JP2016539117A - 平均化された効力を持つ同種異系ｔ細胞のバッチを生成するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、平均化された効力を持つリンパ球のバッチを生成するための方法に関する。具体的には、本発明は、NKアロ反応性および抗HLA免疫応答を避けるために、複数の異なるドナーからのリンパ球をプールする方法に関する。各ドナーからのリンパ球は、TCR成分をコードする少なくとも一つの遺伝子を不活化し、一つにプールしてから、それを必要とする対象に投与される。したがってこの方法では、特にがん、ウイルス感染または自己免疫疾患を処置するための、平均化された効力を持つリンパ球のバッチを、生成することが可能になる。本発明は、この方法によって得ることができるリンパ球のバッチにも関係する。このリンパ球のバッチは、特にがん、自己免疫疾患またはウイルス感染を処置するために、「既製」の治療製品として入手できるようにして、一人または数人の患者への投与に使用することができる。

Description

発明の分野
本発明は、平均化された効力を持つリンパ球のバッチを生成するための方法に関する。具体的には、本発明は、NKアロ反応性および抗HLA免疫応答を避けるために、複数の異なるドナーからのリンパ球をプールする方法に関する。各ドナーからのリンパ球は、TCR成分をコードする少なくとも一つの遺伝子を不活化し、一つにプールしてから、それを必要とする対象に投与される。したがってこの方法では、特にがん、ウイルス感染または自己免疫疾患を処置するための、平均化された効力を持つリンパ球のバッチを、生成することが可能になる。本発明は、この方法によって得ることができるリンパ球のバッチにも関係する。このリンパ球のバッチは、特にがん、自己免疫疾患またはウイルス感染を処置するために、「既製」の治療製品として入手できるようにして、一人または数人の患者への投与に使用することができる。

発明の背景
エクスビボで生成した自己抗原特異的T細胞の移入を伴う養子免疫療法は、ウイルス感染およびがんを処置するための有望な戦略である。養子免疫療法に使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の拡大または遺伝子工学によるT細胞のリダイレクションのいずれかによって生成することができる（Park,Rosenberg et al. 2011）。ウイルス抗原特異的T細胞の移入は、移植関連ウイルス感染の処置や珍しいウイルス関連悪性疾患の処置に使用される確立された手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離と移入は、黒色腫の処置でも奏功することが示されている。

養子免疫療法を使って患者を処置するための最新のプロトコールは、自己細胞移入に基づいている。このアプローチでは、Tリンパ球を患者から回収し、エクスビボで遺伝子改変または選択し、必要であれば細胞の数を増幅するためにインビトロで培養し、最後に患者に注入する。自己療法には、実用上、本質的な技術上およびロジスティクス上の障害がある。その生成には費用のかかる専用の施設と専門的人員とが必要となり、患者の診断後、短時間で自己細胞を生成しなければならないし、患者の予備処置が免疫機能の低下をもたらす場合も多いので、患者のリンパ球は機能的に不十分であり、極めて少数しか存在しない可能性もある。これらの障害ゆえに、各患者の自己細胞調製物は、事実上、新製品であり、有効性および安全性にかなりのばらつきが生じる。

理想的には、治療用細胞が製造済みであり、詳細に特徴付けられており、患者への即時投与に利用できるものであるような標準化された治療法を使用したいと考えるであろう。そのような標準化された治療法は、同じ種に属するが遺伝的には異なる個体から得られる同種異系細胞を使うことによって行うことができる。

しかし同種異系細胞の使用には、現時点では、数多くの短所がある。同種異系細胞の内在性TCR特異性は宿主組織を外来と認識して、深刻な組織損傷および死亡につながりうる移植片対宿主病（GvHD）をもたらす。T細胞受容体（TCR）は、抗原の提示に応答して起こるT細胞の活性化に関与する細胞表面受容体である。免疫グロブリン分子の場合と同様に、アルファ鎖とベータ鎖の可変領域は、T細胞集団内に著しく多様な抗原特異性を生じさせるV（D）J組換えによって生成される。しかし無傷の抗原を認識する免疫グロブリンとは対照的に、T細胞は、プロセシングされたペプチドフラグメントがMHC分子と会合したものによって活性化され、それが、T細胞による抗原認識に、MHC拘束性と呼ばれる追加要素を持ち込むことになる。ドナーとレシピエントとの間のMHCの相違をT細胞受容体が認識すると、T細胞増殖が起こり、GVHDが発生する可能性が生じる。同種異系細胞を効果的に使用するために、TCRアルファまたはTCRベータを不活化すれば、TCRがT細胞の表面から排除されて、アロ抗原の認識を防ぎ、したがってGVHDを防ぐことになりうる。

一方、宿主免疫系は、宿主対移植片拒絶（HvG）と呼ばれるプロセスによって、宿主同種異系細胞を迅速に拒絶することができ、これが、移入された細胞の有効性を著しく制限することになる。同種移植片拒絶は、MHC遺伝子（ヒトではHLA系）がコードする多形性の高い細胞表面分子に応答するレシピエントTリンパ球に依存する。HLA免疫応答は患者の免疫系を抑制することによって避けることができるものの、単一ドナーからの同種異系T細胞移植の効力は、患者の過去の免疫学的経験に左右され、移植の有効性は変動しやすく、予測不可能である。実際、妊娠の経験がある患者や、輸血を受けたことがある患者は、免疫記憶および非自己HLA分子に対する循環抗体を既に発生させている可能性があり、したがって一定のHLA分子に対して「感作」されているであろう。したがって、一般的な臓器移植の例では、抗HLA抗体によって移植片拒絶の引き金が引かれる。移植片拒絶はドナーとレシピエントのMHC（HLA）分子を一致させることによって避けうる。実際面では、これは、1）最も近いHLAマッチを選択するために、細胞タイピングを行って、移植前にドナーとレシピエントのHLA遺伝子型を決定すること、および2）レシピエントの血清中にドナーリンパ球上のHLA分子に対する循環抗体を検出することによって、なんとかされてきた。レシピエントT細胞のタイピングを行うことと、ドナーのリンパ球上のHLA分子に対する循環抗体をレシピエントの血清中に検出することとを避けるために、本発明者らは、複数の異なるドナーに由来するT細胞のバッチを生成することによって同種異系免疫療法製品を開発することを、初めて提唱する。

本方法は、効力が平均化された臨床的応答を得ることを可能にするはずである。実際には、抗HLA抗体を持つ患者におけるドナーリンパ球の減損を避けるために、さまざまなHLAタイプを発現するように選択されたリンパ球を生着させ、よって同じ抗HLA抗体に供されるドナー細胞の比率が高くなることを防ぐ。加えて、ナチュラルキラー（NK）細胞は、表面受容体キラー免疫グロブリン様受容体（KIR）によってHLAクラスI分子を認識して、NK細胞機能を阻害するシグナルを送達する。これらの受容体は、正常（すなわちHLAクラスI^＋）自己細胞に対するNK細胞媒介性の攻撃を防ぐ。HLAクラスIの発現が自己HLAと異なる細胞は、NKが媒介する殺滅を受けやすくなる。

さまざまなHLAアレルを発現する複数の異なるドナーに由来するリンパ球を、本発明に従って、すなわちドナー間および患者間の変動性を考慮して、適正にプールすることにより、それらのリンパ球の少なくとも一画分は、KIRに会合する適当なMHCクラスIアレルを発現し、よってリンパ球の生着に対するNKアロ反応性の著しい悪影響を回避することが保証される。要約すると、複数の異なるドナーに由来するリンパ球のバッチは、患者中の既存の抗HLA免疫反応性の悪影響を最小限に抑え、NKアロ反応性を低減することで、効力が平均化された臨床的応答を可能にする。

本発明は、「既製」の同種異系処置剤としての投与を意図した、複数の異なるドナーに由来する、平均化された効力を持つT細胞のバッチを使用することに基づく、新しい治療戦略に関する。これらのバッチのリンパ球は、GVHDを避けるために細胞表面にTCRを発現していないこと、および患者における抗HLA免疫反応性の効果を最小限に抑え、かつNKアロ反応性を低減するために、複数の異なるドナーに由来することを特徴とする。この方法は、より具体的には、以下の工程を含む：個別ドナーからリンパ球の試料を得る工程；個別試料の細胞においてTCR成分をコードする少なくとも一つの遺伝子を不活化する工程；前記試料からTCR陰性細胞を精製する工程；および少なくとも2つの試料をプールすることで、平均化された効力を持つT細胞のバッチを得る工程。この方法によって得られたT細胞のバッチは、腫瘍またはウイルス感染を平均化された効力で処置するのに、とりわけ適している。

発明の詳細な説明
本明細書において特に定義する場合を除き、使用する技術用語および科学用語はすべて、遺伝子療法、生化学、遺伝学および分子生物学の分野の当業者が一般に理解している意味と同じ意味を有する。

本明細書には適切な方法および材料を記載するが、本明細書に記載するものと類似するまたは等価な方法および材料はすべて、本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書において言及する刊行物、特許出願、特許、および他の文献はすべて、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。矛盾が生じた場合は、定義を含めて本明細書が優先されることになる。さらに、別段の明示がある場合を除き、材料、方法、および実施例はすべて単なる例示であり、限定を意図していない。

本発明の実施には、別段の表示がある場合を除き、当技術分野の技能の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の通常の技法が使用されるであろう。そのような技法は文献に詳しく説明されている。例えばCurrent Protocols in Molecular Biology（Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA）; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition（Sambrook et al, 2001,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー: Cold Spring Harbor Laboratory Press）; Oligonucleotide Synthesis（M. J. Gait編, 1984）; Mullis et al.米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization（B. D. HarriesおよびS. J. Higgins編 1984）; Transcription And Translation（B. D. HamesおよびS. J. Higgins編 1984）; Culture Of Animal Cells（R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987）; Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press, 1986）; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning（1984）;シリーズ『Methods In ENZYMOLOGY』（J. AbelsonおよびM. Simon編集主幹, Academic Press, Inc.,ニューヨーク）、特にVol.154およびVol.155（Wu et al.編）ならびにVol.185、「Gene Expression Technology」（D. Goeddel編）; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells（J. H. MillerおよびM. P. Calos編, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory）; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology（MayerおよびWalker編, Academic Press,ロンドン, 1987）; Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV（D. M. WeirおよびC. C. Blackwell編, 1986）; およびManipulating the Mouse Embryo（Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー, 1986）を参照されたい。

平均化された効力を持つリンパ球のバッチを生成するための方法
一般的局面において、本発明は、がんまたは感染を平均化された効力で処置するための、複数の異なるドナーに由来する不活化TCRリンパ球の少なくとも一つのバッチを生成するための方法に関する。具体的には、該方法は以下の工程を含む：個別ドナーからリンパ球の試料を得る工程；各個別試料の細胞においてTCR成分をコードする少なくとも一つの遺伝子を不活化する工程；前記試料からTCR陰性細胞を精製する工程；および少なくとも2つの試料をプールすることで、T細胞のバッチを得る工程。複数の異なるドナーからのリンパ球をプールすることにより、平均化された効力を持つ「既製の処置」に適したバッチを得ることが可能になる。

