KR20040084911A

KR20040084911A - 희소돌기아교세포 선조 세포를 이용한 선천적으로미엘린화되지 않은 전뇌의 미엘린화

Info

Publication number: KR20040084911A
Application number: KR10-2004-7012596A
Authority: KR
Inventors: 골드맨스티븐에이; 로이니타; 윈드렘마타
Original assignee: 코넬 리서치 파운데이션 인코포레이티드
Priority date: 2002-02-15
Filing date: 2003-02-14
Publication date: 2004-10-06
Also published as: US20130004467A1; US20160264937A1; AU2003211063A1; US20080206209A1; EP1480521A2; US20030223972A1; WO2003070171A3; US8206699B2; US9371513B2; EP2532241A1; US10190095B2; CA2476376C; CA2476376A1; EP1480521B1; US20170159015A1; JP2005517717A; EP2532241B1; EP1480521A4; WO2003070171A9; WO2003070171A2

Abstract

본 발명의 한가지 형태는 축삭의 재미엘린화를 허용하는 조건하에서 탈미엘린화된 축삭을 희소돌기아교세포 선조 세포로 처리하는 것에 의해 탈미엘린화된 축삭을 재미엘린화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 태양은 미엘린 손실 또는 희소돌기아교세포의 손실에 의해 매개되는 상태를 치료하는 데 효과적인 조건하에서 희소돌기아교세포 선조 세포를 대상에 투여하는 것에 의해 미엘린 손실 또는 희소돌기아교세포 손실에 의해 매개된 상태를 갖는 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 추가 태양은 다른 포유류 뇌 또는 척수 세포 타입을 함유한 혼합 집단으로부터 희소돌기아교세포 선조 세포를 동정하고 분리하는 시험관내 방법에 관한 것이다. 이 방법은 처리된 혼합 집단을 생산하기 위해 뉴런과 뉴런 선조 세포를 혼합 집단으로부터 제거하는 것에 관련된다. 이어서 희소돌기아교세포 선조 세포를 처리된 혼합 집단으로부터 분리하여 희소돌기아교세포 선조 세포가 풍부한 집단을 형성한다.

Description

희소돌기아교세포 선조 세포를 이용한 선천적으로 미엘린화되지 않은 전뇌의 미엘린화{MYELINATION OF CONGENITALLY DYSMYELINATED FOREBRAINS USING OLIGODENDROCYTE PROGENITOR CELLS}

유전된 백색질장애에서 혈관 백색질뇌종, 그리고 다발성 경화증에 이르기까지 다양한 질병들이 미엘린 손상 또는 손실로부터 야기된다. 특히 소아 백색질장애에서, 치밀 미엘린은 적절히 발달하지 못하거나 또는 독성 저장 비정상의 배경에서 손상된다. 최근의 연구는 이식된 희소돌기아교세포 또는 그들의 선조를 이용하여이들 선천적인 미엘린 질병을 치료하는 것에 촛점을 맞추었다. 설치류 및 인간-유래 세포 이식물 둘다 선천적인 비미엘린화(dysmyelination)의 다양한 실험 모델에서 평가되었다. 이식된 뇌 세포의 미엘린생성 능력은 처음에 쉬버러(shiverer) 마우스에서 주목되었다 (Lachapelle et al., "Transplantation of CNS Fragment Into the Brain of Shiverer Mutant Mice: Extensive Myelination by Implanted Oligodendrocytes",Dev. Neurosci6:325-334 (1983)). 쉬버러는 MBP 유전자에서 너무 이른 종결 코돈으로 인해 마지막 5개의 엑손들이 생략된, 미엘린 염기성 단백질(MBP)이 결핍된 돌연변이다 (Roach et al., "Chromosomal Mapping of Mouse Myelin Basic Protein Gene and Structure and Transcription of the Partially Deleted Gene in Shiverer Mutant Mice,"Cell42:149-155 (1985)). 쉬버러는 상염색체성 열성 돌연변이이며, shi/shi 동형접합체는 중추 치밀 미엘린을 발달시키지 못한다. 이들은 일반적으로 20-22주에 조화운동불능, 협동불능, 경련, 및 발작을 가지면서 사망한다. 태아 인간 뇌 조직이 쉬버러에 이식된 경우, 희소돌기아교세포 분화와 국소적 미엘린화 둘다의 증거가 나타났다 (Lachapelle et al., "Transplantation of Fragments of CNS Into the Brains of Shivere Mutant Mice: Extensive Myelination by Implanted Oligodendrocytes,"Dev. Neurosci6:326-334 (1983); Gumpel et al., "Transplantation of Human Embryonic Oligodendrocytes Into Shivere Brain",Ann NY Acad Sci495:71-85 (1987); 및 Seilhean et al., "Myelination by Transplanted Human and Mouse Central Nervous System Tissue After Long-Term Cryopreservation",Acta Neuropathol91:82-88 (1996)). 하지만,이들 미분획된 이식물들은 단지 부조화스러운 재미엘린화만을 생성하였고 다른, 잠재적으로 바람직하지 못한 표현형들을 함께 생성시켰다. 따라서 풍부한 아교 선조 세포를 그들의 미엘린생성 능력에 대하여 평가한 결과, 이들은 아마도 이식된 세포에 의한 주된 별아교세포 분화로 인한 저 효율에도 불구하고 쉬버러 축삭(axon)을 미엘린화시킬 수 있는 것으로 발견되었다 (Warrington et al., "Differential Myelinogenic Capacity of Specific Development Stages of the Oligodendrocyte Lineage Upon Transplantation Into Hypomyelinating Hosts,"J. Neurosci Res34:1-13 (1993)). Snyder와 그 동료들은 (Yandava et al., "Global Cell Replacement is Feasible via Neural Stem Cell Transplantation: Evidence from the Dysmyelinated Shiverer Mouse Brain,"Proc. Natl. Acad. Sci.96: 7029-7034 (1999)) 이어서 불멸화된 다능성 선조 세포가 또한 쉬버러에서 미엘린화에 기여할 수 있음을 주목하였다. Duncan과 동료들은 유사하게 신생아 설치류의 실밑 영역으로부터 생겨난 올리고스피어-유래 세포가 출생전후기 심실내(intraventricular) 투여시 다른 비미엘린화된 돌연변이, 미엘린-결핍 쥐에 이식될 수 있음을 주목하였다 (Learish et al., "Intraventricular Transplantation of Oligodendrocyte Progenitors into a Feta Myelin Mutant Results in Widespread Formation of Myelin,"Ann Neurol46:716-722 (1999)). 이들 연구에도 불구하고, 인간 희소돌기아교세포 선조 세포 분리물이 비미엘린화된 뇌를 미엘린화하는 능력은 지금까지 검토되지 않았다.

본 발명은 본 기술 분야의 결핍 사항들을 극복하는 것을 목적으로 한다.

본 출원은 2002년 2월 15일에 출원된 미국 가출원 60/358,006호의 이익을 향유한다.

본 출원의 대상은 국립 보건원 그랜트 No.NINDS R01NS39559하에서 미국 정부로부터의 보조로 이루어졌다. 미국 정부는 일정 권리를 가질 수 있다.

본 발명은 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 선조 세포를 이용하여, 선천적으로 미엘린화되지 않은 전뇌를 미엘린화시키는 것과 미엘린의 손실 또는 희소돌기아교세포의 손실에 의해 매개된 상태를 갖는 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 다른 포유류 뇌 또는 척수 세포 타입을 함유한 혼합 집단으로부터 희소돌기아교세포 선조 세포를 동정하고 분리하는 방법도 개시된다.

본 발명의 한 태양은 축삭의 재미엘린화를 허용하는 조건하에서 희소돌기아교세포 선조 세포로 탈미엘린화된(demyelinated) 축삭을 처리함으로써 탈미엘린화된 축삭을 재미엘린화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 태양은 미엘린 손실 또는 희소돌기아교세포의 손실에 의해 매개되는 상태를 치료하는 데 효과적인 조건하에서 희소돌기아교세포 선조 세포를 대상에 투여하는 것에 의해 미엘린 손실 또는 희소돌기아교세포 손실에 의해 매개된 상태를 갖는 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가 태양은 다른 포유류 뇌 또는 척수 세포 타입을 함유한 혼합 집단으로부터 희소돌기아교세포 선조 세포를 동정하고 분리하는 시험관내 방법에 관한 것이다. 이 방법은 처리된 혼합 집단을 생산하기 위해 뉴런과 뉴런 선조 세포를 혼합 집단으로부터 제거하는 것에 관련된다. 이어서 희소돌기아교세포 선조 세포를 처리된 혼합 집단으로부터 분리하여 희소돌기아교세포 선조 세포가 풍부한 집단을 형성한다.

출원인들은 아교 및 희소돌기아교세포 선조 세포를 인간 뇌로부터 분리할 수 있는 수단을 개발하였으며; 이것은 세포 이식 연구를 위해 천연의 인간 희소돌기아교세포 선조 세포(OPC)의 매우 풍부한 분리물을 이용할 수 있도록 하였다.

이 연구에서는, 인간 뇌로부터 직접 분리된 아교 선조 세포의 매우 풍부한 집단이 선천적 비미엘린화의 세포계 치료를 위한 기질로 이용될 수 있는 지를 조사하였다. 구체적으로, 성인 뇌뿐만 아니라, 최대 올리고신생(oligoneogenesis) 기간동안의 태아 뇌로부터 유래된 인간 OPC가 충분히 이동성이고 미엘린생성성이어서 출생전후기 숙주의 광범위한 미엘린화를 매개할 것으로 가정되었다. 이것은 희소돌기아교세포 선조 세포가 사실상 태아 및 성인 인간 전뇌 둘다로부터 표면 항원-계 FACS를 통해 대량으로 추출 및 분리될 수 있음을 보여주었다. 이 세포들은 출생전후기 이종이식 후 쉬버러 뇌의 광범위하고 매우 효율적인 미엘린화가 가능하였다. 이들은 추정 백색질 전체에 걸쳐 넓게 침윤하고, 존재하는 쥐 축삭을 둘러싸고, 항원적으로 그리고 미세구조적으로 밀집된 미엘린을 형성하였다. 이식 후, 세포는 시간에 따라 그들의 분열성 확장을 늦추었고, 원치 않는 표현형 또는 실질 응집물을 생성하지 않았다. 태아 및 성인-유래 OPC 둘다 쥐 축삭을 재미엘린화할 수 있으나, 중요한 차이가 주목되었다: 태아 OPC는 매우 이동성인 반면 이들은 느리고 비효율적으로 미엘린화하였다. 대조적으로, 성인-유래된 OPC는 더 적은 거리에 걸쳐 이동하였으나, 이들은 태아 대응부보다 더 신속하고 높은 비율로 미엘린화하였다. 따라서, 이들 인간 아교 선조 세포의 분리물은 선천적으로 비- 또는 저미엘린화된 뇌를 재미엘린화시키기 위한 효과적인 세포 기질을 제공할 수 있다. 실용적인 관점에서, 단계-정의된 세포 타입의 선택은 공여 물질의 이용가능성에 의해 그리고 질병 표적의 구체적 생물학에 의해 지배받을 수 있으며, 이는 태아 및 성인 OPC 모두가 구조적 재미엘린화를 일으킬 수 있음을 입증하였기 때문이다.

