JP2018504145A

JP2018504145A - 再発性／難治性急性骨髄性リンパ腫または芽球性形質細胞様樹状細胞新生物を処置するための、ｃｄ１２３に結合するキメラ抗原受容体を賦与された、操作されたｔ細胞受容体ノックアウト免疫細胞

Info

Publication number: JP2018504145A
Application number: JP2017557491A
Authority: JP
Inventors: バーブラジョンソンサス; アルビンドラジパール; フィリップドゥシャトー; アレクサンドルジュイレラット; ジュリアンヴァルトン; ローマンガレット; マチューシモン
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2015-01-26
Filing date: 2016-01-25
Publication date: 2018-02-15
Also published as: BR112017015453A2; AU2016212158B2; US20180000914A1; CA2973529A1; US20180002435A1; MX2017009349A; CN107406516B; JP2018504144A; US20180002427A1; US11014989B2; WO2016120219A1; JP6884709B2; EP3250602A1; KR20170134331A; IL253049B; EP3250607A1; MX2017009182A; CN113968914A; RU2731543C2; CA2973532A1

Abstract

本発明は、CD123に特異的なキメラ抗原受容体（CAR）を発現しTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作された免疫細胞に関し、該CARは、免疫細胞の特異性および反応性をCD123発現細胞へ向け直すことができる組換えキメラタンパク質であり、より具体的には、該CARにおいて細胞外リガンド結合部は、CD123陽性細胞に対する特異的免疫を付与するCD123モノクローナル抗体から誘導されたscFVである。そのようなCD123 CARを賦与された操作された免疫細胞は、再発難治性AMLおよび芽球性形質細胞様樹状細胞新生物の処置に、また骨髄移植前の処置としての使用に、とりわけ適している。

Description

発明の分野
本発明は、概して、インターロイキン3受容体アルファ鎖（IL-3Ra、分化抗原群（cluster of differentiation）123、CD123）に特異的なキメラ抗原受容体（CAR）を発現するように操作されたTCR遺伝子ノックアウトT細胞、およびそれらの使用、例えばIL-3Ra、CD123の発現と関連する疾患または状態、すなわち急性骨髄性白血病（AML）および芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（BPDCN）を処置するための、それらの使用に関する。

本発明は、
少なくとも1つの、ヒト化されていてもよいKlon43からの細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、細胞内ドメインおよび共刺激ドメインを含む、分化抗原群123（CD123）に特異的なキメラ抗原受容体（CAR）、
該ヒンジ中に挿入されていてもよい自殺ドメイン
を発現するように操作された、T細胞受容体（TCRアルファまたはベータ遺伝子）および/またはヒトデオキシシチジンキナーゼ（dCK遺伝子またはdck遺伝子）ノックアウト（KO）免疫T細胞に関する。ここで、該CD123 CARはヒトCD123に特異的であり、CD123陽性細胞に対する特異的免疫を付与する。一態様では、急性骨髄性白血病AMLの処置またはAMLの合併症の処置に使用するための本対象が提供される。一態様において、本対象は、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（BPDCN）の処置のために提供される。一態様において、本対象は、移植のブリッジとして、骨髄移植前の処置として提供される。

本発明のCD123 CARを賦与された、操作された免疫細胞は、以前のCD123 CARと比較して、リンパ腫および白血病の処置に関して高い効率を示し、患者には、プリン類似体の存在下で使用することができ、副作用も以前の処置より少ない。

発明の背景
白血病などのリンパ増殖性疾患、特に急性骨髄性白血病（AML）の導入処置（induction treatment）は50年近くにわたってほとんど何も変わっていない。そのような標準的導入化学療法は完全寛解を導入する場合もあるが、多くの患者が結局は再発を起こして、この疾患に屈することから、AMLのための、特に再発性難治性AMLのための、新規な治療薬の開発が必要とされている。

BPDCNなどの悪性度の高いリンパ増殖性疾患でも同様の知見が報告されている。これらの疾患は依然として予後不良である。これらのがん性細胞の免疫表現型検査により、インターロイキン3受容体アルファ鎖（IL-3Rα;CD123-NCBIリファレンス:NP_001254642）は、これらの腫瘍細胞では正常細胞と比較して過剰に発現しているため、免疫療法の標的となりうることが明らかになっている。加えて、CD123特異的治療薬について2件の第I相治験が完了しており、どちらの薬物も良好な安全性プロファイルを呈した（ClinicalTrials.gov ID: NCT00401739およびNCT00397579）。残念なことに、これらのCD123標的薬の効力は限定的であることから、抗白血病活性を認めるには、CD123を標的とするさらに強力で特異的な代替療法が必要であることが示唆された。

白血病処置のためのおそらくより強力な代替治療として、MHC非依存的に免疫細胞の特異性を細胞表面腫瘍関連抗原（TAA）へと選択的に向かわせて（Jena, Dotti et al. 2010）、それらを壊滅する、キメラ抗原受容体（CAR）を発現する免疫細胞の使用が考えられる。

CARは、ターゲティング部分からなる合成受容体であり、このターゲティング部分には、単一融合分子中または複数融合分子中の1つまたは複数のシグナリングドメインが付随している。CARの結合部分は概して、フレキシブルリンカーによって接合されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片（light and variable fragments）を含む単鎖抗体（scFv）の抗原結合ドメインからなる。受容体ドメインまたはリガンドドメインに基づく結合部分も使用されて成功を収めている。第一世代CAR用のシグナリングドメインは、CD3ゼータ鎖またはFc受容体ガンマ鎖の細胞質領域から誘導される。第一世代CARは、T細胞の細胞傷害性をうまく向け直すことが示されているが、インビボで長期間にわたる増加および抗腫瘍活性を与えることはできなかった。CARで修飾されたT細胞のインビトロでの生存率を高め、その増殖を増加させるために、OX-40（CD134）および4-1BB（CD137）を含む共刺激分子からのシグナリングドメインが、単独で、または組み合わせて付加された。しかし、ドメインの組み合わせのすべてが、インビボで免疫細胞を標的細胞に向かわせることができるCARをもたらすわけではない。

ヒトがんのマウスモデルにおいて、CARは、CAR発現細胞を、各ドメインの性質および長さに応じた効率で、腫瘍細胞の表面に発現した抗原に向け直すことができる（Condomine M. et al., 2015 Plos One 10（6）:e0130518）。今までに、CARを発現する特異的T細胞の自家移入は、単独で、サイトカインストーム、細胞集団の非特異的破壊、または求められていない特異的免疫反応などといったいくつかの副作用にもかかわらず、特別な形態のがんの処置では奏功することが示されている（Park, Rosenberg et al. 2011）。操作された同種異系CD123 CAR T細胞をAMLの処置に安全かつ効率的に使用できるかどうかはわかっていない（ClinicalTrials.gov ID:NCT02159495）。

そこで、そのような処置の恩恵を受けうる患者人口を広げるために、CARを発現するいわゆる同種異系T細胞が、がんを患うヒトにおいてそれらを使用するために調製された。この場合、免疫細胞は健常ドナーから単離され、操作された後、処置を必要とする何人かの選ばれた異なる患者において、処置として使用される。

そのために、そしてまた潜在的な移植片対宿主病のリスクを低減するために、免疫応答に関与する分子の発現量、例えばMHC分子またはTCR分子のサブユニットの発現量が低減している、操作されたCAR発現免疫細胞が得られるように、選ばれた遺伝子が注意深くノックアウトされた。そのような操作された細胞が任意の宿主において依然として増殖し生き残る程度は、既に化学療法剤で処置された患者においては特に、今なおほとんどわかっていない。

CD123を標的とするそのようなCAR発現免疫T細胞と、抗がん処置として通常使用される処置としての細胞傷害性化学療法剤との併用は、抗がん処置がT細胞の増殖および/または生存にも影響を及ぼすので、今なお課題である。

したがって、特異的であり、効率がよく、薬物、特に抗がん化学療法剤、例えば細胞増殖に影響を及ぼすものなどの使用と適合する、CD123を標的とするT細胞であって、それでもなお増殖し、生き残って、その標的（がん細胞）に到達することができるものを開発する必要もある。

「既製の（off-the-shelf）」同種異系治療用細胞を化学療法と一緒に使用するために、本発明者らは、がんを患っておりかつ/または化学療法剤で既に処置されている患者の免疫系にとって同種異系性が低く（less allogeneic）許容的である操作された同種異系T細胞を提供するための手段を特定した。化学療法と本願請求項の対象である免疫療法との相乗効果によって、治療上の利益が与えられる。

本発明は、細胞選別と細胞枯渇がどちらも可能になるように細胞外結合ドメイン（scFv）が修飾されている抗CD123キメラ抗原受容体（抗CD123 CAR）にも向けられる。これを可能にする構造は、モノクローナル抗体によって認識されるエピトープであり（mAbによる選別/枯渇系（mAb-driven sorting/depletion system）、または特異的モノクローナル抗体によって認識されるエピトープ、またはミモトープと呼ばれる）、細胞外ドメインのscFv内および/またはヒンジ内に挿入された、選ばれたエピトープを含む。このエピトープは、特異的抗体（好ましくは、ヒト化されていてもよいモノクローナル抗体（mAb））によって認識される特異性を有する。主にCARの外部リガンド結合ドメインがエピトープを含むように修飾されるという事実を考慮すると、異なるCARアーキテクチャ、すなわちPCTUS2013/058005に開示されている一本鎖または多鎖を想定することができる。

VHポリペプチドおよびVLポリペプチドならびに特異的エピトープで形成される本発明のキメラscFvは、それ自体が、エピトープの挿入位置およびリンカーの使用に依存して異なる構造を有しうる（図3）。本発明は、上記の結果得られる方法であって、修飾されたCARを賦与された、操作された免疫細胞を選別しかつ/または枯渇させるための方法にも関係する。

そのような系の作製には、いくつかのエピトープ-mAbペア、特に医学的使用が既に承認されているもの、例えば非限定的な例としてCD20/リツキシマブなどを使用することができる。

最後に、本発明は、抗CD123 CARを賦与された、操作された免疫細胞の数、活性および生存が、該CARの外部リガンド結合ドメインに対する抗体を使って細胞を枯渇させることによって調整される、治療方法を包含する。

インターロイキン3受容体アルファ鎖（CD123）は、白血病腫瘍細胞上に、急性骨髄性白血病（AML）の場合は特に、同じ系譜の正常細胞と比較して、高頻度に過剰発現していると同定された。

本発明者らは、KLON43抗体からのscFV、FcγRIIIαからのヒンジ、および宿主細胞にインビボでの増殖能を付与する細胞内ドメインを含むCD123特異的CARを発現し、CD123標的細胞に到達し、それらの生存を改変するように操作された免疫細胞であって、ひとたび標的細胞が封じ込められたら前記操作された免疫細胞を特異的に破壊することを可能にする追加マーカーまたは自殺ドメインを含む免疫細胞を作製した。これらのCD123特異的CARは、区別することなく、CD123特異的CARまたは抗CD123 CAR、または123 CAR、または「本発明のCAR」と呼ばれる。

本発明では、AML、B細胞リンパ増殖性障害（BC-LPD）またはBPDCNを患っている患者を処置するために、このIL-3受容体サブユニットに特異的な一つの抗体、すなわちklon43抗体、またはこのklon43抗体から誘導されるヒト化配列を使って、特異的および選択的で免疫寛容原性のTCR KO CD123 CAR発現T細胞が調製された。

同時に、これらの細胞は、難治性/再発性がんの進行および出現を停止させる前がん性細胞の破壊を可能にする。これらの細胞は、インビボで増殖し、組織またはニッチに到達するその能力ゆえに、がん性細胞そのものよりも早く作用し、悪性度の高いリンパ増殖性障害でさえ根絶することができる。

非特異的インビトロ活性化（例えば抗CD3/CD28被覆ビーズおよび組換えIL2によるもの）に続いて、ドナーからのT細胞を、ウイルス形質導入法を使って、本発明のCARを発現するポリヌクレオチドで形質転換した。移植片対宿主反応を低減するために、T細胞をさらに操作して、T細胞受容体TCR（αβ-T細胞受容体）のコンポーネントの破壊により、アロ反応性が低下したT細胞を作製した。

好ましい一態様では、古典的抗がん薬、すなわちプリン類似体と併用される、抗がん薬に対して耐性な免疫寛容原性T細胞を作製するために、表9において特定する遺伝子の特別な組み合わせを欠失させることによって、T細胞をさらに操作した。

上記の結果得られる操作されたT細胞は、CD123陽性細胞に対する反応性を呈したことから、本発明のCARはT細胞の抗原依存的活性化の一因になり、その増殖の一因にもなることが示された。このことは、これらの操作された細胞を、免疫療法にとって有用なものにする。

上記の結果得られる操作されたT細胞は、インビボでCD123陽性細胞に対する反応性を呈した。また、これらの操作されたT細胞はインビボでがん細胞の数を有意に低減する。

特定の一態様では、本発明の操作されたT細胞の投与を数回行って、それらを、第1処置（導入）としての免疫療法、強化処置としての免疫療法、古典的抗がん化学療法との併用処置としての免疫療法にとって有用なものにすることができる。

本発明のCARをコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列については、本明細書において詳述する。

本発明の操作された免疫細胞は、B細胞性リンパ腫処置または白血病処置などの治療的応用にとってとりわけ有用であり、生物から選択的に排除することができる。R

本発明の操作された免疫細胞の模式図。この図に提示する操作された免疫細胞は、CARをコードするレトロウイルスポリペプチドによって形質導入されたT細胞である。このT細胞は、患者へのより良い、より安全な生着が可能になるようにさらに操作され、それは本発明の枠組みの一部である。X遺伝子は、TCRのコンポーネントを発現する遺伝子（TCRアルファ遺伝子またはTCRベータ遺伝子）であり、Yは、プリン類似体に対するT細胞の感受性に関与する遺伝子dCKである。ヒト化されていてもよいCD123 scfv、FcRIIIまたはCD8アルファからのヒンジ、CD8アルファからの膜貫通ドメイン、ならびに4-1BBおよびCD3ゼータからの2つの細胞内ドメインを含む、本発明の2つのCAR（123 CAR）の模式図。本発明のCARの例を示す図。L:（GGGGS）nである、VHとVLの間のリンカー。ここで、n＝1〜4、好ましくはn＝3（SEQ ID NO：10）。Li:GGGSまたはSGGGGSまたはGSGGGGSに対応するリンカー配列、TM:膜貫通ドメイン。ヒト化されていてもよいKlon43からのVH、リンカーL、ヒト化されていてもよいKlon43からのVL、自殺ドメイン（例えば2コピーの配列CPYSNPSLCS（SEQ ID NO：161）のCD20ミモトープ、および1コピーのSEQ ID NO：169）（該ミモトープは好ましくはscfv中にある）、CD8ヒンジまたはその一部、CD8アルファからの膜貫通ドメイン（CD8 TM）、共刺激ドメイン（4-1BB）および刺激ドメイン（ITAM CD3ゼータ）を含む本発明のCD123 CARを、調製した。本発明のCD123 CARでは、リンカーLiによって互いに、そしてVLに連結された2コピーの配列CPYSNPSLCSのCD20ミモトープが、抗CD123 scFvとCD8アルファからのヒンジとの間に挿入されており、随意のリンカーLIがミモトープをヒンジに接合する（SEQ ID NO：160）。（例えばscFvにおける）エピトープの挿入については他の可能性も考えられ、それらを図3に丸で図示する。 CAR+ T細胞をCD123発現細胞（RPMI8226）またはCD123を発現しない細胞（K562）と6時間にわたって共培養したときの、あるアーキテクチャ（v3:CD8-ヒンジ/CD8-膜貫通）に関する、本発明の異なるscFvの脱顆粒活性。異なるレベルのCD123を発現する細胞（KG1aまたはRPMI8226）またはCD123を発現しない細胞（K562）と24時間にわたって共培養したときの、T細胞によるIFNガンマ放出。 PNA（20mg/kg）ipで処置したマウスにおけるインビボでのCAR-T細胞の特異的細胞溶解活性の用量応答 PNA（20mg/kg）ipで処置したマウスにおけるインビボでのCAR-T細胞の特異的細胞溶解活性の用量応答。

（表１）

（表２）本発明のCD123 CARのための本発明の抗CD123 scfvに使用されたKlon43からの抗体断片の配列

（表３）本発明のCD123 CARのための本発明の抗CD123 scfvに使用されたKlon43からのヒト化抗体断片の配列

（表４）構造V-1のCAR

（表５）構造V-3のCAR

（表６）構造V-5のCAR

（表７）本発明のCARの細胞外ドメインにおいて使用することができる、ミモトープとも呼ばれるmAb特異的エピトープ（およびそれらに対応するmAb）の例。例えばミモトープおよびエピトープとそれらに対応するmAb

本発明の抗CD123 CARの配列（SEQ ID NO：31〜160）、好ましい配列はSEQ ID NO：31、32、160および34〜117であり、34〜117のなかでは、76〜117が、より好ましく、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97はさらに好ましい。

発明の詳細な説明
本発明は以下を提供する。
1．
ヒト化されていてもよいVH、リンカー、好ましくは配列（GGGGS）nのリンカー（n＝1〜4、好ましくはn＝3）、およびヒト化されていてもよいVL、ヒンジを順に含む、細胞外リガンド結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、ならびに
細胞質ドメイン、
モノクローナル抗体に特異的な少なくとも1つのエピトープ（ミモトープ）
を含む、CD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）。
2．
SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30から選択されるヒト化されていてもよいVH、リンカー、好ましくは配列（GGGGS）nのリンカー（n＝1〜4、好ましくはn＝3）、およびSEQ ID NO：11、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、およびSEQ ID NO：23から選択されるヒト化されていてもよいVL、ヒンジを順に含む、細胞外リガンド結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
CD8アルファからの膜貫通ドメイン、ならびに
CD3ゼータシグナリングドメインおよび4-1BBからの共刺激ドメインを含む、細胞質ドメイン
を含む、1記載のCD123 CAR。
3．
ヒトCD28 NP_006130.1との同一性を有する配列を含まない、1または2記載のCD123 CAR。
4．
SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、およびSEQ ID NO：187から選択される配列を含み、少なくとも1つのSEQ ID NO：161をさらに含んでもよい、1〜3のいずれか一つに記載のCD123 CAR。
5．
細胞外ドメインが、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、およびSEQ ID NO：170、好ましくはSEQ ID NO：161およびSEQ ID NO：169からなるリストから選択される、モノクローナル抗体に特異的な少なくとも1つのエピトープ（ミモトープ）を含む、1〜4のいずれか一つに記載のCD123 CAR。
6．
SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、およびSEQ ID NO：197から選択される配列を含む、1〜5のいずれか一つに記載のCD123 CAR。
7．
請求項1〜6のいずれか一つに記載のCD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）をコードする、ポリヌクレオチド。
8．
請求項7記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
9．
バックボーンと、請求項1〜6のいずれか一つに記載のCD123 CARのうちのいずれか1つをコードする少なくとも1つの配列とを含む、発現ベクター。
10．
バックボーン、EF1プロモーター、RQR8オープンリーディングフレーム（RQR8 ORF）、1〜6のCD123 CARのうちのいずれか1つをコードする配列を含む、発現ベクター。
11．
細胞表面膜に1〜6のいずれか一つに記載のCD123 CARを発現する、T細胞受容体（TCR）をノックアウト（KO）したかまたはTCRとヒトデオキシシチジンキナーゼ（dCK）とをKOした操作された免疫細胞。
12．
1〜6のいずれか一つに記載のCD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）をコードするポリヌクレオチドを含む、TCR KOであるまたはTCRおよびdCK KOである操作された免疫細胞。
13．
細胞表面に自殺ドメインをさらに発現する、4記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞。
14．
少なくとも1つのMHCタンパク質の発現が抑制されている、11〜13のいずれか一つに記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞。
15．
治療において使用するための、11〜14のいずれか一つに記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞。
16．
状態が、急性骨髄性白血病（AML）、好ましくは難治性/再発性AML、BPDNLである、または骨髄移植中もしくは骨髄移植前に使用するための、15記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞。
17．
処置として、好ましくはリンパ増殖性障害の処置として、より好ましくは白血病もしくはリンパ腫の処置として使用するための、または急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群、およびBPDNLからなる群より選択される処置のための、15記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞。
18．
AMLの処置として使用するための、15記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞。

