場合の（ａ）
の高倍率のもの； 図１５（ｅ）＝背側で側方の象限を
通して（ａ）を高倍率にしたもの； 図１５（ｂ），
（ｄ），（ｆ）＝コントロールの細胞を移植された動物
で、図１５（ａ），（ｃ），（ｅ）に対して記載したの
と同じ条件で行われたもの； 倍率（Ｍａｇ．）：図１
５（ａ），（ｂ）＝２０Ｘ； 図１５（ｃ）〜（ｆ）＝
２２０Ｘ）
【図１６】 実験例ＩＩＩに記載されているように、ｐ
ＬＴｈＲＮＬレトロウイルス性の完全なベクターの線形
状の制限酵素マップを示す概略図である。（矢印は、プ
ロモーターの位置と転写の方向を示している。； ＬＴ
Ｒ＝長末端反復配列； ＲＳＶ＝修飾されたＲＳＶプロ
モーター； ｎｅｏＲ＝ネオマイシン−抵抗性の遺伝
子）
【図１７】 図１６に示され、かつ実験例ＩＩにおいて
説明されているように、ベクターｐＬＴｈＲＮＬの誘導
を説明するための図である。
【図１８】 （ａ）〜（ｄ）は、実験例ＩＩＩにおいて
説明されているとおり、フィブロネクチン免疫活性を示
す尾形への繊維芽細胞移植を示す生物組織の顕微鏡写真
である。（倍率：図１８（ａ），（ｃ）＝１０Ｘ； 図
１８（ｂ），（ｄ）＝２０Ｘ）
【図１９】 実験例ＩＩＩに説明されているとおり、４
群の実験動物のグループについて、基準点から次の移植
までのローテーションの回数を調べた場合の平均的な変
化の割合を示すグラフである。（図面の上部：尾の線条
体においてコントロールによる移植及びＴＨ−感染物に
ついての移植による置き換え；下部：吻側の線条体にお
いてコントロールによる移植及びＴＨ−感染物について
の移植による置き換え；横軸は標準偏差）
【図２０】 実験例ＩＶにおける記載に従って、プライ
マリースキン（ｐｒｉｍａｒｙｓｋｉｎ）の繊維芽細胞
及びラット−１の繊維芽細胞の成長曲線を示したグラフ
である。
【図２１】 実験例ＩＶにおいて記載されているよう
に、移植するに先立ち培地において一回あるいは４回の
継代接種を行った後、経過を観察しつつ３週間から８週
間生存させた後の自己の繊維芽細胞の容量（ｍｍ３）を
示すヒストグラムである。
【図２２】 実験例ＩＶに記載されているように、１μ
ｌあたり１０４個、２．５×１０４個、及び１０５個の
細胞を移植して得られた自己の繊維芽細胞移植片の容量
（ｍｍ３）を示すヒストグラムである。
【図２３】 （ａ）〜（ｄ）は、実験例ＩＶで説明した
とおり、移植後、３週間（図２３（ａ），（ｃ））及び
８週間（図２３（ｂ），（ｄ））たった時点で繊維芽細
胞を免疫組織化学的に染色し、得られた線条体プライマ
リー繊維芽細胞における移植片（Ｇ）を示す生物組織の
顕微鏡写真である。（倍率：図２３（ａ），（ｂ）＝１
２Ｘ； 図２３（ｃ），（ｄ）＝１２０Ｘ）
【図２４】 （ａ）〜（ｆ）は、実験例ＩＶにおいて説
明されているように、移植後、３週間（図２４（ａ），
（ｃ），（ｅ））及び８週間（図２４（ｂ），（ｄ），
（ｆ））たった時点で、図２４（ａ）及び（ｂ）はクレ
シルバイオレットで染色した線条体内のプライマリー繊
維芽細胞における移植片（Ｇ）を示す細胞組織の顕微鏡
写真、図２４（ｃ）及び（ｄ）は同時点で、ＧＦＡＰに
ついて免疫学的に染色した線条体内のプライマリー繊維
芽細胞における移植片（Ｇ）を示す細胞組織の顕微鏡写
真、そして図２４（ｅ）及び（ｆ）は同時点で、ＯＸ−
４２について免疫学的に染色した線条体内のプライマリ
ー繊維芽細胞における移植片（Ｇ）を示す細胞組織の顕
微鏡写真である。（倍率＝１２０Ｘ）
【図２５】 （ａ）〜（ｃ）は、実験例ＩＶにおいて説
明したように、移植（Ｆ＝繊維芽細胞自体； 黒い星印
＝繊維芽細胞の存在部分である。）した後８週間での自
己移植の超構造（ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を示
す生物組織の顕微鏡写真である。（倍率：図２５（ａ）
＝６，６００Ｘ； 図２５（ｂ）＝９，１００Ｘ； 図
２５（ｃ）＝１６，６００Ｘ）
【図２６】 （ａ），（ｂ）は、実験例ＩＶに記載され
ているように、移植片に存在する星状細胞の存在部分及
び食細胞を示す生物組織の顕微鏡写真である。（倍率：
図２６（ａ）＝１６，６００Ｘ； 図２６（ｂ）＝１
５，０００Ｘ）
【図２７】 （ａ）〜（ｄ）は、実験例ＩＶにおいて記
載したように、移植血管を示す生物組織の顕微鏡写真で
ある。（図２７（ａ）、Ｅ＝窓のない内皮細胞（ｆｅｎ
ｅｓｔｒａｔｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ
ｓ））； 図２７（ｂ）、矢じり部分＝嵌入部分； 図
２７（ｃ）、矢印＝細胞内部への注入；図２７（ｄ）、
Ａｓ＝星状細胞の存在部分； 倍率：図２７（ａ）＝１
３，２００Ｘ； 図２７（ｂ）＝２５，４００Ｘ； 図
２７（ｃ）＝２５，０００Ｘ；図２７（ｄ）＝１６，６
００Ｘ）
【図２８】 実験例Ｖにおいて説明したように、ＴＨト
ランス遺伝子を含有するプライマリー繊維芽細胞のチロ