도 1A-D는 태아 인간 희소돌기아교세포 선조 세포의 형광-활성화된 분류를 보여준다. 이것은 A2B5와 PSA-NCAM 둘다를 위한 동시 면역염색 후, 23주된 인간 태아 실(ventricular) 영역 분리물의 이중-색상 FACS의 결과를 보여준다. 좌측의FACS 플롯(도 1A)은 매치되는 염색되지 않은 23주 분리물을 보여준다. 우측에서, 도 1B는 A2B5(FL1, y 축)과 PSA-NCAM(FL2, x 축)을 위한 이중 면역표지 후 분류된 동일한 VZ 분리물을 보여준다. 도 1C-D는 A2B5-분류된 세포가 모노클로날 항체 O4에 의해 인식된 희소돌기아교세포의 설파티드 항원을 발현함을 보여준다. 분리물의 16.5%를 구성하는, R1R3내의 A2B5⁺/PSA-NCAM^-분획은 아교 선조 세포에 해당하였다. 이들이 별아교 세포와 희소돌기아교세포 둘다를 생성할 수 있음에도 불구하고, 이들은 이 임신 나이에서 유래될 경우 우선적으로 올리고신생성이며, 따라서 희소돌기아교세포 선조 세포(OPC)로 지정되었다. 대조적으로, 항원성 표현형 A2B5^-/PSA-NCAM⁺에 의해 정의된 R1R5 분획은 주로 시험관내에서 뉴런을 생성하였으며, 따라서 뉴런 선조 풀로 정의되었다.

도 2A-E는 태아 인간 OPC가 신속하게 이동하여 전뇌에 침윤함을 보여준다. 이 합성체는 쉬버러 수용체내로의 출생전후기 이식 후 4주째에 이식된 인간 세포의 분포를 보여준다. 인간 세포는 항-인간 핵 항원(ANA) 면역 염색에 의해 국소화되며; 이어서 저-전력 형광 이미지를 대표적인 전후방향 레벨에서 수집하여 체계화하였다. 이식된(engrafted) 세포는 전뇌에 걸쳐 넓게 퍼졌으나, 대부분은 피질밑 백색질 로(tract)에 남아 있다. 도 2A는 샘플된 레벨을 확인하는 시상의 개략도를 보여준다. 도 2B-E는 두정 평면에서 AP 1.25, 1.0, -1.0 및 -2.0에 해당하는 섹션을 보여준다. 스케일 바= 3mm.

도 3A-I는 이식된 인간 OPC가 전뇌의 광범위한 영역을 미엘린화시키는 것을보여준다. 도 3A-B는 신생아인 동종접합체 쉬버러 마우스내로 이식된 분류된 인간 태아 OPC에 의한 광범위한 미엘린 염기성 단백질 발현이, 뇌량의 더 큰 영역(도 3A와 도 3B, 2개의 다른 마우스)이 12주까지 미엘린화됨(MBP)을 나타내는 것을 보여준다. 도 3C는 인간 OPC가 또한 이동하여 내부 캡슐의 등배쪽 범위에 걸쳐 섬유를 미엘린화시켜, 한번의 출생전후기 주사후 전뇌의 광범위한 재미엘린화를 나타냄을 보여준다. 도 3D는 출생전후기 이종이식 후 3개월에 이식 쉬버러 뇌들보에서의 미엘린 염기성 단백질 발현이, 인간 핵 항원(hNA)에 의해 동정되는 인간 공여 세포와 관련됨을 보여준다. 이식된 인간 세포와 그들의 연합된 미엘린 둘다 변함없이 뇌들보 축삭 로에 평행하게 놓이는 것으로 발견되었다. 도 3E-H는 미엘린 염기성 단백질 (MBP)로 둘러싸인 인간 세포(hNA)를 가진, 이식된 쉬버러 뇌량의 공초점 광학 섹션을 보여준다. 인간 세포(화살표)는 MBP⁺섬유의 그물내에서 발견된다 (도 3E, 1㎛ 떨어져 찍은, 도 3F-H의 광학 섹션의 합병된 이미지). 도 3I는 OPC가 환경-의존성 방식으로 희소돌기아교세포 또는 별아교세포로서 보충되어, 이식된 OPC가 일반적으로 추정 백색질에서는 미엘린생성 희소돌기아교세포로서 성숙하나 백색 및 회백질 둘다에서 GFAP-정의된 별아교세포로 성숙함을 입증한다. 이 사진은 인간 태아 OPC(hNA)로 출생전후기 이식된 후 3개월에, 쉬버러 뇌의 줄무늬뇌들보 경계를 보여준다. 공여체-유래된 MBP 발현이 뇌량에서 명백하며, 공여체-유래된 GFAP⁺별아교세포는 줄무늬 측에서 주를 이룬다. 스케일 바 = 200㎛. 스케일: 도 3A-C, 1mm; 도 3D, 100㎛; 도 3E-H, 20㎛; 도 3I, 200㎛.

도 4A-G는 이식된 인간 선조 세포에 의한 축삭 피포(ensheathment)와 미엘린 밀집을 보여준다. 도 4A는 MBP, 인간 ANA, 및 신경필라멘트 단백질을 위한 삼중-면역염색을 보여주는 공초점 현미경 사진이다. 이 이미지에서, 모든 MBP 면역염색은 분류된 인간 OPC로부터 유래하는 한편, NF⁺축삭은 마우스 숙주의 것들이다. 화살표는 인간 희소돌기아교세포 MBP에 의해 둘러싸인 쥐 축삭의 절편들을 나타낸다. 도 4B는 태아 OPC 이식 후 12주에 죽인 쉬버러 수용체의 뇌량을 통해 찍은 광학 섹션의 2㎛ 깊이 합성체이다. 쉬버러 축삭은, 각 측상에서 접한 NF⁺축삭을 지표선이 가로지를 때 MBP-면역반응성에 의해 피포된 것으로 표시하였다. 별표는 도 4C에서 확대된 필드를 나타낸다. 더 높은 확대도의, 도 4C에서, MBP-면역반응성은 양측에서 둘러싸인 축삭을 둘러싸는 것으로 보여질 수 있다. 도 4D는 성인 shi/shi 동종접합체의 뇌량을 통한 시상절단의 전자 현미경사진이다. 쉬버러 축삭은 일반적으로 밀집되지 못하는, 미엘린의 하나의 느슨한 싸개를 가져, 주요 밀집 선들이 형성되지 못한다. 도 4E-G는 출생 직후 인간 희소돌기아교세포 선조 세포로 이식된 16주된 쉬버러 동종접합체의 대표적인 현미경 사진이다. 이들 이미지는 조밀하게 밀집된 미엘린 덮개를 가진 고유의 쉬버러 축삭을 보여준다. 별표는 삽입물로 확대된 필드를 나타낸다. 삽입물, 주요 밀집선은 미엘린 라멜라사이에서 발견되어, 이식된 인간 OPC에 의한 미엘린화의 EM 확인을 제공한다. 스케일 바 = 도 4A, 20㎛; 도 4B, 40㎛; 도 4C-F, 1㎛.

도 5A-C는 이식된 선조 세포의 분열 활성이 시간에 따라 떨어짐을 보여준다.도 5A-B는 이종이식 후 4주(도 5A)와 12주(도 5B)에서, 이식된 태아 인간 OPC에 의한 BrdU 통합을 보여준다. 쉬버러 수용체에 출생 후 1일째에 분류된 인간 OPC를 실내 주사하고, 이어서 죽이기에 앞서 2일동안 하루 두번 BrdU(100㎍/g, i.p.)를 주사하였다. 유사분열성 인간 OPC가 BrdU/hNA⁺세포(화살표)로 관찰되었다. 스케일 바 = 50㎛.

도 5C는 출생전후기 이식 후 시간의 함수로서의 유사분열 활성 공여 세포의 빈도의 감소이다. 죽이기 앞서 48시간동안 BrdU를 통합한 인간 공여 세포의 분획은 4주째에 42±6.1%로부터 12주째에 8.2±2.4%로 떨어졌다. 감소 분석은 BrdU 통합의 속도가 지수적 감소에 따라 시간에 따라 감소함을 나타냈다: y = 83.4e^-0.22x, 상관 계수 r= -0.87(p=0.012).

도 6A-F는 태아 및 성인 OPC가 미엘린생성의 그들의 속도와 효율에서 상당히 상이함을 보여준다. 도 6A는 성인-유래 인간 OPC(hNA)가 이종이식 후 4주째에 밀도있는 MBP 발현을 이룸을 보여준다. 대조적으로, 도 6B는 태아 OPC가 4주째에 검출가능한 MBP-IR을 발현하지 않으며 그러한 발현은 12주까지 나타나지 않음을 보여준다. 스케일 = 100㎛. 도 4C-D는 쉬버러 동종접합체의 뇌들보-가는털 접합부의 저확대 및 고확대 관상 영상이며, 성인-유래 hOPC로 출생전후기 이식된 후 12주째에 밀도있는 미엘린화를 보여준다. 개별적으로 평가될 때, 이 수용체 백색질내의 공여체 세포의 거의 절반이 MBP를 발현하는 것으로 발견되었다. 도 6E는 12주째에 평가할 때, 이식된 성인 OPC는 태아 OPC보다 상당히 더 높은 비율이 MBP 발현을 일으킴을보여준다. 도 6F는 그럼에도 불구하고 태아 공여 세포가 동일하게 이식된 성인 OPC보다 더욱 효과적으로 그리고 더 많은 수로 이식됨을 보여준다. * 는 p<0.05; ** p<0.005, 스튜던트 t-테스트(2측 검정). 스케일: 도 6A-B, 100㎛, 도 6C, 1 mm; 도 6D, 30㎛.

본원에서 이용될 때, 핵산 분자와 함께 이용될 경우 용어 "분리된"은 1) 실질적으로 정제된 형태로 유기체로부터 분리된 핵산 분자(즉, 그 유기체로부터 기원하는 다른 물질이 실질적으로 없음), 또는 2) 그 유기체로부터 반드시 분리되지는 않지만 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자(즉, 합성되거나 또는 재조합적으로 생산된 핵산 분자)를 말한다.

본 발명의 한 가지 태양은 축삭의 재미엘린화를 허용하는 조건하에서 희소돌기아교세포 선조 세포로 탈미엘린화된 축삭을 처리함으로써 탈미엘린화된 축삭을 재미엘린화시키는 방법에 관한 것이다.

탈미엘린화된 축삭의 재미엘린화는 (1) 자궁을 통한 태아 실내 주사; (2) 실내 또는 실질내 (즉, 뇌, 뇌간, 또는 척수) 주사; (3) 성인 및 청소년기 대상내로의 실질내 주사; 또는 (4) 혈관내 투여에 의해 수행될 수 있다. 그러한 투여는 원하는 재미엘린화의 정도에 따라 1 x 10⁵내지 5 x 10⁷범위의 세포 투여량에 관련된다.

미엘린 손실에 의해 매개되는 상태는 허혈성 탈미엘린화 상태, 염증성 탈미엘린화 상태, 소아 백색질장애, 점액다당류증, 출생전후기 배 매트릭스 출혈, 뇌성 마비, 심실주위 류코이날라시아, 방사선-유도된 상태, 및 다양한 병인론에 기인한 피질밑 백색질뇌증을 포함한다.