本発明は以下も提供する。
1a．
少なくとも1つの細胞外結合ドメインを含む、CD123に特異的なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリペプチドであって、該細胞外ドメインは少なくとも1つのscFvを含み、該scfvは少なくともCD123に特異的に結合するVH鎖およびVL鎖を含んでいて、該細胞外結合ドメインは、少なくとも1つのmAb特異的エピトープまたはミモトープを含む、ポリペプチド。
2a．
mAb特異的エピトープがVH鎖とVL鎖の間またはVHおよびVLの前に位置する、1a記載のポリペプチド。

一態様において、CD123に特異的なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリペプチドは、膜貫通ドメイン（TM）とヒンジとを含んでおり、該mAb特異的エピトープはscfvとヒンジとの間に位置する。

本発明は、以下を提供する。
3a．
該VH鎖およびVL鎖ならびにmAb特異的エピトープが少なくとも1つのリンカーによって互いに結合され、ヒンジによって該CARの膜貫通ドメインに結合されている、1aまたは2a記載のポリペプチド。
4a．
mAb-エピトープが2つのリンカーによってVH鎖およびVL鎖に接合されている、3a記載のポリペプチド。
5a．
mAb特異的エピトープが、そのようなエピトープを含むCARを発現するT細胞のインビトロ細胞選別および/またはインビボ細胞枯渇のために、エピトープ特異的mAbによって結合されるエピトープである、1a〜3aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
6a．
ポリペプチドが1つの細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含み、該細胞外結合ドメインが少なくとも1つのmAb特異的エピトープを含む、1a〜5aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
7a．
細胞外結合ドメインが1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のmAb特異的エピトープを含む、1a〜6aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
8a．
細胞外結合ドメインが1、2、3または4個のmAb特異的エピトープを含む、1a〜7aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
9a．
細胞外結合ドメインが2、3または4個のmAb特異的エピトープを含む、1a〜8aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
10a．
細胞外結合ドメインが以下の配列を含む、1a〜9aのいずれか一つに記載のポリペプチド:
V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ1-（L）_x-;
V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ1-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-;
V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ1-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-エピトープ3-（L）_x-;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₁-L₁-V₂;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-V₁-L₁-V₂;
エピトープ1-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-エピトープ3-（L）_x-V₁-L₁-V₂;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ2-（L）_x;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-エピトープ3-（L）_x-;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-エピトープ3-（L）_x-エピトープ4-（L）_x-;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ3-（L）_x-;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ3-（L）_x-エピトープ4-（L）_x-;
V₁-（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₂;
V₁-（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₂-（L）_x-エピトープ2-（L）_x;
V₁-（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₂-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-エピトープ3-（L）_x;
V₁-（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₂-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-エピトープ3-（L）_x-エピトープ4-（L）_x;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₁-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-V₂;または
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₁-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-V₂-（L）_x-エピトープ3-（L）_x
ここで、
V₁はV_LでありかつV₂はV_Hであるか、またはV₁はV_HでありかつV₂はV_Lであり;
L₁は、V_H鎖をV_L鎖に連結するのに適したリンカーであり;
Lは、グリシン残基およびセリン残基を含むリンカーであって、細胞外結合ドメイン中のLの各存在は、同じ細胞外結合ドメインにおけるLの他の存在と同一であること、または相違することができ、
xは0または1であって、xの各存在は他のものからは独立して選択され、
エピトープ1、エピトープ2およびエピトープ3はmAb特異的エピトープであって、同一であること、または相違することができる。
11a．
細胞外結合ドメインが以下の配列を含む、10a記載のポリペプチド:
V₁-L₁-V₂-L-エピトープ1; V₁-L₁-V₂-L-エピトープ1-L; V₁-L₁-V₂-L-エピトープ1-L-エピトープ2; V₁-L₁-V₂-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L; V₁-L₁-V₂-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3; V₁-L₁-V₂-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L; V₁-L₁-V₂-エピトープ1; V₁-L₁-V₂-エピトープ1-L; V₁-L₁-V₂-エピトープ1-L-エピトープ2; V₁-L₁-V₂-エピトープ1-L-エピトープ2-L; V₁-L₁-V₂-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3; V₁-L₁-V₂-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L; エピトープ1-V₁-L₁-V₂; エピトープ1-L-V₁-L₁-V₂; L-エピトープ1-V₁-L₁-V₂; L-エピトープ1-L-V₁-L₁-V₂; エピトープ1-L-エピトープ2-V₁-L₁-V₂; エピトープ1-L-エピトープ2-L-V₁-L₁-V₂; L-エピトープ1-L-エピトープ2-V₁-L₁-V₂; L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-V₁-L₁-V₂; エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-V₁-L₁-V₂; エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L-V₁-L₁-V₂; L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-V₁-L₁-V₂; L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L-V₁-L₁-V₂; V₁-L-エピトープ1-L-V₂; L-エピトープ1-L-V₁-L-エピトープ2-L-V₂; V₁-L-エピトープ1-L-V₂-L-エピトープ2-L; V₁-L-エピトープ1-L-V₂-L-エピトープ2-L-エピトープ3; V₁-L-エピトープ1-L-V₂-L-エピトープ2-エピトープ3; V₁-L-エピトープ1-L-V₂-L-エピトープ2-L-エピトープ3-エピトープ4; L-エピトープ1-L-V₁-L-エピトープ2-L-V₂-L-エピトープ3-L; エピトープ1-L-V₁-L-エピトープ2-L-V₂-L-エピトープ3-L; L-エピトープ1-L-V₁-L-エピトープ2-L-V₂-L-エピトープ3; L-エピトープ1-L-V₁-L₁-V₂-L-エピトープ2-L; L-エピトープ1-L-V₁-L₁-V₂-L-エピトープ2-L-エピトープ3; L-エピトープ1-L-V₁-L₁-V₂-L-エピトープ2-エピトープ3;またはエピトープ1-L-V₁-L₁-V₂-L-エピトープ2-L-エピトープ3-エピトープ4
ここで、
V₁はV_LでありかつV₂はV_Hであるか、またはV₁はV_HでありかつV₂はV_Lであり;
L₁は、V_H鎖をV_L鎖に連結するのに適した任意のリンカーであり;
Lは、グリシン残基およびセリン残基を含むリンカーであって、細胞外結合ドメイン中のLの各存在は、同じ細胞外結合ドメインにおけるLの他の存在と同一であること、または相違することができ、
エピトープ1、エピトープ2およびエピトープ3はmAb特異的エピトープであって、同一であること、または相違することができる。
12a．
L₁がグリシンおよび/またはセリンを含むリンカーである、10a記載のポリペプチド。
13a．
L₁が、アミノ酸配列（Gly-Gly-Gly-Ser）_nまたは（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）_nを含むリンカーであって、nは1、2、3、4、または5であるか、L₁が、アミノ酸配列（Gly₄Ser）₄または（Gly₄Ser）₃を含むリンカーである、12a記載のポリペプチド。
14a．
Lがグリシンおよび/またはセリンを含むリンカーである、10a〜13aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
15a．
Lが、

から選択されるアミノ酸配列を有するリンカーである、14a記載のポリペプチド。
16a．
LがSGGGG、GGGGSまたはSGGGGSである、14a記載のポリペプチド。
17a．
エピトープ1、エピトープ2、エピトープ3およびエピトープ4が、イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ-CD3、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、QBEND-10、およびウステキヌマブによって特異的に認識されるmAb特異的エピトープから独立して選択される、10a〜16aのいずれか一つに記載のポリペプチド。

好ましい一態様において、エピトープ1、エピトープ2はリツキシマブによって特異的に認識され、エピトープ3はQBEND-10によって特異的に認識される。

18a．
エピトープ1、エピトープ2、エピトープ3およびエピトープ4が、SEQ ID NO：161〜170のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープから独立して選択される、10a〜16aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
19a．
エピトープ1がSEQ ID NO：161のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである、10a〜18aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
20a．
エピトープ2がSEQ ID NO：161のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである、請求つに10a〜19aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
21a．
エピトープ3が、SEQ ID NO：161またはSEQ ID NO：169のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである、請求項10a〜20aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
22a．
エピトープ4がSEQ ID NO：161のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである、請求項10a〜21aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
23a．
エピトープ1、エピトープ2およびエピトープ4がSEQ ID NO：161のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープであり、エピトープ3がSEQ ID NO：169のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである、請求項22a記載のポリペプチド。
24a．
mAb特異的エピトープが表7に列挙するものから選択される1つのポリペプチドに由来する、1a〜9aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
25a．
mAb特異的エピトープが、イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ-CD3、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、QBEND-10、およびウステキヌマブによって特異的に認識されるmAb特異的エピトープから選択される、1a〜9aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
26a．
mAb特異的エピトープが、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、またはSEQ ID NO：170のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープから選択される、1a〜9aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
27a．
mAb特異的エピトープがSEQ ID NO：160のアミノ酸配列を有する、1a〜9aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
28a．
該VH鎖およびVL鎖が、SEQ ID NO：11（CD123抗原VH）、SEQ ID NO：12（CD123抗原VL）との同一性が80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超である抗原標的配列を有する、1a〜27aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
29a．
該CD123抗原が細胞表面マーカー抗原である、1a〜27aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
30a．
該CD123抗原ががん関連表面抗原である、1a〜27aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
31a．
該抗原がCD123である、1a〜27aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
32a．
VHおよびVLが、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：24〜SEQ ID NO：30のVH、およびSEQ ID NO：12;SEQ ID NO：18〜SEQ ID NO：23のVLから選択される、1a〜27aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
33a．
ヒンジがCD8アルファヒンジまたはFcγRIIIアルファヒンジを含む、2a〜32aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
34a．
膜貫通ドメインが膜貫通領域CD8を含む、2a〜3a3のいずれか一つに記載のポリペプチド。
35a．
膜貫通ドメインがCD8アルファの膜貫通領域を含む、2a〜33aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
36a．
膜貫通ドメインが、CD8アルファの膜貫通領域およびCD8アルファからのヒンジを含む、2a〜33aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
37a．
細胞内ドメインがCD3ゼータシグナリングドメインを含む、2a〜37aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
38a．
細胞内ドメインが4-1BBドメインを含む、2a〜37aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
39a．
CARが単鎖CARである、1a〜38aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
40a．
CARが多鎖CARである、1a〜38aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
40aの2．
CARがSEQ ID NO：189〜SEQ ID NO：197から選択される配列を有する、1a〜39aのいずれか一つに記載のポリペプチド。
41a．
1a〜40aのいずれか一つに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
42a．
該CARがCD3ゼータシグナリングドメインおよび4-1BBからの共刺激ドメインを含む、1a〜40aのいずれか一つに記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
43a．
41aまたは42aの核酸を含む発現ベクター。
44a．
1a〜40aのいずれか一つに記載のポリペプチドを自らの細胞表面に発現する操作された免疫細胞。
45a．
炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）、制御性Tリンパ球またはヘルパーTリンパ球から、好ましくはCTL細胞から誘導される、44a記載の操作された免疫細胞。
46a．
医薬として使用するための、44aまたは45a記載の操作された免疫細胞。
47a．
（a）免疫細胞を用意する工程、
（b）1a〜40aのいずれか一つに記載のキメラ抗原受容体をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを該細胞に導入する工程、
（c）該ポリヌクレオチドを該細胞中に発現させる工程
を含む、44a〜46aのいずれか一つに記載の免疫細胞を工学的に作り出すための方法。
48a．
免疫細胞がT細胞である、47a記載の免疫細胞を操作するための方法。
49a．
請求項1a〜40aのいずれか一つに記載の少なくとも1つのmAb特異的エピトープを含むポリペプチドを自らの細胞表面に発現する操作された免疫細胞をインビトロ選別するための方法であって、
該操作された免疫細胞を含む免疫細胞の集団をmAb特異的エピトープに特異的なモノクローナル抗体と接触させる工程、
モノクローナル抗体に結合する細胞を選択することで、操作された免疫細胞が濃縮された細胞の集団を得る工程
を含む方法。
50a．
mAb特異的エピトープに特異的なモノクローナル抗体が発蛍光団にコンジュゲートされ、モノクローナル抗体に結合する細胞を選択する工程が蛍光活性化細胞選別法（FACS）によって行われる、49a記載の方法。
51a．
mAb特異的エピトープに特異的なモノクローナル抗体が磁気粒子にコンジュゲートされ、モノクローナル抗体に結合する細胞を選択する工程が磁気活性化細胞選別法（MACS）によって行われる、49a記載の方法。
52a．
ポリペプチドがSEQ ID NO：160のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープを含み、モノクローナル抗体がリツキシマブである、49〜51のいずれか一つに記載の方法。
53a．
ポリペプチドがSEQ ID NO：169のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープを含み、免疫細胞の集団と接触させるために使用される抗体がQBEND-10である、49a〜51aのいずれか一つに記載の方法。
54a．
操作された免疫細胞が濃縮されている細胞の集団が、CAR発現免疫細胞を少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％含む、49a〜53aのいずれか一つに記載の方法。
55a．
1a〜40aのいずれか一つに記載の少なくとも1つのmAb特異的エピトープを含むポリペプチドを自らの細胞表面に発現する操作された免疫細胞を患者においてインビボ枯渇させるための方法であって、該操作された免疫細胞を少なくとも1つのエピトープ特異的mAbと接触させる工程を含む方法。
56a．
mAb特異的エピトープがCD20エピトープまたはミモトープであり、エピトープ特異的mAbがリツキシマブである、56a記載の方法。
57a．
mAb特異的エピトープがSEQ ID NO：160のアミノ酸配列を有する、57a記載の方法。
58a．
エピトープ特異的mAbが、補体系を活性化することのできる分子とコンジュゲートされる、56a〜58aのいずれか一つに記載の方法。
59a．
細胞傷害性薬物がエピトープ特異的mAbにカップリングされる、56a〜58aのいずれか一つに記載の方法。
60a．
1a〜40aのいずれか一つに記載の少なくとも1つのmAb特異的エピトープを含むポリペプチドを自らの細胞表面に発現する操作された免疫細胞を患者においてインビボ枯渇させるための方法であって、該操作された免疫細胞を、該細胞上に保持されたmAb特異的エピトープとエフェクター（および細胞傷害性）細胞上に保持された表面抗原との両方に結合することができる二重特異性mAb（BsAb）と接触させる工程を含む方法。
61a．
該免疫細胞がT細胞である、47a〜60aのいずれか一つに記載の方法。

具体的には、本発明は、
1b）
ヒト化されていてもよいSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29およびSEQ ID NO：30から選択されるVH、少なくとも1つのリンカー、好ましくは配列（GGGGS）nのリンカーであって、n＝1〜4、より好ましくはn＝3、ならびにヒト化されていてもよいSEQ ID NO：11、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：23から選択されるVL、ヒンジを順に含む、細胞外リガンド結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
CD8アルファからの膜貫通ドメイン、ならびに
CD3ゼータシグナリングドメインおよび 4-1BBからの共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
を含むCD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）
も提供する。

SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29およびSEQ ID NO：30から選択されるVH、SEQ ID NO：10のリンカー、ならびにSEQ ID NO：11、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：23から選択されるVL、ヒンジを順に含む、細胞外リガンド結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
CD8アルファからの膜貫通ドメイン、ならびに
CD3ゼータシグナリングドメインおよび 4-1BBからの共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
を含む、CD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）。

2b）
本発明は、ヒトCD28 NP_006130.1との同一性を有する配列を含まない、1b記載のCD123 CARを提供する。
3b）
本発明は、該細胞外ドメインが、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される配列の、モノクローナル抗体に特異的な少なくとも1つのエピトープ、またはそれらの組み合わせ、好ましくはSEQ ID NO：161の、モノクローナル抗体に特異的な少なくとも1つのエピトープを含む、1bまたは2b記載のCD123 CARを提供する。

本発明は、SEQ ID NO：189〜SEQ ID NO：197から選択される配列を含むCD123 CARを提供する。

本発明は、SEQ ID NO：190の配列を含むCD123 CARを提供する。

本発明は、SEQ ID NO：191の配列を含むCD123 CARを提供する。

本発明は、SEQ ID NO：192の配列を含むCD123 CARを提供する。

本発明は、SEQ ID NO：193の配列を含むCD123 CARを提供する。

本発明は、SEQ ID NO：194の配列を含むCD123 CARを提供する。

本発明は、SEQ ID NO：195の配列を含むCD123 CARを提供する。

本発明は、SEQ ID NO：196の配列を含むCD123 CARを提供する。

本発明は、SEQ ID NO：197の配列を含むCD123 CARを提供する。

本発明は、該細胞外ドメインが、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168およびSEQ ID NO：169、およびSEQ ID NO：170から選択される配列の、モノクローナル抗体に特異的な少なくとも1つのエピトープを含むscfvを含む、1bまたは2b記載のCD123 CARを提供する。

好ましくは、本発明は、該細胞外ドメインが、SEQ ID NO：161を認識するモノクローナル抗体に特異的な2つのエピトープとSEQ ID NO：169を認識するモノクローナル抗体に特異的なさらに2つのエピトープとを含むscfvを含む、1bまたは2b記載のCD123 CARを提供する。

4b）
本発明は、SEQ ID NO：171の配列を含む、3bのCD123 CARを提供する。
5b）
本発明は、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33およびSEQ ID NO：34〜SEQ ID NO：160から選択される配列を有する、1b記載のCD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）を提供する。
6b）
本発明は、SEQ ID NO：34〜SEQ ID NO：160から選択される配列を有する、1b〜5bのいずれか一つに記載のCD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）を提供する。
7b）
本発明は、1b〜6bのいずれか一つに記載のCD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）をコードするポリヌクレオチドを提供する。
8b）
本発明は、7記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
9b）
本発明は、バックボーンと、1b〜6bのいずれか一つに定義したCD123 CARのうちのいずれか1つをコードする配列とを含む発現ベクターを提供する。
10b）
本発明は、バックボーン、好ましくはEF1プロモーターを含むバックボーン、RQR8オープンリーディングフレーム（RQR8 ORF）、上記1〜8態様のCD123 CARのうちのいずれか1つをコードする配列を含む発現ベクターを提供する。
11b）
本発明は、1b〜9bのいずれか一つに記載のCD123 CARを細胞表面膜に発現する、操作されたT細胞受容体（TCR）ノックアウト（KO）であるまたはTCRおよびヒトデオキシシチジンキナーゼ（dCK）KOである免疫細胞を提供する。
12b）
本発明は、1b〜6bのいずれか一つに記載のCD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）をコードするポリヌクレオチドを含む、TCR KOであるまたはTCRおよびdCK KOである操作された免疫細胞を提供する。

本発明のCD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、TCR KOであるまたはTCRおよびdCK KOである操作された免疫細胞。

バックボーンと、本発明のCD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）をコードするポリヌクレオチドを含む配列とを含む発現ベクターを含む、TCR KOであるまたはTCRおよびdCK KOである操作された免疫細胞。

バックボーン、EF1プロモーター、RQR8オープンリーディングフレーム（RQR8 ORF）、本発明のCD123 CARのうちのいずれか1つをコードする配列を含む発現ベクターを含む、TCR KOであるまたはTCRおよびdCK KOである操作された免疫細胞。

13b）
本発明は、さらに自殺ドメインを細胞表面に発現する、11bまたは12bに記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞を提供する。
14b）
本発明は、細胞表面の該自殺ドメインがCD123 CAR細胞外ドメインに挿入されている、10b〜13bのいずれか一つに記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫T細胞を提供する。

dCK遺伝子が欠失して、プリンヌクレオチド類似体（PNA）に対する耐性を付与している、11b〜14bのいずれか一つに記載のTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞。

