KR20230074718A - 저면역원성 세포로 감작된 환자를 치료하는 방법 및 관련 방법 및 조성물 - Google Patents
저면역원성 세포로 감작된 환자를 치료하는 방법 및 관련 방법 및 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
감작된 환자에 투여하기 위한 저면역원성 세포가 본원에 개시된다. 일부 경우에, 환자가 이전 임신 또는 이전 이식으로 인해 감작된다. 일부 구현예에서, 세포는 외인성으로 CD47 단백질을 발현하고 MHC 클래스 I 단백질, MHC 클래스 II 단백질 또는 둘 다의 감소된 발현을 나타낸다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 USC § 119(e)에 따라 2020년 8월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 63/065,342; 2021년 1월 11일에 출원된 63/136,137; 2021년 2월 19일에 출원된 63/151,628; 및 2021년 4월 14일에 출원된 63/175,030에 대한 우선권을 주장하며, 그 개시 전체가 본원에 참조로 포함된다.
항원(예를 들어, 공여체 동종항원)에 대한 감작은 임상 이식 치료법이 직면하는 문제이다. 예를 들어, 이식 수신체의 면역계가 동종이계 물질을 거부하는 성향은 치료제의 잠재적 유효성을 크게 감소시키고 이러한 치료를 둘러싼 가능한 긍정적 효과를 감소시킨다. 다행스럽게도 동물 모델과 인간 환자 모두에서 저면역원성 세포 또는 조직 이식이 과학적으로 실행 가능하고 수많은 장애 및 병태의 치료에 대해 임상적으로 유망한 접근이라는 실질적인 증거가 있다.
이와 같이, 수신체의 면역계에 의한 검출을 회피하는 세포 기반 치료법을 생성하기 위한 신규 접근, 조성물 및 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
항원(예를 들어, 공여체 동종항원)에 대한 감작은 임상 이식 치료법이 직면하는 문제이다. 예를 들어, 이식 수신체의 면역계가 동종이계 물질을 거부하는 성향은 치료제의 잠재적 유효성을 크게 감소시키고 이러한 치료를 둘러싼 가능한 긍정적 효과를 감소시킨다. 다행스럽게도 동물 모델과 인간 환자 모두에서 저면역원성 세포 또는 조직 이식이 과학적으로 실행 가능하고 수많은 장애 및 병태의 치료에 대해 임상적으로 유망한 접근이라는 실질적인 증거가 있다.
이와 같이, 수신체의 면역계에 의한 검출을 회피하는 세포 기반 치료법을 생성하기 위한 신규 접근, 조성물 및 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
일부 측면에서, 저면역원성 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 저면역원성 세포는 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 (I) (a) 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (b) MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (c) 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는 (d) B2M 및 CIITA의 감소된 발현 중 하나 이상을 포함하고; 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며; (II) 환자는 감작된 환자이고, 환자는 (i) 하나 이상의 동종항원에 대해 감작되고; (ii) 하나 이상의 자가 항원에 대해 감작되고; (iii) 이전 이식으로 인해 감작되고; (iv) 이전 임신으로 인해 감작되고; (v) 병태 또는 질환에 대해 이전에 치료를 받았고 및/또는 (vi) 조직 또는 장기 이식 환자이고, 저면역원성 세포는 조직 또는 장기 이식을 투여하기 전에, 동시에 및/또는 후에 투여된다.
일부 측면에서, 췌장 섬세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 췌장 섬세포는 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 (I) (a) 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (b) MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (c) 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는 (d) B2M 및 CIITA의 감소된 발현 중 하나 이상을 포함하고; 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며; (II) (a) 환자는 감작된 환자가 아니거나; (b) 환자가 감작된 환자이고, 환자는 (i) 하나 이상의 동종항원에 대해 감작되고; (ii) 하나 이상의 자가 항원에 대해 감작되고; (iii) 이전 이식으로 인해 감작되고; (iv) 이전 임신으로 인해 감작되고; (v) 병태 또는 질환에 대해 이전에 치료를 받았고 및/또는 (vi) 조직 또는 장기 환자이고, 췌장 섬세포는 조직 또는 장기 이식을 투여하기 전에 투여된다.
일부 측면에서, 심장 전구 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 심장 전구 세포는 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 (I) (a) 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (b) MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (c) 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는 (d) B2M 및 CIITA의 감소된 발현 중 하나 이상을 포함하고; 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며; (II) (a) 환자는 감작된 환자가 아니거나 (b) 환자가 감작된 환자이고, 환자는 (i) 하나 이상의 동종항원에 대해 감작되고; (ii) 하나 이상의 자가 항원에 대해 감작되고; (iii) 이전 이식으로 인해 감작되고; (iv) 이전 임신으로 인해 감작되고; (v) 병태 또는 질환에 대해 이전에 치료를 받았고 및/또는 (vi) 조직 또는 장기 환자이고, 심장 근육 세포는 조직 또는 장기 이식을 투여하기 전에 투여된다.
일부 측면에서, 아교 전구체 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 아교 전구체 세포는 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 (I) (a) 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (b) MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (c) 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는 (d) B2M 및 CIITA의 감소된 발현 중 하나 이상을 포함하고; 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며; (II) (a) 환자는 감작된 환자가 아니거나; (b) 환자가 감작된 환자이고, 환자는 (i) 하나 이상의 동종항원에 대해 감작되고; (ii) 하나 이상의 자가 항원에 대해 감작되고; (iii) 이전 이식으로 인해 감작되고; (iv) 이전 임신으로 인해 감작되고; (v) 병태 또는 질환에 대해 이전에 치료를 받았고 및/또는 (vi) 조직 또는 장기 환자이고, 아교 전구체 세포는 조직 또는 장기 이식을 투여하기 전에 투여된다.
일부 구현예에서, 환자는 감작된 환자이고 환자는 하나 이상의 동종항원 또는 하나 이상의 자가 항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 동종항원은 인간 백혈구 항원을 포함한다.
일부 구현예에서, 환자는 이전 이식으로 인해 감작된 감작 환자이고, (a) 이전 이식은 세포 이식, 수혈, 조직 이식 및 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택되고, 임의로 이전 이식은 동종이계 이식이거나; (b) 이전 이식은 인간 기원의 키메라, 변형된 비인간 자가 세포, 변형된 자가 세포, 자가 조직 및 자가 장기로 구성된 군으로부터 선택된 이식이고, 임의로 이전 이식은 자가 이식이다.
일부 구현예에서, 환자는 이전 임신으로 인해 감작된 감작 환자이고 환자는 이전에 임신 중 동종면역화를 나타냈으며, 임의로 임신 중 동종면역화는 태아 및 신생아의 용혈성 질환(HDFN), 신생아 동종면역 호중구감소증(NAN) 또는 태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증(FNAIT)이다.
일부 구현예에서, 환자는 병태 또는 질환에 대한 이전 치료로 인해 감작된 감작 환자이고, 병태 또는 질환은 본원에 설명된 바와 같이 환자가 치료받고 있는 질환 또는 병태와 상이하거나 동일하다.
일부 구현예에서, 환자는 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았고, 이전 치료는 세포 집단을 포함하지 않았으며, (a) 세포 집단이 이전 치료와 동일한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여되고; (b) 세포 집단이 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 향상된 치료 효과를 나타내고; (c) 세포 집단이 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 더 긴 치료 효과를 나타내고; (d) 이전 치료가 치료적으로 효과적이었고; (e) 이전 치료가 치료적으로 비효과적이었고; (f) 환자가 이전 치료에 대해 면역 반응을 일으켰고; 및/또는 (g) 세포 집단이 이전 치료와 상이한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여된다.
일부 구현예에서, 이전 치료는 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템을 포함하는 치료 세포 집단을 투여하는 것을 포함하고, 면역 반응은 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템의 활성화에 반응하여 발생한다.
일부 구현예에서, 이전 치료는 기계 보조 치료를 포함하며, 임의로 기계 보조 치료는 혈액투석 또는 심실 보조 장치를 포함한다.
일부 구현예에서, 이전 치료는 동종이계 CAR-T 세포 기반 치료법 또는 자가 CAR-T 세포 기반 치료법을 포함하고, 자가 CAR-T 세포 기반 치료법은 브렉수카브타진 오토루셀, 악시카브타진 실로루셀, 이데카브타진 비클루셀, 리소카브타진 마라루셀, 티사겐렉루셀, Cartesian Therapeutics의 Descartes-08 또는 Descartes-11, Novartis의 CTL110, Poseida Therapeutics의 P-BMCA-101, Autolus Limited의 AUTO4, Cellectis의 UCARTCS, Precision Biosciences의 PBCAR19B 또는 PBCAR269A, Fate Therapeutics의 FT819, 및 Clyad Oncology의 CYAD-211로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 환자는 알레르기를 갖고, 임의로 알레르기는 건초열, 식품 알레르기, 곤충 알레르기, 약물 알레르기 및 아토피성 피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 알레르기이다.
일부 구현예에서, 세포는 DUX4, CD24, CD46, CD55, CD59, CD200, PD-L1, HLA-E, HLA-G, IDO1, FasL, IL-35, IL-39, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpin B9, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD142의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD46의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD59의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 줄기 세포로부터 분화된다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 만능 줄기 세포이고, 임의로 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 심장 세포, 심장 전구 세포, 신경 세포, 아교 전구 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포, NK 세포 및 CAR-NK 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포는 1차 세포로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 1차 세포는 1차 T 세포, 1차 베타 세포 또는 1차 망막 색소 상피 세포이다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 환자와 상이한 하나 이상의 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 T 세포 풀로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 CD19, CD22 또는 BCMA에 결합한다.
일부 구현예에서, CAR은 세포가 CD19 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR이다. 일부 구현예에서, CAR은 세포가 CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD22-특이적 CAR이다. 일부 구현예에서, 세포는 세포가 CD19/CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR은 단일 바이시스트론 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR은 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌는 상이하다. 일부 구현예에서, 세포는 각각 제3 게놈 유전자좌에 삽입된 제3 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 게놈 유전자좌는 제1 또는 제2 게놈 유전자좌와 동일하다. 일부 구현예에서, 제3 게놈 유전자좌는 제1 및/또는 제2 게놈 유전자좌와 상이하다.
일부 구현예에서, 세이프 하버 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, PPP1R12C(AAVS1로도 알려짐) 유전자, ROSA26 유전자 유전자좌 및 CLYBL 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 표적 유전자좌는 CXCR4 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자좌, CD142 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CCR5 유전자좌로의 삽입은 CCR5 유전자의 엑손 1-3, 인트론 1-2 또는 또 다른 코딩 서열(CDS)에 있다. 일부 구현예에서, PPP1R12C 유전자 유전자좌로의 삽입은 PPP1R12C 유전자의 인트론 1 또는 인트론 2이다. 일부 구현예에서, CLYBL 유전자 유전자좌로의 삽입은 CLYBL 유전자의 인트론 2이다. 일부 구현예에서, ROSA26 유전자 유전자좌로의 삽입은 ROSA26 유전자의 인트론 1이다. 일부 구현예에서, 세이프 하버 유전자좌로의 삽입으로의 삽입은 SHS231 유전자좌이다. 일부 구현예에서, CD142 유전자 유전자좌로의 삽입은 CD142 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, MICA 유전자 유전자좌로의 삽입은 MICA 유전자의 CDS에 있다. 일부 구현예에서, MICB 유전자 유전자좌로의 삽입은 MICB 유전자의 CDS에 있다. 일부 구현예에서, B2M 유전자 유전자좌로의 삽입은 B2M 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, CIITA 유전자 유전자좌로의 삽입은 CIITA 유전자의 엑손 3 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자 유전자좌로의 삽입은 TRAC 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, TRB 유전자 유전자좌로의 삽입은 TRB 유전자의 CDS에 있다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 내인성 T 세포 수용체; 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4); 프로그래밍된 세포 사멸(PD1); 및 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1) 중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하고, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 TRAC의 감소된 발현을 포함하였다.
일부 구현예에서, 세포는 내인성 T 세포 수용체; 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4); 프로그래밍된 세포 사멸(PD1); 및 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1) 중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 TRAC 및 TRB의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포이다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CAG 및/또는 EF1a 프로모터이다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1일 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1일 이상 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1주 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1주 이상 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1개월 이상 후에, 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1개월 이상 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 환자는 세포 집단의 투여 시 면역 반응을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 세포 집단의 투여 시 면역 반응 부재는 전신 면역 반응 부재, 적응 면역 반응 부재, 선천성 면역 반응 부재, T 세포 반응 부재, B 세포 반응 부재 및 전신 급성 세포성 면역 반응 부재로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 환자는 (a) 세포 집단의 투여 시 전신 TH1 활성화 부재; (b) 세포 집단의 투여 시 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 면역 활성화 부재; (c) 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 공여체 특이적 IgG 항체 부재; (d) 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 IgM 및 IgG 항체 생성 부재; 및 (e) 세포 집단의 투여 시 세포 집단의 세포독성 T 세포 사멸 부재 중 하나 이상을 나타낸다.
일부 구현예에서, 환자는 세포 집단의 투여의 적어도 3일 이상 전에 또는 후에 면역억제제를 투여받지 않는다.
일부 구현예에서, 방법은 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 1차 투여; 회복 기간; 및 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 2차 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 회복 기간은 적어도 1개월 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 회복 기간은 적어도 2개월 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시되며, 임의로 세포는 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템으로 인한 제거로 인해 더 이상 검출 가능하지 않다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템에 의해 제거되고, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시된다.
일부 구현예에서, 방법은 적어도 2회 투약 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 세포 결핍의 치료를 위해 또는 심장, 폐, 신장, 간, 췌장, 장, 위, 각막, 골수, 혈관, 심장 판막, 뇌, 척수 및 뼈로 구성된 군으로부터 선택된 조직 또는 장기에서의 병태 또는 질환의 치료를 위한 세포 치료법으로서 투여된다.
방법의 일부 구현예에서, (a) 세포 결핍은 신경퇴행성 질환과 관련되거나 세포 치료법은 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 것이거나; (b) 세포 결핍은 간 질환과 관련되거나 세포 치료법은 간 질환의 치료를 위한 것이거나; (c) 세포 결핍은 각막 질환과 관련되거나 세포 치료법은 각막 질환의 치료를 위한 것이거나; (d) 세포 결핍은 심혈관 병태 또는 질환과 관련되거나 세포 치료법은 심혈관 병태 또는 질환의 치료를 위한 것이거나; (e) 세포 결핍은 당뇨병과 관련되거나 세포 치료법은 당뇨병 치료를 위한 것이거나; (f) 세포 결핍은 혈관 병태 또는 질환과 관련되거나 세포 치료법은 혈관 병태 또는 질환의 치료를 위한 것이거나; (g) 세포 결핍은 자가면역 갑상샘염과 관련되거나 세포 치료법은 자가면역 갑상샘염의 치료를 위한 것이거나; (h) 세포 결핍은 신장 질환과 관련되거나 세포 치료법은 신장 질환 치료를 위한 것이다.
방법의 일부 구현예에서, (a) 신경퇴행성 질환은 백질이영양증, 헌팅턴병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 횡단 척수염, 및 펠리체우스-메르츠바허병(PMD)으로 구성된 군으로부터 선택되거나; (b) 간 질환은 간 경변증을 포함하거나; (c) 각막 질환은 푹스 이영양증 또는 선천성 유전 내피 이영양증이거나; (d) 심혈관 질환은 심근 경색 또는 울혈성 심부전이다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 (a) 아교 전구 세포, 희소돌기아교세포, 성상세포 및 도파민성 뉴런으로 구성된 군으로부터 선택된 세포로서, 임의로 도파민성 뉴런은 신경 줄기 세포, 신경 전구 세포, 미성숙 도파민성 뉴런 및 성숙 도파민성 뉴런으로 구성된 군으로부터 선택되는, 세포; (b) 간세포 또는 간 전구 세포; (c) 각막 내피 전구 세포 또는 각막 내피 세포; (d) 심근세포 또는 심장 전구 세포; (e) 췌장 베타 섬세포를 포함하는 췌장 섬세포로서, 임의로 췌장 섬세포는 췌장 섬 전구 세포, 미성숙 췌장 섬세포, 및 성숙 췌장 섬세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 세포; (f) 내피 세포; (g) 갑상샘 전구 세포; 또는 (h) 신장 전구체 세포 또는 신장 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 암의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 암은 B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 샘암종, 췌장 샘암종, 교모세포종, 신경모세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 환자는 조직 또는 장기 이식을 받고 있으며, 임의로 조직 또는 장기 이식 또는 부분 장기 이식은 심장 이식, 폐 이식, 신장 이식, 간 이식, 췌장 이식, 장 이식, 위 이식, 각막 이식, 골수 이식, 혈관 이식, 심장 판막 이식, 뼈 이식, 부분 폐 이식, 부분 신장 이식, 부분 간 이식, 부분 췌장 이식, 부분 장 이식 및 부분 각막 이식으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 조직 또는 장기 이식은 동종이식편 이식이다. 일부 구현예에서, 조직 또는 장기 이식은 자가이식편 이식이다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 조직 또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 투여되고 조직 또는 장기 이식은 동일한 조직 또는 장기의 대체를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 조직 또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 투여되고 조직 또는 장기 이식은 상이한 조직 또는 장기의 대체를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 장기 이식은 신장 이식이고 세포 집단은 췌장 베타 섬세포 집단이다. 일부 구현예에서, 환자는 당뇨병을 갖는다. 일부 구현예에서, 장기 이식은 심장 이식이고 세포 집단은 박동조율 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 장기 이식은 췌장 이식이고 세포 집단은 베타 섬세포 집단이다. 일부 구현예에서, 장기 이식은 부분 간 이식이고 세포 집단은 간세포 또는 간 전구 세포 집단이다.
일부 측면에서, 환자의 장애를 치료하기 위한 저면역원성 세포 집단의 용도가 본원에 제공되며, 저면역원성 세포는 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 (I) (a) 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (b) MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (c) 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는 (d) B2M 및 CIITA의 감소된 발현 중 하나 이상을 포함하고; 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며; (II) (a) 환자는 감작된 환자가 아니거나; (b) 환자는 감작된 환자이다.
일부 측면에서, 환자의 장애를 치료하기 위한 췌장 섬세포 집단의 용도가 본원에 제공되며, 췌장 섬세포는 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 (I) (a) 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (b) MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (c) 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는 (d) B2M 및 CIITA의 감소된 발현 중 하나 이상을 포함하고; 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며; (II) (a) 환자는 감작된 환자가 아니거나; (b) 환자는 감작된 환자이다.
일부 측면에서, 환자의 장애를 치료하기 위한 심장 근육 세포 집단의 용도가 본원에 제공되며, 심장 근육 세포는 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 (I) (a) 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (b) MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (c) 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는 (d) B2M 및 CIITA의 감소된 발현 중 하나 이상을 포함하고; 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며; (II) (a) 환자는 감작된 환자가 아니거나; (b) 환자는 감작된 환자이다.
일부 측면에서, 환자의 장애를 치료하기 위한 아교 전구 세포 집단의 용도가 본원에 제공되며, 아교 전구 세포는 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 (I) (a) 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (b) MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (c) 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는 (d) B2M 및 CIITA의 감소된 발현 중 하나 이상을 포함하고; 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며; (II) (a) 환자는 감작된 환자가 아니거나; (b) 환자는 감작된 환자이다.
일부 구현예에서, 환자는 감작된 환자이고 환자는 하나 이상의 동종항원 또는 하나 이상의 자가 항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 동종항원은 인간 백혈구 항원을 포함한다.
일부 구현예에서, 환자는 이전 이식으로 인해 감작된 감작 환자이고, 이전 이식은 세포 이식, 수혈, 조직 이식 및 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택되고, 임의로 이전 이식은 동종이계 이식이거나; 이전 이식은 인간 기원의 키메라, 변형된 비인간 자가 세포, 변형된 자가 세포, 자가 조직 및 자가 장기로 구성된 군으로부터 선택된 이식이고, 임의로 이전 이식은 자가 이식이다.
일부 구현예에서, 환자는 이전 임신으로 인해 감작된 감작 환자이고 환자는 이전에 임신 중 동종면역화를 나타냈으며, 임의로 임신 중 동종면역화는 태아 및 신생아의 용혈성 질환(HDFN), 신생아 동종면역 호중구감소증(NAN) 또는 태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증(FNAIT)이다.
일부 구현예에서, 환자는 병태 또는 질환에 대한 이전 치료로 인해 감작된 감작 환자이다. 일부 구현예에서, 환자는 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았고, 이전 치료는 세포 집단을 포함하지 않았으며, (a) 세포 집단은 이전 치료와 동일한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여되고; (b) 세포 집단은 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 향상된 치료 효과를 나타내고; (c) 세포 집단은 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 더 긴 치료 효과를 나타내고; (d) 이전 치료는 치료적으로 효과적이었고; (e) 이전 치료는 치료적으로 비효과적이었고; (f) 환자는 이전 치료에 대해 면역 반응을 일으켰고 및/또는 (g) 세포 집단은 이전 치료와 상이한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여된다.
일부 구현예에서, 이전 치료는 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템을 포함하는 치료 세포 집단을 투여하는 것을 포함하고, 면역 반응은 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템의 활성화에 반응하여 발생한다.
일부 구현예에서, 이전 치료는 기계 보조 치료를 포함하며, 임의로 기계 보조 치료는 혈액투석 또는 심실 보조 장치를 포함한다.
일부 구현예에서, 환자는 알레르기를 갖고, 임의로 알레르기는 건초열, 식품 알레르기, 곤충 알레르기, 약물 알레르기 및 아토피성 피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 알레르기이다.
일부 구현예에서, 세포는 DUX4, CD24, CD46, CD55, CD59, CD200, PD-L1, HLA-E, HLA-G, IDO1, FasL, IL-35, IL-39, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpin B9, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD142의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD46의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD59의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 줄기 세포로부터 분화된다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 만능 줄기 세포이고, 임의로 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포이다.
일부 구현예에서, 세포는 심장 세포, 신경 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포, NK 세포 및 CAR-NK 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포는 1차 세포로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 1차 세포는 1차 T 세포, 1차 베타 세포 또는 1차 망막 색소 상피 세포이다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 환자와 상이한 하나 이상의 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 T 세포 풀로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 CD19, CD22 또는 BCMA에 결합한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포가 CD19 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR이다. 일부 구현예에서, CAR은 세포가 CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD22-특이적 CAR이다. 일부 구현예에서, 세포는 세포가 CD19/CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR은 단일 바이시스트론 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR은 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌는 상이하다. 일부 구현예에서, 세포는 각각 제3 게놈 유전자좌에 삽입된 제3 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 게놈 유전자좌는 제1 또는 제2 게놈 유전자좌와 동일하다. 일부 구현예에서, 제3 게놈 유전자좌는 제1 및/또는 제2 게놈 유전자좌와 상이하다.
일부 구현예에서, 세이프 하버 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, PPP1R12C(AAVS1로도 알려짐) 유전자 및 CLYBL 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 표적 유전자좌는 CXCR4 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자좌, ROSA26 유전자 유전자좌, CD142 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CCR5 유전자 유전자좌로의 삽입은 CCR5 유전자의 엑손 1-3, 인트론 1-2 또는 또 다른 코딩 서열(CDS)에 있다. 일부 구현예에서, PPP1R12C 유전자 유전자좌로의 삽입은 PPP1R12C 유전자의 인트론 1 또는 인트론 2이다. 일부 구현예에서, CLYBL 유전자 유전자좌로의 삽입은 CLYBL 유전자의 인트론 2이다. 일부 구현예에서, ROSA26 유전자 유전자좌로의 삽입은 ROSA26 유전자의 인트론 1이다. 일부 구현예에서, 세이프 하버 유전자좌로의 삽입은 SHS231 유전자좌이다. 일부 구현예에서, CD142 유전자 유전자좌로의 삽입은 CD142 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, MICA 유전자 유전자좌로의 삽입은 MICA 유전자의 CDS에 있다. 일부 구현예에서, MICB 유전자 유전자좌로의 삽입은 MICB 유전자의 CDS에 있다. 일부 구현예에서, B2M 유전자 유전자좌로의 삽입은 B2M 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, CIITA 유전자 유전자좌로의 삽입은 CIITA 유전자의 엑손 3 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자 유전자좌로의 삽입은 TRAC 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, TRB 유전자 유전자좌로의 삽입은 TRB 유전자의 CDS에 있다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 (a) 내인성 T 세포 수용체; (b) 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4); (c) 프로그램된 세포 사멸(PD1); 및 (d) 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1) 중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하며, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 TRAC의 감소된 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 (a) 내인성 T 세포 수용체; (b) 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4); (c) 프로그램된 세포 사멸(PD1); 및 (d) 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1) 중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포이며; 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이다. 일부 구현예에서, 세포는 TRAC 및 TRB의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포이다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CAG 및/또는 EF1a 프로모터이다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1일 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1일 이상 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1주 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1주 이상 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1개월 이상 후에, 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1개월 이상 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 환자는 세포 집단의 투여 시 면역 반응을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 세포 집단의 투여 시 면역 반응 부재는 전신 면역 반응 부재, 적응 면역 반응 부재, 선천성 면역 반응 부재, T 세포 반응 부재, B 세포 반응 없음 및 전신 급성 세포성 면역 반응 없음으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 환자는 (a) 세포 집단의 투여 시 전신 TH1 활성화 부재; (b) 세포 집단의 투여 시 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 면역 활성화 부재; (c) 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 공여체 특이적 IgG 항체 부재; (d) 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 IgM 및 IgG 항체 생성 부재; 및 (e) 세포 집단의 투여 시 세포 집단의 세포독성 T 세포 사멸 부재 중 하나 이상을 나타낸다.
일부 구현예에서, 환자는 세포 집단의 투여의 적어도 3일 이상 전에 또는 후에 면역억제제를 투여받지 않는다.
일부 구현예에서, 방법은 (a) 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 1차 투여; (b) 회복 기간; 및 (c) 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 2차 투여를 포함하는 투약 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 회복 기간은 적어도 1개월 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 회복 기간은 적어도 2개월 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템에 의해 제거되고, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시된다.
일부 구현예에서, 세포의 용도는 적어도 2회 투약 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 세포 결핍의 치료를 위해 또는 심장, 폐, 신장, 간, 췌장, 장, 위, 각막, 골수, 혈관, 심장 판막, 뇌, 척수 및 뼈로 구성된 군으로부터 선택된 조직 또는 장기에서의 병태 또는 질환의 치료를 위한 세포 치료법으로서 투여된다.
일부 구현예에서, (a) 세포 결핍은 신경퇴행성 질환과 관련되거나 세포 치료법은 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 것이거나; (b) 세포 결핍은 간 질환과 관련되거나 세포 치료법은 간 질환의 치료를 위한 것이거나; (c) 세포 결핍은 각막 질환과 관련되거나 세포 치료법은 각막 질환의 치료를 위한 것이거나; (d) 세포 결핍은 심혈관 병태 또는 질환과 관련되거나 세포 치료법은 심혈관 병태 또는 질환의 치료를 위한 것이거나; (e) 세포 결핍은 당뇨병과 관련되거나 세포 치료법은 당뇨병 치료를 위한 것이거나; (f) 세포 결핍은 혈관 병태 또는 질환과 관련되거나 세포 치료법은 혈관 병태 또는 질환의 치료를 위한 것이거나; (g) 세포 결핍은 자가면역 갑상샘염과 관련되거나 세포 치료법은 자가면역 갑상샘염의 치료를 위한 것이거나; (h) 세포 결핍은 신장 질환과 관련되거나 세포 치료법은 신장 질환 치료를 위한 것이다.
일부 구현예에서, (a) 신경퇴행성 질환은 백질이영양증, 헌팅턴병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 횡단 척수염, 및 펠리체우스-메르츠바허병(PMD)으로 구성된 군으로부터 선택되거나; (b) 간 질환은 간 경변증을 포함하거나; (c) 각막 질환은 푹스 이영양증 또는 선천성 유전 내피 이영양증이거나; (d) 심혈관 질환은 심근 경색 또는 울혈성 심부전이다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 (a) 아교 전구 세포로 구성된 군으로부터 선택된 세포, (b) 희소돌기아교세포, 성상세포 및 도파민성 뉴런으로서, 임의로 도파민성 뉴런은 신경 줄기 세포, 신경 전구 세포, 미성숙 도파민성 뉴런, 및 성숙 도파민성 뉴런으로 구성된 군으로부터 선택된, 세포; (c) 간세포 또는 간 전구 세포; (d) 각막 내피 전구 세포 또는 각막 내피 세포; (e) 심근세포 또는 심장 전구 세포; (f) 췌장 베타 섬세포를 포함하는 췌장 섬세포로서, 임의로 췌장 섬세포는 췌장 섬 전구 세포, 미성숙 췌장 섬세포 및 성숙 췌장 섬세포로 구성된 군으로부터 선택된, 세포; (g) 내피 세포; (h) 갑상샘 전구 세포; 또는 (i) 신장 전구체 세포 또는 신장 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 암의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 암은 B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 샘암종, 췌장 샘암종, 교모세포종, 신경모세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 환자는 조직 또는 장기 이식을 받고 있으며, 임의로 조직 또는 장기 이식 또는 부분 장기 이식은 심장 이식, 폐 이식, 신장 이식, 간 이식, 췌장 이식, 장 이식, 위 이식, 각막 이식, 골수 이식, 혈관 이식, 심장 판막 이식, 뼈 이식, 부분 폐 이식, 부분 신장 이식, 부분 간 이식, 부분 췌장 이식, 부분 장 이식 및 부분 각막 이식으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 조직 또는 장기 이식은 동종이식편 이식이다. 일부 구현예에서, 조직 또는 장기 이식은 자가이식편 이식이다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 조직 또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 투여되고 조직 또는 장기 이식은 동일한 조직 또는 장기의 대체를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 조직 또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 투여되고 조직 또는 장기 이식은 상이한 조직 또는 장기의 대체를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 장기 이식은 신장 이식이고 세포 집단은 신장 전구체 세포 또는 신장 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 환자는 당뇨병을 갖는다. 일부 구현예에서, 장기 이식은 심장 이식이고 세포 집단은 심장 전구 세포 또는 박동조율 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 장기 이식은 췌장 이식이고 세포 집단은 췌장 베타 섬세포 집단이다. 일부 구현예에서, 장기 이식은 부분 간 이식이고 세포 집단은 간세포 또는 간 전구 세포 집단이다.
일부 측면에서, 저면역원성 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 저면역원성 세포는 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드, CAR을 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 (I) (a) 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (b) MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (c) 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는 (d) B2M 및 CIITA의 감소된 발현 중 하나 이상을 포함하고, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며; (II) (a) 환자는 감작된 환자가 아니거나; (b) 환자가 감작된 환자이고, 환자는 (i) 하나 이상의 동종항원에 대해 감작되고; (ii) 하나 이상의 자가 항원에 대해 감작되고; (iii) 이전 이식으로 인해 감작되고; (iv) 이전 임신으로 인해 감작되고; (v) 병태 또는 질환에 대해 이전에 치료를 받았고 및/또는 (vi) 조직 또는 장기 환자이고, 저면역원성 세포는 조직 또는 장기 이식을 투여하기 전에 투여된다.
일부 구현예에서, 환자는 감작된 환자이고 환자는 하나 이상의 동종항원 또는 하나 이상의 자가 항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 동종항원은 인간 백혈구 항원을 포함한다.
일부 구현예에서, 환자는 이전 이식으로 인해 감작된 감작 환자이고, 이전 이식은 세포 이식, 수혈, 조직 이식 및 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택되고, 임의로 이전 이식은 동종이계 이식이거나; 이전 이식은 인간 기원의 키메라, 변형된 비인간 자가 세포, 변형된 자가 세포, 자가 조직 및 자가 장기로 구성된 군으로부터 선택된 이식이고, 임의로 이전 이식은 자가 이식이다.
일부 구현예에서, 환자는 이전 임신으로 인해 감작된 감작 환자이고 환자는 이전에 임신 중 동종면역화를 나타냈으며, 임의로 임신 중 동종면역화는 태아 및 신생아의 용혈성 질환(HDFN), 신생아 동종면역 호중구감소증(NAN) 또는 태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증(FNAIT)이다.
일부 구현예에서, 환자는 병태 또는 질환에 대한 이전 치료로 인해 감작된 감작 환자이다. 일부 구현예에서, 환자는 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았고, 이전 치료는 세포 집단을 포함하지 않았으며, (a) 세포 집단은 이전 치료와 같은 동일한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여되고; (b) 세포 집단은 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 향상된 치료 효과를 나타내고; (c) 세포 집단은 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 더 긴 치료 효과를 나타내고; (d) 이전 치료는 치료적으로 효과적이었고; (e) 이전 치료는 치료적으로 비효과적이었고; (f) 환자는 이전 치료에 대해 면역 반응을 일으켰고 및/또는 (g) 세포 집단은 이전 치료와 상이한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여된다.
일부 구현예에서, 이전 치료는 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템을 포함하는 치료 세포 집단을 투여하는 것을 포함하고, 면역 반응은 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템의 활성화에 반응하여 발생한다.
일부 구현예에서, 이전 치료는 기계 보조 치료를 포함하며, 임의로 기계 보조 치료는 혈액투석 또는 심실 보조 장치를 포함한다.
일부 구현예에서, 환자는 알레르기를 갖고, 임의로 알레르기는 건초열, 식품 알레르기, 곤충 알레르기, 약물 알레르기 및 아토피성 피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 알레르기이다.
일부 구현예에서, 세포는 DUX4, CD24, CD46, CD55, CD59, CD200, PD-L1, HLA-E, HLA-G, IDO1, FasL, IL-35, IL-39, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpin B9, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD142의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD46의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD59의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 줄기 세포로부터 분화된다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 만능 줄기 세포이고, 임의로 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CAR T 세포 또는 CAR-NK 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 1차 T 세포로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 환자와 상이한 하나 이상의 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 T 세포 풀로부터 유래된다.
일부 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 CD19, CD22 또는 BCMA에 결합한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포가 CD19 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR이다. 일부 구현예에서, CAR은 세포가 CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD22-특이적 CAR이다. 일부 구현예에서, 세포는 세포가 CD19/CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR은 단일 바이시스트론 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR은 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌는 상이하다.
일부 구현예에서, 세포는 각각 제3 게놈 유전자좌에 삽입된 제3 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 게놈 유전자좌는 제1 또는 제2 게놈 유전자좌와 동일하다. 일부 구현예에서, 제3 게놈 유전자좌는 제1 및/또는 제2 게놈 유전자좌와 상이하다.
일부 구현예에서, 세이프 하버 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, PPP1R12C(AAVS1로도 알려짐) 유전자 및 CLYBL 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 표적 유전자좌는 CXCR4 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자좌, ROSA26 유전자 유전자좌, CD142 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CCR5 유전자 유전자좌로의 삽입은 CCR5 유전자의 엑손 1-3, 인트론 1-2 또는 또 다른 코딩 서열(CDS)에 있다. 일부 구현예에서, PPP1R12C 유전자 유전자좌로의 삽입은 PPP1R12C 유전자의 인트론 1 또는 인트론 2이다. 일부 구현예에서, CLYBL 유전자 유전자좌로의 삽입은 CLYBL 유전자의 인트론 2이다. 일부 구현예에서, ROSA26 유전자 유전자좌로의 삽입은 ROSA26 유전자의 인트론 1이다. 일부 구현예에서, 세이프 하버 유전자좌로의 삽입으로의 삽입은 SHS231 유전자좌이다. 일부 구현예에서, CD142 유전자 유전자좌로의 삽입은 CD142 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, MICA 유전자 유전자좌로의 삽입은 MICA 유전자의 CDS에 있다. 일부 구현예에서, MICB 유전자 유전자좌로의 삽입은 MICB 유전자의 CDS에 있다. 일부 구현예에서, B2M 유전자 유전자좌로의 삽입은 B2M 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, CIITA 유전자 유전자좌로의 삽입은 CIITA 유전자의 엑손 3 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자 유전자좌로의 삽입은 TRAC 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, TRB 유전자 유전자좌로의 삽입은 TRB 유전자의 CDS에 있다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 내인성 T 세포 수용체; 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4); 프로그래밍된 세포 사멸(PD1); 및 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1) 중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하며, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 TRAC의 감소된 발현을 포함하였다.
일부 구현예에서, 세포는 내인성 T 세포 수용체; 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4); 프로그래밍된 세포 사멸(PD1); 및 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1) 중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포이며, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이다. 일부 구현예에서, 세포는 TRAC 및 TRB의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포이다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CAG 및/또는 EF1a 프로모터이다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1일 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1일 이상 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1주 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1주 이상 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1개월 이상 후에, 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1개월 이상 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 환자는 세포 집단의 투여 시 면역 반응을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 세포 집단의 투여 시 면역 반응 부재는 전신 면역 반응 부재, 적응 면역 반응 부재, 선천성 면역 반응 부재, T 세포 반응 부재, B 세포 반응 없음 및 전신 급성 세포성 면역 반응 없음으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 환자는 (i) 세포 집단의 투여 시 전신 TH1 활성화 부재; (ii) 세포 집단의 투여 시 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 면역 활성화 부재; (iii) 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 공여체 특이적 IgG 항체 부재; (iv) 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 IgM 및 IgG 항체 생성 부재; 및 (v) 세포 집단의 투여 시 세포 집단의 세포독성 T 세포 사멸 부재 중 하나 이상을 나타낸다.
일부 구현예에서, 환자는 세포 집단의 투여의 적어도 3일 이상 전에 또는 후에 면역억제제를 투여받지 않는다.
일부 구현예에서, 방법은 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 1차 투여; 회복 기간; 및 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 2차 투여를 포함하는 투약 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 회복 기간은 적어도 1개월 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 회복 기간은 적어도 2개월 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템에 의해 제거되고, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시된다.
일부 구현예에서, 방법은 적어도 2회 투약 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 암의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 암은 B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 샘암종, 췌장 샘암종, 교모세포종, 신경모세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 환자의 장애를 치료하기 위한 저면역원성 세포 집단의 용도가 제공되며, 저면역원성 세포는 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드, CAR을 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 (I) (a) 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (b) MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현; (c) 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는 (d) B2M 및 CIITA의 감소된 발현 중 하나 이상을 포함하고; 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며; (II) 환자는 감작된 환자가 아니거나; 환자는 감작된 환자이다.
일부 구현예에서, 환자는 감작된 환자이고 환자는 하나 이상의 동종항원 또는 하나 이상의 자가 항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타낸다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 동종항원은 인간 백혈구 항원을 포함한다.
일부 구현예에서, 환자는 이전 이식으로 인해 감작된 감작 환자이고, 이전 이식은 세포 이식, 수혈, 조직 이식 및 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택되고, 임의로 이전 이식은 동종이계 이식이거나; 이전 이식은 인간 기원의 키메라, 변형된 비인간 자가 세포, 변형된 자가 세포, 자가 조직 및 자가 장기로 구성된 군으로부터 선택된 이식이고, 임의로 이전 이식은 자가 이식이다.
일부 구현예에서, 환자는 이전 임신으로 인해 감작된 감작 환자이고 환자는 이전에 임신 중 동종면역화를 나타냈으며, 임의로 임신 중 동종면역화는 태아 및 신생아의 용혈성 질환(HDFN), 신생아 동종면역 호중구감소증(NAN) 또는 태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증(FNAIT)이다.
일부 구현예에서, 환자는 병태 또는 질환에 대한 이전 치료로 인해 감작된 감작 환자이다. 일부 구현예에서, 환자는 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았고, 이전 치료는 세포 집단을 포함하지 않았으며, (a) 세포 집단은 이전 치료와 같은 동일한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여되고; (b) 세포 집단은 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 향상된 치료 효과를 나타내고; (c) 세포 집단은 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 더 긴 치료 효과를 나타내고; (d) 이전 치료는 치료적으로 효과적이었고; (e) 이전 치료는 치료적으로 비효과적이었고; (f) 환자는 이전 치료에 대해 면역 반응을 일으켰고 및/또는 (g) 세포 집단은 이전 치료와 상이한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 이전 치료는 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템을 포함하는 치료 세포 집단을 투여하는 것을 포함하고, 면역 반응은 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템의 활성화에 반응하여 발생한다. 일부 구현예에서, 이전 치료는 기계 보조 치료를 포함하며, 임의로 기계 보조 치료는 혈액투석 또는 심실 보조 장치를 포함한다.
일부 구현예에서, 환자는 알레르기를 갖고, 임의로 알레르기는 건초열, 식품 알레르기, 곤충 알레르기, 약물 알레르기 및 아토피성 피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 알레르기이다.
일부 구현예에서, 세포는 DUX4, CD24, CD46, CD55, CD59, CD200, PD-L1, HLA-E, HLA-G, IDO1, FasL, IL-35, IL-39, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpin B9, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD142의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD46의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD59의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 줄기 세포로부터 분화된다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 만능 줄기 세포이고, 임의로 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CAR T 세포 또는 CAR-NK 세포이고, 세포는 줄기 세포로부터 분화된다. 일부 구현예에서 세포는 1차 T 세포로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 환자와 상이한 하나 이상의 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 T 세포 풀로부터 유래된다.
일부 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 CD19, CD22 또는 BCMA에 결합한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포가 CD19 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR이다. 일부 구현예에서, CAR은 세포가 CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD22-특이적 CAR이다. 일부 구현예에서, 세포는 세포가 CD19/CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR은 단일 바이시스트론 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR은 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌는 상이하다. 일부 구현예에서, 세포는 각각 제3 게놈 유전자좌에 삽입된 제3 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 게놈 유전자좌는 제1 또는 제2 게놈 유전자좌와 동일하다. 일부 구현예에서, 제3 게놈 유전자좌는 제1 및/또는 제2 게놈 유전자좌와 상이하다.
일부 구현예에서, 세이프 하버 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, PPP1R12C(AAVS1로도 알려짐) 유전자 및 CLYBL 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 표적 유전자좌는 CXCR4 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자좌, ROSA26 유전자 유전자좌, CD142 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CCR5 유전자 유전자좌로의 삽입은 CCR5 유전자의 엑손 1-3, 인트론 1-2 또는 또 다른 코딩 서열(CDS)에 있다. 일부 구현예에서, PPP1R12C 유전자 유전자좌로의 삽입은 PPP1R12C 유전자의 인트론 1 또는 인트론 2이다. 일부 구현예에서, CLYBL 유전자 유전자좌로의 삽입은 CLYBL 유전자의 인트론 2이다.
일부 구현예에서, ROSA26 유전자 유전자좌로의 삽입은 ROSA26 유전자의 인트론 1이다. 일부 구현예에서, 세이프 하버 유전자좌로의 삽입으로의 삽입은 SHS231 유전자좌이다. 일부 구현예에서, CD142 유전자 유전자좌로의 삽입은 CD142 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, MICA 유전자 유전자좌로의 삽입은 MICA 유전자의 CDS에 있다. 일부 구현예에서, MICB 유전자 유전자좌로의 삽입은 MICB 유전자의 CDS에 있다. 일부 구현예에서, B2M 유전자 유전자좌로의 삽입은 B2M 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, CIITA 유전자 유전자좌로의 삽입은 CIITA 유전자의 엑손 3 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자 유전자좌로의 삽입은 TRAC 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있다. 일부 구현예에서, TRB 유전자 유전자좌로의 삽입은 TRB 유전자의 CDS에 있다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 (a) 내인성 T 세포 수용체; (b) 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4); (c) 프로그램된 세포 사멸(PD1); 및 (d) 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1) 중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하며, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 TRAC의 감소된 발현을 포함하였다.
일부 구현예에서, 세포는 (a) 내인성 T 세포 수용체; (b) 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4); (c) 프로그램된 세포 사멸(PD1); 및 (d) 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1) 중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포이며, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이다. 일부 구현예에서, 세포는 TRAC 및 TRB의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포이다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CAG 및/또는 EF1a 프로모터이다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1일 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1일 이상 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1주 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1주 이상 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1개월 이상 후에, 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1개월 이상 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 환자는 세포 집단의 투여 시 면역 반응을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 세포 집단의 투여 시 면역 반응 부재는 전신 면역 반응 부재, 적응 면역 반응 부재, 선천성 면역 반응 부재, T 세포 반응 부재, B 세포 반응 없음 및 전신 급성 세포성 면역 반응 없음으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 환자는 (a) 세포 집단의 투여 시 전신 TH1 활성화 부재; (b) 세포 집단의 투여 시 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 면역 활성화 부재; (c) 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 공여체 특이적 IgG 항체 부재; (d) 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 IgM 및 IgG 항체 생성 부재; 및 (e) 세포 집단의 투여 시 세포 집단의 세포독성 T 세포 사멸 부재 중 하나 이상을 나타낸다.
일부 구현예에서, 환자는 세포 집단의 투여의 적어도 3일 이상 전에 또는 후에 면역억제제를 투여받지 않는다.
일부 구현예에서, 방법은 (a) 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 1차 투여; (b) 회복 기간; 및 (c) 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 2차 투여를 포함하는 투약 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 회복 기간은 적어도 1개월 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 회복 기간은 적어도 2개월 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시된다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템에 의해 제거되고, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 세포의 용도는 적어도 2회 투약 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 암의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 암은 B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 샘암종, 췌장 샘암종, 교모세포종, 신경모세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
설명된 용도 또는 방법의 일부 구현예에서, 이전 치료는 동종이계 CAR-T 세포 기반 치료법 또는 자가 CAR-T 세포 기반 치료법을 포함하고, 자가 CAR-T 세포 기반 치료법은 브렉수카브타진, 오토루셀, 악시캅타겐 실로루셀, 이데카브타진 비클루셀, 리소카브타진 마라루셀, 티사겐렉루셀, Cartesian Therapeutics의 Descartes-08 또는 Descartes-11, Novartis의 CTL110, Poseida Therapeutics의 P-BMCA-101, Autolus Limited의 AUTO4, Cellectis의 UCARTCS, Precision Biosciences의 PBCAR19B 또는 PBCAR269A, Fate Therapeutics의 FT819, 및 Clyad Oncology의 CYAD-211로 구성된 군으로부터 선택된다.
도 1a-1f는 야생형 인간(도 1a, 1b, 1d 및 1f) 및 HIP(도 1a, 1c, 1d 및 1e) iPSC를 교차 투여한 NHP의 혈청으로부터의 일련의 대표적 ELISPOT 정량이다. 도 1a-1c는 1차 주사에서 야생형 인간 iPSC(wtxeno), 2차 주사에서 wtxeno 및 3차 주사에서 인간 HIP iPSC(HIPxeno)를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. 도 1d-1f는 1차 주사에서 HIPxeno, 2차 주사에서 HIPxeno 및 3차 주사에서 wtxeno를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. wtxeno 주사 및 HIPxeno 주사를 받은 후 실행된 모든 검정은 각각 수평선이 있는 막대 및 수직선이 있는 막대로 나타낸다. 다양한 시점, 예를 들어 처리-전("pre-Tx"), 제7일, 제13일, 제75일, 및 이후 교차 주사("pre-Tx"), 그 후 제7일, 제13일 및 제75일을 포함하는 세포 투여에서 분석을 위해 혈액을 채취했다. 아래 괄호 안의 일 기호는 도 1a-7c, 8c 및 8e에 나타낸 바와 같이 1차 주사(첫 번째 행), 2차 주사(두 번째 행) 및 3차 주사(세 번째 행)에 대해 혈액이 채취된 시간을 표시한다.
도 2a 및 2b는 야생형(도 2a) 또는 HIP(도 2a 및 2b) 인간 iPSC를 교차 투여한 NHP의 혈청에서 공여체 특이적 IgG 항체 결합을 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 2a 및 2b는 1차 주사에서 wtxeno, 2차 주사에서 wtxeno 및 3차 주사에서 HIPxeno를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. wtxeno 및 HIPxeno에 대해 실행된 모든 검정은 도 2a에서 각각 수평선이 있는 원 및 수직선이 있는 원으로 나타낸다. 도 2b는 HIPxeno 주사를 받은 후의 IgG DSA 수준을 나타낸다.
도 3a 및 3b는 야생형(도 3a 및 3b) 또는 HIP(도 3a) 인간 iPSC를 교차 투여한 NHP의 혈청에서 공여체 특이적 IgG 항체 결합을 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 3a 및 3b는 1차 주사에서 HIPxeno, 2차 주사에서 HIPxeno 및 3차 주사에서 wtxeno를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. wtxeno 및 HIPxeno에 대해 실행된 모든 검정은 도 2a에서 각각 수평선이 있는 원 및 수직선이 있는 원으로 나타낸다. 도 3b는 wtxeno 주사를 받은 후의 IgG DSA 수준을 나타낸다.
도 4a-4c는 야생형(도 4a 및 4b) 또는 HIP(도 4a 및 4c) 인간 iPSC를 교차 투여한 NHP의 혈청에서 총 IgM 항체를 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 4a-4c는 1차 주사에서 인간 HIP iPSC(HIPxeno), 2차 주사에서 HIPxeno 및 3차 주사에서 wtxeno를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. 도 4b는 wtxeno 주사를 받은 후의 총 IgM 항체 수준을 나타내고 도 4c는 2차 주사에서 HIPxeno를 받은 후의 총 IgM 항체 수준을 나타낸다.
도 5a-5c는 야생형(도 5a 및 5b) 또는 HIP(도 5a 및 5c) 인간 iPSC를 교차 투여한 NHP의 혈청에서 총 IgM 항체를 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 5a-5c는 1차 주사에서 wtxeno, 2차 주사에서 wtxeno 및 3차 주사에서 HIPxeno를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. 도 5b는 2차 주사에서 wtxeno를 받은 후의 총 IgM 항체 수준을 나타내고 도 5c는 3차 주사에서 HIPxeno를 받은 후의 총 IgM 항체 수준을 나타낸다.
도 6a-6c는 야생형(도 6a 및 6b) 또는 HIP(도 6a 및 6c) 인간 iPSC를 교차 투여한 NHP의 혈청에서 총 IgG 항체를 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 6a-6c는 1차 주사에서 HIPxeno, 2차 주사에서 HIPxeno 및 3차 주사에서 wtxeno를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. 도 6b는 3차 주사에서 wtxeno를 받은 후의 총 IgG 항체 수준을 나타내고 도 6c는 2차 주사에서 HIPxeno를 받은 후의 총 IgG 항체 수준을 나타낸다.
도 7a-7c는 야생형(도 7a 및 7b) 또는 HIP(도 7a 및 7c) 인간 iPSC를 교차 투여한 NHP의 혈청에서 총 IgG 항체를 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 7a-7c는 1차 주사에서 HIPxeno, 2차 주사에서 wtxeno 및 3차 주사에서 HIPxeno를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. 도 7b는 2차 주사에서 wtxeno를 받은 후의 총 IgG 항체 수준을 나타내고 도 7c는 3차 주사에서 HIPxeno를 받은 후의 총 IgG 항체 수준을 나타낸다.
도 8a-8e는 야생형 NHP로의 HIP 인간 iPSC의 자연 살해(NK) 세포-매개 사멸의 부재를 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 8a-8c는 1차 주사에서 HIPxeno, 2차 주사에서 HIPxeno 및 3차 주사에서 wtxeno를 받은 연구 그룹에서의 NK 세포 매개 사멸을 나타낸다. 1차 주사 단계(도 8a) 및 2차 주사 단계(도 8b)에서 인간 HIP iPSC의 NK 세포 사멸의 부재를 실시간 세포 바이오센서 데이터 그래프에 도시한다. 도 8d 및 8e는 1차 주사에서 wtxeno, 2차 주사에서 wtxeno 및 3차 주사에서 HIPxeno를 받은 연구 그룹에서의 NK 세포 매개 사멸을 나타낸다. 3차 주사 단계에서 인간 HIP iPSC의 NK 세포 사멸의 부재(도 8d)를 실시간 세포 바이오센서 데이터 그래프에 도시한다. 표적 세포 사멸%는 왼쪽 y축(평균±sd)에 나타내고, 사멸 속도를 오른쪽 y축에 나타낸다(사멸 t1/2 -1, 평균 ±sem; 흰색 삼각형으로 나타냄). wtxeno 및 HIPxeno 주사를 받은 후 실행된 검정을 각각 수평선이 있는 원 및 수직선이 있는 원으로 나타낸다.
도 9a는 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC의 대표적 BLI 이미지를 나타낸다. 시간 경과에 따른 BLI 신호 및 제0일 또는 이식-전 수준 대비 시간 경과에 따른 BLI 신호%를 아래에서 도 9a, 10, 11, 12a-12b 및 13c의 BLI 이미지에 나타낸다. 도 9b는 이식 6주 후 주사 부위로부터의 조직의 면역조직학적 이미지를 나타낸다. 이미지는 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC 및 이의 자손을 표시하는 SMA 양성 혈관 및 루시퍼라제 양성 세포를 나타낸다.
도 10은 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 야생형 붉은털원숭이 iPSC(상단 행) 및 야생형 붉은털원숭이 iPSC의 이식 후 5주 동안 감작된 동일한 수신체의 오른쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC(하단 행)의 대표적 BLI 이미지를 나타낸다.
도 11은 다른 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 야생형 붉은털원숭이 iPSC(상단 행) 및 야생형 붉은털원숭이 iPSC의 이식 후 5주 동안 감작된 동일한 수신체의 오른쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC(하단 행)의 대표적 BLI 이미지를 나타낸다.
도 12a 및 12b는 HIP 붉은털원숭이 iPSC에서 야생형 붉은털원숭이 iPSC로의 교차 연구로부터 동종이계 NHP 수신체의 대표적 BLI 이미지를 나타낸다. 상단 행은 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC 및 이의 자손의 이미지를 나타내고 하단 행은 동일한 수신체의 오른쪽 다리에 이식된 야생형 붉은털원숭이 iPSC를 나타낸다. 또한 오른쪽 하단에 초기 HIP iPSC 이식 8주 및 9주 후 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC 및 이의 자손의 이미지를 도시한다.
도 13a는 교차 주사 시 초기에 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 야생형 붉은털원숭이 iPSC 및 동일한 수신체의 오른쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC의 대표적 동종이계 NHP 수신체에 대한 시간 경과에 따른 대표적 BLI 신호를 나타낸다. 도 13b는 교차 주사 시 초기에 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC 및 동일한 수신체의 오른쪽 다리에 이식된 야생형 붉은털원숭이 iPSC의 대표적 동종이계 NHP 수신체에 대한 시간 경과에 따른 대표적 BLI 신호를 나타낸다. 도 13c는 제0일부터 제9주까지 왼쪽 다리에 1차 주사로 투여된 HIP 붉은털원숭이 iPSC의 동종이계 NHP 수신체의 대표적 BLI 이미지를 나타낸다.
도 14a-14g는 NHP 수신체로의 이종 이식 전 인간 wt 및 HIP iPSC의 특성규명을 나타낸다. 도 14a 및 14b는 wtxeno(도 14a) 및 HIPxeno(도 14b) 배양의 형태를 나타낸다. wtxeno(도 14c) 및 HIPxeno(도 14d) 상의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 및 CD47의 표면 발현을 유세포 측정에 의해 평가하고 히스토그램으로 도시한다. 도 14e는 이식 전 wtxeno 및 HIPxeno의 세포 조제물의 생활성을 나타낸다. NHP 수신체로의 생활성은 90% 초과였다(평균±s.d.). 도 14f는 wtxeno iPSC를 피하 주사한 NSG 마우스의 시간 경과에 따른 대표적 BLI 이미지 및 BLI 신호를 나타낸다. 도 14g는 HIPxeno iPSC를 피하 주사한 NSG 마우스의 시간 경과에 따른 대표적 BLI 이미지 및 BLI 신호를 나타낸다.
도 15a-15j는 NHP 수신체로의 동종이계 이식 전 붉은털원숭이 wt 및 HIP iPSC의 특성규명을 나타낸다. 도 15a-15c는 wtallo(도 15a) 및 HIPallo(도 15b 및 15c) 배양의 형태를 나타낸다. wtallo(도 15d) 및 HIPallo(도 15e 및 15f) 상의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 및 CD47의 표면 발현을 유세포 측정으로 평가하고 히스토그램으로 도시한다. 도 15g는 이식 전 wtallo 및 HIPallo의 세포 조제물의 생활성을 나타낸다. NHP 수신체로의 생활성은 90% 초과였다(평균±s.d.). 도 15h는 wtallo iPSC를 피하 주사한 NSG 마우스의 시간 경과에 따른 대표적 BLI 이미지 및 BLI 신호를 나타낸다. 도 15i 및 15j는 HIPallo iPSC를 피하 주사한 NSG 마우스의 시간 경과에 따른 대표적 BLI 이미지 및 BLI 신호를 나타낸다.
도 16은 B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실 , CD47tg iPSC에서 CD47 발현을 평가하는 대표적 그래프이다. 이들 iPSC에서 CD47 전이유전자(transgene)를 세이프 하버 부위(AAVS1, CYBL 또는 CCR5)에 삽입하고 CAG 또는 EF1α 프로모터를 CD47 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하기 위해 사용하였다. 나타낸 바와 같이, B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실 , CD47tg iPSC는 CD47을 기준선 대비 약 30-200배 발현한다.
도 17은 B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실 , CD47tg iPSC에서 CD47 발현을 평가하는 대표적 그래프이다. 이들 iPSC에서 CD47 전이유전자를 CYBL 세이프 하버 부위에 삽입하고 EF1α 프로모터를 CD47 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하기 위해 사용하였다. 나타낸 바와 같이, B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실 , CD47tg iPSC는 P23 및 P27에서 CD47을 과발현한다.
도 18은 여러 시점(P20, P21, P23, 및 P27)에서 B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, CD47tg iPSC에서 CD47 발현을 평가하는 대표적 그래프이다. 이들 iPSC에서 CD47 전이유전자를 CCR5 또는 CLYBL 세이프 하버 부위에 삽입하고 CAG 또는 EF1α 프로모터를 CD47 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하기 위해 사용하였다. 나타낸 바와 같이, B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, CD47tg iPSC는 다양한 시점에서 CD47을 과발현한다.
도 19a-19c는 선천성 면역 세포(NK 세포 및 대식세포)에 의한 B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, CD47tg iPSC의 사멸을 평가하기 위한 연구로부터의 대표적 그래프이다. B2M 삽입결실 /삽입결실 및 CIITA삽입결실/삽입결실 iPSC의 CD47tg를 세이프 하버 부위(AAVS1, CYBL 또는 CCR5)에 삽입하였다. 나타낸 바와 같이, 모든 세포 클론이 NK 및 대식세포 세포 사멸로부터 보호되었다.
기술의 다른 목적, 장점 및 구현예는 하기 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
도 2a 및 2b는 야생형(도 2a) 또는 HIP(도 2a 및 2b) 인간 iPSC를 교차 투여한 NHP의 혈청에서 공여체 특이적 IgG 항체 결합을 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 2a 및 2b는 1차 주사에서 wtxeno, 2차 주사에서 wtxeno 및 3차 주사에서 HIPxeno를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. wtxeno 및 HIPxeno에 대해 실행된 모든 검정은 도 2a에서 각각 수평선이 있는 원 및 수직선이 있는 원으로 나타낸다. 도 2b는 HIPxeno 주사를 받은 후의 IgG DSA 수준을 나타낸다.
도 3a 및 3b는 야생형(도 3a 및 3b) 또는 HIP(도 3a) 인간 iPSC를 교차 투여한 NHP의 혈청에서 공여체 특이적 IgG 항체 결합을 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 3a 및 3b는 1차 주사에서 HIPxeno, 2차 주사에서 HIPxeno 및 3차 주사에서 wtxeno를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. wtxeno 및 HIPxeno에 대해 실행된 모든 검정은 도 2a에서 각각 수평선이 있는 원 및 수직선이 있는 원으로 나타낸다. 도 3b는 wtxeno 주사를 받은 후의 IgG DSA 수준을 나타낸다.
도 4a-4c는 야생형(도 4a 및 4b) 또는 HIP(도 4a 및 4c) 인간 iPSC를 교차 투여한 NHP의 혈청에서 총 IgM 항체를 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 4a-4c는 1차 주사에서 인간 HIP iPSC(HIPxeno), 2차 주사에서 HIPxeno 및 3차 주사에서 wtxeno를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. 도 4b는 wtxeno 주사를 받은 후의 총 IgM 항체 수준을 나타내고 도 4c는 2차 주사에서 HIPxeno를 받은 후의 총 IgM 항체 수준을 나타낸다.
도 5a-5c는 야생형(도 5a 및 5b) 또는 HIP(도 5a 및 5c) 인간 iPSC를 교차 투여한 NHP의 혈청에서 총 IgM 항체를 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 5a-5c는 1차 주사에서 wtxeno, 2차 주사에서 wtxeno 및 3차 주사에서 HIPxeno를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. 도 5b는 2차 주사에서 wtxeno를 받은 후의 총 IgM 항체 수준을 나타내고 도 5c는 3차 주사에서 HIPxeno를 받은 후의 총 IgM 항체 수준을 나타낸다.
도 6a-6c는 야생형(도 6a 및 6b) 또는 HIP(도 6a 및 6c) 인간 iPSC를 교차 투여한 NHP의 혈청에서 총 IgG 항체를 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 6a-6c는 1차 주사에서 HIPxeno, 2차 주사에서 HIPxeno 및 3차 주사에서 wtxeno를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. 도 6b는 3차 주사에서 wtxeno를 받은 후의 총 IgG 항체 수준을 나타내고 도 6c는 2차 주사에서 HIPxeno를 받은 후의 총 IgG 항체 수준을 나타낸다.
도 7a-7c는 야생형(도 7a 및 7b) 또는 HIP(도 7a 및 7c) 인간 iPSC를 교차 투여한 NHP의 혈청에서 총 IgG 항체를 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 7a-7c는 1차 주사에서 HIPxeno, 2차 주사에서 wtxeno 및 3차 주사에서 HIPxeno를 받은 연구 그룹의 결과를 나타낸다. 도 7b는 2차 주사에서 wtxeno를 받은 후의 총 IgG 항체 수준을 나타내고 도 7c는 3차 주사에서 HIPxeno를 받은 후의 총 IgG 항체 수준을 나타낸다.
도 8a-8e는 야생형 NHP로의 HIP 인간 iPSC의 자연 살해(NK) 세포-매개 사멸의 부재를 나타내는 일련의 대표적 그래프이다. 도 8a-8c는 1차 주사에서 HIPxeno, 2차 주사에서 HIPxeno 및 3차 주사에서 wtxeno를 받은 연구 그룹에서의 NK 세포 매개 사멸을 나타낸다. 1차 주사 단계(도 8a) 및 2차 주사 단계(도 8b)에서 인간 HIP iPSC의 NK 세포 사멸의 부재를 실시간 세포 바이오센서 데이터 그래프에 도시한다. 도 8d 및 8e는 1차 주사에서 wtxeno, 2차 주사에서 wtxeno 및 3차 주사에서 HIPxeno를 받은 연구 그룹에서의 NK 세포 매개 사멸을 나타낸다. 3차 주사 단계에서 인간 HIP iPSC의 NK 세포 사멸의 부재(도 8d)를 실시간 세포 바이오센서 데이터 그래프에 도시한다. 표적 세포 사멸%는 왼쪽 y축(평균±sd)에 나타내고, 사멸 속도를 오른쪽 y축에 나타낸다(사멸 t1/2 -1, 평균 ±sem; 흰색 삼각형으로 나타냄). wtxeno 및 HIPxeno 주사를 받은 후 실행된 검정을 각각 수평선이 있는 원 및 수직선이 있는 원으로 나타낸다.
도 9a는 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC의 대표적 BLI 이미지를 나타낸다. 시간 경과에 따른 BLI 신호 및 제0일 또는 이식-전 수준 대비 시간 경과에 따른 BLI 신호%를 아래에서 도 9a, 10, 11, 12a-12b 및 13c의 BLI 이미지에 나타낸다. 도 9b는 이식 6주 후 주사 부위로부터의 조직의 면역조직학적 이미지를 나타낸다. 이미지는 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC 및 이의 자손을 표시하는 SMA 양성 혈관 및 루시퍼라제 양성 세포를 나타낸다.
도 10은 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 야생형 붉은털원숭이 iPSC(상단 행) 및 야생형 붉은털원숭이 iPSC의 이식 후 5주 동안 감작된 동일한 수신체의 오른쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC(하단 행)의 대표적 BLI 이미지를 나타낸다.
도 11은 다른 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 야생형 붉은털원숭이 iPSC(상단 행) 및 야생형 붉은털원숭이 iPSC의 이식 후 5주 동안 감작된 동일한 수신체의 오른쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC(하단 행)의 대표적 BLI 이미지를 나타낸다.
도 12a 및 12b는 HIP 붉은털원숭이 iPSC에서 야생형 붉은털원숭이 iPSC로의 교차 연구로부터 동종이계 NHP 수신체의 대표적 BLI 이미지를 나타낸다. 상단 행은 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC 및 이의 자손의 이미지를 나타내고 하단 행은 동일한 수신체의 오른쪽 다리에 이식된 야생형 붉은털원숭이 iPSC를 나타낸다. 또한 오른쪽 하단에 초기 HIP iPSC 이식 8주 및 9주 후 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC 및 이의 자손의 이미지를 도시한다.
도 13a는 교차 주사 시 초기에 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 야생형 붉은털원숭이 iPSC 및 동일한 수신체의 오른쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC의 대표적 동종이계 NHP 수신체에 대한 시간 경과에 따른 대표적 BLI 신호를 나타낸다. 도 13b는 교차 주사 시 초기에 동종이계 NHP 수신체의 왼쪽 다리에 이식된 HIP 붉은털원숭이 iPSC 및 동일한 수신체의 오른쪽 다리에 이식된 야생형 붉은털원숭이 iPSC의 대표적 동종이계 NHP 수신체에 대한 시간 경과에 따른 대표적 BLI 신호를 나타낸다. 도 13c는 제0일부터 제9주까지 왼쪽 다리에 1차 주사로 투여된 HIP 붉은털원숭이 iPSC의 동종이계 NHP 수신체의 대표적 BLI 이미지를 나타낸다.
도 14a-14g는 NHP 수신체로의 이종 이식 전 인간 wt 및 HIP iPSC의 특성규명을 나타낸다. 도 14a 및 14b는 wtxeno(도 14a) 및 HIPxeno(도 14b) 배양의 형태를 나타낸다. wtxeno(도 14c) 및 HIPxeno(도 14d) 상의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 및 CD47의 표면 발현을 유세포 측정에 의해 평가하고 히스토그램으로 도시한다. 도 14e는 이식 전 wtxeno 및 HIPxeno의 세포 조제물의 생활성을 나타낸다. NHP 수신체로의 생활성은 90% 초과였다(평균±s.d.). 도 14f는 wtxeno iPSC를 피하 주사한 NSG 마우스의 시간 경과에 따른 대표적 BLI 이미지 및 BLI 신호를 나타낸다. 도 14g는 HIPxeno iPSC를 피하 주사한 NSG 마우스의 시간 경과에 따른 대표적 BLI 이미지 및 BLI 신호를 나타낸다.