허혈성 탈미엘린화 상태는 피질 발작, 라쿠나(Lacunar) 경색, 저산소후 백색질뇌증, 당뇨성 백색질뇌증, 및 고혈압성 백색질뇌증을 포함한다.

염증성 탈미엘린화 상태는 다발성 경화증, 쉴더 병(Schelder's Disease), 횡단 척수염, 시각 신경염, 예방접종후 뇌척수염, 및 감염후 뇌척수염을 포함한다.

소아 백색질장애 상태는 리소좀 축적병(예, 테이-삭스 질병(Tay-Sachs Disease), 카바반 질병(Cavavan's Disease), 페리젠스-메르즈바흐 질병(Pelizaens-Merzbacher Disease), 및 크라베의 글로보이드 신체 백색질 장애(Crabbe's Globoid body leukodystrophy)를 포함한다.

점액다당류증의 예는 슬리의 질병이다.

방사선-유도된 상태는 방사선-유도된 백색질뇌증 및 방사선-유도된 척수염을 포함한다.

피질밑 백색질뇌증을 야기하는 병인은 HIV/AIDS, 머리 외상, 및 다발-경색 상태를 포함한다.

희소돌기아교세포 선조 세포는 희소돌기아교세포 선조 세포를 이용한 탈미엘린화된 축삭의 치료에 관하여 상기에서 개시한 것과 실질적으로 동일한 방식으로본 발명의 태양에 따라 투여된다.

본 발명의 한 태양에서는, 희소돌기아교세포 선조 세포를, 방사선 투여 후 그리고 탈미엘린화가 일어나기 전에 대상에게 투여한다. 방사선 투여의 목적은 중추 신경계의 일차 및 전이성 종양을 치료하는 것이다.

본 발명에 따라 희소돌기아교세포 선조 세포로 치료된 대상은 바람직하게는 사람 그리고 가장 바람직하게는 성인 또는 출생 후 사람이다.

다른 포유류 뇌 또는 척수 세포 타입을 함유하는 혼합 집단으로부터 뉴런 및 뉴런 선조 세포를 제거하는 단계는 프로모터에 기초한 세포 분류에 의해 수행될 수 있다. 이 과정은 희소돌기아교세포 선조 세포뿐만 아니라 뉴런과 뉴런 선조 세포를 포함하는, 뇌와 척수로부터의 세포 타입의 혼합 집단을 제공하고, 뉴런과 뉴런 선조 세포에서는 기능하지만 희소돌기아교세포 선조 세포에서는 기능하지 않는 프로모터를 선별하는 것을 포함한다. 이 프로모터의 조절하에서 마커 단백질을 암호하는 핵산 분자를 세포 타입의 혼합 집단에 도입하고, 뉴런 또는 뉴런 선조 세포의 집단이 마커 단백질을 발현하도록 한다. 마커 단백질을 발현하는 세포를 세포의 혼합 집단으로부터 분리하며, 분리된 세포는 뉴런 및 뉴런 선조 세포이다. 뉴런과 뉴런 선조 세포에서 기능하는 프로모터와 마커 단백질을 암호하는 핵산을 이용하여 세포 타입의 혼합 집단으로부터 뉴런 및 뉴런 선조 세포를 선별하는 과정은 전체가 본원에 참고문헌으로 인용되는 미국 특허 6,245,564호에 개시된다.

뉴런과 뉴런 선조 세포는 선택된 세포를 위해 특이적인 프로모터가 이용가능하기만 하면, 본 발명에 따라 다른 포유류 뇌 또는 척수 세포 타입을 함유한 혼합 집단으로부터 분리될 수 있다. 프로모터를 설명하기 위하여 여기서 이용되는 대로, "특이적인"은 프로모터가 선택된 세포 타입에서만 작용함을 의미한다. 선택된 세포 타입은 다른 세포 타입 또는 선조 세포의 발생 사이클내의 다른 단계를 말할 수 있다. 예를 들어, 선택된 세포는 특정 성인 세포 표현형이 되며 선택된 프로모터는 단지 그 선조 세포에서만 작용할 수 있다;즉 그 프로모터는 성인 세포에서는 작용하지 않는다. 운명이 정해진 선조 세포와 운명이 정해지지 않은 선조 세포는 둘다 선조 세포로 간주될 수 있음에도 불구하고, 이들 세포는 선조 세포 발생의 다른 단계에 있으며 만일 선택된 프로모터가 선조 세포의 특정 단계에 특이적이라면 본 발명에 따라 분리될 수 있다. 당업자는 관심의 세포에 대해 특이적인 프로모터의 이용가능성에 기초하여 선별하기 위한 관심의 세포를 쉽게 결정할 수 있다.

뉴런 또는 뉴런 선조 세포에 대해 특이적인 적합한 프로모터는 MAP-1B 프로모터(본원에 참고문헌으로 전체가 인용되는 Liu and Fischer,Gene171: 307-308 (1996)), NCAM 프로모터 (본원에 참고문헌으로 전체가 인용되는 Holst et al.,J Biol Chem269: 22245-22252 (1994)), HES-5 HLH 단백질 프로모터 (본원에 참고문헌으로 전체가 인용되는 Takebayashi et al.,J Biol Chem270: 1342-1349 (1995)), α1-튜불린 프로모터 (본원에 참고문헌으로 전체가 인용되는 Gloster, A., et al.,J Neurosci14: 7319-7330 (1994)), α-인터넥신 프로모터 (본원에 참고문헌으로 전체가 인용되는 Ching et al.,J Biol Chem266: 19459-19468 (1991)), 및 GAP-43 프로모터 (본원에 참고문헌으로 전체가 인용되는 Starr et al.,Brain Res638:211-220(1994))를 포함한다.

뉴런과 뉴런 선조 세포에 특이적인 프로모터를 결정한 후, 단백질 마커, 바람직하게는 녹색 형광 단백질을 그 프로모터의 조절하에서 암호하는 핵산 분자를 분류될 다수의 세포내로 도입한다.

녹색 형광 단백질을 암호하는 분리된 핵산 분자는 게놈의 또는 재조합의, 생물학적으로 분리된 또는 합성된 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(mRNA를 포함하는 RNA)일 수 있다. DNA 분자는 GFP를 암호하는 메신저 RNA(mRNA)의 DNA 카피인 cDNA 분자일 수 있다. 한 구체예에서, GFP는 아쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria)에서 얻을 수 있다 (참고문헌으로 본원에 전체가 인용되는 Prasher et al.의 미국 특허 5,491,084호). pGFP10.1로 지정된 플라스미드를 특허 절차상 미생물 기탁의 국제 승인에 대한 부다페스트 조약의 조건에 따라 이를 만족시키면서 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852의 ATCC에 ATCC 기탁 번호 75547로 1993.9.1에 기탁하였다. 이 플라스미드는 이 플라스미드가 개시된 미국 특허 5,491,084호가 1996.2.13에 발행됨에 따라 ATCC로부터 구할 수 있다. 이 플라스미드는 그 전체가 참고문헌으로 본원에 인용되는 Chalfie et al.의 미국 특허5,491,084호에 개시된 대로 아쿠오레아 빅토리아의 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호하는 cDNA를 포함한다. pRSGFP-C1로 지정된, 이 GFP의 돌연변이된 형태 (적색-이동된 돌연변이 형태)는 Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, California)에서 판매한다.

pTα1-RSGFP로 지정된 플라스미드를 특허 절차상 미생물 기탁의 국제 승인에 대한 부다페스트 조약의 조건에 따라 이를 만족시키면서 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852의 ATCC에 ATCC 기탁 번호 98298로 1997.1.21에 기탁하였다. 이 플라스미드는 Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, California)의 적색 이동된 GFP(RS-GFP)와 Dr. F. Miller (Montreal Neurological Institute, McGill University, Montreal, Canada)에 의해 제공된 Tα1 프로모터 서열을 이용한다. 본 발명에 따라, Tα1 프로모터는 다른 특이적 프로모터로 대체될 수 있으며, RS-GFP 유전자는 표준 제한 효소와 라이게이션 과정을 이용하여 GFP의 다른 형태로 대체될 수 있다.

원래 단백질보다 강하게 방출하는 돌연변이된 GFP 형태뿐만 아니라 고등 척추동물에서의 안정한 번역에 순응하는 GFP의 형태가 이제 이용가능하며 동일한 목적을 위해 이용될 수 있다. pTα1-GFPh로 지정된 플라스미드를 특허 절차상 미생물 기탁의 국제 승인에 대한 부다페스트 조약의 조건에 따라 이를 만족시키면서 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852의 ATCC에 ATCC 기탁 번호 98299로 1997.1.21에 기탁하였다. 이 플라스미드는 Zolotukhin와 Muzyczka의 인간화된 GFP(GFPh) (Levy, J., et al.,Nature Biotechnol14: 610-614 (1996), 참고문헌으로 전체가 본원에 인용됨)와 Dr. F. Miller (Montreal)에 의해 제공된 Tα1 프로모터 서열을 이용한다. 본 발명에 따라, Tα1 프로모터는 다른 특이적 프로모터로 대체될 수 있으며, GFPh 유전자는 표준 제한 효소와 라이게이션 과정을 이용하여 GFP의 다른 형태로 대체될 수 있다. GFP의 형광 형태를 암호하는 임의의 핵산 분자를 본 발명에 따라 이용할 수 있다.

이어서 표준 기법을 이용하여 GFP를 암호하는 핵산 분자를 선택된 세포에 특이적인 프로모터의 조절하에 놓는다. 일반적으로, 이것은 제한 효소와 라이게이션의 이용에 관련된다.

선택된 프로모터(그 자체가 핵산 분자임)의 조절하에서 GFP를 암호하는 핵산 분자를 (필요하다면 다른 적합한 조절 요소와 함께) 포함하는 생성된 구조체를 이어서 분류될 다수의 세포내로 도입한다. 구조체의 핵산 분자를 다수의 세포내로 도입하기 위한 기법은 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터의 이용에 관련될 수 있다. 이들 발현 벡터(플라스미드와 바이러스 등)를 이용하여 핵산 분자를 다수의 세포내로 도입할 수 있다.

핵산 분자를 숙주 세포내로 도입하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이들은 1) 미세한 유리 주사바늘을 통해 세포의 핵내로 DNA를 직접 주입하는 미세주입; 2) 양 전하를 띤 화학기(DEAE, 디에틸아미노에틸)가 결합된 불활성 탄수화물 중합체(덱스트란)와 DNA를 항온처리하는 덱스트란 항온처리(DNA는 그것의 음전하를 띤 인산염 기를 통해 DEAE-덱스트란에 부착하고, 큰 DNA-함유 입자는 다시 세포의 표면에 부착하며(세포는 세포내이입으로 알려진 과정에 의해 그들을 흡수함), DNA의 일부는 세포의 세포질에서의 파괴를 피하여 핵으로 탈출하며 여기서 세포내의 다른 유전자처럼 RNA로 전사될 수 있음); 3) 세포가 칼슘 인산염과의 침전물 형태로 DNA를 효과적으로 흡수하는 칼슘 인산염 공침전; 4) 세포를 DNA를 함유한 용액에 놓고 짧은 전기 충격을 가하여 그 막의 구멍이 일시적으로 열리도록 하여 DNA가 그 구멍을 통하여 직접 세포질내로 들어가며, 그들이 DEAE-덱스트란과 칼슘 인산염 과정에서 거치는 세포내이입 소낭을 회피하는 전기천공(이들 소낭을 통한 통과는 때때로 DNA를 파괴하거나 손상시킬 수 있음); 5) DNA가 인공 지질 소낭인 리포좀내로 통합되고 이것이 세포 막과 융합하여 그 내용물을 직접 세포질내로 전달하는 리포좀 매개 형질전환; 6) DNA가 금 입자의 표면에 흡수되고 탄도 장치를 이용하여 고압하에서 세포내로 발사되는 바이오리스틱(biolistic) 형질전환; 7) 순수 DNA 삽입; 및 8) 핵산 분자가 바이러스 벡터를 이용하여 세포내로 도입되는 바이러스-매개된 형질전환을 포함한다. 바이러스 성장은 바이러스 게놈을 세포내로 들어가게 하는 능력에 의존하므로, 바이러스는 그렇게 하는 효율적인 방법을 고안하였다. 이들 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 허피스바이러스, 및 아데노-연합 바이러스를 포함한다.