15b）
本発明は、少なくとも1つのMHCタンパク質の発現が抑制されている、11b〜14bのいずれか一つに記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞を提供する。
16b）
本発明は、治療において使用するための、（11b）〜（15b）のいずれか一つに記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞を提供する。

本発明は、1b）〜6b）に記載するようなCD123 CARを含む薬学的組成物を提供する。

本発明は、11b〜15bのいずれか一つに記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞を含む薬学的組成物を提供する。

17b）
本発明は、状態が急性骨髄性白血病（AML）、好ましくは難治性/再発性AML、BPDNLであるか、または骨髄移植中に使用するための、16bに記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞を提供する。
18b）
本発明は、処置として使用するための、好ましくはリンパ増殖性障害の処置、より好ましくは白血病またはリンパ腫の処置として使用するための、または急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群、およびBPDNLからなる群より選択される処置のための、16bに記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞を提供する。

本発明は、治療において使用するための上記薬学的組成物を提供する。

本発明は、急性骨髄性白血病（AML）、好ましくは難治性/再発性AML、BPDNLを処置するための治療において使用するための、または骨髄移植中に使用するための、上記薬学的組成物を提供する。

本発明は、処置として使用するための、好ましくはリンパ増殖性障害の処置、より好ましくは白血病またはリンパ腫の処置として使用するための、または急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群、およびBPDNLからなる群より選択される処置のための、薬学的組成物を提供する。

本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語は、全て、遺伝子治療、薬理学、免疫学、生化学、遺伝学、および分子生物学の領域の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。

適当な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である全ての方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得る。本明細書において言及された刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照は、全て、参照によってその全体が組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、他に特記されない限り、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。

本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を利用するであろう。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.,1984)；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York)、特に、第154巻および第155巻(Wu et al.eds.)および第185巻、「Gene Expression Technology」(D.Goeddel,ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；ならびにManipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)を参照されたい。

本発明は、モノクローナル抗CD123抗体KLON43からのVHおよびVLまたはそのヒト化VH配列およびヒト化VL配列を含む細胞外リガンド結合ドメイン、CD8アルファからのヒンジまたはFcγRIIIαからのヒンジ、CD8アルファからの膜貫通ドメイン、CD3ゼータシグナリングドメインおよび4-1BBからの共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むCD123特異的キメラ抗原受容体（「CD123 CAR」または「CAR」）を発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、該123 CARが、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、もしくはSEQ ID NO：33のいずれか1つ、またはSEQ ID NO：34〜SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：160のうちのいずれか1つ、または好ましくはSEQ ID NO：188〜SEQ ID NO：197のうちのいずれか1つとの配列同一性を有するものを開示する。

好ましくは、本発明は、SEQ ID NO：31、32または160のCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）、より好ましくはSEQ ID NO：31のCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KO）、さらに好ましくはSEQ ID NO：32のCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよびdck KO）を開示する。

有益なことに、本発明は、SEQ ID NO：31、32または160のCD123特異的CARおよび自殺ドメインを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）、より好ましくはSEQ ID NO：31のCD123特異的CARおよび自殺ドメインを発現する操作された免疫細胞（TCR KO）、さらに好ましくはSEQ ID NO：32のCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよびdck KO）、より一層好ましくはSEQ ID NO：160または以下の配列SEQ ID NO：188〜SEQ ID NO：197のうちの1つのCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよびdck KO）を開示する。

本発明は、図2に図解するV1、V3から選択されるポリペプチド構造のうちの1つを有するCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、該構造が、モノクローナル抗CD123抗体KLON43からのVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、CD8アルファまたはFcγRIIIαからのヒンジ、CD8アルファからの膜貫通ドメイン、CD3ゼータシグナリングドメインおよび4-1BBからの共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含み、CD28からの配列を含まず、該123 CARは、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32のどちらか、好ましくはSEQ ID NO：32に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

本発明は、図2に図解するV1、V3から選択されるポリペプチド構造のうちの1つを有するCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、該構造が、モノクローナル抗CD123抗体KLON43からのVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、CD8アルファまたはFcγRIIIαからのヒンジ、CD8アルファからの膜貫通ドメイン、CD3ゼータシグナリングドメインおよび4-1BBからの共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含み、CD28からの配列を含まず、該123 CARは、SEQ ID NO：34〜SEQ ID NO：159、好ましくはSEQ ID NO：34〜SEQ ID NO：117、好ましくはSEQ ID NO：76〜SEQ ID NO：117のいずれかに対して少なくとも80％の配列同一性を有する、操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

一態様において、本発明は、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：78; SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：8）、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91. SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97から選択される配列を有するCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

好ましくは、本発明は、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：78; SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96 SEQ ID NO：97から選択される配列を有するCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

より好ましくは、本発明は、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97から選択される配列を有するCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

そしてさらに好ましくは、本発明は、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97から選択される配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

本発明の最も好ましい態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：172の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：173の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：174の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：175の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：176の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：177の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：178の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：179の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：180の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：181の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：182の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：183の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：184の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：185の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：186の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様は、SEQ ID NO：161〜SEQ ID NO：170から選択される、特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープ、好ましくは2つのSEQ ID NO：161および1つのSEQ ID NO：169を含む、SEQ ID NO：187の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様において、本発明は、SEQ ID NO：188の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様において、本発明は、SEQ ID NO：189の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様において、本発明は、SEQ ID NO：190の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様において、本発明は、SEQ ID NO：191の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様において、本発明は、SEQ ID NO：192の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様において、本発明は、SEQ ID NO：193の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様において、本発明は、SEQ ID NO：194の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様において、本発明は、SEQ ID NO：195の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様において、本発明は、SEQ ID NO：196の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

最も好ましい別の一態様において、本発明は、SEQ ID NO：197の配列を有するCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

本発明は、細胞選別と細胞枯渇の両方が可能になるように細胞外結合ドメインが修飾されたCD123特異的123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。「mAbによる選別/枯渇系」または「モノクローナル抗体に特異的なエピトープ」または「ミモトープ」と呼ばれるこの構造は、本発明の抗CD123 CARの細胞外ドメイン内に挿入された、特に抗CD123 scFv中に挿入されるか、TMとヒンジの間に挿入された、選ばれたエピトープであり、このエピトープは特異的抗体（好ましくはmAb）によって認識される特異性を有する。主にCARの外部リガンド結合ドメインがエピトープを含むように修飾されるという事実を考慮すると、異なるCARアーキテクチャ、すなわち単鎖または多鎖を想定することができる。VHポリペプチドおよびVLポリペプチドならびに特異的エピトープで形成される本発明のキメラscFvは、エピトープの挿入位置およびリンカーの使用に依存して、それ自体が異なる構造を有しうる。本発明は、上記の結果得られる、修飾されたCARを賦与された、操作された免疫細胞を選別しかつ/または枯渇させるための方法にも関係する。

一部の態様において、抗CD123 CARの細胞外結合ドメインは、以下の配列（ミモトープを含む）を含む（N末を左側に置く）:
V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ1-（L）_x;
V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ1-（L）_x-エピトープ2-（L）_x;
V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ1-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-エピトープ3-（L）_x;

（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₁-L₁-V₂;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-V₁-L₁-V₂;
エピトープ1-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-エピトープ3-（L）_x-V₁-L₁-V₂;

（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ2-（L）_x;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-エピトープ3-（L）_x;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-エピトープ3-（L）_x-エピトープ4-（L）_x;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ3-（L）_x;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-V₁-L₁-V₂-（L）_x-エピトープ3-（L）_x-エピトープ4-（L）_x;

V₁-（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₂;
V₁-（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₂-（L）_x-エピトープ2-（L）_x;
V₁-（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₂-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-エピトープ3-（L）_x;
V₁-（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₂-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-エピトープ3-（L）_x-エピトープ4-（L）_x;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₁-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-V₂;
（L）_x-エピトープ1-（L）_x-V₁-（L）_x-エピトープ2-（L）_x-V₂-（L）_x-エピトープ3-（L）_x;

V₁-L₁-V₂-L-エピトープ1;
V₁-L₁-V₂-L-エピトープ1-L;
V₁-L₁-V₂-L-エピトープ1-L-エピトープ2;
V₁-L₁-V₂-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L;
V₁-L₁-V₂-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3;
V₁-L₁-V₂-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L;
V₁-L₁-V₂-エピトープ1;
V₁-L₁-V₂-エピトープ1-L;
V₁-L₁-V₂-エピトープ1-L-エピトープ2;
V₁-L₁-V₂-エピトープ1-L-エピトープ2-L;
V₁-L₁-V₂-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3;
V₁-L₁-V₂-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L;

エピトープ1-V₁-L₁-V₂;
エピトープ1-L-V₁-L₁-V₂;
L-エピトープ1-V₁-L₁-V₂;
L-エピトープ1-L-V₁-L₁-V₂;
エピトープ1-L-エピトープ2-V₁-L₁-V₂;
エピトープ1-L-エピトープ2-L-V₁-L₁-V₂;
L-エピトープ1-L-エピトープ2-V₁-L₁-V₂;
L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-V₁-L₁-V₂;
エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-V₁-L₁-V₂;
エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L-V₁-L₁-V₂;
L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-V₁-L₁-V₂;
L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L-V₁-L₁-V₂;

V₁-L-エピトープ1-L-V₂;
L-エピトープ1-L-V₁-L-エピトープ2-L-V₂;
V₁-L-エピトープ1-L-V₂-L-エピトープ2-L;
V₁-L-エピトープ1-L-V₂-L-エピトープ2-L-エピトープ3;
V₁-L-エピトープ1-L-V₂-L-エピトープ2-エピトープ3;
V₁-L-エピトープ1-L-V₂-L-エピトープ2-L-エピトープ3-エピトープ4;
L-エピトープ1-L-V₁-L-エピトープ2-L-V₂-L-エピトープ3-L;
エピトープ1-L-V₁-L-エピトープ2-L-V₂-L-エピトープ3-L;
L-エピトープ1-L-V₁-L-エピトープ2-L-V₂-L-エピトープ3;

L-エピトープ1-L-V₁-L₁-V₂-L-エピトープ2-L;
L-エピトープ1-L-V₁-L₁-V₂-L-エピトープ2-L-エピトープ3;
L-エピトープ1-L-V₁-L₁-V₂-L-エピトープ2-エピトープ3;または
エピトープ1-L-V₁-L₁-V₂-L-エピトープ2-L-エピトープ3-エピトープ4
ここで、
V₁およびV₂はScFv抗CD123のV_HおよびV_Lであり（すなわち、V₁はV_LでありかつV₂はV_Hであるか、またはV₁はV_HでありかつV₂はV_Lであり）、
L₁は、ScFv中でVH鎖をVL鎖に連結するのに適した任意のリンカーであり、
Lは、リンカー、好ましくはグリシン残基およびセリン残基を含むリンカーであり、細胞外結合ドメインにおけるLの各存在は、同じ細胞外結合ドメインにおけるLの他の存在と同一であること、または相違することができ、
xは0または1であり、xの各存在は他のものに依存せず、
エピトープ1、エピトープ2およびエピトープ3はmAb特異的エピトープ（またはミモトープ）であって、同一であること、または相違することができる。

一部の態様において、細胞外結合ドメインは以下の配列を含む（N末を左側に置く）:
V_H-L₁-V_L-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L;
L-エピトープ1-L-V_H-L-エピトープ2-L-V_L-L-エピトープ3-L;
V_L-L¹-V_H-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L;または
L-エピトープ1-L-V_L-L-エピトープ2-L-V_H-L-エピトープ3-L;
ここで、L、L1、エピトープ1、エピトープ2およびエピトープ3は上に定義したとおりである。

L₁は、グリシンおよび/またはセリンを含むリンカーである。一部の態様において、L₁は、アミノ酸配列（Gly-Gly-Gly-Ser）_nまたは（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）_nを含むリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4、または5である。一部の態様において、L₁は（Gly₄Ser）₄または（Gly₄Ser）₃である。

Lはフレキシブルリンカー、好ましくはグリシンおよび/またはセリンを含むものである。一部の態様において、Lは、

から選択されるアミノ酸配列を有する。一部の態様において、細胞外結合ドメインが数個のLの存在を含む場合に、それらのLはすべて同一である。一部の態様において、細胞外結合ドメインが数個のLの存在を含む場合に、それらのLはすべてが同一であるわけではない。一部の態様において、LはSGGGGSである。一部の態様において、細胞外結合ドメインは数個のLの存在を含み、それらのLはすべてSGGGGSである。

一部の態様において、エピトープ1、エピトープ2、およびエピトープ3は同一であるか、または相違し、表7に示すようなアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープから選択される。

好ましい一態様において、エピトープ1、エピトープ2は同一であるか、または相違し、イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ-CD3、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、QBEND-10、アレムツズマブ、またはウステキヌマブ、好ましくは特に医学的使用が既に承認されているもの、例えば非限定的な例としてリツキシマブによって特異的に認識されるmAb特異的エピトープから選択される。

最後に、本発明は、CARを賦与された操作された免疫細胞の数、活性化および/または生存が、CD123 CAR中の、モノクローナル抗体に特異的な少なくとも1つのエピトープに細胞表面において直接結合する抗体を使って、制御される治療方法を包含する。

本発明は、本明細書において開示するCD123特異的CARのうちのいずれか1つ、好ましくは以下の配列SEQ ID NO：188〜SEQ ID NO：197のうちの1つを個別に発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する態様を包含する。

本発明は、上に開示したCD123特異的CARのうちのいずれか（それぞれ）1つをコードし、よってそのCD123特異的CARを個別に発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）の調製を可能にするベクターを開示する態様を包含する。特に本発明は、上に開示するCD123特異的CARのうちの（それぞれ）1つをコードし、好ましくはバックボーンを含むベクターを開示する態様を包含する。

本発明は、上に開示したCD123特異的CARのうちのいずれか（それぞれ）1つ、好ましくは以下の配列SEQ ID NO：188〜SEQ ID NO：197のうちの1つをコードし、よってそのCD123特異的CARを個別に発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）の調製を可能にするベクターを開示する態様を包含する。

本発明は、上に開示したCD123特異的CARのうちのいずれか（それぞれ）1つを個別に発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）と、薬学的に許容される媒体とを含む薬学的組成物を開示する態様を包含する。

本発明は、医薬として使用するための、上に開示したCD123特異的CARのうちのいずれか（それぞれ）1つを個別に発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）と、薬学的に許容される媒体とを含む薬学的組成物を開示する態様を包含する。

本発明は、医薬として使用するための、104〜1010個/kgの、上に開示したCD123特異的CARのうちのいずれか（それぞれ）1つを個別に発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）と、薬学的に許容される媒体とを含む薬学的組成物を開示する態様を包含する。

本発明は、図2に図解するポリペプチド構造V3を有する上述の特異的CD123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、該CD123 CARがSEQ ID NO：31に対して少なくとも80％の配列同一性を有するものを開示する。

本発明は、図2に図解するポリペプチド構造V3を有する上述の特異的CD123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、該CD123 CARがSEQ ID NO：32に対して少なくとも80％の配列同一性を有するものを開示する。

本発明は、図2に図解するポリペプチド構造V3を有する上述の特異的CD123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、該CD123 CARがSEQ ID NO：33に対して少なくとも80％の配列同一性を有するものを開示する。

本発明は、図2に図解するポリペプチド構造V3を有する上述の特異的CD123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、該CD123 CARがSEQ ID NO：160に対して少なくとも80％の配列同一性を有するものを開示する。

本発明は、以下の配列SEQ ID NO：188〜SEQ ID NO：197のうちの1つを有する特異的CD123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）を開示する。

本発明は、上述のCD123 CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、モノクローナル抗CD123抗体からの細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLがそれぞれ、以下の配列のうちの少なくとも1つ:

と、以下の配列のうちの1つ:

とを含むものを開示する。

本発明は、上述のCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、モノクローナル抗CD123抗体からの細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLがそれぞれ、以下の配列のうちの少なくとも1つ:

またはそれらの組み合わせを含むものを開示する。

有益なことに、本発明は、上述のCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、モノクローナル抗CD123抗体からの細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLがそれぞれ、以下の配列のうちの少なくとも1つ:

と、以下の配列のうちの少なくとも1つ:

とを含むものを開示する。

より好ましい一態様において、本発明は、それぞれ（SEQ ID NO：172〜SEQ ID NO：187）からの配列を有するCARを提供する。

別の一態様において、本発明は、以下のCARを賦与された操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、上述のCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、該構造V3（図2参照）がCD8アルファヒンジおよびCD8アルファ膜貫通ドメインを含み、好ましくはCD28配列を含まないものを開示する。

本発明は、上述のCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、該構造V3が、CD8アルファヒンジ、4-1BB細胞質ドメインおよびCD8アルファ膜貫通ドメインを含むものを開示する。

本発明は、上述のCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、該構造V3が、CD8アルファヒンジおよび4-1BB膜貫通ドメインを含み、CD28からの配列を含まないものを開示する。

本発明は、上記CD123特異的CARを発現し、しかもCD123に特異的ではない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、操作された免疫細胞を開示する。好ましい一態様において、CD123に特異的ではない別の細胞外リガンド結合ドメインは自殺ドメインであり、より好ましくは特許出願PA 2015 70044表2）に開示されているいずれか1つの自殺ドメインである。

本発明は、上述のCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）であって、該CD123特異的CARが、GおよびSを含むリンカーLiによって結合された、少なくとも1つのSEQ ID NO:161、好ましくは少なくとも2つのSEQ ID NO:161を含む自殺ドメインを含むものを開示する。

一態様において、該自殺ドメインは、本発明のCD123 CARのヒンジドメインに組み込まれる。より好ましい一態様において、本発明は、SEQ ID NO:160のCD123 CAR、またはSEQ ID NO:160に対して少なくとも95％の同一性を有するCD123 CARを提供する。

参照により本明細書に組み入れられる特許出願PA201570044の表2に記載されているような他の自殺ドメインも本発明に適している。

本発明は、上記の操作された免疫細胞であって、少なくとも1つのMHCタンパク質、好ましくはβ2m、またはHLAの発現が、該操作された免疫細胞内で抑制されているものを開示する。β2mはベータ2ミクログロブリンを意味し、HLAはヒト白血球抗原を意味する。MHCタンパク質はクラスIまたはクラスIIのMHCタンパク質である。

本発明は、少なくとも1つの免疫抑制薬、化学療法薬、または抗がん薬、好ましくはプリン類似体に対する耐性を付与するために操作された、上記の操作された免疫細胞を開示する。

本発明は、薬学的に許容される媒体と、上述のCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）のうちのいずれか1つとを含む組成物を開示する。

本発明は、薬学的に許容される媒体と、上述のCD123特異的CARを発現する操作された免疫細胞（TCR KOおよび/またはdck KO）のうちのいずれか1つと、別の薬物、好ましくはプリン類似体、より好ましくはFLAG処置とを含む組成物を開示する。

本発明でのプリン類似体の例としては、ペントスタチン、フルダラビン2-デオキシアデノシン、クラドリビン、クロファラビン、ネララビン、好ましくはペントスタチン、フルダラビン一リン酸、および2-クロロデオキシアデノシン（2-CDA）が挙げられる。

本発明のCD123 T細胞と関連しうるFLAG処置の例は、以下のとおりである:追加薬のない標準的FLAG、FLAG-IDA、Mito-FLAG、FLAMSA。

本発明でのFLAG処置の例として、以下が挙げられる。

以下の併用処置が本明細書において開示される。

本発明は、治療において使用するための、上述のいずれか1つの操作された免疫細胞、上に開示した操作された免疫細胞を含む組成物を開示する。

本発明は、患者がヒトである、上記の治療において使用するための、本発明の操作された免疫細胞、上に開示した操作された免疫細胞を含む組成物を開示する。

本発明は、状態が、CD123発現細胞を特徴とする前悪性または悪性がん状態である、上記の治療において使用するための、上に開示した操作された免疫細胞、操作された免疫細胞を含む組成物を開示する。

本発明は、状態が、CD123発現細胞の過剰を特徴とする状態である、上記の治療において使用するための、上に開示した操作された免疫細胞、操作された免疫細胞を含む組成物を開示する。

