CN118076362A

CN118076362A - 用于改变低免疫原性细胞中的基因表达的诱导型系统

Info

Publication number: CN118076362A
Application number: CN202280067236.XA
Authority: CN
Inventors: W·道德勒; E·萨姆; R·拉莫斯-扎亚斯; S·施雷普费尔
Original assignee: Sana Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sana Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-11
Filing date: 2022-08-11
Publication date: 2024-05-24

Abstract

本文公开了工程化细胞和/或低免疫原性细胞，包括工程化细胞和/或低免疫原性干细胞、由其分化的工程化细胞和/或低免疫原性细胞、和/或工程化细胞和/或低免疫原性CAR‑T细胞(原代的或从工程化和/或低免疫原性干细胞分化的)，以及它们的使用和产生的相关方法，包括一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的可调控的降低表达和CD47的可调控过表达。本文提供了进一步表现出降低的T细胞受体表达的细胞。

Description

用于改变低免疫原性细胞中的基因表达的诱导型系统

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年8月11日提交的美国临时申请号63/232,141和2021年10月21日提交的美国临时申请号63/270,454的优先权，每个申请的公开内容整体以引用方式并入本文。

发明内容

现成的治疗细胞可提供优于基于自体细胞的策略的优势，包括易于制造、质量控制以及避免恶性污染和T细胞功能障碍。然而，针对组织不相容性细胞的强烈宿主抗移植物免疫响应阻止了同种异体细胞的扩增和持续存在，并降低了该方法的功效。

在动物模型和人类患者中都有大量证据表明，低免疫原性细胞移植是一种科学可行并且临床上有前途的治疗多种病症、疾患和疾病的途径。

仍然需要用于产生避免被受体免疫系统检测的基于细胞的疗法的新途径、组合物和方法。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化细胞，其包含相对于对照增加CD47的表达的可调控修饰。

在一些实施方案中，工程化细胞选自由以下细胞组成的组：干细胞、多能干细胞(PSC)、诱导型多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)、胚胎干细胞(ESC)、胰岛细胞、β胰岛细胞、免疫细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、巨噬细胞、免疫特权细胞、视细胞、视网膜色素上皮细胞(RPE)、肝细胞、甲状腺细胞、内皮细胞、皮肤细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、肌细胞、心脏细胞和血细胞。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化胰岛细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，胰岛细胞是β胰岛细胞。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化内皮细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化心肌细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化平滑肌细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化骨骼肌细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化肝细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化神经胶质祖细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化多巴胺能神经元，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化免疫特权细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化视网膜色素上皮细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化甲状腺细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化免疫细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，工程化免疫细胞包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化T细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，工程化T细胞包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化NK细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化巨噬细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达至少大约相同量的CD47。

在一些实施方案中，细胞是免疫特权细胞。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约10％的量的CD47。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的CD47。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的CD47。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约1000％的量的CD47。

在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是对照中表达的至少约1.1倍。

在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是对照中表达的至少约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍。

在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是对照中表达的至少约4倍、约4.5倍、约5倍或约5.5倍。

在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是对照中表达的至少约4倍。

在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是对照中表达的至少约4.5倍。

在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是对照中表达的至少约5倍。

在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是对照中表达的至少约5.5倍。

在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是对照中表达的至少约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍。

在一些实施方案中，对照是野生型细胞、对照细胞或基线参考。

在一些实施方案中，对照细胞是未修饰的或未改变的细胞，任选地其中未修饰的或未改变的细胞与工程化细胞属于相同的细胞类型。

在一些实施方案中，对照细胞是来自供体的起始材料或来自供体库的起始细胞库。

在一些实施方案中，基线参考是同种型对照或背景信号水平。

在一些实施方案中，基线是同种型对照，任选地其中CD47水平使用基于抗体的测定法来测定。

在一些实施方案中，CD47水平使用基于抗体的定量方法、任选的Quantibrite^TM测定法来测定。

在一些实施方案中，工程化细胞是每个细胞表达至少约200,000、250,000、300,000、350,000或400,000个CD47分子的β胰岛细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞是表达CD47表达是基线的至少约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍或更高的视网膜色素上皮细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞是每个细胞表达至少约180,000、190,000、200,000、210,000、220,000、230,000、240,000、250,000、260,000、270,000、280,000、290,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000、650,000或700,000个CD47分子的T细胞。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原的表达，以及ii)增加一种或多种致耐受因子的表达，其中该工程化细胞以阈值水平或更高水平表达致耐受因子。

在一些实施方案中，基线是同种型对照，任选地其中致耐受因子的量使用基于抗体的测定法来测定。

在一些实施方案中，致耐受因子的量使用基于抗体的定量方法、任选的Quantibrite^TM测定法来测定。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达至少大约相同量的致耐受因子。

在一些实施方案中，细胞是免疫特权细胞。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约10％的量的致耐受因子。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的致耐受因子。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的致耐受因子。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约1000％的量的致耐受因子。

在一些实施方案中，细胞表达的致耐受因子的水平是对照中表达的至少约1.1倍。

在一些实施方案中，细胞表达的致耐受因子的水平是对照中表达的至少约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍。

在一些实施方案中，细胞表达的致耐受因子的水平是对照中表达的至少约4倍、约4.5倍、约5倍或约5.5倍。

在一些实施方案中，细胞表达的致耐受因子的水平是对照中表达的至少约4倍。

在一些实施方案中，细胞表达的致耐受因子的水平是对照中表达的至少约4.5倍。

在一些实施方案中，细胞表达的致耐受因子的水平是对照中表达的至少约5倍。

在一些实施方案中，细胞表达的致耐受因子的水平是对照中表达的至少约5.5倍。

在一些实施方案中，细胞表达的致耐受因子的水平是对照中表达的至少约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍。

在一些实施方案中，修饰降低以下分子的表达：(a)MHC I类分子；(b)MHC II类分子；或(c)MHC I类分子和MHC II类分子。

在一些实施方案中，修饰相对于对照降低B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B和/或NFY-C中的一种或多种的表达。

在一些实施方案中，细胞不表达MHC I类分子和/或MHC II类分子。

在一些实施方案中，细胞相对于对照不表达B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B和/或NFY-C中的一种或多种。

在一些实施方案中，修饰包括敲除选自由B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B和/或NFY-C组成的组的一个或多个靶标。

在一些实施方案中，修饰降低选自由B2M、TAP1、NLRC5和/或CIITA组成的组的一个或多个靶标的表达。

在一些实施方案中，修饰包括敲除选自由B2M、TAP1、NLRC5和/或CIITA组成的组的一个或多个靶标。

在一些实施方案中，敲除发生在两个等位基因中。

在一些实施方案中，细胞还包含相对于对照降低CTLA-4、PD-1、IRF1、MIC-A、MIC-B、参与氧化或ER应激的蛋白质、TRAC、TRB、CD142、ABO、CD38、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的表达的一种或多种修饰。

在一些实施方案中，参与氧化或ER应激的蛋白质选自由硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、PKR样ER激酶(PERK)、需要肌醇的酶1α(IRE1α)和DJ-1(PARK7)组成的组。

在一些实施方案中，修饰包括敲除选自由CTLA-4、PD-1、IRF1、MIC-A、MIC-B、参与氧化或ER应激的蛋白质、TRAC、TRB、CD142、ABO、CD38、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的组成的组的一个或多个靶标。

在一些实施方案中，敲除发生在两个等位基因中。

在一些实施方案中，修饰降低B2M的表达。

在一些实施方案中，修饰降低CIITA的表达。

在一些实施方案中，修饰降低B2M和CIITA的表达。

在一些实施方案中，修饰包括敲除B2M和/或CIITA。

在一些实施方案中，B2M和/或CIITA敲除发生在两个等位基因中。

在一些实施方案中，修饰降低NK细胞配体、任选的MIC-A和/或MIC-B的表达。

在一些实施方案中，修饰包括敲除MIC-A和/或MIC-B。

在一些实施方案中，MIC-A和/或MIC-B敲除发生在两个等位基因中。

在一些实施方案中，细胞还包含相对于对照降低一种或多种Y染色体基因的表达的修饰。

在一些实施方案中，一种或多种Y染色体基因选自由Y连接的原钙粘附蛋白-11和Y连接的神经连接蛋白-4的组成的组。

在一些实施方案中，修饰降低TXNIP的表达。

在一些实施方案中，修饰包括敲除TXNIP。

在一些实施方案中，TXNIP敲除发生在两个等位基因中。

在一些实施方案中，细胞还包含降低B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B、NFY-C、CTLA-4、PD-1、IRF1、MIC-A、MIC-B、参与氧化或ER应激的蛋白质、TRAC、TRB、CD142、ABO、CD38、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的表达的修饰。

在一些实施方案中，细胞不表达B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B、NFY-C、CTLA-4、PD-1、IRF1、MIC-A、MIC-B、参与氧化或ER应激的蛋白质、TRAC、TRB、CD142、ABO、CD38、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD。

在一些实施方案中，细胞还包含相对于对照降低B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的表达的修饰。

在一些实施方案中，细胞不表达B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD。

在一些实施方案中，细胞包含降低一种或多种致耐受因子的表达的另外修饰。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子选自由A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1和/或Serpinb9组成的组。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子选自由A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD47、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1和/或Serpinb9组成的组。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括CD47。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括HLA-E。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括CD24。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括PD-L1。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括CD46。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括CD55。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括CD59。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括CR1。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括MANF。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括A20/TNFAIP3。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括HLA-E和CD47。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括CD24、CD47和/或PDL1中的一种或多种。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括HLA-E、CD24、CD47和/或PDL1中的一种或多种。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括CD46、CD55、CD59和/或CR1中的一种或多种。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括HLA-E、CD46、CD55、CD59和/或CR1中的一种或多种。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括HLA-E、CD24、CD47、PDL1、CD46、CD55、CD59和/或CR1中的一种或多种。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括HLA-E和PDL1。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括HLA-E、PDL1和/或A20/TNFAIP中的一种或多种。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括HLA-E、PDL1和/或MANF中的一种或多种。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子包括HLA-E、PDL1、A20/TNFAIP和/或MANF中的一种或多种。

在一些实施方案中，修饰：(a)降低MHC I类和/或MHC II类分子的表达；(b)降低MIC-A和/或MIC-B的表达；(c)增加CD47以及任选的CD24和PD-L1的表达；以及(d)增加CD46、CD55、CD59和CR1的表达。

在一些实施方案中，修饰：(a)降低MHC I类分子的表达；(b)降低MIC-A和/或MIC-B的表达；(c)降低TXNIP的表达；以及(d)增加PD-L1和HLA-E的表达。

在一些实施方案中，修饰进一步增加A20/TNFAIP3和MANF的表达。

在一些实施方案中，细胞源自人细胞或动物细胞。

在一些实施方案中，细胞是源自干细胞或其后代的分化细胞。

在一些实施方案中，干细胞选自由多能干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)和胚胎干细胞(ESC)组成的组。

在一些实施方案中，细胞源自原代细胞或其后代。

在一些实施方案中，细胞在施用至受体患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。

在一些实施方案中，细胞在施用至受体患者后被成熟NK细胞保护免受细胞裂解。

在一些实施方案中，细胞在施用至受体患者后逃避巨噬细胞吞噬。

在一些实施方案中，细胞在施用至受体患者后不诱导对细胞的先天和/或适应性免疫响应。

在一些实施方案中，细胞在施用至受体患者后不诱导对细胞的基于抗体的免疫响应。

在一些实施方案中，修饰中的一种或多种是可调控修饰。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化细胞，其包含相对于对照改变工程化细胞中一个或多个靶标的表达的一种或多种可调控修饰，任选地其中该一种或多种可调控修饰相对于对照增加CD47的表达。

在一些实施方案中，一种或多种可调控修饰包含条件性或诱导型基于RNA的组分，用于相对于对照i)增加或ii)降低或敲除一个或多个靶标的表达。

在一些实施方案中，条件性或诱导型基于RNA的组分选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA以及条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组。

在一些实施方案中，条件性基于RNA的组分处于选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组的条件性启动子的控制下。

在一些实施方案中，诱导型基于RNA的组分处于受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子的控制下。

在一些实施方案中，可调控修饰包含条件性或诱导型基于DNA的组分，用于相对于对照i)增加或ii)降低或敲除一个或多个靶标的表达。

在一些实施方案中，条件性或诱导型基于DNA的组分选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶、条件性或诱导型引物编辑、条件性或诱导型PASTE编辑和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组。

在一些实施方案中，条件性基于DNA的组分处于选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组的条件性启动子的控制下。

在一些实施方案中，条件性基于DNA的组分处于受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子的控制下。

在一些实施方案中，可调控修饰包含条件性或诱导型基于蛋白质的组分，用于相对于对照i)增加或ii)降低或敲除一个或多个靶标的表达。

在一些实施方案中，条件性或诱导型基于蛋白质的组分是条件性或诱导型降解决定子组分。

在一些实施方案中，条件性或诱导型降解决定子组分选自由使用SMASH标签的配体诱导性降解(LID)、使用Shield-1的LID、使用生长素的LID、使用雷帕霉素的LID、条件性或诱导型肽降解决定子(例如，基于IKZF3的降解决定子)和条件性或诱导型蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)组成的组。

在一些实施方案中，条件性基于蛋白质的组分处于选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组的条件性启动子的控制下。

在一些实施方案中，基于蛋白质的组分处于受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子的控制下。

在一些实施方案中，细胞包含与编码一种或多种致耐受因子或CD47的外源多核苷酸可操作地连接的条件性启动子。

在一些实施方案中，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的条件性启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码一种或多种致耐受因子或CD47的货物多核苷酸。

在一些实施方案中，条件性启动子选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组。

在一些实施方案中，细胞包含与编码一种或多种致耐受因子或CD47的外源多核苷酸可操作地连接的诱导型启动子。

在一些实施方案中，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的诱导型启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码一种或多种致耐受因子或CD47的货物多核苷酸。

在一些实施方案中，诱导型启动子受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。

在一些实施方案中，细胞包含与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或100％序列同一性的CD47多肽。

在一些实施方案中，细胞包含与SEQ ID NO:130的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或100％序列同一性的CD47多肽。

在一些实施方案中，细胞还包含相对于对照增加A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1和/或Serpinb9中的一种或多种的表达的可调控修饰。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1和/或Serpinb9。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1和/或Serpinb9。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约1000％的量的A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1和/或Serpinb9。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子或CD47由第一外源多核苷酸编码。

在一些实施方案中，细胞包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。

在一些实施方案中，第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的第一和/或第二特异性基因座中。

在一些实施方案中，第一和/或第二特异性基因座选自由安全港基因座、靶基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组。

在一些实施方案中，安全港基因座选自由CCR5基因座、PPP1R12C基因座、Rosa基因座、ROSA26基因座和CLYBL基因座组成的组。

在一些实施方案中，靶基因座选自由CXCR4基因座、ALB基因座、SHS231基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座组成的组。

在一些实施方案中，使用慢病毒载体将第一外源多核苷酸和/或第二外源多核苷酸引入到细胞中。

在一些实施方案中，使用融合原介导的递送或选自由以下各项组成的组的转座酶系统将第一和/或第二外源多核苷酸引入到细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。

在一些实施方案中，本文提供了一种胰岛细胞，相对于对照，具有降低的MHC I类HLA表达和/或降低的MHC II类HLA表达并且表达高至少约1000％的量的CD47。

在一些实施方案中，细胞是表达的CD47的水平是对照中表达的至少约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍的原代β胰岛细胞。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化细胞，其表达相对于对照高至少约10％的量的CD47，或表达的CD47的水平是对照中表达的至少约1.1倍。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％的量的CD47。

在一些实施方案中，细胞是相对于对照表达高至少约1000％或至少约2000％的量的CD47的原代胰岛细胞。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化T细胞，相对于对照，其具有降低的MHCI类HLA表达和/或降低的MHC II类HLA表达并且表达高至少约10％的量的CD47，表达的CD47的水平是对照中表达的至少约1.1倍，或表达至少约170,000个CD47分子。

在一些实施方案中，细胞是相对于对照表达高至少约300％或至少约400％的量的CD47的T细胞。

在一些实施方案中，细胞是表达的CD47的水平是对照中表达的至少约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍的T细胞。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化T细胞，其表达至少约170,000个CD47分子。

在一些实施方案中，T细胞表达至少约180,000个CD47分子、至少约190,000个CD47分子、至少约200,000个CD47分子、至少约210,000个CD47分子、至少约220,000个CD47分子、至少约230,000个CD47分子、至少约240,000个CD47分子、至少约250,000个CD47分子、至少约260,000个CD47分子、至少约270,000个CD47分子、至少约280,000个CD47分子、至少约290,000个CD47分子或至少约300,000个CD47分子。

在一些实施方案中，细胞包含1、2、3、4或5个拷贝的编码CD47的外源多核苷酸。

在一些实施方案中，细胞包含与编码CD47的外源多核苷酸可操作地连接的组成型启动子。

在一些实施方案中，编码CD47的外源多核苷酸通过病毒介导的整合递送至细胞。

在一些实施方案中，病毒介导的整合是慢病毒介导的。

在一些实施方案中，编码CD47的外源多核苷酸通过HDR整合在细胞基因组中的某个位点处。

在一些实施方案中，编码CD47的外源多核苷酸整合到TRAC基因中的基因座、TRBC基因中的基因座或其组合中。

在一些实施方案中，编码CD47的外源多核苷酸整合到至少一个TRAC等位基因、至少一个TRBC等位基因或其组合中。

在一些实施方案中，编码CD47的外源多核苷酸整合到至少两个TRAC等位基因、至少两个TRBC等位基因或其组合中。

在一些实施方案中，细胞包含外源多核苷酸，该外源多核苷酸包含与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性、与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少约85％序列同一性、与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性、与SEQ IDNO:129的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性、与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少约98％的序列同一性、与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少约99％的序列同一性或具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CD47多肽。

在一些实施方案中，细胞包含外源多核苷酸，该外源多核苷酸包含与SEQ ID NO:130的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性、与SEQ ID NO:130的氨基酸序列具有至少约85％序列同一性、与SEQ ID NO:130的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性、与SEQ IDNO:130的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性、与SEQ ID NO:130的氨基酸序列具有至少约98％的序列同一性、与SEQ ID NO:130的氨基酸序列具有至少约99％的序列同一性或具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CD47多肽。

在一些实施方案中，细胞包含相对于对照降低的一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达。

在一些实施方案中，降低的一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达是由对编码MHC I类和/或II类HLA的一种或多种基因的组成型修饰引起的。

在一些实施方案中，细胞包含选自由MHC I类和MHC II类HLA组成的组的靶标的一种或多种敲除。

在一些实施方案中，一种或多种敲除是组成型敲除。

在一些实施方案中，细胞包含相对于对照降低的选自由B2M和CIITA组成的组的一个或多个靶标的表达。

在一些实施方案中，降低的B2M和/或CIITA的表达是由对B2M基因和/或CIITA基因的组成型修饰引起的。

在一些实施方案中，细胞包含选自由B2M和CIITA组成的组的靶标的一种或多种敲除。

在一些实施方案中，细胞包含B2M的两个等位基因和/或CIITA的两个等位基因的敲除。

在一些实施方案中，一种或多种敲除是组成型敲除。

在一些实施方案中，细胞还包含编码一种或多种其他致耐受因子的外源多核苷酸。

在一些实施方案中，一种或多种其他致耐受因子选自由HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CI-抑制剂和IL-35组成的组。

在一些实施方案中，细胞包含相对于对照降低的B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的表达。

在一些实施方案中，细胞是多能干细胞。

在一些实施方案中，多能干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)或胚胎干细胞(ESC)。

在一些实施方案中，细胞是源自多能干细胞或其后代的分化细胞。

在一些实施方案中，分化细胞选自由胰岛细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、CAR-M细胞、内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞和甲状腺细胞组成的组。

在一些实施方案中，细胞是原代细胞或其后代。

在一些实施方案中，原代细胞或其后代是T细胞或NK细胞。

在一些实施方案中，T细胞还包含降低的T细胞受体(TCR)-α和/或TCR-β的表达。

在一些实施方案中，T细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。

在一些实施方案中，T细胞还包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。

在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47表达，以及相对于对照降低的MHC I类和MHC II类人白细胞抗原中的一种或多种的表达。

在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是不表达CD47或低表达CD47的野生型细胞或对照细胞中表达的至少约2倍、约3倍、约4倍或约5倍，并且相对于对照细胞，降低MHCI类和MHC II类人白细胞抗原中的一种或多种的表达。

在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是不表达或低表达CD47的相同细胞类型的野生型细胞或对照细胞中表达的至少约3倍、约4倍或约5倍。

在一些实施方案中，对照细胞是胰岛细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、CAR-M细胞、内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞或甲状腺细胞。

在一些实施方案中，分化细胞或其后代、或原代免疫细胞或其后代在施用至受体患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性，在施用至受体患者后被成熟NK细胞保护免受细胞裂解，在施用至受体患者后逃避巨噬细胞吞噬，在施用至受体患者后不诱导对细胞的先天和/或适应性免疫响应，和/或在施用至受体患者后不诱导对细胞的基于抗体的免疫响应。

在一些实施方案中，细胞是自体细胞。

在一些实施方案中，细胞是同种异体细胞。

在一些实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含本文公开的工程化细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。

在一些实施方案中，工程化细胞是β胰岛细胞，并且药物组合物还包含一种或多种另外的胰岛细胞。

在一些实施方案中，本文提供了一种治疗将受益于基于细胞的疗法的患有疾病或疾患的患者的方法，其包括向患者施用临床有效量或治疗有效量的本文公开的工程化细胞。

在一些实施方案中，本文提供了一种治疗将受益于基于细胞的疗法的患有疾病或疾患的患者的方法，其包括向患者施用包含本文公开的工程化细胞的细胞群。

在一些实施方案中，本文提供了一种治疗将受益于基于细胞的疗法的患有疾病或疾患的患者的方法，其包括向患者施用包含本文公开的分化细胞的细胞群。

在一些实施方案中，本文提供了一种治疗将受益于基于细胞的疗法的患有疾病或疾患的患者的方法，其包括向患者施用本文公开的药物组合物。

在一些实施方案中，疾病或疾患选自由以下各项组成的组：癌症、遗传病症、慢性传染病、自身免疫性病症、神经系统病症、心脏病症(选自由儿科心肌病、年龄相关性心肌病、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、慢性缺血性心肌病、围产期心肌病、炎性心肌病、特发性心肌病、其他心肌病、心肌缺血再灌注损伤、心室功能障碍、心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、终末期心脏病、动脉粥样硬化、局部缺血、高血压、再狭窄、心绞痛、风湿性心脏病、动脉炎症、心血管疾病、心肌梗塞、心肌局部缺血、心肌梗塞、心脏局部缺血、心脏损伤、心肌局部缺血、血管疾病、后天性心脏病、先天性心脏病、冠状动脉疾病、传导系统功能障碍、冠状动脉功能障碍、肺动脉高压、心律失常、肌营养不良、肌肉质量异常、肌肉变性、心肌炎、感染性心肌炎、药物或毒素诱导的肌肉异常、过敏性心肌炎、二尖瓣关闭不全、自身免疫性心内膜炎、原发性心律失常疾病、心脏微血管病、长QT综合征、短QT综合征、布鲁加达综合征、儿茶酚胺能多形性室性心动过速、耶韦尔和兰格-尼尔森综合征(Jervelland Lange-Nielsen syndrome)、心肌梗塞、心力衰竭、心肌病、先天性心脏缺陷、心脏瓣膜疾病或功能障碍、心内膜炎、风湿热、二尖瓣脱垂、感染性心内膜炎、肥厚性心肌病、扩张性心肌病、心肌炎、心脏扩大、二尖瓣关闭不全组成的组)、神经系统病症(选自由阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、佩-梅二氏病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、其他神经退行性疾病或疾患、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、局部缺血、多发性硬化、创伤性脑损伤、癫痫、僵直症、脑炎、脑膜炎、偏头痛、中风、短暂性脑缺血发作、蛛网膜下出血、硬膜下出血、血肿、硬膜外出血、脊髓损伤、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、周围神经病、吉兰-巴雷综合征(Guillan-Barre syndrome)、神经痛、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、τ蛋白病、皮克病(Pickdisease)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、嗜银粒病、贝尔麻痹(Bell’s palsy)、脑瘫、运动神经元疾病、神经纤维瘤病、脑炎、脑膜炎、图雷特氏综合征(Tourette’ssyndrome)、精神分裂症、精神病、抑郁症和其他神经精神病症组成的组)、血管性痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多发性硬化、其他神经退行性疾病或疾患、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、图雷特氏综合征(TS)、精神分裂症、精神病、抑郁症、其他神经精神病症、HIV-1相关神经认知障碍、创伤性脑损伤、中风、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、脑出血、癫痫发作、脊髓损伤、嗜银粒病(AGD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、皮质基底节变性(CBD)、17号染色体相关帕金森氏病(FTDP-17)、多系统萎缩(MSA)、帕金森氏病/弥漫性路易体病(PD/DLBD)或阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化形成、动脉血栓形成、静脉血栓形成、血小板微血管病、血管渗漏、弥漫性血管内凝血、糖尿病、胰岛素抵抗、心血管疾病、血管疾病、周围血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、周围血管阻塞性疾病、中风、再灌注损伤、肢体局部缺血、神经病(例如，周围神经病或糖尿病性神经病)、器官衰竭(例如，肝衰竭、肾衰竭等)、糖尿病、类风湿性关节炎、骨质疏松症、血管损伤、组织损伤、高血压、由冠状动脉疾病引起的心绞痛和心肌梗塞、肾血管性高血压、由肾动脉狭窄引起的肾衰竭、下肢跛行、短暂性脑缺血发作或中风、心肌梗塞和肢体局部缺血、缺血组织的修复、血管和心脏瓣膜的形成、人工血管的工程化、受损血管的修复以及诱导工程化组织中血管的形成(例如，在移植之前)、修复或替换需要血管细胞或血管化的组织、心脏组织、肝脏组织、胰腺组织、肾组织、肌肉组织、神经组织、骨组织等(其可以是受损的并且以过度细胞死亡为特征的组织、有受损风险的组织或人工工程化组织)、冠状动脉疾病、脑血管疾病、主动脉狭窄、主动脉瘤、外周动脉疾病、动脉粥样硬化、静脉曲张、血管病、缺乏冠状动脉灌注的心脏梗塞区域、不愈合伤口、糖尿病或非糖尿病性溃疡、或任何希望诱导血管形成、从而改进在血管重建手术中使用的假体植入物(例如，由诸如Dacron和Gortex的合成材料制成的血管)的其他疾病或病症、选自由血管损伤、心血管疾病、血管疾病、周围血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、周围血管阻塞性疾病、高血压、缺血性组织损伤、再灌注损伤、肢体局部缺血、中风、神经病(例如，周围神经病或糖尿病性神经病)、器官衰竭(例如，肝衰竭、肾衰竭等)、糖尿病、类风湿性关节炎、骨质疏松症、脑血管疾病、高血压、由冠状动脉疾病引起的心绞痛和心肌梗塞、肾血管性高血压、由肾动脉狭窄引起的肾衰竭、下肢跛行、其他血管疾患或疾病组成的组的血管病症、自身免疫性甲状腺炎、甲状腺肿、甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退(先天性或自身免疫性)、甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’sthyroiditis)、产后甲状腺炎、亚急性甲状腺炎、医源性甲状腺功能减退、格雷夫氏病(Grave’s disease)和甲状腺眼病、传染性肝炎(甲型、乙型和丙型)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪肝疾病、肝硬化、血色素沉着病、高草酸尿症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、肝衰竭、威尔逊氏病(Wilson’s disease)、肝性脑病、黄疸、急性肝卟啉症、阿拉吉欧综合征(Alagille syndrome)、胆道闭锁、布特-基亚里综合征(Budd-Chiari syndrome)、高胆红素血症、克里格勒-纳贾尔综合征(Crigler-Najjarsyndrome)、吉尔伯特-莫伊伦格腊赫特综合征(Gilbert-Meulengracht syndrome)、杜宾-约翰逊综合征(Dubin-Johnson syndrome)、罗托综合征(Rotor syndrome)、半乳糖血症、1型糖原贮积病、肝肾综合征、妊娠期肝内胆汁淤积症、进行性家族性肝内胆汁淤积、雷耶氏综合征(Reye’s syndrome)、溶酶体酸性脂酶缺乏症、酒精相关性胰腺炎、胆石性胰腺炎、糖尿病(1型和2型)、前驱糖尿病、妊娠期糖尿病、无胰腺性糖尿病、胰腺外分泌功能不全、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、遗传性胰腺炎、高胰岛素血症、胰腺囊肿、佐林格-埃里森综合征(Zollinger-Ellison syndrome)、史华曼-戴蒙德综合征(Shwachman-Diamond syndrome)、遗传性血色素沉着症、地中海贫血、胰腺铁沉积、囊性纤维化、胰腺分裂和胰腺切除、黄斑变性或具有受损RPE细胞的患者、年龄相关性黄斑变性(AMD)、早期AMD、中期AMD、晚期AMD、非新生血管性年龄相关性黄斑变性、干性黄斑变性(干性年龄相关性黄斑变性)、湿性黄斑变性(湿性年龄相关性黄斑变性)、成人发病的卵黄样黄斑营养不良(AVMD)、贝斯特卵黄样黄斑营养不良、斯塔加特样黄斑营养不良(STGD3)、索尔比氏眼底营养不良(SFD)、ABCA4相关疾病、Usher IB型、常染色体隐性遗传性黄斑变性、常染色体显性玻璃体视网膜脉络膜病、幼年型黄斑变性(JMD)、莱伯先天性黑蒙(Leber's Congenital Amaurosis)或色素性视网膜炎、视网膜脱离、视网膜撕裂、严重联合免疫缺陷(SCID)、奥门综合征(Omenn syndrome)、软骨-毛发发育不全、网状发育不全、维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrichsyndrome)、共济失调性毛细血管扩张症、迪乔治综合征(DiGeorge syndrome)、免疫性骨发育不良、先天性角化不良、慢性皮肤粘膜念珠菌病、恶性血液病、滤泡性淋巴瘤(FL)、骨髓肿瘤、成熟T/NK肿瘤、组织细胞肿瘤、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)、华氏巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、伯基特淋巴瘤(BL)(Burkitt lymphoma)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBL)、霍奇金淋巴瘤()、套细胞淋巴瘤(MCL)、毛细胞白血病(HCL)、骨髓增生性/骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴性白血病(T-ALL)、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、自身免疫性疾病包括例如狼疮、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病(Crohn’sdisease)、溃疡性结肠炎、阿狄森氏病(Addison’s disease)、格雷夫斯病、舍格伦氏综合征(syndrome)、桥本氏甲状腺炎、1型糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、乳糜泻、癌症包括但不限于B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌、膀胱癌、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、自身免疫性肝病、舍格伦氏综合征、类风湿性关节炎、系统性硬化症(硬皮病)、器官特异性自身免疫性疾病(自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎)、酒精相关性肝病、多发性硬化、NK细胞缺陷(NKD)(功能性(FNKD)或经典型(CNKD))、X连锁免疫缺陷多内分泌腺病肠病(IPEX)样综合征、布卢姆综合征(Bloom syndrome)、范可尼氏贫血(Fanconi’s anemia)、先天性角化不良、谢迪埃克-赫加希综合征(Chediak-Higashi syndrome)、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(FHL)、格里瑟里综合征2型(Griscelli syndrome type 2)、赫曼斯基-普德拉克综合征(HermanskyPudliak syndrome)、帕-勒氏综合征(Papillon-Lefevre syndrome)、维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、常染色体隐性高IgE综合征、梅-海二氏异常(MayHegglin anomaly)以及I型或III型白细胞粘附缺陷。

在一些实施方案中，分化细胞选自由以下细胞组成的组：间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)、胰岛细胞、β胰岛细胞、免疫细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、巨噬细胞、免疫特权细胞、视细胞、视网膜色素上皮细胞(RPE)、肝细胞、甲状腺细胞、内皮细胞、皮肤细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、肌细胞、心脏细胞和血细胞。

在一些实施方案中，在施用细胞群之前不向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。

在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，其中患者已被施用一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂是小分子或抗体。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂选自由以下各项组成的组：环孢菌素、硫唑嘌呤、霉酚酸、吗替麦考酚酯、皮质类固醇、泼尼松、甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺吡啶、抗疟药、布喹那、来氟米特、咪唑立宾、15-脱氧精胍菌素、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素、他克莫司(FK-506)、OKT3、抗胸腺细胞球蛋白、胸腺五肽(胸腺素-α)和免疫抑制抗体。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括环孢菌素。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括吗替麦考酚酯。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括皮质类固醇。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括环磷酰胺。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括雷帕霉素。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括他克莫司(FK-506)。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括抗胸腺细胞球蛋白。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂是一种或多种免疫调节剂。

在一些实施方案中，一种或多种免疫调节剂是小分子或抗体。

在一些实施方案中，抗体结合至选自由以下各项组成的组的受体或配体中的一种或多种：IL-2受体的p75、MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-6、IGF、IGFR1、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a、CD58和结合它们的任何配体的抗体。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂在施用工程化细胞前施用至或已施用至患者。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂在施用工程化细胞前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天施用至或已施用至患者。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂在施用工程化细胞前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间施用至或已施用至患者。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂在施用工程化细胞后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天施用至或已施用至患者。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂在施用工程化细胞后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间施用至或已施用至患者。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂在第一次施用工程化细胞的同一天施用至或已施用至患者。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂在施用工程化细胞后施用至或已施用至患者。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂在第一次和/或第二次施用工程化细胞后施用至或已施用至患者。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂在第一次和/或第二次施用工程化细胞前施用至或已施用至患者。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂在第一次和/或第二次施用工程化细胞前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天施用至或已施用至患者。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂在第一次和/或第二次施用工程化细胞前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间施用至或已施用至患者。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂在第一次和/或第二次施用工程化细胞后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天施用至或已施用至患者。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂在第一次和/或第二次施用工程化细胞后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间施用至或已施用至患者。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂的施用剂量低于为减少不包含工程化细胞的修饰的免疫原性细胞的免疫排斥而施用的一种或多种免疫抑制剂的剂量。

在一些实施方案中，本文提供了本文公开的工程化细胞群用于治疗将受益于基于细胞的疗法的受体患者的病症或疾患的用途。

在一些实施方案中，本文提供了一种用于产生本文公开的工程化细胞或包含本文公开的工程化细胞的细胞群的方法，该方法包括：(a)获得分离的细胞；以及(b)将分离的细胞与一种或多种试剂和/或组分接触以修饰分离的细胞中的基因表达，从而产生工程化细胞或包含工程化细胞的细胞群。

在一些实施方案中，该方法还包括确定工程化细胞或细胞群的CD47表达水平。

在一些实施方案中，该方法还包括如果确定工程化细胞或细胞群以阈值水平或更高水平表达CD47，则选择工程化细胞或细胞群用于生产治疗产品。

在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群相对于对照表达至少大约相同量的CD47。

在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群相对于对照表达高至少约10％的量的CD47。

在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群相对于对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的CD47。

在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群相对于对照表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的CD47。

在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群相对于对照表达高至少约1000％的量的CD47。

在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群表达的CD47水平是对照中表达的至少约1.1倍。

在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群表达的CD47水平是对照中表达的至少约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍。

在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群表达的CD47水平是对照中表达的至少约4倍、约4.5倍、约5倍或约5.5倍。

在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群表达的CD47水平是对照中表达的至少约4倍。

在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群表达的CD47水平是对照中表达的至少约4.5倍。

在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群表达的CD47水平是对照中表达的至少约5倍。

在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群表达的CD47水平是对照中表达的至少约5.5倍。

在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群表达的CD47水平是对照中表达的至少约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍。

在一些实施方案中，对照是野生型细胞或野生型细胞群、对照细胞或对照细胞群、或基线参考。

在一些实施方案中，对照细胞或对照细胞群包含未修饰的或未改变的细胞，任选地其中该未修饰的或未改变的细胞与工程化细胞属于相同的细胞类型。

在一些实施方案中，对照细胞或对照细胞群是来自供体的起始材料或来自供体库的起始细胞库。

在一些实施方案中，工程化细胞是β胰岛细胞，并且细胞群包含β胰岛细胞和另外的胰岛细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞包含相对于对照改变工程化细胞中一个或多个靶标的表达的可调控修饰。

在一些实施方案中，相对于野生型细胞、野生型细胞群、对照细胞或对照细胞群，可调控修饰降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达。

在一些实施方案中，相对于野生型细胞、野生型细胞群、对照细胞或对照细胞群，可调控修饰增加一种或多种致耐受因子的表达。

在一些实施方案中，修饰分离的细胞中基因表达的一种或多种试剂包含i)改变一个或多个靶标的表达的条件性或诱导型基于RNA的组分，ii)改变一个或多个靶标的表达的条件性或诱导型基于DNA的组分，或iii)改变一个或多个靶标的表达的条件性或诱导型基于蛋白质的组分。

在一些实施方案中，该方法还包括将分离的细胞与外源因子接触或将分离的细胞暴露于一定条件以活化条件性或诱导型启动子，从而引起一个或多个靶标的表达，从而产生工程化细胞。

在一些实施方案中，本文提供了一种用于产生工程化细胞的方法，该工程化细胞包含可调控修饰，这些可调控修饰相对于对照i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加一种或多种致耐受因子的表达，该方法包括：(a)获得分离的细胞；(b)向细胞中引入用于MHC I类和/或MHC II类人白细胞分子的可调控的降低的表达的条件性或诱导型基于RNA的组分、用于MHC I类和/或MHC II类人白细胞分子的可调控的降低的表达的条件性或诱导型基于DNA的组分、或用于MHC I类和/或MHC II类人白细胞分子的可调控的降低的表达的条件性或诱导型基于蛋白质的组分；(c)将细胞暴露于一定条件或外源因子以活化条件性或诱导型组分，从而导致MHC I类和/或MHC类分子的表达降低；(d)向分离的细胞中引入包含与编码一种或多种致耐受因子的外源多核苷酸可操作地连接的条件性或诱导型启动子的核酸，用于可调控地增加一种或多种致耐受因子的表达；以及(e)将工程化细胞暴露于一定条件或外源因子以活化条件性或诱导型启动子，从而引起外源的一种或多种致耐受因子的表达，并从而产生工程化细胞。

在一些实施方案中，步骤(a)-(d)以任何顺序进行。

在一些实施方案中，步骤(a)-(d)中的一个或多个同时进行。

在一些实施方案中，步骤(b)和(c)在步骤(d)和(e)之前进行。

在一些实施方案中，步骤(d)和(e)在步骤(b)和(c)之前进行。

在一些实施方案中，步骤(c)和(e)依序进行。

在一些实施方案中，步骤(c)和(e)同时进行。

在一些实施方案中，本文提供了一种用于鉴定适合用作治疗产品的细胞群或包含本文公开的工程化细胞的细胞群的方法，该方法包括：(a)获得分离的细胞；(b)向细胞中引入相对于对照降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达的一种或多种修饰；(c)向细胞中引入相对于对照增加CD47的表达的一种或多种修饰；(d)测量细胞的CD47表达水平；以及(e)选择相对于对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47的细胞群，并鉴定该群适合用作治疗产品。

在一些实施方案中，本文提供了一种用于鉴定适合用作治疗产品的细胞群或包含本文公开的工程化细胞的细胞群的方法，该方法包括：(a)获得分离的细胞；(b)向细胞中引入相对于对照降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达的一种或多种修饰；(c)向细胞中引入相对于对照增加CD47的表达的一种或多种修饰；(d)测量细胞的CD47表达水平；以及(e)选择表达的CD47水平是对照中表达的至少约1.1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍的细胞群，并鉴定该群适合用作治疗产品。

在一些实施方案中，步骤(b)在步骤(c)之前进行。

在一些实施方案中，步骤(c)在步骤(b)之前进行。

在一些实施方案中，步骤(b)和(c)同时进行。

在一些实施方案中，本文提供了一种确定细胞群是否适合用作治疗产品的方法，该方法包括：(a)产生包含编码CD47的第一外源多核苷酸的工程化细胞，任选地本文公开的工程化细胞；(b)测量细胞的CD47表达水平；以及(c)如果细胞相对于对照以高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47表达，则确定该细胞群适合用作治疗产品。

在一些实施方案中，本文提供了一种确定细胞群是否适合用作治疗产品的方法，该方法包括：(a)产生包含编码CD47的第一外源多核苷酸的工程化细胞，任选地本文公开的工程化细胞；(b)测量细胞的CD47表达水平；以及(c)如果细胞表达的CD47的水平是对照中表达的至少约1.1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍，则确定该细胞群适合用作治疗产品。

在一些实施方案中，本文提供了一种确定低免疫原性细胞免疫逃避所需的CD47表达水平的阈值的方法，该方法包括：(a)产生包含编码CD47的第一外源多核苷酸的工程化细胞；(b)基于CD47表达水平分选工程化细胞，以产生具有相似CD47表达水平的细胞库；(c)评估由细胞库诱导的免疫响应；以及(d)确定免疫逃避所需的CD47表达水平的阈值。

在一些实施方案中，该方法的步骤(a)还包括将细胞工程化以使其包含相对于野生型细胞或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因和主要组织相容性复合物(MHC)I类和/或II类人白细胞抗原的表达。

在一些实施方案中，免疫响应的评估是使用体外测定法或体内测定法进行的。

在一些实施方案中，免疫响应的评估是通过测量NK细胞介导的细胞毒性、成熟NK细胞的裂解、巨噬细胞吞噬、对细胞的基于抗体的免疫响应或通过测量在施用至受体患者一定时间后仍然存在于受体中的细胞的百分比进行的。

在一些实施方案中，本文提供了一种用于鉴定适合用作治疗产品的细胞群或包含本文公开的工程化细胞的细胞群的方法，该方法包括：(a)向分离的细胞中引入相对于对照降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达的一种或多种修饰，以及(b)向细胞中引入相对于对照增加CD47的表达的一种或多种修饰。

在一些实施方案中，该方法还包括步骤(c)测量细胞的CD47表达水平。

在一些实施方案中，该方法还包括步骤(d)选择相对于对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47的细胞群，并鉴定该群适合用作治疗产品。

在一些实施方案中，该方法还包括步骤(d)选择表达的CD47的水平是对照中表达的至少约1.1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍的细胞群，并鉴定该群适合用作治疗产品。

在一些实施方案中，步骤(a)在步骤(b)之前进行。

在一些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前进行。

在一些实施方案中，步骤(a)和(b)同时进行。

低免疫原性细胞、其生产方法及其使用方法的详细描述可见于2020年8月13日提交的美国临时申请号63/065,342、2020年12月31日提交的美国临时申请号63/136,152、2021年4月14日提交的美国临时申请号63/175,030、2021年4月14日提交的美国临时申请号63/175,003和2021年1月11日提交的美国临时申请(代理人案卷号18615-30046.00)、2015年5月9日提交的WO2016/183041、2018年1月14日提交的WO2018/132783、2019年7月17日提交的WO2020/018615、2019年7月17日提交的WO2020/018620、2020年2月16日提交的WO2020/168317、2021年4月27日提交的PCT/US2021/029443，这些申请的包括实施例、序列表和附图在内的公开内容通过引用整体并入本文。

附图说明

图1A、图1C、图1E、图1G、图1I、图1K和图1M描绘了测量从分离自B2M敲除C57BL/6(B6)小鼠的β胰岛细胞产生然后用含有CD47转基因的慢病毒转导的原代小鼠B2M^-/-、CD47tgβ胰岛细胞的细胞表面上的CD47水平的流式细胞术数据。用B2M^-/-、CD47tgβ胰岛细胞评估各种MOI。将CD47水平与同种型对照(左侧)进行比较。图1B、图1D、图1F、图1H、图1J、图1L和图1N描绘了小鼠NK细胞对B2M^-/-、CD47tgβ胰岛细胞的NK细胞介导的杀伤的数据。

图2A至图2AB描绘了来自NK细胞和巨噬细胞对B2M^-/-、CD47tg T细胞的NK细胞和巨噬细胞介导的杀伤或缺乏的Xelligence测定的数据。

图3A至图3L描绘了来自NK细胞对B2M^-/-、CD47tg T细胞的NK细胞介导的杀伤或缺乏的Xelligence测定的数据。

图4A至图4C描绘了测量未修饰的原代RPE细胞的细胞表面上的HLA-I、HLA-II和CD47水平的流式细胞术数据。

图5A至图5D描绘了测量B2M^-/-、CIITA^-/-、CD47tg原代RPE细胞的细胞表面上的HLA-I、HLA-II和CD47水平的细胞形态学(图5A)和流式细胞术(图5B至图5D)数据。

图6A至图6I描绘了测量未修饰的(6A-6C)、B2M^-/-、CIITA^-/-(6D-6F)和B2M^-/-、CIITA^-/-、CD47tg(6G-6I)原代RPE细胞的细胞表面上的HLA-I、HLA-II和CD47水平的流式细胞术数据。

图7A至图7I描绘了来自NK细胞和巨噬细胞对未修饰的(7A-7C)、B2M^-/-、CIITA^-/-(7D-7F)和B2M^-/-、CIITA^-/-、CD47tg(7G-7I)原代RPE细胞的NK细胞和巨噬细胞介导的杀伤或缺乏的Xelligence测定的数据。

本公开的其他目的、优点和实施方案将从以下具体实施方式中显而易见。

具体实施方式

I.引言

本文描述的是部分基于WO2018132783和2021年12月23日提交的PCT/US21/65157中描述的低免疫编辑平台的工程化或修饰的免疫逃避细胞，包括但不限于人免疫逃避细胞，这两篇文献每一篇以引用方式整体并入本文。为了克服受试者对这些原代和/或干细胞衍生的移植物的免疫排斥的问题，本发明人已开发并在本文中描述了代表任何可移植细胞类型的可行来源的低免疫原性细胞(例如，低免疫原性多能细胞、源自此类的分化细胞和原代细胞)。此类细胞在向受体受试者施用后受到保护而免于适应性和/或先天免疫排斥。有利地，无论受试者的基因构成如何，本文公开的细胞均不会被受体受试者的免疫系统排斥，因为它们在向受体受试者施用后受到保护而免于适应性和先天免疫排斥。在一些实施方案中，低免疫原性细胞可调控地缺乏一种或多种MHC I类和II类抗原分子和/或T细胞受体的表达。在某些实施方案中，低免疫原性细胞可调控地缺乏主要组织相容性复合物(MHC)I和II抗原分子和/或T细胞受体的表达，并且可调控地过表达一种或多种致耐受因子。在某些实施方案中，低免疫原性细胞诸如低免疫原性T细胞可调控地缺乏一种或多种MHC I和II抗原分子和/或T细胞受体的表达，可调控地过表达CD47和可调控地表达CAR。在一些实施方案中，低免疫原性细胞可调控地缺乏一种或多种MHC I和II抗原分子和/或T细胞受体和/或一种或多种Y染色体基因的表达。在某些实施方案中，低免疫原性细胞可调控地缺乏一种或多种MHC I和II抗原分子和/或T细胞受体和/或一种或多种Y染色体基因的表达，并且可调控地过表达CD47。在某些实施方案中，低免疫原性细胞可调控地缺乏一种或多种MHC I和II抗原分子和/或T细胞受体和/或RHD的表达，并且可调控地过表达CD47蛋白。在某些实施方案中，低免疫原性细胞可调控地缺乏一种或多种MHC I和II抗原分子和/或T细胞受体和/或ABO的表达，并且可调控地过表达CD47蛋白。在某些实施方案中，低免疫原性细胞可调控地缺乏一种或多种MHC I和II抗原分子和/或T细胞受体和/或MICA的表达，并且可调控地过表达CD47蛋白。在某些实施方案中，低免疫原性细胞可调控地缺乏一种或多种MHC I和II抗原分子和/或T细胞受体和/或MICB的表达，并且可调控地过表达CD47蛋白。在某些实施方案中，低免疫原性细胞诸如低免疫原性T细胞可调控地缺乏一种或多种MHC I和II抗原分子和/或T细胞受体和/或一种或多种Y染色体基因的表达，可调控地过表达CD47和可调控地表达CAR。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞不经受先天免疫细胞排斥。在一些情况下，低免疫原性细胞对NK细胞介导的裂解不敏感。在一些情况下，低免疫原性细胞对巨噬细胞吞噬不敏感。在一些实施方案中，低免疫原性细胞可用作普遍相容的细胞或组织(例如，通用供体细胞或组织)的来源，所述细胞或组织被移植到受体受试者中而几乎不需要免疫抑制剂。此类低免疫原性细胞在移植后保留细胞特异性特征和特性，包括例如多能性，以及能够植入和与对应的天然细胞类似地发挥作用。

本文公开的技术利用人细胞中致耐受因子的可调控的表达和MHC I分子、MHC II分子的可调控的调节(例如，降低或消除)和/或TCR表达。在一些实施方案中，利用可调控的罕见切割核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和归巢核酸内切酶系统)的可调控基因组编辑技术也用于减低或消除细胞中参与先天和/或适应性免疫响应的基因的表达(例如，通过缺失参与先天和/或适应性免疫响应的基因的基因组DNA或通过将基因组DNA插入此类基因中，从而影响基因表达)。在一些实施方案中，可调控的基因组编辑技术或其他基因调节技术用于在人细胞中插入耐受诱导(耐受原性)因子，使得细胞及其后代(包括由其制备的任何分化细胞)能够在移植到受体受试者中后逃避免疫识别。因此，本文所述的细胞表现出影响MHC I分子、MHC II分子和/或TCR表达的一种或多种基因和因子的可调控的调节表达，并逃避受体受试者的免疫系统。

令人惊讶地发现，一些过表达外源多核苷酸的转基因可以在iPSC和原代细胞分化为例如工程化的低免疫原性分化细胞的过程中变得沉默。因此，本公开提供了允许外源多核苷酸的可调控表达的系统。还发现，在产生分化细胞(例如，工程化的低免疫原性分化细胞)之前不需要降低一种或多种MHC I分子、MHC II分子和/或TCR的表达。因此，本公开还提供了允许可调控地敲除或敲低MHC I分子、MHC II分子和/或TCR的系统。

基因组编辑技术能够在期望的基因座位点处实现双链DNA断裂。这些受控的双链断裂促进特定基因座位点处的同源重组。此过程聚焦于用识别并且结合至核酸分子的特定序列并且在核酸分子内诱导双链断裂的核酸内切酶来靶向所述特定序列(诸如染色体)。通过易错的非同源末端连接(NHEJ)或通过同源重组(HR)来修复双链断裂。

除非另有明确相反的指示，否则多个实施方案的实践将采用化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，所述方法在本领域的技术范围内，其中许多方法出于说明目的在下文中描述。此类技术在文献中充分解释。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第3版,2001)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,2008年7月更新)；ShortProtocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover,DNACloning:A Practical Approach,第I和II卷(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins编辑,1984)；Perbal,APractical Guide to Molecular Cloning(1984)；Harlow和Lane,Antibodies,(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)；CurrentProtocols in Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober编辑,1991)；Annual Review of Immunology；以及期刊诸如Advances inImmunology上的专题论文。

II.定义

如本公开中所述，将采用以下术语，并且所述术语如下所述定义。

如本文所用，术语“抗原”是指能够激发免疫响应的分子。抗原包括但不限于细胞、细胞提取物、蛋白质、多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖和其他分子的肽和非肽模拟物、小分子、脂质、糖脂、碳水化合物、病毒和病毒提取物以及多细胞生物体诸如寄生虫和过敏原。术语抗原广泛地包括被宿主免疫系统识别为外源的任何类型的分子。

术语“自身免疫性疾病”或“自身免疫性病症”或“炎性疾病”或“炎性病症”是指其中受试者针对其自身组织和/或细胞产生先天和/或适应性免疫响应的任何疾病或病症。自身免疫性病症可以影响受试者(例如，人)的几乎每个器官系统，包括但不限于神经、胃肠和内分泌系统以及皮肤和其他结缔组织、眼睛、血液和血管的疾病。自身免疫性疾病的实例包括但不限于桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、系统性红斑狼疮、舍格伦氏综合征(Sjogren's syndrome)、格雷夫斯病(Graves'disease)、硬皮病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力和糖尿病。

如本文所用的术语“癌症”被定义为细胞的过度增殖，其独特特征(例如，失去正常控制)导致不受调控的生长、缺乏分化、局部组织侵袭和转移。关于本发明的方法，癌症可以是任何癌症，包括以下癌症中的任一种：急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠癌、食道癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌肿瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜、大网膜和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和/或尿膀胱癌。如本文所用，除非另有明确说明，否则术语“肿瘤”是指恶性类型的细胞或组织的异常生长，并且不包括良性类型组织。

术语“慢性感染性疾病”是指由感染原引起的疾病，其中感染持续存在。这样的疾病可包括肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HSV-6、HSV-II、CMV和EBV)和HIV/AIDS。非病毒的实例可包括慢性真菌病，诸如曲霉病、念珠菌病、球孢子菌病以及与隐球菌和组织胞浆菌病相关的疾病。慢性细菌感染原的非限制性实例可以是肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogene)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。在一些实施方案中，该病症是人免疫缺陷病毒(HIV)感染。在一些实施方案中，病症是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。

如本文所用，“临床有效量”是指足以在疾病、病症或疾患的治疗和/或管理中提供临床益处的量。在一些实施方案中，临床有效量是已显示对疾病、病症或疾患的护理标准产生至少一个改进的临床终点的量。在一些实施方案中，临床有效量是例如在临床试验中已证明足以为治疗疾病、病症或疾患提供统计上显著和有意义的有效性的量。在一些实施方案中，临床有效量也是治疗有效量。在其他实施方案中，临床有效量不是治疗有效量。

如本文所用，“条件性启动子”在某些细胞条件下或在某些细胞阶段下具有活性。如本文所用，条件性启动子包括例如细胞特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子、发育特异性启动子、细胞分化特异性启动子、分化诱导型启动子、细胞周期特异性启动子和细胞阶段特异性启动子。“细胞特异性启动子”、“组织特异性启动子”和“谱系特异性启动子”是使核苷酸序列在特定细胞、组织或谱系类型中表达的启动子，该特定细胞、组织或谱系类型例如呼吸、前列腺、胰腺、乳腺、肾、肠、神经、骨骼、血管、肝、造血、肌肉、内皮、上皮或心脏细胞。使得核苷酸序列在发育或细胞分化的特定阶段表达的启动子通常称为“发育特异性启动子”、“细胞分化特异性启动子”或“分化诱导型启动子”，并且包括例如当细胞从一种细胞类型转变为另一种细胞类型，例如从未分化的细胞转变为分化的细胞，例如从干细胞转变为多能祖细胞、从多能祖细胞转变为谱系定型祖细胞、从谱系定型祖细胞转变为前体细胞或从前体细胞转变为成熟细胞时被活化或失活的启动子。使得核苷酸序列在细胞周期的特定阶段表达的启动子通常称为“细胞周期特异性启动子”或“细胞阶段特异性启动子”。许多标准条件性启动子是本领域技术人员已知的。

“组成型启动子”在大多数条件下通常是活性的，即促进转录。在一些实例中，组成型启动子能够在不存在刺激(例如，热休克、化学品等)的情况下指导可操作地连接的核酸序列的转录。在一些实例中，组成型启动子在大多数时间在大多数细胞类型中是活性的。许多标准条件性启动子是本领域技术人员已知的。组成型启动子包括在本文中作为“可调控启动子”的一种类型。

在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰(包括例如遗传改变或修饰)导致靶标或选择的多核苷酸序列的表达降低。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致靶标或选择的多肽序列的表达降低。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致靶标或选择的多核苷酸序列的表达增加。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致靶标或选择的多肽序列的表达增加。术语“减少(decrease)”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”和“减少(decrease)”在本文中均一般用于意指减少统计上显著的量。然而，为避免疑问，“减少(decrease)”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”、“减少(decrease)”意指与参考水平相比减少至少10％，例如与参考水平相比减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多并包括100％减少(即，与参考样品相比不存在的水平)或在10-100％之间的任何减少。在一些实施方案中，细胞经工程化以相对于未改变或未修饰的野生型细胞具有降低的一个或多个靶标的表达。

在另外的或替代的实施方案中，本公开考虑以技术人员可用的任何方式改变靶标多核苷酸序列，例如利用TALEN系统或RNA引导的转座酶。应当理解，尽管本文详细描述了利用CRISPR/Cas(例如，Cas9和Cas12a)和TALEN的方法的实例，但本公开不限于这些方法/系统的使用。本文可以利用技术人员已知的降低或消除靶细胞中的表达的其他靶向例如B2M的方法。

如本文所用，“降解决定子元件”是指调控蛋白质降解的蛋白质亚基。在一些情况下，降解决定子包含提供指导多肽进行细胞降解的降解信号的氨基酸序列。降解决定子可通过蛋白酶体或自噬-溶酶体途径促进附着多肽的降解。在融合蛋白中，降解决定子必须可操作地连接到感兴趣多肽，但不需要与其邻接，只要降解决定子仍然起作用以指导感兴趣多肽降解即可。优选地，降解决定子诱导感兴趣多肽快速降解。有关降解决定子及其在蛋白质降解中的功能的讨论，参见例如Kanemaki等人(2013)Pflugers Arch.465(3):419-425、Erales等人(2014)Biochim Biophys Acta 1843(1):216-221、Schrader等人(2009)Nat.Chem.Biol.5(11):815-822、Ravid等人(2008)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.9(9):679-690、Tasaki等人(2007)Trends Biochem Sci.32(11):520-528、Meinnel等人(2006)Biol.Chem.387(7):839-851、Kim等人(2013)Autophagy 9(7):1100-1103、Varshaysky(2012)Methods Mol.Biol.832:1-11以及Fayadat等人(2003)Mol Biol Cell.14(3):1268-1278，这些内容以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，所述的工程化和低免疫原性细胞来源于iPSC或其后代。如本文所用，术语“来源于iPSC或其后代”涵盖生成的初始iPSC及其任何后续后代。如本文所用，术语“后代”涵盖例如第一代后代，即通过例如传统繁殖方法直接来源于、获得自、可获得自或可来源于初始iPSC的后代。术语“后代”还涵盖另外的世代，诸如第二代、第三代、第四代、第五代、第六代、第七代或更多代，即通过例如传统繁殖方法来源于、获得自、可获得自或可来源于前一代的细胞世代。术语“后代”还涵盖由于初始iPSC或其后代的修饰或改变而产生的修饰的细胞。

术语“供体受试者”是指动物，例如，可以从其获得细胞的人。如本文可互换使用的，“非人动物”和“非人哺乳动物”包括哺乳动物诸如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人灵长类动物。术语“供体受试者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，供体受试者是哺乳动物诸如人或其他哺乳动物(诸如家养哺乳动物例如狗、猫、马等，或生产哺乳动物例如牛、羊、猪等)。“供体受试者”还可以指多于一个供体，例如一个或多个人或非人动物或非人哺乳动物。

术语“内源”是指天然存在于细胞中的参考分子或多肽。类似地，当用于提及编码核酸的表达时，所述术语是指天然包含在细胞内并且不是外源引入的编码核酸的表达。类似地，当用于提及启动子序列时，所述术语是指天然包含在细胞内并且不是外源引入的启动子序列。

如本文所用的术语“工程化细胞”是指已经通过人为干预以至少一些方式改变的细胞，所述人为干预包括例如通过遗传改变或修饰，使得工程化细胞不同于野生型细胞。

如本文所用，在表达的多核苷酸或多肽的上下文中，术语“外源”旨在意指将所提及的分子或所提及的多肽引入到感兴趣的细胞中。可以例如通过将编码核酸引入到细胞的遗传物质中(诸如通过整合到染色体中)或者作为非染色体遗传物质(诸如质粒或表达载体)来引入多肽。因此，当用于提及编码核酸的表达时，所述术语是指将编码核酸以可表达的形式引入到细胞中。

“外源”分子是细胞中通常不存在，但可以通过一种或多种遗传、生化或其他方法引入到细胞中的分子、构建体、因子等。“细胞中通常存在”是相对于细胞的特定发育阶段和环境条件确定的。因此，例如，仅在神经元胚胎发育期间存在的分子相对于成体神经元细胞是外源分子。外源分子可以包括例如功能失常的内源分子的功能型式或功能正常的内源分子的功能失常型式。

除其他外，外源分子或因子可以是诸如通过组合化学过程生成的小分子，或者可以是大分子，诸如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何修饰的衍生物或包含上述分子中的一种或多种的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链的；可以是直链、支链或环状的；并且可以是任意长度。核酸包括那些能够形成双链体的核酸，以及形成三链体的核酸。参见例如美国专利号5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙酰化酶、去乙酰化酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解旋酶。

外源分子或构建体可以是与内源分子相同类型的分子，例如外源蛋白质或核酸。在此类情况下，将外源分子以比细胞中内源分子更高的浓度引入到细胞中。在一些情况下，外源核酸可以包含感染病毒基因组、引入到细胞中的质粒或附加体或者细胞中通常不存在的染色体。用于将外源分子引入到细胞中的方法是本领域技术人员已知的并且包括但不限于脂质介导的转移(即，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。

如本文所用，“融合体”包括基因治疗载体，该基因治疗载体包含用工程化融合原假型化的逆转录病毒载体，该工程化融合原包含修饰成包含靶向部分的G蛋白和被隐蔽而不再识别其同源受体的F蛋白。在一些实施方案中，融合原蛋白复合物来自副黏病毒，任选地其中该副黏病毒是尼帕病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒载体是慢病毒载体。

出于本公开的目的，“基因”包括编码基因产物的DNA区域，以及调控基因产物的产生的所有DNA区域，无论此类调控序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列，诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点及/或基因座控制区。

“基因表达”是指将包含在基因中的信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑的过程修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、豆蔻酰化和/或糖基化修饰的蛋白质。

如本文所用的术语“遗传修饰”及其语法等同物可以指代核酸(例如生物体基因组内的核酸)的一种或多种改变。例如，遗传修饰可以指代基因或基因部分或其他核酸序列的改变、添加和/或缺失。遗传修饰的细胞还可以指代具有添加的、缺失的和/或改变的基因或基因部分的细胞。遗传修饰的细胞还可以指代添加了不是基因或基因部分的核酸序列的细胞。遗传修饰包括，例如，瞬时敲入或敲低机制，以及导致靶基因或基因部分或核酸序列的永久敲入、敲低或敲除的机制。遗传修饰包括，例如，瞬时敲入，以及导致核酸序列的永久敲入的机制。遗传修饰还包括，例如，降低或增加的转录、降低或增加的mRNA稳定性、降低或增加的翻译以及降低或增加的蛋白质稳定性。

如本文所用，术语“移植(grafting)”、“施用”、“引入”、“植入”和“移植(transplanting)”以及它们的语法变体在通过导致引入的细胞定位或至少部分定位在期望部位或全身引入(例如，进入循环)的方法或途径将细胞(例如，本文所述的细胞)置于受试者中的上下文中可互换使用。可以将细胞直接植入期望部位，或通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者的期望部位，在所述位置中，植入的细胞或细胞组分中的至少一部分保持存活。在向受试者施用后细胞的生存期可以短至几小时(例如，二十四小时)至几天，甚至长达若干年。在一些实施方案中，细胞还可例如以胶囊形式施用(例如，注射)到期望部位以外的位置，诸如在脑中或皮下，以将植入的细胞维持在植入位置并且避免植入的细胞迁移。

“HLA”或“人白细胞抗原”或“HLA分子”或“人白细胞抗原分子”复合物是编码人MHC蛋白的基因复合物。构成HLA复合物的这些细胞表面蛋白负责调控对抗原的免疫响应。在人类中，存在两种MHC，即I类分子和II类分子，“HLA-I”和“HLA-II”，或“HLA-I分子”和“HLA-II分子”。HLA-I包括三种蛋白质，即HLA-A、HLA-B和HLA-C，所述三种蛋白质呈递来自细胞内的肽，并且由HLA-I复合物呈递的抗原吸引杀伤T细胞(也称为CD8+ T细胞或细胞毒性T细胞)。HLA-I蛋白与β-2微球蛋白(B2M)相关。HLA-II包括五种蛋白质，即HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR，它们将来自细胞外的抗原呈递给T淋巴细胞。这会刺激CD4+细胞(也称为辅助T细胞)。应当理解，“MHC”或“HLA”的使用并不意味着限制，因为它取决于基因是来自人(HLA)还是来自鼠(MHC)。因此，当它涉及哺乳动物细胞时，这些术语在本文中可互换使用。

当在本文中用于表征细胞时，术语“免疫特权的”和“低免疫原性的”可互换使用，并且通常意指此类细胞较不易受到移植此类细胞的受试者先天或适应性免疫排斥，例如，该细胞较不易收到移植此类细胞的受试者同种异体排斥。例如，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，这种低免疫原性细胞可能约2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更不太容易受到被移植此类细胞的受试者的先天或适应性免疫排斥。在一些实施方案中，基因组编辑技术用于调节一种或多种MHC I和MHC II基因的表达，并因此有助于产生低免疫原性细胞。在一些实施方案中，低免疫原性细胞在MHC错配的同种异体受体中逃避免疫排斥。在一些情况下，当向MHC错配的同种异体受体施用(例如，移植或植入)时，由本文概述的低免疫原性干细胞产生的分化细胞逃避免疫排斥。在一些实施方案中，低免疫原性细胞受到保护而免于T细胞介导的适应性免疫排斥和/或先天免疫细胞排斥。低免疫原性细胞、其产生方法及其使用方法的详细描述可见于2015年5月9日提交的WO2016183041、2018年1月14日提交的WO2018132783、2018年3月20日提交的WO2018176390、2019年7月17日提交的WO2020018615、2019年7月17日提交的WO2020018620、2020年7月31日提交的PCT/US2020/44635、2020年7月31日提交的WO2021022223、2020年8月24日提交的WO2021041316、2021年4月27日提交的WO2021222285和2021年4月27日提交的WO2021222285，包括实施例、序列表和附图的公开内容以引用方式整体并入本文。

细胞的低免疫原性可以通过评价细胞的免疫原性(诸如细胞引发适应性和先天免疫响应或避免引发此类适应性和先天免疫响应的能力)来确定。这种免疫响应可以使用本领域技术人员认可的测定法来测量。在一些实施方案中，先天和/或适应性免疫响应测定测量低免疫原性细胞对T细胞增殖、T细胞活化、T细胞杀伤、供体特异性抗体产生、NK细胞增殖、NK细胞活化和巨噬细胞活性的影响。在一些情况下，低免疫原性细胞及其衍生物在向受试者施用后经历被T细胞和/或NK细胞杀伤的降低。在一些情况下，与未修饰或野生型细胞相比，细胞及其衍生物显示出降低的巨噬细胞吞噬。在一些实施方案中，与对应的未修饰的野生型细胞相比，低免疫原性细胞在受体受试者中引发降低或减弱的免疫响应。在一些实施方案中，低免疫原性细胞是非免疫原性的或不能在受体受试者中引发先天和/或适应性免疫响应。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中的术语百分比“同一性”是指两个或更多个序列或子序列在比较和比对以获得最大对应关系时具有相同的核苷酸或氨基酸残基的指定百分比，如使用下述序列比较算法(例如，BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)中的一种或通过目测所测量的。根据应用，百分比“同一性”可以存在于被比较序列的区域中，例如，存在于功能结构域中，或者存在于两个待比较序列的全长中。对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果需要的话)，并且指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

可以例如通过以下算法进行序列的最佳比对以实现比较：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法、这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传软件包(Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或目测(一般参见Ausubel等人，下文)。

适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，该BLAST算法描述于Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。

如本文所用的“免疫信号传导因子”在一些情况下是指活化免疫信号传导通路的分子、蛋白质、肽等。

如本文所用的“免疫抑制因子”或“免疫调控因子”或“致耐受因子”包括低免疫因子(hypoimmunity factor)、补体抑制剂、以及在施用、移植或植入后调节或影响细胞被宿主或受体受试者的免疫系统识别的能力的其他因子。这些可能与额外的基因修饰相组合。

术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”在本文中均用于一般意指增加统计上显著的量；为避免任何疑问，术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多并包括100％增加或在10％-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加，或在2倍与10倍之间的任何增加，或更多增加。在一些实施方案中，也称为基础水平的参考水平是0。

在一些实施方案中，改变是插入缺失。如本文所用，“插入缺失”是指由插入、缺失或其组合产生的突变。如本领域技术人员将理解的，除非插入缺失的长度是三的倍数，否则基因组序列的编码区中的插入缺失将导致移码突变。在一些实施方案中，改变是点突变。如本文所用，“点突变”是指替换核苷酸之一的取代。本公开的基因编辑(例如CRISPR/Cas)系统可以用于在靶多核苷酸序列中诱导任何长度的插入缺失或点突变。

“诱导型启动子”仅在某些条件下具有活性，诸如但不限于在给定分子因子(例如，药剂、生物分子、化学品、配体等)或给定环境条件(例如，特定CO₂浓度、营养水平、光、热)的存在下。在不存在所述条件的情况下，诱导型启动子通常不允许显著或可测量水平的转录活性。例如，诱导型启动子可根据温度、pH、激素、代谢物(例如，乳糖、甘露醇、氨基酸)、光(例如，波长特异性)、渗透势(例如，盐诱导的)、重金属或抗生素来诱导。许多标准诱导型启动子是本领域技术人员已知的。诱导型启动子包括在本文中作为“可调控启动子”的一种类型。

在一些情况下，诱导型基因表达系统可以在配体、小分子、肽、因子、药剂等存在下开启或关闭转录。在一些情况下，诱导型基因表达系统可以响应于配体、小分子、肽、因子、药剂等的存在而活化蛋白质降解途径。

如本文所用，“敲低”是指靶mRNA或对应靶蛋白的表达降低。通常相对于施用或表达不介导RNA表达水平降低的非对照分子(例如，非靶向对照shRNA、siRNA或miRNA)后存在的水平来报告敲低。在一些实施方案中，靶基因的敲低是通过条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA、或条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)实现的。在一些实施方案中，靶基因的敲低是通过基于蛋白质的组分(诸如条件性或诱导型降解决定子方法)实现的。在一些实施方案中，靶基因的敲低通过遗传修饰来实现，包括shRNA、siRNA、miRNA或使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)。

通常通过使用定量聚合酶链式反应(qPCR)扩增测量mRNA水平或通过用蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定(ELISA)测量蛋白质水平来评估敲低。分析蛋白质水平提供mRNA切割以及翻译抑制的评估。用于测量敲低的另外技术包括RNA溶液杂交、核酸酶保护、Northern杂交、用微阵列监测基因表达、抗体结合、放射免疫测定和荧光活化细胞分析。基于本文描述的细节，本领域技术人员将容易地理解如何使用本公开的基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)敲除靶多核苷酸序列或其部分。

本文中的“敲入(knock in)”或“敲入(knock-in)”意指由将DNA序列插入到宿主细胞的染色体基因座中而引起的遗传修饰。这引起敲入基因、基因部分或核酸序列插入产物的表达的起始或水平增加，例如RNA转录物水平和/或编码蛋白质水平的增加。如本领域技术人员将理解的，这可以以若干种方式实现，包括将基因或其部分的一个或多个额外拷贝插入或添加到宿主细胞中、或改变内源基因的调控组分以增加蛋白质的表达、或插入期望其表达的指定核酸序列。这可通过修饰启动子、添加不同的启动子、添加增强子、添加其他调控元件或修饰其他基因表达序列来实现。

如本文所用，“敲除(knock out)”或“敲除(knock-out)”包括以干扰靶多核苷酸序列的翻译或功能的方式缺失全部或部分靶多核苷酸序列。例如，可以通过在靶多核苷酸序列中(包括靶多核苷酸序列的功能结构域(例如，DNA结合结构域)中)诱导插入或缺失(“插入缺失”)来改变靶多核苷酸序列，从而实现敲除。基于本文描述的细节，本领域技术人员将容易地理解如何使用本公开的基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)敲除靶多核苷酸序列或其部分。

在一些实施方案中，遗传修饰或改变导致靶多核苷酸序列或其部分的敲除或敲低。使用本公开的基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)敲除靶多核苷酸序列或其部分可用于多种应用。例如，出于研究目的，敲除细胞中的靶多核苷酸序列可以在体外执行。出于离体目的，敲除细胞中的靶多核苷酸序列可用于治疗或预防与靶多核苷酸序列的表达相关的病症(例如，通过离体敲除细胞中的突变体等位基因并且将包含敲除的突变体等位基因的这些细胞引入到受试者中)或用于改变细胞的基因型或表型。

基因表达的“调节”是指基因表达水平的变化。表达的调节可以包括但不限于基因活化和基因抑制。调节也可以是完全的，即其中基因表达完全失活或活化至野生型水平或更高；或者它可以是部分的，其中基因表达部分降低或部分活化至野生型水平的一部分。如本文所用，术语“修饰基因表达”是指将本文公开的任何修饰引入细胞中以制备本文公开的工程化细胞。

在另外的或替代的方面，本公开考虑以技术人员可用的任何方式改变靶多核苷酸序列，例如，利用核酸酶系统，诸如TAL效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶(ZFN)系统。应当理解，尽管本文详细描述了利用CRISPR/Cas(例如，Cas9和Cas12a)和TALEN的方法的实例，但本公开不限于这些方法/系统的使用。本文可以利用技术人员已知的降低或消除靶细胞中的表达的其他靶向方法。本文提供的方法可以用于改变细胞中的靶多核苷酸序列。本公开出于任何目的考虑了改变细胞中的靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，改变细胞中的靶多核苷酸序列以产生突变体细胞。如本文所用，“突变体细胞”是指具有不同于其原始基因型的所得基因型的细胞。在一些情况下，“突变细胞”表现出突变表型，例如当使用本公开的基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)系统改变功能正常的基因时。在其他情况下，“突变细胞”表现出野生型表型，例如当本公开的基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)系统用于校正突变基因型时。在一些实施方案中，改变细胞中的靶多核苷酸序列以校正或修复遗传突变(例如，以恢复细胞的正常表型)。在一些实施方案中，改变细胞中的靶多核苷酸序列以诱导遗传突变(例如，以破坏基因或基因组元件的功能)。

如本文所用的术语“天然细胞”是指未经其他方式修饰(例如，工程化)的细胞。在一些实施方案中，天然细胞是天然存在的野生型或对照细胞。

术语“有效地连接(operatively linked)”或“可操作地连接(operably linked)”关于两个或更多个组件(诸如序列元件)的并置可互换使用，其中组件被排列成使得两个组件都正常运行并且允许至少一个组件可以介导施加在至少一个其他组件上的功能的可能性。举例来说，如果转录调控序列(诸如启动子)响应于一种或多种转录调控因子的存在或不存在而控制编码序列的转录水平，则所述转录调控序列有效地连接至编码序列。转录调控序列通常以顺式方式与编码序列有效地连接，但不必与其直接相邻。例如，增强子是有效地连接至编码序列的转录调控序列，即使它们不连续。

如本文所用的“多能干细胞”具有分化成三个胚层中的任一个的潜力：内胚层(例如胃连接、胃肠道、肺等)、中胚层(例如肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖组织等)或外胚层(例如表皮组织和神经系统组织)。如本文所用的术语“多能干细胞”还涵盖“诱导性多能干细胞”或“iPSC”，或一类来源于非多能细胞的多能干细胞。在一些实施方案中，多能干细胞由不是多能细胞的细胞产生或生成。换句话说，多能干细胞可以是非多能细胞的直接或间接后代。亲本细胞的实例包括已被重编程以通过各种方式诱导多能、未分化表型的体细胞。此类“iPS”或“iPSC”细胞可以通过诱导某些调控基因的表达或通过某些蛋白质的外源应用来产生。用于诱导iPS细胞的方法是本领域已知的并且在下文进一步描述。(参见例如Zhou等人,Stem Cells 27(11):2667-74(2009)；Huangfu等人,Nature Biotechnol.26(7):795(2008)；Woltjen等人,Nature 458(7239):766-770(2009)；以及Zhou等人,Cell StemCell8:381-384(2009)；这些文献中的每一篇通过引用整体并入本文。)诱导性多能干细胞(iPSC)的生成在下文中概述。如本文所用，“hiPSC”是人诱导性多能干细胞。在一些实施方案中，如本文所用，“多能干细胞”还涵盖间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)和/或胚胎干细胞(ESC)。

如本文所用，“启动子”、“启动子序列”或“启动子区”是指能够结合RNA聚合酶并参与启动下游编码或非编码序列转录的DNA调控区/序列。在一些实例中，启动子序列包括转录起始位点，并且向上游延伸以包括以高于背景的可检测水平启动转录所必需的最小数量的碱基或元件。在一些实施方案中，启动子序列包括转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域。真核生物启动子将经常但不总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。