実際、単一のドナーに由来するT細胞効力は、患者の過去の免疫学的経験に左右されうる。以前に移植、輸血の対象になるか、妊娠を経験している患者は、対応するHLAタイプを発現する細胞の枯渇につながりうる抗HLA抗体を発現している可能性がある。そのような抗体による高比率の細胞の枯渇を避けるための本発明者らのアプローチは、さまざまなHLAタイプを発現するように選択された複数の異なるドナーからT細胞のバッチを生成することである。他方、単一のドナーからのT細胞効力は、NKアロ反応性にも左右されうる。ナチュラルキラー（NK）細胞はKIRによってHLAクラスI分子を認識して、NK細胞機能を阻害するシグナルを送達する。HLAクラスIの発現が不適当である単一のドナーに由来するT細胞は、NKが媒介する死滅を起こしやすくなる。複数の異なるドナー（好ましくはさまざまなHLAタイプを発現するように選択された複数の異なるドナー）に由来するT細胞のバッチの生成と使用は、NK細胞のKIRによって認識される適当なHLAクラスI分子を発現する細胞の集団、そしてそれゆえにNK細胞の攻撃を阻害する細胞の集団が存在する確率を増加させる。したがってこのプーリング戦略では、理想的には、移植された細胞の大きな集団がNKアロ反応性と抗HLA抗体とによって枯渇するのを避けるために、十分なHLA多様性を維持することに焦点が絞られる。

本発明者らが行った統計的解析によれば、求めている治療法においてどの生物学的パラメータをより重要であるとみなし、それらのパラメータの優先順位をどのように選択するかに依存して、ドナーの数は異なる範囲に入りうることが、立証された。例えば、生着の確率を高めるのに十分な多様性を提供しつつ、感染性疾患のリスクを制限するためにドナー数を最少にすることが求められる状況では、少なくとも3人のドナー、好ましくは3〜50人のドナー、より好ましくは3〜30人のドナー、さらに好ましくは3〜10人のドナーに由来するリンパ球をプールすることによって、十分なHLA多様性を得ることができる。したがって、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45人、最大で50人のドナーに由来するリンパ球をプールすることによって、十分なHLA多様性を得ることができる。

対照的に、例えば最終バッチ中で所与の生物学的パラメータが2標準偏差、好ましくは1標準偏差の区間内に留まることが求められる一方、そのパラメータに関するドナー間のばらつきが大きいという状況では、30〜150人のドナー、好ましくは50〜150人のドナー、より好ましくは50〜100人のドナー、さらに好ましくは50、60または70人〜100人のドナーをプールした方がよい。

細胞表面分子のHLA系は、ヒトでは第6染色体上の大きな遺伝子群であるMHC内にコードされている。これには、ベータ-2-ミクログロブリン（β2m）鎖と組み合わされて古典的クラスI分子HLA-A、HLA-B、およびHLA-Cを形成する多形性の高い3つのクラスIα鎖遺伝子、ならびに組み合わされてHLA-DR、HLA-DP、およびHLA-DQクラスII分子を形成する3対の多形性クラスIIα鎖およびβ鎖遺伝子が含まれる。これらの遺伝子座に加えて、クラスIII遺伝子は、補体系の成分を含む免疫系のさまざまな血清タンパク質をコードしている。HLA分子の細胞分布は、主として、その機能によって決まる。クラスI HLA分子によって提示されるペプチドは、ウイルス病原体やそれらの遺伝子産物などといったサイトゾルタンパク質に由来する。したがって、身体の大半の有核細胞はHLAクラスI分子を構成的に発現しており（というのも、これらの細胞はウイルス攻撃を受けやすいからである）、免疫系の細胞は特に高密度にHLAクラスI分子を発現している。クラスII分子によって提示されるペプチドはエンドソームタンパク質の分解によって生成するので、クラスII発現は範囲がはるかに狭く、主として、外因性の可溶性および粒状抗原をプロセシングし提示する能力を有する細胞に限定される。これらの特徴を持つ細胞には、Bリンパ球、樹状細胞（DC）、マクロファージ、および単球が含まれ、クラスII分子は、炎症状態において、一定のタイプの上皮細胞および内皮細胞（EC）上に誘導されうる。

各個体は比較的少数のHLAアレルしか発現しない。すなわち、各親からのHLA-A、HLA-BおよびHLA-C古典的クラスI分子のそれぞれを1アレルと、各親からの3つの主要クラスII分子（HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ）のそれぞれを1アレルであり、これらのアレルを供給している染色体間の乗換えはほとんどまたは全くない。これら少数のアレルがカバーする特定ペプチド結合部位の順列の数は、大半の潜在的に危険な抗原がT細胞受容体（TCR）によって提示され、認識されうることを意味する（概観するにはBolton Eleanor, Bradley, transplantation immunology, chapter 3, essential immunology for surgeonsを参照されたい）。

ある特定態様において、NKアロ反応性を避けるには、T細胞のバッチが適当なクラスI HLA分子を発現する必要がある。NKアロ反応性を最小限に抑えるための好ましい一態様では、HLA-Bおよび/またはHLA-Aアレルの少なくとも一つのBw4モチーフ、HLA-C遺伝子座における1つのC1および/または1つのC2クラスアレルを発現するように、ドナーを選択する。より好ましい一実施形態では、HLA-Bおよび/またはHLA-A遺伝子座の少なくとも一つのBw4モチーフならびにHLA-C遺伝子座における1つのC1アレルおよび1つのC2アレルを発現するように、ドナーを選択する。

本プーリング戦略は、本発明に従って、より具体的には、TCR成分をコードする少なくとも一つの遺伝子を不活化することによって可能になる。TCRアルファ遺伝子および/またはTCRベータ遺伝子を不活化することによって、TCRを細胞内で機能しないようにする。このTCR不活化は、複数の異なるドナーからの細胞をプールし、GvHDを回避することを可能にする。遺伝子を不活化するとは、関心対象の遺伝子が機能的タンパク質の形態で発現しないことをいう。本発明の好ましい一態様において、本方法の遺伝子改変は、TCRをコードする遺伝子の遺伝的不活化に依拠し、それは、あるレアカットエンドヌクレアーゼが、ある標的遺伝子内での開裂を特異的に触媒し、それによって該標的遺伝子を不活化するように、工学的操作のために用意された細胞内で、該レアカットエンドヌクレアーゼを発現させることによって行われる。レアカットエンドヌクレアーゼが引き起こす核酸鎖の切断は、一般に、相同組換えまたは非相同末端結合（NHEJ）という別個の機序によって修復される。しかしNHEJは不完全な修復プロセスであり、しばしば開裂部位のDNA配列を変化させることになる。この機序は、2つのDNA末端のうち残っているものの、直接的再ライゲーションによる再接合（Critchlow and Jackson 1998）、またはいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合による再接合（Ma, Kim et al. 2003）を伴う。非相同末端結合（NHEJ）による修復は小さな挿入または小さな欠失をもたらすことが多く、特異的遺伝子ノックアウトの作出に使用することができる。前記の改変は、少なくとも1ヌクレオチドの置換、欠失、または付加であることができる。開裂が誘発する突然変異導入事象、すなわちNHEJ事象に続く突然変異導入事象が起こった細胞は、当技術分野において周知の方法によって同定および/または選択することができる。特定の一態様では、各個別試料の細胞においてT細胞受容体（TCR）の一成分をコードする少なくとも一つの遺伝子を不活化する工程が、T細胞受容体（TCR）の一成分をコードする少なくとも一つの遺伝子を破壊することができるレアカットエンドヌクレアーゼを、前記細胞中に導入することを含む。より具体的な一態様では、T細胞受容体（TCR）の一成分をコードする少なくとも一つの遺伝子を破壊する能力を有するレアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸で、各個別試料の細胞を形質転換し、該レアカットエンドヌクレアーゼを該細胞中で発現させる。

該レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼであることができる。好ましい一態様では、該レアカットエンドヌクレアーゼがTALEヌクレアーゼである。TALEヌクレアーゼとは、転写活性化因子様エフェクター（TALE）に由来するDNA結合ドメインと、核酸標的配列を開裂するための1つのヌクレアーゼ触媒ドメインとからなる融合タンパク質を表す（Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Cermak, Doyle et al. 2011; Geissler, Scholze et al. 2011; Huang, Xiao et al. 2011; Li, Huang et al. 2011; Mahfouz, Li et al. 2011; Miller, Tan et al. 2011; Morbitzer, Romer et al. 2011; Mussolino, Morbitzer et al. 2011; Sander, Cade et al. 2011; Tesson, Usal et al. 2011; Weber, Gruetzner et al. 2011; Zhang, Cong et al. 2011; Deng, Yan et al. 2012; Li, Piatek et al. 2012; Mahfouz, Li et al. 2012; Mak, Bradley et al. 2012）。本発明では、養子免疫療法戦略に関連する遺伝子を正確に標的とするために、新しいTALEヌクレアーゼを設計した。

本発明において好ましいTALEヌクレアーゼは、配列番号1〜5（TCRアルファ）、配列番号6および7（TCRベータ）からなる群より選択される標的配列を認識し、それを開裂するものである。該TALEヌクレアーゼは、好ましくは、配列番号8〜配列番号13から選択されるポリペプチド配列を含む。この方法の効率をより良く、より安全にするには、TCR遺伝子を標的とする該エンドヌクレアーゼをコードするmRNA分子を細胞にトランスフェクトすることによって、該細胞をアロジェネイックにする。

別の態様では、標的遺伝子を不活化する能力を強化するために、前記レアカットエンドヌクレアーゼと共に追加の触媒ドメインをさらに細胞中に導入することで、突然変異導入を増加させることができる。具体的には、該追加触媒ドメインがDNA末端プロセシング酵素である。DNA末端プロセシング酵素の非限定的な例として、5-3'エキソヌクレアーゼ、3-5'エキソヌクレアーゼ、5-3'アルカリエキソヌクレアーゼ、5'フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ（hosphatase）、ヒドロラーゼおよび鋳型非依存性DNAポリメラーゼが挙げられる。そのような触媒ドメインの非限定的な例は、hExoI（EXO1_HUMAN）、酵母ExoI（EXO1_YEAST）、大腸菌（E.coli）ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、TdT（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）ヒトDNA2、酵母DNA2（DNA2_YEAST）からなる群より選択されるタンパク質ドメインまたはタンパク質ドメインの触媒活性誘導体から構成される。好ましい一態様では、前記追加触媒ドメインが3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有し、より好ましい一態様では、前記追加触媒ドメインがTREX、さらに好ましくはTREX2触媒ドメイン（WO2012/058458）である。別の好ましい態様では、前記触媒ドメインが一本鎖TREX2ポリペプチドによってコードされる。前記追加触媒ドメインは、本発明のヌクレアーゼ融合タンパク質またはキメラタンパク質に、任意でペプチドリンカーによって、融合されていてもよい。

エンドヌクレアーゼ切断は相同組換え率を上昇させることが知られている。したがって、別の態様において、本方法の遺伝子改変工程は、標的核酸配列と外因性核酸の間で相同組換えが起こるように、標的核酸配列の一部分と相同である少なくとも一つの配列を含む外因性核酸を細胞中に導入する工程をさらに含む。特定の態様では、該外因性核酸が標的核酸配列のそれぞれ5'側および3'側にある領域と相同である第1部分および第2部分を含む。これらの態様における該外因性核酸は、第1部分と第2部分の間に、標的核酸配列の5'側および3'側にある領域とは相同性のない第3部分も含む。標的核酸配列の開裂に続いて、標的核酸配列と外因性核酸との間の相同組換え事象が刺激される。好ましくは、前記ドナーマトリックス内の少なくとも50bp、好ましくは100bp超、より好ましくは200bp超の相同配列が使用される。ある特定態様において、相同配列は200bp〜6000bp、より好ましくは1000bp〜2000bpであることができる。実際には、共有される核酸相同性が、切断部位の上流および下流に隣接する領域に位置し、導入されるべき核酸配列はそれら2つのアームの間に位置すべきである。

キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体（CAR）は、リガンド結合ドメインの性質を活用して、免疫細胞の特異性および反応性を、選ばれた標的に向けてリダイレクトすることができる。したがって、別の特定態様において本方法は、前記リンパ球にキメラ抗原受容体を導入する工程を、さらに含む。該キメラ抗原受容体は、特異的抗標的細胞免疫活性を呈するキメラタンパク質が生成するように、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば所望の抗原（例えば腫瘍抗原）に対する抗体ベースの特異性と、T細胞受容体活性化細胞内ドメインとを併せ持つ。一般にCARは、T細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合された細胞外一本鎖抗体（scFv）からなり（scFv:ζ）、T細胞中で発現した場合に、モノクローナル抗体の特異性に基づいて抗原認識をリダイレクトする能力を有する。本方法において使用されるCARの一例は、CD19抗原に対するCARであり、非限定的な例として、配列番号14または配列番号15のアミノ酸配列を含むことができる。