本発明は、悪性がん状態が血液がん状態である、上記の治療において使用するための、上に開示した操作された免疫細胞、操作された免疫細胞を含む組成物を開示する。

本発明は、血液がん状態が白血病または悪性リンパ増殖性障害である、上記の治療において使用するための、上に開示した操作された免疫細胞、操作された免疫細胞を含む組成物を開示する。

本発明は、白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される、上記の治療において使用するための、上に開示した操作された免疫細胞、操作された免疫細胞を含む組成物を開示する。

本発明は、白血病が急性骨髄性白血病（AML）、好ましくは難治性/再発性AMLである、上記の治療において使用するための、上に開示した操作された免疫細胞、操作された免疫細胞を含む組成物を開示する。

一態様において、本発明は、該血液がんが悪性リンパ増殖性障害である、上記の治療において使用するための、上に開示した操作された免疫細胞、操作された免疫細胞を含む組成物を開示する。

本発明は、悪性リンパ増殖性障害がリンパ腫である、上記の治療において使用するための、操作された免疫細胞を開示する。

本発明は、リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）からなる群より選択される、上記の治療において使用するための、操作された免疫細胞を開示する。

AML、好ましくは難治性再発性AMLの処置において使用するための、追加薬のないFLAG処置と併用される、10⁴〜10⁸細胞/kgの本発明のTCR KOおよびdck KO T細胞中で発現するSEQ ID NO：31またはSEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160のCD123 CAR。

BPDCNの処置において使用するための、追加薬のないFLAG処置と併用される、10⁴〜10⁸細胞/kgの本発明のTCR KOおよびdck KO T細胞中で発現するSEQ ID NO：31またはSEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160のCD123 CAR。

移植のブリッジとして骨髄移植前の処置として使用するための、追加薬のないFLAG処置と併用される、10⁴〜10⁸細胞/kgの本発明のTCR KOおよびdck KO T細胞中で発現するSEQ ID NO：31またはSEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160のCD123 CAR。

AML、好ましくは難治性再発性AMLの処置において使用するための、フルダラビン（20mg/kg〜50mg/kg）と併用される、本発明のTCR KOおよびdck KO T細胞（104〜108細胞/kg）中で発現するSEQ ID NO：31またはSEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160のCD123 CAR。

BPDCNの処置において使用するための、フルダラビン（20mg/kg〜50mg/kg）と併用される、本発明のTCR KOおよびdck KO T細胞（10⁴〜10⁸細胞/kg）中で発現するSEQ ID NO：31またはSEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160のCD123 CAR。

移植のブリッジとして骨髄移植前の処置として使用するための、フルダラビン（20mg/kg〜50mg/kg）と併用される、本発明のTCR KOおよびdck KO T細胞（104〜108細胞/kg）中で発現するSEQ ID NO：31またはSEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160のCD123 CAR。

本発明は、血液がん細胞を損傷させる方法であって、該血液がん細胞を、該がん細胞の損傷を引き起こすのに有効な量（10⁴〜10⁸細胞/kg）の本発明の操作された細胞と接触させる工程を含む方法を開示する。

本発明は、
1.ドナーからの免疫細胞を用意する工程、
2.TCR遺伝子をノックアウトする工程、
3.該細胞の表面に上記のうちのいずれか1つの本発明のCD123特異的キメラ抗原受容体を発現させる工程
を含む、免疫細胞を操作する方法を開示する。

ドナーは、がんを患っている患者自身（自家養子移入の場合）であってもよいし、別の個体（同種異系T細胞の養子移入の場合）であってもよい。本発明は、
1.ドナーからの免疫細胞を用意する工程、
2.TCR遺伝子およびdck遺伝子をノックアウトする工程、
3.上記のうちのいずれか1つによるCD123特異的キメラ抗原受容体を、該CD123特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを該細胞中に導入することによって、該細胞の表面に発現させる工程
を含む、上記の、免疫細胞を操作する方法を開示する。

より好ましい一態様において、該方法は、細胞表面に自殺ドメインを発現させる工程を含む。

本発明は、
1.免疫細胞を用意する工程、
2.SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:17のハーフTALEヌクレアーゼTALENを使ってTCR遺伝子をノックアウトし、dck遺伝子もノックアウトする工程、
3.上記のCD123特異的キメラ抗原受容体のうちのいずれか1つを、該CD123特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを該細胞に導入することによって、該細胞の表面に発現させる工程
を含む、上記の、免疫細胞を操作する方法を開示する。

好ましい一態様において、該方法は、自殺ドメイン、好ましくは以下の抗体のうちの1つによって認識される自殺ドメインを細胞表面に発現させる工程を含む:イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ-CD3、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、QBEND-10、およびウステキヌマブ。

別の一態様において、該方法は、本発明の操作された免疫細胞を、特異的モノクローナル抗原、例えばイブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ-CD3、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、QBEND-10、およびウステキヌマブから選択される本明細書において開示するものなどに結合させる工程をさらに含む。

本発明は、処置を必要とする対象を処置する方法であって、
1.上記のうちのいずれか1つによるCD123特異的キメラ抗原受容体を表面に発現する免疫細胞、またはそれを含む組成物を用意する工程、
2.該患者に該免疫細胞を投与する工程
を含む方法を開示する。好ましい一態様では、該組成物がプリン類似体フルダラビンをさらに含む。

別の一態様において、該組成物は、FLAG処置、追加薬のないFLAG処置と関連づけられる。

一態様において、処置を必要とする対象は、AML、好ましくは難治性再発性AML、BPDNLを患っているか、または骨髄移植を受けなければならない。

本発明は、免疫細胞がドナーから提供される、上記の、処置を必要とする対象を処置する方法を開示する。

本発明は、免疫細胞が患者自身から提供される、上記の、処置を必要とする対象を処置する方法を開示する。

CD123特異的キメラ抗原受容体
本発明は、KLON43抗体からのまたはKLON43抗体から誘導される細胞外リガンド結合ドメイン、CD8アルファからの膜貫通ドメイン、CD8アルファからのまたはFcγRIIIαからのヒンジ、自殺ドメイン、およびシグナリング伝達ドメインを含む、新しい抗CD123キメラ抗原受容体（CAR）に関する。好ましい一態様において、該自殺ドメインはヒンジドメイン中に組み込まれている。より好ましい一態様において、該自殺ドメインは、ヒンジドメインに組み込まれた少なくとも2つのSEQ ID NO：161の配列を含む。

好ましい一態様において、本発明の抗CD123 CARは、SEQ ID NO：31、32、または160のポリペプチドである。

別の一態様において、本発明の抗CD123 CARは、SEQ ID NO：34〜SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：34〜SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：76〜SEQ ID NO：117のポリペプチドである。

本明細書において使用する「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、CD123に結合する能力を有するオリゴペプチドまたはポリペプチドと定義される。好ましくは、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するCD123を認識するように選ぶことができる。より好ましくは、細胞外リガンド結合ドメインは、AML、BPDCNに関連する標的細胞上で、またはがん状態に関与するCD123発現細胞上で、細胞表面マーカーとして作用するCD123を認識するように選ぶことができる。

好ましい一態様において、該細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって接合された標的抗原特異的モノクローナル抗CD123抗体KLON43の軽鎖可変（V_L）断片および重鎖可変（V_H）断片を含む単鎖抗体断片（scFv）を含む。該V_LおよびV_Hは、好ましくは表1〜2に開示する配列から選択され、より好ましくは、Klon43からのまたはKlon43から誘導されるVH、リンカーおよびVL（表2に記載のヒト化VHおよびVL）を含むscfvから選択される。それらは、好ましくは、配列SEQ ID NO：10を含む配列（GGGGS）nのフレキシブルリンカーによって一つに連結され、ここで、n＝1〜4、より好ましくはn＝3である。換言すると、該CARは、優先的に、VHについてはSEQ ID NO:12、VLについてはSEQ ID NO:11、そしてヒト化断片についてはSEQ ID NO:18〜SEQ ID NO:30からなる群より選択されるアミノ酸配列と100％同一なポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む（表2参照）。

「組換え抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、例えば、バクテリオファージ、酵母発現系、または哺乳動物細胞発現系によって発現された抗体または抗体断片のような、組換えDNAテクノロジーを使用して生成された抗体または抗体断片を意味する。その用語は、抗体もしくは抗体断片をコードしかつ抗体もしくは抗体断片のタンパク質を発現するDNA分子の合成によって生成された抗体もしくは抗体断片、または抗体もしくは抗体断片を特定するアミノ酸配列も意味するものと解釈されるべきであり、DNAおよびアミノ酸は、当技術分野において入手可能であり周知であるDNAまたはアミノ酸配列の組換えまたは合成のテクノロジーを使用して入手されたものである。

本明細書において使用されるように、「保存的配列修飾」または「ヒト化」または「ヒト化抗体」または「ヒト化抗体断片」、「ヒト化VHまたはヒト化VL」という用語は、CARの結合特徴に有意に影響を与えず変更もしない、かつ／または修飾されたアミノ酸配列を含有しているCARの活性に有意に影響を与えず、ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答を低下させるかまたは消失させるアミノ酸修飾をさすものとする。

好ましい態様において、アミノ酸修飾は、CARの結合特徴を有意に改善する、かつ／または修飾されたアミノ酸配列を含有しているCARの活性を有意に改善し、ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答を低下させるかまたは消失させる。

そのような保存的修飾には、CAR内の抗体断片および／またはCAR分子の他の部分におけるアミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれる。修飾は、部位特異的変異誘発、PCRによって媒介される変異誘発のような当技術分野において公知の標準的な技術によって、または最適化された生殖系列配列を利用することによって、抗体、抗体断片、または本発明のCAR分子の他の部分のいずれかへ導入され得る。

保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と交換されるものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。従って、本発明のCAR内の1個以上のアミノ酸残基を、同一側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と交換することができ、改変されたCARを、本明細書に記載された機能アッセイを使用して、CD123に結合する能力について試験することができる。

一つの態様において、scfvは、モノクローナル抗体に結合する少なくとも1つ、好ましくは2つのエピトープを含む。そのようなエピトープの例は、表7に開示する。

本発明によるCARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すると、シグナル伝達ドメインは、CARが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1種の活性化を担う。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。従って、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、専門の機能を果たすよう細胞に指図するタンパク質の部分をさす。

CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協調的に作用するT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の誘導体またはバリアントおよび合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインには、細胞質シグナリング配列の2種の別個のクラス（抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの）が含まれる。一次細胞質シグナリング配列には、免疫受容活性化チロシンモチーフであるITAMとして公知であるシグナリングモチーフが含まれ得る。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内テールに見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるITAMの例には、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれ得る。好ましい態様において、CARのシグナリング伝達ドメインには、SEQ ID NO:9からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナリングドメインが含まれ得る。

具体的な態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子とは、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むが、これらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83に特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが、増殖のような、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。共刺激分子の例には、CD27、CD28、CD8、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83に特異的に結合するリガンドが含まれる。

一態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメイン、特に共刺激分子は、CD28（NP_006130.1）を含まない。

好ましい一態様において、本発明のCARは、ヒトCD28の配列（NP_006130.1）を含まず、かつ/または他のどのCD28からの配列も含まない。

別の好ましい態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、4-1BB（GenBank：AAA53133）の断片からなる群より選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。具体的には、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:8からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。

本発明によるCARは、細胞の表面膜上に発現される。従って、そのようなCARは、膜貫通ドメインをさらに含む。適切な膜貫通ドメインの特徴的な特色には、細胞、本発明において好ましくは、免疫細胞、具体的には、リンパ球またはナチュラルキラー（NK）細胞の表面に発現され、予定された標的細胞に対する免疫細胞の細胞性応答を指図するために共に相互作用する能力が含まれる。膜貫通ドメインは、天然起源または合成起源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通型タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通型ポリペプチドは、α、β、γ、またはδのようなT細胞受容体のサブユニット、CD3複合体を構成するポリペプチド、IL2受容体p55（α鎖）、p75（β鎖）、またはγ鎖、Fc受容体、具体的には、Fcγ受容体IIIまたはCDタンパク質のサブユニット鎖であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性の残基を含んでいてもよい。

好ましい態様において、膜貫通ドメイン（TM）は、ヒトCD8α鎖（例えば、NP_001139345.1）、IGg1、IGg4、FcγRIIIαに由来する。

より好ましい一態様において、TMドメインはSEQ ID NO：6の配列またはその一部を含む。本発明のCD123 CARは通常、SEQ ID NO：6のポリペプチドに対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を示すCD8αからの膜貫通ドメイン（TM）を、さらに含む。

一態様において、本発明のCD123 CARは、4-1BBからのTMドメイン、好ましくは配列

のTMドメインを含まない。より好ましい一態様において、ヒンジはSEQ ID NO：171のヒンジである。

本発明のCARは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域を含む。本明細書において使用する「ヒンジ領域」という用語は通常、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結する機能を果たす任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特にヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインの柔軟性および接近可能性を高めるために使用される。ヒンジ領域は、最大300アミノ酸、好ましくは10〜100アミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸を含みうる。ヒンジ領域は、天然分子の全部または一部から、例えばCD8、CD4の細胞外領域の全部または一部から、または抗体定常領域の全部または一部から、誘導することができる。

一態様において、ヒンジ領域は、表7に開示するモノクローナル抗体によって認識される少なくとも1つのエピトープを含む。

一態様において、ヒンジ領域は、少なくとも2つのSEQ ID NO：161の配列を含み、好ましくはSEQ ID NO：171のヒンジ領域である。

一態様において、本発明のCD123 CARは、scfv中に少なくとも1つのSEQ ID NO：161の配列を含む。

一態様において、本発明のCD123 CARは、scfv中に、好ましくはscfvのN末端に、2つのSEQ ID NO：161の配列と1つのSEQ ID NO：169の配列とを含む。

あるいは、ヒンジ領域は天然のヒンジ配列に対応する合成配列であるか、または完全な合成ヒンジ配列でありうる。好ましい一態様において、該ヒンジドメインは、本明細書においてそれぞれSEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4およびSEQ ID NO：5として示すヒトCD8アルファ鎖、FcγRIIIα受容体またはIgG1の一部、またはこれらのポリペプチドに対して好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、95％ 97％、または99％の配列同一性を呈するヒンジポリペプチドを含む。

より好ましい一態様において、ヒンジドメインは、ヒトCD8アルファ鎖の一部またはFcγRIIIα受容体の一部を含み、より好ましくはヒンジドメインは、SEQ ID NO：3もしくはSEQ ID NO：4の配列、またはSEQ ID NO：3もしくはSEQ ID NO：4に対して少なくとも80％、少なくとも90％、95％ 97％、または99％の配列同一性を持つ配列を含む。

他の追加のscfv
標的抗原のダウンレギュレーションまたは変異は、癌細胞において一般的に観察され、抗原損失エスケープバリアントを作製する。従って、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞を標的に対してより特異的にするため、本発明によるCD123特異的CARは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化するための、他の細胞外リガンド結合ドメインを含んでいてもよい。一つの態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、同一の膜貫通ポリペプチド上にタンデムに置かれてもよく、任意で、リンカーによって隔てられていてもよい。別の態様において、異なる細胞外リガンド結合ドメインは、CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に置かれてもよい。別の態様において、本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団に関する。具体的には、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を該細胞の表面に発現させる工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。別の具体的な態様において、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。CARの集団とは、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、またはそれ以上のCARを意味する。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化することができる。

本発明は、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む、単離された免疫細胞にも関係する。

好ましい一態様において、本発明のCD123 CARは、SEQ ID NO：31のポリペプチドまたはSEQ ID NO：32のポリペプチドを含み、より好ましくは本発明のCD123 CARは、SEQ ID NO：31に対して少なくとも80％の同一性、好ましくは80％〜99％の同一性を持つポリペプチド、またはSEQ ID NO：32に対して80〜99％の同一性を有するポリペプチドを含む。さらに好ましくは、本発明のCARは、SEQ ID NO：31のポリペプチドに対して、またはSEQ ID NO：32に対して、85〜99％の同一性を有するポリペプチドを含む。

好ましい一態様において、本発明のCD123 CARは、下記の配列SEQ ID NO：31を有するポリペプチドを含む。

好ましい一態様において、本発明のCD123 CARは、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：31およびSEQ ID NO：160から選択される下記の配列を有するポリペプチドを含む。

好ましい一態様において、本発明のCARは、以下の配列から選択される少なくとも1つのポリペプチド:

と、以下の配列から選択される少なくとも1つの配列:

とを含む。

一態様において、本発明のCD123 CARは、以下の配列から選択される1つのポリペプチド:SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29,およびSEQ ID NO：30と、以下の配列から選択されるペプチド:SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、およびSEQ ID NO：23とを含む。

一態様において、本発明のCD123 CARは、SEQ ID NO：11のポリペプチドに対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するポリペプチド、またはSEQ ID NO：12のポリペプチドに対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するポリペプチドを含む。

より好ましい一態様において、本発明のCD123 CARは、SEQ ID NO：11＋SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：12に対する80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含むポリペプチドを含む。

本発明によれば、本発明の抗CD123 CARを発現する免疫細胞は抗がん免疫応答をトリガーし、GVHDを誘発しないか、GVHDを低減し、FLAG処置のプリン類似体の存在下でさえ増殖する。

好ましい態様において、本発明の抗CD123 CARを付与された本発明のCARを発現する免疫細胞は、ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答を含まない免疫応答を誘発する。

本発明によると、本発明の操作された免疫細胞を効率的な量で、その必要のある患者へ、少なくとも1回単独でまたは別の処置と組み合わせて、投与することができる。

ポリヌクレオチド、ベクター
本発明は、上記の本発明によるCARをコードするポリヌクレオチド、ベクターにも関する。

ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスのようなプラスミドもしくはウイルスベクター）の中に存在し得る。

具体的な態様において、2Aペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む一つのポリヌクレオチドまたはベクターに、異なる核酸配列を含めることができる。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされた2つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（（Donnelly and Elliott 2001；Atkins,Wills et al.2007；Doronina,Wu et al.2008）を参照されたい）。「コドン」とは、リボソームによって1つのアミノ酸残基へ翻訳されるmRNA（またはDNA分子のセンス鎖）上の3ヌクレオチドを意味する。従って、ポリペプチドが、インフレームにある2Aオリゴペプチド配列によって隔てられている時、mRNA内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、2つのポリペプチドが合成され得る。そのようなリボソームスキップ機序は、当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされた数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。

膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ差し向けるためには、（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。即ち、2種の配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路へ差し向けられるよう位置付けられる。分泌シグナル配列は概して、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列の5'に位置するが、ある種の分泌シグナル配列は、関心対象の核酸配列の他の場所に位置し得る（例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照されたい）。好ましい態様において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列SEQ ID NO:1および2を含むか、またはSEQ ID NO:1もしくは2、好ましくはSEQ ID NO:1と少なくとも90％、95％、97％、もしくは99％の配列同一性を含む。

当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化とは、関心対象の配列において、所定の種の高発現遺伝子において通常は稀であるコドンを、そのような種の高発現遺伝子において概して高頻度であるコドンへ交換することをさす。そのようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。

一態様では、本発明のCD123 CARをコードする異なる核酸配列を、1つのポリヌクレオチドまたはベクターに含めることができる。

より好ましい一態様において、本願に係る発明は、本発明のCARの安定発現を可能にするベクターに向けられる。安定とは、ここでは、注射の少なくとも1年後に、操作された細胞の細胞表面に、本発明のCARが検出されることを意味する。

別の一態様において、本願に係る発明は、本発明のCD123 CAR、好ましくはSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160のCD123 CARの安定発現を可能にするベクターに向けられる。

好ましい一態様において、本発明は、本発明のCD123 CARのいずれか1つ、好ましくはSEQ ID NO31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160のCD123 CARをコードする配列を含むpCLS27333ベクターを提供する。