在一些实施方案中，工程化和低免疫原性细胞从原代T细胞或其后代繁殖。如本文所用，术语“从原代T细胞或其后代繁殖”涵盖从供体受试者分离的初始原代T细胞及其任何后续后代。如本文所用，术语“后代”涵盖例如第一代后代，即通过例如传统繁殖方法直接来源于、获得自、可获得自或可来源于初始原代T细胞的后代。术语“后代”还涵盖另外的世代，诸如第二代、第三代、第四代、第五代、第六代、第七代或更多代，即通过例如传统繁殖方法来源于、获得自、可获得自或可来源于前一代的细胞世代。术语“后代”还涵盖由于初始原代T细胞或其后代的修饰或改变而产生的修饰的细胞。

术语“受体患者”是指动物，例如，向其提供用本文所述的细胞进行治疗(包括预防性治疗)的人。对于指定动物(诸如人类患者)特有的那些感染、疾患或疾病状态的治疗，术语患者是指该指定动物。术语“受体患者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，受体患者是哺乳动物诸如人或其他哺乳动物(诸如家养哺乳动物例如狗、猫、马等，或生产哺乳动物例如牛、羊、猪等)。在一些实施方案中，受体患者患有感染、疾患、疾病或病症。在一些实施方案中，受体患者怀疑患有感染、疾患、疾病或病症。

如本文所用，“可调控修饰”是指在某些条件下进行的细胞的任何修饰，诸如但不限于细胞条件或阶段、或外部条件。在实施方案中，可调控修饰包括靶基因的可调控敲除。在实施方案中，可调控修饰包括一种或多种靶基因的可调控的降低的表达。在实施方案中，可调控修饰包括可调控的增加的一种或多种内源或外源基因的表达。在实施方案中，可调控修饰包括条件性或诱导型基于DNA的组分、条件性或诱导型基于RNA的组分、或条件性或诱导型基于蛋白质的组分，以增加、降低或敲除靶基因的表达。

如本文所用，“可调控启动子”仅在某些条件下有活性，诸如但不限于细胞条件或阶段、或外部条件。如本文所用，可调控启动子包括条件性启动子和诱导型启动子。在一些情况下，诱导型可调控基因表达系统可以在配体、小分子、肽、因子、药剂等存在下开启或关闭转录。在一些情况下，可调控基因表达系统可以响应于配体、小分子、肽、因子、药剂等的存在而活化蛋白质降解途径。

如本文所用，术语“调控序列”、“调控元件”和“控制元件”是可互换的，并且是指待表达的多核苷酸靶标的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非翻译序列)的多核苷酸序列。调控序列影响例如但不限于转录的时间、转录的量或水平、RNA处理或稳定性和/或相关结构核苷酸序列的翻译。调控序列可包括活化因子结合序列、增强子、内含子、聚腺苷酸化识别序列、启动子、阻遏物结合序列、茎环结构、翻译起始序列、翻译前导序列、转录终止序列、翻译终止序列、引物结合位点等。人们认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全界定，不同长度的核苷酸序列可具有相同的调控或启动子活性。

如本文所用的“安全港基因座”是指这样的基因座，其允许以使得新插入的遗传元件能够可预测地发挥作用的方式表达转基因或外源基因，并且也不会以对宿主细胞产生风险的方式引起宿主基因组的改变。示例性“安全港”基因座包括但不限于CCR5基因、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因、CLYBL基因和/或Rosa基因(例如，ROSA26)。如本文所用的“靶标基因座”是指允许表达转基因或外源基因的基因座。示例性“靶标基因座”包括但不限于CXCR4基因、白蛋白基因、SHS231基因座、F3基因(也称为CD142)、MICA基因、MICB基因、LRP1基因(也称为CD91)、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因和/或KDM5D基因(也称为HY)。编码外源基因的外源多核苷酸可以插入到B2M、CIITA、TRAC、TRBC、CCR5、F3(即，CD142)、MICA、MICB、LRP1、HMGB1、ABO、RHD、FUT1、KDM5D(即，HY)、PDGFRa、OLIG2和/或GFAP的CDS区中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到PPP1R12C(即AAVS1)或CCR5的内含子1或2中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到CCR5的外显子1或2或3中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到CLYBL的内含子2中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到Ch-4:58,976,613(即，SHS231)中的500bp窗口中。编码外源基因的外源多核苷酸可以插入上述安全港或靶标基因座的允许外源表达的任何合适区域，包括例如安全港或靶标基因座中的内含子、外显子或编码序列区域。

如本文所用，“靶标”可以指代通过本文所述的方法经受可调控的降低表达的基因、基因部分、基因组部分或蛋白质。

如本文所用，“治疗有效量”是指足以在疾病、病症或疾患的治疗和/或管理中提供治疗益处的量。在一些实施方案中，治疗有效量是足以改善、缓和、稳定、逆转、减缓、减弱或延迟疾病、病症或疾患的进展或疾病、病症或疾患的症状或副作用的进展的量。在一些实施方案中，治疗有效量也是临床有效量。在其他实施方案中，治疗有效量不是临床有效量。

如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”包括向受试者施用治疗或临床有效量的本文所述的细胞，使得受试者的疾病的至少一种症状得到减轻或疾病得到改善，例如，有益的或期望的治疗或临床结果。出于此技术的目的，有益的或期望的治疗或临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减轻、稳定(即，不恶化)的疾病状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗可以指与未接受治疗的预期存活相比延长存活。因此，本领域技术人员认识到，治疗可改善疾病状况，但可能不是疾病的完全治愈。在一些实施方案中，在治疗疾患、疾病或病症后，所述疾患、疾病或病症的一种或多种症状减轻至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。

出于此技术的目的，疾病治疗的有益的或期望的治疗或临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减轻、稳定(即，不恶化)的疾病状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。

“载体”或“构建体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够指导感兴趣基因的表达并且可以将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物以及整合载体。用于将载体或构建体引入到细胞中的方法是本领域技术人员已知的并且包括但不限于脂质介导的转移(即，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和/或病毒载体介导的转移。

在一些实施方案中，细胞经工程化以相对于未改变或未修饰的野生型细胞具有降低或增加的一个或多个靶标的表达。在一些实施方案中，细胞经工程化以相对于未改变或未修饰的野生型细胞具有组成型的降低或增加的一个或多个靶标的表达。在一些实施方案中，细胞经工程化以相对于未改变或未修饰的野生型细胞具有可调控的降低或增加的一个或多个靶标的表达。在一些实施方案中，细胞相对于野生型细胞或相同细胞类型的对照细胞包含增加的CD47表达。在细胞的上下文中，“野生型”或“wt”或“对照”意指任何天然存在的细胞。野生型或对照细胞的实例包括天然存在的原代细胞和T细胞。然而，举例来说，在工程化细胞的上下文中，如本文所用，“野生型”或“对照”还可以意指这样的工程化细胞，可能含有导致一种或多种MHC I类分子和/或II类分子和/或T细胞受体的表达降低的核酸改变，但不经历导致CD47蛋白过表达的基因编辑程序。例如，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA和/或TRAC表达的工程化细胞。此外，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA、TRAC和/或TRBC表达的工程化细胞。如本文所用，“野生型”或“对照”还意指这样的工程化细胞，可能含有导致CD47蛋白过表达的核酸改变，但不经历导致一种或多种MHC I类和/或II类分子和/或T细胞受体的表达降低的基因编辑程序。在iPSC或其后代的上下文中，“野生型”或“对照”还意指这样的iPSC或其后代，可能含有导致多能性的核酸改变，但不经历本公开的基因编辑程序以实现一种或多种MHC I类和/或II类分子和/或T细胞受体的表达降低和/或CD47蛋白过表达。例如，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA和/或TRAC表达的iPSC或其后代。此外，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA、TRAC和/或TRBC表达的iPSC或其后代。在原代T细胞或其后代的上下文中，“野生型”或“对照”还意指这样的原代T细胞或其后代，可能含有导致一种或多种MHC I类和/或II类分子和/或T细胞受体的表达降低的核酸改变，但不经历导致CD47蛋白过表达的基因编辑过程。例如，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA和/或TRAC表达的原代T细胞或其后代。此外，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA、TRAC和/或TRBC表达的原代T细胞或其后代。同样在原代T细胞或其后代的上下文中，“野生型”或“对照”还意指这样的原代T细胞或其后代，可能含有导致CD47蛋白过表达的核酸改变，但不经历导致一种或多种MHC I类和/或II类分子和/或T细胞受体的表达降低的基因编辑过程。在一些实施方案中，细胞经工程化以相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞具有可调控的降低或增加的一个或多个靶标的表达。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料被另外修饰或工程化以具有改变的一种或多种基因的表达以产生工程化细胞。在一些实施方案中，对照细胞来自与本文描述的细胞相同的起始材料。在一些实施方案中，对照细胞来自参考起始材料。在一些实施方案中，起始材料来自单一供体。在一些实施方案中，起始材料来自供体库。

在一些实施方案中，细胞被工程化以相对于对照表达更高量的致耐受因子。如本文所用，术语“对照”可以在细胞、细胞群、样品或测量的上下文中使用。在一些实施方案中，细胞被工程化以相对于对照细胞表达更高量的致耐受因子。在一些实施方案中，细胞被工程化以相对于对照细胞群表达更高量的致耐受因子。在一些实施方案中，细胞被工程化以相对于对照样品表达更高量的致耐受因子。在一些实施方案中，细胞被工程化以相对于对照测量表达更高量的致耐受因子，该对照测量包括但不限于测定或测试中的基线参考或对照信号。如本文所用，“基线参考”是指本领域技术人员根据本公开已知的任何合适的参考值或信号水平，包括在本文呈现的实例中使用的那些。在一些实施方案中，基线参考是指可以与测试表达水平进行比较的表达的对照水平，并且在一些水平中是指正常水平。在一些实施方案中，基线参考是指适用于所使用的特定测试或测定的对照或背景水平。在一些实施方案中，基线参考是指对照信号，包括但不限于来自本领域已知的可用于评估表达水平的任何合适的测试或测定的同种型对照值。在一些实施方案中，基线参考是指来自本领域已知的可用于评估表达水平的任何合适的测试或测定的背景信号。在一些实施方案中，细胞被工程化以以阈值水平或更高水平表达致耐受因子。在一些实施方案中，细胞被工程化以以阈值水平或更高水平表达CD47。阈值可以使用本领域技术人员根据说明书已知的任何合适的方法(包括例如本文公开的那些)来确定。在一些实施方案中，基线参考对于工程化细胞或包含工程化细胞的细胞群是特异性的。

应当注意，权利要求可被草拟为排除任何任选要素。因此，本声明旨在作为在引用权利要求要素时使用诸如“唯一”、“仅”等排他性术语或使用“否定”限制的先行基础。如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的，在不背离本公开的范围或精神的情况下，本文描述和说明的个别实施方案中的每一个都具有易于与其他若干个实施方案中的任一个的特征分离或组合的离散组分和特征。任何列举的方法可以按照列举的事件的顺序或按照逻辑上可能的任何其他顺序来进行。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料也可用于实践或测试本公开，但是现在描述代表性说明性方法和材料。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限与下限之间的每个中介值(intervening value)(除非上下文另外清楚地指出，否则直到下限的单位的十分之一)以及该所述范围内的任何其他所述值或中介值都涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本公开内，属于所述范围内的任何明确排除的极限值。在所述范围包括极限值中的一个或两个的情况下，不包括那些被包括的极限值中的一个或两个的范围也包括在本公开中。某些范围在本文中以术语“约”开头的数值呈现。术语“约”在本文中用于为其后的确切数字以及接近或近似于所述术语后的数字的数字提供字面支持。在确定数字是接近还是近似具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在所呈现的上下文中提供与具体列举的数字的实质等效的数字。术语约在本文中用于意指值的正负百分之十(10％)。例如，“约100”是指90与110之间的任何数字。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度就如每项单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指示通过引用并入。此外，每项引用的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文以公开和描述与引用的所述出版物相关的主题。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本文所述的本技术由于现有技术而无权先于这种出版物。此外，提供的公布日期可能与实际公布日期不同，这可能需要独立地确认。

在进一步描述本技术前，应当理解本技术不限于描述的特定实施方案，因此当然可发生变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图是限制性的，因为本公开的范围将仅受所附权利要求书限制。还应理解，本文所用的标题不是限制性的并且仅旨在引导读者，但主题通常适用于本文公开的技术。

III.具体实施方式

A.低免疫原性细胞

在一些实施方案中，本公开提供了包含可调控修饰的工程化(例如，修饰的和遗传修饰的)细胞，所述可调控修饰i)相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的表达，其中可调控的降低的表达是通过基于RNA的组分、基于DNA的组分或基于蛋白质的组分进行的，和/或ii)相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞增加编码一种或多种致耐受因子的第一外源多核苷酸的表达，其中可调控的过表达是通过条件性或诱导型启动子进行的。在一些实施方案中，细胞能够逃避活化NK细胞介导的和/或基于抗体的免疫响应。

在一些实施方案中，细胞是诱导性多能干细胞、其任何类型的分化细胞、原代免疫细胞和任何组织的其他原代细胞。在一些实施方案中，分化细胞是心脏细胞及其亚群、神经细胞及其亚群、脑内皮细胞及其亚群、多巴胺能神经元及其亚群、神经胶质祖细胞及其亚群、内皮细胞及其亚群、甲状腺细胞及其亚群、肝细胞及其亚群、胰岛细胞及其亚群、或视网膜色素上皮细胞及其亚群。在一些实施方案中，分化细胞是T细胞及其亚群、NK细胞及其亚群。在一些实施方案中，原代免疫细胞是T细胞及其亚群和NK细胞及其亚群。在一些实施方案中，原代组织细胞包括原代内皮细胞及其亚群。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，本文所述的细胞包含一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达，其中该可调控的降低的表达是通过基于RNA的组分进行的。在一些实施方案中，基于RNA的组分选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA以及条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组。在一些实施方案中，基于RNA的组分处于条件性启动子的控制下，其中该条件性启动子是细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子或分化诱导型启动子。在一些实施方案中，基于RNA的组分处于诱导型启动子的控制下，其中该诱导型启动子受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，本文所述的细胞包含一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达，其中该可调控的降低的表达是通过基于DNA的组分进行的。在一些实施方案中，基于DNA的组分是使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行的敲除或敲低。在一些实施方案中，基于DNA的组分处于条件性启动子的控制下，其中该条件性启动子是细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子或分化诱导型启动子。在一些实施方案中，基于DNA的组分处于诱导型启动子的控制下，其中该诱导型启动子受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，本文所述的细胞包含一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达，其中该可调控的降低的表达是通过基于蛋白质的组分进行的。在一些实施方案中，基于蛋白质的组分是条件性或诱导型降解决定子方法。在一些实施方案中，降解决定子方法选自由使用SMASH标签的配体诱导性降解(LID)、使用Shield-1的LID、使用生长素的LID、使用雷帕霉素的LID、条件性或诱导型肽降解决定子(例如，基于IKZF3的降解决定子)和条件性或诱导型蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)组成的组。在一些实施方案中，基于蛋白质的组分处于条件性启动子的控制下，其中该条件性启动子是细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子或分化诱导型启动子。在一些实施方案中，基于蛋白质的组分处于诱导型启动子的控制下，其中该诱导型启动子受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。

在一些实施方案中，本文所述的细胞包含编码一种或多种致耐受因子的第一外源多核苷酸的可调控的过表达，其中该可调控的过表达是通过条件性或诱导型启动子进行的。在一些实施方案中，可调控的过表达是通过条件性启动子进行的，其中该条件性启动子是细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子或分化诱导型启动子。在一些实施方案中，可调控的过表达是通过诱导型启动子进行的，该诱导型启动子受小分子、配体或生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。

在一些实施方案中，本公开涉及多能干细胞(例如，多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC))、源自此类多能干细胞的分化细胞(诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)和原代细胞(诸如但不限于原代T细胞和原代NK细胞)。在一些实施方案中，多能干细胞、源自所述多能干细胞的分化细胞(诸如T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)和原代细胞(诸如原代T细胞和原代NK细胞)被工程化以用于一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达或可调控的表达缺乏，并且在一些情况下，用于T细胞受体(TCR)复合物的可调控的降低的表达或可调控的表达缺乏。在一些实施方案中，除了(i)一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达或可调控的表达缺乏以及(ii)T细胞受体(TCR)复合物的可调控的降低的表达或可调控的表达缺乏之外，低免疫T细胞和原代T细胞可调控地过表达CD47并且任选地可调控地过表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR包含与选自由CD19、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA组成的组的任一个结合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR是CD19特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD22特异性CAR。在一些情况下，CAR是CD38特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD123特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD138特异性CAR。在一些情况下，CAR是BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是双特异性CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR是CD19/CD22双特异性CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR是BCMA/CD38双特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD19特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD22特异性CAR、CD38特异性CAR、CD123特异性CAR、CD138特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD22特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD19特异性CAR、CD38特异性CAR、CD123特异性CAR、CD138特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD38特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD22特异性CAR、CD18特异性CAR、CD123特异性CAR、CD138特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD123特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD22特异性CAR、CD38特异性CAR、CD19特异性CAR、CD138特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD138特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD22特异性CAR、CD38特异性CAR、CD123特异性CAR、CD19特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达BCMA特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD22特异性CAR、CD38特异性CAR、CD123特异性CAR、CD138特异性CAR和CD19特异性CAR。

在一些实施方案中，源自iPSC的低免疫细胞(诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)可调控地过表达CD47，并且包括B2M基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，源自iPSC的低免疫细胞(诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)可调控地过表达CD47，并且包括CIITA基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。

在一些实施方案中，源自iPSC的低免疫细胞通过分化诱导性多能干细胞(诸如低免疫原性诱导性多能干细胞)产生。

在一些实施方案中，源自ESC的低免疫细胞(诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)可调控地过表达CD47，并且包括B2M基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，源自ESC的低免疫细胞(诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)可调控地过表达CD47，并且包括CIITA基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，源自iPSC的低免疫细胞通过分化多能干细胞诸如低免疫原性胚胎干细胞产生。

在一些实施方案中，原代T细胞和源自iPSC的低免疫T细胞可调控地过表达一种或多种致耐受因子和嵌合抗原受体(CAR)，并且包括B2M基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，原代T细胞和源自iPSC的低免疫T细胞可调控地过表达一种或多种致耐受因子，并且包括CIITA基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，原代T细胞和源自iPSC的低免疫T细胞可调控地过表达一种或多种致耐受因子和CAR，并且包括TRAC基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，原代T细胞和源自iPSC的低免疫T细胞可调控地过表达一种或多种致耐受因子和CAR，并且包括TRB基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，原代T细胞和源自iPSC的低免疫T细胞可调控地过表达一种或多种致耐受因子和CAR，并且包括选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的一种或多种可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，原代T细胞和源自iPSC的低免疫T细胞可调控地过表达一种或多种致耐受因子和CAR，并且包括B2M、CIITA、TRAC和TRB基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，原代T细胞和源自iPSC的低免疫T细胞可调控地过表达CD47和嵌合抗原受体(CAR)，并且包括B2M基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，原代T细胞和源自iPSC的低免疫T细胞可调控地过表达CD47，并且包括CIITA基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，原代T细胞和源自iPSC的低免疫T细胞可调控地过表达CD47和CAR，并且包括TRAC基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，原代T细胞和源自iPSC的低免疫T细胞可调控地过表达CD47和CAR，并且包括TRB基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，原代T细胞和源自iPSC的低免疫T细胞可调控地过表达CD47和CAR，并且包括选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的一种或多种可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，原代T细胞和源自iPSC的低免疫T细胞可调控地过表达CD47和CAR，并且包括B2M、CIITA、TRAC和TRB基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除或敲低。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，低免疫T细胞通过分化诱导性多能干细胞(诸如低免疫原性诱导性多能干细胞)产生。

在一些实施方案中，原代T细胞和源自iPSC的低免疫T细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。

在一些实施方案中，工程化或修饰细胞是多能干细胞、诱导性多能干细胞、从这类多能干细胞和诱导性多能干细胞分化的NK细胞、从此类多能干细胞和诱导性多能干细胞分化的T细胞、或原代T细胞。原代T细胞的非限制性实例包括CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、初始T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型。在一些实施方案中，原代T细胞选自包括细胞毒性T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、调控性T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞及其组合的组。NK细胞和原代NK细胞的非限制性实例包括未成熟NK细胞和成熟NK细胞。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料被另外修饰或工程化以具有改变的一种或多种基因的表达以产生工程化细胞。

在一些实施方案中，原代T细胞来自一个或多个供体受试者的原代T细胞库，所述供体受试者不同于受体受试者(例如，被施用细胞的患者)。原代T细胞可获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100个或更多个供体受试者并汇集在一起。原代T细胞可从1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个、或100个或更多个供体受试者获得并汇集在一起。在一些实施方案中，原代T细胞从一个或多个个体收获，并且在一些情况下，原代T细胞或原代T细胞库在体外培养。在一些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以可调控地外源表达CD47并在体外培养。

在许多实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以可调控地表达嵌合抗原受体(CAR)。CAR可以是本领域技术人员已知的任一种。可用的CAR包括与选自包括CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA的组的抗原结合的那些。在一些情况下，CAR与FDA批准的CAR-T细胞疗法中使用的CAR(诸如但不限于tisagenlecleucel和axicabtageneciloleucel中使用的那些)或正在临床试验中研究的其他CAR相同或等效。

在一些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以与未修饰的原代T细胞相比可调控地表现出降低的内源T细胞受体的表达。在某些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以与未修饰的原代T细胞相比表现出降低的CTLA-4、PD-1或CTLA-4和PD-1两者的表达。对包括T细胞的细胞进行遗传修饰的方法在例如WO2020/018620和WO2016/183041中详细描述，其公开内容通过引用整体并入本文，包括表格、附录、序列表和附图。

在一些实施方案中，CAR-T细胞包含CAR，所述CAR选自包括以下的组：(a)第一代CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域；(b)第二代CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传导结构域；(c)第三代CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传导结构域；(d)第四代CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域，以及在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。

在一些实施方案中，CAR-T包含CAR，所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR还包含接头。在一些实施方案中，CAR包含CD19抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR包含CD28或CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CAR包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CAR包含Whitlow接头GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域选自包括但不限于以下的组：(a)靶向肿瘤细胞的抗原特征的抗原结合结构域；(b)靶向T细胞的抗原特征的抗原结合域；(c)靶向自身免疫性或炎性病症的抗原特征的抗原结合结构域；(d)靶向衰老细胞的抗原特征的抗原结合结构域；(e)靶向感染性疾病的抗原特征的抗原结合结构域；以及(f)结合细胞的细胞表面抗原的抗原结合结构域。

在一些实施方案中，CAR还包含一个或多个接头。scFv的形式通常是由柔性肽序列或“接头”连接的两个可变结构域，方向为VH-接头-VL或VL-接头-VH。根据说明书，本领域技术人员已知的任何合适的接头都可以用于CAR。合适的接头的实例包括但不限于基于GS的接头序列和Whitlow接头GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，接头是GS或gly-ser接头。示例性gly-ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly₄Ser)_n，以及(Gly₄Ser)_n和/或(Gly₄Ser₃)_n。在一些实施方案中，n＝l。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3，即Ser(Gly₄Ser)₃。在一些实施方案中，n＝4，即Ser(Gly₄Ser)₄。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。在一些实施方案中，n＝7。在一些实施方案中，n＝8。在一些实施方案中，n＝9。在一些实施方案中，n＝10。另一个示例性gly-ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly₄Ser)_n。在一些实施方案中，n＝l。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在另一个实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。另一个示例性gly-ser多肽接头包含(Gly4Ser)n。在一些实施方案中，n＝l。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。另一个示例性gly-ser多肽接头包含(Gly₃Ser)_n。在一些实施方案中，n＝l。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在另一个实施方案中，n＝5。在又另一个实施方案中，n＝6。另一个示例性gly-ser多肽接头包含(Gly₄Ser₃)_n。在一些实施方案中，n＝l。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。另一个示例性gly-ser多肽接头包含(Gly₃Ser)_n。在一些实施方案中，n＝l。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在另一个实施方案中，n＝5。在又另一个实施方案中，n＝6。

在一些实施方案中，抗原结合结构域选自包括以下的组：抗体、其抗原结合部分或片段、scFv和Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域与CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138或BCMA结合。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗CD19 scFv，诸如但不限于FMC63。

在一些实施方案中，跨膜结构域包括选自包括以下各者的跨膜区的组的跨膜结构域：TCRα、TCRβ、TCRζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD28、CD45、CD22、CD33、CD34、CD37、CD40、CD40L/CD154、CD45、CD64、CD80、CD86、OX40/CD134、4-1BB/CD137、CD154、FcεRIγ、VEGFR2、FAS、FGFR2B及其功能变体。

在一些实施方案中，CAR的信号传导结构域包括共刺激结构域。例如，信号传导结构域可以含有共刺激结构域。或者，信号传导结构域可以含有一个或多个共刺激结构域。在某些实施方案中，信号传导结构域包括一个共刺激结构域。在其他实施方案中，信号传导结构域包括多个共刺激结构域。在一些情况下，当CAR包含两个或更多个共刺激结构域时，两个共刺激结构域不相同。在一些实施方案中，共刺激结构域包括两个不同的共刺激结构域。在一些实施方案中，所述一个共刺激结构域增强T细胞活化期间的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。在一些实施方案中，所述多个共刺激结构域增强T细胞活化期间的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。

如本文所述，第四代CAR可以含有抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域和在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些情况下，细胞因子基因是低免疫原性细胞的内源或外源细胞因子基因。在一些情况下，细胞因子基因编码促炎细胞因子。在一些实施方案中，促炎细胞因子选自包括IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF、IFN-γ及其功能片段的组。在一些实施方案中，在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域包含转录因子或其功能结构域或片段。

在一些实施方案中，CAR包含CD3泽塔(CD3ζ)结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。在其他实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在某些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。在一些实施方案中，CAR包含(i)抗CD19 scFv；(ii)CD8α铰链和跨膜结构域或其功能变体；(iii)4-1BB共刺激结构域或其功能变体；以及(iv)CD3ζ信号传导结构域或其功能变体。

用于引入CAR构建体或产生CAR-T细胞的方法是本领域技术人员众所周知的。详细描述可见于例如Vormittag等人,Curr Opin Biotechnol,2018,53,162-181；和Eyquem等人,Nature,2017,543,113-117。

在一些实施方案中，来源于原代T细胞的细胞包含降低的内源性T细胞受体的表达，例如通过破坏内源性T细胞受体基因(例如，T细胞受体α恒定区(TRAC)或T细胞受体β恒定区(TRB))。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在破坏的T细胞受体基因处。在一些实施方案中，将编码多肽的外源核酸插入在TRAC或TRB基因座处。

在一些实施方案中，来源于原代T细胞的细胞包含降低的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)的表达。降低或消除CTLA4、PD1以及CTLA4和PD1两者的表达的方法可以包括本领域技术人员认可的任何方法，诸如但不限于利用罕见切割核酸内切酶的遗传修饰技术和RNA沉默或RNA干扰技术。罕见切割核酸内切酶的非限制性实例包括任何Cas蛋白、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和/或归巢核酸内切酶。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在CTLA4和/或PD1基因座处。

在一些实施方案中，将编码一种或多种具有可调控表达的致耐受因子的转基因插入细胞的预选基因座。在一些实施方案中，将编码CAR的转基因插入到细胞的预选基因座中。在某些实施方案中，将编码一种或多种具有可调控表达的致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因插入细胞的预选基因座中。预选基因座可以是安全港基因座或靶标基因座。安全港基因座的非限制性实例包括但不限于CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座和CLYBL基因座、Rosa基因座(例如，ROSA26基因座)。靶标基因座的非限制性实例包括但不限于CXCR4基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、F3基因座(也称为CD142)、MICA基因座、MICB基因座、LRP1基因座(也称为CD91基因座)、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。编码一种或多种致耐受因子的转基因可插入PPP1R12C(即，AAVS1)或CCR5的内含子1或2中。编码一种或多种致耐受因子的转基因可插入PPP1R12C(即，AAVS1)或CCR5的内含子1或2中。编码一种或多种致耐受因子的转基因可插入CCR5的外显子1或2或3中。编码一种或多种致耐受因子的转基因可插入CLYBL的内含子2中。编码一种或多种致耐受因子的转基因可插入Ch-4:58,976,613(即，SHS231)的500bp窗口中。编码一种或多种致耐受因子的转基因可以插入上述安全港或靶标基因座的允许外源表达的任何合适区域，包括例如安全港或靶标基因座中的内含子、外显子或编码序列区域。在一些实施方案中，预选基因座选自由B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组。在一些实施方案中，预选基因座是B2M基因座。在一些实施方案中，预选基因座是CIITA基因座。在一些实施方案中，预选基因座是TRAC基因座。在一些实施方案中，预选基因座是TRB基因座。

在一些实施方案中，将编码一种或多种具有可调控表达的致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因插入到相同的基因座中。在一些实施方案中，将编码一种或多种具有可调控表达的致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因插入到不同的基因座中。在许多情况下，将编码一种或多种致耐受因子的转基因插入到安全港或靶标基因座中。在许多情况下，将编码CAR的转基因插入到安全港或靶标基因座中。在一些情况下，将编码一种或多种致耐受因子的转基因插入到B2M基因座中。在一些情况下，将编码CAR的转基因插入到B2M基因座中。在某些情况下，将编码一种或多种致耐受因子的转基因插入到CIITA基因座中。在某些情况下，将编码CAR的转基因插入到CIITA基因座中。在特定情况下，将编码一种或多种致耐受因子的转基因插入到TRAC基因座中。在特定情况下，将编码CAR的转基因插入到TRAC基因座中。在许多其他情况下，将编码一种或多种致耐受因子的转基因插入到TRB基因座中。在许多其他情况下，将编码CAR的转基因插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因插入到安全港或靶标基因座(例如，CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座)中。

在许多实施方案中，将编码一种或多种具有可调控表达的致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因插入到安全港或靶标基因座中。在某些实施方案中，编码一种或多种具有可调控表达的致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制并插入到安全港或靶标基因座中。在某些实施方案中，编码一种或多种具有可调控表达的致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因受它们自己的启动子控制并插入到安全港或靶标基因座中。在某些实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因插入到TRAC基因座中。在某些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制并插入到TRAC基因座中。在某些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因受它们自己的启动子控制并插入到TRAC基因座中。在一些实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制并插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因受它们自己的启动子控制并插入到TRB基因座中。在其他实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因插入到B2M基因座中。在其他实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制并插入到B2M基因座中。在其他实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因受它们自己的启动子控制并插入到B2M基因座中。在各种实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因插入到CIITA基因座中。在各种实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制并插入到CIITA基因座中。在各种实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因受它们自己的启动子控制并插入到CIITA基因座中。

在一些情况下，控制所述任何转基因表达的启动子是组成型启动子。在一些情况下，控制所描述的任何转基因的表达的启动子是条件性启动子。在其他情况下，所述任何转基因的启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子是EF1α启动子。在一些实施方案中，启动子是CAG启动子。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受组成型启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受条件性启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受细胞周期特异性启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受组织特异性启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受谱系特异性启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受分化诱导型启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受诱导型启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受由小分子调控的诱导型启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受由配体调控的诱导型启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受由生物剂调控的诱导型启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受由适体介导的聚腺苷酸化调节剂调控的诱导型启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受由适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CAR转基因受组成型启动子控制。在一些实施方案中，CAR转基因受条件性启动子控制。在一些实施方案中，CAR转基因受细胞周期特异性启动子控制。在一些实施方案中，CAR转基因受组织特异性启动子控制。在一些实施方案中，CAR转基因受谱系特异性启动子控制。在一些实施方案中，CAR转基因受分化诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CAR转基因受诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CAR转基因受由小分子调控的诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CAR转基因受由配体调控的诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CAR转基因受由生物剂调控的诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CAR转基因受由适体介导的聚腺苷酸化调节剂调控的诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CAR转基因受由适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因均受条件性启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因均受诱导型启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受组成型启动子控制，并且编码CAR的转基因受诱导型启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受组成型启动子控制，并且编码CAR的转基因受条件性启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受条件性启动子控制，并且编码CAR的转基因受诱导型启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受条件性启动子控制，并且编码CAR的转基因受组成型启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受诱导型启动子控制，并且编码CAR的转基因受条件性启动子控制。在各种实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受EF1α启动子控制，并且编码CAR的转基因受EF1α启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受CAG启动子控制，并且编码CAR的转基因受CAG启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受CAG启动子控制，并且编码CAR的转基因受EF1α启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因受EF1α启动子控制，并且编码CAR的转基因受CAG启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因的表达均由单个EF1α启动子控制。在一些实施方案中，编码一种或多种致耐受因子的转基因和编码CAR的转基因的表达均由单个CAG启动子控制。

在另一个实施方案中，本文公开的本公开涉及多能干细胞(例如，多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC))、源自此类多能干细胞的分化细胞(例如，低免疫T细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)和可调控地过表达CD47(诸如可调控地外源表达CD47蛋白)的原代T细胞，具有一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达或缺乏表达，并且具有T细胞受体(TCR)复合物的可调控的降低的表达或缺乏表达。在一些实施方案中，低免疫T细胞和原代T细胞可调控地过表达CD47(诸如可调控地外源表达CD47蛋白)，具有一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达或缺乏表达，并且具有T细胞受体(TCR)复合物的可调控的降低的表达或缺乏表达。

在一些实施方案中，多能干细胞(例如，多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC))、源自此类多能干细胞的分化细胞(例如，低免疫T细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)和原代T细胞可调控地过表达CD47并且包括B2M基因的可调控的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、源自此类多能干细胞的分化细胞和原代T细胞可调控地过表达CD47并且包括CIITA基因的可调控的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、源自此类多能干细胞的分化细胞(诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)是可调控的B2M^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞可调控地过表达CD47并且包括TRAC基因的可调控的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞可调控地过表达CD47并且包括TRB基因的可调控的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞可调控地过表达CD47并且包括选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的一种或多种可调控的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞可调控地过表达CD47并且包括B2M、CIITA和TRAC基因的可调控的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞可调控地过表达CD47并且包括B2M、CIITA和TRB基因的可调控的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞可调控地过表达CD47并且包括B2M、CIITA、TRAC和TRB基因的可调控的基因组修饰。在某些实施方案中，多能干细胞、源自此类多能干细胞的分化细胞和原代T细胞是可调控的B2M^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，所描述的工程化或修饰细胞是多能干细胞(例如，胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)、从此类多能干细胞分化的T细胞或原代T细胞。原代T细胞的非限制性实例包括CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、初始T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料被另外修饰或工程化以具有改变的一种或多种基因的表达以产生工程化细胞。

在一些实施方案中，将编码一种或多种具有可调控表达的致耐受因子的转基因插入细胞的预选基因座。预选基因座可以是安全港或靶标基因座。安全港基因座的非限制性实例包括CCR5基因座、PPP1R12C基因座和CLYBL基因座、Rosa基因座。靶标基因座的非限制性实例包括CXCR4基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。在一些实施方案中，预选基因座是TRAC基因座。在一些实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的转基因插入到安全港或靶标基因座(例如，CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座)中。在某些实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的转基因插入到B2M基因座中。在某些实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的转基因插入到B2M基因座中。在某些实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的转基因插入到TRAC基因座中。在某些实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的转基因插入到TRB基因座中。

在一些情况下，编码一种或多种致耐受因子的转基因的表达受条件性启动子控制。在其他情况下，编码一种或多种致耐受因子的转基因的表达受诱导型启动子控制。

在又一个实施方案中，本文公开的本公开涉及多能干细胞(例如，多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC))、源自此类多能干细胞的T细胞(例如，低免疫T细胞)，以及具有一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达或可调控的表达缺乏并且具有T细胞受体(TCR)复合物的可调控的降低的表达或可调控的表达缺乏的原代T细胞。在一些实施方案中，细胞具有一种或多种MHC I类抗原分子、MHC II类抗原分子和TCR复合物的可调控的降低的或可调控的表达缺乏。

在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、源自其的分化细胞(例如，T细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和从其分化的视网膜色素上皮细胞)和原代T细胞包括B2M基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、源自其的分化细胞(例如，T细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和从其分化的视网膜色素上皮细胞)和原代T细胞包括CIITA基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲除。在一些实施方案中，细胞(包括iPSC和源自此类多能干细胞的分化细胞(诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞))是可调控的B2M^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，ESC或iPSC)、从其分化的T细胞和原代T细胞包括TRAC基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲低。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、从其分化的T细胞和原代T细胞包括TRB基因的可调控的基因组修饰或可调控的敲低。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、从其分化的T细胞和原代T细胞包括选自由B2M、CIITA和TRAC基因组成的组的一种或多种可调控的基因组修饰或可调控的敲低。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、从其分化的T细胞和原代T细胞包括选自由B2M、CIITA和TRB基因组成的组的一种或多种可调控的基因组修饰或可调控的敲低。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、从其分化的T细胞和原代T细胞包括选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的一种或多种可调控的基因组修饰或可调控的敲低。在某些实施方案中，包括iPSC、从其分化的T细胞和原代T细胞的细胞是可调控的B2M^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、CD47tg。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^-/-、TRAC^-/-、TRBC^-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}、TRBC^{插入缺失/插入缺失}、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的B2M^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是可调控的CIITA^敲低、TRAC^敲低、TRBC^敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，所述修饰的细胞是多能干细胞、诱导性多能干细胞、从此类多能干细胞和诱导性多能干细胞分化的T细胞、或原代T细胞。原代T细胞的非限制性实例包括CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、初始T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料被另外修饰或工程化以具有改变的一种或多种基因的表达以产生工程化细胞。

本公开的细胞表现出一种或多种MHC I类抗原分子、MHC II类抗原分子和/或TCR复合物的表达的可调控地降低或可调控地缺乏。降低MHC I和/或MHC II的表达可以例如通过以下方式中的一种或多种来实现：(1)直接靶向多态HLA等位基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和MHC-II基因；(2)去除B2M，这将阻止所有MHC-I分子的表面运输；(3)去除CIITA，这将阻止所有MHC-II分子的表面运输；以及/或者(4)缺失对HLA表达至关重要的MHC增强体组分，诸如LRC5、RFX5、RFXANK、RFXAP、IRFl、NF-Y(包括NFY-A、NFY-B、NFY-C)和CIITA。

在一些实施方案中，通过靶向个体HLA(例如，敲除、敲低或降低HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR的表达)、靶向HLA表达的转录调控因子(例如，敲除或降低NLRC5、CIITA、RFX5、RFXAP、RFXANK、NFY-A、NFY-B、NFY-C和/或IRF-1的表达)、阻断MHC I类分子的表面运输(例如，敲除或降低B2M和/或TAP1的表达)和/或用HLA-razor靶向来干扰HLA表达(参见例如WO2016183041)。

在一些实施方案中，本文公开的细胞(包括但不限于多能干细胞、诱导性多能干细胞、源自此类干细胞的分化细胞和原代T细胞)可调控地不表达对应于MHC-I和/或MHC-II的一种或多种人白细胞抗原分子(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR)，并且因此被表征为低免疫原性。例如，在某些实施方案中，所公开的多能干细胞和诱导性多能干细胞已经被修饰，使得干细胞或由其制备的分化干细胞可调控地不表达以下MHC-I分子中的一种或多种或者可调控地表现出以下MHC-I分子中的一种或多种的降低表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中，HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种可以是细胞的可调控的“敲除”。具有可调控的敲除的HLA-A基因、HLA-B基因和/或HLA-C基因的细胞可以可调控地表现出每种敲除基因的降低的或消除的表达。在一些实施方案中，HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种可以在细胞中被可调控地敲低或敲除。具有敲低的HLA-A基因、HLA-B基因和/或HLA-C基因的细胞可以可调控地表现出每种敲低基因的降低的或消除的表达。

在一些实施方案中，允许通过靶向HLA基因中的保守区域来同时缺失所有MHC I类等位基因的指导RNA、shRNA、siRNA或miRNA被鉴定为HLA Razor。在一些实施方案中，gRNA是CRISPR系统的一部分，诸如可调控的CRISPR系统，诸如条件性或诱导型CRISPR系统。在替代的实施方案中，gRNA是TALEN系统的一部分，诸如可调控的TALEN系统，诸如条件性或诱导型TALEN系统。在一些实施方案中，shRNA、siRNA或mRNA是可调控的RNAi系统的一部分，诸如条件性或诱导型RNAi系统。在一些实施方案中，靶向HLA中已鉴定的保守区域的HLA Razor在WO2016183041中描述。在一些实施方案中，利用多个靶向已鉴定的保守区域的HLA Razor。通常应理解，靶向HLA中的保守区域的任何指导物、siRNA、shRNA或miRNA都可以充当HLARazor。

所提供的方法可用于细胞诸如但不限于多能干细胞、分化细胞和原代T细胞中MHCI类表达和/或MHC II类表达的可调控的失活或消除。在一些实施方案中，利用罕见切割核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和归巢核酸内切酶系统)的可调控基因组编辑技术也用于减低或消除细胞中参与先天和/或适应性免疫响应的基因的表达(例如，通过缺失参与先天和/或适应性免疫响应的基因的基因组DNA或通过将基因组DNA插入此类基因中，从而影响基因表达)。在某些实施方案中，可调控的基因组编辑技术或其他基因调节技术用于在人细胞中插入耐受诱导因子，使它们和由其制备的分化细胞成为低免疫原性细胞。因此，低免疫原性细胞降低或消除了一种或多种MHC I和MHC II表达的表达。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中是非免疫原性的(例如，不诱导先天和/或适应性免疫响应)。

在一些实施方案中，细胞包括修饰以可调控地增加CD47和选自由DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9组成的组的一种或多种因子的表达。

在一些实施方案中，细胞包含调控MHC I类分子、MHC II类分子或MHC I类和MHCII类分子的表达的一种或多种靶多核苷酸序列的可调控的基因组修饰或可调控的敲低。在一些实施方案中，可调控的基因编辑系统用于修饰一种或多种靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，可调控的RNAi系统用于敲低一种或多种靶多核苷酸序列的表达。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是选自包括B2M、CIITA和NLRC5的组的一种或多种。在一些实施方案中，细胞包含对B2M基因的可调控的基因编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对CIITA基因的可调控的基因编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对NLRC5基因的可调控的基因编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对B2M和CIITA基因的可调控的基因编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对B2M和NLRC5基因的可调控的基因编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对CIITA和NLRC5基因的可调控的基因编辑修饰。在许多实施方案中，细胞包含对B2M、CIITA和NLRC5基因的可调控的基因编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含靶向B2M基因的可调控的RNAi系统。在一些实施方案中，细胞包含靶向CIITA基因的可调控的RNAi系统。在一些实施方案中，细胞包含靶向NLRC5基因的可调控的RNAi系统。在一些实施方案中，细胞包含靶向B2M和CIITA基因的可调控的RNAi系统。在一些实施方案中，细胞包含靶向B2M和NLRC5基因的可调控的RNAi系统。在一些实施方案中，细胞包含靶向CIITA和NLRC5基因的可调控的RNAi系统。在许多实施方案中，细胞包含靶向B2M、CIITA和NLRC5基因的可调控的RNAi系统。在某些实施方案中，细胞的基因组已被改变以减少或缺失HLA表达的关键组分。在某些实施方案中，细胞包含靶向HLA表达的关键组分的可调控的RNAi系统。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料被另外修饰或工程化以具有改变的一种或多种基因的表达以产生工程化细胞。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞诸如心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞或视网膜色素上皮细胞、造血干细胞、原代NK细胞、CAR-NK细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)或其群，在该基因组中基因已被可调控地编辑以缺失基因组DNA的连续片段，从而降低或消除细胞或其群中一种或多种MHC I类分子的表面表达。在某些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞诸如心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞或视网膜色素上皮细胞、造血干细胞、原代NK细胞、CAR-NK细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)或其群，在该基因组中基因已被可调控地编辑以缺失基因组DNA的连续片段，从而降低或消除细胞或其群中一种或多种MHC II类分子的表面表达。在许多实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞诸如心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞或视网膜色素上皮细胞、造血干细胞、原代NK细胞、CAR-NK细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)或其群，在该基因组中一种或多种基因已被可调控地编辑以缺失基因组DNA的连续片段，从而降低或消除细胞或其群中一种或多种MHC I类和II类分子的表面表达。

在许多实施方案中，一种或多种MHC I分子和/或MHC II分子的表达通过靶向和缺失基因组DNA的连续片段来可调控地调控，从而降低或消除选自由B2M、CIITA和NLRC5组成的组的靶基因的表达。在一些实施方案中，本文描述了基因编辑的细胞(例如，修饰的人细胞)，其包含可调控的外源CD47蛋白和可调控地失活或修饰的CIITA基因序列，以及在一些情况下，可调控地失活或修饰B2M基因序列的另外的基因修饰。在一些实施方案中，本文描述了基因编辑的细胞，其包含可调控的外源CD47蛋白和可调控地失活或修饰的CIITA基因序列，以及在一些情况下，可调控地失活或修饰NLRC5基因序列的另外的基因修饰。在一些实施方案中，本文描述了基因编辑的细胞，其包含可调控的外源CD47蛋白和可调控地失活或修饰的B2M基因序列，以及在一些情况下，可调控地失活或修饰NLRC5基因序列的另外的基因修饰。在一些实施方案中，本文描述了基因编辑的细胞，其包含可调控的外源CD47蛋白和可调控地失活或修饰的B2M基因序列，以及在一些情况下，可调控地失活或修饰CIITA基因序列和NLRC5基因序列的另外的基因修饰。

本文提供了表现出一种或多种靶向多核苷酸序列的修饰的细胞，该修饰可调控地调控以下任一种的表达：(a)MHC I抗原分子，(b)MHC II抗原分子，(c)TCR复合物，(d)MHC I和II抗原分子，以及(e)MHC I和II抗原分子和TCR复合物。在某些实施方案中，修饰包括可调控地增加CD47的表达。在一些实施方案中，细胞包括外源或重组CD47多肽。在某些实施方案中，修饰包括嵌合抗原受体的可调控的表达。在一些实施方案中，细胞包含外源或重组嵌合抗原受体多肽。

在一些实施方案中，细胞包括可调控地调控一种或多种MHC I抗原分子、MHC II抗原分子和/或TCR复合物的表达的一种或多种靶多核苷酸序列的基因组修饰。在一些实施方案中，使用基因编辑系统来可调控地修饰一种或多种靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸序列靶向选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB组成的组的一种或多种基因。在某些实施方案中，T细胞(例如，从低免疫原性iPSC分化的T细胞和原代T细胞)的基因组已被改变以可调控地减少或缺失HLA和TCR表达的关键组分，例如，HLA-A抗原、HLA-B抗原、HLA-C抗原、HLA-DP抗原、HLA-DQ抗原、HLA-DR抗原、TCR-α和TCR-β。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞或其群，在该基因组中基因已被可调控地编辑以缺失基因组DNA的连续片段，从而降低或消除细胞或其群中一种或多种MHC I类分子的表面表达。在某些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞或其群，在该基因组中基因已被可调控地编辑以缺失基因组DNA的连续片段，从而降低或消除细胞或其群中一种或多种MHC II类分子的表面表达。在某些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞或其群，在该基因组中基因已被可调控地编辑以缺失基因组DNA的连续片段，从而降低或消除细胞或其群中TCR分子的表面表达。在许多实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞或其群，在该基因组中一种或多种基因已被可调控地编辑以缺失基因组DNA的连续片段，从而降低或消除细胞或其群中一种或多种MHC I类和II类分子和TCR复合物分子的表面表达。

在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括可调控地基因组编辑人细胞以切割CIITA基因序列以及可调控地编辑此类细胞的基因组以改变一种或多种另外的靶多核苷酸序列，诸如但不限于B2MTRAC和TRB。在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括可调控地基因组编辑人细胞以切割B2M基因序列以及可调控地编辑此类细胞的基因组以改变一种或多种另外的靶多核苷酸序列，诸如但不限于CIITA、TRAC和TRB。在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括可调控地基因组编辑人细胞以切割TRAC基因序列以及可调控地编辑此类细胞的基因组以改变一种或多种另外的靶多核苷酸序列，诸如但不限于B2MCIITA和TRB。在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括可调控地基因组编辑人细胞以切割TRB基因序列以及可调控地编辑此类细胞的基因组以改变一种或多种另外的靶多核苷酸序列，诸如但不限于B2M CIITA和TRAC。

本文提供了低免疫原性干细胞，其包含：i)相对于野生型干细胞，HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和TCR-β的可调控的降低的表达，其中该可调控的降低的表达是通过基于RNA的组分、基于DNA的组分或基于蛋白质的组分进行的，以及ii)一组外源基因，其包含编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码嵌合抗原受体(CAR)的第二可调控基因，其中该第一可调控基因和/或第二可调控基因被插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。本文还提供了包括任何亚型的原代T细胞的低免疫原性原代T细胞，其包含：i)相对于野生型原代T细胞，HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和TCR-β的可调控的降低的表达，其中该可调控的降低的表达是通过基于RNA的组分、基于DNA的组分或基于蛋白质的组分进行的，以及ii)一组外源基因，其包含编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码嵌合抗原受体(CAR)的第二可调控基因，其中该第一可调控基因和/或第二可调控基因被插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。本文还提供了从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的低免疫原性T细胞，其包含：i)相对于野生型原代T细胞，HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和TCR-β的可调控的降低的表达，其中该可调控的降低的表达是通过基于RNA的组分、基于DNA的组分或基于蛋白质的组分进行的，以及ii)一组外源基因，其包含编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码嵌合抗原受体(CAR)的第二可调控基因，其中该第一可调控基因和/或第二可调控基因被插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。

在一些实施方案中，所述工程化细胞群在施用至受体患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。在一些实施方案中，工程化细胞群通过NK细胞的一个或多个亚群逃避NK细胞介导的细胞毒性。在一些实施方案中，工程化细胞群在施用至受体患者后被NK细胞(包括未成熟和/或成熟NK细胞)保护免受细胞裂解。在一些实施方案中，工程化细胞群在施用至受体患者后逃避巨噬细胞吞噬。在一些实施方案中，工程化细胞群在施用至受体患者后不诱导对细胞的先天和/或适应性免疫响应。在一些实施方案中，工程化细胞群通过NK细胞的一个或多个亚群逃避NK细胞介导的细胞毒性，如通过体外测定或体内测定所确定的。在一些实施方案中，工程化细胞群在施用至受体患者后被NK细胞(包括未成熟和/或成熟NK细胞)保护免受细胞裂解，如通过体外测定或体内测定所确定的。在一些实施方案中，工程化细胞群在施用至受体患者后逃避巨噬细胞吞噬，如通过体外测定或体内测定所确定的。在一些实施方案中，工程化细胞群在施用至受体患者后不诱导对细胞的先天和/或适应性免疫响应，如通过体外测定或体内测定所确定的。

在一些实施方案中，本文所述的细胞包含安全开关。本文所用的术语“安全开关”是指用于控制感兴趣基因或蛋白质的表达的系统，当所述感兴趣基因或蛋白质下调或上调时，导致例如通过宿主免疫系统的识别来产生细胞的清除或死亡。安全开关可以被设计成在发生不良临床事件时由外源分子触发。可以通过调控DNA、RNA和蛋白质水平的表达来设计安全开关。安全开关包括允许响应于不良事件而控制细胞活性的蛋白质或分子。在一个实施方案中，安全开关是“杀伤开关”，其以无活性状态表达，并且在通过选择性的外部提供的剂活化开关时对表达安全开关的细胞是致命的。在一个实施方案中，安全开关基因相对于构建体中的感兴趣基因是顺式作用的。安全开关的活化引起细胞通过凋亡或坏死单独杀伤自身或杀伤自身和邻近细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞，例如干细胞、诱导性多能干细胞、造血干细胞、原代细胞或分化细胞，包括但不限于心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、CAR-T细胞、NK细胞和/或CAR-NK细胞，包含安全开关。

在一些实施方案中，安全开关包含抑制或阻断CD47与SIRPα的相互作用的治疗剂。在一些方面，CD47-SIRPα阻断剂是中和、阻断、拮抗或干扰CD47、SIRPα或两者的细胞表面表达的剂。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂抑制或阻断CD47、SIRPα或两者的相互作用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂(例如，CD47-SIRPα阻断剂、抑制剂、减少剂、拮抗剂、中和剂或干扰剂)包括选自包括以下的组的药剂：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含SIRPα的融合蛋白以及它们的组合。

在一些实施方案中，本文所述的细胞包含“自杀基因”(或“自杀开关”)。如果低免疫原性细胞以不期望的方式生长和分裂，则自杀基因会引起它们的死亡。自杀基因消融途径包括基因转移载体中的自杀基因，所述自杀基因编码仅在被指定化合物活化时才会导致细胞杀伤的蛋白质。自杀基因可以编码选择性地将无毒化合物转化成高毒性代谢物的酶。在一些实施方案中，本文所述的细胞，例如干细胞、诱导性多能干细胞、造血干细胞、原代细胞或分化细胞，包括但不限于心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、CAR-T细胞、NK细胞和/或CAR-NK细胞，包含自杀基因。

在一些实施方案中，所述工程化细胞群在施用至受体受试者后引发降低水平的免疫活化或不引发免疫活化。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中引发降低水平的全身性TH1活化或不引发全身性TH1活化。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中引发降低水平的外周血单核细胞(PBMC)的免疫活化或不引发PBMC的免疫活化。在一些实施方案中，细胞在施用至受体受试者后引发降低水平的针对细胞的供体特异性IgG抗体或不引发所述供体特异性IgG抗体。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中引发降低水平的针对细胞的IgM和IgG抗体产生或不引发所述IgM和IgG抗体产生。在一些实施方案中，细胞在施用至受体受试者后引发降低水平的细胞的细胞毒性T细胞杀伤。

B.条件性HIP细胞和用于条件性下调靶基因的方法

引入靶基因的可调控的降低的表达提高了使用低免疫原性细胞(HIP细胞)开发的细胞疗法的安全性。在一些实施方案中，靶基因的可调控的降低的表达使得可以避免从多能干细胞分化细胞时的潜在困难。在一些实施方案中，靶基因的可调控的降低的表达包括B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的可调控的降低的表达，诸如可调控的敲除或敲低。一种或多种靶基因的可调控的降低的表达起到控制受体受试者对移植的低免疫原性细胞的先天和/或适应性免疫响应的作用。

本文描述了用于降低靶基因的表达的方法，其涉及以受控方式“关闭”靶基因表达的机制。还描述了具有一种或多种靶基因的可调控的降低的表达的HIP细胞。在一些情况下，可诱导细胞敲除或敲低一种或多种靶基因的表达。

在一些实施方案中，引入受体受试者的细胞的低免疫性是通过免疫抑制分子(包括低免疫性因子和补体抑制剂)的过表达以及HLA-I和HLA-II基因座的抑制或遗传破坏来实现的。这些修饰从负责清除感染的恶性或非自身细胞(诸如T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞)的受体免疫系统效应细胞中隐藏细胞。从免疫系统中隐藏细胞允许同种异体细胞在体内存在和持续存在。所描述的任何免疫抑制分子的表达水平可以在细胞中的蛋白质水平、mRNA水平或DNA水平上进行控制。类似地，所描述的任何免疫信号传导分子的表达水平可以在细胞中的蛋白质水平、mRNA水平或DNA水平上进行控制。

在一些实施方案中，所描述的任何可调控的降低表达的方法(例如，RNA水平、DNA水平和蛋白质水平方法)用于降低细胞中靶蛋白的水平，使得靶蛋白的较低水平低于阈值水平。在一些实施方案中，细胞中靶蛋白的水平降低至低于表达阈值水平约10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1倍或0.5倍。在一些实施方案中，细胞中靶蛋白的水平降低至低于表达阈值水平约10倍至5倍、10倍至3倍、9倍至1倍、8倍至1倍、7倍至0.5倍、6倍至1倍、5倍至0.5倍、4倍至0.5倍、3倍至0.5倍、2倍至0.5倍或1倍至0.5倍。在一些实施方案中，靶蛋白的表达的阈值水平是基于此类因子在诱导性多能干细胞中的表达建立的。在一些实施方案中，靶蛋白的表达的阈值水平是基于相应低免疫细胞诸如MHC I和MHC II敲除细胞或MHCI/MHC II/TCR敲除细胞中靶蛋白的表达水平建立的。

1.基于RNA的组分

靶基因可以被shRNA、siRNA或miRNA靶向，从而导致编码因子的转录物降解。shRNA、siRNA或miRNA可以是外源提供的或遗传编码的以提供对抑制性RNA转录的控制。shRNA、siRNA或miRNA可以与靶基因的转录物退火，从而导致RISC复合物降解。

在一些实施方案中，用于诱导型RNA调控以下调靶基因表达的方法包括但不限于条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA、条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)和条件性或诱导型RNA靶向核酸酶。

在一些实施方案中，该方法包括靶向靶基因的RNA的shRNA、siRNA或miRNA。在一些情况下，shRNA、siRNA或miRNA的表达由小分子或生物剂诱导。在一些情况下，shRNA、siRNA或miRNA的表达由细胞条件诱导。

在一些实施方案中，提供了用于通过获得分离的细胞并引入含有条件性或诱导型RNA聚合酶启动子的构建体来控制哺乳动物细胞(例如，人细胞)的免疫原性的方法，该条件性或诱导型RNA聚合酶启动子与靶向靶基因的shRNA、siRNA或miRNA序列可操作地连接，该靶基因与组成型启动子可操作地连接，该组成型启动子与可控制诱导型RNA聚合酶启动子的反式活化因子元件可操作地连接。在一些实施方案中，构建体包括U6Tet启动子、靶向靶基因的shRNA、siRNA或miRNA、组成型启动子和响应于四环素或其衍生物(例如，多西环素)的Tet阻遏因子元件。在其他情况下，shRNA、siRNA或miRNA消除靶基因的表达。在其他情况下，shRNA、siRNA或miRNA使靶基因的表达降低约99％或更少，例如99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、90％、85％或更少。本文所述的任何组成型启动子、条件性启动子、诱导型启动子、靶基因和细胞均适用于该方法。

在许多实施方案中，工程化细胞表达靶向靶基因的诱导型shRNA、siRNA或miRNA。在一些实施方案中，RNA聚合酶、shRNA、siRNA或miRNA的表达在诱导型启动子的控制下，该诱导型启动子受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。在一些实施方案中，细胞与活化shRNA、siRNA或miRNA的表达以降解靶基因的因子接触，该因子诸如但不限于配体、分子、肽、小分子或生物剂。在一些实施方案中，RNA聚合酶、shRNA、siRNA或miRNA的表达处于适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关的控制下。在一些实施方案中，RNA聚合酶、shRNA、siRNA或miRNA的表达处于条件性启动子的控制下，该条件性启动子例如细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子或分化诱导型启动子。

在一些实施方案中，提供了用于通过获得分离的细胞并向该细胞中引入以下来控制哺乳动物细胞(例如，人细胞)的免疫原性的方法：(i)第一构建体，该第一构建体包含与靶向靶基因的shRNA、siRNA或miRNA可操作地连接的条件性或诱导型RNA聚合酶启动子，使得shRNA、siRNA或miRNA与对应于条件性或诱导型RNA聚合酶启动子的反式活化因子元件可操作地连接。

在一些实施方案中，该方法包括用于靶向靶基因的启动子以下调其转录的CRISPR干扰系统(CRISPRi)。在一些情况下，靶向靶基因的CRISPRi和/或gRNA的表达由小分子或生物剂诱导。在一些情况下，CRISPRi和/或gRNA的表达由细胞条件诱导。CRISPRi方法的详细描述见于例如Engreitz等人,Cold Spring Harb Perspect Biol,2019,11:a035386，其以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，CRISPRi系统利用dCas9阻遏因子融合蛋白，其受组成型启动子和处于条件性或诱导型启动子控制下的靶基因特异性gRNA控制。

在一些实施方案中，dCas9阻遏因子融合蛋白和/或gRNA的表达处于诱导型启动子的控制下，该诱导型启动子受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。在一些实施方案中，细胞与活化dCas9阻遏因子融合蛋白和/或gRNA的表达以降解靶基因的因子(诸如但不限于配体、分子、肽、小分子或生物剂)接触。在一些实施方案中，dCas9阻遏因子融合蛋白和/或gRNA的表达处于适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关的控制下。在一些实施方案中，dCas9阻遏因子融合蛋白和/或gRNA的表达处于条件性启动子的控制下，该条件性启动子例如细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子或分化诱导型启动子。

在一些实施方案中，基于CRISPR的方法包括用于靶向对应于靶基因(诸如但不限于Cas13、Cas7或Csx1)的mRNA序列的核酸酶。在一些情况下，靶向靶基因的核酸酶和/或gRNA的表达由小分子或生物剂诱导。在一些情况下，核酸酶和/或gRNA的表达由细胞条件诱导。

在一些实施方案中，核酸酶和/或gRNA的表达处于诱导型启动子的控制下，该诱导型启动子受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。在一些实施方案中，细胞与活化核酸酶和/或gRNA的表达以降解靶基因的因子(诸如但不限于配体、分子、肽、小分子或生物剂)接触。在一些实施方案中，核酸酶和/或gRNA的表达处于适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关的控制下。在一些实施方案中，核酸酶和/或gRNA的表达处于条件性启动子的控制下，该条件性启动子例如细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子或分化诱导型启动子。

在一些实施方案中，提供了用于通过获得分离的细胞并向该细胞中引入以下来控制哺乳动物细胞(例如，人细胞)的免疫原性的方法：(i)第一构建体，该第一构建体包含与编码Cas13a核酸酶、其变体或其融合蛋白的基因可操作地连接的组成型启动子；以及(iii)第二构建体，该第二构建体包含与靶向靶基因的gRNA序列可操作地连接的条件性或诱导型RNA聚合酶启动子，使得gRNA序列与对应于条件性或诱导型RNA聚合酶启动子的反式活化因子元件可操作地连接。

在一些实施方案中，可用于靶基因的RNA水平控制的诱导型表达系统包括但不限于配体诱导型转录因子系统、小分子诱导型系统、生物剂诱导型系统、受体介导的表达控制系统、适体介导的聚腺苷酸化调节剂(参见例如WO 2017/083747和WO 2021/041924，其内容以引用方式整体并入本文)和配体调控的核糖开关。在一些实施方案中，诱导型表达系统包含四环素控制的操纵子系统、合成的基于Notch(SynNotch)的系统(参见例如Morsut等人,Cell,2016,164:780-791和Yang等人,Commun Biol,2020,3:116)和通过配体(例如，适体、肽或小分子)介导的所得前体mRNA的可变剪接来调控靶基因的表达的核糖开关。有用的核糖开关包括感应配体的存在并改变靶基因的剪接的感应区和效应区。核糖开关gRNA的详述和实例见于例如US 9,228,207、US 9,993,491和US10,421,989，以及Seeliger等人,PLoSOne,2012,7(1):e29266；其内容以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，可用于靶基因的RNA水平控制的条件性表达系统包括但不限于条件性启动子控制下的方法，所述条件性启动子包括但不限于细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子。

在一些实施方案中，工程化细胞中的靶基因诸如B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD的水平被基于RNA的组分降低至低于表达阈值水平约10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1倍或0.5倍。在一些实施方案中，工程化细胞中的CD47的水平降低至低于表达阈值水平约10倍至5倍、10倍至3倍、9倍至1倍、8倍至1倍、7倍至0.5倍、6倍至1倍、5倍至0.5倍、4倍至0.5倍、3倍至0.5倍、2倍至0.5倍或1倍至0.5倍。在一些情况下，B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD表达的阈值水平基于诱导型多能干细胞中B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD的内源性表达来建立。在一些情况下，B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD表达的阈值水平基于野生型或未修饰细胞中B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD的内源性表达来建立。

2.基于DNA的组分

通过使用条件性或诱导型启动子对靶基因的转录调控提供了通过添加或去除生物剂或小分子(诸如但不限于多西环素)或通过改变细胞条件来打开或关闭基因表达的能力。通过靶向核酸酶活性的遗传破坏可以消除靶基因的表达。

在一些实施方案中，用于条件性或诱导型DNA调控的方法包括但不限于使用细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子、分化诱导型启动子、诱导型启动子、可控核糖开关和使用条件性或诱导型核酸酶(例如，条件性或诱导型CRISPR，条件性或诱导型TALEN，条件性或诱导型锌指核酸酶，条件性或诱导型归巢核酸内切酶，条件性或诱导型大范围核酸酶等)敲除以靶向一种或多种靶基因的DNA序列。在一些实施方案中，条件性或诱导型核酸酶包括这样的核酸酶，其表达受小分子的存在控制。在一些实施方案中，条件性或诱导型核酸酶包括这样的核酸酶，使得核酸酶RNA或蛋白质向细胞的递送受小分子的存在控制。在一些实施方案中，核酸酶的表达由小分子或生物剂诱导。在一些实施方案中，Cas核酸酶和/或引导RNA(gRNA)的表达由小分子或生物剂诱导。在一些情况下，Cas核酸酶和/或gRNA的表达由细胞条件诱导。

在一些实施方案中，用于诱导型表达的方法包括但不限于配体诱导型转录因子系统(例如，四环素控制的操纵子系统)、受体介导的表达系统控制(例如，SynNotch系统)和配体调控的用于控制mRNA或gRNA活性的核糖开关系统。诱导型表达方法的详述见于例如Kallunki等人,Cells,2019,796(doi:10.3390/cells8080796)，其以引用方式整体并入本文。

本文所述的任何组成型启动子、条件性启动子、诱导型启动子、靶基因和细胞均适用于该方法。

在一些实施方案中，本公开提供了一种产生干细胞(例如，低免疫原性多能干细胞或低免疫原性诱导性多能干细胞)或其分化细胞的方法，该干细胞或其分化细胞已被修饰以条件性地敲除或敲低选自由B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和RHD组成的组的靶基因中的任一种。

在一些实施方案中，可用于靶基因的DNA水平控制的诱导型表达系统包括但不限于配体诱导型转录因子系统、小分子诱导型系统、生物剂诱导型系统、受体介导的表达控制系统、适体介导的聚腺苷酸化调节剂(参见例如WO 2017/083747和WO 2021/041924，其内容以引用方式整体并入本文)和配体调节的核糖开关。在一些实施方案中，诱导型表达系统包含四环素控制的操纵子系统、合成的基于Notch(SynNotch)的系统(参见例如Morsut等人,Cell,2016,164:780-791和Yang等人,Commun Biol,2020,3:116)和通过配体(例如，适体、肽或小分子)介导的所得前体mRNA的可变剪接来调控靶基因的表达的核糖开关。有用的核糖开关包括感应配体的存在并改变靶基因的剪接的感应区和效应区。核糖开关gRNA的详述和实例见于例如US 9,228,207、US 9,993,491和US10,421,989，以及Seeliger等人,PLoSOne,2012,7(1):e29266；其内容以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，可用于靶基因的DNA水平控制的条件性表达系统包括但不限于条件性启动子控制下的方法，所述条件性启动子包括但不限于细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子。

在一些实施方案中，工程化细胞中的靶基因诸如B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD的水平被基于DNA的组分降低至低于表达阈值水平约10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1倍或0.5倍。在一些实施方案中，工程化细胞中的CD47的水平降低至低于表达阈值水平约10倍至5倍、10倍至3倍、9倍至1倍、8倍至1倍、7倍至0.5倍、6倍至1倍、5倍至0.5倍、4倍至0.5倍、3倍至0.5倍、2倍至0.5倍或1倍至0.5倍。在一些情况下，B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD表达的阈值水平基于诱导型多能干细胞中B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD的内源性表达来建立。在一些情况下，B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD表达的阈值水平基于野生型或未修饰细胞中B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD的内源性表达来建立。

3.基于蛋白质的组分

在一些实施方案中，通过基于降解决定子的方法建立靶蛋白的调控降解，该方法允许将靶蛋白募集至内源蛋白周转机制。靶向蛋白质降解的机制包括但不限于募集到E3连接酶以进行泛素化和随后的蛋白酶体降解、直接募集到蛋白酶体和募集到溶酶体。

在一些实施方案中，降解决定子进行诱导型蛋白质降解的方法包括但不限于使用SMASH标签的配体诱导型降解(LID)、使用Shield-1的配体诱导型降解、使用生长素的配体诱导型降解、使用雷帕霉素的配体诱导型降解、肽降解决定子(例如，基于IKZF3的降解决定子)和蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。在配体诱导型降解方法的一些实施方案中，降解决定子标签保持在非活性构象但被诱导采用在结合特定分子(诸如但不限于Shield-1分子)时能够被蛋白酶体识别的构象。参见例如Roth等人,Cellular Molecular Life Sciences,2019,76(14),2761-2777，其以引用方式整体并入本文。SMASH降解决定子技术的详细描述可以见于Hannah和Zhou,Nat Chem Biol,2015,11:637-638以及Chung等人,Nat ChemBiol,2015,11:713-720，它们以引用方式整体并入本文。LID降解决定子技术的详细描述可以见于Bonger等人,Nat Chem Biol,2011,7(8):531-7，其以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，提供了用于通过获得分离的细胞并引入含有条件性或诱导型启动子的构建体来控制哺乳动物细胞(例如，人细胞)的免疫原性的方法，该条件性或诱导型启动子与针对靶蛋白(例如，B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD)的肽蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)元件可操作地连接。

在肽降解决定子的一些实施方案中，使用将小分子介导的募集赋予E3连接酶的肽标签。在一些实施方案中，肽标签包含以免疫调节药物(IMiD)依赖性方式募集到E3连接酶受体(CRBN)的淋巴限制性转录因子IKZF3，如Koduri等人,Proc Natl Acad Sci,2019,116(7),2539-2544(其以引用方式整体并入本文)中所述。在某些实施方案中，降解决定子能够靶向靶蛋白以进行降解(例如，通过泛素化途径)、诱导蛋白质降解或降解蛋白质。

在PROTAC的一些实施方案中，使用双功能分子将靶蛋白募集到细胞的蛋白质降解机制。在一些实施方案中，双功能分子以高亲和力结合靶蛋白的天然或野生型序列。在一些实施方案中，双功能分子包括小分子或生物剂(例如，抗体或其片段)。参见例如Burslem等人,Cell Chemical Biology,2018,25,67-77和Roth等人,Cellular Molecular LifeSciences,2019,76(14),2761-2777，它们以引用方式整体并入本文。

在双功能抗体的一些实施方案中，抗体靶向靶蛋白以及导致内化和降解的第二内源受体。一种或多种靶蛋白的可控表达可以通过双功能抗体(例如，化学重编程的双功能抗体)、通过降解决定子进行的诱导型蛋白质降解、诱导型RNA调控、诱导型DNA调控和诱导型表达方法来提供。参见例如Natsume和Kanemaki,Annu Rev Genet,2017,51,82-102；Burslem和Crews,Chem Rev,2017,117,11269-11301；Banik等人,ChemRxiv,2019；它们以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，表达靶蛋白的细胞与结合细胞的抗体接触以进行降解。

在一些实施方案中，诱导型降解决定子元件选自配体诱导型降解决定子元件(诸如小分子辅助关闭(SMASH)降解决定子元件、Shield-1响应型降解决定子元件、生长素响应型降解决定子元件和雷帕霉素响应型降解决定子元件)、肽降解决定子元件和肽蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)元件。在有用的实施方案中，配体诱导型降解决定子元件是小分子辅助关闭(SMASH)降解决定子元件并且用于控制免疫原性的外源因子是阿孙普韦。在一些实施方案中，靶基因选自由B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和RHD组成的组。

在一些实施方案中，用于条件性或诱导型蛋白质调控的方法在细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子、分化诱导型启动子、诱导型启动子或可控核糖开关的控制下。在一些实施方案中，条件性或诱导型降解决定子的表达受小分子或生物剂的存在控制。在一些情况下，条件性或诱导型降解决定子的表达受细胞条件控制。

在一些实施方案中，本公开提供了一种产生干细胞(例如，低免疫原性多能干细胞或低免疫原性诱导性多能干细胞)或其分化细胞的方法，该干细胞或其分化细胞已被修饰以条件性地降解选自由B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和RHD组成的组的靶蛋白中的任一种。

在一些实施方案中，可用于靶基因的蛋白质水平控制的诱导型表达系统包括但不限于配体诱导型转录因子系统、小分子诱导型系统、生物剂诱导型系统、受体介导的表达控制系统、适体介导的聚腺苷酸化调节剂(参见例如WO 2017/083747和WO 2021/041924，其内容以引用方式整体并入本文)和配体调控的核糖开关。在一些实施方案中，诱导型表达系统包含四环素控制的操纵子系统、合成的基于Notch(SynNotch)的系统(参见例如Morsut等人,Cell,2016,164:780-791和Yang等人,Commun Biol,2020,3:116)和通过配体(例如，适体、肽或小分子)介导的所得前体mRNA的可变剪接来调控靶基因的表达的核糖开关。有用的核糖开关包括感应配体的存在并改变靶基因的剪接的感应区和效应区。核糖开关gRNA的详述和实例见于例如US 9,228,207、US 9,993,491和US10,421,989，以及Seeliger等人,PLoSOne,2012,7(1):e29266；其内容以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，可用于靶基因的蛋白质水平控制的条件性表达系统包括但不限于条件性启动子控制下的方法，所述条件性启动子包括但不限于细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子。

在一些实施方案中，工程化细胞中的靶蛋白诸如B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD的水平被基于蛋白质的组分降低至低于表达阈值水平约10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1倍或0.5倍。在一些实施方案中，工程化细胞中的CD47的水平降低至低于表达阈值水平约10倍至5倍、10倍至3倍、9倍至1倍、8倍至1倍、7倍至0.5倍、6倍至1倍、5倍至0.5倍、4倍至0.5倍、3倍至0.5倍、2倍至0.5倍或1倍至0.5倍。在一些情况下，B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD蛋白质的阈值水平基于诱导性多能干细胞中B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD的内源性蛋白质来建立。在一些情况下，B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD表达的阈值水平基于野生型或未修饰细胞中B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD的内源性表达来建立。

C.条件性HIP细胞和用于条件性上调转基因的方法

转基因的可调控过表达的引入提高了使用低免疫原性细胞(HIP细胞)开发的细胞疗法的安全性。本文所述的HIP细胞的特征是一种或多种免疫调控(免疫抑制)因子的可调控表达。在一些实施方案中，免疫抑制因子(本文也称为“低免疫性因子”)包括但不限于CD47、CD24、CD200、HLA-G、HLA-E、HLA-C、HLA-E重链、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、Serpinb9、CCl21和Mfge8。在某些实施方案中，免疫抑制因子是CD47。免疫抑制因子的可调控或可诱导表达用于控制接受移植的低免疫原性细胞的受体的先天和/或适应性免疫响应。

本文描述了以可控方式表达免疫信号传导因子以增加该因子的表达从而改变细胞的低免疫原性的方法。

一种或多种免疫抑制因子的可控表达可以通过使用降解决定子的诱导型配体稳定系统、诱导型RNA上调系统(例如，诱导型CRISPR活化)和诱导型DNA上调系统来提供。在一些实施方案中，诱导型DNA上调系统包含诱导型CRISPR活化(CRISPRa)、组织特异性启动子、诱导型启动子和核糖开关。

CRISPRa方法的详细描述见于例如Engreitz等人,Cold Spring Harb PerspectBiol,2019,11:a035386，其以引用方式整体并入本文。诱导型核糖开关的详细描述和实例见于例如US 9,228,207、US 9,993,491和US10,421,989，以及Seeliger等人,PLoS One,2012,7(1):e29266；它们的内容以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，工程化细胞包含外源多核苷酸，该外源多核苷酸包含编码一种或多种致耐受因子的条件性或诱导型转基因。在一些实施方案中，CD47的表达处于诱导型启动子的控制下，该诱导型启动子受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。在一些实施方案中，细胞与活化CD47的表达的因子(诸如但不限于配体、分子、肽、小分子或生物剂)接触。在一些实施方案中，CD47的表达处于适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关的控制下。在一些实施方案中，CD47的表达处于条件性启动子的控制下，该条件性启动子例如细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子或分化诱导型启动子。

在一些实施方案中，提供了用于通过获得分离的细胞并向该细胞中引入(i)包含编码一种或多种致耐受因子的条件性或诱导型转基因的第一构建体来控制哺乳动物细胞(例如，人细胞)的免疫原性的方法。

D.调控元件

启动子可以是任何天然或已知启动子的衍生物或修饰变体，包括天然或已知启动子的插入和缺失以及它们的组合或排列。还可以使用包含来自本文所述的两种或更多种不同启动子的序列元件的嵌合启动子。在任何情况下，可以容易地测试任何启动子在本文描述的细胞中的有效性。

对于多种宿主细胞，多种类型的适当的表达载体和合适的调控序列是本领域已知的。通常，一种或多种调控核苷酸序列可包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、聚腺苷酸化位点、Kozak共有序列和增强子或活化因子序列。