免疫チェックポイント遺伝子
T細胞媒介性免疫には、抗原特異的細胞のクローン選択、二次リンパ組織におけるそれらの活性化と増殖、抗原部位および炎症部位へのそれらの輸送、直接的エフェクター機能の遂行および多数のエフェクター免疫細胞への（サイトカインおよび膜リガンドを介した）支援の提供を伴う多数の逐次的段階が含まれる。これらの段階のそれぞれは、応答を微調整する刺激シグナルと阻害シグナルとを釣り合わせることによって調節される。「免疫チェックポイント」という用語がT細胞によって発現される一群の分子を意味することは、当業者には理解されるであろう。これらの分子は、免疫応答を下方調整または阻害するための「ブレーキ」として効果的に役立つ。免疫チェックポイント分子には、例えば限定するわけではないが、プログラムドデス（Programmed Death）1（PD-1、別名PDCD1またはCD279、アクセッション番号:NM_005018）、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4、別名CD152、GenBankアクセッション番号AF414120.1）、LAG3（別名CD223、アクセッション番号:NM_002286.5）、Tim3（別名HAVCR2、GenBankアクセッション番号:JX049979.1）、BTLA（別名CD272、アクセッション番号:NM_181780.3）、BY55（別名CD160、GenBankアクセッション番号:CR541888.1）、TIGIT（別名VSTM3、アクセッション番号:NM_173799）、LAIR1（別名CD305、GenBankアクセッション番号:CR542051.1（Meyaard, Adema et al. 1997））、シグレック（SIGLEC）10（GeneBankアクセッション番号:AY358337.1）、2B4（別名CD244、アクセッション番号:NM_001166664.1）、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、シグレック7（Nicoll, Ni et al. 1999）、シグレック9（Zhang, Nicoll et al. 2000; Ikehara, Ikehara et al. 2004）、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、F0XP3、PRDM1、BATF（Quigley, Pereyra et al. 2010）、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3などがあり、これらは免疫細胞を直接阻害する。例えばCTLA-4は、一定のCD4およびCD8 T細胞上に発現する細胞表面タンパク質であり、抗原提示細胞上でそのリガンド（B7-1およびB7-2）が会合すると、T細胞活性化およびエフェクター機能が阻害される。

したがって、T細胞のバッチを生成する上述の方法では、免疫チェックポイントに関与する少なくとも一つのタンパク質、特にPD1および/またはCTLA-4を不活化することによってT細胞をさらに改変する工程を含むことが、有利になりうる。

免疫抑制耐性T細胞
同種異系細胞は宿主免疫系によって迅速に拒絶される。非照射血液製品中に存在する同種異系白血球は5〜6日を越えては持続しないことが実証されている（Boni, Muranski et al. 2008）。したがって同種異系細胞の拒絶を防止するために、通常、宿主の免疫系をある程度抑制する必要がある。しかし、養子免疫療法の場合、免疫抑制薬の使用は、導入される治療用T細胞にも有害な効果を持つ。それゆえに、これらの条件下で養子免疫療法アプローチを効果的に使用するには、導入される細胞が免疫抑制処置に対して耐性である必要もあるだろう。そこで特定の態様において、本発明の方法は、T細胞を改変することで、好ましくは免疫抑制剤の標的をコードする少なくとも一つの遺伝子を不活化することによって、それらT細胞を免疫抑制剤に対して耐性にする工程をさらに含む。免疫抑制剤は、いくつかある作用機序の一つによって免疫機能を抑制する作用物質である。言い換えると、免疫抑制剤は、免疫応答の程度を減少させる能力によって示される、化合物が果たす役割である。非限定的な例として、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン-2α鎖ブロッカー、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、ジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害剤、コルチコステロイドまたは免疫抑制代謝拮抗物質であることができる。古典的な細胞傷害性免疫抑制薬は、DNA合成を阻害することによって作用する。T細胞の活性化によって作用するものや、ヘルパー細胞の活性化を阻害することによって作用するものもある。本発明の方法は、T細胞における免疫抑制剤の標的を不活化することによって、免疫療法用のT細胞に免疫抑制耐性を付与することを可能にする。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、CD52、グルココルチコイド受容体（GR）、FKBPファミリー遺伝子メンバーおよびシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーなどといった、免疫抑制剤の受容体であることができる。特定の態様において、本方法の遺伝子改変は、あるレアカットエンドヌクレアーゼが、ある標的遺伝子内での開裂を特異的に触媒し、それによって該標的遺伝子を不活化するように、工学的操作のために用意された細胞内で、該レアカットエンドヌクレアーゼを発現させることに依拠する。該レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼであることができる。好ましい本発明のTALEヌクレアーゼは、配列番号16〜21（GR）および配列番号34〜39（CD52）からなる群より選択される標的配列を認識し、それを開裂するものである。該TALEヌクレアーゼは、好ましくは、配列番号22〜配列番号33および配列番号40〜配列番号41から選択されるポリペプチド配列を含む。

化学療法剤耐性T細胞
がん検出および腫瘍細胞生物学の分野には顕著な進歩があったが、末期がんおよび転移がんの処置は依然として大きな難問である。細胞傷害性化学療法剤は、今なお、最もよく使用され奏功する抗がん処置である。しかし、それらは一様に有効なわけではなく、免疫療法などの新規療法と共にこれらの作用物質を導入することには問題が多い。そこで、がん治療およびT細胞の選択的生着を改良するために、該細胞を化学療法剤の毒性副作用から保護するために、それらの細胞に薬物耐性を付与することができる。したがって、別の特定態様において、本発明の方法は、薬物耐性を付与するために前記T細胞を改変することを、さらに含む。本明細書において、作用物質に対して「耐性または抵抗性」であるとは、改変されていない細胞の増殖を阻害または防止する量の作用物質の存在下で細胞が増殖するように遺伝子改変された細胞を意味する。

特定の一態様では、少なくとも一つの薬物耐性遺伝子の発現によって、前記薬物耐性をT細胞に付与することができる。前記薬物耐性遺伝子とは、化学療法剤（例えばメトトレキサート）などの作用物質に対する「耐性」をコードする核酸配列を指す。

別の特定態様では、薬物感受性遺伝子の不活化によって、前記薬物耐性をT細胞に付与することができる。T細胞に薬物耐性を付与するために不活化することができる興味深い薬物感受性遺伝子候補の一つは、ヒトヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子（Genbank:M26434.1）である。具体的には、工学的に操作されたT細胞中でHPRTを不活化しておくことで、細胞増殖抑制性代謝産物6-チオグアニン（6TG）に対する耐性を付与することができる。この6TGは、HPRTによって細胞傷害性チオグアニンヌクレオチドに転化され、これは現在、がんを持つ患者、特に白血病を持つ患者に使用されている（Hacke, Treger et al. 2013）。別の態様では、通常はT細胞の表面に発現するCD3を不活化することにより、テプリズマブなどの抗CD3抗体に対する耐性を付与することができる。

治療効率は、多剤耐性同種異系T細胞を遺伝子操作することによって著しく強化することができる。そのような戦略は、相乗効果を呈する薬物の併用に応答する腫瘍の処置において、とりわけ効果的である。そのうえ、工学的に操作された多重耐性T細胞は、最小量の薬剤を使って拡大し、選択することができる。したがって本発明の方法は、T細胞に多剤耐性を付与するために該T細胞を改変することを、さらに含むことができる。

自殺遺伝子
別の局面において、工学的に操作されたT細胞は、投与後、何年にもわたって拡大し、持続することができるので、投与されたT細胞の選択的枯渇を可能にするために、安全機構を含めておくことが望ましい。そこで、いくつかの態様において、本発明の方法は、組換え自殺遺伝子による該T細胞の形質転換を含むことができる。該組換え自殺遺伝子は、対象に投与された後の該T細胞の直接的毒性および/または無制御な増殖のリスクを低減するために使用される（Quintarelli, Vera et al. 2007; Tey, Dotti et al. 2007）。自殺遺伝子により、インビボで、形質転換細胞を選択的に枯渇させることが可能になる。具体的には、自殺遺伝子は、非毒性プロドラッグを細胞傷害薬に転化するか、または毒性遺伝子発現産物を発現させる能力を有する。言い換えると、「自殺遺伝子」とは、単独で、または他の化合物の存在下で、細胞死を引き起こす産物をコードしている核酸である。そのような自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼをコードするものである。他の例には、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼや、5-フルオロシトシンを高毒性化合物5-フルオロウラシルに転化することができる細菌遺伝子シトシンデアミナーゼがある。自殺遺伝子には、非限定的な例として、カスパーゼ-9もしくはカスパーゼ-8またはシトシンデアミナーゼも含まれる。カスパーゼ-9は、特異的二量体誘導化合物（chemical inducer of dimerization: CID）を使って活性化することができる。本明細書にいう「プロドラッグ」とは、本発明の方法において有用な任意の化合物であって、毒性生成物に転化することができるものを意味する。本発明の方法では、自殺遺伝子の遺伝子産物によって、プロドラッグが毒性生成物に転化される。そのようなプロドラッグの代表例はガンシクロビルである。ガンシクロビルは、HSVチミジンキナーゼによって、インビボで毒性化合物に転化される。すると、そのガンシクロビル誘導体が、腫瘍細胞に対して毒性を示す。プロドラッグの他の代表例には、VZV-TK用のアシクロビル、FIAU［1-（2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル）-5-ヨードウラシル］、6-メトキシプリンアラビノシド、およびシトシンデアミナーゼ用の5-フルオロシトシンなどがある。

送達方法
上述したさまざまな方法では、レアカットエンドヌクレアーゼなどといった関心対象のタンパク質を細胞中に導入する。非限定的な例として、関心対象のタンパク質は、トランスジーンとして、好ましくは少なくとも一つのプラスミドベクターにコードされたトランスジーンとして、導入することができる。ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが細胞中に導入された結果として、細胞においてインサイチューで合成されうる。あるいは、ポリペプチドを細胞外で生産してから、細胞に導入してもよい。ポリヌクレオチドコンストラクトを細胞中に導入するための方法は当技術分野において公知であり、非限定的な例として、ポリヌクレオチドコンストラクトが細胞のゲノムに組み込まれる安定形質転換法、ポリヌクレオチドコンストラクトが細胞のゲノムには組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによる方法が挙げられる。該ポリヌクレオチドは、例えば組換えウイルスベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって、細胞中に導入することができる。例えば、一過性形質転換法には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたはパーティクルボンバードメントなどが含まれる。該ポリヌクレオチドは、細胞内での発現を見込んで、ベクターに、より具体的にはプラスミドまたはウイルスに、含めることができる。該プラスミドベクターは、該ベクターを受け取った細胞の同定および/または選択に備えた選択マーカーを含むことができる。1つのベクター中に複数の異なるトランスジーンを含めることができる。該ベクターは、2Aペプチドをコードする配列などのリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含むことができる。ピコルナウイルスのアフトウイルスサブグループに同定された2Aペプチドは、あるコドンから次のコドンへと、それらのコドンがコードする2つのアミノ酸間にペプチド結合を形成することなく、リボソーム「スキップ」を引き起こす。（Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025（2001）; Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21（1997）; Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28（13）: 4227-4239（2008）; Atkins et al., RNA 13: 803-810（2007）参照）。「コドン」とは、リボソームによって1つのアミノ酸残基に翻訳されるmRNA上（またはDNA分子のセンス鎖上）の3つのヌクレオチドを意味する。したがって、2つのポリペプチドをインフレームの2Aオリゴペプチド配列で隔てると、mRNA内の単一の連続したオープンリーディングフレームからそれら2つのポリペプチドを合成することができる。そのようなリボソームスキップ機序は当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーRNAがコードするいくつかのタンパク質を発現させるために、いくつかのベクターによって使用されていることが知られている。非限定的な例として、本発明では、レアカットエンドヌクレアーゼとDNA末端プロセシング酵素とを細胞中で発現させるために、2Aペプチドを使用した。