細胞
本発明による細胞とは、自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞をさす。本発明による細胞は、好ましくは、ドナーから入手されたT細胞である。本発明によるT細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。好ましい態様において、細胞は、ヒト細胞、具体的には、ヒト幹細胞である。より好ましい態様において、細胞はヒトT細胞、具体的には操作されたヒトT細胞である。

代表的なヒト幹細胞は、CD34+細胞である。単離された細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞、または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、もしくはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞であってもよい。別の態様において、該細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。好ましい態様において、該細胞は、操作されたCD4+Tリンパ球および操作されたCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。

本発明の細胞の増大および遺伝子修飾の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して対象から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から入手され得る。本発明のある種の態様において、当業者に入手可能であり公知である多数のT細胞株が使用され得る。別の態様において、細胞は、好ましくは、健常ドナーに由来する。別の態様において、細胞は、異なる表現型特徴を示す細胞の混合集団の一部である。

好ましくは、幹細胞の単離および調製は、少なくとも一つのヒト胚の破壊を必要としない。免疫細胞は、自己処置の実施を考慮して、患者に起因してもよいし、または同種処置において使用され得る同種細胞の作製を考慮して、1種または数種のドナーに起因してもよい。

より好ましくは、本発明の操作された免疫細胞は、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32,またはSEQ ID NO：33に対応する抗CD123 CARを細胞表面に発現し、さらに好ましくは、本発明の操作された免疫細胞は、ヒト化されたSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、またはSEQ ID NO：32に対応するヒト化抗CD123 CARを発現する。

一態様において、本発明の操作された免疫細胞は、SEQ ID NO：34〜SEQ ID NO：159、好ましくはSEQ ID NO：34〜SEQ ID NO：117、より好ましくはSEQ ID NO：76〜SEQ ID NO：117に対応する抗CD123 CARを発現する。

これらの抗CD123 CARのなかでは、

を含むものが好ましく、

は、より好ましく、VH3/VL2、VH4/VL1、VH4/VL2、VH4/VL3、VH4/VL4を含むものは、さらに好ましい。

最も好ましいのは、ヒト化Klone43（huK43）および

を有するものである。

一態様において、本発明の操作された免疫細胞は、SEQ ID NO：160およびSEQ ID NO：172〜SEQ ID NO：187に対応する抗CD123 CARを発現する。

CARが付与されるよう免疫細胞を操作する方法：
本発明は、参照によって本明細書に組み入れられるWO2014/130635、WO2013176916、WO2013176915に以前に記載されたCD123 CARをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを免疫細胞へエクスビボで導入する工程を含む、免疫治療のための免疫細胞を調製する方法を包含する。

好ましい態様において、該ポリヌクレオチドは、免疫細胞において安定的に発現されることを考慮して、レンチウイルスベクターに含まれている。

より好ましい態様において、該ポリヌクレオチドは、免疫細胞において安定的に発現されることを考慮して、レンチウイルスベクターに含まれている。

さらなる態様によると、方法は、同種移植のためにより適当なものにするため、およびGVHD反応を低減するため、細胞を遺伝子修飾する工程をさらに含む。

T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を不活性化することによるT細胞の修飾
第1の局面によると、免疫細胞は、例えば、HLAまたはβ2mのタンパク質発現をコードするかまたは制御する遺伝子の不活性化と組み合わせられてもよい、WO 2013/176915に記載されたようなT細胞受容体（TCR）の1個以上の成分を発現する少なくとも1種の遺伝子を不活性化することによって、比較的非同種にされ得る。従って、移植片対宿主症候群および移植片拒絶のリスクは有意に低下する。

従って、免疫細胞がT細胞である時、本発明は、比較的非同種となるようT細胞を操作する方法も提供する。

細胞を比較的非同種にする方法は、T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子、特に、TCRα遺伝子、TCRβ遺伝子を不活性化する工程を含むことができる。

T細胞受容体（TCR）の1個以上の成分を不活性化することによって、同種移植のために適当なCAR発現免疫細胞を調製するための、WO2013/176915に開示された方法は、全て、参照によって本明細書に組み入れられる。

本発明は、T細胞受容体（TCR）の1個以上の成分を発現する少なくとも1種の遺伝子が不活性化されている抗CD123 CAR発現免疫細胞を包含する。従って、本発明は、抗CD123 CAR発現T細胞を提供し、ここで該CARはKlon 43に由来し、具体的には、SEQ ID NO：31との少なくとも80％の同一性を有し、T細胞受容体（TCR）の1個以上の成分を発現する少なくとも1種の遺伝子が不活性化されている。

本発明は、T細胞受容体（TCR）の1つまたは複数のコンポーネントを発現する少なくとも1つの遺伝子が不活化された、抗CD123 CAR発現免疫細胞を包含する。したがって本発明は、CARがKlon43から誘導され、特にSEQ ID NO：32に対して少なくとも80％の同一性を有し、T細胞受容体（TCR）の1つまたは複数のコンポーネントを発現する少なくとも1つの遺伝子が不活化されている、抗CD123 CAR発現T細胞を提供する。

本発明は、T細胞受容体（TCR）の1つまたは複数のコンポーネントを発現する少なくとも1つの遺伝子が不活化された、抗CD123 CAR発現免疫細胞を包含する。したがって本発明は、CARがKlon43から誘導され、特にSEQ ID NO：160に対して少なくとも80％の同一性を有し、T細胞受容体（TCR）の1つまたは複数のコンポーネントを発現する少なくとも1つの遺伝子が不活化されている、抗CD123 CAR発現T細胞を提供する。

本発明によると、T細胞受容体（TCR）の1個以上の成分が不活性化されている抗CD123 CAR免疫細胞は、医薬として使用するためのものである。

TCR遺伝子の不活性化とは、関心対象の遺伝子が、機能性のタンパク質の形態で発現されないことを意味する。具体的な態様において、方法の遺伝子修飾は、レアカットエンドヌクレアーゼが1種の標的遺伝子において特異的に切断を触媒し、それによって、標的遺伝子を不活性化するよう、1種のレアカットエンドヌクレアーゼを、操作すべき準備された細胞において発現させることに頼る。レアカットエンドヌクレアーゼによって引き起こされた核酸鎖破断は概して、相同組換えまたは非相同末端結合（NHEJ）の別の機序を通して修復される。しかしながら、NHEJは、切断の部位においてDNA配列に変化をもたらすことが多い不完全な修復過程である。機序は、直接再連結（Critchlow and Jackson 1998）を通した、またはいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合（Betts,Brenchley et al.2003；Ma,Kim et al.2003）を介した、2個のDNA末端のうち残っているものの再結合を含む。非相同末端結合（NHEJ）を介した修復は、小さい挿入または欠失をもたらすことが多く、特異的な遺伝子ノックアウトの作製のために使用され得る。その修飾は、少なくとも1個のヌクレオチドの置換、欠失、または付加であり得る。切断によって誘導された変異誘発イベント、即ち、NHEJのイベントに続く変異誘発イベントが起こった細胞は、当技術分野において周知の方法によって同定されかつ／または選択され得る。具体的な態様において、個々の各試料の細胞においてT細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を不活性化する工程は、T細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を妨害することができるレアカットエンドヌクレアーゼを細胞へ導入する工程を含む。より具体的な態様において、個々の各試料の細胞は、T細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を妨害することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸によって形質転換され、レアカットエンドヌクレアーゼが細胞において発現させられる。

レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼ、またはMBBBDヌクレアーゼであり得る。好ましい態様において、レアカットエンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼである。TALEヌクレアーゼとは、TAL（Transcription Activator Like）エフェクター（TALE）に由来するDNA結合ドメインと核酸標的配列を切断する1個のヌクレアーゼ触媒ドメインとからなる融合タンパク質を表す（Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010；Cermak,Doyle et al.2011；Geissler,Scholze et al.2011；Huang,Xiao et al.2011；Li,Huang et al.2011；Mahfouz,Li et al.2011；Miller,Tan et al.2011；Morbitzer,Romer et al.2011；Mussolino,Morbitzer et al.2011；Sander,Cade et al.2011；Tesson,Usal et al.2011；Weber,Gruetzner et al.2011；Zhang,Cong et al.2011；Deng,Yan et al.2012；Li,Piatek et al.2012；Mahfouz,Li et al.2012；Mak,Bradley et al.2012）。本発明において、新しいTALEヌクレアーゼが、養子免疫治療戦略のための関連する遺伝子を正確に標的とするために設計された。

標的配列を認識し切断する好ましいTALEヌクレアーゼは、PCT/EP2014/075317に記載されている。具体的には、標的遺伝子を不活性化する能力を増強するため、変異誘発を増加させるため、レアカットエンドヌクレアーゼと共に、付加的な触媒ドメインをさらに細胞に導入することができる。より具体的には、付加的な触媒ドメインは、DNA末端プロセシング酵素である。DNA末端プロセシング酵素の非限定的な例には、5-3'エキソヌクレアーゼ、3-5'エキソヌクレアーゼ、5-3'アルカリエキソヌクレアーゼ、5'フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、加水分解酵素、および鋳型非依存性DNAポリメラーゼが含まれる。そのような触媒ドメインの非限定的な例には、hExoI（EXO1_HUMAN）、酵母ExoI（EXO1_YEAST）、大腸菌（E.coli）ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、TdT（末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ）、ヒトDNA2、酵母DNA2（DNA2_YEAST）からなる群より選択されるタンパク質ドメインまたはタンパク質ドメインの触媒活性誘導体が含まれる。好ましい態様において、付加的な触媒ドメインは、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有し、より好ましい態様において、付加的な触媒ドメインは、TREX、より好ましくは、TREX2触媒ドメイン（WO2012/058458）である。別の好ましい態様において、触媒ドメインは、単鎖TREX2ポリペプチドによってコードされる。付加的な触媒ドメインは、任意で、ペプチドリンカーによって、本発明によるヌクレアーゼ融合タンパク質またはキメラタンパク質に融合され得る。

ヌクレオチド鎖切断による破断は、相同組換えの割合を増大させることが公知である。従って、別の態様において、方法の遺伝子修飾工程は、標的核酸配列と外来性核酸との間で相同組換えが起こるよう、標的核酸配列の一部分に相同の配列を少なくとも含む外来性核酸を、細胞へ導入する工程をさらに含む。具体的な態様において、外来性核酸は、それぞれ、標的核酸配列の5'および3'の領域に相同である第1部分および第2部分を含む。これらの態様において、外来性核酸は、標的核酸配列の5'および3'の領域との相同性を含まない、第1部分と第2部分との間に位置する第3部分も含む。標的核酸配列の切断の後、相同組換えイベントが、標的核酸配列と外来性核酸との間で刺激される。好ましくは、少なくとも50bpの、好ましくは、100bpより長く、より好ましくは、200bpより長い相同配列が、ドナーマトリックス内に使用される。具体的な態様において、相同配列は、200bp〜6000bp、より好ましくは、1000bp〜2000bpであり得る。実際、共有された核酸相同性は、破断の部位の上流および下流に隣接する領域に位置し、導入すべき核酸配列は、2つのアームの間に位置するべきである。

薬剤耐性T細胞
本発明者は、免疫療法のためにTCR KO T細胞を操作しようとし、特に、治療剤（抗がん薬）と併用することができるSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するTCR KO免疫細胞を工学的に作り出そうとした。

ある作用物質に対して「耐性または抵抗性」である細胞とは、本明細書では、遺伝子修飾なしの細胞の増殖を阻害しまたは防止する量の作用物質の存在下でも細胞が増殖し、活性であるように、遺伝子修飾された細胞を意味する。

遺伝子を不活化するとは、関心対象の遺伝子が機能的タンパク質の形態では発現しないことをいう。特定の態様において、本方法の遺伝子修飾は、用意された操作対象細胞におけるレアカットエンドヌクレアーゼの発現に依拠し、該レアカットエンドヌクレアーゼは、ある標的遺伝子における切断を特異的に触媒し、それによって該標的遺伝子を不活化するものである。特定の一態様において、少なくとも1つの薬物増感遺伝子を不活化する工程は、少なくとも1つの薬物増感遺伝子を破壊することができるレアカットエンドヌクレアーゼを細胞中に導入する工程を含む。より具体的な一態様では、該細胞を、薬物増感遺伝子を破壊する能力を有するレアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸で形質転換し、該レアカットエンドヌクレアーゼを該細胞中に発現させる。レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、またはTALEヌクレアーゼであってよい。好ましい一態様において、レアカットエンドヌクレアーゼはTALEヌクレアーゼである。

好ましい一態様において、T細胞に薬物耐性を付与するために不活化することができる薬物増感遺伝子は、ヒトデオキシシチジンキナーゼ（dCK）遺伝子である。この酵素は、デオキシリボヌクレオシド類であるデオキシシチジン（dC）、デオキシグアノシン（dG）およびデオキシアデノシン（dA）のリン酸化に要求される。プリンヌクレオチド類似体（PNA）は、dCKによって、PNA一リン酸、PNA二リン酸、およびPNA三リン酸に代謝される。それらの三リン酸型、特にクロファラビン三リン酸は、DNA合成に関してATPと競合して、アポトーシス促進剤として作用し、トリヌクレオチド生産に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ（RNR）の強力な阻害剤である。

好ましくは、T細胞におけるdCKの不活化は、TALEヌクレアーゼによって媒介される。この目標を達成するために、数ペアのdCK TALEヌクレアーゼをポリヌクレオチドレベルで設計し、アセンブルし、シーケンシングによって検証した。本発明に従って使用することができるTALEヌクレアーゼペアの例は、PCT/EP2014/075317に記述されている。

T細胞におけるこのdCK不活化は、クロファラビンおよびフルダラビンなどのプリンヌクレオシド類似体（PNA）に対する耐性を付与する。

より好ましい一態様では、T細胞におけるdCK不活化が、TRAC遺伝子の不活化と組み合わせることで、これらの二重ノックアウト（KO）T細胞を、クロファラビンなどの薬物に対して耐性にすると共に、無傷のTCRを持つ同じ細胞よりも同種異系性を低くする。この二重の特徴は、治療目標にとってはとりわけ有用であり、がんを持つ患者、好ましくは難治性再発性AMLまたはBPDNLを持つ患者を処置するために、免疫療法用の「既製の」同種異系細胞を化学療法と併用することを可能にする。

この二重KO不活化dCK/TRACは、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、またはSEQ ID NO：160のCD123 CARの発現前または発現後に、同時にまたは逐次的に行うことができる。本発明において奏功したTALEヌクレアーゼdCK/TRACペアの一例は、PCT/EP2014/075317、特に2つの遺伝子座の標的配列（dCKおよびTRAC）に記載されている。

別の局面によれば、本発明のCD123 CAR発現T細胞（SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するTCR KO免疫細胞）は、がんを処置するための標準医療として使用される免疫抑制薬または化学療法処置に対するその耐性が改良されるように、さらに遺伝子操作することができる。

代謝拮抗物質、アルキル化剤、アントラサイクリン類、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、白金化合物および紡錘体毒など、いくつかの細胞毒性作用物質（抗がん薬）が、がん細胞を殺すために開発されてきた。しかし、これらの薬物は免疫T細胞の機能/生存に影響を及ぼすので、免疫療法などの新規治療法と共にこれらの作用物質を導入することには問題がある。例えば化学療法剤は、その非特異的毒性プロファイルゆえに、頑強な抗腫瘍免疫担当細胞の樹立にとっては有害な場合がある。細胞増殖経路を標的とする低分子に基づく治療法も抗腫瘍免疫の樹立を妨害しうる。一過性に有効な化学療法レジメンを新規な免疫担当細胞療法と併用することができれば、抗新生物治療の著しい改良が達成されるかもしれない（概観するには（Dasgupta, McCarty et al. 2011）。

がん治療を改良し、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160のCD123 CARを発現する同種異系TCR KO T細胞の選択的生着を改良するために、該同種異系T細胞に薬物耐性を付与することで、それらを化学療法剤の毒性副作用から保護する。薬物耐性遺伝子を発現するT細胞は、薬物感受性細胞と比較して、生残し、増倍するであろうから、T細胞の薬物耐性は、インビボまたはエクスビボでのそれらの濃縮も可能にする。

化学療法剤に耐性なT細胞を工学的に作り出すための方法はPCT/EP2014/075317に開示されており、この文献はそのすべてが参照により本明細書に組み入れられる。

特に本発明は、免疫療法に適したSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160のCD123 CARを発現する同種異系TCR KO T細胞を工学的に作り出す方法であって、T細胞受容体（TCR）コンポーネントをコードする少なくとも1つの遺伝子が不活化され、薬物耐性を付与するために少なくとも1つの遺伝子が修飾される、好ましくはdCK遺伝子が修飾される方法を開示する。

プリン類似体との併用療法に適した、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160のCD123 CARを発現する同種異系T細胞を工学的に作り出す方法であって、以下の工程を含む方法:
SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞を用意する工程、
T細胞受容体（TCR）コンポーネントをコードする少なくとも1つの遺伝子を不活化することによって、該抗CD123 CAR発現T細胞を修飾する工程、
該抗CD123 CAR発現T細胞に薬物耐性を付与するために、好ましくはプリン類似体に対する耐性を付与するために、該抗CD123 CAR発現T細胞を修飾する工程、
該薬物の存在下で該操作された抗CD123 CAR発現T細胞を増加させる工程であって、ここで、該薬物は、ペントスタチン、フルダラビン2-デオキシアデノシン、クラドリビン、クロファラビン、ネララビン、好ましくはペントスタチン、フルダラビン一リン酸、および2-クロロデオキシアデノシン（2-CDA）から選択されるプリン類似体である、工程。

あるいは、本発明は、以下の工程を含む方法に関する:
SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞を用意する工程、
該SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞に薬物耐性を付与するために、dck遺伝子を欠失させることによって、該SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞を修飾する工程であって、ここで、該薬物は好ましくはプリン類似体である、工程、
T細胞受容体（TCR）コンポーネントをコードする少なくとも1つの遺伝子を不活化することによって、該SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞を修飾する工程、
該操作されたSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞を該薬物の存在下で増加させる工程であって、ここで、該薬物は、ペントスタチン、フルダラビン 2-デオキシアデノシン、クラドリビン、クロファラビン、ネララビン、好ましくはペントスタチン、フルダラビン一リン酸、および2-クロロデオキシアデノシン（2-CDA）から選択されるプリン類似体である、工程。

特に本発明は、T細胞受容体（TCRアルファ）コンポーネントをコードする遺伝子が不活化され、プリン類似体に対する耐性を付与するためにdCK遺伝子が修飾されている、免疫療法に適した同種異系細胞を工学的に作り出す方法であって、以下の工程を含む方法に関する:
抗CD123 CAR発現T細胞、特にSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞を用意する工程、
T細胞受容体（TCRアルファ）コンポーネントをコードする遺伝子を不活化することによって、該SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞を修飾する工程、
プリン類似体に対する耐性を付与するために、該SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞中のdCK遺伝子を不活化する工程、
該操作されたSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞を該薬物の存在下で増加させる工程。

あるいは、本発明は、以下の工程を含む方法に関する:
抗CD123 CAR発現T細胞、特にSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞を用意する工程、
プリン類似体に対する耐性を付与するために、該SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞中のdCK遺伝子を不活化する工程、
T細胞受容体（TCRアルファ）コンポーネントをコードする少なくとも1つの遺伝子を不活化することによって、該SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞を修飾する工程、
該操作された抗CD123 CAR発現T細胞をプリン類似体の存在下で増加させる工程。

好ましい一態様において、提供されるSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、またはSEQ ID NO：160のCD123 CARを発現するdCK KO、TCR KO T細胞は、ペントスタチン、フルダラビン 2-デオキシアデノシン、クラドリビン、クロファラビン、またはネララビンから選択される薬物に対して、好ましくはフルダラビン一リン酸に対して、または2-クロロデオキシアデノシン（2-CDA）に対して、耐性である。