1.组成型启动子

本领域已知的任何组成型或普遍存在的启动子均可用于本公开。组成型或普遍存在的启动子的实例包括例如肌动蛋白启动子(例如，ACTB启动子)、白蛋白启动子、杆状病毒IE1启动子、β-肌动蛋白启动子、与衍生自巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子(CAG启动子)的增强子连接的β-肌动蛋白启动子、CaM-激酶启动子、CMV-HSV胸苷激酶启动子、胶原蛋白1A1启动子(Sokolov等人1995；Breault等人1997)、胶原1A2启动子(Akai等人1999；Antoniv等人2001)、二氢叶酸还原酶启动子、延伸因子1α(EF1α)启动子、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人,1981)、HPRT启动子、莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复区(MMLV LTR)、磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子、腺病毒(Ad)的E1A或主要晚期启动子(MLP)基因的启动子、RNA聚合酶pol I、pol II、pol III、U6或HI的启动子、微管蛋白启动子、泛素(UbC)启动子、波形蛋白启动子、病毒启动子(例如，禽肉瘤病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒(CMV))(Boshart等人,Cell,41:521-530(1985))、最小CMV启动子(Gossen和Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89:5547-5551)、禽痘病毒、乙型肝炎病毒、多瘤病毒、逆转录病毒、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、猿猴病毒40(SV40)。

2.诱导型启动子和元件

本领域已知的任何诱导型启动子均可用于本公开。术语“诱导型启动子”是指响应于内源性或外源性刺激(例如通过化学化合物(化学诱导剂))的存在或响应于环境、激素、化学和/或发育信号而选择性表达编码序列或功能性RNA的启动子。诱导型或调控型启动子包括例如由激素、类固醇、生长因子、细胞因子、细胞抑制剂、辐射、小分子、金属、热休克、光、四环素、干扰素、前药、适体等诱导或调控的启动子。可调控启动子的实例描述于以下文献中：Goverdhana等人,Mol Ther,12:189-211,2005；Agha-Mohammadi和Lotze,J ClinInvest,105:1177-1183；Mullick等人,BMC Biotech,6:43,2006；以及US20210155667，它们中的每一篇以其整体并入本文。

诱导型启动子的实例包括例如小分子或配体响应性启动子，包括例如脱落酸(ABA)系统(Liang等人,Sci Signal.2011年3月15日；4(164):rs2)、香豆霉素响应性启动子(Zhao等人,Hum Gene Ther.2003年11月20日；14(17):1619-29)、cumate调控型启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、多西环素诱导型启动子(例如，tre)(Bohl等人,(1998)Blood 92(5),1512-7)、蜕皮激素昆虫启动子(No等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))、GAL1-GAL10启动子、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)调控型启动子、乳糖诱导启动子、米非司酮响应性启动子(例如，GAL4-Elb启动子)、小鼠乳腺白血病病毒启动子、丙酮酸激酶启动子、雷帕霉素诱导型启动子(Magari等人,J Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))、RU486-诱导型系统(Wang等人,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang等人,Gene Ther.,4:432-441(1997))、四环素调控型启动子例如四环素抑制型系统(Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))或四环素诱导型系统[Gossen等人,Science,268:1766-1769(1995)；还参见Harvey等人,Curr.Opin.Chem.Biol,2:512-518(1998)；还参见US20210155667，全部以引用方式整体并入本文]；醇调控型启动子；环境/应激诱导型启动子，包括例如热休克响应启动子(例如，热休克70启动子)、缺氧驱动启动子、IL-8启动子、干扰素响应启动子、NF-Kb响应性启动子、pH调控型启动子；光响应性启动子，包括例如生动(VVD)系统、可光活化的(PA)-Tet-OFF/ON系统；金属响应性启动子，包括例如金属硫蛋白诱导型启动子(例如，铜诱导型ACEl、锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子)；发病机制调控型启动子，包括例如由水杨酸、乙烯或苯并噻二唑(BTH)诱导的启动子；RNA聚合酶诱导型启动子，包括例如T3RNA聚合酶启动子、T7聚合酶启动子系统(参见例如WO 98/10088，其以引用方式整体并入本文)；以及类固醇激素诱导型启动子，包括例如包含使启动子对激素受体的配体有响应的激素响应元件的启动子，其中激素受体包括例如雌激素、孕酮和糖皮质激素受体，并且其中配体包括生理配体，例如雌激素、孕酮或皮质醇，以及非生理配体，例如他莫昔芬、地塞米松。

在一些实施方案中，诱导型靶基因调控是通过诱导型CRISPR活化(CRISPRa)的方式进行的，包括例如与募集活化因子肽(例如SunTag)的支架融合的dCas9、与一系列活化结构域融合的dCas9(例如，dCas9-VPR)、与活化因子融合的dCas9，并且标记的gRNA募集其他活化因子(例如，SAM)。CRISPRa方法的详细描述见于例如Engreitz等人,Cold Spring HarbPerspect Biol,2019,11:a035386。

在一些实施方案中，诱导型靶基因调控是通过诱导型核糖开关/适体进行的。如本文所用，术语“适体”是指特异性结合配体的RNA多核苷酸。术语“配体”是指被适体特异性结合的分子。基因调控盒是指重组DNA构建体，当其掺入到靶基因的DNA中时，通过适体/配体介导的所得前mRNA的可变剪接来提供调控靶基因表达的能力。核糖开关含有感应区(例如，适体)和效应区，它们一起负责感测小分子配体的存在并改变对替代外显子的剪接。在一个实施方案中，当适体配体存在时，靶基因的表达增加，而当配体不存在时，靶基因的表达减少。诱导型核糖开关的详细描述和实例见于例如US 9,228,207、US 9,993,491和US10,421,989，以及Seeliger等人,PLoS One,2012,7(1):e29266。

在一些实施方案中，诱导型靶基因调控是通过调控融合蛋白进行的。真核细胞中的基因表达可以使用强启动子严格调控，该强启动子由操纵子控制，而该操纵子又由调控型融合蛋白(RFP)调控。RFP基本上由转录阻断结构域和调控其活性的配体结合结构域组成。在配体结合结构域的同源配体存在的情况下，RFP结合操纵子，从而阻止GOI的转录。当同源配体被撤除时，RFP被去稳定，并且目标核苷酸序列的转录继续进行。

在一些实施方案中，诱导型靶基因调控是通过降解决定子进行的。在一些实施方案中，降解决定子元件选自配体诱导型降解决定子元件、肽降解决定子元件和肽蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)元件。在一些实施方案中，配体诱导型降解决定子元件选自小分子辅助关闭(SMASH)降解决定子元件、Shield-1响应型降解决定子元件、生长素响应型降解决定子元件和雷帕霉素响应型降解决定子元件。在某些实施方案中，配体诱导型降解决定子元件是小分子辅助关闭(SMASH)降解决定子元件并且外源因子是阿孙普韦。在靶基因的可调控的上调的情况下，降解决定子元件可以是如Tan等人,Gene Regulation:Methods,第9卷,增刊1,S123,2004年5月1日中描述的降解决定子系统，其中含有ZFP TF的降解决定子可与可调控的开关诸如孕酮受体配体结合结构域组合，从而导致靶基因的米非司酮依赖性上调。

3.细胞周期特异性启动子

在一些实施方案中，条件靶基因调控是通过细胞周期特异性启动子进行的。细胞周期阶段特异性表达控制元件可选自细胞周期特异性启动子和以细胞周期特异性方式影响转录或翻译控制的其他元件。当表达控制元件是启动子时，启动子的选择将取决于选择用于研究的细胞周期的阶段。

本领域已知的任何细胞周期特异性启动子均可用于本公开。细胞周期特异性启动子的实例包括例如细胞周期蛋白B1启动子(Cogswell等人,Mol.Cell Biol.,(1995),15(5),2782-90；Hwang等人,J.Biol.Chem.,(1995),270(47),2841 9-24；Piaggio等人,Exp.Cell Res.,(1995),21 6(2),396-402)、Cdc25B启动子(Korner等人,J.Biol.Chem.,(2001),276(1 3),9662-9)；细胞周期蛋白A2启动子(Henglein等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,(1994),91(12),5490-4；Zwicker等人,Embo J.,(1995),14(18),451 4-22)、Cdc2启动子(Tommasi和Pfeifer,Mol.Cell Biol.,(1995),15(12),6901 -13；Zwicker等人,Embo J(1995),14(1 8),4514-22)、Cdc25C启动子(Korner和Muller,J.Biol.Chem.,(2000),275(25),1 8676-81；Korner等人,Nucl.Acids Res.,(1997),25(24),4933-9)、细胞周期蛋白E启动子(Botz等人,Mol.Cell Biol.,(1996),16(7),3401 -9；Korner和Muller,J.Biol.Chem.,(2000),275(25),18676-81)、Cdc6启动子(Hateboer等人,Mol.Cell Biol.,(1998),1 8(11),6679-97；Yan等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,(1998),95(7),3603-8)、DHFR启动子(Shimada等人,J.Biol.Chem.,(1986),261(3),1 445-52；Shimada和Nienhuis,J.Biol.Chem.,(1985),260(4),2468-74)、组蛋白启动子(vanWijnen等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,(1994),91,1 2882-12886)。

在一些实施方案中，细胞周期特异性IRES元件也用于本公开中。细胞周期特异性IRES元件的实例包括例如G2-IRES(Cornelis等人,Mol.Cell,(2000),5(4),597-605)；HCVIRES(Honda等人,Gastroenterology,(2000),1 1 8,1 52-1 62)；ODC IRES(Pyronet等人,Mol.Cell,(2000),5,607-61 6)；c-myc IRES(Pyronnet等人,Mol.Cell,(2000),5(4),607-1 6)和p58 PITSLRE IRES(Cornelis等人,Mol.Cell,(2000),5(4),597-605)。

4.组织特异性启动子和谱系特异性启动子

在一些实施方案中，启动子是空间限制性启动子(即，细胞类型特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子等)，使得在多细胞生物体中，启动子在特定细胞的亚群中具有活性(即，“ON”)。空间限制性启动子也可称为增强子、转录控制元件、控制序列等。可以使用任何方便的空间限制性启动子，并且合适的启动子的选择将取决于生物体。例如，对于植物、苍蝇、蠕虫、哺乳动物、小鼠等已知各种空间限制的启动子。因此，空间限制的启动子可用来取决于生物调节各种各样不同组织和细胞类型中的编码本发明定点修饰多肽的核酸的表达。一些空间限制的启动子还为时间限制的以使得启动子在胚胎发育的特定阶段过程中或在生物过程(例如，小鼠体内的毛囊周期)的特定阶段过程中处于“ON”状态或“OFF”状态。

在某些实施方案中，转基因的表达可以处于启动子的控制下，该启动子优先在某些谱系诸如呼吸细胞谱系、前列腺细胞谱系、胰腺细胞谱系、乳腺细胞谱系、肾细胞谱系、肠细胞谱系、神经细胞谱系、骨骼细胞谱系、血管细胞谱系、肝细胞谱系、造血细胞谱系、肌肉细胞谱系或心脏细胞谱系中启动转录。谱系特异性启动子的实例包括但不限于Sox-2启动子(神经祖细胞特异性，参见美国专利号7,781,214)、肌球蛋白轻链2启动子(心脏特异性，参见Huber I等人,FASEB J 2007,21:2551-63)、aMHC启动子(心脏特异性，参见Kita-Matsuo H,PLoS One 2009,4:e5046；Ritner C等人,PLoS One 2011,6:el6004)、Hb9启动子(运动神经元特异性，参见Singh等人,Exp Neurol 2005,196:224-34)、Dazl启动子(生殖细胞特异性，参见Nicholas CR等人,Genesis 2009,47:74-84)、白蛋白启动子(肝细胞特异性，参见Lavon N等人,Differentiation 2004,72:230-238)和Pdxl启动子(胰腺祖细胞特异性，参见Lavon N等人,Stem Cells 2006,24:1923-1930)。

在某些实施方案中，转基因的表达可以处于组织特异性启动子的控制下，诸如对于以下具有特异性的启动子：肝、胰腺(外分泌或内分泌部分)、脾、食道、胃、大肠或小肠、结肠、胃肠道、心脏、肺、肾、胸腺、甲状旁腺、松果体、垂体、乳腺、唾液腺、卵巢、子宫、子宫颈(例如，颈部)、前列腺、睾丸、生殖细胞、耳、眼、脑、视网膜、小脑、大脑、PNS或CNS、胎盘、肾上腺皮质或髓质、皮肤、淋巴结、肌肉、脂肪、骨、软骨、滑膜、骨髓、上皮、内皮、血管、神经组织等。组织特异性启动子还可以对某些疾病组织诸如癌症具有特异性。参见Fukazawa等人,Cancer Research 64:363-369,2004(以引用方式并入本文)。

本领域已知的任何组织特异性启动子均可用于本发明。仅为了说明，Chen等人(Nucleic Acid Research,第34卷,database issue,第D104-D107页,2006年)描述了TiProD，组织特异性启动子数据库(以引用方式并入本文)。具体地，TiProD是一些功能特征已知的人启动子序列的数据库。它允许用户查询各个启动子和它们介导的表达模式、各个组织的基因表达特征，并根据它们的组织特异性活性或根据相应基因所分配的各个基因本体术语检索启动子组。该数据库定义了组织特异性的量度，其允许用户区分普遍表达的基因和特异性表达的基因。数据库可在tiprod.cbi.pku dot edu.cn:8080/index.html访问。它覆盖了上述大部分(如果不是全部)组织。可以使用的其他启动子包括在<biobase/de/pages/ρroducts/transpor html>在线公开的启动子，其为具有按基因/活性分类的超过15,000个不同启动子序列的数据库。

心脏细胞特异性启动子的实例包括例如α-肌球蛋白重链启动子、AE3启动子、Aplnr启动子、心脏肌动蛋白启动子、心脏肌钙蛋白C启动子、结蛋白(DES)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子(任选地具有MCK或心脏肌钙蛋白-T增强子)、肌球蛋白轻链-2启动子、Nfatc1启动子和Npr3启动子(Franz等人(1997)Cardiovasc.Res.35:560-566；Robbins等人(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.752:492-505；Linn等人(1995)Circ.Res.76:584-591；Parmacek等人(1994)Mol.Cell.Biol.14:1870-1885；Hunter等人(1993)Hypertension 22:608-617；以及Sartorelli等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4047-4051)。

肌肉细胞特异性启动子的实例包括例如平滑肌α-肌动蛋白(SMA)启动子、SM-肌球蛋白重链启动子、calponin-h1启动子、SM22α启动子、血管α-肌动蛋白启动子、肠γ-肌动蛋白启动子、骨骼-α肌动蛋白(SkA)启动子、哺乳动物肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物结蛋白(DES)启动子、哺乳动物肌钙蛋白I(TNNI2)启动子和哺乳动物骨骼α-肌动蛋白(ASKA)启动子。

神经细胞特异性启动子的实例包括例如星形胶质细胞：神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(Smith-Arica等人,2000；Lee等人,2008)；GABA能神经元：谷氨酸脱羧酶(GAD)启动子(Rasmussen等人,2007)；谷氨酸能神经元：磷酸盐活化的谷氨酰胺酶(PAG)或囊状谷氨酸转运蛋白(vGLUT)启动子(Rasmussen等人,2007)；小神经胶质细胞：F4/80启动子、CD68启动子(Rosario等人,2016)；神经元：突触蛋白-1(Syn1)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Peel等人,1997；Kugler等人,2001；Kugler等人,2003；McLean等人,2014)；少突胶质细胞：髓磷脂碱性蛋白(MBP)(von Jonquieres等人,2013)或人髓磷脂相关糖蛋白(MAG)启动子，后者为全长和截短形式(von Jonquieres等人,2016)。神经细胞特异性启动子的其他实例包括例如芳族氨基酸脱羧酶(AADC)启动子、Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶II-α(CamKIIα)启动子(参见例如Mayford等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:13250；以及Casanova等人(2001)Genesis 31:37)、CMV增强子/血小板衍生的生长因子-β启动子(参见例如Liu等人(2004)Gene Therapy 11:52-60)、DAT启动子、DNMT启动子(参见例如Bartge等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3648-3652)、脑啡肽启动子(参见例如Comb等人(1988)EMBO J.17:3793-3805)、ENO2启动子、GnRH启动子(参见例如Radovick等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3402-3406)、L7启动子(参见例如Oberdick等人(1990)Science 248:223-226)、MAP2启动子、神经丝轻链基因启动子(Piccioli等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991))、神经丝启动子、NURR1启动子、PITX3启动子、S100启动子、血清素受体启动子(参见例如GenBank S62283)、突触蛋白启动子、Tau启动子、thy-1启动子(参见例如Chen等人(1987)Cell 51:7-19；以及Llewellyn等人(2010)Nat.Med.16(10):1161-1166)、TUBA1A启动子、TUJ1启动子、酪氨酸羟化酶启动子(TH)(参见例如Oh等人(2009)Gene Ther 16:437；Sasaoka等人(1992)Mol.Brain Res.16:274；Boundy等人(1998)J.Neurosci.18:9989；以及Kaneda等人(1991)Neuron 6:583-594)、VGF启动子(Piccioli等人,Neuron 15:373-84(1995))和VMAT2启动子。

神经胶质祖细胞特异性启动子的实例包括例如A2B5启动子、BLBP启动子、脑源性神经营养因子BDNF启动子、CD105启动子、CD11b启动子、CD11c启动子、CD133启动子、CD140a启动子、CD45启动子、CD9启动子、睫状神经营养因子CNTF启动子、连接蛋白43启动子、CX3CR1启动子、EGFR启动子、表皮生长因子EGF启动子、FGF8启动子、FOXG1启动子、GalC启动子、GAP-43启动子、GD3启动子、GLAST、谷氨酰胺合成酶启动子、IBA-1启动子、LNGFR启动子、MBP启动子、Musashi启动子、神经生长因子NGF启动子、巢蛋白启动子、神经营养因子-3NT-3启动子、NG2启动子、NKX2.2启动子、NT-4启动子、O4启动子、OLIG1启动子、OLIG2启动子、P2RY12启动子、PAX6启动子、PDGFαR启动子、S100β启动子、SOX10启动子、TMEM119启动子和波形蛋白启动子。

神经特异性启动子的其他实例包括例如2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶CNP启动子、Ach启动子、ASCL1启动子、β-微管蛋白启动子、钙结合蛋白启动子、c-fos启动子、ChAT启动子、corin启动子、CRF启动子、CTIP2启动子、二氨基联苯胺(DAB)启动子、DLX1启动子、DLX2启动子、DLX5启动子、DLX6启动子、多巴胺转运蛋白(DAT)启动子、双皮质素启动子、EMX2p75启动子、叉头盒蛋白A2 FOXA2启动子、叉头盒蛋白O1 FOXO1启动子、叉头盒蛋白O4FOXO4启动子、FOX3启动子、FOXG1启动子、G蛋白活化的内向整流钾通道2(GIRK2)启动子、γ-氨基丁酸GABA启动子、谷氨酸脱羧酶1GAD1启动子、谷氨酸离子型受体NMDA型亚基1GRIN1启动子、下丘脑分泌素启动子、胰岛素基因增强子蛋白(Isl1)启动子、LHX6启动子、LHX8启动子、LIM同源盒转录因子1-αLMX1A启动子、LIM同源盒转录因子l-β(LMX1B)启动子、AFB启动子、MAP2启动子、微管相关蛋白2(MAP-2)启动子、髓磷脂碱性蛋白MBP启动子、NADPH启动子、巢蛋白启动子、NGF启动子、NGFI-B启动子、NKX2.1启动子、NKX2.2启动子、NKX6.2启动子、NPAS1启动子、Nurr1启动子、NURR1启动子、OLIG2启动子、配对盒蛋白(Pax6)启动子、PAX6启动子、POMC启动子、PV启动子、RAX启动子、SATB2启动子、SIX6启动子、溶质载体家族1成员6SLC1A6启动子、SOX6启动子、SST启动子、TBR1启动子、TH启动子、微管蛋白β链3NEUN启动子、微管蛋白β链3TUB3启动子、TuJ1启动子、VAChT启动子和VGLUT1启动子。

内皮细胞特异性启动子的实例包括例如血管生成特异性启动子：Esm1、Apelin；动脉特异性启动子：Sox17启动子、Bmx启动子。内皮细胞特异性启动子的其他实例包括例如钙粘蛋白5(Cdh5，也称为血管内皮钙粘蛋白)启动子、内皮细胞蛋白C结合蛋白(EPCR)启动子、Fabp4启动子、Kdr(Flk1/VEGFR2)启动子、血小板衍生的生长因子B(PDGFB)启动子、Tek/Tie2启动子、在角质形成细胞的情况下的角蛋白启动子、在前列腺上皮的情况下的probasin启动子和VE钙粘蛋白启动子。

脑内皮细胞特异性启动子的实例包括例如晚期糖基化终产物特异性受体AGER启动子和多药耐药性相关蛋白5ABCC5、ATP-ABCC2结合盒转运蛋白ABCG2启动子、ATP依赖性移位酶ABCB1启动子、基底细胞粘附分子BCAM启动子、小管多特异性有机阴离子转运蛋白1ABCC2启动子、CD117(c-kit)启动子、CD146启动子、CD31启动子、CD34启动子、CD45启动子、claudin-5启动子、CXCR4启动子、eNOS启动子、兴奋性氨基酸转运蛋白3SLC1A1启动子、GLUT-1启动子、胰岛素受体INSR启动子、大中性氨基酸转运蛋白小亚基1SLC7A5启动子、瘦素受体LEPR启动子、低密度脂蛋白受体LDLR启动子、低密度脂蛋白受体相关蛋白1 LRP1启动子、多药耐药相关蛋白1ABCC1启动子、多药耐药相关蛋白4 ABCC4启动子、occludin启动子、PDGF启动子、PECAM-1启动子、p-糖蛋白启动子、视黄醇摄取受体STRA6启动子、SDF-1启动子、钠偶联中性氨基酸转运蛋白5SLC38A5启动子、溶质载体家族16成员1 SLC16A1启动子、转铁蛋白受体TFRC启动子、VE钙粘蛋白启动子、VE-钙粘蛋白启动子、VEGF启动子、vonWillebrand因子启动子和ZO-1启动子。

胰岛细胞特异性启动子的实例包括例如RIP启动子、胰岛祖细胞：Pdx1启动子(NT-009799)、Neurogenin 3启动子(NT-008583)、NeuroD1启动子(NT-005265)、巢蛋白启动子(NT-004858)和Ptf1a-p48启动子(NT-008705)、Pax6、Insm1、Nkx2-2启动子；成熟胰岛细胞：胰岛素启动子(GenBank登录号NT-009308)、胰高血糖素启动子(NT-022154)、生长抑素启动子(NT-005962)和胰多肽启动子(NT-010755)、MafB、MafA、Pcsk1、Iapp、G6pc2和Ins1启动子。

视网膜色素上皮细胞特异性启动子的实例包括例如β磷酸二酯酶基因启动子(Nicoud等人,(2007)J.Gene Med.9:1015)、视锥细胞视蛋白启动子(COP)、光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)基因增强子(Nicoud等人(2007))、IRBP基因启动子(Yokoyama等人(1992)Exp Eye Res.55:225)、红/绿视蛋白启动子(COP)、色素性视网膜炎基因启动子(Nicoud等人,(2007)同上)、视紫红质激酶启动子(Young等人(2003)Ophthalmol.Vis.Sci.44:4076)、视紫红质(ROD)启动子、胸腺细胞抗原(Thy1.2,6500bp)启动子和卵黄样黄斑营养不良(VMD2)启动子。

肝细胞特异性启动子的实例包括例如白蛋白(Miyatake等人JVirol,71:5124-32(1997))、甲胎蛋白(AFP)(Arbuthnot等人,Hum.Gene Ther,7:1503-14(1996))、乙型肝炎病毒核心启动子(Sandig等人,Gene Ther.,3:1002-9(1996))、人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、脂肪酸结合肠蛋白的启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、Apo AI和Apo AII启动子、α1-抗胰蛋白酶启动子和转甲状腺素蛋白启动子(Quian等人,(1995)Mol Cell Biol15,1364-1376；Bristol J A,Gallo-Penn A,Andrews J,Idamakanti N,Kaleko M,Connelly S.(2001)Hum Gene Ther第12卷(13):1651-61)。

甲状腺细胞特异性启动子的实例包括例如甲状腺球蛋白(Tg)启动子、甲状腺过氧化物酶(TPO)启动子和TSH受体(TSHr)启动子。

T细胞特异性启动子的实例包括例如CD2启动子(Hansal等人,JImmunol,161:1063-8(1998))、免疫球蛋白重链启动子和T细胞受体α链启动子。

癌细胞特异性启动子的实例包括例如在黑素瘤细胞和黑素细胞的情况下的酪氨酸酶启动子或TRP2启动子、在乳腺细胞和/或癌症的情况下的MMTV或WAP启动子、在肠细胞和/或癌症的情况下的绒毛蛋白或FABP启动子、在CNS细胞和/或癌症的情况下的巢蛋白或GFAP启动子，以及在肺癌的情况下的Clara细胞分泌蛋白启动子。

5.分化特异性启动子

本领域已知的任何分化特异性启动子均可用于本公开。分化特异性启动子的实例包括上述那些。组织特异性表达的另一种方法包括用于拷贝数依赖性、位置非依赖性转基因表达的“BAC TG-EMBED”方法，甚至在诱导静止和/或细胞分化成多种细胞类型之后，例如使用含有～200 kb的人GAPDH基因座和1.2kb人UBC启动子的GAPDH BAC(Chaturvedi等人,Gene Ther 25,376–391(2018))。

6.转录调控结构域：

本领域已知的任何转录调控结构域均可用于本公开。常见结构域包括，例如，转录因子结构域(活化因子、抑制因子、共活化因子、共抑制因子)、沉默子、癌基因(例如，myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mos家族成员等)；DNA修复酶及其相关因子和修饰因子；DNA重排酶及其相关因子和修饰因子；染色质相关蛋白及其修饰因子(例如，激酶、乙酰化酶和去乙酰化酶)；和DNA修饰酶(例如，甲基转移酶，诸如DNMT家族成员(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L等、拓扑异构酶、解旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、核酸内切酶)及其相关因子和修饰因子。参见例如美国公开号2013/0253040，其以引用方式整体并入本文。

本领域已知的任何转录活化因子均可用于本公开。转录活化因子的实例包括例如HSV VP 16活化结构域(参见例如Hagmann等人,J.Virol.71,5952-5962(1 97))核激素受体(参见例如Torchia等人,Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-383(1998))；核因子κB的p65亚基(Bitko和Bank,J.Virol.72:5610-5618(1998)及Doyle和Hunt,Neuroreport8:2937-2942(1997))；Liu等人,Cancer Gene Ther.5:3-28(1998))或人工嵌合功能结构域，诸如VP64(Beerli等人,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14623-33)和降解决定子(Molinari等人,(1999)EMBO J.18,6439-6447)。额外的示例性活化结构域包括Oct 1、Oct-2A、Spl、AP-2和CTF1(Seipel等人,EMBOJ.11,4961-4968(1992)以及p300、CBP、PCAF、SRC1 PvALF、AtHD2A和ERF-2。参见例如Robyr等人,(2000)Mol.Endocrinol.14:329-347；Collingwood等人,(1999)J.Mol.Endocrinol 23:255-275；Leo等人,(2000)Gene 245:1-11；Manteuffel-Cymborowska(1999)Acta Biochim.Pol.46:77-89；McKenna等人,(1999)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.69:3-12；Malik等人,(2000)Trends Biochem.Sci.25:277-283；以及Lemon等人,(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504。另外的示例性活化结构域包括但不限于OsGAI、HALF-1、Cl、AP1、ARF-5、-6、-1和-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1，参见例如Ogawa等人,(2000)Gene245:21-29；Okanami等人,(1996)Genes Cells 1:87-99；Goff等人,(1991)Genes Dev.5:298-309；Cho等人,(1999)Plant Mol Biol 40:419-429；Ulmason等人,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:5844-5849；Sprenger-Haussels等人,(2000)Plant J.22:1-8；Gong等人,(1999)Plant Mol.Biol.41:33-44；以及Hobo等人,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15,348-15,353。

本领域已知的任何增强子均可用于本公开。增强子的实例包括例如CMV增强子(eCMV)、RSV增强子和SV40增强子。

本领域已知的任何绝缘子元件均可用于本公开。绝缘子元件的实例包括例如cHS4(Chung等人,1993)和源自人HNRPA2B1-CBX3基因座的普遍存在的染色质开放元件(UCOE)(A2UCOE)。

本领域已知的任何组蛋白乙酰转移酶(HAT)均可用于本公开。HAT的实例包括例如A型核定位的诸如MYST家族成员MOZ、Ybf2/Sas3、MOF和Tip60、GNAT家族成员Gcn5或pCAF、p300家族成员CBP、p300和Rttl09(Bemdsen和Denu(2008)Curr Opin Struct Biol l8(6):682-689)。

本领域已知的任何组蛋白脱乙酰酶(HDAC)均可用于本公开。HDAC的实例包括例如I类(HDAC-l、2、3和8)、II类(HDAC IIA(HDAC-4、5、7和9)、HD AC IIB(HDAC 6和10))、IV类(HDAC-l 1)和III类(也称为sirtuin(SIRT)；SIRT1-7)(参见Mottamal等人,(2015)Molecules 20(3):3898-394l)。

本领域已知的任何组蛋白磷酸化酶或激酶均可用于本公开。组蛋白磷酸化酶或激酶的实例包括例如MSK1、MSK2、ATR、ATM、DNA-PK、Bubl、VprBP、IKK-a、PKCpi、Dik/Zip、JAK2、PKC5、WSTF和CK2。

本领域已知的任何甲基化结构域均可用于本公开。甲基化结构域的实例包括例如Ezh2、PRMT1/6、PRMT5/7、PRMT 2/6、CARM1、set7/9、MLL、ALL-1、Suv 39h、G9a、SETDB1、Ezh2、Set2、Dotl、PRMT 1/6、PRMT 5/7、PR-Set7和Suv4-20h。

本领域已知的涉及苏木化或生物素化的任何结构域均可用于本公开。参与苏木化或生物素化的结构域的实例包括例如Lys9、13、4、18和12(综述参见Kousarides(2007)Cell128:693-705)。

本领域已知的任何转录后调控元件均可用于本公开。转录后调控元件的实例包括例如乙型肝炎病毒(HBV)转录后调控元件(PRE)(HPRE)(Huang,Z.M.和Yen,T.S.(1995)Mol.Cell.Biol.15:3864-3869)和土拨鼠肝炎病毒(WHV)PRE(WPRE)(美国专利号6,136,597和6,287,814)。

7.逆转转基因沉默的其他方法

本领域已知的任何方法均可用于可调控地过表达转基因，例如CD47。可用于逆转转基因沉默和可调控地过表达转基因的方法的实例包括例如使用仅细胞质(非核)载体(非病毒mRNA载体或基于正链RNA的病毒载体，例如基于仙台病毒的载体)；CpG消融、CpG耗竭和最小化的DNA载体；向随机染色体位点中的多个转基因插入；位点特异性染色体整合；转基因的附加型定位(来自SV40、多瘤病毒、乳头状瘤病毒的紧凑附加型复制子；爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的EBNA1-oriP DNA片段可用于支持分裂实验室细胞的核质中质粒基因载体的维持)；在基因治疗载体中使用基因座控制区(染色质绝缘子或其他顺式作用基因座控制区(LCR))；重复载体施用以补偿沉默的转基因；转基因表达的小分子增强子(例如，已知影响染色质状态的物质，诸如组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A、4-苯基丁酸、丁酸、戊酸、己酸、丙戊酸和视黄酸；对用于基因转移的特定载体具有特异性的小分子增强子，例如，已知羟基脲在用AAV载体递送后增强转基因表达)；以及翻译后调控元件。参见例如Tolmachov等人(2013).Silencing of Transgene Expression:A Gene TherapyPerspective.10.5772/53379.

8.可调控的降低或过表达的时机

在一些实施方案中，靶基因的可调控的降低的表达包括B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB和/或RHD的可调控的降低的表达，诸如可调控的敲除或敲低。可调控的降低的表达可以在细胞的工程化和分化过程中的任何点开始。例如，可调控的降低的表达可以在第1天之间的任何时间点开始、引入或诱导，例如原代细胞分离的当天或细胞变成iPSC细胞的当天和细胞终末分化的当天。

在一些实施方案中，转基因的可调控的过表达包括外源多核苷酸的可调控的过表达，例如编码一种或多种致耐受因子的外源转基因的可调控的过表达。可调控的过表达可以在细胞的工程化和分化过程中的任何点开始。例如，可调控的过表达可以在第1天之间的任何时间点开始、引入或诱导，例如原代细胞分离的当天或细胞变成iPSC细胞的当天和细胞终末分化的当天。

E.CIITA

在一些实施方案中，本公开通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)II类反式活化因子(CIITA)表达来可调控地调节(例如，降低或消除)一种或多种MHC II基因的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)进行调节。在一些实施方案中，使用选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA和条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组的基于RNA的组分进行调节。在一些实施方案中，使用选自由敲除组成的组的基于DNA的组分、使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行调节。在一些实施方案中，使用条件性或诱导型降解决定子方法的基于蛋白质的组分进行调节。

CIITA是LR或核苷酸结合结构域(NBD)富亮氨酸重复序列(LRR)蛋白家族的成员，并且通过与MHC增强体缔合来调控MHC II的转录。

在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是CIITA的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CIITA的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CIITA的直向同源物。

在一些实施方案中，降低或消除的CIITA的表达降低或消除以下MHC II类中的一种或多种的表达：HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。

在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码CIITA蛋白的基因座处包含可调控的基因修饰。换句话说，细胞在CIITA基因座处包含可调控的遗传修饰。在一些情况下，编码CIITA蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NM_000246.4和NCBI Genbank No.U18259中列出。在一些情况下，CIITA基因座在NCBI Gene ID No.4261中描述。在某些情况下，CIITA的氨基酸序列被描绘为NCBI GenBank No.AAA88861.1。CIITA蛋白和基因座的额外描述可见于Uniprot No.P33076、HGNC Ref.No.7067和OMIM Ref.No.600005。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向CIITA基因的可调控的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向CIITA基因的可调控的遗传修饰是通过包含可调控的Cas蛋白或编码Cas蛋白的可调控的多核苷酸和至少一种用于特异性靶向CIITA基因的指导核糖核酸序列的可调控的罕见切割核酸内切酶进行的。在一些实施方案中，用于特异性靶向CIITA基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表12的SEQ IDNO:5184-36352组成的组。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫响应的能力降低。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在CIITA基因处。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含CIITA表达的可调控的敲除，使得细胞是可调控的CIITA^-/-。在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞可调控地将插入缺失引入到CIITA基因座中，使得细胞是可调控的CIITA^{插入缺失/插入缺失}。在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含CIITA表达的可调控的敲低，使得细胞是可调控的CIITA^敲低。

测试CIITA基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的CIITA基因的所得遗传修饰和HLA-II表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，CIITA蛋白表达使用对用CIITA蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

F.B2M

在一些实施方案中，本文公开的技术通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)辅助链B2M的表达来可调控地调节(例如，降低或消除)一种或多种MHC-I基因的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)进行调节。在一些实施方案中，使用选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA和条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组的基于RNA的组分进行调节。在一些实施方案中，使用选自由敲除或敲低组成的组的基于DNA的组分、使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行调节。在一些实施方案中，使用条件性或诱导型降解决定子方法的基于蛋白质的组分进行调节。

通过调节(例如，降低或缺失)B2M的表达，MHC-I分子的表面运输被阻断并且细胞被赋予低免疫原性。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫响应的能力降低。

在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是B2M的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是B2M的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是B2M的直向同源物。

在一些实施方案中，降低或消除的B2M的表达降低或消除以下MHC I分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。

在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码B2M蛋白的基因座处包含可调控的基因修饰。换句话说，细胞在B2M基因座处包含可调控的遗传修饰。在一些情况下，编码B2M蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NM_004048.4和Genbank No.AB021288.1中列出。在一些情况下，B2M基因座在NCBI Gene ID No.567中描述。在某些情况下，B2M的氨基酸序列被描绘为NCBI GenBank No.BAA35182.1。B2M蛋白和基因座的额外描述可见于Uniprot No.P61769、HGNC Ref.No.914和OMIM Ref.No.109700。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向B2M基因的可调控的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向B2M基因的可调控的遗传修饰是通过包含可调控的Cas蛋白或编码Cas蛋白的可调控的多核苷酸和至少一种用于特异性靶向B2M基因的指导核糖核酸序列的可调控的罕见切割核酸内切酶进行的。在一些实施方案中，用于特异性靶向B2M基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表15的SEQID NO:81240-85644组成的组。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在B2M基因处。

测试B2M基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的B2M基因的所得遗传修饰和HLA-I表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，B2M蛋白表达使用对用B2M蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含B2M表达的可调控的敲除，使得细胞是可调控的B2M^-/-。在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞可调控地将插入缺失引入到B2M基因座中，使得细胞是可调控的B2M^{插入缺失/插入缺失}。在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含B2M表达的可调控的敲低，使得细胞是可调控的B2M^敲低。

G.NLRC5

在某些实施方案中，本文公开的技术通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)NLR家族含有5/NOD27/CLR16.1的CARD结构域(NLRC5)的表达来可调控地调节(例如，降低或消除)一种或多种MHC-I基因的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)进行调节。在一些实施方案中，使用选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA和条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组的基于RNA的组分进行调节。在一些实施方案中，使用选自由敲除或敲低组成的组的基于DNA的组分、使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行调节。在一些实施方案中，使用条件性或诱导型降解决定子方法的基于蛋白质的组分进行调节。

NLRC5是MHC-I介导的免疫响应的关键调控子，并且与CIITA类似，NLRC5高度可被IFN-γ诱导并且可以易位到细胞核中。NLRC5活化MHC-I基因的启动子并且诱导MHC-I以及参与MHC-I抗原呈递的相关基因的转录。

在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLRC5的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLRC5的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLRC5的直向同源物。

在一些实施方案中，降低或消除的NLRC5的表达降低或消除以下MHC I分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。

在一些实施方案中，本文概述的细胞包含靶向NLRC5基因的可调控的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向NLRC5基因的可调控的遗传修饰是通过包含可调控的Cas蛋白或编码Cas蛋白的可调控的多核苷酸和至少一种用于特异性靶向NLRC5基因的指导核糖核酸序列的可调控的罕见切割核酸内切酶进行的。在一些实施方案中，用于特异性靶向NLRC5基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由WO2016183041的附录3或表14的SEQ ID NO:36353-81239组成的组，其公开内容通过引用整体并入本文。

测试NLRC5基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的NLRC5基因的所得遗传修饰和HLA-I表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，NLRC5蛋白表达使用对用NLRC5蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含NLRC5表达的可调控的敲除，使得细胞是可调控的NLRC5^-/-。在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞可调控地将插入缺失引入到NLRC5基因座中，使得细胞是可调控的NLRC5^{插入缺失/插入缺失}。在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含NLRC5表达的可调控的敲低，使得细胞是可调控的NLRC5^敲低。

H.TRAC

在某些实施方案中，本文公开的技术通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)T细胞受体α链恒定区的表达来可调控地调节(例如，降低或消除)TCR基因(包括TRAC基因)的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)进行调节。在一些实施方案中，使用选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA和条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组的基于RNA的组分进行调节。在一些实施方案中，使用选自由敲除或敲低组成的组的基于DNA的组分、使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行调节。在一些实施方案中，使用条件性或诱导型降解决定子方法的基于蛋白质的组分进行调节。

通过调节(例如，降低或缺失)TRAC的表达，TCR分子的表面运输被阻断。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫响应的能力也降低。

在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是TRAC的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRAC的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRAC的直向同源物。

在一些实施方案中，降低或消除的TRAC的表达降低或消除了TCR表面表达。

在一些实施方案中，细胞，诸如但不限于多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和源自原代T细胞的细胞在编码TRAC蛋白的基因座处包含可调控的基因修饰。换句话说，细胞在TRAC基因座处包含可调控的遗传修饰。在一些情况下，编码TRAC蛋白的核苷酸序列在Genbank No.X02592.1中列出。在一些情况下，TRAC基因座在RefSeq.No.NG_001332.3和NCBI Gene ID No.28755中描述。在某些情况下，TRAC的氨基酸序列被描绘为Uniprot No.P01848。TRAC蛋白和基因座的额外描述可见于UniprotNo.P01848、HGNC Ref.No.12029和OMIM Ref.No.186880。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向TRAC基因的可调控的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向TRAC基因的可调控的遗传修饰是通过包含可调控的Cas蛋白或编码Cas蛋白的可调控的多核苷酸和至少一种用于特异性靶向TRAC基因的指导核糖核酸序列的可调控的罕见切割核酸内切酶进行的。在一些实施方案中，用于特异性靶向TRAC基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由US20160348073(其通过引用并入本文)的SEQ IDNO:532-609和9102-9797组成的组。

测试TRAC基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的TRAC基因的所得遗传修饰和TCR表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，TRAC蛋白表达使用对用TRAC蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含TRAC表达的可调控的敲除，使得细胞是可调控的TRAC^-/-。在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞可调控地将插入缺失引入到TRAC基因座中，使得细胞是可调控的TRAC^{插入缺失/插入缺失}。在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含TRAC表达的可调控的敲低，使得细胞是可调控的TRAC^敲低。

I.TRB

在许多实施方案中，本文公开的技术通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)T细胞受体β链恒定区的表达来可调控地调节(例如，降低或消除)TCR基因(包括编码T细胞抗原受体β链的基因，例如，TRB、TRBC或TCRB基因)的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)进行调节。在一些实施方案中，使用选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA和条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组的基于RNA的组分进行调节。在一些实施方案中，使用选自由敲除或敲低组成的组的基于DNA的组分、使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行调节。在一些实施方案中，使用条件性或诱导型降解决定子方法的基于蛋白质的组分进行调节。

通过调节(例如，降低或缺失)TRB的表达，TCR分子的表面运输被阻断。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫响应的能力也降低。

在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是TRB的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRB的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRB的直向同源物。

在一些实施方案中，降低或消除的TRB的表达降低或消除了TCR表面表达。

在一些实施方案中，细胞，诸如但不限于多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和源自原代T细胞的细胞在编码TRB蛋白的基因座处包含可调控的基因修饰。换句话说，细胞在TRB基因座处包含可调控的遗传修饰。在一些情况下，编码TRB蛋白的核苷酸序列在UniProt No.P0DSE2中列出。在一些情况下，TRB基因座在RefSeq.No.NG_001333.2和NCBI Gene ID No.6957中描述。在某些情况下，TRB的氨基酸序列被描绘为Uniprot No.P01848。TRB蛋白和基因座的额外描述可见于GenBankNo.L36092.2、Uniprot No.P0DSE2和HGNC Ref.No.12155。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向TRB基因的可调控的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向TRB基因的可调控的遗传修饰是通过包含可调控的Cas蛋白或编码Cas蛋白的可调控的多核苷酸和至少一种用于特异性靶向TRB基因的指导核糖核酸序列的可调控的罕见切割核酸内切酶进行的。在一些实施方案中，用于特异性靶向TRB基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由US20160348073(其通过引用并入本文)的SEQ IDNO:610-765和9798-10532组成的组。

测试TRB基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的TRB基因的所得遗传修饰和TCR表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，TRB蛋白表达使用对用TRB蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含TRB表达的可调控的敲除，使得细胞是可调控的TRB^-/-。在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞可调控地将插入缺失引入到TRB基因座中，使得细胞是可调控的TRB^{插入缺失/插入缺失}。在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含TRB表达的可调控的敲低，使得细胞是可调控的TRB^敲低。

J.CD142

在某些实施方案中，本文公开的技术调节(例如，降低或消除)CD142的表达，CD142也称为组织因子、因子III和F3。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)进行调节。

在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CD142或CD142的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CD142的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CD142的直向同源物。

在一些实施方案中，本文概述的细胞包含靶向CD142基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向CD142基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向CD142基因的至少一个指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向CD142的gRNA序列的方法。

测试CD142基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的CD142基因的所得遗传修饰和CD142表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，CD142蛋白表达使用对用CD142蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

关于人CD142的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01M094530、HGNC No.3541、NCBI Gene ID 2152、NCBI RefSeq No.NM_001178096.1、NM_001993.4、NP_001171567.1和NP_001984.1、UniProt No.P13726等。

K.RHD

在一些实施方案中，本文公开的技术通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)RHD基因的表达来可调控地调节(例如，降低或消除)RhD抗原的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)进行调节。在一些实施方案中，使用选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA和条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组的基于RNA的组分进行调节。在一些实施方案中，使用选自由敲除或敲低组成的组的基于DNA的组分、使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行调节。在一些实施方案中，使用条件性或诱导型降解决定子方法的基于蛋白质的组分进行调节。

在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫响应的能力降低。

在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是RHD基因的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是RHD基因的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是RHD基因的直向同源物。

在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码RhD抗原蛋白的基因座处包含基因可调控修饰。换言之，细胞包含在RHD基因座处的可调控的遗传修饰。在一些情况下，编码RhD抗原蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NM_001127691.2、NM_001282868.1、NM_001282869.1、NM_001282871.1或NM_016124.4中或在GenbankNo.L08429中列出。在一些情况下，RHD基因基因座在NCBI Gene IDNo.6007中描述。在某些情况下，RhD抗原蛋白的氨基酸序列被描绘为NCBI GenBank No.AAA02679.1。RhD蛋白和基因基因座的其他描述可以见于UniprotNo.Q02161、HGNC Ref.No.10009和OMIM Ref.No.111680。

在一些实施方案中，本文概述的细胞包含靶向RHD基因的可调控的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向RHD基因的可调控的遗传修饰是通过使用可调控的基因编辑工具(诸如但不限于可调控的CRISPR/Cas、可调控的TALE核酸酶、可调控的锌指核酸酶、其他基于可调控的病毒的基因编辑系统或可调控的RNA干扰)对RHD基因进行可调控地基因编辑而产生的。在一些实施方案中，基因编辑靶向RHD基因的编码序列。在一些情况下，细胞不产生功能性RHD基因产物。在不存在RHD基因产物的情况下，细胞完全缺乏Rh血型抗原。

在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向RHD基因的可调控的遗传修饰包含可调控的Cas蛋白或编码可调控的Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向RHD基因的至少一种指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向RHD的gRNA序列的方法。

测试RHD基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的RHD基因的所得遗传修饰和RHD表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，RhD蛋白表达使用对用RhD蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

L.Y-连接的原钙粘附蛋白-11

在一些实施方案中，本文公开的技术通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)Y染色体基因的表达来可调控地调节(例如，降低或消除)一种或多种Y染色体基因的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)进行调节。在一些实施方案中，使用选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA和条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组的基于RNA的组分进行调节。在一些实施方案中，使用选自由敲除或敲低组成的组的基于DNA的组分、使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行调节。在一些实施方案中，使用条件性或诱导型降解决定子方法的基于蛋白质的组分进行调节。

在某些实施方案中，本文公开的技术通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)Y-连接的原钙粘附蛋白-11基因(例如，PCDH11Y)的表达来可调控地调节(例如，降低或消除)Y-连接的原钙粘附蛋白-11抗原的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)进行调节。在一些实施方案中，本文公开的技术通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)Y染色体基因的表达来可调控地调节(例如，降低或消除)一种或多种Y染色体基因的表达。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行调节。在一些实施方案中，使用选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA和条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组的基于RNA的组分进行调节。在一些实施方案中，使用选自由敲除或敲低组成的组的基于DNA的组分、使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行调节。在一些实施方案中，使用条件性或诱导型降解决定子方法的基于蛋白质的组分进行调节。

在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是PCDH11Y基因的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是PCDH11Y基因的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是PCDH11Y基因的直向同源物。

在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码Y-连接的原钙粘附蛋白-11抗原蛋白的基因座处包含可调控的基因修饰。换句话说，细胞在PCDH11Y基因座处包含可调控的遗传修饰。在一些情况下，编码Y-连接的原钙粘附蛋白-11抗原蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NNM_001278619.1、NM_032971.2、NM_032972.2、NM_032973.2或XM_017030082.1中或在Genbank No.AJ276803、AF277053、AF332216、AF332217、AJ564958、AJ564959、AJ564960、AJ564961、AJ564962、AJ564963、AJ564966或AJ56496中列出。在一些情况下，PCDH11Y基因座在NCBI Gene ID No.83259中描述。在某些情况下，Y-连接的原钙粘附蛋白-11抗原的氨基酸序列被描绘为NCBI GenBank No.CAC13122.1、AAL55729.1、AAK13468.1、AAK13469.1、CAD92429.1、CAD92430.1、CAD92431.1、CAD92432.1、CAD92433.1、CAD92434.1、CAD92437.1或CAD92440.1。Y-连接的原钙粘附蛋白-11抗原蛋白和基因座的其他描述可以见于Uniprot No.Q9BZA8、HGNC Ref.No.15813和OMIM Ref.No.400022。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向PCDH11Y基因的可调控的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向PCDH11Y基因的可调控的遗传修饰是通过使用可调控的基因编辑工具(诸如但不限于可调控的CRISPR/Cas、可调控的TALE核酸酶、可调控的锌指核酸酶、其他基于可调控的病毒的基因编辑系统或可调控的RNA干扰)对PCDH11Y基因进行可调控地基因编辑而产生的。在一些实施方案中，基因编辑靶向PCDH11Y基因的编码序列。在一些情况下，细胞不产生功能性PCDH11Y基因产物。在缺乏PCDH11Y基因产物的情况下，细胞完全缺乏Y-连接的原钙粘附蛋白-11抗原。

在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向PCDH11Y基因的可调控的遗传修饰包含可调控的Cas蛋白或编码可调控的Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向PCDH11Y基因的至少一种指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向PCDH11Y的gRNA序列的方法。

测试PCDH11Y基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR产生的PCDH11Y基因的遗传修饰和Y-连接的原钙粘附蛋白-11抗原蛋白表达的减少可以通过FACS分析来测定。在另一个实施方案中，Y-连接的原钙粘附蛋白-11抗原蛋白表达使用对用Y-连接的原钙粘附蛋白-11抗原蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

M.Y-连接的神经连接蛋白-4

在一些实施方案中，本文公开的技术通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)Y-连接的神经连接蛋白-4基因(例如，NLGN4Y)的表达来可调控地调节(例如，降低或消除)Y-连接的神经连接蛋白-4抗原的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)进行调节。在一些实施方案中，使用选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA和条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组的基于RNA的组分进行调节。在一些实施方案中，使用选自由敲除或敲低组成的组的基于DNA的组分、使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行调节。在一些实施方案中，使用条件性或诱导型降解决定子方法的基于蛋白质的组分进行调节。

在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是NLGN4Y基因的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLGN4Y基因的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLGN4Y基因的直向同源物。

在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码Y-连接的神经连接蛋白-4抗原蛋白的基因座处包含可调控的基因修饰。换句话说，细胞在NLGN4Y基因座处包含可调控的遗传修饰。在一些情况下，编码Y-连接的神经连接蛋白-4抗原蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NM_001164238.1、NM_001206850.1、NM_014893.4、XM_017030034.1、XM_017030035.1、XM_017030036.1、XM_017030037.1、XM_017030038.1、XM_017030040.1或XM_017030041.1中或在Genbank No.AF376804、AB023168、BX537428、AC010726、AC010879、AC010979、AC011903、BC032567、BC113525或BC113551中列出。在一些情况下，NLGN4Y基因座在NCBI Gene IDNo.22829中描述。在某些情况下，Y-连接的神经连接蛋白-4抗原的氨基酸序列被描绘为NCBI GenBank No.AAM46113.1、BAA76795.2、CAD97670.1、AA H32567.1、AAI13526.1或AAI13552.1。Y-连接的神经连接蛋白-4抗原蛋白和基因座的其他描述可以见于UniprotNo.Q8NFZ3、HGNC Ref.No.15529和OMIM Ref.No.400028。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向NLGN4Y基因的可调控的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向NLGN4Y基因的可调控的遗传修饰是通过使用可调控的基因编辑工具(诸如但不限于可调控的CRISPR/Cas、可调控的TALE核酸酶、可调控的锌指核酸酶、其他基于可调控的病毒的基因编辑系统或可调控的RNA干扰)对NLGN4Y基因进行基因编辑而产生的。在一些实施方案中，基因编辑靶向NLGN4Y基因的编码序列。在一些情况下，细胞不产生功能性NLGN4Y基因产物。在缺乏NLGN4Y基因产物的情况下，细胞完全缺乏Y-连接的神经连接蛋白-4抗原。

在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向NLGN4Y基因的可调控的遗传修饰包含可调控的Cas蛋白或编码可调控的Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向NLGN4Y基因的至少一种指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向NLGN4Y的gRNA序列的方法。

测试NLGN4Y基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR产生的NLGN4Y基因的遗传修饰和Y-连接的神经连接蛋白-4抗原蛋白表达的减少可以通过FACS分析来测定。在另一个实施方案中，Y-连接的神经连接蛋白-4抗原蛋白表达使用对用Y-连接的神经连接蛋白-4抗原蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

N.RHD

在一些实施方案中，本文公开的技术通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)RHD基因的表达来可调控地调节(例如，降低或消除)RhD抗原的表达。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行调节。在一些实施方案中，使用选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA和条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组的基于RNA的组分进行调节。在一些实施方案中，使用选自由敲除或敲低组成的组的基于DNA的组分、使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行调节。在一些实施方案中，使用条件性或诱导型降解决定子方法的基于蛋白质的组分进行调节。

在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码RhD抗原蛋白的基因座处包含可调控的基因修饰。换言之，细胞包含在RHD基因座处的可调控的遗传修饰。在一些情况下，编码RhD抗原蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NM_001127691.2、NM_001282868.1、NM_001282869.1、NM_001282871.1或NM_016124.4中或在GenbankNo.L08429中列出。在一些情况下，RHD基因基因座在NCBI Gene IDNo.6007中描述。在某些情况下，RhD抗原蛋白的氨基酸序列被描绘为NCBI GenBank No.AAA02679.1。RhD蛋白和基因基因座的其他描述可以见于Uniprot No.Q02161、HGNC Ref.No.10009和OMIM Ref.No.111680。

在一些实施方案中，本文概述的细胞包含靶向RHD基因的可调控的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向RHD基因的遗传修饰是通过使用可调控的基因编辑工具(诸如但不限于可调控的CRISPR/Cas、可调控的TALE核酸酶、可调控的锌指核酸酶、其他基于可调控的病毒的基因编辑系统或可调控的RNA干扰)对RHD基因进行基因编辑而产生的。在一些实施方案中，基因编辑靶向RHD基因的编码序列。在一些情况下，细胞不产生功能性RHD基因产物。在不存在RHD基因产物的情况下，细胞完全缺乏Rh血型抗原。

O.ABO

在一些实施方案中，本文公开的技术通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)ABO基因的表达来可调控地调节(例如，降低或消除)组织血型ABO系统转移酶(ABO)的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)进行调节。在一些实施方案中，使用选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA和条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组的基于RNA的组分进行调节。在一些实施方案中，使用选自由敲除或敲低组成的组的基于DNA的组分、使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行调节。在一些实施方案中，使用条件性或诱导型降解决定子方法的基于蛋白质的组分进行调节。

在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是ABO基因的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是ABO基因的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是ABO基因的直向同源物。

在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码ABO蛋白的基因座处包含可调控的基因修饰。换句话说，细胞在ABO基因座处包含可调控的遗传修饰。在一些情况下，编码ABO蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NM_020469.2中或在Genbank No.AF134412中列出。在一些情况下，ABO基因座在NCBI Gene ID No.28中描述。在某些情况下，ABO的氨基酸序列被描绘为NCBI GenBank No.AAD26572.1。ABO蛋白和基因座的额外描述可见于Uniprot No.P16442、HGNC Ref.No.79和OMIM Ref.No.110300。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向ABO基因的可调控的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向ABO基因的可调控的遗传修饰是通过使用可调控的基因编辑工具(诸如但不限于可调控的CRISPR/Cas、可调控的TALE核酸酶、可调控的锌指核酸酶、其他基于可调控的病毒的基因编辑系统或可调控的RNA干扰)对ABO基因进行基因编辑而产生的。在一些实施方案中，基因编辑靶向ABO基因的编码序列。在一些情况下，细胞不产生功能性ABO基因产物。在不存在ABO基因产物的情况下，细胞完全缺乏ABO蛋白。

在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向ABO基因的可调控的遗传修饰包含可调控的Cas蛋白或编码可调控的Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向ABO基因的至少一种指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向ABO的gRNA序列的方法。

测试ABO基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR产生的ABO基因的遗传修饰和ABO蛋白表达的减少可以通过FACS分析来测定。在另一个实施方案中，ABO蛋白表达使用对用ABO蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

P.MIC-A

在一些实施方案中，本文公开的技术通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)MIC-A基因的表达来可调控地调节(例如，降低或消除)一种或多种MHC I类多肽相关序列A(MIC-A)的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)进行调节。在一些实施方案中，使用选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA和条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组的基于RNA的组分进行调节。在一些实施方案中，使用选自由敲除或敲低组成的组的基于DNA的组分、使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行调节。在一些实施方案中，使用条件性或诱导型降解决定子方法的基于蛋白质的组分进行调节。

在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是MIC-A基因的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是MIC-A基因的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是MIC-A基因的直向同源物。

在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码MIC-A蛋白的基因座处包含可调控的基因修饰。换句话说，细胞在MIC-A基因座处包含可调控的遗传修饰。在一些情况下，编码MIC-A蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NM_000247.2中或在Genbank No.BC016929中列出。在一些情况下，MIC-A基因座在NCBI Gene ID No.100507436中描述。在某些情况下，MIC-A的氨基酸序列被描绘为NCBI GenBankNo.AAH16929.1。MIC-A蛋白和基因座的额外描述可见于Uniprot No.Q29983、HGNC Ref.No.7090和OMIM Ref.No.600169。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向MIC-A基因的可调控的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向MIC-A基因的可调控的遗传修饰是通过使用可调控的基因编辑工具(诸如但不限于可调控的CRISPR/Cas、可调控的TALE核酸酶、可调控的锌指核酸酶、其他基于可调控的病毒的基因编辑系统或可调控的RNA干扰)对MIC-A基因进行基因编辑而产生的。在一些实施方案中，基因编辑靶向MIC-A基因的编码序列。在一些情况下，细胞不产生功能性MIC-A基因产物。在不存在MIC-A基因产物的情况下，细胞完全缺乏MIC-A蛋白。

在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向MIC-A基因的可调控的遗传修饰包含可调控的Cas蛋白或编码可调控的Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向MIC-A基因的至少一种指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向MIC-A的gRNA序列的方法。

测试MIC-A基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR产生的MIC-A基因的遗传修饰和MIC-A蛋白表达的减少可以通过FACS分析来测定。在另一个实施方案中，MIC-A蛋白表达使用对用MIC-A蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

Q.MIC-B

在一些实施方案中，本文公开的技术通过可调控地靶向和调节(例如，降低或消除)MIC-B基因的表达来可调控地调节(例如，降低或消除)一种或多种MHC I类多肽相关序列B(MIC-B)的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)进行调节。在一些实施方案中，使用选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA和条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组的基于RNA的组分进行调节。在一些实施方案中，使用选自由敲除或敲低组成的组的基于DNA的组分、使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法进行调节。在一些实施方案中，使用条件性或诱导型降解决定子方法的基于蛋白质的组分进行调节。

在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是MIC-B基因的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是MIC-B基因的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是MIC-B基因的直向同源物。

在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码MIC-B蛋白的基因座处包含可调控的基因修饰。换句话说，细胞在MIC-B基因座处包含可调控的遗传修饰。在一些情况下，编码MIC-B蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NM_001289160.1中或在Genbank No.AK314228中列出。在一些情况下，MIC-B基因座在NCBI Gene ID No.4277中描述。在某些情况下，MIC-B的氨基酸序列被描绘为NCBI GenBank No.BAG36899.1。MIC-B蛋白和基因座的额外描述可见于Uniprot No.Q29980、HGNC Ref.No.7091和OMIM Ref.No.602436。

在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞包含靶向MIC-B基因的可调控的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向MIC-B基因的可调控的遗传修饰是通过使用可调控的基因编辑工具(诸如但不限于可调控的CRISPR/Cas、可调控的TALE核酸酶、可调控的锌指核酸酶、其他基于可调控的病毒的基因编辑系统或可调控的RNA干扰)对MIC-B基因进行基因编辑而产生的。在一些实施方案中，基因编辑靶向MIC-B基因的编码序列。在一些情况下，细胞不产生功能性MIC-B基因产物。在不存在MIC-B基因产物的情况下，细胞完全缺乏MIC-B蛋白。

在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向MIC-B基因的可调控的遗传修饰包含可调控的Cas蛋白或编码可调控的Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向MIC-B基因的至少一种指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向MIC-B的gRNA序列的方法。

测试MIC-B基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR产生的MIC-B基因的遗传修饰和MIC-B蛋白表达的减少可以通过FACS分析来测定。在另一个实施方案中，通过对用MIC-B蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测MIC-B蛋白表达。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

R.CTLA-4

在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CTLA-4或CTLA-4的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CTLA-4的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CTLA-4的直向同源物。

在一些实施方案中，本文概述的细胞包含靶向CTLA-4基因的遗传修饰。在某些实施方案中，原代T细胞包含靶向CTLA-4基因的遗传修饰。遗传修饰可以降低T细胞(包括原代T细胞和CAR-T细胞)中CTLA-4多核苷酸和CTLA-4多肽的表达。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向CTLA-4基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向CTLA-4基因的至少一个指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向CTLA-4的gRNA序列的方法。

测试CTLA-4基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的CTLA-4基因的所得遗传修饰和CTLA-4表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，CTLA-4蛋白表达使用对用CTLA-4蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

关于人CTLA-4的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC02P203867、HGNC No.2505、NCBI Gene ID 1493、NCBI RefSeq No.NM_005214.4、NM_001037631.2、NP_001032720.1和NP_005205.2、UniProt No.P16410等。

S.PD-1

在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是PD-1或PD-1的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是PD-1的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是PD-1的直向同源物。

在一些实施方案中，本文概述的细胞包含遗传修饰，所述遗传修饰靶向编码程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)蛋白的基因或靶向PDCD1基因。在某些实施方案中，原代T细胞包含靶向PDCD1基因的遗传修饰。遗传修饰可以降低T细胞(包括原代T细胞和CAR-T细胞)中PD-1多核苷酸和PD-1多肽的表达。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向PDCD1基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向PDCD1基因的至少一个指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向PD-1的gRNA序列的方法。

测试PDCD1基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的PDCD1基因的所得遗传修饰和PD-1表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，PD-1蛋白表达使用对用PD-1蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认灭活遗传修饰的存在。

关于人PD-1(包括PDCD1基因)的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC02M241849、HGNC No.8760、NCBI Gene ID 5133、Uniprot No.Q15116以及NCBI RefSeq No.NM_005018.2和NP_005009.2。

T.CD47

在一些实施方案中，本公开提供了一种已被修饰以可调控地过表达致耐受因子(例如，免疫调节多肽)CD47的细胞或其群。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以可调控地过表达CD47的方法。在一些实施方案中，干细胞可调控地过表达外源CD47。在一些情况下，细胞可调控地表达载体，所述表达载体包含编码人CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用同源定向修复对细胞进行遗传修饰以包含编码可调控的CD47的整合外源多核苷酸。在一些情况下，细胞可调控地表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，使得该核苷酸序列被插入到安全港或靶标基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞可调控地表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，其中该核苷酸序列被插入到AAVS1基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞可调控地表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，其中该核苷酸序列被插入到CCR5基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞可调控地表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，其中该核苷酸序列被插入到安全港基因座或靶标基因座(诸如但不限于CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座)的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞可调控地表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，其中该核苷酸序列被插入到TRAC基因座的至少一个等位基因中。

CD47是一种白细胞表面抗原，并且在细胞粘附和整联蛋白调节中发挥作用。它在细胞表面上表达，并且向循环巨噬细胞发出不要吞噬细胞的信号。

在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码与NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码具有NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含与NCBI Ref.No.NM_001777.3和NM_198793.2中列出的序列具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含NCBI Ref.Sequence No.NM_001777.3和NM_198793.2中列出的CD47核苷酸序列。在一些实施方案中，编码CD47多核苷酸的核苷酸序列是密码子优化序列。在一些实施方案中，编码CD47多核苷酸的核苷酸序列是人密码子优化序列。

在一些实施方案中，细胞包含与NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽在一些实施方案中，本文概述的细胞包含具有NCBI Ref.SequenceNo.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列的CD47多肽。。

表1中提供了具有信号序列和不具有信号序列的人CD47的示例性氨基酸序列。

表1.人CD47的氨基酸序列

在一些实施方案中，细胞包含与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少80％序列同一性(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的CD47多肽，其中该CD47多肽与具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CD47多肽具有基本上相同的生物学功能和活性。在一些实施方案中，细胞包含具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CD47多肽。在一些实施方案中，细胞包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少80％序列同一性(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的CD47多肽，其中该CD47多肽与具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CD47多肽具有基本上相同的生物学功能和活性。在一些实施方案中，细胞包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CD47多肽。

在一些实施方案中，细胞包含编码与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更高)的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含编码具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含编码与SEQ ID NO:130的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更高)的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含编码具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，对核苷酸序列进行密码子优化以在特定细胞中表达。

在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码CD47的可调控的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码CD47的可调控的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(CD142)、MICA、MICB、LRP1(CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的可调控的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的可调控的多核苷酸插入到本文提供的表16中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码CD47的可调控的多核苷酸可操作地连接至启动子。

在一些实施方案中，启动子是内源性或组成型启动子。在一些实施方案中，启动子是条件性或诱导型启动子。在一些实施方案中，条件性启动子是细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子或分化诱导型启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。

在一些实施方案中，细胞被工程化以相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达增加量的CD47。

增加的CD47表达的量可以测量为例如相对于未改变或未修饰的野生型细胞的表达的倍数(multiple)、倍数(fold)或百分比。例如，在一些实施方案中，本文所述的细胞表达的CD47的水平是相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的至少约1x、至少约1.1x、至少约1.2x、至少约1.3x、至少约1.4x、至少约1.5x、至少约1.6x、至少约1.7x、至少约1.8x、至少约1.9x、至少约2x、至少约2.1x、至少约2.2x、至少约2.3x、至少约2.4x、至少约2.5x、至少约2.6x、至少约2.7x、至少约2.8x、至少约2.9x、至少约3x、至少约3.1x、至少约3.2x、至少约3.3x、至少约3.4x、至少约3.5x、至少约3.6x、至少约3.7x、至少约3.8x、至少约3.9x、至少约4x、至少约4.1x、至少约4.2x、至少约4.3x、至少约4.4x、至少约4.5x、至少约4.6x、至少约4.7x、至少约4.8x、至少约4.9x、至少约5x、至少约5.1x、至少约5.2x、至少约5.3x、至少约5.4x、至少约5.5x、至少约5.6x、至少约5.7x、至少约5.8x、至少约5.9x、至少约6x、至少约6.1x、至少约6.2x、至少约6.3x、至少约6.4x、至少约6.5x、至少约6.6x、至少约6.7x、至少约6.8x、至少约6.9x、至少约7x、至少约7.1x、至少约7.2x、至少约7.3x、至少约7.4x、至少约7.5x、至少约7.6x、至少约7.7x、至少约7.8x、至少约7.9x、至少约8x、至少约8.1x、至少约8.2x、至少约8.3x、至少约8.4x、至少约8.5x、至少约8.6x、至少约8.7x、至少约8.8x、至少约8.9x、至少约9x、至少约9.1x、至少约9.2x、至少约9.3x、至少约9.4x、至少约9.5x、至少约9.6x、至少约9.7x、至少约9.8x、至少约9.9x、至少约10x或更高。

在一些实施方案中，本文所述的细胞表达的CD47的水平是相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的至少约1倍、至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.1倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍、至少约3倍、至少约3.1倍、至少约3.2倍、至少约3.3倍、至少约3.4倍、至少约3.5倍、至少约3.6倍、至少约3.7倍、至少约3.8倍、至少约3.9倍、至少约4倍、至少约4.1倍、至少约4.2倍、至少约4.3倍、至少约4.4倍、至少约4.5倍、至少约4.6倍、至少约4.7倍、至少约4.8倍、至少约4.9倍、至少约5倍、至少约5.1倍、至少约5.2倍、至少约5.3倍、至少约5.4倍、至少约5.5倍、至少约5.6倍、至少约5.7倍、至少约5.8倍、至少约5.9倍、至少约6倍、至少约6.1倍、至少约6.2倍、至少约6.3倍、至少约6.4倍、至少约6.5倍、至少约6.6倍、至少约6.7倍、至少约6.8倍、至少约6.9倍、至少约7倍、至少约7.1倍、至少约7.2倍、至少约7.3倍、至少约7.4倍、至少约7.5倍、至少约7.6倍、至少约7.7倍、至少约7.8倍、至少约7.9倍、至少约8倍、至少约8.1倍、至少约8.2倍、至少约8.3倍、至少约8.4倍、至少约8.5倍、至少约8.6倍、至少约8.7倍、至少约8.8倍、至少约8.9倍、至少约9倍、至少约9.1倍、至少约9.2倍、至少约9.3倍、至少约9.4倍、至少约9.5倍、至少约9.6倍、至少约9.7倍、至少约9.8倍、至少约9.9倍、至少约10倍或更高。

在一些实施方案中，本文所述的细胞表达的CD47的水平是相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约550％、至少约600％、至少约650％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％、至少约1500％、至少约2000％、至少约2500％、至少约3000％、至少约3500％、至少约4000％、至少约4500％、至少约5000％、至少约5500％、至少约6000％、至少约6500％、至少约7000％、至少约7500％、至少约8000％、至少约8500％、至少约9000％、至少约10000％或更高。

增加的CD47表达的量也可以测量为例如相对于未改变或未修饰的野生型细胞的表达增加的倍数(multiple)、倍数(fold)或百分比。例如，在一些实施方案中，相对于相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的CD47的水平，本文所述的细胞表达高至少约0.1x、高至少约0.1x、高至少约0.2x、高至少约0.3x、高至少约0.4x、高至少约0.5x、高至少约0.6x、高至少约0.7x、高至少约0.8x、高至少约0.9x、高至少约2x、高至少约1x、高至少约1.1x、高至少约1.2x、高至少约1.3x、高至少约1.4x、高至少约1.5x、高至少约1.6x、高至少约1.7x、高至少约1.8x、高至少约1.9x、高至少约2x、高至少约2.1x、高至少约2.2x、高至少约2.3x、高至少约2.4x、高至少约2.5x、高至少约2.6x、高至少约2.7x、高至少约2.8x、高至少约2.9x、高至少约3x、高至少约3.1x、高至少约3.2x、高至少约3.3x、高至少约3.4x、高至少约3.5x、高至少约3.6x、高至少约3.7x、高至少约3.8x、高至少约3.9x、高至少约4x、高至少约4.1x、高至少约4.2x、高至少约4.3x、高至少约4.4x、高至少约4.5x、高至少约4.6x、高至少约4.7x、高至少约4.8x、高至少约4.9x、高至少约5x、高至少约5.1x、高至少约5.2x、高至少约5.3x、高至少约5.4x、高至少约5.5x、高至少约5.6x、高至少约5.7x、高至少约5.8x、高至少约5.9x、高至少约6x、高至少约6.1x、高至少约6.2x、高至少约6.3x、高至少约6.4x、高至少约6.5x、高至少约6.6x、高至少约6.7x、高至少约6.8x、高至少约6.9x、高至少约7x、高至少约7.1x、高至少约7.2x、高至少约7.3x、高至少约7.4x、高至少约7.5x、高至少约7.6x、高至少约7.7x、高至少约7.8x、高至少约7.9x、高至少约8x、高至少约8.1x、高至少约8.2x、高至少约8.3x、高至少约8.4x、高至少约8.5x、高至少约8.6x、高至少约8.7x、高至少约8.8x、高至少约8.9x、高至少约9x、高至少约9.1x、高至少约9.2x、高至少约9.3x、高至少约9.4x、高至少约9.5x、高至少约9.6x、高至少约9.7x、高至少约9.8x、高至少约9.9x、高至少约10x或更高的量的CD47表达。

在一些实施方案中，相对于相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的CD47的水平，本文所述的细胞表达高至少约0.1倍、高至少约0.2倍、高至少约0.3倍、高至少约0.4倍、高至少约0.5倍、高至少约0.6倍、高至少约0.7倍、高至少约0.8倍、高至少约0.9倍、高至少约1倍、高至少约1.1倍、高至少约1.2倍、高至少约1.3倍、高至少约1.4倍、高至少约1.5倍、高至少约1.6倍、高至少约1.7倍、高至少约1.8倍、高至少约1.9倍、高至少约2倍、高至少约2.1倍、高至少约2.2倍、高至少约2.3倍、高至少约2.4倍、高至少约2.5倍、高至少约2.6倍、高至少约2.7倍、高至少约2.8倍、高至少约2.9倍、高至少约3倍、高至少约3.1倍、高至少约3.2倍、高至少约3.3倍、高至少约3.4倍、高至少约3.5倍、高至少约3.6倍、高至少约3.7倍、高至少约3.8倍、高至少约3.9倍、高至少约4倍、高至少约4.1倍、高至少约4.2倍、高至少约4.3倍、高至少约4.4倍、高至少约4.5倍、高至少约4.6倍、高至少约4.7倍、高至少约4.8倍、高至少约4.9倍、高至少约5倍、高至少约5.1倍、高至少约5.2倍、高至少约5.3倍、高至少约5.4倍、高至少约5.5倍、高至少约5.6倍、高至少约5.7倍、高至少约5.8倍、高至少约5.9倍、高至少约6倍、高至少约6.1倍、高至少约6.2倍、高至少约6.3倍、高至少约6.4倍、高至少约6.5倍、高至少约6.6倍、高至少约6.7倍、高至少约6.8倍、高至少约6.9倍、高至少约7倍、高至少约7.1倍、高至少约7.2倍、高至少约7.3倍、高至少约7.4倍、高至少约7.5倍、高至少约7.6倍、高至少约7.7倍、高至少约7.8倍、高至少约7.9倍、高至少约8倍、高至少约8.1倍、高至少约8.2倍、高至少约8.3倍、高至少约8.4倍、高至少约8.5倍、高至少约8.6倍、高至少约8.7倍、高至少约8.8倍、高至少约8.9倍、高至少约9倍、高至少约9.1倍、高至少约9.2倍、高至少约9.3倍、高至少约9.4倍、高至少约9.5倍、高至少约9.6倍、高至少约9.7倍、高至少约9.8倍、高至少约9.9倍、高至少约10倍或更高的量的CD47表达。

在一些实施方案中，相对于相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的CD47的水平，本文所述的细胞表达高至少约10％、高至少约20％、高至少约30％、高至少约40％、高至少约50％、高至少约60％、高至少约70％、高至少约80％、高至少约90％、高至少约100％、高至少约125％、高至少约150％、高至少约200％、高至少约250％、高至少约300％、高至少约350％、高至少约400％、高至少约450％、高至少约500％、高至少约550％、高至少约600％、高至少约650％、高至少约700％、高至少约750％、高至少约800％、高至少约850％、高至少约900％、高至少约950％、高至少约1000％、高至少约1500％、高至少约2000％、高至少约2500％、高至少约3000％、高至少约3500％、高至少约4000％、高至少约4500％、高至少约5000％、高至少约5500％、高至少约6000％、高至少约6500％、高至少约7000％、高至少约7500％、高至少约8000％、高至少约8500％、高至少约9000％、高至少约10000％或更高的量的CD47表达。

CD47表达的量也可以测量为例如细胞的CD47分子的数量。例如，在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约150,000至约1,000,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约150,000至约200,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约200,000至约250,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约250,000至约300,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约300,000至约350,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约350,000至约400,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约400,000至约450,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约450,000至约500,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约500,000至约550,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约550,000至约600,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约600,000至约650,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约650,000至约700,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约700,000至约750,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约750,000至约800,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约800,000至约850,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约850,000至约900,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约900,000至约950,000个CD47分子。在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达约950,000至约1,000,000个CD47分子。