シンヒドロキシラーゼに対して、インビトロでラベリン
グした結果を示す細胞組織の顕微鏡写真である。（倍率
＝２５Ｘ）
【図２９】 実験例Ｖにおいて説明されているように、
アポモルフィンが導入された６−ＯＨＤＡ−障害を与え
られたラット（６−ＯＨＤＡ−ｌｅｓｉｏｎｅｄｒａｔ
ｓ）での転回行動に対しての移植の結果を示すグラフで
ある。
【図３０】 （ａ）〜（ｂ）は、実験例Ｖにおいて説明
したように、ラットの線条体に移植されたＴＨプライマ
リー繊維芽細胞に、インシトゥでハイブリダイゼーショ
ンした結果を示す生物組織の顕微鏡写真である。（図３
０（ａ）は、ＦＦ２／ＴＨ細胞の移植片； 図３０
（ｂ）は、ＦＦ２／βＧａｌ細胞（コントロール）の移
植片； Ｇ＝移植片； Ｖ＝脳室）
【図３１】 （ａ）〜（ｄ）は、実験例Ｖに記載された
とおり、βＧａｌ組織化学的にあるいはＴＨｍＲＮＡに
インシトゥでハイブリダイゼーションのいずれかに対し
て、移植された細胞をインビボでラベリングした結果を
示す細胞組織の顕微鏡写真である。（図３１（ａ）は、
βＧａｌを組織化学的に染色したＦＦ２／βＧａｌの移
植片； 図３１（ｂ）は、ＦＦ２／Ｇａｌ移植片の高倍
率としたもの； 図３１（ｃ）は、ＦＦ２／ＴＨ移植で
のＴＨ ｍＲＮＡに対するインシトゥでのハイブリダイ
ゼーション、矢印＝繊維芽細胞； 図３１（ｄ）は、Ｆ
Ｆ２／βＧａｌ移植でのＴＨ ｍＲＮＡに対するインシ
トゥでのハイブリダイゼーション； 倍率：（ａ）＝１
０Ｘ、（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）＝４０Ｘ）
【図３２】 （ａ），（ｂ）は、実験例Ｖにおいて示さ
れているように、インビボにおけるＦＦ２／ＴＨ繊維芽
細胞のＴＨ−免疫活性を示す顕微鏡写真である。（アス
トリスク＝ロダミン蛍光色素； 倍率＝２０Ｘ）
【図３３】 実験例ＶＩに示され、かつ説明されている
ように、遺伝子及び細胞タイプから得られるヒトのＮＧ
Ｆの分泌を図示したグラフである。
【図３４】 実験例ＶＩＩに示されているように、ｐＬ
ＣｈＲＮＬベクターの模式図である。
【図３５】 （ａ）〜（ｆ）は、実験例ＶＩＩにおいて
記載されているように、免疫染色された繊維芽細胞の顕
微鏡写真である。
【図３６】 （ａ）〜（ｃ）は、実験例ＶＩＩにおける
記載に従うものであって、図３６（ａ）は、繊維芽細胞
から得られた全ＲＮＡのノーザンブロット分析の電気泳
動パターンを示す写真であり、図３６（ｂ）は、繊維芽
細胞におけるｃｈＡＴ活性を分析した棒グラフであり、
図３６（ｃ）は繊維芽細胞によって培地に分泌されたＡ
Ｃｈを分析した棒グラフである。
【図３７】 （ａ）〜（ｂ）は、ＨＰＬＣによって測定
されているように、また、実験例ＶＩＩに記載されてい
るように、ラット−１／ｄＣｈＡＴの培養物にコリンク
ロライドを添加した結果を図示したグラフである。（図
３７（ａ）＝細胞内のＡＣｈ及び細胞外のＡＣｈにおけ
る効果； 図３７（ｂ）＝ＣｈＡＴ活性についての効
果）
【図３８】 （ａ）〜（ｃ）は、実験例ＶＩＩにて説明
に基づいて、ｄＣｈＡＴの発現に対して血清を除去する
ことによって導かれる静止期の状態を結果的に示してお
り、図３８（ａ）はＣｈＡＴ活性に対する効果を示すグ
ラフであり、図３８（ｂ）は定常レベルのｄＣｈＡＴ
ｍＲＮＡについての効果を示すノーザンブロット分析の
電気泳動パターンを示す写真であり、そして図３８
（ｃ）はｄＣｈＡＴ／シクロフィリン（ｃｙｃ．） ｍ
ＲＮＡの比に対する効果を示すグラフである。
【図３９】 （ａ）〜（ｃ）は、実験例ＶＩＩにて説明
に基づいて、ｄＣｈＡＴの発現に対して阻害剤を接触さ
せることによって導かれる静止期の状態の影響を示して
おり、図３９（ａ）はＣｈＡＴ活性に対する効果を示す
グラフであり、図３９（ｂ）はｄＣｈＡＴ ｍＲＮＡの
レベルに対する効果を示すノーザンブロット分析の電気
泳動パターンを示す写真であり、そして図３９（ｃ）は
ｄＣｈＡＴ／シクロフィリン（ｃｙｃ．）の比に対する
効果を示すグラフである。
【図４０】 実験例ＶＩＩにおいて記載されているよう
に、融合性の繊維芽細胞から得られるＡＣｈの遊離にお
けるコリンの影響を示す棒グラフである。
【図４１】 実験例ＶＩＩＩにおいて説明されているよ
うに、ベクターｐＳＶＳ３２ＡＣＡＴの環状の制限酵素
マップを示す図である。
【図４２】 実験例ＶＩＩＩにおいて説明されているよ
うに、ベクターｐＭＬＶＣＡＴの環状の制限酵素マップ
を示す図である。
【図４３】 実験例ＶＩＩＩにおいて説明されているよ
うに、ベクターｐＣＭＶＣＡＴの環状の制限酵素マップ
を示す図である。
【図４４】 実験例ＶＩＩＩにおいて説明されているよ
うに、ＳＶ ４０、ＬＴＲ及びコラーゲンプロモーター
（Ｃｏｌｌ及びＣｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハン
サー）の相対的なＣＡＴ発現を示す棒状グラフである。
【図４５】 （ａ）〜（ｂ）は、実験例ＩＸにおいて説
明されているように、ｄＣｈＡＴ−発現性の繊維芽細胞
におけるＴＧＦβ、ＩＬ−１β及びＴＮＦαの効果を示
すノーザンブロット分析による電気泳動パターンの写真
である。（図４５（ａ）は、ＴＧＦ−β（レーン２）及
びＩＬ−１β（レーン３）の効果を示す。図４５（ｂ）
は、Ｉｎｆγの効果を示している。レーン１＝コントロ
ール； シクロフィリン（Ｃｙｃ）＝実質的なコントロ
ール； レーン２＝２４時間後の効果； レーン３＝４
８時間後の効果； ｄＣｈＡＴ＝ｄＣｈＡＴプロウイル
ス性（ｐｒｏｖｉｒａｌ）のｍＲＮＡを示している。）
【図４６】 実験例ＩＸにおいて説明されているよう
に、融合性のｄＣｈＡＴ−生産性の繊維芽細胞における
ＴＧＦγ及びＩＬ−１βの複合投与、更にデキサメタゾ
ンを加えた複合投与の効果を示すノーザンブロット分析
による電気泳動パターンの写真である。（レーン１＝コ
ントロール； レーン２＝ＴＧＦ−β／ＩＬ−１β；
レーン３＝デキサメタゾンのみの投与； レーン４＝Ｔ
ＧＦβ／ＩＬ−１β及びデキサメタゾン； 強いシグナ
ル＝ｄＣｈＡＴ ｍＲＮＡ； 弱いシグナル＝シクロフ
ィリン ｍＲＮＡ）
【図４７】 （ａ）〜（ｂ）は、実験例ＩＸに記載され
ているように、２％の血清に対して１０％含まれている
コラーゲンプロモーターについての活性と、コラーゲン
プロモーター上の種々のサイトカインの効果について示
している棒状グラフである。
【図４８】 （ａ）〜（ｄ）は、実験例ＩＸにおいて記
載されているように、図４８（ａ）及び図４８（ｂ）は
成体のフィッシャーラット（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｒａｔ
ｓ）の線条体に移植されたＬＴＲ−ＣＡＴ細胞の移植片
を示す生物組織の顕微鏡写真であり、また、図４８
（ｃ）及び図４８（ｄ）は成体のフィッシャーラットの
線条体に移植されたＣｏｌｌ（Ｅ）−ＣＡＴ細胞の移植
片を示す生物組織の顕微鏡写真である。（白い矢印＝繊
維芽細胞）
【図４９】 （ａ）〜（ｄ）は、実験例Ｘにおいて記載
されているように、右の線条体に注入されて遺伝子的に
修飾された細胞、及び左の線条体に注入された感染され
ていないコントロールをそれぞれ移植した後、図４９
（ａ）及び図４９（ｂ）は１週間たった時点、及び図４
９（ｃ）及び図４９（ｄ）は８週間たった時点で、左と
右の線条体を通過して水平に切断した状態の生物組織を
示す顕微鏡写真である。（Ｇ＝移植片； ＮＢ＝メイネ
ルト（Ｍｅｙｎｅｒｔ）の核の基底（ｎｕｃｌｅｕｓ
ｂａｓａｌｉｓ）； ＲＴ＝細網の視床核（ｒｅｔｉｃ
ｕｌａｒ ｔｈａｌａｍｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ）； ス
ケールバー：図４９（ａ），（ｂ）は０．４５ｍｍ；
図４９（ｃ），（ｄ）は、０．２２ｍｍ）
【図５０】 実験例Ｘに記載されているように、移植
後、８週間たった時点のＮＧＦ−生産細胞が結合された
移植片を示す生物組織の電子顕微鏡写真である。（Ｆ＝
繊維芽細胞； Ｅ＝内皮細胞； 矢印＝星状細胞の存在
部分； スケールバー＝１．０μｍ）
【図５１】 実験例Ｘにおいて記載されているように、
８週間たった時点のＮＧＦ−生産細胞の移植片内での軸
索−膠の配列（ａｘｏ−ｇｌｉａｌ ａｒｒａｎｇｅｍ
ｅｎｔ）を示す細胞組織の顕微鏡写真（図５１（ａ））
及びその模式図（図５１（ｂ））である。（Ａｘ＝髄鞘
のない軸索； Ａｓ＝反応性の星状細胞の存在部分；
矢じり＝基底層（ｂａｓａｌ ｌａｍｉｎａ）； スケ
ールバー＝１．０μｍ）
【図５２】 図５２（ｈ）は、実験例Ｘにおいて記載さ
れているように、片側のフィンブリエ−円蓋（ＦＦ）を
剥離し、ＮＧＦ−生産性あるいはコントロールである非
−感染のプライマリー繊維芽細胞のいずれかを用いてコ
ラーゲンを構成する移植片の置き換えを行った後の成体
ラットの前頭の矢状縫合部を概略的に示した図である。
（ＭＳ＝培地の隔膜、Ｇ＝移植片、及びＤＧ＝海馬の有
歯の脳回）図５２（ａ）〜（ｇ）は、図５２（ｈ）で示
した該当部分の生物組織の写真である。図５２（ａ）
は、片側のＦＦの吸引障害（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ Ｆ
Ｆａｓｐｉｒａｔｉｖｅ ｌｅｓｉｏｎ）とＮＧＦ−生
産の移植片（矢じりは、中隔の中心線）の置き換えを行
った後に、ＮＧＦレセプターに対して免疫組織化学的に
染色された中隔を通して比較することのできるレベルで
見た頭頂部分の写真である。図５２（ｂ）は、片側のＦ
Ｆの吸引障害とコントロールの移植片（矢じりは、中隔
の中心線）の置き換えを行った後に、ＮＧＦレセプター
に対して免疫組織化学的に染色された中隔を通して比較
することのできるレベルで見た頭頂部分の写真である。