抗CD123 CAR発現免疫細胞に薬物耐性を付与する遺伝子発現
具体的な態様において、少なくとも1種の薬剤耐性遺伝子の発現によって、薬剤耐性を本発明のT細胞に付与することができる。薬剤耐性遺伝子とは、化学療法剤（例えば、メトトレキサート）のような薬剤に対する「耐性」をコードする核酸配列をさす。換言すると、細胞における薬剤耐性遺伝子の発現は、薬剤耐性遺伝子なしの対応する細胞の増殖より大きな程度まで薬剤の存在下で細胞の増殖を可能にするか、または該薬物の存在下での生存を可能にする。細胞における薬剤耐性遺伝子の発現は、薬剤の存在下での細胞の増殖を可能にし、その活性には影響を与えない。本発明の薬剤耐性遺伝子は、代謝拮抗薬、メトトレキサート、ビンブラスチン、シスプラチン、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞傷害性抗生物質、抗イムノフィリン、それらの類似体または誘導体に対する耐性をコードしていてよい。

一つの態様において、薬剤耐性遺伝子は、薬物（または薬剤）、具体的には、アラシチン（Aracytine）、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（VP16）、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸の組み合わせ、メクロレタミン、プロカルバジン、クロラムブシル、シタラビン、アントラサイクリン、6-チオグアニン、ヒドロキシ尿素、プレドニゾン、およびそれらの組み合わせより選択される抗癌薬に対する耐性を付与する。

本発明のCD123 CAR発現T細胞に薬剤耐性を付与するために使用される可能性のある数種の薬剤耐性遺伝子が同定されている（Takebe,Zhao et al.2001；Sugimoto,Tsukahara et al.2003；Zielske,Reese et al.2003；Nivens,Felder et al.2004；Bardenheuer,Lehmberg et al.2005；Kushman,Kabler et al.2007）。

薬剤耐性遺伝子の一例は、変異型または修飾型のジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）をコードする遺伝子でもあり得る。DHFRは、細胞内のテトラヒドロ葉酸の量の制御に関与する酵素であって、DNA合成のために必須である。メトトレキサート（MTX）のような葉酸類似体は、DHFRを阻害し、従って、抗新生物剤として臨床的に使用されている。治療において使用される葉酸代謝拮抗薬による阻害に対して増加した耐性を有するDHFRの異なる変異型が記載されている。具体的な態様において、本発明による薬剤耐性遺伝子は、メトトレキサートのような葉酸代謝拮抗薬処置に対する耐性を付与する少なくとも1個の変異を含むヒト野生型DHFR（GenBank：AAH71996.1）の変異型をコードする核酸配列であり得る。具体的な態様において、DHFRの変異型は、位置G15、L22、F31、またはF34、好ましくは、位置L22またはF31に少なくとも1個の変異型アミノ酸を含む（Schweitzer,Dicker et al.1990；国際出願WO94/24277；米国特許US6,642,043）。具体的な態様において、DHFR変異型は、位置L22およびF31に2個の変異型アミノ酸を含む。本明細書に記載されたアミノ酸位置の対応は、GenBank：AAH71996.1に示された野生型DHFRポリペプチドの型のアミノ酸の位置でしばしば表される。具体的な態様において、位置15のセリン残基が、好ましくは、トリプトファン残基に交換される。別の具体的な態様において、位置22のロイシン残基が、好ましくは、変異体DHFRの葉酸代謝拮抗薬との結合を妨害するであろうアミノ酸、好ましくは、フェニルアラニンまたはチロシンのような無電荷アミノ酸残基に交換される。別の具体的な態様において、位置31または34のフェニルアラニン残基が、好ましくは、アラニン、セリン、またはグリシンのような小さい親水性アミノ酸に交換される。

本明細書において使用されるように、「葉酸代謝拮抗剤」または「葉酸類似体」とは、何らかのレベルで葉酸代謝経路に干渉するための分子をさす。葉酸代謝拮抗剤の例には、例えば、メトトレキサート（MTX）；アミノプテリン；トリメトレキサート（Neutrexin（商標））；エダトレキサート；N10-プロパルギル-5,8-ジデアザ葉酸（CB3717）；ZD1694（Tumodex）、5,8-ジデアザイソ葉（dideazaisofolic）酸（IAHQ）；5,10-ジデアザテトラヒドロ葉酸（DDATHF）；5-デアザ葉酸；PT523（Nα-(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-Nδ-ヘミフタロイル-L-オルニチン）；10-エチル-10-デアザアミノプテリン（DDATHF、ロマトレキソール（lomatrexol））；ピリトレキシム（piritrexim）；10-EDAM；ZD1694；GW1843；ペメトレキサート（Pemetrexate）、およびPDX（10-プロパルギル-10-デアザアミノプテリン）が含まれる。

薬剤耐性遺伝子の別の例は、グアノシンヌクレオチドのデノボ合成における律速酵素であるイノシン-5'-一リン酸脱水素酵素II（IMPDH2）の変異型または修飾型でもあり得る。IMPDH2の変異型または修飾型は、IMPDH阻害剤耐性遺伝子である。IMPDH阻害剤は、ミコフェノール酸（MPA）、またはそのプロドラッグ、ミコフェノール酸モフェチル（MMF）であり得る。変異体IMPDH2は、IMPDH阻害剤に対する有意に増加した耐性をもたらす変異を、少なくとも1個、好ましくは、2個、野生型ヒトIMPDH2（NP_000875.2）のMAP結合部位に含み得る。変異は、好ましくは、位置T333および／またはS351にある（Yam,Jensen et al.2006；Sangiolo,Lesnikova et al.2007；Jonnalagadda,Brown et al.2013）。具体的な態様において、位置333のトレオニン残基は、イソロイシン残基に交換され、位置351のセリン残基は、チロシン残基に交換される。本明細書に記載されたアミノ酸位置の対応は、NP_000875.2に示された野生型ヒトIMPDH2ポリペプチドの型のアミノ酸の位置でしばしば表される。

別の薬剤耐性遺伝子は、カルシニューリンの変異型である。カルシニューリン（PP2B）は、多くの生物学的過程に関与しており、T細胞活性化の中心である、広範に発現されているセリン／トレオニンプロテインホスファターゼである。カルシニューリンは、触媒サブユニット（CnA；3種のアイソフォーム）および制御サブユニット（CnB；2種のアイソフォーム）から構成されたヘテロ二量体である。T細胞受容体の会合の後、カルシニューリンは、転写因子NFATを脱リン酸し、NFATが核に移行し、IL2のような重要な標的遺伝子を活性化することを可能にする。FKBP12との複合体のFK506、またはCyPAとの複合体のシクロスポリンA（CsA）は、カルシニューリン活性部位へのNFATの到達を阻止し、その脱リン酸を防止し、それによって、T細胞活性化を阻害する（Brewin,Mancao et al.2009）。本発明の薬剤耐性遺伝子は、FK506および／またはCsAのようなカルシニューリン阻害剤に対して耐性のカルシニューリンの変異型をコードする核酸配列であり得る。具体的な態様において、変異型は、位置：V314、Y341、M347、T351、W352、L354、K360に野生型カルシニューリンヘテロ二量体の少なくとも1個の変異型アミノ酸を含み得、好ましくは、位置T351およびL354またはV314およびY341に二重変異を含み得る。具体的な態様において、GenBank：ACX34092.1に相当する配列において、位置341のバリン残基は、リジン残基またはアルギニン残基に交換され得、位置341のチロシン残基は、フェニルアラニン残基に交換され得；位置347のメチオニンは、グルタミン酸残基、アルギニン残基、またはトリプトファン残基に交換され得；位置351のトレオニンは、グルタミン酸残基に交換され得；位置352のトリプトファン残基は、システイン残基、グルタミン酸残基、またはアラニン残基に交換され得、位置353のセリンは、ヒスチジン残基またはアスパラギン残基に交換され得、位置354のロイシンは、アラニン残基に交換され得；位置360のリジンは、アラニン残基またはフェニルアラニン残基に交換され得る。本明細書に記載されたアミノ酸位置の対応は、（GenBank：ACX34092.1）に示された野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体aポリペプチドの型のアミノ酸の位置でしばしば表される。

別の具体的な態様において、変異型は、位置：V120、N123、L124、またはK125に野生型カルシニューリンヘテロ二量体bの少なくとも1個の変異アミノ酸を含み得、好ましくは、位置L124およびK125に二重変異を含み得る。具体的な態様において、GenBank：ACX34095.1に相当するアミノ酸配列において、位置120のバリンは、セリン残基、アスパラギン酸残基、フェニルアラニン残基、またはロイシン残基に交換され得；位置123のアスパラギンは、トリプトファン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、ヒスチジン、またはセリンに交換され得；位置124のロイシンは、トレオニン残基に交換され得；位置125のリジンは、アラニン、グルタミン酸、トリプトファンに交換され得、またはロイシン-アルギニンもしくはイソロイシン-グルタミン酸のような2個の残基が、位置125のリジンの後に付加されてもよい。本明細書に記載されたアミノ酸位置の対応は、（GenBank：ACX34095.1）に示された野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体bポリペプチドの型のアミノ酸の位置でしばしば表される。

別の薬剤耐性遺伝子は、ヒトアルキルグアニントランスフェラーゼ（hAGT）をコードする0(6)-メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（MGMT）である。AGTは、ニトロソウレアおよびテモゾロミド（TMZ）のようなアルキル化剤の細胞傷害効果に対する耐性を付与するDNA修復タンパク質である。6-ベンジルグアニン（6-BG）は、ニトロソウレアの毒性を強化するAGTの阻害剤であり、この薬剤の細胞傷害効果を強化するためにTMZと同時投与される。AGTのバリアントをコードするMGMTの数種の変異型は、6-BGによる不活性化に対して高度に耐性であるが、DNA傷害を修復する能力を保持している（Maze,Kurpad et al.1999）。具体的な態様において、AGT変異型は、アミノ酸配列SEQ ID NO:18（UniProtKB：P16455）において、野生型AGT位置P140に変異型アミノ酸を含み得る。好ましい態様において、位置140のプロリンはリジン残基に交換される。

別の薬剤耐性遺伝子は、多剤耐性タンパク質1（MDR1）遺伝子であり得る。この遺伝子は、細胞膜を介した代謝副産物の輸送に関与するP-糖タンパク質（P-GP）として公知の膜糖タンパク質をコードする。P-Gpタンパク質は、数種の構造的に無関係な化学療法剤に対して広い特異性を示す。

多剤耐性タンパク質1の過剰発現は、ミトキサントロンのような薬物に対する耐性を付与することが記載されている（Charles S.Morrow,Christina Peklak-Scott,Bimjhana Bishwokarma,Timothy E.Kute,Pamela K.Smitherman,and Alan J.Townsend.多剤耐性タンパク質1（MRP1、ABCC1）はグルタチオン依存性薬物排出を介してミトキサントロンに対する耐性を媒介する（Multidrug Resistance Protein 1(MRP1,ABCC1) Mediates Resistance to Mitoxantrone via Glutathione-Dependent Drug Efflux）Mol Pharmacol April 2006 69:1499-1505）。

従って、MDR-1（NP_000918）をコードする核酸配列の発現によって、薬剤耐性を細胞に付与することができる。

本発明の薬剤耐性細胞を調製するさらに別の方式は、アムサクリンに対する耐性を付与するため、ヒトトポイソメラーゼII遺伝子のArg486およびGlu571における変異のような特異的な変異を有する細胞を調製することである（S.PATEL,B.A.KELLER,and L.M.FISHER.2000.MOLECULAR PHARMACOLOGY.Vol 57:p784-791(2000)）。

本発明の薬剤耐性細胞を調製するさらに別の方式は、ダウノルビシンに対する耐性を付与するため、マイクロRNA-21を過剰発現する細胞を調製することである（白血病K562細胞株におけるPTEN発現の制御によるダウノルビシンに対する耐性におけるmiR-21の関与（Involvement of miR-21 in resistance to daunorubicin by regulating PTEN expression in the leukaemia K562 cell line）Bai,Haitao et al.FEBS Letters,Volume 585,Issue 2,402-408）。

好ましい態様において、本発明の細胞は、そのような薬剤耐性を付与するmRNAまたはタンパク質を保持しており、阻害性のmRNAまたは遺伝子も含み、その発現は別の薬物による条件付きであり、そのため他の薬物の存在下でまたは他の薬物の投与時に本発明の薬剤耐性細胞の選択的な破壊が可能となる。

薬剤耐性遺伝子は、細胞傷害性抗生物質に対する耐性を付与することもでき、ble遺伝子またはmcrA遺伝子であり得る。免疫細胞におけるble遺伝子またはmcrAの異所発現は、化学療法剤、それぞれ、ブレオマイシンまたはマイトマイシンCに曝された時の選択有利性を与え得る。

遺伝子治療のための最も実用的なアプローチは、ベクター、好ましくは、ウイルスベクターによる効率的な遺伝子送達を使用することによる、T細胞を操作するための遺伝子の付加である。従って、具体的な態様において、本発明は、好ましくは少なくとも1種のベクターによってコードされたトランスジーンを、細胞へ導入することによって、薬剤耐性を、本発明のCD123免疫細胞に付与する方法を提供する。

ゲノムへの遺伝子のランダム挿入は、挿入された遺伝子または挿入部位の近くの遺伝子の不適切な発現をもたらす場合がある。ゲノム内の特定の部位へ遺伝子をターゲティングするための、内在性配列を含む外来性核酸の相同組換えを使用した特異的遺伝子治療は、確実なT細胞の操作を可能にする。前記のように、本発明の方法の遺伝子修飾工程は、内在性遺伝子と外来性核酸との間に相同組換えが起こるよう、薬剤耐性遺伝子をコードする配列および内在性遺伝子の一部分を少なくとも含む外来性核酸を細胞へ導入する工程を含み得る。具体的な態様において、内在性遺伝子は、相同組換えの後、野生型遺伝子が、薬物に対する耐性を付与する遺伝子の変異型に交換されるような、野生型「薬剤耐性」遺伝子であり得る。

ヌクレオチド鎖切断による破断は、相同組換えの割合を刺激することが公知である。従って、具体的な態様において、本発明の方法は、内在性遺伝子内の標的配列を切断することができるレアカットエンドヌクレアーゼを細胞において発現させる工程をさらに含む。内在性遺伝子は、例えば、DHFR、IMPDH2、カルシニューリン、またはAGTをコードすることができる。レアカットエンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPR/Cas9エンドヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼであり得る。

不活性化され得る酵素の別の例は、ヒトヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子（Genbank：M26434.1）である。具体的には、HPRTは、癌、具体的には、白血病を有する患者を処置するために現在使用されている、HPRTによって細胞傷害性チオグアニンヌクレオチドに変換される細胞分裂阻害性代謝物質6-チオグアニン（6TG）に対する耐性を付与するため、操作T細胞において不活性化され得る（Hacke,Treger et al.2013）。グアニン類似体は、ホスホリボシル部分の付加を触媒し、6メルカプトプリン（6MP）および6チオグアニン（6TG）を含むTGMPグアニン類似体の形成を可能にするHPRTトランスフェラーゼによって代謝され、ALLを処置するためのリンパ枯渇（lymphodepleting）薬として一般的に使用される。それらは、HPRT（ホスホリボシル部分の付加を触媒し、TGMPの形成を可能にするヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）によって代謝される。その後のリン酸化は、三リン酸化型の形成をもたらし、それは、最終的にはDNAに組み込まれる。DNAへ組み入れられた後、チオGTPは、チオレート基を介してDNA複製のフィデリティーを損ない、細胞完全性にとって高度に有害であるランダム点変異を生成する。

別の態様において、T細胞の表面に通常発現されているCD3の不活性化は、テプリズマブのような抗CD3抗体に対する耐性を付与することができる。

併用処置
「治療剤」、「化学療法剤」または「薬物」または「抗癌薬」という用語は、本明細書において使用されるように、医薬、好ましくは癌細胞と相互作用しそれによって細胞の増殖状態を低下させかつ／または細胞を死滅させることができる化合物またはそれらの誘導体をさす。化学療法剤または「抗癌薬」の例には、アルキル化剤（例えば、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、オキサリプラチン、ウラムスチン（Uramustine）、テモゾロミド、ホテムスチン）、代謝拮抗物質（例えば、クロファラビン、フルダラビン、または2'-デオキシアデノシン、メトトレキサート（MTX）、5-フルオロウラシル、もしくはそれらの誘導体、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセドのようなプリンヌクレオシド代謝拮抗薬）、抗腫瘍抗生物質（例えば、マイトマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン）、植物由来抗腫瘍剤（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、ビンブラスチン、（ビノレルビン）、ドセタキセル、パクリタクセル）、トポイソメラーゼ阻害剤（イリノテカン、トポテカン、エトポシド）が含まれるが、これらに限定されない。

好ましい態様において、治療剤、化学療法薬とは、本明細書において使用されるように、癌を処置するため、具体的には造血癌細胞、さらに具体的にはAML、さらにより具体的には難治性再発性のAMLを処置し、それによって、癌細胞の増殖状態を低下させかつ／または癌細胞を死滅させるために使用され得る化合物またはそれらの誘導体をさす。

化学療法剤の他の例には、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（VP16）、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸、メクロレタミン、プロカルバジン、クロラムブシル、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の他の態様において、本発明の細胞は、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（VP16）、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸、シタラビン、アントラサイクリン、6-チオグアニン、ヒドロキシ尿素、プレドニゾン、およびそれらの組み合わせより選択される薬物（または薬剤）と共に患者へ投与される。

そのような薬剤には、抗癌剤、TRIMETHOTRIXATE（商標）（TMTX）、TEMOZOLOMIDE（商標）、RALTRITREXED（商標）、S-(4-ニトロベンジル)-6-チオイノシン（NBMPR）、6-ベンジルグアニジン（6-BG）、ビスクロロニトロソウレア（BCNU）、およびCAMPTOTHECIN（商標）、またはそれらのいずれかの治療用誘導体がさらに含まれ得るが、これらに限定されない。

より好ましい態様において、TCRおよびdck KO遺伝子を有する、SEQ ID NO：31の、SEQ ID NO：32の、またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞は、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（VP16）、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸、およびそれらの組み合わせより選択される少なくとも1種の治療剤と組み合わせて、患者へ投与される。

TCRおよびdck KO遺伝子を持つ、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞は、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベペシド、エトポシド（VP16）、三酸化二ヒ素、トランスレチノイン酸およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの治療剤と組み合わされて、治療剤として使用される。

好ましくは、TCRおよびdck KO遺伝子を持つ、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞は、プリン類似体（フルダラビン）と組み合わされて、治療剤として使用される。

好ましくは、TCRおよびdck KO遺伝子を持つ、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するT細胞は、FLAG処置と組み合わされて、治療剤として使用される。

一態様において、該CD123 CARは、SEQ ID NO：76〜SEQ ID NO：117から選択され、二重TCR dCK KO T細胞中で発現し、治療剤としてプリン類似体またはFLAGと併用される。

本発明において、併用処置は、選別および/または枯渇のためのmAbの注入を含む。好ましい一態様において、該mAbはリクスチマブ（Rixutimab）である。

好ましくは静脈内経路で投与されるリツキシマブの最大用量は2,250mg/m2である。これは、静脈内プッシュ（intravenous push）または静脈内ボーラスとしては投与されない。

抗CD123 CAR発現免疫細胞の多剤耐性
別の具体的な態様において、本発明者らは、患者が異なる薬物によって処置された時の操作されたT細胞の選択を媒介するため、複数の薬物に対して耐性の同種T細胞、具体的には、同種抗CD123 CAR発現T細胞を使用して、「既製の」免疫治療戦略を開発しようと努力した。治療効率は、多剤耐性同種T細胞を遺伝子操作することによって有意に増強され得る。そのような戦略は、相乗効果を示す薬物組み合わせに応答する腫瘍の処置において特に有効であり得る。さらに、操作された多剤耐性T細胞は、増大することができ、最小限の用量の薬剤を使用して選択され得る。