在一些实施方案中，本文所述的细胞每个细胞表达至少约180,000个CD47分子、至少约190,000个CD47分子、至少约200,000个CD47分子、至少约210,000个CD47分子、至少约220,000个CD47分子、至少约230,000个CD47分子、至少约240,000个CD47分子、至少约250,000个CD47分子、至少约260,000个CD47分子、至少约270,000个CD47分子、至少约280,000个CD47分子、至少约290,000个CD47分子、至少约300,000个CD47分子、至少约210,000个CD47分子、至少约220,000个CD47分子、至少约230,000个CD47分子、至少约240,000个CD47分子、至少约250,000个CD47分子、至少约260,000个CD47分子、至少约270,000个CD47分子、至少约280,000个CD47分子、至少约290,000个CD47分子、至少约300,000个CD47分子、至少约210,000个CD47分子、至少约220,000个CD47分子、至少约230,000个CD47分子、至少约240,000个CD47分子、至少约250,000个CD47分子、至少约260,000个CD47分子、至少约270,000个CD47分子、至少约280,000个CD47分子、至少约290,000个CD47分子、至少约300,000个CD47分子、至少约310,000个CD47分子、至少约320,000个CD47分子、至少约330,000个CD47分子、至少约340,000个CD47分子、至少约350,000个CD47分子、至少约360,000个CD47分子、至少约370,000个CD47分子、至少约380,000个CD47分子、至少约390,000个CD47分子、至少约400,000个CD47分子、至少约410,000个CD47分子、至少约420,000个CD47分子、至少约430,000个CD47分子、至少约440,000个CD47分子、至少约450,000个CD47分子、至少约460,000个CD47分子、至少约470,000个CD47分子、至少约480,000个CD47分子、至少约490,000个CD47分子、至少约500,000个CD47分子、至少约510,000个CD47分子、至少约520,000个CD47分子、至少约530,000个CD47分子、至少约540,000个CD47分子、至少约550,000个CD47分子、至少约560,000个CD47分子、至少约570,000个CD47分子、至少约580,000个CD47分子、至少约590,000个CD47分子、至少约600,000个CD47分子、至少约610,000个CD47分子、至少约620,000个CD47分子、至少约630,000个CD47分子、至少约640,000个CD47分子、至少约650,000个CD47分子、至少约660,000个CD47分子、至少约670,000个CD47分子、至少约680,000个CD47分子、至少约690,000个CD47分子、至少约700,000个CD47分子、至少约710,000个CD47分子、至少约720,000个CD47分子、至少约730,000个CD47分子、至少约240,000个CD47分子、至少约750,000个CD47分子、至少约760,000个CD47分子、至少约770,000个CD47分子、至少约780,000个CD47分子、至少约790,000个CD47分子、至少约800,000个CD47分子、至少约810,000个CD47分子、至少约820,000个CD47分子、至少约830,000个CD47分子、至少约840,000个CD47分子、至少约850,000个CD47分子、至少约860,000个CD47分子、至少约870,000个CD47分子、至少约880,000个CD47分子、至少约890,000个CD47分子、至少约900,000个CD47分子、至少约910,000个CD47分子、至少约920,000个CD47分子、至少约930,000个CD47分子、至少约940,000个CD47分子、至少约950,000个CD47分子、至少约960,000个CD47分子、至少约970,000个CD47分子、至少约980,000个CD47分子、至少约990,000个CD47分子或至少约1,000,000个CD47分子。

表达水平可归因于本领域技术人员已知的多种因素。例如，编码CD47的外源多核苷酸的表达水平可以受以下多种因素的影响：细胞中的外源多核苷酸的拷贝数，例如细胞中的外源多核苷酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝；存在的调控元件，例如本文所述或本领域已知的任何调控元件，包括本文所述或本领域已知的任何组成型、诱导型或条件性启动子；外源多核苷酸插入细胞基因组的位置；用于将外源多核苷酸引入到细胞中的载体类型；外源多核苷酸中的盒的排序，例如双顺反子等。

CD47表达水平是相对于相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的CD47的水平来测量的。例如，T细胞中由编码CD47的外源多核苷酸赋予的CD47表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型T细胞的表达水平来传达；NK细胞中由编码CD47的外源多核苷酸赋予的CD47表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型NK细胞的表达水平来传达；内皮细胞中由编码CD47的外源多核苷酸赋予的CD47表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型内皮细胞的表达水平来传达；胰岛细胞中由编码CD47的外源多核苷酸赋予的CD47表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型胰岛细胞的表达水平来传达；心肌细胞中由编码CD47的外源多核苷酸赋予的CD47表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型心肌细胞的表达水平来传达；平滑肌细胞中由编码CD47的外源多核苷酸赋予的CD47表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型平滑肌细胞的表达水平来传达；骨骼肌细胞中由编码CD47的外源多核苷酸赋予的CD47表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型骨骼肌细胞的表达水平来传达；肝细胞中由编码CD47的外源多核苷酸赋予的CD47表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型肝细胞的表达水平来传达；神经胶质祖细胞中由编码CD47的外源多核苷酸赋予的CD47表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型神经胶质祖细胞的表达水平来传达；多巴胺能神经元中由编码CD47的外源多核苷酸赋予的CD47表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型多巴胺能神经元的表达水平来传达；

视网膜色素上皮细胞中由编码CD47的外源多核苷酸赋予的CD47表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型视网膜色素上皮细胞的表达水平来传达；甲状腺细胞中由编码CD47的外源多核苷酸赋予的CD47表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型甲状腺细胞的表达水平来传达。

在另一个实施方案中，CD47蛋白表达使用对用针对CD47蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认外源CD47 mRNA的存在。

U.CD24

在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其已经被修饰以表达致耐受因子(例如，免疫调节多肽)CD24。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CD24的方法。在一些实施方案中，干细胞表达外源CD24。在一些情况下，细胞表达表达载体，该表达载体包含编码人CD24多肽的核苷酸序列。

CD24也被称为热稳定抗原或小细胞肺癌簇4抗原，它是一种糖基化的糖基磷脂酰肌醇锚定表面蛋白(Pirruccello等人,J Immunol,1986,136,3779-3784；Chen等人,Glycobiology,2017,57,800-806)。它与先天免疫细胞上的Siglec-10结合。最近证明了经由Siglec-10的CD24充当先天免疫检查点(Barkal等人,Nature,2019,572,392-396)。

在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码与NCBI Ref.Sequence No.NP_001278666.1、NP_001278667.1、NP_001278668.1和NP_037362.1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD24多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码具有NCBI Ref.Sequence No.NP_001278666.1、NP_001278667.1、NP_001278668.1和NP_037362.1中列出的氨基酸序列的CD24多肽的核苷酸序列。

在一些实施方案中，细胞包含与NCBI Ref.No.NM_00129737.1、NM_00129738.1、NM_001291739.1和NM_013230.3中列出的序列具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含NCBI Ref.Sequence No.NM_00129737.1、NM_00129738.1、NM_001291739.1和NM_013230.3中列出的核苷酸序列。

在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码CD24的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码CD24的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(CD142)、MICA、MICB、LRP1(CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码CD24的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CD24的多核苷酸插入到本文提供的表15中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码CD24的多核苷酸可操作地连接至启动子。

在另一个实施方案中，CD24蛋白表达使用对用针对CD24蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认外源CD24 mRNA的存在。

在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码CD24的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码CD24的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也称为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也称为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码CD24的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CD24的多核苷酸插入到本文提供的表15中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码CD24的多核苷酸可操作地连接至启动子。

V.DUX4

在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)或其群体，其包含经修饰以增加致耐受因子或免疫抑制因子(诸如DUX4)的表达的基因组。在一些实施方案中，本公开提供了用于改变细胞的基因组以提供增加的DUX4表达的方法。在一些实施方案中，本公开提供了一种包含外源表达的DUX4蛋白的细胞或其群体。在一些实施方案中，增加的DUX4表达抑制、降低或消除一种或多种以下MHC I分子的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。

DUX4是一种转录因子，在胚胎组织和诱导性多能干细胞中具有活性，并且在正常、健康的体细胞组织中沉默(Feng等人,2015,ELife4；De Iaco等人,2017,Nat Genet,49,941-945；Hendrickson等人,2017,Nat Genet,49,925-934；Snider等人,2010,PLoS Genet,e1001181；Whiddon等人,2017,Nat Genet)。DUX4表达阻断IFN-γ介导的主要组织相容性复合物(MHC)I类基因表达(例如，B2M、HLA-A、HLA-B和HLA-C的表达)的诱导。DUX4表达与被MHCI类抑制的抗原呈递有关(Chew等人,Developmental Cell,2019,50,1-14)。DUX4在切割阶段基因表达(转录)程序中充当转录因子。其靶基因包括但不限于编码基因、非编码基因和重复元件。

DUX4有至少两种亚型，最长的亚型包括DUX4 C末端转录活化结构域。亚型通过可变剪接产生。参见，例如，Geng等人,2012,Dev Cell,22,38-51；Snider等人,2010,PLoSGenet,e1001181。DUX4的活性亚型包括其N末端DNA结合结构域和其C末端活化结构域。参见，例如，Choi等人,2016,Nucleic Acid Res,44,5161-5173。

已经证明了减少DUX4的CpG基序数量会减少DUX4转基因的沉默(Jagannathan等人,Human Molecular Genetics,2016,25(20):4419-4431)。Jagannathan等人,同上中提供的核酸序列代表DUX4的密码子改变序列，其包含一个或多个碱基取代以降低CpG位点的总数，同时保留DUX4蛋白质序列。核酸序列可从Addgene目录号99281商购获得。

在许多实施方案中，可利用至少一种或多种多核苷酸来促进细胞(例如干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)外源表达DUX4。

在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码DUX4的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码DUX4的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(CD142)、MICA、MICB、LRP1(CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码DUX4的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码DUX4的多核苷酸插入到本文提供的表15中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸可操作地连接至启动子。

在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列包含有包含密码子改变的DUX4核苷酸序列的多核苷酸序列，所述密码子改变的DUX4核苷酸序列包含一个或多个碱基取代以降低CpG位点的总数，同时保留DUX4蛋白质序列。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列包含一个或多个碱基取代以降低与2020年7月31日提交的PCT/US2020/44635的SEQ IDNO:1具有至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的CpG位点的总数。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列是PCT/US2020/44635的SEQ ID NO:1。

在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列是编码与选自包括以下的组的序列具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多肽序列的核苷酸序列：如PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQID NO:29。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列是编码选自包括以下的组的多肽序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。如SEQ ID NO:2-29所示的氨基酸序列在PCT/US2020/44635的图1A至图1G中示出。

在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACN62209.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACN62209.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与NCBI RefSeq No.NP_001280727.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含NCBI RefSeq No.NP_001280727.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACP30489.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACP30489.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与UniProt No.P0CJ85.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含UniProt No.P0CJ85.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号AUA60622.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号AUA60622.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24683.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24683.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACN62210.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACN62210.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24706.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24706.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24685.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24685.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACP30488.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACP30488.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24687.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24687.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACP30487.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACP30487.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24717.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24717.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24690.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24690.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24689.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24689.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24692.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24692.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24693.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24693.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24712.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24712.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24691.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24691.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与UniProt No.P0CJ87.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含UniProt No.P0CJ87.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24714.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24714.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24684.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24684.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24695.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24695.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24699.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24699.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与NCBI RefSeq No.NP_001768.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含NCBI RefSeq No.NP_001768中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与NCBI RefSeq No.NP_942088.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含NCBI RefSeq No.NP_942088.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO:28具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO:29具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO:29的氨基酸序列。

在其他实施方案中，使用表达载体来促进致耐受因子的表达。在一些实施方案中，表达载体包含编码DUX4的多核苷酸序列，所述编码DUX4的多核苷酸序列是密码子改变序列，其包含一个或多个碱基取代以降低CpG位点的总数，同时保留DUX4蛋白质序列。在一些情况下，DUX4的密码子改变序列包含PCT/US2020/44635的SEQ ID NO:1。在一些情况下，DUX4的密码子改变序列是PCT/US2020/44635的SEQ ID NO:1。在其他实施方案中，表达载体包含编码DUX4的多核苷酸序列，所述序列包含PCT/US2020/44635的SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，表达载体包含编码DUX4多肽序列的多核苷酸序列，所述DUX4多肽序列与选自包括以下的组的序列具有至少95％的序列同一性：PCT/US2020/44635的SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，表达载体包含编码DUX4多肽序列的多核苷酸序列，所述DUX4多肽序列选自包括以下的组：PCT/US2020/44635的SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。

可以使用已知技术(诸如Western印迹、ELISA测定、FACS测定、免疫测定等)来测定DUX4表达的增加。

W.额外的致耐受因子

在某些实施方案中，可以将一种或多种致耐受因子插入或重新插入到基因组编辑的细胞中，以产生免疫豁免的通用供体细胞，诸如通用供体干细胞、通用供体T细胞或通用供体细胞。在某些实施方案中，本文公开的低免疫原性细胞已被另外修饰以表达一种或多种致耐受因子。示例性致耐受因子包括但不限于以下中的一种或多种：CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和Serpinb9。在一些实施方案中，致耐受因子选自由以下各项组成的组：CD200、HLA-G、HLA-E、HLA-C、HLA-E重链、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、IL-10、IL-35、FasL、Serpinb9、CCL21、CCL22和Mfge8。在一些实施方案中，致耐受因子选自由以下各项组成的组：DUX4、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、C1-抑制剂和IL-35。在一些实施方案中，致耐受因子选自由以下各项组成的组：HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、C1-抑制剂和IL-35。在一些实施方案中，致耐受因子选自包括以下的组：CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和Serpinb9。

关于人CD27(其也被称为CD27L受体、肿瘤坏死因子受体超家族成员7、TNFSF7、T细胞活化抗原S152、Tp55和T14)的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC12P008144、HGNC No.11922、NCBI Gene ID 939、Uniprot No.P26842以及NCBIRefSeq No.NM_001242.4和NP_001233.1。

关于人CD46的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01P207752、HGNC No.6953、NCBI Gene ID 4179、Uniprot No.P15529以及NCBI RefSeqNo.NM_002389.4、NM_153826.3、NM_172350.2、NM_172351.2、NM_172352.2NP_758860.1、NM_172353.2、NM_172359.2、NM_172361.2、NP_002380.3、NP_722548.1、NP_758860.1、NP_758861.1、NP_758862.1、NP_758863.1、NP_758869.1和NP_758871.1。

关于人CD55(也称为补体衰变加速因子)的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01P207321、HGNCNo.2665、NCBI Gene ID 1604、UniprotNo.P08174以及NCBI RefSeqNo.NM_000574.4、NM_001114752.2、NM_001300903.1、NM_001300904.1、NP_000565.1、NP_001108224.1、NP_001287832.1和NP_001287833.1。

关于人CD59的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC11M033704、HGNC No.1689,NCBI Gene ID 966、Uniprot No.P13987以及NCBI RefSeqNo.NP_000602.1、NM_000611.5、NP_001120695.1、NM_001127223.1、NP_001120697.1、NM_001127225.1、NP_001120698.1、NM_001127226.1、NP_001120699.1、NM_001127227.1、NP_976074.1、NM_203329.2、NP_976075.1、NM_203330.2、NP_976076.1和NM_203331.2。

关于人CD200的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC03P112332、HGNC No.7203、NCBI Gene ID 4345、Uniprot No.P41217以及NCBI RefSeqNo.NP_001004196.2、NM_001004196.3、NP_001305757.1、NM_001318828.1、NP_005935.4、NM_005944.6、XP_005247539.1和XM_005247482.2。

关于人HLA-C的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC06M031272、HGNC No.4933、NCBI Gene ID 3107、Uniprot No.P10321以及NCBI RefSeqNo.NP_002108.4和NM_002117.5。

关于人HLA-E的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC06P047281、HGNC No.4962、NCBI Gene ID 3133、Uniprot No.P13747以及NCBI RefSeqNo.NP_005507.3和NM_005516.5。

关于人HLA-G的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC06P047256、HGNC No.4964、NCBI Gene ID 3135、Uniprot No.P17693以及NCBI RefSeqNo.NP_002118.1和NM_002127.5。

关于人PD-L1或CD274的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC09P005450、HGNC No.17635、NCBI Gene ID 29126、Uniprot No.Q9NZQ7以及NCBIRefSeq No.NP_001254635.1、NM_001267706.1、NP_054862.1和NM_014143.3。

关于人IDO1的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC08P039891、HGNC No.6059、NCBI Gene ID 3620、Uniprot No.P14902以及NCBI RefSeqNo.NP_002155.1和NM_002164.5。

关于人IL-10的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01M206767、HGNC No.5962、NCBI Gene ID 3586、Uniprot No.P22301以及NCBI RefSeqNo.NP_000563.1和NM_000572.2。

关于人Fas配体(其也被称为FasL、FASLG、CD178、TNFSF6等)的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01P172628、HGNC No.11936、NCBI Gene ID356、Uniprot No.P48023以及NCBI RefSeq No.NP_000630.1、NM_000639.2、NP_001289675.1和NM_001302746.1。

关于人CCL21的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC09M034709、HGNC No.10620、NCBI Gene ID 6366、Uniprot No.O00585以及NCBI RefSeqNo.NP_002980.1和NM_002989.3。

关于人CCL22的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC16P057359、HGNC No.10621、NCBI Gene ID6367、Uniprot No.O00626以及NCBI RefSeqNo.NP_002981.2、NM_002990.4、XP_016879020.1和XM_017023531.1。

关于人Mfge8的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC15M088898、HGNC No.7036、NCBI Gene ID 4240、Uniprot No.Q08431以及NCBI RefSeqNo.NP_001108086.1、NM_001114614.2、NP_001297248.1、NM_001310319.1、NP_001297249.1、NM_001310320.1、NP_001297250.1、NM_001310321.1、NP_005919.2和NM_005928.3。

关于人SerpinB9的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC06M002887、HGNC No.8955、NCBI Gene ID 5272、Uniprot No.P50453以及NCBI RefSeqNo.NP_004146.1、NM_004155.5、XP_005249241.1和XM_005249184.4。

调节基因和因子(蛋白质)表达的方法包括基因组编辑技术和RNA或蛋白质表达技术等。对于所有这些技术，使用众所周知的重组技术来产生如本文所概述的重组核酸。

在一些实施方案中，细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)具有使B2M和CIITA基因灭活的遗传修饰，并且表达选自包括以下的组的多种外源多肽：CD47和DUX4、CD47和CD24、CD47和CD27、CD47和CD46、CD47和CD55、CD47和CD59、CD47和CD200、CD47和HLA-C、CD47和HLA-E、CD47和HLA-E重链、CD47和HLA-G、CD47和PD-L1、CD47和IDO1、CD47和CTLA4-Ig、CD47和C1-抑制剂、CD47和IL-10、CD47和IL-35、CD47和IL-39、CD47和FasL、CD47和CCL21、CD47和CCL22、CD47和Mfge8以及CD47和Serpinb9及其任何组合。在一些情况下，此类细胞还具有使CD142基因灭活的遗传修饰。

在一些情况下，基因编辑系统(诸如CRISPR/Cas系统)用于促进将致耐受因子(诸如致耐受因子)插入到安全港或靶标基因座(诸如AAVS1基因座)中以主动抑制免疫排斥反应。在一些情况下，使用表达载体将致耐受因子插入到安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，安全港或靶标基因座是AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也称为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也称为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。

在一些实施方案中，靶基因(例如，CD47或另一种致耐受因子基因)的表达通过含有(1)对内源靶基因(例如，CD47或另一种致耐受因子基因)具有特异性的位点特异性结合结构域和(2)转录活化因子的融合蛋白或蛋白复合物的表达而增加。

在一些实施方案中，调控因子由位点特异性DNA结合核酸分子(诸如指导RNA(gRNA))组成。在一些实施方案中，方法通过位点特异性DNA结合靶蛋白来实现，诸如通过锌指蛋白(ZFP)或含有ZFP的融合蛋白(其也被称为锌指核酸酶(ZFN))来实现。

在一些实施方案中，调控因子包含位点特异性结合结构域，诸如使用DNA结合蛋白或DNA结合核酸，其与靶向区域的基因特异性结合或杂交。在一些实施方案中，所提供的多核苷酸或多肽与位点特异性核酸酶(诸如修饰的核酸酶)偶联或复合。例如，在一些实施方案中，使用包含修饰的核酸酶的DNA靶向蛋白的融合物来实现施用，诸如使用大范围核酸酶或RNA指导的核酸酶，诸如成簇规律间隔短回文核酸(CRISPR)-Cas系统，诸如CRISPR-Cas9系统。在一些实施方案中，核酸酶经修饰以缺乏核酸酶活性。在一些实施方案中，修饰的核酸酶是催化死亡的dCas9。

在一些实施方案中，位点特异性结合结构域可来源于核酸酶。例如，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的识别序列，诸如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。还参见美国专利号5,420,032；美国专利号6,833,252；Belfort等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Dujon等人,(1989)Gene 82:115-118；Perler等人,(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228；Gimble等人,(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等人,(1998)J.Mol.Biol.280:345-353；以及New England Biolabscatalogue。此外，可以对归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性进行工程化以结合非天然靶位点。参见例如Chevalier等人,(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat等人,(2003)Nucleic Acids Res.31:2952-2962；Ashworth等人,(2006)Nature 441:656-659；Paques等人,(2007)Current Gene Therapy 7:49-66；美国专利公开号2007/0117128。

锌指、TALE和CRISPR系统结合结构域可以被“工程化”以结合预定的核苷酸序列，例如经由天然存在的锌指或TALE蛋白的识别螺旋区域的工程化(改变一个或多个氨基酸)。工程化DNA结合蛋白(锌指或TALE)是非天然存在的蛋白质。合理的设计标准包括应用取代规则和计算机化算法来处理存储现有ZFP和/或TALE设计和结合数据的信息的数据库中的信息。参见例如美国专利号6,140,081；6,453,242；和6,534,261；另见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496和美国公开号20110301073。

在一些实施方案中，位点特异性结合结构域包含一种或多种以序列特异性方式结合DNA的锌指蛋白(ZFP)或其结构域。ZFP或其结构域是通过一种或多种锌指以序列特异性方式结合DNA的较大蛋白质内的蛋白质或结构域，所述一种或多种锌指是其结构通过锌离子配位而稳定的结合结构域内的氨基酸序列区域。

在ZFP中，有靶向特定DNA序列的人工ZFP结构域，长度通常为9-18个核苷酸，由个别指组装生成。ZFP包括其中单一指结构域的长度为大约30个氨基酸并且含有α螺旋，并且具有两个、三个、四个、五个或六个指的ZFP，所述α螺旋含有两个不变的组氨酸残基，所述组氨酸残基通过锌与单一β转角的两个半胱氨酸配位。通常，ZFP的序列特异性可以通过在锌指识别螺旋上的四个螺旋位置(-1、2、3和6)处进行氨基酸取代来改变。因此，在一些实施方案中，ZFP或含有ZFP的分子是非天然存在的，例如，被工程化以与选择的靶位点结合。参见例如Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美国公开号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；和美国专利公开号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，所述文献通过引用整体并入本文。

许多基因特异性工程化锌指是可商购获得的。例如，Sangamo Biosciences(Richmond,CA,USA)与Sigma–Aldrich(St.Louis,MO,USA)合作开发了用于锌指构建的平台(CompoZr)，其允许研究人员绕过锌指构建与验证，并且为数千种蛋白质提供特异性靶向的锌指(Gaj等人,Trends in Biotechnology,2013,31(7),397-405)。在一些实施方案中，使用或定制设计可商购获得的锌指。

在一些实施方案中，位点特异性结合结构域包含天然存在的或工程化的(非天然存在的)转录活化因子样蛋白(TAL)DNA结合结构域，诸如转录活化因子样蛋白效应物(TALE)蛋白中的所述结构域，参见例如美国专利公开号20110301073，其通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，位点特异性结合结构域来源于CRISPR/Cas系统。一般来讲，“CRISPR系统”统指参与表达CRISPR相关(“Cas”)基因或指导其活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式活化CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr伴侣序列(在内源CRISPR系统的上下文中涵盖“直接重复序列”和tracrRNA加工的部分直接重复序列)、指导序列(在内源CRISPR系统的上下文中也被称为“间隔子”，或“靶向序列”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。

一般来讲，指导序列包括靶向结构域，所述靶向结构域包含与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，指导序列与其对应靶序列之间的互补程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。在一些实例中，gRNA的靶向结构域与靶核酸上的靶序列互补，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％互补，例如完全互补。

在一些实施方案中，靶位点在靶基因的转录起始位点的上游。在一些实施方案中，靶位点与基因的转录起始位点相邻。在一些实施方案中，靶位点与基因转录起始位点下游的RNA聚合酶暂停位点相邻。

在一些实施方案中，靶向结构域被配置为靶向靶基因的启动子区域以促进转录起始、一种或多种转录增强子或活化因子和/或RNA聚合酶的结合。一种或多种gRNA可用于靶向基因的启动子区域。在一些实施方案中，可以靶向基因的一个或多个区域。在某些方面，靶位点位于基因转录起始位点(TSS)任一侧的600个碱基对内。

设计或鉴定作为或包含靶向基因的序列(包括外显子序列和调控区(包括启动子和活化因子)的序列)的gRNA序列在技术人员的水平内。用于CRISPR基因组编辑的全基因组gRNA数据库是公开可用的，其含有人类基因组或小鼠基因组中的基因的组成型外显子中的示例性单一指导RNA(sgRNA)靶序列(参见例如genescript.com/gRNA-dat abase.html；另见Sanjana等人(2014)Nat.Methods,11:783-4；www.e-crisp.org/E-CRISP/；crispr.mit.edu/)。在一些实施方案中，gRNA序列是或包含与非靶基因具有最小脱靶结合的序列。

在一些实施方案中，调控因子还包含功能结构域，例如转录活化因子。

在一些实施方案中，转录活化因子是或含有一种或多种调控元件，诸如靶基因的一种或多种转录控制元件，由此识别如上文所提供的位点特异性结构域以驱动这种基因的表达。在一些实施方案中，转录活化因子驱动靶基因的表达。在一些情况下，转录活化因子可以是或含有异源反式活化结构域的全部或一部分。例如，在一些实施方案中，转录活化因子选自单纯疱疹衍生的反式活化结构域、Dnmt3a甲基转移酶结构域、p65、VP16和VP64。

在一些实施方案中，调控因子是锌指转录因子(ZF-TF)。在一些实施方案中，调控因子是VP64-p65-Rta(VPR)。

在某些实施方案中，调控因子还包含转录调控结构域。常见结构域包括，例如，转录因子结构域(活化因子、抑制因子、共活化因子、共抑制因子)、沉默子、癌基因(例如，myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mos家族成员等)；DNA修复酶及其相关因子和修饰因子；DNA重排酶及其相关因子和修饰因子；染色质相关蛋白及其修饰因子(例如，激酶、乙酰化酶和去乙酰化酶)；和DNA修饰酶(例如，甲基转移酶，诸如DNMT家族成员(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L等、拓扑异构酶、解旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、核酸内切酶)及其相关因子和修饰因子。参见例如美国公开号2013/0253040，其以引用方式整体并入本文。

用于实现活化的合适结构域包括HSV VP 16活化结构域(参见例如Hagmann等人,J.Virol.71,5952-5962(1 97))核激素受体(参见例如Torchia等人,Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-383(1998))；核因子κB的p65亚基(Bitko和Bank,J.Virol.72:5610-5618(1998)及Doyle和Hunt,Neuroreport 8:2937-2942(1997))；Liu等人,Cancer Gene Ther.5:3-28(1998))或人工嵌合功能结构域，诸如VP64(Beerli等人,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14623-33)和降解决定子(Molinari等人,(1999)EMBOJ.18,6439-6447)。额外的示例性活化结构域包括Oct 1、Oct-2A、Spl、AP-2和CTF1(Seipel等人,EMBOJ.11,4961-4968(1992)以及p300、CBP、PCAF、SRC1 PvALF、AtHD2A和ERF-2。参见例如Robyr等人,(2000)Mol.Endocrinol.14:329-347；Collingwood等人,(1999)J.Mol.Endocrinol 23:255-275；Leo等人,(2000)Gene 245:1-11；Manteuffel-Cymborowska(1999)Acta Biochim.Pol.46:77-89；McKenna等人,(1999)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.69:3-12；Malik等人,(2000)Trends Biochem.Sci.25:277-283；以及Lemon等人,(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504。另外的示例性活化结构域包括但不限于OsGAI、HALF-1、Cl、AP1、ARF-5、-6、-1和-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1，参见例如Ogawa等人,(2000)Gene245:21-29；Okanami等人,(1996)Genes Cells 1:87-99；Goff等人,(1991)Genes Dev.5:298-309；Cho等人,(1999)Plant Mol Biol 40:419-429；Ulmason等人,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:5844-5849；Sprenger-Haussels等人,(2000)Plant J.22:1-8；Gong等人,(1999)Plant Mol.Biol.41:33-44；以及Hobo等人,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15,348-15,353。

可用于制备遗传阻遏物的示例性阻遏结构域包括但不限于KRAB A/B、KOX、TGF-β-诱导型早期基因(TIEG)、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMT家族成员(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L等)、Rb和MeCP2。参见例如Bird等人,(1999)Cell99:451-454；Tyler等人,(1999)Cell 99:443-446；Knoepfler等人,(1999)Cell 99:447-450；以及Robertson等人,(2000)Nature Genet.25:338-342。额外的示例性抑制结构域包括但不限于ROM2和AtHD2A。参见例如Chem等人,(1996)Plant Cell 8:305-321；以及Wu等人,(2000)Plant J.22:19-27。

在一些情况下，所述结构域参与染色体的表观遗传调控。在一些实施方案中，所述结构域是组蛋白乙酰转移酶(HAT)，例如A型、核定位的，诸如MYST家族成员MOZ、Ybf2/Sas3、MOF和Tip60、GNAT家族成员Gcn5或pCAF、p300家族成员CBP、p300或Rttl09(Bemdsen和Denu(2008)Curr Opin Struct Biol 18(6):682-689)。在其他情况下，结构域是组蛋白去乙酰化酶(HD AC)，诸如I类(HDAC-l、2、3和8)、II类(HDAC IIA(HDAC-4、5、7和9)、HD AC IIB(HDAC 6和10))、IV类(HDAC-l 1)、III类(也称为sirtuin(SIRT)；SIRT1-7)(参见Mottamal等人,(2015)Molecules 20(3):3898-394l)。在一些实施方案中使用的另一个结构域是组蛋白磷酸化酶或激酶，其中实例包括MSK1、MSK2、ATR、ATM、DNA-PK、Bubl、VprBP、IKK-a、PKCpi、Dik/Zip、JAK2、PKC5、WSTF和CK2。在一些实施方案中，使用甲基化结构域并且其可以选自诸如Ezh2、PRMT1/6、PRMT5/7、PRMT 2/6、CARM1、set7/9、MLL、ALL-1、Suv 39h、G9a、SETDB1、Ezh2、Set2、Dotl、PRMT 1/6、PRMT 5/7、PR-Set7和Suv4-20h的组。参与苏木化和生物素化的结构域(Lys9、13、4、18和12)也可用于一些实施方案中(综述参见Kousarides(2007)Cell 128:693-705)。

融合分子通过本领域技术人员众所周知的克隆和生化缀合方法构建。融合分子包含DNA结合结构域和功能结构域(例如，转录活化或抑制结构域)。融合分子还任选地包含核定位信号(例如，来自SV40培养基T抗原的信号)和表位标签(诸如，例如，FLAG和血凝素)。设计融合蛋白(和编码它们的核酸)，使得翻译阅读框保留在融合组分中。

一个方面的功能结构域(或其功能片段)的多肽组分与另一方面的非蛋白质DNA结合结构域(例如，抗生素、嵌入剂、小沟结合物、核酸)之间的融合体通过本领域技术人员已知的生化缀合方法来构建。参见，例如Pierce Chemical Company(Rockford,IL)目录。已经描述了用于进行小沟结合物与多肽之间的融合的方法和组合物。Mapp等人,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3930-3935。同样，CRISPR/Cas TF以及包含与多肽组分功能结构域缔合的sgRNA核酸组分的核酸酶也是本领域技术人员已知的并在本文中详细描述。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以可调控地表达CD47。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以可调控地表达CD47的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将CD47插入到细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表29的SEQ ID NO:200784-231885组成的组，所述文献通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-C。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-C的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-C插入到细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表10的SEQ IDNO:3278-5183组成的组，所述文献通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-E。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-E的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-E插入到细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表19的SEQ IDNO:189859-193183组成的组，所述文献通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-F。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-F的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-F插入到细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表45的SEQ IDNO:688808-399754组成的组，所述文献通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-G。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-G的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-G插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表18的SEQ IDNO:188372-189858组成的组，所述文献通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达PD-L1。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达PD-L1的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将PD-L1插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表21的SEQ IDNO:193184-200783组成的组，所述文献通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达CTLA4-Ig。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CTLA4-Ig的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将CTLA4-Ig插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041(包括序列表)中公开的任一种。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达CI-抑制剂。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CI-抑制剂的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将CI-抑制剂插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041(包括序列表)中公开的任一种。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达IL-35。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达IL-35的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将IL-35插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041(包括序列表)中公开的任一种。

在一些实施方案中，使用表达载体在细胞中表达致耐受因子。例如，用于在细胞中表达CD47的表达载体包含编码CD47的多核苷酸序列。表达载体可以是诱导型表达载体。表达载体可以是病毒载体，诸如但不限于慢病毒载体。在一些实施方案中，使用融合原介导的递送或选自由以下各项组成的组的转座酶系统将致耐受因子引入到细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。

在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码致耐受因子的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码致耐受因子的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(CD142)、MICA、MICB、LRP1(CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码致耐受因子的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码致耐受因子的多核苷酸插入到本文提供的表16中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码致耐受因子的多核苷酸可操作地连接至启动子。

在一些实施方案中，细胞被工程化以相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达增加量的以下中的一种或多种：CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9。

增加的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达的量可以测量为例如相对于未改变或未修饰的野生型细胞的表达的倍数(multiple)、倍数(fold)或百分比。例如，在一些实施方案中，本文所述的细胞表达的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的水平是相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的至少约1x、至少约1.1x、至少约1.2x、至少约1.3x、至少约1.4x、至少约1.5x、至少约1.6x、至少约1.7x、至少约1.8x、至少约1.9x、至少约2x、至少约2.1x、至少约2.2x、至少约2.3x、至少约2.4x、至少约2.5x、至少约2.6x、至少约2.7x、至少约2.8x、至少约2.9x、至少约3x、至少约3.1x、至少约3.2x、至少约3.3x、至少约3.4x、至少约3.5x、至少约3.6x、至少约3.7x、至少约3.8x、至少约3.9x、至少约4x、至少约4.1x、至少约4.2x、至少约4.3x、至少约4.4x、至少约4.5x、至少约4.6x、至少约4.7x、至少约4.8x、至少约4.9x、至少约5x、至少约5.1x、至少约5.2x、至少约5.3x、至少约5.4x、至少约5.5x、至少约5.6x、至少约5.7x、至少约5.8x、至少约5.9x、至少约6x、至少约6.1x、至少约6.2x、至少约6.3x、至少约6.4x、至少约6.5x、至少约6.6x、至少约6.7x、至少约6.8x、至少约6.9x、至少约7x、至少约7.1x、至少约7.2x、至少约7.3x、至少约7.4x、至少约7.5x、至少约7.6x、至少约7.7x、至少约7.8x、至少约7.9x、至少约8x、至少约8.1x、至少约8.2x、至少约8.3x、至少约8.4x、至少约8.5x、至少约8.6x、至少约8.7x、至少约8.8x、至少约8.9x、至少约9x、至少约9.1x、至少约9.2x、至少约9.3x、至少约9.4x、至少约9.5x、至少约9.6x、至少约9.7x、至少约9.8x、至少约9.9x、至少约10x或更高。

在一些实施方案中，本文所述的细胞表达的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的水平是相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的至少约1倍、至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.1倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍、至少约3倍、至少约3.1倍、至少约3.2倍、至少约3.3倍、至少约3.4倍、至少约3.5倍、至少约3.6倍、至少约3.7倍、至少约3.8倍、至少约3.9倍、至少约4倍、至少约4.1倍、至少约4.2倍、至少约4.3倍、至少约4.4倍、至少约4.5倍、至少约4.6倍、至少约4.7倍、至少约4.8倍、至少约4.9倍、至少约5倍、至少约5.1倍、至少约5.2倍、至少约5.3倍、至少约5.4倍、至少约5.5倍、至少约5.6倍、至少约5.7倍、至少约5.8倍、至少约5.9倍、至少约6倍、至少约6.1倍、至少约6.2倍、至少约6.3倍、至少约6.4倍、至少约6.5倍、至少约6.6倍、至少约6.7倍、至少约6.8倍、至少约6.9倍、至少约7倍、至少约7.1倍、至少约7.2倍、至少约7.3倍、至少约7.4倍、至少约7.5倍、至少约7.6倍、至少约7.7倍、至少约7.8倍、至少约7.9倍、至少约8倍、至少约8.1倍、至少约8.2倍、至少约8.3倍、至少约8.4倍、至少约8.5倍、至少约8.6倍、至少约8.7倍、至少约8.8倍、至少约8.9倍、至少约9倍、至少约9.1倍、至少约9.2倍、至少约9.3倍、至少约9.4倍、至少约9.5倍、至少约9.6倍、至少约9.7倍、至少约9.8倍、至少约9.9倍、至少约10倍或更高。

在一些实施方案中，本文所述的细胞表达的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的水平是相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约550％、至少约600％、至少约650％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％、至少约1500％、至少约2000％、至少约2500％、至少约3000％、至少约3500％、至少约4000％、至少约4500％、至少约5000％、至少约5500％、至少约6000％、至少约6500％、至少约7000％、至少约7500％、至少约8000％、至少约8500％、至少约9000％、至少约10000％或更高。

增加的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达的量也可以测量为例如相对于未改变或未修饰的野生型细胞的表达增加的倍数(multiple)、倍数(fold)或百分比。例如，在一些实施方案中，相对于相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的水平，本文所述的细胞表达高至少约0.1x、高至少约0.1x、高至少约0.2x、高至少约0.3x、高至少约0.4x、高至少约0.5x、高至少约0.6x、高至少约0.7x、高至少约0.8x、高至少约0.9x、高至少约2x、高至少约1x、高至少约1.1x、高至少约1.2x、高至少约1.3x、高至少约1.4x、高至少约1.5x、高至少约1.6x、高至少约1.7x、高至少约1.8x、高至少约1.9x、高至少约2x、高至少约2.1x、高至少约2.2x、高至少约2.3x、高至少约2.4x、高至少约2.5x、高至少约2.6x、高至少约2.7x、高至少约2.8x、高至少约2.9x、高至少约3x、高至少约3.1x、高至少约3.2x、高至少约3.3x、高至少约3.4x、高至少约3.5x、高至少约3.6x、高至少约3.7x、高至少约3.8x、高至少约3.9x、高至少约4x、高至少约4.1x、高至少约4.2x、高至少约4.3x、高至少约4.4x、高至少约4.5x、高至少约4.6x、高至少约4.7x、高至少约4.8x、高至少约4.9x、高至少约5x、高至少约5.1x、高至少约5.2x、高至少约5.3x、高至少约5.4x、高至少约5.5x、高至少约5.6x、高至少约5.7x、高至少约5.8x、高至少约5.9x、高至少约6x、高至少约6.1x、高至少约6.2x、高至少约6.3x、高至少约6.4x、高至少约6.5x、高至少约6.6x、高至少约6.7x、高至少约6.8x、高至少约6.9x、高至少约7x、高至少约7.1x、高至少约7.2x、高至少约7.3x、高至少约7.4x、高至少约7.5x、高至少约7.6x、高至少约7.7x、高至少约7.8x、高至少约7.9x、高至少约8x、高至少约8.1x、高至少约8.2x、高至少约8.3x、高至少约8.4x、高至少约8.5x、高至少约8.6x、高至少约8.7x、高至少约8.8x、高至少约8.9x、高至少约9x、高至少约9.1x、高至少约9.2x、高至少约9.3x、高至少约9.4x、高至少约9.5x、高至少约9.6x、高至少约9.7x、高至少约9.8x、高至少约9.9x、高至少约10x或更高的量的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达。

在一些实施方案中，相对于相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的水平，本文所述的细胞表达高至少约0.1倍、高至少约0.2倍、高至少约0.3倍、高至少约0.4倍、高至少约0.5倍、高至少约0.6倍、高至少约0.7倍、高至少约0.8倍、高至少约0.9倍、高至少约1倍、高至少约1.1倍、高至少约1.2倍、高至少约1.3倍、高至少约1.4倍、高至少约1.5倍、高至少约1.6倍、高至少约1.7倍、高至少约1.8倍、高至少约1.9倍、高至少约2倍、高至少约2.1倍、高至少约2.2倍、高至少约2.3倍、高至少约2.4倍、高至少约2.5倍、高至少约2.6倍、高至少约2.7倍、高至少约2.8倍、高至少约2.9倍、高至少约3倍、高至少约3.1倍、高至少约3.2倍、高至少约3.3倍、高至少约3.4倍、高至少约3.5倍、高至少约3.6倍、高至少约3.7倍、高至少约3.8倍、高至少约3.9倍、高至少约4倍、高至少约4.1倍、高至少约4.2倍、高至少约4.3倍、高至少约4.4倍、高至少约4.5倍、高至少约4.6倍、高至少约4.7倍、高至少约4.8倍、高至少约4.9倍、高至少约5倍、高至少约5.1倍、高至少约5.2倍、高至少约5.3倍、高至少约5.4倍、高至少约5.5倍、高至少约5.6倍、高至少约5.7倍、高至少约5.8倍、高至少约5.9倍、高至少约6倍、高至少约6.1倍、高至少约6.2倍、高至少约6.3倍、高至少约6.4倍、高至少约6.5倍、高至少约6.6倍、高至少约6.7倍、高至少约6.8倍、高至少约6.9倍、高至少约7倍、高至少约7.1倍、高至少约7.2倍、高至少约7.3倍、高至少约7.4倍、高至少约7.5倍、高至少约7.6倍、高至少约7.7倍、高至少约7.8倍、高至少约7.9倍、高至少约8倍、高至少约8.1倍、高至少约8.2倍、高至少约8.3倍、高至少约8.4倍、高至少约8.5倍、高至少约8.6倍、高至少约8.7倍、高至少约8.8倍、高至少约8.9倍、高至少约9倍、高至少约9.1倍、高至少约9.2倍、高至少约9.3倍、高至少约9.4倍、高至少约9.5倍、高至少约9.6倍、高至少约9.7倍、高至少约9.8倍、高至少约9.9倍、高至少约10倍或更高的量的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达。

在一些实施方案中，相对于相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的水平，本文所述的细胞表达高至少约10％、高至少约20％、高至少约30％、高至少约40％、高至少约50％、高至少约60％、高至少约70％、高至少约80％、高至少约90％、高至少约100％、高至少约125％、高至少约150％、高至少约200％、高至少约250％、高至少约300％、高至少约350％、高至少约400％、高至少约450％、高至少约500％、高至少约550％、高至少约600％、高至少约650％、高至少约700％、高至少约750％、高至少约800％、高至少约850％、高至少约900％、高至少约950％、高至少约1000％、高至少约1500％、高至少约2000％、高至少约2500％、高至少约3000％、高至少约3500％、高至少约4000％、高至少约4500％、高至少约5000％、高至少约5500％、高至少约6000％、高至少约6500％、高至少约7000％、高至少约7500％、高至少约8000％、高至少约8500％、高至少约9000％、高至少约10000％或更高的量的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达。

表达水平可归因于本领域技术人员已知的多种因素。例如，编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的外源多核苷酸的表达水平可以受以下多种因素的影响：细胞中的外源多核苷酸的拷贝数，例如细胞中的外源多核苷酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝；存在的调控元件，例如本文所述或本领域已知的任何调控元件，包括本文所述或本领域已知的任何组成型、诱导型或条件性启动子；外源多核苷酸插入细胞基因组的位置；用于将外源多核苷酸引入到细胞中的载体类型；外源多核苷酸中的盒的排序，例如双顺反子等。

CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达水平是相对于相同细胞类型的未改变或未修饰的野生型细胞中表达的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的水平来测量的。例如，T细胞中由编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的外源多核苷酸赋予的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型T细胞的表达水平来传达；NK细胞中由编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的外源多核苷酸赋予的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型NK细胞的表达水平来传达；内皮细胞中由编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的外源多核苷酸赋予的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型内皮细胞的表达水平来传达；胰岛细胞中由编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的外源多核苷酸赋予的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型胰岛细胞的表达水平来传达；心肌细胞中由编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的外源多核苷酸赋予的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型心肌细胞的表达水平来传达；平滑肌细胞中由编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的外源多核苷酸赋予的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型平滑肌细胞的表达水平来传达；骨骼肌细胞中由编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的外源多核苷酸赋予的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型骨骼肌细胞的表达水平来传达；肝细胞中由编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的外源多核苷酸赋予的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型肝细胞的表达水平来传达；神经胶质祖细胞中由编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的外源多核苷酸赋予的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型神经胶质祖细胞的表达水平来传达；多巴胺能神经元中由编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的外源多核苷酸赋予的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型多巴胺能神经元的表达水平来传达；视网膜色素上皮细胞中由编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的外源多核苷酸赋予的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型视网膜色素上皮细胞的表达水平来传达；甲状腺细胞中由编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9的外源多核苷酸赋予的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9表达水平以相对于未改变或未修饰的野生型甲状腺细胞的表达水平来传达。

在另一个实施方案中，CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9蛋白表达使用对用CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测。在另一个实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来确认外源CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9 mRNA的存在。

X.嵌合抗原受体

本文提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的低免疫原性细胞。在一些实施方案中，CAR与CD19结合。在一些实施方案中，CAR与CD22结合。在一些实施方案中，CAR与CD19结合。在一些实施方案中，CAR与CD19和CD22结合。在一些实施方案中，CAR选自由第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR和第四代CAR组成的组。在一些实施方案中，CAR包括结合单个靶抗原的单个结合结构域。在一些实施方案中，CAR包括结合多于一个靶抗原(例如，2、3或更多个靶抗原)的单个结合结构域。在一些实施方案中，CAR包括两个结合结构域，使得每个结合结构域结合不同的靶抗原。在一些实施方案中，CAR包括两个结合结构域，使得每个结合结构域与相同的靶抗原结合。包括CD19特异性、CD22特异性和CD19/CD22双特异性CAR的示例性CAR的详细描述可见于WO2012/079000、WO2016/149578和WO2020/014482，包括序列表和附图在内的公开内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，CAR包括两个结合结构域，使得每个结合结构域与相同的靶抗原结合。包括CD19特异性、CD22特异性和CD19/CD22双特异性CAR的示例性CAR的详细描述可见于WO2012/079000、WO2016/149578和WO2020/014482，包括序列表和附图在内的公开内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，CD19特异性CAR包括抗CD19单链抗体片段(scFv)、跨膜结构域(诸如源自人CD8α的跨膜结构域)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD20特异性CAR包括抗CD20 scFv、跨膜结构域(诸如源自人CD8α的跨膜结构域)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD19/CD20双特异性CAR包括抗CD19 scFv、抗CD20 scFv、跨膜结构域(源自人CD8α的跨膜结构域)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD22特异性CAR包括抗CD22scFv、跨膜结构域(诸如源自人CD8α的跨膜结构域)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD19/CD22双特异性CAR包括抗CD19 scFv、抗CD22 scFv、跨膜结构域(源自人CD8α的跨膜结构域)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。

在一些实施方案中，CAR包含由T细胞携带的商业CAR构建体。基于商业CAR-T细胞的疗法的非限制性实例包括得自Cartesian The rapeutics的布瑞基奥仑赛布瑞基奥仑赛艾基维仑赛利基迈仑赛替沙仑赛Descartes-08和Descartes-11、得自Novartis的CT L110、得自Poseida Therapeutics的P-BMCA-101、得自Autolus Li mited的AUTO4、得自Cellectis的UCARTCS、得自Precision Biosc iences的PBCAR19B和PBCAR269A、得自Fate Therapeutics的FT819以及得自Clyad Oncology的CYAD-211。

在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸编码包含抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性细胞包含有包含抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，多核苷酸是或包含有包含抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR是或包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和至少一个信号传导结构域(例如，一个、两个或三个信号传导结构域)的第一代CAR。在一些实施方案中，CAR包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传导结构域的第二代CAR。在一些实施方案中，CAR包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传导结构域的第三代CAR。在一些实施方案中，第四代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域和在CAR成功信号传导时诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包含抗体、抗体片段、scFv或Fab。

1.抗原结合结构域(ABD)靶向肿瘤细胞或癌细胞特征性抗原

在一些实施方案中，抗原结合结构域(ABD)靶向肿瘤细胞特征性抗原。换句话说，抗原结合结构域靶向肿瘤细胞或癌细胞表达的抗原。在一些实施方案中，ABD结合肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤细胞特征性抗原(例如，与肿瘤细胞或癌细胞相关的抗原)或肿瘤相关抗原选自细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰环化酶、组氨酸激酶相关受体、表皮生长因子受体(EGFR)(包括ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18和FGF21)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)(包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)、RET受体和Eph受体家族(包括EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、Bestrophins、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸受体、ABC转运蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、鞘氨醇-1-磷酸受体(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多跨跨膜蛋白、T细胞受体基序、T细胞α链、T细胞β链、T细胞γ链、T细胞δ链、CCR7、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD34、CD35、CD40、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD62L、CD68、CD80、CD95、CD117、CD127、CD133、CD137(4-1BB)、CD163、F4/80、IL-4Ra、Sca-1、CTLA-4、GITR、GARP、LAP、粒酶B、LFA-1、转铁蛋白受体、NKp46、穿孔素、CD4+、Th1、Th2、Th17、Th40、Th22、Th9、Tfh、典型Treg、FoxP3+、Tr1、Th3、Treg17、T_REG、CDCP、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(例如，CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ²、VEGF、VEGFR 1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、肌腱蛋白、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、Smoothened、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR、ANTXR1、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、白介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板源生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gpl00、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、主要组织相容性复合物I类相关基因蛋白(MR1)、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体(uPAR)、Fos-相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A,B,C)CD49f、CD151 CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC或其抗原片段或抗原部分。

2.ABD靶向T细胞特征性抗原

在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向T细胞特征性抗原。在一些实施方案中，ABD结合与T细胞相关的抗原。在一些情况下，这种抗原由T细胞表达或位于T细胞的表面上。在一些实施方案中，T细胞特征性抗原或T细胞相关抗原选自细胞表面受体、膜转运蛋白(例如，主动或被动转运蛋白，例如，离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或T细胞特征性细胞粘附蛋白。在一些实施方案中，T细胞特征性抗原可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰环化酶、组氨酸激酶相关受体、AKT1、AKT2、AKT3、ATF2、BCL10、CALM1、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD4、CD8、CD28、CD45、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD247(CD3ζ)、CTLA-4(CD152)、ELK1、ERK1(MAPK3)、ERK2、FOS、FYN、GRAP2(GADS)、GRB2、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HRAS、IKBKA(CHUK)、IKBKB、IKBKE、IKBKG(NEMO)、IL2、ITPR1、ITK、JUN、KRAS2、LAT、LCK、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MKK3)、MAP2K4(MKK4)、MAP2K6(MKK6)、MAP2K7(MKK7)、MAP3K1(MEKK1)、MAP3K3、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K8、MAP3K14(NIK)、MAPK8(JNK1)、MAPK9(JNK2)、MAPK10(JNK3)、MAPK11(p38β)、MAPK12(p38γ)、MAPK13(p38δ)、MAPK14(p38α)、NCK、NFAT1、NFAT2、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NRAS、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PIK3C2B、PIK3C3(VPS34)、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PKCA、PKCB、PKCM、PKCQ、PLCY1、PRF1(穿孔素)、PTEN、RAC1、RAF1、RELA、SDF1、SHP2、SLP76、SOS、SRC、TBK1、TCRA、TEC、TRAF6、VAV1、VAV2或ZAP70。

3.ABD靶向自身免疫或炎性病症特征性抗原

在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向自身免疫或炎性病症特征性抗原。在一些实施方案中，ABD结合与自身免疫或炎性病症相关的抗原。在一些情况下，抗原由与自身免疫或炎性病症相关的细胞表达。在一些实施方案中，自身免疫或炎性病症选自慢性移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮、关节炎、免疫复合物肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、葡萄膜炎、肝炎、系统性硬化症或硬皮病、I型糖尿病、多发性硬化、冷凝集素病、寻常型天疱疮、格雷夫氏病、自身免疫性溶血性贫血、A型血友病、原发性舍格伦氏综合征、血栓性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、埃文氏综合征、IgM介导的神经病、冷球蛋白血症、皮肌炎、特发性血小板减少症、强直性脊柱炎、大疱性类天疱疮、获得性血管性水肿、慢性荨麻疹、抗磷脂脱髓鞘性多发性神经病和自身免疫性血小板减少症或中性粒细胞减少症或纯红细胞再生障碍，虽然同种免疫疾病的示例性非限制性实例包括同种异体致敏(参见例如Blazar等人,2015,Am.J.Transplant,15(4):931-41)或来自造血或实体器官移植、输血、妊娠与胎儿的异种致敏、新生儿同种免疫血小板减少症、新生儿溶血性疾病、对外来抗原的致敏，诸如用酶或蛋白质替代疗法治疗的遗传性或获得性缺陷病症的替代、血液制品和基因疗法可发生。在一些实施方案中，自身免疫或炎性病症特征性抗原选自细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶或组氨酸激酶相关受体。

在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合B细胞、浆细胞或成浆细胞上表达的配体。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干扰素受体，GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5或CD2。参见，例如，US2003/0077249；WO 2017/058753；WO 2017/058850，其内容通过引用并入本文。

4.ABD靶向衰老细胞特征性抗原

在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向衰老细胞特征性抗原，例如尿激酶型纤溶酶原活化因子受体(uPAR)。在一些实施方案中，ABD结合与衰老细胞相关的抗原。在一些情况下，抗原由衰老细胞表达。在一些实施方案中，CAR可用于治疗或预防以衰老细胞的异常积累为特征的病症，例如肝和肺纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病和骨关节炎。

5.ABD靶向感染性疾病特征性抗原

在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向感染性疾病特征性抗原。在一些实施方案中，ABD结合与感染性疾病相关的抗原。在一些情况下，抗原由感染性疾病的细胞表达。在一些实施方案中，其中感染性疾病选自HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人疱疹病毒、人疱疹病毒8型(HHV-8、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV))、人T-淋巴细胞病毒-1性(HTLV-1)、默克尔细胞多瘤病毒(MCV)、猿猴病毒40(SV40)、爱泼斯坦-巴尔病毒、CMV、人乳头瘤病毒。在一些实施方案中，感染性疾病特征性抗原选自细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、组氨酸激酶相关受体、HIV Env、gpl20或HIV-1Env上的CD4诱导的表位。

6.ABD结合细胞的细胞表面抗原

在一些实施方案中，抗原结合结构域与细胞的细胞表面抗原结合。在一些实施方案中，细胞表面抗原是具体或特定细胞类型的特征(例如，由其表达)。在一些实施方案中，细胞表面抗原是多于一种类型的细胞的特征。

在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域结合T细胞特征性细胞表面抗原，诸如T细胞上的细胞表面抗原。在一些实施方案中，T细胞特征性抗原可以是细胞表面受体、膜转运蛋白(例如，主动或被动转运蛋白，例如，离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或T细胞特征性细胞粘附蛋白。在一些实施方案中，T细胞特征性抗原可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶或组氨酸激酶相关受体。

在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合T细胞受体。在一些实施方案中，T细胞受体可以是AKT1、AKT2、AKT3、ATF2、BCL10、CALM1、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD4、CD8、CD28、CD45、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD247(CD3ζ)、CTLA-4(CD152)、ELK1、ERK1(MAPK3)、ERK2、FOS、FYN、GRAP2(GADS)、GRB2、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HRAS、IKBKA(CHUK)、IKBKB、IKBKE、IKBKG(NEMO)、IL2、ITPR1、ITK、JUN、KRAS2、LAT、LCK、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MKK3)、MAP2K4(MKK4)、MAP2K6(MKK6)、MAP2K7(MKK7)、MAP3K1(MEKK1)、MAP3K3、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K8、MAP3K14(NIK)、MAPK8(JNK1)、MAPK9(JNK2)、MAPK10(JNK3)、MAPK11(p38β)、MAPK12(p38γ)、MAPK13(p38δ)、MAPK14(p38α)、NCK、NFAT1、NFAT2、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NRAS、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PIK3C2B、PIK3C3(VPS34)、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PKCA、PKCB、PKCM、PKCQ、PLCY1、PRF1(穿孔素)、PTEN、RAC1、RAF1、RELA、SDF1、SHP2、SLP76、SOS、SRC、TBK1、TCRA、TEC、TRAF6、VAV1、VAV2或ZAP70。

7.跨膜结构域

在一些实施方案中，CAR跨膜结构域包含以下的至少一个跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能变体。在一些实施方案中，跨膜结构域至少包含以下的跨膜区：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能变体。抗原结合结构域结合

8.信号传导结构域或多个信号传导结构域

在一些实施方案中，本文所述的CAR包含选自以下中的一种或多种的一个或至少一个信号传导结构域：B7-1/CD80；B7-2/CD86；B7-H1/PD-L1；B7-H2；B7-H3；B7-H4；B7-H6；B7-H7；BTLA/CD272；CD28；CTLA-4；Gi24/VISTA/B7-H5；ICOS/CD278；PD-1；PD-L2/B7-DC；PDCD6)；4-1BB/TNFSF9/CD137；4-1BB配体/TNFSF9；BAFF/BLyS/TNFSF13B；BAFF R/TNFRSF13C；CD27/TNFRSF7；CD27配体/TNFSF7；CD30/TNFRSF8；CD30配体/TNFSF8；CD40/TNFRSF5；CD40/TNFSF5；CD40配体/TNFSF5；DR3/TNFRSF25；GITR/TNFRSF18；GITR配体/TNFSF18；HVEM/TNFRSF14；LIGHT/TNFSF14；淋巴毒素-α/TNF-β；OX40/TNFRSF4；OX40配体/TNFSF 4；RELT/TNFRSF19L；TACI/TNFRSF13B；TL1A/TNFSF15；TNF-α；TNF RII/TNFRSF1B)；2B4/CD244/SLAMF4；BLAME/SLAMF8；CD2；CD2F-10/SLAMF9；CD48/SLAMF2；CD58/LFA-3；CD84/SL AMF5；CD229/SLAMF3；CRACC/SLAMF7；NTB-A/SLAMF6；SL AM/CD150)；CD2；CD7；CD53；CD82/Kai-1；CD90/Thy1；CD96；CD160；CD200；CD300a/LMIR1；HLA I类；HLA-DR；Ikaros；整联蛋白α4/CD49d；整联蛋白α4β1；整联蛋白α4β7/LPAM-1；LAG-3；TCL1A；TCL1B；CRTAM；DAP12；Dectin-1/CLEC7A；DPPI V/CD26；EphB6；TIM-1/KIM-1/HAVCR；TIM-4；TSLP；TSLP R；淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)；NKG2C、CD3ζ结构域、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性地结合CD83的配体、或其功能片段。

在一些实施方案中，至少一个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体。在一些实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。

在一些实施方案中，至少两个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少两个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体。在一些实施方案中，至少两个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。

在一些实施方案中，至少三个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；以及(ii)CD28结构域，或4-1BB结构域，或其功能变体。在其他实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体。在一些实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。

在一些实施方案中，所述CAR包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。

在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。

在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体，和/或(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。

在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。

9.在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域

在一些实施方案中，第一、第二、第三或第四代CAR还包含在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因对于包含CAR的靶细胞是内源性或外源性的，该CAR包含在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因编码促炎细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子基因编码IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF、IL-4、IL-10或IFN-γ或其功能片段。在一些实施方案中，在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中，在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中，转录因子或其功能结构域或片段是或包含活化T细胞的核因子(NFAT)、NF-kB或其功能结构域或片段。参见例如Zhang.C.等人,Engineering CAR-T cells.Biomarker Research.5:22(2017)；WO2016126608；Sha,H.等人Chimaeric antigen receptor T-cell therapy for tumourimmunotherapy.Bioscience Reports,2017年1月27日,37(1)。

在一些实施方案中，CAR还包含一个或多个间隔子，例如，其中所述间隔子是抗原结合结构域与跨膜结构域之间的第一间隔子。在一些实施方案中，第一间隔子包括免疫球蛋白恒定区或其变体或修饰形式的至少一部分。在一些实施方案中，间隔子是跨膜结构域与信号传导结构域之间的第二间隔子。在一些实施方案中，第二间隔子是寡肽，例如，其中寡肽包含甘氨酸和丝氨酸残基，例如但不限于甘氨酸-丝氨酸双联体。在一些实施方案中，CAR包含两个或更多个间隔子，例如抗原结合结构域与跨膜结构域之间的间隔子以及跨膜结构域与信号传导结构域之间的间隔子。

在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第一代CAR的核酸。在一些实施方案中，第一代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和一个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。

在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第二代CAR的核酸。在一些实施方案中，第二代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和两个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域增强T细胞活化过程中的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。

在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第三代CAR的核酸。在一些实施方案中，第三代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和至少三个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域增强T细胞活化过程中的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。在一些实施方案中，第三代CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，该至少两个共刺激结构域不同。

在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第四代CAR的核酸。在一些实施方案中，第四代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和至少两个、三个或四个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域增强T细胞活化过程中的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。

10.包含抗体或其抗原结合部分的ABD

在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域是或包含抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域是或包含scFv或Fab。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域包含CD19抗体、CD22抗体、T细胞α链抗体、T细胞β链抗体、T细胞γ链抗体、T细胞δ链抗体、CCR7抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD5抗体、CD7抗体、CD8抗体、CD11b抗体、CD11c抗体、CD16抗体、CD20抗体、CD21抗体、CD25抗体、CD28抗体、CD34抗体、CD35抗体、CD40抗体、CD45RA抗体、CD45RO抗体、CD52抗体、CD56抗体、CD62L抗体、CD68抗体、CD80抗体、CD95抗体、CD117抗体、CD127抗体、CD133抗体、CD137(4-1BB)抗体、CD163抗体、F4/80抗体、IL-4Ra抗体、Sca-1抗体、CTLA-4抗体、GITR抗体、GARP抗体、LAP抗体、粒酶B抗体、LFA-1抗体、MR1抗体、uPAR抗体或转铁蛋白受体抗体的scFv或Fab片段。

在一些实施方案中，CAR包含作为共刺激结构域的信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含第二共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少三个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含共刺激结构域，该共刺激结构域选自CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体中的一种或多种。在一些实施方案中，如果CAR包含两个或更多个共刺激结构域，则两个共刺激结构域是不同的。在一些实施方案中，如果CAR包含两个或更多个共刺激结构域，则两个共刺激结构域是相同的。

除了本文所述的CAR之外，多种嵌合抗原受体和编码其的核苷酸序列是本领域已知的，并且将适用于如本文所述的体内和体外的靶细胞的融合体递送和重编程。参见例如WO2013040557、WO2012079000、WO2016030414、Smith T等人,NatureNanotechnology.2017。DOI:10.1038/NNANO.2017.57，它们的公开内容以引用方式并入本文。

11.CAR的额外说明

在某些实施方案中，细胞可以包含编码CAR的外源多核苷酸。CAR(也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体)是已经被工程化以给予宿主细胞(例如，T细胞)靶向特定蛋白质的新能力的受体蛋白。这些受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和T细胞活化功能结合在单个受体中。本公开的多顺反子载体可用于在宿主细胞(例如，T细胞)中表达一种或多种CAR，用于针对各种靶抗原的基于细胞的疗法。由一个或多个表达盒表达的CAR可以相同或不同。在这些实施方案中，CAR可以包含特异性结合靶抗原的胞外结合结构域(也称为“结合剂”)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，CAR还可以包含一种或多种另外的元件，包括一种或多种信号肽、一种或多种胞外铰链结构域和/或一种或多种胞内共刺激结构域。结构域可以彼此直接相邻，或者可以有一个或多个氨基酸连接结构域。编码CAR的核苷酸序列可以源自哺乳动物序列，例如小鼠序列、灵长类动物序列、人序列或其组合。在编码CAR的核苷酸序列是非人的情况下，CAR的序列可以是人源化的。编码CAR的核苷酸序列还可以针对在哺乳动物细胞例如人细胞中表达进行密码子优化。在这些实施方案的任一个中，编码CAR的核苷酸序列可以与本文公开的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。序列变异可能是由于密码子优化、人源化、基于限制酶的克隆疤痕和/或连接功能结构域的额外氨基酸残基等。

在某些实施方案中，CAR可在N末端包含信号肽。信号肽的非限制性实例包括CD8α信号肽、IgK信号肽和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体亚基α(GMCSFR-α，也称为集落刺激因子2受体亚基α(CSF2RA))信号肽及其变体，所述信号肽的氨基酸序列在下表2中提供。

表2.信号肽的示例性序列

在某些实施方案中，CAR的胞外结合结构域可以包含对一种靶抗原或多种靶抗原具有特异性的一种或多种抗体。抗体可以是抗体片段，例如scFv，或单结构域抗体片段，例如VHH。在某些实施方案中，scFv可以包含通过接头连接的抗体的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。V_H和V_L可以以任一顺序连接，即V_H-接头-V_L或V_L-接头-V_H。接头的非限制性实例包括Whitlow接头、(G₄S)_n(n可以是正整数，例如，1、2、3、4、5、6等)接头及其变体。在某些实施方案中，抗原可以是仅在肿瘤细胞上或优先在肿瘤细胞上表达的抗原，或是自身免疫或炎性疾病的特征性抗原。示例性靶抗原包括但不限于CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD70、κ、λ和B细胞成熟剂(BCMA)、G蛋白偶联受体家族C组5成员D(GPRC5D)(与白血病相关)；CS1/SLAMF7、CD38、CD138、GPRC5D、TACI和BCMA(与骨髓瘤相关)；GD2、HER2、EGFR、EGFRvIII、B7H3、PSMA、PSCA、CAIX、CD171、CEA、CSPG4、EPHA2、FAP、FRα、IL-13Rα、间皮素、MUC1、MUC16和ROR1(与实体瘤相关)。在这些实施方案中的任一个中，CAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。

在某些实施方案中，CAR可以包含铰链结构域，也称为间隔子。术语“铰链”和“间隔子”在本公开中可互换使用。铰链结构域的非限制性实例包括CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、IgG4铰链结构域、IgG4铰链-CH2-CH3结构域及其变体，所述铰链结构域的氨基酸序列在下表3中提供。

表3.铰链结构域的示例性序列

在某些实施方案中，CAR的跨膜结构域可以包含以下的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能变体，包括这些序列中的每一种的人形式。在其他实施方案中，跨膜结构域可以包含以下的跨膜区：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能变体，包括这些序列中的每一个的人形式。表4提供了一些示例性跨膜结构域的氨基酸序列。

表4.跨膜结构域的示例性序列

在某些实施方案中，CAR的胞内信号传导结构域和/或胞内共刺激结构域可以包含选自以下中的一种或多种信号传导结构域：B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNFβ、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNFα、TNF RII/TNFRSF1B、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、NKG2C、CD3ζ、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，及其功能变体，包括这些序列中的每一种的人形式。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域和/或细胞内共刺激结构域包含选自CD3ζ结构域、ITAM、CD28结构域、4-1BB结构域或其功能变体的一个或多个信号传导结构域。表5提供了一些示例性胞内共刺激和/或信号传导结构域的氨基酸序列。在某些实施方案中，如在下文所述的tisagenlecleucel的情况下，SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域可在氨基酸位置14处具有突变，例如谷氨酰胺(Q)至赖氨酸(K)的突变(参见SEQ IDNO:115)。

表5.细胞内共刺激和/或信号传导结构域的示例性序列

在多顺反子载体编码两个或更多个CAR的某些实施方案中，两个或更多个CAR可以包含相同的功能结构域，或一个或多个不同的功能结构域，如所描述的。例如，两个或更多个CAR可以包含不同的信号肽、胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域，以最小化由于序列相似性导致的重组风险。或者，替代性地，两个或更多个CAR可以包含相同的结构域。在使用相同结构域和/或主链的情况下，任选在核苷酸序列水平上引入密码子差异以最小化重组的风险。

CD19 CAR

在一些实施方案中，CAR是CD19 CAR(“CD19-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码CD19 CAR的核苷酸序列的表达盒。在一些实施方案中，CD19 CAR可以串联地包含信号肽、特异性结合CD19的胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，CD19 CAR的信号肽包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合结构域对CD19(例如，人CD19)具有特异性。CD19 CAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。在一些实施方案中，胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。

在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合结构域包含源自FMC63单克隆抗体(FMC63)的scFv，其包含通过接头连接的FMC63的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。FMC63和衍生的scFv已在Nicholson等人,Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)和PCT申请公开号WO2018/213337中进行了描述，这些文献中每一篇的全部内容已引用方式并入本文。在一些实施方案中，完整FMC63衍生的scFv(也称为FMC63 scFv)及其不同部分的氨基酸序列提供于下表6中。在一些实施方案中，CD19特异性scFv包含SEQ ID NO:19、20或25中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:19、20或25中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO:21-23和26-28中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:21-23中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:26-28中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD19特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，连接scFv的V_H和V_L部分的接头是具有SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列的Whitlow接头。在一些实施方案中，Whitlow接头可以被不同的接头替代，例如具有SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列的3xG₄S接头，其产生不同的FMC63衍生的具有SEQID NO:29中列出的氨基酸序列的scFv。在这些实施方案中的某些中，CD19特异性scFv包含SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。

表6.抗CD19 scFv和组分的示例性序列

在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合结构域源自CD19特异性抗体，包括例如SJ25C1(Bejcek等人,Cancer Res.55:2346-2351(1995))、HD37(Pezutto等人,J.Immunol.138(9):2793-2799(1987))、4G7(Meeker等人,Hybridoma 3:305-320(1984))、B43(Bejcek(1995)),BLY3(Bejcek(1995))、B4(Freedman等人,70:418-427(1987))、B4HB12b(Kansas&Tedder,J.Immunol.147:4094-4102(1991)；Yazawa等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:15178-15183(2005)；Herbst等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.335:213-222(2010))、BU12(Callard等人,J.Immunology,148(10):2983-2987(1992))和CLB-CD19(De Rie Cell.Immunol.118:368-381(1989))。在这些实施方案中的任一个中，CD19CAR的胞外结合结构域可以包含任何抗体的V_H、V_L和/或一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，CD19 CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD19 CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD19 CAR的胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域。4-1BB(也称为CD137)向T细胞传递有效的共刺激信号，促进分化并增强T淋巴细胞的长期存活。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域是人的。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域包括CD28共刺激结构域。CD28是T细胞上的另一种共刺激分子。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域是人的。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞内共刺激结构域包括如所述的4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。

在一些实施方案中，CD19 CAR的胞内信号传导结构域包含CD3zeta(ζ)信号传导结构域。CD3ζ与T细胞受体(TCR)结合产生信号并含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。CD3ζ信号传导结构域是指来自ζ链胞质结构域的氨基酸残基，其足以功能性地传递T细胞活化所必需的初始信号。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域是人的。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列，所述CD19 CAR包括例如包含以下的CD19 CAR：具有SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:29中列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可额外包含如所述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列，所述CD19 CAR包括例如包含以下的CD19 CAR：具有SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:29中列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可额外包含如所述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列，所述CD19 CAR包括例如包含以下的CD19 CAR：具有SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:29中列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:17的CD28共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可额外包含如所述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:116中列出的CD19 CAR或与SEQ ID NO:116中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)(参见表7)。编码的CD19 CAR具有SEQ ID NO:117中列出的相应氨基酸序列或与SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)，具有以下组分：CD8α信号肽、FMC63 scFv(V_L-Whitlow接头-V_H)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码可商购获得的CD19 CAR实施方案的核苷酸序列的表达盒。由T细胞表达和/或编码的CD19 CAR的市售实施方案的非限制性实例包括替沙仑赛、利基迈仑赛、阿基仑赛和布瑞基奥仑赛。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码替沙仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。替沙仑赛包含具有以下组分的CD19CAR：CD8α信号肽、FMC63 scFv(V_L-3xG₄S接头-V_H)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。替沙仑赛中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列提供于表7中，序列的注释提供于表8中。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码利基迈仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。利基迈仑赛包含具有以下组分的CD19CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信号肽、FMC63scFv(V_L-Whitlow接头-V_H)、IgG4铰链结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。利基迈仑赛中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列提供于表7中，序列的注释提供于表9中。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码阿基仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。阿基仑赛包含具有以下组分的CD19CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信号肽、FMC63 scFv(V_L-Whitlow接头-V_H)、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。阿基仑赛中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列提供于表7中，序列的注释提供于表10中。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码布瑞基奥仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。布瑞基奥仑赛包含具有以下组分的CD19 CAR：GMCSFR-α信号肽、FMC63scFv、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:31、33或35中列出的CD19CAR或与SEQ ID NO:31、33或35中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。编码的CD19 CAR分别具有SEQ ID NO:32、34或36中列出的相应氨基酸序列或分别与SEQ ID NO:32、34或36中列出的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)。

表7.CD19 CAR的示例性序列

表8.替沙仑赛CD19 CAR序列的注释

表9.利基迈仑赛CD19 CAR序列的注释

表10.阿基仑赛CD19 CAR序列的注释

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:31、33或35中列出的CD19CAR或与SEQ ID NO:31、33或35中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。编码的CD19 CAR分别具有SEQ ID NO:32、34或36中列出的相应氨基酸序列，分别与SEQ ID NO:32、34或36中列出的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)。

CD20 CAR

在一些实施方案中，CAR是CD20 CAR(“CD20-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码CD20 CAR的核苷酸序列的表达盒。CD20是这样的抗原，早在前-B期就在B细胞表面上发现，并以逐渐增加的水平直到B细胞成熟，也在大多数B细胞肿瘤的细胞上发现。CD20阳性细胞有时也在霍奇金病、骨髓瘤和胸腺瘤的病例中发现。在一些实施方案中，CD20 CAR可以串联地包含信号肽、特异性结合CD20的胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，CD20 CAR的信号肽包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合结构域对CD20(例如，人CD20)具有特异性。CD20 CAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。在一些实施方案中，胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。

在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合结构域源自CD20特异性抗体，包括例如Leu16、IF5、1.5.3、利妥昔单抗、奥妥珠单抗、替伊莫单抗、奥法妥木单抗、托西莫单抗、奥尼妥单抗、维妥珠单抗、乌妥昔单抗和奥瑞利珠单抗。在一些实施方案中，CD20 CAR源自对CD20具有特异性的CAR，包括例如MB-106、UCART20或C-CAR066，如表11A中详述。在这些实施方案中的任一个中，CD20CAR的胞外结合结构域可以包含V_H、V_L和/或抗体中的任一个的一个或多个CDR或表11A中详述的CAR或由其组成。

表11A.示例性CD20特异性CAR

在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合结构域包含源自Leu16单克隆抗体的scFv，其包含通过接头连接的Leu16的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。参见Wu等人,Protein Engineering.14(12):1025-1033(2001)。在一些实施方案中，接头是3xG₄S接头。在其他实施方案中，接头是如本文所描述的Whitlow接头。在一些实施方案中，完整Leu16衍生的scFv(也称为Leu16 scFv)的不同部分及其不同部分的氨基酸序列提供于下表11B中。在一些实施方案中，CD20特异性scFv包含SEQ ID NO:37、38或42中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:37、38或42中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO:39-41、43和44中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:39-41中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:43-44中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD20特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

表11B.抗CD20 scFv和组分的示例性序列

在一些实施方案中，CD20 CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD20 CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD20 CAR的胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，胞内共刺激结构域包含CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD20 CAR的胞内信号传导结构域包含CD3zeta(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:1的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。

CD22 CAR

在一些实施方案中，CAR是CD22 CAR(“CD22-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码CD22 CAR的核苷酸序列的表达盒。CD22是一种跨膜蛋白，主要存在于成熟B细胞的表面，作为B细胞受体(BCR)信号传导的抑制性受体起作用。CD22在60-70％的B细胞淋巴瘤和白血病(例如，慢性B淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma))中表达，并且在B细胞发育早期阶段的细胞表面或干细胞上不存在。在一些实施方案中，CD22 CAR可以串联地包含信号肽、特异性结合CD22的胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，CD22 CAR的信号肽包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域对CD22(例如，人CD22)具有特异性。CD22 CAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。在一些实施方案中，胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。

在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域源自CD22特异性抗体，包括例如SM03、奥加伊妥珠单抗、依帕珠单抗、莫塞妥莫单抗和匹那妥珠单抗。在这些实施方案中的任一个中，CD22 CAR的胞外结合结构域可以包含任何抗体的V_H、V_L和/或一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含源自m971单克隆抗体(m971)的scFv，其包含通过接头连接的m971的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。在一些实施方案中，接头是3xG₄S接头。在其他实施方案中，可改用Whitlow接头。在一些实施方案中，完整m971衍生的scFv(也称为m971 scFv)及其不同部分的氨基酸序列提供于下表12中。在一些实施方案中，CD22特异性scFv包含SEQ ID NO:45、46或50中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:45、46或50中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO:47-49和51-53中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:47-49中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:51-53中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD22特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含源自m971-L7的scFv，其是与亲本抗体m971相比CD22结合亲和力显著提高(从约2nM提高至小于50pM)的m971的亲和力成熟变体。在一些实施方案中，源自m971-L7的scFv包含通过3xG₄S接头连接的m971-L7的V_H和V_L。在其他实施方案中，可改用Whitlow接头。在一些实施方案中，完整m971-L7衍生的scFv(也称为m971-L7 scFv)及其不同部分的氨基酸序列提供于下表12中。在一些实施方案中，CD22特异性scFv包含SEQ ID NO:54、55或59中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:54、55或59中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ IDNO:56-58和60-62中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:56-58中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:60-62中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD22特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