나타내진 대로, 세포를 형질전환시키는 이들 방법의 일부는 중간 플라스미드 벡터의 이용을 필요로 한다. 참고문헌으로 그 전체가 본원에 인용되는 Cohen과 Boyer의 미국 특허 4,237,224호는 제한 효소 절단과 DNA 리가제를 이용한 라이게이션을 이용한 재조합 플라스미드의 형태로 발현 시스템을 생산하는 것을 개시한다. 이어서 이들 재조합 플라스미드를 형질전환 수단에 의해 도입하고 조직 배양으로성장한 진핵 세포 및 원핵 유기체를 포함한 단세포 배양물에서 복제시킨다. DNA 서열을, 참고문헌으로 그 전체가 본원에 인용되는 Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)에 개시된 바와 같은 당업계의 표준 클로닝 과정을 이용하여 플라스미드 벡터내로 클로닝한다.

전술한 방법 중 하나에 따라, GFP를 암호하는 핵산 분자를 다수의 세포내로 도입한다. 하지만, GFP의 발현을 조절하는 프로모터는 단지 관심의 세포에서만 작용한다. 따라서, GFP는 단지 관심 세포에서만 발현된다. GFP는 형광 단백질이므로, 관심 세포는 GFP의 형광에 의해 다수의 세포중에서 동정될 수 있다.

형광 세포를 검출하는 적합한 수단을 이용할 수 있다. 형광(epifluorescence) 광학을 이용하여 세포를 동정할 수 있으며, 레이저 트위저(Cell Robotics Inc., Albuquerque, New Mexico)에 의해 세포를 물리적으로 선별하고 합칠 수 있다. 이들은 형광 세포를 비-형광 세포로부터 효과적으로 분리시키는 방법인 형광 활성화된 세포 분류를 통해 대량으로 분리될 수 있다.

본 발명의 이 태양에 따라, 처리된 혼합 집단으로부터 희소돌기아교세포 선조 세포를 분리하는 한 구체예는, 프로모터의 조절하의 형광 단백질 암호 핵산 분자를 희소돌기아교세포 선조 세포외에 포유류 뇌 또는 척수 세포 타입을 함유하는 전체 혼합 집단내로 도입하는 것으로 시작하는 것이 아니라 이 핵산 분자를 처리된 혼합 집단내로 도입하는 것을 제외하고는, 전술한 대로 프로모터에 기초한 세포 분리에 의해 수행한다. 처리된 혼합 집단으로부터 희소돌기아교세포 선조 세포를 분류함에 있어, 희소돌기아교세포 선조 세포에 특이적인 프로모터를 이용한다. 본 발명의 이 태양을 수행하는 데 적합한 프로모터는 사이클릭 뉴클레오티드 포스포릴라제 I 프로모터, 미엘린 염기성 단백질 프로모터, JC 바이러스 최소 코어 프로모터, 단백지질 단백질 프로모터, qk1 프로모터(즉, 퀘이킹(quaking) 유전자 생성물을 위한 프로모터), 및 사이클릭 뉴클레오티드 포스포릴라제 II 프로모터일 수 있다.

처리된 혼합 집단으로부터 희소돌기아교세포 선조 세포를 회수하기 위해 프로모터-계 세포 분류를 이용하는 것에 대한 대안으로서, 면역분리 과정을 이용한다.

이것은 특정 타입의 선조 세포상에 자연적으로 존재하는 단백질성 표면 마커에 기초하여 세포를 분리하는 것에 관련된다. 예를 들어, 표면 마커 A2B5는 처음에 발현되는 초기 희소돌기아교세포 마커이다. 본원에 참고문헌으로 인용되는 Nunes et al. , "Identification and Isolation of Multipotential Neural Progenitor Cells from the Adult Human White Matter,"Soc. Neurosci. Abstr.(2001)을 참고한다. 이 마커에 특이적인 항체를 이용하여 희소돌기아교세포 선조 세포를 세포 타입들의 혼합 집단으로부터 분리할 수 있다. 그러한 항체를 형광 태그로 표지하여 그들이 결합하는 세포의 분리를 촉진할 수 있다. 대안으로서, 항체를 상자성 비드에 부착시켜 부착된 항체를 통해 비드에 결합하는 세포가 생물자석 분리 과정에 의해 회수될 수 있다.

A2B5로 지정된, Gq 강글리오사이드에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 특허 절차상 미생물 기탁의 국제 승인에 대한 부다페스트 조약의조건에 따라 이를 만족시키면서 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852의 ATCC에 ATCC 기탁 번호 CRL-01520으로 기탁되었다.

희소돌기아교세포 선조 세포가 풍부해진 집단은 적어도 90% 순수, 바람직하게는 적어도 95% 순수, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수하다. 본 발명의 이 태양을 실시하기 위해 이용된 세포 타입의 혼합 집단은 바람직하게는 인간 세포이다. 이들 세포는 성인 또는 출생 후 인간 세포가 바람직하다.

뇌와 척수 세포 타입의 혼합 집단으로부터 뉴런 및 뉴런 선조 세포를 제거하고,처리된 혼합 집단을 남겨두고 이어서 처리된 집단으로부터 희소돌기아교세포 선조 세포를 분리함으로써 희소돌기아교세포 선조 세포를 얻는 상기 과정을 이용하는 대신, 참고문헌으로 본원에 인용되는 Goldman, et. al.의 미국 특허 6,245,564호와 Goldman, et. al.의 미국 특허 출원 No. 09/282,239호에 개시된 대로 프로모터에 기초 세포 분류를 이용하여 뇌와 척수 세포 타입의 혼합 집단으로부터 희소돌기아교세포 선조 세포를 직접 분리할 수 있다. 이 방법은 본질적으로 희소돌기아교세포 선조 세포에서만 작용하는 프로모터를 이용하여 상기에서 개시된 대로이다.

실시예 1 - 세포

임신 후반기의 인간 태아(21 내지 23주)로부터의 세포 조직을 낙태시에 얻었다. 전뇌 실/실하부 영역을 남아 있는 뇌 실질조직없이 신속하게 절단하고, 샘플을 얼음에서 얼렸다. 이어서 저민 샘플을 이전에 개시된 대로 파파인/DNA아제를 이용하여 항상 추출 3시간이내에 분해시켰다 (Keyoung et al., "SpecificIdentification, Selection and Extraction of Neural Stem Cells from the Fetal Human Brain,"Nature Biotechnology19: 843-850 (2001), 참고문헌으로 그 전체가 본원에 인용됨). 이어서 분해물을 20ng/ml FGF를 가진 DMEM/F12/N1의 최소 배양 배지에서 밤새 유지시켰다.

실시예 2 - 분류

분해 다음날, 세포를 30분동안 MAb A2B5 상등액(클론 105;ATCC, Manassas, VA)과 1:1로 항온처리하고, 이어서 세척하고, 마이크로비드-태그를 가진 쥐 항-마우스 IgM(Miltenyi Biotech)으로 표지하였다. 모든 항온처리는 라커에서 4℃에서 실시하였다. 일부 예에서는, 이전에 개시된 방법들에 따라 (Keyoung et al., "Specific Identification, Selection and Extraction of Neural Stem Cells from the Fetal Human Brain,"Nature Biotechnology19: 843-850 (2001) 및 Roy et al., "In Vitro Neurogenesis by Progenitor Cells Isolated from the Adult Human Hippocampus,"Nat Med6: 271-277 (2000), 참고문헌으로 본원에 그 전체가 인용됨) FACSVantage SE/Turbo를 이용하여 A2B5와 PSA-NCAM-정의된 하부집단들의 표현형 균질성과 비율을 정의하기 위하여 2-채널 형광-활성화된 세포 분류를 수행하였다. 보다 일반적으로, 그리고 모든 이식물 목적을 위한 제조성 분류를 위해, 이어서 A2B5⁺세포(MACS;Miltenyi)의 자기 분리를 제조자의 프로토콜을 따라 수행하였다. 이어서 결합된 세포를 용출시키고 30분동안 1:25로 항-NCAM(Pharmingen)과 항온처리하고, 1:200으로 항-마우스 PE로 표지하였다. 이어서 PSA-NCAM⁺집단을 FACS에 의해 제거하여 매우 풍부해진 A2B5⁺/ PSA-NCAM^-세포 집단을 얻었다. 이들을 이식때까지, 20ng/ml bFGF를 가진 염기 배지에서 1-7일동안 시험관내에서 유지하였다. 도 1 참고.

실시예 3 - 이식 및 태깅(tagging)

동종접합성 쉬버러들을 군체로 키웠다. 출생일이내에, 세포 전달을 위해 새끼를 동결마취시켰다. 이어서 두개골을 통해 삽입된 유리 피펫을 이용하여 공여 세포를 뇌량, 내부 캡슐, 또는 측실내로 이식하였다. 이어서 새끼를 어미에게 되돌리고, 나중에 4,8,12, 또는 16주에 죽였다. 일부 실험을 위하여, 수용체 마우스에게 죽이기 전 2일동안 BrdU(100㎍/g, 1.5mg/100㎕ 용액으로서)를 2일 연속하여 12시간동안 주사하였다.

실시예 4 - 면역조직화학

Chemicon 으로부터의 항-인간 핵 항체(MAB 1281), 그리고 로다민 레드 X-접합된 염소 항-마우스(Jackson; cat. 115-295-146) 또는 비접합된 토끼 항-마우스 Fab(Jackson 315-007-003) 그리고 이어서 로다민 레드 X-염소 항-토끼(Jackson 111-295-144)를 이용하여, 이식된 세포를 동정하였다. 도 2 참고. 스턴버거(Sternberger) MAb 94 또는 Abcam 7349(쥐)에 의해 스턴버거 모노클로날 91, MBP를 이용하여 CNP를 인식하였으며; 항-인간 GFAP(스턴버거 MAb 21)를 이용하여 인간 GFAP를 검출하였다. 도 3 및 도 4A-C 참고. BrdU를 개시된 표현형 마커(Louissaint et al., "Coordinated Interaction of Angiogenesis and Neurogenesis in the Adult Songbird Brain,"Neuron34: 945-960 (2002), 참고문헌으로 본원에 그 전체가 인용됨)로 동시에 면역표지화하였다.