図５２（ｃ）は、ＡＣｈＥで染色されたＮＧＦ−生産性
の繊維芽細胞の移植片を通して見た頭頂部分の写真であ
り、図５２（ｄ）は、ＡＣｈＥで染色されたコントロー
ルである非感染の繊維芽細胞の移植片を通して見た頭頂
部分の写真である（点線は、移植のほぼ境界線を示して
いる。）。（図５２（ｂ）及び（ｃ）のスケールバーは
１００μｍであり、図５２（ｄ）のスケールバーは２０
０μｍである。） 図５２（ｅ），（ｆ）及び（ｇ）
は、ＡＣｈＥで染色された海馬の有歯の脳回を通して見
た場合の頭頂部分の写真である。（Ｇ＝顆粒層、ＩＭ＝
内側の分子層、ＯＭ＝外側の分子層、及びＰ＝ポリモル
フォリン層）
【図５３】 図５３（ａ）〜（ｄ）は実験例Ｘに記載さ
れているように、衰退してゆく蛍光で中隔神経がラベル
され、続いてＮＧＦ−生産性の移植片を受け入れた動物
に手術を行った後の有歯の脳回内の蛍光ミクロスフェア
（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ
ｓ）の定位置に配されることを示す生物組織の顕微鏡写
真である。（図５３（ａ）＝同じ側の中心部分の隔膜；
図５３（ｂ）＝反対側の斜めのバンド； 図５３
（ｃ）＝中隔の中心線； 及び図５３（ｄ）＝同じ側の
斜めのバンド； スケールバー＝５０μｍ）
【図５４】 図５４（ａ）〜（ｆ）は、実験例Ｘに説明
されているとおり、手術を行った後のコラーゲン及びＮ
ＧＦ−生産性繊維芽細胞の移植片内にある髄鞘を有して
いない軸索の超構造的分散配置を示す生物組織の電子顕
微鏡写真である。（＊＝星状細胞の存在部分； Ｓ＝ス
ワン細胞（Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌｓ）； Ｌ＝キャ
ピラリーの管腔（ルーメン））
【図５５】 図５５（ａ）〜（ｆ）は、実験例Ｘに説明
されているように、ＦＦを剥離してコラーゲンマトリッ
クス中にＮＧＦ−生産性の繊維芽細胞を移植した後にお
いての有歯の脳回中におけるＡＣｈＥ活性を示す生物組
織の顕微鏡写真であって、図５５（ａ）は局所的な分配
配置として示している顕微鏡写真、また図５５（ｂ）〜
（ｆ）はシナプスでの分配配置として示している顕微鏡
写真である。図５５（ａ）は、超構造的なレベルで検出
を行う組織にすぐに隣接している部分を採取して、ＡＣ
ｈＥで染色した有歯の脳回の頭頂部分（４０μｍ）の顕
微鏡写真である。（ＩＭ＝内側の分子層、ＯＭ＝外側の
分子層、Ｇ＝顆粒層、Ｐ＝ポリモルフォリン層） 図５
５（ｂ）は顆粒層を示す顕微鏡写真である。図５５
（ｃ）は分子層を示す写真である。（図５５（ｄ）、
（ｅ），（ｆ）における矢じり＝シナプスの接触部、Ｓ
ｈ＝樹状突起の形状、Ｓｐ＝脊髄、Ａｓ＝星状細胞の存
在部分、スケールバー：図５５（ａ）＝２５μｍ、図５
５（ｂ）＝０．５μｍ、図５５（ｃ）及びそれぞれ図５
５（ｄ）〜（ｆ）＝０．２５μｍ） ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１０月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図９】
【図２】
【図３】
【図６】
【図３４】
【図４】
【図５】
【図１１】
【図４６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１３】
【図１２】
【図１４】
【図１６】
【図１５】
【図１７】
【図１９】
【図１８】
【図２０】
【図２８】
【図３６】
【図２１】
【図２２】
【図５０】
【図２３】
【図２４】
【図２６】
【図２５】
【図２７】
【図３３】
【図４２】
【図２９】
【図３１】
【図４０】
【図３０】
【図３２】
【図４４】
【図３５】
【図３７】
【図３８】
【図４１】
【図３９】
【図４３】
【図４５】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５１】
【図５３】
【図５４】
【図５２】
【図５５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フレッド ゲイジ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 90237 ラホラ カミニトヘレコ 8358 (72)発明者 セオドア フリードマン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 90237 ラホラ ラホラショアーズドライ ブ 9470 (72)発明者 マイケル ビー． ローゼンバーグ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92130 サンディエゴ ナンバー193 トレ イブラフドライブ 12688 (72)発明者 ジョン エイ． ウォルフ アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53705 