表12.抗CD22 scFv和组分的示例性序列

在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含免疫毒素HA22或BL22。免疫毒素BL22和HA22是包含与细菌毒素融合的CD22特异性scFv的治疗剂，因此可以结合表达CD22的癌细胞的表面并杀死癌细胞。BL22包含抗CD22抗体的dsFv，RFB4，其与38-kDa截短形式的假单胞菌外毒素A融合(Bang等人,Clin.Cancer Res.,11:1545-50(2005))。HA22(CAT8015，莫塞妥莫单抗免疫毒素)是BL22的突变的、较高亲和力形式(Ho等人,J.Biol.Chem.,280(1):607-17(2005))。对CD22具有特异性的HA22和BL22的抗原结合结构域的合适序列公开于例如美国专利号7,541,034、7,355,012和7,982,011中，这些专利据此全文以引用方式并入。

在一些实施方案中，CD22 CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD22 CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD22 CAR的胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，胞内共刺激结构域包含CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，CD22 CAR的胞内信号传导结构域包含CD3zeta(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。

BCMACAR

在一些实施方案中，CAR是BCMACAR(“BCMA-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码BCMA-CAR的核苷酸序列的表达盒。BCMA是在B细胞谱系的细胞上表达的肿瘤坏死家族受体(TNFR)成员，在终末分化的B细胞或成熟的B淋巴细胞上表达最高。BCMA参与介导浆细胞的存活以维持长期体液免疫。最近发现，BCMA的表达与多种癌症有关，诸如多发性骨髓瘤、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、各种白血病和成胶质细胞瘤。在一些实施方案中，BCMACAR可以串联地包含信号肽、特异性结合BCMA的胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，BCMACAR的信号肽包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域对BCMA(例如，人BCMA)具有特异性。BCMACAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。

在一些实施方案中，胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域源自BCMA特异性抗体，包括例如贝兰他单抗、埃拉那他单抗、特利司他单抗、LCAR-B38M和西达基。在这些实施方案中的任一个中，BCMACAR的胞外结合结构域可以包含任何抗体的V_H、V_L和/或一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含源自C11D5.3的scFv，其是如Carpenter等人,Clin.Cancer Res.19(8):2048-2060(2013)中描述的鼠单克隆抗体。还参见PCT申请公开号WO2010/104949。C11D5.3衍生的scFv可以包含通过Whitlow接头连接的C11D5.3的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)，其氨基酸序列在表13中提供。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域包含SEQ ID NO:63、64或68中列出的氨基酸序列或与SEQID NO:63、64或68中列出的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ IDNO:65-67和69-71中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:65-67中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:69-71中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含源自另一种鼠单克隆抗体C12A3.2的scFv，如Carpenter等人.,Clin.Cancer Res.19(8):2048-2060(2013)和PCT申请公开号WO2010/104949中所描述的，其氨基酸序列也提供于下表13中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域包含SEQ ID NO:72、73或77中列出的氨基酸序列或与SEQ IDNO:72、73或77中列出的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO:74-76和78-80中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:74-76中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:78-80中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含对人BCMA具有高特异性的鼠单克隆抗体，在Friedman等人,Hum.Gene Ther.29(5):585-601(2018)中称为BB2121。还参见PCT申请公开号WO2012163805。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含两条重链(VHH)的单个可变片段，其可以结合BCMA的两个表位，如Zhao等人,J.Hematol.Oncol.11(1):141(2018)中所描述的，也称为LCAR-B38M。还参见PCT申请公开号WO2018/028647。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含完全人重链可变结构域(FHVH)，如Lam等人,Nat.Commun.11(1):283(2020)中所描述的，也称为FHVH33。还参见PCT申请公开号WO2019/006072。FHVH33及其CDR的氨基酸序列在下表13中提供。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域包含SEQ ID NO:81中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:81中列出的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO:82-84中列出的氨基酸序列的CDR。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含源自CT103A(或CAR0085)的scFv，如美国专利号11,026,975B2中所描述的，其氨基酸序列提供于下表13中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域包含SEQ ID NO:118、119或123中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:118、119或123中列出的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO:120-122和124-126中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:120-122中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:124-126中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。

另外，针对BCMA的CAR和结合剂已在美国申请公开号2020/0246381 A1和2020/0339699 A1中进行了描述，这些申请中的每一个的全部内容以引用方式并入本文。

表13.抗BCMA结合物和组分的示例性序列

在一些实施方案中，BCMACAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，胞内共刺激结构域包含CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，BCMACAR的胞内信号传导结构域包含CD3 zeta(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码BCMACAR，包括例如包含如所描述的BCMA特异性胞外结合结构域、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)中的任一种的BCMACAR。在这些实施方案中的任一个中，BCMA CAR可额外包含如所述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，该核苷酸序列编码BCMACAR，包括例如包含如所描述的BCMA特异性胞外结合结构域、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:17的CD28共刺激结构域、SEQ IDNO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或它们的变体(即，具有与所公开的序列至少80％相同，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99相同的序列)中的任一种的BCMACAR。在这些实施方案中的任一个中，BCMA CAR可以另外包含如所描述的信号肽。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:127中列出的BCMACAR或与SEQ ID NO:127中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)(参见表14)。编码的BCMACAR具有SEQ ID NO:128中列出的相应氨基酸序列或与SEQ ID NO:128中列出的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)，具有以下组分：CD8α信号肽、CT103A scFv(V_L-Whitlow接头-V_H)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。

在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码可商购获得的BCMACAR实施方案的核苷酸序列的表达盒，包括例如艾基维仑赛(ide-cel，也称为bb2121)。在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码艾基维仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。艾基维仑赛包含具有以下组分的BCMACAR：BB2121结合剂、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。

表14.BCMACAR的示例性序列

Y.低免疫原性细胞的特征

在一些实施方案中，低免疫原性干细胞群与对照干细胞(例如，野生型干细胞或免疫原性干细胞)相比保留多能性。在一些实施方案中，低免疫原性干细胞群与对照干细胞(例如，野生型干细胞或免疫原性干细胞)相比保留分化潜能。

在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞在受试者或患者中引发降低或较低水平的免疫活化。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的免疫活化水平相比，所述低免疫原性细胞引发的免疫活化水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发免疫活化。

在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞在受试者或患者中引发降低或较低水平的T细胞响应。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的T细胞响应水平相比，所述低免疫原性细胞引发的T细胞响应水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发对细胞的T细胞响应。

在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞在受试者或患者中引发降低或较低水平的NK细胞响应。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的NK细胞响应水平相比，所述低免疫原性细胞引发的NK细胞响应水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发对细胞的NK细胞响应。

在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞在受试者或患者中引发降低或较低水平的巨噬细胞吞噬。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的巨噬细胞吞噬水平相比，所述低免疫原性细胞引发的NK细胞响应水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发细胞的巨噬细胞吞噬。

在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞在受试者或患者中引发降低或较低水平的系统性TH1活化。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的全身性TH1活化水平相比，所述低免疫原性细胞引发的全身性TH1活化水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发全身性TH1活化。

在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞在受试者或患者中引发降低或较低水平的NK细胞杀伤。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的NK细胞杀伤水平相比，所述低免疫原性细胞引发的NK细胞杀伤水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发NK细胞杀伤。

在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞在受试者或患者中引发降低或较低水平的外周血单核细胞(PBMC)的免疫活化。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的PBMC的免疫活化水平相比，所述低免疫原性细胞引发的PBMC的免疫活化水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发PBMC的免疫活化。

在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞在受试者或患者中引发降低或较低水平的供体特异性IgG抗体。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的供体特异性IgG抗体水平相比，所述低免疫原性细胞引发的供体特异性IgG抗体水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发供体特异性IgG抗体。

在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞在受试者或患者中引发降低或较低水平的供体特异性IgM抗体。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的供体特异性IgM抗体水平相比，所述低免疫原性细胞引发的供体特异性IgM抗体水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发供体特异性IgM抗体。

在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞在受试者或患者中引发降低或较低水平的IgM和IgG抗体产生。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的IgM和IgG抗体产生水平相比，所述低免疫原性细胞引发的IgM和IgG抗体产生水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发IgM和IgG抗体产生。

在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞在受试者或患者中引发降低或较低水平的细胞毒性T细胞杀伤。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的细胞毒性T细胞杀伤水平相比，所述低免疫原性细胞引发的细胞毒性T细胞杀伤水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发细胞毒性T细胞杀伤。

在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞在受试者或患者中引发降低或较低水平的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的CDC水平相比，所述低免疫原性细胞引发的CDC水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发CDC。

Z.来自原代T细胞的治疗性细胞

本文提供低免疫原性细胞，包括但不限于逃避免疫识别的原代T细胞。在一些实施方案中，低免疫原性细胞由T细胞(诸如原代T细胞)产生(例如，生成、培养或衍生)。在一些情况下，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、去除或取得)原代T细胞。在一些实施方案中，由T细胞库产生原代T细胞，使得T细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人类，包括一个或多个健康人类)。在一些实施方案中，原代T细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1或更多个、2或更多个、3或更多个、4或更多个、5或更多个、10或更多个、20或更多个、30或更多个、40或更多个、50或更多个、或100或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，T细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得T细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。

在一些实施方案中，低免疫原性细胞不活化患者(例如，施用后的受体)中的先天和/或适应性免疫响应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用低免疫原性细胞群来治疗病症的方法。在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性细胞包含经工程化(例如，修饰)以表达嵌合抗原受体的T细胞，所述嵌合抗原受体包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体。在一些情况下，T细胞是来自一个或多个个体的原代T细胞群或亚群。在一些实施方案中，本文描述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包含降低的内源性T细胞受体的表达。

在一些实施方案中，本公开涉及低免疫原性原代T细胞，其可调控地过表达CD47和CAR，并且具有一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达或缺乏表达，并且具有TCR复合物分子的降低的表达或缺乏表达。本文概述的细胞可调控地过表达CD47和CAR并逃避免疫识别。在一些实施方案中，原代T细胞表现出MHC I类抗原/分子、MHC II类抗原/分子和/或TCR复合物分子的可调控的降低的水平或活性。在某些实施方案中，原代T细胞可调控地过表达CD47和CAR并且在B2M基因中具有可调控的基因组修饰。在一些实施方案中，T细胞可调控地过表达CD47和CAR并且在CIITA基因中具有可调控的基因组修饰。在一些实施方案中，原代T细胞可调控地过表达CD47和CAR并且在TRAC基因中具有可调控的基因组修饰。在一些实施方案中，原代T细胞可调控地过表达CD47和CAR并且在TRB基因中具有可调控的基因组修饰。在一些实施方案中，T细胞可调控地过表达CD47和CAR并且在以下基因中的一种或多种中具有可调控的基因组修饰：B2M、CIITA、TRAC和TRB基因。

本公开的示例性T细胞选自由以下各项组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、效应记忆RA T细胞、调控性T细胞、组织浸润淋巴细胞及其组合。在某些实施方案中，T细胞表达CCR7、CD27、CD28和CD45RA。在一些实施方案中，中央T细胞表达CCR7、CD27、CD28和CD45RO。在其他实施方案中，效应记忆T细胞表达PD-1、CD27、CD28和CD45RO。在其他实施方案中，效应记忆RA T细胞表达PD-1、CD57和CD45RA。

在一些实施方案中，T细胞是修饰的(例如，工程化的)T细胞。在一些情况下，修饰的T细胞包含引起细胞表达至少一种嵌合抗原受体的修饰，所述嵌合抗原受体与以下细胞中的至少一种的表面上表达的感兴趣的抗原或表位结合：受损细胞、发育异常细胞、感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变体细胞及其组合。在其他情况下，修饰的T细胞包含引起细胞表达至少一种蛋白质的修饰，当细胞接近相邻细胞、组织或器官时，所述蛋白质在相邻细胞、组织或器官中调节感兴趣的生物学效应。对原代T细胞的有用修饰在US2016/0348073和WO2020/018620中详细描述，所述文献的公开内容整体并入本文。

在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性细胞包含经工程化(例如，修饰)以表达嵌合抗原受体的T细胞，所述嵌合抗原受体包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体。在一些情况下，T细胞是来自一个或多个个体的原代T细胞群或亚群。在一些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的内源性T细胞受体的表达。在一些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的表达。在其他实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的程序性细胞死亡(PD-1)的表达。在某些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的CTLA-4和PD-1的表达。降低或消除CTLA-4、PD-1以及CTLA-4和PD-1两者的表达的方法可以包括本领域技术人员认可的任何方法，诸如但不限于利用罕见切割核酸内切酶的遗传修饰技术和RNA沉默或RNA干扰技术。罕见切割核酸内切酶的非限制性实例包括任何Cas蛋白、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和归巢核酸内切酶。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在CTLA-4和/或PD-1基因座处。

在一些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括增强的PD-L1表达。

在一些实施方案中，低免疫原性T细胞包括编码CAR的多核苷酸，其中将所述多核苷酸插入到基因组基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也称为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也称为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD-1或CTLA-4基因中。

在一些实施方案中，低免疫原性T细胞包括编码CAR的多核苷酸，该CAR使用表达载体在细胞中可调控地表达。在一些实施方案中，使用病毒表达载体将CAR引入细胞，该病毒表达载体介导CAR序列整合到细胞的基因组中。例如，用于在细胞中表达CAR的表达载体包含编码所述CAR的多核苷酸序列。表达载体可以是诱导型表达载体。表达载体可以是病毒载体，诸如但不限于慢病毒载体。

本文提供的低免疫原性T细胞可用于治疗合适的癌症，包括但不限于B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。

AA.从低免疫原性多能干细胞分化的治疗性细胞

本文提供低免疫原性细胞，其包括来源于多能干细胞的逃避免疫识别的细胞。在一些实施方案中，细胞不活化患者或受试者(例如，施用后的受体)中的先天和/或适应性免疫响应。提供了治疗病症的方法，其包括向有需要的受体受试者重复给药低免疫原性细胞群。

在一个方面，本文提供了分化成不同细胞类型用于随后移植到受体受试者中的HIP细胞。如本领域已知的，通常通过评估细胞特异性标志物的存在可以测定分化。如本领域技术人员将理解的，可以使用本领域已知的技术移植分化低免疫原性多能细胞衍生物，这取决于细胞类型和这些细胞的最终用途。

在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出一种或多种MHC I类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达。在其他实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出一种或多种MHC II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达。在某些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出TCR复合物的可调控的降低的表达。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出一种或多种MHC I类和II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出一种或多种MHC I类和II类人白细胞抗原分子和TCR复合物的可调控的降低的表达。

在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出一种或多种MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达并且表现出可调控的增加的CD47表达。在一些情况下，细胞通过具有编码一种或多种致耐受因子的一种或多种转基因来可调控地过表达CD47。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以可调控地表现出一种或多种MHC I类和II类人白细胞抗原分子的降低的表达并且表现出可调控的增加的CD47表达。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出一种或多种MHC I类和II类人白细胞抗原分子和TCR复合物的可调控的降低的表达并且表现出可调控的增加的CD47表达。

在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出一种或多种MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达，以表现出可调控的增加的CD47表达，并且可调控地外源表达嵌合抗原受体。在一些情况下，细胞通过具有编码一种或多种致耐受因子的一种或多种转基因来可调控地过表达一种或多种致耐受因子。在一些情况下，细胞通过具有一个或多个CAR转基因而可调控地过表达CAR。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以可调控地表现出一种或多种MHC I类和II类人白细胞抗原分子的降低的表达，表现出一种或多种致耐受因子的增加的可调控的表达，并且可调控地外源表达嵌合抗原受体。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以可调控地表现出一种或多种MHC I类和II类人白细胞抗原分子和TCR复合物的降低的表达，以表现出一种或多种致耐受因子的可调控的增加的表达，并且可调控地外源表达嵌合抗原受体。

在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出一种或多种MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达并且表现出可调控的增加的CD47表达。在一些情况下，细胞通过具有一个或多个CD47转基因而过表达CD47。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出一种或多种MHC I类和II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达并且表现出可调控的增加的CD47表达。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出一种或多种MHC I类和II类人白细胞抗原分子和TCR复合物的可调控的降低的表达并且表现出可调控的增加的CD47表达。

在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出一种或多种MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达，以表现出可调控的增加的CD47表达，并且外源表达嵌合抗原受体。在一些情况下，细胞通过具有一个或多个CD47转基因而过表达CD47多肽。在一些情况下，细胞通过具有一个或多个CAR转基因而过表达CAR多肽。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出一种或多种MHC I类和II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达，表现出可调控的增加的CD47表达，并且外源表达嵌合抗原受体。在一些实施方案中，多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出一种或多种MHC I类和II类人白细胞抗原分子和TCR复合物的可调控的降低的表达，以表现出可调控的增加的CD47表达，并且外源表达嵌合抗原受体。

此类多能干细胞是低免疫原性干细胞。此类分化的细胞是低免疫原性细胞。

本文所述的任何多能干细胞都可以分化成生物体和组织的任何细胞。在一些实施方案中，细胞表现出一种或多种MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的可调控的降低的表达和TCR复合物的可调控的降低的表达。在一些情况下，与相同细胞类型的未修饰或野生型细胞相比，一种或多种MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达可调控地降低。在一些情况下，与相同细胞类型的未修饰或野生型细胞相比，TCR复合物的表达可调控地降低。在一些实施方案中，细胞表现出增加的CD47表达。在一些情况下，与相同细胞类型的未修饰或野生型细胞相比，本公开涵盖的细胞中的CD47的表达增加。在一些实施方案中，细胞表现出外源CAR表达。本文描述了用于降低MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子和TCR复合物水平并增加CD47和CAR的表达的方法。

在一些实施方案中，当施用至患者(例如，受体受试者)时，本文所述方法中使用的细胞逃避免疫识别和响应。所述细胞可以逃避免疫细胞在体外和体内的杀伤。在一些实施方案中，细胞逃避巨噬细胞和NK细胞的杀伤。在一些实施方案中，细胞被免疫细胞或受试者的免疫系统忽略。换句话说，根据本文所述的方法施用的细胞不可被免疫系统的免疫细胞检测到。在一些实施方案中，细胞被遮蔽并因此避免免疫排斥。

确定多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞是否逃避免疫识别的方法包括但不限于IFN-γElispot测定、小胶质细胞杀伤测定、细胞植入动物模型、细胞因子释放测定、ELISA、使用生物发光成像或铬释放测定或用于细胞分析的实时定量微电子生物传感器系统(RTCA系统,Agilent)进行的杀伤测定、混合淋巴细胞反应、免疫荧光分析等。

本文概述的治疗性细胞可用于治疗病症，诸如但不限于癌症、遗传病症、慢性传染病、自身免疫性病症、神经系统病症等。

1.从低免疫原性多能细胞分化的心脏细胞

本文提供了从低免疫原性诱导性多能(HIP)细胞分化的用于随后移植或植入到受试者(例如，接受者)中的心脏细胞类型。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。示例性心脏细胞类型包括但不限于心肌细胞、结节心肌细胞、传导心肌细胞、工作心肌细胞、心肌细胞前体细胞、心肌祖细胞、心脏干细胞、心肌细胞、心房心脏干细胞、心室心脏干细胞、心外膜细胞、造血细胞、血管内皮细胞、心内膜内皮细胞、心脏瓣膜间质细胞、心脏起搏细胞等。

在一些实施方案中，将本文所述的心脏细胞施用至受体受试者以治疗选自由以下各项组成的组的心脏病症：儿科心肌病、年龄相关性心肌病、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、慢性缺血性心肌病、围产期心肌病、炎性心肌病、特发性心肌病、其他心肌病、心肌缺血再灌注损伤、心室功能障碍、心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、终末期心脏病、动脉粥样硬化、局部缺血、高血压、再狭窄、心绞痛、风湿性心脏病、动脉炎症、心血管疾病、心肌梗塞、心肌局部缺血、心肌梗塞、心脏局部缺血、心脏损伤、心肌局部缺血、血管疾病、后天性心脏病、先天性心脏病、冠状动脉疾病、传导系统功能障碍、冠状动脉功能障碍、肺动脉高压、心律失常、肌营养不良、肌肉质量异常、肌肉变性、心肌炎、感染性心肌炎、药物或毒素诱导的肌肉异常、过敏性心肌炎、二尖瓣关闭不全、自身免疫性心内膜炎、原发性心律失常疾病、心脏微血管病、长QT综合征、短QT综合征、布鲁加达综合征、儿茶酚胺能多形性室性心动过速以及耶韦尔和兰格-尼尔森综合征(参见van den Brink等人,StemCells.2020年2月；38(2):174-186)。

因此，本文提供了用于在有需要的受试者中治疗和预防心脏损伤或心脏病或心脏病症的方法。本文所述的方法可用于治疗、改善、预防多种心脏病或其症状(诸如导致心脏结构和/或功能病理性损伤的那些疾病或其症状)或减缓其进展。术语“心脏病”、“心脏病症”和“心脏损伤”在本文中可互换使用，并且是指与心脏(包括瓣膜、内皮、梗塞区或心脏的其他组件或结构)相关的疾患和/或病症。此类心脏病或心脏相关疾病包括但不限于心肌梗塞、心力衰竭、心肌病、先天性心脏缺陷、心脏瓣膜疾病或功能障碍、心内膜炎、风湿热、二尖瓣脱垂、感染性心内膜炎、肥厚性心肌病、扩张性心肌病、心肌炎、心脏扩大和/或二尖瓣关闭不全等。

在一些实施方案中，心肌细胞前体包括能够产生包括成熟(末期)心肌细胞的后代的细胞。通常可以使用选自GATA-4、Nkx2.5和MEF-2转录因子家族的一种或多种标志物来鉴定心肌细胞前体细胞。在一些情况下，心肌细胞是指表达来自以下列表的一种或多种标志物(有时至少2、3、4或5种标志物)的未成熟心肌细胞或成熟心肌细胞：心肌肌钙蛋白I(cTnl)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌节肌球蛋白重链(MHC)、GATA-4、Nkx2.5、N-钙粘蛋白、β2-肾上腺素受体、ANF、MEF-2转录因子家族、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌红蛋白和心房利尿钠因子(ANF)。在一些实施方案中，心脏细胞表现出自发的周期性收缩活动。在一些情况下，当心脏细胞在具有适当Ca2+浓度和电解质平衡的合适组织培养环境中培养时，不必向培养基中添加任何额外成分就可以观察到细胞沿细胞的一个轴以周期性方式收缩，然后从收缩中释放。在一些实施方案中，心脏细胞是低免疫原性心脏细胞。

在一些实施方案中，通过体外分化从低免疫原性多能(HIP)细胞群产生低免疫原性心脏细胞群的方法包括：(a)在包含GSK抑制剂的培养基中培养低免疫原性诱导性多能干细胞群；(b)在包含WNT拮抗剂的培养基中培养HIP细胞群以产生前心脏细胞群；以及(c)在包含胰岛素的培养基中培养前心脏细胞群以产生低免疫心脏细胞群。在一些实施方案中，GSK抑制剂是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，GSK抑制剂的浓度范围为约2mM至约10mM。在一些实施方案中，WNT拮抗剂是IWR1、其衍生物或其变体。在一些情况下，WNT拮抗剂的浓度范围为约2mM至约10mM。

在一些实施方案中，低免疫原性心脏细胞群与非心脏细胞分离。在一些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性心脏细胞群。在某些实施方案中，在施用之前扩增并冷冻保存分离的低免疫原性心脏细胞群。

用于将诱导性多能干细胞或多能干细胞分化成心脏细胞的其他有用方法描述于例如US2017/0152485；US2017/0058263；US2017/0002325；US2016/0362661；US2016/0068814；US9,062,289；US7,897,389；和US7,452,718中。用于从诱导性多能干细胞或多能干细胞产生心脏细胞的另外的方法描述于例如Xu等人,Stem Cells and Development,2006,15(5):631-9、Burridge等人,Cell Stem Cell,2012,10:16-28和Chen等人,StemCell Res,2015,l5(2):365-375中。

在各种实施方案中，低免疫原性心脏细胞可以在包含以下的培养基中培养：BMP途径抑制剂、WNT信号传导活化剂、WNT信号传导抑制剂、WNT激动剂、WNT拮抗剂、Src抑制剂、EGFR抑制剂、PCK活化剂、细胞因子、生长因子、心肌剂、化合物等。

WNT信号传导活化剂包括但不限于CHIR99021。PCK活化剂包括但不限于PMA。WNT信号传导抑制剂包括但不限于选自KY02111、SO3031(KY01-I)、SO2031(KY02-I)和SO3042(KY03-I)以及XAV939的化合物。Src抑制剂包括但不限于A419259。EGFR抑制剂包括但不限于AG1478。

用于从iPSC产生心脏细胞的剂的非限制性实例包括活化素A、BMP4、Wnt3a、VEGF、可溶性卷曲蛋白、环孢菌素A、血管紧张素II、去氧肾上腺素、抗坏血酸、二甲基亚砜、5-氮杂-2'-脱氧胞苷等。

本文提供的细胞可以在表面诸如合成表面上培养，以支持和/或促进低免疫原性多能细胞分化成心脏细胞。在一些实施方案中，所述表面包含聚合物材料，包括但不限于所选的一种或多种丙烯酸酯单体的均聚物或共聚物。丙烯酸酯单体和甲基丙烯酸酯单体的非限制性实例包括四(乙二醇)二丙烯酸酯、二甲基丙烯酸甘油酯、二甲基丙烯酸1,4-丁二醇、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、二(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、四(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、1,6-己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷乙氧基化物(1EO/QH)甲基、三环[5.2.1.02,6]癸烷二甲醇二丙烯酸酯、新戊二醇乙氧基化物二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。丙烯酸酯按照本领域已知的方式合成或从商业供应商获得，诸如Polysciences,Inc.、Sigma Aldrich,Inc.和Sartomer,Inc。

聚合物材料可以分散在支撑材料的表面上。适用于培养细胞的有用的支撑材料包括陶瓷物质、玻璃、塑料、聚合物或共聚物、其任何组合、或一种材料在另一种材料上的涂层。在一些情况下，玻璃包括钠钙玻璃、耐热玻璃、高硅氧玻璃、石英玻璃、硅或这些玻璃的衍生物等。

在一些情况下，包括树枝状聚合物的塑料或聚合物包括聚(氯乙烯)、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙酸乙烯酯-马来酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)单甲基丙烯酸酯、环烯烃聚合物、氟碳聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯亚胺或这些的衍生物等。在一些情况下，共聚物包括聚(乙酸乙烯酯-共-马来酸酐)、聚(苯乙烯-共-马来酸酐)、聚(乙烯-共-丙烯酸)或这些的衍生物等。

如本文所述制备的心脏细胞的功效可以在心脏冷冻损伤的动物模型中评估，该心脏冷冻损伤导致55％的左心室壁组织在未进行治疗的情况下变成瘢痕组织(Li等人,Ann.Thorac.Surg.62:654,1996；Sakai等人,Ann.Thorac.Surg.8:2074,1999,Sakai等人,Thorac.Cardiovasc.Surg.118:715,1999)。成功的治疗可以减少疤痕面积，限制疤痕扩张，并改善心脏功能(通过收缩压、舒张压和发展压确定)。还可以使用左前降支的远端部分中的栓塞线圈来对心脏损伤进行建模(Watanabe等人,Cell Transplant.7:239,1998)，并且可以通过组织学和心脏功能来评价治疗功效。

在一些实施方案中，施用包括植入受试者的心脏组织、静脉内注射、动脉内注射、冠状动脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、心肌内注射、经心内膜注射、经心外膜注射或输注。

在一些实施方案中，施用了工程化心脏细胞的患者还施用了心脏药物。适用于联合疗法的心脏药物的说明性实例包括但不限于生长因子、编码生长因子的多核苷酸、血管生成剂、钙通道阻断剂、抗高血压剂、抗有丝分裂剂、正性肌力剂、抗动脉粥样硬化剂、抗凝血剂、β-受体阻滞剂、抗心律失常剂、抗炎剂、血管扩张剂、溶栓剂、强心苷、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、原生动物抑制剂、硝酸盐、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、脑钠肽(BNP)；抗肿瘤剂、类固醇等。

可以多种方式监测根据本文提供的方法的治疗效果。例如，可以利用心电图(ECG)或霍特监测器(holier monitor)来确定治疗功效。ECG是心律和电脉冲的量度，并且是一种用于确定治疗是否改善或维持、预防或减缓受试者心脏电传导的退化的非常有效且非侵入性方式。使用可以长时间佩戴的便携式ECG霍特监测器来监测心脏异常、心律失常病症等也是评估治疗有效性的可靠方法。ECG或核研究可用于确定心室功能的改善。

2.从低免疫原性多能细胞分化的神经细胞

本文提供了从HIP细胞分化的不同神经细胞类型，其可用于随后移植或植入到受体受试者中。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。示例性神经细胞类型包括但不限于脑内皮细胞、神经元(例如，多巴胺能神经元)、神经胶质细胞等。

在一些实施方案中，将本文所述的神经细胞施用至受体受试者以治疗选自由以下各项组成的组的神经系统病症：阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、佩-梅二氏病、其他神经退行性疾病或疾患、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、局部缺血、多发性硬化、创伤性脑损伤、癫痫、僵直症、脑炎、脑膜炎、偏头痛、中风、短暂性脑缺血发作、蛛网膜下出血、硬膜下出血、血肿、硬膜外出血、脊髓损伤、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、周围神经病、吉兰-巴雷综合征、神经痛、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、τ蛋白病、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、嗜银粒病、贝尔麻痹、脑瘫、运动神经元疾病、神经纤维瘤病、脑炎、脑膜炎、图雷特氏综合征、精神分裂症、精神病、抑郁症或其他神经精神病症(如Gorman等人,J CellMol Med.2008Dec；12(6A):2263-2280、Kovacs等人,Handbook of Clin Neurol.2018；145:355-368中所描述的)。

在一些实施方案中，诱导性多能干细胞的分化通过将细胞暴露或接触已知产生特定细胞谱系的特定因子来进行，以便将其分化物靶向特定的、期望的谱系和/或感兴趣的细胞类型。在一些实施方案中，终末分化细胞表现出专门的表型特性或特征。在某些实施方案中，本文所述的干细胞分化成神经外胚层、神经元、神经内分泌、多巴胺能、胆碱能、血清素能(5-HT)、谷氨酸能、GABA能、肾上腺素能、去甲肾上腺素能、交感神经元、副交感神经元、交感周围神经元或神经胶质细胞群。在一些情况下，神经胶质细胞群包括小胶质(例如，变形、分支、活化的吞噬和活化的非吞噬)细胞群或大胶质(中枢神经系统细胞：星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞和放射状胶质细胞；和周围神经系统细胞：施旺氏细胞(Schwanncell)和卫星细胞)细胞群，或任何前述细胞的前体和祖细胞。

用于产生不同类型的神经细胞的方案描述于PCT申请号WO2010144696、美国专利号9,057,053；9,376,664；和10,233,422。用于分化低免疫原性多能细胞的方法的额外描述可见于例如Deuse等人,Nature Biotechnology,2019,37,252-258和Han等人,Proc NatlAcad Sci USA,2019,116(21),10441-10446。以下参考文献中描述了用于确定神经细胞移植在神经系统病症或疾患的动物模型中的效果的方法：对于脊髓损伤，Curtis等人,CellStem Cell,2018,22,941-950；对于帕金森氏病(Parkinson's disease)，Kikuchi等人,Nature,2017,548:592-596；对于ALS–Izrael等人,Stem Cell Research,2018,9(1):152和Izrael等人,IntechOpen,DOI:10.5772/intechopen.72862；对于癫痫，Upadhya等人,PNAS,2019,116(1):287-296

3.从低免疫原性多能细胞分化的脑内皮细胞

在一些实施方案中，向受试者施用神经细胞以治疗血管性痴呆、阿尔茨海默氏病；疾病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多发性硬化、其他神经退行性疾病或疾患、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、图雷特氏综合征(TS)、精神分裂症、精神病、抑郁症、其他神经精神病症、HIV-1相关神经认知障碍、创伤性脑损伤(如Grammas等人,Exp Rev Mol Med.2011年3月；13:e19；Wang等人,Front Aging Neurosci.2018年11月16日；00376中所描述的)。在一些实施方案中，将本文所述的神经细胞施用至受试者以治疗或改善中风。在一些实施方案中，将神经元和神经胶质细胞施用至患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)的受试者。在一些实施方案中，施用脑内皮细胞以减轻脑出血的症状或影响。在一些实施方案中，将多巴胺能神经元施用至患有帕金森氏病的患者。在一些实施方案中，将去甲肾上腺素能神经元、GABA能中间神经元施用至经历过癫痫发作的患者。在一些实施方案中，将运动神经元、中间神经元、施旺氏细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞施用至经历过脊髓损伤的患者。

在一些实施方案中，脑内皮细胞(EC)、其前体和祖细胞通过在包含促进EC或神经细胞产生的一种或多种因子的培养基中培养细胞来从表面上的多能干细胞(例如，诱导性多能干细胞)分化。在一些情况下，培养基包含以下中的一种或多种：CHIR-99021、VEGF、碱性FGF(bFGF)和Y-27632。在一些实施方案中，培养基包含被设计用于促进神经细胞的存活和功能性的补充物。

在一些实施方案中，脑内皮细胞(EC)、其前体和祖细胞通过在非条件或条件培养基中培养细胞来从表面上的多能干细胞分化。在一些情况下，培养基包含促进或促成分化的因子或小分子。在一些实施方案中，培养基包含选自由以下各项组成的组的一种或多种因子或小分子：VEGR、FGF、SDF-1、CHIR-99021、Y-27632、SB 431542及其任何组合。在一些实施方案中，用于分化的表面包含一种或多种胞外基质蛋白。表面可以涂覆有一种或多种胞外基质蛋白。可以使细胞在悬浮液中分化，然后将其放入凝胶基质形式(诸如基质胶、明胶或纤维蛋白/凝血酶形式)中以促进细胞存活。在一些情况下，如本领域已知的那样，通常通过评价细胞特异性标志物的存在来测定分化。

在一些实施方案中，脑内皮细胞表达或分泌选自由CD31、VE钙粘蛋白及其组合组成的组的因子。在某些实施方案中，脑内皮细胞表达或分泌选自由以下各项组成的组的因子中的一种或多种：CD31、CD34、CD45、CD117(c-kit)、CD146、CXCR4、VEGF、SDF-1、PDGF、GLUT-1、PECAM-1、eNOS、claudin-5、occludin、ZO-1、p-糖蛋白、von Willebrand因子、VE-钙粘蛋白、低密度脂蛋白受体LDLR、低密度脂蛋白受体相关蛋白1 LRP1、胰岛素受体INSR、瘦素受体LEPR、基底细胞粘附分子BCAM、转铁蛋白受体TFRC、晚期糖基化终产物特异性受体AGER、视黄醇摄取受体STRA6、大中性氨基酸转运蛋白小亚基1 SLC7A5、兴奋性氨基酸转运蛋白3 SLC1A1、钠偶联中性氨基酸转运蛋白5 SLC38A5、溶质载体家族16成员1 SLC16A1、ATP依赖性移位酶ABCB1、ATP-ABCC2-结合盒转运蛋白ABCG2、多药耐药相关蛋白1 ABCC1、小管多特异性有机阴离子转运蛋白1 ABCC2、多药耐药相关蛋白4 ABCC4和多药耐药相关蛋白5 ABCC5。

在一些实施方案中，脑EC的特征在于具有选自由以下各项组成的组的一种或多种特征：紧密连接的高表达、高电阻、低开窗、小血管周围空间、胰岛素和转铁蛋白受体的普遍存在以及高线粒体数量。

在一些实施方案中，使用正选择策略来选择或纯化脑EC。在一些情况下，根据内皮细胞标志物诸如但不限于CD31对脑EC进行分选。换句话说，将CD31阳性脑EC分离出来。在一些实施方案中，使用负选择策略来选择或纯化脑EC。在一些实施方案中，通过选择表达多能性标志物(包括但不限于TRA-1-60和SSEA-1)的细胞来去除未分化或多能干细胞。

4.从低免疫原性多能细胞分化的多巴胺能神经元

在一些实施方案中，本文所述的HIP细胞分化成多巴胺能神经元，包括神经元干细胞、神经元祖细胞、未成熟多巴胺能神经元和成熟多巴胺能神经元。

在一些情况下，术语“多巴胺能神经元”包括表达酪氨酸羟化酶(TH)的神经元细胞，所述酪氨酸羟化酶是多巴胺合成的限速酶。在一些实施方案中，多巴胺能神经元分泌神经递质多巴胺，并且很少或不表达多巴胺羟化酶。多巴胺能(DA)神经元可以表达以下标志物中的一种或多种：神经元特异性烯醇化酶(NSE)、1-芳香族氨基酸脱羧酶、囊泡单胺转运蛋白2、多巴胺转运蛋白、Nurr-l和多巴胺2受体(D2受体)。在某些情况下，术语“神经干细胞”包括沿着神经细胞途径部分分化并表达一种或多种神经标志物(包括例如巢蛋白)的多能细胞群。神经干细胞可以分化成神经元或神经胶质细胞(例如，星形胶质细胞和少突胶质细胞)。术语“神经祖细胞”包括表达FOXA2和低水平b-微管蛋白但不表达酪氨酸羟化酶的培养细胞。在培养适当的因子诸如本文所述的那些时，此类神经祖细胞具有分化成多种神经元亚型；特别是多种多巴胺能神经元亚型的能力。

在一些实施方案中，将源自HIP细胞的DA神经元施用至患者，例如人患者，以治疗神经退行性疾病或疾患。在一些情况下，神经变性疾病或疾患选自由帕金森氏病、亨廷顿氏病和多发性硬化症组成的组。在其他实施方案中，DA神经元用于治疗或改善神经精神障碍的一种或多种症状，诸如注意力缺陷多动障碍(ADHD)、抽动秽语综合征(TS)、精神分裂症、精神病和抑郁症。在又其他实施方案中，DA神经元用于治疗DA神经元受损的患者。

在一些实施方案中，静脉内或通过注射将分化的DA神经元移植到患者体内的特定位置。在一些实施方案中，将DA细胞移植到大脑的黑质(特别是致密区域中或附近)、腹侧被盖区(VTA)、尾状核、壳核、伏隔核、丘脑底核或其任何组合中，以替代其变性导致帕金森氏病的DA神经元。DA细胞可以作为细胞悬浮液注射到目标区域中。或者，当包含在此种递送装置中时，可将DA细胞嵌入支持基质或支架中。在一些实施方案中，支架是可生物降解的。在其他实施方案中，支架是不可生物降解的。支架可包含天然或合成(人工)材料。

在一些实施方案中，DA神经元、其前体和祖细胞通过在包含一种或多种因子或添加剂的培养基中培养干细胞来从多能干细胞分化。促进DA神经元分化、生长、扩增、维持和/或成熟的有用因子和添加剂包括但不限于Wntl、FGF2、FGF8、FGF8a、音猬因子(SHH)、脑源性神经营养因子(BDNF)、转化生长因子a(TGF-a)、TGF-b、白介素1β、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、GSK-3抑制剂(例如，CHIR-99021)、TGF-b抑制剂(例如，SB-431542)、B-27补充剂、多索吗啡、嘌吗啡胺、头蛋白、视黄酸、cAMP、抗坏血酸、neurturin、敲除血清替代物、N-乙酰基半胱氨酸、c-kit配体、它们的修饰形式、它们的模拟物、它们的类似物以及它们的变体。在一些实施方案中，DA神经元在活化或抑制WNT途径、NOTCH途径、SHH途径、BMP途径、FGF途径等的一种或多种因子的存在下分化。分化方案及其详细描述提供于例如US9,968,637、US7,674,620、Kim等人,Nature,2002,418,50-56、Bjorklund等人,PNAS,2002,99(4),2344-2349、Grow等人,Stem Cells Transl Med.2016,5(9):1133-44以及Cho等人,PNAS,2008,105:3392-3397中，其公开内容整体(包括实施例、方法、附图和结果的详细描述)以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，低免疫原性多巴胺能神经元群体是从非神经元细胞中分离的。在一些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性多巴胺能神经元群体。在某些实施方案中，在施用之前扩增并冷冻保存分离的低免疫原性多巴胺能神经元群。

为了表征和监测DA分化并评估DA表型，可以评价任何数量的分子和遗传标志物的表达。例如，遗传标志物的存在可以通过本领域技术人员已知的各种方法来确定。分子标志物的表达可以通过定量方法来确定，诸如但不限于基于qPCR的测定、免疫测定、免疫细胞化学测定、免疫印迹测定等。DA神经元的示例性标志物包括但不限于TH、b-微管蛋白、配对盒蛋白(Pax6)、胰岛素基因增强蛋白(Isl1)、巢蛋白、二氨基联苯胺(DAB)、G蛋白活化的内向整流钾通道2(GIRK2)、微管相关蛋白2(MAP-2)、NURR1、多巴胺转运蛋白(DAT)、叉头盒蛋白A2(FOXA2)、FOX3、双皮质素和LIM同源盒转录因子l-β(LMX1B)等。在一些实施方案中，DA神经元表达选自corin、FOXA2、TuJ1、NURR1及其任何组合的一种或多种标志物。

在一些实施方案中，根据细胞电生理活性评估DA神经元。细胞的电生理学可以通过使用本领域技术人员已知的测定来评价。例如，全细胞和穿孔膜片钳、用于检测细胞电生理活性的测定、用于测量细胞动作电位大小和持续时间的测定、以及用于检测DA细胞的多巴胺产生的功能测定。

在一些实施方案中，DA神经元分化的特征在于自发节律性动作电位和在注入去极化电流后具有尖峰频率适应的高频动作电位。在其他实施方案中，DA分化的特征在于多巴胺的产生。产生的多巴胺水平是通过测量动作电位达到其最大幅度一半(尖峰半最大宽度)时的宽度来计算的。

在一些实施方案中，静脉内或通过注射将分化的DA神经元移植到患者体内的特定位置。在一些实施方案中，将分化的DA细胞移植到大脑的黑质(特别是致密区域中或附近)、腹侧被盖区(VTA)、尾状核、壳核、伏隔核、丘脑底核或其任何组合中，以替代其变性导致帕金森氏病的DA神经元。分化的DA细胞可以作为细胞悬浮液注射到目标区域中。或者，当包含在此种递送装置中时，可将分化的DA细胞嵌入支持基质或支架中。在一些实施方案中，支架是可生物降解的。在其他实施方案中，支架是不可生物降解的。支架可包含天然或合成(人工)材料。

DA神经元的递送可通过使用合适的媒介物来实现，所述媒介物诸如但不限于脂质体、微粒或微胶囊。在其他实施方案中，分化的DA神经元以包含等渗赋形剂的药物组合物的形式施用。所述药物组合物是在对于人类施用而言足够无菌的条件下制备的。在一些实施方案中，从HIP细胞分化的DA神经元以药物组合物的形式提供。细胞组合物的治疗制剂的一般原则可见于Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,and CellularImmunotherapy,G.Morstyn和W.Sheridan编辑,Cambridge University Press,1996和Hematopoietic Stem Cell Therapy,E.Ball、J.Lister和P.Law,Churchill Livingstone,2000，其公开内容通过引用并入本文。

对来源于干细胞的神经元及其制备方法的有用描述可见于例如Kirkeby等人,Cell Rep,2012,1:703-714；Kriks等人,Nature,2011,480:547-551；Wang等人,Stem CellReports,2018,11(1):171-182；Lorenz Studer,“Chapter 8-Strategies for BringingStem Cell-Derived Dopamine Neurons to the clinic-The NYSTEM Trial”in Progressin Brain Research,2017,第230卷,第191-212页；Liu等人,Nat Protoc,2013,8:1670-1679；Upadhya等人,Curr Protoc Stem Cell Biol,38,2D.7.1-2D.7.47；美国公布申请号20160115448和US8,252,586；US8,273,570；US9,487,752和US10,093,897，其内容通过引用整体并入本文。

除了DA神经元之外，其他神经元细胞、其前体和祖细胞也可以通过在包含一种或多种因子或添加剂的培养基中培养细胞来从本文概述的HIP细胞分化。因子和添加剂的非限制性实例包括GDNF、BDNF、GM-CSF、B27、碱性FGF、碱性EGF、NGF、CNTF、SMAD抑制剂、Wnt拮抗剂、SHH信号传导活化剂及其任何组合。在一些实施方案中，SMAD抑制剂选自由以下各项组成的组：SB431542、LDN-193189、头蛋白PD169316、SB203580、LY364947、A77-01、A-83-01、BMP4、GW788388、GW6604、SB-505124、乐德木单抗(lerdelimumab)、美替木单抗(metelimumab)、GC-I008、AP-12009、AP-110I4、LY550410、LY580276、LY364947、LY2109761、SB-505124、E-616452(RepSox ALK抑制剂)、SD-208、SMI6、NPC-30345、K 26894、SB-203580、SD-093、活化素-M108A、P144、可溶性TBR2-Fc、DMH-1、多索吗啡二盐酸盐及其衍生物。在一些实施方案中，Wnt拮抗剂选自由以下各项组成的组：XAV939、DKK1、DKK-2、DKK-3、DKK-4、SFRP-1、SFRP-2、SFRP-3、SFRP-4、SFRP-5、WIF-1、Soggy、IWP-2、IWR1、ICG-001、KY0211、Wnt-059、LGK974、IWP-L6及其衍生物。在一些实施方案中，SHH信号传导活化剂选自由以下各项组成的组：平滑激动剂(SAG)、SAG类似物、SHH、C25-SHH、C24-SHH、purmorphamine、Hg-Ag和/或其衍生物。

在一些实施方案中，神经元表达选自由以下各项组成的组的一种或多种标志物：离子型谷氨酸受体NMDA型亚基1GRIN1、谷氨酸脱羧酶1GAD1、γ-氨基丁酸GABA、酪氨酸羟化酶TH、LIM同源盒转录因子1-αLMX1A、叉头盒蛋白O1 FOXO1、叉头盒蛋白A2FOXA2、叉头盒蛋白O4 FOXO4、FOXG1、2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶CNP、髓磷脂碱性蛋白MBP、微管蛋白β链3TUB3、微管蛋白β链3NEUN、溶质载体家族1成员6SLC1A6、SST、PV、钙结合蛋白、RAX、LHX6、LHX8、DLX1、DLX2、DLX5、DLX6、SOX6、MAFB、NPAS1、ASCL1、SIX6、OLIG2、NKX2.1、NKX2.2、NKX6.2、VGLUT1、MAP2、CTIP2、SATB2、TBR1、DLX2、ASCL1、ChAT、NGFI-B、c-fos、CRF、RAX、POMC、下视丘分泌素、NADPH、NGF、Ach、VAChT、PAX6、EMX2p75、CORIN、TUJ1、NURR1和/或其任何组合。

5.从低免疫原性多能细胞分化的神经胶质细胞

在一些实施方案中，所描述的神经细胞包括神经胶质细胞，诸如但不限于小神经胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞和施旺氏细胞、神经胶质前体及其神经胶质祖细胞是通过将多能干细胞分化成治疗有效的神经胶质细胞等产生的。低免疫原性多能干细胞的分化产生低免疫原性神经细胞，诸如低免疫原性神经胶质细胞。

在一些实施方案中，通过在包含选自由以下各项组成的组的一种或多种剂的培养基中培养多能干细胞来产生神经胶质细胞、其前体和祖细胞：视黄酸、IL-34、M-CSF、FLT3配体、GM-CSF、CCL2、TGFβ抑制剂、BMP信号传导抑制剂、SHH信号传导活化剂、FGF、血小板衍生生长因子PDGF、PDGFR-α、HGF、IGF1、头蛋白、SHH、多索吗啡、头蛋白及其任何组合。在某些情况下，BMP信号传导抑制剂是LDN193189、SB431542或其组合。在一些实施方案中，神经胶质细胞表达NKX2.2、PAX6、SOX10、脑源性神经营养因子BDNF、中性粒细胞营养因子-3NT-3、NT-4、EGF、睫状神经营养因子CNTF、神经生长因子NGF、FGF8、EGFR、OLIG1、OLIG2、髓磷脂碱性蛋白MBP、GAP-43、LNGFR、巢蛋白、GFAP、CD11b、CD11c、CX3CR1、P2RY12、IBA-1、TMEM119、CD45及其任何组合。示例性分化培养基可以包括可促进或能够产生本领域技术人员所认识的神经胶质细胞类型的任何特定因子和/或小分子。

为了确定根据体外分化方案产生的细胞是否表现出神经胶质细胞的特性和特征，可将细胞移植到动物模型中。在一些实施方案中，将神经胶质细胞注射到免疫受损的小鼠，例如免疫受损的shiverer小鼠中。将神经胶质细胞施用至小鼠的大脑中，并在预先选择的时间后对植入的细胞进行评价。在一些情况下，通过使用免疫染色和成像方法来使大脑中的植入细胞可视化。在一些实施方案中，确定神经胶质细胞表达已知的神经胶质细胞生物标志物。

用于从干细胞产生神经胶质细胞、其前体和祖细胞的有用方法可见于例如US7,579,188；US7,595,194；US8,263,402；US8,206,699；US8,252,586；US9,193,951；US9,862,925；US8,227,247；US9,709,553；US2018/0187148；US2017/0198255；US2017/0183627；US2017/0182097；US2017/253856；US2018/0236004；WO2017/172976；和WO2018/093681。用于分化多能干细胞的方法描述于例如Kikuchi等人,Nature,2017,548,592-596；Kriks等人,Nature,2011,547-551；Doi等人,Stem Cell Reports,2014,2,337-50；Perrier等人,Proc Natl Acad Sci USA,2004,101,12543-12548；Chambers等人,Nat Biotechnol,2009,27,275-280；以及Kirkeby等人,Cell Reports,2012,1,703-714。

神经细胞移植对于脊髓损伤的功效可在例如急性脊髓损伤的大鼠模型中进行评估，如McDonald等人,Nat.Med.,1999,5:1410)和Kim等人,Nature,2002,418:50所述。例如，成功的移植可能会显示2-5周后病灶处存在移植源细胞，分化成星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或神经元，并从病灶端沿着脊髓迁移，并且步态、协调性和负重能力改善。基于神经细胞类型和待治疗的神经疾病或疾患选择特定的动物模型。

在一些实施方案中，将从低免疫原性细胞分化的神经胶质细胞施用至有需要的受试者，其中该受试者患有疾病或疾患，包括但不限于嗜银粒病(AGD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、皮质基底节变性(CBD)、17号染色体相关帕金森氏病(FTDP-17)、多系统萎缩(MSA)、帕金森氏病/弥漫性路易体病(PD/DLBD)或阿尔茨海默氏病(参见Miller等人,Neuron GliaBiol.2004年2月；1(1):13–21)。

神经细胞可以允许它们植入到预期组织部位并重建或再生功能缺陷区域的方式施用。例如，根据所治疗的疾病，神经细胞可以直接移植到中枢神经系统的实质或鞘内部位。在一些实施方案中，通过静脉内、脊柱内、脑室内、鞘内、动脉内、肌内、腹膜内、皮下、肌内、腹内、眼内、球后及其组合将本文所述的任何神经细胞(包括脑内皮细胞、神经元、多巴胺能神经元、室管膜细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和施旺氏细胞)注射到患者体内。在一些实施方案中，细胞以推注或连续输注的形式注射或沉积。在某些实施方案中，神经细胞通过注射到脑内、脑部附近以及它们的组合来施用。例如，可通过在受试者的头骨中开的钻孔来进行注射。向脑施用神经细胞的合适位点包括但不限于脑室、侧脑室、大池、壳核、基底核、海马皮层、纹状体、脑尾状区及其组合。

用于本公开的神经细胞(包括多巴胺能神经元)的另外的描述可见于WO2020/018615，其公开内容以引用方式整体并入本文。

6.从低免疫原性多能细胞分化的内皮细胞

本文提供了分化成各种内皮细胞类型的低免疫原性多能细胞，用于随后移植或植入到受试者(例如，接受者)中。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。

在一些实施方案中，将从受试者低免疫原性多能细胞分化的内皮细胞施用至有需要的患者，例如人患者。可以将内皮细胞施用至患有诸如但不限于以下疾病或疾患的患者：动脉粥样硬化、动脉粥样硬化形成、动脉血栓形成、静脉血栓形成、血小板微血管病、血管渗漏、弥漫性血管内凝血、糖尿病、胰岛素抵抗(如Rajendra等人,Int J Biol Sci.2013年11月9日；9(10):1057-1069中所描述的)、心血管疾病、血管疾病、周围血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、周围血管阻塞性疾病、中风、再灌注损伤、肢体局部缺血、神经病(例如，周围神经病或糖尿病性神经病)、器官衰竭(例如，肝衰竭、肾衰竭等)、糖尿病、类风湿性关节炎、骨质疏松症、血管损伤、组织损伤、高血压、由冠状动脉疾病引起的心绞痛和心肌梗塞、肾血管性高血压、由肾动脉狭窄引起的肾衰竭、下肢跛行等。在某些实施方案中，患者已经患有或正在患有短暂性脑缺血发作或中风，在一些情况下，这可能是由于脑血管疾病。在一些实施方案中，施用工程化内皮细胞以治疗组织缺血，例如在动脉粥样硬化、心肌梗塞和肢体局部缺血中发生的组织缺血，并且修复损伤的血管。在一些情况下，细胞用于移植物的生物工程。

例如，内皮细胞可用于细胞疗法，用于修复缺血组织、形成血管和心脏瓣膜、工程化人工血管、修复受损血管以及诱导工程化组织中血管的形成(例如，移植前)。此外，内皮细胞可被另外修饰以递送剂来靶向和治疗肿瘤。

在某些实施方案中，本文提供了一种修复或替换需要血管细胞或血管化的组织的方法。所述方法涉及向需要此类治疗的人患者施用含有分离的内皮细胞的组合物以促进此类组织中的血管形成。需要血管细胞或血管化的组织可以是心脏组织、肝脏组织、胰腺组织、肾组织、肌肉组织、神经组织、骨组织等，其可以是受损的并且以过度细胞死亡为特征的组织、有受损风险的组织或人工工程化组织。

在一些实施方案中，可通过施用内皮细胞来治疗可能与心脏疾病或病症相关的血管疾病，所述内皮细胞诸如但不限于如本文所述衍生的定形血管内皮细胞和心内膜内皮细胞。此类血管疾病包括但不限于冠状动脉疾病、脑血管疾病、主动脉狭窄、主动脉瘤、外周动脉疾病、动脉粥样硬化、静脉曲张、血管病、缺乏冠状动脉灌注的心脏梗塞区域、不愈合伤口、糖尿病或非糖尿病性溃疡，或任何希望诱导血管形成的其他疾病或病症。

在许多实施方案中，内皮细胞用于改进在血管重建手术中使用的假体植入物(例如，由诸如Dacron和Gortex的合成材料制成的血管)。例如，假体动脉移植物通常用于替代灌注重要器官或肢体的患病动脉。在其他实施方案中，工程化内皮细胞用于覆盖假体心脏瓣膜的表面，以通过使瓣膜表面不易形成血栓来降低栓塞形成的风险。

可使用众所周知的外科技术将所概述的内皮细胞移植到患者体内，以将组织和/或分离的细胞移植到血管中。在一些实施方案中，通过注射(例如，心肌内注射、冠状动脉内注射、经心内膜注射、经心外膜注射、经皮注射)、输注、移植和植入将细胞引入患者的心脏组织中。

内皮细胞的施用(递送)包括但不限于皮下或胃肠外施用，包括静脉内、动脉内(例如，冠状动脉内)、肌内、腹膜内、心肌内、经心内膜、经心外膜、鼻内施用以及鞘内施用，和输液技术。

如本领域技术人员所理解的，使用本领域已知的技术移植HIP衍生物，这取决于细胞类型和这些细胞的最终用途。在一些实施方案中，静脉内或通过注射将细胞移植到患者体内的特定位置。当移植到特定位置时，可将细胞悬浮在凝胶基质中，以防止它们在固定时分散。

示例性内皮细胞类型包括但不限于毛细血管内皮细胞、血管内皮细胞、主动脉内皮细胞、动脉内皮细胞、静脉内皮细胞、肾内皮细胞、脑内皮细胞、肝内皮细胞等。

本文概述的内皮细胞可表达一种或多种内皮细胞标志物。此类标志物的非限制性实例包括VE-钙粘蛋白(CD 144)、ACE(血管紧张素转换酶)(CD 143)、BNH9/BNF13、CD31、CD34、CD54(ICAM-l)、CD62E(E-选择素)、CD105(Endoglin)、CD146、Endocan(ESM-l)、Endoglyx-l、内皮粘蛋白(Endomucin)、Eotaxin-3、EPAS1(内皮PAS结构域蛋白1)、因子VIII相关抗原、FLI-l、Flk-l(KDR、VEGFR-2)、FLT-l(VEGFR-l)、GATA2、GBP-l(鸟苷酸结合蛋白-l)、GRO-α、HEX、ICAM-2(细胞间粘附分子2)、LM02、LYVE-l、MRB(神奇迂回(magicroundabout))、核仁素、PAL-E(病理解剖学Leiden-内皮(pathologische anatomieLeiden-endothelium))、RTK、sVCAM-l、TALI、TEM1(肿瘤内皮标志物1)、TEM5(肿瘤内皮标志物5)、TEM7(肿瘤内皮标志物7)、血栓调节蛋白(TM、CD141)、VCAM-l(血管细胞粘附分子-1)(CD106)、VEGF、vWF(冯威里氏因子)、ZO-l、内皮细胞选择性粘附分子(ESAM)、CD102、CD93、CD184、CD304和DLL4。

在一些实施方案中，内皮细胞经遗传修饰以表达编码目标蛋白质的外源多核苷酸，该目标蛋白质诸如但不限于可用于治疗病症/疾患或改善病症/疾患的症状的酶、激素、受体、配体或药物。用于遗传修饰内皮细胞的标准方法描述于例如US5,674,722中。

此类内皮细胞可用于提供可用于预防或治疗疾病的多肽或蛋白质的组成型合成和递送。以此方式，多肽被直接分泌到个体的血流或身体其他区域(例如，中枢神经系统)中。在一些实施方案中，内皮细胞可被修饰以分泌胰岛素、凝血因子(例如，因子VIII或冯威里氏因子)、α-l抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素(例如，IL-l、IL-2、IL-3)等。

在一些实施方案中，内皮细胞可以以改善其在植入的移植物中的性能的方式修饰。非限制性说明性实例包括分泌或表达血栓溶解剂以防止管腔内凝块形成、分泌平滑肌增殖抑制剂以防止由于平滑肌肥大导致的管腔狭窄、以及表达和/或分泌内皮细胞有丝分裂原或自分泌因子以刺激内皮细胞增殖并改善移植物管腔内皮细胞衬里的程度或持续时间。

在一些实施方案中，工程化内皮细胞用于将治疗水平的分泌产物递送至特定器官或肢体。例如，可将体外工程化(转导)的内皮细胞内衬的血管植入物移植到特定的器官或肢体中。转导的内皮细胞的分泌产物将以高浓度递送至灌注组织，从而达到目标解剖位置的预期效果。

在其他实施方案中，内皮细胞被遗传修饰以含有当由血管化肿瘤中的内皮细胞表达时破坏或抑制血管生成的基因。在一些情况下，还可以对内皮细胞进行遗传修饰以表达本文所述的任何一种选择性自杀基因，其允许在完成肿瘤治疗后对移植的内皮细胞进行阴性选择。

在一些实施方案中，将本文所述的内皮细胞施用至受体受试者以治疗选自由以下各项组成的组的血管病症：血管损伤、心血管疾病、血管疾病、周围血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、周围血管阻塞性疾病、高血压、缺血性组织损伤、再灌注损伤、肢体局部缺血、中风、神经病(例如，周围神经病或糖尿病性神经病)、器官衰竭(例如，肝衰竭、肾衰竭等)、糖尿病、类风湿性关节炎、骨质疏松症、脑血管疾病、高血压、由冠状动脉疾病引起的心绞痛和心肌梗塞、肾血管性高血压、由肾动脉狭窄引起的肾衰竭、下肢跛行和/或其他血管疾患或疾病。

在一些实施方案中，低免疫原性多能细胞分化成内皮集落形成细胞(ECFC)以形成新血管，从而解决外周动脉疾病。分化内皮细胞的技术是已知的。参见例如Prasain等人,doi:10.1038/nbt.3048，其通过引用整体并入本文，特别是用于从人多能干细胞产生内皮细胞以及用于移植技术的方法和试剂。可以如本领域已知的那样，通常通过评价内皮细胞相关或特异性标志物的存在或通过在功能上测量来测定分化。

在一些实施方案中，通过体外分化从低免疫原性多能细胞群产生低免疫原性内皮细胞群的方法包括：(a)在包含GSK抑制剂的第一培养基中培养HIP细胞群；(b)在包含VEGF和bFGF的第二培养基中培养HIP细胞群以产生前内皮细胞群；以及(c)在包含ROCK抑制剂和ALK抑制剂的第三培养基中培养前内皮细胞群以产生低免疫原性内皮细胞群。

在一些实施方案中，GSK抑制剂是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，GSK抑制剂的浓度范围为约1mM至约10mM。在一些实施方案中，ROCK抑制剂是Y-27632、其衍生物或其变体。在一些情况下，ROCK抑制剂的浓度范围为约1pM至约20pM。在一些实施方案中，ALK抑制剂是SB-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，ALK抑制剂的浓度范围为约0.5pM至约10pM。

在一些实施方案中，第一培养基包含2pM至约10pM的CHIR-99021。在一些实施方案中，第二培养基包含50ng/ml VEGF和10ng/ml bFGF。在其他实施方案中，第二培养基还包含Y-27632和SB-431542。在各种实施方案中，第三培养基包含10pM Y-27632和1pM SB-431542。在某些实施方案中，第三培养基还包含VEGF和bFGF。在特定情况下，第一培养基和/或第二培养基不含胰岛素。

在一些实施方案中，内皮细胞可以接种到聚合物基质上。在一些情况下，聚合物基质是可生物降解的。合适的可生物降解的基质是本领域众所周知的并且包括胶原-GAG、胶原、纤维蛋白、PLA、PGA和PLA/PGA共聚物。额外的可生物降解的材料包括聚(酸酐)、聚(羟基酸)、聚(原酸酯)、聚(富马酸丙酯)、聚(己内酯)、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、可生物降解的聚氰基丙烯酸酯、可生物降解的聚氨酯和多糖。

也可以使用不可生物降解的聚合物。其他不可生物降解但生物相容的聚合物包括聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩、聚苯乙烯、聚酯、不可生物降解的聚氨酯、聚脲、聚(乙烯乙酸乙烯酯)、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚(环氧乙烷)。聚合物基质可以形成为任何形状，例如颗粒、海绵、管、球、线、卷绕线、毛细管网络、膜、纤维、网或片。聚合物基质可被修饰以包含天然或合成的胞外基质材料和因子。

在一些实施方案中，低免疫原性内皮细胞群与非内皮细胞分离。在一些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性内皮细胞群。在某些实施方案中，在施用之前扩增并冷冻保存分离的低免疫原性内皮细胞群。

用于本文提供的方法中的内皮细胞的额外描述可见于WO2020/018615，其公开内容通过引用整体并入本文。

7.从低免疫原性多能细胞分化的甲状腺细胞

在一些实施方案中，低免疫原性多能细胞分化成甲状腺祖细胞和甲状腺滤泡类器官，它们可以分泌甲状腺激素以解决自身免疫性甲状腺炎。分化甲状腺细胞的技术是本领域已知的。参见例如Kurmann等人,Cell Stem Cell,2015年11月5日；17(5):527-42，其通过引用整体并入本文，特别是用于从人多能干细胞产生甲状腺细胞以及用于移植技术的方法和试剂。可以如本领域已知的那样，通常通过评价甲状腺细胞相关或特异性标志物的存在或通过在功能上测量来测定分化。

在一些实施方案中，将从受试者低免疫原性多能细胞分化的甲状腺细胞施用至患者，例如患有诸如但不限于以下疾病或疾患的人类患者：甲状腺肿、甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退(先天性或自身免疫性)、甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、产后甲状腺炎、亚急性甲状腺炎、医源性甲状腺功能减退、格雷夫氏病和甲状腺眼病(参见Lassen等人,AnnEndocrinol(Paris).2019年9月；80(4):240-249；Bilezikian等人,Lancet.2018年1月13日；391(10116):168-178；Weetman,J Endocrinol Invest.2021年5月；44(5):883-890；Weiler,Clin Exp Optom.2017年1月；100(1):20-25)。

8.从低免疫原性多能细胞分化的肝细胞

在一些实施方案中，低免疫原性移动性多能干(HIP)细胞分化成肝细胞以解决肝细胞功能丧失或肝硬化。有多种技术可用于将HIP细胞分化为肝细胞；参见例如Pettinato等人,doi:10.1038/spre32888、Snykers等人,Methods Mol Biol,2011 698:305-314、Si-Tayeb等人,Hepatology,2010,51:297-305以及Asgari等人,Stem Cell Rev,2013,9(4):493-504，所有这些文献均以引用方式整体并入本文，并且特别针对用于分化的方法和试剂。可以如本领域已知的那样，通常通过评价肝细胞相关和/或特异性标志物的存在来测定分化，所述标志物包括但不限于白蛋白、甲胎蛋白和纤维蛋白原。还可以在功能上(诸如氨的代谢、LDL储存和摄取、ICG摄取和释放以及糖原储存)测量分化。

在一些实施方案中，将从受试者低免疫原性多能细胞分化的肝细胞施用至患者，例如患有诸如但不限于以下疾病或疾患的人类患者：传染性肝炎(甲型、乙型和丙型；Bianco等人,Dig Liver Dis.2004年12月；36(12):834-842)、自身免疫性肝炎(Sirbe等人,Int J Mol Sci.2021年12月；22(24):13578)、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎(两者均描述于Park等人Biomedicines.2022年6月；10(6):1288)、非酒精性脂肪肝疾病(Francque等人,JHEP Rep.2021年10月；3(5):100322)、肝硬化(Yoshiji等人,JGastroenterol.2021；56(7):593-619)、血色素沉着症(Brissot等人,Nat Rev DisPrimers.2018年4月5日；4:18016)、高草酸尿症(Hoppe和Martin-Higueras,Drugs.2022；82(10):1077-1094)、α-1抗胰蛋白酶缺乏症(Chapman等人,Int J Chron Obstruct PulmonDis.2018；13:419-432)、肝衰竭(Zaccherini等人,JHEP Rep.2021年2月:3(1):100176)、威尔逊氏病(Yuan等人,Curr Neuropharmacol.2021年4月；19(4):465-485)、肝性脑病(Goh等人,Cochrane Database Syst Rev.2018年5月；2018(5):CD012410)、黄疸(Chee等人,HongKong Med J.2018年6月；24(3):285-292)、急性肝卟啉症(Wang等人,Hepatol.Commun.2018年12月20日；3(2):193-206)、阿拉吉欧综合征(Kohut等人,Semin Liver Dis.2021年11月；41(4):525-537)、胆道闭锁(Lakshminarayann和Davenport,J Autoimmun.2016年9月；73:1-9)、布特-基亚里综合征(Iliescu等人,Med Ultrason.2019年8月31日；21(3):344-348)、高胆红素血症、克里格勒-纳贾尔综合征、吉尔伯特-莫伊伦格腊赫特综合征、杜宾-约翰逊综合征、罗托综合征(全部描述于Strassburg,Best Pract Res Clin Gastroenterol.2010年10月；24(5):555-571中)、半乳糖血症(Coelho等人,J Inherit Metab Dis.2017年5月；40(3):325-342)、1型糖原贮积病(Kishnani等人,Genet Med.2014年11月；16(11):e1)、肝肾综合征(Ojeda-Yuren等人,Ann Hepatol.2021年5月-6月；22:100236)、妊娠期肝内胆汁淤积症(Smith和Rood,Clin Obstet Gynecol.2020年3月；63(1):134-151)、进行性家族性肝内胆汁淤积(Baker等人,Clin Res Hepaol Gastroenterol.2019年2月；43(1):20-36)、雷耶氏综合征(Maheady,J Pediatr Health Care.1989年9月-10月；3(5):246-250)或溶酶体酸性脂酶缺乏症(Pastores和Hughes,Drug Des Devel Ther.2020年2月11日；14:591-601)。

9.从低免疫原性多能细胞分化的胰岛细胞

在一些实施方案中，胰岛细胞(也称为β细胞)源自本文所述的HIP细胞。在一些情况下，将分化成各种胰岛细胞类型的低免疫原性多能细胞移植或植入到受试者(例如，接受者)中。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。示例性胰岛细胞类型包括但不限于胰岛祖细胞、未成熟胰岛细胞、成熟胰岛细胞等。在一些实施方案中，将本文所述的胰腺细胞施用至受试者以治疗糖尿病。

在一些实施方案中，将从受试者低免疫原性多能细胞分化的胰岛细胞施用至患者，例如患有诸如但不限于以下疾病或疾患的人类患者：酒精相关性胰腺炎、胆石性胰腺炎、糖尿病(1型和2型)、前驱糖尿病、妊娠期糖尿病、无胰腺性糖尿病、胰腺外分泌功能不全、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、遗传性胰腺炎、高胰岛素血症、胰腺囊肿、佐林格-埃里森综合征、史华曼-戴蒙德综合征、遗传性血色素沉着症、地中海贫血、胰腺铁沉积、囊性纤维化、胰腺分裂和胰腺切除(参见Ciochina等人,Biomolecules 2022年5月；12(5):618)。

在一些实施方案中，胰岛细胞来源于本文所述的低免疫原性多能细胞。用于将多能干细胞分化为胰岛细胞的有用方法描述于例如US9,683,215；US9,157,062；和US8,927,280。在一些实施方案中，胰岛细胞包括α、β、δ、PP(产生胰多肽)和/或ε-细胞(产生生长素释放肽)胰岛细胞。在一些实施方案中，胰岛细胞包括iPSC衍生的β细胞。

在一些实施方案中，通过如本文所公开的方法产生的胰岛细胞分泌胰岛素。在一些实施方案中，胰岛细胞表现出内源胰岛细胞的至少两个特征，例如但不限于响应于葡萄糖而分泌胰岛素和β细胞标志物的表达。

示例性β细胞标志物或β细胞祖细胞标志物包括但不限于c肽、Pdxl、葡萄糖转运蛋白2(Glut2)、HNF6、VEGF、葡萄糖激酶(GCK)、激素原转换酶(PC 1/3)、Cdcpl、NeuroD、Ngn3、Nkx2.2、Nkx6.l、Nkx6.2、Pax4、Pax6、Ptfla、Isll、Sox9、Soxl7和FoxA2。

在一些实施方案中，分离的胰岛细胞响应于葡萄糖的增加而产生胰岛素。在各种实施方案中，分离的胰岛细胞响应于葡萄糖的增加而分泌胰岛素。在一些实施方案中，细胞具有独特的形态，诸如鹅卵石细胞形态和/或约17pm至约25pm的直径。

在一些实施方案中，低免疫原性多能细胞分化成β样细胞或胰岛类器官以用于移植以解决I型糖尿病(T1DM)。细胞系统是解决T1DM的一种有前途的方法，参见例如Ellis等人,Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2017年10月；14(10):612-628，其以引用方式并入本文。此外，Pagliuca等人(Cell,2014,159(2):428-39)报道了从hiPSC成功分化出β-细胞，其内容以引用方式整体并入本文，特别是其中概述的用于从人多能干细胞大规模生产功能性人β-细胞的方法和试剂。此外，Vegas等人显示了从人多能干细胞产生人β细胞，然后进行封装以避免宿主的免疫排斥；Vegas等人,Nat Med,2016,22(3):306-11，其通过引用整体并入本文，特别是其中概述的用于从人多能干细胞大规模产生功能性人β细胞的方法和试剂。

在一些实施方案中，通过体外分化从低免疫原性多能细胞群产生低免疫原性胰岛细胞群的方法包括：(a)在包含选自由胰岛素样生长因子、转化生长因子、FGF、EGF、HGF、SHH、VEGF、转化生长因子-b超家族、BMP2、BMP7、GSK抑制剂、ALK抑制剂、BMP 1型受体抑制剂和视黄酸组成的组的一种或多种因子的第一培养基中培养HIP细胞群以产生未成熟胰岛细胞群；以及(b)在不同于第一培养基的第二培养基中培养未成熟胰岛细胞群以产生低免疫胰岛细胞群。在一些实施方案中，GSK抑制剂是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，GSK抑制剂的浓度范围为约2mM至约10mM。在一些实施方案中，ALK抑制剂是SB-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，ALK抑制剂的浓度范围为约1pM至约10pM。在一些实施方案中，第一培养基和/或第二培养基不含动物血清。

在一些实施方案中，低免疫原性胰岛细胞群与非胰岛细胞分离。在一些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性胰岛细胞群。在某些实施方案中，在施用之前扩增并冷冻保存分离的低免疫原性胰岛细胞群。

如本领域已知的那样，通常通过评价β细胞相关或特异性标志物(包括但不限于胰岛素)的存在来测定分化。也可以在功能上测量分化，诸如测量葡萄糖代谢，一般参见Muraro等人,Cell Syst.2016年10月26日；3(4):385–394.e3，其特此通过引用整体并入，特别是其中概述的生物标志物。一旦产生β细胞，就可以将其移植(作为细胞悬浮液或在本文讨论的凝胶基质内)到门静脉/肝脏、网膜、胃肠粘膜、骨髓、肌肉或皮下囊中。

用于本公开的胰岛细胞(包括多巴胺能神经元)的另外的描述可见于WO2020/018615，其公开内容以引用方式整体并入本文。

10.从低免疫原性多能细胞分化的视网膜色素上皮(RPE)细胞

本文提供了源自上述HIP细胞的视网膜色素上皮(RPE)细胞。例如，可通过分化人HIP细胞来产生人RPE细胞。在一些实施方案中，将分化成各种RPE细胞类型的低免疫原性多能细胞移植或植入到受试者(例如，接受者)中。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。

术语“RPE”细胞是指具有与天然RPE细胞相似或基本相似的基因表达谱的色素视网膜上皮细胞。当在平面基底上生长至汇合时，来源于多能干细胞的此类RPE细胞可具有天然RPE细胞的多边形、平面片状形态。

可将RPE细胞植入患有黄斑变性的患者或具有受损RPE细胞的患者体内。在一些实施方案中，患者患有年龄相关性黄斑变性(AMD)、早期AMD、中期AMD、晚期AMD、非新生血管性年龄相关性黄斑变性、干性黄斑变性(干性年龄相关性黄斑变性)、湿性黄斑变性(湿性年龄相关性黄斑变性)、成人发病的卵黄样黄斑营养不良(AVMD)、贝斯特卵黄样黄斑营养不良、斯塔加特样黄斑营养不良(STGD3)、索尔比氏眼底营养不良(SFD)、ABCA4相关疾病、UsherIB型、常染色体隐性遗传性黄斑变性、常染色体显性玻璃体视网膜脉络膜病、幼年型黄斑变性(JMD)(例如，斯塔加特病、贝斯特病和幼年型视网膜劈裂)、莱伯先天性黑蒙或色素性视网膜炎(全部描述于Yang等人,Front Pharmacol.2021年7月28日；12:727870；Sparrow等人,Curr Mol Med.2010年12月；10(9):802-823中)。在其他实施方案中，患者患有视网膜脱离或视网膜撕裂。

示例性RPE细胞类型包括但不限于视网膜色素上皮(RPE)细胞、RPE祖细胞、未成熟RPE细胞、成熟RPE细胞、功能性RPE细胞等。

用于将多能干细胞分化成RPE细胞的有用方法描述于例如US9,458,428和US9,850,463中，其公开内容通过引用整体并入本文，包括说明书。用于从人诱导性多能干细胞产生RPE细胞的另外的方法可见于例如Lamba等人,PNAS,2006,103(34):12769-12774；Mellough等人,Stem Cells,2012,30(4):673-686；Idelson等人,Cell Stem Cell,2009,5(4):396-408；Rowland等人,Journal of Cellular Physiology,2012,227(2):457-466；Buchholz等人,Stem Cells Trans Med,2013,2(5):384-393；以及da Cruz等人,NatBiotech,2018,36:328-337。

已经使用Kamao等人,Stem Cell Reports 2014:2:205-18(其特此通过引用整体并入，特别是其中概述的用于分化技术和试剂的方法和试剂)中概述的技术使人多能干细胞分化成RPE细胞；还可参见Mandai等人,N Engl J Med,2017,376:1038-1046，其内容对于用于产生RPE细胞片和移植到患者体内的技术整体并入。可以如本领域已知的那样，通常通过评价RPE相关和/或特异性标志物的存在或通过在功能上测量来测定分化。参见例如Kamao等人,Stem Cell Reports,2014,2(2):205-18，其内容通过引用整体并入本文，特别是结果部分的第一段中概述的标志物。