실시예 5 - 전자 현미경법

6% 당 인산염 완충액(당-PB)내의 4% 파라포름알데히드와 0.25% 글루타르알데하이드로 동물을 관류시키고, 동일한 용액에서 후고정시키고, 이어서 교번하는 두꺼운(400㎛) 섹션과 얇은(100㎛) 섹션으로 비브라톰(Vibratome)에 의해 조각내었다. 얇은 섹션을 MBP에 대해 면역염색하고, 두꺼운 섹션을 당-PB중의 2% 파라포름알데하이드와 2.5% 글루타르알데하이드에 후고정시켰다. 명백한 MBP 발현을 나타내는 얇은 섹션에 이웃한 두꺼운 섹션을 이어서 1% 오스뮴-1.5% 페리시아나이드, 1.5% 수성 우라닐 아세테이트에서 처리하고, 프로필렌 옥사이드를 통해 탈수시키고, 이어서 에폰(Epon)에 넣고 납 시트레이트로 염색하였다. 도 4D-G 참고.

실시예 6 - 희소돌기아교세포 선조 세포는 태아 인간 실벽으로부터 분류될 수 있다

21-23 주 임신기의 후반 제 2기 인간 실 영역으로부터 분리된 세포를 먼저 자기적으로 분류하여 A2B5⁺세포를 분리하였다. 이들은 희소돌기아교세포와 뉴런 선조 세포 둘다를 포함하였다. PSA-NCAM은 인간 실 영역 발생의 이 단계에서 모든 미성숙 뉴런에 의해 발현되므로, 이어서 FACS를 이용하여 더 큰 A2B5⁺세포 집단으로부터 PSA-NCAM⁺세포를 선별하였다. NCAM-정의된 뉴런 선조 세포와 어린 뉴런의 A2B5⁺풀로부터의 이 제거는 A2B5⁺/PSA-NCAM^_세포의 하부집단을 생산하였으며, 이는 본 발명의 희소돌기아교세포 선조 풀을 정의하였다. 잘못된 양성의 발생율을 0.1% 미만으로 제한하기 위한 높은-엄격도 대조 역치를 갖는 2색 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의하여, A2B5⁺/PSA-NCAM^_분획이 이들 모아진 21-23주 실 영역 샘플내의(n=5) 세포들의 15.4±4.8%를 구성함을 결정하였다 (도 1). PSA-NCAM-고갈된 A2B5⁺풀이 대부분 희소돌기아교세포 - 그리고 배타적으로 글리아-를 기본 배양 조건하에서 생산했기 때문에, 이들 VZ 선조들의 아교 제한 및 희소돌기아교세포 불균형이 시험관내에서 입증되었다 (도 1). 이들 동일한 조건하에서, A2B5⁺세포의 PSA-NCAM⁺분획은 주로 뉴런으로 분화하였다. 따라서, 이중 항원 면역분류, 2색 FACS 및 A2B5⁺세포의 연속적인 면역자기적 풍부 및 이어지는 PSA-NCAM⁺세포의 FACS 고갈의 두가지 별도의 방법은 각각 21-23주 태아 인간 실 영역으로부터의 희소돌기아교세포 선조 세포의 고수율 추출과 선택적인 농축을 허용하였다. 후자 기법 - 면역자기적 분리 및 이어지는 단일색 FACS 고갈-은 직접적인 2색 FACS보다 더 높은 총 수율을 이루었으며, 이 연속적인 접근법을 이용하여 이식된 인간 OPC 집단을 추출하고 분리하였다.

실시예 7 - 이식된 희소돌기아교세포 선조는 이종이식 후 넓게 이동하였다

동종접합체 shi/shi 마우스를 실내로 그리고 뇌들보내로, P0-1에서의 선조 세포 분리물로 주사하였다. 동물을 하부그룹으로 나누고 4,8,12 또는 16주에 4주간격으로 죽였다. 동물은 면역억제되지 않았으며; 이식 허용을 확실히 하기 위해 출생전후기 내성화에 의존하였으며, 그 결과 동물들은 출생일 또는 그 다음날(P0-1)에 이식되었다. 이들 주사는, 이 연구를 위해 주사된 44마리 신생 마우스중 34마리에서(태아 hOPC로 주사된 33마리 중 25, 성인-유래 OPC로 주사된 11마리 중 9마리), 상당한 정량가능한 세포 이식(3 위에서 아래로(rostrocaudal) 레벨에서의 관상 섹션 당 100 세포 이상으로 정의됨, 100㎛ 이상 떨어져 샘플링함)을 생성하였다. 세포 응집물이 종종 4주째에 실에서 관찰되었지만, 12주째에 대부분의 이식된 세포가 뇌들보 벽 및 가는털 벽을 관통하여 뇌들보, 가는털 및 캡슐성 백색질을 침입하였다 (도 2).

OPC는 일반적으로 신속하게 이동하여 위쪽의 소겸자의 전방 백색질로부터 아래쪽의 뇌교에 이르기까지 피질밑 실질 전체에 걸쳐 퍼졌다.

4주째에, 인간 핵 항원(hNA)의 발현에 의해 동정된 이식된 세포는 백색질 전체에 걸쳐 넓게, 주로 뇌량, 외부 캡슐, 및 해마의 가는 털내에 분산되어 발견되었다 (도 2). 많은 핵, 특히 주사 부위에 대하여 위쪽 또는 아래쪽의 핵이 이동체의 형태를 가지고, 로의 방향으로 신장되어 나타났다. 더욱이, 구별되는 소수가 격벽, 줄무늬체, 및 후각망울을 포함한 회색질 영역에 들어갔으며, 신피질에는 덜 들어갔다. 8주째에, 인간 세포는 전뇌에 걸쳐 널리 퍼졌으며, 간뇌에는 적은 수가 들어갔다. 이들 8주 동물들 중 2마리에서, 세포는 뇌간 백색질 로에 들어가, 대뇌 다리를 거쳐 뇌교까지 이동하는 것으로 나타났다. 12주동안 생존시킨 동물에서, 세포는 주로 백색질 로에서 발견되지만 전뇌 전체에 걸쳐 발견되었다. 인간 핵이 전뇌에 걸쳐 발견되고 앞부분 뇌간 주위에 흩어져 있음에도 불구하고, 이종이식 밀도는 변함없이 세포 도입의 가는털 및 뇌들보 부위에서 가장 컸다.

실시예 8 - 이식된 태아 선조는 성숙되어 미엘린 염기성 단백질을 발현하였다

다음 질문은 이식된 태아-유래 선조세포가 미엘린생성 희소돌기아교세포로 생체내에서 성숙하는지였다. 이를 위하여, 이식된 마우스와 이식되지 않은 대조 마우스를 이식 후 4,8,및 12주에 희소돌기아교세포의 미엘린 염기성 단백질(MBP)에 대해 면역염색시켰다. 쉬버러 마우스는 MBP 유전자의 첫번째 엑손만을 발현하기 때문에(Roach, et al. ,"Chromosomal Mapping of Mouse Myelin Basic Protein Gene and Structure and Transcription of the Partially Deleted Gene in Shiverer Mutant Mice,"Cell42: 149-155 (1985), 참고문헌으로 본원에 인용됨), C-말단에 대한 항-MBP 항체는 쉬버러 동종접합체의 절단된 MBP를 인식하지 않는다. 그 결과, 이식된 동물에서 검출된 MBP 면역반응성은 반드시 공여체-유래 희소돌기아교세포에서 유래한다. 4주째에는, 광범위한 세포 분산에도 불구하고 11마리 동물중 10마리에서 검출가능한 MBP가 나타나지 않았으며; 약한 초기 MBP-면역반응성 영역이 한 마우스에서 나타났다. 8주째에, MBP 발현의 고르지못한 점들이 7마리 마우스중 4마리에서, 일반적으로 그들의 뇌들보와 해마맞교차내에서 발견되었다. 그럼에도 12주에는, 광범위한 MBP 발현이 7마리 마우스중 5마리에서 전뇌 백색질 로 전체에 걸쳐 발견되었다. MBP 발현은 특히 뒷부분에서는 가는털에서 그리고 전반부에서는 뇌량에서 풍부하였다. 사실, 뇌량은 일반적으로 그 내외측 정도까지 MBP를 발현하며,시상 평면에서 그 전체 길이를 따라 발현하였다 (도 3A-C).

이식된 세포에 의한 미엘린생성의 넓은 분포는 수용체 뇌에서 상당한 부피의 미엘린 재구성을 야기하였다. 예를 들어, 도 3에서 나타난 12-주 뇌에서, 뇌들보 미엘린화의 영역은 위에서 아래로 뇌량의 길이인 약 4mm까지 뻗어가는 한편, 아래에서 1mm 내외측 폭으로부터 위쪽에서 4mm 까지 삼각판으로 확장했다. 200㎛의 평균 뇌들보 깊이에서, MBP-정의된 미엘린 생산의 효과적인 부피는 1.4 mm³였다. 중요하게도, 이 MBP는 사람 공여 세포와 연합되었다 (도 3D). MBP-IR이 이식된 인간 공여체 OPC와 배타적으로 관련되었음을 입증하기 위하여, 공초점 영상화를 이용하여 MBP-면역반응성과 인간 핵 항원의 동시국소화를 검사하였다. 직각 재구성을 가진 광학적 섹션화를 이용하여, MBP⁺세포 각각이, 항-인간 핵 면역염색으로 정의할 때, 인간 체세포와 연합되었다는 점에서 이들 세포는 인간 기원임이 확인되었다.(도 3E-H).

실시예 9 - 선조 세포-유래된 희소돌기아교세포는 축삭을 재미엘린화한다

다음 문제는 공여체-유래된 미엘린이 실제로 숙주 쉬버러 축삭을 피포시키는 지 였다. 이를 위해, 공초점 영상화와 전자 현미경법을 이용하여, 각각 축삭 피포와 미엘린 밀집화를 평가하였다. 공초점 분석은, 100,000 분류된 태아 인간 OPC로 P1에서 각각 이식되고 이어서 12주에 죽인 3개의 쉬버러 뇌의 샘플에서 수행하였다 (도 4A-C). 뇌들보 MBP 발현 영역을 먼저 면역표지 고정 섹션에 의해 동정하였다.밀도높은 MBP 발현의 이들 점들은 이어서, 공여체-유래된 세포와 숙주 쉬버러 축삭을 각각 태그하기 위해, 인간 핵 항원과 신경필라멘트 단백질 둘다에 대해 면역표지시킨 후 공초점 영상화에 의해 평가하였다. 이 수단에 의해, 인간 선조 세포는 많은 수의 미엘린화하는 희소돌기아교세포를 생성함이 밝혀졌다. 이들 세포의 미엘린 덮개는 그들에 바로 이웃해 있는 숙주 축삭에 직접 병렬하고, 일반적으로 축삭을 완전히 둘러싸는 것으로 밝혀졌다. 점수를 매긴 수용체 중에서, NF⁺숙주 뇌들보 축삭의 11.9±1.6%(평균 ± SE)가 MBP-면역반응성으로 둘러싸이는 것으로 발견되었다 (n=3 마우스, 3개의 표시된 필드/동물)(도 4A-C). 샘플링은 최대 뇌들보 MBP 발현의 영역으로 치우쳐, 이들 수가 반드시 모든 전뇌 로에서의 미엘린화의 발생을 반영하지는 않는다. 오히려, 이들 자료는 단지 상당 분획의 기존 쥐 축삭이 공여 선조 세포의 출생전후기 이식에 이어 인간 미엘린에 의해 피로될 수 있음을 확인한다.