本発明のより好ましい一態様において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばエレクトロポレーションなどによって細胞中に直接導入されるmRNAであることができる。本発明者らはT細胞におけるmRNAエレクトロポレーションの最適条件を決定した。

本発明者はcytoPulse技術を使用した。この技術は、細胞内に物質を送達するために、パルス電場を使って、生細胞を一時的に透過性にすることを可能にする。PulseAgile（BTX Havard Apparatus、米国01746マサチューセッツ州ホリストン、オクトーバーヒルロード84）エレクトロポレーション波形の使用に基づくこの技術では、パルスの持続時間、強度ならびにパルス間の間隔を正確に制御することができる（米国特許第6,010,613号および国際公開WO2004083379）。これらのパラメータはいずれも、細胞死を最小限に抑えてトランスフェクション効率を高くするための最善の条件が得られるように、変更することができる。基本的には、最初の高い電場パルスが細孔形成を可能にし、それより低い後続の電場パルスが、ポリヌクレオチドを細胞中に移動させる。

T細胞の精製
精製T細胞とは、精製T細胞組成物におけるT細胞:造血細胞の比が、末梢血におけるT細胞:造血細胞の比と比較して増加していることを意味する。具体的には、精製CD8+ T細胞とは、精製CD8+ T細胞におけるCD8⁺ T細胞:CD8^- T細胞の比が、末梢血におけるCD8⁺ T細胞:CD8^- T細胞の比と比較して増加していることを意味する。精製CD4+ T細胞とは、精製CD4+ T細胞におけるCD4⁺ T細胞:CD4^- T細胞の比が、末梢血におけるCD4⁺ T細胞:CD4^- T細胞の比と比較して増加していることを意味する。好ましくは、精製T細胞（CD8+またはCD4+）は、組成物中に存在する全T細胞の少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％、さらには少なくとも99％を占める。CD4+またはCD8+ T細胞を精製するための方法は当業者には公知である。表面マーカーの発現がこれらの細胞の同定と精製を容易にする。それらの同定および単離方法には、FACS、カラムクロマトグラフィー、磁気ビーズによるパンニング、ウェスタンブロット、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、超拡散（hyperdiffusion）クロマトグラフィーなどや、種々の免疫学的方法、例えば流体またはゲル沈降素反応、免疫拡散法（単純または二重）、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、免疫蛍光アッセイなどがある。免疫学的手法およびイムノアッセイ手法全般を概観するには、Stites and Terr（eds.）1991 Basic and Clinical Immunology（7th ed.）およびPaul（前掲）を参照されたい。好ましい一態様では、T細胞を磁気選別法で精製する。

T細胞の活性化および拡大
T細胞の遺伝子改変の前であるか後であるかを問わず、T細胞は一般に、例えば米国特許第6,352,694号、同第6,534,055号、同第6,905,680号、同第6,692,964号、同第5,858,358号、同第6,887,466号、同第6,905,681号、同第7,144,575号、同第7,067,318号、同第7,172,869号、同第7,232,566号、同第7,175,843号、同第5,883,223号、同第6,905,874号、同第6,797,514号、同第6,867,041号および米国特許出願公開第20060121005号に記載されている方法を使って、活性化し、拡大することができる。T細胞はインビトロまたはインビボで拡大することができる。一般に、本発明のT細胞は、T細胞表面のCD3 TCR複合体および共刺激因子を刺激することでT細胞のための活性化シグナルを生じさせる作用物質との接触によって、拡大する。例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）などの化学物質、またはフィトヘマグルチニン（PHA）のような分裂促進性レクチンを使って、T細胞のための活性化シグナルを生じさせることができる。非限定的な例として、例えば面上に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗CD2抗体との接触によって、あるいはカルシウムイオノフォアと一緒にプロテインキナーゼC活性化因子（例えばブリオスタチン）と接触させることによって、T細胞集団をインビトロで刺激することができる。T細胞表面のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用する。例えば、T細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、T細胞の集団を、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞の増殖を刺激するには、抗CD3抗体および抗CD28抗体。例えば、各シグナルを与える作用物質は、溶解した状態にあっても、面にカップリングされていてもよい。当業者には容易に理解できるであろうが、細胞に対する粒子の比は、標的細胞と比較した粒径に依存する。

T細胞培養に適した条件として、増殖と生存に必要な因子、例えば血清（例:ウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン-2（IL-2）、インスリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、IL-21およびTNF-、または当業者に公知の、細胞成長用の他の任意の添加物を含有しうる適当な培地（例えば最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo5（Lonza））が挙げられる。細胞成長用の他の添加物には、界面活性剤、プラスマネート、および還元剤、例えばN-アセチル-システインや2-メルカプトエタノールなどがあるが、これらに限定されるわけではない。培地としては、RPMI1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo1、およびX-Vivo20、Optimizerを挙げることができ、これには、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミン類が添加され、無血清であるか、適当量の血清（または血漿）または組成の明確な一組のホルモン、および/またはT細胞の成長と拡大にとって十分な量のサイトカインが添加される。ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は実験培養にのみ含め、対象に注入される細胞の培養には含めない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下、例えば適当な温度（例えば37℃）および雰囲気（例えば空気＋5％CO2）で、維持される。異なる刺激時間にばく露されたT細胞は、異なる特徴を呈しうる。

平均化された効力を持つT細胞のバッチ
本発明は、上述の方法によって得ることができる平均化された効力を持つT細胞のバッチにも関係する。「平均化された効力」とは、本発明の同じバッチまたは本発明の異なるバッチから小分けされたある用量の細胞を複数の異なる患者に注入したとして、これらの細胞が該患者の少なくとも80％、より好ましくは90％、さらに好ましくは95％に生着をもたらすことを意味する。

上に開示したように、本発明は、より具体的には、平均化された効力を持つT細胞のバッチであって、T細胞受容体成分をコードする遺伝子が少なくとも一つは破壊されており、T細胞が少なくとも2人の異なるドナーに由来するものに関する。本発明において、細胞とは、自然免疫応答および/または適応免疫応答の開始および/または遂行に機能的に関与する造血系由来の細胞を指す。本発明の細胞は、好ましくは、ドナーから得られるT細胞である。本発明のT細胞は幹細胞に由来することができる。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であることができる。代表的なヒト幹細胞はCD34+細胞である。単離される細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、NK細胞、B細胞、または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球またはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞であることもできる。別の態様において、該細胞はCD4+ Tリンパ球およびCD8+ Tリンパ球からなる群に由来することができる。本発明の細胞の拡大および遺伝子改変に先だって、細胞の供給源は、さまざまな非限定的方法によって得ることができる。細胞はいくつかの非限定的供給源、例えば末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍などから得ることができる。本発明の一定の態様では、当業者が入手できる、当業者に公知の、数多くのT細胞を使用してもよい。別の態様では、該細胞が、好ましくは、健康なドナーに由来する。別の態様では、該細胞が、異なる表現型特徴を提示する混成細胞集団の一部である。

バッチとは、本明細書では、複数の異なるドナー試料からの異なる細胞をプールした結果であるとみなされる。

バッチの一部としての細胞は、例えばCryoMACS（登録商標）凍結バッグ（Miltenyi Biotec Inc.、01801メリーランド州ウォーバーン、プレジデンシャルウェイ120、スイート305）に入れて、注入可能な凍結培地中で凍結保存することができる。バッグの容積は、使用目的（複数の異なる患者または一人の患者のために複数回分に小分け）によってさまざまでありうる。通常、各バッグには、次の注入用等級の試薬（％vol/vol）: 31.25 plasmalyte-A、31.25 デキストロース（5％）、0.45 NaCl、最高7.50 DMASO、1.00 デキストラン40、5.00 ヒト血清 アルブミンを含有する凍結培地が分注されており、細胞は1バッグあたり約1×10⁹〜1×10¹¹細胞、より一般的には1.5×10⁹〜1×10¹¹、より具体的には1.5×10⁹〜1.5×10¹⁰細胞である。一般に10〜100mlの容量を有するバッグは、必要になるまで、血液バンク条件下、監視下の-135℃フリーザーで、または液体窒素中-196℃で、貯蔵しておくことができる。

治療的応用
本発明の好ましい一態様では、上述したさまざまな方法で得られたT細胞のバッチを、同種異系養子細胞免疫療法に使用することができる。

具体的には、本発明のT細胞のバッチは、がん、自己免疫疾患またはウイルス感染の処置を必要とする患者において、それらを処置するために使用することができる。別の局面において、本発明は、処置を必要とする患者を処置するための方法であって、以下の工程の少なくとも一つを含む方法に依拠する:
（a）上述した方法のいずれか一つによって得ることができる平均化された効力を持つT細胞のバッチを用意する工程;
（b）該細胞を該患者に投与する工程。

好都合なことに、本発明のT細胞は、インビボでロバストなT細胞拡大を起こすことができ、長期間にわたって持続することができる。

前記の処置は、改善的処置、治癒的処置、または予防的処置であることができる。本発明は、それがT細胞（典型的にはドナーから得たもの）の非アロ反応性細胞への形質転換を可能にするものである限りにおいて、同種異系免疫療法にとりわけ適している。これは標準的プロトコールで行うことができ、必要なだけ何度でも再現することができる。結果として生じる改変T細胞はプールされ、「既製」の治療製品として入手できるようにして、一人または数人の患者に投与される。

ここに開示する方法で使用することができる細胞については上述した。該処置は、がん、ウイルス感染、自己免疫障害または移植片対宿主病（GvHD）と診断された患者を処置するために使用することができる。処置することができるがんには、血管新生した腫瘍だけでなく、血管新生していないか、まだ実質的に血管新生していない腫瘍も含まれる。がんは、非固形腫瘍（例えば血液腫瘍、例えば白血病およびリンパ腫）を含むことができ、あるいは固形腫瘍を含むことができる。本発明のT細胞のバッチで処置することができるがんのタイプには、癌腫、芽腫、および肉腫、ならびに一定の白血病またはリンパ系悪性疾患、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性疾患、例えば肉腫、癌腫、および黒色腫が含まれるが、これらに限定されるわけではない。成人腫瘍/成人がんおよび小児腫瘍/小児がんも含まれる。

本方法は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法および放射線療法の群から選択されるがんに対する1種または複数種の治療法との併用処置であることができる。

本発明の好ましい一態様によれば、該処置は、免疫抑制処置を受けている患者に施行される。本方法は、好ましくは、少なくとも一つの免疫抑制剤または化学療法剤に対して、当該免疫抑制剤または化学療法剤の受容体をコードする遺伝子の不活化によって耐性になっている細胞または細胞の集団に依拠する。この局面において、免疫抑制処置は、患者における本発明のT細胞の選択および拡大を助けるはずである。

本発明の細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、埋め込みまたは移植による方法を含む、好都合な任意の方法で行うことができる。本明細書に記載する組成物は、患者に皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、節内投与、髄内投与、筋肉内投与するか、静脈内注射またはリンパ管内注射によって投与するか、または腹腔内投与することができる。一態様において、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。