도 15a-15j는 NHP 수신체로의 동종이계 이식 전 붉은털원숭이 wt 및 HIP iPSC의 특성규명을 나타낸다. 도 15a-15c는 wtallo(도 15a) 및 HIPallo(도 15b 및 15c) 배양의 형태를 나타낸다. wtallo(도 15d) 및 HIPallo(도 15e 및 15f) 상의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 및 CD47의 표면 발현을 유세포 측정으로 평가하고 히스토그램으로 도시한다. 도 15g는 이식 전 wtallo 및 HIPallo의 세포 조제물의 생활성을 나타낸다. NHP 수신체로의 생활성은 90% 초과였다(평균±s.d.). 도 15h는 wtallo iPSC를 피하 주사한 NSG 마우스의 시간 경과에 따른 대표적 BLI 이미지 및 BLI 신호를 나타낸다. 도 15i 및 15j는 HIPallo iPSC를 피하 주사한 NSG 마우스의 시간 경과에 따른 대표적 BLI 이미지 및 BLI 신호를 나타낸다.
도 16은 B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실 , CD47tg iPSC에서 CD47 발현을 평가하는 대표적 그래프이다. 이들 iPSC에서 CD47 전이유전자(transgene)를 세이프 하버 부위(AAVS1, CYBL 또는 CCR5)에 삽입하고 CAG 또는 EF1α 프로모터를 CD47 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하기 위해 사용하였다. 나타낸 바와 같이, B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실 , CD47tg iPSC는 CD47을 기준선 대비 약 30-200배 발현한다.
도 17은 B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실 , CD47tg iPSC에서 CD47 발현을 평가하는 대표적 그래프이다. 이들 iPSC에서 CD47 전이유전자를 CYBL 세이프 하버 부위에 삽입하고 EF1α 프로모터를 CD47 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하기 위해 사용하였다. 나타낸 바와 같이, B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실 , CD47tg iPSC는 P23 및 P27에서 CD47을 과발현한다.
도 18은 여러 시점(P20, P21, P23, 및 P27)에서 B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, CD47tg iPSC에서 CD47 발현을 평가하는 대표적 그래프이다. 이들 iPSC에서 CD47 전이유전자를 CCR5 또는 CLYBL 세이프 하버 부위에 삽입하고 CAG 또는 EF1α 프로모터를 CD47 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하기 위해 사용하였다. 나타낸 바와 같이, B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, CD47tg iPSC는 다양한 시점에서 CD47을 과발현한다.
도 19a-19c는 선천성 면역 세포(NK 세포 및 대식세포)에 의한 B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, CD47tg iPSC의 사멸을 평가하기 위한 연구로부터의 대표적 그래프이다. B2M 삽입결실 /삽입결실 및 CIITA삽입결실/삽입결실 iPSC의 CD47tg를 세이프 하버 부위(AAVS1, CYBL 또는 CCR5)에 삽입하였다. 나타낸 바와 같이, 모든 세포 클론이 NK 및 대식세포 세포 사멸로부터 보호되었다.
기술의 다른 목적, 장점 및 구현예는 하기 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
I. 소개
본 개시는 세포 치료법에 대한 면역계 반응의 영향을 경감 및/또는 회피하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 세포-유래 및/또는 조직 이식에 대한 대상체의 면역 거부 문제를 극복하기 위해, 본 발명자들은 임의의 이식 가능한 세포 유형에 대한 생활성 공급원을 나타내는 면역-회피 세포(예를 들어, 저면역원성 세포 또는 저면역원성 만능 세포)를 개발하고 본원에 개시하였다. 유리하게는, 본원에 개시된 세포는 대상체의 유전적 구성 또는 하나 이상의 이전 동종이계 또는 자가 세포 유래 및/또는 조직 이식에 대한 대상체 내의 임의의 기존 반응과 상관없이 수신 대상체의 면역계에 의해 거부되지 않는다.
본원에 개시된 기술은 MHC I 및/또는 MHC II 발현을 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)하기 위해 유전적 변형을 이용한다. 일부 구현예에서, 희귀 절단 엔도뉴클레아제(예를 들어, CRISPR/Cas, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제 시스템)를 이용하는 게놈 편집 기술이 또한 인간 세포에서 면역 반응에 관여하는 유전자의 발현을 감소 또는 제거하기 위해(예를 들어, 유전자 발현이 영향을 받도록, 면역 반응에 관여하는 유전자의 게놈 DNA를 결실시키거나 이러한 유전자에 게놈 DNA를 삽입함으로써) 사용된다. 특정 구현예에서, 게놈 편집 기술 또는 다른 유전자 조절 기술이 인간 세포에서 관용성-유도(관용원성) 인자를 삽입하기 위해 사용되어, 이들 및 이로부터 제조된 분화된 세포가 수신 대상체에 생착 시 면역 인식을 회피할 수 있게 한다. 이와 같이, 본원에 설명된 세포는 MHC I 및/또는 MHC II 발현에 영향을 미치는 하나 이상의 유전자 및/또는 인자의 조절된 발현을 나타낸다.
본원에 설명된 게놈 편집 기술은 원하는 유전자좌 부위에서 이중 가닥 DNA 절단을 가능하게 한다. 이러한 제어된 이중 가닥 절단은 특정 유전자좌 부위에서 상동 재조합을 촉진한다. 이 공정은 서열을 인식하고 이에 결합하며 핵산 분자의 이중 가닥 절단을 유도하는 엔도뉴클레아제로 염색체와 같은 핵산 분자의 특정 서열을 표적화하는 데 중점을 둔다. 이중 가닥 절단은 오류가 발생하기 쉬운 비상동 말단 연결(NHEJ) 또는 상동 재조합(HR)에 의해 복구된다.
본원에 설명된 특정 게놈 편집 기술은 게놈 서열을 변경하기 위해 염기 편집 또는 프라임 편집이 단일 핵산 염기를 대안적 염기로 변경하는 데 사용될 수 있는 원하는 유전자좌 부위에서 단일 가닥 DNA 절단을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 염기 편집은 MHC I 및/또는 MHC II 항원, 관용원성 인자(들) 및/또는 CAR 발현을 조절하기 위해 사용된다. 염기 편집에 대한 설명은 예를 들어 문헌(Rothgangl et al., Nat Biotechnol., 2021, 39, 949-957; Porto et al., Nat Rev Drug Discov., 2020, 19, 839-859; 및 Rees and Lui, Nat Rev Genet., 2018, 19(12), 770-788)에서 찾을 수 있다. 일부 구현예에서, 프라임 편집은 MHC I 및/또는 MHC II 항원, 관용원성 인자(들), 및/또는 CAR 발현을 조절하기 위해 사용된다. 프라임 편집에 대한 설명은, 예를 들어 문헌(Anzalone et al., Nature, 2019, 576, 149-157; Kantor et al., Int J Mole Sci., 2020, 21(17), 6240; Schene et al., Nat. Commun., 2020, 11, 5232; 및 Scholefield and Harrison, Gene Therapy, 2021, doi.org/10.1038/s41434-021-00263-9)에서 찾을 수 있다.
특정 구현예의 실시는 구체적으로 반대로 표시되지 않는 한, 당분야의 기술 범위 내에 있는 화학, 생화학, 유기 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 유전학, 면역학 및 세포 생물학의 통상적인 방법을 사용할 것이며, 그 중 다수가 예시 목적으로 아래에 설명된다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌(Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; 뿐만 아니라 Advances in Immunology와 같은 정기간행물의 학술논문)을 참고한다.
II. 정의
용어 "자가면역 질환"은 대상체가 자신의 조직 및/또는 세포에 대해 파괴적인 면역 반응을 일으키는 임의의 질환 또는 장애를 지칭한다. 자가면역 장애는 신경계, 위장관계 및 내분비계뿐만 아니라 피부 및 다른 결합 조직, 눈, 혈액 및 혈관의 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 대상체(예를 들어, 인간)의 거의 모든 기관계에 영향을 미칠 수 있다. 자가면역 질환의 예는 하시모토 갑상샘염, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 그레이브스병, 피부경화증, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증 및 당뇨병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "암"은 그의 고유한 속성(예를 들어, 정상 제어의 상실)이 조절되지 않는 성장, 분화 결여, 국소 조직 침습 및 전이를 초래하는 세포의 과증식으로 정의된다. 본 발명의 방법과 관련하여, 암은 임의의 급성 림프구성 암, 급성 골수성 백혈병, 폐포 횡문근육종, 방광암, 뼈암, 뇌암, 유방암, 항문암, 항문관암 또는 항문직장암, 눈암, 간내 담관암, 관절암, 목암, 담낭암 또는 흉막암, 코암, 비강암 또는 중이암, 구강암, 외음부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수암, 결장암, 식도암, 자궁경부암, 섬유육종, 위장관 유암종/종양, 호지킨 림프종, 하인두암, 신장암, 후두암, 백혈병, 액체 종양, 간암, 폐암, 림프종, 악성 중피종, 비만세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 비호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 복막암, 대망암 및 장간막암, 인두암, 전립샘암, 직장암, 신장암, 피부암, 소장암, 연조직암, 고형 종양, 위암, 고환암, 갑상샘암, 요관암 및/또는 방광암을 포함하는 임의의 암일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "종양"은 달리 구체적으로 표시되지 않는 한 악성 유형의 세포 또는 조직의 비정상적 성장을 지칭하며, 양성 유형 조직은 포함하지 않는다.
용어 "만성 감염성 질환"은 감염이 지속되는 감염성 제제에 의해 유발된 질환을 지칭한다. 이러한 질환은 간염(A, B 또는 C), 헤르페스 바이러스(예를 들어 VZV, HSV-1, HSV-6, HSV-II, CMV 및 EBV) 및 HIV/AIDS를 포함할 수 있다. 비바이러스성 예는 아스페르길러스증, 칸디다증, 콕시디오이드진균증, 및 크립토코커스와 관련된 질환 및 히스토플라스마증과 같은 만성 진균 질환을 포함할 수 있다. 만성 세균성 감염성 제제의 비제한적 예는 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 및 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)일 수 있다. 일부 구현예에서, 장애는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염이다. 일부 구현예에서, 장애는 적응 면역결핍 증후군(AIDS)이다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 변경 또는 변형(예를 들어, 유전적 변경 또는 변형 포함)은 표적 또는 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 감소된 발현을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 변경 또는 변형은 표적 또는 선택된 폴리펩티드 서열의 감소된 발현을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 변경 또는 변형은 표적 또는 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 증가된 발현을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 변경 또는 변형은 표적 또는 선택된 폴리펩티드 서열의 증가된 발현을 초래한다. 용어 "감소하다", "감소된", 및 "감소"는 모두 일반적으로 통계적으로 유의한 양만큼의 감소를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 그러나 의심의 여지를 없애기 위해 "감소하다", "감소된", "감소"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10% 감소, 예를 들어 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 최대 100% 감소(즉, 참조 샘플과 비교하여 부재 수준), 또는 참조 수준과 비교하여 10-100% 사이의 임의의 감소를 의미한다. 일부 구현예에서, 세포는 변경되지 않거나 변형되지 않은 야생형 세포에 비해 하나 이상의 표적의 감소된 발현을 갖도록 조작된다. 세포의 맥락에서 "야생형" 또는 "wt"는 자연에서 발견되는 임의의 세포를 의미한다. 그러나, 예로서, 본원에 사용된 바와 같은 조작된 세포 또는 저면역원성 세포의 맥락에서, "야생형"은 또한 MHC I 및/또는 II 및/또는 T-세포 수용체의 감소된 발현을 초래하는 핵산 변화를 함유할 수 있는, 그러나 CD47 단백질의 과발현을 초래하는 유전자 편집 절차를 거치지 않은 조작된 세포 또는 저면역원성 세포를 의미할 수 있으며, 예를 들어, 세포는 CD47에 대해 "야생형"일 수 있지만 MHC I 및/또는 II 및/또는 T-세포 수용체에 관련하여 변경될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "야생형"은 또한 CD47 단백질의 과발현을 초래하는 핵산 변화를 함유할 수 있지만 MHC I 및/또는 II 및/또는 T-세포 수용체의 감소된 발현을 초래하는 유전자 편집 절차를 거치지 않은 조작된 세포 또는 저면역원성 세포를 의미할 수 있으며, 예를 들어, 세포는 MHC I 및/또는 II 및/또는 T-세포 수용체에 대해 "야생형"일 수 있지만 CD47과 관련하여 변경될 수 있다. PSC 또는 이의 자손의 맥락에서, "야생형"은 또한 만능성을 초래하는 핵산 변화를 함유할 수 있지만 MHC I 및/또는 II 및/또는 T-세포 수용체의 감소된 발현 및/또는 CD47 단백질의 과발현을 달성하기 위해 본 기술의 유전자 편집 절차를 거치지 않은 PSC 또는 이의 자손을 의미한다. 또한 PSC 또는 이의 자손의 맥락에서 "야생형"은 또한 CD47 단백질의 과발현을 초래하는 핵산 변화를 함유할 수 있지만 MHC I 및/또는 II 및/또는 T 세포 수용체의 감소된 발현을 초래하는 유전자 편집 절차를 거치지 않은 PSC 또는 이의 자손을 의미한다. 1차 세포 또는 이의 자손의 맥락에서, "야생형"은 또한 MHC I 및/또는 II 및/또는 T-세포 수용체의 감소된 발현을 초래하는 핵산 변화를 함유할 수 있지만 CD47 단백질의 과발현을 초래하는 유전자 편집 절차를 거치지 않은 1차 세포 또는 이의 자손을 의미한다. 또한 1차 세포 또는 이의 자손의 맥락에서 "야생형"은 또한 CD47 단백질의 과발현을 초래하는 핵산 변화를 함유할 수 있지만 MHC I 및/또는 II 및/또는 T 세포 수용체의 감소된 발현을 초래하는 유전자 편집 절차를 거치지 않은 1차 세포 또는 이의 자손을 의미한다. 일부 구현예에서, 세포는 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 하나 이상의 표적의 발현이 감소되거나 증가되도록 조작된다.
용어 "내인성"은 세포에 자연적으로 존재하는 참조 분자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 유사하게, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용될 때 이 용어는 외인성으로 도입되지 않고 세포 내에 자연적으로 함유된 암호화 핵산의 발현을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "외인성"은 참조 분자 또는 참조 폴리펩티드가 관심 세포에 도입됨을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 폴리펩티드는 염색체로의 통합에 의해 또는 플라스미드 또는 발현 벡터와 같은 비-염색체 유전 물질로서 세포의 유전 물질로 암호화 핵산을 도입함으로써 도입될 수 있다. 따라서, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용되는 이 용어는 암호화 핵산을 발현 가능한 형태로 세포에 도입하는 것을 지칭한다. "외인성" 분자는 일반적으로 세포에 존재하지 않지만 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 다른 방법에 의해 세포에 도입될 수 있는 분자, 작제물, 인자 등이다. "세포 내 정상적인 존재"는 세포의 특정 발생 단계 및 환경 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예를 들어 뉴런의 배아 발생 동안에만 존재하는 분자는 성체 뉴런 세포에 대해 외인성 분자이다. 외인성 분자는 예를 들어 오작동 내인성 분자의 작용 버전 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 오작동 버전을 포함할 수 있다.
외인성 분자 또는 인자는 무엇보다도 조합 화학 공정에 의해 생성되는 것과 같은 소분자, 또는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자의 임의의 변형된 유도체, 또는 상기 분자 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체와 같은 거대분자일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며 단일 또는 이중 가닥일 수 있고; 선형, 분기형 또는 원형일 수 있고; 임의의 길이일 수 있다. 핵산은 이중체를 형성할 수 있는 것들뿐만 아니라 삼중체 형성 핵산을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,176,996 및 5,422,251을 참고한다. 단백질은 DNA 결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화된 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 재조합효소, 리가제, 토포이소머라제, 자이라제 및/또는 헬리카제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상 "유전자"는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 영역뿐만 아니라 이러한 조절 서열이 코딩 및/또는 전사된 서열에 인접한지와 무관하게, 유전자 산물의 생성을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결인자, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위와 같은 번역 조절 서열, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기점, 매트릭스 부착 부위 및/또는 위치 제어 영역을 포함하지만 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
"유전자 발현"은 유전자에 포함된 정보의 유전자 산물로의 전환을 지칭한다. 유전자 산물은 유전자의 직접 전사 산물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 산물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 공정에 의해 변형된 RNA 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스토일화 및/또는 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "유전적 변형" 및 그 문법적 동등물은 핵산, 예를 들어 유기체의 게놈 내의 핵산의 하나 이상의 변경을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 유전적 변형은 유전자 또는 유전자의 일부 또는 다른 핵산 서열의 변경, 부가 및/또는 결실을 지칭할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 또한 유전자 또는 유전자 일부가 부가, 결실 및/또는 변경된 세포를 지칭할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 유전자 또는 유전자 일부가 아닌 핵산 서열이 부가된 세포를 지칭할 수도 있다. 유전적 변형은 예를 들어 일시적 녹인 또는 녹다운 메커니즘 그리고 표적 유전자 또는 유전자의 일부 또는 핵산 서열의 영구적 녹인, 녹다운 또는 녹아웃을 초래하는 메커니즘 모두를 포함한다. 유전적 변형은, 예를 들어 일시적 녹인 및 핵산 서열의 영구적 녹인을 초래하는 메커니즘을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "그래프팅하는", "투여하는", "도입하는", "임플란트하는" 및 "이식하는"뿐만 아니라 이의 문법적 변형은 원하는 부위에 도입된 세포의 편재 또는 적어도 부분적 편재 또는 전신 도입(예를 들어, 순환으로)을 초래하는 방법 또는 경로에 의한 대상체로의 세포(예를 들어, 본원에 설명된 세포) 배치 맥락에서 상호교환적으로 사용된다. 세포는 원하는 부위에 직접 임플란트될 수 있거나, 대안적으로 임플란트된 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부가 생활성인 대상체의 원하는 위치로의 전달을 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상체에 투여한 후 세포의 생활성 기간은 짧게는 몇 시간, 예를 들어 24시간에서 길게는 몇 년일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 또한 임플란트된 세포를 임플란트 위치에 유지하고 임플란트된 세포의 이동을 피하기 위해 캡슐로 뇌 또는 피하와 같은 원하는 부위 이외의 위치에 투여(예를 들어, 주사)될 수 있다.
"HLA" 또는 "인간 백혈구 항원" 복합체는 인간의 주조직 적합성 복합체(MHC) 단백질을 암호화하는 유전자 복합체이다. HLA 복합체를 구성하는 이러한 세포 표면 단백질은 항원에 대한 면역 반응의 조절을 담당한다. 인간에게는 클래스 I과 클래스 II, "HLA-I"와 "HLA-II"의 두 가지 MHC가 있다. HLA-I은 HLA-A, HLA-B, HLA-C의 3가지 단백질을 포함하며, 이들은 세포 내부로부터 펩티드를 제시하고 HLA-I 복합체에 의해 제시된 항원은 킬러 T 세포(CD8+ T-세포 또는 세포독성 T 세포로도 알려짐)를 유인한다. HLA-I 단백질은 β-2 마이크로글로불린(B2M)과 관련된다. HLA-II는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOB, HLA-DQ 및 HLA-DR의 5가지 단백질을 포함하며, 이들은 세포 외부로부터 T 림프구로 항원을 제시한다. 이는 CD4+ 세포(T 헬퍼 세포로도 알려짐)를 자극한다. "MHC" 또는 "HLA"의 사용은 유전자가 인간(HLA) 또는 쥣과(MHC)로부터 유래되었는지 여부에 따라 달라지기 때문에 제한을 의미하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 따라서, 포유동물 세포와 관련하여 이들 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
세포를 특성규명하기 위해 본원에 사용된 용어 "저면역원성"은 일반적으로 이러한 세포가 면역 거부, 예를 들어 이러한 세포가 이식된 대상체에 의한 선천성 또는 적응 면역 거부에 덜 취약하다는 것을 의미하며, 예를 들어 세포는 이러한 세포가 이식된 대상체에 의한 동종거부에 덜 취약하다. 예를 들어, 변경되지 않거나 변형되지 않은 야생형 또는 비-저면역원성 세포에 비해, 이러한 저면역원성 세포는 약 2.5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상 이러한 세포가 이식된 대상체에 의한 면역 거부에 덜 취약하다. 일부 구현예에서, 게놈 편집 기술이 MHC I 및 MHC II 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용되며, 따라서 저면역원성 세포의 생성에 기여한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 MHC-미스매치 동종이계 수신체에서 면역 거부를 회피한다. 일부 경우에, 본원에 개략된 저면역원성 줄기 세포로부터 생성된 분화 세포는 MHC-미스매치 동종이계 수신체에 투여(예를 들어, 이식 또는 그래프트)될 때 면역 거부를 회피한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 T 세포-매개 적응 면역 거부 및/또는 선천성 면역 세포 거부로부터 보호된다. 저면역원성 세포, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법에 대한 상세한 설명은 실시예, 서열 목록 및 도면을 포함하는 개시 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌(2015년 5월 9일에 출원된 WO2016183041; 2018년 1월 14일에 출원된 WO2018132783; 2018년 3월 20일에 출원된 WO2018176390; 2019년 7월 17일에 출원된 WO2020018615; 2019년 7월 17일에 출원된 WO2020018620; 2020년 7월 31일에 출원된 PCT/US2020/44635; 2019년 8월 1일에 출원된 US62/881,840; 2019년 8월 23일에 출원된 US62/891,180; 2020년 4월 27일에 출원된 US63/016,190; 및 2020년 7월 15일에 출원된 US63/052,360)에서 확인된다.
세포의 저면역원성은 적응 및 선천성 면역 반응을 유도하거나 이러한 적응 및 선천성 면역 반응의 유도를 피하는 세포의 능력과 같은 세포의 면역원성을 평가함으로써 결정될 수 있다. 이러한 면역 반응은 당업자에 의해 인식되는 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응 검정은 T 세포 증식, T 세포 활성화, T 세포 사멸, 공여체 특이적 항체 생성, NK 세포 증식, NK 세포 활성화 및 대식세포 활성에 대한 저면역원성 세포의 효과를 측정한다. 일부 경우에, 저면역원성 세포 및 이의 유도체는 대상체에 투여 시 T 세포 및/또는 NK 세포에 의한 감소된 사멸을 겪는다. 일부 경우에, 세포 및 이의 유도체는 변형되지 않은 세포 또는 야생형 세포와 비교하여 감소된 대식세포 삼킴을 나타낸다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 상응하는 변형되지 않은 야생형 세포와 비교하여 수신 대상체에서 감소되거나 줄어든 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 비면역원성이거나 수신 대상체에서 면역 반응을 유도하지 못한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일성"%는 최대 대응을 위해 비교 및 정렬될 때 아래에 설명된 서열 비교 알고리즘(예를 들어, BLASTP 및 BLASTN 또는 당업자에게 이용 가능한 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하거나 육안 검사에 의해 측정된 특정 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 적용에 따라, "동일성"%는 비교되는 서열의 영역에 걸쳐, 예를 들어 기능적 도메인에 걸쳐 존재할 수 있거나, 대안적으로 비교될 2개 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다. 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열이 비교되는 참조 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때 컴퓨터에 시험 및 참조 서열이 입력되고 필요에 따라 하위서열 좌표가 지정되고 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수에 기반하여 참조 서열 대비 시험 서열(들)에 대한 서열 동일성%를 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌(Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981))의 국소 상동성 알고리즘, 문헌(Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970))의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌(Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988))의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 전산화된 구현(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Wisconsin Genetics 소프트웨어 패키지, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) 또는 육안 검사(일반적으로 Ausubel et al., 하기 참고)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성% 및 서열 유사성%를 결정하기 적합한 알고리즘의 한 예는 문헌(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))에 설명되어 있는 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)을 통해 공개적으로 이용 가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역 신호전달 인자"는 일부 경우에 면역 신호전달 경로를 활성화하는 분자, 단백질, 펩티드 등을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역억제 인자" 또는 "면역 조절 인자" 또는 "관용원성 인자"는 저면역 인자, 보체 억제제, 및 투여, 이식 또는 생착 시 숙주 또는 수신 대상체의 면역계에 의해 인식되는 세포의 능력을 조절하거나 이에 영향을 미치는 다른 인자를 포함한다. 이들은 추가적인 유전적 변형과 조합될 수 있다.
용어 "증가된", "증가하다" 또는 "향상시키다" 또는 "활성화하다"는 모두 일반적으로 정적으로 유의한 양의 증가를 의미하는 것으로 본원에서 사용되며; 의심의 여지를 없애기 위해 용어 "증가되다", "증가하다" 또는 "향상시키다" 또는 "활성화하다"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10% 증가, 예를 들어 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 최대 100% 증가 또는 10-100% 사이의 임의의 증가, 또는 참조 수준과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 2배 내지 10배 이상 사이의 임의의 증가를 의미한다.
일부 구현예에서, 변경은 삽입결실(indel)이다. 본원에 사용된 바와 같이 "삽입결실"은 삽입, 결실 또는 이의 조합으로 인한 돌연변이를 지칭한다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 게놈 서열의 코딩 영역에서의 삽입결실은 삽입결실의 길이가 3의 배수가 아닌 한 프레임이동 돌연변이를 초래할 것이다. 일부 구현예에서, 변경은 점 돌연변이이다. 본원에 사용된 바와 같이, "점 돌연변이"는 뉴클레오티드 중 하나를 대체하는 치환을 지칭한다. 본 개시의 CRISPR/Cas 시스템은 예를 들어 유전자 편집, 염기 편집 또는 프라임 편집을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 임의의 길이의 삽입결실 또는 점 돌연변이를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "염기 편집"은 표적화된 유전자 유전자좌에서, 일부 경우에는 이중 가닥 DNA 절단 없이, 다른 경우에는 단일 가닥 DNA 절단 없이, 프로그래밍 가능한 하나의 염기쌍을 또 다른 염기쌍으로 전환하는 방법을 지칭한다. 일부 구현예에서, 염기 편집은 표적 DNA 부위를 인식하기 위해 촉매적으로 손상된 Cas9를 이용하고, 프로토스페이서 서열 내부 및/또는 외부의 염기 편집 창인 PAM 서열 인식 범위를 이용한다. 용어 "프라임 편집"은 프로그래밍 가능한 폴리머라제(예컨대 WO2020191242에 설명된 바와 같은 napDNAbp와 같은, 그러나 이에 제한되지 않음) 및 특정 가이드 RNA를 이용하는 유전자 편집 방법을 지칭한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 표적 DNA 서열에 통합되는 유전 정보를 암호화(또는 유전 정보를 결실)하기 위한 DNA 합성 주형을 포함한다. 당업자에게 인식되는 바와 같이, 염기 편집 및 프라임 편집은 설명된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현을 조절(예를 들어, 감소, 제거, 증가 및 향상)하는 데 유용한다.
본원에 사용된 바와 같이, "녹아웃" 및 "녹다운"은 각각 편집된 유전자의 발현을 일으키지 않는 및 발현을 감소시키는 유전적 변형을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "녹다운"은 표적 mRNA 또는 상응하는 표적 단백질의 발현 감소를 지칭한다. 녹다운은 일반적으로 RNA(예를 들어, 비-표적화 제어 shRNA, siRNA, 가이드 RNA 또는 miRNA)의 발현 수준의 감소를 매개하지 않는 제어 분자의 투여 또는 발현 후에 존재하는 수준 대비 보고된다. 일부 구현예에서, 표적 유전자의 녹다운은 shRNA, siRNA, miRNA 또는 CRISPR 간섭(CRISPRi)을 통해 달성된다. 일부 구현예에서, 표적 유전자의 녹다운은 데그론 방법과 같은 단백질 기반 방법에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 표적 유전자의 녹다운은 shRNA, siRNA, miRNA를 포함하는 유전적 변형 또는 유전자 편집 시스템(예를 들어 CRISPR/Cas)의 사용에 의해 달성된다.
녹다운은 일반적으로 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR) 증폭을 사용하여 mRNA 수준을 측정하거나 웨스턴 블롯 또는 효소 연관 면역흡착 검정(ELISA)으로 단백질 수준을 측정하여 평가된다. 단백질 수준을 분석하면 mRNA 절단뿐만 아니라 번역 억제를 모두 평가할 수 있다. 녹다운을 측정하기 위한 추가 기술은 RNA 용액 혼성화, 뉴클레아제 보호, 노던 혼성화, 마이크로어레이를 사용한 유전자 발현 모니터링, 항체 결합, 방사면역검정 및 형광 활성화 세포 분석을 포함한다. 당업자는 본원에 설명된 상세사항에 기반하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부를 녹아웃하기 위해 본 개시의 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas)을 사용하는 방법을 쉽게 이해할 것이다.
본원에서 "녹인"은 숙주 세포의 염색체 유전자좌에 DNA 서열을 삽입함으로써 발생하는 유전적 변형을 의미한다. 이것은 녹인된 유전자, 유전자의 일부 또는 핵산 서열 삽입 산물의 발현 수준을 증가시키며, 예를 들어 RNA 전사 수준 및/또는 암호화된 단백질 수준을 증가시킨다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 이것은 유전자 또는 이의 일부의 하나 이상의 추가 카피를 숙주 세포에 삽입 또는 부가하거나 제조되는 단백질의 발현을 증가시키는 내인성 유전자의 조절 성분을 변경하거나 발현이 원하는 특정 핵산 서열을 삽입하는 것을 포함하는 여러 방식으로 달성될 수 있다. 이는 프로모터를 변형하거나, 상이한 프로모터를 부가하거나, 인핸서를 부가하거나, 다른 조절 요소를 부가하거나, 다른 유전자 발현 서열을 변형함으로써 달성될 수 있다. 본 개시의 CRISPR/Cas 시스템은 상동성 암이 있는 주형을 사용하는 상동성 DNA 복구에 의하건 특정 서열이 편집되는 프라임 편집 또는 유전자 쓰기에 의해 서열을 녹인하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 용어 "녹인"은 숙주 세포에 유전적 기능을 부가하는 공정을 의미한다. 이것은 녹인된 유전자 산물, 예를 들어 RNA 또는 암호화된 단백질의 수준을 증가시킨다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 이것은 숙주 세포에 유전자의 하나 이상의 추가 카피를 부가하거나 제조되는 단백질의 발현을 증가시키는 내인성 유전자의 조절 성분을 변경하는 것을 포함하는 여러 방식으로 달성될 수 있다. 이것은 프로모터를 변형하거나, 상이한 프로모터를 부가하거나, 인핸서를 부가하거나, 다른 유전자 발현 서열을 변형하여 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "녹아웃"은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 번역 또는 기능을 방해하는 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 결실시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 녹아웃은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능적 도메인(예를 들어, DNA 결합 도메인)을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 삽입 또는 결실("삽입결실")을 유도함으로써 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하여 달성될 수 있다. 당업자는 본원에 설명된 상세사항에 기반하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부를 녹아웃하기 위해 본 개시의 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas)을 사용하는 방법을 쉽게 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 유전적 변형 또는 변경은 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부의 녹아웃 또는 녹다운을 초래한다. 본 기술의 유전자 편집 시스템(예를 들어 CRISPR/Cas)을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부를 녹아웃하는 것은 다양한 적용에 유용할 수 있다. 예를 들어, 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 녹아웃하는 것은 연구 목적을 위해 시험관내 수행될 수 있다. 생체외 목적을 위해, 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 녹아웃하는 것은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 발현과 관련된 장애를 치료하거나 방지하는 데(예를 들어, 생체외 세포에서 돌연변이 대립유전자를 녹아웃하고 녹아웃된 돌연변이 대립유전자를 포함하는 세포를 대상체에 도입함으로써) 또는 세포의 유전형 또는 표현형을 변화시키는 데 유용할 수 있다. 일부 경우에 그리고 본원에 사용된 바와 같이, "녹아웃"은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 방해하는 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 결실시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 녹아웃은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능적 도메인(예를 들어, DNA 결합 도메인)에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입결실을 유도함으로써 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하여 달성될 수 있다. 당업자는 본원에 설명된 상세사항에 기반하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부를 녹아웃하기 위해 본 개시의 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)을 사용하는 방법을 쉽게 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 변경은 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부의 녹아웃을 초래한다. 본 개시의 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부를 녹아웃하는 것은 다양한 적용에 유용할 수 있다. 예를 들어, 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 녹아웃하는 것은 연구 목적을 위해 시험관내 수행될 수 있다. 생체외 목적을 위해, 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 녹아웃하는 것은(예를 들어, 생체외 세포에서 돌연변이 대립유전자를 녹아웃하고 녹아웃된 돌연변이 대립유전자를 포함하는 세포를 대상체에 도입함으로써) 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 발현과 관련된 장애를 치료하거나 방지하는 데 유용할 수 있다.
유전자 발현의 "조절"은 유전자 발현 수준의 변화를 지칭한다. 발현의 조절은 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 조절은 또한 전체적일 수 있으며, 즉 유전자 발현이 완전히 불활성화되거나 야생형 수준 이상으로 활성화되거나; 조절은 부분적일 수 있으며, 유전자 발현은 부분적으로 감소되거나 야생형 수준의 일부 분율로 부분적으로 활성화된다.
추가적인 또는 대안적인 측면에서, 본 기술은 예를 들어 TAL 효과기 뉴클레아제(TALEN) 또는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템과 같은 뉴클레아제 시스템을 이용하여 당업자에게 이용 가능한 임의의 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는 것을 고려한다. CRISPR/Cas(예를 들어, Cas9 및 Cpf1) 및 TALEN을 이용하는 방법의 예가 본원에 상세히 설명되지만, 본 기술은 이러한 방법/시스템의 사용으로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 당업자에게 알려진 표적 세포에서의 발현을 감소시키거나 제거하기 위한 다른 표적화 방법이 본원에서 이용될 수 있다. 본원에 제공된 방법은 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하기 위해 사용될 수 있다. 본 기술은 임의의 목적을 위해 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는 것을 고려한다. 일부 구현예에서, 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 돌연변이체 세포를 생성하도록 변경된다. 본원에 사용된 바와 같이, "돌연변이체 세포"는 원래의 유전형과 상이한 생성 유전형을 갖는 세포를 지칭한다. 일부 경우에, "돌연변이체 세포"는 예를 들어 정상적으로 기능하는 유전자가 본 개시의 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas)을 사용하여 변경될 때, 돌연변이체 표현형을 나타낸다. 다른 경우에, "돌연변이체 세포"는 예를 들어 본 개시의 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas)이 돌연변이체 유전형을 수정하기 위해 사용될 때, 야생형 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 유전적 돌연변이를 수정하거나 복구하기 위해(예를 들어, 세포에 정상 표현형을 복원하기 위해) 변경된다. 일부 구현예에서, 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 유전적 돌연변이를 유도하기 위해(예를 들어, 유전자 또는 게놈 요소의 기능을 파괴하기 위해) 변경된다.
용어 "작동적으로 연결된" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 2개의 성분이 정상적으로 기능하고 적어도 하나의 성분은 적어도 하나의 다른 성분에 작용하는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 성분이 배열되는 2개 이상의 성분(예를 들어 서열 요소)의 병치와 관련하여 상호 교환적으로 사용된다. 예시로서, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 코딩 서열의 전사 수준을 제어하는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결된 것이다. 전사 조절 서열은 일반적으로 코딩 서열과 시스로 작동적으로 연결되지만 이에 직접 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 이들이 인접하지 않더라도 코딩 서열에 작동적으로 연결된 전사 조절 서열이다.
본원에 사용된 바와 같이, "만능 줄기 세포"는 3개의 배엽: 내배엽(예를 들어 위 연결, 위장관, 폐 등), 중배엽(예를 들어 근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기 조직 등) 또는 외배엽(예를 들어 표피 조직 및 신경계 조직) 중 임의의 것으로 분화할 수 있는 잠재력을 갖는다. 본원에 사용된 용어 "만능 줄기 세포"는 "유도된 만능 줄기 세포" 또는 "iPSC", 또는 비-만능 세포로부터 유래된 만능 줄기 세포의 유형을 또한 포괄한다. 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포는 만능 세포가 아닌 세포로부터 생산되거나 생성된다. 즉, 만능 줄기 세포는 비-만능 세포의 직접적 또는 간접적 자손일 수 있다. 모 세포의 예는 다양한 수단에 의해 만능 미분화 표현형을 유도하도록 재프로그래밍된 체세포를 포함한다. 이러한 iPS" 또는 "iPSC" 세포는 특정 조절 유전자의 발현을 유도하거나 특정 단백질의 외인성 적용에 의해 생성될 수 있다. iPS 세포의 유도 방법은 당분야에 알려져 있으며 아래에 추가로 설명되어 있다(예를 들어, 각각 이의 전체가 본원에 참조로 포함된 Zhou et al., Stem Cells 27 (11): 2667-74 (2009); Huangfu et al., Nature Biotechnol. 26 (7): 795 (2008); Woltjen et al., Nature 458 (7239): 766-770 (2009); 및 Zhou et al., Cell Stem Cell 8:381-384 (2009) 참고). 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)의 생성은 아래에 개략된다. 본원에 사용된 바와 같이, "hiPSC"는 인간 유도된 만능 줄기 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, "세이프 하버 유전자좌"는 새로 삽입된 유전적 요소가 예측 가능하게 기능할 수 있도록 는 방식으로 전이유전자 또는 외인성 유전자의 발현을 허용하고 또한 숙주 세포에 위험을 부여하는 방식으로 숙주 게놈의 변경을 유발하지 않을 수 있는 유전자 유전자좌를 지칭한다. 예시적인 "세이프 하버" 유전자좌는 CCR5 유전자, PPP1R12C(또한 AAVS1로도 알려짐) 유전자, CLYBL 유전자 및/또는 Rosa 유전자(예를 들어, ROSA26)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 "표적 유전자좌"는 전이유전자 또는 외인성 유전자의 발현을 허용하는 유전자 유전자좌를 지칭한다. 예시적인 "표적 유전자좌"는 CXCR4 유전자, 알부민 유전자, SHS231 유전자좌, F3 유전자(CD142로도 알려짐), MICA 유전자, MICB 유전자, LRP1 유전자(CD91로도 알려짐), HMGB1 유전자, ABO 유전자, RHD 유전자, FUT1 유전자 및/또는 KDM5D 유전자(HY로도 알려짐)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 외인성 유전자는 B2M, CIITA, TRAC, TRBC, CCR5, F3(즉, CD142), MICA, MICB, LRP1, HMGB1, ABO, RHD, FUT1, KDM5D(즉, HY), PDGFRa, OLIG2 및/또는 GFAP에 대한 CDS 영역에 삽입될 수 있다. 외인성 유전자는 PPP1R12C(즉, AAVS1) 또는 CCR5에 대해 인트론 1 또는 2에 삽입될 수 있다. 외인성 유전자는 CCR5에 대해 엑손 1 또는 2 또는 3에 삽입될 수 있다. 외인성 유전자는 CLYBL에 대해 인트론 2에 삽입될 수 있다. 외인성 유전자는 Ch-4:58,976,613(즉, SHS231)에서 500 bp 창에 삽입될 수 있다. 외인성 유전자는 예를 들어 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 내의 인트론, 엑손 또는 코딩 서열 영역을 포함하는 외인성 발현을 허용하는 전술한 세이프 하버 또는 표적 유전자좌의 임의의 적합한 영역에 삽입될 수 있다.
용어 "대상체" 및 "개체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 동물, 예를 들어 세포를 얻을 수 있고/있거나 본원에 설명된 바와 같이 세포로 예방적 치료를 포함하는 치료가 제공되는 인간을 지칭한다. 인간 대상체와 같은 특정 동물에 특이적인 감염, 병태 또는 질환 상태의 치료를 위해, 용어 대상체는 특정 동물을 지칭한다. 본원에 상호 교환적으로 사용된 바와 같은 "비인간 동물" 및 "비인간 포유동물"은 래트, 마우스, 토끼, 양, 고양이, 개, 소, 돼지 및/또는 비인간 영장류와 같은 포유동물을 포함한다. 용어 "대상체"는 또한 포유동물, 파충류, 양서류 및/또는 어류를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 척추동물을 포괄한다. 그러나, 유리하게는, 대상체는 인간과 같은 포유동물, 또는 길들여진 포유동물, 예를 들어 개, 고양이, 말 등, 또는 생산 포유동물, 예를 들어 소, 양, 돼지 등과 같은 다른 포유동물이다.
본원에 사용된 용어 "치료하는" 및 "치료"는 대상체가 질환의 적어도 하나의 증상의 감소 또는 질환의 개선, 예를 들어, 유익하거나 원하는 임상 결과를 갖도록 본원에 기재된 유효량의 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 이 기술의 목적을 위해 유익하거나 원하는 임상 결과는 검출 가능하거나 검출 불가능한 하나 이상의 증상의 경감, 질환 범위의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 완화 또는 억제, 그리고 검출 가능하거나 검출 불가능한 진정(부분적 또는 전체적)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 치료는 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존 기간과 비교하여 생존 기간을 연장하는 것을 지칭할 수 있다. 따라서, 당업자는 치료가 질환 병태를 개선할 수 있지만 질환에 대한 완전한 근치가 아닐 수 있음을 인식한다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상은 질환의 치료 시 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 경감된다.
본 기술의 목적을 위해, 질환 치료의 유익하거나 원하는 임상 결과는 검출 가능하거나 검출 불가능한 하나 이상의 증상의 경감, 질환 범위의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 완화 또는 억제, 및 진정(부분적이건 전체적이건)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"벡터" 또는 "작제물"은 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 작제물", "발현 벡터" 및 "유전자 전달 벡터"는 관심 유전자의 발현을 지시할 수 있고 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 의미한다. 따라서, 이 용어는 클로닝 및 발현 비히클뿐만 아니라 통합 벡터를 포함한다. 벡터 또는 작제물을 세포에 도입하는 방법은 당업자에게 알려져 있고 지질-매개 전달(즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공, 직접 주입, 세포 융합, 입자 충격, 인산칼슘 공침전, DEAE-덱스트란-매개 전달 및/또는 바이러스 벡터-매개 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
임의의 선택적 요소를 배제하도록 청구범위가 작성될 수 있음이 주지된다. 이와 같이, 본 진술은 청구범위 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "오직", "만" 등과 같은 이러한 배타적 용어 사용에 대한 선행 근거 역할을 하기 위한 것이다. 본 개시를 읽을 때 당업자에게 명백할 바와 같이, 본원에 설명되고 예시된 각각의 개별 구현예는 본 기술의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고 임의의 다른 여러 구현예의 특징과 쉽게 분리되거나 조합되는 별개의 성분 및 특징을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사건의 순서 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다. 본원에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 기술의 실시 또는 시험에서 또한 사용될 수 있지만, 이제 대표적인 예시적 방법 및 물질이 설명된다.
본 기술이 추가로 설명되기 전에, 이 기술이 설명된 특정 구현예에 제한되지 않으며, 물론 그 자체가 변할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본 기술의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 기술이 속하는 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 값의 범위가 제공되는 경우, 맥락상 명확히 달리 명시하지 않는 한, 하한 단위의 10분의 1까지, 해당 범위의 상한 및 하한 사이의 각각의 중간 값 및 임의의 다른 언급된 또는 그 언급된 범위에서의 중간 값이 본 기술 내에 포괄됨이 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며 또한 본 기술 내에 포괄되며 언급된 범위에서 임의의 특별히 배제된 제한이 적용된다. 언급된 범위가 하나의 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 포함된 하나의 또는 둘 모두의 한계를 제외한 범위도 본 기술에 포함된다. 특정 범위는 용어 "약"이 선행하는 수치 값과 함께 본원에 제시된다. 용어 "약"은 용어가 선행하는 정확한 수치뿐만 아니라 용어가 선행하는 수치에 가깝거나 근사 수치에 대한 문언적 지지를 제공하기 위해 본원에서 사용된다. 수치가 구체적으로 인용된 수치에 가깝거나 근사치인지 여부를 결정할 때, 인용되지 않은 수치에 가깝거나 근사치는 제시된 맥락에서 구체적으로 인용된 수치와 실질적으로 균등부를 제공하는 수치일 수 있다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 또한, 각각의 인용된 간행물, 특허 또는 특허 출원은 간행물이 인용된 주제를 개시하고 설명하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전의 그 개시에 대한 것이며 본원에 설명된 기술이 선행 기술로 인해 이러한 간행물보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 또한 제공되는 공개일은 실제 공개일과 상이할 수 있으며, 독립적으로 확인해야 할 수 있다.
본 기술이 추가로 설명되기 전에, 이 기술이 설명된 특정 구현예에 제한되지 않으며, 물론 그 자체가 변할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본 기술의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 제목은 제한하는 것이 아니라 단지 독자를 지향하기 위한 것이지만 주제는 일반적으로 본원에서 개시된 기술에 적용됨이 이해되어야 한다.
III. 구현예의 상세한 설명
A. 환자에 대한 저면역원성 세포의 투여
본원에 제공된 한 측면에서 본원에 설명된 저면역원성 세포 집단을 투여함으로써 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 주제 저면역원성 세포(예를 들어, 본원에 설명된 바와 같은 저면역원성 줄기 세포로부터 분화된 세포)는 예를 들어 질환 또는 장애의 치료를 위한 세포 치료법의 후보를 포함하는 임의의 적합한 환자에 투여될 수 있다. 세포 치료법의 후보는 본원에 제공된 주제 저면역원성 세포의 치료 효과로부터 잠재적으로 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 병태를 갖는 임의의 환자를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 세포 결핍을 갖는다. 본원에 제공된 주제 저면역원성 세포의 치료 효과로부터 이익을 얻는 후보는 질환 또는 병태의 제거, 감소 또는 완화를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, "세포 결핍"은 환자에서 세포 집단의 기능 장애 또는 손실을 유발하는 임의의 질환 또는 병태를 지칭하며, 환자는 세포 집단을 자연적으로 대체하거나 재생시킬 수 없다. 예시적인 세포 결핍은 자가면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 당뇨병, 전신성 루푸스 및 홍반), 신경퇴행성 질환(예를 들어, 헌팅턴병 및 파킨슨병), 심혈관 병태 및 질환, 혈관 병태 및 질환, 각막 병태 및 질환, 간 병태 및 질환, 갑상샘 병태 및 질환, 및/또는 신장 병태 및 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포가 투여된 환자는 암을 갖는다. 본원에 제공된 저면역원성 세포에 의해 치료될 수 있는 예시적인 암은 B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 샘암종, 췌장 샘암종, 교모세포종, 신경모세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및/또는 방광암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 암 환자는 본원에 제공된 저면역원성 CAR-T 세포의 투여에 의해 치료된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 저면역원성 세포는 예를 들어 세포 이식, 수혈, 조직 이식 및/또는 장기 이식과 같은 이전 이식에 존재하는 하나 이상의 항원으로 인해 감작된 환자의 치료에 유용한다. 특정 구현예에서, 이전 이식은 동종이계 이식이고 환자는 동종이계 이식으로부터의 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된다. 동종이계 이식은 동종이계 세포 이식, 동종이계 수혈, 동종이계 조직 이식 및/또는 동종이계 장기 이식을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 환자는 임신 중이거나 임신한 감작된 환자이다(예를 들어, 임신 중 동종면역화를 갖거나 가졌음). 특정 구현예에서, 환자는 이전 이식에 포함된 하나 이상의 항원으로 인해 감작되며, 이전 이식은 변형된 인간 세포, 조직 및/또는 장기이다. 일부 구현예에서, 변형된 인간 세포, 조직 및/또는 장기는 변형된 자가 인간 세포, 조직 및/또는 장기이다. 일부 구현예에서, 이전 이식은 비인간 세포, 조직 및/또는 장기이다. 예시적인 구현예에서, 이전 이식은 변형된 비인간 세포, 조직 및/또는 장기이다. 특정 구현예에서, 이전 이식은 인간 성분을 포함하는 키메라이다. 특정 구현예에서, 이전 이식은 CAR-T 세포이고/이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 이전 이식은 자가 이식이고 환자는 자가 이식으로부터의 하나 이상의 자가 항원에 대해 감작된다. 특정 구현예에서, 이전 이식은 자가 세포, 조직 및/또는 장기이다. 일부 구현예에서, 감작된 환자는 이전에 동종이계 CAR-T 세포 기반 치료법 또는 자가 CAR-T 세포 기반 치료법을 받았다. 자가 CAR-T 세포 기반 치료법의 비제한적 예는 브렉수카브타진 오토루셀(TECARTUS®), 악시카브타진 실로루셀(YESCARTA®), 이데카브타진 비클루셀(ABECMA®), 리소카브타진 마라루셀(BREYANZI®), 티사겐렉루셀(KYMRIAH®), Cartesian Therapeutics의 Descartes-08 및 Descartes-11, Novartis의 CTL110, Poseida Therapeutics의 P-BMCA-101 및 Autolus Limited의 AUTO4를 포함한다. 동종이계 CAR-T 세포 기반 치료법의 비제한적 예는 Cellectis의 UCARTCS, Precision Biosciences의 PBCAR19B 및 PBCAR269A, Fate Therapeutics의 FT819, 및 Clyad Oncology의 CYAD-211을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자가 이전에 본 기술의 세포를 포함하지 않는 동종이계 CAR-T 세포 기반 치료법 또는 자가 CAR-T 세포 기반 치료법을 포함하는 1차 치료법을 받은 후, 감작된 환자에 본 기술의 세포를 포함하는 2차 치료법이 투여된다. 일부 구현예에서, 환자가 이전에 본 기술의 세포를 포함하지 않는 동종이계 CAR-T 세포 기반 치료법 또는 자가 CAR-T 세포 기반 치료법을 포함하는 1차 및/또는 2차 치료법을 받은 후, 감작된 환자에 본 기술의 세포를 포함하는 3차 치료법이 투여된다. 일부 구현예에서, 환자가 이전에 본 기술의 세포를 포함하지 않는 동종이계 CAR-T 세포 기반 치료법 또는 자가 CAR-T 세포 기반 치료법을 포함하는 일련의 치료법을 받은 후, 감작 환자에 본 기술의 세포를 포함하는 후속 치료법이 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 일부 구현예에서 각 경우에 1선, 2선, 3선 및 추가 선의 치료 후를 포함하는 (i) 본원에 제공된 세포를 포함하지 않는 동종이계 또는 자가 CAR-T 세포 기반 치료법과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 실패한 치료 후, (ii) 본원에 제공된 세포를 포함하지 않는 동종이계 또는 자가 CAR-T 세포 기반 치료법과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 치료적으로 비효과적인 치료 후, 또는 (iii) 본원에 제공된 세포를 포함하지 않는 동종이계 또는 자가 CAR-T 세포 기반 치료법과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 효과적인 치료 후, 특정 병태 또는 질환에 대한 다음 인라인 치료로서 사용된다.
특정 구현예에서, 감작된 환자는 알레르기를 갖고 하나 이상의 알레르겐에 대해 감작된다. 예시적인 구현예에서, 환자는 건초열, 식품 알레르기, 곤충 알레르기, 약물 알레르기 및/또는 아토피성 피부염을 갖는다.
본 개시의 관점에서 당분야에 알려진 임의의 적합한 방법이 환자가 감작된 환자인지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 환자가 감작된 환자인지 여부를 결정하는 방법의 예는 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 유세포측정 검정을 포함하는 세포 기반 검정, 및 ELISA 및 폴리스티렌 비드 기반 어레이를 포함하는 고상 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 환자가 감작된 환자인지 여부를 결정하는 방법의 다른 예는 항체 스크리닝 방법, 패널 반응성 항체%(PRA) 시험, 예를 들어 단일 항원 비드(SAB)를 사용하는 Luminex 기반 검정 및 Luminex IgG 검정, HLA 항체의 평균 형광 강도(MFI) 값 평가, 계산된 패널 반응성 항체(cPRA) 검정, IgG 역가 시험, 보체 결합 검정, IgG 하위유형 검정, 및/또는 문헌(Colvin et al., Circulation. 2019 Mar 19;139(12):e553-e578)에 설명된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 주제 저면역원성 세포를 사용하는 치료를 받고 있는 환자는 이전 치료를 받았다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 이전 치료와 동일한 병태를 치료하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 이전 치료와 상이한 병태를 치료하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 환자에 투여된 저면역원성 세포는 이전 치료에 의해 치료된 동일한 병태 또는 질환의 치료에 대해 향상된 치료 효과를 나타낸다. 일부 구현예에서, 투여된 저면역원성 세포는 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 더 긴 치료 효과를 나타낸다. 예시적인 구현예에서, 투여된 세포는 이전 치료와 비교하여 암 세포에 대해 향상된 효능, 유효성 및/또는 특이성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 저면역원성 세포는 암 치료를 위한 CAR-T-세포이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 각각의 경우 1선, 2선, 3선 및 추가 선의 치료 후를 포함하는, 실패한 치료 후, 치료적으로 비효과적인 치료 후, 또는 효과적인 치료 후, 특정 병태 또는 질환에 대한 다음 인라인 치료로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이전 치료(예를 들어, 1선 치료)는 치료적으로 비효과적인 치료이다. 본원에 사용된 바와 같이, "치료적으로 비효과적인" 치료는 환자에서 원하는 것보다 적은 임상 결과를 생성하는 치료를 지칭한다. 예를 들어, 세포 결핍에 대한 치료와 관련하여, 치료적으로 비효과적인 치료는 환자에서 결핍 세포를 대체하기 위한 원하는 수준의 기능성 세포 및/또는 세포 활성을 달성하지 못하고/못하거나 치료 내구성이 부족한 치료를 지칭할 수 있다. 암 치료와 관련하여, 치료적으로 비효과적인 치료는 원하는 수준의 효능, 유효성 및/또는 특이성을 달성하지 못하는 치료를 지칭한다. 치료 효과는 당분야에 알려진 임의의 적합한 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 이전 치료에 대한 면역 반응을 일으킨다. 일부 구현예에서, 이전 치료는 환자에 의해 거부되는 세포, 조직 및/또는 장기 이식편이다. 일부 구현예에서, 이전 치료는 기계 보조 치료를 포함하였다. 일부 구현예에서, 기계 보조 치료는 혈액투석 또는 심실 보조 장치를 포함하였다. 일부 구현예에서, 환자는 기계 보조 치료에 대한 면역 반응을 일으켰다. 일부 구현예에서, 이전 치료는 요망되지 않는 방식으로 성장하고 분열할 경우, 안전 스위치가 활성화될 때, 치료 세포의 사멸을 유발할 수 있는 안전 스위치를 포함하는 치료 세포 집단을 포함하였다. 일부 구현예에서, 환자는 치료 세포의 사멸을 유도하는 안전 스위치의 결과로서 면역 반응을 일으킨다. 일부 구현예에서, 환자는 이전 치료로 인해 감작된다. 예시적인 구현예에서, 환자는 투여된 저면역원성 세포에 의해 감작되지 않는다.
일부 구현예에서, 주제 저면역원성 세포는 이를 필요로 하는 환자에게 조직, 장기 및/또는 부분 장기 이식을 제공하기 전에, 이와 동시에 및/또는 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 환자는 저면역원성 세포에 대한 면역 반응을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 특정 조직 및/또는 장기의 세포 결핍을 치료하기 위해 환자에 투여되고, 이어서 환자는 동일한 특정 조직 또는 장기에 대한 조직 또는 장기 이식을 받는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 이식을 위해 조직 또는 장기에서 원 위치로 환자에 투여된다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 조직 또는 장기 이식 전에 또는 후에 조직 또는 장기의 원 위치로 환자에 투여된다. 이러한 구현예에서, 저면역원성 세포 치료는 궁극적인 조직 또는 장기 대체에 대한 가교 치료법으로서 기능한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 환자는 간 장애를 갖고 간 이식을 받기 전에 본원에 제공된 바와 같은 저면역원성 간세포 치료를 받는다. 일부 구현예에서, 환자는 간 장애를 갖고 있고 간 이식을 받은 후에 본원에 제공된 바와 같은 저면역원성 간세포 치료를 받는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 특정 조직 및/또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 환자에 투여되고, 이어서 환자는 상이한 조직 또는 장기에 대한 조직 및/또는 장기 이식을 받는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 환자는 신장 이식을 받기 전에 저면역원성 췌장 베타 세포로 치료받은 당뇨병 환자이다. 일부 구현예에서, 환자는 신장 이식을 받은 후에 저면역원성 췌장 베타 세포로 치료받는 당뇨병 환자이다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 치료는 환자가 조직 또는 장기 이식을 받기 전에 및/또는 후에 공여체 조직 및/또는 장기에 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 세포 결핍의 치료를 위한 것이다. 예시적인 구현예에서, 조직 또는 장기 이식은 심장 이식, 폐 이식, 신장 이식, 간 이식, 췌장 이식, 장 이식, 위 이식, 각막 이식, 골수 이식, 혈관 이식, 심장 판막 이식 및/또는 뼈 이식이다.
환자를 치료하는 방법은 일반적으로 세포, 특히 본원에 제공된 저면역원성 세포의 투여를 통해 이루어진다. 이해될 바와 같이, 세포 및/또는 치료법의 시기와 관련하여 본원에 설명된 모든 다수의 구현예에 대해, 세포의 투여는 원하는 부위에서 도입된 세포의 적어도 부분적인 편재를 초래하는 방법 또는 경로에 의해 달성된다. 세포는 원하는 부위에 직접 임플란트될 수 있거나, 대안적으로 임플란트된 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부가 생활성으로 유지되는 대상체의 원하는 위치로 전달되는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 원하는 장기 또는 장기의 원하는 위치에 원 위치로 임플란트된다. 일부 구현예에서, 세포는 환자가 조직 또는 장기 이식을 받기 전에 및/또는 후에 공여체 조직 및/또는 장기에 임플란트될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 세포 치료법에 의해 경감될 수 있는 임의의 질환, 장애, 병태 및/또는 이의 증상과 같은 질환 또는 장애를 치료하기 위해 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 감작된 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월 이상 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 감작되거나 감작의 특성 또는 특징을 나타낸 적어도 1주 이상(예를 들어, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주, 20주 이상) 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 이식(예를 들어 동종이계 이식)을 받고 임신하고(예를 들어, 임신 중 동종면역화를 갖거나 가졌음) 및/또는 감작되고 및/또는 감작의 특성 및/또는 특징을 나타낸 적어도 1개월 이상(예를 들어, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월 이상) 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 이식을 받은 환자, 임신한 환자(예를 들어, 임신 중 동종면역화를 갖거나 가졌음) 및/또는 항원(예를 들어, 동종항원)에 대해 감작된 환자에게 본원에 설명된 세포 집단의 1차 용량 투여, 1차 용량 후 회복 기간, 및 설명된 세포 집단의 2차 용량 투여를 포함하는 투약 요법이 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단에 존재하는 세포 유형의 복합물은 상이하다. 특정 구현예에서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단에 존재하는 세포 유형의 복합물은 동일하거나 실질적으로 동등하다. 많은 구현예에서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단은 동일한 세포 유형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단은 상이한 세포 유형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단은 동일한 백분율의 세포 유형을 포함한다. 다른 구현예에서, 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단은 상이한 백분율의 세포 유형을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 세포 결핍의 치료를 위해 및/또는 심장, 폐, 신장, 간, 췌장, 장, 위, 각막, 골수, 혈관, 심장 판막, 뇌, 척수 및/또는 뼈로 구성된 군으로부터 선택된 조직 및/또는 장기에서 병태 또는 질환의 치료를 위한 세포 치료법으로서 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 결핍은 신경퇴행성 질환과 관련되고 세포 치료법은 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 백질이영양증, 헌팅턴병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 횡단 척수염 및/또는 펠리체우스-메르츠바허병(PMD)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포는 아교 전구 세포, 희소돌기아교세포, 성상세포 및 도파민성 뉴런으로 구성된 군으로부터 선택되고, 임의로 도파민성 뉴런은 신경 줄기 세포, 신경 전구 세포, 미성숙 도파민성 뉴런, 및 성숙 도파민 뉴런으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 결핍은 간 질환과 관련되고 세포 치료법은 간 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 간 질환은 간 경변증을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 간세포 또는 간 전구 세포이다. 일부 구현예에서, 세포 결핍은 각막 질환과 관련되고 세포 치료법은 각막 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 각막 질환은 푹스 이영양증 또는 선천성 유전 내피 이영양증이다. 일부 구현예에서, 세포는 각막 내피 전구 세포 또는 각막 내피 세포이다. 일부 구현예에서, 세포 결핍은 심혈관 병태 또는 질환과 관련되고 세포 치료법은 심혈관 병태 또는 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 심혈관 질환은 심근 경색 및/또는 울혈성 심부전이다. 일부 구현예에서, 세포는 심근세포 또는 심장 전구 세포이다. 일부 구현예에서, 세포 결핍은 당뇨병과 관련되고 세포 치료법은 당뇨병의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 세포는 췌장 베타 섬세포를 포함하는 췌장 섬세포이고, 임의로 췌장 섬세포는 췌장 섬 전구 세포, 미성숙 췌장 섬세포 및 성숙 췌장 섬세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 결핍은 혈관 병태 또는 질환과 관련되고 세포 치료법은 혈관 병태 또는 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 세포는 내피 세포이다. 일부 구현예에서, 세포 결핍은 자가면역 갑상샘염과 관련되고 세포 치료법은 자가면역 갑상샘염의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 세포는 갑상샘 전구 세포이다. 일부 구현예에서, 세포 결핍은 신장 질환과 관련되고 세포 치료법은 신장 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 세포는 신장 전구체 세포 또는 신장 세포이다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 암의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 암의 치료를 위해 투여되고 세포 집단은 CAR-T 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 암은 B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 샘암종, 췌장 샘암종, 교모세포종, 신경모세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 환자는 조직 또는 장기 이식을 받고 있으며, 임의로 조직 또는 장기 이식 또는 부분 장기 이식은 심장 이식, 폐 이식, 신장 이식, 간 이식, 췌장 이식, 장 이식, 위 이식, 각막 이식, 골수 이식, 혈관 이식, 심장 판막 이식, 뼈 이식, 부분 폐 이식, 부분 신장 이식, 부분 간 이식, 부분 췌장 이식, 부분 장 이식 및/또는 부분 각막 이식으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 조직 또는 장기 이식은 동종이식편 이식이다. 일부 구현예에서, 조직 또는 장기 이식은 자가이식편 이식이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 조직 또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 투여되고 조직 또는 장기 이식은 동일한 조직 또는 장기의 대체를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 조직 및/또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 투여되고 조직 및/또는 장기 이식은 상이한 조직 또는 장기의 대체를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 장기 이식은 신장 이식이고 세포 집단은 신장 전구체 세포 또는 신장 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 환자는 당뇨병을 갖고 세포 집단은 베타 섬세포 집단이다. 일부 구현예에서, 장기 이식은 심장 이식이고 세포 집단은 심장 전구 세포 또는 박동조율 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 장기 이식은 췌장 이식이고 세포 집단은 췌장 베타 섬세포 집단이다. 일부 구현예에서, 장기 이식은 부분 간 이식이고 세포 집단은 간세포 또는 간 전구 세포 집단이다.
일부 구현예에서, 회복 기간은 저면역원성 세포 집단의 1차 투여 후에 시작되고 이러한 세포가 환자에서 더 이상 존재하지 않거나 검출 가능하지 않을 때 종료된다. 일부 구현예에서, 회복 기간의 지속기간은 세포의 초기 투여 적어도 1주(예를 들어, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주, 20주 이상) 후이다. 일부 구현예에서, 회복 기간의 지속기간은 세포의 초기 투여 적어도 1개월(예를 들어, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월 이상) 후이다.
일부 구현예에서, 투여된 저면역원성 세포 집단은 환자에서 감소되거나 더 낮은 수준의 전신 TH1 활성화를 유도한다. 일부 경우에, 세포에 의해 유도된 전신 TH1 활성화 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생성된 전신 TH1 활성화 수준과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 더 낮다. 일부 구현예에서, 투여된 저면역원성 세포 집단은 환자에서 전신 TH1 활성화를 유도하지 못한다.
일부 구현예에서, 투여된 저면역원성 세포 집단은 환자에서 감소되거나 더 낮은 수준의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 면역 활성화를 유도한다. 일부 경우에, 세포에 의해 유도된 PBMC의 면역 활성화 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생성된 PBMC의 면역 활성화 수준과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 더 낮다. 일부 구현예에서, 투여된 저면역원성 세포 집단은 환자에서 PBMC의 면역 활성화를 유도하지 못한다.
일부 구현예에서, 투여된 저면역원성 세포 집단은 환자에서 감소되거나 더 낮은 수준의 공여체 특이적 IgG 항체를 유도한다. 일부 경우에, 세포에 의해 유도된 공여체 특이적 IgG 항체의 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생성된 공여체 특이적 IgG 항체의 수준과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 더 낮다. 일부 구현예에서, 투여된 저면역원성 세포 집단은 환자에서 공여체-특이적 IgG 항체를 유도하지 못한다.
일부 구현예에서, 투여된 저면역원성 세포 집단은 환자에서 감소되거나 더 낮은 수준의 IgM 및 IgG 항체 생성을 유도한다. 일부 경우에, 세포에 의해 유도된 IgM 및 IgG 항체 생성 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생성된 IgM 및 IgG 항체 생성 수준과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 더 낮다. 일부 구현예에서, 투여된 저면역원성 세포 집단은 환자에서 IgM 및 IgG 항체 생성을 유도하지 못한다.
일부 구현예에서, 투여된 저면역원성 세포 집단은 환자에서 감소되거나 더 낮은 수준의 세포독성 T 세포 사멸을 유도한다. 일부 경우에, 세포에 의해 유도된 세포독성 T 세포 사멸 수준은 면역원성 세포의 투여에 의해 생성된 세포독성 T 세포 사멸 수준과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 더 낮다. 일부 구현예에서, 투여된 저면역원성 세포 집단은 환자에서 세포독성 T 세포 사멸을 유도하지 못한다.