在一些实施方案中，通过体外分化从低免疫原性多能细胞群产生低免疫原性视网膜色素上皮(RPE)细胞群的方法包括：(a)在包含选自由以下各项组成的组的任一种因子的第一培养基中培养低免疫原性多能细胞群：活化素A、bFGF、BMP4/7、DKK1、IGF1、头蛋白、BMP抑制剂、ALK抑制剂、ROCK抑制剂和VEGFR抑制剂，以产生前RPE细胞群；以及(b)在与第一培养基不同的第二培养基中培养前RPE细胞群，以产生低免疫原性RPE细胞群。在一些实施方案中，ALK抑制剂是SB-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，ALK抑制剂的浓度范围为约2mM至约10pM。在一些实施方案中，ROCK抑制剂是Y-27632、其衍生物或其变体。在一些情况下，ROCK抑制剂的浓度范围为约1pM至约10pM。在一些实施方案中，第一培养基和/或第二培养基不含动物血清。

可以如本领域已知的那样，通常通过评价RPE相关和/或特异性标志物的存在或通过在功能上测量来测定分化。参见例如Kamao等人,Stem Cell Reports,2014,2(2):205-18，其内容通过引用整体并入本文，特别是结果部分。

用于本公开的RPE细胞的另外的描述可见于WO2020/018615，其公开内容以引用方式整体并入本文。

对于治疗应用，根据所公开的方法制备的细胞通常可以以包含等渗赋形剂的药物组合物的形式提供，并且在对人体施用足够无菌的条件下制备。有关细胞组合物的药物制剂的一般原则，参见“Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,andCellular Immunotherapy,”Morstyn&Sheridan编辑,Cambridge University Press,1996；以及“Hematopoietic Stem Cell Therapy,”E.D.Ball,J.Lister&P.Law,ChurchillLivingstone,2000。可以将细胞包装在适合分配或临床使用的装置或容器中。

11.从低免疫原性多能细胞分化的T淋巴细胞

本文提供的T淋巴细胞(T细胞，包括原代T细胞)来源于本文所述的HIP细胞(例如，低免疫原性iPSC)。用于从多能干细胞(例如，iPSC)生成T细胞(包括CAR-T细胞)的方法在例如Iriguchi等人,Nature Communications 12,430(2021)；Themeli等人,Cell Stem Cell,16(4):357-366(2015)；Themeli等人,Nature Biotechnology 31:928-933(2013)中描述。

T淋巴细胞衍生的低免疫原性细胞包括但不限于逃避免疫识别的原代T细胞。在一些实施方案中，低免疫原性细胞由T细胞(诸如原代T细胞)产生(例如，生成、培养或衍生)。在一些情况下，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、去除或取得)原代T细胞。在一些实施方案中，由T细胞库产生原代T细胞，使得T细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人类，包括一个或多个健康人类)。在一些实施方案中，原代T细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1或更多个、2或更多个、3或更多个、4或更多个、5或更多个、10或更多个、20或更多个、30或更多个、40或更多个、50或更多个、或100或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，T细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得T细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。

在一些实施方案中，将从受试者低免疫原性多能细胞分化的T淋巴细胞施用至患者，例如患有诸如但不限于以下疾病或疾患的人类患者：严重联合免疫缺陷(SCID)、奥门综合征(Omenn syndrome)、软骨-毛发发育不全、网状发育不全(全部描述于Shearer等人,JAllergy Clin Immunol.2014年4月；133(4):1092-8)、维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)(Massaad等人,Ann N Y Acad Sci.2013年5月；1285:26-4)、共济失调性毛细血管扩张症(Rothblum-Oviatt等人,Orphnet J Rare Dis.2016年11月25日；11(1):159)、迪乔治综合征(22q11.2缺失综合征，参见McDonald-McGinn等人,Nat RevDis Primers.2015年11月19日；1:15071)、免疫性骨发育不良(Saraiva等人,J MedGenet.1999年10月；36(10):786-789)、先天性角化不良(Stoopler和Shanti,Mayo ClinProc.2019年9月；94(9):1668-1669)或慢性皮肤粘膜念珠菌病(Kirkpatrick,J Am AcadDermatol.1994年9月；31(3Pt 2):S14-17)。在其他实施方案中，本文提供的T细胞可用于治疗合适的癌症，包括但不限于B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌(参见Mohanti等人,Oncol Rep 42:2183-2195,2019)。

在一些实施方案中，将从受试者低免疫原性多能细胞分化的T淋巴细胞施用至患者，例如患有诸如但不限于以下疾病或疾患的人类患者：严重联合免疫缺陷(SCID)、奥门综合征、软骨-毛发发育不全、网状发育不全(全部描述于Shearer等人,J Allergy ClinImmunol.2014年4月；133(4):1092-8)、维斯科特-奥尔德里奇综合征(Massaad等人,Ann NY Acad Sci.2013年5月；1285:26-4)、共济失调性毛细血管扩张症(Rothblum-Oviatt等人,Orphnet J Rare Dis.2016年11月25日；11(1):159)、迪乔治综合征(22q11.2缺失综合征，参见McDonald-McGinn等人,Nat Rev Dis Primers.2015年11月19日；1:15071)、免疫性骨发育不良(Saraiva等人,J Med Genet.1999年10月；36(10):786-789)、先天性角化不良(Stoopler和Shanti,Mayo Clin Proc.2019年9月；94(9):1668-1669)或慢性皮肤粘膜念珠菌病(Kirkpatrick,J Am Acad Dermatol.1994年9月；31(3Pt 2):S14-17)。在其他实施方案中，本文提供的T细胞可用于治疗合适的癌症，包括但不限于B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌(参见Mohanti等人,Oncol Rep 42:2183-2195,2019)。

在一些实施方案中，癌症为恶性血液病。恶性血液病的非限制性实例包括滤泡性淋巴瘤(FL)、骨髓肿瘤、成熟T/NK肿瘤、组织细胞肿瘤、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)、华氏巨球蛋白血症、伯基特淋巴瘤(BL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBL)、霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、毛细胞白血病(HCL)、骨髓增生性/骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴性白血病(T-ALL)、T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤(参见Taylor等人,Blood 2017年7月27日；130(4):410–423)。

在一些实施方案中，疾病是自身免疫性疾病，包括例如狼疮、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、阿狄森氏病、格雷夫斯病、舍格伦氏综合征、桥本氏甲状腺炎、1型糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎和乳糜泻(描述于Wang等人,J Intern Med.2015；278(4):369-395)。

在一些实施方案中，HIP衍生的T细胞包括嵌合抗原受体(CAR)。任何合适的CAR均可以包括在HIP衍生的T细胞中，包括本文所述的CAR。在一些实施方案中，HIP衍生的T细胞包括编码CAR的多核苷酸，其中该多核苷酸插入基因组基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到安全港或靶基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD-1或CTLA-4基因中。可以使用任何合适的方法将CAR插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。

本文提供的HIP衍生的T细胞可用于治疗合适的癌症，包括但不限于B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。

12.来源于低免疫原性多能细胞的NK细胞

本文提供的自然杀伤(NK)细胞来源于本文所述的HIP细胞(例如，低免疫原性iPSC)。

NK细胞(也定义为“大颗粒淋巴细胞”)代表一种从普通淋巴祖细胞(也产生B淋巴细胞和T淋巴细胞)分化的细胞谱系。与T细胞不同，NK细胞在质膜上不天然包含CD3。重要的是，NK细胞不表达TCR，并且通常也缺乏其他抗原特异性细胞表面受体(以及TCR和CD3，它们也不表达免疫球蛋白B细胞受体，而是通常表达CD16和CD56)。NK细胞的细胞毒性活性不需要致敏作用，但可通过使用多种细胞因子(包括IL-2)的活化而增强。NK细胞通常被认为缺乏抗原受体介导的信号传导所必需的适当或完整的信号传导通路，因此不被认为能够进行抗原受体依赖性信号传导、活化和扩增。NK细胞具有细胞毒性，并且平衡活化性和抑制性受体信号传导以调节其细胞毒性活性。例如，表达CD16的NK细胞可结合与感染细胞结合的抗体的Fc结构域，从而导致NK细胞活化。相比之下，针对表达高水平MHC I类蛋白/分子的细胞的活性降低。在与靶细胞接触时，NK细胞释放蛋白质(诸如穿孔素)和酶(诸如蛋白酶(颗粒酶))。穿孔素可以在靶细胞的细胞膜上形成孔，从而诱导细胞凋亡或细胞裂解。

有许多技术可以用于从多能干细胞(例如iPSC)生成NK细胞，包括CAR-NK细胞；参见，例如Zhu等人,Methods Mol Biol.2019；2048:107-119；Knorr等人,Stem Cells TranslMed.2013 2(4):274-83.doi:10.5966/sctm.2012-0084；Zeng等人,Stem CellReports.2017Dec12；9(6):1796-1812；Ni等人,Methods Mol Biol.2013；1029:33-41；Bernareggi等人,Exp Hematol.2019 71:13-23；Shankar等人,Stem Cell Res Ther.2020；11(1):234，所述文献全部通过引用整体并入本文，特别是用于分化的方法和试剂。可以如本领域已知的那样，通常通过评价NK细胞相关和/或特异性标记物的存在来测定分化，所述标志物包括但不限于CD56、KIRs、CD16、NKp44、NKp46、NKG2D、TRAIL、CD122、CD27、CD244、NK1.1、NKG2A/C、NCR1、Ly49、CD49b、CD11b、KLRG1、CD43、CD62L和/或CD226。

在一些实施方案中，将从受试者低免疫原性多能细胞分化的NK细胞施用至患者，例如患有诸如但不限于以下疾病或疾患的人类患者：系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、自身免疫性肝病、舍格伦氏综合征、类风湿性关节炎、系统性硬化症(硬皮病)、器官特异性自身免疫性疾病(自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎)、酒精相关性肝病、多发性硬化(全部描述于Liu等人,Front Immunol.2021；12:624687中)、NK细胞缺陷(NKD)(功能性(FNKD)或经典型(CNKD))、X连锁免疫缺陷多内分泌腺病肠病(IPEX)样综合征、布卢姆综合征、范可尼氏贫血、先天性角化不良、谢迪埃克-赫加希综合征、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(FHL)、格里瑟里综合征2型、赫曼斯基-普德拉克综合征、帕-勒氏综合征、维斯科特-奥尔德里奇综合征、常染色体隐性高IgE综合征、梅-海二氏异常或I型或III型白细胞粘附缺陷(全部描述于Orange,J.S,J Allergy Clin Immunol.2013年9月；132(3):515–526中)。在其他实施方案中，本文提供的NK细胞可用于治疗合适的癌症，包括但不限于B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌(参见Mohanti等人,Oncol Rep42:2183-2195,2019)。

在一些实施方案中，NK细胞不活化患者(例如，施用后的受体)中的先天和/或适应性免疫响应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用NK细胞群来治疗病症的方法。在一些实施方案中，本文所述的NK细胞包含经工程化(例如，修饰)以表达嵌合抗原受体的NK细胞，所述嵌合抗原受体包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体。任何合适的CAR都可以包括在NK细胞中，包括本文所述的CAR。在一些实施方案中，NK细胞包括编码CAR的多核苷酸，其中将所述多核苷酸插入到基因组基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到安全港或靶基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD1或CTLA4基因中。可以使用任何合适的方法将CAR插入到NK细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。

BB.遗传修饰方法

在一些实施方案中，本文的载体是能够转移或转运另一核酸分子(包括转移或转运到细胞或细胞基因组中)的核酸分子。转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如插入载体核酸分子中。载体可包括在细胞中指导自主复制的序列，或者可包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括例如质粒(例如DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如复制缺陷逆转录病毒和慢病毒。非病毒载体可能需要递送媒介物以促进核酸分子进入到细胞中。

病毒载体可包含核酸分子，其包括病毒衍生的核酸元件，所述核酸元件通常促进核酸分子转移或整合到细胞基因组中或者转移或整合到介导核酸转移的病毒颗粒中。病毒颗粒通常将包括各种病毒组分，并且有时除了核酸外还包括宿主细胞组分。病毒载体可以包含例如能够将核酸转移到细胞中或转移到被转移的核酸中的病毒或病毒颗粒(例如，作为裸DNA)。病毒载体和转移质粒可以包含主要来源于病毒的结构和/或功能遗传元件。逆转录病毒载体可包含病毒载体或质粒，其含有主要来源于逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分。

在本文所述的一些载体中，与对应的野生型病毒相比，有助于复制或复制所必需的一个或多个蛋白质编码区的至少一部分可能不存在。这使得病毒载体复制有缺陷。在一些实施方案中，载体能够转导靶非分裂宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中。

在一些实施方案中，逆转录病毒核酸包含以下中的一种或多种(例如，全部)：5'启动子(例如，用于控制整个包装的RNA的表达)、5'LTR(例如，其包括R(聚腺苷酸化尾信号)和/或包括引物活化信号的U5)、引物结合位点、psi包装信号、用于核输出的RRE元件、直接位于转基因上游以控制转基因表达的启动子、转基因(或其他外源药剂元件)、多嘌呤区和3'LTR(例如，其包括突变的U3、R和U5)。在一些实施方案中，逆转录病毒核酸还包含cPPT、WPRE和/或绝缘子元件中的一种或多种。

逆转录病毒通常通过将其基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝并随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中来复制。野生型逆转录病毒基因组的结构通常包含5'长末端重复序列(LTR)和3'LTR，在它们之间或之内有能够使基因组被包装的包装信号、引物结合位点、实现整合到宿主细胞基因组中的整合位点以及编码促进病毒颗粒组装的包装组分的gag、pol和env基因。更复杂的逆转录病毒具有附加的特征，诸如HIV中的rev和RRE序列，其使得整合的原病毒的RNA转录物能够从感染靶细胞的细胞核有效输出到细胞质。在原病毒中，病毒基因在两个末端侧接称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR参与原病毒整合和转录。LTR也充当增强子-启动子序列，并且可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的衣壳化是通过位于病毒基因组的5’端的psi序列发生的。

LTR本身通常是相似的(例如相同的)序列，其可以分成三个元件，称为U3、R和U5。U3源自对RNA的3'末端独特的序列。R源自在RNA两端重复的序列，并且U5源自RNA的5'端特有的序列。这三种元件的尺寸在不同的逆转录病毒中可以有相当大的变化。

对于病毒基因组，转录起始位点通常在一个LTR中的U3与R之间的边界处，而聚(A)添加(终止)位点在另一个LTR中的R与U5之间的边界处。U3含有原病毒的大部分转录控制元件，其包括对细胞和在一些情况下病毒转录活化因子蛋白作出应答的启动子和多个增强子序列。一些逆转录病毒包含编码参与调节基因表达的蛋白质的以下基因中的任何一种或多种：tot、rev、tax和rex。

关于结构基因gag、pol和env本身，gag编码病毒的内部结构蛋白。Gag蛋白被蛋白水解加工为成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(RT)，它含有介导基因组复制的DNA聚合酶、相关RNA酶H和整合酶(IN)。env基因编码病毒体的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，它们形成与细胞受体蛋白特异性相互作用的复合物。这种相互作用例如通过使过病毒膜与细胞膜融合来促进感染。

在复制缺陷逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可以不存在或没有功能。RNA两个末端的R区通常是重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组的5'和3'末端的独特序列。逆转录病毒还可以含有编码除gag、pol和env之外的蛋白质的附加基因。额外基因的实例包括(在HIV中)vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef中的一种或多种。EIAV具有(尤其)额外基因S2。

适用于特定的实施方案的说明性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒(spumavirus)、弗瑞德鼠(Friend murine)白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))和慢病毒。

在一些实施方案中，逆转录病毒是γ逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是ε逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是α逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是β逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是δ逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是泡沫逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是内源性逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是慢病毒。

在一些实施方案中，逆转录病毒或慢病毒载体还包含一个或多个绝缘子元件，例如本文所述的绝缘子元件。在各种实施方案中，载体包含与编码外源性剂的多核苷酸可操作地连接的启动子。载体可以具有一个或多个LTR，其中任一个LTR包含一个或多个修饰，诸如一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。载体还可包含一个或多个增加转导效率的辅助元件(例如，cPPT/FLAP)、病毒包装(例如，Psi(Y)包装信号，RRE)和/或增加外源基因表达的其他元件(例如，聚(A)序列)，并且可任选地包含WPRE或HPRE。在一些实施方案中，慢病毒核酸例如从5'至3'包含以下中的一种或多种(例如全部)：启动子(例如CMV)、R序列(例如包含TAR)、U5序列(例如用于整合)、PBS序列(例如用于逆转录)、DIS序列(例如用于基因组二聚化)、psi包装信号、部分gag序列、RRE序列(例如用于核输出)、cPPT序列(例如用于核输入)、驱动外源性剂表达的启动子、编码外源性剂的基因、WPRE序列(例如，用于有效的转基因表达)、PPT序列(例如，用于逆转录)、R序列(例如，用于聚腺苷酸化和终止)和U5信号(例如，用于整合)。

说明性慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；维士那-梅地病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一些实施方案中，使用基于HIV的载体骨架(即，HIV顺式作用序列元件)。慢病毒载体可包含含有结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒，包括主要源自慢病毒的LTR。

在实施方案中，慢病毒载体(例如，慢病毒表达载体)可包含慢病毒转移质粒(例如，作为裸DNA)或感染性慢病毒颗粒。关于诸如克隆位点、启动子、调控元件、异源核酸等元件，应理解这些元件的序列可以在慢病毒颗粒中以RNA形式存在，并且可以在DNA质粒中以DNA形式存在。

在实施方案中，慢病毒载体是具有足够的逆转录病毒遗传信息以允许在包装组分的存在下将RNA基因组包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中的载体。靶细胞的感染可以包括逆转录和整合到靶细胞基因组中。RLV通常携带非病毒编码序列，所述序列将由载体递送至靶细胞。在实施方案中，RLV不能在靶细胞内独立复制产生感染性逆转录病毒颗粒。通常，RLV缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或参与复制的其他基因。载体可以被配置为分裂内含子载体，例如，如PCT专利申请WO 99/15683中所述，所述申请通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，慢病毒载体包含最小的病毒基因组，例如，病毒载体已被操纵以去除非必需元件并保留必需元件，以便提供感染、转导和递送感兴趣的核苷酸序列至靶宿主细胞所需的功能，例如，如WO 98/17815中所述，所述专利通过引用整体并入本文。

最小慢病毒基因组可包含例如(5')R-U5-一个或多个第一核苷酸序列-U3-R(3')。然而，用于在源细胞中产生慢病毒基因组的质粒载体也可以包括可操作地连接至慢病毒基因组上以指导基因组在源细胞中的转录的转录调控控制序列。这些调控序列可以包含与转录的逆转录病毒序列缔合的天然序列，例如5’U3区，或者它们可以包含异源启动子，例如另一种病毒启动子，例如CMV启动子。一些慢病毒基因组包含促进有效病毒产生的额外序列。例如，在HIV的情况下，可包括rev和RRE序列。

在一些实施方案中，将罕见切割核酸内切酶以编码罕见切割核酸内切酶的核酸的形式引入到含有靶多核苷酸序列的细胞中。将核酸引入细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的DNA。在一些实施方案中，核酸包含mRNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的mRNA(例如，合成的修饰mRNA)。

本公开考虑利用本公开的基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)以本领域技术人员可用的任何方式改变靶多核苷酸序列。可以使用能够改变细胞中的靶多核苷酸序列的任何CRISPR/Cas系统。此类CRISPR-Cas系统可以采用多种Cas蛋白(Haft等人PLoS ComputBiol.2005；1(6)e60)。此类Cas蛋白的允许CRISPR/Cas系统改变细胞中的靶多核苷酸序列的分子机制包括RNA结合蛋白、核酸内切酶和外切酶、解旋酶和聚合酶。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是I型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是II型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是V型CRISPR系统。

本公开的CRISPR/Cas系统可用于改变细胞中的任何靶多核苷酸序列。本领域技术人员将容易理解，在任何特定细胞中待改变的期望的靶多核苷酸序列可以对应于基因组序列的表达与病症相关或以其他方式促进病原体进入细胞的任何基因组序列。例如，在细胞中改变的期望的靶多核苷酸序列可以是对应于含有疾病相关单多核苷酸多态性的基因组序列的多核苷酸序列。在此类实例中，本公开的CRISPR/Cas系统可用于通过用野生型等位基因替换细胞中的疾病相关SNP来校正所述疾病相关SNP。作为另一个实例，负责使病原体进入或增殖到细胞中的靶基因的多核苷酸序列可能是合适的靶标，所述靶标用于缺失或插入以破坏靶基因的功能，从而防止病原体进入细胞或在细胞内增殖。

在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是人基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是哺乳动物基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是脊椎动物基因组序列。

在一些实施方案中，本公开的CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白和能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的至少一种至两种核糖核酸。如本文所用，“蛋白质”和“多肽”可互换使用以指代通过肽键连接的一系列氨基酸残基(即，氨基酸的聚合物)，并且包括修饰的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物。示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、上述项的同源物、旁系同源物、片段以及其他等效物、变体和类似物。

在一些实施方案中，Cas蛋白包含一个或多个氨基酸取代或修饰。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代包括保守氨基酸取代。在一些情况下，取代和/或修饰可以防止或减少蛋白水解降解和/或延长多肽在细胞中的半衰期。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含肽键替换(例如，脲、硫脲、氨基甲酸酯、磺酰脲等)。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含替代氨基酸(例如，D-氨基酸、β-氨基酸、同型半胱氨酸、磷酸丝氨酸等)。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含修饰以包括部分(例如，聚乙二醇化、糖基化、脂化、乙酰化、封端等)。

在一些实施方案中，Cas蛋白包含核心Cas蛋白、其同种型、或具有与任何Cas蛋白或其同种型类似的功能或活性的任何Cas样蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含核心Cas蛋白。示例性Cas核心蛋白包括但不限于Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8和Cas9。在一些实施方案中，Cas蛋白包含V型Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含大肠杆菌(E.coli)亚型的Cas蛋白(也称为CASS2)。大肠杆菌亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cse1、Cse2、Cse3、Cse4和Cas5e。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Ypest亚型的Cas蛋白(也称为CASS3)。Ypest亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csy1、Csy2、Csy3和Csy4。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Nmeni亚型的Cas蛋白(也称为CASS4)。Nmeni亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csn1和Csn2。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Dvulg亚型的Cas蛋白(也称为CASS1)。Dvulg亚型的示例性Cas蛋白包括Csd1、Csd2和Cas5d。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Tneap亚型的Cas蛋白(也称为CASS7)。Tneap亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cst1、Cst2、Cas5t。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Hmari亚型的Cas蛋白。Hmari亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csh1、Csh2和Cas5h。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Apern亚型的Cas蛋白(也称为CASS5)。Apern亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5和Cas5a。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Mtube亚型的Cas蛋白(也称为CASS6)。Mtube亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5。在一些实施方案中，Cas蛋白包括RAMP模块Cas蛋白。示例性RAMP模块Cas蛋白包括但不限于Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5和Cmr6。参见例如Klompe等人,Nature 571,219–225(2019)；Strecker等人,Science 365,48–53(2019)。Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和/或GSU0054。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和/或GSU0054。在一些实施方案中，Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas9、Csn2和/或Cas4。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas9、Csn2和/或Cas4。在一些实施方案中，Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和/或Csx10。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和/或Csx10。在一些实施方案中，Cas蛋白的实例包括但不限于：Csf1。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Csf1。在一些实施方案中，Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10和C2c9；以及CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)。另见例如Koonin等人,Curr Opin Microbiol.2017；37:67-78:“Diversity,classification and evolution of CRISPR-Cas systems”。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12d和/或Cas12e。在一些实施方案中，Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和/或Cas13d。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和/或Cas13d。

在一些实施方案中，Cas蛋白包括本文所述的Cas蛋白中的任一种或其功能部分。如本文所用，“功能部分”是指肽的一部分，其保留其与至少一种核糖核酸(例如，指导RNA(gRNA))复合并且切割靶多核苷酸序列的能力。在一些实施方案中，功能部分包含可操作地连接的Cas9蛋白功能结构域的组合，所述Cas9蛋白功能结构域选自由DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域组成的组。在一些实施方案中，功能部分包含可操作地连接的Cas12a(也称为Cpf1)蛋白功能结构域的组合，所述Cas12a蛋白功能结构域选自由DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域组成的组。在一些实施方案中，功能结构域形成复合物。在一些实施方案中，Cas9蛋白的功能部分包含RuvC样结构域的功能部分。在一些实施方案中，Cas9蛋白的功能部分包含HNH核酸酶结构域的功能部分。在一些实施方案中，Cas12a蛋白的功能部分包含RuvC样结构域的功能部分。

在一些实施方案中，可以将外源Cas蛋白以多肽形式引入到细胞中。在某些实施方案中，可以将Cas蛋白缀合或融合至细胞穿透多肽或细胞穿透肽。如本文所用，“细胞穿透多肽”和“细胞穿透肽”分别指代促进分子摄取到细胞中的多肽或肽。细胞穿透多肽可以含有可检测标记。

在许多实施方案中，可以将Cas蛋白缀合或融合至带电蛋白(例如，其携带正电荷、负电荷或整体中性电荷)。这种连接可以是共价的。在一些实施方案中，可以将Cas蛋白与超正电荷GFP融合以显著增加Cas蛋白穿透细胞的能力(Cronican等人ACS Chem Biol.2010；5(8):747-52)。在某些实施方案中，可以将Cas蛋白融合至蛋白转导结构域(PTD)以促进其进入细胞。示例性PTD包括Tat、寡精氨酸和穿透肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至PTD的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至tat结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含与寡精氨酸结构域融合的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含与穿透肽结构域融合的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至超正电荷GFP的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至PTD的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至tat结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含与寡精氨酸结构域融合的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含与穿透肽结构域融合的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至超正电荷GFP的Cas12a多肽。

一些实施方案中，可以将Cas蛋白以编码Cas蛋白的核酸的形式引入含有靶多核苷酸序列的细胞中。将核酸引入细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的DNA。在一些实施方案中，核酸包含mRNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的mRNA(例如，合成的修饰mRNA)。

在一些实施方案中，Cas蛋白与一种至两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与一种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白由如本文所述的修饰的核酸(例如，合成的修饰mRNA)编码。

本公开的方法考虑使用能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的任何核糖核酸。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含tracrRNA。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含CRISPR RNA(crRNA)。在一些实施方案中，单个核糖核酸包含指导RNA，所述指导RNA将Cas蛋白引导到细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含将Cas蛋白引导到细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的引导RNA。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸均包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。如本领域技术人员将理解的，可以选择本公开的核糖核酸与多种不同的靶基序杂交，这取决于采用的特定CRISPR/Cas系统和靶多核苷酸的序列。还可以选择一种至两种核糖核酸以最大程度的减少与除靶多核苷酸序列之外的核酸序列的杂交。在一些实施方案中，当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时，一种至两种核糖核酸与含有至少两个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时，一种至两种核糖核酸与含有至少一个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸被设计成与紧邻被Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸中的每一种被设计成与紧邻被Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交，所述脱氧核糖核酸基序在位于靶基序之间的突变等位基因的两侧。

在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸中的每一种包含将Cas蛋白引导到细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的引导RNA。

在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，引导RNA)与靶多核苷酸序列的相同链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，引导RNA)与靶多核苷酸序列的相反链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，引导RNA)不与靶多核苷酸序列的相反链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，引导RNA)与靶多核苷酸序列的重叠靶基序互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，引导RNA)与靶多核苷酸序列的偏移靶基序互补和/或杂交。

在一些实施方案中，经由病毒转导(例如，慢病毒转导)将编码Cas蛋白的核酸和编码至少一种至两种核糖核酸的核酸引入细胞中。在一些实施方案中，Cas蛋白与1-2种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与一种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白由如本文所述的修饰的核酸(例如，合成的修饰mRNA)编码。

可用于本文所述的基于CRISPR/Cas的基因靶向的示例性gRNA序列在表15中提供。所述序列可见于2016年5月9日提交的WO2016183041，包括表、附录和序列表的公开内容通过引用整体并入本文。

表15.可用于靶向基因的示例性gRNA序列

可用于本文所述的基于CRISPR/Cas的基因靶向的其他示例性gRNA序列在2021年5月19日提交的美国临时专利申请号63/190,685和2021年7月14日提交的美国临时专利申请号63/221,887中提供，包括表、附录和序列表的公开内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，本技术的细胞使用转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)方法来制备。

“TALE核酸酶”(TALEN)意指由通常来源于转录活化因子样效应物(TALE)的核酸结合结构域和一个核酸酶催化结构域组成的用以切割核酸靶序列的融合蛋白。催化结构域优选地是核酸酶结构域，并且更优选地是具有核酸内切酶活性的结构域，例如I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。在多个实施方案中，可以将TALE结构域融合至大范围核酸酶，例如I-CreI和I-OnuI或其功能变体。在更优选的实施方案中，所述核酸酶是单体TALE核酸酶。单体TALE-核酸酶是不需要二聚化来进行特异性识别和切割的TALE-核酸酶，诸如工程化TAL重复序列与WO2012138927中所述的催化结构域I-TevI的融合物。转录活化因子样效应物(TALE)是来自细菌物种黄单胞菌属(Xanthomonas)的蛋白质，其包含多个重复序列，每个重复序列包含对核酸靶向序列的每个核苷酸碱基具有特异性的位置12和13中的二残基(RVD)。具有相似模块化逐碱基核酸结合性质(MBBBD)的结合结构域也可以来源于申请人最近在不同细菌物种中发现的新模块化蛋白。新模块化蛋白具有比TAL重复序列显示更多序列可变性的优势。优选地，与识别不同核苷酸相关的RVD是用于识别C的HD；用于识别T的NG；用于识别A的NI；用于识别G或A的NN；用于识别A、C、G或T的NS；用于识别T的HG；用于识别T的IG；用于识别G的NK；用于识别C的HA；用于识别C的ND；用于识别C的HI；用于识别G的HN；用于识别G的NA；用于识别G或A的SN；和用于识别T的YG；用于识别A的TL；用于识别A或G的VT；以及用于识别A的SW。在另一个实施方案中，关键氨基酸12和13可以向其他氨基酸残基突变，以便调节其对核苷酸A、T、C和G的特异性，特别是增强这种特异性。TALEN套件在商业上出售。

在一些实施方案中，使用锌指核酸酶(ZFN)对细胞进行操作。“锌指结合蛋白”是一种由于通过锌离子的配位稳定蛋白质结构而优选地以序列特异性方式结合DNA、RNA和/或蛋白质的蛋白质或多肽。术语锌指结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。单个DNA结合结构域通常被称为“指”。ZFP具有至少一个指，通常具有两个指、三个指或六个指。每个指结合两个至四个DNA碱基对，通常是三个或四个DNA碱基对。ZFP与被称为靶位点或靶区段的核酸序列结合。每个指通常包含大约30个氨基酸的锌螯合DNA结合亚结构域。研究表明，这类单个锌指由含有与锌配位的两个不变组氨酸残基的α螺旋以及单个β转角的两个半胱氨酸残基组成(参见，例如，Berg&Shi,Science271:1081-1085(1996))。

在一些实施方案中，本公开的细胞使用归巢核酸内切酶来制备。此类归巢核酸内切酶是本领域众所周知的(Stoddard 2005)。归巢核酸内切酶识别DNA靶序列并产生单链或双链断裂。归巢核酸内切酶具有高度特异性，识别长度范围为12个至45个碱基对(bp)、通常长度范围为14bp至40bp的DNA靶位点。根据本技术的归巢核酸内切酶可例如对应于LAGLIDADG核酸内切酶、HNH核酸内切酶或GIY-YIG核酸内切酶。根据本公开的优选归巢核酸内切酶可以是I-CreI变体。

在一些实施方案中，本技术的细胞使用大范围核酸酶来制备。按照定义，大范围核酸酶是识别大序列的序列特异性核酸内切酶(Chevalier,B.S.和B.L.Stoddard,NucleicAcids Res.,2001,29,3757-3774)。它们可以切割活细胞中的独特位点，从而将切割位点附近的基因靶向增强1000倍或更多(Puchta等人,Nucleic Acids Res.,1993,21,5034-5040；Rouet等人,Mol.Cell.Biol.,1994,14,8096-8106；Choulika等人,Mol.Cell.Biol.,1995,15,1968-1973；Puchta等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93,5055-5060；Sargent等人,Mol.Cell.Biol.,1997,17,267-77；Donoho等人,Mol.Cell.Biol,1998,18,4070-4078；Elliott等人,Mol.Cell.Biol.,1998,18,93-101；Cohen-Tannoudji等人,Mol.Cell.Biol.,1998,18,1444-1448)。

在一些实施方案中，使用RNA沉默或RNA干扰(RNAi)敲低(例如，降低、消除或抑制)多肽(诸如致耐受因子)的表达以制备本技术的细胞。可用的RNAi方法包括利用合成RNAi分子、短干扰RNA(siRNA)、PIWI相互作用NRA(piRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)的方法以及本领域技术人员认可的其他瞬时敲低方法。包括序列特异性shRNA、siRNA、miRNA等的用于RNAi的试剂是可商购获得的。例如，通过将CIITA siRNA引入到细胞中或将表达CIITA shRNA的病毒转导到细胞中，可以在多能干细胞中敲低CIITA。在一些实施方案中，采用RNA干扰来降低或抑制选自由CIITA、B2M、NLRC5、TCR-α和TCR-β组成的组的至少一种的表达。

在一些实施方案中，本文提供的细胞经遗传修饰以降低一种或多种免疫因子(包括靶多肽)的表达以产生免疫豁免或低免疫原性细胞。在某些实施方案中，本文公开的细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、原代T细胞和CAR-T细胞)包含一种或多种遗传修饰以降低一种或多种靶多核苷酸的表达。此类靶多核苷酸和多肽的非限制性实例包括CIITA、B2M、NLRC5、CTLA-4、PD-1、HLA-A、HLA-BM、HLA-C、RFX-ANK、NFY-A、RFX5、RFX-AP、NFY-B、NFY-C、IRF1和TAP1。

在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行遗传修饰。通过调节(例如，降低或缺失)一个或多个靶多核苷酸的表达，此类细胞在植入到受体受试者中时表现出降低的免疫活化。在一些实施方案中，细胞被认为是低免疫原性的，例如，在施用时在受体受试者或患者中。

A.基因编辑系统

在一些实施方案中，用于遗传修饰细胞以敲除、敲低或以其他方式修饰一个或多个基因的方法包括使用定点核酸酶，包括例如锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、转座酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统，以及本领域已知的切口酶系统、碱基编辑系统、引物编辑系统和基因编写系统。

1.ZFN

ZFN是包含一系列位点特异性DNA结合结构域的融合蛋白，所述结构域改编自附接至细菌FokI限制酶的核酸内切酶结构域的含锌指转录因子。ZFN可具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)DNA结合结构域或锌指结构域。参见，例如，Carroll等人,Genetics Society of America(2011)188:773-782；Kim等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93:1156-1160。每个锌指结构域都是被一个或多个锌离子稳定的小蛋白质结构基序，并且通常识别3至4bp的DNA序列。因此，串联结构域可以潜在地与细胞基因组中独特的延伸核苷酸序列结合。

可以组合特异性已知的各种锌指以产生识别约6、9、12、15或18bp序列的多指多肽。各种选择和模块化组装技术可用于生成识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。可以对锌指进行工程化以结合预定的核酸序列。工程化锌指以结合预定核酸序列的标准是本领域已知的。参见，例如，Sera等人,Biochemistry(2002)41:7074-7081；Liu等人,Bioinformatics(2008)24:1850-1857。

含有FokI核酸酶结构域或其他二聚核酸酶结构域的ZFN用作二聚体。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须通过适当间隔开的核酸酶结合DNA的相反链。参见Bitinaite等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95:10570-10575。为了切割基因组中的指定位点，设计了一对ZFN以识别侧接所述位点的两个序列，一个在正向链上，而另一个在反向链上。当ZFN在所述位点的任一侧结合后，核酸酶结构域二聚化并且切割所述位点处的DNA，从而生成具有5'突出端的DSB。然后可以借助含有被同源臂侧接的期望突变的修复模板，利用HDR来引入特定突变。修复模板通常是引入到细胞中的外源双链DNA载体。参见Miller等人,Nat.Biotechnol.(2011)29:143-148；Hockemeyer等人,Nat.Biotechnol.(2011)29:731-734。

2.TALEN

TALEN是可以用于编辑靶基因的人工核酸酶的另一个实例。TALEN来源于被称为TALE重复序列的DNA结合结构域，它通常包含具有10至30个重复序列的串联阵列，所述重复序列结合并识别延伸的DNA序列。每个重复序列长度为33至35个氨基酸，两个相邻的氨基酸(称为重复可变双残基或RVD)赋予四个DNA碱基对之一的特异性。因此，重复序列与靶DNA序列中的碱基对之间存在一一对应关系。

通过将一个或多个TALE DNA结合结构域(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)融合至核酸酶结构域(例如FokI核酸内切酶结构域)而人工产生TALEN。参见Zhang,Nature Biotech.(2011)29:149-153。为了在TALEN中使用，已经对FokI进行了若干种突变；例如，这些改善了切割特异性或活性。参见Cermak等人,Nucl.Acids Res.(2011)39:e82；Miller等人,Nature Biotech.(2011)29:143-148；Hockemeyer等人,Nature Biotech.(2011)29:731-734；Wood等人,Science(2011)333:307；Doyon等人,Nature Methods(2010)8:74-79；Szczepek等人,Nature Biotech(2007)25:786-793；Guo等人,J.Mol.Biol.(2010)200:96。FokI结构域用作二聚体，需要具有独特的DNA结合结构域的两个构建体，用于靶基因组中的具有正确的方向和间距的位点。TALE DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域之间的氨基酸残基数量以及两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数量似乎都是实现高水平活性的重要参数。Miller等人,Nature Biotech.(2011)29:143-148。

通过将工程化TALE重复序列与核酸酶结构域相组合，可以产生对任何期望的DNA序列具有特异性的位点特异性核酸酶。与ZFN类似，可以将TALEN引入到细胞中以在基因组中的期望靶位点生成DSB，因此TALEN可以用于以类似的HDR介导的途径敲除基因或敲入突变。参见Boch,Nature Biotech.(2011)29:135-136；Boch等人,Science(2009)326:1509-1512；Moscou等人,Science(2009)326:3501。

3.大范围核酸酶

大范围核酸酶是内切核酸酶家族中的酶，其特征在于它们能够识别并切割大DNA序列(14至40个碱基对)。基于大范围核酸酶的影响核酸酶活性和/或DNA识别的结构基序，将大范围核酸酶分为多个家族。最广泛和最有名的大范围核酸酶是LAGLIDADG家族中的蛋白质，其名称来源于保守的氨基酸序列。参见Chevalier等人,Nucleic Acids Res.(2001)29(18):3757-3774。另一方面，GIY-YIG家族成员具有GIY-YIG模块，其长度为70-100个残基，并且包括具有四个不变残基的四个或五个保守序列基序，其中两个是活性所需的。参见Van Roey等人,Nature Struct.Biol.(2002)9:806-811。His-Cys家族大范围核酸酶的特征在于在涵盖数百个氨基酸残基的区域中的一系列高度保守的组氨酸和半胱氨酸。参见Chevalier等人,Nucleic Acids Res.(2001)29(18):3757-3774。NHN家族的成员由含有被天冬酰胺残基包围的两对保守组氨酸的基序定义。参见Chevalier等人,Nucleic AcidsRes.(2001)29(18):3757-3774。

由于高特异性要求，鉴定特定靶DNA序列的天然大范围核酸酶的机会较低，因此已使用各种方法(包括诱变和高通量筛选方法)来创建识别独特序列的大范围核酸酶变体。用于对具有改变的DNA结合特异性的大范围核酸酶进行工程化(例如以结合预定核酸序列)的策略是本领域已知的。参见，例如,Chevalier等人,Mol.Cell.(2002)10:895-905；Epinat等人,Nucleic Acids Res(2003)31:2952-2962；Silva等人,J Mol.Biol.(2006)361:744-754；Seligman等人,Nucleic Acids Res(2002)30:3870-3879；Sussman等人,J Mol Biol(2004)342:31-41；Doyon等人,J Am Chem Soc(2006)128:2477-2484；Chen等人,ProteinEng Des Sel(2009)22:249-256；Arnould等人,J Mol Biol.(2006)355:443-458；Smith等人,Nucleic Acids Res.(2006)363(2):283-294。

与ZFN和TALEN一样，大范围核酸酶可以在基因组DNA中产生DSB，如果修复不当(例如，经由NHEJ)，它可以产生移码突变，从而导致靶基因在细胞中的表达降低。或者，可以将外来DNA与大范围核酸酶一起引入到细胞中。根据外来DNA的序列和染色体序列，此过程可用于修饰靶基因。参见Silva等人,Current Gene Therapy(2011)11:11-27。

4.转座酶

转座酶是结合转座子的末端并且通过剪切和粘贴机制或复制性转座机制催化其移动到基因组另一部分的酶。通过将转座酶连接至其他系统(诸如CRISPER/Cas系统)，可以开发新的基因编辑工具以实现基因组DNA的位点特异性插入或操作。有两种已知的使用转座子的DNA整合方法，其使用催化无活性的Cas效应蛋白和Tn7样转座子。转座酶依赖性DNA整合不在基因组中引发DSB，这可以保证更安全和更具特异性的DNA整合。

5.CRISPR/Cas系统

CRISPR系统作为提供一种获得性免疫的参与防御入侵噬菌体和质粒的系统最初在原核生物(例如，细菌和古细菌)中发现。现在它已被改编并用作研究和临床应用中流行的基因编辑工具。

CRISPR/Cas系统通常包含至少两种组件：一个或多个指导RNA(gRNA)和Cas蛋白。Cas蛋白是一种将DSB引入到靶位点中的核酸酶。CRISPR-Cas系统有两大类：1类系统使用多种Cas蛋白的复合物来降解核酸；2类系统使用单一大Cas蛋白来达到相同目的。1类分为I、III和IV型；2类分为II、V和VI型。适用于基因编辑应用的不同Cas蛋白包括但不限于Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3和Mad7。最广泛使用的Cas9在本文中被描述为说明性的。这些Cas蛋白可来源于不同的来源物种。例如，Cas9可以来源于化脓性链球菌(S.pyogenes)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)。

在原始微生物基因组中，II型CRISPR系统将来自入侵DNA的序列掺入到宿主基因组内编码为阵列的CRISPR重复序列之间。来自CRISPR重复序列阵列的转录物被加工成CRISPR RNA(crRNA)，每个都具有从入侵DNA转录的可变序列(称为“原间隔”序列)，以及CRISPR重复序列的一部分。每个crRNA与第二反式活化CRISPR RNA(tracrRNA)杂交，并且这两个RNA与Cas9核酸酶形成复合物。crRNA的原间隔编码部分指导Cas9复合物切割互补的靶DNA序列，前提条件是它们与被称为“原间隔相邻基序”(PAM)的短序列相邻。

自发现以来，CRISPR系统已被改编用于在从细菌到真核细胞(包括人类细胞)的广泛细胞和生物体中诱导序列特异性DSB和靶向基因组编辑。在基因编辑应用的用途中，人工设计的合成gRNA已经替代了原始的crRNA:tracrRNA复合物。例如，gRNA可以是由crRNA、四环和tracrRNA构成的单一指导RNA(sgRNA)。crRNA通常包含互补区域(也称为间隔子，长度通常为约20个核苷酸)，其经过用户设计以识别感兴趣的靶DNA。tracrRNA序列包含用于Cas核酸酶结合的支架区域。crRNA序列和tracrRNA序列通过四环连接，每个都具有用于彼此杂交的短重复序列，因此生成嵌合sgRNA。可以通过简单地改变gRNA中存在的间隔子或互补区域序列来改变Cas核酸酶的基因组靶标。互补区域将通过标准的RNA-DNA互补碱基配对规则将Cas核酸酶引导至靶DNA位点。

为了使Cas核酸酶发挥作用，紧邻基因组DNA中的靶序列的下游必须有PAM的存在。Cas蛋白对PAM的识别被认为会破坏相邻基因组序列的稳定性，从而允许gRNA询问序列并且在存在匹配序列时导致gRNA-DNA配对。PAM的特定序列因Cas基因的种类而异。例如，最常用的来源于化脓性链球菌的Cas9核酸酶识别5'-NGG-3'的PAM序列，或者以较低的效率识别5'-NAG-3'，其中“N”可以是任何核苷酸。具有替代PAM的其他Cas核酸酶变体也已经表征并成功用于基因组编辑，所述变体总结在下表19中。

表19.示例性Cas核酸酶变体及其PAM序列

R＝A或G；Y＝C或T；W＝A或T；V＝A或C或G；N＝任何碱基

在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含一个或多个突变以改变它们的活性、特异性、识别和/或其他特征。例如，Cas核酸酶可具有一个或多个突变，所述突变改变其保真度以减轻脱靶效应(例如，SpCas9的eSpCas9、SpCas9-HF1、HypaSpCas9、HeFSpCas9和evoSpCas9高保真变体)。又如，Cas核酸酶可具有改变其PAM特异性的一个或多个突变。6.切口酶

Cas(特别是Cas9)的核酸酶结构域，核酸酶可以独立突变以生成被称为DNA“切口酶”的酶。切口酶能够通过与常规CRISPR/Cas核酸酶系统(包括例如CRISPR/Cas9)相同的特异性引入单链切割。切口酶可用于生成可用于基因编辑系统的双链断裂(Mali等人,NatBiotech,31(9):833-838(2013)；Mali等人Nature Methods,10:957–963(2013)；Mali等人,Science,339(6121):823-826(2013))。在一些情况下，当使用两种Cas切口酶时，在每个切割末端上会产生长突出端而不是平末端，这允许对精确基因整合和插入进行额外控制(Mali等人,Nat Biotech,31(9):833-838(2013)；Mali等人Nature Methods,10:957–963(2013)；Mali等人,Science,339(6121):823-826(2013))。由于两种切口Cas酶必须有效地切割其靶DNA，因此与基于双链切割Cas的系统相比，配对的切口酶可以具有更低的脱靶效应(Ran等人,Cell,155(2):479-480(2013)；Mali等人,Nat Biotech,31(9):833-838(2013)；Mali等人Nature Methods,10:957–963(2013)；Mali等人,Science,339(6121):823-826(2013))。

引物编辑是一种通用且精确的基因组编辑方法，其使用与工程化逆转录酶融合的催化受损的Cas9核酸内切酶将新的遗传信息直接写入指定的DNA位点，该工程化逆转录酶用引物编辑引导RNA(pegRNA)编程，该引物编辑引导RNA指定靶位点并编码期望的编辑。参见例如Anzalone等人,Nature,576:149-157(2019)；WO2021072328；WO2022067130，所有这些文献均以引用方式整体并入本文。Cas9和逆转录酶也可用于将整合酶位点插入基因组，用于在称为可通过位点特异性靶向元件进行可编程添加(PASTE)编辑的过程中插入目标核酸。参见例如Ioannidi等人,bioRxiv 2021.11.01.466786；doi.org/10.1101/2021.11.01.466786。

CC.致耐受因子和/或嵌合抗原受体的重组表达方法

对于所有这些技术，使用众所周知的重组技术来生成如本文所概述的重组核酸。在某些实施方案中，编码致耐受因子或嵌合抗原受体的重组核酸可与表达构建体中的一个或多个调控核苷酸序列可操作地连接。调控核苷酸序列通常适用于待治疗的宿主细胞和受体受试者。对于多种宿主细胞，多种类型的适当的表达载体和合适的调控序列是本领域已知的。通常，一种或多种调控核苷酸序列可包括但不限于启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化因子序列。还考虑了本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子、组合了超过一个启动子的元件的杂合启动子、或合成启动子。表达构建体可存在于细胞中的附加体(诸如质粒)上，或者表达构建体可插入到染色体中，诸如基因座中。在一些实施方案中，表达载体包括可选择的标记基因以允许选择转化的宿主细胞。一些实施方案包括这样的表达载体，其包含编码变体多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与至少一个调控序列可操作地连接。本文使用的调控序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。在一些实施方案中，表达载体被设计用于选择待转化的宿主细胞、期望表达的特定变体多肽、载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力和/或载体编码的任何其他蛋白质(诸如抗生素标志物)的表达。

合适的哺乳动物启动子的实例包括例如来自以下基因的启动子：延伸因子1α(EF1α)启动子、CAG启动子、仓鼠的泛素/S27a启动子(WO 97/15664)、猿猴空泡病毒40(SV40)早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复区、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(MMTV)、莫洛尼氏鼠白血病病毒长末端重复区和人巨细胞病毒(CMV)早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的实例是肌动蛋白、免疫球蛋白或热休克启动子。在额外的实施方案中，用于哺乳动物宿主细胞的启动子可以从病毒的基因组获得，所述病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公开的UK 2,211,504)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)。在其他实施方案中，使用异源哺乳动物启动子。实例包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克启动子。SV40的早期和晚期启动子作为同样含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段方便地获得(Fiers等人,Nature 273:113-120(1978))。人巨细胞病毒的即刻早期启动子作为HindIII限制酶片段方便地获得(Greenaway等人,Gene 18:355-360(1982))。前述参考文献通过引用整体并入。

在一些实施方案中，表达载体是双顺反子或多顺反子表达载体。双顺反子或多顺反子表达载体可包括(1)与每个开放阅读框融合的多个启动子；(2)基因之间的剪接信号的插入；(3)表达受单一启动子驱动的基因的融合；和(4)基因之间的蛋白水解切割位点(自切割肽)的插入或基因之间的内部核糖体进入位点(IRES)的插入。

将本文所述的多核苷酸引入到细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔、融合原和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，经由病毒转导(例如，AAV转导、慢病毒转导)或者以其他方式在病毒载体上递送(例如，融合原介导的递送)，将多核苷酸引入到细胞中。在一些实施方案中，经由融合原介导的递送或选自由以下各项组成的组的转座酶系统将多核苷酸引入到细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。

在一些实施方案中，本文提供的细胞经遗传修饰以包括插入到低免疫原性细胞的一个或多个基因组基因座中的一种或多种外源多核苷酸。在一些实施方案中，外源多核苷酸编码感兴趣的蛋白质，例如嵌合抗原受体。可以使用任何合适的方法将外源多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。

与通常涉及活化细胞(诸如活化T细胞(例如，CD8⁺ T细胞))的将本文所述的多核苷酸引入到细胞中的某些方法不同，可以利用合适的技术将多核苷酸引入到非活化T细胞中。合适的技术包括但不限于用一种或多种结合CD3、CD8和/或CD28的抗体或其可以或不可以结合珠子的片段或部分(例如，scFv和VHH)来活化T细胞(CD8⁺ T细胞)。令人惊讶的是，融合原介导的将多核苷酸引入到T细胞中是在非活化T细胞(例如，CD8⁺ T细胞)中执行的，所述细胞先前未接触过一种或多种活化抗体或其片段或部分(例如，CD3、CD8和/或CD28)。在一些实施方案中，融合原介导的将多核苷酸引入到T细胞中是在体内进行的(例如，在T细胞已经被施用至受试者之后)。在其他实施方案中，融合原介导的将多核苷酸引入到T细胞中是在体外进行的(例如，在T细胞被施用至受试者之前)。

本文提供了包含相对于野生型T细胞可调控地降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和/或TCR-β表达的非活化T细胞，其中该非活化T细胞还包含编码可调控的一种或多种致耐受因子的第一外源多核苷酸。

在一些实施方案中，非活化T细胞未用抗CD3抗体、抗CD28抗体、T细胞活化细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达活化标志物。在一些实施方案中，非活化T细胞表达CD3和CD28，并且其中CD3和/或CD28是无活性的。

在一些实施方案中，抗CD3抗体是OKT3。在一些实施方案中，抗CD28抗体是CD28.2。在一些实施方案中，T细胞活化细胞因子选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的T细胞活化细胞因子组。在一些实施方案中，可溶性T细胞共刺激分子选自由抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD137L抗体和抗ICOS-L抗体组成的可溶性T细胞共刺激分子组。

在一些实施方案中，非活化T细胞是原代T细胞。在其他实施方案中，非活化T细胞从本公开的低免疫原性细胞分化。在一些实施方案中，T细胞是CD8⁺ T细胞。

在一些实施方案中，非活化T细胞还包含编码可调控的嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。在一些实施方案中，CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。

在一些实施方案中，第一和/或第二外源多核苷酸由病毒载体(包括慢病毒载体)携带。在一些实施方案中，第一和/或第二外源多核苷酸由包含CD8结合剂的慢病毒载体携带。在一些实施方案中，使用融合原介导的递送或选自由以下各项组成的组的转座酶系统将第一和/或第二外源多核苷酸引入到细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。

在一些实施方案中，非活化T细胞还包含编码CD47的第二外源多核苷酸。在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因的指定基因座中。在一些实施方案中，指定基因座选自由安全港基因座或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组。在一些实施方案中，将编码CD47的第二外源多核苷酸插入到选自由以下各项组成的组的指定基因座中：安全港或靶标基因座、靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CAR的第一外源多核苷酸插入到选自由安全港基因座、靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组的指定基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸插入到选自由安全港基因座、靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组的指定基因座。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码CD47的第一外源多核苷酸插入到不同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码一种或多种致耐受因子的第一外源多核苷酸插入到相同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码一种或多种致耐受因子的第一外源多核苷酸插入到B2M基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码一种或多种致耐受因子的第一外源多核苷酸插入到CIITA基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码一种或多种致耐受因子的第一外源多核苷酸插入到TRAC基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码一种或多种致耐受因子的第一外源多核苷酸插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码一种或多种致耐受因子的第一外源多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，安全港或靶基因座选自由以下各项组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。

在一些实施方案中，非活化T细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达B2M。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达CIITA。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达TCR-α。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达TCR-β。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达TCR-α和TCR-β。

在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到TRAC基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和/或编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，使用病毒转导将第一外源多核苷酸和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将第一外源多核苷酸和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到TRAC基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到TRB基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和/或编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到TRB基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到B2M基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和/或编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到B2M基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到CIITA基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和/或编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到CIITA基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码CAR的第二可调控基因。

在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRB^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到TRAC基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和/或编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRB^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到TRAC基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRB^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到TRB基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和/或编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRB^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到TRB基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRB^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到B2M基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和/或编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRB^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到B2M基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRB^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到CIITA基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和/或编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，非活化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRB^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到CIITA基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码CAR的第二可调控基因。

本文提供了相对于野生型T细胞包含可调控地降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达的工程化T细胞，其中该工程化T细胞还包含编码可调控的一种或多种致耐受因子的第一外源多核苷酸，该一种或多种致耐受因子由包含CD8结合剂的慢病毒载体携带。

在一些实施方案中，工程化T细胞是原代T细胞。在其他实施方案中，工程化T细胞从本公开的低免疫原性细胞分化。在一些实施方案中，T细胞是CD8⁺ T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4⁺ T细胞。

在一些实施方案中，工程化T细胞不表达活化标志物。在一些实施方案中，工程化T细胞表达CD3和CD28，并且其中CD3和/或CD28是无活性的。

在一些实施方案中，工程化T细胞未用抗CD3抗体、抗CD28抗体、T细胞活化细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。在一些实施方案中，抗CD3抗体是OKT3，其中抗CD28抗体是CD28.2，其中T细胞活化细胞因子选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的T细胞活化细胞因子组，并且其中可溶性T细胞共刺激分子选自由抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD137L抗体和抗ICOS-L抗体组成的可溶性T细胞共刺激分子组。在一些实施方案中，工程化T细胞尚未用选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的组的一种或多种T细胞活化细胞因子处理。在一些情况下，细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子是IL-2，并且另一种选自由IL-7、IL-15和IL-21组成的组。

在一些实施方案中，工程化T细胞还包含编码可调控的嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因的指定基因座中。在一些实施方案中，指定基因座选自由安全港基因座、靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组。在一些实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因插入到选自由安全港基因座、靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组的指定基因座。在一些实施方案中，将编码CAR的第二可调控基因插入到选自由安全港基因座、靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组的指定基因座。在一些实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码CAR的第二可调控基因插入到不同的基因座中。在一些实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码CAR的第二可调控基因插入到相同的基因座中。在一些实施方案中，将编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和编码CAR的第二可调控基因插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRB基因座或安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，安全港或靶基因座选自由以下各项组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。

在一些实施方案中，CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。在一些实施方案中，CAR是CD19特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD22特异性CAR。在一些实施方案中，CAR包含与选自由CD19、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA组成的组的任一个结合的抗原结合结构域。

在一些实施方案中，工程化T细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原，其中工程化T细胞不表达B2M，其中工程化T细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原，其中工程化T细胞不表达CIITA，且/或其中工程化T细胞不表达TCR-α和TCR-β。

在一些实施方案中，工程化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRAC^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到TRAC基因座、TRB基因座、B2M基因座或CIITA基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和/或编码CAR的第二可调控基因。在一些实施方案中，工程化T细胞是B2M^{插入缺失/插入缺失}、CIITA^{插入缺失/插入缺失}、TRB^{插入缺失/插入缺失}细胞，其包含插入到TRAC基因座、TRB基因座、B2M基因座或CIITA基因座中的编码一种或多种致耐受因子的第一可调控基因和/或编码CAR的第二可调控基因。

在一些实施方案中，本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞在受试者中。在其他实施方案中，本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞在体外。

在一些实施方案中，本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞表达CD8结合剂。在一些实施方案中，CD8结合剂是抗CD8抗体。在一些实施方案中，抗CD8抗体选自由以下各项组成的组：小鼠抗CD8抗体、兔抗CD8抗体、人抗CD8抗体、人源化抗CD8抗体、骆驼科动物(例如美洲驼、羊驼、骆驼)抗CD8抗体及其片段。在一些实施方案中，其片段是scFv或VHH。在一些实施方案中，CD8结合剂结合CD8α链和/或CD8β链。

在一些实施方案中，CD8结合剂融合至掺入病毒包膜中的跨膜结构域。在一些实施方案中，慢病毒载体用病毒融合蛋白假型化。在一些实施方案中，病毒融合蛋白包含一种或多种修饰以降低与其天然受体的结合。

在一些实施方案中，病毒融合蛋白融合至CD8结合剂。在一些实施方案中，病毒融合蛋白包含融合至CD8结合剂的尼帕病毒F糖蛋白和尼帕病毒G糖蛋白。在一些实施方案中，慢病毒载体不包含T细胞活化分子或T细胞共刺激分子。在一些实施方案中，慢病毒载体编码第一外源多核苷酸和/或第二外源多核苷酸。

在一些实施方案中，在转移到第一受试者体内后，非活化T细胞或工程化T细胞表现出选自由以下各项组成的组的一种或多种响应：(a)T细胞响应，(b)NK细胞响应，和(c)巨噬细胞响应，所述响应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者是不同的受试者。在一些实施方案中，巨噬细胞响应是吞噬。

在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，非活化T细胞或工程化T细胞在转移到受试者体内后表现出选自由以下各项组成的组的一项或多项：(a)受试者的TH1活化减少，(b)受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)受试者的完整PBMC的杀伤减少。

在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，非活化T细胞或工程化T细胞在转移到受试者体内后引发选自由以下各项组成的组的一项或多项：(a)受试者的供体特异性抗体减少，(b)受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。

在一些实施方案中，在受试者体内用包含CD8结合剂的慢病毒载体转导非活化T细胞或工程化T细胞。在一些实施方案中，慢病毒载体携带编码CAR和/或CD47的基因。

在一些实施方案中，在转移到第一受试者体内后，本文所述的细胞表现出选自由以下各项组成的组的一种或多种响应：(a)T细胞响应，(b)NK细胞响应，和(c)巨噬细胞响应，所述响应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者是不同的受试者。在一些实施方案中，巨噬细胞响应是吞噬。

在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，本文所述的细胞在转移到受试者体内后表现出选自由以下各项组成的组的一项或多项：(a)受试者的TH1活化减少，(b)受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)受试者的完整PBMC的杀伤减少。

在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，本文所述的细胞在转移到受试者体内后引发选自由以下各项组成的组的一项或多项：(a)受试者的供体特异性抗体减少，(b)受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。

在一些实施方案中，在受试者体内用包含CD8结合剂的慢病毒载体转导本文所述的细胞。在一些实施方案中，慢病毒载体携带编码CAR和/或CD47的基因。

在一些实施方案中，使用基因治疗载体或选自由以下各项组成的组的转座酶系统将编码CAR和/或CD47的基因引入到细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。在一些实施方案中，基因治疗载体是逆转录病毒或融合体。

本文提供药物组合物，其包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。

本文提供的方法包括向受试者施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物。

在一些实施方案中，在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。

本文提供了治疗罹患癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，其中在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。

本文提供了用于在有需要的受试者体内扩增能够识别并杀伤所述受试者的肿瘤细胞的T细胞的方法，其包括向受试者施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，其中在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。

本文提供了用于治疗受试者的疾患、疾病或病症的剂量方案，其包括施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中药物组合物以约1-3个治疗有效剂量施用。本文提供了用于治疗受试者的疾患、疾病或病症的剂量方案，其包括施用包含本公开的细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中药物组合物以约1-3个临床有效剂量施用。

一旦改变，本文所述的任何分子的表达的存在可以使用已知技术来测定，诸如蛋白质印迹、ELISA测定、FACS测定、其他免疫测定、逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)等。

DD.诱导性多能干细胞的生成

本技术提供了产生低免疫原性多能细胞的方法。在一些实施方案中，方法包括生成多能干细胞。小鼠和人类多能干细胞(通常称为iPSC；对于鼠类细胞为miPSC或对于人类细胞为hiPSC)的产生在本领域中通常是已知的。如本领域技术人员将理解的，有多种不同的方法用于产生iPCS。最初的诱导是使用四种转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的病毒引入在小鼠胚胎或成年成纤维细胞中进行的；参见Takahashi和Yamanaka Cell 126:663-676(2006)，所述文献特此通过引用整体并入，特别是其中概述的技术。从那时起，已经开发了许多方法；参见Seki等人,World J.Stem Cells 7(1):116-125(2015)进行回顾，以及Lakshmipathy和Vermuri编辑,Methods in Molecular Biology:Pluripotent StemCells,Methods and Protocols,Springer 2013，这两篇文献均以引用方式整体据此明确并入，特别是用于产生hiPSC的方法(参见例如后一篇参考文献的第3章)。

通常，iPSC通过在宿主细胞中瞬时表达一种或多种重编程因子来生成，所述重编程因子通常使用附加型载体引入。在这些条件下，少量的细胞被诱导成为iPSC(一般来讲，这一步的效率很低，因为没有使用选择标志物)。一旦细胞被“重编程”并成为多能细胞，它们就会失去附加型载体并使用内源基因产生因子。

如本领域技术人员还理解的，可以使用或被使用的重编程因子的数量可以变化。通常，当使用较少的重编程因子时，细胞转化为多能状态的效率下降，“多能性”也下降，例如，较少的重编程因子可能导致细胞不是完全多能的，而是可能只能够分化成较少的细胞类型。

在一些实施方案中，使用单个重编程因子OCT4。在其他实施方案中，使用两个重编程因子OCT4和KLF4。在其他实施方案中，使用三个重编程因子OCT4、KLF4和SOX2。在其他实施方案中，使用四个重编程因子OCT4、KLF4、SOX2和c-Myc。在其他实施方案中，可以使用选自SOKMNLT；SOX2、OCT4(POU5F1)、KLF4、MYC、NANOG、LIN28和SV40L T抗原的5、6或7个重编程因子。一般来讲，这些重编程因子基因是在附加型载体上提供的，诸如是本领域已知的和可商购获得的。

一般来讲，如本领域已知的，iPSC通过瞬时表达如本文所述的重编程因子由非多能细胞(诸如但不限于血细胞、成纤维细胞等)制成。

EE.低免疫原性表型和多能性保留的测定

一旦已经生成低免疫原性细胞，就可如WO2016183041和WO2018132783中所述测定它们的低免疫原性和/或多能性保留。

在一些实施方案中，使用如WO2018132783的图13和图15中例示的多种技术测定低免疫原性。这些技术包括移植到同种异体宿主中和监测逃脱宿主免疫系统的低免疫原性多能细胞生长(例如畸胎瘤)。在一些情况下，低免疫原性多能细胞衍生物被转导以表达荧光素酶，然后可以使用生物发光成像进行跟踪。类似地，测试宿主动物对此类细胞的T细胞和/或B细胞响应，以确认所述细胞不在宿主动物中引起免疫响应。通过Elispot、ELISA、FACS、PCR或质谱流式细胞术(CYTOF)评估T细胞响应。使用FACS或Luminex来评估B细胞响应或抗体响应。另外或另选地，可测定细胞避免先天免疫响应(例如，NK细胞杀伤)的能力，如WO2018132783的图14和图15中通常所示。

在一些实施方案中，使用本领域技术人员认可的T细胞免疫测定(诸如T细胞增殖测定、T细胞活化测定和T细胞杀伤测定)来评价细胞的免疫原性。在一些情况下，T细胞增殖测定包括用干扰素-γ预处理细胞并将细胞与标记的T细胞共培养，并且在预先选择的时间量后测定T细胞群(或增殖的T细胞群)的存在。在一些情况下，T细胞活化测定包括将T细胞与本文概述的细胞共培养，并且确定T细胞中T细胞活化标志物的表达水平。

可以执行体内测定以评估本文概述的细胞的免疫原性。在一些实施方案中，使用同种异体人源化免疫缺陷小鼠模型来确定低免疫原性细胞的存活率和免疫原性。在一些情况下，将低免疫原性多能干细胞移植到同种异体人源化NSG-SGM3小鼠中并测定细胞排斥、细胞存活率和畸胎瘤形成。在一些情况下，植入的低免疫原性多能干细胞或其分化细胞在小鼠模型中展现出长期存活。

用于确定免疫原性(包括细胞的低免疫原性)的额外技术描述于例如Deuse等人,Nature Biotechnology,2019,37,252-258和Han等人,Proc Natl Acad Sci USA,2019,116(21),10441-10446，包括附图、附图说明和方法描述的公开内容通过引用整体并入本文。

类似地，以多种方式测试多能性保留。在一些实施方案中，通过某些多能性特异性因子的表达来测定多能性，如本文一般描述和WO2018132783的图29所示。另外或替代地，将多能细胞分化成一种或多种细胞类型作为多能性的指示。

如本领域技术人员将理解的，可以使用本领域已知并且如下文所述的技术(例如，使用结合HLA复合物的标记抗体(例如，使用与人类主要组织相容性HLA I类抗原分子的α链结合的可商购获得的HLA-A、HLA-B和HLA-C抗体)的FACS技术)来测量多能细胞中MHC I功能(当细胞衍生自人类细胞时，为HLA I)的成功降低。

另外，可以对细胞进行测试，以确认HLA I复合物不在细胞表面上表达。这可使用如上文所讨论的一种或多种HLA细胞表面组分的抗体通过FACS分析来测定。

可以使用本领域已知的技术(诸如使用蛋白质的抗体的蛋白质印迹、FACS技术、RT-PCR技术等)来测量多能细胞或其衍生物中MHC II功能(当细胞衍生自人类细胞时，为HLA II)的成功降低。

另外，可以对细胞进行测试，以确认HLA II复合物不在细胞表面上表达。再次，这种测定如本领域已知的那样进行(例如参见WO2018132783的图21)并且通常使用基于与人类HLA II类HLA-DR、DP和大多数DQ抗原结合的商业抗体的蛋白质印迹或FACS分析进行。

除了减少一种或多种HLA I和II(或MHC I和II)分子外，该技术的低免疫原性细胞对巨噬细胞吞噬作用和NK细胞杀伤的敏感性也降低。由于TCR复合物的降低或缺乏以及一种或多种致耐受因子转基因的表达，所得的低免疫原性细胞“逃避”免疫巨噬细胞和先天途径。

FF.外源多核苷酸

在一些实施方案中，本文提供的低免疫原性细胞经遗传修饰以包括插入到低免疫原性细胞的一个或多个基因组基因座中的一种或多种外源多核苷酸。在一些实施方案中，外源多核苷酸编码感兴趣的蛋白质，例如嵌合抗原受体。可以使用任何合适的方法将外源多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。

可以将外源多核苷酸插入低免疫原性细胞的任何合适的基因组基因座中。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入到如本文所述的安全港或靶标基因座中。合适的安全港和靶标基因座包括但不限于CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因、白蛋白基因、SHS231基因座、CLYBL基因、Rosa基因(例如，ROSA26)、F3基因(也称为CD142)、MICA基因、MICB基因、LRP1基因(也称为CD91)、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因、PDGFRa基因、OLIG2基因、GFAP基因和KDM5D基因(也称为HY)。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入到安全港或靶标基因座的内含子、外显子或编码序列区域中。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入到内源基因中，其中插入导致内源基因的沉默或表达降低。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD-1或CTLA-4基因座中。用于插入外源多核苷酸的示例性基因组基因座描绘于表16和表17中。

表16：用于插入外源多核苷酸的示例性基因组基因座

表17：Cas9引导RNA的非限制性实例

对于Cas9引导物，表18中提供了所有Cas9引导物的间隔子序列。描述了20nt引导序列对应于独特的引导序列并且可以是本文描述的那些中的任一种，包括例如表18中列出的那些。

表18：Cas9引导RNA

在一些实施方案中，包括外源多核苷酸的低免疫原性细胞来源于低免疫原性诱导性多能细胞(HIP)，例如，如本文所述。此类低免疫原性细胞包括例如心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、胰岛细胞(β细胞)、视网膜色素上皮细胞、NK细胞和T细胞。在一些实施方案中，包含外源多核苷酸的低免疫原性细胞是β细胞、T细胞(例如，原代T细胞)或神经胶质细胞。

在一些实施方案中，外源多核苷酸编码外源CD47多肽(例如，人CD47多肽)，并且将外源多肽插入到如本文所公开的安全港或靶标基因座或安全港或靶位点中，或插入到引起内源基因的沉默或表达降低的基因组基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD1或CTLA4基因座中。

在一些实施方案中，包括外源多核苷酸的低免疫原性细胞是原代T细胞或来源于低免疫原性多能细胞(例如，低免疫原性iPSC)的T细胞。在一些实施方案中，外源多核苷酸是嵌合抗原受体(例如，本文所述的任何CAR)。在一些实施方案中，外源多核苷酸可操作地连接至用于在低免疫原性细胞中表达外源多核苷酸的启动子。

GG.药学上可接受的载剂

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物还包括药学上可接受的载剂。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；盐，诸如氯化钠；和/或非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(TWEEN^TM)、泊洛沙姆(PLURONICS^TM)或聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，药物组合物包括药学上可接受的缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)。

在一些实施方案中，药物组合物包括选自由以下各项组成的组的一种或多种电解质基础溶液：乳酸林格氏溶液(Ringer's solution)、PlasmaLyte-A^TM、伊斯科夫改良的杜尔贝科培养基、Normosol-R^TM、Veen-D^TM、和Hank平衡盐溶液(不含酚红)。这些基础溶液非常接近哺乳动物胞外生理液体的组成。

在一些实施方案中，药物组合物包括一种或多种选自由以下各项组成的组的冷冻保护剂：阿拉伯半乳聚糖、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、右旋糖、葡聚糖、海藻糖、蔗糖、棉子糖、羟乙基淀粉(HES)、丙二醇、人血清白蛋白(HSA)和二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方案中，药学上可接受的缓冲剂是中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包括CSB、Plasma-Lyte-A^TM、HSA、DMSO和海藻糖中的一种或多种。

是一种细胞内样的优化溶液，其含有渗透剂(osmotic agent)/渗透压剂(oncotic agent)、自由基清除剂和能量源以最大程度地减少细胞凋亡、最大程度地减少局部缺血/再灌注损伤并最大限度地提高最大数量的活的功能细胞的解冻后恢复。不含血清和蛋白质，并且无免疫原性。由USP级或更高级的原料遵循cGMP制造。是用0％、2％、5％或10％ DMSO预先配制的一系列溶液。CSB是的无DMSO版本。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-100％、5-95％、10-90％、15-85％、20-80％、30-80％、40-80％、50-80％、60-80％、70-80％、25-75％、30-70％、35-65％、40-60％或45-55％重量/重量的CSB的基础溶液。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％重量/重量的CSB的基础溶液。

PlasmaLyte-A^TM是一种非聚合血浆增容剂，并且含有与培养基中发现的那些相似的必需盐和营养物质，但不含有组织培养基中发现的未批准用于人体输注或在U.S.P.等级中不可用的额外成分(例如，酚红)。PlasmaLyte-A^TM含有约140mEq/L的钠(Na)、约5mEq/L的钾(K)、约3mEq/L的镁(Mg)、约98mEq/L的氯(Cl)、约27mEq/L的乙酸盐和约23mEq/L的葡糖酸盐。(PlasmaLyte-A^TM可从Baxter,Hyland Division,Glendale Calif.商购获得，产品号为2B2543)。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-100％、5-95％、10-90％、15-85％、15-80％、15-75％、15-70％、15-65％、15-60％、15-55％、15-50％、15-45％、15-40％、15-35％、15-30％、15-25％、20-80％、20-75％、20-70％、20-65％、20-60％、20-55％、20-50％、20-45％、20-40％、20-35％、20-30％、25-75％、30-70％、35-65％、40-60％或45-55％重量/重量的PlasmaLyte-A^TM基础溶液。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％重量/重量的PlasmaLyte-A^TM基础溶液。

在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-10％、0.3-9.3％、0.3-8.3％、0.3-7.3％、0.3-6.3％、0.3-5.3％、0.3-4.3％、0.3-3.3％、0.3-2.3％、0.3-1.3％、0.6-8.3％、0.9-7.3％、1.2-6.3％、1.5-5.3％、1.8-4.3％或2.1-3.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0％、0.3％、0.6％、0.9％、1.2％、1.5％、1.8％、2.1％、2.4％、2.7％、3.0％、3.3％、3.6％、3.9％、4.3％、4.6％、4.9％、5.3％、5.6％、5.9％、6.3％、6.6％、6.9％、7.3％、7.6％、7.9％、8.3％、8.6％、8.9％、9.3％、9.6％、9.9％或10％重量/体积的HSA。

在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-10％、0.5-9.5％、1-9％、1.5-8.5％、2-8％、3-8％、4-8％、5-8％、6-8％、7-8％、2.5-7.5％、3-7％、3.5-6.5％、4-6％或4.5-5.5％体积/体积的二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0％、0.25％、0.5％、0.75％、1.0％,1.25％、1.5％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％或10.0％体积/体积的HSA。

在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-500mM、50-450mM、100-400mM、150-350mM或200-300mM的海藻糖。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、125mM、150mM、175mM、200mM、225mM、250mM、275mM、300mM、325mM、350mM、375mM、400mM、425mM、450mM、475mM或500mM的海藻糖。

示例性药物组合物组分在表34中示出。

表34.示例性药物组合物组分。

*除PlasmaLyte之外的额外HSA。

在一些实施方案中，药物组合物包含本文所述的低免疫原性细胞和药学上可接受的载剂，所述载剂包含31.25％(体积/体积)Plasma-Lyte A、31.25％(体积/体积)的5％右旋糖/0.45％氯化钠、10％葡聚糖40(LMD)/5％右旋糖、20％(体积/体积)的25％人血清白蛋白(HSA)和7.5％(体积/体积)二甲基亚砜(DMSO)。

HH.制剂和剂量方案

任何治疗有效量的本文所述的细胞都可以包括在药物组合物中，这取决于所治疗的适应症。细胞的非限制性实例包括原代T细胞、从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞以及本文所述的从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的其他细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至少约1x 10²、5x 10²、1x 10³、5x 10³、1x 10⁴、5x 10⁴、1x 10⁵、5x 10⁵、1x 10⁶、5x 10⁶、1x 10⁷、5x 10⁷、1x 10⁸、5x 10⁸、1x 10⁹、5x 10⁹、1x 10¹⁰或5x 10¹⁰个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至多约1x 10²、5x 10²、1x 10³、5x 10³、1x 10⁴、5x 10⁴、1x10⁵、5x 10⁵、1x 10⁶、5x 10⁶、1x 10⁷、5x 10⁷、1x 10⁸、5x 10⁸、1x 10⁹、5x 10⁹、1x 10¹⁰或5x10¹⁰个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至多约6.0x 10⁸个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至多约8.0x 10⁸个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至少约1x10²-5x 10²、5x 10²-1x 10³、1x 10³-5x 10³、5x 10³-1x 10⁴、1x 10⁴-5x 10⁴、5x 10⁴-1x 10⁵、1x 10⁵-5x 10⁵、5x 10⁵-1x 10⁶、1x 10⁶-5x 10⁶、5x 10⁶-1x 10⁷、1x 10⁷-5x 10⁷、5x 10⁷-1x10⁸、1x 10⁸-5x 10⁸、5x 10⁸-1x 10⁹、1x 10⁹-5x 10⁹、5x 10⁹-1x 10¹⁰或1x 10¹⁰-5x 10¹⁰个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括约1.0x 10⁶至约2.5x 10⁸个细胞。在某些实施方案中，药物组合物包括约2.0x 10⁶至约2.0x 10⁸个细胞，诸如但不限于原代T细胞、从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。