マジソン ユニバーシティベイド ライブ 1122 (72)発明者 マルコム シンスティン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92130 サンディエゴ アパートメント190 カラメルクリークロード 12510 (72)発明者 マイケル デー． カワジャ カナダ国 Ｍ４Ｘ １Ｋ２ オンタリオ州 トロント ナンバー３ シャーボーンス トリート 404 (72)発明者 ヤソダラ レイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92130 サンディエゴ コートデラシエナ 4184

Claims (74)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】哺乳動物の中枢神経系における欠陥、疾
    病、あるいは損傷をこうむっている細胞を治療するため
    の方法において、その方法は中枢神経系にドナー細胞を
    移植する段階を有しており、前記ドナー細胞が中枢神経
    系における前記欠陥、疾病、あるいは損傷をこうむって
    いる細胞を修復するのに充分量の機能性分子を生産する
    ことができるように遺伝子操作されていることを特徴と
    する細胞の治療方法。
  2. 【請求項２】前記ドナー細胞を移植する段階が、検体の
    脳に前記ドナー細胞を導入する段階を含むことを特徴と
    する請求項１記載の細胞の治療方法。
  3. 【請求項３】前記ドナー細胞を移植する段階が、検体の
    脊髄に前記ドナー細胞を導入する段階を含むことを特徴
    とする請求項１記載の細胞の治療方法。
  4. 【請求項４】前記導入が、脳内、室内、硬膜下腔、被
    殻、子房下位、海馬、皮質、条内、尾形内、または静脈
    内に注入することからなることを特徴とする請求項２記
    載の細胞の治療方法。
  5. 【請求項５】前記ドナー細胞が、前記細胞内に少なくと
    も一つの治療性のトランス遺伝子を挿入することによっ
    て操作されていることを特徴とする請求項１記載の細胞
    の治療方法。
  6. 【請求項６】前記挿入段階が、ウイルス性のベクターあ
    るいはレトロウイルス性のベクターあるいは向神経性ウ
    イルスからなるグループから選択されるベクターであっ
    て、前記トランス遺伝子を運搬するベクターを挿入する
    段階からなることを特徴とする請求項５記載の細胞の治
    療方法。
  7. 【請求項７】前記ベクターは、疱疹ウイルスベクターで
    あることを特徴とする請求項６記載の細胞の治療方法。
  8. 【請求項８】前記ベクターは、狂犬病ウイルスベクター
    であることを特徴とする請求項６記載の細胞の治療方
    法。
  9. 【請求項９】前記ベクターは、ウイルス性のベクターで
    あることを特徴とする請求項６記載の細胞の治療方法。
  10. 【請求項１０】前記ベクターは、レトロウイルス性のベ
    クターであることを特徴とする請求項６記載の細胞の治
    療方法。
  11. 【請求項１１】前記レトロウイルス性のベクターは、図
    １２に示されているような最終構造を持つ、レトロウイ
    ルスベクターｐＬＮ．８ＲＮＬであることを特徴とする
    請求項１０記載の細胞の治療方法。
  12. 【請求項１２】前記レトロウイルス性のベクターは、図
    １６に示されているような最終構造を持つ、レトロウイ
    ルスベクターｐＬＴｈＲＮＬであることを特徴とする請
    求項１０記載の細胞の治療方法。
  13. 【請求項１３】前記ドナー細胞への挿入段階が、トラン
    ス遺伝子をエンコードしているＤＮＡを、非ウイルス性
    であってかつ自然の法則に従うようにトランスフェクシ
    ョンすることを特徴とする請求項５記載の細胞の治療方
    法。
  14. 【請求項１４】前記非ウイルス性であってかつ自然の法
    則に従うトランスフェクションが、トランス遺伝子をエ
    ンコードするＤＮＡのマイクロインジェクションである
    ことを特徴とする請求項１３記載の細胞の治療方法。
  15. 【請求項１５】前記ドナー細胞への挿入段階は、エレク
    トロポレイション（electroporation）段階であること
    を特徴とする請求項５記載の細胞の治療方法。
  16. 【請求項１６】前記ドナー細胞への挿入段階は、化学的
    に仲介されているトランスフェクションであることを特
    徴とする請求項５記載の細胞の治療方法。
  17. 【請求項１７】前記化学的に仲介されているトランスフ
    ェクションが、カルシウムホスフェート トランスフェ
    クションであることを特徴とする請求項１６記載の細胞