상기 논의된 바와 같이, 특정 구현예에서 인간 백혈구 항원과 같은 동종항원에 대해 감작된 환자에 투여될 수 있는 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 환자는 예를 들어 임신 중 동종면역화(예를 들어, 태아 및 신생아 용혈성 질환(HDFN), 신생아 동종면역 호중구감소증(NAN) 또는 태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증(FNAIT))를 가지며 임신하고 있거나 임신했었다. 즉, 환자는 태아 및 신생아의 용혈성 질환(HDFN), 신생아 동종면역 호중구감소증(NAN), 및 태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증(FNAIT)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임신 중 동종면역화와 관련된 장애 또는 병태를 갖고 있거나 가졌었다. 일부 구현예에서, 환자는 동종이계 세포 이식, 동종이계 수혈, 동종이계 조직 이식 또는 동종이계 장기 이식과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 동종이계 이식을 받았다. 일부 구현예에서, 환자는 동종항원에 대한 기억 B 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 동종항원에 대한 기억 T 세포를 나타낸다. 이러한 환자는 동종항원에 대해 기억 B 세포 및 기억 T 세포를 모두 나타낼 수 있다.
설명된 세포의 투여 시, 환자는 저면역원성이 아닌 세포에 대한 반응과 비교하여 전신 면역 반응을 나타내지 않거나 감소된 수준의 전신 면역 반응을 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 저면역원성이 아닌 세포에 대한 반응과 비교하여 적응 면역 반응을 나타내지 않거나 감소된 수준의 적응 면역 반응을 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 저면역원성이 아닌 세포에 대한 반응과 비교하여 선천성 면역 반응을 나타내지 않거나 감소된 수준의 선천성 면역 반응을 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 저면역원성이 아닌 세포에 대한 반응과 비교하여 T 세포 반응을 나타내지 않거나 감소된 수준의 T 세포 반응을 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 저면역원성이 아닌 세포에 대한 반응과 비교하여 B 세포 반응을 나타내지 않거나 감소된 수준의 B 세포 반응을 나타낸다.
본원에서 더 상세히 설명된 바와 같이, 외인성 CD47 폴리펩티드 및 MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하는 저면역원성 세포 집단, 외인성 CD47 폴리펩티드 및 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하는 저면역원성 세포 집단, 및 외인성 CD47 폴리펩티드 및 MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하는 저면역원성 세포 집단이 본원에 제공된다.
B. 저면역원성 세포
MHC I 분자, MHC II 분자, 또는 MHC I 및 MHC II 분자의 발현을 조절하는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 변형을 포함하는 세포가 본원에 제공된다. 특정 측면에서, 변형은 CD47의 발현 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 MHC 클래스 I 분자의 발현을 감소시키는 하나 이상의 일시적 변형 또는 게놈 변형 및 CD47의 발현을 증가시키는 변형을 포함한다. 즉, 조작된 세포는 CD47 단백질을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고 하나 이상의 MHC 클래스 I 분자의 감소된 또는 침묵화된 표면 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포는 MHC 클래스 II 분자의 발현을 감소시키는 하나 이상의 게놈 변형 및 CD47의 발현을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 경우에, 조작된 세포는 외인성 CD47 핵산 및 단백질을 포함하고 하나 이상의 MHC 클래스 I 분자의 감소된 또는 침묵화된 표면 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포는 MHC 클래스 II 분자의 발현을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 게놈 변형, MHC 클래스 II 분자의 발현을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 게놈 변형, 및 CD47의 발현을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 외인성 CD47 단백질을 포함하고, 하나 이상의 MHC 클래스 I 분자의 감소된 또는 침묵화된 표면 발현을 나타내고, 하나 이상의 MHC 클래스 II 분자의 감소된 또는 결여된 표면 발현을 나타낸다. 많은 구현예에서, 세포는 B2M삽입결실/삽입결실, CIITA 삽입결실/삽입결실 , CD47tg 세포이다.
MHC I 및/또는 MHC II 발현의 감소는 예를 들어 하기: (1) 다형성 HLA 대립유전자(HLA-A, HLA-B, HLA-C) 및 MHC-II 유전자의 직접 표적화; (2) 모든 MHC-I 분자의 표면 수송을 감소시킬 B2M의 제거; 및/또는 (3) LRC5, RFX-5, RFXANK, RFXAP, IRF1, NF-Y(NFY-A, NFY-B, NFY-C 포함)와 같은 MHC 인핸소좀의 하나 이상의 성분, 및 HLA 발현에 중요한 CIITA의 결실 중 하나 이상에 의해 달성될 수 있다.
특정 구현예에서, HLA 발현은 방해된다. 일부 구현예에서, HLA 발현은 개별 HLA의 표적화(예를 들어, HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C의 발현 녹아웃), HLA 발현의 전사 조절제의 표적화(예를 들어, NLRC5, CIITA, RFX5, RFXAP, RFXANK, NFY-A, NFY-B, NFY-C 및/또는 IRF-1의 발현 녹아웃), MHC 클래스 I 분자의 표면 수송 차단(예를 들어, B2M 및/또는 TAP1의 발현 녹아웃), 및/또는 HLA-Razor로의 표적화(예를 들어, WO2016183041 참고)에 의해 방해된다.
특정 측면에서, 본원에 개시된 줄기 세포 또는 분화된 줄기 세포를 포함하는 세포는 MHC-I 및/또는 MHC-II에 상응하고 따라서 저면역원성인 것으로 특성규명되는 하나 이상의 인간 백혈구 항원(예를 들어, HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C)을 발현하지 않는다. 예를 들어, 특정 측면에서, 본원에 개시된 줄기 세포 또는 분화된 줄기 세포를 포함하는 세포는 줄기 세포 또는 이로부터 제조된 분화된 줄기 세포가 하기 MHC-I 분자: HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 중 하나 이상을 발현하지 않거나 감소된 발현을 나타내도록 변형되었다. 일부 구현예에서, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 중 하나 이상은 세포의 "녹아웃"일 수 있다. 녹아웃된 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 및/또는 HLA-C 유전자를 가진 세포는 각각의 녹아웃된 유전자의 감소되거나 제거된 발현을 나타낼 수 있다.
특정 구현예에서, HLA 유전자에서 보존된 영역을 표적화함으로써 모든 MHC 클래스 I 대립유전자의 동시 결실을 허용하는 가이드 RNA는 HLA Razor로 확인된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 CRISPR 시스템, 예를 들어 CRISPR-Cas9 시스템의 일부이다. 대안적 측면에서 gRNA는 TALEN 시스템의 일부이다. 한 측면에서, HLA에서 확인된 보존 영역을 표적화하는 HLA Razor가 WO2016183041에 설명되어 있다. 다른 측면에서, 확인된 보존 영역을 표적화하는 다수의 HLA Razor가 이용된다. 일반적으로 HLA에서 보존된 영역을 표적화하는 임의의 가이드가 HLA Razor로 역할할 수 있음이 이해된다.
일부 구현예에서, 세포는 CD47 및 DUX4, CD24, CD27, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, IL-39, FasL, CCL21, CCL22, Mfge8, CD16, CD52, H2-M3 및 Serpinb9로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자의 발현을 증가시키는 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자의 발현을 조절하는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 게놈 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 표적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 B2M, CIITA 및 NLRC5를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 세포는 B2M 유전자에 대한 유전자 편집 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 CIITA 유전자에 대한 유전자 편집 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 NLRC5 유전자에 대한 유전적 편집 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 B2M 및 CIITA 유전자에 대한 유전자 편집 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 B2M 및 NLRC5 유전자에 대한 유전자 편집 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 CIITA 및 NLRC5 유전자에 대한 유전자 편집 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 B2M, CIITA 및 NLRC5 유전자에 대한 유전자 편집 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 게놈은 HLA 발현의 중요한 성분을 감소시키거나 결실시키도록 변경되었다.
일부 구현예에서, 본 개시는 유전자가 편집되어 게놈 DNA의 인접한 스트레치를 결실시킴으로써 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 I 분자의 발현, 예를 들어 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 I 분자의 표면 발현을 감소시키거나 제거한 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 세포 또는 CAR-T 세포) 또는 이의 집단을 제공한다. 특정 측면에서, 본 개시는 유전자가 편집되어 게놈 DNA의 인접한 스트레치를 결실시킴으로써 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 II 분자의 표면 발현을 감소시키거나 제거한 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 세포 또는 CAR-T 세포) 또는 이의 집단을 제공한다. 특정 측면에서, 본 개시는 하나 이상의 유전자가 편집되어 게놈 DNA의 인접한 스트레치를 결실시킴으로써 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 I 및 II 분자의 표면 발현을 감소시키거나 제거한 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 세포 또는 CAR-T 세포) 또는 이의 집단을 제공한다.
특정 구현예에서, MHC I 분자 및/또는 MHC II 분자의 발현은 게놈 DNA의 인접한 스트레치를 표적화하거나 결실시켜 B2M, CIITA 및 NLRC5로 구성된 군으로부터 선택된 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 제거함으로써 조절된다. 일부 구현예에서, 외인성 CD47 단백질 및 불활성화되거나 변형된 CIITA 유전자 서열, 그리고 일부 경우에 B2M 유전자 서열을 불활성화하거나 변형하는 추가 유전자 변형을 포함하는 유전적으로 편집된 세포(예를 들어, 변형된 인간 세포)가 본원에 설명된다. 일부 구현예에서, 외인성 CD47 단백질 및 불활성화되거나 변형된 CIITA 유전자 서열, 그리고 일부 경우에 NLRC5 유전자 서열을 불활성화하거나 변형하는 추가 유전자 변형을 포함하는 유전적으로 편집된 세포가 본원에 설명된다. 일부 구현예에서, 외인성 CD47 단백질 및 불활성화되거나 변형된 B2M 유전자 서열, 그리고 일부 경우에 NLRC5 유전자 서열을 불활성화하거나 변형하는 추가 유전자 변형을 포함하는 유전적으로 편집된 세포가 본원에 설명된다. 일부 구현예에서, 외인성 CD47 단백질 및 불활성화되거나 변형된 B2M 유전자 서열, 그리고 일부 경우에 CIITA 유전자 서열 및 NLRC5 유전자 서열을 불활성하되거나 변형하는 추가 유전자 변형을 포함하는 유전적으로 편집된 세포가 본원에 설명된다.
일부 구현예에서, 세포는 B2M -/- , CIITA -/- , TRAC -/- , TRB -/- , CD47tg 세포이다. 일부 구현예에서, B2M -/- , CIITA -/- , TRAC -/- , TRB -/- , CD47tg 세포는 1차 T 세포 또는 저면역원성 만능 세포(예를 들어, 저면역원성 iPSC)로부터 유래된 T 세포이다.
일부 구현예에서, 세포는 B2M -/- , CIITA -/- , TRAC -/- , 및 CD47tg 세포이다. 일부 구현예에서, B2M -/- , CIITA -/- , TRAC -/- , 및 CD47tg 세포는 1차 T 세포 또는 저면역원성 만능 세포(예를 들어, 저면역원성 iPSC)로부터 유래된 T 세포이다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 세포는 만능 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 이러한 줄기 세포로부터 유도되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 및 이의 임의의 자손을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 종양 침윤 림프구 및 이의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 저면역 T 세포 및 1차 T 세포는 CD47 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 과발현하고, B2M 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역 T 세포 및 1차 T 세포는 CD47을 과발현하고 CIITA 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역 T 세포 및 1차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고, TRAC 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역 T 세포 및 1차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고, TRB 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역 T 세포 및 1차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고, B2M, CIITA, TRAC 및 TRB 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 게놈 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역 T 세포 및 1차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고, B2M, CIITA, TRAC 및 TRB 유전자의 게놈 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 또한 CAR을 발현하는 B2M -/- , CIITA -/- , TRAC -/- , 및 CD47tg 세포이다.
일부 구현예에서, 세포는 또한 CAR을 발현하는 B2M -/- , CIITA -/- , TRB -/- , 및 CD47tg 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 또한 CAR을 발현하는 B2M -/- , CIITA -/- , TRAC -/- , TRB -/- , 및 CD47tg 세포이다. 많은 구현예에서, 세포는 또한 CAR을 발현하는 B2M 삽입결실/삽입결실 , CIITA 삽입결실/삽입결실 , TRAC 삽입결실/삽입결실 , 및 CD47tg 세포이다. 많은 구현예에서, 세포는 또한 CAR을 발현하는 B2M 삽입결실/삽입결실 , CIITA 삽입결실/삽입결실 , TRB 삽입결실/삽입결실 , 및 CD47tg 세포이다. 많은 구현예에서, 세포는 또한 CAR을 발현하는 B2M 삽입결실/삽입결실 , CIITA 삽입결실/삽입결실 , TRAC 삽입결실/삽입결실 , TRB 삽입결실/삽입결실 , 및 CD47tg 세포이다. 일부 구현예에서, 설명된 변형된 세포는 만능 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 이러한 만능 줄기 세포 및 유도된 만능 줄기 세포로부터 분화된 세포, 또는 1차 T 세포이다. 1차 T 세포의 비제한적 예는 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 나이브 T 세포, 조절 T(Treg) 세포, 비조절 T 세포, Th1 세포, Th2 세포, Th9 세포, Th17 세포, T-소포 헬퍼(Tfh) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 효과기 T(Teff) 세포, 중추 기억 T(Tcm) 세포, 효과기 기억 T(Tem) 세포, CD45RA를 발현하는 효과기 기억 T 세포(TEMRA 세포), 조직 상주 기억(Trm) 세포, 가상 기억 T 세포, 선천성 기억 T 세포, 기억 줄기 세포(Tsc), γδ T 세포 및 T 세포의 임의의 다른 하위유형을 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 종양 침윤 림프구 및/또는 이의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포는 수신 수신 대상체(예를 들어, 세포가 투여된 환자)와 상이한 하나 이상의 공여 대상체로부터의 1차 T 세포 풀로부터 유래된다. 1차 T 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100 이상의 공여 대상체로부터 얻어지고 함께 풀링될 수 있다. 1차 T 세포는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 20 이상, 50 이상, 또는 100 이상의 공여 대상체로부터 얻어지고 함께 풀링될 수 있다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포는 하나 또는 복수의 개체로부터 수확되고, 일부 경우에 1차 T 세포 또는 1차 T 세포 풀은 시험관내 배양된다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포 또는 1차 T 세포 풀은 CD47을 외인성으로 발현하도록 조작 되고 시험관내 배양된다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포 또는 1차 T 세포 풀은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된다. CAR은 당업자에게 알려진 임의의 것일 수 있다. 유용한 CAR은 CD19, CD20, CD22, CD38, CD123, CD138 및 BCMA를 포함하는 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 것들을 포함한다. 일부 경우에, CAR은 브렉수카브타진 오토루셀, 악시카브타진 실로루셀, 이데카브타진 비클루셀, 리소카브타진 마라루셀, 티사겐렉루셀, 또는 임상 시험에서 조사 중인 다른 것들에서 사용되는 것들과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 FDA-승인 CAR-T 세포 치료법에서 사용되는 것들과 동일하거나 동등하다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포 또는 1차 T 세포 풀은 변형되지 않은 1차 T 세포와 비교하여 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 나타내도록 조작된다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포 또는 1차 T 세포 풀은 변형되지 않은 1차 T 세포와 비교하여 CTLA4, PD1, 또는 CTLA4 및 PD1 둘 다의 감소된 발현을 나타내도록 조작된다. T 세포를 포함하는 세포를 유전적으로 변형하는 방법은 예를 들어 WO2020018620 및 WO2016183041에 상세하게 설명되어 있으며, 그 개시는 표, 별첨, 서열 목록 및 도면을 포함하여 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, CAR-T 세포는 (a) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 1세대 CAR; (b) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 2개의 신호전달 도메인을 포함하는 2세대 CAR; (c) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 3개의 신호전달 도메인을 포함하는 3세대 CAR; 및 (d) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 3개 또는 4개의 신호전달 도메인, 및 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 4세대 CAR을 포함하는 군으로부터 선택된 CAR을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR-T 세포는 항원 결합 도메인, 막횡단 및 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 또한 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD19 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD28 또는 CD8α 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD8α 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 Whitlow 링커 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열 번호 14)를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 (a) 신생물 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인 표적; (b) T 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; (c) 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; (d) 노화 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; (e) 감염성 질환의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; 및 (f) 세포의 세포 표면 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하지만 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체, 이의 항원 결합 부분 또는 단편, scFv 및 Fab를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD38, CD123, CD138, 또는 BCMA에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 FMC63과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 항-CD19 scFv이다.
일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD9, CD16, CD28, CD45, CD22, CD33, CD34, CD37, CD40, CD40L/CD154, CD45, CD64, CD80, CD86, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, CD154, FcεRIγ, VEGFR2, FAS, FGFR2B 및 이의 기능적 변이체의 막횡단 영역을 포함하는 군으로부터 선택된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 신호전달 도메인(들)은 공동자극 도메인(들)을 포함한다. 예를 들어, 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함할 수 있다. 또는 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 신호전달 도메인은 하나의 공동자극 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 신호전달 도메인은 공동자극 도메인들을 포함한다. 일부 경우에, CAR이 2개 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 경우, 2개의 공동자극 도메인은 동일하지 않다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 동일하지 않은 2개의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생성, CAR-T 세포 증식 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생성, CAR-T 세포 증식 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다.
본원에 설명된 바와 같이, 4세대 CAR은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 3개 또는 4개의 신호전달 도메인, 및 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 사이토카인 유전자는 저면역원성 세포의 내인성 또는 외인성 사이토카인 유전자이다. 일부 경우에, 사이토카인 유전자는 친염증성 사이토카인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 친염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-9, IL-12, IL-18, TNF, IFN-감마 및 이의 기능적 단편을 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인은 전사 인자 또는 이의 기능적 도메인 또는 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 CD3 제타(CD3ζ) 도메인 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 전이유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) 항-CD19 scFv; (ii) CD8α 힌지 및 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 공동자극 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) CD3ζ 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
CAR 작제물을 도입하거나 CAR-T 세포를 생성하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 자세한 설명은 예를 들어 문헌(Vormittag et al., Curr Opin Biotechnol., 2018, 53, 162-181; 및 Eyquem et al., Nature, 2017, 543, 113-117)에서 확인된다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 예를 들어, 내인성 T 세포 수용체 유전자(예를 들어 T 세포 수용체 알파 불변 영역("TRAC"로 지칭됨) 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변 영역("TRBC" 또는 "TRB"로 지칭됨)의 파괴에 의한, 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드(예를 들어, 키메라 항원 수용체, CD47, 또는 본원에 개시된 또 다른 관용원성 인자)를 암호화하는 외인성 핵산은 파괴된 T 세포 수용체 유전자에 삽입된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산은 TRAC 또는 TRB 유전자좌에 삽입된다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA4) 및/또는 프로그래밍된 세포 사멸(PD1)의 감소된 발현을 포함한다. CTLA4, PD1 및 CTLA4와 PD1 둘 모두의 발현을 감소시키거나 제거하는 방법은 희귀-절단 엔도뉴클레아제 및 RNA 침묵화 또는 RNA 간섭 기술을 이용하는 유전적 변형 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업자에 의해 인식되는 임의의 것을 포함할 수 있다. 희귀 절단 엔도뉴클레아제의 비제한적 예는 임의의 Cas 단백질, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 및/또는 귀소 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드(예를 들어, 키메라 항원 수용체, CD47, 또는 본원에 개시된 또 다른 관용원성 인자)를 암호화하는 외인성 핵산은 CTLA4 및/또는 PD1 유전자 유전자좌에 삽입된다.
일부 구현예에서, CD47 전이유전자는 세포의 미리 선택된 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 전이유전자는 세포의 미리 선택된 유전자좌에 삽입된다. 많은 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 세포의 미리 선택된 유전자좌에 삽입된다. 미리 선택된 유전자좌는 세이프 하버 유전자좌 또는 표적 유전자좌일 수 있다. 세이프 하버 유전자좌의 비제한적 예는 CCR5 유전자 유전자좌, PPP1R12C(AAVS1로도 알려짐) 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌 및/또는 Rosa 유전자 유전자좌(예를 들어 ROSA26 유전자 유전자좌)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 표적 유전자좌의 비제한적 예는 CXCR4 유전자, 알부민 유전자, SHS231 유전자좌, F3 유전자(CD142로도 알려짐), MICA 유전자, MICB 유전자, LRP1 유전자(CD91로도 알려짐), HMGB1 유전자, ABO 유전자, RHD 유전자, FUT1 유전자, KDM5D 유전자(HY로도 알려짐), B2M 유전자, CIITA 유전자, TRAC 유전자, TRBC 유전자, CCR5 유전자, F3(즉, CD142) 유전자, MICA 유전자, MICB 유전자, LRP1 유전자, HMGB1 유전자, ABO 유전자, RHD 유전자, FUT1 유전자, KDM5D(즉, HY) 유전자, PDGFRa 유전자, OLIG2 유전자, 및/또는 GFAP 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 미리 선택된 유전자좌는 B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 미리 선택된 유전자좌는 B2M 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 미리 선택된 유전자좌는 CIITA 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 미리 선택된 유전자좌는 TRAC 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 미리 선택된 유전자좌는 TRB 유전자좌이다.
일부 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 동일한 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 상이한 유전자좌에 삽입된다. 많은 경우에 CD47 전이유전자는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 많은 경우에, CAR을 암호화하는 전이유전자는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 일부 경우에, CD47 전이유전자는 B2M 유전자좌에 삽입된다. 일부 경우에, CAR을 암호화하는 전이유전자는 B2M 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자는 CIITA 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 전이유전자는 CIITA 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자는 TRAC 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 전이유전자는 TRAC 유전자좌에 삽입된다. 다른 구현예에서, CD47 전이유전자는 TRB 유전자좌에 삽입된다. 다른 구현예에서, CAR을 암호화하는 전이유전자는 TRB 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 세이프 하버 유전자좌(예를 들어, CCR5 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌 및/또는 Rosa 유전자 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 표적 유전자좌(예를 들어, CXCR4 유전자, 알부민 유전자, SHS231 유전자좌, F3 유전자(CD142로도 알려짐), MICA 유전자, MICB 유전자, LRP1 유전자(CD91로도 알려짐), HMGB1 유전자, ABO 유전자, RHD 유전자, FUT1 유전자, KDM5D 유전자(HY로도 알려짐), B2M 유전자, CIITA 유전자, TRAC 유전자, TRBC 유전자, CCR5 유전자, F3(즉, CD142) 유전자, MICA 유전자, MICB 유전자, LRP1 유전자, HMGB1 유전자, ABO 유전자, RHD 유전자, FUT1 유전자, KDM5D(즉, HY) 유전자, PDGFRa 유전자, OLIG2 유전자 및/또는 GFAP 유전자에 삽입된다.
많은 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 많은 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 단일 프로모터에 의해 제어되고 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 많은 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 이들의 고유한 프로모터에 의해 제어되고 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 많은 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 TRAC 유전자좌에 삽입된다. 많은 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 단일 프로모터에 의해 제어되고 TRAC 유전자좌에 삽입된다. 많은 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 이들의 고유한 프로모터에 의해 제어되고 TRAC 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 TRB 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 단일 프로모터에 의해 제어되고 TRB 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 이들의 고유한 프로모터에 의해 제어되고 TRB 유전자좌에 삽입된다. 다른 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 B2M 유전자좌에 삽입된다. 다른 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 단일 프로모터에 의해 제어되고 B2M 유전자좌에 삽입된다. 다른 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 이들의 고유한 프로모터에 의해 제어되고 B2M 유전자좌에 삽입된다. 다양한 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 CIITA 유전자좌에 삽입된다. 다양한 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 단일 프로모터에 의해 제어되고 CIITA 유전자좌에 삽입된다. 다양한 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 이들의 고유한 프로모터에 의해 제어되고 CIITA 유전자좌에 삽입된다. 일부 경우에, 설명된 임의의 전이유전자의 발현을 제어하는 프로모터는 구성적 프로모터이다. 다른 경우에, 설명된 임의의 전이유전자에 대한 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF1 알파(EF1α) 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CAG 프로모터이다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 모두 구성적 프로모터에 의해 제어된다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자는 모두 유도성 프로모터에 의해 제어된다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자는 구성적 프로모터에 의해 제어되고 CAR을 암호화하는 전이유전자는 유도성 프로모터에 의해 제어된다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자는 유도성 프로모터에 의해 제어되고 CAR을 암호화하는 전이유전자는 구성적 프로모터에 의해 제어된다. 다양한 구현예에서, CD47 전이유전자는 EF1 알파 프로모터에 의해 제어되고 CAR을 암호화하는 전이유전자는 EF1 알파 프로모터에 의해 제어된다. 다른 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자 둘 모두의 발현은 단일 EF1 알파 프로모터에 의해 제어된다. 다양한 구현예에서, CD47 전이유전자는 CAG 프로모터에 의해 제어되고 CAR을 암호화하는 전이유전자는 CAG 프로모터에 의해 제어된다. 다른 구현예에서, CD47 전이유전자 및 CAR을 암호화하는 전이유전자 둘 다의 발현은 단일 CAG 프로모터에 의해 제어된다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자는 CAG 프로모터에 의해 제어되고 CAR을 암호화하는 전이유전자는 EF1 알파 프로모터에 의해 제어된다. 일부 구현예에서, CD47 전이유전자는 EF1 알파 프로모터에 의해 제어되고 CAR을 암호화하는 전이유전자는 CAG 프로모터에 의해 제어된다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 세포는 안전 스위치를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "안전 스위치"는 하향조절되거나 상향조절될 때, 예를 들어 숙주의 면역계에 의한 인식을 통해 세포의 제거 또는 사멸을 야기하는 관심 유전자 또는 단백질의 발현을 제어하기 위한 시스템을 지칭한다. 안전 스위치는 임상 부작용이 발생한 경우 외인성 분자에 의해 유도되도록 설계될 수 있다. 안전 스위치는 DNA, RNA 및 단백질 수준의 발현을 조절하여 조작될 수 있다. 안전 스위치는 부작용에 반응하여 세포 활동을 제어할 수 있는 단백질 또는 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 안전 스위치는 불활성 상태로 발현되고 선택적인, 외부에서 제공되는 제제에 의한 스위치 활성화 시 안전 스위치를 발현하는 세포에 치명적인 "사멸 스위치"이다. 한 구현예에서, 안전 스위치 유전자는 작제물에서 관심 유전자와 관련하여 시스-작용한다. 안전 스위치의 활성화는 세포가 아폽토시스 또는 괴사를 통해 자신만을 또는 자신과 이웃 세포를 사멸시키도록 한다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 세포, 예를 들어 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 세포 또는 심장 세포, 심장 전구 세포, 신경 세포, 아교 전구 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, CART 세포, NK 세포, 및/또는 CAR-NK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 분화된 세포는 안전 스위치를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 세포는 "자살 유전자"(또는 "자살 스위치")를 포함한다. 자살 유전자는 저면역원성 세포가 요망되지 않는 방식으로 성장하고 분열할 경우 이의 사멸을 유발할 수 있다. 자살 유전자 제거 접근은 특정 화합물에 의해 활성화될 때만 세포 사멸을 초래하는 단백질을 암호화하는 유전자 전달 벡터에 자살 유전자를 포함한다. 자살 유전자는 무독성 화합물을 고독성 대사산물로 선택적으로 전환하는 효소를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 세포, 예를 들어 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 세포 또는 심장 세포, 심장 전구 세포, 신경 세포, 아교 전구 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, CART 세포, NK 세포, 및/또는 CAR-NK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 분화된 세포는 자살 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 설명된 조작된 세포 집단은 수신 대상체에 투여 시 감소된 수준의 면역 활성화를 유도하거나 면역 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 감소된 면역 반응은 "야생형" 세포 집단이 투여된 환자 또는 대조군 대상체에서의 면역 반응과 비교된다. 일부 구현예에서, 세포는 수신 대상체에서 감소된 수준의 전신 TH1 활성화를 유도하거나 전신 TH1 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 수신 대상체에서 감소된 수준의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 면역 활성화를 유도하거나 PBMC의 면역 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 수신 대상체에 투여 시 세포에 대해 감소된 수준의 공여체 특이적 IgG 항체를 유도하거나 공여체 특이적 IgG 항체를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 수신 대상체의 세포에 대해 감소된 수준의 IgM 및 IgG 항체 생성을 유도하거나 IgM 및 IgG 항체 생성을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 수신 대상체에 투여 시 세포의 감소된 수준의 세포독성 T 세포 사멸을 유도한다.
1. T 세포 및 iPSC로부터 유래된 치료 세포
면역 인식을 회피하는 T 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 저면역원성 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 iPSC, MSC 및/또는 ESC와 같은 만능 줄기 세포로부터 생성(예를 들어, 생성, 배양 또는 유래)된다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 1차 T 세포와 같은 T 세포로부터 생성(예를 들어, 생성, 배양 또는 유도)된다. 일부 경우에, 1차 T 세포는 대상체 또는 개체로부터 얻어진다(예를 들어 수확, 추출, 제거 또는 채취됨). 일부 구현예에서, 1차 T 세포는 T 세포가 하나 이상의 대상체(예를 들어, 하나 이상의 건강한 인간을 포함하는 하나 이상의 인간)로부터 유래되도록 T 세포 풀로부터 생성된다. 일부 구현예에서, T 세포 풀은 1-100, 1-50, 1-20, 1-10, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상 또는 100 이상의 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 공여 대상체는 환자(예를 들어, 치료 세포가 투여되는 수신체)와 상이하다. 일부 구현예에서, T 세포 풀은 환자로부터의 세포를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, T 세포 풀이 얻어지는 공여 대상체 중 하나 이상은 환자와 상이하다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 환자(예를 들어, 투여 시 수신체)에서 면역 반응을 활성화하지 않는다. 저면역원성 세포 집단을 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 수신체) 또는 환자에 반복 투약하는 단계를 포함하는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포(예를 들어, 저면역원성 1차 T 세포) 집단은 인간 환자에 적어도 2회(예를 들어, 2, 3, 4, 5회 이상) 투여된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 환자(예를 들어, 투여 시 수신체)에서 면역 반응을 활성화하지 않는다. 저면역원성 세포 집단을 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 수신체) 또는 환자에 투여함으로써 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 저면역원성 세포는 본원에 설명된 키메라 항원 수용체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된(예를 들어, 변형된) T 세포를 포함한다. 일부 경우에, T 세포는 하나 이상의 개체로부터의 1차 T 세포 집단 또는 하위집단이다. 일부 구현예에서, 조작된 또는 변형된 T 세포와 같은 본원에 설명된 T 세포는 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 기술은 CD47 및 CAR을 과발현하고, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 발현이 감소되거나 발현이 없고, TCR 복합체 분자의 발현이 감소되거나 발현이 없는 저면역원성 1차 T 세포에 관한 것이다. 본원에 개략된 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고 면역 인식을 회피한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포는 MHC 클래스 I 항원, MHC 클래스 II 항원 및/또는 TCR 복합체 분자의 감소된 수준 또는 활성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 1차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고 B2M 유전자에 게놈 변형을 보유한다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고 CIITA 유전자에 게놈 변형을 보유한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고 TRAC 유전자에 게놈 변형을 보유한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고 TRB 유전자에 게놈 변형을 보유한다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD47 및 CAR을 과발현하고 하기 유전자: B2M, CIITA, TRAC 및 TRB 유전자 중 하나 이상에 게놈 변형을 보유한다.
본 개시의 예시적인 T 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 중추 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포, 효과기 기억 RA T 세포, 조절 T 세포, 조직 침윤 림프구, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 많은 구현예에서, T 세포는 CCR7, CD27, CD28 및 CD45RA를 발현한다. 일부 구현예에서, 중추 T 세포는 CCR7, CD27, CD28 및 CD45RO를 발현한다. 다른 구현예에서, 효과기 기억 T 세포는 PD1, CD27, CD28 및 CD45RO를 발현한다. 다른 구현예에서, 효과기 기억 RA T 세포는 PD1, CD57 및 CD45RA를 발현한다.
일부 구현예에서, T 세포는 변형된 T 세포이다. 일부 경우에, 변형된 T 세포는 세포가 손상된 세포, 이형성 세포, 감염된 세포, 면역원성 세포, 염증 세포, 악성 세포, 화생 세포, 돌연변이체 세포 및 이의 조합 중 적어도 하나의 표면 상에 발현된 관심 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유발하는 변형을 포함한다. 다른 경우에, 변형된 T 세포는 세포가 인접한 세포, 조직 또는 장기에 근접할 때 인접한 세포, 조직 또는 장기에서 관심 생물학적 효과를 조절하는 적어도 하나의 단백질을 발현하도록 유발하는 변형을 포함한다. 1차 T 세포에 대한 유용한 변형은 US2016/0348073 및 WO2020/018620에 상세히 설명되어 있으며, 그 개시 전체가 본원에 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 저면역원성 세포는 본원에 설명된 키메라 항원 수용체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된(예를 들어, 변형된) T 세포를 포함한다. 일부 경우에, T 세포는 하나 이상의 개체로부터의 1차 T 세포 집단 또는 하위집단이다. 일부 구현예에서, 조작된 또는 변형된 T 세포와 같은 본원에 설명된 T 세포는 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작되거나 변형된 T 세포와 같은 본원에 설명된 T 세포는 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA4)의 감소된 발현을 포함한다. 다른 구현예에서, 조작된 또는 변형된 T 세포와 같은 본원에 설명된 T 세포는 프로그래밍된 세포 사멸(PD1)의 감소된 발현을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작되거나 변형된 T 세포와 같은 본원에 설명된 T 세포는 CTLA4 및 PD1의 감소된 발현을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 또는 변형된 T 세포와 같은 본원에 설명된 T 세포는 PD-L1의 향상된 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 T 세포는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 게놈 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3(CD142로도 알려짐), MICA, MICB, LRP1(또한 CD91로 알려짐), HMGB1, ABO, RHD, FUT1, PDGFRa, OLIG2, GFAP 또는 KDM5D 유전자 유전자좌와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 B2M, CIITA, TRAC, TRB, PD1 또는 CTLA4 유전자에 삽입된다.
2. 키메라 항원 수용체
키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 저면역원성 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 1차 T 세포 또는 본원에 제공된 저면역원성 만능 세포(HIP)(예를 들어, 만능 줄기 세포)로부터 유래된 T 세포이다. 일부 구현예에서, CAR은 1세대 CAR, 2세대 CAR, 3세대 CAR 및 4세대 CAR로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 저면역원성 세포는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 저면역원성 세포는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 적어도 하나의 신호전달 도메인(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 신호전달 도메인)을 포함하는 1세대 CAR이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 2개의 신호전달 도메인을 포함하는 2세대 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 3개의 신호전달 도메인을 포함하는 3세대 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 3개 또는 4개의 신호전달 도메인, 및 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 4세대 CAR. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체, 항체 단편, scFv 또는 Fab이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 저면역원성 세포(예를 들어, 저면역원성 1차 T 세포 또는 HIP-유래 T 세포)는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 게놈 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3(CD142로도 알려짐), MICA, MICB, LRP1(또한 CD91로 알려짐), HMGB1, ABO, RHD, FUT1, PDGFRa, OLIG2, GFAP 및/또는 KDM5D 유전자 유전자좌와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 B2M, CIITA, TRAC, TRB, PD1 또는 CTLA4 유전자에 삽입된다. 임의의 적합한 방법이 본원에 설명된 유전자 편집 방법(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)을 포함하는 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌에 CAR을 삽입하기 위해 사용될 수 있다.
a) 항원 결합 도메인(ABD)이 신생물 또는 암 세포의 항원 특성을 표적화함
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인(ABD)은 신생물 세포의 항원 특성을 표적화한다. 즉, 항원 결합 도메인은 신생물 또는 암 세포에 의해 발현된 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, ABD는 종양 관련 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 신생물 세포의 항원 특성(예를 들어, 신생물 또는 암 세포와 관련된 항원) 또는 종양 관련 항원은 세포 표면 수용체, 이온 채널-연결 수용체, 효소-연결 수용체, G 단백질-커플링 수용체, 수용체 티로신 키나제, 티로신 키나제 관련 수용체, 수용체 유사 티로신 포스파타제, 수용체 세린/트레오닌 키나제, 수용체 구아닐릴 사이클라제, 히스티딘 키나제 관련 수용체, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)(ErbB1/EGFR, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 및 ErbB4/HER4 포함), 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR)(FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF18 및 FGF21 포함) 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR)(VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 PIGF 포함), RET 수용체 및 Eph 수용체 패밀리(EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA9, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4 및 EphB6 포함), CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CFTR, CIC-1, CIC-2, CIC-4, CIC-5, CIC-7, CIC-Ka, CIC-Kb, 베스트로핀, TMEM16A, GABA 수용체, 글리신 수용체, ABC 수송체, NAV1.1, NAV1.2, NAV1.3, NAV1.4, NAV1.5, NAV1.6, NAV1.7, NAV1.8, NAV1.9, 스핑고신-1-포스페이트 수용체(S1P1R), NMDA 채널, 막횡단 단백질, 멀티스팬 막횡단 단백질, T 세포 수용체 모티프; T 세포 알파 사슬; T 세포 β 사슬; T 세포 γ 사슬; T 세포 δ 사슬, CCR7, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11b, CD11c, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD28, CD34, CD35, CD40, CD45RA, CD45RO, CD52, CD56, CD62L, CD68, CD80, CD95, CD117, CD127, CD133, CD137(4-1BB), CD163, F4/80, IL-4Ra, Sca-1, CTLA-4, GITR, GARP, LAP, 그랜자임 B, LFA -1, 트랜스페린 수용체, NKp46, 퍼포린, CD4+, Th1, Th2, Th17, Th40, Th22, Th9, Tfh, 정규 Treg, FoxP3+, Tr1, Th3, Treg17, TREG, CDCP, NT5E, EpCAM, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, 탄산 탈수효소 IX, PSMA, 엽산 결합 단백질, 강글리오시드(예를 들어 CD2, CD3, GM2), 루이스-γ2, VEGF, VEGFR 1/2/3, αVβ3, α5β1, ErbB1/EGFR, ErbB1/HER2, ErB3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANKL, FAP, 테나신, PDL-1, BAFF, HDAC, ABL, FLT3, KIT, MET, RET, IL-1β, ALK, RANKL, mTOR, CTLA-4, IL-6, IL-6R, JAK3, BRAF, PTCH, Smoothened, PIGF, ANPEP, TIMP1, PLAUR, PTPRJ, LTBR 또는 ANTXR1, 엽산 수용체 알파(FRa), ERBB2(Her2/neu), EphA2, IL-13Ra2, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 메소텔린, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, MUC16(CA125), L1CAM, LeY, MSLN, IL13Rα1, L1-CAM, Tn Ag, 전립샘 특이적 막 항원(PSMA), ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, 인터루킨-11 수용체 a(IL-11Ra), PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, 혈소판 유래 성장 인자 수용체-베타(PDGFR-베타), SSEA-4, CD20, MUC1, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-1 수용체, CAIX, LMP2, gp1OO, bcr-abl, 티로시나제, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLACl, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6, E7, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, 주조직 적합성 복합체 클래스 I-관련 유전자 단백질(MR1), 유로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR), Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바빈, 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, MelanA/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 파단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYPIB I, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, 신생항원, CD133, CD15, CD184, CD24, CD56, CD26, CD29, CD44, HLA-A, HLA-B, HLA-C, (HLA-A,B,C) CD49f, CD151 CD340, CD200, tkrA, trkB 또는 trkC, 및/또는 이의 항원성 단편 또는 항원성 부분으로부터 선택된다.
b) ABD가 T 세포의 항원 특성을 표적화함
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 T 세포의 항원 특성을 표적화한다. 일부 구현예에서, ABD는 T 세포와 관련된 항원에 결합한다. 일부 경우에, 이러한 항원이 T 세포에 의해 발현되거나 T 세포의 표면 상에 위치한다. 일부 구현예에서, T 세포의 항원 특성 또는 T 세포 관련 항원은 T 세포에 특징적인 세포 표면 수용체, 막 수송 단백질(예를 들어 이온 채널 단백질, 기공 형성 단백질과 같은, 예를 들어, 능동 또는 수동 수송 단백질 등), 막횡단 수용체, 막 효소 및/또는 세포 부착 단백질로부터 선택된다. 일부 구현예에서, T 세포의 항원 특성은 G 단백질-커플링 수용체, 수용체 티로신 키나제, 티로신 키나제 관련 수용체, 수용체 유사 티로신 포스파타제, 수용체 세린/트레오닌 키나제, 수용체 구아닐릴 사이클라제, 히스티딘 키나제 관련 수용체, AKT1; AKT2; AKT3; ATF2; BCL10; CALM1; CD3D(CD3δ); CD3E(CD3ε); CD3G(CD3γ); CD4; CD8; CD28; CD45; CD80(B7-1); CD86(B7-2); CD247(CD3ζ); CTLA4(CD152); ELK1; ERK1(MAPK3); ERK2; FOS; FYN; GRAP2(GADS); GRB2; HLA-DRA; HLA-DRB1; HLA-DRB3; HLA-DRB4; HLA-DRB5; HRAS; IKBKA(CHUK); IKBKB; IKBKE; IKBKG(NEMO); IL2; ITPR1; ITK; JUN; KRAS2; LAT; LCK; MAP2K1(MEK1); MAP2K2(MEK2); MAP2K3(MKK3); MAP2K4(MKK4); MAP2K6(MKK6); MAP2K7(MKK7); MAP3K1(MEKK1); MAP3K3; MAP3K4; MAP3K5; MAP3K8; MAP3K14(NIK); MAPK8(JNK1); MAPK9(JNK2); MAPK10(JNK3); MAPK11(p38β); MAPK12(p38γ); MAPK13(p38δ); MAPK14(p38α); NCK; NFAT1; NFAT2; NFKB1; NFKB2; NFKBIA; NRAS; PAK1; PAK2; PAK3; PAK4; PIK3C2B; PIK3C3(VPS34); PIK3CA; PIK3CB; PIK3CD; PIK3R1; PKCA; PKCB; PKCM; PKCQ; PLCY1; PRF1(퍼포린); PTEN; RAC1; RAF1; RELA; SDF1; SHP2; SLP76; SOS; SRC; TBK1; TCRA; TEC; TRAF6; VAV1; VAV2; 및/또는 ZAP70일 수 있다.
c) ABD가 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특성을 표적화함
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특성을 표적화한다. 일부 구현예에서, ABD는 자가면역 또는 염증성 장애와 관련된 항원에 결합한다. 일부 경우에, 항원은 자가면역 또는 염증성 장애와 관련된 세포에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 자가면역 또는 염증성 장애는 만성 이식편-대-숙주병(GVHD), 루푸스, 관절염, 면역 복합체 사구체신염, 굿파스쳐, 포도막염, 간염, 전신 경화증 또는 피부경화증, I형 당뇨병, 다발성 경화증, 저온 응집소 질환, 심상성 천포창, 그레이브스병, 자가면역 용혈성 빈혈, 혈우병 A, 원발성 쇼그렌 증후군, 혈전성 혈소판감소증 자반병, 시신경 척수염, 에반 증후군, IgM 매개 신경병증, 한랭글로불린혈증, 피부근염, 특발성 혈소판감소증, 강직성 척추염, 수포성 유천포창, 후천성 혈관부종, 만성 두드러기, 항인지질 탈수초성 다발신경병증, 및 자가면역 혈소판감소증 또는 호중구감소증 또는 순수 적혈구 무형성증으로부터 선택되는 반면, 동종면역 질환의 예시적인 비제한적 예는 조혈 또는 고형 장기 이식, 수혈, 태아 동종감작을 동반한 임신, 신생아 동종면역 혈소판감소증, 신생아의 용혈성 질환, 효소 또는 단백질 대체 치료법, 혈액 제품 및/또는 유전자 치료법으로 치료되는 선천성 또는 후천성 결핍 장애의 대체로 일어날 수 있는 것과 같은 외래 항원에 대한 감작으로 인한 동종감작(예를 들어, Blazar et al., 2015, Am. J. Transplant, 15(4):931-41 참고) 및/또는 이종감작을 포함한다. 일부 경우에 동종감작은 수신 대상체 또는 임신 대상체의 면역계가 비-자가 항원으로 간주하는 인간 백혈구 항원에 대한 면역 반응(예를 들어 순환 항체)의 발생을 지칭한다. 일부 구현예에서, 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특성은 세포 표면 수용체, 이온 채널-연결 수용체, 효소-연결 수용체, G 단백질-커플링 수용체, 수용체 티로신 키나제, 티로신 키나제 관련 수용체, 수용체 유사 티로신 포스파타제, 수용체 세린/트레오닌 키나제, 수용체 구아닐릴 사이클라제 및/또는 히스티딘 키나제 관련 수용체로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 B 세포, 형질 세포 또는 형질모세포 상에서 발현되는 리간드에 결합한다. 일부 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD27, CD38, CD45R, CD138, CD319, BCMA, CD28, TNF, 인터페론 수용체, GM-CSF, ZAP-70, LFA-1, CD3 감마, CD5 또는 CD2에 결합한다. 그 내용이 본원에 참조로 포함되는, US 2003/0077249; WO 2017/058753; WO 2017/058850을 참고한다.
d) ABD가 노화 세포의 항원 특성을 표적화함
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 노화 세포의 항원 특성, 예를 들어, 유로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)를 표적화한다. 일부 구현예에서, ABD는 노화 세포와 관련된 항원에 결합한다. 일부 경우에, 항원은 노화 세포에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, CAR은 노화 세포의 비정상적 축적을 특징으로 하는 장애, 예를 들어 간 및 폐 섬유증, 죽상경화증, 당뇨병 및 골관절염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
e) ABD가 전염성 질환의 항원 특성을 표적화함
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 감염성 질환의 항원 특성을 표적화한다. 일부 구현예에서, ABD는 감염성 질환과 관련된 항원에 결합한다. 일부 경우에, 항원은 전염성 질환에 의해 영향받는 세포에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 HIV, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 8(HHV-8, 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스(KSHV)), 인간 T-림프영양 바이러스-1(HTLV-1), 메르켈 세포 폴리오마바이러스(MCV), 유인원 바이러스 40(SV40), 엡스타인-바 바이러스, CMV, 인간 유두종바이러스로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 감염성 질환의 항원 특성은 세포 표면 수용체, 이온 채널-연결 수용체, 효소-연결 수용체, G 단백질-커플링 수용체, 수용체 티로신 키나제, 티로신 키나제 관련 수용체, 수용체-유사 수용체 티로신 포스파타제, 수용체 세린/트레오닌 키나제, 수용체 구아닐릴 사이클라제, 히스티딘 키나제 관련 수용체, HIV Env, gpl20 또는 HIV-1 Env 상의 CD4-유도 에피토프로부터 선택된다.
f) ABD가 세포의 세포 표면 항원에 결합함
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 세포의 세포 표면 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 세포 표면 항원은 특정 또는 특정한 세포 유형의 특성이다(예를 들어, 이에 의해 발현됨). 일부 구현예에서, 세포 표면 항원은 하나 초과 유형의 세포의 특성이다.
일부 구현예에서, CAR 항원 결합 도메인은 T 세포 상의 세포 표면 항원과 같은 T 세포에 특징적인 세포 표면 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, T 세포의 항원 특성은 T 세포에 특징적인 세포 표면 수용체, 막 수송 단백질(예를 들어 이온 채널 단백질, 기공 형성 단백질과 같은, 예를 들어, 능동 또는 수동 수송 단백질 등), 막횡단 수용체, 막 효소, 및/또는 세포 부착 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포의 항원 특성은 G 단백질-커플링 수용체, 수용체 티로신 키나제, 티로신 키나제 관련 수용체, 수용체-유사 티로신 포스파타제, 수용체 세린/트레오닌 키나제, 수용체 구아닐릴 사이클라제, 및/또는 히스티딘 키나제 관련 수용체일 수 있다.
일부 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체에 결합한다. 일부 구현예에서, T 세포 수용체는 AKT1; AKT2; AKT3; ATF2; BCL10; CALM1; CD3D(CD3δ); CD3E(CD3ε); CD3G(CD3γ); CD4; CD8; CD28; CD45; CD80(B7-1); CD86(B7-2); CD247(CD3ζ); CTLA4(CD152); ELK1; ERK1(MAPK3); ERK2; FOS; FYN; GRAP2(GADS); GRB2; HLA-DRA; HLA-DRB1; HLA-DRB3; HLA-DRB4; HLA-DRB5; HRAS; IKBKA(CHUK); IKBKB; IKBKE; IKBKG(NEMO); IL2; ITPR1; ITK; JUN; KRAS2; LAT; LCK; MAP2K1(MEK1); MAP2K2(MEK2); MAP2K3(MKK3); MAP2K4(MKK4); MAP2K6(MKK6); MAP2K7(MKK7); MAP3K1(MEKK1); MAP3K3; MAP3K4; MAP3K5; MAP3K8; MAP3K14(NIK); MAPK8(JNK1); MAPK9(JNK2); MAPK10(JNK3); MAPK11(p38β); MAPK12(p38γ); MAPK13(p38δ); MAPK14(p38α); NCK; NFAT1; NFAT2; NFKB1; NFKB2; NFKBIA; NRAS; PAK1; PAK2; PAK3; PAK4; PIK3C2B; PIK3C3(VPS34); PIK3CA; PIK3CB; PIK3CD; PIK3R1; PKCA; PKCB; PKCM; PKCQ; PLCY1; PRF1(퍼포린); PTEN; RAC1; RAF1; RELA; SDF1; SHP2; SLP76; SOS; SRC; TBK1; TCRA; TEC; TRAF6; VAV1; VAV2; 또는 ZAP70일 수 있다.
g) 막횡단 도메인
일부 구현예에서, CAR-막횡단 도메인은 적어도 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33. CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 또는 이의 기능적 변이체의 막횡단 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 적어도 CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD37, CD80, CD86, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS, 및/또는 FGFR2B, 및/ 또는 이의 기능적 변이체의 막횡단 영역(들)을 포함한다.
h) 신호전달 도메인 또는 복수의 신호전달 도메인
일부 구현예에서, 본원에 설명된 CAR은 B7-1/CD80; B7-2/CD86; B7-H1/PD-L1; B7-H2; B7-H3; B7-H4; B7-H6; B7-H7; BTLA/CD272; CD28; CTLA-4; Gi24/VISTA/B7-H5; ICOS/CD278; PD1; PD-L2/B7-DC; PDCD6); 4-1BB/TNFSF9/CD137; 4-1BB 리간드/TNFSF9; BAFF/BLyS/TNFSF13B; BAFF R/TNFRSF13C; CD27/TNFRSF7; CD27 리간드/TNFSF7; CD30/TNFRSF8; CD30 리간드/TNFSF8; CD40/TNFRSF5; CD40/TNFSF5; CD40 리간드/TNFSF5; DR3/TNFRSF25; GITR/TNFRSF18; GITR 리간드/TNFSF18; HVEM/TNFRSF14; LIGHT/TNFSF14; 림포톡신-알파/TNF-베타; OX40/TNFRSF4; OX40 리간드/TNFSF4; RELT/TNFRSF19L; TACI/TNFRSF13B; TL1A/TNFSF15; TNF-알파; TNFRII/TNFRSF1B); 2B4/CD244/SLAMF4; BLAME/SLAMF8; CD2; CD2F-10/SLAMF9; CD48/SLAMF2; CD58/LFA-3; CD84/SLAMF5; CD229/SLAMF3; CRACC/SLAMF7; NTB-A/SLAMF6; SLAM/CD150); CD2; CD7; CD53; CD82/Kai-1; CD90/Thy1; CD96; CD160; CD200; CD300a/LMIR1; HLA 클래스 I; HLA-DR; Ikaros; 인테그린 알파 4/CD49d; 인테그린 알파 4 베타 1; 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1; LAG-3; TCL1A; TCL1B; CRTAM; DAP12; Dectin-1/CLEC7A; DPPIV/CD26; EphB6; TIM-1/KIM-1/HAVCR; TIM-4; TSLP; TSLP R; 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1); NKG2C, CD3 제타 도메인, 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), CD27, CD28, 4-1BB, CD134/OX40, CD30, CD40, PD1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, 및/또는 이의 기능적 단편 중 하나 이상으로부터 선택된 하나의 또는 적어도 하나의 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 신호전달 도메인은 CD3 제타 도메인 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 신호전달 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 신호전달 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 신호전달 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 전이유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 2개의 신호전달 도메인은 CD3 제타 도메인 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 적어도 2개의 신호전달 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 신호전달 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 신호전달 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 전이유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 3개의 신호전달 도메인은 CD3 제타 도메인 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 적어도 3개의 신호전달 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 적어도 3개의 신호전달 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 3개의 신호전달 도메인은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 전이유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 3개의 신호전달 도메인은 CD8α 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 CD3 제타 도메인 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체, 및/또는 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 전이유전자를 포함한다.
i) CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인
일부 구현예에서, 1세대, 2세대, 3세대 또는 4세대 CAR은 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 표적 세포에 대해 내인성 또는 외인성이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 친염증성 사이토카인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 IL-1, IL-2, IL-9, IL-12, IL-18, TNF 또는 IFN-감마 또는 이의 기능적 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인은 전사 인자 또는 이의 기능적 도메인 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인은 전사 인자 또는 이의 기능적 도메인 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 전사 인자 또는 이의 기능적 도메인 또는 단편은 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT), NF-kB, 또는 이의 기능적 도메인 또는 단편이거나 이를 포함한다. 예를 들어 문헌(Zhang. C. et al., Engineering CAR-T cells. Biomarker Research. 5:22 (2017); WO 2016126608; Sha, H. et al. Chimaeric antigen receptor T-cell therapy for tumour immunotherapy. Bioscience Reports Jan 27, 2017, 37 (1))을 참고한다.
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 스페이서 또는 힌지를 추가로 포함하고, 예를 들어 스페이서는 항원 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이의 제1 스페이서이다. 일부 구현예에서, 제1 스페이서는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 변이체 또는 변형된 버전의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 막횡단 도메인과 신호전달 도메인 사이의 제2 스페이서이다. 일부 구현예에서, 제2 스페이서는 올리고펩티드이며, 예를 들어 올리고펩티드는 글리신-세린 이중체와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 글리신 및 세린 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 2개 이상의 스페이서, 예를 들어 항원 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이의 스페이서 및 막횡단 도메인과 신호전달 도메인 사이의 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 CD28 힌지, CD8a 힌지 또는 IgG4 힌지이다.
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 링커를 추가로 포함한다. scFv의 형식은 일반적으로 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH 배향으로 가요성 펩티드 서열 또는 "링커"에 의해 연결된 두 개의 가변 도메인이다. 명세서의 관점에서 당업자에게 알려진 임의의 적합한 링커가 CAR에서 사용될 수 있다. 적합한 링커의 예는 GS 기반 링커 서열 및 Whitlow 링커 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열 번호 14)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 링커는 GS 또는 gly-ser 링커이다. 예시적인 gly-ser 폴리펩티드 링커는 아미노산 서열 Ser(Gly4Ser)n뿐만 아니라 (Gly4Ser)n 및/또는 (Gly4Ser3)n을 포함한다. 일부 구현예에서, n=1이다. 일부 구현예에서, n=2이다. 일부 구현예에서, n=3, 즉 Ser(Gly4Ser)3이다. 일부 구현예에서, n=4, 즉 Ser(Gly4Ser)4이다. 일부 구현예에서, n=5이다. 일부 구현예에서, n=6이다. 일부 구현예에서, n=7이다. 일부 구현예에서, n=8이다. 일부 구현예에서, n=9이다. 일부 구현예에서, n=10이다. 다른 예시적인 gly-ser 폴리펩티드 링커는 아미노산 서열 Ser(Gly4Ser)n을 포함한다. 일부 구현예에서, n=1이다. 일부 구현예에서, n=2이다. 일부 구현예에서, n=3이다. 또 다른 구현예에서, n=4이다. 일부 구현예에서, n=5이다. 일부 구현예에서, n=6이다. 또 다른 예시적인 gly-ser 폴리펩티드 링커는 (Gly4Ser)n을 포함한다. 일부 구현예에서, n=1이다. 일부 구현예에서, n=2이다. 일부 구현예에서, n=3이다. 일부 구현예에서, n=4이다. 일부 구현예에서, n=5이다. 일부 구현예에서, n=6이다. 또 다른 예시적인 gly-ser 폴리펩티드 링커는 (Gly3Ser)n을 포함한다. 일부 구현예에서, n=1이다. 일부 구현예에서, n=2이다. 일부 구현예에서, n=3이다. 일부 구현예에서, n=4이다. 또 다른 구현예에서, n=5이다. 또 다른 구현예에서, n=6이다. 또 다른 예시적인 gly-ser 폴리펩티드 링커는 (Gly4Ser3)n을 포함한다. 일부 구현예에서, n=1이다. 일부 구현예에서, n=2이다. 일부 구현예에서, n=3이다. 일부 구현예에서, n=4이다. 일부 구현예에서, n=5이다. 일부 구현예에서, n=6이다. 또 다른 예시적인 gly-ser 폴리펩티드 링커는 (Gly3Ser)n을 포함한다. 일부 구현예에서, n=1이다. 일부 구현예에서, n=2이다. 일부 구현예에서, n=3이다. 일부 구현예에서, n=4이다. 또 다른 구현예에서, n=5이다. 또 다른 구현예에서, n=6이다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 세포 중 임의의 하나는 CAR 또는 1세대 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 1세대 CAR은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 T 세포 활성화 동안 하류 신호전달을 매개한다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 세포 중 임의의 하나는 CAR 또는 2세대 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 2세대 CAR은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 2개의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 T 세포 활성화 동안 하류 신호전달을 매개한다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 공동자극 도메인이다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생성, CAR-T 세포 증식 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 세포 중 임의의 하나는 CAR 또는 3세대 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 3세대 CAR은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 3개의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 T 세포 활성화 동안 하류 신호전달을 매개한다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 공동자극 도메인이다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생성, CAR-T 세포 증식, 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 3세대 CAR은 적어도 2개의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 공동자극 도메인은 동일하지 않다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 세포 중 임의의 하나는 CAR 또는 4세대 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 4세대 CAR은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 적어도 2, 3 또는 4개의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 T 세포 활성화 동안 하류 신호전달을 매개한다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 공동자극 도메인이다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생성, CAR-T 세포 증식, 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다.
j) 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 ABD
일부 구현예에서, CAR 항원 결합 도메인은 항체 또는 그의 항원 결합 부분이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 항원 결합 도메인은 scFv 또는 Fab이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 항원 결합 도메인은 T-세포 알파 사슬 항체의 scFv 또는 Fab 단편; T 세포 β 사슬 항체; T 세포 γ 사슬 항체; T 세포 δ 사슬 항체; CCR7 항체; CD3 항체; CD4 항체; CD5 항체; CD7 항체; CD8 항체; CD11b 항체; CD11c 항체; CD16 항체; CD19 항체; CD20 항체; CD21 항체; CD22 항체; CD25 항체; CD28 항체; CD34 항체; CD35 항체; CD40 항체; CD45RA 항체; CD45RO 항체; CD52 항체; CD56 항체; CD62L 항체; CD68 항체; CD80 항체; CD95 항체; CD117 항체; CD127 항체; CD133 항체; CD137(4-1BB) 항체; CD163 항체; F4/80 항체; IL-4Ra 항체; Sca-1 항체; CTLA-4 항체; GITR 항체 GARP 항체; LAP 항체; 그랜자임 B 항체; LFA-1 항체; MR1 항체; uPAR 항체; 또는 트랜스페린 수용체 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 공동자극 도메인인 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 제2 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 적어도 2개의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 적어도 3개의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD27, CD28, 4-1BB, CD134/OX40, CD30, CD40, PD1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 중 하나 이상으로부터 선택된 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR이 2개 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 경우, 2개의 공동자극 도메인은 상이하다. 일부 구현예에서, CAR이 2개 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 경우, 2개의 공동자극 도메인은 동일하다.
본원에 설명된 CAR에 더하여, 다양한 CAR 및 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 당분야에 알려져 있고 본원에 설명된 바와 같이 생체내 및 시험관내 표적 세포의 퓨소좀(fusosomal) 전달 및 재프로그래밍에 적합할 것이다. 예를 들어 그 개시가 본원에 참조로 포함된 문헌(WO2013040557; WO2012079000; WO2016030414; Smith T, et al., Nature Nanotechnology. 2017. DOI: 10.1038/NNANO.2017.57)을 참고한다.
3. 만능 줄기 세포로부터 유래된 치료 세포
면역 인식을 회피하는 만능 줄기 세포로부터 유래된 세포를 포함하는 저면역원성 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 환자 또는 대상체(예를 들어, 투여 시 수신체)에서 면역 반응을 활성화하지 않는다. 저면역원성 세포 집단을 치료를 필요로 하는 수신 대상체에 반복 투약하는 단계를 포함하는 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내도록 변형된다. 다른 구현예에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내도록 변형된다. 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 I 및 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내도록 변형된다. 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 I 및/또는 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내고 증가된 CD47 발현을 나타내도록 변형된다. 일부 경우에, 세포는 관용원성 인자를 암호화하는 하나 이상의 전이유전자을 보유함으로써 CD47을 과발현한다. 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포는 MHC 클래스 I 및/또는 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내고 증가된 관용원성 인자 발현을 나타내도록 변형된다. 일부 경우에, 세포는 하나 이상의 CD24 전이유전자를 보유함으로써 CD24를 과발현한다. 경우에 따라 세포는 하나 이상의 DUX4 전이유전자를 보유함으로써 DUX4를 과발현한다. 이러한 만능 줄기 세포는 저면역원성 만능 세포이다. 이러한 분화된 세포는 저면역원성 세포이다. 분화된 세포의 예는 심장 세포, 심장 전구 세포, 신경 세포, 아교 전구 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포, NK 세포 및/또는 CAR-NK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 설명된 임의의 만능 줄기 세포는 유기체 및 조직의 임의의 세포로 분화될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 MHC 클래스 I 및/또는 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 경우에, MHC 클래스 I 및/또는 II 인간 백혈구 항원의 발현은 동일한 세포 유형의 변형되지 않은 세포 또는 야생형 세포와 비교하여 감소된다. 일부 구현예에서, 세포는 증가된 CD47 발현을 나타낸다. 일부 경우에, 동일한 세포 유형의 변형되지 않은 세포 또는 야생형 세포와 비교하여 본원에 설명된 세포에서 CD47의 발현이 증가된다. MHC 클래스 I 및/또는 II 인간 백혈구 항원의 수준을 감소시키고 CD47 및 하나 이상의 관용원성 인자의 발현을 증가시키는 방법이 본원에 설명된다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 방법에서 사용되는 세포는 환자(예를 들어, 수신 대상체)에 투여될 때 면역 인식 및 반응을 회피한다. 세포는 시험관내 및 생체내 면역 세포에 의한 사멸을 회피할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 대식세포 및 NK 세포에 의한 사멸을 회피한다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포 또는 대상체의 면역계에 의해 무시된다. 즉, 본원에 설명된 방법에 따라 투여된 세포는 면역계의 면역 세포에 의해 검출 불가능하다. 일부 구현예에서, 세포는 클로킹되어(cloaked) 면역 거부를 피한다.
만능 줄기 세포 및 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화된 임의의 세포가 면역 인식을 회피하는지 여부를 결정하는 방법은 IFN-γ Elispot 검정, 미세아교세포 사멸 검정, 세포 생착 동물 모델, 사이토카인 방출 검정, ELISA, 생물발광 이미징 또는 크롬 방출 검정 또는 Xcelligence 분석을 사용하는 사멸 검정, 혼합 림프구 반응, 면역형광 분석 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 개략된 치료 세포는 암, 유전 장애, 만성 감염성 질환, 자가면역 장애, 신경학적 장애 등과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 장애를 치료하는 데 유용하다.
4. 변형된 세포의 예시적 구현예
일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47의 증가된 발현 및 MHC 클래스 I 복합체의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47의 증가된 발현 및 MHC 클래스 II 복합체의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47의 증가된 발현 및 MHC 클래스 II 및 MHC 클래스 II 복합체의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다.
일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47의 증가된 발현 및 B2M의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47의 증가된 발현 및 CIITA의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47의 증가된 발현 및 NLRC5의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47의 증가된 발현 그리고 B2M 및 CIITA 중 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47의 증가된 발현 그리고 B2M 및 NLRC5 중 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47의 증가된 발현 그리고 CIITA 및 NLRC5 중 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47의 증가된 발현 그리고 B2M, CIITA 및 NLRC5 중 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 본원에 설명된 임의의 세포는 또한 DUX4, CD24, CD27, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, IL-39, FasL, CCL21, CCL22, Mfge8 및 Serpinb9를 포함하지만 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자의 증가된 발현을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47 및 적어도 하나의 다른 관용원성 인자의 증가된 발현 및 MHC 클래스 I 복합체의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47 및 적어도 하나의 다른 관용원성 인자의 증가된 발현 및 MHC 클래스 II 복합체의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47 및 적어도 하나의 다른 관용원성 인자의 증가된 발현 및 MHC 클래스 II 및 MHC 클래스 II 복합체의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47 및 적어도 하나의 다른 관용원성 인자의 증가된 발현 및 B2M의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47 및 적어도 하나의 다른 관용원성 인자의 증가된 발현 및 CIITA의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47 및 적어도 하나의 다른 관용원성 인자의 증가된 발현 및 NLRC5의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47 및 적어도 하나의 다른 관용원성 인자의 증가된 발현 그리고 B2M 및 CIITA 중 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47 및 적어도 하나의 다른 관용원성 인자의 증가된 발현 그리고 B2M 및 NLRC5의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47 및 적어도 하나의 다른 관용원성 인자의 증가된 발현 그리고 CIITA 및 NLRC5 중 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 및 이의 집단은 CD47 및 적어도 하나의 다른 관용원성 인자의 증가된 발현 그리고 B2M, CIITA 및 NLRC5 중 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 관용원성 인자는 DUX4, CD24, CD27, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, IL-39, FasL, CCL21, CCL22, Mfge8 및 Serpinb9를 포함하지만 이에 제한되지 않는 군으로부터의 임의의 것을 포함한다.
당업자는 유전자, 단백질 또는 분자의 증가된 또는 감소된 발현과 같은 발현 수준이 필적하는 세포와 비교되거나 참조될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, CD47의 증가된 발현을 갖는 조작된 줄기 세포는 변형되지 않은 줄기 세포와 비교하여 더 높은 수준의 CD47 단백질을 갖는 변형된 줄기 세포를 지칭한다.