이어서, 전자 현미경을 이용하여 숙주 축삭이 실제로 공여체-유래 희소돌기아교세포에 의해 피포되고, 후자는 미세구조적-밀집 미엘린을 생성함을 입증하였다. 미엘린의 연속 층들을 함께 밀집시키기 위해서는 MBP가 요구되므로, 그 발현은 건강한 중추 미엘린의 주요 밀집 선의 형성에 요구된다. MBP-결핍 쉬버러에서, 미엘린은 단지 축삭 주위에 느슨하게 둘러싸며, 몇몇 겹 이상을 나타내지 못하며, 주요 밀집선이 부족하다. 출생전후기 인간 선조 세포 이식체의 shi/shi 동종접합체 수용체에서, 이식된 인간 OPC는 사실상 미엘린화될 뿐만 아니라 주요 밀집선을 갖는 밀집된 미엘린을 생산하였다 (도 4D-G). 이식 후 12주와 16주에 미세구조적으로평가할 때, 공여체-유래 미엘린은 숙주 쉬버러 축삭을 둘러싸고 피포하는 것으로 확인되었다 (도 4D-G).

이 미세구조 분석은 공초점 분석에 의해 얻어진 자료를 확인하는 수단으로서, 공여체-유래 OPC에 의해 미엘린화된 축삭의 비율을 정량하는 것을 가능하게 했다. 출생 후 1일에 이식되고 16주후 조직화학을 위해 죽인 2마리 마우스에서 유래한 MBP⁺필드의 샘플에서(n=50), 전체 평균 7.4%의 기존 뇌들보 축삭이, 주요 밀집선의 존재에 의해 정의할 때, 공여체-유래 미엘린 피포를 갖는 것으로 밝혀졌다 (1832의 표시된 축삭 중 136). 공초점 분석에서처럼, 이들 자료는 그들의 MBP-면역반응성을 기초로 선택되고 성공적인 이식 영역으로서 정의된 뇌들보 영역에서 얻어진 미엘린화의 총 효율을 반영하며; 그 결과는 수용체 백색질의 치우치지 않은 샘플을 반영하는 것을 의도하지 않는다. 그 경고에도 불구하고, 이들 발견은 분류된 태아 인간 OPC가 출생전후기 이종이식시 미엘린생성 희소돌기아교세포로서 효율적으로 분화할 수 있음을 입증한다.

실시예 10 - 유사분열적으로 활성인 공여체 OPC의 비율은 이종이식 후 천천히 감소했다

다음 문제는 이식된 OPC가 이식 후 분열을 계속하는지, 그리고 그렇다면, 얼마나 오랜동안 하는지였다. 이를 위해, 출생시의 태아 hOPC로 마우스를 이식하고(n=6), 이어서 4,8,및 12주에 이들을 죽이기에 앞서 2일동안 하루 두번 BrdU를 이들에 주사하였다. BrdU에 대한 면역염색은, 출생 후 1일에 이식되고 그들의 항-인간 핵 항원(hNA) 발현에 의해 정의된, 이식된 인간 OPC의 평균 42±6.1%가4주째에 여전히 활발하게 분열하고 있음을 밝혔다 (도 5). 대조적으로, 이식 후 8 및 12주에, 이식된 OPC중 유사분열성 BrdU^+//hNA⁺세포의 분획은 각각 11.2±1.6 및 8.2±2.4%로 떨어졌다. 이 결과는 이식된 선조 세포가 이식 후 적어도 첫달동안은 처음에 유사분열적으로 활성이나, 이어서 그 후에는 그들의 유사분열 활성이 느려져, 모든 OPC와 그 자손의 10% 미만이 이식 후 3개월때에 입증가능하게 순환하고 있음을 제안한다 (도 5A-C). 퇴화 분석은, 공여체-유래된 세포의 유사분열 지수와 이식 후 시간의 길이 사이에 역 비례관계를 밝혔다 (r=0.90; p<0.05). 중요하게도, 이식된 선조 풀의 보존된 유사분열 능력에도 불구하고, 종양 형성, 퇴화, 또는 악성 형질전환의 조직학적 증거는 이 연구의 태아 OPC-이식된 마우스에서 이식 후 3개월동안 나타나지 않았다 (n=34; 16주에 분석된 9마리를 포함).

실시예 11 - 이식된 세포의 다수가 별아교세포로 분화했다

GFAP에 의해 정의할 때, 일부 이식된 태아 OPC는 별아교세포로 분화하였으며, 이식 후 4주에 그러한 것으로 나타났다. 이들 GFAP⁺별아교세포는 일반적으로, 백색질에만 한정되는, 그들의 희소돌기아교세포 대응부보다 넓은 영역에 걸쳐 확장함에도 불구하고, MBP⁺희소돌기아교세포와 혼합되어 있는 것으로 밝혀졌다. 중요하게도, 이식된 태아 hOPC는 쉬버러 뇌에서 드물게 뉴런으로 분화하였다: 이식 후 4,8, 또는 12주에서 이식된 쉬버러 백색질에서 딴곳(heterotopic) βIII-튜불린 또는 MAP2-정의된 뉴런은 전혀 나타나지 않았다 (n=총 33). 유사하게 격벽 또는 줄무늬체로 이동한 세포들은 뉴런으로 분화하지 않았으며; 뇌량으로부터 등 신피질로들어간 것으로 밝혀진 때때로의 이동체도 분화하지 않았다. hNA/βIII-튜불린⁺뉴런이 4주에 후각 망울에서 발견된 단지 2마리 마우스에서, 인간 공여체-유래 뉴런이 발견되었으며, 이는 후각 뇌실막밑 및 망울의 신경성 환경을 반영한 것같다. 더욱 일반적으로, 회색질에 침입한 이들 공여체 OPC는 일반적으로 별아교세포로 발전하였다. 그 결과, 공여체-유래 별아교세포와 희소돌기아교세포는 일반적으로 각각 회색질 및 백색질에 해당하는 예리하게 구별된 지리학적 도메인에서 발견되었다. 공여체-유래 별아교세포는 일반적으로 숙주 회색질에서 더욱 풍부한 한편, 이들은 그럼에도 불구하고 회색질과 백색질 둘다에서 퍼져 있었다; 대조적으로, 공여체-유래 희소돌기아교세포는 숙주 회색질에서 배제되었다 (도 3I). 공여체-유래 아교세포 표현형의 이러한 분리는 이식된 세포를 위한 예리하게 정의된 도메인 경계를 야기하였다.

실시예 12 - 성인-유래된 OPC는 태아 OPC보다 신속하게 미엘린화한다

출원인들은 이어서 태아 OPC가 성인 뇌로부터 유래한 그들의 대응부와, 이동 능력, 미엘린생성 능력 또는 그 시간 과정에 있어서 상이한 지를 알고자 하였다. 이를 위하여, 쉬버러 마우스 새끼 2마리를 P0에서 A2B5-분류된 성인 OPC로 이식하였다 (n=12 마우스, 이중 9마리는 성공적인 공여체 이식을 나타냄). 이들 성인-유래된 hOPC를 정상 인간 피질밑 백색질의 외과적 절제로부터 추출하고, 이로부터 A2B5⁺OPC를 A2B5-지시된 면역자기적 분류(IMS)를 통하여 추출하고, 이어서 이들의출생전후기 이종이식에 앞서 최소 배지에서 밤새 배양하였다. 이식된 마우스를 4,8 또는 12주동안 생존시킨 후, 조직화학을 위해 죽였다. 이들의 뇌를 절개하여, 그들의 태아 OPC-이식된 대응부에서 했던 것처럼, MBP, GFAP 및 항-인간 핵 항원에 대해 염색하였다.

태아 및 성인-유래 인간 희소돌기아교세포 선조 세포가 이종이식시 그들의 각 시간 과정과 미엘린생성의 효율에서 상당히 상이함을 발견하였다. 성인 OPC는 그들의 태아 대응부보다 더욱 신속하게 쉬버러 뇌를 미엘린화하여, 이종이식 후 4주째에 광범위하고 밀도있는 MBP 발현을 이루었다. 대조적으로, 태아 OPC에 의한 상당한 MBP 발현은 일반적으로 이식 후 12주까지는 관찰되지 않았다 (도 6A-D).

실시예 13 - 성인 OPC는 태아 OPC보다 더 높은 효율로 미엘린생성 희소돌기아교세포를 생산한다

태아 OPC보다 더 신속하게 성숙하는 것에 더하여, 성인 OPC는 태아-유래 OPC보다, 훨씬 더 높은 비율로 그리고 훨씬 더 적은 별아교세포 동시-생산을 가지면서 희소돌기아교세포를 생성함이 발견되었다. 수용체 뇌량의 중간선에서 평가될 때, 태아 hNA-정의된 OPC의 10.2±4.4%가 12주에 MBP를 발현하는 반면, 4주에는 사실상 발현이 전혀 없었다. 대조적으로, 매치된 수용체내로의 이종이식 후 4주째에 성인 OPC의 39.5±16.3%가 MBP를 발현하였다 (스튜던트 2측 검정 t-테스트에 의해 p<0.001)(도 6E). 동일하게 이식된 성인 OPC에 비하여, 상당히 더 많은 수의 태아 공여체 세포가 숙주 뇌에서 발견되었다 (도 6F 참고). 따라서, 태아 OPC는 성인 OPC만큼 잘 또는 더 잘 쉬버러 수용체내로 이식되었으나, 이식된 이들 성인 세포는그들의 태아 대응부보다 적어도 4배 더 희소돌기아교세포로 성숙하고 미엘린을 발생시키기 쉬웠다.

더욱이, 성인 OPC는 대부분 숙주 백색질에 제한된 채 남아 그 내부에서 거의 완전히 MBP⁺희소돌기아교세포를 생성하는 한편, 태아 OPC는 회색질과 백색질 둘다로 이동하여 환경-의존성 방식으로 별아교세포와 희소돌기아교세포 둘다를 생성하였다 (도 3I). 아마도 그들의 희소돌기아교세포 분화의 더 큰 속도와 효율의 결과로서, 이식된 성인 OPC와 그들의 유도체는 드물게 백색질의 경계를 넘어 이동한 반면, 태아 OPC는 넓게 이동하여 그들의 별아교세포성 유도체와 미분화 유도체는 전뇌 회색질 및 백색질 둘다에 걸쳐 확장하였다.

따라서, 매우 올리고신생성인 후기 제2기 전뇌로부터 분류된 인간 OPC의 매우 풍부해진 분리물은, 성공적으로 출생전후기 백색질 장애의 유전 모델인 쉬버러 마우스 뇌에 이식되어 뇌를 미엘린화할 수 있다. 구체적으로, 인간 OPC는 항원 표현형 A2B5⁺/PSA-NCAM^-에 대한 FACS를 이용하여, 고수율로 후기 제2기 인간 실 영역으로부터 선택적으로 추출될 수 있음이 발견되었다. 신생 쥐 전뇌에 이식될 때, 이들 세포는 전뇌에 걸쳐 넓게 이동하여 희소돌기아교세포와 별아교세포 둘다로서 발생 백색질에서 성숙하며, 추정 회색질에서는 별아교세포로 성숙하였다. 그 후 이식된 인간 OPC가 태아 또는 성인 기원인지에 따른 시간 과정인 4-12주의 기간에 걸쳐, 공여체-유래 희소돌기아교세포는 미엘린을 생산하도록 성숙하고, 그 결과 쉬버러 피질밑내의 기존 축삭의 광범위한 미엘린화가 이루어졌다. 공초점 및 미세구조적 분석에 의해 그렇게 입증된 이 미엘린화는 지리학적으로 광범위하며, 종뇌의 모든 백색질 영역에 걸쳐 확장되었다.