    の治療方法。
  18. 【請求項１８】前記ドナー細胞への挿入段階は、リポソ
    ーム仲介のトランスフェクションであることを特徴とす
    る請求項５記載の細胞の治療方法。
  19. 【請求項１９】前記ドナー細胞への挿入段階は、リポフ
    ェクション（lipofection）であることを特徴とする請
    求項５記載の細胞の治療方法。
  20. 【請求項２０】前記機能性分子は、成長因子、酵素、ガ
    ングリオシド、抗生物質、神経伝達物質、及びこれらの
    分子の前駆体からなるグループから選択されることを特
    徴とする請求項１記載の細胞の治療方法。
  21. 【請求項２１】前記治療性のトランス遺伝子は、チロシ
    ンヒドロキシラーゼ、ＮＧＦ、トリプトファンヒドロキ
    シラーゼ、ＣｈＡＴ、ＧＡＢＡ−デカルボキシラーゼ、
    エンケファリン、ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤ
    Ｃ）、シリアリーニューロナルトロフィックファクター
    （ＣＮＴＦ：ciliary neuronal trophic factor）、脳
    由来のニューロトロフィックファクター（ＢＤＮＦ：br
    ain derived neurotrophic factor）、ニューロトロフ
    ィン（ＮＴ−３）、ＮＴ−４、及びベイシックフィブロ
    ブラスト グロース ファクター（基底繊維芽細胞成長
    因子：ｂＦＧＦ）からなるグループから選択されること
    を特徴とする請求項５記載の細胞の治療方法。
  22. 【請求項２２】請求項１記載の細胞の治療方法は更に、
    中枢神経系に起こった前記疾病あるいは損傷を治療する
    ための治療薬を共に投与することを含むことを特徴とす
    る細胞の治療方法。
  23. 【請求項２３】前記治療薬は、成長因子、ガングリオシ
    ド、抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、毒物、代
    謝拮抗物質、軸索プロモーティング分子（neurite prom
    oting molecules）、及びこれらの薬物の前駆体からな
    るグループから選択されることを特徴とする請求項２２
    記載の細胞の治療方法。
  24. 【請求項２４】前記治療薬は、細胞性の物質であること
    を特徴とする請求項２２記載の細胞の治療方法。
  25. 【請求項２５】前記細胞性の物質は、副腎クロム親和性
    細胞、胎児の脳組織細胞、及び胎盤細胞からなるグルー
    プから選択されることを特徴とする請求項２４記載の細
    胞の治療方法。
  26. 【請求項２６】請求項１記載の細胞の治療方法は更に、
    前記損傷あるいは疾病をこうむっている部位に、損傷を
    受けた神経の再結合あるいは相互関係の改善を容易にす
    るのに役立つ物質を移植する段階を含むことを特徴とす
    る細胞の治療方法。
  27. 【請求項２７】前記物質は、脳のホモジェネート、胎盤
    のホモジェネート、コラーゲン、完全な細胞、合成の物
    質、軸索プロモーティング細胞外マトリックス、及び遺
    伝子的に修飾されたドナー細胞からなるグループから選
    択されることを特徴とする請求項２６記載の細胞の治療
    方法。
  28. 【請求項２８】前記ドナー細胞は、フィブロブラスト
    （神経芽細胞）、神経、グリアル細胞（神経膠細胞）、
    ケラチノサイト（ケラチン生成細胞）、ヘパトサイト
    （脳室の上衣細胞）、ボーンマロウ細胞（骨髄細胞）、
    海馬細胞、嗅覚の粘膜細胞、ステム細胞、副腎細胞、連
    結細胞、白血球、及びクロム親和性細胞からなるグルー
    プから選択されることを特徴とする請求項１記載の細胞
    の治療方法。
  29. 【請求項２９】前記ドナー細胞は、異種の解剖学的構造
    領域から得られる細胞タイプの混合細胞であることを特
    徴とする請求項１記載の細胞の治療方法。
  30. 【請求項３０】前記細胞は、プライマリー細胞であるこ
    とを特徴とする請求項１記載の細胞の治療方法。
  31. 【請求項３１】前記細胞は、不滅化された細胞であるこ
    とを特徴とする請求項１記載の細胞の治療方法。
  32. 【請求項３２】前記ドナー細胞の移植段階は、一回の移
    植当り約１０4個から約１０8個の細胞を移植することを
    特徴とする請求項１記載の細胞の治療方法。
  33. 【請求項３３】前記ドナー細胞は、約２回から約２０回
    継代接種された細胞からなることを特徴とする請求項１
    記載の細胞の治療方法。
  34. 【請求項３４】前記移植段階は、数種の異なる部位にお
    ける遺伝子的に操作されたドナー細胞の複合的な移植で