細胞または細胞集団の投与は、体重1kgあたり10³〜10¹⁰細胞、好ましくは10⁵〜10⁶細胞/kg体重（これらの範囲内にある細胞数のすべての整数値を含む）の投与からなることができる。細胞または細胞集団は、1回または複数回投与することができる。別の態様では、有効量の細胞が単回投与として投与される。別の態様では、有効量の細胞が、ある期間にわたって、2回以上の投薬として投与される。投与のタイミングは主治医の判断により、患者の臨床的状態に依存する。細胞または細胞集団は、血液バンクやドナーなど、任意の供給源から得ることができる。個々のニーズはさまざまであるが、ある特定の疾患または状態に関して、所与の細胞タイプの有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技能の範囲内にある。有効量とは、治療上または予防上の利益を与える量を意味する。投与される薬用量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、並行処置がもしあれば、その種類、処置の頻度、および所望する効果の性質に依存するであろう。

別の態様では、有効量の細胞または細胞を含む薬学的組成物が、非経口投与される。投与は静脈内投与であることができる。投与は腫瘍内への注射によって直接的に行うこともできる。

本発明の一定の態様では、いくつかの関連処置モダリティ、例えば限定するわけではないが、抗ウイルス療法シドフォビルおよびインターロイキン-2、シタラビン（別名ARA-C）またはMS患者のナタリズマブ（nataliziimab）処置、または乾癬患者のエファリズマブ（efaliztimab）処置、またはPML患者のための他の処置と一緒に（例えばその前に、それと同時に、またはその後に）、細胞が患者に投与される。さらなる態様では、本発明のT細胞を、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、およびFK506、抗体、または他の免疫破壊剤（immunoablative agent）、例えばCAMPATH、抗CD3抗体または他の抗体療法、サイトキシン（cytoxin）、フルダラビン（fludaribine）、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸（mycoplienolic acid）、ステロイド、FR901228、サイトカイン、および照射法と併用することができる。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または成長因子が誘発するシグナリングにとって重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, 1 1; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93）。さらに別の態様では、本発明の細胞組成物が、骨髄移植と一緒に、あるいはフルダラビンなどの化学療法剤、引き出しビーム放射線療法（XRT）、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを用いるT細胞破壊療法と一緒に、（例えば事前に、同時に、または事後に）患者に投与される。別の態様では、B細胞破壊療法、例えばCD20と反応する作用物質、例えばリツキサンに続いて、本発明の細胞組成物が投与される。例えば一態様において、対象は、高用量化学療法による標準的処置と、それに続く末梢血幹細胞移植とを受けうる。一定の態様では、移植に続いて、対象が、拡大された本発明の免疫細胞の注入を受ける。さらに別の態様では、拡大された細胞が外科手術前または外科手術後に投与される。

薬学的組成物
本発明のT細胞のバッチは、単独で投与するか、希釈剤および/またはIL-2もしくは他のサイトカインまたは他の細胞集団などといった他の成分と組み合わされた薬学的組成物として投与することができる。簡単に述べると、本発明の薬学的組成物は、1つまたは複数の医薬上または生理学上許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わされた本明細書に記載するT細胞を含みうる。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液;グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの糖質;タンパク質;ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン;酸化防止剤;キレート剤、例えばEDTAまたはグルタチオン;アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）;および保存剤を含みうる。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与用に処方される。本発明の薬学的組成物は、処置（または防止）しようとする疾患にとって適当な方法で、投与することができる。適当な投薬量は臨床治験によって決定されうるが、投与量および投与頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などといった因子によって決まるであろう。

定義
上記の説明では、いくつかの用語を広く使用している。本態様の理解を容易にするために、以下の定義を記載する。

本明細書で用いる「a」または「an」は、1または複数を意味しうる。

ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書では、一文字記号で指定され、その場合、QはGln、すなわちグルタミン残基を意味し、RはArg、すなわちアルギニン残基を意味し、DはAsp、すなわちアスパラギン酸残基を意味する。

ヌクレオチドは次のように指定される：ヌクレオシドの塩基の指定には一文字記号を使用する。すなわち、aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドに関して、rはgまたはa（プリンヌクレオチド）を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dはg、aまたはtを表し、vはg、aまたはcを表し、bはg、tまたはcを表し、hはtまたはcを表し、かつnはg、a、tまたはcを表す。

本明細書にいう「核酸」または「核酸分子」とは、ヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成するフラグメント、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成するフラグメントを指す。核酸分子は、天然ヌクレオチド（例えばDNAおよびRNA）もしくは天然ヌクレオチドの類似体（例えば天然ヌクレオチドのエナンチオマー型）または両者の組み合わせであるモノマーから構成されうる。核酸は一本鎖または二本鎖のいずれかであることができる。

「遺伝子」とは遺伝の基本単位を意味し、染色体に沿って線状に配置された、特異的タンパク質またはタンパク質のセグメントをコードするDNAのセグメントからなる。遺伝子は典型的には、プロモーター、5'非翻訳領域、1つまたは複数のコーディング領域（エクソン）、任意でイントロン、3'非翻訳領域を含む。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサーおよび/またはサイレンサーを、さらに含みうる。

「トランスジーン」という用語は、核酸配列（例えば1つまたは複数のポリペプチドをコードするもの）であって、それが導入される宿主細胞にとって一部または全部が異種、すなわち外来であるか、それが導入される宿主細胞の内在性遺伝子に対して相同であるが、それが挿入される細胞のゲノムを改変するような形で、細胞ゲノム中に挿入されるように設計するか、または細胞ゲノム中に挿入することができるもの（例えばトランスジーンは、天然遺伝子の場所とは異なる場所に挿入されるか、またはその挿入がノックアウトをもたらす）を意味する。トランスジーンは、ポリペプチドをコードする選ばれた核酸の最適な発現に必要とされうる1つまたは複数の転写調節配列および他の任意の核酸、例えばイントロンを含むことができる。トランスジーンがコードするポリペプチドは、そのトランスジーンが挿入される細胞において、発現しなくてもよいし、発現するが生物学的に活性でなくてもよい。

「ゲノム」とは、核ゲノム、クロロプラストゲノム、ミトコンドリアゲノムなど、ある細胞が含有している遺伝物質全体を意味する。

「レアカットエンドヌクレアーゼ」という用語は、DNA分子またはRNA分子（好ましくはDNA分子）内の核酸間の結合の加水分解（開裂）を触媒する能力を有する野生型酵素または変異体酵素を指す。特に該ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼ、より好ましくは、高度に特異的であって、10〜45塩基対（bp）長の範囲（通常は10〜35塩基対長の範囲）の核酸標的部位を認識するレアカットエンドヌクレアーゼであることができる。本発明のエンドヌクレアーゼは、特異的ポリヌクレオチド配列（「標的配列」ともいう）を認識し、その位置で核酸を開裂する。レアカットエンドヌクレアーゼは、特異的ポリヌクレオチド配列を認識し、その位置で一本鎖切断または二本鎖切断を生じさせることができる。

ある特定態様において、本発明のレアカットエンドヌクレアーゼは、Cas9エンドヌクレアーゼであることができる。実際、最近になって、II型原核生物CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats）適応免疫系に由来するRNAガイド（RNA-guided）Cas9ヌクレアーゼ（Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013）に基づいて、新しいゲノム工学ツールが開発された（概観するにはSorek, Lawrence et al. 2013を参照されたい）。CRISPR関連（Cas）系は、細菌で初めて発見されたもので、ウイルスまたはプラスミドの外来DNAに対する防御機構として機能する。CRISPRによるゲノム工学では、まず、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる短い配列モチーフが隣接していることの多い標的配列の選択から着手する。標的配列の選択に続いて、この標的配列に相補的な特異的crRNAを工学的に作製する。II型CRISPR系において必要なトランス活性化crRNA（tracrRNA）をcrRNAと対合させ、与えられたCas9タンパク質に結合させる。Cas9は、tracRNAとcRNAの塩基対合を容易にする分子アンカーとして作用する（Deltcheva, Chylinski et al. 2011）。この三元複合体では、二重tracrRNA:crRNA構造が、エンドヌクレアーゼCas9をコグネイト標的配列に導くガイドRNAとして作用する。Cas9-tracrRNA:crRNA複合体による標的認識は、標的配列とcrRNAとの間の相同性に関して標的配列を走査することによって開始される。標的配列-crRNA相補性に加えて、DNAターゲティングには、プロトスペーサーに隣接する短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ-PAM）の存在も必要である。二重RNAと標的配列の間の対合に続いて、Cas9は、次に、PAMモチーフの3塩基上流に平滑二本鎖切断を導入する（Garneau, Dupuis et al. 2010）。本発明では、例えばTCR成分をコードする遺伝子を特異的に標的とするように、ガイドRNAを設計することができる。ガイドRNAと標的配列の間の対合に続いて、Cas9がTCR遺伝子内での開裂を誘発する。

レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼという名前でも知られているホーミングエンドヌクレアーゼであることもできる。そのようなホーミングエンドヌクレアーゼは当技術分野では周知である（Stoddard 2005）。ホーミングエンドヌクレアーゼは高度に特異的であって、12〜45塩基対（bp）長の範囲（通常は14〜40bp長の範囲）のDNA標的部位を認識する。本発明のホーミングエンドヌクレアーゼは、例えばLAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ、またはGIY-YIGエンドヌクレアーゼなどに対応しうる。本発明の場合、好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、I-CreI変異体であることができる。「変異体」エンドヌクレアーゼ、すなわち自然には存在せず、遺伝子工学によってまたはランダム突然変異導入法によって得られるエンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼが認識するものとは異なるDNA配列に結合することができる（国際出願WO2006/097854を参照されたい）。

該レアカットエンドヌクレアーゼは、モジュール型DNA結合ヌクレアーゼであることができる。モジュール型DNA結合ヌクレアーゼとは、エンドヌクレアーゼの少なくとも一つの触媒ドメインと、少なくとも一つのDNA結合ドメインまたは核酸標的配列を指定するタンパク質とを含む、任意の融合タンパク質を意味する。DNA結合ドメインは一般に、独立して折りたたまれるポリペプチドによって形成されるRNA結合ドメインまたはDNA結合ドメインであって、そのポリペプチドは二本鎖または一本鎖を認識する少なくとも一つのモチーフを含有している。特異的核酸配列に結合する能力を有するそのようなポリペプチドが、当技術分野では数多く記述されている。そのような結合ドメインは、多くの場合、非限定的な例として、ヘリックス-ターン-ヘリックスドメイン、ロイシンジッパードメイン、翼状ヘリックスドメイン、ヘリックス-ループ-ヘリックスドメイン、HMGボックスドメイン、免疫グロビン（Immunoglobin）ドメイン、B3ドメインまたは工学的に操作されたジンクフィンガードメインなどを含む。

本発明の好ましい一態様では、DNA結合ドメインが転写活性化因子様エフェクター（TALE）に由来し、この場合、配列特異性は、キサントモナス（Xanthomonas）またはラルストニア（Ralstonia）細菌タンパク質に由来する一連の33〜35アミノ酸リピートによって決まる。これらのリピートは、塩基対との相互作用を指定する2つのアミノ酸位置が本質的に異なっている（Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009）。DNAターゲット中の各塩基対には、単一のリピートが、当該リピートのそれら2つの変異体アミノ酸（いわゆるリピート可変ジペプチド、RVD）に起因する特異性で接触する。TALE結合ドメインは、標的配列の第1チミン塩基（T₀）という要件の原因となるN末端トランスロケーションドメインと、核局在化シグナル（NLS）を含有するC末端ドメインとを、さらに含みうる。TALE核酸結合ドメインは一般に、複数のTALEリピート配列を含む工学的に操作されたコアTALEスキャフォールドに対応し、各リピートは、TALE認識部位の各ヌクレオチド塩基に特異的なRVDを含んでいる。本発明では、該コアスキャフォールドの各TALEリピート配列が、30〜42アミノ酸、より好ましくは33または34アミノ酸で構成され、12番目と13番目に位置する2つの決定的アミノ酸（いわゆるリピート可変ジペプチド（repeat variable dipeptide）、RVD）が、当該TALE結合部位配列の1ヌクレオチドの認識を媒介する。等価な2つの決定的アミノ酸は、33アミノ酸長または34アミノ酸長より長いTALEリピート配列では特に、12番目および13番目以外の位置にも位置しうる。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するRVDは、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNNである。別の態様では、ヌクレオチドA、T、CおよびGに対するそれらの特異性を調整し、そして特にその特異性を強化するために、決定的アミノ酸12および13を突然変異させることができる。TALE核酸結合ドメインは、通常、8〜30個のTALEリピート配列を含む。より好ましくは、本発明の該コアスキャフォールドは、8〜20個のTALEリピート配列を含み、より一層好ましくは15個のTALEリピート配列を含む。また、これは、該TALEリピート配列セットのC末端に位置する20アミノ酸で構成される単一の追加切断型TALEリピート配列、すなわち追加C末端ハーフTALEリピート配列を含むこともできる。