한 구현예에서, 외인성 CD47 폴리펩티드를 발현하고 하나 이상의 MHC 클래스 I 복합체 단백질, 하나 이상의 MHC 클래스 II 복합체 단백질, 또는 MHC 클래스 I 및 클래스 II 복합체 단백질의 임의의 조합의 감소된 발현을 갖는 세포(예를 들어, 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 세포, CAR-T 세포, 및/또는 CAR-NK 세포)가 본원에 제공된다. 또 다른 구현예에서, 세포는 외인성 CD47 폴리펩티드를 발현하고 감소된 수준의 B2M 및 CIITA 폴리펩티드를 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 외인성 CD47 폴리펩티드를 발현하고 B2M 및 CIITA 유전자의 유전적 변형을 보유한다. 일부 경우에, 유전적 변형은 B2M 및 CIITA 유전자를 불활성화한다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 세포, CAR-T 세포 및/또는 CAR-NK 세포)는 B2M 및 CIITA 유전자를 불활성화하는 유전적 변형을 보유하고 CD47 및 DUX4, CD47 및 CD24, CD47 및 CD27, CD47 및 CD46, CD47 및 CD55, CD47 및 CD59, CD47 및 CD200, CD47 및 HLA-C, CD47 및 HLA-E, CD47 및 HLA-E 중쇄, CD47 및 HLA-G, CD47 및 PD-L1, CD47 및 IDO1, CD47 및 CTLA4-Ig, CD47 및 C1-억제제, CD47 및 IL-10, CD47 및 IL-35, CD47 및 IL-39, CD47 및 FasL, CD47 및 CCL21, CD47 및 CCL22, CD47 및 Mfge8, CD47 및 Serpinb9, 및 이의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 복수의 외인성 폴리펩티드를 발현한다. 일부 경우에, 이러한 세포는 또한 CD142 유전자를 불활성화하는 유전적 변형을 보유한다.
C. CD47
일부 구현예에서, 본 개시는 관용원성 인자(예를 들어, 면역조절 폴리펩티드) CD47을 발현하도록 변형된 세포 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 CD47을 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 외인성 CD47을 발현한다. 일부 경우에, 세포는 인간 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 상동성 유도 복구를 사용하여 CD47을 암호화하는 통합된 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 유전적으로 변형된다.
CD47은 백혈구 표면 항원이며 세포 부착 및 인테그린 조절에 역할을 한다. 이는 세포의 표면 상에서 발현되며 순환 대식세포에 세포를 먹지 말라는 신호를 보낸다.
일부 구현예에서, 본원에 개략된 세포는 NCBI Ref. 서열 번호 NP_001768.1 및 NP_942088.1로 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)을 갖는 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개략된 세포는 NCBI Ref. 서열 번호 NP_001768.1 및 NP_942088.1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 NCBI Ref. 번호 NM_001777.3 및 NM_198793.2에 제시된 서열과 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)을 갖는 CD47에 대한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 NCBI Ref. 서열 번호 NM_001777.3 및 NM_198793.2에 제시된 바와 같은 CD47에 대한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD47 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 서열이다. 일부 구현예에서, CD47 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인간 코돈 최적화된 서열이다.
일부 구현예에서, 세포는 NCBI Ref. 서열 번호 NP_001768.1 및 NP_942088.1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개략된 세포는 NCBI Ref. 서열 번호 NP_001768.1 및 NP_942088.1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다.
신호 서열이 있는 및 신호 서열이 없는 인간 CD47의 예시적인 아미노산 서열이 표 1에 제공된다.
일부 구현예에서, 세포는 서열 번호 12의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 서열 번호 12의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 서열 번호 13의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)을 갖는 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 서열 번호 13의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)을 갖는 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 특정 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다.
일부 구현예에서, 적합한 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템 또는 본원에 설명된 임의의 유전자 편집 시스템)이 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌에 CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 용이하게 하기 위해 사용된다. 일부 경우에, CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3(CD142로도 알려짐), MICA, MICB, LRP1(CD91로도 알려짐), HMGB1, ABO, RHD, FUT1, PDGFRa, OLIG2, GFAP 또는 KDM5D 유전자 유전자좌와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공된 표 4에 설명된 유전자 유전자좌 중 임의의 하나에 삽입된다. 특정 구현예에서, CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
또 다른 구현예에서, CD47 단백질 발현은 CD47 단백질에 대한 항체로 탐침분석된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 또 다른 구현예에서, 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)이 외인성 CD47 mRNA의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
D. CD24
일부 구현예에서, 본 개시는 관용원성 인자(예를 들어, 면역조절 폴리펩티드) CD24를 발현하도록 변형된 세포 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 CD24를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 외인성 CD24를 발현한다. 일부 경우에, 세포는 인간 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 상동성 유도 복구를 사용하여 CD24를 암호화하는 통합된 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 유전적으로 변형된다.
열 안정성 항원 또는 소세포 폐암 클러스터 4 항원으로도 지칭되는 CD24는 글리코실화된 글리코실포스파티딜이노시톨-고정 표면 단백질이다(Pirruccello et al., J Immunol., 1986, 136, 3779-3784; Chen et al., Glycobiology, 2017, 57, 800-806). 이는 선천성 면역 세포 상에서 Siglec-10에 결합한다. 최근 Siglec-10을 통해 CD24가 선천성 면역 체크포인트로 작용하는 것으로 나타났다(Barkal et al., Nature, 2019, 572, 392-396).
일부 구현예에서, 본원에 개략된 세포는 NCBI Ref. 번호 NP_001278666.1, NP_001278667.1, NP_001278668.1, 및 NP_037362.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)을 갖는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개략된 세포는 NCBI Ref. 번호 NP_001278666.1, NP_001278667.1, NP_001278668.1, 및 NP_037362.1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 NCBI Ref. 번호 NM_00129737.1, NM_00129738.1, NM_001291739.1, 및 NM_013230.3에 제시된 서열과 적어도 85% 서열 동일성(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 NCBI Ref. 번호 NM_00129737.1, NM_00129738.1, NM_001291739.1, 및 NM_013230.3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, CD24 단백질 발현은 CD24 단백질에 대한 항체로 탐침분석된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 또 다른 구현예에서, 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)이 외인성 CD24 mRNA의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 적합한 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템 또는 본원에 설명된 임의의 유전자 편집 시스템)이 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌에 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 용이하게 하기 위해 사용된다. 일부 경우에, CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3(CD142로도 알려짐), MICA, MICB, LRP1(CD91로도 알려짐), HMGB1, ABO, RHD, FUT1, PDGFRa, OLIG2, GFAP 또는 KDM5D 유전자 유전자좌와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공된 표 4에 표시된 유전자 유전자좌 중 임의의 하나에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
E. DUX4
일부 구현예에서, 본 개시는 관용원성 또는 DUX4와 같은 면역억제 인자의 발현을 증가시키도록 변형된 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 세포 또는 CAR-T 세포) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 DUX4의 증가된 발현을 제공하기 위해 세포의 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시는 외인성으로 발현된 DUX4 단백질을 포함하는 세포 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 상동성 유도 복구를 사용하여 DUX4를 암호화하는 통합된 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서, DUX4의 증가된 발현은 하기 MHC I 분자 - HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 중 하나 이상의 발현을 억제, 감소 또는 제거한다.
DUX4는 배아 조직 및 유도된 만능 줄기 세포에서 활성이고 정상적이고 건강한 체세포 조직에서는 침묵하는 전사 인자이다(Feng et al., 2015, ELife4; De Iaco et al., 2017, Nat Genet., 49, 941-945; Hendrickson et al., 2017, Nat Genet., 49, 925-934; Snider et al., 2010, PLoS Genet., e1001181; Whiddon et al., 2017, Nat Genet.). DUX4 발현은 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 유전자 발현(예를 들어 B2M, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C의 발현)의 IFN-감마 매개 유도를 차단하는 역할을 한다. DUX4 발현은 MHC 클래스 I에 의한 억제된 항원 제시에 연루되었다(Chew et al., Developmental Cell, 2019, 50:1-14). DUX4는 절단 단계 유전자 발현(전사) 프로그램에서 전사 인자로 기능한다. 표적 유전자는 코딩 유전자, 비코딩 유전자 및 반복 요소를 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
DUX4에는 최소 2개의 이소형이 있으며, 가장 긴 이소형은 DUX4 C-말단 전사 활성화 도메인을 포함한다. 이소형은 대안적 스플라이싱에 의해 생성된다. 예를 들어, 문헌(Geng et al., 2012, Developmental Cell, 22, 38-51; Snider et al., 2010, PLoS Genet., e1001181)을 참고한다. DUX4의 활성 이소형은 그 N 말단 DNA 결합 도메인 및 그 C 말단 활성화 도메인을 포함한다. 예를 들어 문헌(Choi et al., 2016, Nucleic Acid Res., 44, 5161-5173)을 참고한다.
DUX4의 CpG 모티프 수를 줄이면 DUX4 전이유전자의 침묵화가 감소하는 것으로 나타났다(Jagannathan et al., Human Molecular Genetics, 2016, 25(20):4419-4431). Jagannathan 등의 상기 문헌에 제공된 핵산 서열은 DUX4 단백질 서열을 보존하면서 CpG 부위의 총 수를 감소시키는 하나 이상의 염기 치환을 포함하는 DUX4의 코돈 변경된 서열을 나타낸다. 핵산 서열은 Addgene, 카탈로그 번호 99281로부터 상업적으로 이용 가능하다.
특정 측면에서, 세포, 예를 들어 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 세포 또는 CAR-T 세포에 의한 DUX4의 외인성 발현을 용이하게 하기 위해 적어도 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 적합한 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템 또는 본원에 설명된 임의의 유전자 편집 시스템)이 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌에 DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 용이하게 하기 위해 사용된다. 일부 경우에 DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3(CD142로도 알려짐), MICA, MICB, LRP1(CD91로도 알려짐), HMGB1, ABO, RHD, FUT1, PDGFRa, OLIG2, GFAP 또는 KDM5D 유전자 유전자좌와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공된 표 4에 표시된 유전자 유전자좌 중 임의의 하나에 삽입된다. 특정 구현예에서, DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 DUX4 단백질 서열을 보존하면서 CpG 부위의 총 수를 감소시키기 위한 하나 이상의 염기 치환을 포함하는 DUX4의 코돈 변경된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CpG 부위의 총 수를 감소시키는 하나 이상의 염기 치환을 포함하는 DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 2020년 7월 31일에 출원된 PCT/US2020/44635의 서열 번호 1과 적어도 85%(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 PCT/US2020/44635의 서열 번호 1이다.
일부 구현예에서, DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 PCT/US2020/44635에 제공된 바와 같은 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28 및 서열 번호 29를 포함하는 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28 및 서열 번호 29를 포함하는 군으로부터 선택된 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다. 서열 번호 2-29로 제시된 아미노산 서열을 PCT/US2020/44635의 도 1a-1g에 나타난다.
일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ACN62209.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ACN62209.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 NCBI RefSeq 번호 NP_001280727.1에 제시된 서열 또는 NCBI RefSeq 번호 NP_001280727.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ACP30489.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ACP30489.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 UniProt 번호 P0CJ85.1에 제시된 서열 또는 UniProt 번호 P0CJ85.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 AUA60622.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 AUA60622.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24683.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24683.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ACN62210.1 또는 GenBank 접근 번호 ACN62210.1에 제시된 아미노산 서열에 제시된 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24706.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24706.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24685.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24685.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ACP30488.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ACP30488.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24687.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24687.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ACP30487.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ACP30487.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24717.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24717.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24690.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24690.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24689.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24689.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24692.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24692.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24693.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24693.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24712.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24712.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24691.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24691.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 UniProt 번호 P0CJ87.1에 제시된 서열 또는 UniProt 번호 P0CJ87.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24714.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24714.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24684.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24684.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24695.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24695.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 GenBank 접근 번호 ADK24699.1에 제시된 서열 또는 GenBank 접근 번호 ADK24699.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 NCBI RefSeq No. NP_001768.1에 제시된 서열 또는 NCBI RefSeq No. NP_001768에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 NCBI RefSeq No. NP_942088.1에 제시된 서열 또는 NCBI RefSeq No. NP_942088.1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 PCT/US2020/44635에 제공된 서열 번호 28 또는 PCT/US2020/44635에 제공된 서열 번호 28의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4 폴리펩티드는 PCT/US2020/44635에 제공된 서열 번호 29 또는 PCT/US2020/44635에 제공된 서열 번호 29의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 관용원성 인자의 발현은 발현 벡터를 사용하여 용이하게 된다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 DUX4 단백질 서열을 보존하면서 CpG 부위의 총 수를 감소시키는 하나 이상의 염기 치환을 포함하는 코돈 변경된 서열인 DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, DUX4의 코돈 변경된 서열은 PCT/US2020/44635의 서열 번호 1을 포함한다. 일부 경우에 DUX4의 코돈 변경된 서열은 PCT/US2020/44635의 서열 번호 1이다. 다른 구현예에서, 발현 벡터는 PCT/US2020/44635의 서열 번호 1을 포함하는 DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 PCT/US2020/44635의 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28 및 서열 번호 29를 포함하는 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 DUX4 폴리펩티드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 PCT/US2020/44635의 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28 및 서열 번호 29를 포함하는 군으로부터 선택된 DUX4 폴리펩티드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
DUX4 발현의 증가는 웨스턴 블롯, ELISA 검정, FACS 검정, 면역검정 등과 같은 알려진 기술을 사용하여 검정될 수 있다.
F. CIITA
특정 측면에서, 본원에 개시된 기술은 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA) 발현을 표적화하고 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)함으로써 MHC II 유전자의 발현을 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)한다. 일부 구현예에서, 조절은 유전자 편집(예를 들어 CRISPR/Cas) 시스템을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 CRISPR, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하는 녹아웃 또는 녹다운으로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 shRNA, siRNA, miRNA 및 CRISPR 간섭(CRISPRi)으로 구성된 군으로부터 선택된 RNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, CIITA 발현의 조절은 감소된 전사, 감소된 mRNA 안정성(예컨대, RNAi 메커니즘에 의한) 및 감소된 단백질 수준을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
CIITA는 LR 또는 뉴클레오티드 결합 도메인(NBD) 류신-풍부 반복(LRR) 단백질 패밀리의 구성원이며 MHC 인핸소좀과 연합하여 MHC II의 전사를 조절한다.
일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CIITA의 변이체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CIITA의 동족체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CIITA의 오르소로그이다.
일부 구현예에서, CIITA의 감소되거나 제거된 발현은 하기 MHC 클래스 II HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ 및 HLA-DR 중 하나 이상의 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 본원에 개략된 세포는 CIITA 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 CIITA 유전자를 표적화하는 유전적 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041의 별첨 1 또는 표 12의 서열 번호 5184-36352로 구성된 군으로부터 선택되며, 개시 전체가 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드(예를 들어, 키메라 항원 수용체, CD47, 또는 본원에 개시된 또 다른 관용원성 인자)를 암호화하는 외인성 핵산이 CIITA 유전자에 삽입된다.
CIITA 유전자가 불활성화되었는지 여부를 시험하기 위한 검정이 알려져 있고 본원에 설명된다. 한 구현예에서, PCR에 의한 CIITA 유전자의 생성된 유전적 변형 및 HLA-II 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 또 다른 구현예에서, CIITA 단백질 발현은 CIITA 단백질에 대한 항체로 탐침분석된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 또 다른 구현예에서, 역전사 효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)이 불활성화 유전적 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
G. B2M
특정 구현예에서, 본원에 개시된 기술은 보조 사슬 B2M의 발현을 표적화하고 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)함으로써 MHC-I 유전자의 발현을 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)한다. 일부 구현예에서, 조절은 유전자 편집(예를 들어 CRISPR/Cas) 시스템을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 CRISPR, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하는 녹아웃 또는 녹다운으로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 shRNA, siRNA, miRNA 및 CRISPR 간섭(CRISPRi)으로 구성된 군으로부터 선택된 RNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, B2M 발현의 조절은 감소된 전사, 감소된 mRNA 안정성(예를 들어, RNAi 메커니즘에 의한) 및 감소된 단백질 수준을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
B2M의 발현을 조절(예를 들어, 감소 또는 결실)함으로써, MHC-I 분자의 표면 수송이 차단되고 이러한 세포는 수신 대상체에 생착될 때 면역 관용성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어 투여 시 수신 대상체 또는 환자에서, 저면역원성으로 간주된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 B2M의 변이체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 B2M의 동족체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 B2M의 오르소로그이다.
일부 구현예에서, B2M의 감소되거나 제거된 발현은 하기 MHC I 분자 - HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 중 하나 이상의 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 본원에 개략된 저면역원성 세포는 B2M 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 B2M 유전자를 표적화하는 유전적 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, B2M 유전자를 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016/183041의 별첨 2 또는 표 15의 서열 번호 81240-85644로 구성된 군으로부터 선택되며, 개시 전체가 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드(예를 들어, 키메라 항원 수용체, CD47, 또는 본원에 개시된 또 다른 관용원성 인자)를 암호화하는 외인성 핵산이 B2M 유전자에 삽입된다.
B2M 유전자가 불활성화되었는지 여부를 시험하기 위한 검정이 알려져 있고 본원에 설명된다. 한 구현예에서, PCR에 의한 B2M 유전자의 생성된 유전적 변형 및 HLA-I 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 또 다른 구현예에서, B2M 단백질 발현은 B2M 단백질에 대한 항체로 탐침분석된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 또 다른 구현예에서, 역전사 효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)이 불활성화 유전적 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
H. NLRC5
특정 측면에서, 본원에 개시된 기술은 NLR 패밀리, 5/NOD27/CLR16.1을 함유하는 CARD 도메인(NLRC5)의 발현을 표적화하고 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)함으로써 MHC-I 유전자의 발현을 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)한다. 일부 구현예에서, 조절은 유전자 편집(예를 들어, CRISPR/Cas) 시스템시스템을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 CRISPR, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하는 녹아웃 또는 녹다운으로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 shRNA, siRNA, miRNA 및 CRISPR 간섭(CRISPRi)으로 구성된 군으로부터 선택된 RNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, NLRC5 발현의 조절은 감소된 전사, 감소된 mRNA 안정성(예를 들어, RNAi 기전을 통한) 및 감소된 단백질 수준을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
NLRC5는 MHC-I 매개 면역 반응의 조절제이며, NLRC5는 CIITA와 유사하게 IFN-γ에 의해 고도로 유도 가능하며 핵으로 전위할 수 있다. NLRC5는 MHC-I 유전자의 프로모터를 활성화하고 MHC-I뿐만 아니라 MHC-I 항원 제시에 관여하는 관련 유전자의 전사를 유도한다.
일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 NLRC5의 변이체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 NLRC5의 동족체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 NLRC5의 오르소로그이다.
일부 구현예에서, NLRC5의 감소되거나 제거된 발현은 다음 MHC I 분자 - HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 중 하나 이상의 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 본원에 개략된 세포는 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전적 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041의 별첨 3 또는 표 14의 서열 번호 36353-81239로 구성된 군으로부터 선택되며, 개시 전체가 참조로 포함된다.
NLRC5 유전자가 불활성화되었는지 여부를 시험하기 위한 검정이 알려져 있으며 본원에 설명된다. 한 구현예에서, PCR에 의한 NLRC5 유전자의 생성된 유전적 변형 및 HLA-I 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 또 다른 구현예에서, NLRC5 단백질 발현은 NLRC5 단백질에 대한 항체로 탐침분석된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 또 다른 구현예에서, 역전사 효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)이 불활성화 유전적 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
I. TRAC
많은 구현예에서, 본원에 개시된 기술은 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역의 발현을 조절 가능하게 표적화하고 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)함으로써 TRAC 유전자를 포함하는 TCR 유전자의 발현을 조절 가능하게 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)한다. 일부 구현예에서, 조절은 유전자 편집(예를 들어 CRISPR/Cas) 시스템을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 CRISPR, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하는 녹아웃 또는 녹다운으로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 shRNA, siRNA, miRNA 및 CRISPR 간섭(CRISPRi)으로 구성된 군으로부터 선택된 RNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, TRAC 발현의 조절은 감소된 전사, 감소된 mRNA 안정성(예를 들어, RNAi 메커니즘에 의한) 및 감소된 단백질 수준을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
TRAC의 발현을 조절(예를 들어, 감소 또는 결실)함으로써 TCR 분자의 표면 수송이 차단된다. 일부 구현예에서, 세포는 또한 수신 대상체에서 면역 반응을 유도하는 감소된 능력을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 기술의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 TRAC의 변이체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 TRAC의 동족체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 TRAC의 오르소로그이다.
일부 구현예에서, TRAC의 감소되거나 제거된 발현은 TCR 표면 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 만능 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 1차 T 세포, 및 1차 T 세포로부터 유래된 세포와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 세포는 TRAC 단백질을 암호화하는 유전자 유전자좌에 조절 가능한 유전자 변형을 포함한다. 즉, 세포는 TRAC 유전자좌에서 조절 가능한 유전적 변형을 포함한다. 일부 경우에, TRAC 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 Genbank No. X02592.1에 제시된다. 일부 경우에, TRAC 유전자 유전자좌는 RefSeq NG_001332.3 및 NCBI 유전자 ID No. 28755에 설명된다. 특정 경우에, TRAC의 아미노산 서열은 UniProt 번호 P01848로 표시된다. TRAC 단백질 및 유전자 유전자좌의 추가 설명은 UniProt 번호 P01848, HGNC Ref. 12029 및 OMIM Ref. 번호 186880에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개략된 저면역원성 세포는 TRAC 유전자를 표적화하는 조절 가능한 유전적 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자를 표적화하는 조절 가능한 유전적 변형은 조절 가능한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 조절 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조절 가능한 희귀 절단 엔도뉴클레아제, 및 TRAC 유전자를 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 통해 이루어진다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자를 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 US20160348073의 서열 번호 532-609 및 9102-9797로 구성된 군으로부터 선택되며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
TRAC 유전자가 불활성화되었는지 여부를 시험하기 위한 검정은 알려져 있고 본원에 설명된다. 일부 구현예에서, PCR에 의한 TRAC 유전자의 생성된 유전적 변형 및 TCR 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 또 다른 구현예에서, TRAC 단백질 발현은 TRAC 단백질에 대한 항체로 탐침분석된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 또 다른 구현예에서, 역전사 효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)이 불활성화 유전적 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에 개략된 저면역원성 세포는 TRAC 발현의 조절 가능한 녹아웃을 포함하여, 세포가 조절 가능하게 TRAC -/- 가 되도록 한다. 일부 구현예에서, 본원에 개략된 저면역원성 세포는 TRAC 유전자 유전자좌에 삽입결실을 조절 가능하게 도입하여, 세포가 조절 가능하게 TRAC 삽입결실/삽입결실 이 되도록 한다. 일부 구현예에서, 본원에 개략된 저면역원성 세포는 TRAC 발현의 조절 가능한 녹다운을 포함하여, 세포가 조절 가능하게 TRAC 녹다운 이 되도록 한다.
J. TRB
많은 구현예에서, 본원에 개시된 기술은 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역의 발현을 조절 가능하게 표적화 및 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)하여 T 세포 항원 수용체, 베타 사슬을 암호화하는 유전자(예를 들어, TRB, TRBC 또는 TCRB 유전자)를 포함하는 TCR 유전자의 발현을 조절 가능하게 조절(예를 들어 감소 또는 제거)한다. 일부 구현예에서, 조절은 유전자 편집(예를 들어 CRISPR/Cas) 시스템을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 CRISPR, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하는 녹아웃 또는 녹다운으로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 shRNA, siRNA, miRNA 및 CRISPR 간섭(CRISPRi)으로 구성된 군으로부터 선택된 RNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, TRB 발현의 조절은 감소된 전사, 감소된 mRNA 안정성(예를 들어, RNAi 메커니즘에 의한) 및 감소된 단백질 수준을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
TRB의 발현을 조절(예를 들어, 감소 또는 결실)함으로써, TCR 분자의 표면 수송이 차단된다. 일부 구현예에서, 세포는 또한 수신 대상체에서 면역 반응을 유도하는 감소된 능력을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 기술의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 TRB의 변이체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 TRB의 동족체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 TRB의 오르소로그이다.
일부 구현예에서, TRB의 감소되거나 제거된 발현은 TCR 표면 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 만능 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포로부터 분화된 T 세포, 1차 T 세포, 및 1차 T 세포로부터 유래된 세포와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 세포는 TRB 단백질을 암호화하는 유전자 유전자좌에서 조절 가능한 유전자 변형을 포함한다. 즉, 세포는 TRB 유전자 유전자좌에서 조절 가능한 유전적 변형을 포함한다. 일부 경우에, TRB 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 UniProt 번호 P0DSE2에 제시된다. 일부 경우에, TRB 유전자 유전자좌는 RefSeq. NG_001333.2 및 NCBI 유전자 ID No. 6957에 설명된다. 특정 경우에, TRB의 아미노산 서열은 UniProt 번호 P01848로 표시된다. TRB 단백질 및 유전자 유전자좌의 추가 설명은 GenBank No. L36092.2, UniProt 번호 P0DSE2 및 HGNC Ref. 번호 12155에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개략된 저면역원성 세포는 TRB 유전자를 표적화하는 조절 가능한 유전적 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, TRB 유전자를 표적화하는 조절 가능한 유전적 변형은 조절 가능한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 조절 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조절 가능한 희귀 절단 엔도뉴클레아제, 및 TRB 유전자를 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 통해 이루어진다. 일부 구현예에서, TRB 유전자를 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 US20160348073의 서열 번호 610-765 및 9798-10532로 구성된 군으로부터 선택되며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
TRB 유전자가 불활성화되었는지 여부를 시험하기 위한 검정은 알려져 있고 본원에 설명된다. 일부 구현예에서, PCR에 의한 TRB 유전자의 생성된 유전적 변형 및 TCR 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 또 다른 구현예에서, TRB 단백질 발현은 TRB 단백질에 대한 항체로 탐침분석된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 또 다른 구현예에서, 역전사 효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)이 불활성화 유전적 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에 개략된 저면역원성 세포는 TRB 발현의 조절 가능한 녹아웃을 포함하여, 세포가 조절 가능하게 TRB -/- 가 되도록 한다. 일부 구현예에서, 본원에 개략된 저면역원성 세포는 TRB 유전자 유전자좌에 삽입결실을 조절 가능하게 도입하여, 세포가 조절 가능하게 TRB 삽입결실/삽입결실 이 되도록 한다. 일부 구현예에서, 본원에 개략된 저면역원성 세포는 TRB 발현의 조절 가능한 녹다운을 포함하여, 세포가 조절 가능하게 TRB 녹다운 이 되도록 한다.
K. CD142
특정 측면에서, 본원에 개시된 기술은 조직 인자, 인자 III 및 F3으로도 알려진 CD142의 발현을 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)한다. 일부 구현예에서, 조절은 유전자 편집(예를 들어 CRISPR/Cas) 시스템을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 변형은 CRISPR, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하는 녹아웃 또는 녹다운으로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 shRNA, siRNA, miRNA 및 CRISPR 간섭(CRISPRi)으로 구성된 군으로부터 선택된 RNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, CD142 발현의 조절은 감소된 전사, 감소된 mRNA 안정성(예를 들어, RNAi 메커니즘을 통한) 및 감소된 단백질 수준을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CD142 또는 CD142의 변이체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CD142의 동족체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CD142의 오르소로그이다.
일부 구현예에서, 본원에 개략된 세포는 CD142 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 CD142 유전자를 표적화하는 유전적 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 CD142 유전자를 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산(gRNA) 서열을 포함한다. CD142를 표적화하는 gRNA 서열을 확인하는 데 유용한 방법이 아래에 설명된다.
CD142 유전자가 불활성화되었는지 여부를 시험하기 위한 검정이 알려져 있고 본원에 설명된다. 한 구현예에서, PCR에 의한 CD142 유전자의 생성된 유전적 변형 및 CD142 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 또 다른 구현예에서, CD142 단백질 발현은 CD142 단백질에 대한 항체로 탐침분석된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 또 다른 구현예에서, 역전사 효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)이 불활성화 유전적 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
인간 CD142에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC01M094530, HGNC 번호 3541, NCBI 유전자 ID 2152, NCBI RefSeq 번호 NM_001178096.1, NM_001993.4, NP_001171567.1, 및 NP_001984.1, UniProt 번호 P13726 등에 제공된다.
L. CTLA4
특정 측면에서, 본원에 개시된 기술은 CTLA4의 발현을 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)한다. 일부 구현예에서, 조절은 유전자 편집(예를 들어 CRISPR/Cas) 시스템을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 CRISPR, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하는 녹아웃 또는 녹다운으로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 shRNA, siRNA, miRNA 및 CRISPR 간섭(CRISPRi)으로 구성된 군으로부터 선택된 RNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, CTLA4 발현의 조절은 감소된 전사, 감소된 mRNA 안정성(예를 들어, RNAi 메카니즘에 의한) 및 감소된 단백질 수준을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CTLA4 또는 CTLA4의 변이체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CTLA4의 동족체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CTLA4의 오르소로그이다.
일부 구현예에서, 본원에 개략된 세포는 CTLA4 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 1차 T 세포는 CTLA4 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 포함한다. 유전적 변형은 1차 T 세포 및 CAR-T 세포를 포함하는 T 세포에서 CTLA4 폴리뉴클레오티드 및 CTLA4 폴리펩티드의 발현을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 CTLA4 유전자를 표적화하는 유전적 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 CTLA4 유전자를 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산(gRNA) 서열을 포함한다. CTLA4를 표적화하는 gRNA 서열을 확인하는 데 유용한 방법이 아래에 설명된다.
CTLA4 유전자가 불활성화되었는지 여부를 시험하기 위한 검정이 알려져 있고 본원에 설명된다. 한 구현예에서, PCR에 의한 CTLA4 유전자의 생성된 유전적 변형 및 CTLA4 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 검정일 수 있다. 다른 구현예에서, CTLA4 단백질 발현은 CTLA4 단백질에 대한 항체로 탐침분석된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 또 다른 구현예에서, 역전사 효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)이 불활성화 유전적 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
인간 CTLA4에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC02P203867, HGNC 번호 2505, NCBI 유전자 ID 1493, NCBI RefSeq 번호 NM_005214.4, NM_001037631.2, NP_001032720.1 및 NP_005205.2, UniProt 번호 P16410 등에 제공된다.
M. PD1
특정 측면에서, 본원에 개시된 기술은 PD1의 발현을 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)한다. 일부 구현예에서, 조절은 유전자 편집(예를 들어 CRISPR/Cas) 시스템을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 CRISPR, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하는 녹아웃 또는 녹다운으로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 변형은 일시적이다(예를 들어, siRNA 방법을 사용하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 조절은 shRNA, siRNA, miRNA 및 CRISPR 간섭(CRISPRi)으로 구성된 군으로부터 선택된 RNA 기반 방법을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, PD1 발현의 조절은 감소된 전사, 감소된 mRNA 안정성(예를 들어, RNAi 기전을 통한 것) 및 감소된 단백질 수준을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 PD1 또는 PD1의 변이체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 PD1의 동족체이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 PD1의 오르소로그이다.
일부 구현예에서, 본원에 개략된 세포는 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD1) 단백질 또는 PDCD1 유전자를 암호화하는 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 1차 T 세포는 PDCD1 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 포함한다. 유전적 변형은 1차 T 세포 및 CAR-T 세포를 포함하는, T 세포에서 PD1 폴리뉴클레오티드 및 PD1 폴리펩티드의 발현을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 희귀 절단 엔도뉴클레아제에 의한 PDCD1 유전자를 표적화하는 유전적 변형은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 PDCD1 유전자를 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산(gRNA) 서열을 포함한다. PD1을 표적화하는 gRNA 서열을 확인하는 데 유용한 방법이 아래에 설명된다.
PDCD1 유전자가 불활성화되었는지 여부를 시험하기 위한 검정이 알려져 있고 본원에 설명된다. 한 구현예에서, PCR에 의한 PDCD1 유전자의 생성된 유전적 변형 및 PD1 발현의 감소는 FACS 분석에 의한 분석일 수 있다. 또 다른 구현예에서, PD1 단백질 발현은 PD1 단백질에 대한 항체로 탐침분석된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 또 다른 구현예에서, 역전사 효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)이 불활성화 유전적 변형의 존재를 확인하기 위해 사용된다.
PDCD1 유전자를 포함하는 인간 PD1에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC02M241849, HGNC 번호 8760, NCBI 유전자 ID 5133, Uniprot 번호 Q15116, 및 NCBI RefSeq 번호 NM_005018.2 및 NP_005009.2에 제공된다.
N. 추가 관용원성 인자
특정 구현예에서, 하나 이상의 관용원성 인자가 게놈-편집 세포에 삽입되거나 재삽입되어 보편적 공여체 줄기 세포, 보편적 공여체 T 세포 또는 보편적인 공여체 세포와 같은 면역 특권이 있는 보편적 공여체 세포를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 저면역원성 세포는 하나 이상의 관용원성 인자를 발현하도록 추가로 변형되었다.
예시적인 관용원성 인자는 CD47, DUX4, CD24, CD27, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, IL-39, FasL, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpinb9, CD16 Fc 수용체, IL15-RF, CD16, CD52, H2-M3 및 CD35를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 관용원성 인자는 CD200, HLA-G, HLA-E, HLA-C, HLA-E 중쇄, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, IL-10, IL-35, FasL, Serpinb9, CCL21, CCL22 및 Mfge8로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 관용원성 인자는 DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 관용원성 인자는 HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 경우에, CRISPR/Cas 시스템과 같은 유전자 편집 시스템은 관용원성 인자와 같은 관용원성 인자를 세이프 하버 또는 AAVS1 유전자좌와 같은 표적 유전자좌에 삽입하는 것을 용이하게 하여 능동적으로 면역 거부를 억제하기 위해 사용된다. 일부 경우에, 관용원성 인자는 발현 벡터를 사용하여 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3(CD142로도 알려짐), MICA, MICB, LRP1(CD91로도 알려짐), HMGB1, ABO, RHD, FUT1, PDGFRa, OLIG2, GFAP 또는 KDM5D 유전자 유전자좌이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 세포 게놈이 CD47을 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 1차 세포 및/또는 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 CD47을 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 CD47의 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 본원에 참조로 포함된 WO2016183041의 표 29의 서열 번호 200784-231885로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1차 세포는 심장 세포, 심장 전구 세포, 신경 세포, 아교 전구 세포, 내피 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, T 세포, B 세포 또는 NK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도된 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시는 세포 게놈이 HLA-C를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 1차 세포 및/또는 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 HLA-C를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 HLA-C의 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 본원에 참조로 포함된 WO2016183041의 표 10의 서열 번호 3278-5183으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1차 세포는 심장 세포, 심장 전구 세포, 신경 세포, 아교 전구 세포, 내피 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, T 세포, B 세포 또는 NK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도된 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시는 세포 게놈이 HLA-E를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 1차 세포 및/또는 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 HLA-E를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 HLA-E의 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 본원에 참조로 포함된 WO2016183041의 표 19의 서열 번호 189859-193183으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1차 세포는 심장 세포, 심장 전구 세포, 신경 세포, 아교 전구 세포, 내피 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, T 세포, B 세포 또는 NK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도된 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시는 세포 게놈이 HLA-F를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 1차 세포 및/또는 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 HLA-F를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 HLA-F의 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 본원에 참조로 포함된 WO2016183041의 표 45의 서열 번호 688808-399754로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1차 세포는 심장 세포, 심장 전구 세포, 신경 세포, 아교 전구 세포, 내피 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, T 세포, B 세포 또는 NK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도된 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시는 세포 게놈이 HLA-G를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 1차 세포 및/또는 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 HLA-G를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 HLA-G의 줄기 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 본원에 참조로 포함된 WO2016183041의 표 18의 서열 번호 188372-189858로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1차 세포는 심장 세포, 심장 전구 세포, 신경 세포, 아교 전구 세포, 내피 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, T 세포, B 세포 또는 NK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도된 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시는 세포 게놈이 PD-L1을 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 1차 세포 및/또는 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 PD-L1을 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 PD-L1의 줄기 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 본원에 참조로 포함된 WO2016183041의 표 21의 서열 번호 193184-200783으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1차 세포는 심장 세포, 심장 전구 세포, 신경 세포, 아교 전구 세포, 내피 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, T 세포, B 세포 또는 NK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도된 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시는 세포 게놈이 CTLA4-Ig를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 1차 세포 및/또는 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 CTLA4-Ig를 발현 하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 CTLA4-Ig의 줄기 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 서열 목록을 포함하여 WO2016183041에 개시된 임의의 것으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 세포 게놈이 CI-억제제를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 1차 세포 및/또는 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 CI-억제제를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 줄기 세포주에 CI-억제제의 삽입을 용이하게 하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 서열 목록을 포함하여 WO2016183041에 개시된 임의의 것으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1차 세포는 심장 세포, 심장 전구 세포, 신경 세포, 아교 전구 세포, 내피 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, T 세포, B 세포 또는 NK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도된 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시는 세포 게놈이 IL-35를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 1차 세포 및/또는 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 IL-35를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 IL-35의 줄기 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 서열 목록을 포함하여 WO2016183041에 개시된 임의의 것으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1차 세포는 심장 세포, 심장 전구 세포, 신경 세포, 아교 전구 세포, 내피 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, T 세포, B 세포 또는 NK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도된 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 관용원성 인자는 발현 벡터를 사용하여 세포에서 발현된다. 예를 들어, 세포에서 CD47을 발현하기 위한 발현 벡터는 CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 발현 벡터는 유도성 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 바이러스 벡터일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 세포 게놈이 HLA-A, HLA-B, HLA-C, RFX-ANK, CIITA, NFY-A, NLRC5, B2M, RFX5, RFX-AP, HLA-G, HLA-E, NFY-B, PD-L1, NFY-C, IRF1, TAP1, GITR, 4-1BB, CD28, B7-1, CD47, B7-2, OX40, CD27, HVEM, SLAM, CD226, ICOS, LAG3, TIGIT, TIM3, CD160, BTLA, CD244, LFA-1, ST2, HLA-F, CD30, B7-H3, VISTA, TLT, PD-L2, CD58, CD2, HELIOS 및 IDO1로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 중 임의의 하나를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포(예를 들어, 1차 세포 및/또는 저면역원성 줄기 세포 및 이의 유도체) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, RFX-ANK, CIITA, NFY-A, NLRC5, B2M, RFX5, RFX-AP, HLA-G, HLA-E, NFY-B, PD-L1, NFY-C, IRF1, TAP1, GITR, 4-1BB, CD28, B7-1, CD47, B7-2, OX40, CD27, HVEM, SLAM, CD226, ICOS, LAG3, TIGIT, TIM3, CD160, BTLA, CD244, LFA-1, ST2, HLA-F, CD30, B7-H3, VISTA, TLT, PD-L2, CD58, CD2, HELIOS 및 IDO1로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 중 임의의 하나를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 선택된 폴리펩티드의 줄기 세포주로의 삽입을 용이하게 하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산이 WO2016183041의 별첨 1-47 및 서열 목록에 개시된 임의의 것으로부터 선택되며, 그 개시가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 적합한 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템 또는 본원에 설명된 임의의 유전자 편집 시스템)이 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌에 관용원성 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 용이하게 하기 위해 사용된다. 일부 경우에, 관용원성 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, SHS231, F3(CD142로도 알려짐), MICA, MICB, LRP1(CD91로도 알려짐), HMGB1, ABO, RHD, FUT1, PDGFRa, OLIG2, GFAP 또는 KDM5D 유전자 유전자좌와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 관용원성 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 관용원성 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공된 표 4에 표시된 유전자 유전자좌 중 임의의 하나에 삽입된다. 특정 구현예에서, 관용원성 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
O. 유전적 변형 방법
일부 구현예에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산의 형태로 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포에 도입된다. 핵산을 세포에 도입하는 공정은 임의의 적합한 기술에 의해 달성될 수 있다. 적합한 기술은 인산칼슘 또는 지질-매개 형질감염, 전기천공 및 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 또는 감염을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 본원에 설명된 바와 같이 변형된 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 본원에 설명된 바와 같은 변형된 mRNA(예를 들어, 합성, 변형된 mRNA)를 포함한다.
본원에 설명된 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 본 개시의 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas)을 이용하는 당업자가 이용 가능한 임의의 방식으로 변경될 수 있다. 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경할 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 CRISPR-Cas 시스템은 다양한 Cas 단백질을 사용할 수 있다(Haft et al. PLoS Comput Biol. 2005; 1(6)e60). CRISPR/Cas 시스템이 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하도록 허용하는 이러한 Cas 단백질의 분자 기구는 RNA 결합 단백질, 엔도- 및 엑소-뉴클레아제, 헬리카제 및 폴리머라제를 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR I형 시스템이다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR II형 시스템이다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR V형 시스템이다.
본원에 개시된 유전자 편집(예를 들어, CRISPR/Cas) 시스템은 세포에서 임의의 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하기 위해 사용될 수 있다. 당업자는 임의의 특정 세포에서 변경될 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 게놈 서열의 발현이 장애와 관련되거나 다르게는 세포로의 병원체의 유입을 용이하게 하는 임의의 게놈 서열에 상응할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 세포에서 변경하기 위한 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 질환 관련 단일 폴리뉴클레오티드 다형성을 함유하는 게놈 서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 이러한 예에서, 본원에 개시된 CRISPR/Cas 시스템은 이를 야생형 대립유전자로 대체함으로써 세포에서 질환 관련 SNP를 교정하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 병원체의 세포로의 진입 또는 증식을 담당하는 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 유전자의 기능을 손상시켜 병원체가 세포에 유입되거나 세포 내에서 증식하는 것을 방지하기 위한 결실 또는 삽입에 적합한 표적일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 게놈 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 포유동물 게놈 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 척추동물 게놈 서열이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 CRISPR/Cas 시스템은 Cas 단백질 및 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프로 Cas 단백질을 유도하고 혼성화할 수 있는 적어도 1개 내지 2개의 리보핵산을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "단백질" 및 "폴리펩티드"는 펩티드 결합(즉, 아미노산의 중합체)에 의해 연결된 일련의 아미노산 잔기를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며 변형된 아미노산(예를 들어, 인산화, 당화, 글리코실화 등) 및 아미노산 유사체를 포함한다. 예시적인 폴리펩티드 또는 단백질은 유전자 산물, 자연 발생 단백질, 동족체, 파라로그, 단편 및 다른 동등물, 변이체 및 전술한 것들의 유사체를 포함한다.
일부 구현예에서 Cas 단백질은 하나 이상의 아미노산 치환 또는 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에, 치환 및/또는 변형은 단백분해를 방지 또는 감소시키고/시키거나 세포에서 폴리펩티드의 반감기를 연장시킬 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 펩티드 결합 대체(예를 들어, 우레아, 티오우레아, 카바메이트, 설포닐 우레아 등)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 대안적 아미노산(예를 들어, D-아미노산, 베타-아미노산, 호모시스테인, 포스포세린 등)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 모이어티를 포함하는 변형(예를 들어, PEG화, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 말단 캡핑 등)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 코어 Cas 단백질, 이의 이소형, 또는 임의의 Cas 단백질 또는 이의 이소형과 유사한 기능 또는 활성을 갖는 임의의 Cas-유사 단백질을 포함한다. 예시적인 Cas 코어 단백질은 Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8 및 Cas9를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 대장균 하위유형의 Cas 단백질(CASS2로도 알려짐)을 포함한다. 대장균 하위유형의 예시적인 Cas 단백질은 Cse1, Cse2, Cse3, Cse4 및 Cas5e를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Ypest 하위유형의 Cas 단백질(CASS3으로도 알려짐)을 포함한다. Ypest 하위유형의 예시적인 Cas 단백질은 Csy1, Csy2, Csy3 및 Csy4를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Nmeni 하위유형의 Cas 단백질(CASS4로도 알려짐)을 포함한다. Nmeni 하위유형의 예시적인 Cas 단백질은 Csn1 및 Csn2를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Dvulg 하위유형의 Cas 단백질(CASS1로도 알려짐)을 포함한다. Dvulg 하위유형의 예시적인 Cas 단백질은 Csd1, Csd2 및 Cas5d를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Tneap 하위유형의 Cas 단백질(CASS7로도 알려짐)을 포함한다. Tneap 하위유형의 예시적인 Cas 단백질은 Cst1, Cst2, Cas5t를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Hmari 하위유형의 Cas 단백질을 포함한다. Hmari 하위유형의 예시적인 Cas 단백질은 Csh1, Csh2 및 Cas5h를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Apern 하위유형의 Cas 단백질(CASS5로도 알려짐)을 포함한다. Apern 하위유형의 예시적인 Cas 단백질은 Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5 및 Cas5a를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Mtube 하위유형의 Cas 단백질(CASS6으로도 알려짐)을 포함한다. Mtube 하위유형의 예시적인 Cas 단백질은 Csm1, Csm2, Csm3, Csm4 및 Csm5를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 RAMP 모듈 Cas 단백질을 포함한다. 예시적인 RAMP 모듈 Cas 단백질은 Cmr1, Cmr2, Cmr3, Cmr4, Cmr5 및 Cmr6을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌(Klompe et al., Nature 571, 219-225 (2019); Strecker et al., Science 365, 48-53 (2019))을 참고한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 I형 하위유형의 Cas 단백질을 포함한다. I형 CRISPR/Cas 효과기 단백질은 클래스 1 CRISPR/Cas 효과기 단백질의 하위유형이다. 예는 Cas3, Cas8a, Cas5, Cas8b, Cas8c, Cas10d, Cse1, Cse2, Csy1, Csy2, Csy3 및/또는 GSU0054를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas3, Cas8a, Cas5, Cas8b, Cas8c, Cas10d, Cse1, Cse2, Csy1, Csy2, Csy3, 및/또는 GSU0054를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 II형 하위유형의 Cas 단백질을 포함한다. II형 CRISPR/Cas 효과기 단백질은 클래스 2 CRISPR/Cas 효과기 단백질의 하위유형이다. 예는 Cas9, Csn2 및/또는 Cas4를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9, Csn2 및/또는 Cas4를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 III형 하위유형의 Cas 단백질을 포함한다. III형 CRISPR/Cas 효과기 단백질은 클래스 1 CRISPR/Cas 효과기 단백질의 하위유형이다. 예는 Cas10, Csm2, Cmr5, Cas10, Csx11 및/또는 Csx10을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas10, Csm2, Cmr5, Cas10, Csx11, 및/또는 Csx10을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 IV형 하위유형의 Cas 단백질을 포함한다. IV형 CRISPR/Cas 효과기 단백질은 클래스 1 CRISPR/Cas 효과기 단백질의 하위유형이다. 예는 Csf1을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서 Cas 단백질은 Csf1을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 V형 하위유형의 Cas 단백질을 포함한다. V형 CRISPR/Cas 효과기 단백질은 클래스 2 CRISPR/Cas 효과기 단백질의 하위유형이다. V형 CRISPR/Cas 시스템 및 이의 효과기 단백질(예를 들어 Cas12a와 같은 Cas12 패밀리 단백질)의 예에 대해서는 예를 들어 문헌(Shmakov et al., Nat Rev Microbiol. 2017; 15(3):169-182: "Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.")을 참고한다. 예는 Cas12 패밀리(Cas12a, Cas12b, Cas12c), C2c4, C2c8, C2c5, C2c10 및 C2c9; 뿐만 아니라 CasX(Cas12e) 및 CasY(Cas12d)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌(Koonin et al., Curr Opin Microbiol. 2017; 37:67-78: "Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems.")을 참고한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d 및/또는 Cas12e와 같은 Cas12 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 본원에 설명된 Cas 단백질 중 임의의 하나 또는 이의 기능적 부분을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "기능적 부분"은 적어도 하나의 리보핵산(예를 들어, 가이드 RNA(gRNA))과 복합체화하고 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 절단하는 능력을 유지하는 펩티드 부분을 지칭한다. 일부 구현예에서, 기능적 부분은 DNA 결합 도메인, 적어도 하나의 RNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 작동 가능하게 연결된 Cas9 단백질 기능적 도메인의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능적 부분은 DNA 결합 도메인, 적어도 하나의 RNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 작동 가능하게 연결된 Cas12a(Cpf1로도 알려짐) 단백질 기능적 도메인의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능성 도메인은 복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질의 기능적 부분은 RuvC-유사 도메인의 기능적 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질의 기능적 부분은 HNH 뉴클레아제 도메인의 기능적 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질의 기능적 부분은 RuvC-유사 도메인의 기능적 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 외인성 Cas 단백질은 폴리펩티드 형태로 세포에 도입될 수 있다. 특정 구현예에서, Cas 단백질은 세포 침투 폴리펩티드 또는 세포 침투 펩티드에 접합되거나 융합될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 "세포 침투 폴리펩티드" 및 "세포 침투 펩티드"는 각각 분자의 세포로의 흡수를 용이하게 하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 지칭한다. 세포 침투 폴리펩티드는 검출 가능한 표지를 함유할 수 있다.
특정 구현예에서, Cas 단백질은 하전된 단백질(예를 들어, 양전하, 음전하 또는 전체 중성 전하를 보유함)에 접합되거나 융합될 수 있다. 이러한 연결은 공유적일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas 단백질이 세포에 침투하는 능력을 상당히 증가시키기 위해 초양전하 GFP에 융합될 수 있다(Cronican et al. ACS Chem Biol. 2010; 5(8):747-52). 특정 구현예에서, Cas 단백질은 단백질 전달 도메인(PTD)에 융합되어 세포로의 진입을 용이하게 할 수 있다. 예시적인 PTD는 Tat, 올리고아르기닌 및 페네트라틴을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 세포 침투 펩티드에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 PTD에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 tat 도메인에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 올리고아르기닌 도메인에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 페네트라틴 도메인에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 초양전하 GFP에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질은 세포 침투 펩티드에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질은 PTD에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질은 tat 도메인에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질은 올리고아르기닌 도메인에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질은 페네트라틴 도메인에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질은 초양전하 GFP에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas 단백질을 암호화하는 핵산의 형태로 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포에 도입될 수 있다. 핵산을 세포에 도입하는 공정은 임의의 적합한 기술에 의해 달성될 수 있다. 적합한 기술은 인산칼슘 또는 지질-매개 형질감염, 전기천공 및 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 또는 감염을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 본원에 설명된 바와 같이 변형된 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 본원에 설명된 바와 같은 변형된 mRNA(예를 들어, 합성, 변형된 mRNA)를 포함한다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 1개 내지 2개의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 2개의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 하나의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 본원에 설명된 바와 같은 변형된 핵산(예를 들어, 합성, 변형된 mRNA)에 의해 암호화된다.
본원에 개시된 방법은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프로 Cas 단백질을 유도하고 혼성화할 수 있는 임의의 리보핵산의 사용을 고려한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리보핵산은 tracrRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리보핵산은 CRISPR RNA(crRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 리보핵산은 Cas 단백질을 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프로 유도하고 혼성화하는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리보핵산은 Cas 단백질을 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프로 유도하고 이에 혼성화하는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 1개 내지 2개의 리보핵산 둘 모두는 Cas 단백질을 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프로 유도하고 이에 혼성화하는 가이드 RNA를 포함한다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 본원에 제공된 리보핵산은 사용된 특정 CRISPR/Cas 시스템 및 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에 따라 다양한 상이한 표적 모티프에 혼성화하도록 선택될 수 있다. 1개 내지 2개의 리보핵산은 또한 표적 폴리뉴클레오티드 서열 이외의 핵산 서열과의 혼성화를 최소화하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 1개 내지 2개의 리보핵산은 세포에서 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교할 때 적어도 2개의 미스매치를 함유하는 표적 모티프에 혼성화한다. 일부 구현예에서, 1개 내지 2개의 리보핵산은 세포에서 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교할 때 적어도 하나의 미스매치를 함유하는 표적 모티프에 혼성화한다. 일부 구현예에서, 1개 내지 2개의 리보핵산은 Cas 단백질에 의해 인식되는 데옥시리보핵산 모티프에 바로 인접한 표적 모티프에 혼성화하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 1개 내지 2개의 리보핵산은 각각 표적 모티프 사이에 위치한 돌연변이체 대립유전자 측면에 있는 Cas 단백질에 의해 인식되는 데옥시리보핵산 모티프에 바로 인접한 표적 모티프에 혼성화하도록 설계된다.
일부 구현예에서, 1개 내지 2개의 리보핵산은 각각 Cas 단백질을 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프로 유도하고 이에 혼성화하는 가이드 RNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 리보핵산(예를 들어, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 동일한 가닥 상의 서열에 상보적이고 및/또는 혼성화한다. 일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 리보핵산(예를 들어, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 반대 가닥 상의 서열에 상보적이고 및/또는 혼성화한다. 일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 리보핵산(예를 들어, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 반대 가닥 상의 서열에 상보적이지 않고 및/또는 혼성화하지 않는다. 일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 리보핵산(예를 들어, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 중첩 표적 모티프에 상보적이고 및/또는 혼성화한다. 일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 리보핵산(예를 들어, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 오프셋 표적 모티프에 상보적이고 및/또는 혼성화한다.
일부 구현예에서, Cas 단백질을 암호화하는 핵산 및 적어도 1개 내지 2개의 리보핵산을 암호화하는 핵산은 바이러스 형질도입(예를 들어, 렌티바이러스 형질도입)을 통해 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 1-2개 리보핵산과 복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 2개의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 하나의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 본원에 설명된 바와 같은 변형된 핵산(예를 들어, 합성, 변형된 mRNA)에 의해 암호화된다.
본원에 설명된 유전자의 CRISPR/Cas 기반 표적화에 유용한 예시적인 gRNA 서열이 표 2에 제공된다. 서열은 2016년 5월 9일에 출원된 WO2016183041에서 찾을 수 있으며, 표, 별첨 및 서열 목록을 포함하는 개시 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본원에 설명된 유전자의 CRISPR/Cas 기반 표적화에 유용한 다른 예시적인 gRNA 서열은 2021년 5월 19일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/190,685 및 2021년 7월 14일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/221,887에 제공되며, 표, 별첨 및 서열 목록을 포함하는 개시 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 세포는 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 방법론을 사용하여 제조된다. "TALE-뉴클레아제"(TALEN)는 전형적으로 전사 활성화제 유사 효과기(TALE)로부터 유래된 핵산 결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하기 위한 하나의 뉴클레아제 촉매 도메인으로 구성된 융합 단백질로 의도된다. 촉매 도메인은 바람직하게는 뉴클레아제 도메인이고 보다 바람직하게는 예를 들어 I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-I과 같은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 도메인이다. 특정 구현예에서, TALE 도메인은 예를 들어 I-CreI 및 I-OnuI 또는 이의 기능적 변이체와 같은 메가뉴클레아제에 융합될 수 있다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 뉴클레아제는 단량체 TALE-뉴클레아제이다. 단량체 TALE-뉴클레아제는 WO2012138927에 설명된 I-TevI의 촉매 도메인과 조작된 TAL 반복체의 융합물과 같은, 특이적 인식 및 절단을 위해 이량체화를 필요로 하지 않는 TALE-뉴클레아제이다. 전사 활성화제 유사 효과기(TALE)는 박테리아 종 잔토모나스(Xanthomonas)으로부터의 단백질로, 복수의 반복 서열을 포함하며, 각각의 반복체는 핵산 표적화된 서열의 각각의 뉴클레오티드 염기에 특이적인 위치 12 및 13에 이중 잔기(RVD)를 포함한다. 유사한 모듈식 염기 당 염기 핵산 결합 특성(MBBBD)을 갖는 결합 도메인이 또한 상이한 박테리아 종에서 본 출원인에 의해 최근에 발견된 새로운 모듈식 단백질로부터 유래될 수 있다. 새로운 모듈식 단백질은 TAL 반복체보다 더 많은 서열 변동성을 나타내는 장점을 갖는다. 바람직하게는, 상이한 뉴클레오티드의 인식과 관련된 RVD는 C를 인식하기 위한 HD, T를 인식하기 위한 NG, A를 인식하기 위한 NI, G 또는 A를 인식하기 위한 NN, A, C, G 또는 T를 인식하기 위한 NS, T를 인식하기 위한 HG, T를 인식하기 위한 IG, G를 인식하기 위한 NK, C를 인식하기 위한 HA, C를 인식하기 위한 ND, C를 인식하기 위한 HI, G를 인식하기 위한 HN, G를 인식하기 위한 NA, G 또는 A를 인식하기 위한 SN 및 T를 인식하기 위한 YG, A를 인식하기 위한 TL, A 또는 G를 인식하기 위한 VT 및 A를 인식하기 위한 SW이다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 12 및 13은 뉴클레오티드 A, T, C 및 G에 대한 이의 특이성을 조절하기 위해, 특히 이 특이성을 향상시키기 위해 다른 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다. TALEN 키트는 상업적으로 판매된다.
일부 구현예에서, 세포는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 사용하여 조작된다. "징크 핑거 결합 단백질"은 아연 이온의 배위를 통한 단백질 구조의 안정화 결과, 바람직하게는 서열 특이적 방식으로, DNA, RNA 및/또는 단백질에 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 용어 징크 핑거 결합 단백질은 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다. 개별 DNA 결합 도메인은 전형적으로 "핑거"로 지칭된다. ZFP는 적어도 하나의 핑거, 전형적으로 2개 핑거, 3개 핑거 또는 6개 핑거를 갖는다. 각각의 핑거는 2-4개의 DNA 염기쌍, 전형적으로 3-4개의 DNA 염기쌍에 결합한다. ZFP는 표적 부위 또는 표적 절편이라고 불리는 핵산 서열에 결합한다. 각각의 핑거는 전형적으로 대략 30개 아미노산, 아연 킬레이트, DNA 결합 하위 도메인을 포함한다. 연구는 이 클래스의 단일 징크 핑거가 단일 베타 회전의 2개의 시스테인 잔기를 따라 아연과 배위된 2개의 불변 히스티딘 잔기를 함유하는 알파 나선으로 구성됨을 실증하였다(예를 들어, Berg & Shi, Science 271:1081-1085 (1996) 참고).
일부 구현예에서, 본원에 설명된 세포는 귀소 엔도뉴클레아제를 사용하여 제조된다. 이러한 귀소 엔도뉴클레아제는 당분야에 잘 알려져 있다(Stoddard 2005). 귀소 엔도뉴클레아제는 DNA 표적 서열을 인식하고 단일 또는 이중 가닥 절단을 생성한다. 귀소 엔도뉴클레아제는 길이가 12-45개 염기쌍(bp) 범위, 일반적으로 길이가 14-40 bp 범위인 DNA 표적 부위를 인식하며 고도로 특이적이다. 귀소 엔도뉴클레아제는 예를 들어 LAGLIDADG 엔도뉴클레아제, HNH 엔도뉴클레아제 또는 GIY-YIG 엔도뉴클레아제에 상응할 수 있다. 일부 구현예에서, 귀소 엔도뉴클레아제는 I-CreI 변이체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 세포는 메가뉴클레아제를 사용하여 제조된다. 메가뉴클레아제는 정의상 큰 서열을 인식하는 서열 특이적 엔도뉴클레아제이다(Chevalier, B. S. and B. L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-3774). 이들은 살아 있는 세포에서 고유한 부위를 절단하여 절단 부위 근처에서 유전자 표적화를 1000배 이상 향상시킬 수 있다(Puchta et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 5034-5040; Rouet et al., Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096-8106; Choulika et al., Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968-1973; Puchta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 5055-5060; Sargent et al., Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 267-77; Donoho et al., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4070-4078; Elliott et al., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93-101; Cohen-Tannoudji et al., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 1444-1448).
일부 구현예에서, 본원에 제공된 세포는 관용원성 인자와 같은 폴리펩티드의 발현을 녹다운(예를 들어, 감소, 제거 또는 억제)하기 위해 RNA 침묵화 또는 RNA 간섭(RNAi, siRNA로도 지칭됨)을 사용하여 제조된다. 유용한 RNAi 방법은 합성 RNAi 분자, 짧은 간섭 RNA(siRNA), PIWI-상호작용 NRA(piRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 및 당업자에 의해 인식되는 다른 일시적 녹다운 방법을 이용하는 것들을 포함한다. 서열 특이적 shRNA, siRNA, miRNA 등을 포함하는 RNAi용 시약이 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, CIITA는 CIITA siRNA를 도입하거나 CIITA shRNA-발현 바이러스를 세포에 도입함으로써 만능 줄기 세포에서 녹다운될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 간섭은 CIITA, B2M 및 NLRC5로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 발현을 감소시키거나 억제하기 위해 사용된다.
1. 유전자 편집 시스템
일부 구현예에서, 세포를 유전적으로 변형시켜 하나 이상의 유전자를 녹아웃, 녹다운 또는 달리 변형하는 방법은 예를 들어 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제, 전위효소, 및 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR)/Cas 시스템뿐만 아니라 당분야에 알려진 닉카제 시스템, 염기 편집 시스템, 프라임 편집 시스템 및 유전자 쓰기 시스템을 포함하는 부위 지정 뉴클레아제를 사용하는 단계를 포함한다.
a) ZFN
ZFN은 박테리아 FokI 제한 효소의 엔도뉴클레아제 도메인에 부착된 징크 핑거 함유 전사 인자로부터 적응된 일련의 부위 특이적 DNA 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. ZFN은 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 DNA 결합 도메인 또는 징크 핑거 도메인을 가질 수 있다. 예를 들어, 문헌(Carroll et al., Genetics Society of America (2011) 188:773-782; Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:1156-1160)을 참고한다. 각각의 징크 핑거 도메인은 하나 이상의 아연 이온에 의해 안정화된 작은 단백질 구조 모티프이며 일반적으로 3-4-bp DNA 서열을 인식한다. 따라서 탠덤 도메인은 세포의 게놈 내에서 고유한 확장된 뉴클레오티드 서열에 잠재적으로 결합할 수 있다.
특이성이 알려진 다양한 징크 핑거가 조합되어 약 6, 9, 12, 15 또는 18-bp 서열을 인식하는 멀티핑거 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 파지 디스플레이, 효모 1-하이브리드 시스템, 박테리아 1-하이브리드 및 2-하이브리드 시스템, 및 포유동물 세포를 포함하는 특정 서열을 인식하는 징크 핑거(및 이의 조합)를 생성하기 위해 다양한 선택 및 모듈식 조립 기술이 이용 가능하다. 징크 핑거는 소정 핵산 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 소정 핵산 서열에 결합하도록 징크 핑거를 조작하는 기준은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌(Sera et al., Biochemistry (2002) 41:7074-7081; Liu et al., Bioinformatics (2008) 24:1850-1857)을 참고한다.
FokI 뉴클레아제 도메인 또는 다른 이량체 뉴클레아제 도메인을 함유하는 ZFN은 이량체로 기능한다. 따라서 비-회문반복 DNA 부위를 표적화하기 위해서는 한 쌍의 ZFN이 필요하다. 2개의 개별 ZFN은 적절한 간격으로 떨어져 있는 뉴클레아제를 사용하여 DNA의 반대쪽 가닥에 결합해야 한다. 문헌(Bitinaite et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95:10570-10575)을 참고한다. 게놈의 특정 부위를 절단하기 위해 한 쌍의 ZFN은 부위 측면에 있는 두 개의 서열로서, 하나는 정방향 가닥에 있고 다른 하나는 역방향 가닥에 있는, 서열을 인식하도록 설계된다. 부위의 어느 한 쪽에서 ZFN의 결합 시, 뉴클레아제 도메인이 이량체화하고 부위에서 DNA를 절단하여 5' 오버행이 있는 DSB를 생성한다. 그런 다음 HDR이 상동성 아암 측면에 원하는 돌연변이를 함유하는 복구 주형의 도움으로 특정 돌연변이를 도입하기 위해 이용될 수 있다. 복구 주형은 일반적으로 세포에 도입된 외인성 이중 가닥 DNA 벡터이다. 문헌(Miller et al., Nat. Biotechnol. (2011) 29:143-148; Hockemeyer et al., Nat. Biotechnol. (2011) 29:731-734)을 참고한다.
b) TALEN
TALEN은 표적 유전자를 편집하기 위해 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제의 또 다른 예이다. TALEN은 TALE 반복체라고 하는 DNA 결합 도메인으로부터 유래되며, 일반적으로 확장된 DNA 서열에 결합하고 이를 인식하는 10-30개 반복체가 있는 탠덤 어레이를 포함한다. 각각의 반복체는 길이가 33-35개 아미노산이며, 4개의 DNA 염기쌍 중 하나에 대한 특이성을 부여하는 2개의 인접한 아미노산(반복 가변 이중 잔기 또는 RVD라고 함)이 있다. 따라서 표적 DNA 서열에서 반복체와 염기쌍 사이에는 일대일 대응이 존재한다.
TALEN은 하나 이상의 TALE DNA 결합 도메인(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)을 뉴클레아제 도메인, 예를 들어 FokI 엔도뉴클레아제 도메인에 융합하여 인공적으로 생성된다. 문헌(Zhang, Nature Biotech. (2011) 29:149-153)을 참고한다. FokI에 대한 여러 돌연변이가 TALEN에서 사용하기 위해 만들어졌다; 이들은 예를 들어 절단 특이성 또는 활성을 개선한다. 문헌(Cermak et al., Nucl. Acids Res. (2011) 39:e82; Miller et al., Nature Biotech. (2011) 29:143-148; Hockemeyer et al., Nature Biotech. (2011) 29:731-734; Wood et al., Science (2011) 333:307; Doyon et al., Nature Methods (2010) 8:74-79; Szczepek et al., Nature Biotech (2007) 25:786-793; Guo et al., J. Mol. Biol. (2010) 200:96)을 참고한다. FokI 도메인은 이량체로 기능하며 적절한 배향과 간격을 가진 표적 게놈의 부위에 대한 고유한 DNA 결합 도메인이 있는 두 개의 작제물을 필요로 한다. TALE DNA 결합 도메인과 FokI 뉴클레아제 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수 및 2개의 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기 수가 모두 높은 수준의 활성을 달성하기 위해 중요한 매개변수인 것으로 보인다(Miller et al., Nature Biotech. (2011) 29:143-148).