    あることを特徴とする請求項１記載の細胞の治療方法。
  35. 【請求項３５】前記ドナー細胞は、前記細胞に挿入され
    たトランス遺伝子の混合物であることを特徴とする請求
    項３４記載の細胞の治療方法。
  36. 【請求項３６】前記ドナー細胞は、細胞タイプが混合し
    た細胞であることを特徴とする請求項３４記載の細胞の
    治療方法。
  37. 【請求項３７】前記移植段階は、単一の部位への遺伝子
    的に操作されたドナー細胞の複合的な移植であることを
    特徴とする請求項１記載の細胞の治療方法。
  38. 【請求項３８】前記ドナー細胞は、細胞タイプが混合し
    た細胞であることを特徴とする請求項３７記載の細胞の
    治療方法。
  39. 【請求項３９】前記ベクターは、前記ドナー細胞が静止
    しているときに前記トランス遺伝子の発現を高めるよう
    なプロモーターを運搬することを特徴とする請求項６記
    載の細胞の治療方法。
  40. 【請求項４０】前記プロモーターは、コラーゲンプロモ
    ーターであることを特徴とする請求項３９記載の方法。
  41. 【請求項４１】前記コラーゲンプロモーターは、α１
    （Ｉ）及びα２（Ｉ）からなるグループから選択される
    ことを特徴とする請求項４０記載の細胞の治療方法。
  42. 【請求項４２】前記ベクターは更に、前記プロモーター
    の活性を増強するエンハンサー配列を運搬することを特
    徴とする請求項３９記載の細胞の治療方法。
  43. 【請求項４３】前記エンハンサー配列は、ＳＶ４０エン
    ハンサー配列であることを特徴とする請求項４２記載の
    細胞の治療方法。
  44. 【請求項４４】前記エンハンサー配列は、コラーゲンプ
    ロモーターのエンハンサー配列であることを特徴とする
    請求項４２記載の細胞の治療方法。
  45. 【請求項４５】前記エンハンサー配列はα２（Ｉ）コラ
    ーゲンエンハンサー配列であることを特徴とする請求項
    ４４記載の細胞の治療方法。
  46. 【請求項４６】請求項３９記載の細胞の治療方法は更
    に、前記分子の発現を調節するためにサイトカイン（cy
    tokines）を投与することを含むことを特徴とする細胞
    の治療方法。
  47. 【請求項４７】前記サイトカインは、インターロイキン
    −１β、インターフェロン−α、腫瘍神経症因子−α、
    腫瘍成長因子−β、基底繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧ
    Ｆ）、及び表皮成長因子（ＥＧＦ）からなるグループか
    ら選択されることを特徴とする請求項４６記載の細胞の
    治療方法。
  48. 【請求項４８】請求項１記載の細胞の治療方法は更に、
    哺乳動物のＣＮＳにおけるドナー細胞の生存を維持する
    ための成長因子の使用を含むことを特徴とする細胞の治
    療方法。
  49. 【請求項４９】前記成長因子は、ｂＦＧＦあるいはＥＧ
    Ｆであることを特徴とする請求項４８記載の細胞の治療
    方法。
  50. 【請求項５０】請求項１記載の細胞の治療方法は更に、
    前記分子のための前駆体を投与することによって前記機
    能性分子の分泌の調節を行うこと含む細胞の治療方法。
  51. 【請求項５１】前記機能性分子はアセチルコリンであ
    り、また前記前駆体はコリンであることを特徴とする請
    求項５０記載の細胞の治療方法。
  52. 【請求項５２】前記ドナー細胞は、プライマリー繊維芽
    細胞であることを特徴とする請求項１記載の細胞の治療
    方法。
  53. 【請求項５３】前記ドナー細胞は、プライメート（霊長
    類：primate）の繊維芽細胞であることを特徴とする請
    求項５２記載の細胞の治療方法。
  54. 【請求項５４】前記ドナー細胞は、ヒトの繊維芽細胞で
    あることを特徴とする請求項５２記載の方法。
  55. 【請求項５５】哺乳動物の中枢神経系における欠陥、疾
    病、あるいは損傷を被っている細胞を治療するための方
    法が、次の（ａ）及び（ｂ）からなる段階、即ち（ａ）
    中枢神経系において欠陥、疾病、あるいは損傷をこうむ
    っている細胞を有する哺乳動物の中枢神経系に、アセチ
    ルコリンを発現させるためのＣｈＡＴ ｃＤＮＡを含有
    するベクターで遺伝子的に修飾された繊維芽細胞を移植
    する段階、及び、（ｂ）前記繊維芽細胞由来の前記アセ
    チルコリンの分泌を維持しかつ高めるために、コリンク
    ロライドを経口投与する段階、を含むことを特徴とする
    細胞を治療するための方法。
  56. 【請求項５６】前記細胞を治療するための方法が、アル