従って、本発明による方法は、本発明のT細胞へ多剤耐性を付与するため、本発明のT細胞を修飾する工程を含み得る。多剤耐性は、複数の薬剤耐性遺伝子を発現させるか、または複数の薬剤感作遺伝子を不活性化することによって、付与され得る。別の具体的な態様において、多剤耐性は、少なくとも1種の薬剤耐性遺伝子を発現させ、少なくとも1種の薬剤感作遺伝子を不活性化することによって、T細胞に付与され得る。具体的には、多剤耐性は、DHFRの変異型、IMPDH2の変異型、カルシニューリンの変異型、MGMTの変異型、ble遺伝子、およびmcrA遺伝子のような少なくとも1種の薬剤耐性遺伝子を発現させ、HPRT遺伝子のような少なくとも1種の薬剤感作遺伝子を不活性化することによって、T細胞に付与され得る。好ましい態様において、多剤耐性は、HPRT遺伝子を不活性化し、DHFRの変異型を発現させることによって；またはHPRT遺伝子を不活性化し、IMPDH2の変異体を発現させることによって；またはHPRT遺伝子を不活性化し、カルシニューリンの変異体を発現させることによって；HPRT遺伝子を不活性化し、MGMTの変異型を発現させることによって；HPRT遺伝子を不活性化し、ble遺伝子を発現させることによって；HPRT遺伝子を不活性化し、mcrA遺伝子を発現させることによって、付与され得る。

一つの態様において、本発明は、複数の薬剤耐性遺伝子を発現するか、または複数の薬剤感作遺伝子が不活性化されている、同種抗CD123 CAR発現T細胞を提供する。

本発明の抗CD123 CAR発現免疫細胞における自殺遺伝子
いくつかの場合において、操作されたT細胞は投与後数年にわたり増大し存続することができるため、投与されたT細胞の選択的除去を可能にする安全機序を含むことが望ましい。従って、いくつかの態様において、本発明の方法は、組換え自殺遺伝子によるT細胞の形質転換を含む。組換え自殺遺伝子は、対象へ投与された後、T細胞の直接毒性および／または調節されない増殖のリスクを低下させるため、使用される（Quintarelli C,Vera F,blood 2007；Tey SK,Dotti G.,Rooney CM,boil blood marrow transplant 2007）。自殺遺伝子は、インビボで形質転換細胞の選択的除去を可能にする。具体的には、自殺遺伝子は、無毒のプロドラッグを細胞傷害性薬物へ変換するかまたは毒性遺伝子発現産物を発現する能力を有する。換言すると、「自殺遺伝子」とは、単独でまたは他の化合物の存在下で細胞死を引き起こす産物をコードする核酸である。

そのような自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼをコードするものである。付加的な例は、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ、および5-フルオロシトシンを高度に毒性の化合物5-フルオロウラシルに変換することができる細菌遺伝子シトシンデアミナーゼである。自殺遺伝子には、非限定的な例として、カスパーゼ9またはカスパーゼ8またはシトシンデアミナーゼも含まれる。カスパーゼ9は、特異的な化学的二量化誘導因子（CID）を使用して活性化され得る。自殺遺伝子は、細胞の表面に発現され、細胞を治療用モノクローナル抗体に対して感受性にすることができるポリペプチドであってもよい。本明細書において使用されるように、「プロドラッグ」とは、毒性生成物へ変換され得る本発明の方法において有用な任意の化合物を意味する。プロドラッグは、本発明の方法において自殺遺伝子の遺伝子産物によって毒性生成物へ変換される。そのようなプロドラッグの代表例は、HSVチミジンキナーゼによってインビボで毒性化合物へ変換されるガンシクロビルである。ガンシクロビル誘導体は、その後、腫瘍細胞に対して毒性となる。プロドラッグの他の代表例には、アシクロビル、FIAU[1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードウラシル]、VZV-TKのための6-メトキシプリンアラビノシド、およびシトシンデアミナーゼのための5-フルオロシトシンが含まれる。

本発明の一つの好ましい自殺遺伝子系は、抗CD20 mAb、リツキシマブによって認識される抗原性モチーフ、具体的には、WO2013153391に記載されたいわゆるRQR8ポリペプチドに含まれるようなQBen10を含む、組換え抗原性ポリペプチドを利用する。次いで、必要とされた時に、認可されている抗体薬リツキシマブが、細胞枯渇のために使用され得る。

一態様において、本発明は、SEQ ID NO：31または32の抗CD123 CARを発現するTCR KO-dCK KO T細胞であって、該細胞の選択的破壊を可能にするRQR8自殺遺伝子を発現する細胞を提供する。

より好ましくは、本発明は、TCR KO-dCK KO 抗CD123 CAR発現T細胞であって、該CD123 CARが、CD123 CAR発現細胞の選択的破壊を可能にする自殺ドメインを含み、好ましくは該自殺ドメインがSEQ ID NO：161のドメインを少なくとも2つは含み、より好ましくは該CD123 CARがSEQ ID NO：171の配列を含むものを提供する。

薬物耐性同種異系CAR T細胞の細胞傷害性を試験するためのCD123+/luc+薬物耐性Daudi細胞
本発明は、CD123を発現すると共にプリン類似体に対して耐性である標的細胞を製造するための方法も包含する。これらの標的細胞は、本発明のCD123 CAR T細胞の細胞傷害性を試験するのにとりわけ有用である。これらの細胞は、臨床的に意義のある用量のクロファラビンに対して十分に耐性であり、ルシフェラーゼ活性を内包している。この特徴の組み合わせにより、マウスモデルにおいてインビボでそれらを追跡すること、または必要な場合にそれらを壊滅することが可能になる。

より具体的には、それらは、クロファラビンまたはその他のPNAの存在下で、マウスにおける薬剤耐性T細胞の細胞傷害特性を査定するために使用され得る。クロファラビン耐性Daudi細胞は、薬剤耐性B細胞悪性疾患を保有している導入治療から再発した急性リンパ芽球性白血病（ALL）患者の生理学的状態を模倣する。従って、これらの細胞は、薬剤耐性CAR T細胞の信頼性および細胞傷害性を評価するために非常に興味深い。好ましくは、これらの標的細胞は、CD123+ルシフェラーゼ+Daudi細胞である。

単離された細胞
本発明は、CD123に結合するCD123 CARを発現する単離された細胞に関する。従って、本発明は、抗CD123 CAR発現細胞に関する。具体的な態様において、抗CD123 CAR発現細胞は、少なくとも1種の薬物に対して耐性であり、かつ／またはT細胞受容体成分をコードする少なくとも1種の妨害された遺伝子を含む。

好ましい一態様において、本発明は、CD123に結合し、少なくとも1つのプリン類似体に対して耐性であり、破壊されたT細胞受容体アルファコンポーネントコード遺伝子を含む、CARを発現する単離されたT細胞に関する。

より好ましい一態様において、本発明は、CD123に結合し、CD123発現細胞を壊滅し、少なくとも1つのプリン類似体に対して耐性であり、破壊されたT細胞受容体アルファコンポーネントコード遺伝子を含む、SEQ ID NO：31、32または160のCARを発現する単離されたT細胞に関する。

より好ましい一態様において、本発明は、CD123に結合し、CD123発現細胞を壊滅し、少なくとも1つのプリン類似体に対して耐性であり、破壊されたT細胞受容体アルファコンポーネントコード遺伝子を含む、SEQ ID NO：160のCARを発現する単離されたT細胞に関する。

より好ましい一態様において、本発明は、CD123に結合し、CD123発現細胞を壊滅し、少なくとも1つのプリン類似体に対して耐性であり、破壊されたT細胞受容体ベータコンポーネントコード遺伝子を含む、SEQ ID NO：160のCARを発現する単離されたT細胞に関する。

別の一特定態様において、該抗CD123 CAR発現T細胞は、少なくとも1つの破壊された薬物増感遺伝子、例えばdCK遺伝子またはHPRT遺伝子を含む。より具体的な一態様において、該単離された抗CD123 CAR T細胞は、破壊されたHPRT遺伝子を含み、DHFR変異体を発現し;該単離された抗CD123 CAR T細胞は、破壊されたHPRT遺伝子を含み、IMPDH2変異体を発現し; 該単離された抗CD123 CAR T細胞は、破壊されたHPRT遺伝子を含み、カルシニューリン変異体を発現し; 該単離された抗CD123 CAR T細胞は、破壊されたHPRT遺伝子を含み、AGT変異体を発現する。

特に本発明は、単離されたT細胞、特に、単離された同種異系抗CD123 CAR発現T細胞、好ましくはSEQ ID NO：31 32または160の配列を有するペプチドを含む単離された同種異系抗CD123 CAR発現T細胞に関し、該単離された同種異系抗CD123 CAR発現T細胞は、より具体的には、プリン類似体に対して耐性であり、プリン類似体の存在下での免疫療法に特に適している。

一局面において、本発明は、単離された免疫細胞を操作することで、それを、クロロファラビン（clorofarabine）またはフルダラビンなどのプリン類似体（プリンヌクレオチド類似体、すなわちPNA）に対して耐性にして、それらを、これら従来の化学療法剤で前もって処置された患者におけるがん免疫療法処置に使用することができるようにするための方法を提供する。

薬物に対する耐性は、当該薬物に対する細胞の感受性を担う1つまたは複数の遺伝子（薬物増感遺伝子）、例えばdcK遺伝子および/またはHPRT遺伝子を不活化することによって、本発明の単離されたT細胞に対して付与することができる。

免疫チェックポイント
本発明は、抗CD123 CAR、特にSEQ ID NO：31、またはSEQ ID NO：32、またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現する同種異系dCK KO T細胞であって、T細胞受容体（TCR）の1つまたは複数のコンポーネントを発現する少なくとも1つの遺伝子が不活化され、かつ/またはWO2014/184741において言及されているように、遺伝子CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1（orblimp1）、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3から選択される1つの遺伝子が不活化されているものを提供する。

本発明のさらなる局面によると、CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1（またはblimp1）、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3より選択される遺伝子のようなT細胞活性化の制御因子として働く「免疫チェックポイント」として働くタンパク質をコードする遺伝子を不活性化することによって、より高活性にするためまたは消耗を制限するため、免疫細胞をさらに操作することができ、好ましくは、遺伝子はPDCD1またはCTLA-4である。本発明のT細胞において発現を低下させるかまたは抑制することができる遺伝子の例は、表9に示される。

一つの態様において、遺伝子は、β2ミクログロブリンタンパク質をコードするT細胞活性化の制御因子として働く遺伝子である。

本発明のさらなる局面によると、薬物、具体的には、癌、具体的には、AMLのようなCD123発現細胞によって媒介される癌に対する化学療法において使用される薬物に対して耐性にするため、本発明の抗CD123 CAR免疫細胞をさらに操作することができる。これは、薬物に対する耐性を付与する遺伝子を導入することによって達成され得る。この同一の遺伝子は、以前に記載されたような遺伝子誘導可能阻害／発現系を使用することによってオンオフされ得る（Garcia EL,Mills AA(2002)誘導可能Creによって媒介される切り出しによる致死の回避（Getting around lethality with inducible Cre-mediated excision.）Semin Cell Dev Biol 13:151-8、Lewandoski M(2001)マウスにおける遺伝子発現の条件的調節（Conditional control of gene expression in the mouse.）Nat Rev Genet 2:743-55；Scharfenberger L,Hennerici T,Kirly G et al.(2014)皮膚生物学におけるトランスジェニックマウステクノロジー：完全または組織特異的ノックアウトマウスの生成（Transgenic mouse technology in skin biology:Generation of complete or tissue-specific knockout mice.）J Invest Dermatol 134:e16；Schwenk F,Kuhn R,Angrand PO et al.(1998)マウスにおける時間的にかつ空間的に制御された体細胞変異誘発（Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.）Nucleic Acids Res 26:1427-32）。

従って、（i）T細胞受容体（TCR）の1個以上の成分を発現する少なくとも1種の遺伝子が不活性化されており、（ii）薬物（PNA以外）に対する耐性を付与する少なくとも1種の遺伝子が組み入れられているか、または薬物（PNA以外）に対する感受性を付与する遺伝子が不活性化のために欠失もしくは変異しており、（iii）表9に開示された遺伝子より選択される別の遺伝子が不活性化されている、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、またはSEQ ID NO：160に対応する配列の抗CD123 CARを発現するPNA耐性免疫T細胞が、本発明の目的である。

本発明は、単離された抗CD123 CAR免疫細胞、または本発明の方法によって入手可能な細胞株、より具体的には、本明細書に記載されたタンパク質、ポリペプチド、対立遺伝子バリアント、変更されたもしくは欠失させられた遺伝子、またはベクターのいずれかを含む単離された細胞を包含する。

本目的は、がん、特にAML、難治性再発性のAML、BPDNLの処置のために提供される。

本発明の免疫細胞または細胞株は、外来性の組換えポリヌクレオチド、具体的には、CARもしくは自殺遺伝子（SEQ ID NO：161をコードする）をさらに含んでいてもよいし、または治療用生成物としての、理想的には「既製の」生成物としてのそれらの効率に寄与するチェックポイントタンパク質もしくはそれらのリガンドをコードする変更されたもしくは欠失させられた遺伝子を含んでいてもよい。

別の局面において、本発明は、上記の方法によって入手可能な操作された免疫細胞を少なくとも一回投与することによって、患者における癌を処置するかまたは防止する方法に関する。

（表５）本発明の操作されたT細胞において修飾された、免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子のリスト

上記遺伝子の1つ、好ましくは2つの対立遺伝子は、本発明の操作されたT細胞において修飾されており、該遺伝子/対立遺伝子をノックアウトするのに使用するTALENの各調製のために、遺伝子座が検証される。

好ましい態様において、免疫細胞をさらに操作する方法は、DNA切断によって前述の遺伝子を選択的に不活性化する特異的なレアカットエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、具体的には、mRNAを、T細胞へ導入する工程を含む。より好ましい態様において、レアカットエンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼまたはCas9エンドヌクレアーゼである。TALヌクレアーゼは、他の型のレアカットエンドヌクレアーゼより高い特異性および切断効率を有することが従来立証されているため、一定のターンオーバーで大規模に操作された免疫細胞を作製するための選り抜きのエンドヌクレアーゼである。

送達方法
前記の異なる方法は、薬剤耐性遺伝子、レアカットエンドヌクレアーゼ、キメラ抗原受容体（CAR）、具体的には、抗CD123 CAR、より具体的には、SEQ ID NO：31または32または160を含みかつ自殺ドメインを含有するCARのような、関心対象のタンパク質を、単離された細胞において発現させる工程を含む。

非限定的な例として、関心対象のタンパク質は、好ましくは、少なくとも1種のプラスミドベクターによってコードされたトランスジーンとしての導入によって、細胞において発現させられ得る。ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞において発現させられ得る。あるいは、細胞外でポリペプチドを作製し、次いで、細胞へ導入してもよい。

ポリヌクレオチド構築物を細胞へ導入する方法は、当技術分野において公知であって、非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を含む。

ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等によって細胞へ導入され得る。例えば、一過性形質転換法には、例えば、微量注入、電気穿孔または微粒子銃、細胞融合が含まれる。ポリヌクレオチドは、細胞において発現されることを考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含まれていてもよい。プラスミドベクターは、ベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーを含み得る。

異なるトランスジーンが1個のベクターに含まれていてもよい。ベクターは、2Aペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含むことができる。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされた2個のアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、コドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（Donnelly et al.,J.of General Virology 82:1013-1025(2001)；Donnelly et al.,J.of Gen.Virology 78:13-21(1997)；Doronina et al.,Mol.And.Cell.Biology 28(13):4227-4239(2008)；Atkins et al.,RNA 13:803-810(2007)を参照すること）。

「コドン」とは、リボソームによって1個のアミノ酸残基へ翻訳される、mRNA（またはDNA分子のセンス鎖）上の3ヌクレオチドを意味する。従って、ポリペプチドが、インフレームの2Aオリゴペプチド配列によって分離されている時、mRNA内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、2種のポリペプチドが合成され得る。そのようなリボソームスキップ機序は、当技術分野において周知であって、単一のメッセンジャーRNAによってコードされた数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。

本発明のより好ましい態様において、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、電気穿孔によって、細胞へ直接導入されるmRNAであり得る。本発明者らは、T細胞におけるmRNA電気穿孔のための最適条件を決定した。本発明者らは、細胞への材料の送達のため、生細胞を一時的に透過性にすることをパルス電場の使用によって可能にするcytoPulseテクノロジーを使用した。PulseAgile（BTX Havard Apparatus,84 October Hill Road,Holliston,MA 01746,USA）電気穿孔波形の使用に基づくテクノロジーは、パルスの継続時間、強度、およびパルス間隔の正確な調節を与える（米国特許第6,010,613号および国際PCT出願WO2004083379）。これらのパラメーターは、全て、最小の死亡率での高いトランスフェクション効率のための最良の条件に到達するために修飾され得る。基本的には、最初の高電場パルスが孔形成を可能にし、その後のより低い電場パルスが細胞へのポリヌクレオチドの移動を可能にする。

上記の様々な方法は、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、またはSEQ ID NO：160のCD123 CARを細胞へ導入する工程を含む。非限定的な例として、CARは、1種のプラスミドベクターによってコードされたトランスジーンとして導入され得る。プラスミドベクターは、ベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーも含有し得る。

ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞においてインサイチューで合成され得る。あるいは、ポリペプチドは、細胞外で作製され、次いで、細胞へ導入されてもよい。ポリヌクレオチド構築物を細胞へ導入する方法は、当技術分野において公知であり、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を非限定的な例として含む。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等によって細胞へ導入され得る。例えば、一過性形質転換法には、例えば、微量注入、電気穿孔、または微粒子銃が含まれる。ポリヌクレオチドは、細胞における発現を考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含まれ得る。

操作された免疫細胞
本発明は、細胞を操作する方法によって入手可能な単離された細胞または細胞株にも関する。具体的には、単離された細胞は、少なくとも1種の上記のCARを含む。別の態様において、単離された細胞は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む。具体的には、単離された細胞は、CARをコードする外因性のポリヌクレオチド配列を含む。本発明の遺伝子改変免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機序と無関係に増殖する。

既に記載された方法のいずれか一つによって入手された単離された免疫細胞、好ましくは、T細胞も、本発明の範囲に包含される。免疫細胞とは、自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞をさす。本発明による免疫細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞はCD34+細胞である。単離された細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞、または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、もしくはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞であってもよい。別の態様において、細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の増大および遺伝子改変の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して対象から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から入手され得る。本発明のある種の態様において、当業者に入手可能であり公知である多数のT細胞株が使用され得る。別の態様において、細胞は、健常ドナー、癌を有すると診断された患者、または感染を有すると診断された患者に由来し得る。別の態様において、細胞は、異なる表現型的特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。既に記載された方法によって形質転換されたT細胞から入手された細胞株も、本発明の範囲に包含される。免疫抑制処置に対して抵抗性であり、以前の方法によって入手可能である改変された細胞は、本発明の範囲に包含される。

好ましい一態様として、本発明は、機能的TCRを発現せず、PNAに対して耐性であり、CD123陽性細胞に対して反応性である、上述のSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160に対応する配列を有するCD123 CARを賦与されたT細胞またはT細胞の集団を、患者への、好ましくはAML、難治性再発AML、BPDNL、またはリンパ増殖性障害を患っている患者へのそれらの養子移入のために、または骨髄移植前の処置として、提供する。

より好ましい一態様として、本発明は、上述のCD123陽性細胞に対して反応性であり、機能的TCRを発現せず、選ばれたPNAに対して耐性である、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160に対応する配列を有するCD123 CAR CD123 CARを賦与されたT細胞またはT細胞の集団を、該選択されたPNAで処置された患者へのそれらの同種異系移植のために、提供する。

さらに好ましい一態様において、本発明は、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160に対応する配列を有するCD123 CARのポリペプチドを含む抗CD123 CARを賦与されたT細胞またはTRC KO dCK KO T細胞の集団を、別の一処置と組み合わせて提供する。

T細胞の活性化および増大
本発明の遺伝子改変免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機序と無関係に増殖するが、本発明の免疫細胞、具体的には、T細胞は、T細胞の遺伝子改変の前であっても後であっても、例えば、米国特許第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；および米国特許出願公開第20060121005号に記載されるような方法を一般に使用して、さらに活性化させ増大させることができる。T細胞は、インビトロまたはインビボで増大させることができる。