조작된 TALE 반복체를 뉴클레아제 도메인과 조합함으로써, 임의의 원하는 DNA 서열에 특이적인 부위-특이적 뉴클레아제가 생성될 수 있다. ZFN과 유사하게 TALEN은 세포에 도입되어 게놈의 원하는 표적 부위에서 DSB를 생성할 수 있으므로 유사한 HDR 매개 경로에서 유전자를 녹아웃하거나 돌연변이를 녹인하기 위해 사용될 수 있다. 문헌(Boch, Nature Biotech. (2011) 29:135-136; Boch et al., Science (2009) 326:1509-1512; Moscou et al., Science (2009) 326:3501)을 참고한다.
c) 메가뉴클레아제
메가뉴클레아제는 큰 DNA 서열(14-40개 염기쌍)을 인식하고 절단하는 능력을 특징으로 하는 엔도뉴클레아제 패밀리의 효소이다. 메가뉴클레아제는 뉴클레아제 활성 및/또는 DNA 인식에 영향을 미치는 구조 모티프에 기반하여 패밀리로 분류된다. 가장 광범위하고 가장 잘 알려진 메가뉴클레아제는 LAGLIDADG 패밀리의 단백질로, 보존된 아미노산 서열로 인해 명명된다. 문헌(Chevalier et al., Nucleic Acids Res. (2001) 29(18): 3757-3774)을 참고한다. 다른 한편, GIY-YIG 패밀리 구성원은 70-100 잔기 길이의 GIY-YIG 모듈을 가지며 4개의 불변 잔기가 있는 4개 또는 5개의 보존된 서열 모티프를 포함하고, 그 중 2개가 활성을 위해 필요하다. 문헌(Van Roey et al., Nature Struct. Biol. (2002) 9:806-811)을 참고한다. His-Cys 패밀리 메가뉴클레아제는 수백 개의 아미노산 잔기를 포괄하는 영역에 걸쳐 고도로 보존된 일련의 히스티딘 및 시스테인을 특징으로 한다. 문헌(Chevalier et al., Nucleic Acids Res. (2001) 29(18):3757-3774)을 참고한다. NHN 패밀리의 구성원은 아스파라긴 잔기로 둘러싸인 두 쌍의 보존된 히스티딘을 함유하는 모티프에 의해 정의된다. 문헌(Chevalier et al., Nucleic Acids Res. (2001) 29(18):3757-3774)을 참고한다.
특정 표적 DNA 서열에 대한 천연 메가뉴클레아제를 동정할 가능성은 높은 특이성 요건으로 인해 낮기 때문에, 고유한 서열을 인식하는 메가뉴클레아제 변이체를 생성하기 위해 돌연변이유발, 및 고처리량 스크리닝 방법을 포함하는 다양한 방법이 사용되어 왔다. 예를 들어 소정 핵산 서열에 결합하는, 변경된 DNA-결합 특이성을 갖는 메가뉴클레아제를 조작하기 위한 전략은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌(Chevalier et al., Mol. Cell. (2002) 10:895-905; Epinat et al., Nucleic Acids Res (2003) 31:2952-2962; Silva et al., J Mol. Biol. (2006) 361:744-754; Seligman et al., Nucleic Acids Res (2002) 30:3870-3879; Sussman et al., J Mol Biol (2004) 342:31-41; Doyon et al., J Am Chem Soc (2006) 128:2477-2484; Chen et al., Protein Eng Des Sel (2009) 22:249-256; Arnould et al., J Mol Biol. (2006) 355:443-458; Smith et al., Nucleic Acids Res. (2006) 363(2):283-294)을 참고한다.
ZFN 및 TALEN과 마찬가지로, 메가뉴클레아제는 게놈 DNA에서 DSB를 생성할 수 있으며, 이는 예를 들어 NHEJ를 통해 부적절하게 복구되면 프레임 이동 돌연변이를 생성하여 세포에서 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 대안적으로 외래 DNA가 메가뉴클레아제와 함께 세포에 도입될 수 있다. 외래 DNA의 서열 및 염색체 서열에 따라, 이 공정이 표적 유전자를 변형하기 위해 사용될 수 있다. 문헌(Silva et al., Current Gene Therapy (2011) 11:11-27)을 참고한다.
d) 전위효소
전위효소는 트랜스포존의 말단에 결합하고 자르기 및 붙이기 메커니즘 또는 복제 전위 메커니즘에 의해 게놈의 또 다른 부분으로의 이동을 촉매하는 효소이다. 전위효소를 CRISPER/Cas 시스템과 같은 다른 시스템에 연결함으로써 게놈 DNA의 부위 특이적 삽입 또는 조작을 가능하게 하는 새로운 유전자 편집 도구가 개발될 수 있다. 촉매적으로 불활성인 Cas 효과기 단백질 및 Tn7 유사 트랜스포존을 사용하는 트랜스포존을 사용하는 두 가지 알려진 DNA 통합 방법이 있다. 전위효소 의존적 DNA 통합은 게놈에서 DSB를 유발하지 않아 보다 안전하고 보다 특이적인 DNA 통합을 보장할 수 있다.
e) CRISPR/Cas 시스템
CRISPR 시스템은 획득 면역의 형태를 제공하는 침입 파지 및 플라스미드에 대한 방어에 관여하는 시스템으로서 원래 원핵 유기체(예를 들어, 박테리아 및 고세균)에서 발견되었다. 이제 그것은 연구 및 임상 적용에서 널리 사용되는 유전자 편집 도구로 채택 및 사용되어 왔다.
CRISPR/Cas 시스템은 일반적으로 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA) 및 Cas 단백질의 적어도 2개 성분을 포함한다. Cas 단백질은 표적 부위에 DSB를 도입하는 뉴클레아제이다. CRISPR-Cas 시스템은 2개의 주요 클래스로 나뉜다: 클래스 1 시스템은 여러 Cas 단백질 복합체를 사용하여 핵산을 분해한다; 클래스 2 시스템은 동일한 목적을 위해 하나의 큰 Cas 단백질을 사용한다. 클래스 1은 I형, III형 및 IV형으로 나뉜다; 클래스 2는 II형, V형 및 VI형으로 나뉜다. 유전자 편집 적용에 채택된 상이한 Cas 단백질은 Cas3, Cas4, Cas5, Cas8a, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas12, Cas12a(Cpf1), Cas12b(C2c1), Cas12c(C2c3), Cas12d(CasY), Cas12e(CasX), Cas12f(C2c10), Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12k(C2c5), Cas13, Cas13a(C2c2), Cas13b, Cas13c, Cas13d, C2c4, C2c8, C2c9, Cmr5, Cse1, Cse2, Csf1, Csm2, Csn2, Csx10, Csx11, Csy1, Csy2, Csy3 및 Mad7을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 가장 널리 사용되는 Cas9는 II형 Cas 단백질이며 본원에서 예시적으로 설명된다. 이러한 Cas 단백질은 다른 원천 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, Cas9는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) 또는 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)로부터 유래될 수 있다.
원래의 미생물 게놈에서 II형 CRISPR 시스템은 숙주 게놈 내의 어레이로 암호화된 CRISPR 반복 서열 사이에 침입 DNA의 서열로부터의 서열을 통합한다. CRISPR 반복 어레이로부터의 전사체는 각각 "프로토스페이서" 서열로 알려진 침입 DNA로부터 전사된 가변 서열뿐만 아니라 CRISPR 반복체의 일부를 보유하는 CRISPR RNA(crRNA)로 처리된다. 각각의 crRNA는 두 번째 트랜스활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)와 혼성화하고 이 두 RNA는 Cas9 뉴클레아제와 복합체를 형성한다. crRNA의 프로토스페이서-암호화 부분은 "프로토스페이서 인접 모티프"(PAM)로 알려진 짧은 서열에 인접하는 경우 Cas9 복합체가 상보적인 표적 DNA 서열을 절단하도록 유도한다.
발견 이후 CRISPR 시스템은 박테리아에서 인간 세포를 포함하는 진핵 세포에 이르는 광범위한 세포 및 유기체에서 서열 특이적 DSB 및 표적 게놈 편집을 유도하는 데 채택되었다. 유전자 편집 적용에서 사용할 때 인공적으로 설계된 합성 gRNA가 원래의 crRNA:tracrRNA 복합체를 대체했다. 예를 들어, gRNA는 crRNA, 테트라루프 및 tracrRNA로 이루어진 단일 가이드 RNA(sgRNA)일 수 있다. crRNA는 일반적으로 관심 표적 DNA를 인식하도록 사용자-설계 상보적 영역(스페이서라고도 함, 일반적으로 길이 약 20개 뉴클레오티드)을 포함한다. tracrRNA 서열은 Cas 뉴클레아제 결합을 위한 스캐폴드 영역을 포함한다. crRNA 서열 및 tracrRNA 서열은 테트라루프에 의해 연결되고 각각은 서로 혼성화하기 위한 짧은 반복 서열을 가져서 키메라 sgRNA를 생성한다. gRNA에 존재하는 스페이서 또는 상보적 영역 서열을 간단히 변화시켜 Cas 뉴클레아제의 게놈 표적을 변화시킬 수 있다. 상보적인 영역은 표준 RNA-DNA 상보적 염기쌍 형성 규칙을 통해 Cas 뉴클레아제를 표적 DNA 부위로 유도할 것이다.
Cas 뉴클레아제가 기능하기 위해서는 게놈 DNA에서 표적 서열의 바로 하류에 PAM이 있어야 한다. Cas 단백질에 의한 PAM의 인식은 인접한 게놈 서열을 탈안정화하여 gRNA에 의한 서열의 조사를 허용하고 일치하는 서열이 존재할 때 gRNA-DNA 쌍을 초래하는 것으로 생각된다. PAM의 특정 서열은 Cas 유전자의 종에 따라 다르다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes)로부터 유래된 가장 일반적으로 사용되는 Cas9 뉴클레아제는 5'-NGG-3' 또는 덜 효율적인 속도로 5'-NAG-3'의 PAM 서열을 인식하며, 여기서 "N"은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대안적 PAM이 있는 다른 Cas 뉴클레아제 변이체도 특성규명되었으며 게놈 편집을 위해 성공적으로 사용되었고, 이는 아래 표 3에 요약된다.
일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 이의 활성, 특이성, 인식 및/또는 다른 특성을 변경하기 위해 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, Cas 뉴클레아제는 표적-외 효과를 경감시키기 위해 그 충실도를 변경하는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다(예를 들어, SpCas9의 eSpCas9, SpCas9-HF1, HypaSpCas9, HeFSpCas9 및 evoSpCas9 고-충실도 변이체). 또 다른 예로 Cas 뉴클레아제는 그 PAM 특이성을 변경하는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 세포는 면역-특권 또는 저면역원성 세포를 생성하기 위해 하나 이상의 면역 인자(표적 폴리펩티드 포함)의 발현을 감소시키도록 유전적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 세포(예를 들어, 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포 및 CAR-T 세포)는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. 이러한 표적 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 비제한적 예는 CIITA, B2M, NLRC5, CTLA4, PD1, HLA-A, HLA-BM, HLA-C, RFX-ANK, NFY-A, RFX5, RFX-AP, NFY-B, NFY-C, IRF1 및/또는 TAP1을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적 변형은 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 발생한다. 하나 또는 복수의 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절(예를 들어, 감소 또는 결실)함으로써, 이러한 세포는 수신 대상체에 생착될 때 감소된 면역 활성화를 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어 투여 시 수신 대상체 또는 환자에서 저면역원성으로 간주된다.
f) 닉카제
Cas의 뉴클레아제 도메인, 특히 Cas9, 뉴클레아제는 독립적으로 돌연변이되어 DNA "닉카제"로 지칭되는 효소를 생성할 수 있다. 닉카제는 예를 들어 CRISPR/Cas9를 포함하여 일반 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템과 동일한 특이성을 가진 단일 가닥 절단을 도입할 수 있다. 닉카제는 유전자 편집 시스템에서 사용할 수 있는 이중 가닥 절단을 생성하기 위해 사용될 수 있다(Mali et al., Nat Biotech, 31(9):833-838 (2013); Mali et al. Nature Methods, 10:957-963 (2013); Mali et al., Science, 339(6121):823-826 (2013)). 일부 경우에, 2개의 Cas 닉카제가 사용될 때, 정밀한 유전자 통합 및 삽입에 대한 추가적인 제어를 허용하는 무딘 말단 대신 절단된 말단 각각에서 긴 오버행이 생성된다(Mali et al., Nat Biotech, 31(9):833-838 (2013); Mali et al. Nature Methods, 10:957-963 (2013); Mali et al., Science, 339(6121):823-826 (2013)). 닉 형성 Cas 효소는 둘 모두 이의 표적 DNA에 효과적으로 닉을 형성해야 하므로, 쌍을 이룬 닉카제는 이중 가닥 절단 Cas 기반 시스템과 비교하여 더 낮은 표적-외 효과를 가질 수 있다(Ran et al., Cell, 155(2):479-480(2013); Mali et al., Nat Biotech, 31(9):833-838 (2013); Mali et al. Nature Methods, 10:957-963 (2013); Mali et al., Science, 339(6121):823-826 (2013)).
P. 관용원성 인자 및/또는 키메라 항원 수용체의 재조합 발현 방법
이러한 모든 기술에 대해, 잘 알려진 재조합 기술이 사용되어 본원에 개략된 바와 같은 재조합 핵산을 생성한다. 특정 구현예에서, 관용원성 인자 또는 키메라 항원 수용체를 암호화하는 재조합 핵산은 발현 작제물에서 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 치료될 숙주 세포 및 수신 대상체에 적절할 것이다. 다양한 숙주 세포에 대해 여러 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 당분야에 알려져 있다. 전형적으로, 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성화제 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 당분야에 알려진 바와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터가 또한 고려된다. 프로모터는 자연 발생 프로모터이거나 하나 초과의 프로모터 요소를 조합하는 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 작제물은 플라스미드와 같은 에피솜 상에서 세포에 존재할 수 있거나, 발현 작제물은 염색체에 삽입될 수 있다. 특정 구현예에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 허용하는 선별 마커 유전자를 포함한다. 특정 구현예는 적어도 하나의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 본원에 사용하기 위한 조절 서열은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 벡터는 형질전환될 숙주 세포, 발현하고자 하는 특정 변이체 폴리펩티드, 벡터의 카피 수, 그 카피 수를 제어하는 능력 및/또는 항생제 마커와 같이 벡터에 의해 암호화되는 임의의 다른 단백질의 발현의 선택을 위해 설계된다.
적합한 포유동물 프로모터의 예는 예를 들어 하기 유전자로부터의 프로모터: 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터, 햄스터의 유비퀴틴/S27a 프로모터(WO 97/15664), 유인원 액포화 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV)의 긴 말단 반복 영역, 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터(MMTV), 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스 긴 말단 반복 영역 및 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)의 초기 프로모터를 포함한다. 다른 이종 포유동물 프로모터의 예는 액틴, 면역글로불린 또는 열 충격 프로모터(들)이다. 추가 구현예에서, 포유동물 숙주 세포에서 사용하기 위한 프로모터는 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스(UK 2,211,504, 1989년 7월 5일 공개), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스 및 유인원 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻을 수 있다. 추가 구현예에서, 이종 포유동물 프로모터가 사용된다. 예는 액틴 프로모터, 면역글로불린 프로모터 및 열-충격 프로모터를 포함한다. SV40의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로 편리하게 얻어진다(Fiers et al., Nature 273: 113-120 (1978)). 인간 사이토메갈로바이러스의 최초기 프로모터는 HindIII 제한 효소 단편으로 편리하게 얻어진다(Greenaway et al., Gene 18: 355-360 (1982)). 전술한 참고문헌 전체가 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 발현 벡터는 바이시스트론 또는 멀티시스트론 발현 벡터이다. 바이시스트론 또는 멀티시스트론 발현 벡터는 (1) 개방 해독 프레임 각각에 융합된 다중 프로모터; (2) 유전자 사이의 스플라이싱 신호 삽입; (3) 발현이 단일 프로모터에 의해 유도되는 유전자의 융합; 및 (4) 유전자 사이의 단백분해 절단 부위의 삽입(자가-절단 펩티드) 또는 유전자 사이의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 삽입을 포함할 수 있다.
본원에 설명된 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 공정은 임의의 적합한 기술에 의해 달성될 수 있다. 적합한 기술은 인산칼슘 또는 지질-매개 형질감염, 전기천공, 퓨소겐(fusogen) 및 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 또는 감염을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입(예를 들어, 렌티바이러스 형질도입)을 통해 세포에 도입되거나 다르게는 바이러스 벡터 상에서 전달된다(예를 들어, 퓨소겐-매개 전달).
수신 대상체에 투여 시 면역 반응을 촉발하거나 활성화하지 않는 세포가 본원에 제공된다. 상기 설명된 바와 같이, 일부 구현예에서, 세포는 수신체의 면역 인식 및 관용성에 영향을 미치는 유전자 및 관용원성(예를 들어, 면역) 인자의 발현을 증가시키도록 변형된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 표적 단백질의 발현을 조절하는 게놈 변형을 보유하는 본원에 개시된 임의의 세포(예를 들어, 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포 CAR-T 세포, 및 CAR-NK 세포)가 또한 하나 이상의 관용원성 인자를 발현하도록 변형된다. 예시적인 관용원성 인자는 CD47, DUX4, CD24, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, FasL, CCL21, CCL22, Mfge8 및 Serpinb9를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 관용원성 인자는 DUX4, CD47, CD24, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, FasL, CCL21, CCL22, Mfge8 및 Serpinb9를 포함하는 군으로부터 선택된다.
인간 CD27(CD27L 수용체, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 7(TNFSF7), T 세포 활성화 항원 S152, Tp55 및 T14로도 알려짐)에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC12P008144, HGNC 번호 11922, NCBI 유전자 ID 939, Uniprot 번호 P26842 및 NCBI RefSeq 번호 NM_001242.4 및 NP_001233.1에 제공된다.
인간 CD46에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC01P207752, HGNC 번호 6953, NCBI 유전자 ID 4179, Uniprot 번호 P15529, 및 NCBI RefSeq 번호 NM_002389.4, NM_153826.3, NM_172350.2, NM_172351.2, NM_172352.2 NP_758860.1, NM_172353.2, NM_172359.2, NM_172361.2, NP_002380.3, NP_722548.1, NP_758860.1, NP_758861.1, NP_758862.1, NP_758863.1, NP_758869.1, 및 NP_758871.1에 제공된다.
인간 CD55(보체 붕괴-가속화 인자로도 알려짐)에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC01P207321, HGNC 번호 2665, NCBI 유전자 ID 1604, Uniprot 번호 P08174, 및 NCBI RefSeq 번호 NM_000574.4, NM_001114752.2, NM_001300903.1, NM_001300904.1, NP_000565.1, NP_001108224.1, NP_001287832.1, 및 NP_001287833.1에 제공된다.
인간 CD59에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC11M033704, HGNC 번호 1689, NCBI 유전자 ID 966, Uniprot 번호 P13987, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_000602.1, NM_000611.5, NP_001120695.1, NM_001127223.1, NP_001120697.1, NM_001127225.1, NP_001120698.1, NM_001127226.1, NP_001120699.1, NM_001127227.1, NP_976074.1, NM_203329.2, NP_976075.1, NM_203330.2, NP_976076.1, 및 NM_203331.2에 제공된다.
인간 CD200에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC03P112332, HGNC 번호 7203, NCBI 유전자 ID 4345, Uniprot 번호 P41217, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_001004196.2, NM_001004196.3, NP_001305757.1, NM_001318828.1, NP_005935.4, NM_005944.6, XP_005247539.1, 및 XM_005247482.2에 제공된다.
인간 HLA-C에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC06M031272, HGNC 번호 4933, NCBI 유전자 ID 3107, Uniprot 번호 P10321, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_002108.4 및 NM_002117.5에 제공된다.
인간 HLA-E에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC06P047281, HGNC 번호 4962, NCBI 유전자 ID 3133, Uniprot 번호 P13747, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_005507.3 및 NM_005516.5에 제공된다.
인간 HLA-G에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC06P047256, HGNC 번호 4964, NCBI 유전자 ID 3135, Uniprot 번호 P17693, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_002118.1 및 NM_002127.5에 제공된다.
인간 PD-L1 또는 CD274에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC09P005450, HGNC 번호 17635, NCBI 유전자 ID 29126, Uniprot 번호 Q9NZQ7, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_001254635.1, NM_001267706.1, NP_054862.1, 및 NM_014143.3에 제공된다.
인간 IDO1에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC08P039891, HGNC 번호 6059, NCBI 유전자 ID 3620, Uniprot 번호 P14902, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_002155.1 및 NM_002164.5에 제공된다.
인간 IL-10에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC01M206767, HGNC 번호 5962, NCBI 유전자 ID 3586, Uniprot 번호 P22301, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_000563.1 및 NM_000572.2에 제공된다.
인간 Fas 리간드(FasL, FASLG, CD178, TNFSF6 등으로 알려짐)에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC01P172628, HGNC 번호 11936, NCBI 유전자 ID 356, Uniprot 번호 P48023, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_000630.1, NM_000639.2, NP_001289675.1, 및 NM_001302746.1에 제공된다.
인간 CCL21에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC09M034709, HGNC 번호 10620, NCBI 유전자 ID 6366, Uniprot 번호 O00585, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_002980.1 및 NM_002989.3에 제공된다.
인간 CCL22에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC16P057359, HGNC 번호 10621, NCBI 유전자 ID 6367, Uniprot 번호 O00626, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_002981.2, NM_002990.4, XP_016879020.1, 및 XM_017023531.1에 제공된다.
인간 Mfge8에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC15M088898, HGNC 번호 7036, NCBI 유전자 ID 4240, Uniprot 번호 Q08431, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_001108086.1, NM_001114614.2, NP_001297248.1, NM_001310319.1, NP_001297249.1, NM_001310320.1, NP_001297250.1, NM_001310321.1, NP_005919.2, 및 NM_005928.3에 제공된다.
인간 SerpinB9에 대해 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어 GeneCard 식별자 GC06M002887, HGNC 번호 8955, NCBI 유전자 ID 5272, Uniprot 번호 P50453, 및 NCBI RefSeq 번호 NP_004146.1, NM_004155.5, XP_005249241.1, 및 XM_005249184.4에 제공된다.
유전자 및 인자(단백질)의 발현을 조절하는 방법은 게놈 편집 기술, 및 RNA 또는 단백질 발현 기술 등을 포함한다. 이들 기술 모두에 대해, 본원에 개략된 바와 같은 재조합 핵산을 생성하기 위해 잘 알려진 재조합 기술이 사용된다.
일부 구현예에서, 표적 유전자(예를 들어, DUX4, CD47, 또는 다른 관용원성 인자)의 발현은 융합 단백질 또는 (1) 내인성 DUX4, CD47, 또는 다른 유전자에 특이적인 부위 특이적 결합 도메인 및 (2) 전사 활성화제를 함유하는 단백질 복합체의 발현에 의해 증가된다.
일부 구현예에서, 방법은 상동성 유도 복구/재조합을 포함하는 유전적 변형 방법에 의해 달성된다.
일부 구현예에서, 조절 인자는 가이드 RNA(gRNA)와 같은 부위 특이적 DNA 결합 핵산 분자로 이루어진다. 일부 구현예에서, 방법은 징크 핑거 단백질(ZFP) 또는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)로도 알려진 ZFP를 함유하는 융합 단백질과 같은 부위 특이적 DNA 결합 표적화 단백질에 의해 달성된다.
일부 구현예에서, 조절 인자는 표적화된 영역에서 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는, DNA 결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산을 사용하는 것과 같이 부위-특이적 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 변형된 뉴클레아제와 같은 부위-특이적 뉴클레아제에 커플링되거나 복합체화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 투여는 변형된 뉴클레아제, 예컨대 메가뉴클레아제 또는 RNA-가이드 뉴클레아제, 예컨대 CRISPR-Cas9 시스템과 같은 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 핵산(CRISPR)-Cas 시스템의 DNA-표적화 단백질을 포함하는 융합체를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결여되도록 변형된다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레아제는 촉매적으로 사멸된 dCas9이다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII와 같은 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 인식 서열. 또한 문헌(미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; Belfort et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al., (1989) Gene 82:115-118; Perler et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al., (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al., (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs 카탈로그)을 참고한다. 또한, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA 결합 특이성은 비천연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어 문헌(Chevalier et al., (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res. 31 :2952-2962; Ashworth et al., (2006) Nature 441 :656-659; Paques et al., (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; 미국 특허 공개 번호 2007/0117128)을 참고한다.
징크 핑거, TALE 및 CRISPR 시스템 결합 도메인은 예를 들어 자연 발생 징크 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 소정 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 조작된 DNA 결합 단백질(징크 핑거 또는 TALE)은 비-자연 발생 단백질이다. 설계를 위한 합리적 기준은 기존 ZFP 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 치환 규칙 및 전산화된 알고리즘의 적용을 포함한다. 예를 들어, 문헌(미국 특허 번호 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 그리고 미국 공개 번호 20110301073)을 참고한다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 결합 도메인은 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 하나 이상의 징크 핑거 단백질(ZFP) 또는 이의 도메인을 포함한다. ZFP 또는 이의 도메인은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열 영역인 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 더 큰 단백질 내의 단백질 또는 도메인이다.
ZFP 중에는 전형적으로 개별 핑거의 조립에 의해 생성되는 9-18개 뉴클레오티드 길이의, 특정 DNA 서열을 표적화하는 인공 ZFP 도메인이 있다. ZFP는 단일 핑거 도메인의 길이가 대략 30개 아미노산이고 단일 베타 회전의 2개의 시스테인과 아연을 통해 배위된 2개의 불변 히스티딘 잔기를 함유하는 알파 나선을 함유하고 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 핑거를 갖는 것들을 포함한다. 일반적으로 ZFP의 서열 특이성은 징크 핑거 인식 나선의 4개 나선 위치(-1, 2, 3 및 6)에 아미노산 치환을 제조함으로써 변경될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, ZFP 또는 ZFP-함유 분자는 비-자연 발생이며, 예를 들어 선택 표적 부위에 결합하도록 조작된다. 예를 들어, 모두 이의 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌(Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; 미국 특허 번호 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공개 번호 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061)을 참고한다.
많은 유전자 특이적 조작된 징크 핑거가 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, Sangamo Biosciences(Richmond, CA, USA)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)와 협력하여 징크-핑거 작제를 위한 플랫폼(CompoZr)을 개발하여 연구자들이 징크-핑거 작제 및 검증을 모두 우회하고, 수천 개의 단백질에 대해 특이적으로 표적화된 징크 핑거를 제공하도록 허용한다(Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). 일부 구현예에서, 상업적으로 이용 가능한 징크 핑거가 사용되거나 맞춤 설계된다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 결합 도메인은 전사 활성화제-유사 단백질 효과기(TALE) 단백질과 같은 자연 발생 또는 조작된(비-자연 발생) 전사 활성화제-유사 단백질(TAL) DNA 결합 도메인을 포함하며, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌(미국 특허 공개 번호 20110301073)을 참고한다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 결합 도메인은 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 일반적으로 "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분적 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복체" 및 tracrRNA-처리 부분적 직접 반복체를 포괄함), 가이드 서열(또한 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서" 또는 "표적화 서열"로도 지칭됨), 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 포함하는, CRISPR 관련("Cas") 유전자의 발현 또는 활성을 유도하는 데 관여하는 전사체 및 다른 요소를 총칭한다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하기 위해 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 표적 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때 가이드 서열과 그 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 일부 경우에, gRNA의 표적화 도메인은 상보적이며, 예를 들어 표적 핵산 상의 표적 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상보적, 예를 들어 완전 상보적이다.
일부 구현예에서, 표적 부위는 표적 유전자의 전사 개시 부위의 상류이다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위에 인접한다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위 하류의 RNA 폴리머라제 정지 부위에 인접한다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 표적 유전자의 프로모터 영역을 표적화하여 전사 개시, 하나 이상의 전사 인핸서 또는 활성화제 및/또는 RNA 폴리머라제의 결합을 촉진하도록 구성된다. 하나 이상의 gRNA가 유전자의 프로모터 영역을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자의 하나 이상의 영역이 표적화될 수 있다. 특정 측면에서, 표적 부위는 유전자의 전사 시작 부위(TSS)의 어느 한 쪽의 600개 염기쌍 내에 있다.
엑손 서열 및 프로모터 및 활성화제를 포함하는 조절 영역의 서열을 포함하는, 유전자를 표적화하는 서열이거나 이를 포함하는 gRNA 서열을 설계하거나 확인하는 것은 당업자의 수준 내에 있다. CRISPR 게놈 편집을 위한 게놈 전체 gRNA 데이터베이스가 공개적으로 이용 가능하며, 이는 인간 게놈 또는 마우스 게놈에서 유전자의 구성적 엑손에 예시적인 단일 가이드 RNA(sgRNA) 표적 서열을 함유한다(예를 들어 genescript.com/gRNA-database.html; 또한, Sanjana et al. (2014) Nat. Methods, 11:783-4; www.e-crisp.org/E-CRISP/; crispr.mit.edu/ 참고). 일부 구현예에서, gRNA 서열은 비-표적 유전자에 대해 최소 표적-외 결합을 갖는 서열이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 조절 인자는 기능적 도메인, 예를 들어 전사 활성화제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 전사 활성화제는 표적 유전자의 하나 이상의 전사 제어 요소와 같은 하나 이상의 조절 요소이거나 이를 함유하여, 상기 제공된 바와 같은 부위-특이적 도메인이 이러한 유전자의 발현을 유도하기 위해 인식된다. 일부 구현예에서, 전사 활성화제는 표적 유전자의 발현을 유도한다. 일부 경우에, 전사 활성화제는 이종 트랜스활성화 도메인의 전부 또는 일부일 수 있거나 이를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 전사 활성화제는 단순 헤르페스-유래 트랜스활성화 도메인, Dnmt3a 메틸트랜스퍼라제 도메인, p65, VP16 및 VP64로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 조절 인자는 징크 핑거 전사 인자(ZF-TF)이다. 일부 구현예에서, 조절 인자는 VP64-p65-Rta(VPR)이다.
특정 구현예에서, 조절 인자는 전사 조절 도메인을 추가로 포함한다. 공통 도메인은 예를 들어 전사 인자 도메인(활성화제, 억제인자, 공동활성화제, 공동억제인자), 침묵화제, 종양유전자(예를 들어 myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos 패밀리 구성원 등); DNA 복구 효소 및 이의 관련 인자 및 변형제; DNA 재배열 효소 및 이의 관련 인자 및 변형제; 염색질 관련 단백질 및 이의 변형제(예를 들어, 키나제, 아세틸라제 및 탈아세틸라제); 및 DNA 변형 효소(예를 들어, 메틸트랜스퍼라제, 예컨대 DNMT 패밀리의 구성원(예를 들어, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L 등, 토포이소머라제, 헬리카제, 리가제, 키나제, 포스파타제, 폴리머라제, 엔도뉴클레아제) 및 이의 관련 인자 및 변형제를 포함한다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌(미국 공개 번호 2013/0253040)을 참고한다.
활성화 달성에 적합한 도메인은 HSV VP16 활성화 도메인(예를 들어, Hagmann et al., J. Virol. 71, 5952-5962 (1 97) 참고) 핵 호르몬 수용체(예를 들어 Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998) 참고); 핵 인자 카파 B의 p65 서브유닛(Bitko & Bank, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) 및 Doyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)); Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)), 또는 VP64(Beerli et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14623-33) 및 데그론(Molinari et al., (1999) EMBO J. 18, 6439-6447)과 같은 인공 키메라 기능적 도메인을 포함한다. 추가의 예시적인 활성화 도메인은 Oct 1, Oct-2A, Spl, AP-2 및 CTF1(Seipel etal, EMBOJ. 11, 4961-4968 (1992) 뿐만 아니라 p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, AtHD2A 및 ERF-2를 포함한다. 예를 들어, 문헌(Robyr et al., (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood et al., (1999) J. Mol. Endocrinol 23:255-275; Leo et al., (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKenna et al., (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik et al., (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; 및 Lemon et al., (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504)을 참고한다. 추가의 예시적인 활성화 도메인은 OsGAI, HALF-1, Cl, AP1, ARF-5, -6, -1 및 -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP 및 TRAB1을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 예를 들어 문헌(Ogawa et al., (2000) Gene 245:21-29; Okanami et al., (1996) Genes Cells 1 :87-99; Goff et al., (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho et al., (1999) Plant Mol Biol 40:419-429; Ulmason et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels et al., (2000) Plant J. 22:1-8; Gong et al., (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; 및 Hobo et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353)을 참고한다.
유전적 억제제를 만들기 위해 사용될 수 있는 예시적인 억제 도메인은 KRAB A/B, KOX, TGF-베타 유도성 초기 유전자(TIEG), v-erbA, SID, MBD2, MBD3, DNMT 패밀리의 구성원(예를 들어 DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L 등), Rb 및 MeCP2를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 문헌(Bird et al., (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al., (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al., (1999) Cell 99:447-450; 및 Robertson et al., (2000) Nature Genet. 25:338-342)을 참고한다. 추가의 예시적인 억제 도메인은 ROM2 및 AtHD2A를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 문헌(Chem et al., (1996) Plant Cell 8:305-321; 및 Wu et al., (2000) Plant J. 22:19-27)을 참고한다.
일부 경우에, 도메인은 염색체의 후성적 조절에 관여한다. 일부 구현예에서, 도메인은 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT), 예를 들어 MYST 패밀리 구성원 MOZ, Ybf2/Sas3, MOF 및 Tip60, GNAT 패밀리 구성원 Gcn5 또는 pCAF, p300 패밀리 구성원 CBP, p300 또는 Rttl09와 같은 핵 편재된 A형이다(Bemdsen and Denu (2008) Curr Opin Struct Biol 18(6):682-689). 다른 경우에 도메인은 클래스 I(HDAC-1, 2, 3 및 8), 클래스 II(HDAC IIA(HDAC-4, 5, 7 및 9), HD AC IIB(HDAC 6 및 10)), 클래스 IV(HDAC-11), 클래스 III(시르투인(SIRT)으로도 알려짐; SIRT1-7)과 같은 히스톤 탈아세틸라제(HD AC)이다(Mottamal et al., (2015) Molecules 20(3):3898-394l 참고). 일부 구현예에서 사용되는 또 다른 도메인은 히스톤 포스포릴라제 또는 키나제이며, 그 예는 MSK1, MSK2, ATR, ATM, DNA-PK, Bubl, VprBP, IKK-a, PKCpi, Dik/Zip, JAK2, PKC5, WSTF 및 CK2를 포함한다. 일부 구현예에서, 메틸화 도메인이 사용되고 Ezh2, PRMT1/6, PRMT5/7, PRMT 2/6, CARM1, set7/9, MLL, ALL-1, Suv 39h, G9a, SETDB1, Ezh2, Set2, Dot1, PRMT 1/6, PRMT 5/7, PR-Set7 및 Suv4-20h와 같은 군으로부터 선택될 수 있고, 수모일화 및 비오틴화에 관여하는 도메인(Lys9, 13, 4, 18 및 12)도 일부 구현예에서 사용될 수 있다(검토를 위해 Kousarides (2007) Cell 128:693-705 참고).
융합 분자는 당업자에게 잘 알려진 클로닝 및 생화학적 접합 방법에 의해 작제된다. 융합 분자는 DNA-결합 도메인 및 기능적 도메인(예를 들어, 전사 활성화 또는 억제 도메인)을 포함한다. 융합 분자는 또한 임의로 핵 편재 신호(예를 들어, SV40 중간 T-항원으로부터의 신호) 및 에피토프 태그(예를 들어, FLAG 및 헤마글루티닌)를 포함한다. 융합 단백질(및 이를 암호화하는 핵산)은 융합체 성분 중 번역 해독 프레임이 보존되도록 설계된다.
한편으로는 기능적 도메인(또는 이의 기능적 단편)의 폴리펩티드 성분과 다른 한편의 비단백질 DNA-결합 도메인(예를 들어 항생제, 삽입제, 마이너 그루브 결합제, 핵산) 사이의 융합이 당업자에게 알려진 생화학적 접합 방법에 의해 작제된다. 예를 들어 문헌(Pierce Chemical Company 카탈로그(Rockford, IL))를 참고한다. 마이너 그루브 결합제와 폴리펩티드 사이의 융합체를 만드는 방법 및 조성물이 설명되었다(Mapp et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935). 마찬가지로, 폴리펩티드 성분 기능적 도메인과 연합된 sgRNA 핵산 성분을 포함하는 CRISPR/Cas TF 및 뉴클레아제도 당업자에게 알려져 있고 본원에 상세히 설명되어 있다.
야생형 T 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 비-활성화 T 세포가 본원에 제공되며, 활성화된 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 제1 유전자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, T 세포 활성화 사이토카인 또는 가용성 T 세포 공동자극 분자로 처리되지 않았다. 일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 활성화 마커를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 CD3 및 CD28을 발현하고, CD3 및/또는 CD28은 불활성이다.
일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 OKT3이다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체는 CD28.2이다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로 구성된 T 세포 활성화 사이토카인 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 가용성 T 세포 공동자극 분자는 항-CD28 항체, 항-CD80 항체, 항-CD86 항체, 항-CD137L 항체 및 항-ICOS-L 항체로 구성된 가용성 T 세포 공동자극 분자 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 1차 T 세포이다. 다른 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 본 기술의 저면역원성 세포로부터 분화된다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다.
일부 구현예에서, 제1 유전자는 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터에 의해 운반된다. 일부 구현예에서, 제1 유전자는 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR로 구성된 군으로부터 선택된 CAR이다. 일부 구현예에서, CAR은 이중특이적 CAR이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 CAR은 CD19/CD22 이중특이적 CAR이다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 유전자는 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터에 의해 운반된다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 유전자는 조건부 또는 유도성 전위효소, 조건부 또는 유도성 PiggyBac 트랜스포존, 조건부 또는 유도성 슬리핑 뷰티(SB11) 트랜스포존, 조건부 또는 유도성 Mos1 트랜스포존 및 조건부 또는 유도성 Tol2 트랜스포존으로 구성된 군으로부터 선택된 퓨소겐-매개 전달 또는 전위효소 시스템을 사용하여 세포에 도입된다.
일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 제2 유전자 CD47을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 유전자는 T 세포의 적어도 하나의 대립유전자의 특정 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 특정 유전자좌는 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 제2 유전자는 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된 특정 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 제1 유전자는 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된 특정 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자는 상이한 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자는 동일한 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서 CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자는 B2M 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자는 CIITA 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자는 TRAC 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자는 TRB 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌, F3(CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자, 유전자좌 MICB 유전자, 유전자좌 LRP1(CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, ad RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌, PDGFRa 유전자 유전자좌, OLIG2 유전자 유전자좌, GFAP 유전자 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 B2M을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서 비-활성화 T 세포는 HLA-DP, HLA-DQ 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 CIITA를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 TCR-알파 및 TCR-베타를 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 TRAC 유전자좌에 삽입된 CD47을 암호화하는 제2 유전자 및/또는 CAR을 암호화하는 제1 유전자를 포함하는 B2M삽입결실/삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, TRAC삽입결실/삽입결실 세포이다. 일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 TRAC 유전자좌에 삽입된 CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자를 포함하는 B2M삽입결실/삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, TRAC삽입결실/삽입결실 세포이다. 일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 TRB 유전자좌에 삽입된 CD47을 암호화하는 제2 유전자 및/또는 CAR을 암호화하는 제1 유전자를 포함하는 B2M삽입결실/삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, TRAC삽입결실/삽입결실 세포이다. 일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 TRB 유전자좌에 삽입된 CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자를 포함하는 B2M삽입결실/삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, TRAC삽입결실/삽입결실 세포이다. 일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 B2M 유전자좌에 삽입된 CD47을 암호화하는 제2 유전자 및/또는 CAR을 암호화하는 제1 유전자를 포함하는 B2M삽입결실/삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, TRAC삽입결실/삽입결실 세포이다. 일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 B2M 유전자좌에 삽입된 CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자를 포함하는 B2M삽입결실/삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, TRAC삽입결실/삽입결실 세포이다. 일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 CIITA 유전자좌에 삽입된 CD47을 암호화하는 제2 유전자 및/또는 CAR을 암호화하는 제1 유전자를 포함하는 B2M삽입결실/삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, TRAC삽입결실/삽입결실 세포이다. 일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포는 CIITA 유전자좌에 삽입된 CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자를 포함하는 B2M삽입결실/삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, TRAC삽입결실/삽입결실 세포이다.
야생형 T 세포에 비해 HLA-A, HLA-B, HLA-C, CIITA, TCR-알파 및/또는 TCR-베타의 감소된 발현을 포함하는 조작된 T 세포가 본원에 제공되며, 조작된 T 세포는 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터에 의해 운반되는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 제1 유전자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 1차 T 세포이다. 다른 구현예에서, 조작된 T 세포는 본 기술의 저면역원성 세포로부터 분화된다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ T 세포이다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 활성화 마커를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 CD3 및 CD28을 발현하고, CD3 및/또는 CD28은 불활성이다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, T 세포 활성화 사이토카인 또는 가용성 T 세포 공동자극 분자로 처리되지 않았다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 OKT3이고, 항-CD28 항체는 CD28.2이고, T 세포 활성화 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15, 및 IL-21로 구성된 T 세포 활성화 사이토카인 군으로부터 선택되고, 가용성 T 세포 공동자극 분자는 항-CD28 항체, 항-CD80 항체, 항-CD86 항체, 항-CD137L 항체, 및 항-ICOS-L 항체로 구성된 가용성 T 세포 공동자극 분자 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 활성화 사이토카인으로 처리되지 않았다. 일부 경우에, 사이토카인이 IL-2이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-2 그리고 IL-7, IL-15 및 IL-21로 구성된 군으로부터 선택된 또 다른 사이토카인이다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 제2 유전자 CD47을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 유전자는 T 세포의 적어도 하나의 대립유전자의 특정 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 특정 유전자좌는 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 제2 유전자는 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된 특정 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 제1 유전자는 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된 특정 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자는 상이한 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자는 동일한 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 제2 유전자 및 CAR을 암호화하는 제1 유전자는 B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌, TRB 유전자좌, 또는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전자좌, F3(CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자, 유전자좌 MICB 유전자, 유전자좌 LRP1(CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, ad RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌, PDGFRa 유전자 유전자좌, OLIG2 유전자 유전자좌, GFAP 유전자 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CAR은 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 항원을 발현하지 않으며, 조작된 T 세포는 B2M을 발현하지 않으며, 조작된 T 세포는 HLA-DP, HLA-DQ, 및/또는 HLA-DR 항원을 발현하지 않고, 조작된 T 세포는 CIITA를 발현하지 않고 및/또는 조작된 T 세포는 TCR-알파 및 TCR-베타를 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 TRAC 유전자좌, TRB 유전자좌, B2M 유전자좌 또는 CIITA 유전자좌에 삽입된 CD47을 암호화하는 제2 유전자 및/또는 CAR을 암호화하는 제1 유전자를 포함하는 B2M삽입결실/삽입결실, CIITA삽입결실/삽입결실, TRAC삽입결실/삽입결실 세포이다.
일부 구현예에서, 본 기술의 비-활성화 T 세포 및/또는 조작된 T 세포는 대상체에 있다. 다른 구현예에서, 본 기술의 비-활성화 T 세포 및/또는 조작된 T 세포는 시험관내에 있다.
일부 구현예에서, 본 기술의 비-활성화 T 세포 및/또는 조작된 T 세포는 CD8 결합제를 발현한다. 일부 구현예에서, CD8 결합제는 항-CD8 항체이다. 일부 구현예에서, 항-CD8 항체는 마우스 항-CD8 항체, 토끼 항-CD8 항체, 인간 항-CD8 항체, 인간화 항-CD8 항체, 낙타류(예를 들어, 라마, 알파카, 낙타) 항-CD8 항체 및 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이의 단편은 scFV 또는 VHH이다. 일부 구현예에서, CD8 결합제는 CD8 알파 사슬 및/또는 CD8 베타 사슬에 결합한다.
일부 구현예에서, CD8 결합제는 바이러스 외피에 통합된 막횡단 도메인에 융합된다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 바이러스 융합 단백질로 위유형화된다. 일부 구현예에서, 바이러스 융합 단백질은 그 천연 수용체에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 융합 단백질은 CD8 결합제에 융합된다. 일부 구현예에서, 바이러스 융합 단백질은 CD8 결합제에 융합된 Nipah 바이러스 F 당단백질 및 Nipah 바이러스 G 당단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 T 세포 활성화 분자 또는 T 세포 공동자극 분자를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 제1 유전자 및/또는 제2 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 제1 대상체로의 전달 후, 비-활성화 T 세포 또는 조작된 T 세포는 제2 대상체로의 전달 후 야생형 세포와 비교하여 감소된 (a) T 세포 반응, (b) NK 세포 반응, 및 (c) 대식세포 반응으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 반응을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제1 대상체와 제2 대상체는 상이한 대상체이다. 일부 구현예에서, 대식세포 반응은 삼킴이다.
일부 구현예에서, 대상체로의 전달 후, 비-활성화 T 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체로의 전달 후 야생형 세포와 비교하여 (a) 대상체에서 감소된 TH1 활성화, (b) 대상체에서 감소된 NK 세포 사멸 및 (c) 대상체에서 전체 PBMC에 의한 감소된 사멸로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 나타낸다.
일부 구현예에서, 대상체로의 전달 후, 비-활성화 T 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체로의 전달 후 야생형 세포와 비교하여 (a) 대상체에서 감소된 공여체 특이적 항체, (b) 대상체에서 감소된 IgM 또는 IgG 항체 및 (c) 대상체에서 감소된 보체-의존적 세포독성(CDC)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 유도한다.
일부 구현예에서, 비-활성화 T 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체 내에서 CD8 결합제를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 CAR 및/또는 CD47을 암호화하는 유전자를 운반한다.
본 기술의 비-활성화 T 세포 및/또는 조작된 T 세포 집단 및 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물이 본원에 제공된다.
본 기술의 비활성 T 세포 및/또는 조작된 T 세포 집단을 포함하는 조성물, 또는 본 기술의 하나 이상의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 대상체는 조성물의 투여 전, 후 및/또는 동시에 T 세포 활성화 치료를 투여받지 않는다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화 치료는 림프구고갈을 포함한다.
본 기술의 비-활성화 T 세포 및/또는 조작된 T 세포 집단을 포함하는 조성물, 또는 본 기술의 하나 이상의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 대상체는 조성물의 투여 전, 후 및/또는 동시에 T 세포 활성화 치료를 투여받지 않는다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화 치료는 림프구고갈을 포함한다.
본 기술의 비-활성화 T 세포 및/또는 조작 T 세포의 집단을 포함하는 조성물 또는 본 기술의 하나 이상의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내에서 T 세포 증식을 필요로 하는 대상체에서 종양 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있는 T 세포를 증식시키는 방법이 본원에 제공되며, 대상체는 조성물의 투여 전, 후 및/또는 동시에 T 세포 활성화 치료를 투여받지 않는다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화 치료는 림프구고갈을 포함한다.
본 기술의 비-활성화 T 세포 및/또는 조작된 T 세포 집단을 포함하는 약학 조성물, 또는 본 기술의 하나 이상의 약학 조성물, 및 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 담체, 희석제 또는 부형제의 투여를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 투약 요법이 본원에 제공되며, 약학 조성물은 약 1-3개 용량으로 투여된다.
일단 변경되면, 본원에 설명된 임의의 분자의 발현의 존재는 웨스턴 블롯, ELISA 검정, FACS 검정 등과 같은 알려진 기술을 사용하여 검정될 수 있다.
Q. 유도된 만능 줄기 세포의 생성
한 측면에서, 저면역원성 만능 세포를 생성하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 만능 줄기 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 마우스 및 인간 만능 줄기 세포(일반적으로 iPSC; 쥣과 세포의 경우 miPSC 또는 인간 세포의 경우 hiPSC로 지칭됨)의 생성은 일반적으로 당분야에 알려져 있다. 당업자에게 이해될 바와 같이, iPCS 생성을 위한 다양한 상이한 방법이 존재한다. 최초의 유도는 4개의 전사 인자, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4의 바이러스 도입을 사용하여 마우스 배아 또는 성체 섬유아세포로부터 수행되었다; 그 전체가 그리고 특히 여기에 개략된 기술이 본원에 참조로 포함된 문헌(Takahashi and Yamanaka Cell 126:663-676 (2006))을 참고한다. 그 이후로 많은 방법이 개발되었다; 둘 다 명시적으로 이의 전체 그리고 특히 hiPSC를 생성하는 방법에 대해 본원에 참조로 포함된 문헌(리뷰를 위해 Seki et al., World J. Stem Cells 7(1): 116-125 (2015), 및 Lakshmipathy and Vermuri, editors, Methods in Molecular Biology: Pluripotent Stem Cells, Methods and Protocols, Springer 2013)을 참고한다(예를 들어 후자 참고문헌의 3장 참고).
일반적으로, iPSC는 보통 에피솜 벡터를 사용하여 도입되는 숙주 세포에서 하나 이상의 재프로그래밍 인자의 일시적 발현에 의해 생성된다. 이러한 조건 하에, 소량의 세포가 iPSC가 되도록 유도된다(일반적으로 선택 마커가 사용되지 않기 때문에 이 단계의 효율은 낮음). 일단 세포가 "재프로그래밍"되고 만능이 되면, 이들은 에피솜 벡터(들)를 소실하고 내인성 유전자를 사용하여 인자를 생성한다.
또한 당업자에게 이해되는 바와 같이, 사용될 수 있거나 사용되는 재프로그래밍 인자의 수는 다를 수 있다. 일반적으로, 더 적은 재프로그래밍 인자가 사용될 때, 세포의 만능 상태로의 변환 효율뿐만 아니라 "만능성"이 감소하며, 예를 들면 세포에서 더 적은 재프로그래밍 인자는 완전 만능은 아니지만 더 적은 세포 유형으로만 분화할 수 있는 세포를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 단일 재프로그래밍 인자 OCT4가 사용된다. 다른 구현예에서, 2개의 재프로그래밍 인자, OCT4 및 KLF4가 사용된다. 다른 구현예에서, 3개의 재프로그래밍 인자, OCT4, KLF4 및 SOX2가 사용된다. 다른 구현예에서, 4개의 재프로그래밍 인자, OCT4, KLF4, SOX2 및 c-Myc이 사용된다. 다른 구현예에서, 5개, 6개 또는 7개의 재프로그래밍 인자가 SOKMNLT; SOX2, OCT4(POU5F1), KLF4, MYC, NANOG, LIN28 및 SV40L T 항원으로부터 선택되어 사용될 수 있다. 일반적으로, 이들 리프로그래밍 인자 유전자는 당분야에 알려지고 상업적으로 이용 가능한 것과 같은 에피솜 벡터 상에 제공된다.
일반적으로, 당분야에 알려진 바와 같이, 본원에 설명된 바와 같은 재프로그래밍 인자를 일시적으로 발현시킴으로써 혈액 세포, 섬유아세포 등과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 비만능 세포로부터 iPSC가 제조된다.
R. 저면역원성 표현형 및 만능성 보유에 대한 검정
일단 저면역원성 세포가 생성되면, WO2016183041 및 WO2018132783에 설명된 바와 같이 이들은 저면역원성 및/또는 만능성 보유에 대해 검정될 수 있다.
일부 구현예에서, 저면역원성은 WO2018132783의 도 13 및 도 15에 예시된 바와 같은 여러 기술을 사용하여 검정된다. 이러한 기술은 동종이계 숙주로의 이식 및 숙주 면역계를 벗어나는 저면역원성 만능 세포 성장(예를 들어 기형종)에 대한 모니터링을 포함한다. 일부 경우에, 저면역원성 만능 세포 유도체는 형질도입되어 루시퍼라제를 발현하고 생물발광 이미징을 사용하여 추적될 수 있다. 유사하게, 이러한 세포에 대한 숙주 동물의 T 세포 및/또는 B 세포 반응이 시험되어 세포가 숙주 동물에서 면역 반응을 유발하지 않는지 확인한다. T 세포 반응은 Elispot, ELISA, FACS, PCR 또는 질량 세포측정(CYTOF)에 의해 평가될 수 있다. B 세포 반응 또는 항체 반응은 FACS 또는 Luminex를 사용하여 평가된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 세포는 WO2018132783의 도 14 및 15에 일반적으로 나타낸 바와 같이 선천성 면역 반응, 예를 들어 NK 세포 사멸을 피하는 능력에 대해 검정될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 면역원성은 T 세포 증식 검정, T 세포 활성화 검정, 및 당업자에 의해 인식되는 T 세포 사멸 검정과 같은 T 세포 면역검정을 사용하여 평가된다. 일부 경우에, T 세포 증식 검정은 세포를 인터페론-감마로 전처리하고 세포를 표지된 T 세포와 공동배양하고 소정량의 시간 후에 T 세포 집단(또는 증식하는 T 세포 집단)의 존재를 검정하는 것을 포함한다. 일부 경우에, T 세포 활성화 검정은 T 세포를 본원에 개략된 세포와 공동배양하고 T 세포에서 T 세포 활성화 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다.
생체내 검정이 수행되어 본원에 개략된 세포의 면역원성을 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포의 생존 및 면역원성은 동종이계 인간화 면역결핍 마우스 모델을 사용하여 결정된다. 일부 경우에, 저면역원성 만능 줄기 세포는 동종이계 인간화 NSG-SGM3 마우스에 이식되고 세포 거부, 세포 생존 및 기형종 형성에 대해 검정된다. 일부 경우에, 그래프팅된 저면역원성 만능 줄기 세포 또는 이의 분화된 세포는 마우스 모델에서 장기 생존을 나타낸다.
세포의 저면역원성을 포함하여 면역원성을 결정하기 위한 추가 기술은 예를 들어 문헌(Deuse et al., Nature Biotechnology, 2019, 37, 252-258 and Han et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2019, 116(21), 10441-10446)에 설명되며, 도면, 도면 범례 및 방법의 설명을 포함하는 개시 전체가 본원에 참조로 포함된다.
유사하게, 만능성의 보유는 여러 방식으로 시험된다. 한 구현예에서, 만능성은 본원에 일반적으로 설명되고 WO2018132783의 도 29에 나타낸 바와 같은 특정 만능성-특이적 인자의 발현에 의해 검정된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 만능 세포는 만능성의 표시로서 하나 이상의 세포 유형으로 분화된다.
당업자에게 이해될 바와 같이, 만능 세포에서 MHC I 기능(세포가 인간 세포로부터 유래된 경우 HLA I)의 성공적인 감소는 당분야에 알려진 기술을 사용하여 아래에 설명된 바와 같이; 예를 들어, HLA 복합체에 결합하는 표지된 항체를 사용하는 FACS 기술; 예를 들어, 인간 주조직 적합성 HLA 클래스 I 항원의 알파 사슬에 결합하는 상업적으로 이용 가능한 HLA-A, B, C 항체를 사용하여 측정될 수 있다.
또한, HLA I 복합체가 세포 표면 상에서 발현되지 않음을 확인하기 위해 세포가 시험될 수 있다. 이는 상기 논의된 바와 같이 하나 이상의 HLA 세포 표면 성분에 대한 항체를 사용하는 FACS 분석에 의해 검정될 수 있다.
만능 세포 또는 이의 유도체에서 MHC II 기능(세포가 인간 세포로부터 유래된 경우 HLA II)의 성공적인 감소는 단백질에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅, FACS 기술, RT-PCR 기술 등과 같은 당분야에 알려진 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
또한, HLA II 복합체가 세포 표면 상에서 발현되지 않음을 확인하기 위해 세포가 시험될 수 있다. 다시, 이 검정은 당분야에 알려진 바와 같이 수행되며(예를 들어 WO2018132783의 도 21 참고) 일반적으로 인간 HLA 클래스 II HLA-DR, DP 및 대부분의 DQ 항원에 결합하는 상업적 항체에 기반하는 웨스턴 블롯 또는 FACS 분석을 사용하여 수행된다.
HLA I 및 II(또는 MHC I 및 II)의 감소 이외에, 본원에 제공된 저면역원성 세포는 대식세포 식균작용 및 NK 세포 사멸에 대해 감소된 감수성을 갖는다. 생성된 저면역원성 세포는 하나 이상의 CD24 전이유전자의 발현으로 인해 면역 대식세포 및 선천성 경로를 "벗어"난다.
S. 만능 줄기 세포의 유지
일단 저면역원성 만능 줄기 세포가 생성되면, 이들은 iPSC를 유지하는 것으로 알려진 미분화 상태를 유지할 수 있다. 예를 들어, 세포는 분화를 방지 하고 만능성을 유지하는 배양 배지를 사용하여 매트리겔 상에서 배양될 수 있다. 또한, 이들은 만능성을 유지하기 위한 조건 하에 배양 배지에 있을 수 있다.
T. 저면역원성 유도된 만능(HIP) 줄기 세포로부터 분화된 세포
한 측면에서, 수신 대상체로의 후속 이식을 위해 상이한 세포 유형으로 분화되는 HIP 세포가 본원에 제공된다. 분화는 일반적으로 세포-특이적 마커의 존재를 평가함으로써, 당분야에 알려진 바와 같이 검정될 수 있다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 분화된 저면역원성 만능 세포 유도체는 세포 유형 및 이들 세포의 궁극적 용도 모두에 의존하는 당분야에 알려진 기술을 사용하여 이식될 수 있다.
1. 저면역원성 만능 세포로부터 분화된 심장 세포
대상체(예를 들어, 수신체)로의 후속 이식 또는 생착을 위해 HIP 세포로부터 분화된 심장 세포 유형이 본원에 제공된다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 분화 방법은 알려진 기술을 사용하여 원하는 세포 유형에 의존한다. 예시적인 심장 세포 유형은 심근세포, 결절성 심근세포, 전도성 심근세포, 작업 심근세포, 심근세포 전구체 세포, 심근세포 전구 세포, 심장 줄기 세포, 심장 근육 세포, 심방 심장 줄기 세포, 심실 심장 줄기 세포, 심외막 세포, 조혈 세포, 혈관 내피 세포, 심내막 내피 세포, 심장 판막 간질 세포, 심장 박동조율 세포 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 심장 세포는 소아 심근병증, 노화 관련 심근병증, 확장성 심근병증, 비대성 심근병증, 제한성 심근병증, 만성 허혈성 심근병증, 주산기 심근병증, 염증성 심근병증, 특발성 심근병증, 다른 심근병증, 심근 허혈성 재관류 손상, 심실 기능장애, 심부전, 울혈성 심부전, 관상 동맥 질환, 말기 심장 질환, 죽상동맥경화증, 허혈, 고혈압, 재협착증, 협심증, 류마티스성 심장, 동맥 염증, 심혈관 질환, 심근 경색, 심근 허혈, 울혈성 심부전, 심근 경색, 심장 허혈, 심장 손상, 심근 허혈, 혈관 질환, 후천성 심장병, 선천성 심장병, 죽상동맥경화증, 관상 동맥 질환, 기능장애 전도 시스템, 기능장애 관상 동맥, 폐 고혈압, 심장 부정맥, 근이영양증, 근육량 이상, 근육 퇴행, 심근염, 감염성 심근염, 약물 또는 독소-유도 근육 이상, 과민성 심근염 및 자가면역 심내막염으로 구성된 군으로부터 선택된 심장 장애를 치료하기 위해 수신 대상체에 투여된다.
따라서, 치료 및 방지를 필요로 하는 대상체에서 심장 손상 또는 심장 질환 또는 장애의 치료 및 방지 방법이 본원에 제공된다. 본원에 설명된 방법은 심장의 구조 및/또는 기능에 병리학적 손상을 초래하는 것과 같은 여러 심장 질환 또는 이의 증상의 진행을 치료, 완화, 방지 또는 둔화하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "심장 질환", "심장 장애" 및 "심장 손상"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 심장의 판막, 내피, 경색 영역 또는 다른 성분 또는 구조를 포함하는 심장과 관련된 병태 및/또는 장애를 지칭한다. 이러한 심장 질환 또는 심장 관련 질환은 특히 심근 경색, 심부전, 심근병증, 선천성 심장 결함, 심장 판막 질환 또는 기능장애, 심내막염, 류마티스열, 승모판 탈출증, 감염성 심내막염, 비대성 심근병증, 확장성 심근병증, 심근염, 심비대 및/또는 승모판 부전 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 심근세포 전구체는 성숙(말기 단계) 심근세포를 포함하는 자손을 발생시킬 수 있는 세포를 포함한다. 심근세포 전구체 세포는 종종 GATA-4, Nkx2.5 및 MEF-2 패밀리의 전사 인자로부터 선택된 하나 이상의 마커를 사용하여 확인될 수 있다. 일부 경우에, 심근세포는 하기 목록: 심장 트로포닌 I(cTnl), 심장 트로포닌 T(cTnT), 사코머 미오신 중쇄(MHC), GATA-4, Nkx2.5, N-카드헤린, β2-아드레노셉터, ANF, 전사 인자의 MEF-2 패밀리, 크레아틴 키나제 MB(CK-MB), 미오글로빈 및 심방 나트륨이뇨 인자(ANF)로부터의 하나 이상의 마커(때때로 적어도 2, 3, 4 또는 5개 마커)를 발현하는 미성숙 심근세포 또는 성숙 심근세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 심장 세포는 자발적인 주기적 수축 활성을 실증한다. 일부 경우에, 심장 세포가 적절한 Ca2+ 농도 및 전해질 균형을 갖춘 적절한 조직 배양 환경에서 배양될 때 세포는 세포의 한 축을 가로질러 주기적으로 수축한 다음 배양 배지에 임의의 추가 성분을 첨가하지 않고 수축으로부터 이완되는 것을 관찰할 수 있다. 일부 구현예에서, 심장 세포는 저면역원성 심장 세포이다.
일부 구현예에서, 시험관내 분화에 의해 저면역원성 만능(HIP) 세포 집단으로부터 저면역원성 심장 세포 집단을 생성하는 방법은 (a) GSK 억제제를 포함하는 배양 배지에서 HIP 세포 집단을 배양하는 단계; (b) WNT 길항제를 포함하는 배양 배지에서 HIP 세포 집단을 배양하여 전심장 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (c) 인슐린을 포함하는 배양 배지에서 전심장 세포 집단을 배양하여 저면역 심장 세포 집단을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, GSK 억제제는 CHIR-99021, 이의 유도체 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, GSK 억제제는 약 2 mM 내지 약 10 mM 범위의 농도이다. 일부 구현예에서, WNT 길항제는 IWR1, 이의 유도체 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, WNT 길항제는 약 2 mM 내지 약 10 mM 범위의 농도이다.
일부 구현예에서, 저면역원성 심장 세포 집단은 비-심장 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 단리된 저면역원성 심장 세포 집단은 투여 전에 증식된다. 특정 구현예에서, 단리된 저면역원성 심장 세포 집단은 투여 전에 증식되고 동결보존된다.
일부 구현예에서, 만능 세포는 심혈관 질환을 해결하기 위해 심근세포로 분화된다. hiPSC를 심근세포로 분화시키는 기술은 당분야에 알려져 있고 실시예에서 논의된다. 분화는 일반적으로 심근세포 관련 또는 특이적 마커의 존재를 평가하거나 기능적으로 측정함으로써 당분야에 알려진 바와 같이 검정될 수 있다; 예를 들어 그 전체가 그리고 특히 심근세포를 포함하는 줄기 세포를 분화시키는 방법에 대해 본원에 참조로 포함된 문헌(Loh et al., Cell, 2016, 166, 451-467)을 참고한다.
유도된 만능 줄기 세포 또는 만능 줄기 세포를 심장 세포로 분화시키는 다른 유용한 방법은 예를 들어 문헌(US2017/0152485; US2017/0058263; US2017/0002325; US2016/0362661; US2016/0068814; US9,062,289; US7,897,389; 및 US7,452,718)에 설명된다. 유도된 만능 줄기 세포 또는 만능 줄기 세포로부터 심장 세포를 생성하는 추가 방법은 예를 들어 문헌(Xu et al., Stem Cells and Development, 2006, 15(5): 631-9, Burridge et al., Cell Stem Cell, 2012, 10: 16-28, 및 Chen et al., Stem Cell Res, 2015, l5(2):365-375)에 설명된다.
다양한 구현예에서, 저면역원성 심장 세포는 BMP 경로 억제제, WNT 신호전달 활성화제, WNT 신호 억제제, WNT 효능제, WNT 길항제, Src 억제제, EGFR 억제제, PCK 활성화제, 사이토카인, 성장인자, 강심제, 화합물 등을 포함하는 배양 배지에서 배양될 수 있다.
WNT 신호전달 활성화제는 CHIR99021을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. PCK 활성화제는 PMA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. WNT 신호전달 억제제는 KY02111, SO3031(KY01-I), SO2031(KY02-I) 및 SO3042(KY03-I) 그리고 XAV939로부터 선택되는 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Src 억제제는 A419259를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. EGFR 억제제는 AG1478을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
iPSC로부터 심장 세포를 생성하기 위한 제제의 비제한적 예는 액티빈 A, BMP4, Wnt3a, VEGF, 가용성 frizzled 단백질, 사이클로스포린 A, 안지오텐신 II, 페닐에프린, 아스코르브산, 디메틸설폭시드, 5-아자-2'-데옥시시티딘 등을 포함한다.
본원에 제공된 세포는 저면역원성 만능 세포의 심장 세포로의 분화를 지지 및/또는 촉진하기 위해 합성 표면과 같은 표면 상에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 표면은 선택된 하나 이상의 아크릴레이트 단량체의 단독중합체 또는 공중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 중합체 물질을 포함한다. 아크릴레이트 단량체 및 메타크릴레이트 단량체의 비제한적 예는 테트라(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트, 글리세롤 디메타크릴레이트, 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트, 디(에틸렌 글리콜) 디메타크릴레이트, 테트라(에틸렌 글리콜) 디메타크릴레이트, 1,6-헥산디올 프로폭실레이트 디아크릴레이트, 네오펜틸 글리콜 디아크릴레이트, 트리메틸올프로판 벤조에이트 디아크릴레이트, 트리메틸올프로판 에이혹실레이트(1 EO/QH) 메틸, 트리사이클로[5.2.1.02,6] 데칸 디메탄올 디아크릴레이트, 네오펜틸 글리콜 엑속실레이트 디아크릴레이트 및 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트를 포함한다. 아크릴레이트는 당분야에 알려진 바와 같이 합성되거나 Polysciences, Inc., Sigma Aldrich, Inc. 및 Sartomer, Inc.와 같은 상업적 공급업체로부터 얻는다.
중합체성 물질은 지지 물질의 표면 상에 분산될 수 있다. 세포 배양에 적합한 유용한 지지 물질은 세라믹 물질, 유리, 플라스틱, 중합체 또는 공중합체, 이의 임의의 조합, 또는 또 다른 물질 상의 한 물질의 코팅을 포함한다. 일부 경우에, 유리는 소다 석회 유리, 파이렉스 유리, 바이코르 유리, 석영 유리, 규소 또는 이의 유도체 등을 포함한다.