    ツハイマー病を患っている患者を治療するために用いら
    れることを特徴とする請求項５５記載の細胞を治療する
    ための方法。
  57. 【請求項５７】哺乳動物の中枢神経系に移植された静止
    するドナー細胞からのトランス遺伝子生産物の発現を高
    めるための方法であって、前記ドナー細胞が、前記トラ
    ンス遺伝子を運搬するベクター由来の治療性のトランス
    遺伝子を挿入することによって遺伝子的に修飾されてお
    り、前記ベクター内に静止期のプロモーターを挿入する
    段階を含むことを特徴とするトランス遺伝子生産物の発
    現を高めるための方法。
  58. 【請求項５８】前記プロモーターは、非ウイルス性のプ
    ロモーターであることを特徴とする請求項５７記載のト
    ランス遺伝子生産物の発現を高めるための方法。
  59. 【請求項５９】前記プロモーターは、コラーゲンプロモ
    ーターであることを特徴とする請求項５８記載のトラン
    ス遺伝子生産物の発現を高めるための方法。
  60. 【請求項６０】前記プロモーターは、α１（Ｉ）コラー
    ゲンプロモーター及びα２（Ｉ）コラーゲンプロモータ
    ーからなるグループから選択されることを特徴とする請
    求項５９記載のトランス遺伝子生産物の発現を高めるた
    めの方法。
  61. 【請求項６１】前記治療性のトランス遺伝子の発現は、
    サイトカインの生産を抑制する抗−炎症性の薬物を用い
    て更に高められることを特徴とする請求項５７記載のト
    ランス遺伝子生産物の発現を高めるための方法。
  62. 【請求項６２】前記抗−炎症性の薬物は、ステロイドで
    あることを特徴とする請求項６１記載のトランス遺伝子
    生産物の発現を高めるための方法。
  63. 【請求項６３】前記抗−炎症性の薬物は、デキサメタゾ
    ン（dexamethasone）であることを特徴とする請求項６
    １記載のトランス遺伝子生産物の発現を高めるための方
    法。
  64. 【請求項６４】請求項５７記載のトランス遺伝子生産物
    の発現を高めるための方法が更に、サイトカインの生産
    を減少するための免疫抑制剤の使用を含むことを特徴と
    するトランス遺伝子生産物の発現を高めるための方法。
  65. 【請求項６５】前記免疫抑制剤はシクロスポシン（cycl
    osporin）であることを特徴とする請求項６４記載のト
    ランス遺伝子生産物の発現を高めるための方法。
  66. 【請求項６６】前記サイトカインは、Ｉｎｆγであるこ
    とを特徴とする請求項６４記載のトランス遺伝子生産物
    の発現を高めるための方法。
  67. 【請求項６７】哺乳動物の中枢神経系における欠陥、疾
    病、あるいは損傷をこうむっている細胞を治療するため
    の方法において、その方法は中枢神経系に遺伝子的に修
    飾されたプライマリー繊維芽細胞を移植する段階を有し
    ており、前記繊維芽細胞が、前記欠陥、疾病、あるいは
    損傷をこうむっている細胞を修復するのに充分量の前記
    トランス遺伝子の生産物を生産することができるように
    レトロウイルスベクター内に運搬されている治療性のト
    ランス遺伝子の挿入によって修飾されることを特徴とす
    る細胞の治療方法。
  68. 【請求項６８】前記ベクターは、図１２に示されている
    ような最終構造を持つ、レトロウイルスベクターｐＬ
    Ｎ．８ＲＮＬであることを特徴とする請求項６７記載の
    細胞の治療方法。
  69. 【請求項６９】前記ベクターは、図１６に示されている
    ような最終構造を持つ、レトロウイルスベクターｐＬＴ
    ｈＲＮＬであることを特徴とする請求項６７記載の細胞
    の治療方法。
  70. 【請求項７０】前記トランス遺伝子は、チロシンヒドロ
    キシラーゼであることを特徴とする請求項６７記載の細
    胞の治療方法。
  71. 【請求項７１】前記ドナー細胞は、この細胞を受け入れ
    る哺乳動物種と同一の哺乳動物種から得られる細胞であ
    ることを特徴とする請求項１記載の細胞の治療方法。
  72. 【請求項７２】前記ドナー細胞は、この細胞を受け入れ
    る哺乳動物種と異なる哺乳動物種から得られる細胞であ
    ることを特徴とする請求項１記載の細胞の治療方法。
  73. 【請求項７３】請求項７２記載の細胞の治療方法では、
    前記ドナー細胞に対する免疫反応が抑制されていること
    を特徴とする細胞の治療方法。
  74. 【請求項７４】請求項７３記載の細胞の治療方法では、
    免疫抑制剤が投与されていることを特徴とする細胞の治
    療方法。
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