실시예 14 - 천연 인간 전뇌 OPC의 고수율 정제

출원인들은 앞서 초기 희소돌기아교세포 CNP2 프로모터에 의해 유도된 GFP 발현에 기초한 FACS를 이용하여 성인 백색질로부터의 희소돌기아교세포 선조 세포를 분리할 수 있음을 발견하였다 (Roy et al., "Identification, Isolation, and Promoter-Defined Separation of Mitotic Oligodendrocyte Progenitor Cells from the Adult Human Subcortical White Matter,"Neurosci19: 9986-9995 (1996), 참고 문헌으로 본원에 전문이 인용됨). 이들 세포는 A2B5 항체에 의해 인식되는 표면 강글리오사이드를 발현하였으며, 이는 또한 성인 백색질로부터 집단을 선택적으로 추출하기 위해 이용될 수 있었다. (Windrem et al., "Progenitor Cells Derived from the Adult Human Subcortical White Matter Disperse and Differentiate as Oligodendrocytes WithinDemyelinated Regions of the Rat Brain,"J. Neurosci. Res.69: 966-975 (2002), 참고 문헌으로 본원에 전문이 인용됨). 그러나, A2B5는 희소돌기아교세포뿐만 아니라 어린 뉴런도 인식한다 (Eisenbarth et al., "Monoclonal Antibody to a Plasma Membrane Antigen of Neurins",Proc. Natl. Acad. Sci.76:4913-17 (1979) 및 Raff et al., "Two Types of Astrocytes in Cultures of the Developing Rat White Matter: Differences in Morphology, Surface Gangliosides, and Growth Characteristics",J. Neurosci.3:1289-1300 (1983); 이들은 모두 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 인용됨). 이처럼, A2B5를 기초로 한 분리는, 대부분 뉴런이 없는 성인 백색질로부터 OPC를 추출하는 데에 효과적으로 이용될 수도 있지만, A2B5⁺뉴런이 풍부한 태아의 뇌로부터 그러한 분리를 하는 데는 적절하지 않다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 출원인은 A2B5, 및 어린 뉴런에 의해 어디서나 발현되는 폴리시알일화된(polysialylated) N-CAM (PSA-NCAM)에 대하여 이중 분류를 하였다. A2B5-분류 샘플로부터 PSA-NCAM⁺을 배제함으로써, 거의 오로지 아교세포,그리고 주로 희소돌기아교세포가 되는 세포 집단이 분리되었다. 이 A2B5⁺/PSA-NCAM^-표현형은 태아의 뇌에 있는 풍부한 유사분열 희소돌기아교세포 선조 세포의 풀을 신뢰성있게 확인하였는데, 상기 풀은 P/CNP2:hGFP 및 A2B5로만 인식된 성인 선조 세포 풀과 유사하게 나타났다. 매우 올리고신생성인 21~23 주의 인간 실 부위에서의 다량의 OPC와 조합된 고등급의 OPC 풍부화를 위한 이 고수율 기법의 조합은 최초로 상당량의 인간 희소돌기아교세포 선조 세포를 제공하였는데, 이는 치료용 이식에 적절한 순도 및 품질로 분리된 것이다.

실시예 15 - 이동 중 차등 분산

이들 실험에서, 상당히 풍부화된 인간 OPC 풀을 이들의 이동 활성, 희소돌기아교세포 성숙 및 미엘린생성의 효율을 평가하기 위하여, 신생 시버러 쥐의 뇌에 이식하였다. 상기 분류된 OPC는 이동성이 크다는 것을 입증하였고, 이식 후 4~8 주 내에 대부분의 전뇌 구조에 도달하였다는 것이 밝혀졌다 (도 2). 그러나, 그 두 유도체 표현형, 즉 희소돌기아교세포와 별아교세포의 분산 패턴은 그 시버러 숙주에서 상당히 달랐다. 희소돌기아교세포는 주입 부위에 더 가까운 곳에서 풍부한 반면에, 별아교세포는 보다 넓고 광대하게 분산되어 전뇌 회색질에 침입하였다. 이는 선택 과정을 반영한 것일 수 있는데, 대교세포(astroglia)는 그 희소돌기아교세포 대응물보다 더 빠르게 또는 더 공격적으로 이동한다. 유사하게, A2B5⁺/PAS-NCAM^-정의된 풀은 비균질할 수 있어, 계통-제한 희소돌기아교세포 선조 세포는 주입 부위 부근에 남아 있을 수 있는 한편, 덜 분화된 운동성이 더 큰 선조 세포는 초기 확장 중에 계속 이동하여, 이동 중단시, 별아교세포로서 우선적으로 분화될 수도 있다. 다르게는, 회색질의 실질 부위로의 대교세포의 우선적 이동은 백색질 구획 이상으로의 희소돌기아교세포 침투에 대한 지정학적 제한을 반영할 수도 있다. 이들 각각의 고려 사항은 상이한 분산 패턴에 기여할 것 같다.

실시예 16 - 운명이 정해지지 않은 선조 세포의 지속성

샘플링한 모든 시점에서, 많은 수의 네스틴⁺/hNA⁺세포들은 별아교세포 항원 또는 희소돌기아교세포 항원을 발현하는 데에 실패하였고, 대신에 지속적인 선조 세포로서 숙주 실질에 남아 있는 것으로 나타났다. 이들 운명이 정해지지 않은 네스틴⁺/GFAP^-/MBP^-공여체 세포들의 발생은 성인에서 유래된 이식편(graft)보다는 태아에서 명백히 더 높았다. 그럼에도 불구하고, 대부분의 성인-유래 OPC는 희소돌기아교세포로서 또는 적게는 별아교세포로서 성숙하였지만, 상당 부분이 네스틴⁺/GFAP^-/MBP^-(도 4A)로 남았다. 이러한 운명이 정해지지 않은 세포들은 이식된 수용자에서 득이될 수도 있고 해가 될 수도 있다. 이들 세포는, 약리적으로 또는 탈미엘린화 부상에 대한 반응으로, 생체 내에서 더 자극되어 미엘린생성 희소돌기아교세포가 될 수 있는 선조 세포 공급원을 구성할 수 있다. 다른 한편으로, 이들 세포는 또한 뉴런의 운명으로의 전향시 딴곳 뉴런의 잠재적인 공급원을 나타낼 수도 있으며, 생각건대, 이들 세포는 나중의 종양 형질전환을 위한 유사분열 능력이 있는 세포들의 저장부를 구성할 수도 있다 (본 출원인은 인간 뇌에서 유래된 선조 세포의 수용체에게서 종양 형성을 발견하지 못했다). 따라서, 표현형 운명 및 나중에 확장될 잠재성이 불명확하게 남아 있는, 운명이 정해지지 않은 선조 세포들의 이식된 수용체 중에서의 지속성은, 분류한 희소돌기아교세포 선조 세포들을 임상 치료에 사용하기 전에 고려해야 하는 경고적인 유의점을 제공한다.

실시예 17 - 임상적 유용성

상기 결과들은 성인 탈미엘린화 (Windrem et al., ""Progeniter Cells Derived from the Adult Human Subcortial White Matter Disperse and Differentiate as Oligodendrocytes Within Demyelinated Regions of the Rat Brain",J. Neurosci.Res. 69:966-975 (2002)); 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨)와 같은 선천성 탈미엘린화는, 직접 분리된 인간 CNS 선조 세포의 동종이식을 이용하는, 세포 기반 치료를 위한 적절한 타겟이 될 수도 있다는 것을 암시한다. 본 연구에 있어서, 수용체 쥐의 병 표현형 또는 생존에 대하여 미치는 공여체 이식 및 미엘린화의 효과는 평가되지 않았다. 그러나, 상기 시버러 CNS는 그 CNS 전체에 걸쳐 탈미엘린화되기 때문에, 상당한 치료 이점을 위해서는 뇌 뿐만 아니라 뇌간 및 척수의 광범위한 미엘린화가 요구될 것 같다. 이러한 광범위한 이식 관련 미엘린화는, 중추신경계통에 걸친 복수의 주입 위치에서 전달되는, 본 연구에 이용된 것보다 더 많은 세포 투여를 필요로 할 수도 있다. 이와 관련하여, 더 많은 투여량의 세포를 소뇌숨뇌구조 및 전뇌실에 동시에 주입하면, 전뇌 주입만으로 얻을 수 있는 것보다 실질적으로 더 넓은 공여체 세포 이식 및 미엘린생성이 야기될 것이다 (Mitome et al., "Towards the Reconstruction of Central Nervous System White Matter Using Precursor Cells",Brain124:2147-2161 (2001); 이는 본 명세서에 참고문헌으로 그 전체가 인용됨).

이처럼 비미엘린화된 숙주의 세포 기반 미엘린화 전략은, 신생아 수용체에 도입된 동종항원에 대한 면역학적 내성이 있다면, 갓난 수용체에게로 향해질 때 특히 유익할 수도 있다 (Ridge et al., "Neonatal Tolerance Revisited: Turning on Newborn T Cells With Dendritic Cells,"Science271:1723-1726 (1996); Roser, B., "Celluar Mechanisms in Neonatal and Adult Tolerance,"Immunol. Rev.107:179-202 (1989); Witzke et al., "Induction of Tolerance to Alloantigen,"Rev. Immunogenet.1:374-386 (1999), 이들은 모두 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 인용됨). 어떤 동물도 면역억제 치료를 받지 않았고, 이식된 인간 세포의 면역 거부 증거도 없었다. 이것은 인간 OPC를 성인 쥐 뇌에 이식하는 것과는 크게 다른 것인데, 이 경우에는 이식 세포의 면역 거부가 시클로스포린(cyclosporin)을 사용한 고투여량의 지속적인 면역 억제를 요구하는 상당한 문제였다 (Windrem et al., "Progenitor Cells Derived from the Adult Human Subcortical White MatterDisperse and Differentiate as Oligodendrocytes Within Demyelinated Regions of the Rat Brain,"J. Neurosci. Res.69:966-975 (2002); 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨). 이와 같이, 출생 전후기 배 매트릭스 출혈 및 대뇌 마비 뿐만 아니라, 크라베, 카나반, 테이-삭스 질병을 비롯한 유전적 백색질 장애와 같은 선천성 질환은 모두, 세포 기반의 치료적 재미엘린화를 위한 실행 가능한 타겟임을 입증할 수도 있다.