일부 경우에, 수지상 중합체를 포함하는 플라스틱 또는 중합체는 폴리(비닐 클로라이드), 폴리(비닐 알코올), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(비닐 아세테이트-말레산 무수물), 폴리(디메틸실록산) 모노메타크릴레이트, 사이클릭 올레핀 중합체, 플루오로카본 중합체, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌이민 또는 이의 유도체 등을 포함한다. 일부 경우에, 공중합체는 폴리(비닐 아세테이트-공-말레산 무수물), 폴리(스티렌-공-말레산 무수물), 폴리(에틸렌-공-아크릴산) 또는 이의 유도체 등을 포함한다.
본원에 설명된 바와 같이 제조된 심장 세포의 유효성은 치료 없이 좌심실 벽 조직의 55%가 sCAR-조직이 되도록 유발하는, 심장 동결손상에 대한 동물 모델에서 평가될 수 있다(Li et al., Ann. Thorac. Surg. 62:654, 1996; Sakai et al., Ann. Thorac. Surg. 8:2074, 1999, Sakai et al., Thorac. Cardiovasc. Surg. 118:715, 1999). 성공적인 치료는 흉터 면적을 줄이고 흉터 확대를 제한하며 수축기, 이완기 및 발생된 압력에 의해 결정되는 심장 기능을 개선할 수 있다. 심장 손상은 또한 좌전하행 동맥의 원위 부분에서 색전 코일을 사용하여 모델링될 수 있고(Watanabe et al., Cell Transplant. 7:239, 1998), 치료의 유효성은 조직학 및 심장 기능에 의해 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 투여는 대상체의 심장 조직으로의 임플란트, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 관상내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 심근내 주사, 경심내막 주사, 경심외막 주사 또는 주입을 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 심장 세포가 투여된 환자에는 심장 약물이 또한 투여된다. 병용 치료법에서 사용하기 적합한 심장 약물의 예시적인 예는 성장 인자, 성장 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 혈관신생제, 칼슘 채널 차단제, 항고혈압제, 항유사분열제, 수축촉진제, 항동맥경화제, 항응고제, 베타-차단제, 항부정맥제, 항염증제, 혈관확장제, 혈전용해제, 강심 배당체, 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 원생동물 억제제, 질산염, 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제, 안지오텐신 II 수용체 길항제, 뇌 나트륨이뇨 펩티드(BNP); 항신생물제, 스테로이드 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 제공된 방법에 따른 치료법의 효과는 다양한 방식으로 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 심전도(ECG) 또는 홀리어(holier) 모니터가 치료 유효성을 결정하기 위해 이용될 수 있다. ECG는 심장 박동 및 전기 자극의 척도이며 치료법이 대상체의 심장에서 전기 전도의 저하를 개선 또는 유지, 방지 또는 둔화했는지를 결정하기 위해 매우 효과적이고 비침습적인 방식이다. 심장 이상, 부정맥 장애 등을 모니터링하기 위해 장시기 동안 착용될 수 있는 휴대용 ECG인 홀리어 모니터를 사용하는 것도 치료법의 효과를 평가하기 위해 신뢰할 수 있는 방법이다. ECG 또는 핵 연구가 심실 기능의 개선을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
2. 저면역원성 만능 세포로부터 분화된 신경 세포
수신 대상체로의 후속 이식 또는 생착에 유용한 HIP 세포로부터 분화된 상이한 신경 세포 유형이 본원에 제공된다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 분화 방법은 알려진 기술을 사용하여 원하는 세포 유형에 의존한다. 예시적인 신경 세포 유형은 대뇌 내피 세포, 뉴런(예를 들어, 도파민성 뉴런), 아교 세포 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 유도된 만능 줄기 세포의 분화는 이의 분화를 특정한 원하는 관심 계통 및/또는 세포 유형으로 표적화하기 위해 세포를 특정 세포 계통(들)을 생성하는 것으로 알려진 특정 인자에 노출시키거나 이와 접촉시켜 수행된다. 일부 구현예에서, 말단 분화 세포는 특화된 표현형 특성 또는 특징을 나타낸다. 특정 구현예에서, 본원에 설명된 줄기 세포는 신경외배엽, 신경, 신경내분비, 도파민성, 콜린성, 세로토닌성(5-HT), 글루타메이트성, GABA성, 아드레날린성, 노르아드레날린성, 교감 신경, 부교감 신경, 교감 말초 신경, 또는 아교 세포 세포 집단으로 분화된다. 일부 경우에, 아교 세포 집단은 미세아교(예를 들어, 아메바형, 분지형, 활성화된 식세포 및 활성화된 비-식세포) 세포 집단 또는 거대아교(중추 신경계 세포: 성상세포, 희소돌기아교세포, 뇌실막 세포, 및 방사상 아교세포; 및 말초 신경계 세포: 슈반 세포 및 위성 세포) 세포 집단, 또는 임의의 선행 세포의 전구체 및 전구 세포를 포함한다.
상이한 유형의 신경 세포를 생성하기 위한 프로토콜은 문헌(PCT 출원 번호 WO2010144696, US 특허 번호 9,057,053; 9,376,664; 및 10,233,422)에 설명된다. 저면역원성 만능 세포를 분화시키는 방법에 대한 추가 설명은 예를 들어 문헌(Deuse et al., Nature Biotechnology, 2019, 37, 252-258 및 Han et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2019, 116(21), 10441-10446)에서 찾을 수 있다. 신경학적 장애 또는 병태의 동물 모델에서 신경 세포 이식의 효과를 결정하는 방법은 하기 참고문헌(척수 손상의 경우 - Curtis et al., Cell Stem Cell, 2018, 22, 941-950; 파킨슨병의 경우 - Kikuchi et al., Nature, 2017, 548:592-596; ALS의 경우 - Izrael et al., Stem Cell Research, 2018, 9(1):152 및 Izrael et al., IntechOpen, DOI: 10.5772/intechopen.72862; 간질의 경우 - Upadhya et al., PNAS, 2019, 116(1):287-296)에 설명된다.
a. 대뇌 내피 세포
일부 구현예에서, 신경 세포는 파킨슨병, 헌팅톤병, 다발성 경화증, 다른 신경퇴행성 질환 또는 병태, 주의력 결핍 과잉행동 장애(ADHD), 뚜렛 증후군(TS), 정신분열증, 정신병, 우울증, 다른 신경정신과 장애를 치료하기 위해 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 신경 세포는 뇌졸중을 치료 또는 완화하기 위해 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 뉴런 및 아교 세포는 근위축성 측삭 경화증(ALS)이 있는 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 뇌출혈의 증상 또는 효과를 경감시키기 위해 뇌 내피 세포가 투여된다. 일부 구현예에서, 도파민성 뉴런이 파킨슨병이 있는 환자에 투여된다. 일부 구현예에서, 노르아드레날린성 뉴런, GABA성 중간뉴런이 간질 발작을 경험한 환자에 투여된다. 일부 구현예에서, 운동 뉴런, 중간뉴런, 슈반 세포, 희소돌기아교세포 및 미세아교세포가 척수 손상을 경험한 환자에 투여된다.
일부 구현예에서, 대뇌 내피 세포(EC), 전구체, 및 이의 전구 세포는 대뇌 EC 세포 또는 신경 세포의 생성을 촉진하는 하나 이상의 인자를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 표면 상의 만능 줄기 세포(예를 들어, 유도된 만능 줄기 세포)로부터 분화된다. 경우에 따라 배지는 하기: CHIR-99021, VEGF, 염기성 FGF(bFGF) 및 Y-27632 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 신경 세포의 생존 및 기능성을 촉진하도록 설계된 보충물질을 포함한다.
일부 구현예에서, 대뇌 내피 세포(EC), 전구체, 및 이의 전구 세포는 조건화되지 않은 또는 조건화된 배지에서 세포를 배양함으로써 표면 상의 만능 줄기 세포로부터 분화된다. 일부 경우에, 배지는 분화를 촉진하거나 용이하게 하는 인자 또는 소분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 VEGR, FGF, SDF-1, CHIR-99021, Y-27632, SB 431542 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자 또는 소분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 분화를 위한 표면은 하나 이상의 세포외 기질 단백질을 포함한다. 표면은 하나 이상의 세포외 기질 단백질로 코팅될 수 있다. 세포는 현탁액에서 분화된 다음 세포 생존을 용이하게 하기 위해 매트리겔, 젤라틴 또는 피브린/트롬빈 형태와 같은 겔 매트릭스 형태로 넣을 수 있다. 일부 경우에, 분화는 일반적으로 세포-특이적 마커의 존재를 평가함으로써 당분야에 알려진 바와 같이 검정된다.
일부 구현예에서, 대뇌 내피 세포는 CD31, VE 카드헤린 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 인자를 발현하거나 분비한다. 특정 구현예에서, 대뇌 내피 세포는 CD31, CD34, CD45, CD117(c-kit), CD146, CXCR4, VEGF, SDF-1, PDGF, GLUT-1, PECAM-1, eNOS, claudin-5, occludin, ZO-1, p-당단백질, 폰 빌레브란트 인자, VE-cadherin, 저밀도 지단백질 수용체 LDLR, 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 1 LRP1, 인슐린 수용체 INSR, 렙틴 수용체 LEPR, 기저 세포 부착 분자 BCAM, 트랜스페린 수용체 TFRC, 고급 당화 최종산물 특이적 수용체 AGER, 레티놀 흡수 수용체 STRA6, 큰 중성 아미노산 수송체 작은 서브유닛 1 SLC7A5, 흥분성 아미노산 수송체 3 SLC1A1, 나트륨-커플링 중성 아미노산 수송체 5 SLC38A5, 용질 운반체 패밀리 16 구성원 1 SLC16A1, ATP-의존적 트랜스로카제 ABCB1, ATP-ABCC2-결합 카세트 수송체 ABCG2, 다중약물 내성 관련 단백질 1 ABCC1, 소관 다중특이적 유기 음이온 수송체 1 ABCC2, 다중약물 내성 관련 단백질 4 ABCC4 및 다중약물 내성 관련 단백질 5 ABCC5로 구성된 군으로부터 선택된 인자 중 하나 이상을 발현하거나 분비한다.
일부 구현예에서, 대뇌 EC는 치밀 이음부의 높은 발현, 높은 전기 저항, 낮은 천공, 작은 혈관주위 공간, 높은 인슐린 및 트랜스페린 수용체의 우세성, 및 다수의 미토콘드리아로 구성된 군으로부터 선택된 특징 중 하나 이상을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 대뇌 EC는 양성 선택 전략을 사용하여 선택되거나 정제된다. 일부 경우에 대뇌 EC는 CD31과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 내피 세포 마커에 대해 분류된다. 즉, CD31 양성 대뇌 EC가 단리된다. 일부 구현예에서, 대뇌 EC는 음성 선택 전략을 사용하여 선택 또는 정제된다. 일부 구현예에서, 미분화 또는 만능 줄기 세포는 TRA-1-60 및 SSEA-1을 포함하지만 이에 제한되지 않는 만능 마커를 발현하는 세포를 선택함으로써 제거된다.
b. 도파민성 뉴런
일부 구현예에서, 본원에 설명된 HIP 세포는 신경 줄기 세포, 신경 전구 세포, 미성숙 도파민성 뉴런 및 성숙 도파민성 뉴런을 포함하는 도파민성 뉴런으로 분화된다.
일부 경우에, 용어 "도파민성 뉴런"은 도파민 합성에 대한 속도 제한 효소인 티로신 하이드록실라제(TH)를 발현하는 신경 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 도파민성 뉴런은 신경전달물질인 도파민을 분비하고, 도파민 하이드록실라제의 발현이 거의 또는 전혀 없다. 도파민성(DA) 뉴런은 하기 마커: 뉴런 특이적 에놀라제(NSE), 1-방향족 아미노산 탈카복실라제, 소포 모노아민 수송체 2, 도파민 수송체, Nurr-1 및 도파민-2 수용체(D2 수용체) 중 하나 이상을 발현할 수 있다. 특정 경우에, 용어 "신경 줄기 세포"는 신경 세포 경로를 따라 부분적으로 분화되고 예를 들어 nestin을 포함하는 하나 이상의 신경 마커를 발현하는 만능 세포 집단을 포함한다. 신경 줄기 세포는 뉴런 또는 아교 세포(예를 들어, 성상세포 및 희소돌기아교세포)로 분화될 수 있다. 용어 "신경 전구 세포"는 FOXA2 및 낮은 수준의 b-튜불린을 발현하지만 티로신 하이드록실라제는 발현하지 않는 배양된 세포를 포함한다. 이러한 신경 전구 세포는 다양한 신경 하위유형; 특히 본원에 설명된 것과 같은 적절한 인자의 배양 시 다양한 도파민성 신경 하위유형으로 분화하는 능력을 갖는다.
일부 구현예에서, HIP 세포로부터 유래된 DA 뉴런은 신경퇴행성 질환 또는 병태를 치료하기 위해 환자, 예를 들어 인간 환자에 투여된다. 일부 경우에, 신경퇴행성 질환 또는 병태는 파킨슨병, 헌팅턴병 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, DA 뉴런은 주의력 결핍 과잉행동 장애(ADHD), 뚜렛 증후군(TS), 정신분열증, 정신병 및 우울증과 같은 신경정신 장애의 하나 이상의 증상을 치료하거나 완화하기 위해 사용된다. 또 다른 구현예에서, DA 뉴런은 손상된 DA 뉴런을 갖는 환자를 치료하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, DA 뉴런, 전구체 및 이의 전구 세포는 하나 이상의 인자 또는 첨가제를 포함하는 배지에서 줄기 세포를 배양함으로써 만능 줄기 세포로부터 분화된다. DA 뉴런의 분화, 성장, 증식, 유지 및/또는 성숙을 촉진하는 유용한 인자 및 첨가제는 Wntl, FGF2, FGF8, FGF8a, Sonic Hedgehog(SHH), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 전환 성장 인자 a(TGF-a), TGF-b, 인터루킨 1 베타, 아교 세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), GSK-3 억제제(예를 들어 CHIR-99021), TGF-b 억제제(예를 들어, SB-431542), B-27 보충물질, 도르소모르핀, 푸르모르파민, noggin, 레티노산, cAMP, 아스코르브산, 뉴르투린, 녹아웃 혈청 대체물질, N-아세틸 시스테인, c-kit 리간드, 이의 변형된 형태, 이의 모방체, 이의 유사체, 및 이의 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, DA 뉴런은 WNT 경로, NOTCH 경로, SHH 경로, BMP 경로, FGF 경로 등을 활성화 또는 억제하는 하나 이상의 인자의 존재 하에 분화된다. 분화 프로토콜 및 이의 상세한 설명은 예를 들어 문헌(US9,968,637, US7,674,620, Kim et al., Nature, 2002, 418, 50-56; Bjorklundet al., PNAS, 2002, 99(4), 2344-2349; Growet al., Stem Cells Transl Med. 2016, 5(9): 1133-44, Cho et al., PNAS, 2008, 105:3392-3397)에 제공되며, 실시예, 방법, 도면 및 결과의 상세한 설명을 포함하는 전체 개시가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 도파민성 뉴런 집단은 비-뉴런 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 단리된 저면역원성 도파민성 뉴런 집단은 투여 전에 증식된다. 특정 구현예에서, 단리된 저면역원성 도파민성 뉴런 집단은 투여 전에 증식되고 동결보존된다.
DA 분화를 특성규명 및 모니터링하고 DA 표현형을 평가하기 위해 임의의 수의 분자 및 유전 마커의 발현이 평가될 수 있다. 예를 들어, 유전 마커의 존재는 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 분자 마커의 발현은 qPCR 기반 검정, 면역검정, 면역세포화학 검정, 면역블롯팅 검정 등과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 정량 방법에 의해 결정될 수 있다. DA 뉴런에 대한 예시적인 마커는 TH, b-튜불린, 페어드 박스 단백질(Pax6), 인슐린 유전자 인핸서 단백질(Isl1), nestin, 디아미노벤지딘(DAB), G 단백질-활성화 내향 정류기 칼륨 채널 2(GIRK2), 미세소관 관련 단백질 2(MAP-2), NURR1, 도파민 수송체(DAT), forkhead 박스 단백질 A2(FOXA2), FOX3, 더블코르틴 및 LIM 호메오박스 전사 인자 1-베타(LMX1B) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, DA 뉴런은 corin, FOXA2, TuJ1, NURR1 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다.
일부 구현예에서, DA 뉴런은 세포 전기생리학적 활성에 따라 평가된다. 세포의 전기생리학은 당업자에게 알려진 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 전체 세포 및 천공 패치 클램프, 세포의 전기생리학적 활성을 검출하기 위한 검정, 세포의 활동 전위 크기 및 지속기간을 측정하기 위한 검정 및 DA 세포의 도파민 생성을 검출하기 위한 기능적 검정.
일부 구현예에서, DA 뉴런 분화는 자발적 박동 활동 전위, 및 탈분극 전류의 주입 시 스파이크 빈도 적응을 갖는 고빈도 활동 전위를 특징으로 한다. 다른 구현예에서, DA 분화는 도파민 생성을 특징으로 한다. 생성된 도파민 수준은 그 최대 진폭의 절반에 도달한 지점(스파이크의 절반-최대 폭)에서 활동 전위의 폭을 측정하여 계산된다.
일부 구현예에서, 분화된 DA 뉴런은 환자의 특정 위치에 정맥내로 또는 주사에 의해 이식된다. 일부 구현예에서, 분화된 DA 세포는 그 퇴행이 파킨슨병을 초래하는 DA 뉴런을 대체하기 위해, 뇌의 흑질(특히 치밀 영역 내에 또는 인접하여), 복측 피개 영역(VTA), 미상부, 피각, 측위핵, 시상하부 핵, 또는 이의 임의의 조합으로 이식된다. 분화된 DA 세포는 세포 현탁액으로 표적 영역에 주사될 수 있다. 대안적으로, 분화된 DA 세포는 이러한 전달 장치에 함유될 때 지지 매트릭스 또는 스캐폴드에 포매될 수 있다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 생분해성이다. 다른 구현예에서, 스캐폴드는 생분해성이 아니다. 스캐폴드는 천연 또는 합성(인공) 물질을 포함할 수 있다.
DA 뉴런의 전달은 리포좀, 마이크로입자 또는 마이크로캡슐과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 적합한 비히클을 사용하여 달성될 수 있다. 다른 구현예에서, 분화된 DA 뉴런은 등장성 부형제를 포함하는 약학 조성물로 투여된다. 약학 조성물은 인간 투여를 위해 충분히 멸균인 조건 하에 제조된다. 일부 구현예에서, HIP 세포로부터 분화된 DA 뉴런은 약학 조성물의 형태로 공급된다. 세포 조성물의 치료 제형화의 일반 원리는 문헌(Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996, 및 Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000)에서 확인되며, 그 개시가 본원에 참조로 포함된다.
줄기 세포로부터 유래된 뉴런 및 이의 제조 방법에 대한 유용한 설명은 예를 들어 문헌(Kirkeby et al., Cell Rep, 2012, 1:703-714; Kriks et al., Nature, 2011, 480:547-551; Wang et al., Stem Cell Reports, 2018, 11(1):171-182; Lorenz Studer, "Chapter 8 - Strategies for Bringing Stem Cell-Derived Dopamine Neurons to the clinic-The NYSTEM Trial" in Progress in Brain Research, 2017, volume 230, pg. 191-212; Liu et al., Nat Protoc, 2013, 8:1670-1679; Upadhya et al., Curr Protoc Stem Cell Biol, 38, 2D.7.1-2D.7.47; 미국 공개 출원 번호 20160115448, 및 US8,252,586; US8,273,570; US9,487,752 및 US10,093,897)에서 찾을 수 있고, 내용 전체가 본원에 참조로 포함된다.
DA 뉴런에 더하여, 다른 뉴런 세포, 전구체 및 이의 전구 세포는 하나 이상의 인자 또는 첨가제를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 본원에 개략된 HIP 세포로부터 분화될 수 있다. 인자 및 첨가제의 비제한적 예는 GDNF, BDNF, GM-CSF, B27, 염기성 FGF, 염기성 EGF, NGF, CNTF, SMAD 억제제, Wnt 길항제, SHH 신호전달 활성화제 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, SMAD 억제제는 SB431542, LDN-193189, Noggin PD169316, SB203580, LY364947, A77-01, A-83-01, BMP4, GW788388, GW6604, SB-505124, 레르델리무맙, 메텔리무맙, GC-I008, AP-12009, AP-110I4, LY550410, LY580276, LY364947, LY2109761, SB-505124, E-616452(RepSox ALK 억제제), SD-208, SMI6, NPC-30345, K 26894, SB-203580, SD-093, 액티빈-M108A, P144, 가용성 TBR2-Fc, DMH-1, 도르소모르핀 디하이드로클로라이드 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Wnt 길항제는 XAV939, DKK1, DKK-2, DKK-3, DKK-4, SFRP-1, SFRP-2, SFRP-3, SFRP-4, SFRP-5, WIF-1, Soggy, IWP-2, IWR1, ICG-001, KY0211, Wnt-059, LGK974, IWP-L6 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, SHH 신호전달 활성화제는 Smoothened 효능제(SAG), SAG 유사체, SHH, C25-SHH, C24-SHH, 푸르모르파민, Hg-Ag 및/또는 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 뉴런은 글루타메이트 이온지향성 수용체 NMDA 서브유닛 1형 GRIN1, 글루타메이트 탈카복실라제 1 GAD1, 감마-아미노부티르산 GABA, 티로신 하이드록실라제 TH, LIM 호메오박스 전사 인자 1-알파 LMX1A, Forkhead 박스 단백질 O1 FOXO1, Forkhead 박스 단백질 A2 FOXA2, Forkhead 박스 단백질 O4 FOXO4, FOXG1, 2',3'-사이클릭-뉴클레오티드 3'-포스포디에스터라제 CNP, 미엘린 염기성 단백질 MBP, 튜불린 베타 사슬 3 TUB3, 튜불린 베타 사슬 3 NEUN, 용질 운반체 패밀리 1 구성원 6 SLC1A6, SST, PV, 칼빈딘, RAX, LHX6, LHX8, DLX1, DLX2, DLX5, DLX6, SOX6, MAFB, NPAS1, ASCL1, SIX6, OLIG2, NKX2.1, NKX2.2, NKX6.2, VGLUT1, MAP2, CTIP2, SATB2, TBR1, DLX2, ASCL1, ChAT, NGFI-B, c-fos, CRF, RAX, POMC, 하이포크레틴, NADPH, NGF, Ach, VAChT, PAX6, EMX2p75, CORIN, TUJ1, NURR1 및/또는 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상을 발현한다.
c. 아교 세포
일부 구현예에서, 설명된 신경 세포는 만능 줄기 세포를 치료적으로 유효한 아교 세포 등으로 분화시킴으로써 생성되는 미세아교 세포, 성상세포, 희소돌기아교세포, 뇌실막 세포 및 슈반 세포, 아교 전구체, 및 이의 아교 전구 세포와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 아교 세포를 포함한다. 저면역원성 만능 줄기 세포의 분화는 저면역원성 아교 세포와 같은 저면역원성 신경 세포를 생성한다.
일부 구현예에서, 아교 세포, 이의 전구체 및 전구 세포는 레티노산, IL-34, M-CSF, FLT3 리간드, GM-CSF, CCL2, TGF베타 억제제, BMP 신호전달 억제제, SHH 신호전달 활성화제, FGF, 혈소판 유래 성장 인자 PDGF, PDGFR-알파, HGF, IGF1, noggin, SHH, 도르소모르핀, noggin, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제제를 포함하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양함으로써 생성된다. 특정 경우에, BMP 신호전달 억제제는 LDN193189, SB431542 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 아교 세포는 NKX2.2, PAX6, SOX10, 뇌 유래 신경영양 인자 BDNF, 뉴트로핀-3 NT-3, NT-4, EGF, 섬모 신경영양 인자 CNTF, 신경 성장 인자 NGF, FGF8, EGFR, OLIG1, OLIG2, 미엘린 염기성 단백질 MBP, GAP-43, LNGFR, nestin, GFAP, CD11b, CD11c, CX3CR1, P2RY12, IBA-1, TMEM119, CD45, 및 이의 임의의 조합을 발현한다. 예시적인 분화 배지는 당업자에 의해 인식된 바와 같이 아교 세포 유형의 생성을 용이하게 하거나 가능하게 할 수 있는 임의의 특정 인자 및/또는 소분자를 포함할 수 있다.
시험관내 분화 프로토콜에 따라 생성된 세포가 아교 세포 특성 및 특징을 나타내는지 결정하기 위해 세포가 동물 모델에 이식될 수 있다. 일부 구현예에서, 아교 세포는 면역손상된 마우스, 예를 들어 면역손상된 쉬버러(shiverer) 마우스에 주사된다. 아교 세포는 마우스의 뇌에 투여되고 소정량의 시간 후 생착된 세포가 평가된다. 일부 경우에, 뇌에 생착된 세포는 면역염색 및 이미징 방법을 사용하여 시각화된다. 일부 구현예에서, 아교 세포가 알려진 아교 세포 바이오마커를 발현하는 것으로 결정된다.
줄기 세포로부터 아교 세포, 이의 전구체 및 전구 세포를 생성하는 데 유용한 방법은 예를 들어 문헌(US7,579,188; US7,595,194; US8,263,402; US8,206,699; US8,252,586; US9,193,951; US9,862,925; US8,227,247; US9,709,553; US2018/0187148; US2017/0198255; US2017/0183627; US2017/0182097; US2017/253856; US2018/0236004; WO2017/172976 및 WO2018/093681)에서 확인된다. 만능 줄기 세포를 분화시키는 방법은 예를 들어 문헌(Kikuchi et al., Nature, 2017, 548, 592-596; Kriks et al., Nature, 2011, 547-551; Doi et al., Stem Cell Reports, 2014, 2, 337-50; Perrier et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101, 12543-12548; Chambers et al., Nat Biotechnol, 2009, 27, 275-280; 및 Kirkeby et al., Cell Reports, 2012, 1, 703-714)에 설명된다.
척수 손상에 대한 신경 세포 이식의 유효성은, 예를 들어 문헌(McDonald, et al., Nat. Med., 1999, 5:1410) 및 Kim, et al., Nature, 2002, 418:50)에 설명된 바와 같은 급성 척추 손상의 래트 모델에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 성공적인 이식은 2-5주 후 병변에 존재하는 이식물 유래 세포를 성상세포, 희소돌기아교세포 및/또는 뉴런으로의 분화, 병변 끝으로부터 척수를 따른 이동, 보행, 협응력, 체중 부하의 개선을 나타낼 수 있다. 구체적 동물 모델은 신경 세포 유형 및 치료될 신경학적 질환 또는 병태에 기반하여 선택된다.
신경 세포는 이들이 의도된 조직 부위에 생착하고 기능적으로 결함이 있는 영역을 재구성하거나 재생시키도록 허용하는 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 신경 세포는 치료되는 질환에 따라 중추 신경계의 실질 또는 경막내 부위에 직접 이식될 수 있다. 일부 구현예에서, 대뇌 내피 세포, 뉴런, 도파민성 뉴런, 뇌실막 세포, 성상세포, 미세아교 세포, 희소돌기아교세포 및 슈반 세포를 포함하는 본원에 설명된 임의의 신경 세포가 정맥내, 척수내, 뇌실내, 경막내, 동맥내, 근육내, 복강내, 피하, 근육내, 복강내, 안구내, 안구뒤 및 이의 조합 방식에 의해 환자에 주사된다. 일부 구현예에서, 세포는 볼루스 주사 또는 연속 주입의 형태로 주사되거나 침착된다. 특정 구현예에서, 신경 세포는 뇌, 뇌에 적절한, 및 이의 조합으로 주사에 의해 투여된다. 예를 들어 대상체의 두개골에 뚫린 구멍을 통해 주사될 수 있다. 신경 세포를 뇌에 투여하기 적합한 부위는 뇌실, 측뇌실, 대수조, 피각, 기저핵, 해마 피질, 선조체, 뇌의 미상 영역 및 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 기술에서 사용하기 위한 도파민성 뉴런을 포함하는 신경 세포에 대한 추가 설명은 WO2020/018615에서 확인되며, 개시 전체가 본원에 참조로 포함된다.
3. 저면역원성 만능 세포로부터 분화된 내피 세포
대상체(예를 들어, 수신체)로의 후속 이식 또는 생착을 위해 다양한 내피 세포 유형으로 분화되는 저면역원성 만능 세포가 본원에 제공된다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 분화 방법은 알려진 기술을 사용하여 원하는 세포 유형에 의존한다.
일부 구현예에서, 주제 저면역원성 만능 세포로부터 분화된 내피 세포는 환자, 예를 들어 이를 필요로 하는 인간 환자에 투여된다. 내피 세포는 심혈관 질환, 혈관 질환, 말초 혈관 질환, 허혈성 질환, 심근 경색, 울혈성 심부전, 말초 혈관 폐쇄 질환, 뇌졸중, 재관류 손상, 사지 허혈, 신경병증(예를 들어 말초 신경병증 또는 당뇨병성 신경병증), 장기 부전(예를 들어 간부전, 신부전 등), 당뇨병, 류마티스성 관절염, 골다공증, 혈관 손상, 조직 손상, 고혈압, 협심증 및 관상 동맥 질환으로 인한 심근 경색, 신장 혈관 고혈압, 신장 동맥 협착증으로 인한 신부전, 하지 파행 등과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 질환 또는 병태를 앓는 환자에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 환자는 일부 경우에 뇌혈관 질환으로 인한 것일 수 있는 일시적 허혈 발작 또는 뇌졸중을 앓았거나 앓고 있다. 일부 구현예에서, 조작된 내피 세포는 예를 들어 죽상동맥경화증, 심근 경색 및 사지 허혈에서 발생하는 바와 같은 조직 허혈을 치료하고 손상된 혈관을 복구하기 위해 투여된다. 일부 경우에, 세포는 이식편의 생체조작에서 사용된다.
예를 들어, 내피 세포는 허혈 조직 복구, 혈관 및 심장 판막 형성, 인공 혈관 조작, 손상된 혈관 복구 및 조작된 조직에서 혈관 형성 유도(예를 들어 이식 전)를 위한 세포 치료법에서 사용될 수 있다. 추가로, 내피 세포는 종양을 표적화하고 치료하기 위한 제제를 전달하도록 추가로 변형될 수 있다.
많은 구현예에서, 혈관 세포 또는 혈관화를 필요로 하는 조직의 복구 또는 대체 방법이 본원에 제공된다. 방법에는 이러한 치료를 필요로 하는 인간 환자에 이러한 조직에서 혈관화를 촉진하기 위해 단리된 내피 세포를 함유하는 조성물을 투여하는 단계가 관여한다. 혈관 세포 또는 혈관화를 필요로 하는 조직은 특히 심장 조직, 간 조직, 췌장 조직, 신장 조직, 근육 조직, 신경 조직, 뼈 조직일 수 있으며, 이는 손상되고 과도한 세포 사멸을 특징으로 하는 조직, 손상 위험이 있는 조직 또는 인공적으로 조작된 조직일 수 있다.
일부 구현예에서, 심장 질환 또는 장애와 관련될 수 있는 혈관 질환은 본원에 설명된 바와 같이 최종 혈관 내피 세포 및 심내막 내피 세포와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 내피 세포를 투여함으로써 치료될 수 있다. 이러한 혈관 질환은 관상 동맥 질환, 뇌혈관 질환, 대동맥 협착증, 대동맥류, 말초 동맥 질환, 죽상동맥경화증, 정맥류, 혈관병증, 관상 관류가 부족한 심장 경색 영역, 치유되지 않는 상처, 당뇨병성 또는 비당뇨병성 궤양, 또는 혈관 형성을 유도하는 것이 요망되는 임의의 다른 질환 또는 장애를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 내피 세포는 혈관 재건 수술에서 사용되는 보철 임플란트(예를 들어, 다크론(Dacron) 및 고어텍스(Gortex)와 같은 합성 물질로 만들어진 혈관)를 개선하기 위해 사용된다. 예를 들어 보철 동맥 이식편이 중요한 장기 또는 사지를 관류하는 이환 동맥을 대체하기 위해 종종 사용된다. 다른 구현예에서, 조작된 내피 세포가 보철 심장 판막의 표면을 덮어서 판막 표면을 덜 혈전성으로 만듦으로써 색전 형성 위험을 감소시키기 위해 사용된다.
개략된 내피 세포는 조직 및/또는 단리된 세포를 혈관에 그래프팅하기 위해 잘 알려진 수술 기술을 사용하여 환자에 이식될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 주사(예를 들어, 심근내 주사, 관상내 주사, 경심내막 주사, 경심외막 주사, 경피 주사), 주입, 그래프팅 및 임플란팅에 의해 환자의 심장 조직으로 도입된다.
내피 세포의 투여(전달)는 피하 또는 정맥내, 동맥내(예를 들어, 관상내), 근육내, 복강내, 심근내, 경심내막, 경심외막, 비강내 투여뿐만 아니라 척수내를 포함하는 비경구 투여 및 주입 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
당업자에게 이해될 바와 같이, HIP 유도체는 세포 유형 및 이들 세포의 궁극적인 용도에 모두 의존하는 당분야에 알려진 기술을 사용하여 이식된다. 일부 구현예에서, 세포는 정맥내로 또는 환자의 특정 위치에서 주사에 의해 이식된다. 특정 위치에 이식될 때 세포는 겔 매트릭스에 현탁되어 유지되면서도 분산을 방지할 수 있다.
예시적인 내피 세포 유형은 모세관 내피 세포, 혈관 내피 세포, 대동맥 내피 세포, 동맥 내피 세포, 정맥 내피 세포, 신장 내피 세포, 뇌 내피 세포, 간 내피 세포 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 개략된 내피 세포는 하나 이상의 내피 세포 마커를 발현할 수 있다. 이러한 마커의 비제한적 예는 VE-카드헤린(CD 144), ACE(안지오텐신-전환 효소)(CD 143), BNH9/BNF13, CD31, CD34, CD54(ICAM-1), CD62E(E-셀렉틴), CD105(엔도글린), CD146, 엔도칸(ESM-1), 엔도글리스-1, 엔도뮤신, 에오탁신-3, EPAS1(내피 PAS 도메인 단백질 1), 인자 VIII 관련 항원, FLI-1, Flk-1(KDR, VEGFR-2), FLT-1(VEGFR-1), GATA2, GBP-1(구아닐레이트 결합 단백질-1), GRO-알파, HEX, ICAM-2(세포간 접착 분자 2), LM02, LYVE-1, MRB(magic roundabout), 뉴클레올린, PAL-E(pathologische anatomie Leiden-endothelium), RTK, sVCAM-1, TALI, TEM1(종양 내피 마커 1), TEM5(종양 내피 마커 5), TEM7(종양 내피 마커 7), 트롬보모듈린(TM, CD141), VCAM-1(혈관 세포 접착 분자-1)(CD106), VEGF, vWF(폰 빌레브란트 인자), ZO-1, 내피 세포-선택적 접착 분자(ESAM), CD102, CD93, CD184, CD304 및 DLL4를 포함한다.
일부 구현예에서, 내피 세포는 장애/병태를 치료하거나 또는 장애/병태의 증상을 완화시키는 데 유용한 효소, 호르몬, 수용체, 리간드, 또는 약물과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 관심 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 내피 세포를 유전적으로 변형시키는 표준 방법은 예를 들어 US 5,674,722에 설명되어 있다.
이러한 내피 세포는 질환의 방지 또는 치료에 유용한, 폴리펩티드 또는 단백질의 구성적 합성 및 전달을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 폴리펩티드는 개체의 혈류 또는 신체의 다른 영역(예를 들어, 중추 신경계)으로 직접 분비된다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 인슐린, 혈액 응고 인자(예를 들어, 인자 VIII 또는 폰 빌레브란트 인자), 알파-1 항트립신, 아데노신 탈아미나제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3) 등을 분비하도록 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 내피 세포는 임플란트된 이식편과 관련하여 이의 성능을 개선하는 방식으로 변형될 수 있다. 비제한적 예시적 예는 내강내 응괴 형성을 방지하기 위한 혈전용해제의 분비 또는 발현, 평활근 비대로 인한 내강 협착을 방지하기 위한 평활근 증식 억제제의 분비, 및 내피 세포 증식을 자극하고 이식편 내강의 내피 세포 내벽의 범위 또는 지속기간을 개선하는 내피 세포 미토겐 또는 자가분비 인자의 발현 및/또는 분비를 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 내피 세포는 특정 장기 또는 사지에 치료 수준의 분비된 산물을 전달하기 위해 이용된다. 예를 들어, 시험관내 조작된(형질도입된) 내피 세포가 라이닝된 혈관 임플란트가 특정 장기 또는 사지에 그래프팅될 수 있다. 형질도입된 내피 세포의 분비된 산물은 관류된 조직에 고농도로 전달되어 표적화된 해부학적 위치에 원하는 효과를 달성할 것이다.
다른 구현예에서, 내피 세포는 혈관화 종양에서 내피 세포에 의해 발현될 때 혈관신생을 방해하거나 억제하는 유전자를 함유하도록 유전적으로 변형된다. 일부 경우에, 내피 세포는 또한 종양 치료 완료 시 그래프팅된 내피 세포의 음성 선택을 허용하는 본원에 설명된 선별 자살 유전자 중 임의의 하나를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 내피 세포는 혈관 손상, 심혈관 질환, 혈관 질환, 말초 혈관 질환, 허혈성 질환, 심근 경색, 울혈성 심부전, 말초 혈관 폐쇄 질환, 고혈압, 허혈성 조직 손상, 재관류 손상, 사지 허혈, 뇌졸중, 신경병증(예를 들어 말초 신경병증 또는 당뇨병성 신경병증), 장기 부전(예를 들어 간부전, 신부전 등), 당뇨병, 류마티스성 관절염, 골다공증, 뇌혈관 질환, 고혈압, 협심증 및 관상 동맥 질환으로 인한 심근 경색, 신장 혈관 고혈압, 신장 동맥 협착증으로 인한 신부전, 하지 파행 및/또는 다른 혈관 병태 또는 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 혈관 장애를 치료하기 위해 수신 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 만능 세포는 내피 콜로니 형성 세포(ECFC)로 분화되어 말초 동맥 질환을 다루기 위한 새로운 혈관을 형성한다. 내피 세포를 분화시키는 기술은 알려져 있다. 예를 들어, 그 전체가 그리고 특히 인간 만능 줄기 세포로부터 내피 세포의 생성을 위한 방법 및 시약, 및 또한 이식 기술에 대해 본원에 참조로 포함된, 문헌(Prasain et al., doi: 10.1038/nbt.3048)을 참고한다. 분화는 일반적으로 내피 세포 관련 또는 특이적 마커의 존재를 평가하거나 기능적으로 측정함으로써 당분야에 알려진 바와 같이 검정될 수 있다.
시험관내 분화에 의해 저면역원성 만능 세포 집단으로부터 저면역원성 내피 세포 집단을 생성하는 방법은 (a) GSK 억제제를 포함하는 제1 배양 배지에서 HIP 세포 집단을 배양하는 단계; (b) VEGF 및 bFGF를 포함하는 제2 배양 배지에서 HIP 세포 집단을 배양하여 전-내피 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (c) ROCK 억제제 및 ALK 억제제를 포함하는 제3 배양 배지에서 전-내피 세포 집단을 배양하여 저면역원성 내피 세포 집단을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, GSK 억제제는 CHIR-99021, 이의 유도체 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, GSK 억제제는 약 1 mM 내지 약 10 mM 범위의 농도이다. 일부 구현예에서, ROCK 억제제는 Y-27632, 이의 유도체 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, ROCK 억제제는 약 1 pM 내지 약 20 pM 범위의 농도이다. 일부 구현예에서, ALK 억제제는 SB-431542, 이의 유도체 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, ALK 억제제는 약 0.5 pM 내지 약 10 pM 범위의 농도이다.
일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 2 pM 내지 약 10 pM의 CHIR-99021을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 50 ng/ml VEGF 및 10 ng/ml bFGF를 포함한다. 다른 구현예에서, 제2 배양 배지는 Y-27632 및 SB-431542를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 제3 배양 배지는 10 pM Y-27632 및 1 pM SB-431542를 포함한다. 특정 구현예에서, 제3 배양 배지는 VEGF 및 bFGF를 추가로 포함한다. 특정한 경우에, 제1 배양 배지 및/또는 제2 배지에는 인슐린이 없다.
본원에 제공된 세포는 저면역원성 만능 세포의 심장 세포로의 분화를 지지 및/또는 촉진하기 위해 합성 표면과 같은 표면 상에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 표면은 선택된 하나 이상의 아크릴레이트 단량체의 단독중합체 또는 공중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 중합체 물질을 포함한다. 아크릴레이트 단량체 및 메타크릴레이트 단량체의 비제한적 예는 테트라(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트, 글리세롤 디메타크릴레이트, 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트, 디(에틸렌 글리콜) 디메타크릴레이트, 테트라(에틸렌 글리콜) 디메타크릴레이트, 1,6-헥산디올 프로폭실레이트 디아크릴레이트, 네오펜틸 글리콜 디아크릴레이트, 트리메틸올프로판 벤조에이트 디아크릴레이트, 트리메틸올프로판 에이혹실레이트(1 EO/QH) 메틸, 트리사이클로[5.2.1.02,6] 데칸 디메탄올 디아크릴레이트, 네오펜틸 글리콜 엑속실레이트 디아크릴레이트 및 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트를 포함한다. 아크릴레이트는 당분야에 알려진 바와 같이 합성되거나 Polysciences, Inc., Sigma Aldrich, Inc. 및 Sartomer, Inc.와 같은 상업적 공급업체로부터 얻는다.
일부 구현예에서, 내피 세포는 중합체 매트릭스 상에 시딩될 수 있다. 일부 경우에, 중합체 매트릭스는 생분해성이다. 적합한 생분해성 매트릭스는 당분야에 잘 알려져 있으며 콜라겐-GAG, 콜라겐, 피브린, PLA, PGA 및 PLA/PGA 공중합체를 포함한다. 추가적인 생분해성 물질은 폴리(무수물), 폴리(하이드록시산), 폴리(오르소 에스테르), 폴리(프로필푸메레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리아미드, 폴리아미노산, 폴리아세탈, 생분해성 폴리시아노아크릴레이트, 생분해성 폴리우레탄 및 다당류를 포함한다.
비-생분해성 중합체도 사용될 수 있다. 다른 비생분해성이지만 생체적합성인 중합체는 폴리피롤, 폴리아닙, 폴리티오펜, 폴리스티렌, 폴리에스테르, 비생분해성 폴리우레탄, 폴리우레아, 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리프로필렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트 및 폴리(에틸렌 옥시드)를 포함한다. 중합체 매트릭스는, 예를 들어 입자, 스폰지, 튜브, 구, 가닥, 코일 가닥, 모세관 네트워크, 필름, 섬유, 메쉬 또는 시트와 같은 임의의 형태로 형성될 수 있다. 중합체 매트릭스는 천연 또는 합성 세포외 매트릭스 물질 및 인자를 포함하도록 변형될 수 있다.
중합체 물질은 지지 물질의 표면 상에 분산될 수 있다. 세포 배양에 적합한 유용한 지지 물질은 세라믹 물질, 유리, 플라스틱, 중합체 또는 공중합체, 이의 임의의 조합, 또는 또 다른 물질 상의 한 물질의 코팅을 포함한다. 일부 경우에, 유리는 소다 석회 유리, 파이렉스 유리, 바이코르 유리, 석영 유리, 규소 또는 이의 유도체 등을 포함한다.
일부 경우에, 수지상 중합체를 포함하는 플라스틱 또는 중합체는 폴리(비닐 클로라이드), 폴리(비닐 알코올), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(비닐 아세테이트-말레산 무수물), 폴리(디메틸실록산) 모노메타크릴레이트, 사이클릭 올레핀 중합체, 플루오로카본 중합체, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌이민 또는 이의 유도체 등의 중합체를 포함한다. 일부 경우에, 공중합체는 폴리(비닐 아세테이트-공-말레산 무수물), 폴리(스티렌-공-말레산 무수물), 폴리(에틸렌-공-아크릴산) 또는 이의 유도체 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 내피 세포 집단은 비-내피 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 단리된 저면역원성 내피 세포 집단은 투여 전에 증식된다. 특정 구현예에서, 단리된 저면역원성 내피 세포 집단은 투여 전에 증식되고 동결보존된다.
본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 내피 세포의 추가 설명은 WO2020/018615에서 확인되며, 개시 전체가 본원에 참조로 포함된다.
4. 저면역원성 만능 세포로부터 분화된 갑상샘 세포
일부 구현예에서, 저면역원성 만능 세포는 자가면역 갑상샘염을 해결하기 위해 갑상샘 호르몬을 분비할 수 있는 갑상샘 전구 세포 및 갑상샘 여포 오가노이드로 분화된다. 갑상샘 세포를 분화시키는 기술은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 그 전체가 그리고 특히 인간 만능 줄기 세포로부터 갑상샘 세포를 생성하는 방법 및 시약, 및 또한 이식 기술에 대해 본원에 참조로 포함된 문헌(Kurmann et al., Cell Stem Cell, 2015 Nov 5;17(5):527-42)을 참고한다. 분화는 일반적으로 갑상샘 세포 관련 또는 특이적 마커의 존재를 평가하거나 기능적으로 측정함으로써 당분야에 알려진 바와 같이 검정될 수 있다.
5. 저면역원성 만능 세포로부터 분화된 간세포
일부 구현예에서, 저면역원성 만능 세포는 간세포 기능 상실 또는 간 경화증을 해결하기 위해 간세포로 분화된다. HIP 세포를 간세포로 분화시키기 위해 사용될 수 있는 여러 기술이 있다; 예를 들어, 모두 그 전체가 그리고 특히 분화를 위한 방법론 및 시약에 대해 본원에 참조로 포함된, 문헌(Pettinato et al, doi: 10.1038/spre32888, Snykers et al., Methods Mol Biol, 2011 698:305-314, Si-Tayeb et al., Hepatology, 2010, 51:297-305 and Asgari et al., Stem Cell Rev, 2013, 9(4):493-504)을 참고한다. 분화는 일반적으로 알부민, 알파 태아단백질 및 피브리노겐을 포함하지만 이에 제한되지 않는 간세포 관련 및/또는 특이적 마커의 존재를 평가함으로써 당분야에 알려진 바와 같이 검정될 수 있다. 분화는 또한 암모니아의 대사, LDL 저장 및 흡수, ICG 흡수 및 방출, 그리고 글리코겐 저장과 같이 기능적으로 측정될 수 있다.
6. 저면역원성 만능 세포로부터 분화된 췌장 섬세포
일부 구현예에서, 췌장 섬세포(췌장 베타 세포로도 지칭됨)가 본원에 설명된 HIP 세포로부터 유래된다. 일부 경우에, 다양한 췌장 섬세포 유형으로 분화되는 저면역원성 만능 세포가 대상체(예를 들어 수신체)에 이식되거나 생착된다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 분화 방법은 알려진 기술을 사용하여 원하는 세포 유형에 의존한다. 예시적인 췌장 섬세포 유형은 췌장 섬 전구 세포, 미성숙 췌장 섬세포, 성숙 췌장 섬세포 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 췌장 세포는 당뇨병을 치료하기 위해 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 췌장 섬세포는 본원에 설명된 저면역원성 만능 세포로부터 유래된다. 만능 줄기 세포를 췌장 섬세포로 분화시키는 데 유용한 방법은 예를 들어 문헌(US 9,683,215; US 9,157,062; 및 US 8,927,280)에 설명된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생성된 췌장 섬세포는 인슐린을 분비한다. 일부 구현예에서, 췌장 섬세포는 내인성 췌장 섬세포의 적어도 2개 특성, 예를 들어 비제한적으로 글루코스에 반응한 인슐린 분비 및 베타 세포 마커의 발현을 나타낸다.
예시적인 베타 세포 마커 또는 베타 세포 전구 세포 마커는 c-펩티드, Pdxl, 글루코스 수송체 2(Glut2), HNF6, VEGF, 글루코키나제(GCK), 프로호르몬 전환효소(PC 1/3), Cdcp1, NeuroD, Ngn3, Nkx2.2, Nkx6.1, Nkx6.2, Pax4, Pax6, Ptfla, Isl1, Sox9, Sox17 및 FoxA2를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 단리된 췌장 섬세포는 글루코스 증가에 반응하여 인슐린을 생성한다. 다양한 구현예에서, 단리된 췌장 섬세포는 글루코스의 증가에 반응하여 인슐린을 분비한다. 일부 구현예에서, 세포는 조약돌 세포 형태 및/또는 약 17 pm 내지 약 25 pm의 직경과 같은 별도 형태를 갖는다.
일부 구현예에서, 저면역원성 만능 세포는 I형 진성 당뇨병(T1DM)을 해결하기 위해 이식을 위한 베타-유사 세포 또는 섬 오가노이드로 분화된다. 세포 시스템은 T1DM을 해결하기 위해 유망한 방식이며, 예를 들어 본원에 참조로 포함된 문헌(Ellis et al., Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2017 Oct;14(10):612-628)을 참고한다. 또한, Pagliuca 등(Cell, 2014, 159(2):428-39)은 hiPSC로부터 β-세포의 성공적인 분화에 대해 보고하고, 그 내용은 전체가 그리고 특히 인간 만능 줄기 세포로부터 기능적 인간 β 세포의 대규모 생성에 대해 여기에 개략된 방법 및 시약에 대해 본원에 참조로 포함된다. 또한, Vegas 등은 인간 만능 줄기 세포로부터 인간 β 세포의 생성에 이어 숙주에 의한 면역 거부를 피하기 위한 캡슐화를 나타낸다; 문헌(Vegas et al., Nat Med, 2016, 22(3):306-11)은 전체 그리고 특히 인간 만능 줄기 세포로부터 기능적 인간 β 세포의 대규모 생산에 대해 여기에 개략된 방법 및 시약에 대해 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 시험관내 분화에 의해 저면역원성 만능 세포 집단으로부터 저면역원성 췌장 섬세포 집단을 생성하는 방법은 (a) HIP 세포 집단을 인슐린-유사 성장 인자, 전환 성장 인자, FGF, EGF, HGF, SHH, VEGF, 전환 성장 인자-b 슈퍼패밀리, BMP2, BMP7, GSK 억제제, ALK 억제제, BMP 1형 수용체 억제제, 레티노산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 제1 배양 배지에서 배양하여 미성숙 췌장 섬세포 집단을 생성하는 단계; 및 (b) 제1 배양 배지와 상이한 제2 배양 배지에서 미성숙 췌장 섬세포 집단을 배양하여 저면역 췌장 섬세포 집단을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, GSK 억제제는 CHIR-99021, 이의 유도체 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, GSK 억제제는 약 2 mM 내지 약 10 mM 범위의 농도이다. 일부 구현예에서, ALK 억제제는 SB-431542, 이의 유도체 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, ALK 억제제는 약 1 pM 내지 약 10 pM 범위의 농도이다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지 및/또는 제2 배양 배지에는 동물 혈청이 없다.
일부 구현예에서, 저면역원성 췌장 섬세포 집단은 비-췌장 섬세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 단리된 저면역원성 췌장 섬세포 집단은 투여 전에 증식된다. 특정 구현예에서, 단리된 저면역원성 췌장 섬세포 집단은 투여 전에 증식되고 동결보존된다.
분화는 일반적으로 인슐린을 포함하지만 이에 제한되지 않는 β 세포 관련 또는 특이적 마커의 존재를 평가함으로써 당분야에 알려진 바와 같이 검정된다. 분화는 글루코스 대사 측정과 같이 기능적으로도 측정될 수 있으며, 일반적으로 그 전체가 그리고 특히 여기에 개략된 바이오마커에 대해 본원에 참조로 포함된 문헌(Muraro et al., Cell Syst. 2016 Oct 26; 3(4): 385-394.e3)을 참고한다. 일단 베타 세포가 생성되면, 이들은 간문맥/간, 대망, 위장 점막, 골수, 근육 또는 피하 주머니에 이식될 수 있다(본원에서 논의된 바와 같이 세포 현탁액으로서 또는 겔 매트릭스 내에서).
본 기술에서 사용하기 위한 도파민성 뉴런을 포함하는 췌장 섬세포에 대한 추가 설명은 WO2020/018615에서 확인되며, 개시 전체가 본원에 참조로 포함된다.
7. 저면역원성 만능 세포로부터 분화된 망막 색소 상피(RPE) 세포
전술한 HIP 세포로부터 유래된 망막 색소 상피(RPE) 세포가 본원에 제공된다. 예를 들어, 인간 RPE 세포는 인간 HIP 세포를 분화시켜 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 다양한 RPE 세포 유형으로 분화되는 저면역원성 만능 세포는 대상체(예를 들어, 수신체)에 이식되거나 생착된다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 분화 방법은 알려진 기술을 사용하여 원하는 세포 유형에 의존한다.
용어 "RPE" 세포는 천연 RPE 세포와 유사하거나 실질적으로 유사한 유전적 발현 프로파일을 갖는 색소 망막 상피 세포를 지칭한다. 만능 줄기 세포로부터 유래된 이러한 RPE 세포는 평면 기재 상에서 융합성까지 성장시킬 때 천연 RPE 세포의 다각형 평면 시트 형태를 보유할 수 있다.
RPE 세포는 황반 변성을 앓는 환자 또는 RPE 세포가 손상된 환자에 임플란트될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 노화-관련 황반 변성(AMD), 초기 AMD, 중기 AMD, 후기 AMD, 비신생혈관 노화-관련 황반 변성, 건성 황반 변성(건성 노화-관련 황반 변성), 습성 황반 변성(습성 노화-관련 황반 변성), 소아 황반 변성(JMD)(예를 들어, 스타르가르트병, 베스트병, 및 소아 망막분리증), 레베르 선천성 흑암시 또는 색소성 망막염을 갖는다. 다른 구현예에서, 환자는 망막 박리를 앓는다.
예시적인 RPE 세포 유형은 망막 색소 상피(RPE) 세포, RPE 전구 세포, 미성숙 RPE 세포, 성숙 RPE 세포, 기능적 RPE 세포 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
만능 줄기 세포를 RPE 세포로 분화시키는 데 유용한 방법은 예를 들어 문헌(US9,458,428 및 US9,850,463)에 설명되며, 그 개시는 명세서를 포함하는 전체가 본원에 참조로 포함된다. 인간 유도된 만능 줄기 세포로부터 RPE 세포를 생성하는 추가 방법은 예를 들어 문헌(Lamba et al., PNAS, 2006, 103(34): 12769-12774; Mellough et al., Stem Cells, 2012, 30(4):673-686; Idelson et al., Cell Stem Cell, 2009, 5(4): 396-408; Rowland et al., Journal of Cellular Physiology, 2012, 227(2):457-466, Buchholz et al., Stem Cells Trans Med, 2013, 2(5): 384-393, 및 da Cruz et al., Nat Biotech, 2018, 36:328-337)에서 찾을 수 있다.
인간 만능 줄기 세포는 문헌(Kamao et al, Stem Cell Reports 2014:2:205-18)에 개략된 기술을 사용하여 RPE 세포로 분화되었으며, 그 전체가 그리고 특히 분화 기술 및 시약에 대해 여기에 개략된 방법 및 시약에 대해 본원에 참조로 포함된다; 또한 RPE 세포의 시트 생성 및 환자로의 이식을 위한 기술에 대해 전체가 본원에 포함된 문헌(Mandai et al., N Engl J Med, 2017, 376:1038-1046)을 참고한다. 분화는 일반적으로 RPE 관련 및/또는 특이적 마커의 존재를 평가하거나 기능적으로 측정함으로써 당분야에 알려진 바와 같이 검정될 수 있다. 예를 들어 내용 전체가 그리고 특히 결과 섹션의 첫 번째 단락에 개략된 마커에 대해 본원에 참조로 포함된 문헌(Kamao et al., Stem Cell Reports, 2014, 2(2):205-18)을 참고한다.
일부 구현예에서, 시험관내 분화에 의해 저면역원성 만능 세포 집단으로부터 저면역원성 망막 색소 상피(RPE) 세포 집단을 생성하는 방법은 (a) 저면역원성 만능 세포 집단을 액티빈 A, bFGF, BMP4/7, DKK1, IGF1, noggin, BMP 억제제, ALK 억제제, ROCK 억제제 및 VEGFR 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 인자 중 임의의 하나를 포함하는 제1 배양 배지에서 배양하여 전-RPE 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (b) 전-RPE 세포 집단을 제1 배양 배지와 상이한 제2 배양 배지에서 배양하여 저면역원성 RPE 세포 집단을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, ALK 억제제는 SB-431542, 이의 유도체 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, ALK 억제제는 약 2 mM 내지 약 10 pM 범위의 농도이다. 일부 구현예에서, ROCK 억제제는 Y-27632, 이의 유도체 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, ROCK 억제제는 약 1 pM 내지 약 10 pM 범위의 농도이다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지 및/또는 제2 배양 배지에는 동물 혈청이 없다.
일반적으로 분화는 RPE 관련 및/또는 특이적 마커의 존재를 평가하거나 기능적으로 측정함으로써 당분야에 알려진 바와 같이 검정될 수 있다. 예를 들어 내용 전체가 그리고 특히 결과 섹션에 대해 본원에 참조로 포함된, 문헌(Kamao et al., Stem Cell Reports, 2014, 2(2):205-18)을 참고한다.
본 기술에서 사용하기 위한 RPE 세포의 추가 설명은 WO2020/018615에서 확인되며, 개시 전체가 본원에 참조로 포함된다.
치료 적용을 위해, 개시된 방법에 따라 제조된 세포는 전형적으로 등장성 부형제를 포함하는 약학 조성물의 형태로 공급될 수 있고, 인간 투여를 위해 충분히 멸균인 조건 하에 제조된다. 세포 조성물의 의약 제형화의 일반 원칙에 대해서는 문헌("Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy," by Morstyn & Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996; 및 "Hematopoietic Stem Cell Therapy," E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000)을 참고한다. 세포는 유통 또는 임상 용도에 적합한 장치 또는 용기에 포장될 수 있다.
8. 저면역원성 만능 세포 유래된 T 림프구
본원에 제공된 T 림프구(1차 T 세포를 포함하는 T 세포)는 본원에 설명된 HIP 세포(예를 들어, 저면역원성 iPSC)로부터 유래된다. 만능 줄기 세포(예를 들어, iPSC)로부터 CAR-T-세포를 포함하는 T 세포를 생성하는 방법은 예를 들어 문헌(Iriguchi et al., Nature Communications 12, 430 (2021); Themeli et al. 16(4):357-366 (2015); Themeli et al., Nature Biotechnology 31:928-933 (2013))에 설명된다. T 림프구 유래 저면역원성 세포는 면역 인식을 회피하는 1차 T 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 1차 T 세포와 같은 T 세포로부터 생성(예를 들어, 생성, 배양 또는 유래)된다. 일부 경우에, 1차 T 세포는 대상체 또는 개체로부터 수득(예를 들어 수확, 추출, 제거 또는 채취)된다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포는 T 세포가 하나 이상의 대상체(예를 들어, 하나 이상의 건강한 인간을 포함하는 하나 이상의 인간)로부터 유래되도록 T 세포 풀로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포 풀은 1-100, 1-50, 1-20, 1-10, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 또는 100 이상의 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 공여 대상체는 환자(예를 들어, 치료 세포가 투여되는 수신체)와 상이하다. 일부 구현예에서, T 세포 풀은 환자로부터의 세포를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, T 세포 풀이 얻어지는 공여 대상체 중 하나 이상은 환자와 상이하다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 환자(예를 들어, 투여 시 수신체)에서 면역 반응을 활성화하지 않는다. 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어 수신체) 또는 환자에 저면역원성 세포 집단을 투여하여 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 저면역원성 세포는 본원에 설명된 키메라 항원 수용체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된(예를 들어, 변형된) T 세포를 포함한다. 일부 경우에, T 세포는 하나 이상의 개체로부터의 1차 T 세포 집단 또는 하위집단이다. 일부 구현예에서, 조작된 또는 변형된 T 세포와 같은 본원에 설명된 T 세포는 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, HIP-유래 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 임의의 적합한 CAR은 본원에 설명된 CAR을 포함하는 HIP-유래 T 세포에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, HIP-유래 T 세포는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 게놈 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 B2M, CIITA, TRAC, TRB, PD1 또는 CTLA4 유전자에 삽입된다. 본원에 설명된 유전자 편집 방법(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)을 포함하는 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌에 CAR을 삽입하기 위해 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다.
본원에 제공된 HIP-유래 T 세포는 B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 샘암종, 췌장 샘암종, 교모세포종, 신경모세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및 방광암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 적합한 암의 치료에 유용한다.
9. 저면역원성 만능 세포로부터 유래된 NK 세포
본원에 제공된 자연 살해(NK) 세포는 본원에 설명된 HIP 세포(예를 들어, 저면역원성 iPSC)로부터 유래된다.
NK 세포('거대 과립 림프구'로도 정의됨)는 일반적인 림프 전구 세포(B 림프구 및 T 림프구를 또한 생성함)로부터 분화된 세포 계통을 나타낸다. T 세포와 달리 NK 세포는 자연적으로 원형질막에 CD3를 포함하지 않는다. 중요한 것은 NK 세포는 TCR을 발현하지 않으며 전형적으로 다른 항원 특이적 세포 표면 수용체도 결여된다(TCR 및 CD3뿐만 아니라 면역글로불린 B 세포 수용체도 발현하지 않으며 대신 전형적으로 CD16 및 CD56을 발현함). NK 세포 세포독성 활성은 감작을 필요로 하지 않지만 IL-2를 포함하는 다양한 사이토카인으로의 활성화에 의해 향상된다. NK 세포는 일반적으로 항원-수용체-매개 신호전달에 필요한 적절하거나 완전한 신호전달 경로가 결여된 것으로 생각되며, 따라서 항원 수용체 의존적 신호전달, 활성화 및 증식이 가능한 것으로 생각되지 않는다. NK 세포는 세포독성이며 이의 세포독성 활성을 조절하기 위해 활성화 및 억제 수용체 신호전달의 균형을 맞춘다. 예를 들어, CD16을 발현하는 NK 세포는 감염된 세포에 결합된 항체의 Fc 도메인에 결합하여 NK 세포 활성화를 초래할 수 있다. 반대로 높은 수준의 MHC 클래스 I 단백질을 발현하는 세포에 대해서는 활성이 감소한다. 표적 세포와 접촉하면 NK 세포는 퍼포린과 같은 단백질 및 프로테아제(그랜자임)와 같은 효소를 방출한다. 퍼포린은 표적 세포의 세포막에 기공을 형성하여 아폽토시스 또는 세포 용해를 유도할 수 있다.
만능 줄기 세포(예를 들어, iPSC)로부터 CAR-NK-세포를 포함하는 NK 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있는 여러 기술이 있다; 예를 들어, 모두 전체가 그리고 특히 분화를 위한 방법론 및 시약에 대해 본원에 참조로 포함된, 문헌(Zhu et al., Methods Mol Biol. 2019; 2048:107-119; Knorr et al., Stem Cells Transl Med. 2013 2(4):274-83. doi: 10.5966/sctm.2012-0084; Zeng et al., Stem Cell Reports. 2017 Dec 12;9(6):1796-1812; Ni et al., Methods Mol Biol. 2013;1029:33-41; Bernareggi et al., Exp Hematol. 2019 71:13-23; Shankar et al., Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):234)을 참고한다. 분화는 일반적으로 CD56, KIRs, CD16, NKp44, NKp46, NKG2D, TRAIL, CD122, CD27, CD244, NK1.1, NKG2A/C, NCR1, Ly49, CD49b, CD11b, KLRG1, CD43, CD62L 및/또는 CD226을 포함하지만 이에 제한되지 않는 NK 세포 관련 및/또는 특이적 마커의 존재를 평가함으로써 당분야에 알려진 바와 같이 검정될 수 있다.
일부 구현예에서, 저면역원성 만능 세포는 간세포 기능 상실 또는 간 경화증을 해결하기 위해 간세포로 분화된다. HIP 세포를 간세포로 분화시키기 위해 사용될 수 있는 여러 기술이 있다; 예를 들어, 모두 전체가 그리고 특히 분화를 위한 방법론 및 시약에 대해 본원에 참조로 포함된, 문헌(Pettinato et al., doi: 10.1038/spre32888, Snykers et al., Methods Mol Biol., 2011 698:305-314, Si-Tayeb et al., Hepatology, 2010, 51:297-305 및 Asgari et al., Stem Cell Rev., 2013, 9(4):493-504)을 참고한다. 분화는 일반적으로 알부민, 알파 태아단백질 및 피브리노겐을 포함하지만 이에 제한되지 않는 간세포 관련 및/또는 특이적 마커의 존재를 평가함으로써 당분야에 알려진 바와 같이 검정될 수 있다. 분화는 또한 암모니아의 대사, LDL 저장 및 흡수, ICG 흡수 및 방출, 그리고 글리코겐 저장과 같이 기능적으로 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, NK 세포는 환자(예를 들어, 투여 시 수신체)에서 면역 반응을 활성화하지 않는다. NK 세포 집단을 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 수신체) 또는 환자에 투여함으로써 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 NK 세포는 본원에 설명된 키메라 항원 수용체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된(예를 들어, 변형된) NK 세포를 포함한다. 본원에 설명된 CAR을 포함하는 임의의 적합한 CAR이 NK 세포에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, NK 세포는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 게놈 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 B2M, CIITA, TRAC, TRB, PD1 또는 CTLA4 유전자에 삽입된다. 본원에 설명된 유전자 편집 방법(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)을 포함하는 임의의 적합한 방법이 CAR을 NK 세포의 게놈 유전자좌에 삽입하기 위해 사용될 수 있다.
U. 외인성 폴리뉴클레오티드
일부 구현예에서, 본원에 제공된 저면역원성 세포는 저면역원성 세포의 하나 이상의 게놈 유전자좌에 삽입된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 관심 단백질, 예를 들어 키메라 항원 수용체를 암호화한다. 본원에 설명된 유전자 편집 방법(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)을 포함하는 저면역원성 세포의 게놈 유전자좌에 외인성 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위해 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다.
외인성 폴리뉴클레오티드는 저면역원성 세포의 임의의 적합한 게놈 유전자좌에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 본원에 설명된 바와 같이 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 적합한 세이프 하버 및 표적 유전자좌는 CCR5 유전자, CXCR4 유전자, PPP1R12C(AAVS1로도 알려짐) 유전자, 알부민 유전자, SHS231 유전자좌, CLYBL 유전자, Rosa 유전자(예를 들어, ROSA26), F3 유전자(CD142로도 알려짐), MICA 유전자, MICB 유전자, LRP1 유전자(CD91로도 알려짐), HMGB1 유전자, ABO 유전자, RHD 유전자, FUT1 유전자, PDGFRa 유전자, OLIG2 유전자, GFAP 유전자 및 KDM5D 유전자(HY로도 알려짐)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자 유전자좌의 인트론, 엑손 또는 코딩 서열 영역에 관심이 있다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 내인성 유전자에 삽입되며 삽입은 내인성 유전자의 침묵화 또는 감소된 발현을 유발한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 B2M, CIITA, TRAC, TRB, PD1 또는 CTLA4 유전자 유전자좌에 삽입된다. 외인성 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 예시적인 게놈 유전자좌가 표 4 및 5에 표시된다.