在一些实施方案中，药物组合物具有至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400或500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400或500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400或500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有约1-50ml、50-100ml、100-150ml、150-200ml、200-250ml、250-300ml、300-350ml、350-400ml、400-450ml或450-500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有约1-50ml、50-100ml、100-150ml、150-200ml、200-250ml、250-300ml、300-350ml、350-400ml、400-450ml或450-500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有约1-10ml、10-20ml、20-30ml、30-40ml、40-50ml、50-60ml、60-70ml、70-80ml、70-80ml、80-90ml或90-100ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有范围为约5ml至约80ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有范围为约10ml至约70ml的体积。在某些实施方案中，药物组合物具有范围为约10ml至约50ml的体积。

具体的量/剂量方案将根据个体的体重、性别、年龄和健康状况、制剂、生化性质、生物活性、生物利用度和细胞的副作用以及完整治疗方案中细胞的数量和特性而变化。

在一些实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量的药物组合物包括体积为约10ml至50ml的约1.0x 10⁵至约2.5x 10⁸个细胞，并且药物组合物作为单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用。在一些情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量包括体积为约10ml至50ml的约1.0x 10⁵至约2.5x 10⁸个本文所述的原代T细胞。在一些情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量包括体积为约10ml至50ml的约1.0x10⁵至约2.5x 10⁸个上文已经描述的原代T细胞。在各种情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量包括体积为约10ml至50ml的约1.0x10⁵至约2.5x 10⁸个本文所述的从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量是体积为约10ml至50ml的1.0x 105、1.1x 105、1.2x105、1.3x 105、1.4x 105、1.5x 105、1.6x 105、1.7x 105、1.8x 105、1.9x 105、2.0x 105、2.1x 105、2.2x 105、2.3x 105、2.4x 105、2.5x 105、1.0x 106、1.1x 106、1.2x 106、1.3x106、1.4x 106、1.5x 106、1.6x 106、1.7x 106、1.8x 106、1.9x 106、2.0x 106、2.1x 106、2.2x 106、2.3x 106、2.4x 106、2.5x 106、1.0x 107、1.1x 107、1.2x 107、1.3x 107、1.4x107、1.5x 107、1.6x 107、1.7x 107、1.8x 107、1.9x 107、2.0x 107、2.1x 107、2.2x 107、2.3x 107、2.4x 107、2.5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108或2.5x 108个本文所述的从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。在其他情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量的范围低于约1.0x 10⁵至约2.5x 10⁸个T细胞，包括原代T细胞或从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。在又其他情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量的范围高于约1.0x 10⁵至约2.5x 10⁸个T细胞，包括原代T细胞和从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。

在一些实施方案中，药物组合物作为单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，所述剂量对于50kg或更轻的受试者为约1.0x 10⁵至约1.0x 10⁷个细胞(诸如原代T细胞和从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞)/体重kg。在一些实施方案中，药物组合物作为单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，所述剂量对于50kg或更轻的受试者为约0.5x 10⁵至约1.0x 10⁷、约1.0x 10⁵至约1.0x 10⁷、约1.0x 10⁵至约1.0x 10⁷、约5.0x 10⁵至约1x 10⁷、约1.0x 10⁶至约1x 10⁷、约5.0x 10⁶至约1.0x 10⁷、约1.0x 10⁵至约5.0x 10⁶、约1.0x 10⁵至约1.0x 10⁶、约1.0x 10⁵至约5.0x 10⁵、约1.0x 10⁵至约5.0x 10⁶、约2.0x 10⁵至约5.0x10⁶、约3.0x 10⁵至约5.0x 10⁶、约4.0x 10⁵至约5.0x 10⁶、约5.0x 10⁵至约5.0x 10⁶、约6.0x10⁵至约5.0x 10⁶、约7.0x 10⁵至约5.0x 10⁶、约8.0x 10⁵至约5.0x 10⁶或约9.0x 10⁵至约5.0x 10⁶个细胞/体重kg。在一些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量为约0.2x 10⁶至约5.0x 10⁶个细胞/体重kg。在某些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量在低于约0.2x 10⁶至约5.0x 10⁶个细胞/体重kg的范围内。在一些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量为0.5x 10⁵、0.6x 10⁵、0.7x 10⁵、0.8x10⁵、0.9x 10⁵、1.0x 10⁵、1.1x 10⁵、1.2x 10⁵、1.3x10⁵、1.4x 10⁵、1.5x 10⁵、1.6x 10⁵、1.7x 10⁵、1.8x 10⁵、1.9x 10⁵、2.0x 10⁵、2.1x 10⁵、2.2x10⁵、2.3x 10⁵、2.4x 10⁵、2.5x 10⁵、2.6x 10⁵、2.7x 10⁵、2.8x 10⁵、2.9x 10⁵、3.0x 10⁵、3.1x10⁵、3.2x 10⁵、3.3x 10⁵、3.4x 10⁵、3.5x 10⁵、3.6x 10⁵、3.7x 10⁵、3.8x 10⁵、3.9x 10⁵、4.0x10⁵、4.1x 10⁵、4.2x 10⁵、4.3x 10⁵、4.4x 10⁵、4.5x 10⁵、4.6x 10⁵、4.7x 10⁵、4.8x 10⁵、4.9x10⁵、5.0x 10⁵、0.5x 10⁶、0.6x 10⁶、0.7x 10⁶、0.8x 10⁶、0.9x 10⁶、1.0x 10⁶、1.1x 10⁶、1.2x10⁶、1.3x 10⁶、1.4x 10⁶、1.5x 10⁶、1.6x 10⁶、1.7x 10⁶、1.8x 10⁶、1.9x 10⁶、2.0x 10⁶、2.1x10⁶、2.2x 10⁶、2.3x 10⁶、2.4x 10⁶、2.5x 10⁶、2.6x 10⁶、2.7x 10⁶、2.8x 10⁶、2.9x 10⁶、3.0x10⁶、3.1x 10⁶、3.2x 10⁶、3.3x 10⁶、3.4x 10⁶、3.5x 10⁶、3.6x 10⁶、3.7x 10⁶、3.8x 10⁶、3.9x10⁶、4.0x 10⁶、4.1x 10⁶、4.2x 10⁶、4.3x 10⁶、4.4x 10⁶、4.5x 10⁶、4.6x 10⁶、4.7x 10⁶、4.8x10⁶、4.9x 10⁶、5.0x 10⁶、5.1x 10⁶、5.2x 10⁶、5.3x 10⁶、5.4x 10⁶、5.5x 10⁶、5.6x 10⁶、5.7x10⁶、5.8x 10⁶、5.9x 10⁶、6.0x 10⁶、6.1x 10⁶、6.2x 10⁶、6.3x 10⁶、6.4x 10⁶、6.5x 10⁶、6.6x10⁶、6.7x 10⁶、6.8x 10⁶、6.9x 10⁶、7.0x 10⁶、7.1x 10⁶、7.2x 10⁶、7.3x 10⁶、7.4x 10⁶、7.5x10⁶、7.6x 10⁶、7.7x 10⁶、7.8x 10⁶、7.9x 10⁶、8.0x 10⁶、8.1x 10⁶、8.2x 10⁶、8.3x 10⁶、8.4x10⁶、8.5x 10⁶、8.6x 10⁶、8.7x 10⁶、8.8x 10⁶、8.9x 10⁶、9.0x 10⁶、9.1x 10⁶、9.2x 10⁶、9.3x10⁶、9.4x 10⁶、9.5x 10⁶、9.6x 10⁶、9.7x 10⁶、9.8x 10⁶、9.9x 10⁶、0.5x 10⁷、0.6x 10⁷、0.7x10⁷、0.8x 10⁷、0.9x 10⁷或1.0x 10⁷个细胞/体重kg。在一些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量为约0.2x 10⁶至约5.0x 10⁶个细胞/体重kg。在某些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量在高于约0.2x 10⁶至约5.0x 10⁶个细胞/体重kg的范围内。在一些实施方案中，单一治疗有效剂量或临床有效剂量为约10ml至50ml的体积。在一些实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量静脉内施用。

在一些实施方案中，细胞以单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，所述剂量对于超过50kg的受试者为约1.0x 10⁶至约5.0x 10⁸个细胞(诸如原代T细胞和从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞)。在一些实施方案中，药物组合物作为单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，所述剂量对于50kg或更轻的受试者为约0.5x 10⁶至约1.0x 10⁹、约1.0x10⁶至约1.0x 10⁹、约1.0x 10⁶至约1.0x 10⁹、约5.0x 10⁶至约1.0x 10⁹、约1.0x 10⁷至约1.0x 10⁹、约5.0x 10⁷至约1.0x 10⁹、约1.0x 10⁶至约5.0x 10⁷、约1.0x 10⁶至约1.0x 10⁷、约1.0x 10⁶至约5.0x 10⁷、约1.0x 10⁷至约5.0x 10⁸、约2.0x 10⁷至约5.0x 10⁸、约3.0x 10⁷至约5.0x 10⁸、约4.0x 10⁷至约5.0x 10⁸、约5.0x 10⁷至约5.0x 10⁸、约6.0x 10⁷至约5.0x10⁸、约7.0x 10⁷至约5.0x 10⁸、约8.0x 10⁷至约5.0x 10⁸或约9.0x 10⁷至约5.0x 10⁸个细胞/体重kg。在一些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量为1.0x 10⁶、1.1x 10⁶、1.2x 10⁶、1.3x 10⁶、1.4x 10⁶、1.5x 10⁶、1.6x 10⁶、1.7x 10⁶、1.8x10⁶、1.9x 10⁶、2.0x 10⁶、2.1x 10⁶、2.2x 10⁶、2.3x 10⁶、2.4x 10⁶、2.5x 10⁶、2.6x 10⁶、2.7x10⁶、2.8x 10⁶、2.9x 10⁶、3.0x 10⁶、3.1x 10⁶、3.2x 10⁶、3.3x 10⁶、3.4x 10⁶、3.5x 10⁶、3.6x10⁶、3.7x 10⁶、3.8x 10⁶、3.9x 10⁶、4.0x 10⁶、4.1x 10⁶、4.2x 10⁶、4.3x 10⁶、4.4x 10⁶、4.5x10⁶、4.6x 10⁶、4.7x 10⁶、4.8x 10⁶、4.9x 10⁶、5.0x 10⁶、5.1x 10⁶、5.2x 10⁶、5.3x 10⁶、5.4x10⁶、5.5x 10⁶、5.6x 10⁶、5.7x 10⁶、5.8x 10⁶、5.9x 10⁶、6.0x 10⁶、6.1x 10⁶、6.2x 10⁶、6.3x10⁶、6.4x 10⁶、6.5x 10⁶、6.6x 10⁶、6.7x 10⁶、6.8x 10⁶、6.9x 10⁶、7.0x 10⁶、7.1x 10⁶、7.2x10⁶、7.3x 10⁶、7.4x 10⁶、7.5x 10⁶、7.6x 10⁶、7.7x 10⁶、7.8x 10⁶、7.9x 10⁶、8.0x 10⁶、8.1x10⁶、8.2x 10⁶、8.3x 10⁶、8.4x 10⁶、8.5x 10⁶、8.6x 10⁶、8.7x 10⁶、8.8x 10⁶、8.9x 10⁶、9.0x10⁶、9.1x 10⁶、9.2x 10⁶、9.3x 10⁶、9.4x 10⁶、9.5x 10⁶、9.6x 10⁶、9.7x 10⁶、9.8x 10⁶、9.9x10⁶、1.0x 10⁷、1.1x 10⁷、1.2x 10⁷、1.3x 10⁷、1.4x 10⁷、1.5x 10⁷、1.6x 10⁷、1.7x 10⁷、1.8x10⁷、1.9x 10⁷、2.0x 10⁷、2.1x 10⁷、2.2x 10⁷、2.3x 10⁷、2.4x 10⁷、2.5x 10⁷、2.6x 10⁷、2.7x10⁷、2.8x 10⁷、2.9x 10⁷、3.0x 10⁷、3.1x 10⁷、3.2x 10⁷、3.3x 10⁷、3.4x 10⁷、3.5x 10⁷、3.6x10⁷、3.7x 10⁷、3.8x 10⁷、3.9x 10⁷、4.0x 10⁷、4.1x 10⁷、4.2x 10⁷、4.3x 10⁷、4.4x 10⁷、4.5x10⁷、4.6x 10⁷、4.7x 10⁷、4.8x 10⁷、4.9x 10⁷、5.0x 10⁷、5.1x 10⁷、5.2x 10⁷、5.3x 10⁷、5.4x10⁷、5.5x 10⁷、5.6x 10⁷、5.7x 10⁷、5.8x 10⁷、5.9x 10⁷、6.0x 10⁷、6.1x 10⁷、6.2x 10⁷、6.3x10⁷、6.4x 10⁷、6.5x 10⁷、6.6x 10⁷、6.7x 10⁷、6.8x 10⁷、6.9x 10⁷、7.0x 10⁷、7.1x 10⁷、7.2x10⁷、7.3x 10⁷、7.4x 10⁷、7.5x 10⁷、7.6x 10⁷、7.7x 10⁷、7.8x 10⁷、7.9x 10⁷、8.0x 10⁷、8.1x10⁷、8.2x 10⁷、8.3x 10⁷、8.4x 10⁷、8.5x 10⁷、8.6x 10⁷、8.7x 10⁷、8.8x 10⁷、8.9x 10⁷、9.0x10⁷、9.1x 10⁷、9.2x 10⁷、9.3x 10⁷、9.4x 10⁷、9.5x 10⁷、9.6x 10⁷、9.7x 10⁷、9.8x 10⁷、9.9x10⁷、1.0x 10⁸、1.1x 10⁸、1.2x 10⁸、1.3x 10⁸、1.4x 10⁸、1.5x 10⁸、1.6x 10⁸、1.7x 10⁸、1.8x10⁸、1.9x 10⁸、2.0x 10⁸、2.1x 10⁸、2.2x 10⁸、2.3x 10⁸、2.4x 10⁸、2.5x 10⁸、2.6x 10⁸、2.7x10⁸、2.8x 10⁸、2.9x 10⁸、3.0x 10⁸、3.1x 10⁸、3.2x 10⁸、3.3x 10⁸、3.4x 10⁸、3.5x 10⁸、3.6x10⁸、3.7x 10⁸、3.8x 10⁸、3.9x 10⁸、4.0x 10⁸、4.1x 10⁸、4.2x 10⁸、4.3x 10⁸、4.4x 10⁸、4.5x10⁸、4.6x 10⁸、4.7x 10⁸、4.8x 10⁸、4.9x 10⁸或5.0x10⁸细胞/体重kg。在某些实施方案中，细胞以单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，所述剂量对于超过50kg的受试者为约1.0x10⁷至约2.5x 10⁸个细胞。在一些实施方案中，细胞以单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，对于超过50kg的受试者，所述剂量的范围小于约1.0x 10⁷至约2.5x 10⁸个细胞。在一些实施方案中，细胞以单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，对于超过50kg的受试者，所述剂量的范围高于约1.0x 10⁷至约2.5x 10⁸个细胞。在一些实施方案中，剂量静脉内施用。在一些实施方案中，单一治疗有效剂量或临床有效剂量为约10ml至50ml的体积。在一些实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量静脉内施用。

在一些实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量以约1至50ml/分钟、1至40ml/分钟、1至30ml/分钟、1至20ml/分钟、10至20ml/分钟、10至30ml/分钟、10至40ml/分钟、10至50ml/分钟、20至50ml/分钟、30至50ml/分钟、40至50ml/分钟的速率静脉内施用。在多个实施方案中，药物组合物储存在一个或多个输液袋中用于静脉内施用。在一些实施方案中，剂量以不超过10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、240分钟或300分钟完全施用。

在一些实施方案中，单一治疗有效剂量或临床有效剂量的药物组合物存在于单个输液袋中。在其他实施方案中，将单一治疗有效剂量或临床有效剂量的药物组合物分成2、3、4或5个单独的输液袋。

在一些实施方案中，本文所述的细胞以多个剂量(诸如2、3、4、5、6或更多个剂量)施用，其中多个剂量一起构成治疗有效剂量或临床有效剂量方案。在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔1至24小时的范围施用至受试者。在一些情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1小时至约24小时(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或约24小时)施用。在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔约1天至28天的范围施用至受试者。在一些情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1天至约28天(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或约28天)施用。在某些实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔1周至约6周的范围施用至受试者。在某些情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1周至约6周(例如，约1、2、3、4、5或6周)施用。在若干实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔约1个月至约12个月的范围施用至受试者。在若干种情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1个月至约12个月(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)施用。

在一些实施方案中，在第一时间点向受试者施用第一剂量方案，然后随后在第二时间点向受试者施用第二剂量方案。在一些实施方案中，第一剂量方案与第二剂量方案相同。在其他实施方案中，第一剂量方案与第二剂量方案不同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案中的细胞数量相同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案中的细胞数量不同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案的剂量数相同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案的剂量数不同。

在一些实施方案中，第一剂量方案包括表达第一CAR的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞，并且第二剂量方案包括表达第二CAR的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞，使得第一CAR和第二CAR不同。例如，第一CAR和第二CAR结合不同的靶抗原。在一些情况下，第一CAR包括结合抗原的scFv，而第二CAR包括结合不同抗原的scFv。在一些实施方案中，第一剂量方案包括表达第一CAR的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞，并且第二剂量方案包括表达第二CAR的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞，使得第一CAR和第二CAR相同。第一剂量方案可以与第二剂量方案间隔至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1-3个月、1-6个月、4-6个月、3-9个月、3-12个月或更多个月施用至受试者。在一些实施方案中，在疾病(例如，癌症)过程期间向受试者施用多个剂量方案，并且所述剂量方案中的至少两个包含相同类型的本文所述的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞。在其他实施方案中，多个剂量方案中的至少两个包含不同类型的本文所述的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞。

在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性(CD19)CAR-T细胞以约50x 10⁶至约110x 10⁶(例如，50x 10⁶、51x 10⁶、52x 10⁶、53x 10⁶、54x 10⁶、55x 10⁶、56x 10⁶、57x 10⁶、58x 10⁶、59x 10⁶、60x 10⁶、61x 10⁶、62x 10⁶、63x 10⁶、64x 10⁶、65x 10⁶、66x 10⁶、67x 10⁶、68x 10⁶、69x 10⁶、70x 10⁶、71x 10⁶、72x 10⁶、73x 10⁶、74x 10⁶、75x 10⁶、76x 10⁶、77x 10⁶、78x 10⁶、79x 10⁶、80x 10⁶、81x 10⁶、82x 10⁶、83x 10⁶、84x 10⁶、85x 10⁶、86x 10⁶、87x 10⁶、88x 10⁶、89x 10⁶、90x 10⁶、91x 10⁶、92x 10⁶、93x 10⁶、94x 10⁶、95x 10⁶、96x 10⁶、97x 10⁶、98x 10⁶、99x 10⁶、100x 10⁶、101x 10⁶、102x 10⁶、103x 10⁶、104x 10⁶、105x 10⁶、106x 10⁶、107x 10⁶、108x 10⁶、109x 10⁶或110x 10⁶)个活CD19特异性CAR-T细胞的剂量施用至受试者。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，活CD19特异性CAR-T细胞包括表达CD19特异性CAR的CD4+ T细胞和表达CD19特异性CAR的CD8+ T细胞，其比例为约1:1。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是利基迈仑赛其结构等同物或其功能等同物。

在一些实施方案中，向受试者施用约50x 10⁶至约110x 10⁶(例如，50x 10⁶、51x10⁶、52x 10⁶、53x 10⁶、54x 10⁶、55x 10⁶、56x 10⁶、57x 10⁶、58x 10⁶、59x 10⁶、60x 10⁶、61x10⁶、62x 10⁶、63x 10⁶、64x 10⁶、65x 10⁶、66x 10⁶、67x 10⁶、68x 10⁶、69x 10⁶、70x 10⁶、71x10⁶、72x 10⁶、73x 10⁶、74x 10⁶、75x 10⁶、76x 10⁶、77x 10⁶、78x 10⁶、79x 10⁶、80x 10⁶、81x10⁶、82x 10⁶、83x 10⁶、84x 10⁶、85x 10⁶、86x 10⁶、87x 10⁶、88x 10⁶、89x 10⁶、90x 10⁶、91x10⁶、92x 10⁶、93x 10⁶、94x 10⁶、95x 10⁶、96x 10⁶、97x 10⁶、98x 10⁶、99x 10⁶、100x 10⁶、101x 10⁶、102x 10⁶、103x 10⁶、104x 10⁶、105x 10⁶、106x 10⁶、107x 10⁶、108x 10⁶、109x 10⁶或110x 10⁶)个本文所述的活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些情况下，50％的活CD19特异性CAR-T细胞是表达CD19特异性CAR的CD4+ T细胞，并且50％的活CD19特异性CAR-T细胞是表达CD19特异性CAR的CD8+ T细胞。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是利基迈仑赛其结构等同物或其功能等同物。

在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞以约2x 10⁶个/体重kg的剂量施用至受试者。在一些实施方案中，施用的最大剂量是约2x 10⁸个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是与阿基仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。

在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞以约2x 10⁶个/体重kg的剂量施用至受试者。在一些实施方案中，将最大剂量的约2x 10⁸个活CD19特异性CAR-T细胞施用至体重约100kg和更重的患者。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是与布瑞基奥仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。

在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞以至多约2x 10⁸个活CD19特异性CAR-T细胞的剂量施用至受试者。在一些实施方案中，对于体重约50kg或更轻的受试者，向受试者施用约0.2x 10⁶至约5.0x 10⁶(例如，约0.2x 10⁶、0.4x 10⁶、0.5x 10⁶、0.6x10⁶、0.8x 10⁶、0.9x 10⁶、1.0x 10⁶、1.2x 10⁶、1.4x 10⁶、1.5x 10⁶、1.6x 10⁶、1.8x 10⁶、1.9x10⁶、2.0x 10⁶、2.2x 10⁶、2.4x 10⁶、2.5x 10⁶、2.6x 10⁶、2.8x 10⁶、2.9x 10⁶、3.0x 10⁶、3.2x10⁶、3.4x 10⁶、3.5x 10⁶、3.6x 10⁶、3.8x 10⁶、3.9x 10⁶、4.0x 10⁶、4.2x 10⁶、4.4x 10⁶、4.5x10⁶、4.6x 10⁶、4.8x 10⁶、4.9x 10⁶或5.0x 10⁶)个活CD19特异性CAR-T细胞/体重kg。在一些实施方案中，对于体重大于约50kg的受试者，向受试者施用约0.1x 10⁸至约2.5x 10⁸(例如，约0.1x 10⁶、0.2x 10⁶、0.4x 10⁶、0.5x 10⁶、0.6x 10⁶、0.8x 10⁶、0.9x 10⁶、1.0x 10⁶、1.2x10⁶、1.4x 10⁶、1.5x 10⁶、1.6x 10⁶、1.8x 10⁶、1.9x 10⁶、2.0x 10⁶、2.2x 10⁶、2.4x 10⁶或2.5x 10⁶)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约0.6x 10⁸至约6.0x 10⁸(例如，约0.6x 10⁸、0.8x 10⁸、0.9x 10⁸、1.0x 10⁸、1.2x 10⁸、1.4x 10⁸、1.5x 10⁸、1.6x 10⁸、1.8x 10⁸、1.9x 10⁸、2.0x 10⁸、2.2x 10⁸、2.4x 10⁸、2.5x 10⁸、2.6x 10⁸、2.8x10⁸、2.9x 10⁸、3.0x 10⁸、3.2x 10⁸、3.4x 10⁸、3.5x 10⁸、3.6x 10⁸、3.8x 10⁸、3.9x 10⁸、4.0x10⁸、4.2x 10⁸、4.4x 10⁸、4.5x 10⁸、4.6x 10⁸、4.8x 10⁸、4.9x 10⁸、5.0x 10⁸、5.2x 10⁸、5.4x10⁸、5.5x 10⁸、5.6x 10⁸、5.8x 10⁸、5.9x 10⁸或6.0x 10⁸)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是与替沙仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。

在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约50x10⁶至约110x 10⁶(例如，50x 10⁶、51x 10⁶、52x 10⁶、53x 10⁶、54x 10⁶、55x 10⁶、56x 10⁶、57x10⁶、58x 10⁶、59x 10⁶、60x 10⁶、61x 10⁶、62x 10⁶、63x 10⁶、64x 10⁶、65x 10⁶、66x 10⁶、67x10⁶、68x 10⁶、69x 10⁶、70x 10⁶、71x 10⁶、72x 10⁶、73x 10⁶、74x 10⁶、75x 10⁶、76x 10⁶、77x10⁶、78x 10⁶、79x 10⁶、80x 10⁶、81x 10⁶、82x 10⁶、83x 10⁶、84x 10⁶、85x 10⁶、86x 10⁶、87x10⁶、88x 10⁶、89x 10⁶、90x 10⁶、91x 10⁶、92x 10⁶、93x 10⁶、94x 10⁶、95x 10⁶、96x 10⁶、97x10⁶、98x 10⁶、99x 10⁶、100x 10⁶、101x 10⁶、102x 10⁶、103x 10⁶、104x 10⁶、105x 10⁶、106x10⁶、107x 10⁶、108x 10⁶、109x 10⁶或110x 10⁶)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，活CD19特异性CAR-T细胞包括表达CD19特异性CAR的CD4+ T细胞和表达CD19特异性CAR的CD8+ T细胞，其比例为约1:1。在一些实施方案中，CD19特异性CAR是与利基迈仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。

在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约2x10⁸个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，本文描述的任何CD19特异性CAR-T细胞的单个输液袋包括约68mL的细胞悬浮液中的约2x 10⁸个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，CD19特异性CAR是与阿基仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。

在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约2x10⁸个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，本文描述的任何CD19特异性CAR-T细胞的单个输液袋包括约68mL的细胞悬浮液中的约2x 10⁸个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，CD19特异性CAR是与布瑞基奥仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。

在一些实施方案中，对于体重50kg或更轻的受试者，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约0.2x 10⁶至约5.0x10⁶(例如，约0.2x 10⁶、0.3x 10⁶、0.4x 10⁶、0.5x 10⁶、0.6x 10⁶、0.7x 10⁶、0.8x 10⁶、0.9x 10⁶、1.0x 10⁶、1.1x 10⁶、1.2x 10⁶、1.3x10⁶、1.4x 10⁶、1.5x 10⁶、1.6x 10⁶、1.7x 10⁶、1.8x 10⁶、1.9x 10⁶、2.0x 10⁶、2.1x 10⁶,2.2x10⁶、2.3x 10⁶、2.4x 10⁶、2.5x 10⁶、2.6x 10⁶、2.7x 10⁶、2.8x 10⁶、2.9x 10⁶、3.0x 10⁶、3.1x10⁶、3.2x 10⁶、3.3x 10⁶、3.4x 10⁶、3.5x 10⁶、3.6x 10⁶、3.7x 10⁶、3.8x 10⁶、3.9x 10⁶、4.0x10⁶、4.1x 10⁶、4.2x 10⁶、4.3x 10⁶、4.4x 10⁶、4.5x 10⁶、4.6x 10⁶、4.7x 10⁶、4.8x 10⁶、4.9x10⁶或5.0x 10⁶)个活CD19特异性CAR-T细胞/体重kg。在一些实施方案中，对于体重大于50kg的受试者，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约0.1x 10⁸至约2.5x 10⁸(例如，约0.1x 10⁶、0.2x 10⁶、0.3x 10⁶、0.4x 10⁶、0.5x 10⁶、0.6x 10⁶、0.7x 10⁶、0.8x 10⁶、0.9x 10⁶、1.0x 10⁶、1.1x 10⁶、1.2x 10⁶、1.3x 10⁶、1.4x 10⁶、1.5x 10⁶、1.6x 10⁶、1.7x10⁶、1.8x 10⁶、1.9x 10⁶、2.0x 10⁶、2.1x 10⁶、2.2x 10⁶、2.3x 10⁶、2.4x 10⁶或2.5x 10⁶)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约0.6x 10⁸至约6.0x 10⁸(例如，约0.6x 10⁸、0.7x10⁸、0.8x 10⁸、0.9x 10⁸、1.0x10⁸、1.1x 10⁸,1.2x 10⁸、1.3x 10⁸、1.4x 10⁸、1.5x 10⁸、1.6x 10⁸、1.7x 10⁸、1.8x 10⁸、1.9x10⁸、2.0x 10⁸、2.1x 10⁸、2.2x 10⁸、2.3x 10⁸、2.4x 10⁸、2.5x 10⁸、2.6x 10⁸、2.7x 10⁸、2.8x10⁸、2.9x 10⁸、3.0x 10⁸、3.1x 10⁸、3.2x 10⁸、3.3x 10⁸、3.4x 10⁸、3.5x 10⁸、3.6x 10⁸、3.7x10⁸、3.8x 10⁸、3.9x 10⁸、4.0x 10⁸、4.1x 10⁸、4.2x 10⁸、4.3x 10⁸、4.4x 10⁸、4.5x 10⁸、4.6x10⁸、4.7x 10⁸、4.8x 10⁸、4.9x 10⁸、5.0x 10⁸、5.1x 10⁸、5.2x 10⁸、5.3x 10⁸、5.4x 10⁸、5.5x10⁸、5.6x 10⁸、5.7x 10⁸、5.8x 10⁸、5.9x 10⁸或6.0x 10⁸)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞的单个输液袋包含约10mL至约50mL的细胞悬浮液中的约0.6x 10⁸至约6.0x 10⁸(例如，约0.6x 10⁸、0.7x 10⁸、0.8x 10⁸、0.9x10⁸、1.0x 10⁸、1.1x 10⁸、1.2x 10⁸、1.3x 10⁸、1.4x 10⁸、1.5x 10⁸、1.6x 10⁸、1.7x 10⁸、1.8x10⁸、1.9x 10⁸、2.0x 10⁸、2.1x 10⁸、2.2x 10⁸、2.3x 10⁸、2.4x 10⁸、2.5x 10⁸、2.6x 10⁸、2.7x10⁸、2.8x 10⁸、2.9x 10⁸、3.0x 10⁸、3.1x 10⁸、3.2x 10⁸、3.3x 10⁸、3.4x 10⁸、3.5x 10⁸、3.6x10⁸、3.7x 10⁸、3.8x 10⁸、3.9x 10⁸、4.0x 10⁸、4.1x 10⁸、4.2x 10⁸、4.3x 10⁸、4.4x 10⁸、4.5x10⁸、4.6x 10⁸、4.7x 10⁸、4.8x 10⁸、4.9x 10⁸、5.0x 10⁸、5.1x 10⁸、5.2x 10⁸、5.3x 10⁸、5.4x10⁸、5.5x 10⁸、5.6x 10⁸、5.7x 10⁸、5.8x 10⁸、5.9x 10⁸或6.0x 10⁸)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是与替沙仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。

在一些实施方案中，本文所述的BCMA特异性(BCMA)CAR-T细胞以约250x 10⁶至约500x 10⁶(例如，250x 10⁶、255x 10⁶、260x10⁶、265x 10⁶、270x 10⁶、275x 10⁶、280x 10⁶、285x10⁶、290x 10⁶、295x 10⁶、300x 10⁶、305x 10⁶、310x 10⁶、315x 10⁶、320x 10⁶、325x 10⁶、330x10⁶、335x 10⁶、340x 10⁶、345x 10⁶、350x 10⁶、355x 10⁶、360x 10⁶、365x 10⁶、370x 10⁶、375x10⁶、380x 10⁶、385x 10⁶、390x 10⁶、395x 10⁶、400x 10⁶、405x 10⁶、410x 10⁶、415x 10⁶、420x10⁶、425x 10⁶、430x 10⁶、435x 10⁶、440x 10⁶、445x 10⁶、450x 10⁶、455x 10⁶、460x 10⁶、465x10⁶、470x 10⁶、475x 10⁶、480x 10⁶、485x 10⁶、490x 10⁶、495x 10⁶或500x 10⁶)个活BCMA特异性CAR-T细胞的剂量施用至受试者。在一些实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，活BCMA特异性CAR-T细胞包括表达BCMA特异性CAR的CD4+ T细胞和表达BCMA特异性CAR的CD8+ T细胞,其比例为约1:1。在一些实施方案中，细胞的BCMA特异性CAR是艾基维仑赛其结构等同物或其功能等同物。

在一些实施方案中，向受试者施用约250x 10⁶至约500x 10⁶(例如，250x 10⁶、255x10⁶、260x 10⁶、265x 10⁶、270x 10⁶、275x 10⁶、280x 10⁶、285x 10⁶、290x 10⁶、295x 10⁶、300x10⁶、305x 10⁶、310x 10⁶、315x 10⁶、320x 10⁶、325x 10⁶、330x 10⁶、335x 10⁶、340x 10⁶、345x10⁶、350x 10⁶、355x 10⁶、360x 10⁶、365x 10⁶、370x 10⁶、375x 10⁶、380x 10⁶、385x 10⁶、390x10⁶、395x 10⁶、400x 10⁶、405x 10⁶、410x 10⁶、415x 10⁶、420x 10⁶、425x 10⁶、430x 10⁶、435x10⁶、440x 10⁶、445x 10⁶、450x 10⁶、455x 10⁶、460x 10⁶、465x 10⁶、470x 10⁶、475x 10⁶、480x10⁶、485x 10⁶、490x 10⁶、495x 10⁶或500x 10⁶)个本文所述的活BCMA特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些情况下，50％的活BCMA特异性CAR-T细胞是表达BCMA特异性CAR的CD4+ T细胞，并且50％的活BCMA特异性CAR-T细胞是表达BCMA特异性CAR的CD8+ T细胞。在一些实施方案中，细胞的BCMA特异性CAR是艾基维仑赛其结构等同物或其功能等同物。

在一些实施方案中，本文所述的BCMA特异性CAR-T细胞以至多约5x 10⁸个活BCMA特异性CAR-T细胞的剂量施用至受试者。在一些实施方案中，向受试者施用约2.5x 10⁸至约5.0x 10⁸(例如，约0.2x 10⁸、0.4x 10⁸、0.5x 10⁸、0.6x 10⁸、0.8x 10⁸、0.9x 10⁸、1.0x 10⁸、1.2x 10⁸、1.4x 10⁸、1.5x 10⁸、1.6x 10⁸、1.8x 10⁸、1.9x 10⁸、2.0x 10⁸、2.2x 10⁸、2.4x10⁸、2.5x 10⁸、2.6x 10⁸、2.8x 10⁸、2.9x 10⁸、3.0x 10⁸、3.2x 10⁸、3.4x 10⁸、3.5x 10⁸、3.6x10⁸、3.8x 10⁸、3.9x 10⁸、4.0x 10⁸、4.2x 10⁸、4.4x 10⁸、4.5x 10⁸、4.6x 10⁸、4.8x 10⁸、4.9x10⁸或5.0x10⁸)个活BCMA特异性CAR-T细胞/体重kg。在一些实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的BCMA特异性CAR是与艾基维仑赛相同的BCMA特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。

在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何BCMA特异性CAR-T细胞包括约250x10⁶至约500x 10⁶(例如，250x 10⁶、255x10⁶、260x 10⁶、265x 10⁶、270x 10⁶、275x 10⁶、280x10⁶、285x 10⁶、290x 10⁶、295x 10⁶、300x 10⁶、305x 10⁶、310x 10⁶、315x 10⁶、320x 10⁶、325x10⁶、330x 10⁶、335x 10⁶、340x 10⁶、345x 10⁶、350x 10⁶、355x 10⁶、360x 10⁶、365x 10⁶、370x10⁶、375x 10⁶、380x 10⁶、385x 10⁶、390x 10⁶、395x 10⁶、400x 10⁶、405x 10⁶、410x 10⁶、415x10⁶、420x 10⁶、425x 10⁶、430x 10⁶、435x 10⁶、440x 10⁶、445x 10⁶、450x 10⁶、455x 10⁶、460x10⁶、465x 10⁶、470x 10⁶、475x 10⁶、480x 10⁶、485x 10⁶、490x 10⁶、495x 10⁶或500x 10⁶)个活BCMA特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，活BCMA特异性CAR-T细胞包括表达BCMA特异性CAR的CD4+ T细胞和表达BCMA特异性CAR的CD8+ T细胞,其比例为约1:1。在一些实施方案中，BCMA特异性CAR是与艾基维仑赛相同的BCMA特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。

在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何BCMA特异性CAR-T细胞包括约250x10⁶至约500x 10⁶(例如，250x 10⁶、255x10⁶、260x 10⁶、265x 10⁶、270x 10⁶、275x 10⁶、280x10⁶、285x 10⁶、290x 10⁶、295x 10⁶、300x 10⁶、305x 10⁶、310x 10⁶、315x 10⁶、320x 10⁶、325x10⁶、330x 10⁶、335x 10⁶、340x 10⁶、345x 10⁶、350x 10⁶、355x 10⁶、360x 10⁶、365x 10⁶、370x10⁶、375x 10⁶、380x 10⁶、385x 10⁶、390x 10⁶、395x 10⁶、400x 10⁶、405x 10⁶、410x 10⁶、415x10⁶、420x 10⁶、425x 10⁶、430x 10⁶、435x 10⁶、440x 10⁶、445x 10⁶、450x 10⁶、455x 10⁶、460x10⁶、465x 10⁶、470x 10⁶、475x 10⁶、480x 10⁶、485x 10⁶、490x 10⁶、495x 10⁶或500x 10⁶)个活BCMA特异性CAR-T细胞/体重kg。在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何BCMA特异性CAR-T细胞包括约2.5x 10⁸至约5.0x 10⁸(例如，约0.2x 10⁸、0.4x 10⁸、0.5x 10⁸、0.6x10⁸、0.8x 10⁸、0.9x 10⁸、1.0x 10⁸、1.2x 10⁸、1.4x 10⁸、1.5x 10⁸、1.6x 10⁸、1.8x 10⁸、1.9x10⁸、2.0x 10⁸、2.2x 10⁸、2.4x 10⁸、2.5x 10⁸、2.6x 10⁸、2.8x 10⁸、2.9x 10⁸、3.0x 10⁸、3.2x10⁸、3.4x 10⁸、3.5x 10⁸、3.6x 10⁸、3.8x 10⁸、3.9x 10⁸、4.0x 10⁸、4.2x 10⁸、4.4x 10⁸、4.5x10⁸、4.6x 10⁸、4.8x 10⁸、4.9x 10⁸或5.0x 10⁸)个活BCMA特异性CAR-T细胞/体重kg。在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何BCMA特异性CAR-T细胞包括约2.5x 10⁸至约5.0x10⁸(例如，约0.2x 10⁸、0.4x 10⁸、0.5x 10⁸、0.6x 10⁸、0.8x 10⁸、0.9x 10⁸、1.0x 10⁸、1.2x 10⁸、1.4x 10⁸、1.5x 10⁸、1.6x 10⁸、1.8x 10⁸、1.9x 10⁸、2.0x 10⁸、2.2x 10⁸、2.4x 10⁸、2.5x10⁸、2.6x 10⁸、2.8x 10⁸、2.9x 10⁸、3.0x 10⁸、3.2x 10⁸、3.4x 10⁸、3.5x 10⁸、3.6x 10⁸、3.8x10⁸、3.9x 10⁸、4.0x 10⁸、4.2x 10⁸、4.4x 10⁸、4.5x 10⁸、4.6x 10⁸、4.8x 10⁸、4.9x 10⁸或5.0x 10⁸)个活BCMA特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，本文所述的任何BCMA特异性CAR-T细胞的单个输注袋包含约10mL至约500mL的细胞悬浮液中的约2.5x 10⁸至约5.0x 10⁸(例如，约0.2x 10⁸、0.4x 10⁸、0.5x 10⁸、0.6x 10⁸、0.8x 10⁸、0.9x 10⁸、1.0x 10⁸、1.2x 10⁸、1.4x 10⁸、1.5x 10⁸、1.6x 10⁸、1.8x 10⁸、1.9x 10⁸、2.0x 10⁸、2.2x 10⁸、2.4x 10⁸、2.5x10⁸、2.6x 10⁸、2.8x 10⁸、2.9x 10⁸、3.0x 10⁸、3.2x 10⁸、3.4x 10⁸、3.5x 10⁸、3.6x 10⁸、3.8x10⁸、3.9x 10⁸、4.0x 10⁸、4.2x 10⁸、4.4x 10⁸、4.5x 10⁸、4.6x 10⁸、4.8x 10⁸、4.9x 10⁸或5.0x 10⁸)个活BCMA特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，细胞悬浮液为约50mL、250mL或约500mL。在一些实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的BCMA特异性CAR是与艾基维仑赛相同的BCMA特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。

II.用于施用低免疫原性细胞(包括T细胞)的方法

如本文进一步详细描述的，本文提供了通过施用低免疫原性细胞(特别是低免疫原性T细胞)来治疗患有疾患、病症或病症的患者的方法。应当理解，对于本文所述的与疗法的时间安排和/或组合相关的所有多个实施方案，细胞的施用是通过导致所引入的细胞至少部分定位于期望部位的方法或途径来完成的。可以将细胞直接输注、植入或移植到期望的部位，或通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者的期望位置，植入的细胞或细胞组分中的至少一部分在所述位置中保持活性。

本文提供了用于治疗患有疾患、病症或病症的患者的方法，其包括向受试者(例如人类患者)施用低免疫原性细胞群(例如，原代T细胞、从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞，或从本文所述低免疫原性诱导性多能干细胞分化的其他细胞)。例如，向患者施用低免疫原性原代T细胞群，诸如但不限于CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、未致敏T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型，以治疗疾患、病症或病症。在一些实施方案中，在施用低免疫原性细胞群之前，不向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂(诸如但不限于淋巴细胞清除剂)。在一些实施方案中，在施用细胞前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在施用细胞前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在多个实施方案中，在施用细胞后不向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂，或者在施用细胞后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在施用细胞后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在施用细胞之前或之后向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂，施用的剂量低于具有一种或多种MHC I和/或MHC II分子表达且不具有CD47的外源表达的细胞所需的剂量。

免疫抑制剂和/或免疫调节剂(诸如但不限于淋巴细胞耗竭剂)的非限制性实例包括环孢菌素(cyclosporine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、麦考酚酸(mycophenolic acid)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、皮质类固醇，诸如泼尼松(prednisone)、甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、抗疟药、布喹那(brequinar)、来氟米特(leflunomide)、咪唑立宾(mizoribine)、15-脱氧精胍菌素、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素(rapamycin)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、OKT3、抗胸腺细胞球蛋白、胸腺五肽、胸腺肽-α和类似剂。在一些实施方案中，免疫抑制剂和/或免疫调节剂选自由以下各项组成的免疫抑制抗体组：与IL-2受体的p75结合的抗体、与例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-6、IGF、IGFR1、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a或CD58结合的抗体、以及与其任何配体结合的抗体。在一些实施方案中，这种免疫抑制剂和/或免疫调节剂可选自可溶性IL-15R、IL-10、B7分子(例如，B7-1、B7-2、其变体及其片段)、ICOS和OX40、负性T细胞调控子的抑制剂(诸如针对CTLA-4的抗体)和相似的药剂。

在一些实施方案中，在施用细胞之前或之后向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂，施用的剂量低于具有一种或多种MHC I和/或MHC II分子表达、TCR表达且不具有CD47的外源表达的细胞所需的剂量。在一些实施方案中，在第一次施用细胞之前或之后向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂，施用的剂量低于具有一种或多种MHC I和MHC II表达、TCR表达且不具有CD47的外源表达的细胞所需的剂量。

在一些实施方案中，将所述细胞与治疗剂共同施用，所述治疗剂与选自由以下各项组成的组的一种或多种受体结合和/或相互作用：CD94、KIR2DL4、PD-1、抑制性NK细胞受体和活化NK受体。在一些情况下，治疗剂与NK细胞(包括NK细胞的一个或多个亚群)表面的受体结合。在一些实施方案中，治疗剂选自由以下各项组成的组：抗体及其片段和变体、抗体模拟物、小分子、阻断肽和受体拮抗剂。

对于治疗应用，根据所公开的方法制备的细胞通常可以以包含等渗赋形剂的药物组合物的形式提供，并且在对人体施用足够无菌的条件下制备。有关细胞组合物的药物配制的一般原则，参见“Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,andCellular Immunotherapy,”Morstyn&Sheridan编辑,Cambridge University Press,1996；以及“Hematopoietic Stem Cell Therapy,”E.D.Ball,J.Lister&P.Law,ChurchillLivingstone,2000。可以将细胞包装在适合分配或临床使用的装置或容器中。

在一些实施方案中，本文所述的细胞禁忌用于已知对鼠科动物蛋白、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞蛋白或本文所述的组合物的任何组分具有I型超敏反应或过敏反应的患者。在一些实施方案中，本文所述的细胞禁忌用于患有或已经患有进行性多灶性白质脑病(PML)的患者。在一些实施方案中，本文所述的细胞不推荐用于患有严重的活动性感染的患者。

在一些实施方案中，将本文所述的细胞施用至先前已经用利妥昔单抗治疗的患有自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症的受试者。在一些实施方案中，将本文所述的细胞施用至先前已经用利妥昔单抗治疗并且治疗失败和/或对利妥昔单抗无响应的患有自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症的受试者。在一些实施方案中，患者患有类风湿性关节炎(RA)。在一些实施方案中，患者患有RA并且利妥昔单抗治疗与甲氨蝶呤组合。在一些实施方案中，患者是患有中度至重度活动性RA的成年患者。在一些实施方案中，患者是患有中度至重度活动性RA的成年患者，并且利妥昔单抗治疗与甲氨蝶呤组合。在一些实施方案中，患者是患有中度至重度活动性RA的成年患者，其对一种或多种TNF拮抗剂疗法响应不足，并且利妥昔单抗治疗与甲氨蝶呤组合。在一些实施方案中，与甲氨蝶呤组合的用于RA的利妥昔单抗剂量是每24周间隔2周(一个疗程)和/或基于临床评估但不早于每16周两次1000mg静脉输注。在一些实施方案中，推荐在每次输注前30分钟静脉内注射甲泼尼龙100mg或等效的糖皮质激素。

在一些实施方案中，将本文所述的细胞施用至先前已经用利妥昔单抗治疗的患有自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症的受试者。在一些实施方案中，将本文所述的细胞施用至先前已经用利妥昔单抗治疗并且治疗失败和/或对利妥昔单抗无响应的患有自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症的受试者。在一些实施方案中，患者患有肉芽肿性多血管炎(GPA)(Wegener'sGranulomatosis)。在一些实施方案中，该患者患有与糖皮质激素组合的成年患者的显微镜下多血管炎(MPA)。在一些实施方案中，GPA和MPA与糖皮质激素组合的利妥昔单抗剂量为375mg/m²，每周一次，持续4周。在一些实施方案中，利妥昔单抗作为一次性小瓶中的100mg/10mL溶液施用。在一些实施方案中，利妥昔单抗作为一次性小瓶中的500mg/50mL溶液施用。

免疫抑制剂

在一些实施方案中，在第一次施用工程化原代细胞群或含有其的组合物之前，不向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。

在一些实施方案中，可以向接受工程化原代细胞施用的患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在施用工程化原代细胞之前施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在第一次和/或第二次施用工程化原代细胞之前施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。

免疫抑制剂和/或免疫调节剂的非限制性实例包括环孢菌素(cyclosporine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、麦考酚酸(mycophenolic acid)、霉酚酸酯(mycophenolatemofetil)、皮质类固醇，诸如泼尼松(prednisone)、甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、抗疟药、布喹那(brequinar)、来氟米特(leflunomide)、咪唑立宾(mizoribine)、15-脱氧精胍菌素、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素(rapamycin)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、OKT3、抗胸腺细胞球蛋白、胸腺五肽、胸腺肽-α和类似剂。在一些实施方案中，免疫抑制剂和/或免疫调节剂选自由以下各项组成的免疫抑制抗体组：与IL-2受体的p75结合的抗体、与例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-6、IGF、IGFR1、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a或CD58结合的抗体、以及与其任何配体结合的抗体。在一些实施方案中，在第一次施用细胞之前或之后向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂，施用的剂量低于具有一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达且不具有CD47的外源表达的细胞所需的剂量。

在一个实施方案中，这种免疫抑制剂和/或免疫调节剂可选自可溶性IL-15R、IL-10、B7分子(例如，B7-1、B7-2、其变体及其片段)、ICOS和OX40、负性T细胞调控子的抑制剂(诸如针对CTLA-4的抗体)和相似的药剂。

在一些实施方案中，可以在第一次施用工程化原代细胞群之前向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在第一次施用细胞前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在第一次施用细胞前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。

在具体的实施方案中，在第一次施用细胞后不向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂，或者在第一次施用细胞后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在第一次施用细胞后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。

在一些实施方案中，在施用工程化细胞群之前不向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在许多实施方案中，在第一次和/或第二次施用工程化原代细胞群之前向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在施用细胞前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在第一次和/或第二次施用细胞前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在具体的实施方案中，在施用细胞后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在第一次和/或第二次施用细胞后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。

在一些实施方案中，在第一次施用细胞之前或之后向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂，施用的剂量低于例如具有一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达且不具有CD47的外源表达的免疫原性细胞(例如相同或相似细胞类型或表型但不含有工程化原代细胞的修饰(例如遗传修饰)的细胞群)所需的剂量。

另外的实施方案

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加一种或多种致耐受因子的表达。

在一些实施方案中，本文提供了一种低免疫原性细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加一种或多种致耐受因子的表达。

在一些实施方案中，可调控修饰包括选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的可调控的敲除。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，可调控修饰包含选自B2M和CIITA的一个或多个靶标的可调控的降低的表达。

在一些实施方案中，可调控修饰包括选自B2M和CIITA的一个或多个靶标的可调控的敲除。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，i)降低选自β-2-微球蛋白(B2M)和MHC II类反式活化因子(CIITA)的一个或多个靶标的表达，以及ii)增加一种或多种致耐受因子的表达。

在一些实施方案中，本文提供了一种低免疫原性细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，i)降低选自β-2-微球蛋白(B2M)和MHC II类反式活化因子(CIITA)的一个或多个靶标的表达，以及ii)增加一种或多种致耐受因子的表达。

在一些实施方案中，细胞还包含降低或敲除一种或多种Y染色体基因的表达的可调控修饰。

在一些实施方案中，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞包含可调控修饰，所述可调控修饰降低或敲除选自Y-连接的原钙粘附蛋白-11和Y-连接的神经连接蛋白-4的一个或多个靶标的表达。

在一些实施方案中，可调控修饰包含条件性或诱导型基于RNA的组分，用于相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞降低或敲除一个或多个靶标的表达。

在一些实施方案中，可调控修饰包含条件性或诱导型基于DNA的组分，用于相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞降低或敲除一个或多个靶标的表达。

在一些实施方案中，条件性或诱导型基于DNA的组分是使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法的敲除。

在一些实施方案中，可调控修饰包含条件性或诱导型基于蛋白质的组分，用于相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞降低或敲除一个或多个靶标的表达。

在一些实施方案中，条件性或诱导型基于蛋白质的组分是条件性或诱导型降解决定子方法。

在一些实施方案中，条件性或诱导型降解决定子方法选自由使用SMASH标签的配体诱导性降解(LID)、使用Shield-1的LID、使用生长素的LID、使用雷帕霉素的LID、条件性或诱导型肽降解决定子(例如，基于IKZF3的降解决定子)和条件性或诱导型蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)组成的组。

在一些实施方案中，细胞包含与编码一种或多种致耐受因子的外源多核苷酸可操作地连接的条件性启动子。

在一些实施方案中，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的条件性启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码一种或多种致耐受因子的货物多核苷酸。

在一些实施方案中，条件性启动子是细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子或分化诱导型启动子。

在一些实施方案中，细胞包含与编码一种或多种致耐受因子的外源多核苷酸可操作地连接的诱导型启动子。

在一些实施方案中，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的诱导型启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码一种或多种致耐受因子的货物多核苷酸。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受因子选自由HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CD47、CI-抑制剂和IL-35组成的组。

在一些实施方案中，细胞包含与编码CD47的外源多核苷酸可操作地连接的条件性或诱导型启动子。

在一些实施方案中，细胞包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的CD47多肽。

在一些实施方案中，细胞包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的CD47多肽。

在一些实施方案中，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达增加量的CD47。

在一些实施方案中，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的CD47。

在一些实施方案中，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的CD47。

在一些实施方案中，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约1000％的量的CD47。

在一些实施方案中，细胞还包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞降低B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的表达的可调控修饰。

在一些实施方案中，细胞还包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞增加CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9中的一种或多种的表达的可调控修饰。

在一些实施方案中，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9。

在一些实施方案中，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9。

在一些实施方案中，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约1000％的量的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9。

在一些实施方案中，细胞源自人细胞或动物细胞。

在一些实施方案中，人细胞或动物细胞是多能干细胞。

在一些实施方案中，多能干细胞是诱导型多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)或胚胎干细胞(ESC)。

在一些实施方案中，工程化细胞或低免疫原性细胞是源自多能干细胞或其后代的分化细胞。

在一些实施方案中，分化细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、内皮细胞、胰岛细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞和甲状腺细胞组成的组。

在一些实施方案中，工程化细胞或低免疫原性细胞是原代免疫细胞或其后代。

在一些实施方案中，原代免疫细胞或其后代是T细胞或NK细胞。

在一些实施方案中，T细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。

在一些实施方案中，安全港基因座选自由CCR5基因座、PPP1R12C基因座、Rosa基因座和CLYBL基因座组成的组。

在一些实施方案中，使用慢病毒载体将第一外源多核苷酸和/或第二外源多核苷酸引入到工程化细胞或低免疫原性细胞中。

在一些实施方案中，使用融合原介导的递送或选自由以下各项组成的组的转座酶系统将第一和/或第二外源多核苷酸引入到工程化细胞或低免疫原性细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。

在一些实施方案中，分化细胞或其后代、或原代免疫细胞或其后代在施用至受体患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。

在一些实施方案中，分化细胞或其后代、或原代免疫细胞或其后代在施用至受体患者后受到保护而免于成熟NK细胞的细胞裂解。

在一些实施方案中，分化细胞或其后代、或原代免疫细胞或其后代在施用至受体患者后逃避巨噬细胞吞噬。

在一些实施方案中，分化细胞或其后代、或原代免疫细胞或其后代在施用至受体患者后不诱导对细胞的先天和/或适应性免疫响应。

在一些实施方案中，分化细胞或其后代、或原代免疫细胞或其后代在施用至受体患者后不诱导对细胞的基于抗体的免疫响应。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化细胞，其包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞增加CD47的表达的可调控修饰。

在一些实施方案中，本文提供了一种低免疫原性细胞，其包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞增加CD47的表达的可调控修饰。

在一些实施方案中，细胞包含与编码CD47的外源多核苷酸可操作地连接的条件性启动子。

在一些实施方案中，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的条件性启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码CD47的货物多核苷酸。

在一些实施方案中，细胞包含与编码CD47的外源多核苷酸可操作地连接的诱导型启动子。

在一些实施方案中，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的诱导型启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码CD47的货物多核苷酸。

在一些实施方案中，外源多核苷酸细胞包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的CD47多肽。

在一些实施方案中，细胞还包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达的可调控修饰。

在一些实施方案中，细胞包含选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的可调控的敲除。

在一些实施方案中，细胞还包含与编码一种或多种其他致耐受因子的外源多核苷酸可操作地连接的条件性启动子。

在一些实施方案中，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的条件性启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码一种或多种其他致耐受因子的货物多核苷酸。

在一些实施方案中，细胞包含与编码一种或多种其他致耐受因子的外源多核苷酸可操作地连接的诱导型启动子。

在一些实施方案中，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的诱导型启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码一种或多种其他致耐受因子的货物多核苷酸。

在一些实施方案中，细胞源自人细胞或动物细胞。

在一些实施方案中，人细胞或动物细胞是多能干细胞。

在一些实施方案中，T细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化内皮细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的内皮细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该内皮细胞源自多能干细胞或其后代。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化胰岛细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的胰岛细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该胰岛细胞源自多能干细胞或其后代。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化心肌细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的心肌细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该心肌细胞源自多能干细胞或其后代。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化平滑肌细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的平滑肌细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该平滑肌细胞源自多能干细胞或其后代。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化骨骼肌细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的骨骼肌细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该骨骼肌细胞源自多能干细胞或其后代。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化肝细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的肝细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该肝细胞源自多能干细胞或其后代。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化神经胶质祖细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的神经胶质祖细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该神经胶质祖细胞源自多能干细胞或其后代。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化多巴胺能神经元，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的多巴胺能神经元，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该多巴胺能神经元源自多能干细胞或其后代。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化视网膜色素上皮细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的视网膜色素上皮细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该视网膜色素上皮细胞源自多能干细胞或其后代。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化甲状腺细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的甲状腺细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该甲状腺细胞源自多能干细胞或其后代。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化T细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的T细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，其中该T细胞任选地还包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸，并且其中该T细胞源自多能干细胞或其后代，或者该T细胞是原代免疫细胞或其后代。

在一些实施方案中，本文提供了一种工程化NK细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的NK细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，其中该NK细胞任选地还包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸，并且其中该NK细胞源自多能干细胞或其后代，或者该NK细胞是原代免疫细胞或其后代。

在一些实施方案中，本文提供了一种细胞，其表达相对于相同细胞类型的野生型细胞或对照细胞高至少约10％的量的CD47，或表达的CD47的水平是相同细胞类型的野生型细胞或对照细胞中表达的至少约1.1倍。

在一些实施方案中，本文提供了一种细胞，其表达相对于来自供体的起始细胞或来自供体库的起始细胞库高至少约10％的量的CD47，或表达的CD47的水平是来自供体的起始细胞或来自供体库的起始细胞库中表达的至少约1.1倍。

在一些实施方案中，细胞相对于野生型细胞或对照细胞表达高至少约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％的量的CD47。

在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是相同细胞类型的野生型细胞中表达的至少约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍。

在一些实施方案中，本文提供了一种T细胞，相对于野生型T细胞或对照T细胞，其具有降低的一种或多种MHC I类HLA表达和/或降低的一种或多种MHC II类HLA表达并且表达高至少约10％的量的CD47，表达的CD47的水平是野生型T细胞或对照T细胞中表达的至少约1.1倍，或表达至少约170,000个CD47分子。

在一些实施方案中，细胞是相对于野生型T细胞或对照T细胞表达高至少约300％或至少约400％的量的CD47的T细胞。

在一些实施方案中，细胞是表达的CD47的水平是野生型T细胞或对照T细胞中表达的至少约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍的T细胞。

在一些实施方案中，本文提供了一种T细胞，其表达至少约170,000个CD47分子。

在一些实施方案中，本文提供了一种T细胞，其表达相对于来自供体的起始T细胞或来自供体库的起始T细胞库高至少约10％的量的CD47，或表达的CD47的水平是来自供体的起始细胞或来自供体库的起始细胞库中表达的至少约1.1倍。

在一些实施方案中，细胞是相对于野生型原代胰岛细胞或对照原代胰岛细胞表达高至少约1000％或至少约2000％的量的CD47的原代胰岛细胞。

在一些实施方案中，本文提供了一种胰岛细胞，相对于野生型胰岛细胞或对照胰岛细胞，具有降低的一种或多种MHC I类HLA表达和/或降低的一种或多种MHC II类HLA表达并且表达高至少约1000％的量的CD47。

在一些实施方案中，细胞是表达的CD47的水平是野生型β胰岛细胞或对照β胰岛细胞中表达的至少约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍的原代β胰岛细胞。

在一些实施方案中，病毒介导的整合是慢病毒介导的。

在一些实施方案中，细胞包含外源多核苷酸，该外源多核苷酸包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性、与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少约98％的序列同一性、与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少约99％的序列同一性或具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CD47多肽。

在一些实施方案中，细胞包含外源多核苷酸，该外源多核苷酸包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性、与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少约98％的序列同一性、与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少约99％的序列同一性或具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CD47多肽。

在一些实施方案中，细胞包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的野生型细胞或对照细胞降低的选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子(HLA)的一个或多个靶标的表达。

在一些实施方案中，降低的MHC I类和MHC II类HLA中的一种或多种的表达是由对编码MHC I类和/或II类HLA的一种或多种基因的组成型修饰引起的。

在一些实施方案中，细胞包含选自MHC I类和MHC II类HLA的靶标的一种或多种敲除。

在一些实施方案中，一种或多种敲除是组成型敲除。

在一些实施方案中，细胞包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的野生型细胞或对照细胞降低的选自B2M和CIITA的一个或多个靶标的表达。

在一些实施方案中，其中细胞包含选自B2M和CIITA的靶标的一种或多种敲除。

在一些实施方案中，一种或多种敲除是组成型敲除。

在一些实施方案中，细胞包含相对于相同细胞类型的野生型细胞或对照细胞降低的B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的表达。

在一些实施方案中，细胞是多能干细胞。

在一些实施方案中，细胞是原代细胞或其后代。

在一些实施方案中，原代细胞或其后代是T细胞或NK细胞。

在一些实施方案中，T细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。

在一些实施方案中，细胞相对于不表达或低表达CD47的相同或不同细胞类型的对照细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47表达，以及相对于对照细胞降低的MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子中的一种或多种的表达。

在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是不表达CD47或低表达CD47的相同或不同细胞类型的对照细胞中表达的至少约2倍、约3倍、约4倍或约5倍，并且相对于对照细胞，降低MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子中的一种或多种的表达。

在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是不表达或低表达CD47的相同细胞类型的对照细胞中表达的至少约3倍、约4倍或约5倍。

在一些实施方案中，分化细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、内皮细胞、胰岛细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞或甲状腺细胞。

在一些实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所述的工程化细胞群或低免疫原性细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。

在一些实施方案中，本文提供了一种治疗将受益于基于细胞的疗法的患有疾病或疾患的患者的方法，其包括向患者施用本文所述的工程化细胞群或低免疫原性细胞群。

在一些实施方案中，本文提供了一种治疗将受益于基于细胞的疗法的患有疾病或疾患的患者的方法，其包括向患者施用本文所述的分化细胞群。

在一些实施方案中，本文提供了本文所述的工程化细胞群或低免疫原性细胞群用于治疗将受益于基于细胞的疗法的受体患者的病症或疾患的用途。

在一些实施方案中，本文提供了一种用于产生工程化细胞的方法，该工程化细胞包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，i)降低选自MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，以及ii)增加一种或多种致耐受因子的表达，该方法包括：

(a)获得分离的细胞；

(b)向细胞中引入用于一个或多个靶标的可调控降低的表达的条件性或诱导型基于RNA的组分、用于一个或多个靶标的可调控降低的表达的条件性或诱导型基于DNA的组分、或用于一个或多个靶标的可调控降低的表达的条件性或诱导型基于蛋白质的组分；

(c)将细胞暴露于一定条件或外源因子以活化条件性或诱导型方法，从而导致MHCI类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的表达降低；

(d)向分离的细胞中引入包含与编码一种或多种致耐受因子的外源多核苷酸可操作地连接的条件性或诱导型启动子的核酸；以及

(e)将所述工程化细胞暴露于一定条件或外源因子以活化所述条件性或诱导型启动子，从而引起所述外源的一种或多种致耐受因子的表达，并从而产生所述工程化细胞。

在一些实施方案中，步骤(a)-(d)以任何顺序进行。

在一些实施方案中，步骤(a)-(d)中的一个或多个同时进行。

在一些实施方案中，步骤(b)和(c)在步骤(d)和(e)之前进行。

在一些实施方案中，步骤(d)和(e)在步骤(b)和(c)之前进行。

在一些实施方案中，步骤(c)和(e)依序进行。

在一些实施方案中，步骤(c)和(e)同时进行。

在一些实施方案中，本文提供了一种确定低免疫原性细胞免疫逃避所需的CD47表达水平的阈值的方法，该方法包括：

(a)产生包含编码CD47的第一外源多核苷酸的工程化细胞；

(b)基于CD47表达水平分选所述工程化细胞，以产生具有相似CD47表达水平的细胞库；

(c)评估由所述细胞库诱导的免疫响应；以及

(d)确定免疫逃避所需的CD47表达水平的阈值。

在一些实施方案中，该方法的步骤(a)还包括将细胞工程化以使其包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞降低的一种或多种Y染色体基因和主要组织相容性复合物(MHC)I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达。

IV.实施例

实施例1：具有可调控的外源CD47表达的B2M和CIITA双敲除神经胶质祖细胞的产生

本文描述了一种用于产生具有可调控的外源CD47转基因表达的B2M和CIITA双敲除神经胶质祖细胞的示例性方法。使用慢病毒表达技术将与条件性启动子可操作地连接的编码CD47的外源多核苷酸引入到iPSC中，并使用CRISPR/Cas9技术使iPSC中的B2M和CIITA基因失活。

A.B2M/CIITA的双敲除：

通过本领域技术人员所认识到的任何方法使用CRISPR/Cas9技术来编辑iPSC细胞。在一个实例中，靶向B2M和CIITA中的每一种的引导RNA与sp Cas9复合，以形成Cas9核糖核蛋白(RNP)。B2M和CIITA中的每一种的RNP以特定的sgRNA:Cas9比率单独复合，然后是两种RNP的混合物。然后将RNP混合物与iPSC混合，并在特定条件下进行核转染。将核转染细胞接种并培养。

B.CD47转基因的引入：

使用本领域技术人员所认识到的任何方法产生编码CD47的多核苷酸，所述多核苷酸与不同的条件性启动子和组织/分化特异性启动子可操作地连接，所述条件性启动子是细胞周期特异性启动子。使用的启动子包括但不限于：

·细胞周期特异性启动子：细胞周期蛋白B1启动子、Cdc25B启动子、细胞周期蛋白A2启动子、Cdc2启动子、Cdc25C启动子、细胞周期蛋白E启动子、Cdc6启动子、DHFR启动子和组蛋白启动子。不受理论的束缚，使用细胞周期特异性启动子导致可操作地连接的CD47转基因在细胞周期的各个阶段在iPSC中表达。

·组织/分化特异性启动子：Sox-2启动子(神经祖细胞特异性)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(星形胶质细胞特异性)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子(少突胶质细胞特异性)、人髓磷脂相关糖蛋白(MAG)启动子(少突胶质细胞特异性)、芳族氨基酸脱羧酶(AADC)启动子、Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶II-α(CamKIIα)启动子、CMV增强子/血小板衍生的生长因子-β启动子、DAT启动子、DNMT启动子、脑啡肽启动子、ENO2启动子、GnRH启动子、L7启动子、MAP2启动子、神经丝轻链基因启动子、神经丝启动子、NURR1启动子、PITX3启动子、S100启动子、血清素受体启动子、突触蛋白启动子、Tau启动子、thy-1启动子、TUBA1A启动子、TUJ1启动子、酪氨酸羟化酶(TH)启动子、VGF启动子、VMAT2启动子、A2B5启动子、BLBP启动子、脑源性神经营养因子BDNF启动子、CD105启动子、CD11b启动子、CD11c启动子、CD133启动子、CD140a启动子、CD45启动子、CD9启动子、睫状神经营养因子CNTF启动子、连接蛋白43启动子、CX3CR1启动子、EGFR启动子、表皮生长因子EGF启动子、FGF8启动子、FOXG1启动子、GalC启动子、GAP-43启动子、GD3启动子、GLAST、谷氨酰胺合成酶启动子、IBA-1启动子、LNGFR启动子、MBP启动子、Musashi启动子、神经生长因子NGF启动子、巢蛋白启动子、神经营养因子-3NT-3启动子、NG2启动子、NKX2.2启动子、NT-4启动子、O4启动子、OLIG1启动子、OLIG2启动子、P2RY12启动子、PAX6启动子、PDGFαR启动子、S100β启动子、SOX10启动子、TMEM119启动子和波形蛋白启动子。不受理论的束缚，使用组织/分化特异性启动子导致可操作地连接的CD47转基因在分化成GPC的不同阶段时在iPSC中表达。

慢病毒载体通过本领域技术人员所认识到的任何方法产生。例如，使用含有病毒表达和转移载体的标准化学转染复合物来转染细胞系，所述载体携带与条件性启动子(例如细胞周期特异性启动子或组织/分化特异性启动子)可操作地连接的编码CD47的多核苷酸。将细胞培养物收集，并在转染后澄清，然后离心浓缩。将慢病毒沉淀重浮成最终浓缩物。

将慢病毒浓缩物与标准培养板中的iPSC混合，并且将iPSC用含有与条件性启动子可操作地连接的编码CD47的多核苷酸的构建体来旋转转染和转导。

注意，步骤A可以在步骤B之前、同时或之后发生，以产生具有可调控的外源CD47转基因的B2M/CIITA双敲除iPSC。

分化成GPC：

神经胶质祖细胞通过本领域技术人员所认识到的任何方法从iPSC分化。

在一些情况下，通过在包含选自由以下各项组成的组的一种或多种剂的培养基中培养具有可调控的外源CD47转基因的B2M/CIITA双敲除iPSC来产生神经胶质细胞、其前体和祖细胞：视黄酸、IL-34、M-CSF、FLT3配体、GM-CSF、CCL2、TGFβ抑制剂、BMP信号传导抑制剂(诸如LDN193189、SB431542或其组合)、SHH信号传导活化因子、FGF、血小板衍生的生长因子PDGF、PDGFR-α、HGF、IGF-1、头蛋白、音猬因子(SHH)、多索吗啡(dorsomorphin)、头蛋白及其任何组合。分化培养基包括可促进或能够产生本领域技术人员所认识的神经胶质细胞类型的任何特定因子和/或小分子。

单独地或另外地，多能干细胞的分化通过将细胞暴露于或接触已知产生神经胶质细胞诸如小神经胶质细胞(诸如变形、分支、活化的吞噬和活化的非吞噬细胞)、大神经胶质细胞(诸如星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、放射状胶质细胞、施旺氏细胞(Schwann cell)和卫星细胞)、其前体和其祖细胞的特定因子来进行。用于从干细胞产生神经胶质细胞、其前体和祖细胞的有用方法见于例如美国专利号7,579,188、7,595,194、8,263,402、8,206,699、8,227,247、8,252,586、9,193,951、9,709,553和9,862,925以及美国公开申请号2018/0187148、2017/0198255、2017/0183627、2017/0182097、2017/253856、2018/0236004以及PCT公开申请号WO2017/172976和WO2018/093681，这些文献中的每一篇以引用方式整体并入本文。

使用正选择策略、负选择策略或两者来选择或纯化神经胶质细胞。

GPC的表征：

在一些情况下，为了监测神经胶质细胞分化以及评估神经胶质细胞的表型，评价对神经胶质细胞及其祖细胞具有特异性的任何数量的分子和遗传标志物的表达。例如，遗传标志物的存在通过本领域技术人员已知的各种方法来确定。分子标志物的表达通过定量方法来确定，诸如但不限于基于qPCR的测定、RNA-seq测定、蛋白质组测定、免疫测定、免疫细胞化学测定、免疫印迹测定等。

在一些情况下，神经胶质细胞表达NKX2.2、PAX6、SOX10、脑源性神经营养因子BDNF、中性粒细胞营养因子-3NT-3、NT-4、表皮生长因子EGF、睫状神经营养因子CNTF、神经生长因子NGF、FGF8、EGFR、OLIG1、OLIG2、髓磷脂碱性蛋白MBP、GAP-43、LNGFR、巢蛋白、GFAP、CD11b、CD11c、CD105、CX3CR1、P2RY12、IBA-1、TMEM119、CD45及其任何组合。在一些情况下，神经胶质细胞(包括少突胶质细胞、星形胶质细胞及其祖细胞)表达选自A2B5、CD9、CD133、CD140a、FOXG1、GalC、GD3、GFAP、巢蛋白、NG2、MBP、Musashi、O4、Olig1、Olig2、PDGFαR、S100β、谷氨酰胺合成酶、连接蛋白43、波形蛋白、BLBP、GLAST等的一种或多种标志物。在一些情况下，神经胶质细胞(包括少突胶质细胞、星形胶质细胞及其祖细胞)不表达选自PSA-NCAM、CD9、CD11、CD32、CD36、CD105、CD140a、巢蛋白、PDGFαR等的一种或多种标志物。使用这些示例性标志物中的任一种来表征本文所述的神经胶质细胞。

单独地或另外地，根据通过免疫细胞化学和免疫组织化学测定的形态学来表征神经胶质细胞。在一些情况下，根据功能表征测定来评估神经胶质细胞，诸如但不限于神经元共培养测定、脂多糖(LPS)刺激测定、体外髓磷脂形成测定、ATP流入与钙波振荡测定等。

单独地或另外地，为了确定神经胶质细胞表现出细胞特异性特征和特性，将细胞移植到动物模型中。在一些情况下，将神经胶质细胞注射到免疫受损小鼠，例如免疫受损的shiverer小鼠中。将神经胶质细胞施用至小鼠的脑中，并在预先选择的时间后对植入的细胞进行评价。在一些情况下，使用免疫染色和成像方法来使大脑中的植入细胞可视化。在一些情况下，可以在移植细胞中测定已知神经胶质细胞生物标志物的表达。

以下参考文献中描述了用于确定神经细胞移植在神经系统病症或疾患的动物模型中的效果的另外方法：对于脊髓损伤，Curtis等人,Cell Stem Cell,2018,22,941-950；对于帕金森氏病，Kikuchi等人,Nature,2017,548:592-596；对于ALS，Izrael等人,StemCell Research,2018,9(1):152以及Izrael等人,IntechOpen,DOI:10.5772/intechopen.72862；对于癫痫，Upadhya等人,PNAS,2019,116(1):287-296，这些文献中的每一篇以引用方式整体并入本文。

神经细胞移植对于脊髓损伤的功效在例如急性脊髓损伤的大鼠模型中进行评估，如McDonald等人,Nat.Med.,1999,5:1410和Kim等人,Nature,2002,418:50中所述的。例如，成功的移植可能会显示2-5周后病灶处存在移植源细胞，分化成星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或神经元，并从病灶端沿着脊髓迁移，并且步态、协调性和负重能力改善。基于神经细胞类型和待治疗的神经疾病或疾患选择特定的动物模型。

实施例2：示例性实施方案

细胞

产生了一种工程化细胞，其包含以下可调控修饰：i)相对于未改变或未修饰的野生型细胞，选自β-2-微球蛋白(B2M)和MHC II类反式活化因子(CIITA)的一种或多种靶标的可调控的降低的表达，以及ii)相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，一种或多种致耐受因子的可调控的过表达。

产生了一种低免疫原性细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，i)选自β-2-微球蛋白(B2M)和MHC II类反式活化因子(CIITA)的一种或多种靶标的可调控降低的表达，以及ii)一种或多种致耐受因子的可调控过表达。

产生了一种工程化细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加一种或多种致耐受因子的表达。

产生了一种低免疫原性细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加一种或多种致耐受因子的表达。

遗传修饰

可以产生包含可调控修饰的经工程化细胞或低免疫原性细胞，所述可调控修饰包括选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的可调控敲除。任选地，可以产生包含可调控修饰的经工程化细胞或低免疫原性细胞，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，所述可调控修饰包括选自B2M和CIITA的一个或多个靶标的可调控降低的表达。任选地，可以产生包含可调控修饰的经工程化细胞或低免疫原性细胞，所述可调控修饰包括选自B2M和CIITA的一个或多个靶标的可调控敲除。任选地，可以产生还包含一种或多种Y染色体基因的可调控降低的表达或可调控敲除的经工程化细胞或低免疫原性细胞。任选地，可以产生包含Y-连接的原钙粘附蛋白-11和/或Y-连接的神经调节蛋白-4的降低的表达或可调控敲除的工程化细胞或低免疫原性细胞。

条件性或诱导型表达

可以产生包含条件性或诱导型基于RNA的组分的经工程化细胞或低免疫原性细胞，该条件性或诱导型基于RNA的组分用于相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞一个或多个靶标的可调控降低的表达或敲除。任选地，条件性或诱导型基于RNA的组分选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA以及条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组。任选地，条件性基于RNA的组分处于选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组的条件性启动子的控制下。任选地，诱导型基于RNA的组分处于受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子的控制下。

可以产生包含条件性或诱导型基于DNA的组分的工程化细胞或低免疫原性细胞，该条件性或诱导型基于RNA的组分用于相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，一个或多个靶标的可调控降低的表达或敲除。任选地，条件性或诱导型基于DNA的组分是使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法的敲除。任选地，条件性基于DNA的组分处于选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组的条件性启动子的控制下。任选地，条件性基于DNA的组分处于受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子的控制下。