他の工学的に操作されたDNA結合ドメインに、モジュール型ベース・パー・ベース（base-per-base）特異的核酸結合ドメイン（MBBBD）（PCT/US2013/051783）がある。MBBBDは、例えば、新しく同定されたタンパク質、すなわち最近配列決定された内部共生体菌バークホルデリア・リゾキシニカ（Burkholderia Rhizoxinica）のゲノムに由来するEAV36_BURRH、E5AW43_BURRH、E5AW45_BURRHおよびE5AW46_BURRHタンパク質から、工学的に作製することができる（Lackner, Moebius et al. 2011）。MBBBDタンパク質は、塩基特異的な31〜33アミノ酸のモジュールを含む。これらのモジュールは、キサントモナスTALE共通リピートとは40％未満の配列同一性を呈し、一方、これらのモジュールは、より大きなポリペプチド配列可変性を示す。しかし、これらのモジュール型ペプチドは、それらを一つに組み立てると、キサントモナスTALEヌクレアーゼと非常によくに似た様式で特異的核酸配列を標的にすることができる。本発明の好ましい一態様では、前記DNA結合ドメインが、10〜30個のモジュール、好ましくは16〜20個のモジュールを含む、工学的に操作されたMBBBD結合ドメインである。バークホルデリアおよびキサントモナスに由来する上記タンパク質からのさまざまなドメイン（モジュール、N末端およびC末端）は、特異的核酸配列に対する結合特性を有する新しいタンパク質またはスキャフォールドを工学的に作製するのに有用である。特に、工学的に操作されたMBBBDの追加N末端ドメインおよび追加C末端ドメインは、例えば限定するわけではないが、AvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1cのような天然TALEから誘導することができる。

「TALEヌクレアーゼ」または「MBBBDヌクレアーゼ」とは、典型的には転写活性化因子様エフェクタータンパク質（TALE）またはMBBBD結合ドメインに由来するDNA結合ドメインをエンドヌクレアーゼ触媒ドメインと融合することによってもたらされる、工学的に操作されたタンパク質を指す。そのような触媒ドメインは、好ましくは、ヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは、例えばI-TevI、ColE7、NucAおよびFok-Iのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。ある特定態様では、該ヌクレアーゼが、単量体型TALEヌクレアーゼまたはMBBBDヌクレアーゼである。単量体型のヌクレアーゼは、工学的に操作されたDNA結合ドメインとWO2012138927に記載のI-TevI触媒ドメインとの融合物などといった、特異的認識と開裂のために二量体化を必要としないヌクレアーゼである。別の特定態様では、前記レアカットエンドヌクレアーゼが二量体型のTALEヌクレアーゼまたはMBBBDヌクレアーゼであり、好ましくはFokIに融合されたDNA結合ドメインを含むものである。TALEヌクレアーゼは既に記述されており、遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変を促進するために利用されている（Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010）。工学的に操作されたそのようなTALEヌクレアーゼは、TALEN（商標）という商品名で市販されている（Cellectis、8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France）。

「開裂」という用語は、ポリヌクレオチドの共有結合主鎖の切断を指す。開裂は、例えば限定するわけではないがホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むさまざまな方法によって開始させることができる。一本鎖開裂と二本鎖開裂はどちらも可能であり、二本鎖開裂は2つの異なる一本鎖開裂事象の結果として起こりうる。二本鎖DNA、RNA、またはDNA/RNAハイブリッド開裂は、平滑末端または付着末端のどちらかの生成をもたらしうる。

「キメラ抗原受容体」（CAR）とは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を意味する。

本明細書において使用する「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンドを結合する能力を有するオリゴペプチドまたはポリペプチドと定義される。このドメインは、好ましくは、細胞表面分子と相互作用する能力を有するであろう。例えば細胞外リガンド結合ドメインは、ある特定疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択することができる。

好ましい一態様において、該細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルなリンカーで接合された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変フラグメント（V_L）と重鎖可変フラグメント（V_H）とを含む一本鎖抗体フラグメント（scFv）を含む。好ましい一態様では、該scFVがCD19抗体から誘導される。本発明の該scFVは、好ましくは、CD19モノクローナル抗体4G7から誘導されるscFVを含む（Peipp, Saul et al. 2004）。

本発明のCARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合に続いて、免疫細胞の活性化と免疫応答とをもたらす細胞内シグナリングを担っている。CARに使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例として、抗原受容体会合に続いてシグナル伝達を開始するために協調的に作用するT細胞受容体と補助受容体の細胞質配列を挙げることができる。シグナル伝達ドメインには、抗原依存的一次活性化を開始させるものと、抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを与えるものという、2種類の異なる細胞質シグナリング配列が含まれる。一次細胞質シグナリング配列は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ、すなわちITAMとして知られているシグナリングモチーフを含みうる。特定の態様では、本発明のCARのシグナル伝達ドメインが共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子は、効率のよい免疫応答にとって必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体などがあるが、これらに限定されるわけではない。共刺激分子の例として、CD27、CD28、CD8、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。

本発明のCARは細胞の表面膜上に発現する。したがってCARは膜貫通ドメインを含むことができる。適当な膜貫通ドメインの顕著な特徴には、細胞の表面、本発明では好ましくは免疫細胞、特にリンパ球細胞またはナチュラルキラー（NK）細胞の表面に発現できることと、所定の標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指示するために共同して相互作用できることとが含まれる。膜貫通ドメインは、さらに、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に、ストーク（stalk）領域を含むことができる。本明細書において使用する「ストーク領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結する機能を果たす任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特にストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインに、より多くの屈曲性および接触性を与えるために使用される。ストーク領域は、300アミノ酸まで、好ましくは10〜100アミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸を含みうる。ストーク領域は、天然分子の全部または一部から、例えばCD8、CD4またはCD28の細胞外領域の全部または一部から、あるいは抗体定常領域の全部または一部から、誘導することができる。あるいは、ストーク領域は天然のストーク配列に対応する合成配列であるか、完全な合成ストーク配列であってもよい。

標的抗原のダウンレギュレーションまたは突然変異はがん細胞ではよく観察され、抗原喪失エスケープ変異体が生じる。したがって、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞を標的に対してより特異的にするために、CD19特異的CARは、標的中の異なる要素に同時に結合することによって免疫細胞の活性化と機能を増強するための、別の細胞外リガンド結合ドメインを含むことができる。ある態様では、細胞外リガンド結合ドメインを、同じ膜貫通ポリペプチド上に直列に配置することができ、任意で、リンカーによって隔てることができる。別の態様では、前記異なる細胞外リガンド結合ドメインを、CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に配置することができる。別の態様において、本発明は、それぞれ1つの異なる細胞外リガンド結合ドメインを含んでいるCARの集団に関する。特に本発明は、免疫細胞を工学的に操作する方法であって、免疫細胞を用意する工程、および該細胞の表面に、各々が異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を発現させる工程を含む方法に関する。別の特定態様において、本発明は、免疫細胞を工学的に操作する方法であって、免疫細胞を用意する工程、該細胞に、各々が異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する工程を含む方法に関する。CARの集団とは、各々が異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む少なくとも2種類、3種類、4種類、5種類、6種類またはそれ以上のCARを意味する。本発明の異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的中の異なる要素に同時に結合し、よって免疫細胞の活性化と機能を増強することができる。本発明は、各々が異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む単離された免疫細胞にも関係する。

本明細書において使用する「治療剤」、「化学療法剤」、または「薬物」という用語は、がん細胞と相互作用することによってがん細胞の増殖状態を低減しかつ/またはがん細胞を死滅させることができる化合物またはその誘導体を指す。化学療法剤の例としては、アルキル化剤（例えばシクロホスファミド、イフォサミド（ifosamide））、代謝拮抗薬（例えばメトトレキサート（MTX）、5-フルオロウラシルまたはその誘導体）、抗腫瘍性抗生物質（例えばマイトマイシン、アドリアマイシン）、植物由来の抗腫瘍剤（例えばビンクリスチン、ビンデシン、タキソール）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシドなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。そのような作用物質として、さらに、抗がん剤TRIMETHOTRIXATE（商標）（TMTX）、TEMOZOLOMIDE（商標）、RALTRITREXED（商標）、S-（4-ニトロベンジル）-6-チオイノシン（NBMPR）、6-ベンジルグアニジン（6-BG）、ビス-クロロニトロソウレア（BCNU）およびCAMPTOTHECIN（商標）、またはそれらのいずれかの治療用誘導体も挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。

「薬物耐性遺伝子」とは、化学療法剤（例えばメトトレキサート）などの作用物質に対する「耐性」をコードする核酸配列を意味する。言い換えると、細胞における薬物耐性遺伝子の発現は、当該作用物質の存在下で、当該薬物耐性遺伝子を持たない対応する細胞の増殖よりも高度な細胞の増殖を可能にする。本発明の薬物耐性遺伝子は、代謝拮抗物質、メトトレキサート、ビンブラスチン、シスプラチン、アルキル化剤、アントラサイクリン類、細胞傷害性抗生物質、抗イムノフィリン、それらの類似体または誘導体などに対する耐性をコードすることができる。

標的とする細胞に薬剤耐性を付与するために使用できる可能性がある薬物耐性遺伝子がいくつか同定されており、遺伝子療法技法の進歩は（Takebe, Zhao et al. 2001; Sugimoto, Tsukahara et al. 2003; Zielske, Reese et al. 2003; Nivens, Felder et al. 2004; Bardenheuer, Lehmberg et al. 2005; Kushman, Kabler et al. 2007）。

薬物耐性遺伝子の一例として、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の突然変異型または改変型を挙げることもできる。DHFRは、細胞におけるテトラヒドロ葉酸量の調節に関与する酵素であり、DNA合成にとって不可欠である。メトトレキサート（MTX）などの葉酸類似体はDHFRを阻害し、それゆえに抗新生物剤として臨床的に使用されている。治療に使用される抗葉酸薬による阻害に対する耐性が増加しているDHFRの突然変異型がいくつか記述されている。特定の一態様では、本発明の薬物耐性遺伝子が、メトトレキサートなどの抗葉酸処置に対する耐性を付与する少なくとも一つの突然変異を含むヒト野生型DHFR（GenBank: AAH71996.1）の突然変異型をコードする核酸配列でありうる。特定の実施形態では、DHFRの突然変異型が、位置G15、L22、F31またはF34、好ましくは位置L22またはF31に、少なくとも一つの突然変異アミノ酸を含む（Schweitzer, Dicker et al. 1990;国際出願W094/24277;米国特許US6,642,043）。特定の一態様では、該DHFR突然変異型が位置L22およびF31に2つの突然変異アミノ酸を含む。本明細書に記載するアミノ酸位置の対応は、配列番号42に示す形態の野生型DHFRポリペプチドのアミノ酸の位置との関連で表現されることが多い。特定の一態様では、位置15のセリン残基が、好ましくはトリプトファン残基で置き換えられる。別の特定態様では、位置22のロイシン残基が、好ましくは、突然変異型DHFRの抗葉酸薬への結合を破壊することになるアミノ酸、好ましくはフェニルアラニンまたはチロシンなどの非荷電アミノ酸残基で置き換えられる。別の特定態様では、位置31または34のフェニルアラニン残基が、好ましくは、小さな親水性アミノ酸、例えばアラニン、セリンまたはグリシンで置き換えられる。