Cas9 가이드의 경우, 모든 Cas9 가이드에 대한 스페이서 서열은 20 nt 가이드 서열이 고유한 가이드 서열에 상응하고 예를 들어 표 6에 나열된 것들을 포함하여 본원에 설명된 임의의 것들일 수 있다는 설명과 함께 표 6에 제공된다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 저면역원성 세포는 예를 들어 본원에 설명된 바와 같은 저면역원성 만능 세포(HIP)로부터 유래된다. 이러한 저면역원성 세포는 예를 들어 심장 세포, 신경 세포, 대뇌 내피 세포, 도파민성 뉴런, 아교 세포, 내피 세포, 갑상샘 세포, 췌장 섬세포(베타 세포), 망막 색소 상피 세포 및 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 저면역원성 세포는 췌장 베타 세포, T 세포(예를 들어, 1차 T 세포) 또는 아교 전구 세포이다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 외인성 CD47 폴리펩티드(예를 들어, 인간 CD47 폴리펩티드)를 암호화하고, 외인성 폴리펩티드는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌 또는 본원에 개시된 바와 같은 세이프 하버 또는 표적 부위 또는 내인성 유전자의 침묵화 또는 감소된 발현을 유발하는 게놈 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 B2M, CIITA, TRAC, TRB, PD1 또는 CTLA4 유전자 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 유전자는 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌, TRB 유전자좌, PD1 유전자좌 및 CTLA4 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된 특정 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 유전자는 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌 및 TRB 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된 특정 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 유전자 및 CAR을 암호화하는 유전자는 상이한 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 유전자 및 CAR을 암호화하는 유전자는 동일한 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, CD47을 암호화하는 유전자 및 CAR을 암호화하는 유전자는 B2M 유전자좌, CIITA 유전자좌, TRAC 유전자좌, TRB 유전자좌, 또는 세이프 하버 또는 표적 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, Rosa 유전자 유전좌, F3(CD142) 유전자 유전자좌, MICA 유전자, 유전자좌 MICB 유전자, 유전자좌 LRP1(CD91) 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, ad RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자좌, PDGFRa 유전자 유전자좌, OLIG2 유전자 유전자좌, GFAP 유전자 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 저면역원성 세포는 1차 T 세포 또는 저면역원성 만능 세포(예를 들어, 저면역원성 iPSC)로부터 유래된 T 세포이다. 예시적인 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 키메라 항원 수용체(예를 들어, 본원에 설명된 임의의 CAR)이다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 저면역원성 세포에서 외인성 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 저면역원성 세포 저면역원성 세포는 1차 T 세포 또는 저면역원성 만능 세포(예를 들어, 저면역원성 iPSC)로부터 유래된 T 세포이고, CAR 폴리펩티드를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 동일한 게놈 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 상이한 게놈 유전자좌에 삽입된다. 예시적인 구현예에서, 저면역원성 세포는 1차 T 세포 또는 저면역원성 만능 세포(예를 들어, iPSC)로부터 유래된 T 세포이다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 저면역원성 세포는 1차 NK 세포 또는 저면역원성 만능 세포(예를 들어, 저면역원성 iPSC)로부터 유래된 NK 세포이다. 예시적인 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 키메라 항원 수용체(예를 들어, 본원에 설명된 임의의 CAR)이다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 저면역원성 세포에서 외인성 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 저면역원성 세포 저면역원성 세포는 1차 NK 세포 또는 저면역원성 만능 세포(예를 들어, 저면역원성 iPSC)로부터 유래된 NK 세포이고, CAR 폴리펩티드를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 동일한 게놈 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 상이한 게놈 유전자좌에 삽입된다. 예시적인 구현예에서, 저면역원성 세포는 1차 NK 세포 또는 저면역원성 만능 세포(예를 들어, iPSC)로부터 유래된 NK 세포이다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 본원에 설명된 바와 같은 하나 이상의 게놈 유전자좌에 삽입된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다(예를 들어, 표 4). 일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 동일한 게놈 유전자좌에 삽입된다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 상이한 게놈 유전자좌에 삽입된다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 하기 인자: DUX4, CD24, CD27, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, IL-39, FasL, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpinb9, 및 본원에 제공된 임의의 관용원성 인자 중 하나를 암호화한다.
V. 세포의 이식
당업자에게 이해될 바와 같이, 세포 및 이의 유도체는 세포 유형 및 이들 세포의 궁극적인 용도 모두에 의존하는 당분야에 알려진 기술을 사용하여 이식될 수 있다. 일반적으로, 본원에 설명된 세포는 정맥내로 또는 환자의 특정 위치에서 주사에 의해 이식될 수 있다. 특정 위치에 이식될 때 세포는 유지되면서 분산을 방지하기 위해 겔 매트릭스에 현탁될 수 있다.
W. 면역억제제
일부 구현예에서, 면역억제제 및/또는 면역조절제는 저면역원성 세포 집단의 1차 투여 전에 환자에 투여되지 않는다. 많은 구현예에서, 면역억제제 및/또는 면역조절제는 저면역원성 세포 집단의 1차 투여 전에 환자에 투여된다. 일부 구현예에서, 면역억제제 및/또는 면역조절 세포는 세포의 1차 투여의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 면역억제제 및/또는 면역조절제는 세포의 1차 투여의 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주 이상 전에 투여된다. 특정 구현예에서, 면역억제제 및/또는 면역조절제는 세포의 1차 투여 후 환자에 투여되지 않거나, 세포의 1차 투여의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 면역억제제 및/또는 면역조절제는 세포의 1차 투여의 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주 이상 후에 투여된다. 면역억제제 및/또는 면역조절제의 비제한적 예는 사이클로스포린, 아자티오프린, 미코페놀산, 미코페놀레이트 모페틸, 프레드니손과 같은 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트, 금 염, 설파살라진, 항말라리아제, 브레퀴나르, 레플루노미드, 미조리빈, 15-데옥시스페르구알린, 6-머캅토퓨린, 시클로포스파미드, 라파마이신, 타크롤리무스(FK-506), OKT3, 항-가슴샘 세포 글로불린, 티모펜틴, 티모신-α 및 유사한 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역억제제 및/또는 면역조절제는 IL-2 수용체의 p75에 결합하는 항체, 예를 들어 MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFN-감마, TNF-알파, IL-4, IL-5, IL-6R, IL-6, IGF, IGFR1, IL-7, IL-8, IL-10, CD11a, 또는 CD58에 결합하는 항체, 및 이의 임의의 리간드에 결합하는 항체로 구성된 면역억제 항체 군으로부터 선택된다. 면역억제제 및/또는 면역조절제가 세포의 1차 투여 전에 또는 후에 환자에 투여되는 일부 구현예에서, 투여는 MHC I 및/또는 MHC II 발현을 갖고 CD47의 외인성 발현을 갖지 않는 세포에 필요할 것보다 더 낮은 투여량이다.
한 구현예에서, 이러한 면역억제제 및/또는 면역조절제는 가용성 IL-15R, IL-10, B7 분자(예를 들어, B7-1, B7-2, 이의 변이체 및 이의 단편), ICOS 및 OX40, 음성 T 세포 조절제의 억제제(예를 들어 CTLA-4에 대한 항체) 및 유사한 제제로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역억제제 및/또는 면역조절제는 저면역원성 세포 집단의 투여 전에 환자에 투여되지 않는다. 많은 구현예에서, 면역억제제 및/또는 면역조절제는 저면역원성 세포 집단의 1차 및/또는 2차 투여 전에 환자에 투여된다. 일부 구현예에서, 면역억제제 및/또는 면역조절제는 세포 투여의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 면역억제제 및/또는 면역조절제는 세포의 1차 및/또는 2차 투여의 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주 이상 전에 투여된다. 특정 구현예에서, 면역억제제 및/또는 면역조절제는 세포 투여의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 면역억제제 및/또는 면역조절제는 세포의 제1 및/또는 2차 투여의 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주 이상 후에 투여된다. 면역억제제 및/또는 면역조절제가 세포 투여 전에 또는 후에 환자에 투여되는 일부 구현예에서, 투여는 MHC I 및/또는 MHC II 발현을 갖고 CD47의 외인성 발현을 갖지 않는 세포에 필요할 것보다 더 낮은 투여량이다.
IV. 상세한 구현예
한 측면에서, 외인성 CD47 폴리펩티드 및 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하는 저면역원성 세포 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공되며, 환자는 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된다. 일부 구현예에서, 방법은 환자의 장애를 치료하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 환자는 이전 임신 또는 이전 동종이계 이식으로 인해 감작된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 동종항원은 인간 백혈구 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 동종항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, 동종이계 이식은 동종이계 세포 이식, 동종이계 수혈, 동종이계 조직 이식 및 동종이계 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 환자는 저면역원성 세포 집단에 대해 감소된 면역 반응을 나타내거나 면역 반응을 나타내지 않는다. 일부 경우에, 환자는 동종이계 이식에 대해 면역 반응을 나타내고 저면역원성 세포 집단에 대해 감소된 면역 반응을 나타내거나 면역 반응을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 면역 반응 감소 또는 부재는 저면역원성 세포 집단에 대한 전신 면역 반응 감소 또는 부재, 적응 면역 반응 감소 또는 부재, 선천성 면역 반응 감소 또는 부재, T 세포 반응 감소 또는 부재, 및 B 세포 반응의 감소 또는 부재로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1주 이상 후에 투여된다. 특정 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1개월 이상 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 외인성 CD47 폴리펩티드 및 B2M 및/또는 CIITA의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 외인성 CD47 폴리펩티드 및 B2M 및 CIITA의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 DUX4, CD24, CD46, CD55, CD59, CD200, PD-L1, HLA-E, HLA-G, IDO1, FasL, IL-35, IL-39, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpin B9, 및/또는 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 CD142의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포이다. 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 분화된 세포는 심장 세포, 신경 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포(예를 들어, 형질 세포 또는 혈소판), 및 상피 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 1차 T 세포로부터 유래된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 환자와 상이한 하나 이상(예를 들어, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 50 이상 또는 100 이상)의 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 T 세포 풀로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체(CAR)는 (a) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 1세대 CAR; (b) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 2개의 신호전달 도메인을 포함하는 2세대 CAR; (c) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 3개의 신호전달 도메인을 포함하는 3세대 CAR; 및 (d) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 3개 또는 4개의 신호전달 도메인, 및 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 4세대 CAR로 구성된 군으로부터 선택된다.
CAR의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 (a) 신생물 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; (b) T 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; (c) 항원 결합 도메인은 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특성을 표적화하고; (d) 노화 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; (e) 감염성 질환의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; 및 (f) 세포의 세포 표면 항원에 결합하는 항원 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 항체, 이의 항원 결합 부분, scFv 및 Fab로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD19 또는 BCMA에 결합한다.
일부 구현예에서, CAR의 막횡단 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD9, CD16, CD28, CD45, CD22, CD33, CD34, CD37, CD40, CD40L/CD154, CD45, CD64, CD80, CD86, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, CD154, FcεRIγ, VEGFR2, FAS, FGFR2B 및 이의 기능적 변이체의 막횡단 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 신호전달 도메인(들)은 공동자극 도메인(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 동일하지 않은 2개의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인(들)은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생성, CAR-T 세포 증식 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다.
CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 4세대 CAR의 경우, 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 저면역원성 세포에 대한 내인성 또는 외인성 사이토카인 유전자이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 친염증성 사이토카인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 친염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-9, IL-12, IL-18, TNF, IFN-감마 및 이의 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
4세대 CAR의 일부 구현예에서, CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인은 전사 인자 또는 기능적 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
1차 T 세포로부터 유래된 세포의 일부 구현예에서, CAR은 CD3 제타(CD3ζ) 도메인 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 전이유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 (i) 항-CD19 scFv; (ii) CD8α 힌지 및 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 공동자극 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) CD3ζ 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다. 특정 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA4) 및/또는 프로그래밍된 세포 사멸(PD1)의 감소된 발현을 포함한다. 특정 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)의 증가된 발현을 포함한다.
방법의 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 감소된 수준의 면역 활성화를 유도하거나 면역 활성화를 유도하지 않는다. 특정 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 감소된 수준의 전신 TH1 활성화를 유도하거나 전신 TH1 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 감소된 수준의 면역 활성화를 유도하거나 PBMC의 면역 활성화를 유도하지 않는다. 특정 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 저면역원성 세포에 대한 감소된 수준의 공여체 특이적 IgG 항체를 유도하거나 공여체 특이적 IgG 항체를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 저면역원성 세포에 대해 감소된 수준의 IgM 및 IgG 항체 생성을 유도하거나 IgM 및 IgG 항체 생성을 유도하지 않는다. 다른 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 저면역원성 세포의 감소된 수준의 세포독성 T 세포 사멸을 유도하거나 세포독성 T 세포 사멸을 유도하지 않는다. 특정 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 전신 급성 세포성 면역 반응을 촉발하지 않는다.
일부 구현예에서, 환자는 저면역원성 세포 집단의 투여의 적어도 3일 이상 전에 또는 후에 면역억제제를 투여받지 않는다.
또 다른 측면에서, (a) 치료 유효량의 저면역원성 세포를 포함하는 1차 투여; (b) 회복 기간; 및 (c) 치료 유효량의 저면역원성 세포를 포함하는 2차 투여를 포함하는 투약 요법을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공되며; 저면역원성 세포는 외인성 CD47 폴리펩티드 및 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하고, 환자는 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된다. 일부 구현예에서, 방법은 환자의 장애를 치료하는 데 유용한다.
일부 구현예에서, 환자는 이전 임신 또는 이전 동종이계 이식으로 인해 감작된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 동종항원은 인간 백혈구 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 동종항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, 동종이계 이식은 동종이계 세포 이식, 동종이계 수혈, 동종이계 조직 이식 및 동종이계 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 환자는 저면역원성 세포 집단에 대해 감소된 면역 반응을 나타내거나 면역 반응을 나타내지 않는다. 일부 경우에, 면역 반응 감소 또는 부재는 전신 면역 반응 감소 또는 부재, 적응 면역 반응 감소 또는 부재, 선천성 면역 반응 감소 또는 부재, T 세포 반응 감소 또는 부재, 및 저면역원성 세포 집단에 대한 B 세포 반응의 감소 또는 부재로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포의 1차 투여는 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1주 이상 후에 발생한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포의 1차 투여는 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1개월 이상 후에 발생한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 MHC 클래스 I 및 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 외인성 CD47 폴리펩티드 및 B2M 및/또는 CIITA의 감소된 발현을 발현한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 외인성 CD47 폴리펩티드 및 B2M 및 CIITA의 감소된 발현을 발현한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 DUX4, CD24, CD46, CD55, CD59, CD200, PD-L1, HLA-E, HLA-G, IDO1, FasL, IL-35, IL-39, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpin B9 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 CD142의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포이다. 특정 구현예에서, 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포를 포함한다. 많은 구현예에서, 분화된 세포는 심장 세포, 신경 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포(예를 들어, 형질 세포 또는 혈소판), 및 상피 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 1차 T 세포로부터 유래된 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 환자와 상이한 하나 이상(예를 들어, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 50 이상 또는 100 이상)의 대상체로부터 유래된 1차 T 세포를 포함하는 T 세포 풀로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 키메라 항원 수용체를 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체(CAR)는 (a) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 1세대 CAR; (b) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 2개의 신호전달 도메인을 포함하는 2세대 CAR; (c) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 3개의 신호전달 도메인을 포함하는 3세대 CAR; 및 (d) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 3개 또는 4개의 신호전달 도메인, 및 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 4세대 CAR로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 (a) 항원 결합 도메인이 신생물 세포의 항원 특성을 표적화하고; (b) T 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인, (c) 항원 결합 도메인이 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특성을 표적화하고; (d) 노화 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; (e) 감염성 질환의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; 및 (f) 세포의 세포 표면 항원에 결합하는 항원 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체, 이의 항원 결합 부분, scFv 및 Fab로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD19 또는 BCMA에 결합한다.
일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD9, CD16, CD28, CD45, CD22, CD33, CD34, CD37, CD40, CD40L/CD154, CD45, CD64, CD80, CD86, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, CD154, FcεRIγ, VEGFR2, FAS, FGFR2B 및 이의 기능적 변이체의 막횡단 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 신호전달 도메인(들)은 공동자극 도메인(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 동일하지 않은 2개의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인(들)은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생성, CAR-T 세포 증식 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다.
4세대 CAR의 일부 구현예에서, CAR의 성공적인 신호전달은 사이토카인 유전자의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 저면역원성 세포에 대한 내인성 또는 외인성 사이토카인 유전자이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 친염증성 사이토카인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 친염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-9, IL-12, IL-18, TNF, IFN-감마 및 이의 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 4세대 CAR의 일부 구현예에서, CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인은 전사 인자 또는 기능적 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 CD3 제타(CD3ζ) 도메인 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 전이유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) 항-CD19 scFv; (ii) CD8α 힌지 및 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 공동자극 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) CD3ζ 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA4) 및/또는 프로그래밍된 세포 사멸(PD1)의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)의 증가된 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, 회복 기간은 적어도 1개월 이상(예를 들어, 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월 이상)을 포함한다. 일부 구현예에서, 회복 기간은 적어도 2개월 이상(예를 들어, 적어도 2개월, 3개월, 4개월 이상)을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 2차 투여는 1차 투여로부터의 저면역원성 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시된다.
일부 구현예에서, 1차 및/또는 2차 투여 시(예를 들어, 1차 투여 또는 2차 투여 또는 1차 및 2차 투여 모두 시), 저면역원성 세포는 환자에서 감소된 수준의 면역 활성화를 유도하거나 면역 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 1차 및/또는 2차 투여 시, 저면역원성 세포는 환자에서 감소된 수준의 전신 TH1 활성화를 유도하거나 전신 TH1 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 1차 및/또는 2차 투여 시, 저면역원성 세포는 환자에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 감소된 수준의 면역 활성화를 유도하거나 PBMC의 면역 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 1차 및/또는 2차 투여 시, 저면역원성 세포는 환자에서 저면역원성 세포에 대해 감소된 수준의 공여체 특이적 IgG 항체를 유도하거나 공여체 특이적 IgG 항체를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 1차 및/또는 2차 투여 시, 저면역원성 세포는 환자에서 저면역원성 세포에 대해 감소된 수준의 IgM 및 IgG 항체 생성을 유도하거나 IgM 및 IgG 항체 생성을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 1차 및/또는 2차 투여 시, 저면역원성 세포는 환자에서 저면역원성 세포의 감소된 수준의 세포독성 T 세포 사멸을 유도하거나 세포독성 T 세포 사멸을 유도하지 않는다.
일부 구현예에서, 환자는 저면역원성 세포의 1차 투여의 적어도 3일 이상 전에 또는 후에 면역억제제를 투여받지 않는다. 일부 구현예에서, 환자는 저면역원성 세포의 2차 투여의 적어도 3일 이상 전에 또는 후에 면역억제제를 투여받지 않는다. 특정 구현예에서, 환자는 회복 기간 동안 면역억제제를 투여받지 않는다.
일부 구현예에서, 설명된 방법은 적어도 2회 투약 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 경우에, 투약 요법은 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 환자에 적어도 2회(예를 들어, 적어도 2, 3, 4회 이상) 투여된다.
환자의 장애를 치료하기 위한 외인성 CD47 폴리펩티드 및 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하는 저면역원성 세포 집단의 용도가 본원에 제공되며, 환자는 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된다.
환자의 장애를 치료하기 위한 외인성 CD47 폴리펩티드 및 MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하는 저면역원성 세포 집단의 용도가 본원에 제공되며, 환자는 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된다.
환자의 장애를 치료하기 위한 외인성 CD47 폴리펩티드 및 감소된 수준의 B2M 및 CIITA 폴리펩티드를 포함하는 저면역원성 세포 집단의 용도가 본원에 제공되며, 환자는 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된다.
환자의 장애를 치료하기 위한 외인성 CD47 폴리펩티드, B2M 유전자의 게놈 변형 및 CIITA 유전자의 게놈 변형을 포함하는 저면역원성 세포 집단의 용도가 본원에 제공되며, 환자는 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된다.
세포 집단의 용도의 일부 구현예에서, 하나 이상의 동종항원은 인간 백혈구 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 동종항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타낸다.
설명된 용도의 일부 구현예에서, 환자는 이전 임신 또는 이전 동종이계 이식으로 인해 감작된다. 일부 구현예에서, 동종이계 이식은 동종이계 세포 이식, 동종이계 수혈, 동종이계 조직 이식 및 동종이계 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 환자는 저면역원성 세포 집단에 대해 감소된 면역 반응을 나타내거나 면역 반응을 나타내지 않는다. 특정 구현예에서, 면역 반응 감소 또는 부재는 저면역원성 세포 집단에 대한 전신 면역 반응 감소 또는 부재, 적응 면역 반응 감소 또는 부재, 선천성 면역 반응 감소 또는 부재, T 세포 반응 감소 또는 부재, 및 B 세포 반응 감소 또는 부재로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 DUX4, CD24, CD46, CD55, CD59, CD200, PD-L1, HLA-E, HLA-G, IDO1, FasL, IL-35, IL-39, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpin B9 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 저면역원성 세포는 CD142 유전자의 게놈 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 분화된 세포는 심장 세포, 신경 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포(예를 들어, 형질 세포 또는 혈소판), 및 상피 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 1차 T 세포로부터 유래된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 환자와 상이한 하나 이상(예를 들어, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 50 이상 또는 100 이상)의 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 T 세포 풀로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체(CAR)는 (a) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 1세대 CAR; (b) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 2개의 신호전달 도메인을 포함하는 2세대 CAR; (c) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 3개의 신호전달 도메인을 포함하는 3세대 CAR; 및 (d) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 3개 또는 4개의 신호전달 도메인, 및 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 4세대 CAR로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 (a) 항원 결합 도메인이 신생물 세포의 항원 특성을 표적화하고; (b) T 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인, (c) 항원 결합 도메인이 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특성을 표적화하고; (d) 노화 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; (e) 감염성 질환의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; 및 (f) 세포의 세포 표면 항원에 결합하는 항원 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다.
CAR의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체, 이의 항원 결합 부분, scFv 및 Fab로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD19 또는 BCMA에 결합한다.
CAR의 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD9, CD16, CD28, CD45, CD22, CD33, CD34, CD37, CD40, CD40L/CD154, CD45, CD64, CD80, CD86, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, CD154, FcεRIγ, VEGFR2, FAS, FGFR2B 및 이의 기능적 변이체의 막횡단 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함한다.
CAR의 일부 구현예에서, 신호전달 도메인(들)은 공동자극 도메인(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 동일하지 않은 2개의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인(들)은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생성, CAR-T 세포 증식 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다.
4세대 CAR에 대해 설명된 바와 같이, CAR의 성공적인 신호전달은 사이토카인 유전자의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 저면역원성 세포에 대한 내인성 또는 외인성 사이토카인 유전자이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 친염증성 사이토카인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 친염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-9, IL-12, IL-18, TNF, IFN-감마 및 이의 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 4세대 CAR의 일부 구현예에서, CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인은 전사 인자 또는 기능적 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 CD3 제타 도메인 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 전이유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) 항-CD19 scFv; (ii) CD8α 힌지 및 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 공동자극 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) CD3ζ 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA4) 및/또는 프로그래밍된 세포 사멸(PD1)의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)의 증가된 발현을 포함한다.
한 측면에서, 외인성 CD47 폴리펩티드 및 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하는 저면역원성 세포 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공되며, 환자는 이전에 동종이계 이식을 받았다.
일부 구현예에서, 동종이계 이식은 동종이계 세포 이식, 동종이계 수혈, 동종이계 조직 이식 및 동종이계 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 동종항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 동종항원은 인간 백혈구 항원을 포함한다.
일부 구현예에서, 환자는 저면역원성 세포 집단에 대해 감소된 면역 반응을 나타내거나 면역 반응을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 면역 반응 감소 또는 부재는 저면역원성 세포 집단에 대한 전신 면역 반응 감소 또는 부재, 적응 면역 반응 감소 또는 부재, 선천성 면역 반응 감소 또는 부재, T 세포 반응 감소 또는 부재, 및 B 세포 반응 감소 또는 부재로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1주 이상 후에 투여된다. 특정 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1개월 이상 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 외인성 CD47 폴리펩티드 및 B2M 및/또는 CIITA의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 외인성 CD47 폴리펩티드 및 B2M 및 CIITA의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 DUX4, CD24, CD46, CD55, CD59, CD200, PD-L1, HLA-E, HLA-G, IDO1, FasL, IL-35, IL-39, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpin B9 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 CD142의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포이다. 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 분화된 세포는 심장 세포, 신경 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포(예를 들어, 형질 세포 또는 혈소판), 및 상피 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 1차 T 세포로부터 유래된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 환자와 상이한 하나 이상(예를 들어, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 50 이상 또는 100 이상)의 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 T 세포 풀로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체(CAR)는 (a) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 1세대 CAR; (b) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 2개의 신호전달 도메인을 포함하는 2세대 CAR; (c) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 3개의 신호전달 도메인을 포함하는 3세대 CAR; 및 (d) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 3개 또는 4개의 신호전달 도메인, 및 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 4세대 CAR로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 (a) 항원 결합 도메인이 신생물 세포의 항원 특성을 표적화하고; (b) T 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; (c) 항원 결합 도메인은 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특성을 표적화하고; (d) 노화 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; (e) 감염성 질환의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; 및 (f) 세포의 세포 표면 항원에 결합하는 항원 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체, 이의 항원 결합 부분, scFv 및 Fab로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD19 또는 BCMA에 결합한다.
일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD9, CD16, CD28, CD45, CD22, CD33, CD34, CD37, CD40, CD40L/CD154, CD45, CD64, CD80, CD86, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, CD154, FcεRIγ, VEGFR2, FAS, FGFR2B 및 이의 기능적 변이체의 막횡단 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 신호전달 도메인(들)은 공동자극 도메인(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 동일하지 않은 2개의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인(들)은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생성, CAR-T 세포 증식 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다.
사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 4세대 CAR의 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 저면역원성 세포에 대한 내인성 또는 외인성 사이토카인 유전자이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 친염증성 사이토카인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 친염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-9, IL-12, IL-18, TNF, IFN-감마 및 이의 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
4세대 CAR의 일부 구현예에서, CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인은 전사 인자 또는 기능적 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포의 CAR은 CD3 제타 도메인 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 전이유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) 항-CD19 scFv; (ii) CD8α 힌지 및 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 공동자극 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) CD3ζ 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA4) 및/또는 프로그래밍된 세포 사멸(PD1)의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)의 증가된 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 감소된 수준의 면역 활성화를 유도하거나 면역 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 감소된 수준의 전신 TH1 활성화를 유도하거나 전신 TH1 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 감소된 수준의 면역 활성화를 유도하거나 PBMC의 면역 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 저면역원성 세포에 대해 감소된 수준의 공여체 특이적 IgG 항체를 유도하거나 공여체 특이적 IgG 항체를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 저면역원성 세포에 대해 감소된 수준의 IgM 및 IgG 항체 생성을 유도하거나 IgM 및 IgG 항체 생성을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 저면역원성 세포의 감소된 수준의 세포독성 T 세포 사멸을 유도하거나 세포독성 T 세포 사멸을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 전신 급성 세포성 면역 반응을 촉발하지 않는다.
일부 구현예에서, 환자는 저면역원성 세포 집단의 투여의 적어도 3일 이상 전에 또는 후에 면역억제제를 투여받지 않는다.
또 다른 측면에서, 외인성 CD47 폴리펩티드 및 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하는 저면역원성 세포 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 환자는 이전에 임신 중 동종면역화를 나타냈다. 일부 구현예에서, 임신 중 동종면역화는 태아 및 신생아 용혈성 질환(HDFN), 신생아 동종면역 호중구감소증(NAN) 또는 태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증(FNAIT)이다. 일부 구현예에서, 설명된 방법은 환자의 장애를 치료하는 데 유용한다.
일부 구현예에서, 환자는 저면역원성 세포 집단에 대해 감소된 면역 반응을 나타내거나 면역 반응을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 면역 반응 감소 또는 부재는 저면역원성 세포 집단에 대한 전신 면역 반응 감소 또는 부재, 적응 면역 반응 감소 또는 부재, 선천성 면역 반응 감소 또는 부재, T 세포 반응 감소 또는 부재, 및 B 세포 반응 감소 또는 부재로 구성된 군으로부터 선택된다.
많은 구현예에서, 저면역원성 세포는 MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 외인성 CD47 폴리펩티드 및 B2M 및/또는 CIITA의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 외인성 CD47 폴리펩티드 및 B2M 및 CIITA의 감소된 발현을 포함한다. 특정 구현예에서, 저면역원성 세포는 DUX4, CD24, CD46, CD55, CD59, CD200, PD-L1, HLA-E, HLA-G, IDO1, FasL, IL-35, IL-39, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpin B9 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 저면역원성 세포는 CD142의 감소된 발현 수준을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포이다. 특정 구현예에서, 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포를 포함한다.
많은 구현예에서, 분화된 세포는 심장 세포, 신경 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포(예를 들어, 형질 세포 또는 혈소판), 및 상피 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 1차 T 세포로부터 유래된 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 환자와 상이한 하나 이상(예를 들어, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 50 이상 또는 100 이상)의 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 T 세포 풀로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체(CAR)는 (a) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 1세대 CAR; (b) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 2개의 신호전달 도메인을 포함하는 2세대 CAR; (c) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 3개의 신호전달 도메인을 포함하는 3세대 CAR; 및 (d) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 3개 또는 4개의 신호전달 도메인, 및 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 4세대 CAR로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 (a) 항원 결합 도메인이 신생물 세포의 항원 특성을 표적화하고; (b) T 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; (c) 항원 결합 도메인이 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특성을 표적화하고; (d) 노화 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; (e) 감염성 질환의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; 및 (f) 세포의 세포 표면 항원에 결합하는 항원 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체, 이의 항원 결합 부분, scFv 및 Fab로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD19 또는 BCMA에 결합한다.
일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD9, CD16, CD28, CD45, CD22, CD33, CD34, CD37, CD40, CD40L/CD154, CD45, CD64, CD80, CD86, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, CD154, FcεRIγ, VEGFR2, FAS, FGFR2B 및 이의 기능적 변이체의 막횡단 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 신호전달 도메인(들)은 공동자극 도메인(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 동일하지 않은 2개의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인(들)은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생성, CAR-T 세포 증식 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다.
사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 4세대 CAR의 경우, 일부 구현예에서 사이토카인 유전자는 저면역원성 세포에 대한 내인성 또는 외인성 사이토카인 유전자이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 친염증성 사이토카인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 친염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-9, IL-12, IL-18, TNF, IFN-감마 및 이의 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 CAR의 도메인은 전사 인자 또는 기능적 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 CD3 제타 도메인 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 전이유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) 항-CD19 scFv; (ii) CD8α 힌지 및 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 공동자극 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) CD3ζ 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA4) 및/또는 프로그래밍된 세포 사멸(PD1)의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)의 증가된 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 감소된 수준의 면역 활성화를 유도하거나 면역 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 감소된 수준의 전신 TH1 활성화를 유도하거나 전신 TH1 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 감소된 수준의 면역 활성화를 유도하거나 PBMC의 면역 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 저면역원성 세포에 대해 감소된 수준의 공여체 특이적 IgG 항체를 유도하거나 공여체 특이적 IgG 항체를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 저면역원성 세포에 대해 감소된 수준의 IgM 및 IgG 항체 생성을 유도하거나 IgM 및 IgG 항체 생성을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 저면역원성 세포의 감소된 수준의 세포독성 T 세포 사멸을 유도하거나 세포독성 T 세포 사멸을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포 집단은 투여 시 환자에서 전신 급성 세포성 면역 반응을 촉발하지 않는다.
일부 구현예에서, 환자는 저면역원성 세포 집단의 투여의 적어도 3일 이상 전에 또는 후에 면역억제제를 투여받지 않는다.
하나의 측면에서, 하나 이상의 저면역원성 변형을 포함하는 줄기 세포로부터 분화된 세포 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 세포 결핍을 갖는 감작된 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 하나 이상의 저면역원성 변형을 포함하는 줄기 세포로부터 분화된 세포 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 세포 치료법의 후보인 감작된 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
한 측면에서, 하나 이상의 저면역원성 변형을 포함하는 줄기 세포로부터 분화된 세포 집단을 세포 치료법의 후보인 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공되며, 환자는 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았다.
한 측면에서, 하나 이상의 저면역원성 변형을 포함하는 줄기 세포로부터 분화된 세포 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 세포 치료법의 후보인 감작된 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 환자는 세포 집단의 투여 전, 도중 또는 후에 면역억제제가 투여되지 않는다.
한 측면에서, 환자에 적어도 부분적인 장기 이식을 투여하기 전에 하나 이상의 저면역원성 변형을 포함하는 줄기 세포로부터 분화된 세포 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 적어도 부분적인 장기 부전을 갖는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 조직 또는 장기 이식을 투여하기 전에 하나 이상의 저면역원성 변형을 포함하는 줄기 세포로부터 분화된 세포 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 투여를 필요로 하는 환자에 조직 또는 장기 이식을 투여하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 환자는 감작된 환자이다. 특정 구현예에서, 환자는 이전 임신 또는 이전 이식으로 인해 감작된다. 특정 구현예에서, 이전 이식은 세포 이식, 수혈, 조직 이식 및 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이전 이식은 동종이계 이식이다.
일부 구현예에서, 이전 이식은 인간 기원의 키메라, 변형된 비-인간 자가 세포, 변형된 자가 세포, 자가 조직 및 자가 장기로 구성된 군으로부터 선택된 이식이다. 일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 동종항원 또는 하나 이상의 자가 항원에 대해 감작된다. 특정 구현예에서, 환자는 하나 이상의 동종항원 또는 하나 이상의 자가 항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타낸다.
일부 구현예에서, 환자는 알레르기를 갖는다. 특정 구현예에서, 알레르기는 건초열, 식품 알레르기, 곤충 알레르기, 약물 알레르기 및 아토피성 피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 알레르기이다.
특정 구현예에서, 세포 집단은 외인성 CD47 폴리펩티드를 발현하고 B2M 및/또는 CIITA의 감소된 발현을 갖는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 심장 세포, 신경 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포 및 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 환자는 세포 집단에 대해 감소된 면역 반응을 나타내거나 면역 반응을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 감소된 면역 반응은 "야생형" 세포 집단이 투여된 환자 또는 대조군 대상체의 면역 반응과 비교된다. 일부 구현예에서, 나타난 세포 집단 반응에 대한 면역 반응 감소 또는 부재는 전신 면역 반응 감소 또는 부재, 적응 면역 반응 감소 또는 부재, 선천성 면역 반응 감소 또는 부재, T 세포 반응 감소 또는 부재 및 B 세포 반응 감소 또는 부재로 구성된 군으로부터 선택된다. 예시적인 구현예에서, 환자는 a) 세포 집단의 투여 시 감소된 수준의 전신 TH1 활성화 또는 전신 TH1 활성화 부재; b) 세포 집단의 투여 시 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 감소된 수준의 면역 활성화 또는 PBMC의 면역 활성화 부재; c) 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 감소된 수준의 공여체 특이적 IgG 항체 공여체 특이적 IgG 항체 부재; d) 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 감소된 수준의 IgM 및 IgG 항체 생성 또는 IgM 및 IgG 항체 생성 부재; 및/또는 e) 세포 집단의 투여 시 세포 집단의 감소된 수준의 세포독성 T 세포 사멸 또는 세포독성 T 세포 사멸 부재를 나타낸다.
특정 구현예에서, 환자는 세포 집단의 투여 전에 면역억제제를 투여받지 않는다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 환자가 감작된 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월 이상 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 줄기 세포는 만능 줄기 세포이다. 특정 구현예에서, 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포이다.
일부 구현예에서, 세포 결핍은 신경퇴행성 질환과 관련되거나 세포 치료법은 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 것이다. 특정 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 백질이영양증, 헌팅턴병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 횡단 척수염 및 펠리체우스-메르츠바허병(PMD)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 아교 전구 세포, 희소돌기아교세포, 성상세포 및 도파민성 뉴런으로 구성된 군으로부터 선택된 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 도파민성 뉴런은 신경 줄기 세포, 신경 전구 세포, 미성숙 도파민성 뉴런 및 성숙 도파민성 뉴런으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 세포 결핍은 당뇨병과 관련되거나 세포 치료법은 당뇨병 치료를 위한 것이다. 특정 구현예에서, 세포 집단은 췌장 베타 섬세포를 포함하는 췌장 섬세포 집단이다. 일부 구현예에서, 췌장 섬세포는 췌장 섬 전구 세포, 미성숙 췌장 섬세포 및 성숙 췌장 섬세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 세포 결핍은 심혈관 병태 또는 질환과 관련되거나 세포 치료법은 심혈관 병태 또는 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 심근세포 집단이다.
일부 구현예에서, 세포 결핍은 혈관 병태 또는 질환과 관련되거나 세포 치료법은 혈관 병태 또는 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 내피 세포 집단이다.
일부 구현예에서, 세포 결핍은 자가면역 갑상샘염과 관련되거나 세포 치료법은 자가면역 갑상샘염의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 갑상샘 전구 세포 집단이다.
특정 구현예에서, 세포 결핍은 간 질환과 관련되거나 세포 치료법은 간 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 간 질환은 간 경변증을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 간세포 또는 간 전구 세포 집단이다. 특정 구현예에서, 세포 결핍은 각막 질환과 관련되거나 세포 치료법은 각막 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 각막 질환은 푹스 이영양증 또는 선천성 유전 내피 이영양증이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 각막 내피 전구 세포 또는 각막 내피 세포 집단이다.
일부 구현예에서, 세포 결핍은 신장 질환과 관련되거나 세포 치료법은 신장 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 신장 전구체 세포 또는 신장 세포 집단이다.
특정 구현예에서, 세포 치료법은 암 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 암은 B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 샘암종, 췌장 샘암종, 교모세포종, 신경모세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단이다.
일부 구현예에서, 이전 치료는 세포 집단을 포함하지 않았다. 특정 구현예에서, 세포 집단은 이전 치료와 동일한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 향상된 치료 효과를 나타낸다. 특정 구현예에서, 세포 집단은 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 더 긴 치료 효과를 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 이전 치료와 상이한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 이전 치료는 치료적으로 비효과적이다. 일부 구현예에서, 환자는 이전 치료에 대해 면역 반응을 나타냈다.
일부 구현예에서, 이전 치료는 자살 유전자 안전 스위치 시스템을 포함하는 치료 세포 집단을 투여하는 것을 포함하고, 면역 반응은 자살 유전자 안전 스위치 시스템의 활성화에 반응하여 발생한다.
일부 구현예에서, 이전 치료는 기계 보조 치료를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 기계 보조 치료는 혈액투석 또는 심실 보조 장치를 포함한다.
일부 구현예에서, 조직 및/또는 장기 이식 또는 부분 장기 이식은 심장 이식, 폐 이식, 신장 이식, 간 이식, 췌장 이식, 장 이식, 위 이식, 각막 이식, 골수 이식, 혈관 이식, 심장 판막 이식, 뼈 이식, 부분 폐 이식, 부분 신장 이식, 부분 간 이식, 부분 췌장 이식, 부분 장 이식 및/또는 부분 각막 이식으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 심장, 폐, 신장, 간, 췌장, 장, 위, 각막, 골수, 혈관, 심장, 판막 및/또는 뼈로 구성된 군으로부터 선택된 조직 또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 투여된다.
일부 구현예에서, 조직 또는 장기 이식은 동종이식편 이식이다. 특정 구현예에서, 조직 또는 장기 이식은 자가이식편 이식이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 조직 또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 투여되고 조직 또는 장기 이식은 동일한 조직 또는 장기의 대체를 위한 것이다.
특정 구현예에서, 세포 집단은 조직 또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 투여되고 조직 또는 장기 이식은 상이한 조직 또는 장기의 대체를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 장기 이식은 신장 이식이고 세포 집단은 췌장 베타 섬세포 집단이다. 예시적인 구현예에서, 환자는 당뇨병을 갖는다.
또 다른 측면에서, 저면역원성 세포 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법에서, 저면역원성 세포는 각각 a) 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된 외인성 폴리뉴클레오티드; b) 외인성 CD47 폴리펩티드; 및 c) MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함한다.
한 측면에서, 환자에 투약 요법을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법에서, 투약 요법은 a) 치료 유효량의 저면역원성 세포를 포함하는 1차 투여; b) 회복 기간 및 c) 치료 유효량의 저면역원성 세포를 포함하는 2차 투여를 포함하며; 저면역원성 세포는 각각 B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 저면역원성 세포는 각각 외인성 CD47 폴리펩티드 및 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함한다.
한 측면에서, 환자의 질환 치료를 위한 저면역원성 세포 집단의 용도가 본원에 제공되며, 저면역원성 세포는 각각 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 저면역원성 세포는 각각 외인성 CD47 폴리펩티드 및 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함한다.
한 측면에서, 저면역원성 세포 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법에서, 저면역원성 세포는 각각 a) 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된 외인성 폴리뉴클레오티드; b) 외인성 CD47 폴리펩티드; 및 c) MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하며, 환자는 이전에 동종이계 이식을 받았다.
한 측면에서, 환자에 저면역원성 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는 세포 치료법의 후보인 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법에서, 저면역원성 세포는 각각 a) 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된 외인성 폴리뉴클레오티드; b) 외인성 CD47 폴리펩티드; 및 c) MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함한다.
한 측면에서, 세포 치료법의 후보인 환자에 저면역원성 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법에서, 저면역원성 세포는 각각 a) 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된 외인성 폴리뉴클레오티드; b) 외인성 CD47 폴리펩티드; 및 c) MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하며, 환자는 병태 또는 질환에 대한 이전 치료를 받았다.
한 측면에서, 환자에 저면역원성 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는 세포 치료법의 후보인 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 저면역원성 세포는 각각 a) B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된 외인성 폴리뉴클레오티드; b) 외인성 CD47 폴리펩티드; 및 c) MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하고, 환자는 세포 집단의 투여 전, 도중 또는 후에 면역억제제를 투여받지 않는다.
또 다른 측면에서, 환자에 저면역원성 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 적어도 부분 장기 부전을 갖는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법에서, 저면역원성 세포는 각각 a) 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된 외인성 폴리뉴클레오티드; b) 외인성 CD47 폴리펩티드; 및 c) MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하며, 저면역원성 세포 집단은 적어도 부분 장기 이식을 환자에 투여하기 전에 투여된다.
또 다른 측면에서, 환자에 저면역원성 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에 조직 또는 장기 이식을 투여하는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법에서, 저면역원성 세포는 각각 a) 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된 외인성 폴리뉴클레오티드; 및 b) 외인성 CD47 폴리펩티드를 포함하며, 저면역원성 세포 집단은 조직 또는 장기 이식을 투여하기 전에 투여된다.
또 다른 측면에서, 저면역원성 세포 집단을 환자에 투여하는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법에서, 저면역원성 세포는 각각 a) 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전적 변형; b) 외인성 CD47 폴리펩티드; 및 c) MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함한다.
또 다른 측면에서, 환자에 저면역원성 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 저면역원성 세포는 각각 a) 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입된 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드; b) 외인성 CD47 폴리펩티드; 및 c) MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 외인성 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 외인성 폴리뉴클레오티드는 i) (a)에서 게놈 유전자좌와 상이한 게놈 유전자좌에 위치하거나; ii) (a)의 게놈 유전자좌와 동일한 게놈 유전자좌에 위치한다.
또 다른 측면에서, 저면역원성 세포 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법에서, 저면역원성 세포는 각각 a) 제1 게놈 유전자좌에 삽입된 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드; 및 b) 제2 게놈 유전자좌에 삽입된 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 저면역원성 세포는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내고, 제1 및 제2 게놈 유전자좌는 각각 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌이다.
한 측면에서, 환자에 저면역원성 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법에서, 저면역원성 세포는 각각 a) 제1 게놈 유전자좌에 삽입된 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드; 및 b) 제2 게놈 유전자좌에 삽입된 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 저면역원성 세포는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 나타내고, 제1 및 제2 게놈 유전자좌는 각각 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌는 동일하다. 특정 구현예에서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌는 상이하다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 각각 제3 게놈 유전자좌에 삽입된 제3 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 게놈 유전자좌는 제1 또는 제2 게놈 유전자좌와 동일하다. 일부 구현예에서, 제3 게놈 유전자좌는 제1 및/또는 제2 게놈 유전자좌와 상이하다.
일부 구현예에서, 세이프 하버 또는 표적 유전자좌는 CCR5 유전자 유전자좌, CXCR4 유전자 유전자좌, PPP1R12C(AAVS1로도 알려짐) 유전자, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자좌, CLYBL 유전자 유전자좌, ROSA26 유전자 유전자좌, CD142 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자 유전자좌, PDGFRa 유전자 유전자좌, OLIG2 유전자 유전자좌, GFAP 유전자 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, CCR5 유전자 유전자좌는 엑손 1-3, 인트론 1-2 또는 CCR5 유전자의 암호화 서열(CDS)이다. 일부 구현예에서, PPP1R12C 유전자 유전자좌는 PPP1R12C 유전자의 인트론 1 또는 인트론 2이다. 일부 구현예에서, CLYBL 유전자 유전자좌는 CLYBL 유전자의 인트론 2이다. 특정 구현예에서, ROSA26 유전자 유전자좌는 ROSA26 유전자의 인트론 1이다. 일부 구현예에서, 표적 하버 유전자좌는 SHS231 유전자좌이다. 일부 구현예에서, CD142 유전자 유전자좌는 CD142 유전자의 CDS이다. 특정 구현예에서, MICA 유전자 유전자좌는 MICA 유전자의 CDS이다. 일부 구현예에서, MICB 유전자 유전자좌는 MICB 유전자의 CDS이다. 일부 구현예에서, B2M 유전자 유전자좌는 B2M 유전자의 CDS이다. 예시적인 구현예에서, CIITA 유전자 유전자좌는 CIITA 유전자의 CDS이다. 특정 구현예에서, TRAC 유전자 유전자좌는 TRAC 유전자의 CDS이다. 일부 구현예에서, TRB 유전자 유전자좌는 TRB 유전자의 CDS이다.
특정 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포이다. 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 분화된 세포는 췌장 베타 섬세포, 아교 전구 세포, 심장 세포, 신경 세포, 내피 세포, B 세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포(예를 들어, 형질 세포 또는 혈소판), 및 상피 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 분화된 세포는 T 세포이다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 1차 T 세포로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 저면역원성 세포는 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포이다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 1차 T 세포로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화한다.
예시적인 구현예에서, 키메라 항원 수용체(CAR)는 a) 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 제1 세대 CAR; b) 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 2개의 신호전달 도메인을 포함하는 2세대 CAR, c) 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 3개의 신호전달 도메인을 포함하는 3세대 CAR; 및 d) 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 3개 또는 4개의 신호전달 도메인, 및 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 4세대 CAR로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 a) 신생물 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; b) T 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; c) 항원 결합 도메인이 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특성을 표적화하고; d) 노화 세포의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; e) 감염성 질환의 항원 특성을 표적화하는 항원 결합 도메인; 및 f) 세포의 세포 표면 항원에 결합하는 항원 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 항체, 이의 항원 결합 부분, scFv 및 Fab로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CAR은 2개의 상이한 항원에 결합하는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 CAR이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인(들)은 CD19, CD22 및 BCMA로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 결합한다. 특정 구현예에서, 이중특이적 CAR은 CD19 및 CD22에 결합한다.
일부 구현예에서, CAR의 막횡단 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD9, CD16, CD28, CD45, CD22, CD33, CD34, CD37, CD40, CD40L/CD154, CD45, CD64, CD80, CD86, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, CD154, FcεRIγ, VEGFR2, FAS, FGFR2B 및 이의 기능적 변이체의 막횡단 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 막횡단 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, CAR의 신호전달 도메인(들)은 공동자극 도메인(들)을 포함한다. 특정 구현예에서, 공동자극 도메인은 동일하지 않은 2개의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인(들)은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생성, CAR-T 세포 증식 및/또는 CAR-T 세포 지속성을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 저면역원성 세포에 대한 내인성 또는 외인성 사이토카인 유전자이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 유전자는 친염증성 사이토카인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 친염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-9, IL-12, IL-18, TNF, IFN-감마 및 이의 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인은 전사 인자 또는 기능적 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 CD3 제타(CD3ζ) 도메인 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 또는 이의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 전이유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 (i) 항-CD19 scFv; (ii) CD8α 힌지 및 막횡단 도메인 또는 이의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 공동자극 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 (iv) CD3ζ 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4) 및/또는 프로그래밍된 세포 사멸(PD1)의 감소된 발현을 포함한다. 특정 구현예에서, 저면역원성 세포는 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)의 증가된 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된다. 일부 구현예에서, 환자는 이전 임신 또는 이전 동종이계 이식으로 인해 감작된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 동종항원은 인간 백혈구 항원을 포함한다.
일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 동종항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타낸다. 특정 구현예에서, 동종이계 이식은 동종이계 세포 이식, 동종이계 수혈, 동종이계 조직 이식 및 동종이계 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 환자는 세포 집단에 대해 감소된 면역 반응을 나타내거나 면역 반응을 나타내지 않는다. 특정 구현예에서, 나타나는 세포 집단 반응에 대한 면역 반응 감소 또는 부재는 전신 면역 반응 감소 또는 부재, 적응 면역 반응 감소 또는 부재, 선천성 면역 반응 감소 또는 부재, T 세포 반응 감소 또는 부재 및 B 세포 반응 감소 또는 부재로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 환자는 a) 세포 집단의 투여 시 감소된 수준의 전신 TH1 활성화 또는 전신 TH1 활성화 부재; b) 세포 집단의 투여 시 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 감소된 수준의 면역 활성화 또는 PBMC의 면역 활성화 부재; c) 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 감소된 수준의 공여체 특이적 IgG 항체 또는 공여체 특이적 IgG 항체 부재; d) 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 감소된 수준의 IgM 및 IgG 항체 생성 또는 IgM 및 IgG 항체 생성 부재; 및/또는 e) 세포 집단의 투여 시 세포 집단의 감소된 수준의 세포독성 T 세포 사멸 또는 세포독성 T 세포 사멸 부재를 나타낸다.
일부 구현예에서, 장애는 암이거나 세포 치료법은 암의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 암은 B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 샘암종, 췌장 샘암종, 교모세포종, 신경모세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
V. 실시예
실시예 1: 이종 이식 연구에서 인간 B2M
삽입결실
/삽입결실
, CIITA
삽입결실/삽입결실
,
CD47
tg
유도된 만능 줄기 세포
세포 이식에 대한 MHC I 및 MHC II 발현 감소 및 CD47 발현 증가의 효과를 연구하기 위해 인간 B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA 삽입결실/삽입결실 , CD47tg 유도된 만능 줄기 세포(HIP 세포)를 붉은털원숭이(비인간 영장류 또는 NHP) 수신체에 이식하였다(이종 이식).
연구 설계 및 투여. 8마리 NHP(F/M, 2-3 kg, 12-36월령)를 야생형 또는 HIP 세포의 맹검 투여를 위해 무작위로 두 그룹(n = 4)으로 나누었다. IACUC-승인 프로토콜 하에 각각의 NHP에 약 107개 인간 야생형 또는 HIP 세포를 등에 4회 피하 주사했다. 인간 야생형 iPSC 및 인간 HIP iPSC의 특성을 도 14에 나타낸다. 주사 전("pre-Tx" 또는 제0일) 주사 후 제7일, 제13일, 제25일 등에 분석을 위해 혈액을 채취했다. 야생형 및 HIP 세포 모두 또한 생물발광 이미징(BLI)을 위한 반딧불이 루시퍼라제를 트랜스제닉으로 발현하였고, 세포 생존은 BLI에 의해 모니터링하였다. 연구 설계 및 결과를 도 1a-1f, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a-4c, 5a-5c, 6a-6c 및 7a-7c에 나타낸다.
T 세포 활성화, IgM 및 IgG 수준, 공여체 특이적 IgM 및 IgG의 증가를 나타낸 야생형 세포가 주사된 NHP와 대조적으로 최초 주사 후 이종 HIP 세포를 받은 NHP에서는 전신 면역 반응이 관찰되지 않았다. HIP 세포가 유사한 면역 활성화 결여 상태로 재투여될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, NHP에 최초 주사 후 제118일 내지 제123일 사이에 2차 주사와 동일한 세포 유형(야생형 또는 HIP)을 재주사했다. 전과 같이, 재주사 전("pre-Tx 또는 제0일) 및 그 후 제7일 및 제13일(각각 1차 주사 후 제125일 및 제131일)에 분석을 위해 혈액을 채취하고 세포 생존을 BLI로 모니터링했다. 놀랍게도, 이종 HIP 세포를 재주사한 동물에서는 전신 면역 반응이 관찰되지 않은 반면, 야생형 세포를 재주사한 동물은 전신 면역 활성화를 나타내었다. HIP 세포를 투여한 동물에서 전신 면역 활성화는 관찰되지 않았지만, 세포는 명백하게 국소 이종 반응뿐만 아니라 비히클(매트리겔)에 대한 반응으로 인해 최초 또는 2차 용량에서 13일 기간에 걸쳐 생존하지 못했다(BLI < 최초의 5%). 이러한 결과는 HIP 세포가 다회 용량에서 면역 인식 및 활성화를 회피할 수 있음을 표시한다.
HIP 세포가 미리 형성된 면역 반응을 회피할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 처음에 2개 용량의 야생형 세포를 투여한 4마리 NHP에 HIP 세포를 이식하고 그 반대의 경우도 마찬가지였다(교차 투여). HIP 또는 야생형 세포를 2차 주사(최초 주사 후 제241일) 후 제118일 내지 제123일 사이에 동물에 피하 주사하였다. 전과 같이, 재주사 48일 전 및 그 후 제7일 및 제13일(각각 1차 주사 후 제248일 및 제254일)에 분석을 위해 혈액을 채취하고 BLI로 세포 생존을 모니터링했다.
T 세포 활성화. 야생형 및 HIP 인간 iPSC를 투여한 동물에서의 T 세포 활성화를 Elispot 검정으로 측정했다. 단방향 Elispot 검정의 경우 3차 주사(교차 투여) 48일 전 그리고 7일 및 13일 후 수신체 PBMC를 붉은털원숭이로부터 단리했다. T 세포를 CD3 MACS-분류(Miltenyi)에 의해 PBMC로부터 정제하고 반응체 세포로 사용하였다. 공여체 세포(야생형 또는 HIP 세포)를 미토마이신 처리하고(30분 동안 50 μg/mL, Sigma)하고 자극체 세포로 사용했다. 1 x 105개 자극체 세포를 5 x 105개 수신 반응체 T 세포와 36시간 동안 인큐베이션하고 IFN-γ 스팟 빈도를 Elispot 플레이트 판독기를 사용하여 열거했다. 이전에 HIP 세포를 2회 주사한 후 야생형 세포를 투여한 동물의 경우, 관찰된 Elispot 활성은 교차 주사 후 제7일에 가장 높았다(도 1a-1f). 이러한 결과는 HIP 세포의 이전 주사에 의한 면역 억제 없이, 야생형 세포 주사 후 전신 TH1 활성화 및 급성 세포성 면역 반응을 표시한다. 대조적으로, 이전에 야생형 세포를 2회 주사한 후 HIP 세포를 주사한(교차 주사) 동물은 제0일에 나이브 TH1 세포에 필적하는 Elispot 활성을 가져서, 야생형 이종 세포에 대한 미리 형성된 면역 반응을 갖는 동물에서도 변형된 세포에 대한 전신 TH1 활성화 또는 세포성 면역 반응의 부재를 표시하였다(도 1a-1f).
공여체 특이적 항체 활성. 야생형 및 HIP 세포로의 교차 주사에서 동물에 의한 공여체 특이적 항체의 생성도 검정하였다. 수신체 원숭이의 혈청을 30분 동안 56℃에서 가열하여 보체-제거했다. 동량의 혈청 및 야생형 또는 HIP 세포 현탁액(5×106개 세포/mL)을 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FITC-접합 염소 항-IgM(BD Bioscience) 또는 항-IgG로 표지하고 유세포 측정기(BD Bioscience)로 분석했다.
이전에 HIP 세포를 투여한 동물에 야생형 세포를 교차 주사한 후 제7일 및 제13일에 주사 전 수준 초과의 공여체 특이적 반응성의 증가가 관찰되었으며, IgM은 이소형 전환과 일치하게 제7일부터 제13일까지 감소하였다(데이터는 나타내지 않음). 대조적으로, 이전에 야생형 세포의 2회 주사를 받은, HIP 세포를 투여한 동물에서는 공여체 특이적 IgM 결합이 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 이전에 HIP 세포를 투여한 동물에 야생형 세포를 교차 주사한 후 제13일에 공여체 특이적 반응성의 증가가 관찰되었으며, IgG는 이소형 전환과 일치하게 제7일부터 제13일까지 증가한 다음 제13일부터 제75일까지 감소하였다(도 3a-3b). 대조적으로, 이전에 제7일, 제13일 및 제75일에 야생형 세포의 2회 주사를 받은(도 2a 및 2b), HIP 세포를 투여한 동물에서는 공여체 특이적 IgG 결합이 관찰되지 않았다.
대량 항체 생성. 야생형 또는 HIP 세포의 교차 주사를 받은 동물의 총 항체 생성을 또한 IgM 및 IgG ELISA 키트(Abcam)를 사용하여 검정했다. 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거한 후 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)와 접합된 항-IgM 또는 항-IgG 항체를 첨가한다. 이러한 효소-표지 항체는 이전에 결합된 IgM 또는 IgG와 복합체를 형성한다. 면역흡착제에 결합된 효소는 발색 기질인 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘(TMB)을 첨가하여 검정한다. HIP 세포의 2회 투여 후 야생형 세포를 교차 투여한 동물에서 총 IgM 및 IgG의 급격한 증가가 관찰되었으며, 최대 IgM 생성은 제7일에 관찰되었고 최대 IgG 생성은 제13일에 관찰되어 이소형 전환을 표시하였다(도 4a-4c 및 6a-6c).
놀랍게도, 야생형 세포의 2회 주사 후 HIP 세포를 교차 투여한 동물에서는 어느 시점에서도 총 IgM 또는 IgG의 증가가 관찰되지 않았다(도 5a-5c 및 7a-7c).
일부 IgG는 HIP 주사 전에 관찰되었으며, 이전 야생형 투여로부터의 잔류 생성일 가능성이 있다(도 7a-5c). 종합하면, 이러한 결과는 HIP 세포에 대한 체액성 면역 반응의 거의 완전한 결여를 표시한다.
NK 세포 사멸. NK 세포에 의한 전신 선천성 면역성을 또한 야생형 또는 HIP 세포를 교차 주사한 동물에서 검정하였다. NK 세포 사멸 검정은 XCELLIGENCE MP 플랫폼(ACEA BioSciences)에서 수행하였다. 96-웰 E-플레이트(ACEA BioSciences)를 콜라겐(Sigma-Aldrich)으로 코팅하고 4×105개 야생형 또는 HIP 세포를 100 μl 세포 특이적 배지에 플레이팅하였다. 세포 지수 값이 0.7에 도달한 후, 처리한 동물로부터 단리한 붉은털원숭이 NK 세포를 1 ng/ml 붉은털원숭이 IL-2(MyBiosource, San Diego, CA)를 포함하고 또는 포함하지 않고 1:1의 E:T 비로 첨가하였다. 사멸 대조군으로서 세포를 2% TRITON X100으로 처리하였다. 야생형 또는 HIP 세포에서 자극되거나 자극되지 않은 NK 세포에 의한 사멸은 관찰되지 않아, HIP 세포에서의 CD47 발현이 HLA I 및 HLA II의 부재 하에 NK 세포 및 대식세포로부터 보호하는 데 효과적임을 표시하였다(Deuse et al., 2019, Nat. Biotechnol., 37:252-258 참고). 도 8a-8c에 나타낸 바와 같이, HIP 세포의 제1 용량을 야생형 NHP에 투여한 후에도(도 8c), HIP 세포의 재용량을 야생형 NHP에 투여한 후에도(도 8c) NK 세포 사멸은 관찰되지 않았다. HIP 세포에 대한 HLA I/HLA II(예를 들어, MHC 편집)에도 불구하고 기존 면역성을 갖는 야생형 NHP에 HIP 세포를 교차 주사한 후에도 NK 세포 사멸의 결여가 관찰되었다(도 8d 및 8e).
이식된 세포의 생존. 인간 HIP 세포를 교차 투여한 동물의 경우 전신 면역 반응이 관찰되지 않았지만, 세포는 아마도 국소 이종 반응으로 인해 생존하지 못했다. 이전 야생형 및 HIP 주사의 경우, 동물에서 제거한 세포 플러그에 대해 수행한 조직병리학 분석은 호중구 침윤 또는 피브린(호중구가 해당 영역에 있었다는 지표)뿐만 아니라 비히클에 대한 이물 반응 및 과민성 반응 IV형의 징후를 나타내어, 각각 인간 세포에 대한 이종 반응 및 비히클에 대한 알레르기 반응을 표시하였다. 비히클에 대한 알레르기 및 이물 반응은 비히클(세포 없음)만 주사한 추가 대조군 원숭이에 의해 확인되었으며, 이는 유사한 조직병리학적 특징을 실증하였다.
이 실시예는 HIP 세포가 새로운 전신 면역 반응을 촉발하지 않고 기존 전신 동종이계 면역 반응을 가진 대상체에 투여될 수 있음을 실증한다.
실시예 2: 동종이계 이식 교차 연구에서 인간 B2M
삽입결실
/삽입결실
, CIITA
삽입결실/삽입결실
,
CD47
tg
유도된 만능 줄기 세포(iPSC) 및 야생형 IPSC
이 실시예는 인간 B2M 삽입결실 /삽입결실 , CIITA 삽입결실/삽입결실 , CD47tg 유도된 만능 줄기 세포(HIP iPSC) 및 야생형 iPSC의 붉은털원숭이(비인간 영장류 또는 NHP) 수신체에 대한 이식의 효과를 비교하는 동종이계 이식 교차 연구를 설명한다. 한 세트의 교차 연구에서, 야생형 iPSC를 수용 동물의 등에 피하(s.c,) 이식하고, 약 6주 후 HIP iPSC를 이웃 위치에 s.c. 이식했다. 교차 연구의 두 번째 세트에서 HIP iPSC를 수신체 동물의 등에 s.c. 이식하고 약 6주 후 야생형 iPSC를 이웃 위치에 s.c. 이식했다. 생착된 세포 및 이의 자손의 존재를 모니터링하였다.
데이터는 HIP iPSC가 감작된 NHP 수신체(야생형 iPSC로 최초 이식된 NHP 수신체)의 면역계에 의해 감지되지 않으므로 면역 거부를 피한다는 것을 나타낸다. 생착된 HIP iPSC는 수신체가 기능적 면역계를 보유함에도 불구하고 수신체 면역 반응을 회피했다. 또한 HIP iPSC가 최초 이식된 NHP 수신체는 이후에 이식된 야생형 iPSC에 대한 면역 반응을 가졌다.
A. 방법
붉은털원숭이 CD47을 과발현하는 인간 iPSC의 유전자 편집. 인간 iPSC B2M 삽입결실 /삽입결실, CIITA 삽입결실 / 붉은털원숭이 CD47tg 세포(HIP iPSC 또는 HIP 세포로도 지칭됨)를 당업자가 인식하는 표준 인간 iPSC 세포 배양 방법을 사용하여 배양했다. 붉은털원숭이 야생형 iPSC 및 붉은털원숭이 HIP iPSC의 특성을 도 15에 나타낸다.
붉은털원숭이 iPSC 세포 배양. 붉은털원숭이 iPSC를 당업자가 인식하는 표준 붉은털원숭이 iPSC 세포 배양 방법을 사용하여 배양하였다.
hIPSC의 루시퍼라제 형질도입. hiPSC(즉, HIP iPSC 및 야생형 iPSC)를 구성적 활성 프로모터(즉, CAG 프로모터)에 의한 발현 제어 하에 루시퍼라제 II 유전자를 발현하는 렌티바이러스 입자로 감염시켰다. 감염된 세포에 의한 루시퍼라제 발현을 표준, 상업적으로 이용 가능한 루시퍼라제 검정을 사용하여 확인했다.
비인간 영장류로의 이식을 위한 iPSC 제조. iPSC를 친-생존 칵테일(즉, 카스파제 억제제, BcL-xL, IGF-1, 피나시딜 및 사이클로스포린 A를 포함하는 칵테일)을 포함하는 표준 배양 배지에 재현탁하였다. 주사를 위해 세포를 주사기에 로딩하였다.
붉은털원숭이의 근육내 iPSC 주사. 바람직하게는 세포 임플란트를 받는 다리에서가 아닌 속효성 마취제(즉, 틸레타민 및 졸라제판의 조합)의 근육내(IM) 주사로 동물을 진정시켰다. 일단 마취되면 동물의 양 다리를 카테터 및 세포 이식 부위에서 면도했다. 대퇴 정맥으로부터의 경피적 정맥천자를 통해 혈액 샘플을 채취했다. 카테터를 복재 정맥(바람직하게는 세포 임플란트를 받는 다리에서가 아님)에 배치하였다. 세포 임플란트 영역, 즉 허벅지 또는 대퇴사두근의 전방 표면을 클로르헥시딘 글루코네이트/에탄올 스크럽을 번갈아 사용하여 외과적으로 스크러빙하고 궁극적으로 클로르헥시딘 글루코네이트로 마무리했다.
동물의 대퇴사두근의 앞쪽 중간 위 피부를 통해 절개했다. 대퇴사두근을 핀칭에 의해 단리하고 iPSC를 주사된 세포가 패턴 내의 복수의 위치에 주사되도록 스타버스트 패턴으로 주사하였다. 절개를 봉합사로 봉합하고 주사 영역을 향후 참조를 위해 표시했다.