실시예 18 - 태아 및 성인 선조 세포의 뚜렷한 특징들

태아 및 성인 희소돌기아교세포 선조 세포들이 기본적으로, 그들의 미엘린 생성의 시간 과정과 효율면에서 상이하다는 것을 발견한 것은 놀라운 것이었다 (도 6). 성인에서 유래된 OPC는 그들의 유사하게 분리된 태아 대응물보다 훨씬 더 빨리, 더 큰 효율로, 그리고 상대적으로 더 큰 비율로 성숙하고 미엘린화할 수 있었다. 태아 OPC는 일반적으로 이식 후 8주가 될 때까지 미엘린화하는 것이 관찰되지 않았고, 12주가 되기 전에 상당한 미엘린화를 보이지 않았지만, 성인 OPC는 거의 변함없이 4주 쯤에 빠르게 성숙 및 미엘린화하였다. 태아 대응물보다 더 빨리 미엘린화하는 것 외에, 성인 OPC는 태아-유래 선조 세포보다 훨씬 더 큰 효율, 즉 훨씬 더 큰 상대 비율 및 훨씬 적은 별아교세포 동시생성으로 미엘린생성 희소돌기아교세포로서 성숙하였다. 이러한 이들의 효율적이고, 신속하고 그리고 확실한 미엘린화의 결과, 성인-유래 OPC는 다른 유사한 그리고 비슷하게 유도된 태아-유래 OPC보다 보다 즉각적으로 유용한 치료 벡터를 구성하는 것으로 보인다. 이러한 관찰은 이들 세포의 치료 용례, 특히 태아 및 성인 OPC로 접근하기 위해 선택할 수도 있는질환 타겟과 관련하여 상당한 의미를 갖고 있다. 태아 세포는 뇌의 성장시 그렇지 않으면 선천적 비미엘린화하게 되는 비미엘린화(dysmyelination)를 방지하기 위한 적절한 치료 벡터일 수 있는데, 선천성 비미엘린화의 경우에는 내생적 미엘린화가 느리고 지체된다. 대조적으로, 잔존하는 미엘린이 소실되고 성숙한 축삭이 제거된, 후천성 탈미엘린화 질환은 성인-유래 선조 세포에 의해 제공되는 빠른 성숙 및 미엘린화를 필요로 할 수도 있다.

따라서, 인간의 희소돌기아교세포 선조 세포는 태아 및 성인 뇌로부터 분리될 수 있는데, 각각은 치료적 재미엘린화의 목적을 위한 이식을 가능하게 하는 순도 및 수율로 분리된다. 태아 및 성인-유래 표현형은, 태아 OPC가 더 광범위하게 이동하고, 성인 OPC는 보다 빠르게, 그리고 더 적은 우발적 별아교세포 생성으로 미엘린을 생성한다는 점에서 다르다. 따라서, 2단계로 정의된 표현형은 꽤 구별되는 질환 타겟 및 치료 전략에 적합하다는 것을 입증할 것이다. 그럼에도 불구하고, 태아 및 성인으로부터 유래된 인간의 정제된 OPC는 선천적으로 비미엘린화된 포유류 뇌를 광범위하고 효율적으로 미엘린화하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명을 설명의 목적을 위해 상세히 설명하였지만, 전술한 내용은 오로지 설명의 목적을 위한 것이고, 후술하는 청구의 범위에 한정된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나는 일이 없이 당업자라면 다양한 변형을 할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

Claims

축삭의 재미엘린화(remyelination)를 허용하는 조건하에서 희소돌기아교세포(oligidendrocyte) 선조 세포로 탈미엘린화된 축삭을 처리하는 것을 포함하는 탈미엘린화된 축삭을 재미엘린화하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 처리는 자궁을 통한 태아 심실내 주사, 심실내 또는 실질내 주사, 성인 및 청소년기 대상내로의 실질내 주사, 또는 혈관내 투여에 의해 수행되는 것인 방법.
미엘린 손실 또는 희소돌기아교세포의 손실에 의해 매개되는 상태를 치료하는 데 효과적인 조건하에서 희소돌기아교세포 선조 세포를 대상에 투여하는 것을 포함하는, 미엘린 손실 또는 희소돌기아교세포 손실에 의해 매개된 상태를 갖는 대상을 치료하는 방법.
제3항에 있어서, 희소돌기아교세포의 손실에 의해 매개되는 상태를 갖는 대상을 치료하기 위해 이용되는 방법.
제3항에 있어서, 미엘린 손실에 의해 매개된 상태를 갖는 대상을 치료하기 위해 이용되는 방법.
제5항에 있어서, 상기 상태가 허혈 탈미엘린화 상태인 방법.
제6항에 있어서, 허혈 탈미엘린화 상태가 피질 발작, 라쿠나(Lacunar) 경색, 저산소후 백색질뇌증, 당뇨성 백색질뇌증, 및 고혈압성 백색질뇌증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 상태가 염증성 탈미엘린화 상태인 방법.
제8항에 있어서, 염증성 탈미엘린화 상태가 다발성 경화증, 쉴더 병, 횡단 척수염, 시각 신경염, 예방접종후 뇌척수염, 및 감염후 뇌척수염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 상태가 소아 백색질 장애인 방법.
제10항에 있어서, 소아 백색질 장애 상태가 리소좀 축적병, 카바반 질병, 페리젠스-메르즈바흐 질병, 및 크라베의 글로보이드 신체 백색질 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제10항에 있어서, 소아 백색질 장애 상태가 테이-삭스 질병(Tay-SachsDisease)인 방법.
제5항에 있어서, 상기 상태가 점액다당류증인 방법.
제13항에 있어서, 상기 상태가 슬리 질병(Sly's Disease)인 방법.
제5항에 있어서, 상기 상태가 출생전후기 배 매트릭스 출혈, 심실주위 류코이날라시아, 또는 뇌성 마비인 방법.
제5항에 있어서, 상기 상태가 방사선-유도된 상태인 방법.
제16항에 있어서, 방사선-유도된 상태가 방사선-유도된 백색질뇌증 및 방사선-유도된 척수염인 방법.
제5항에 있어서, 상기 상태가 피질밑 백색질뇌증을 야기하는 병인이며 이 병인은 HIV/AIDS, 머리 외상, 또는 다발-경색 상태인 방법.
제3항에 있어서, 상기 처리는 대상에 방사선을 투여한 후 그리고 탈미엘린화가 일어나기 전에 수행되는 방법.
제3항에 있어서, 상기 대상은 사람인 방법.
제20항에 있어서, 상기 대상은 출생 후 사람인 방법.
제20항에 있어서, 상기 대상은 성인인 방법.
제3항에 있어서, 상기 방법은 뇌에서 수행되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 방법은 척수에서 수행되는 것인 방법.
처리된 혼합 집단을 생산하기 위하여 혼합 집단으로부터 뉴런과 뉴런 선조 세포를 제거하는 단계 및 희소돌기아교세포 선조 세포가 풍부해진 집단을 형성하기 위하여 상기 처리된 혼합 집단으로부터 희소돌기아교세포 선조 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 다른 포유류 뇌 또는 척수 세포 타입을 함유한 혼합 집단으로부터 희소돌기아교세포 선조 세포를 동정하고 분리하는 시험관내 방법.
제25항에 있어서, 상기 희소돌기아교세포 선조 세포의 분리가 하기를 포함하는 것인 방법:

희소돌기아교세포 선조 세포에서만 작용하고 다른 세포 타입에서는 작용하지 않는 프로모터를 선별하는 단계;

상기 프로모터의 조절하에서 형광 단백질을 암호하는 핵산 분자를 상기 처리된 혼합 집단의 모든 세포 타입내로 도입하는 단계;

상기 처리된 혼합 집단내에서 다른 세포 타입이 아닌 희소돌기아교세포 선조 세포만이 상기 형광 단백질을 발현하도록 하는 단계;

희소돌기아교세포 선조 세포로 제한된, 형광성인, 상기 처리된 세포 타입의 혼합 집단의 세포를 동정하는 단계; 및

희소돌기아교세포 선조 세포가 풍부한 집단을 형성하기 위하여 상기 처리된 혼합 집단으로부터 형광 세포를 분리하는 단계.
제26항에 있어서, 상기 도입은 다른 포유류 뇌 또는 척수 세포 타입을 함유한 상기 처리된 혼합 집단의 모든 세포 타입의 바이러스 매개 형질전환을 포함하는 것인 방법.
제27항에 있어서, 상기 바이러스 매개 형질전환은 아데노바이러스 매개 형질전환, 레트로바이러스-매개 형질도입, 렌티바이러스-매개 형질도입, 또는 아데노-관련 바이러스-매개 형질도입을 포함하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 상기 도입은 전기 천공을 포함하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 상기 도입은 다른 포유류 뇌 또는 척수 세포 타입을 함유한 상기 처리된 혼합 집단의 모든 세포 타입의 리포좀 매개 형질전환을 포함하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 상기 형광 세포의 분리는 형광 활성화된 세포 분류를 포함하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 상기 프로모터는 사이클릭 뉴클레오티드 포스포릴라제 I 프로모터, 미엘린 염기성 단백질 프로모터, JC 바이러스 최소 코어 프로모터, 단백지질 단백질 프로모터, qk1 프로모터, 및 사이클릭 뉴클레오티드 포스포릴라제 II 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 희소돌기아교세포 선조 세포 분리는 희소돌기아교세포 선조 세포를 면역분리하는 것을 포함하는 방법.
제33항에 있어서, 상기 면역분리는 처리된 혼합 집단으로부터 A2B5 항원을 갖는 세포를 제거함으로써 수행되는 것인 방법.
제33항에 있어서, 상기 면역분리는 희소돌기아교세포 선조 세포상의 항원을 인식하는 형광 표지된 항체로 수행되는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 희소돌기아교세포 선조 세포의 분리는 형광 활성화된 세포 분류를 더 포함하는 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 제거는 하기를 포함하는 것인 방법:

뉴런 및 뉴런 선조 세포에서만 작용하는 프로모터를 선별하는 단계;상기 프로모터의 조절하에서 마커 단백질을 암호하는 핵산 분자를 상기 혼합 집단내로 도입하는 단계;

뉴런 및 뉴런 선조 세포가 마커 단백질을 발현하도록 하는 단계;

세포의 혼합 집단으로부터 마커 단백질을 발현하는 세포를 분리하며 이때 상기 분리된 세포가 뉴런 및 뉴런 선조 세포인 단계.
제37항에 있어서, 상기 도입이 혼합된 세포 집단의 바이러스 매개 형질도입을 포함하는 것인 방법.
제38항에 있어서, 상기 바이러스 매개 형질도입이 아데노바이러스-매개 형질도입, 레트로바이러스-매개 형질도입, 렌티바이러스-매개 형질도입, 또는 아데노-관련 바이러스-매개 형질도입을 포함하는 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 도입이 전기 천공을 포함하는 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 도입이 바이오리스틱(biolistic) 형질전환을 포함하는 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 도입이 리포좀 매개 형질전환을 포함하는 것인 방법.
제37항에 있어서, 마커 단백질이 형광 단백질이며 상기 분리가 형광 활성화된 세포 분류를 포함하는 것인 방법.
제37항에 있어서, 프로모터가 Tα1 튜불린 프로모터, MAP-1B 프로모터, NCAM 프로모터, HES-5 HLH 프로모터, α-인터넥신 프로모터, 또는 GAP-43 프로모터인 방법.
제25항에 있어서, 세포 타입이 사람인 방법.
제45항에 있어서, 사람이 성인인 방법.
제45항에 있어서, 사람이 출생후 사람인 방법.
제25항의 방법에 따라 생산된 희소돌기아교세포 선조 세포가 풍부한 집단.