本明細書にいう「抗葉酸剤」または「葉酸類似体」とは、何らかのレベルで葉酸代謝経路を妨害することを目的とする分子を指す。抗葉酸剤の例には、メトトレキサート（MTX）;アミノプテリン;トリメトレキセート（Neutrexin（商標））;エダトレキセート; N10-プロパルギル-5,8-ジデアザ葉酸（CB3717）; ZD1694（Tumodex）、5,8-ジデアザイソ葉酸（IAHQ）; 5,10-ジデアザテトラヒドロ葉酸（DDATHF）; 5-デアザ葉酸; PT523（Nα-（4-アミノ-4-デオキシプテロイル）-Nδ-ヘミフタロイル-L-オルニチン）; 10-エチル-10-デアザアミノプテリン（DDATHF、ロメトレキソール（lomatrexol））; ピリトレキシム; 10-EDAM; ZD1694; GW1843; ペメトレキセート（Pemetrexate）およびPDX（10-プロパルギル-10-デアザアミノプテリン）などがある。

薬物耐性遺伝子の別の例として、グアノシンヌクレオチドのデノボ合成における律速酵素であるイノシン-5'-一リン酸デヒドロゲナーゼII（IMPDH2）の突然変異型または改変型を挙げることもできる。突然変異型または改変型のIMPDH2はIMPDH阻害剤耐性遺伝子である。IMPDH阻害剤としては、ミコフェノール酸（MPA）またはそのプロドラッグであるミコフェノール酸モフェチル（MMF）を挙げることができる。突然変異型IMPDH2は、野生型ヒトIMPDH2（配列番号43; NP_000875.2）のMAP結合部位に、IMPDH阻害剤に対する耐性の著しい増加につながる少なくとも一つ、好ましくは二つの突然変異を含みうる。突然変異は、好ましくは、位置T333および/またはS351にある（Yam, Jensen et al. 2006; Sangiolo, Lesnikova et al. 2007; Jonnalagadda, Brown et al. 2013）。特定の一態様では、位置333のスレオニン残基がイソロイシン残基で置き換えられ、位置351のセリン残基がチロシン残基で置き換えられる。本明細書に記載するアミノ酸位置の対応は、配列番号43に示す形態の野生型ヒトIMPDH2ポリペプチドのアミノ酸の位置との関連で表現されることが多い。

別の薬物耐性遺伝子は突然変異型のカルシニューリンである。カルシニューリン（PP2B）は遍在的に発現しているセリン/スレオニンプロテインホスファターゼであり、多くの生物学的プロセスに関与し、T細胞活性化の中心でもある。カルシニューリンは、触媒サブユニット（CnA; 3つのアイソフォーム）と調節サブユニット（CnB; 2つのアイソフォーム）とから構成されるヘテロ二量体である。T細胞受容体の会合後に、カルシニューリンは転写因子NFATを脱リン酸化し、それが核に移行して、IL2などのキー標的遺伝子を活性化することを可能にする。FKBP12との複合体を形成したFK506またはCyPAとの複合体を形成したCsAは、カルシニューリンの活性部位へのNFATのアクセスを遮断することで、その脱リン酸化を防ぎ、それによってT細胞活性化を阻害する（Brewin, Mancao et al. 2009）。本発明の薬物耐性遺伝子は、FK506および/またはCsAなどのカルシニューリン阻害剤に対して耐性な突然変異型のカルシニューリンをコードする核酸配列であることができる。特定の一態様において、該突然変異型は、野生型カルシニューリンヘテロ二量体aの位置V314、Y341、M347、T351、W352、L354、K360に少なくとも一つの突然変異アミノ酸を含むことができ、好ましくは位置T351とL354またはV314とY341に二重突然変異を含むことができる。特定の一態様では、配列番号44の位置341のバリン残基をリジン残基またはアルギニン残基で置き換えることができ、位置341のチロシン残基をフェニルアラニン残基で置き換えることができ、位置347のメチオニンをグルタミン酸残基、アルギニン残基またはトリプトファン残基で置き換えることができ、位置351のスレオニンをグルタミン酸残基で置き換えることができ、位置352のトリプトファン残基をシステイン残基、グルタミン酸残基またはアラニン残基で置き換えることができ、位置353のセリンをヒスチジン残基またはアスパラギン残基で置き換えることができ、位置354のロイシンをアラニン残基で置き換えることができ、位置360のリジンをアラニン残基またはフェニルアラニン残基で置き換えることができる。本明細書に記載するアミノ酸位置の対応は、配列番号44（GenBank: ACX34092.1）に示す形態の野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体aポリペプチドのアミノ酸の位置との関連で表現されることが多い。

別の特定態様では、該突然変異型が野生型カルシニューリンヘテロ二量体bの位置V120、N123、L124またはK125に少なくとも一つの突然変異アミノ酸を含むことができ、好ましくは位置L124とK125に二重突然変異を含みうる。ある特定態様では、配列番号45のアミノ酸配列において、位置120のバリンをセリン残基、アスパラギン酸残基、フェニルアラニン残基またはロイシン残基で置き換えることができ、位置123のアスパラギンをトリプトファン残基、リジン残基、フェニルアラニン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基またはセリン残基で置き換えることができ、位置124のロイシンをスレオニン残基で置き換えることができ、位置125のリジンをアラニン残基、グルタミン酸残基、トリプトファン残基で置き換えるか、位置125のリジンの後にロイシン-アルギニンまたはイソロイシン-グルタミン酸などの2残基を付加することができる。本明細書に記載するアミノ酸位置の対応は、配列番号45（GenBank: ACX34095.1）に示す形態の野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体bポリペプチドのアミノ酸の位置との関連で表現されることが多い。

別の薬物耐性遺伝子は、ヒトアルキルグアニントランスフェラーゼ（hAGT）をコードするO（6）-メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（MGMT）である。AGTは、ニトロソウレアやテモゾロミド（TMZ）などのアルキル化剤の細胞傷害効果に対する耐性を付与するDNA修復タンパク質である。6-ベンジルグアニン（6-BG）は、ニトロソウレアの毒性を増強するAGTの阻害剤であり、TMZの細胞傷害作用を増強するためにTMZと同時投与される。AGTの変異体をコードする突然変異型MGMTのいくつかは、6-BGによる不活化に対して著しく耐性であるが、DNA損傷を修復する能力は保っている（Maze, Kurpad et al. 1999）。ある特定態様では、AGTの突然変異型が、配列番号46のアミノ酸配列（UniProtKB: P16455）の野生型AGTの位置P140に、突然変異アミノ酸を含みうる。好ましい一態様では、位置P140のプロリンがリジン残基で置き換えられる。

別の薬物耐性遺伝子は多剤耐性タンパク質1（MDR1）遺伝子である。この遺伝子は、細胞膜越しの代謝副産物の輸送に関与するP糖タンパク質（P-GP）として知られている膜糖タンパク質をコードしている。P-Gpタンパク質は、構造的に無関係ないくつかの化学療法剤に対して幅広い特異性を呈する。したがって、MDR-1（NP_000918）をコードする核酸配列の発現によって、細胞に薬物耐性を付与することができる。

「ベクター」という用語は、そこに連結された別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子を指す。本発明の「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、あるいは染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸または合成核酸からなりうる線状または環状のDNA分子またはRNA分子が含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましいベクターは、自律的複製能を有するもの（エピソームベクター）および/またはそれらが連結されている核酸を発現させる能力を有するもの（発現ベクター）である。数多くの好適なベクターが当業者に知られており、市販されている。

「送達ベクター」とは、本発明において必要な作用物質/化学物質および分子（タンパク質または核酸）を、細胞と接触させ（すなわち「接触させ」）、または細胞もしくは細胞内区画の内部に送達する（すなわち「導入する」）ために、本発明において使用することができる任意の送達ベクターを表す。これには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マイクロバブル（超音波造影剤）、ナノ粒子、エマルションまたは他の適当な導入ベクターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えばアデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えばインフルエンザウイルス）などのマイナス鎖RNAウイルス、ラブドウイルス（例えば狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば麻疹ウイルスおよびセンダイウイルス）、ピコルナウイルスやアルファウイルスなどのプラス鎖RNAウイルス、および二本鎖DNAウイルス、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン・バー・ウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えばワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、およびカナリア痘ウイルス）が含まれる。他のウイルスには、例えばノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスなどがある。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫ウイルス、哺乳類C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスがある（Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al.編, Lippincott-Raven Publishers,フィラデルフィア, 1996）。

「レンチウイルスベクター」とは、パッケージング容量が比較的大きく、免疫原性が低く、広範囲にわたる異なる細胞タイプに高い効率で安定に形質導入する能力を持つことから、遺伝子送達にとって非常に有望な、HIVベースのレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは通常、3種類（パッケージング、エンベロープおよび導入）以上のプラスミドを生産細胞に一過性にトランスフェクトした後に生成する。HIVのように、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面の受容体との相互作用によって標的細胞に進入する。進入すると、ウイルスRNAは、ウイルス逆転写複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は二本鎖線状ウイルスDNAであり、これが感染細胞のDNAへのウイルス組込みの基質である。「組込みレンチウイルスベクター（すなわちLV）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込むことができるそのようなベクターを意味する。反対に、「非組込みレンチウイルスベクター（すなわちNILV）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用による標的細胞のゲノムへの組込みを起こさない効率のよい遺伝子送達ベクターを意味する。

細胞（単数または複数）とは、任意の真核生細胞、初代細胞およびこれらの生物に由来するインビトロ培養用の細胞株を表す。

「初代細胞」（単数または複数）とは、生組織から直接採取され（すなわち生検材料）、インビトロで成長させるために樹立された細胞であって、ごくわずかな集団倍加しか起こしておらず、それゆえに、連続腫瘍原性細胞株または人工不死化細胞株と比較して、それらが由来する組織の主な機能的成分および特徴を、よりよく表現しているものを表す。非限定的な例として、細胞株は、CHO-K1細胞、HEK293細胞、Caco2細胞、U2-OS細胞、NIH3T3細胞、NSO細胞、SP2細胞、CHO-S細胞、DG44細胞、K-562細胞、U-937細胞、MRC5細胞、IMR90細胞、Jurkat細胞、HepG2細胞、HeLa細胞、HT-1080細胞、HCT-116細胞、Hu-h7細胞、Huvec細胞、Molt4細胞からなる群より選択することができる。

これらのポリペプチドが由来するゲノムデータからは多少の変動性が生じるので、そしてまた、これらのポリペプチド中に存在するアミノ酸のいくつかは活性の有意な喪失を伴わずに置換することが可能であること（機能的変異体）を考慮して、本発明は、本特許出願において提供する配列との間に少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性を有する、上記ポリペプチドのポリペプチド変異体を包含する。

したがって本発明は、配列番号8〜配列番号15および配列番号22〜配列番号33および配列番号40〜46からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、95％、97％または99％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドに向けられる。

「同一性」とは、2つの核酸分子間または2つのポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較のために整列されていてもよい各配列の位置を比較することによって決定することができる。比較する配列中の位置が同じ塩基で占められている場合、その分子はその位置において同一である。核酸配列間またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、それらの核酸配列が共有している位置における同一ヌクレオチドまたは一致ヌクレオチドの数の関数である。2つの配列感の同一性を算出するには、FASTAやBLAST（これらは、GCG配列解析パッケージ（University of Wisconsin、ウィスコンシン州マディソン）の一部として利用することができ、例えばデフォルト設定で使用することができる）などといった、さまざまな整列アルゴリズムおよび/またはプログラムを使用することができる。例えば、本明細書に記載する具体的ポリペプチドに対して少なくとも70％、85％、90％、95％、98％または99％の同一性を有し、かつ好ましくは実質的に同じ機能を呈するポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするヌクレオチドが考えられる。