루시페린 주입을 위해 사전 배치된 정맥내 카테터를 통해 수신체 동물에 루시페린을 주사했다. 심박수와 같은 동물의 활력 징후가 정상으로 돌아오면 주사 영역을 생물발광 이미징(BLI)에 의해 이미지화했다. 세포 생존을 BLI에 의해 모니터링하였다. 정량적 생물발광 이미징 ata를 시간 경과에 따른 BLI 이미지 및 BLI 신호로 표시한다.
B. HIP iPSC의 이식
도 9a에 나타낸 바와 같이, 동종이계 HIP 붉은털원숭이 iPSC를 붉은털원숭이 수신체의 왼쪽 다리에 이식하였다. 이러한 HIP 세포는 수신체에서 면역 반응을 유도하지 못했다. 생착된 세포는 이식 후 적어도 6주 동안 주사 부위에서 검출되었다. 도 9b는 이식 6주 후 HIP iPSC가 생착된 왼쪽 다리의 면역조직화학 염색을 나타낸다. 도 9b는 혈관을 나타내는 평활근 액틴(SMA) 및 이식된 HIP iPSC를 나타내는 루시퍼라제의 염색을 나타낸다.
또한, 도 13c는 동종이계 붉은털원숭이 수신체의 왼쪽 다리에서 이식된 동종이계 HIP 붉은털원숭이 iPSC의 존재를 모니터링하기 위한 유사한 연구의 BLI 이미지를 나타낸다. 이식된 세포 및 이의 자손은 최초 이식 후 적어도 9주 동안 주사 부위에서 확인되었다. HIP iPSC는 세포가 이식 후 적어도 9주 동안 지속되었기 때문에 붉은털원숭이 수신체에서 유의한 면역 반응을 유도하지 못했다.
C. 교차 연구: 동일한 NHP에서 야생형 iPSC에 이어 HIP iPSC 투여
HIP iPSC에 대한 야생형 iPSC의 교차 연구에서 동종이계 붉은털원숭이 야생형 iPSC를 붉은털원숭이 수신체의 왼쪽 다리에 이식했다. 이식된 붉은털원숭이 야생형 iPSC 집단은 이식 후 7일까지 실질적으로 감소했다(100%에서 6.8%로; 도 10). 이식 2주 후 이식된 집단의 10%만 검출되었고 이식 3주 후 집단의 1.4%만 남아있었다. 이식 4주 및 5주 후 주사 부위에서는 이식된 세포가 확인되지 않았다. 이와 같이 붉은털원숭이 수신체는 감작된 것으로 나타났다. 연구의 교차 아암에서, 최초 야생형 iPSC 이식 5주 후(제0일(d0) 교차로도 지칭됨) 감작된 붉은털원숭이 수신체의 오른쪽 다리에 동종이계 HIP 붉은털원숭이 iPSC를 주사했다.
교차 이식 제0일에, 이식된 동종이계 HIP 붉은털원숭이 iPSC가 주사 부위에서 검출 가능하였다(도 10, 하단 행). 교차 이식 제7일(d7)에 이식된 HIP iPSC의 69.2%가 검출되었다. 또한 교차이식 2주 후, 48.1%의 세포가 남아있었다. 이와 같이, 수신체 동물은 연구의 초기 아암에서 야생형 iPSC에 대한 면역 반응을 유도하였고, HIP iPSC는 교차 아암에서 감작된 수신체 동물에서 지속되었다.
도 11은 HIP iPSC에 대한 야생형 iPSC의 또 다른 교차 연구 결과를 나타낸다. 이식된 붉은털원숭이 야생형 iPSC는 나이브 수신체에서 면역 반응을 유도하였다. 구체적으로, 이식된 야생형 iPSC의 10.2%만 이식 후 d7에 검출되었다. 붉은털원숭이 야생형 iPSC의 최초 이식 5주 후(교차 이식의 d0으로도 지칭됨) HIP 붉은털원숭이 iPSC를 이제 감작된 붉은털원숭이 수신체의 오른쪽 다리에 이식했다. 이식된 HIP iPSC가 주사 부위에서 검출되었다(도 11, 하단 행). 교차 이식 7일 후 이식된 세포 및 이의 자손의 28.8%가 주사 부위에 위치하였다. 교차 이식 3주 후 검출된 집단은 이식된 HIP iPSC의 약 32.9%였다.
D. 교차 연구: 동일한 NHP에서 HIP iPSC에 이어 야생형 iPSC 투여
야생형 iPSC에 대한 HIP iPSC의 교차 연구에서, 동종이계 HIP iPSC를 붉은털원숭이 수신체의 왼쪽 다리에 이식했다(도 12). 이식된 HIP iPSC 및 이의 자손은 이식 후 적어도 9주 동안 주사 부위에서 검출 가능했다. 이식 5주 후 최초 이식된 HIP iPSC 집단 및 이의 자손의 약 112%가 존재하였고, 7주차에는 HIP iPSC 및 이의 자손의 202.4%가 존재했다. 8주차 및 9주차에 각각 154.8% 및 178.6%의 HIP iPSC 및 이의 자손이 존재했다. HIP iPSC는 최초 이식 후 적어도 9주 동안 수신체에게서 확인되었다.
HIP iPSC의 최초 이식 6주 후(교차 이식 제0일로도 지칭됨), 동종이계 붉은털원숭이 야생형 iPSC를 붉은털원숭이 수신체의 오른쪽 다리에 이식했다. 이식된 야생형 iPSC는 주사 부위에서 검출되었다(도 12, 하단 행). 교차 이식 7일 후, 이식된 세포 및 이의 자손 중 어느 것도 주사 부위에 위치하지 않았다. 루시퍼라제 신호는 검출되지 않았다. 대조적으로, HIP iPSC의 최초 이식 7주 후, 최초 이식된 HIP iPSC 집단 및 이의 자손의 약 202.4%가 붉은털원숭이 수신체의 왼쪽 다리에 존재하였다.
상술한 일련의 교차 연구 결과는 HIP iPSC가 감작된 NHP 수신체(야생형 iPSC가 최초 이식된 NHP 수신체)의 면역계로부터 숨을 수 있으므로 HIP iPSC가 면역 거부를 피할 수 있음을 나타낸다. 또한 HIP iPSC가 최초 이식된 수신체는 이후 이식된 야생형 iPSC에 대한 면역 반응을 생성했다. 예를 들어, 도 13a 및 13b를 참고한다. 생착된 HIP iPSC는 수신체가 기능적 면역계를 보유함에도 불구하고 면역 반응을 회피했다.
실시예 3: 세이프 하버 부위를 사용한 인간 B2M
삽입결실/삽입결실
,
CIITA
삽입결실/삽입결실
,
CD47
tg
에서 유도된 만능 줄기 세포(IPSC)에서의 외인성 CD47의 발현
이 실시예는 B2M 삽입결실 /삽입결실 , CIITA 삽입결실/삽입결실 , CD47tg 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)에서 외인성 CD47 발현의 발현 특성을 규명하기 위한 연구를 설명하며, 외인성 CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 iPSC에서 세이프 하버 부위에 삽입하였다.
B2M 삽입결실 /삽입결실 , CIITA 삽입결실/삽입결실 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)를 표준 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 사용하여 생성하였다. CAG 또는 EF1α 프로모터에 의해 유도되고 3개의 세이프 하버 부위(AAVS1, CLYBL 또는 CCR5)에 대한 1 kb 상동 아암이 측면에 있는 발현 카세트에서 인간 CD47을 암호화하는 HDR 공여체 플라스미드를 B2M 삽입결실 /삽입결실 , CIITA 삽입결실/삽입결실 iPSC에 도입하였다.
세이프 하버 부위에서 CD47의 표적 통합은 상동성 유도 복구를 매개하는 표준 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 사용하여 달성하였다. 하기 대량 편집 라인을 생성하였다.
대량 편집 라인에서 단일 세포 클로닝을 수행했다. 카피 수 및 플라스미드 삽입에 대해 클론을 평가하고, 표준 기술을 사용하여 세이프 하버 부위로의 통합의 정확한 위치를 확인하기 위해 PCR 유전형 분석을 수행했다. 게놈 평가를 통과한 클론을 증식시키고 클론 선택 검정을 수행하여 각각의 세이프 하버 부위에 대해 2개 또는 3개의 클론으로 범위를 좁혔다. B2M 삽입결실 /삽입결실 , CIITA 삽입결실/삽입결실 , CD47tg 클론에서 CD47 발현의 평가는 유세포 측정을 사용하여 수행하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, CD47 전이유전자가 3개의 하버 부위 각각에 삽입된 B2M 삽입결실 /삽입결실 , CIITA 삽입결실/삽입결실 , CD47tg는 내인성 수준에 비해 약 30-200배 향상된 CD47 발현을 나타냈다. CD47은 또한 iPSC의 여러 세이프 하버 부위에서 CAG 프로모터에 의해 안정적으로 발현되는 것으로 관찰되었다(도 17 및 18 참고). 전신 선천성 면역성으로부터의 B2M 삽입결실 /삽입결실 , CIITA 삽입결실/삽입결실 , CD47tg iPSC의 보호를 상술된 방법을 사용하여 추가로 평가했다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 세이프 하버 부위에 삽입된 CD47 전이유전자를 포함하는 B2M 삽입결실 /삽입결실 , CIITA 삽입결실/삽입결실 , CD47tg iPSC는 NK 세포 및 대식세포 사멸로부터 보호하기에 충분한 수준으로 CD47을 안정적으로 발현했다.
모든 제목 및 섹션 지정은 명확성과 참조 목적으로만 사용되며 어떤 식으로든 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 당업자는 본 명세서에 설명된 기술의 사상 및 범위에 따라 적절하게 상이한 제목 및 섹션으로부터 다양한 측면을 조합하는 유용성을 이해할 것이다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 전체가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 이의 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
당업자에게 명백할 바와 같이, 그 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 출원의 많은 변형 및 변경이 이루어질 수 있다. 본원에 설명된 특정 구현예 및 실시예는 단지 예로서 제공되며, 본 출원은 청구범위가 부여하는 전체 균등부의 범위와 더불어 첨부된 청구범위의 용어에 의해서만 제한된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Sana Biotechnology, Inc.
<120> METHODS OF TREATING SENSITIZED PATIENTS WITH HYPOIMMUNOGENIC
CELLS, AND ASSOCIATED METHODS AND COMPOSITIONS
<130> 122864-01-5044
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic guide sequence for CIITA
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<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, or u
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guuuuagagc ua 12
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000
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<222> (1)..(20)
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic human CD47 polypeptide
<400> 12
Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn
1 5 10 15
Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn
20 25 30
Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr
35 40 45
Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser
50 55 60
Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys
100 105 110
Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu Ile Val
115 120 125
Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe Gly Ile
130 135 140
Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr Ile Ala
145 150 155 160
Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val Gly Ala
165 170 175
Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr Gly Leu
180 185 190
Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His Tyr Tyr
195 200 205
Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala Ile Leu
210 215 220
Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu Ser Leu
225 230 235 240
Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly
245 250 255
Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys
260 265 270
Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys Ala Val
275 280 285
Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met Asn Asp
290 295 300
Glu
305
<210> 13
<211> 323
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic human CD47 polypeptide with signal sequence
<400> 13
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
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165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic Whitlow linker
<400> 14
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
Claims (311)
- 저면역원성 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서, 저면역원성 세포가 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및
(I) 다음:
a. 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
b. MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
c. 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는
d. B2M 및 CIITA의 감소된 발현;
중 하나 이상을 포함하고, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이고;
(II) 환자가 감작된 환자이고, 환자는
i. 하나 이상의 동종항원에 대해 감작되고/되거나;
ii. 하나 이상의 자가 항원에 대해 감작되고/되거나;
iii. 이전 이식으로 인해 감작되고/되거나;
iv. 이전 임신으로 인해 감작되고/되거나;
v. 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았고/받았거나;
vi. 조직 또는 장기 이식 환자이고, 저면역원성 세포는 조직 또는 장기 이식을 투여하기 전에, 동시에 및/또는 후에 투여되는 방법. - 췌장 섬세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서, 췌장 섬세포가 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및
(I) 다음:
a. 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
b. MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
c. 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는
d. B2M 및 CIITA의 감소된 발현;
중 하나 이상을 포함하고, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며;
(II) 여기서
a. 환자가 감작된 환자가 아니거나,
b. 환자가 감작된 환자이고, 환자는:
i. 하나 이상의 동종항원에 대해 감작되고/되거나;
ii. 하나 이상의 자가 항원에 대해 감작되고/되거나;
iii. 이전 이식으로 인해 감작되고/되거나;
iv. 이전 임신으로 인해 감작되고/되거나;
v. 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았고/받았거나;
vi. 조직 또는 장기 환자이고, 췌장 섬세포는 조직 또는 장기 이식을 투여하기 전에 투여되는 방법. - 심장 전구 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서, 심장 전구 세포가 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및
(I) 다음:
a. 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
b. MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
c. 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는
d. B2M 및 CIITA의 감소된 발현;
중 하나 이상을 포함하고, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며;
(II) 여기서
a. 환자가 감작된 환자가 아니거나;
b. 환자가 감작된 환자이고, 환자는:
i. 하나 이상의 동종항원에 대해 감작되고/되거나;
ii. 하나 이상의 자가 항원에 대해 감작되고/되거나;
iii. 이전 이식으로 인해 감작되고/되거나;
iv. 이전 임신으로 인해 감작되고/되거나;
v. 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았고/받았거나;
vi. 조직 또는 장기 환자이고 심장 근육 세포는 조직 또는 장기 이식을 투여하기 전에 투여되는 방법. - 아교 전구 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서, 아교 전구 세포가 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및
(I) 다음:
a. 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
b. MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
c. 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는
d. B2M 및 CIITA의 감소된 발현;
중 하나 이상을 포함하고, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며;
(II) 여기서
a. 환자가 감작된 환자가 아니거나;
b. 환자가 감작된 환자이고, 환자는:
i. 하나 이상의 동종항원에 대해 감작되고/되거나;
ii. 하나 이상의 자가 항원에 대해 감작되고/되거나;
iii. 이전 이식으로 인해 감작되고/되거나;
iv. 이전 임신으로 인해 감작되고/되거나;
v. 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았고/받았거나;
vi. 조직 또는 장기 환자이고, 아교 전구 세포는 조직 또는 장기 이식을 투여하기 전에 투여되는 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 감작된 환자이고, 환자가 하나 이상의 동종항원 또는 하나 이상의 자가 항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타내는, 방법.
- 제5항에 있어서, 하나 이상의 동종항원이 인간 백혈구 항원을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 이전 이식으로 인해 감작된 감작 환자이고,
a. 이전 이식은 세포 이식, 수혈, 조직 이식 및 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택되며, 임의로 이전 이식은 동종이계 이식이거나;
b. 이전 이식은 인간 기원의 키메라, 변형된 비인간 자가 세포, 변형된 자가 세포, 자가 조직 및 자가 장기로 구성된 군으로부터 선택된 이식이고, 임의로 이전 이식은 자가 이식인 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 이전 임신으로 인해 감작된 감작 환자이고, 환자가 이전에 임신 중 동종면역화를 나타냈으며, 임의로 임신 중 동종면역화는 태아 및 신생아의 용혈성 질환(HDFN), 신생아 동종면역 호중구감소증(NAN) 또는 태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증(FNAIT)인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 병태 또는 질환에 대한 이전 치료로 인해 감작된 감작 환자이고, 병태 또는 질환은 환자가 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라 치료받고 있는 질환 또는 병태와 상이하거나 동일한, 방법.
- 제1항 내지 제6항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았고, 이전 치료가 세포 집단을 포함하지 않았으며,
a. 세포 집단이 이전 치료와 동일한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여되고/되거나;
b. 세포 집단이 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 향상된 치료 효과를 나타내고/내거나;
c. 세포 집단이 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 더 긴 치료 효과를 나타내고/내거나;
d. 이전 치료가 치료적으로 효과적이었고/이었거나;
e. 이전 치료는 치료적으로 비효과적이었고/이었거나;
f. 환자가 이전 치료에 대해 면역 반응을 일으켰고/켰거나;
g. 세포 집단이 이전 치료와 다른 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여되는 방법. - 제10항에 있어서, 이전 치료가 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템을 포함하는 치료 세포 집단을 투여하는 것을 포함하고, 면역 반응이 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템의 활성화에 반응하여 발생하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 이전 치료가 기계 보조 치료를 포함하고, 임의로 기계 보조 치료가 혈액투석 또는 심실 보조 장치를 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 이전 치료가 동종이계 CAR-T 세포 기반 치료법 또는 자가 CAR-T 세포 기반 치료법을 포함하고, 자가 CAR-T 세포 기반 치료법이 브렉수카브타진 오토루셀, 악시카브타진 실로루셀, 이데카브타진 비클루셀, 리소카브타진 마라루셀, 티사겐렉루셀, Cartesian Therapeutics의 Descartes-08 또는 Descartes-11, Novartis의 CTL110, Poseida Therapeutics의 P-BMCA-101, Autolus Limited의 AUTO4, Cellectis의 UCARTCS, Precision Biosciences의 PBCAR19B 또는 PBCAR269A, Fate Therapeutics의 FT819 및 Clyad Oncology의 CYAD-211로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 알레르기를 갖고, 임의로 알레르기가 건초열, 식품 알레르기, 곤충 알레르기, 약물 알레르기 및 아토피성 피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 알레르기인, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 DUX4, CD24, CD46, CD55, CD59, CD200, PD-L1, HLA-E, HLA-G, IDO1, FasL, IL-35, IL-39, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpin B9, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD142의 감소된 발현 수준을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD46의 감소된 발현 수준을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD59의 감소된 발현 수준을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 줄기 세포로부터 분화되는, 방법.
- 제18항에 있어서, 줄기 세포가 중간엽 줄기 세포인, 방법.
- 제18항에 있어서, 줄기 세포가 배아 줄기 세포인, 방법.
- 제18항에 있어서, 줄기 세포가 만능 줄기 세포이고, 임의로 만능 줄기 세포가 유도된 만능 줄기 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 심장 세포, 심장 전구 세포, 신경 세포, 아교 전구 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포, NK 세포 및 CAR-NK 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 세포로부터 유래되는, 방법.
- 제23항에 있어서, 1차 세포가 1차 T 세포, 1차 베타 세포 또는 1차 망막 색소 상피 세포인, 방법.
- 제24항에 있어서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포가 환자와 상이한 하나 이상의 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 T 세포 풀로부터 유래되는, 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제26항에 있어서, CAR의 항원 결합 도메인이 CD19, CD22 또는 BCMA에 결합하는, 방법.
- 제27항에 있어서, CAR는 세포가 CD19 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR인, 방법.
- 제27항에 있어서, CAR는 세포가 CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD22-특이적 CAR인, 방법.
- 제27항에 있어서, 세포는 세포가 CD19/CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR을 포함하는, 방법.
- 제30항에 있어서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR이 단일 바이시스트론 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는, 방법.
- 제30항에 있어서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR이 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는, 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입되는, 방법.
- 제33항에 있어서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌가 동일한, 방법.
- 제33항에 있어서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌가 상이한, 방법.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 각각 제3 게놈 유전자좌에 삽입된 제3 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 방법.
- 제36항에 있어서, 제3 게놈 유전자좌가 제1 또는 제2 게놈 유전자좌와 동일한, 방법.
- 제36항에 있어서, 제3 게놈 유전자좌가 제1 및/또는 제2 게놈 유전자좌와 상이한, 방법.
- 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 세이프 하버 유전자좌가 CCR5 유전자 유전자좌, PPP1R12C(AAVS1로도 알려짐) 유전자, ROSA26 유전자 유전자좌 및 CLYBL 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자좌가 CXCR4 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자좌, CD142 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제39항에 있어서, CCR5 유전자 유전자좌로의 삽입이 CCR5 유전자의 엑손 1-3, 인트론 1-2 또는 또 다른 코딩 서열(CDS)에 있는, 방법.
- 제39항에 있어서, PPP1R12C 유전자 유전자좌로의 삽입이 PPP1R12C 유전자의 인트론 1 또는 인트론 2인, 방법.
- 제39항에 있어서, CLYBL 유전자 유전자좌로의 삽입이 CLYBL 유전자의 인트론 2인, 방법.
- 제40항에 있어서, ROSA26 유전자 유전자좌로의 삽입이 ROSA26 유전자의 인트론 1인, 방법.
- 제40항에 있어서, 세이프 하버 유전자좌로의 삽입이 SHS231 유전자좌인, 방법.
- 제40항에 있어서, CD142 유전자 유전자좌로의 삽입이 CD142 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있는, 방법.
- 제40항에 있어서, MICA 유전자 유전자좌로의 삽입이 MICA 유전자의 CDS에 있는, 방법.
- 제40항에 있어서, MICB 유전자 유전자좌로의 삽입이 MICB 유전자의 CDS에 있는, 방법.
- 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, B2M 유전자 유전자좌로의 삽입이 B2M 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있는, 방법.
- 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, CIITA 유전자 유전자좌로의 삽입이 CIITA 유전자의 엑손 3 또는 또 다른 CDS에 있는, 방법.
- 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, TRAC 유전자 유전자좌로의 삽입이 TRAC 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있는, 방법.
- 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, TRB 유전자 유전자좌로의 삽입이 TRB 유전자의 CDS에 있는, 방법.
- 제24항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포가
a. 내인성 T 세포 수용체;
b. 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4);
c. 프로그램된 세포 사멸(PD1); 및
d. 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)
중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하며, 감소된 발현이 변형에 기인하고 감소된 발현이 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적인, 방법. - 제53항에 있어서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포가 TRAC의 감소된 발현을 포함하는, 방법.
- 제22항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 다음 중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포인, 방법:
a. 내인성 T 세포 수용체;
b. 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4);
c. 프로그래밍된 세포 사멸(PD1); 및
d. 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1). - 제55항에 있어서, 세포가 TRAC 및 TRB의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 방법.
- 제57항에 있어서, 프로모터가 CAG 및/또는 EF1a 프로모터인, 방법.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1일 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1일 이상 후에 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1주 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1주 이상 후에 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1개월 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1개월 이상 후에 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 세포 집단의 투여 시 면역 반응을 나타내지 않는, 방법.
- 제62항에 있어서, 세포 집단의 투여 시 면역 반응 부재가 전신 면역 반응 부재, 적응 면역 반응 부재, 선천성 면역 반응 부재, T 세포 반응 부재, B 세포 반응 부재, 및 전신 급성 세포성 면역 반응 부재로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제63항에 있어서, 환자가 다음 중 하나 이상을 나타내는, 방법:
a. 세포 집단의 투여 시 전신 TH1 활성화 부재;
b. 세포 집단의 투여 시 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 면역 활성화 부재;
c. 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 공여체 특이적 IgG 항체 부재;
d. 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 IgM 및 IgG 항체 생성 부재; 및
e. 세포 집단의 투여 시 세포 집단의 세포독성 T 세포 사멸 부재. - 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 세포 집단의 투여의 적어도 3일 이상 전 또는 후에 면역억제제가 투여되지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 포함하는 투약 요법을 포함하는 방법:
a. 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 1차 투여;
b. 회복 기간; 및
c. 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 2차 투여. - 제66항에 있어서, 회복 기간이 적어도 1개월 이상을 포함하는, 방법.
- 제66항에 있어서, 회복 기간이 적어도 2개월 이상을 포함하는, 방법.
- 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시되고, 임의로 세포가 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템으로 인한 제거로 인해 더 이상 검출 불가능한, 방법.
- 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 세포가 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템에 의해 제거되고, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시되는, 방법.
- 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2회 투약 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 심장, 폐, 신장, 간, 췌장, 장, 위, 각막, 골수, 혈관, 심장 판막, 뇌, 척수 및 뼈로 구성된 군으로부터 선택된 조직 또는 장기에서 세포 결핍의 치료를 위해 또는 병태 또는 질환의 치료를 위한 세포 치료법으로서 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
a. 세포 결핍이 신경퇴행성 질환과 관련되거나 세포 치료법이 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 것이거나;
b. 세포 결핍이 간 질환과 관련되거나 세포 치료법이 간 질환의 치료를 위한 것이거나;
c. 세포 결핍이 각막 질환과 관련되거나 세포 치료법이 각막 질환의 치료를 위한 것이거나;
d. 세포 결핍이 심혈관 병태 또는 질환과 관련되거나 세포 치료법이 심혈관 병태 또는 질환의 치료를 위한 것이거나;
e. 세포 결핍이 당뇨병과 관련되거나 세포 치료법이 당뇨병의 치료를 위한 것이거나;
f. 세포 결핍이 혈관 병태 또는 질환과 관련되거나 세포 치료법이 혈관 병태 또는 질환의 치료를 위한 것이거나;
g. 세포 결핍이 자가면역 갑상샘염과 관련되거나 세포 치료법이 자가면역 갑상샘염의 치료를 위한 것이거나;
h. 세포 결핍이 신장 질환과 관련되거나 세포 치료법이 신장 질환의 치료를 위한 것인 방법. - 제73항에 있어서,
a. 신경퇴행성 질환이 백질이영양증, 헌팅턴병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 횡단 척수염 및 펠리제우스-메르츠바허병(PMD)으로 구성된 군으로부터 선택되거나;
b. 간 질환이 간 경변증을 포함하거나;
c. 각막 질환이 푹스 이영양증 또는 선천성 유전 내피 이영양증이거나;
d. 심혈관 질환이 심근 경색 또는 울혈성 심부전인 방법. - 제73항 또는 제74항에 있어서, 세포 집단이 다음을 포함하는, 방법:
a. 아교 전구 세포, 희소돌기아교세포, 성상세포 및 도파민성 뉴런으로 구성된 군으로부터 선택된 세포로서, 임의로 도파민성 뉴런은 신경 줄기 세포, 신경 전구 세포, 미성숙 도파민성 뉴런 및 성숙 도파민성 뉴런으로 구성된 군으로부터 선택된 세포;
b. 간세포 또는 간 전구 세포;
c. 각막 내피 전구 세포 또는 각막 내피 세포;
d. 심근세포 또는 심장 전구 세포;
e. 췌장 베타 섬세포를 포함하는 췌장 섬세포로서, 임의로 췌장 섬세포는 췌장 섬 전구 세포, 미성숙 췌장 섬세포 및 성숙 췌장 섬세포로 구성된 군으로부터 선택된 세포;
f. 내피 세포;
g. 갑상샘 전구 세포; 또는
h. 신장 전구체 세포 또는 신장 세포. - 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 암의 치료를 위해 투여되는, 방법.
- 제76항에 있어서, 암이 B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 샘암종, 췌장 샘암종, 교모세포종, 신경모세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 조직 또는 장기 이식을 받고 있고, 임의로 조직 또는 장기 이식 또는 부분 장기 이식이 심장 이식, 폐 이식, 신장 이식, 간 이식, 췌장 이식, 장 이식, 위 이식, 각막 이식, 골수 이식, 혈관 이식, 심장 판막 이식, 뼈 이식, 부분 폐 이식, 부분 신장이식, 부분 간 이식, 부분 췌장 이식, 부분 장 이식 및 부분 각막 이식으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제78항에 있어서, 조직 또는 장기 이식이 동종이식편 이식인, 방법.
- 제78항에 있어서, 조직 또는 장기 이식이 자가이식편 이식인, 방법.
- 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 조직 또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 투여되고 조직 또는 장기 이식이 동일한 조직 또는 장기의 대체를 위한 것인, 방법.
- 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 조직 또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 투여되고 조직 또는 장기 이식이 상이한 조직 또는 장기의 대체를 위한 것인, 방법.
- 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 장기 이식이 신장 이식이고 세포 집단이 췌장 베타 섬세포 집단인, 방법.
- 제83항에 있어서, 환자가 당뇨병을 갖는, 방법.
- 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 장기 이식이 심장 이식이고 세포 집단이 박동조율 세포 집단인, 방법.
- 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 장기 이식이 췌장 이식이고 세포 집단이 베타 섬세포 집단인, 방법.
- 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 장기 이식이 부분 간 이식이고 세포 집단이 간세포 또는 간 전구 세포 집단인, 방법.
[청구항 88]
환자의 장애 치료를 위한 저면역원성 세포 집단의 용도로서, 저면역원성 세포가 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및
(I) 다음:
a. 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
b. MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
c. 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는
d. B2M 및 CIITA의 감소된 발현;
중 하나 이상을 포함하고, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며;
(II) 여기서
a. 환자가 감작된 환자가 아니거나;
b. 환자가 감작된 환자인, 용도. - 환자의 장애 치료를 위한 췌장 섬세포 집단의 용도로서, 췌장 섬세포가 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및
(I) 다음:
a. 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
b. MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
c. 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는
d. B2M 및 CIITA의 감소된 발현;
중 하나 이상을 포함하고, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며;
(II) 여기서
a. 환자가 감작된 환자가 아니거나;
b. 환자가 감작된 환자인, 용도. - 환자의 장애 치료를 위한 심장 근육 세포 집단의 용도로서, 심장 근육 세포가 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및
(I) 다음:
a. 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
b. MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
c. 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는
d. B2M 및 CIITA의 감소된 발현;
중 하나 이상을 포함하고, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며;
(II) 여기서
a. 환자가 감작된 환자가 아니거나;
b. 환자가 감작된 환자인, 용도. - 환자의 장애 치료를 위한 아교 전구 세포 집단의 용도로서, 아교 전구 세포가 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및
(I) 다음:
a. 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
b. MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
c. 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는
d. B2M 및 CIITA의 감소된 발현;
중 하나 이상을 포함하고, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며;
(II) 여기서
a. 환자가 감작된 환자가 아니거나;
b. 환자가 감작된 환자인, 용도. - 제88항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 감작된 환자이고, 환자가 하나 이상의 동종항원 또는 하나 이상의 자가 항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타내는, 용도.
- 제92항에 있어서, 하나 이상의 동종항원이 인간 백혈구 항원을 포함하는, 용도.
- 제88항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 이전 이식으로 인해 감작된 감작 환자이고,
a. 이전 이식이 세포 이식, 수혈, 조직 이식 및 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택되며, 임의로 이전 이식이 동종이계 이식이거나;
b. 이전 이식이 인간 기원의 키메라, 변형된 비인간 자가 세포, 변형된 자가 세포, 자가 조직 및 자가 장기로 구성된 군으로부터 선택된 이식이고, 임의로 이전 이식이 자가 이식인, 용도. - 제88항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 이전 임신으로 인해 감작된 감작 환자이고, 환자가 이전에 임신 중 동종면역화를 나타냈으며, 임의로 임신 중 동종면역화가 태아 및 신생아의 용혈성 질환(HDFN), 신생아 동종면역 호중구감소증(NAN) 또는 태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증(FNAIT)인, 용도.
- 제88항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 병태 또는 질환에 대한 이전 치료로 인해 감작된 감작 환자인, 용도.
- 제88항 내지 제93항 또는 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았고, 이전 치료가 세포 집단을 포함하지 않았으며,
a. 세포 집단이 이전 치료와 동일한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여되고/되거나;
b. 세포 집단은 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 향상된 치료 효과를 나타내고/내거나;
c. 세포 집단이 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 더 긴 치료 효과를 나타내고/내거나;
d. 이전 치료가 치료적으로 효과적이었고/이었거나;
e. 이전 치료가 치료적으로 비효과적이었고/이었거나;
f. 환자가 이전 치료에 대해 면역 반응을 일으켰고/켰거나;
g. 세포 집단이 이전 치료와 상이한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여되는, 용도. - 제97항에 있어서, 이전 치료가 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템을 포함하는 치료 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하고, 면역 반응이 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템의 활성화에 반응하여 발생하는, 용도.
- 제97항에 있어서, 이전 치료가 기계 보조 치료를 포함하고, 임의로 기계 보조 치료가 혈액투석 또는 심실 보조 장치를 포함하는, 용도.
- 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 알레르기를 갖고, 임의로 알레르기가 건초열, 식품 알레르기, 곤충 알레르기, 약물 알레르기 및 아토피성 피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 알레르기인, 용도.
- 제88항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 DUX4, CD24, CD46, CD55, CD59, CD200, PD-L1, HLA-E, HLA-G, IDO1, FasL, IL-35, IL-39, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpin B9, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 용도.
- 제88항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD142의 감소된 발현 수준을 추가로 포함하는, 용도.
- 제88항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD46의 감소된 발현 수준을 추가로 포함하는, 용도.
- 제88항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD59의 감소된 발현 수준을 추가로 포함하는, 용도.
- 제88항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 줄기 세포로부터 분화되는, 용도.
- 제105항에 있어서, 줄기 세포가 중간엽 줄기 세포인, 용도.
- 제105항에 있어서, 줄기 세포가 배아 줄기 세포인, 용도.
- 제105항에 있어서, 줄기 세포가 만능 줄기 세포이고, 임의로 만능 줄기 세포가 유도된 만능 줄기 세포인, 용도.
- 제88항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 심장 세포, 신경 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 췌장 섬세포, 망막 색소 상피 세포, 간세포, 갑상샘 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 형질 세포, 혈소판, 신장 세포, 상피 세포, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포, NK 세포 및 CAR-NK 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제88항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 세포로부터 유래되는, 용도.
- 제110항에 있어서, 1차 세포가 1차 T 세포, 1차 베타 세포 또는 1차 망막 색소 상피 세포인, 용도.
- 제111항에 있어서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포가 환자와 상이한 하나 이상의 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 T 세포 풀로부터 유래되는, 용도.
- 제88항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 용도.
- 제113항에 있어서, CAR의 항원 결합 도메인이 CD19, CD22 또는 BCMA에 결합하는, 용도.
- 제114항에 있어서, CAR는 세포가 CD19 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR인, 용도.
- 제114항에 있어서, CAR는 세포가 CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD22-특이적 CAR인, 용도.
- 제114항에 있어서, 세포는 세포가 CD19/CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR을 포함하는, 용도.
- 제117항에 있어서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR이 단일 바이시스트론 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는, 용도.
- 제117항에 있어서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR이 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는, 용도.
- 제88항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입되는, 용도.
- 제120항에 있어서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌가 동일한, 용도.
- 제120항에 있어서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌가 상이한, 용도.
- 제88항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 각각 제3 게놈 유전자좌에 삽입된 제3 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 용도.
- 제123항에 있어서, 제3 게놈 유전자좌가 제1 또는 제2 게놈 유전자좌와 동일한, 용도.
- 제123항에 있어서, 제3 게놈 유전자좌가 제1 및/또는 제2 게놈 유전자좌와 상이한, 용도.
- 제120항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 세이프 하버 유전자좌가 CCR5 유전자 유전자좌, PPP1R12C(AAVS1로도 알려짐) 유전자 및 CLYBL 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제120항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자좌가 CXCR4 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자좌, ROSA26 유전자 유전자좌, CD142 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제126항에 있어서, CCR5 유전자 유전자좌로의 삽입이 CCR5 유전자의 엑손 1-3, 인트론 1-2 또는 또 다른 코딩 서열(CDS)에 있는, 용도.
- 제126항에 있어서, PPP1R12C 유전자 유전자좌로의 삽입이 PPP1R12C 유전자의 인트론 1 또는 인트론 2인, 용도.
- 제126항에 있어서, CLYBL 유전자 유전자좌로의 삽입이 CLYBL 유전자의 인트론 2인, 용도.
- 제127항에 있어서, ROSA26 유전자 유전자좌로의 삽입이 ROSA26 유전자의 인트론 1인, 용도.
- 제127항에 있어서, 세이프 하버 유전자좌로의 삽입이 SHS231 유전자좌인, 용도.
- 제127항에 있어서, CD142 유전자 유전자좌로의 삽입이 CD142 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있는, 용도.
- 제127항에 있어서, MICA 유전자 유전자좌로의 삽입이 MICA 유전자의 CDS에 있는, 용도.
- 제127항에 있어서, MICB 유전자 유전자좌로의 삽입이 MICB 유전자의 CDS에 있는, 용도.
- 제120항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, B2M 유전자 유전자좌로의 삽입이 B2M 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있는, 용도.
- 제120항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, CIITA 유전자 유전자좌로의 삽입이 CIITA 유전자의 엑손 3 또는 또 다른 CDS에 있는, 용도.
- 제120항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, TRAC 유전자 유전자좌로의 삽입이 TRAC 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있는, 용도.
- 제120항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, TRB 유전자 유전자좌로의 삽입이 TRB 유전자의 CDS에 있는, 용도.
- 제111항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포가
a. 내인성 T 세포 수용체;
b. 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4);
c. 프로그래밍된 세포 사멸(PD1); 및
d. 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)
중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하고, 감소된 발현이 변형에 기인하고 감소된 발현이 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적인, 용도. - 제140항에 있어서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포가 TRAC의 감소된 발현을 포함하는, 용도.
- 제109항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가
a. 내인성 T 세포 수용체;
b. 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4);
c. 프로그래밍된 세포 사멸(PD1); 및
d. 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)
중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포이고, 감소된 발현이 변형에 기인하고 감소된 발현이 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적인, 용도. - 제142항에 있어서, 세포가 TRAC 및 TRB의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포인, 용도.
- 제88항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 용도.
- 제144항에 있어서, 프로모터가 CAG 및/또는 EF1a 프로모터인, 용도.
- 제88항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1일 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1일 이상 후에 투여되는, 용도.
- 제88항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1주 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1주 이상 후에 투여되는, 용도.
- 제88항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1개월 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1개월 이상 후에 투여되는, 용도.
- 제88항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 세포 집단의 투여 시 면역 반응을 나타내지 않는, 용도.
- 제149항에 있어서, 세포 집단의 투여 시 면역 반응 부재가 전신 면역 반응 부재, 적응 면역 반응 부재, 선천성 면역 반응 부재, T 세포 반응 부재, B 세포 반응 부재, 및 전신 급성 세포성 면역 반응 부재로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제150항에 있어서, 환자가 다음 중 하나 이상을 나타내는, 용도:
a. 세포 집단의 투여 시 전신 TH1 활성화 부재;
b. 세포 집단의 투여 시 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 면역 활성화 부재;
c. 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 공여체 특이적 IgG 항체 부재;
d. 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 IgM 및 IgG 항체 생성 부재; 및
e. 세포 집단의 투여 시 세포 집단의 세포독성 T 세포 사멸 부재. - 제88항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 세포 집단의 투여의 적어도 3일 이상 전 또는 후에 면역억제제가 투여되지 않는, 용도.
- 제88항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 다음을 포함하는 투약 요법을 포함하는, 용도:
a. 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 1차 투여;
b. 회복 기간; 및
c. 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 2차 투여. - 제153항에 있어서, 회복 기간이 적어도 1개월 이상을 포함하는, 용도.
- 제153항에 있어서, 회복 기간이 적어도 2개월 이상을 포함하는, 용도.
- 제153항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시되는, 용도.
- 제153항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 세포가 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템에 의해 제거되고, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시되는, 용도.
- 제155항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2회 투약 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 용도.
- 제88항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 심장, 폐, 신장, 간, 췌장, 장, 위, 각막, 골수, 혈관, 심장 판막, 뇌, 척수 및 뼈로 구성된 군으로부터 선택된 조직 또는 장기에서 세포 결핍의 치료를 위해 또는 병태 또는 질환의 치료를 위한 세포 치료법으로서 투여되는, 용도.
- 제88항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서,
a. 세포 결핍이 신경퇴행성 질환과 관련되거나 세포 치료법이 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 것이거나;
b. 세포 결핍이 간 질환과 관련되거나 세포 치료법이 간 질환의 치료를 위한 것이거나;
c. 세포 결핍이 각막 질환과 관련되거나 세포 치료법이 각막 질환의 치료를 위한 것이거나;
d. 세포 결핍이 심혈관 병태 또는 질환과 관련되거나 세포 치료법이 심혈관 병태 또는 질환의 치료를 위한 것이거나;
e. 세포 결핍이 당뇨병과 관련되거나 세포 치료법이 당뇨병의 치료를 위한 것이거나;
f. 세포 결핍이 혈관 병태 또는 질환과 관련되거나 세포 치료법이 혈관 병태 또는 질환의 치료를 위한 것이거나;
g. 세포 결핍이 자가면역 갑상샘염과 관련되거나 세포 치료법이 자가면역 갑상샘염의 치료를 위한 것이거나;
h. 세포 결핍이 신장 질환과 관련되거나 세포 치료법이 신장 질환의 치료를 위한 것인, 용도. - 제160항에 있어서,
a. 신경퇴행성 질환이 백질이영양증, 헌팅턴병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 횡단 척수염 및 펠리체우스-메르츠바허병(PMD)으로 구성된 군으로부터 선택되거나;
b. 간 질환이 간 경화증을 포함하거나;
c. 각막 질환이 푹스 이영양증 또는 선천성 유전 내피 이영양증이거나;
d. 심혈관 질환이 심근 경색 또는 울혈성 심부전인, 용도. - 제160항 또는 제161항에 있어서, 세포 집단이 다음을 포함하는, 용도:
a. 아교 전구 세포, 희소돌기아교세포, 성상세포 및 도파민성 뉴런으로 구성된 군으로부터 선택된 세포로서, 임의로 도파민성 뉴런은 신경 줄기 세포, 신경 전구 세포, 미성숙 도파민성 뉴런 및 성숙 도파민성 뉴런으로 구성된 군으로부터 선택된 세포;
b. 간세포 또는 간 전구 세포;
c. 각막 내피 전구 세포 또는 각막 내피 세포;
d. 심근세포 또는 심장 전구 세포;
e. 췌장 베타 섬세포를 포함하는 췌장 섬세포로서, 임의로 췌장 섬세포는 췌장 섬 전구 세포, 미성숙 췌장 섬세포 및 성숙 췌장 섬세포로 구성된 군으로부터 선택된 세포;
f. 내피 세포;
g. 갑상샘 전구 세포; 또는
h. 신장 전구체 세포 또는 신장 세포. - 제88항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 암의 치료를 위해 투여되는, 용도.
- 제163항에 있어서, 암이 B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 샘암종, 췌장 샘암종, 교모세포종, 신경모세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제88항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 조직 또는 장기 이식을 받고 있고, 임의로 조직 또는 장기 이식 또는 부분 장기 이식이 심장 이식, 폐 이식, 신장 이식, 간 이식, 췌장 이식, 장 이식, 위 이식, 각막 이식, 골수 이식, 혈관 이식, 심장 판막 이식, 뼈 이식, 부분 폐 이식, 부분 신장 이식, 부분 간 이식, 부분 췌장 이식, 부분 장 이식 및 부분 각막 이식으로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제165항에 있어서, 조직 또는 장기 이식이 동종이식편 이식인, 용도.
- 제165항에 있어서, 조직 또는 장기 이식이 자가이식편 이식인, 용도.
- 제165항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 조직 또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 투여되고 조직 또는 장기 이식이 동일한 조직 또는 장기의 대체를 위한 것인, 용도.
- 제165항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 조직 또는 장기의 세포 결핍의 치료를 위해 투여되고 조직 또는 장기 이식이 상이한 조직 또는 장기의 대체를 위한 것인, 용도.
- 제165항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 장기 이식이 신장 이식이고 세포 집단이 신장 전구체 세포 또는 신장 세포 집단인, 용도.
- 제170항에 있어서, 환자가 당뇨병을 갖는, 용도.
- 제165항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 장기 이식이 심장 이식이고 세포 집단이 심장 전구 세포 또는 박동조율 세포 집단인, 용도.
- 제165항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 장기 이식이 췌장 이식이고 세포 집단이 췌장 베타 섬세포 집단인, 용도.
- 제165항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 장기 이식이 부분 간 이식이고 세포 집단이 간세포 또는 간 전구 세포 집단인, 용도.
- 저면역원성 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서, 저면역원성 세포가 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드, CAR을 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및
(I) 다음:
a. 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
b. MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
c. 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는
d. B2M 및 CIITA의 감소된 발현;
중 하나 이상을 포함하고, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며;
(II) 여기서
a. 환자가 감작된 환자가 아니거나;
b. 환자가 감작된 환자이고, 환자는:
i. 하나 이상의 동종항원에 대해 감작되고/되거나;
ii. 하나 이상의 자가 항원에 대해 감작되고/되거나;
iii. 이전 이식으로 인해 감작되고/되거나;
iv. 이전 임신으로 인해 감작되고/되거나;
v. 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았고/받았거나;
vi. 조직 또는 장기 환자이고, 저면역원성 세포는 조직 또는 장기 이식을 투여하기 전에 투여되는, 방법. - 제175항에 있어서, 환자가 감작된 환자이고, 환자가 하나 이상의 동종항원 또는 하나 이상의 자가 항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타내는, 방법.
- 제176항에 있어서, 하나 이상의 동종항원이 인간 백혈구 항원을 포함하는, 방법.
- 제175항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 이전 이식으로 인해 감작된 감작 환자이고,
a. 이전 이식이 세포 이식, 수혈, 조직 이식 및 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택되며, 임의로 이전 이식이 동종이계 이식이거나;
b. 이전 이식이 인간 기원의 키메라, 변형된 비인간 자가 세포, 변형된 자가 세포, 자가 조직 및 자가 장기로 구성된 군으로부터 선택된 이식이고, 임의로 이전 이식은 자가 이식인, 방법. - 제175항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 이전 임신으로 인해 감작된 감작 환자이고, 환자가 이전에 임신 중 동종면역화를 나타냈으며, 임의로 임신 중 동종면역화가 태아 및 신생아의 용혈성 질환(HDFN), 신생아 동종면역 호중구감소증(NAN) 또는 태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증(FNAIT)인, 방법.
- 제175항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 병태 또는 질환에 대한 이전 치료로 인해 감작된 감작 환자인, 방법.
- 제175항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았고, 이전 치료가 세포 집단을 포함하지 않았으며,
a. 세포 집단이 이전 치료와 동일한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여되고/되거나;
b. 세포 집단이 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 향상된 치료 효과를 나타내고/내거나;
c. 세포 집단이 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환 치료에 대해 더 긴 치료 효과를 나타내고/내거나;
d. 이전 치료가 치료적으로 효과적이었고/이었거나;
e. 이전 치료가 치료적으로 비효과적이었고/이었거나;
f. 환자가 이전 치료에 대해 면역 반응을 일으켰고/켰거나;
g. 세포 집단이 이전 치료와 상이한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여되는, 방법. - 제181항에 있어서, 이전 치료가 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템을 포함하는 치료 세포 집단을 투여하는 것을 포함하고, 면역 반응이 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템의 활성화에 반응하여 발생하는, 방법.
- 제181항에 있어서, 이전 치료가 기계 보조 치료를 포함하고, 임의로 기계 보조 치료가 혈액투석 또는 심실 보조 장치를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 알레르기를 갖고, 임의로 알레르기가 건초열, 식품 알레르기, 곤충 알레르기, 약물 알레르기 및 아토피성 피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 알레르기인, 방법.
- 제175항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 DUX4, CD24, CD46, CD55, CD59, CD200, PD-L1, HLA-E, HLA-G, IDO1, FasL, IL-35, IL-39, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpin B9, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 방법.
- 제175항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD142의 감소된 발현 수준을 추가로 포함하는, 방법.
- 제175항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD46의 감소된 발현 수준을 추가로 포함하는, 방법.
- 제175항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD59의 감소된 발현 수준을 추가로 포함하는, 방법.
- 제175항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 줄기 세포로부터 분화되는, 방법.
- 제189항에 있어서, 줄기 세포가 중간엽 줄기 세포인, 방법.
- 제189항에 있어서, 줄기 세포가 배아 줄기 세포인, 방법.
- 제189항에 있어서, 줄기 세포가 만능 줄기 세포이고, 임의로 만능 줄기 세포가 유도된 만능 줄기 세포인, 방법.
- 제175항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 CAR T 세포 또는 CAR-NK 세포인, 방법.
- 제175항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 T 세포로부터 유래되는, 방법.
- 제194항에 있어서, 세포가 환자와 상이한 하나 이상의 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 T 세포 풀로부터 유래되는, 방법.
- 제175항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, CAR의 항원 결합 도메인이 CD19, CD22, 또는 BCMA에 결합하는, 방법.
- 제196항에 있어서, CAR는 세포가 CD19 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR인, 방법.
- 제196항에 있어서, CAR는 세포가 CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD22-특이적 CAR인, 방법.
- 제196항에 있어서, 세포는 세포가 CD19/CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR을 포함하는, 방법.
- 제199항에 있어서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR이 단일 바이시스트론 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는, 방법.
- 제199항에 있어서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR이 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는, 방법.
- 제175항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입되는, 방법.
- 제202항에 있어서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌가 동일한, 방법.
- 제202항에 있어서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌가 상이한, 방법.
- 제175항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 각각 제3 게놈 유전자좌에 삽입된 제3 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 방법.
- 제206항에 있어서, 제3 게놈 유전자좌가 제1 또는 제2 게놈 유전자좌와 동일한, 방법.
- 제206항에 있어서, 제3 게놈 유전자좌가 제1 및/또는 제2 게놈 유전자좌와 상이한, 방법.
- 제202항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 세이프 하버 유전자좌가 CCR5 유전자 유전자좌, PPP1R12C(AAVS1로도 알려짐) 유전자 및 CLYBL 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제202항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자좌가 CXCR4 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자좌, ROSA26 유전자 유전자좌, CD142 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제208항에 있어서, CCR5 유전자 유전자좌로의 삽입이 CCR5 유전자의 엑손 1-3, 인트론 1-2 또는 또 다른 코딩 서열(CDS)에 있는, 방법.
- 제208항에 있어서, PPP1R12C 유전자 유전자좌로의 삽입이 PPP1R12C 유전자의 인트론 1 또는 인트론 2인, 방법.
- 제208항에 있어서, CLYBL 유전자 유전자좌로의 삽입이 CLYBL 유전자의 인트론 2인, 방법.
- 제209항에 있어서, ROSA26 유전자 유전자좌로의 삽입이 ROSA26 유전자의 인트론 1인, 방법.
- 제209항에 있어서, 세이프 하버 유전자좌로의 삽입이 SHS231 유전자좌인, 방법.
- 제209항에 있어서, CD142 유전자 유전자좌로의 삽입이 CD142 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있는, 방법.
- 제209항에 있어서, MICA 유전자 유전자좌로의 삽입이 MICA 유전자의 CDS에 있는, 방법.
- 제209항에 있어서, MICB 유전자 유전자좌로의 삽입이 MICB 유전자의 CDS에 있는, 방법.
- 제202항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, B2M 유전자 유전자좌로의 삽입이 B2M 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있는, 방법.
- 제202항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, CIITA 유전자 유전자좌로의 삽입이 CIITA 유전자의 엑손 3 또는 또 다른 CDS에 있는, 방법.
- 제202항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, TRAC 유전자 유전자좌로의 삽입이 TRAC 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있는, 방법.
- 제202항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, TRB 유전자 유전자좌로의 삽입이 TRB 유전자의 CDS에 있는, 방법.
- 제194항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포가
a. 내인성 T 세포 수용체;
b. 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4);
c. 프로그래밍된 세포 사멸(PD1); 및
d. 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)
중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하고, 감소된 발현이 변형에 기인하고 감소된 발현이 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적인, 방법. - 제222항에 있어서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포가 TRAC의 감소된 발현을 포함하는, 방법.
- 제193항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가
a. 내인성 T 세포 수용체;
b. 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4);
c. 프로그래밍된 세포 사멸(PD1); 및
d. 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)
중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포이고, 감소된 발현이 변형에 기인하고 감소된 발현이 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적인, 방법. - 제224항에 있어서, 세포가 TRAC 및 TRB의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포인, 방법.
- 제175항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 방법.
- 제226항에 있어서, 프로모터가 CAG 및/또는 EF1a 프로모터인, 방법.
- 제175항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1일 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1일 이상 후에 투여되는, 방법.
- 제175항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1주 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1주 이상 후에 투여되는, 방법.
- 제175항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1개월 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1개월 이상 후에 투여되는, 방법.
- 제175항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 세포 집단의 투여 시 면역 반응을 나타내지 않는, 방법.
- 제231항에 있어서, 세포 집단의 투여 시 면역 반응 부재가 전신 면역 반응 부재, 적응 면역 반응 부재, 선천성 면역 반응 부재, T 세포 반응 부재, B 세포 반응 부재, 및 전신 급성 세포성 면역 반응 부재로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제232항에 있어서, 환자가 다음 중 하나 이상을 나타내는, 방법:
a. 세포 집단의 투여 시 전신 TH1 활성화 부재;
b. 세포 집단의 투여 시 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 면역 활성화 부재;
c. 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 공여체 특이적 IgG 항체 부재;
d. 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 IgM 및 IgG 항체 생성 부재; 및
e. 세포 집단의 투여 시 세포 집단의 세포독성 T 세포 사멸 부재. - 제175항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 세포 집단의 투여의 적어도 3일 이상 전 또는 후에 면역억제제가 투여되지 않는, 방법.
- 제175항 내지 제234항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 다음을 포함하는 투약 요법을 포함하는, 방법:
a. 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 1차 투여;
b. 회복 기간; 및
c. 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 2차 투여. - 제235항에 있어서, 회복 기간이 적어도 1개월 이상을 포함하는, 방법.
- 제235항에 있어서, 회복 기간이 적어도 2개월 이상을 포함하는, 방법.
- 제235항 내지 제237항 중 어느 한 항에 있어서, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시되는, 방법.
- 제235항 내지 제238항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 세포가 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템에 의해 제거되고, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시되는, 방법.
- 제235항 내지 제239항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2회 투약 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제175항 내지 제240항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 암의 치료를 위해 투여되는, 방법.
- 제241항에 있어서, 암이 B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 샘암종, 췌장 샘암종, 교모세포종, 신경모세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 환자의 장애 치료를 위한 저면역원성 세포 집단의 용도로서, 저면역원성 세포가 CD47을 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드, CAR을 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및
(I) 다음:
a. 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
b. MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현;
c. 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 및/또는 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(CIITA)의 감소된 발현; 및/또는
d. B2M 및 CIITA의 감소된 발현;
중 하나 이상을 포함하고, 감소된 발현은 변형에 기인하고 감소된 발현은 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적이며;
(II) 여기서
a. 환자가 감작된 환자가 아니거나
b. 환자가 감작된 환자인, 용도. - 제243항에 있어서, 환자가 감작된 환자이고, 환자가 하나 이상의 동종항원 또는 하나 이상의 자가 항원에 대해 반응성인 기억 B 세포 및/또는 기억 T 세포를 나타내는, 용도.
- 제244항에 있어서, 하나 이상의 동종항원이 인간 백혈구 항원을 포함하는, 용도.
- 제243항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 이전 이식으로 인해 감작된 감작 환자이고,
a. 이전 이식이 세포 이식, 수혈, 조직 이식 및 장기 이식으로 구성된 군으로부터 선택되며, 임의로 이전 이식이 동종이계 이식이거나;
b. 이전 이식이 인간 기원의 키메라, 변형된 비인간 자가 세포, 변형된 자가 세포, 자가 조직 및 자가 장기로 구성된 군으로부터 선택된 이식이고, 임의로 이전 이식이 자가 이식인, 용도. - 제243항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 이전 임신으로 인해 감작된 감작 환자이고 환자가 이전에 임신 중 동종면역화를 나타냈으며, 임의로 임신 중 동종면역화가 태아 및 신생아의 용혈성 질환(HDFN), 신생아 동종면역 호중구감소증(NAN) 또는 태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증(FNAIT)인, 용도.
- 제243항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 병태 또는 질환에 대한 이전 치료로 인해 감작된 감작 환자인, 용도.
- 제243항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 병태 또는 질환에 대해 이전 치료를 받았고, 이전 치료가 세포 집단을 포함하지 않았으며,
a. 세포 집단이 이전 치료와 동일한 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여되고/되거나;
b. 세포 집단이 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환의 치료에 대해 향상된 치료 효과를 나타내고/내거나;
c. 세포 집단이 이전 치료와 비교하여 환자의 병태 또는 질환 치료에 대해 더 긴 치료 효과를 나타내고; 이전 치료가 치료적으로 효과적이었고/이었거나;
d. 이전 치료가 치료적으로 비효과적이었고/이었거나;
e. 환자가 이전 치료에 대해 면역 반응을 일으켰고/켰거나;
f. 세포 집단이 이전 치료와 다른 병태 또는 질환의 치료를 위해 투여되는, 용도. - 제249항에 있어서, 이전 치료가 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템을 포함하는 치료 세포 집단을 투여하는 것을 포함하고, 면역 반응이 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템의 활성화에 반응하여 발생하는, 용도.
- 제249항에 있어서, 이전 치료가 기계 보조 치료를 포함하고, 임의로 기계 보조 치료가 혈액투석 또는 심실 보조 장치를 포함하는, 용도.
- 제243항 내지 제251항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 알레르기를 갖고, 임의로 알레르기가 건초열, 식품 알레르기, 곤충 알레르기, 약물 알레르기 및 아토피성 피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 알레르기인, 용도.
- 제243항 내지 제252항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 DUX4, CD24, CD46, CD55, CD59, CD200, PD-L1, HLA-E, HLA-G, IDO1, FasL, IL-35, IL-39, CCL21, CCL22, Mfge8, Serpin B9, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 용도.
- 제243항 내지 제253항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD142의 감소된 발현 수준을 추가로 포함하는, 용도.
- 제243항 내지 제254항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD46의 감소된 발현 수준을 추가로 포함하는, 용도.
- 제243항 내지 제255항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 CD59의 감소된 발현 수준을 추가로 포함하는, 용도.
- 제243항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 줄기 세포로부터 분화되는, 용도.
- 제257항에 있어서, 줄기 세포가 중간엽 줄기 세포인, 용도.
- 제257항에 있어서, 줄기 세포가 배아 줄기 세포인, 용도.
- 제257항에 있어서, 줄기 세포가 만능 줄기 세포이고, 임의로 만능 줄기 세포가 유도된 만능 줄기 세포인, 용도.
- 제243항 내지 제260항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 CAR T 세포 또는 CAR-NK 세포인, 용도.
- 제243항 내지 제261항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 T 세포로부터 유래되는, 용도.
- 제262항에 있어서, 세포가 환자와 상이한 하나 이상의 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 T 세포 풀로부터 유래되는, 용도.
- 제243항 내지 제263항 중 어느 한 항에 있어서, CAR의 항원 결합 도메인이 CD19, CD22, 또는 BCMA에 결합하는, 용도.
- 제264항에 있어서, CAR은 세포가 CD19 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR인, 용도.
- 제264항에 있어서, CAR은 세포가 CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD22-특이적 CAR인, 용도.
- 제264항에 있어서, 세포는 세포가 CD19/CD22 CAR T 세포이도록 하는 CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR을 포함하는, 용도.
- 제267항에 있어서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR이 단일 바이시스트론 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는, 용도.
- 제267항에 있어서, CD19-특이적 CAR 및 CD22-특이적 CAR이 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는, 용도.
- 제243항 내지 제269항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 세이프 하버 유전자좌, 표적 유전자좌, B2M 유전자 유전자좌, CIITA 유전자 유전자좌, TRAC 유전자 유전자좌, 또는 TRB 유전자 유전자좌를 포함하는 게놈 유전자좌에 삽입되는, 용도.
- 제270항에 있어서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌가 동일한, 용도.
- 제270항에 있어서, 제1 및 제2 게놈 유전자좌가 상이한, 용도.
- 제243항 내지 제272항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 각각 제3 게놈 유전자좌에 삽입된 제3 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 용도.
- 제273항에 있어서, 제3 게놈 유전자좌가 제1 또는 제2 게놈 유전자좌와 동일한, 용도.
- 제273항에 있어서, 제3 게놈 유전자좌가 제1 및/또는 제2 게놈 유전자좌와 상이한, 용도.
- 제270항 내지 제275항 중 어느 한 항에 있어서, 세이프 하버 유전자좌가 CCR5 유전자 유전자좌, PPP1R12C(AAVS1로도 알려짐) 유전자 및 CLYBL 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제270항 내지 제275항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자좌가 CXCR4 유전자 유전자좌, 알부민 유전자 유전자좌, SHS231 유전자좌, ROSA26 유전자 유전자좌, CD142 유전자 유전자좌, MICA 유전자 유전자좌, MICB 유전자 유전자좌, LRP1 유전자 유전자좌, HMGB1 유전자 유전자좌, ABO 유전자 유전자좌, RHD 유전자 유전자좌, FUT1 유전자 유전자좌 및 KDM5D 유전자 유전자좌로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제276항에 있어서, CCR5 유전자 유전자좌로의 삽입이 CCR5 유전자의 엑손 1-3, 인트론 1-2 또는 또 다른 코딩 서열(CDS)에 있는, 용도.
- 제276항에 있어서, PPP1R12C 유전자 유전자좌로의 삽입이 PPP1R12C 유전자의 인트론 1 또는 인트론 2인, 용도.
- 제276항에 있어서, CLYBL 유전자 유전자좌로의 삽입이 CLYBL 유전자의 인트론 2인, 용도.
- 제277항에 있어서, ROSA26 유전자 유전자좌로의 삽입이 ROSA26 유전자의 인트론 1인, 용도.
- 제277항에 있어서, 세이프 하버 유전자좌로의 삽입이 SHS231 유전자좌인, 용도.
- 제277항에 있어서, CD142 유전자 유전자좌로의 삽입이 CD142 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있는, 용도.
- 제277항에 있어서, MICA 유전자 유전자좌로의 삽입이 MICA 유전자의 CDS에 있는, 용도.
- 제277항에 있어서, MICB 유전자 유전자좌로의 삽입이 MICB 유전자의 CDS에 있는, 용도.
- 제270항 내지 제285항 중 어느 한 항에 있어서, B2M 유전자 유전자좌로의 삽입이 B2M 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있는, 용도.
- 제270항 내지 제285항 중 어느 한 항에 있어서, CIITA 유전자 유전자좌로의 삽입이 CIITA 유전자의 엑손 3 또는 또 다른 CDS에 있는, 용도.
- 제270항 내지 제285항 중 어느 한 항에 있어서, TRAC 유전자 유전자좌로의 삽입이 TRAC 유전자의 엑손 2 또는 또 다른 CDS에 있는, 용도.
- 제270항 내지 제285항 중 어느 한 항에 있어서, TRB 유전자 유전자좌로의 삽입이 TRB 유전자의 CDS에 있는, 용도.
- 제262항 내지 제289항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포가
a. 내인성 T 세포 수용체;
b. 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4);
c. 프로그래밍된 세포 사멸(PD1); 및
d. 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)
중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하고, 감소된 발현이 변형에 기인하고 감소된 발현이 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적인, 용도. - 제290항에 있어서, 1차 T 세포로부터 유래된 세포가 TRAC의 감소된 발현을 포함하는, 용도.
- 제261항 내지 제289항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가
a. 내인성 T 세포 수용체;
b. 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4);
c. 프로그래밍된 세포 사멸(PD1); 및
d. 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)
중 하나 이상의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포이고, 감소된 발현이 변형에 기인하고 감소된 발현이 변형을 포함하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 상대적인, 용도. - 제292항에 있어서, 세포가 TRAC 및 TRB의 감소된 발현을 포함하는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 T 세포인, 용도.
- 제243항 내지 제293항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 용도.
- 제294항에 있어서, 프로모터가 CAG 및/또는 EF1a 프로모터인, 용도.
- 제243항 내지 제295항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1일 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1일 이상 후에 투여되는, 용도.
- 제243항 내지 제295항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1주 이상 후에 또는 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1주 이상 후에 투여되는, 용도.
- 제243항 내지 제295항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 환자가 하나 이상의 동종항원에 대해 감작된 적어도 1개월 이상 후에, 환자가 동종이계 이식을 받은 적어도 1개월 이상 후에 투여되는, 용도.
- 제243항 내지 제298항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 세포 집단의 투여 시 면역 반응을 나타내지 않는, 용도.
- 제299항에 있어서, 세포 집단의 투여 시 면역 반응 부재가 전신 면역 반응 부재, 적응 면역 반응 부재, 선천성 면역 반응 부재, T 세포 반응 부재, B 세포 반응 부재, 및 전신 급성 세포성 면역 반응 부재로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제300항에 있어서, 환자가 다음 중 하나 이상을 나타내는, 용도:
a. 세포 집단의 투여 시 전신 TH1 활성화 부재;
b. 세포 집단의 투여 시 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 면역 활성화 부재;
c. 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 공여체 특이적 IgG 항체 부재;
d. 세포 집단의 투여 시 세포 집단에 대한 IgM 및 IgG 항체 생성 부재; 및
e. 세포 집단의 투여 시 세포 집단의 세포독성 T 세포 사멸 부재. - 제243항 내지 제301항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 세포 집단의 투여의 적어도 3일 이상 전 또는 후에 면역억제제가 투여되지 않는, 용도.
- 제243항 내지 제302항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 다음을 포함하는 투약 요법을 포함하는, 용도:
a. 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 1차 투여;
b. 회복 기간; 및
c. 치료 유효량의 세포 집단을 포함하는 2차 투여. - 제303항에 있어서, 회복 기간이 적어도 1개월 이상을 포함하는, 용도.
- 제303항에 있어서, 회복 기간이 적어도 2개월 이상을 포함하는, 용도.
- 제303항 내지 제305항 중 어느 한 항에 있어서, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시되는, 용도.
- 제303항 내지 제306항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 세포가 자살 유전자 또는 안전 스위치 시스템에 의해 제거되고, 2차 투여는 1차 투여로부터의 세포가 환자에서 더 이상 검출 불가능할 때 개시되는, 용도.
- 제303항 내지 제307항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2회 투약 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 용도.
- 제243항 내지 제308항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 암의 치료를 위해 투여되는, 용도.
- 제309항에 있어서, 암이 B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 폐암, 비소세포 폐암, 급성 골수성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 위암, 위 샘암종, 췌장 샘암종, 교모세포종, 신경모세포종, 폐 편평 세포 암종, 간세포 암종 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제97항, 제181항 또는 제249항 중 어느 한 항에 있어서, 이전 치료가 동종이계 CAR-T 세포 기반 치료법 또는 자가 CAR-T 세포 기반 치료법을 포함하고, 자가 CAR-T 세포 기반 치료법이 브렉수카브타진 오토루셀, 악시카브타진 실로루셀, 이데카브타진 비클루셀, 리소카브타진 마라루셀, 티사겐렉루셀, Cartesian Therapeutics의 Descartes-08 또는 Descartes-11, Novartis의 CTL110, Poseida Therapeutics의 P-BMCA-101, Autolus Limited의 AUTO4, Cellectis의 UCARTCS, Precision Biosciences의 PBCAR19B 및 PBCAR269A, Fate Therapeutics의 FT819, 및 Clyad Oncology의 CYAD-211로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도 또는 방법.
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