可以产生包含条件性或诱导型基于蛋白质的组分的工程化细胞或低免疫原性细胞，该条件性或诱导型基于蛋白质的组分用于相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，一个或多个靶标的可调控降低的表达或敲除。任选地，条件性或诱导型基于蛋白质的组分是条件性或诱导型降解决定子方法。任选地，条件性或诱导型降解决定子方法选自由以下各项组成的组：使用SMASH标签的配体诱导性降解(LID)、使用Shield-1的LID、使用生长素的LID、使用雷帕霉素的LID、条件性或诱导型肽降解决定子(例如，基于IKZF3的降解决定子)和条件性或诱导型蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。任选地，条件性基于蛋白质的组分处于选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组的条件性启动子的控制下。任选地，基于蛋白质的组分处于受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子的控制下。

任选地，细胞包含与编码一种或多种致耐受因子的外源多核苷酸可操作地连接的条件性启动子。任选地，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的条件性启动子的外源多核苷酸，和(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码一种或多种致耐受因子的货物多核苷酸。任选地，条件性启动子是细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子或分化诱导型启动子。

任选地，细胞包含与编码一种或多种致耐受因子的外源多核苷酸可操作地连接的诱导型启动子。任选地，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的诱导型启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码一种或多种致耐受因子的货物多核苷酸。任选地，诱导型启动子受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。

任选地，一种或多种致耐受因子选自由HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CD47、CI-抑制剂和IL-35组成的组。任选地，工程化细胞或低免疫原性细胞被工程化以包含与编码CD47的外源多核苷酸可操作地连接的诱导型启动子。任选地，细胞包含与SEQID NO:129的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的CD47多肽。任选地，细胞包含与SEQ IDNO:130的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的CD47多肽。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达增加量的CD47。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的CD47。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的CD47。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约1000％的量的CD47。任选地，细胞相对于基线参照表达增加量的CD47。在一些实施方案中，基线参考是背景信号。在一些实施方案中，基线参考是对照信号。在一些实施方案中，基线参考是同种型对照信号。在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的CD47。在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的CD47。在一些实施方案中，细胞相对于对照表达高至少约1000％的量的CD47。在一些实施方案中，细胞表达的CD47的水平是对照中表达的至少约1.1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍。在一些实施方案中，细胞每个细胞表达至少约180,000个CD47分子、至少约190,000个CD47分子、至少约200,000个CD47分子、至少约210,000个CD47分子、至少约220,000个CD47分子、至少约230,000个CD47分子、至少约240,000个CD47分子、至少约250,000个CD47分子、至少约260,000个CD47分子、至少约270,000个CD47分子、至少约280,000个CD47分子、至少约290,000个CD47分子、至少约300,000个CD47分子、至少约350,000个、至少约400,000个CD47分子。

鉴于本公开，本领域技术人员已知的用于分子定量的任何合适的方法可以在本公开中使用。可用于测定表达水平的方法的实例包括但不限于基于流式细胞术的方法、细胞表面生物素化方法、胰凝乳蛋白酶方法、成像方法、抗体标记方法、表面等离振子共振方法以及Prasad等人,Methods Enzymol.2010；484:179-95和Drescher等人,Methods MolBiol.2009；493:323-43中描述的那些，这两篇文献均以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，致耐受因子或CD47表达的水平使用基于抗体的定量方法、任选的Quantibrite^TM测定法来测定。

另外的修饰

任选地，细胞包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞降低的B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的表达。任选地，细胞不表达B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD。任选地，细胞还包含可调控修饰，所述可调控修饰增加编码CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9中的一种或多种的一种或多种外源多核苷酸的表达。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约1000％的量的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9。

细胞类型

任选地，细胞源自人细胞或动物细胞。任选地，人细胞或动物细胞是多能干细胞。任选地，多能干细胞是诱导型多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)或胚胎干细胞(ESC)。任选地，细胞是源自多能干细胞或其后代的分化细胞。任选地，多能干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)或胚胎干细胞(ESC)。任选地，分化细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、内皮细胞、胰岛细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞和甲状腺细胞组成的组。任选地，细胞是原代免疫细胞或其后代。

任选地，原代免疫细胞或其后代是T细胞或NK细胞。任选地，T细胞还包含降低的T细胞受体(TCR)-α和/或TCR-β的表达。任选地，T细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。任选地，T细胞还包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。

整合位点

任选地，第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的第一和/或第二特异性基因座中。任选地，第一和/或第二特异性基因座选自由安全港基因座、靶基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组。任选地，安全港基因座选自由CCR5基因座、PPP1R12C基因座、Rosa基因座和CLYBL基因座组成的组。任选地，靶基因座选自由CXCR4基因座、ALB基因座、SHS231基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座组成的组。

任选地，使用慢病毒载体将第一和/或第二外源多核苷酸引入到工程化细胞或低免疫原性细胞中。任选地，使用融合原介导的递送或选自由以下各项组成的组的转座酶系统将第一和/或第二外源多核苷酸引入到工程化细胞或低免疫原性细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。

患者响应

任选地，细胞在施用至受体患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。任选地，细胞在施用至受体患者后被成熟NK细胞保护免受细胞裂解。任选地，细胞在施用至受体患者后逃避巨噬细胞吞噬。任选地，细胞在施用至受体患者后不诱导对细胞的先天和/或适应性免疫响应。任选地，细胞在施用至受体患者后不诱导对细胞的基于抗体的免疫响应。

另外的细胞

产生了包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞增加CD47表达的可调控修饰的工程化细胞。

产生了包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞增加CD47表达的可调控修饰的低免疫原性细胞。

任选地，工程化或低免疫原性细胞包含与编码CD47的外源多核苷酸可操作地连接的条件性启动子。任选地，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的条件性启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码CD47的货物多核苷酸。任选地，条件性启动子是细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子或分化诱导型启动子。任选地，细胞包含与编码CD47的外源多核苷酸可操作地连接的诱导型启动子。任选地，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的诱导型启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码CD47的货物多核苷酸。任选地，诱导型启动子受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。任选地，外源多核苷酸细胞包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的CD47多肽。任选地，细胞包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的CD47多肽。

任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达增加量的CD47。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的CD47。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的CD47。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约1000％的量的CD47。

任选地，细胞还包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达的可调控修饰。任选地，细胞包含选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的可调控敲除。任选地，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，可调控修饰包含选自B2M和CIITA的一个或多个靶标的可调控降低的表达。任选地，可调控修饰包括选自B2M和CIITA的一个或多个靶标的可调控敲除。任选地，细胞还包含降低或敲除一种或多种Y染色体基因的表达的可调控修饰。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞包含可调控修饰，所述可调控修饰降低或敲除选自Y-连接的原钙粘附蛋白-11和Y-连接的神经连接蛋白-4的一个或多个靶标的表达。

任选地，可调控修饰包含条件性或诱导型基于RNA的组分，用于相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞降低或敲除一个或多个靶标的表达。任选地，条件性或诱导型基于RNA的组分选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA以及条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组。任选地，条件性基于RNA的组分处于选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组的条件性启动子的控制下。任选地，诱导型基于RNA的组分处于受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子的控制下。

任选地，可调控修饰包含条件性或诱导型基于DNA的组分，用于相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞降低或敲除一个或多个靶标的表达。任选地，条件性或诱导型基于DNA的组分是使用选自由条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶和条件性或诱导型大范围核酸酶组成的组的方法的敲除。任选地，条件性基于DNA的组分处于选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组的条件性启动子的控制下。任选地，条件性基于DNA的组分处于受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子的控制下。

任选地，可调控修饰包含条件性或诱导型基于蛋白质的组分，用于相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞降低或敲除一个或多个靶标的表达。任选地，条件性或诱导型基于蛋白质的组分是条件性或诱导型降解决定子方法。任选地，条件性或诱导型降解决定子方法选自由以下各项组成的组：使用SMASH标签的配体诱导性降解(LID)、使用Shield-1的LID、使用生长素的LID、使用雷帕霉素的LID、条件性或诱导型肽降解决定子(例如，基于IKZF3的降解决定子)和条件性或诱导型蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。任选地，条件性基于蛋白质的组分处于选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组的条件性启动子的控制下。任选地，基于蛋白质的组分处于受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子的控制下。

任选地，细胞还包含与编码一种或多种其他致耐受因子的外源多核苷酸可操作地连接的条件性启动子。任选地，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的条件性启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码一种或多种其他致耐受因子的货物多核苷酸。任选地，条件性启动子是细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子或分化诱导型启动子。任选地，细胞包含与编码一种或多种其他致耐受因子的外源多核苷酸可操作地连接的诱导型启动子。任选地，细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的诱导型启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，该转座子包含编码一种或多种其他致耐受因子的货物多核苷酸。任选地，诱导型启动子受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。任选地，一种或多种其他致耐受因子选自由HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CI-抑制剂和IL-35组成的组。

任选地，细胞还包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞降低B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的表达的可调控修饰。任选地，细胞不表达B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD。

任选地，细胞还包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞增加CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9中的一种或多种的表达的可调控修饰。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9。任选地，细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约1000％的量的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和/或Serpinb9。

任选地，细胞源自人细胞或动物细胞。任选地，人细胞或动物细胞是多能干细胞。任选地，多能干细胞是诱导型多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)或胚胎干细胞(ESC)。任选地，工程化细胞或低免疫原性细胞是源自多能干细胞或其后代的分化细胞。任选地，多能干细胞是诱导型多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)或胚胎干细胞(ESC)。任选地，分化细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、内皮细胞、胰岛细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞和甲状腺细胞组成的组。任选地，工程化细胞或低免疫原性细胞是原代免疫细胞或其后代。任选地，原代免疫细胞或其后代是T细胞或NK细胞。任选地，T细胞还包含降低的T细胞受体(TCR)-α和/或TCR-β的表达。任选地，T细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。任选地，T细胞还包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。任选地，第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的第一和/或第二特异性基因座中。

任选地，第一和/或第二特异性基因座选自由安全港基因座、靶基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组。任选地，安全港基因座选自由CCR5基因座、PPP1R12C基因座、Rosa基因座和CLYBL基因座组成的组。任选地，靶基因座选自由CXCR4基因座、ALB基因座、SHS231基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座组成的组。任选地，使用慢病毒载体将第一和/或第二外源多核苷酸引入到工程化细胞或低免疫原性细胞中。任选地，使用融合原介导的递送或选自由以下各项组成的组的转座酶系统将第一和/或第二外源多核苷酸引入到工程化细胞或低免疫原性细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。

任选地，分化细胞或其后代、或原代免疫细胞或其后代在施用至受体患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。任选地，分化细胞或其后代、或原代免疫细胞或其后代在施用至受体患者后受到保护而免于成熟NK细胞的细胞裂解。任选地，分化细胞或其后代、或原代免疫细胞或其后代在施用至受体患者后逃避巨噬细胞吞噬。任选地，分化细胞或其后代、或原代免疫细胞或其后代在施用至受体患者后不诱导对细胞的先天和/或适应性免疫响应。任选地，分化细胞或其后代、或原代免疫细胞或其后代在施用至受体患者后不诱导对细胞的基于抗体的免疫响应。

产生了一种工程化内皮细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的内皮细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该内皮细胞源自多能干细胞或其后代。

产生了一种工程化胰岛细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的胰岛细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该胰岛细胞源自多能干细胞或其后代。

产生了一种工程化心肌细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的心肌细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该心肌细胞源自多能干细胞或其后代。

产生了一种工程化平滑肌细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的平滑肌细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该平滑肌细胞源自多能干细胞或其后代。

产生了一种工程化骨骼肌细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的骨骼肌细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该骨骼肌细胞源自多能干细胞或其后代。

产生了一种工程化肝细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的肝细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该肝细胞源自多能干细胞或其后代。

产生了一种工程化神经胶质祖细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的神经胶质祖细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该神经胶质祖细胞源自多能干细胞或其后代。

产生了一种工程化多巴胺能神经元，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的多巴胺能神经元，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该多巴胺能神经元源自多能干细胞或其后代。

产生了一种工程化视网膜色素上皮细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的视网膜色素上皮细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该视网膜色素上皮细胞源自多能干细胞或其后代。

产生了一种工程化甲状腺细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的甲状腺细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，并且其中该甲状腺细胞源自多能干细胞或其后代。

产生了一种工程化T细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的T细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，其中该T细胞任选地还包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸，并且其中该T细胞源自多能干细胞或其后代，或者该T细胞是原代免疫细胞或其后代。

一种工程化NK细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的NK细胞，i)降低选自MHC I类和MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，和/或ii)增加CD47的表达，其中该细胞相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47，其中该NK细胞任选地还包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸，并且其中该NK细胞源自多能干细胞或其后代，或者该NK细胞是原代免疫细胞或其后代。

药物组合物

可以将细胞配制成药物组合物。任选地，药物组合物包含本文所述的工程化细胞群或低免疫原性细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。

治疗方法

细胞可用于治疗将受益于基于细胞的疗法的患有疾病或疾患的患者的方法中。任选地，该方法包括向患者施用本文所述的工程化细胞群或低免疫原性细胞群。任选地，该方法包括向患者施用本文所述的分化细胞群。任选地，分化细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、内皮细胞、胰岛细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞和甲状腺细胞组成的组。

用于产生细胞的方法

通过以下方法产生工程化细胞，其包含以下可调控修饰：相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，i)降低选自MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的一个或多个靶标的表达，以及ii)增加一种或多种致耐受因子的表达：

(a)获得分离的细胞；

(e)将工程化细胞暴露于一定条件或外源因子以活化条件性或诱导型启动子，从而引起外源的一种或多种致耐受因子的表达，并从而产生工程化细胞。

任选地，步骤(a)-(d)以任何依序进行。任选地，步骤(a)-(d)中的一个或多个同时进行。任选地，步骤(b)和(c)在步骤(d)和(e)之前进行。任选地，步骤(d)和(e)在步骤(b)和(c)之前进行。任选地，步骤(c)和(e)依序进行。任选地，步骤(c)和(e)同时进行。

测定CD47阈值水平的方法

进行了确定低免疫原性细胞免疫逃避所需的CD47表达水平的阈值的方法，该方法包括：

(a)产生包含编码CD47的第一外源多核苷酸的工程化细胞；

(b)基于CD47表达水平分选工程化细胞，以产生具有相似CD47表达水平的细胞库；

(c)评估由细胞库诱导的免疫响应；以及

(d)确定免疫逃避所需的CD47表达水平的阈值。

任选地，该方法的步骤(a)还包括将细胞工程化以包含相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞可调控降低的一种或多种Y染色体基因和MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达。任选地，使用体外测定法或体内测定法进行免疫响应的评估，包括但不限于流式细胞术方法、抗体方法(供体特异性抗体检测、ELISA、蛋白质印迹分析、标准抗体检测方法)、细胞杀伤测定法、免疫细胞活化测定法。任选地，免疫响应的评估是通过测量NK细胞介导的细胞毒性、成熟NK细胞的裂解、巨噬细胞吞噬、对细胞的基于抗体的免疫响应或通过测量在施用至受体患者一定时间后仍然存在于受体中的细胞的百分比进行的。

实施例3：原代胰岛细胞的MHC-II表达降低和CD47表达增加

将来自B2M敲除C57BL/6(B6)小鼠(MHC单倍型H2^b)的原代β胰岛细胞用含有CD47转基因的慢病毒载体转导，以产生B2M^-/-；CD47tg原代β胰岛。测试了一系列MOI的携带CD47cDNA转基因的慢病毒颗粒。24小时后，除去病毒并进行完全的培养基更换。使用标准FACS系统，使用荧光标记的抗CD47对细胞进行分选。

从C57BL/6(B6)小鼠中分离的B2M^-/-原代胰岛细胞不天然表达MHC-II分子，在刺激后也不会上调MHC-II分子。使用抗体特异性试剂通过流式细胞术评估B2M^-/-、CD47tg原代β胰岛上一种或多种MHC-I、MHC-II和CD47的表面表达。使用同种型抗体作为对照。评价了B2M^-/-、CD47tgβ胰岛细胞中不同CD47蛋白水平的作用以及细胞逃避免疫响应的能力。

为了确定原代β胰岛细胞逃避NK细胞介导的细胞杀伤所需的CD47阈值水平，与同种型对照相比，对B2M^-/-；CD47tgβ胰岛细胞中CD47的表达水平进行了分析，同时分析了小鼠NK细胞的杀伤。通过流式细胞术(使用标准方法)分析B2M^-/-；CD47tgβ胰岛细胞。将细胞用抗Fc受体抗体封闭，并用浓度与同种型对照匹配的抗CD47抗体染色。如图1A-1N所示，B2M^-/-；CD47tgβ胰岛细胞相对于基线表达不同水平的CD47。在XCelligence MP平台(ACEABioSciences,San Diego,CA)上进行小鼠NK细胞的NK细胞杀伤测定。如图1A-1N所示，对于表达的CD47是基线的6.2倍、8.9倍、11.7倍或15.3倍的B2M^-/-；CD47tgβ胰岛细胞，观察到NK细胞杀伤。相比之下，对于表达的CD47是基线的19.1倍、38.4倍或72.5倍的B2M^-/-；CD47tgβ胰岛细胞，没有观察到NK细胞杀伤。数据显示，表达的CD47等于或高于阈值水平的小鼠B2M^-/-；CD47tg原代β胰岛细胞逃避了NK细胞的免疫响应。相对于基线具有15.3倍或更低的CD47表达的这种原代小鼠β胰岛被小鼠NK细胞杀死，而相对于基线具有19.1倍或更高的CD47表达的原代小鼠胰岛细胞不被小鼠NK细胞杀死。

实施例4：在T细胞中降低MHC-I/II表达并增加CD47表达

使用BD Quantibrite^TM珠来评估B2M^-/-、CIITA^-/-、CD47tg原代人T细胞中的总CD47分子数。评价了B2M^-/-；CIITA^-/-；CD47tg原代人T细胞中不同CD47蛋白水平对细胞逃避免疫响应的能力的作用。

为了确定T细胞逃避NK细胞介导的细胞杀伤所需的CD47阈值水平，在XCelligenceMP平台(ACEA BioSciences,San Diego,CA)上使用每个细胞包含不同数量的CD47分子的经修饰原代T细胞进行NK细胞和巨噬细胞杀伤测定。如图2A-2AB所示，对于表达的内源CD47水平是每个细胞53,118或64,778个分子的B2M^-/-；CIITA^-/-T细胞，以及对于表达的CD47水平是每个细胞131,534个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约2至约2.5倍，或相对于对照细胞高约100％至约150％的量的CD47)、每个细胞95,893个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约1.5至约1.8倍，或相对于对照细胞高约50％至约80％的量的CD47)、每个细胞135,284个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约2.1至约2.5倍，或相对于对照细胞高约110％至约150％的量的CD47)、每个细胞168,751个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约2.6至约3.2倍，或相对于对照细胞高约160％至约220％的量的CD47)或每个细胞179,236个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约2.8至约3.4倍，或相对于对照细胞高约180％至约240％的量的CD47)的B2M^-/-；CIITA^-/-；CD47tg T细胞，观察到NK细胞和巨噬细胞杀伤。相比之下，对于表达的CD47水平是每个细胞222,777个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约3.4至约4.2倍，或相对于对照细胞高约240％至约320％的量的CD47)、每个细胞290,942个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约4.5至约5.5倍，或相对于对照细胞高约350％至约450％的量的CD47)、每个细胞369,671个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约5.7至约7倍，或相对于对照细胞高约470％至约600％的量的CD47)、每个细胞415,996个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约6.4至约7.8倍，或相对于对照细胞高约540％至约680％的量的CD47)、每个细胞439,189个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约6.8至约8.3倍，或相对于对照细胞高约580％至约730％的量的CD47)、每个细胞585,377个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约9至约11倍，或相对于对照细胞高约800％至约1000％的量的CD47)或每个细胞689,168个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约10.6至约13倍，或相对于对照细胞高约960％至约1200％的量的CD47)的B2M^-/-；CIITA^-/-；CD47tg T细胞，没有观察到NK细胞杀伤。

数据显示，表达的CD47等于或高于阈值水平的B2M^-/-；CIITA^-/-；CD47tg原代T细胞可逃避NK细胞的免疫响应。每个细胞具有179,236个或更少CD47分子的这种T细胞被NK细胞和巨噬细胞杀伤，而具有222,777个或更多CD47分子的T细胞不被NK细胞或巨噬细胞杀伤。

实施例5：原代人胰岛细胞的MHC-II表达降低和CD47表达增加

使用BD Quantibrite^TM珠来评估B2M^-/-；CD47tg原代人β胰岛中的总CD47分子数。评价了B2M^-/-；CD47tg原代β胰岛细胞中不同CD47蛋白水平对逃避免疫响应的能力的作用。

为了确定胰岛细胞逃避NK细胞介导的细胞杀伤所需的CD47阈值水平，在XCelligence MP平台(ACEA BioSciences,San Diego,CA)上使用每个细胞包含不同数量的CD47分子的经修饰胰岛细胞进行NK细胞杀伤测定。

如图3A-3L所示，对于表达的内源CD47水平是每个细胞53,174或60,410个分子的B2M^-/-；CD47tg原代β胰岛细胞，以及对于表达每个细胞91,558个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约1.7倍或1.5倍，或相对于对照细胞高约70％或50％的量的CD47)、每个细胞109,366个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约2倍或约1.8倍，或相对于对照细胞高约100％或80％的量的CD47)、每个细胞152,475个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约3倍或2.5倍，或相对于对照细胞高约200％或150％的量的CD47)和每个细胞184,773个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约3.5倍或3倍，或相对于对照细胞高约250％或200％的量的CD47)的B2M^-/-；CD47tg原代β胰岛细胞，观察到NK细胞杀伤。相比之下，对于表达的CD47水平是每个细胞203,853个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约3.8倍，或相对于对照细胞高约280％的量的CD47)、每个细胞226,566个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约4.3倍，或相对于对照细胞高约330％的量的CD47)、每个细胞271,191个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约5倍，或相对于对照细胞高约400％的量的CD47)、每个细胞297,154个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约5.6倍，或相对于对照细胞高约460％的量的CD47)、每个细胞572,920个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约10.8倍，或相对于对照细胞高约980％的量的CD47)或每个细胞802,429个分子(对照细胞中表达的内源CD47水平的约15.1倍，或相对于对照细胞高约1410％的量的CD47)的B2M^-/-；CD47tg原代β胰岛细胞，没有观察到NK细胞杀伤。

数据显示，表达的CD47等于或高于阈值水平的B2M^-/-；CD47tg原代人β胰岛细胞逃避了NK细胞的免疫响应。每个细胞具有184,773个或更少的CD47分子的这种胰岛细胞被NK细胞杀伤，而具有203,853个或更多的CD47分子的胰岛细胞不被NK细胞杀伤。

实施例6：原代人RPE细胞的编辑

未修饰的原代人视网膜色素上皮(RPE)细胞表达HLA-I，不表达HLA-II并且低表达CD47(参见例如图4A-4C)。

使用含有CD47转基因的慢病毒载体转导原代人RPE细胞以产生B2M^-/-；CIITA^-/-；CD47tg原代RPE细胞。测试了一系列MOI的携带CD47 cDNA转基因的慢病毒颗粒。24小时后，除去病毒并进行完全的培养基更换。使用标准FACS系统，使用荧光标记的抗CD47对细胞进行分选。

使用抗体特异性试剂通过流式细胞术评估B2M^-/-；CIITA^-/-；CD47tg原代RPE上一种或多种HLA-I、HLA-II和CD47的表面表达。使用同种型抗体作为对照。参见图5A-5D。

评价了B2M^-/-；CIITA^-/-；CD47tg RPE细胞中不同CD47蛋白水平的作用以及细胞逃避免疫响应的能力。

与同种型对照相比，对未修饰的、B2M^-/-；CIITA^-/-(dKO)和B2M^-/-；CIITA^-/-；CD47tg(HIP)原代RPE细胞中CD47的表达水平进行了分析，同时评估了NK细胞和巨噬细胞的杀伤作用。通过流式细胞术(使用标准方法)分析RPE细胞。将细胞用抗Fc受体抗体封闭，并用浓度与同种型对照匹配的抗CD47抗体染色。如图6A-6I所示，B2M^-/-；CIITA^-/-(dKO)RPE细胞相对于基线表达约1.8倍水平的CD47，并且B2M^-/-；CIITA^-/-；CD47tg(HIP)RPE细胞相对于基线表达约20倍水平的CD47。在XCelligence MP平台(ACEA BioSciences,San Diego,CA)上进行NK细胞和巨噬细胞的杀伤测定。如图7A-7I所示，对于dKO RPE观察到NK细胞和巨噬细胞杀伤，但对于HIP RPE没有观察到。

Claims

1.一种工程化细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

2.一种工程化细胞，其包含相对于对照增加CD47的表达的可调控修饰。

3.如权利要求1或2所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下细胞组成的组：干细胞、多能干细胞(PSC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)、胚胎干细胞(ESC)、胰岛细胞、β胰岛细胞、免疫细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、巨噬细胞、免疫特权细胞、视细胞、视网膜色素上皮细胞(RPE)、肝细胞、甲状腺细胞、内皮细胞、皮肤细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、肌细胞、心脏细胞和血细胞。

4.一种工程化胰岛细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

5.如权利要求4所述的工程化胰岛细胞，其中所述胰岛细胞是β胰岛细胞。

6.一种工程化内皮细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

7.一种工程化心肌细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

8.一种工程化平滑肌细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

9.一种工程化骨骼肌细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

10.一种工程化肝细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

11.一种工程化神经胶质祖细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHCI类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

12.一种工程化多巴胺能神经元，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHCI类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

13.一种工程化免疫特权细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

14.一种工程化视网膜色素上皮细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

15.一种工程化甲状腺细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

16.一种工程化免疫细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

17.如权利要求16所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸。

18.一种工程化T细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

19.如权利要求18所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸。

20.一种工程化NK细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

21.如权利要求20所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸。

22.一种工程化巨噬细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加CD47的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达CD47。

23.如权利要求1-22中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于所述对照表达至少大约相同量的CD47。

24.如权利要求23所述的工程化细胞，其中所述细胞是免疫特权细胞。

25.如权利要求1-24中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于所述对照表达高至少约10％的量的CD47。

26.如权利要求1-25中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于所述对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的CD47。

27.如权利要求1-26中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于所述对照表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的CD47。

28.如权利要求1-27中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于所述对照表达高至少约1000％的量的CD47。

29.如权利要求1-24中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的CD47的水平是所述对照中表达的至少约1.1倍。

30.如权利要求1-24或29中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的CD47的水平是所述对照中表达的至少约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍。

31.如权利要求1-24、29或30中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的CD47的水平是所述对照中表达的至少约4倍、约4.5倍、约5倍或约5.5倍。

32.如权利要求1-24或29-31中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的CD47的水平是所述对照中表达的至少约4倍。

33.如权利要求1-24或29-32中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的CD47的水平是所述对照中表达的至少约4.5倍。

34.如权利要求1-24或29-33中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的CD47的水平是所述对照中表达的至少约5倍。

35.如权利要求1-24或29-34中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的CD47的水平是所述对照中表达的至少约5.5倍。

36.如权利要求1-24或29-35中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的CD47的水平是所述对照中表达的至少约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍。

37.如权利要求1-36中任一项所述的工程化细胞，其中所述对照是野生型细胞、对照细胞或基线参考。

38.如权利要求37所述的工程化细胞，其中所述对照细胞是未修饰的或未改变的细胞，任选地其中所述未修饰的或未改变的细胞与所述工程化细胞属于相同的细胞类型。

39.如权利要求37或38所述的工程化细胞，其中所述对照细胞是来自供体的起始材料或来自供体库的起始细胞库。

40.如权利要求37所述的工程化细胞，其中所述基线参考是同种型对照或背景信号水平。

41.如权利要求37或40所述的工程化细胞，其中所述基线是同种型对照，任选地其中所述CD47水平使用基于抗体的测定法来测定。

42.如权利要求41所述的工程化细胞，其中所述CD47水平使用基于抗体的定量方法、任选的Quantibrite^TM测定法来测定。

43.如权利要求40-42中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是每个细胞表达至少约200,000、250,000、300,000、350,000或400,000个CD47分子的β胰岛细胞。

44.如权利要求40-42中任一项所述的工程化细胞，其中工程化细胞是表达CD47表达是基线的至少约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍或更高的视网膜色素上皮细胞。

45.如权利要求40-42中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是每个细胞表达至少约180,000、190,000、200,000、210,000、220,000、230,000、240,000、250,000、260,000、270,000、280,000、290,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000、650,000或700,000个CD47分子的T细胞。

46.一种工程化细胞，其包含以下修饰：相对于对照，i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原的表达，以及ii)增加一种或多种致耐受因子的表达，其中所述工程化细胞以阈值水平或更高水平表达所述致耐受因子。

47.如权利要求46所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自由以下细胞组成的组：干细胞、多能干细胞(PSC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)、胚胎干细胞(ESC)、胰岛细胞、β胰岛细胞、免疫细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、巨噬细胞、免疫特权细胞、视细胞、视网膜色素上皮细胞(RPE)、肝细胞、甲状腺细胞、内皮细胞、皮肤细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、肌细胞、心脏细胞和血细胞。

48.如权利要求46或47所述的工程化细胞，其中所述对照是野生型细胞、对照细胞或基线参考。

49.如权利要求48所述的工程化细胞，其中所述对照细胞是未修饰的或未改变的细胞，任选地其中所述未修饰的或未改变的细胞与所述工程化细胞属于相同的细胞类型。

50.如权利要求48或49所述的工程化细胞，其中所述对照细胞是来自供体的起始材料或来自供体库的起始细胞库。

51.如权利要求48所述的工程化细胞，其中所述基线参考是同种型对照或背景信号水平。

52.如权利要求48或51所述的工程化细胞，其中所述基线是同种型对照，任选地其中所述致耐受因子的量使用基于抗体的测定法来测定。

53.如权利要求52所述的工程化细胞，其中所述致耐受因子的量使用基于抗体的定量方法、任选的QuantibriteT^M测定法来测定。

54.如权利要求46-53中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于所述对照表达至少大约相同量的致耐受因子。

55.如权利要求54所述的工程化细胞，其中所述细胞是免疫特权细胞。

56.如权利要求46-55中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于所述对照表达高至少约10％的量的所述致耐受因子。

57.如权利要求46-56中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于所述对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的所述致耐受因子。

58.如权利要求46-57中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于所述对照表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的所述致耐受因子。

59.如权利要求46-58中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于所述对照表达高至少约1000％的量的所述致耐受因子。

60.如权利要求46-55中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的所述致耐受因子的水平是所述对照中表达的至少约1.1倍。

61.如权利要求46-55或60中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的所述致耐受因子的水平是所述对照中表达的至少约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍。

62.如权利要求46-55、60或61中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的所述致耐受因子的水平是所述对照中表达的至少约4倍、约4.5倍、约5倍或约5.5倍。

63.如权利要求46-55或60-62中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的所述致耐受因子的水平是所述对照中表达的至少约4倍。

64.如权利要求46-55或60-63中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的所述致耐受因子的水平是所述对照中表达的至少约4.5倍。

65.如权利要求46-55或60-64中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的所述致耐受因子的水平是所述对照中表达的至少约5倍。

66.如权利要求46-55或60-65中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的所述致耐受因子的水平是所述对照中表达的至少约5.5倍。

67.如权利要求46-55或60-66中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的所述致耐受因子的水平是所述对照中表达的至少约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍。

68.如权利要求1-67中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰降低以下分子的表达：

a.MHC I类分子；

b.MHC II类分子；或

c.MHC I类分子和MHC II类分子。

69.如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰相对于对照降低B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B和/或NFY-C中的一种或多种的表达。

70.如权利要求1-66中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞不表达MHC I类分子和/或MHC II类分子。

71.如权利要求1-70中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于对照不表达B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B和/或NFY-C中的一种或多种。

72.如权利要求71所述的工程化细胞，其中所述修饰包括敲除选自由B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B和/或NFY-C组成的组的一个或多个靶标。

73.如权利要求1-72中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰降低选自由B2M、TAP1、NLRC5和/或CIITA组成的组的一个或多个靶标的表达。

74.如权利要求73所述的工程化细胞，其中所述修饰包括敲除选自由B2M、TAP1、NLRC5和/或CIITA组成的组的一个或多个靶标。

75.如权利要求72或74所述的工程化细胞，其中所述敲除发生在两个等位基因中。

76.如权利要求1-75中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞还包含相对于对照降低CTLA-4、PD-1、IRF1、MIC-A、MIC-B、参与氧化或ER应激的蛋白质、TRAC、TRB、CD142、ABO、CD38、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的表达的一种或多种修饰。

77.如权利要求76所述的工程化细胞，其中所述参与氧化或ER应激的蛋白质选自由硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、PKR样ER激酶(PERK)、需要肌醇的酶1α(IRE1α)和DJ-1(PARK7)组成的组。

78.如权利要求76或77所述的工程化细胞，其中所述修饰包括敲除选自由CTLA-4、PD-1、IRF1、MIC-A、MIC-B、参与氧化或ER应激的蛋白质、TRAC、TRB、CD142、ABO、CD38、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的组成的组的一个或多个靶标。

79.如权利要求78所述的工程化细胞，其中所述敲除发生在两个等位基因中。

80.如权利要求1-79中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰降低B2M的表达。

81.如权利要求1-79中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰降低CIITA的表达。

82.如权利要求1-79中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰降低B2M和CIITA的表达。

83.如权利要求80-82中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰包括敲除B2M和/或CIITA。

84.如权利要求83所述的工程化细胞，其中B2M和/或CIITA敲除发生在两个等位基因中。

85.如权利要求1-84中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰降低NK细胞配体、任选的MIC-A和/或MIC-B的表达。

86.如权利要求85所述的工程化细胞，其中所述修饰包括敲除MIC-A和/或MIC-B。

87.如权利要求86所述的工程化细胞，其中MIC-A和/或MIC-B敲除发生在两个等位基因中。

88.如权利要求1-87中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞还包含相对于对照降低一种或多种Y染色体基因的表达的修饰。

89.如权利要求88所述的工程化细胞，其中所述一种或多种Y染色体基因选自由Y连接的原钙粘附蛋白-11和Y连接的神经连接蛋白-4的组成的组。

90.如权利要求1-89中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰降低TXNIP的表达。

91.如权利要求90所述的工程化细胞，其中所述修饰包括敲除TXNIP。

92.如权利要求91所述的工程化细胞，其中TXNIP敲除发生在两个等位基因中。

93.如权利要求1-92中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞还包含降低B2M、TAPI、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B、NFY-C、CTLA-4、PD-1、IRF1、MIC-A、MIC-B、参与氧化或ER应激的蛋白质、TRAC、TRB、CD142、ABO、CD38、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的表达的修饰。

94.如权利要求92所述的工程化细胞，其中所述细胞不表达B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B、NFY-C、CTLA-4、PD-1、IRF1、MIC-A、MIC-B、参与氧化或ER应激的蛋白质、TRAC、TRB、CD142、ABO、CD38、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD。

95.如权利要求1-92中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞还包含相对于对照降低B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的表达的修饰。

96.如权利要求95所述的工程化细胞，其中所述细胞不表达B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD。

97.如权利要求1-45中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞包含降低一种或多种致耐受因子的表达的另外修饰。

98.如权利要求97所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子选自由A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1和/或Serpinb9组成的组。

99.如权利要求46-67中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子选自由A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD47、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1和/或Serpinb9组成的组。

100.如权利要求46-67和99中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括CD47。

101.如权利要求46-67和97-100中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括HLA-E。

102.如权利要求46-67和97-101中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括CD24。

103.如权利要求46-67和97-102中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括PD-L1。

104.如权利要求46-67和97-103中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括CD46。

105.如权利要求46-67和97-104中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括CD55。

106.如权利要求46-67和97-105中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括CD59。

107.如权利要求46-67和97-106中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括CR1。

108.如权利要求46-67和97-107中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括MANF。

109.如权利要求46-67和97-108中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括A20/TNFAIP3。

110.如权利要求46-67和97-109中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括HLA-E和CD47。

111.如权利要求46-67和97-110中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括CD24、CD47和/或PDL1中的一种或多种。

112.如权利要求46-67和97-111中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括HLA-E、CD24、CD47和/或PDL1中的一种或多种。

113.如权利要求46-67和97-112中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括CD46、CD55、CD59和/或CR1中的一种或多种。

114.如权利要求46-67和97-113中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括HLA-E、CD46、CD55、CD59和/或CR1中的一种或多种。

115.如权利要求46-67和97-114中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括HLA-E、CD24、CD47、PDL1、CD46、CD55、CD59和/或CR1中的一种或多种。

116.如权利要求46-67和97-115中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括HLA-E和PDL1。

117.如权利要求46-67和97-116中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括HLA-E、PDL1和/或A20/TNFAIP中的一种或多种。

118.如权利要求46-67和97-117中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括HLA-E、PDL1和/或MANF中的一种或多种。

119.如权利要求46-67和97-118中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子包括HLA-E、PDL1、A20/TNFAIP和/或MANF中的一种或多种。

120.如权利要求1-99中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰：

a.降低MHC I类和/或MHC II类分子的表达；

b.降低MIC-A和/或MIC-B的表达；

c.增加CD47以及任选的CD24和PD-L1的表达；以及

d.增加CD46、CD55、CD59和CR1的表达。

121.如权利要求1-99中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰：

a.降低MHC I类分子的表达；

b.降低MIC-A和/或MIC-B的表达；

c.降低TXNIP的表达；以及

d.增加PD-L1和HLA-E的表达。

122.如权利要求121所述的工程化细胞，其中所述修饰进一步增加A20/TNFAIP3和MANF的表达。

123.如权利要求1-122中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞源自人细胞或动物细胞。

124.如权利要求1-123中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是源自干细胞或其后代的分化细胞。

125.如权利要求124所述的工程化细胞，其中所述干细胞选自由多能干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)和胚胎干细胞(ESC)组成的组。

126.如权利要求1-125中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞源自原代细胞或其后代。

127.如权利要求1-126中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞在施用至受体患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。

128.如权利要求1-127中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞在施用至受体患者后被成熟NK细胞保护免受细胞裂解。

129.如权利要求1-128中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞在施用至受体患者后逃避巨噬细胞吞噬。

130.如权利要求1-129中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞在施用至受体患者后不诱导对所述细胞的先天和/或适应性免疫响应。

131.如权利要求1-130中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞在施用至受体患者后不诱导对所述细胞的基于抗体的免疫响应。

132.如权利要求1-131中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰中的一种或多种是可调控修饰。

133.一种工程化细胞，其包含相对于对照改变所述工程化细胞中一个或多个靶标的表达的一种或多种可调控修饰，任选地其中所述一种或多种可调控修饰相对于对照增加CD47的表达。

134.如权利要求132或133所述的工程化细胞，其中所述一种或多种可调控修饰包含条件性或诱导型基于RNA的组分，用于相对于对照i)增加或ii)降低或敲除所述一个或多个靶标的表达。

135.如权利要求134所述的工程化细胞，其中所述条件性或诱导型基于RNA的组分选自由条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA以及条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)组成的组。

136.如权利要求134或135所述的工程化细胞，其中所述条件性基于RNA的组分处于选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组的条件性启动子的控制下。

137.如权利要求134或135所述的工程化细胞，其中所述诱导型基于RNA的组分处于受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子的控制下。

138.如权利要求132或133所述的工程化细胞，其中所述可调控修饰包含条件性或诱导型基于DNA的组分，用于相对于对照i)增加或ii)降低或敲除所述一个或多个靶标的表达。

139.如权利要求138所述的工程化细胞，其中所述条件性或诱导型基于DNA的组分选自由以下各项组成的组：条件性或诱导型CRISPR、条件性或诱导型TALEN、条件性或诱导型锌指核酸酶、条件性或诱导型归巢核酸内切酶、条件性或诱导型引物编辑、条件性或诱导型PASTE编辑和条件性或诱导型大范围核酸酶。

140.如权利要求138或139所述的工程化细胞，其中所述条件性基于DNA的组分处于选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组的条件性启动子的控制下。

141.如权利要求138或139所述的工程化细胞，其中所述条件性基于DNA的组分处于受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子的控制下。

142.如权利要求138或139所述的工程化细胞，其中所述可调控修饰包含条件性或诱导型基于蛋白质的组分，用于相对于对照i)增加或ii)降低或敲除所述一个或多个靶标的表达。

143.如权利要求142所述的工程化细胞，其中所述条件性或诱导型基于蛋白质的组分是条件性或诱导型降解决定子组分。

144.如权利要求143所述的工程化细胞，其中所述条件性或诱导型降解决定子组分选自由使用SMASH标签的配体诱导性降解(LID)、使用Shield-1的LID、使用生长素的LID、使用雷帕霉素的LID、条件性或诱导型肽降解决定子(例如，基于IKZF3的降解决定子)和条件性或诱导型蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)组成的组。

145.如权利要求142-144中任一项所述的工程化细胞，其中所述条件性基于蛋白质的组分处于选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组的条件性启动子的控制下。

146.如权利要求142-144中任一项所述的工程化细胞，其中所述基于蛋白质的组分处于受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控的诱导型启动子的控制下。

147.如权利要求142-146中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞包含与编码所述一种或多种致耐受因子或所述CD47的外源多核苷酸可操作地连接的条件性启动子。

148.如权利要求142-146中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的条件性启动子的外源多核苷酸，和(ii)包含转座子的外源多核苷酸，所述转座子包含编码所述一种或多种致耐受因子或所述CD47的货物多核苷酸。

149.如权利要求147或148所述的工程化细胞，其中所述条件性启动子选自由细胞周期特异性启动子、组织特异性启动子、谱系特异性启动子和分化诱导型启动子组成的组。

150.如权利要求132-146中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞包含与编码所述一种或多种致耐受因子或所述CD47的外源多核苷酸可操作地连接的诱导型启动子。

151.如权利要求132-146中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞包含(i)包含与转座酶可操作地连接的诱导型启动子的外源多核苷酸，以及(ii)包含转座子的外源多核苷酸，所述转座子包含编码所述一种或多种致耐受因子或所述CD47的货物多核苷酸。

152.如权利要求150或151所述的工程化细胞，其中所述诱导型启动子受小分子、配体、生物剂、适体介导的聚腺苷酸化调节剂或适体调控的核糖开关调控。

153.如权利要求1-45或99-152中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞包含与SEQID NO:129的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或100％序列同一性的CD47多肽。

154.如权利要求1-45或99-152中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞包含与SEQID NO:130的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或100％序列同一性的CD47多肽。

155.如权利要求132-154中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞还包含相对于对照增加A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1和/或Serpinb9中的一种或多种的表达的可调控修饰。

156.如权利要求155所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1和/或Serpinb9。

157.如权利要求155或156所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于对照表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1和/或Serpinb9。

158.如权利要求155-157中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于对照表达高至少约1000％的量的A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1和/或Serpinb9。

159.如权利要求155-158中任一项所述的工程化细胞，其中所述对照是野生型细胞、对照细胞或基线参考。

160.如权利要求159所述的工程化细胞，其中所述对照细胞是未修饰的或未改变的细胞，任选地其中所述未修饰的或未改变的细胞与所述工程化细胞属于相同的细胞类型。

161.如权利要求159或160所述的工程化细胞，其中所述对照细胞是来自供体的起始材料或来自供体库的起始细胞库。

162.如权利要求159所述的工程化细胞，其中所述基线参考是同种型对照或背景信号水平。

163.如权利要求1-162中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受因子或所述CD47由第一外源多核苷酸编码。

164.如权利要求1-163中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。

165.如权利要求163或164所述的工程化细胞，其中所述第一外源多核苷酸和/或所述第二外源多核苷酸插入到所述细胞的至少一个等位基因的第一和/或第二特异性基因座中。

166.如权利要求165所述的工程化细胞，其中所述第一和/或第二特异性基因座选自由安全港基因座、靶标基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组。

167.如权利要求166所述的工程化细胞，其中所述安全港基因座选自由CCR5基因座、PPP1R12C基因座、Rosa基因座、ROSA26基因座和CLYBL基因座组成的组。

168.如权利要求166所述的工程化细胞，其中所述靶标基因座选自由CXCR4基因座、ALB基因座、SHS231基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座组成的组。

169.如权利要求163-168中任一项所述的工程化细胞，其中使用慢病毒载体将所述第一和/或第二外源多核苷酸引入到所述细胞中。

170.如权利要求163-169中任一项所述的工程化细胞，其中使用融合原介导的递送或选自由以下各项组成的组的转座酶系统将所述第一和/或第二外源多核苷酸引入到所述细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。

171.一种胰岛细胞，其相对于对照具有降低的MHC I类HLA表达和/或降低的MHC II类HLA表达并且表达高至少约1000％的量的CD47。

172.如权利要求171所述的细胞，其中所述细胞是表达的CD47的水平是对照中表达的至少约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍的原代β胰岛细胞。

173.一种工程化细胞，其表达相对于对照高至少约10％的量的CD47，或表达的CD47的水平是对照中表达的至少约1.1倍。

174.一种工程化细胞，其表达相对于对照高至少约10％的量的CD47，或表达的CD47的水平是对照中表达的至少约1.1倍。

175.如权利要求173或174所述的工程化细胞，其中所述细胞相对于对照表达高至少约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％的量的CD47。

176.如权利要求173-175中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞表达的CD47的水平是所述对照中表达的至少约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍。

177.如权利要求173-176中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是相对于对照表达高至少约1000％或至少约2000％的量的CD47的原代胰岛细胞。

178.如权利要求171-177中任一项所述的工程化细胞，其中所述对照是野生型细胞、对照细胞或基线参考。

179.如权利要求178所述的工程化细胞，其中所述对照细胞是未修饰的或未改变的细胞，任选地其中所述未修饰的或未改变的细胞与所述工程化细胞属于相同的细胞类型。

180.如权利要求178或179所述的工程化细胞，其中所述对照细胞是来自供体的起始材料或来自供体库的起始细胞库。

181.如权利要求178所述的工程化细胞，其中所述基线参考是同种型对照或背景信号水平。

182.如权利要求171-181中任一项所述的工程化细胞，其中所述CD47水平使用基于抗体的定量方法、任选的Quantibrite^TM测定法来测定。

183.一种工程化T细胞，其相对于对照具有降低的MHC I类HLA表达和/或降低的MHC II类HLA表达并且表达高至少约10％的量的CD47，表达的CD47的水平是对照中表达的至少约1.1倍，或表达至少约170,000个CD47分子。

184.如权利要求221所述的工程化细胞，其中所述细胞是相对于对照表达高至少约300％或至少约400％的量的CD47的T细胞。

185.如权利要求183所述的工程化细胞，其中所述细胞是表达的CD47的水平是所述对照中表达的至少约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍的T细胞。

186.一种工程化T细胞，其表达至少约170,000个CD47分子。

187.如权利要求186所述的工程化T细胞，其中所述T细胞表达至少约180,000个CD47分子、至少约190,000个CD47分子、至少约200,000个CD47分子、至少约210,000个CD47分子、至少约220,000个CD47分子、至少约230,000个CD47分子、至少约240,000个CD47分子、至少约250,000个CD47分子、至少约260,000个CD47分子、至少约270,000个CD47分子、至少约280,000个CD47分子、至少约290,000个CD47分子或至少约300,000个CD47分子。

188.如权利要求183-187中任一项所述的工程化细胞，其中所述对照是野生型细胞、对照细胞或基线参考。

189.如权利要求188所述的工程化细胞，其中所述对照细胞是未修饰的或未改变的细胞，任选地其中所述未修饰的或未改变的细胞与所述工程化细胞属于相同的细胞类型。

190.如权利要求188或189所述的工程化细胞，其中所述对照细胞是来自供体的起始材料或来自供体库的起始细胞库。

191.如权利要求190所述的工程化细胞，其中所述基线参考是同种型对照或背景信号水平。

192.如权利要求183-191中任一项所述的工程化细胞，其中所述CD47水平使用基于抗体的定量方法、任选的Quantibrite^TM测定法来测定。

193.如权利要求1-192中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞包含1、2、3、4或5个拷贝的编码CD47的外源多核苷酸。

194.如权利要求193所述的工程化细胞，其中所述细胞包含与编码CD47的外源多核苷酸可操作地连接的组成型启动子。

195.如权利要求1-194中任一项所述的工程化细胞，其中编码CD47的外源多核苷酸经由病毒介导的整合递送至所述细胞。

196.如权利要求195所述的工程化细胞，其中所述病毒介导的整合是慢病毒介导的。

197.如权利要求1-196中任一项所述的工程化细胞，其中编码CD47的外源多核苷酸经由HDR整合在所述细胞基因组中的某个位点处。

198.如权利要求197所述的工程化细胞，其中所述编码CD47的外源多核苷酸整合到TRAC基因中的基因座、TRBC基因中的基因座或其组合中。

199.如权利要求198所述的T细胞，其中所述编码CD47的外源多核苷酸整合到至少一个TRAC等位基因、至少一个TRBC等位基因或其组合中。

200.如权利要求198或199所述的T细胞，其中所述编码CD47的外源多核苷酸整合到至少两个TRAC等位基因、至少两个TRBC等位基因或其组合中。

201.如权利要求1-200中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含外源多核苷酸，所述外源多核苷酸包含与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性、与SEQ IDNO:129的氨基酸序列具有至少约85％序列同一性、与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性、与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性、与SEQID NO:129的氨基酸序列具有至少约98％的序列同一性、与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少约99％的序列同一性或具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CD47多肽。

202.如权利要求1-200中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含外源多核苷酸，所述外源多核苷酸包含与SEQ ID NO:130的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性、与SEQ IDNO:130的氨基酸序列具有至少约85％序列同一性、与SEQ ID NO:130的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性、与SEQ ID NO:130的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性、与SEQID NO:130的氨基酸序列具有至少约98％的序列同一性、与SEQ ID NO:130的氨基酸序列具有至少约99％的序列同一性或具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CD47多肽。

203.如权利要求171-202中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含相对于对照降低的一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达。

204.如权利要求203所述的细胞，其中所述降低的所述一种或多种MHC I类和/或MHCII类分子的表达是由对编码所述MHC I类和/或II类HLA的一种或多种基因的组成型修饰引起的。

205.如权利要求204或205中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含选自由MHC I类和MHC II类HLA组成的组的靶标的一种或多种敲除。

206.如权利要求205所述的细胞，其中所述一种或多种敲除是组成型敲除。

207.如权利要求204-206中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含相对于所述对照降低的选自由B2M和CIITA组成的组的一个或多个靶标的表达。

208.如权利要求207所述的细胞，其中所述降低的B2M和/或CIITA的表达是由对所述B2M基因和/或所述CIITA基因的组成型修饰引起的。

209.如权利要求204-208中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含选自由B2M和CIITA组成的组的靶标的一种或多种敲除。

210.如权利要求209所述的细胞，其中所述细胞包含B2M的两个等位基因和/或CIITA的两个等位基因的敲除。

211.如权利要求209或210所述的细胞，其中所述一种或多种敲除是组成型敲除。

212.如权利要求204-211中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含编码一种或多种其他致耐受因子的外源多核苷酸。

213.如权利要求212所述的细胞，其中所述一种或多种其他致耐受因子选自由HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CI-抑制剂和IL-35组成的组。

214.如权利要求204-213中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含相对于所述对照降低的B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的表达。

215.如权利要求214所述的细胞，其中所述细胞不表达B2M、CIITA、NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、MIC-A/B、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD。

216.如权利要求204-215中任一项所述的细胞，其中所述细胞是多能干细胞。

217.如权利要求216所述的细胞，其中所述多能干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)或胚胎干细胞(ESC)。

218.如权利要求204-217中任一项所述的细胞，其中所述细胞是源自多能干细胞或其后代的分化细胞。

219.如权利要求218所述的细胞，其中所述分化细胞选自由胰岛细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、CAR-M细胞、内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞和甲状腺细胞组成的组。

220.如权利要求204-219中任一项所述的细胞，其中所述细胞是原代细胞或其后代。

221.如权利要求220所述的细胞，其中所述原代细胞或其后代是T细胞或NK细胞。

222.如权利要求219或221中任一项所述的细胞，其中所述T细胞还包含降低的T细胞受体(TCR)-α和/或TCR-β的表达。

223.如权利要求222所述的细胞，其中所述T细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。

224.如权利要求219或221-223中任一项所述的细胞，其中所述T细胞还包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。

225.如权利要求204-224中任一项所述的细胞，其中所述细胞相对于对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47表达，以及相对于对照降低的MHC I类和MHC II类人白细胞抗原中的一种或多种的表达。

226.如权利要求204-225中任一项所述的细胞，其中所述细胞表达的CD47的水平是不表达CD47或低表达CD47的野生型细胞或对照细胞中表达的至少约2倍、约3倍、约4倍或约5倍，并且相对于所述对照细胞，降低MHC I类和MHC II类人白细胞抗原中的一种或多种的表达。

227.如权利要求226所述的细胞，其中所述细胞表达的CD47的水平是不表达或低表达CD47的相同细胞类型的野生型细胞或对照细胞中表达的至少约3倍、约4倍或约5倍。

228.如权利要求225-227中任一项所述的细胞，其中所述对照细胞是胰岛细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、CAR-M细胞、内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞或甲状腺细胞。

229.如权利要求219-228中任一项所述的细胞，其中所述分化细胞或其后代、或所述原代免疫细胞或其后代在施用至受体患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性，在施用至受体患者后被成熟NK细胞保护免受细胞裂解，在施用至受体患者后逃避巨噬细胞吞噬，在施用至受体患者后不诱导对所述细胞的先天和/或适应性免疫响应，和/或在施用至受体患者后不诱导对所述细胞的基于抗体的免疫响应。

230.如权利要求1-229中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是自体细胞。

231.如权利要求1-229中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是同种异体细胞。

232.一种药物组合物，其包含如权利要求1-231中任一项所述的工程化细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。

233.如权利要求232所述的药物组合物，其中所述工程化细胞是β胰岛细胞，并且所述药物组合物还包含一种或多种另外的胰岛细胞。

234.一种治疗将受益于基于细胞的疗法的患有疾病或疾患的患者的方法，其包括向所述患者施用临床有效量或治疗有效量的如权利要求1-231中任一项所述的工程化细胞。

235.一种治疗将受益于基于细胞的疗法的患有疾病或疾患的患者的方法，其包括向所述患者施用包含如权利要求1-231中任一项所述的工程化细胞的细胞群。

236.一种治疗将受益于基于细胞的疗法的患有疾病或疾患的患者的方法，其包括向所述患者施用包含如权利要求1-231中任一项所述的分化细胞的细胞群。

237.一种治疗将受益于基于细胞的疗法的患有疾病或疾患的患者的方法，其包括向所述患者施用如权利要求302或303所述的药物组合物。

238.如权利要求234-237所述的方法，其中所述疾病或疾患选自由以下各项组成的组：癌症、遗传病症、慢性传染病、自身免疫性病症、神经系统病症、心脏病症(选自由儿科心肌病、年龄相关性心肌病、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、慢性缺血性心肌病、围产期心肌病、炎性心肌病、特发性心肌病、其他心肌病、心肌缺血再灌注损伤、心室功能障碍、心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、终末期心脏病、动脉粥样硬化、局部缺血、高血压、再狭窄、心绞痛、风湿性心脏病、动脉炎症、心血管疾病、心肌梗塞、心肌局部缺血、心肌梗塞、心脏局部缺血、心脏损伤、心肌局部缺血、血管疾病、后天性心脏病、先天性心脏病、冠状动脉疾病、传导系统功能障碍、冠状动脉功能障碍、肺动脉高压、心律失常、肌营养不良、肌肉质量异常、肌肉变性、心肌炎、感染性心肌炎、药物或毒素诱导的肌肉异常、过敏性心肌炎、二尖瓣关闭不全、自身免疫性心内膜炎、原发性心律失常疾病、心脏微血管病、长QT综合征、短QT综合征、布鲁加达综合征、儿茶酚胺能多形性室性心动过速、耶韦尔和兰格-尼尔森综合征、心肌梗塞、心力衰竭、心肌病、先天性心脏缺陷、心脏瓣膜疾病或功能障碍、心内膜炎、风湿热、二尖瓣脱垂、感染性心内膜炎、肥厚性心肌病、扩张性心肌病、心肌炎、心脏扩大、二尖瓣关闭不全组成的组)、神经系统病症(选自由阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、佩-梅二氏病、其他神经退行性疾病或疾患、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、局部缺血、多发性硬化、创伤性脑损伤、癫痫、僵直症、脑炎、脑膜炎、偏头痛、中风、短暂性脑缺血发作、蛛网膜下出血、硬膜下出血、血肿、硬膜外出血、脊髓损伤、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、周围神经病、吉兰-巴雷综合征、神经痛、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、τ蛋白病、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、嗜银粒病、贝尔麻痹、脑瘫、运动神经元疾病、神经纤维瘤病、脑炎、脑膜炎、图雷特氏综合征、精神分裂症、精神病、抑郁症和其他神经精神病症组成的组)、血管性痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多发性硬化、其他神经退行性疾病或疾患、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、图雷特氏综合征(TS)、精神分裂症、精神病、抑郁症、其他神经精神病症、HIV-1相关神经认知障碍、创伤性脑损伤、中风、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、脑出血、癫痫发作、脊髓损伤、嗜银粒病(AGD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、皮质基底节变性(CBD)、17号染色体相关帕金森氏病(FTDP-17)、多系统萎缩(MSA)、帕金森氏病/弥漫性路易体病(PD/DLBD)或阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化形成、动脉血栓形成、静脉血栓形成、血小板微血管病、血管渗漏、弥漫性血管内凝血、糖尿病、胰岛素抵抗、心血管疾病、血管疾病、周围血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、周围血管阻塞性疾病、中风、再灌注损伤、肢体局部缺血、神经病(例如，周围神经病或糖尿病性神经病)、器官衰竭(例如，肝衰竭、肾衰竭等)、糖尿病、类风湿性关节炎、骨质疏松症、血管损伤、组织损伤、高血压、由冠状动脉疾病引起的心绞痛和心肌梗塞、肾血管性高血压、由肾动脉狭窄引起的肾衰竭、下肢跛行、短暂性脑缺血发作或中风、心肌梗塞和肢体局部缺血、缺血组织的修复、血管和心脏瓣膜的形成、人工血管的工程化、受损血管的修复以及诱导工程化组织中血管的形成(例如，在移植之前)、修复或替换需要血管细胞或血管化的组织、心脏组织、肝脏组织、胰腺组织、肾组织、肌肉组织、神经组织、骨组织等(其可以是受损的并且以过度细胞死亡为特征的组织、有受损风险的组织或人工工程化组织)、冠状动脉疾病、脑血管疾病、主动脉狭窄、主动脉瘤、外周动脉疾病、动脉粥样硬化、静脉曲张、血管病、缺乏冠状动脉灌注的心脏梗塞区域、不愈合伤口、糖尿病或非糖尿病性溃疡、或任何希望诱导血管形成、从而改进在血管重建手术中使用的假体植入物(例如，由诸如Dacron和Gortex的合成材料制成的血管)的任何其他疾病或病症、选自由血管损伤、心血管疾病、血管疾病、周围血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、周围血管阻塞性疾病、高血压、缺血性组织损伤、再灌注损伤、肢体局部缺血、中风、神经病(例如，周围神经病或糖尿病性神经病)、器官衰竭(例如，肝衰竭、肾衰竭等)、糖尿病、类风湿性关节炎、骨质疏松症、脑血管疾病、高血压、由冠状动脉疾病引起的心绞痛和心肌梗塞、肾血管性高血压、由肾动脉狭窄引起的肾衰竭、下肢跛行、其他血管疾患或疾病组成的组的血管病症、自身免疫性甲状腺炎、甲状腺肿、甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退(先天性或自身免疫性)、甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、产后甲状腺炎、亚急性甲状腺炎、医源性甲状腺功能减退、格雷夫氏病和甲状腺眼病、传染性肝炎(甲型、乙型和丙型)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪肝疾病、肝硬化、血色素沉着病、高草酸尿症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、肝衰竭、威尔逊氏病、肝性脑病、黄疸、急性肝卟啉症、阿拉吉欧综合征、胆道闭锁、布特-基亚里综合征、高胆红素血症、克里格勒-纳贾尔综合征、吉尔伯特-莫伊伦格腊赫特综合征、杜宾-约翰逊综合征、罗托综合征、半乳糖血症、1型糖原贮积病、肝肾综合征、妊娠期肝内胆汁淤积症、进行性家族性肝内胆汁淤积、雷耶氏综合征、溶酶体酸性脂酶缺乏症、酒精相关性胰腺炎、胆石性胰腺炎、糖尿病(1型和2型)、前驱糖尿病、妊娠期糖尿病、无胰腺性糖尿病、胰腺外分泌功能不全、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、遗传性胰腺炎、高胰岛素血症、胰腺囊肿、佐林格-埃里森综合征、史华曼-戴蒙德综合征、遗传性血色素沉着症、地中海贫血、胰腺铁沉积、囊性纤维化、胰腺分裂和胰腺切除、黄斑变性或具有受损RPE细胞的患者、年龄相关性黄斑变性(AMD)、早期AMD、中期AMD、晚期AMD、非新生血管性年龄相关性黄斑变性、干性黄斑变性(干性年龄相关性黄斑变性)、湿性黄斑变性(湿性年龄相关性黄斑变性)、成人发病的卵黄样黄斑营养不良(AVMD)、贝斯特卵黄样黄斑营养不良、斯塔加特样黄斑营养不良(STGD3)、索尔比氏眼底营养不良(SFD)、ABCA4相关疾病、Usher IB型、常染色体隐性遗传性黄斑变性、常染色体显性玻璃体视网膜脉络膜病、幼年型黄斑变性(JMD)、莱伯先天性黑蒙或色素性视网膜炎、视网膜脱离、视网膜撕裂、严重联合免疫缺陷(SCID)、奥门综合征、软骨-毛发发育不全、网状发育不全、维斯科特-奥尔德里奇综合征、共济失调性毛细血管扩张症、迪乔治综合征、免疫性骨发育不良、先天性角化不良、慢性皮肤粘膜念珠菌病、恶性血液病、滤泡性淋巴瘤(FL)、骨髓肿瘤、成熟T/NK肿瘤、组织细胞肿瘤、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)、华氏巨球蛋白血症、伯基特淋巴瘤(BL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBL)、霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、毛细胞白血病(HCL)、骨髓增生性/骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴性白血病(T-ALL)、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、自身免疫性疾病包括例如狼疮、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、阿狄森氏病、格雷夫斯病、舍格伦氏综合征、桥本氏甲状腺炎、1型糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、乳糜泻、癌症包括但不限于B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌、膀胱癌、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、自身免疫性肝病、舍格伦氏综合征、类风湿性关节炎、系统性硬化症(硬皮病)、器官特异性自身免疫性疾病(自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎)、酒精相关性肝病、多发性硬化、NK细胞缺陷(NKD)(功能性(FNKD)或经典型(CNKD))、X连锁免疫缺陷多内分泌腺病肠病(IPEX)样综合征、布卢姆综合征、范可尼氏贫血、先天性角化不良、谢迪埃克-赫加希综合征、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(FHL)、格里瑟里综合征2型、赫曼斯基-普德拉克综合征、帕-勒氏综合征、维斯科特-奥尔德里奇综合征、常染色体隐性高IgE综合征、梅-海二氏异常以及I型或III型白细胞粘附缺陷。

239.如权利要求234-238所述的方法，其中所述分化细胞选自由以下各项组成的组：间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)、胰岛细胞、β胰岛细胞、免疫细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、巨噬细胞、免疫特权细胞、视细胞、视网膜色素上皮细胞(RPE)、肝细胞、甲状腺细胞、内皮细胞、皮肤细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、肌细胞、心脏细胞和血细胞。

240.如权利要求234-239中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞群之前不向所述患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。

241.如权利要求234-240中任一项所述的方法，其还包括向所述患者施用一种或多种免疫抑制剂。

242.如权利要求234-241中任一项所述的方法，其中所述患者已被施用一种或多种免疫抑制剂。

243.如权利要求241或242所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂是小分子或抗体。

244.如权利要求241-243中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂选自由以下各项组成的组：环孢菌素、硫唑嘌呤、霉酚酸、吗替麦考酚酯、皮质类固醇、泼尼松、甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺吡啶、抗疟药、布喹那、来氟米特、咪唑立宾、15-脱氧精胍菌素、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素、他克莫司(FK-506)、OKT3、抗胸腺细胞球蛋白、胸腺五肽(胸腺素-α)和免疫抑制抗体。

245.如权利要求241-244中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括环孢菌素。

246.如权利要求241-245中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括吗替麦考酚酯。

247.如权利要求241-246中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括皮质类固醇。

248.如权利要求241-247中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括环磷酰胺。

249.如权利要求241-248中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括雷帕霉素。

250.如权利要求241-249中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括他克莫司(FK-506)。

251.如权利要求241-250中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括抗胸腺细胞球蛋白。

252.如权利要求241-251中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂是一种或多种免疫调节剂。

253.如权利要求252所述的方法，其中所述一种或多种免疫调节剂是小分子或抗体。

254.如权利要求243或权利要求253所述的方法，其中所述抗体结合至选自由以下各项组成的组的受体或配体中的一种或多种：IL-2受体的p75、MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-6、IGF、IGFR1、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a、CD58和结合至它们的任何配体的抗体。

255.如权利要求241-254中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂在施用所述工程化细胞前施用至或已施用至所述患者。

256.如权利要求241-255中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂在施用所述工程化细胞前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天施用至或已施用至所述患者。

257.如权利要求241-256中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂在施用所述工程化细胞前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间施用至或已施用至所述患者。

258.如权利要求241-257中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂在施用所述工程化细胞后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天施用至或已施用至所述患者。

259.如权利要求241-258中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂在施用所述工程化细胞后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间施用至或已施用至所述患者。

260.如权利要求241-259中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂在第一次施用所述工程化细胞的同一天施用至或已施用至所述患者。

261.如权利要求241-260中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂在施用所述工程化细胞后施用至或已施用至所述患者。

262.如权利要求241-261中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂在第一次和/或第二次施用所述工程化细胞后施用至或已施用至所述患者。

263.如权利要求241-262中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂在第一次和/或第二次施用所述工程化细胞前施用至或已施用至所述患者。

264.如权利要求241-263中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂在第一次和/或第二次施用所述工程化细胞前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天施用至或已施用至所述患者。

265.如权利要求241-264中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂在第一次和/或第二次施用所述工程化细胞前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间施用至或已施用至所述患者。

266.如权利要求241-265中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂在第一次和/或第二次施用所述工程化细胞后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天施用至或已施用至所述患者。

267.如权利要求241-266中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂在第一次和/或第二次施用所述工程化细胞后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间施用至或已施用至所述患者。

268.如权利要求241-267中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂的施用剂量低于为减少不包含所述工程化细胞的修饰的免疫原性细胞的免疫排斥而施用的一种或多种免疫抑制剂的剂量。

269.如权利要求1-231中任一项所述的工程化细胞群用于治疗将受益于基于细胞的疗法的受体患者的病症或疾患的用途。

270.一种用于产生如权利要求1-231中任一项所述的工程化细胞或包含如权利要求1-231中任一项所述的工程化细胞的细胞群的方法，所述方法包括

a.获得分离的细胞；和

b.使所述分离的细胞与一种或多种试剂和/或组分接触以修饰所述分离的细胞中的基因表达，从而产生所述工程化细胞或包含所述工程化细胞的所述细胞群。

271.如权利要求270所述的方法，其中所述方法还包括确定所述工程化细胞或所述细胞群的CD47表达水平。

272.如权利要求270或271所述的方法，其中所述方法还包括如果确定所述工程化细胞或所述细胞群以阈值水平或更高水平表达CD47，则选择所述工程化细胞或所述细胞群用于生产治疗产品。

273.如权利要求27-272中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞或所述细胞群相对于所述对照表达至少大约相同量的CD47。

274.如权利要求270-273中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞或所述细胞群相对于所述对照表达高至少约10％的量的CD47。

275.如权利要求270-274中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞或所述细胞群相对于所述对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量的CD47。

276.如权利要求270-275中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞或所述细胞群相对于所述对照表达高至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％的量的CD47。

277.如权利要求270-276中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞或所述细胞群相对于所述对照表达高至少约1000％的量的CD47。

278.如权利要求270-277中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞或所述细胞群表达的CD47水平是所述对照中表达的至少约1.1倍。

279.如权利要求270-273和278中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞或所述细胞群表达的CD47水平是所述对照中表达的至少约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍。

280.如权利要求270-273、278和279中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞或所述细胞群表达的CD47水平是所述对照中表达的至少约4倍、约4.5倍、约5倍或约5.5倍。

281.如权利要求270-273和278-280中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞或所述细胞群表达的CD47水平是所述对照中表达的至少约4倍。

282.如权利要求270-273和278-281中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞或所述细胞群表达的CD47水平是所述对照中表达的至少约4.5倍。

283.如权利要求270-273和278-282中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞或所述细胞群表达的CD47水平是所述对照中表达的至少约5倍。

284.如权利要求270-273和278-283中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞或所述细胞群表达的CD47水平是所述对照中表达的至少约5.5倍。

285.如权利要求270-273和278-284中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞或所述细胞群表达的CD47水平是所述对照中表达的至少约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍。

286.如权利要求270-285中任一项所述的方法，其中所述对照是野生型细胞或野生型细胞群、对照细胞或对照细胞群、或基线参考。

287.如权利要求286所述的方法，其中所述对照细胞或所述对照细胞群包含未修饰的或未改变的细胞，任选地其中所述未修饰的或未改变的细胞与所述工程化细胞属于相同的细胞类型。

288.如权利要求286或287所述的方法，其中所述对照细胞或所述对照细胞群是来自供体的起始材料或来自供体库的起始细胞库。

289.如权利要求286所述的方法，其中所述基线参考是同种型对照或背景信号水平。

290.如权利要求270-289中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞是β胰岛细胞，并且所述细胞群包含β胰岛细胞和另外的胰岛细胞。

291.如权利要求270-289中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞包含相对于对照改变所述工程化细胞中一个或多个靶标的表达的可调控修饰。

292.如权利要求291所述的方法，其中相对于野生型细胞、野生型细胞群、对照细胞或对照细胞群，所述可调控修饰降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达。

293.如权利要求291或292所述的方法，其中相对于野生型细胞、野生型细胞群、对照细胞或对照细胞群，所述可调控修饰增加一种或多种致耐受因子的表达。

294.如权利要求293-294中任一项所述的方法，其中修饰所述分离的细胞中基因表达的所述一种或多种试剂包含i)改变所述一个或多个靶标的表达的条件性或诱导型基于RNA的组分，ii)改变所述一个或多个靶标的表达的条件性或诱导型基于DNA的组分，或iii)改变所述一个或多个靶标的表达的条件性或诱导型基于蛋白质的组分。

295.如权利要求294所述的方法，其中所述方法还包括将所述分离的细胞与外源因子接触或将所述分离的细胞暴露于一定条件以活化所述条件性或诱导型启动子，从而引起所述一个或多个靶标的表达，从而产生所述工程化细胞。

296.一种用于产生工程化细胞的方法，所述工程化细胞包含可调控修饰，所述可调控修饰相对于对照i)降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达，以及ii)增加一种或多种致耐受因子的表达，所述方法包括：

(a)获得分离的细胞；

(b)向所述细胞中引入用于所述MHC I类和/或MHC II类人白细胞分子的可调控的降低表达的条件性或诱导型基于RNA的组分、用于所述MHC I类和/或MHC II类人白细胞分子的可调控的降低表达的条件性或诱导型基于DNA的组分、或用于所述MHC I类和/或MHC II类人白细胞分子的可调控的降低表达的条件性或诱导型基于蛋白质的组分；

(c)将所述细胞暴露于一定条件或外源因子以活化所述条件性或诱导型组分，从而导致所述MHC I类和/或MHC类分子的表达降低；

(d)向所述分离的细胞中引入包含与编码所述一种或多种致耐受因子的外源多核苷酸可操作地连接的条件性或诱导型启动子的核酸，用于可调控地增加所述一种或多种致耐受因子的表达；以及

297.如权利要求296所述的方法，其中步骤(a)-(d)以任何依序进行。

298.如权利要求296所述的方法，其中步骤(a)-(d)中的一个或多个同时进行。

299.如权利要求296所述的方法，其中步骤(b)和(c)在步骤(d)和(e)之前进行。

300.如权利要求296所述的方法，其中步骤(d)和(e)在步骤(b)和(c)之前进行。

301.如权利要求296所述的方法，其中步骤(c)和(e)依序进行。

302.如权利要求296所述的方法，其中步骤(c)和(e)同时进行。

303.一种用于鉴定适合用作治疗产品的细胞群或包含如权利要求1-231中任一项所述的工程化细胞的细胞群的方法，所述方法包括：

(a)获得分离的细胞；

(b)向所述细胞中引入相对于对照降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达的一种或多种修饰；

(c)向所述细胞中引入相对于对照增加CD47的表达的一种或多种修饰；

(d)测量所述细胞的CD47表达水平；以及

(e)选择相对于所述对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47的细胞群，并鉴定所述群适合用作治疗产品。

304.一种用于鉴定适合用作治疗产品的细胞群或包含如权利要求1-231中任一项所述的工程化细胞的细胞群的方法，所述方法包括：

(a)获得分离的细胞；

(d)测量所述细胞的CD47表达水平；以及

(e)选择表达的CD47的水平是对照中表达的至少约1.1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍的细胞群，并鉴定所述群适合用作治疗产品。

305.如权利要求303或304所述的方法，其中步骤(b)在步骤(c)之前进行。

306.如权利要求303或304所述的方法，其中步骤(c)在步骤(b)之前进行。

307.如权利要求303或304所述的方法，其中步骤(b)和(c)同时进行。

308.一种确定细胞群是否适合用作治疗产品的方法，所述方法包括：

(a)产生包含编码CD47的第一外源多核苷酸的工程化细胞，任选地如权利要求1-231中任一项所述的工程化细胞；

(b)测量所述细胞的CD47表达水平；以及

(c)如果所述细胞相对于对照以高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47表达，则确定所述细胞群适合用作治疗产品。

309.一种确定细胞群是否适合用作治疗产品的方法，所述方法包括：

(b)测量所述细胞的CD47表达水平；以及

(c)如果所述细胞表达的CD47的水平是对照中表达的至少约1.1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍，则确定所述细胞群适合用作治疗产品。

310.如权利要求296-309中任一项所述的方法，其中所述对照是野生型细胞、对照细胞或基线参考。

311.如权利要求310所述的方法，其中所述对照细胞是未修饰的或未改变的细胞，任选地其中所述未修饰的或未改变的细胞与所述工程化细胞属于相同的细胞类型。

312.如权利要求310或311所述的方法，其中所述对照细胞是来自供体的起始材料或来自供体库的起始细胞库。

313.如权利要求310所述的方法，其中所述基线参考是同种型对照或背景信号水平。

314.如权利要求296-313中任一项所述的方法，其中所述CD47水平使用基于抗体的定量方法、任选的Quantibrite^TM测定法来测定。

315.一种确定低免疫原性细胞的免疫逃避所需的CD47表达水平的阈值的方法，所述方法包括：

(a)产生包含编码CD47的第一外源多核苷酸的工程化细胞；

(c)评估由所述细胞库诱导的免疫响应；以及

(d)确定免疫逃避所需的CD47表达水平的阈值。

316.如权利要求315所述的方法，其中所述CD47水平使用基于抗体的定量方法、任选的Quantibrite^TM测定法来测定。

317.如权利要求315所述的方法，其中所述方法的步骤(a)还包括将所述细胞工程化以包含相对于野生型细胞或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因和主要组织相容性复合物(MHC)I类和/或II类人白细胞抗原的表达。

318.如权利要求315或317所述的方法，其中所述免疫响应的评估是使用体外测定法或体内测定法进行的。

319.如权利要求318所述的方法，其中所述免疫响应的评估是通过测量NK细胞介导的细胞毒性、成熟NK细胞的裂解、巨噬细胞吞噬、对所述细胞的基于抗体的免疫响应或通过测量在施用至受体患者一定时间后仍然存在于损伤受体中的所述细胞的百分比进行的。

320.一种用于鉴定适合用作治疗产品的细胞群或包含如权利要求1-231中任一项所述的工程化细胞的细胞群的方法，所述方法包括：

(a)向分离的细胞中引入相对于对照降低一种或多种MHC I类和/或MHC II类分子的表达的一种或多种修饰，以及

(b)向所述细胞中引入相对于对照增加CD47的表达的一种或多种修饰。

321.如权利要求320所述的方法，其还包括步骤(c)测量所述细胞的CD47表达水平。

322.如权利要求321所述的方法，其还包括步骤(d)选择相对于所述对照表达高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的量的CD47的细胞群，并鉴定所述群适合用作治疗产品。

323.如权利要求321所述的方法，其还包括步骤(d)选择表达的CD47的水平是对照中表达的至少约1.1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍或约20倍的细胞群，并鉴定所述群适合用作治疗产品。

324.如权利要求320-323中任一项所述的方法，其中步骤(a)在步骤(b)之前进行。

325.如权利要求320-323中任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前进行。

326.如权利要求320-323中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)同时进行。