1-統計的アプローチ:複数の異なるドナーからの試料をプールすることによる標準偏差の低減
1.1/プーリングによる標準偏差の低減
適格ドナーの集団内で変動する生物学的パラメータを≪a≫とする。≪a≫の値の分布関数をDとする。ここでD（x）は、ランダムに抜き出したドナーにおいて≪a≫を測定した場合に、≪a≫がxに等しくなる確率である。平均化された≪a≫の値（すなわち≪平均≫）をE（a）、その分散をS（a）、その標準偏差をS（a）^（1/2）とする。

一人の個別ドナーだけから作業するのではなく、ここでは、数人の個体の（等モル）混合物（≪プール≫）から作業することを考える。これらの異なる個体において異なる≪a≫値の間には何の関連もないものと仮定する。

適格ドナーの集団から取り出したn人の個体のプールについて測定される≪a≫の値を≪b_n≫とする。平均化された≪b_n≫の値は依然としてE（a）であり、その分散はS（b_n）＝S（a）×n^-1であり、その標準偏差はS（a）^（1/2）×n^-（1/2）である。≪b_n≫の値間のばらつきは、個別ドナー間の≪a≫に見られるものと比較して、n^-（1/2）倍≪改善される≫。

例えば、生物学的パラメータがその平均値からその値の10％の標準偏差で変動すると、該生物学的パラメータは、4人のプールでは10％/2＝5％の標準偏差で変動し、16人のプールでは10％/4＝2.5％の標準偏差で変動することになる。

数種類の生物学的パラメータの標準偏差を同時に低減する場合、それらの一部が互いに独立ではなく、該生物学的パラメータの一部の標準偏差を低減するためにドナーが選択されるのであれば、いくつかのパラメータについては平均値のシフトが見られることもありうる（それらの標準偏差は依然として低減している）点に、留意されたい。

1.2/プーリングの制限:不適格ドナーの組み入れ
ドナーにおいて測定されるパラメータであって、該ドナーの除外につながる値を有する場合があるパラメータを≪c≫とする（≪c≫は量的尺度または二値尺度の対象である）。

ドナーを適格にする値をcが有する確率をH（c）とし、ドナーを不適格にする値をcが有する確率を（1-H（c））とする。

≪c≫の値ゆえに不適格であるドナーを一人も含まないn人のドナーのプールを取り出す確率はH（c）ⁿである。

（要求される治療的投薬のために）プールに組み入れられるドナーの総数をTとすると、R＝T/nは、そのドナー集団から取り出される異なるプールの数を表す。

プールサイズnを最適化することは、
（i）細胞の使用目的に関係する標準偏差の十分な低減
と
（ii）あるプールを不適格化するであろうドナーを含まない十分な確率
との間での折り合いの結果である。

1.3/前提セットの例
前提セット1
（i）健康なドナーからの血液において通常測定される生物学的パラメータ、生物学的受容体（多形）のそのリガンドに対するアフィニティ、およびドナーから得られる試料内の細胞部分集団の相対的比率は、最大で一桁の変動を有する。最悪の場合、各パラメータの標準偏差はVmax＝その平均値の90％になるだろう;
（ii）プロセスまたは治療の一部としてのこれらのパラメータに対する許容差は、Vtol＝30％程度である（すなわち、少なくとも3分の1への低減が望ましい）;
（iii）候補ドナーが、それを含む任意のプールを不適格化するパラメータ値を有する確率は、最大でZ＝1％である;
（iv）目標は、プールのそれぞれに不適格化ドナーを一人も含まない可能性を、少なくともK＝90％にすることである。

上記の仮定によれば、許容できるn（すなわちプールサイズ）の値は、以下のように範囲設定することができる。

一方、

前提セット2
この第2の実施例ではいくつかの≪重要な≫パラメータに焦点を絞る。標準偏差を低減すべきp個の≪重要な≫パラメータのいずれかが、あるドナーについて、該パラメータの平均値を含むVconf（信頼区間）を越える値を有するならば、当該ドナーはそれを含む任意のプールを不適格化すると仮定する。言い換えると、低減した標準偏差（≪ガウスの中心（Center of Gaussian）≫ともいう）を有するのに十分な数の均一な≪平均的≫ドナーが望ましい。

標準偏差を低減すべきであると共に、その極値を除外すべき、p個のパラメータa₁、a₂、a₃、... a_pを考え、パラメータ≪a_i≫ の値が信頼区間Vconf_i内にある確率をQ_Vconf（a_i）とする。
この場合、W＝ΠQ_Vconf（a_i）（すべてのQ_Vconf（a_i）の積）は、（パラメータa_iは独立であるという前提の下で）あるドナーがそれを含むプールを不適格化しない確率を表す。先の表記では、（1-Z）＝Wである。

加えて、Wⁿは、ランダムに取り出したn人のドナーのプールに不適格化ドナーが一人も含まれない確率を表す。

例えばもし、
・p個のパラメータa₁、a₂、a₃、... a_pの分布がガウス型 であり、かつ
・Vconf_i＝S（a_i）^（1/2）＝Vconf（p個のパラメータのすべてで同じ:1標準偏差）
であるとすれば、W＝Q_Vconf（a₁）^pであり、目的は

となる。

p個のパラメータに関して≪平均的≫ドナーを求めるのであれば、ln（K）/（ln（Q_Vconf）×p）を上回らない数のドナーを同時にプールすべきである。

例えば、
Q_Vconf（a_i）＝84.13％＝Q_Vconf（任意のiについて）であり、かつ
・K＝50％であれば、n≦4/pでなければならない。

Vconfが2標準偏差に対応するなら、Q_Vconf（a_i）＝97.72％＝Q_Vconf（任意のiについて）であり、かつ
・K＝50％であれば、n≦30/pでなければならず、
・K＝85％であれば、n≦7/pでなければならない。

前提セット3
以下を仮定する:
・ドナーは、3つの主要パラメータによって、プーリングについて適格または不適格と判定されうる;
・上述した3つのパラメータの±2標準偏差以内の値は許容される;
・上述した3つのパラメータのいずれかが±2標準偏差を越えるドナーを一人も含まない確率は、少なくとも75％であるべきである。

これらの前提の下では、p＝3、Q_Vconf（a_i）＝97.72％＝Q_Vconf、およびK＝75％である。すると、n≦4.15なので、n＝4の場合、プーリングにより、標準偏差は4^-（1/2）倍、すなわち係数0.5だけ、≪改善≫される。

1.4結論
上記を考慮すると、以下のいずれかを規定することが可能であると思われる:

（I）・不適格ドナーの割合をごくわずかにするのに十分に大きい許容区間W（≪ガウスの中心≫）、および
・無作為に取り出したプール中に不適格ドナーを含まない（したがって該プールが却下されない）最小許容確率K、
次に、ドナー間の変動性からプールの許容できる変動性への所望の低減率≪F≫を推定し、そこから
・F²、各プールにおけるドナーの最小数、
・ln（K）/ln（W）、各プールにおけるドナーの最大数
を推定すること。
例えば、もし
・パラメータの分布がガウス型であり、
・平均からの逸脱が2標準偏差を越えないパラメータ値を持つドナーを受け入れ（例えばW＝97.72％であれば、ランダムに取り出したドナーが却下される確率は2.28％になるだろう）、
・不適格ドナーを含んでいるために却下されるプールを15％以下にすべき（すなわち（K＝85％）
であるならば、プールによるランダムドナーの最大数は

とすべきである。
または
（II）・前記パラメータまたはその代用物（例えば極値を持つドナーを除外すること）に基づいてドナーを選択し、それによって、あるドナーが不適格になる確率を低減し（例えば不適格ドナーの除外が不完全な場合に、その確率が0.2％未満なら、W＝99.8％になるだろう）
・次に、プーリングによってパラメータの変動性を低減する（すなわち、上述の数字なら、

であり、プール間のパラメータの標準偏差は選択したドナー間の標準偏差の9分の1になる）
ことによって、パラメータの標準偏差を低減すること。

例えば、パラメータの測定そのものが多少の誤差率または量の不確実性≪ε≫に従うなら、平均から1標準偏差以内のパラメータ測定値を持つドナーの選択は、プール中に多少の不適格ドナー（そのドナーのパラメータ測定値は、最大で、要求される区間から距離≪ε≫だけ外れた位置にあるだろう）を許すことになるだろう。

この確率が約0.1％であり、プール中に不適格ドナーを含まない所望の確率が90％であるならば、最大で、

である。

後者の場合、一人の不適格ドナーを含むプールのパラメータ値がそれ自体、適格ドナーを選択するために使用した所望の区間（すなわち上記の例では平均から1標準偏差）から外れる確率は（無視することはできないとしても）極めて低い。

参考文献

Claims (20)

1. 複数の異なるドナーに由来するT細胞のバッチを生成するための方法であって、
   （a）個別ドナーからT細胞試料を得る工程、
   （b）T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも一つの遺伝子を破壊するレアカットエンドヌクレアーゼを、個別試料それぞれの細胞中に導入する工程、
   （c）該試料からTCR陰性細胞を精製する工程、
   （d）少なくとも2人の個別ドナーからの該試料に由来する該TCR陰性細胞をプールすることで、既製品として使用するためのT細胞のバッチを得る工程
   を含む、方法。
2. 3〜50人の個別ドナーからの試料をプールする工程を含む、請求項1記載の方法。
3. 3〜30人、好ましくは3〜10人の個別ドナーからの試料をプールする工程を含む、請求項2記載の方法。
4. 複数のドナーが異なるHLAタイプを発現する、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
5. T細胞の活性化工程をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
6. 活性化工程が、T細胞を抗CD3および抗CD28抗体と接触させることを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
7. レアカットエンドヌクレアーゼが、該レアカットエンドヌクレアーゼをコードするmRNAのトランスフェクションによって導入される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
8. レアカットエンドヌクレアーゼが工学的に操作されたTALEヌクレアーゼである、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
9. 少なくとも一人のドナーが、HLAクラスIを発現するT細胞を有する、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
10. 少なくとも一人のドナーが、HLA-C1およびHLA-C2アレルと、HLA-AまたはHLA-BアレルのBw4モチーフとを発現するT細胞を有する、請求項9記載の方法。
11. 少なくとも一つのキメラ抗原受容体（CAR）をT細胞の表面に発現させる工程をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
12. 免疫チェックポイント遺伝子をコードする少なくとも一つの遺伝子を不活化することによってT細胞がさらに改変される、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
13. T細胞が、免疫抑制剤または化学療法剤の標的をコードする少なくとも一つの遺伝子を不活化することによってさらに改変される、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
14. T細胞が組換え自殺遺伝子で形質転換される、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
15. 請求項1〜14のいずれか一項記載の方法に従って得ることができるT細胞のバッチ。
16. T細胞のバッチであって、該T細胞が、破壊された、T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも一つの遺伝子を含み、かつ少なくとも2人の異なるドナーに由来する、T細胞のバッチ。
17. 3〜50人、好ましくは3〜30人、より好ましくは3〜10人の異なるドナーに由来するT細胞を含む、請求項16記載のT細胞のバッチ。
18. 養子細胞免疫療法において使用するための、請求項15〜17のいずれか一項記載のT細胞のバッチ。
19. がん、ウイルス疾患、または自己免疫疾患の処置に使用するための、請求項15〜18のいずれか一項記載のT細胞のバッチ。
20. 請求項15〜19のいずれか一項記載のT細胞のバッチを含む、薬学的組成物。