概して本発明のT細胞は、T細胞の表面上のCD3 TCR複合体および共刺激分子を刺激してT細胞のための活性化シグナルを作製する薬剤との接触によって増大する。例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、またはフィトヘマグルチニン（PHA）のような分裂促進性レクチンのような化学物質が、T細胞のための活性化シグナルを作製するために使用され得る。

非限定的な例として、T細胞集団は、例えば、表面に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片もしくは抗CD2抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼC活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、インビトロで刺激され得る。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のため、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の集団は、T細胞の増殖を刺激するために適切な条件の下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。T細胞培養のために適切な条件には、血清（例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト胎児血清）、インターロイキン2（IL-2）、インスリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、およびTNF-、または当業者に公知の細胞の増殖のためのその他の添加剤を含む、増殖および生存可能性のために必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 5（Lonza））が含まれる。細胞の増殖のためのその他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート（plasmanate）、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールのような還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加されており、無血清であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくはホルモンの定義されたセットおよび／もしくはT細胞の増殖および増大のために十分な量のサイトカインが補足されている、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、およびX-Vivo 20、Optimizerが含まれ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養にのみ含まれ、対象へ注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気＋5％C02）で維持される。様々な刺激時間に曝されたT細胞は、異なる特徴を示し得る。

別の具体的な態様において、細胞は、組織または細胞との共培養によって増大させることができる。細胞は、細胞を対象へ投与した後、インビボで、例えば、対象の血液中で増大させてもよい。

薬学的組成物
本明細書では、本発明の遺伝子操作された免疫細胞、例えばSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160に対応する配列を有する遺伝子操作されたTCR KO-dCK KO CD123 CAR T細胞を含む薬学的組成物が提供される。

本明細書では、本発明の遺伝子操作された免疫細胞、例えばSEQ ID NO：188〜SEQ ID NO：197から選択される配列のいずれか1つに対応する配列を有する遺伝子操作されたTCR KO-dCK KO CD123 CAR T細胞を含む薬学的組成物が提供される。

別の一態様では、本発明の遺伝子操作された免疫T細胞、例えば遺伝子操作されたTCR KO dCK KO、SEQ ID NO：34〜SEQ ID NO：159、好ましくはSEQ ID NO：34、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：78; SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：8）、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、およびSEQ ID NO：97から選択される配列のいずれか1つを有するCD123 CAR、T細胞を含む薬学的組成物が提供される。

本開示によれば、「薬学的組成物」という用語は、個体に投与するための組成物に関する。好ましい一態様において、薬学的組成物は、非経口、経皮、管腔内、動脈内、髄腔内、または静脈内（iv）投与用の組成物、またはがんへの直接注射用の組成物を含む。特に、薬学的組成物は、iv注入またはiv注射によって個体に投与されることが想定される。適切な組成物の投与は、さまざまな方法によって、例えば静脈内（iv）、皮下、腹腔内、筋肉内、局所または皮内投与によって、達成することができる。

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含みうる。適切な薬学的担体の例は当技術分野において周知であり、リン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルション、例えば油/水エマルション、さまざまなタイプの湿潤剤、滅菌溶液などを含む。そのような単体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化することができる。これらの薬学的組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。

投薬レジメンは担当医および臨床的因子によって決定されるであろう。医学分野では周知のとおり、どの患者への投薬量も、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与されるその化合物、性別、投与時期および投与経路、全身の健康状態、および同時に投与される他の薬物などといった多くの因子に依存する。投与される投薬量の一例は、体重1キログラムあたり、1日あたり、0.24μg〜48mg、好ましくは0.24μg〜24mg、より好ましくは0.24μg〜2.4mg、さらに好ましくは0.24μg〜1.2mg、最も好ましくは0.24μg〜240mgユニットの範囲の本発明の細胞である。特に好ましい投薬量は本明細書において後述する。進行は定期的評定によってモニターすることができる。

本開示のCAR細胞組成物は、局所的に、または全身性に、投与することができる。投与は一般的には非経口投与、例えば静脈内投与であるだろう。DNAは標的部位に直接、例えば内部標的部位または外部標的部位へのバイオリスティック送達によって、または動脈内の部位にカテーテルによって、投与することもできる。好ましい一態様において、薬学的組成物は皮下投与され、さらに好ましい一態様では静脈内投与される。非経口投与用の調製物には、滅菌水溶液または滅菌非水溶液、懸濁液、およびエマルションが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、水、アルコール/水溶液、エマルションまたは懸濁液、食塩水および緩衝媒質が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または固定油が含まれる。静脈内用媒体には、水分栄養補充液、電解質補充液（例えばリンゲルデキストロースに基づくもの）などが含まれる。保存剤および他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在しうる。加えて、本開示の薬学的組成物は、例えば血清アルブミンまたは免疫グロブリン、好ましくはヒト起源のもののような、タンパク質性担体を含みうる。本開示の薬学的組成物は、タンパク質性二重特異性単鎖抗体コンストラクトまたはそれをコードする核酸分子もしくはベクター（本開示に記載するもの）に加えて、その薬学的組成物の使用目的に依存して、さらなる生物学的活性剤を含みうると考察される。

本明細書に記載する組成物はいずれも、キットに含まれうる。非限定的な一例では、細胞療法において使用するための本発明の1つまたは複数の細胞、および/または組換え発現ベクターを内包する、細胞療法において使用するための1つまたは複数の細胞を生成させるための試薬類が、キットに含まれうる。キットコンポーネントは適切な容器手段に入れて提供される。

キットの一部のコンポーネントは、水性媒質に入れて梱包されるか、凍結乾燥物の形態で梱包されるか、凍結状態で梱包されうる。キットの容器手段は、一般的には、コンポーネントを入れることができ、好ましくは適切に小分けすることができる、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含むであろう。キットに2つ以上のコンポーネントが存在する場合、そのキットは、一般的には、当該追加コンポーネントを別々に入れることができる第2、第3、または他の追加容器も含有するであろう。しかし、コンポーネントのさまざまな組み合わせを1本のバイアルに含めてもよい。キットは、典型的には、市販用に密封された、コンポーネントを収容するための手段も含むであろう。そのような容器には、所望のバイアルが保持される射出成形または吹き込み成形プラスチック容器を含めることができる。

キットのコンポーネントが1つおよび/または複数の溶液として提供される場合、その溶液は水溶液であり、滅菌水溶液は特に有用である。一部の例において、容器は、それ自体が、そこから身体の感染部に適用すること、動物に注射すること、および/またはキットの他のコンポーネントと混合することができる、シリンジ、ピペット、および/または類似する他の装置を意味しうる。

好ましい一態様において、1つおよび/または複数の溶液は低温耐性（cryoresistant）である。

しかし、キットのコンポーネントまたはその一部は、乾燥した粉末または錠剤として提供することもできる。試薬および/またはコンポーネントが乾燥粉末として提供される場合、適切な溶媒の添加によってその粉末を再構成することができる。溶媒も別の容器手段に入れて提供することができると想定される。キットは、滅菌された薬学的に許容される緩衝液および/または他の希釈剤を入れるための第2の容器手段も含みうる。

特定の態様では、細胞療法に使用される細胞がキットに入れて提供され、一部の例では、細胞がキットの本質的に唯一のコンポーネントである。キットは、所望の細胞を作るための試薬および材料を含みうる。特別な態様では、試薬および材料が、所望の配列を増幅するためのプライマー、ヌクレオチド、適切な緩衝液または緩衝液試薬、塩などを含み、一部の例では、試薬は、本明細書において記載するCAR分子および/またはそのための調節要素をコードするベクターおよび/またはDNAを含む。

特定の態様では、個体から1つまたは複数の試料を抽出するのに適した1つまたは複数の装置がキットに含まれる。この装置は、シリンジ、メスなどでありうる。

一部の例において、キットは、細胞療法態様に加えて、例えば化学療法、ホルモン療法、および/または免疫療法などといった第2のがん療法も含む。キットは、ある個体のために特定のがんに適合させ、その個体のためのそれぞれの第2がん療法を含むことができる。好ましくは、該他のがん療法はプリン類似体、FLAG処置である。

本発明のCD123 CARを含む操作されたT細胞の治療的使用
さまざまな態様において、ここで考えられるCARコンストラクト、核酸配列、ベクター、宿主細胞、および/またはそれらを含む薬学的組成物は、腫瘍性疾患などのがん性疾患の防止、処置または改善のために使用される。特定の態様において、本開示の薬学的組成物は、例えば固形腫瘍を有するがんを含むがんの防止、改善および/または処置において、特に役立ちうる。

特定の態様では、治療有効量の、複数の、本開示の細胞のいずれかを、個体に投与する工程を含む、個体をがんについて処置する方法が、ここに提供される。

一定の局面において、がんは固形腫瘍であり、腫瘍は任意のサイズであってよいが、具体的態様では、固形腫瘍が直径約2mm以上である。一定の局面において、本方法はさらに、治療有効量の追加がん療法を個体に与える工程を含む。

本明細書にいう「処置」または「処置する」は、ある疾患または病理学的状態の症状または病理に対する任意の有益なまたは望ましい効果を含み、処置される疾患または状態、例えばがんの、1つまたは複数の測定可能なマーカーの最小限の低減をも含みうる。処置は、任意で、疾患または状態の症状の低減または改善、疾患または状態の進行の遅延を伴うことができる。「処置」は疾患もしくは状態またはその関連症状の完全な根絶または治癒を必ずしも示さない。

本明細書において使用する「防止する」および類似の単語、例えば「防止された」、「防止すること」などは、疾患または状態、例えばがんの発生または再発の見込みを防止し、阻害し、または低減するためのアプローチを示す。また、この用語は、疾患または状態の発症または再発を遅延させ、または疾患もしくは状態の症状の発生または再発を遅延させることもいう。本明細書において使用する「防止」および類似の単語は、疾患または状態の発症または再発前に、疾患または状態の強さ、効果、症状および/または負荷を低減することも包含する。

特定の態様において、本発明では、部分的に、標準的なベクターおよび/または遺伝子送達システムを使って、単独で、または任意の組み合わせで、また、少なくとも一部の局面では、薬学的に許容される担体または賦形剤と一緒に、投与することができる細胞、CARコンストラクト、核酸分子およびベクターが考えられる。一定の態様では、投与に続いて、該核酸分子またはベクターが、対象のゲノム中に安定に組み込まれうる。

特別な態様では、一定の細胞または組織に特異的であって該細胞中で残留するウイルスベクターを使用することができる。適切な薬学的担体および賦形剤は、当技術分野において周知である。本開示に従って調製される組成物は、上に特定した疾患の防止もしくは処置または遅延に使用することができる。

さらにまた、本開示は、腫瘍性疾患を防止、処置または改善するための方法であって、その必要がある対象または個体に、有効量の、本明細書に記載の、および/または本明細書に記載のプロセスによって作成される、SEQ ID NO：31のCD123 CAR、またはSEQ ID NO：32のCD123 CAR、またはSEQ ID NO：160のCD123 CAR、それをコードする核酸配列、前記CD123 CARをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを内包する免疫細胞、例えばT細胞または細胞傷害性Tリンパ球を投与する工程を含む方法に関する。

例示的CD 123 CAR細胞の組成物に関して考えられる適応症は、腫瘍性疾患を含むがん性疾患である。

本開示の組成物の投与は、あらゆるステージおよびタイプのリンパ増殖性障害に、例えば微少残存病変、早期がん、進行がん、ならびに/または再発性および/もしくは難治性がんに、有用である。

本開示はさらに、他の化合物、例えば二重特異性抗体コンストラクト、標的毒素、または免疫細胞を介して作用する他の化合物との共投与プロトコールを包含する。

本発明化合物の共投与のための臨床レジメンは、他のコンポーネントの投与と同時、その投与前またはその投与後の共投与を包含しうる。特定の併用療法は、化学療法、放射線、外科手術、ホルモン療法、または他のタイプの免疫療法を含む。

治療のための特定用量は、当技術分野における常法を使って決定しうる。しかし、特別な態様では、本発明の操作されたCD 123T細胞が、それを必要とする個体に1回送達される。ただし、一部の例では、送達は複数回、例えば2、3、4、5、6回、またはそれ以上である。複数回の投与が行われる場合、投与間の時間感覚は、任意の適切な時間であってよいが、特別な態様では、投与間が数日または数週間または数ヶ月である。用量およびT細胞ドナーの起源は、望ましくない副作用が回避されるように選択される。投与間の時間は単一レジメン中で変動する場合があり、レシピエント（それを必要とする患者）に依存しうる。特定の態様において、投与間の時間は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の日数または週数である。特別な例では、例えば4〜8週間または6〜8週間である。

特別な態様において、あるレジメンは、本発明のCD123 T細胞の以下の用量レジメンのうちの1つを含む:
11×10⁴/m²、
11×10⁵/m²、
11×10⁶/m²、
23×10⁶/m²、
31×10⁷/m² 43×10⁷/m²、
51×10⁸/m²、
または10⁴〜10¹⁰細胞/kg。

代替的一態様において、T細胞は以下の用量レジメンで個体に与えられる:
用量レベルCD123 CTL用量
11×10⁶/m²、
21×10⁷/m²、
31×10⁸/m²、
6 10⁴〜5.10⁸細胞/kg。

本発明の操作されたCD123 CAR免疫細胞の効率的な量は、各被処置個体の状態に依存して適合させうるような量に対応する。

治療的応用
別の一態様において、さまざまな方法によって得られる単離された細胞、または本発明の単離された細胞から（1〜50回のインビトロ継代後に）誘導される細胞は、医薬として使用することができる。概して、医薬として使用することができる本発明の操作されたTCR KO dCK KO CD123 CAR T細胞は、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：34〜SEQ ID NO：159のいずれか1つに対応する配列を有するCD123 CARを有するものであってよい。

好ましい一態様では、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160に対応する配列を有する遺伝子操作されたTCR KO dCK KO CD123 CAR T細胞が、医薬として使用するために提供される。

別の好ましい一態様では、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：8）、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97から選択される配列のいずれか1つを有する遺伝子操作されたTCR KO dCK KO CD123 CAR T細胞が、医薬として使用するために提供される。

別の好ましい一態様では、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191; SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197から選択される配列のいずれか1つを有する遺伝子操作されたTCR KO dCK KO CD123 CAR T細胞が、医薬として使用するために提供される。

別の一態様において、該医薬は、がんを処置するために、特にB細胞性リンパ腫および白血病の処置のために、それを必要とする患者において使用することができる。

別の一態様において、本発明の単離された細胞または該単離された細胞から誘導される細胞株は、がんの処置を必要とする患者におけるがんを処置するための、医薬の製造において使用することができる。

特定の一態様では、抗CD123 CAR発現T細胞が、AML、AMLサブタイプ、AML関連合併症、およびAML関連状態を処置するための医薬として提供される。好ましい一態様では、抗CD123 CARがSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160を含む、抗CD123 CAR発現T細胞が、医薬として提供される。

別の一態様において、該医薬は、CD123発現細胞が媒介する病理学的状態またはCD123発現細胞の直接的または間接的活性を特徴とする状態を処置するために使用することができる。換言すると、本発明は、CD123発現細胞の有害な活性に関連づけられる状態を処置するために、特にAML、AMLサブタイプ、AML関連合併症、およびAML関連状態から選択される状態を処置するために、医薬として使用するための、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の80％〜100％を含む抗CD123 CAR発現T細胞に関係する。

別の一局面において、本発明は、処置を必要とする患者を処置するための方法であって、以下の工程のうちの少なくとも1つを含む方法に依拠する:
（a）前述の方法のいずれか1つによって得ることができる免疫細胞を用意する工程、
（b）該形質転換された免疫細胞を該患者に投与する工程。

ある態様において、本発明のT細胞は、頑強なインビボT細胞増加を起こすことができ、長期間にわたって残留することができる。

好ましい一態様では、該T細胞を選択的に壊滅する薬物または抗体の投与によって、該T細胞を壊滅する。

より好ましい一態様において、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：34〜SEQ ID NO：159のいずれか1つに対応する配列を有するCD123 CARを有する本発明の遺伝子操作されたTCR KO dCK KO CD123 CAR T細胞は、処置のために医薬として使用された後、自殺ドメインRQR8またはCD20ドメインまたはSEQ ID NO：161を認識する抗体を使って、好ましくはリツキシマブを使って、患者から取り除かれる。

該処置は、改善的処置、治療的処置、または予防的処置であってよい。これは、自家免疫療法処置の一部または同種異系免疫療法処置の一部のどちらかでありうる。自家とは、患者の処置に使用される細胞、細胞株または細胞集団が、当該患者またはヒト白血球抗原（HLA）適合ドナーに起源を有することを意味する。同種異系とは、患者の処置に使用される細胞または細胞集団が、当該患者に起源を有するのではなく、ドナーに起源を有することを意味する。

開示の方法で使用することができる本発明の細胞については、先のセクションにおいて述べた。該処置は、CD123発現細胞を特徴とする、特にCD123発現細胞の過剰を特徴とする、前悪性がん状態または悪性がん状態と診断された患者を処置するために使用することができる。そのような状態は、白血病などの血液がんまたは悪性リンパ増殖性障害に見いだされる。リンパ増殖性障害は、リンパ腫、特に多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）であってよい。

本発明の細胞または該細胞を含む薬学的組成物を使って処置しうるがんは、非固形腫瘍（血液腫瘍など、例えば限定するわけではないが、プレB ALL（小児適応症）、成人ALL、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、BPDNL、AML、難治性再発AML、または骨髄移植前を含みうる。

本発明のCARを発現するCD123細胞で処置されるがんのタイプには、白血病またはリンパ系悪性疾患が含まれるが、それらに限定されるわけではない。成人腫瘍/がんおよび小児腫瘍/がんも含まれる。

一態様において、本発明は、本発明の抗CD123 CAR発現T細胞を含む薬学的組成物を、CD123発現細胞が媒介する疾患、特にCD123発現細胞が媒介する血液がんの処置におけるその使用のために提供し、好ましくは、該抗CD123 CARはSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160を有し、より好ましくはSEQ ID NO：160、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191; SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197から選択される配列を有する。本明細書に開示する、CD123が媒介するまたはCD123が関与する、他の任意の悪性リンパ増殖性障害は、本発明の抗CD123 CAR発現細胞で、改善されうる。

好ましい一態様において、本発明の抗CD123 CAR発現細胞を使って処置しうるがんは、白血病（AML）、白血病に関連する疾患、またはその合併症である。

本発明の抗CD123 CAR発現細胞を使って処置することのできる白血病は、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群（melodysplastic syndrome）、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群であってよい。

本発明の抗CD123 CAR発現細胞を使って処置しうるAMLまたはAMLサブタイプは、CD123陽性細胞が関与するかどうかを問わず、特に、急性骨髄芽球性白血病、最未分化型急性骨髄芽球性白血病、未分化型急性骨髄芽球性白血病、分化型急性骨髄芽球性白血病、前骨髄球性または急性前骨髄球性白血病（APL）、急性骨髄性単球性白血病、骨髄好酸球増加を伴う骨髄単球性、急性単芽球性白血病（M5a）または急性単球性白血病（M5b）、赤白血病（M6a）および極めて稀な未分化型赤白血病（M6b）を含む急性赤白血病、急性巨核芽球性白血病、急性好塩基球性白血病、骨髄線維症を伴う急性汎骨髄症でありうる。

本発明の抗CD123 CAR発現細胞を使って処置しうるAMLのサブタイプには、ヘアリー細胞白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病も含まれる。

AMLは、特異的遺伝子異常を伴うAMLとして分類することができる。分類は、導入療法に対する応答、再発リスク、生存率を予測する核型の能力に基づく。

したがって、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の本発明の抗CD123 CAR発現細胞を使って処置しうるAMLは、染色体8と染色体21の間の転座を伴うAML、染色体16における転座または逆位を伴うAML、染色体9と染色体11の間の転座を伴うAML、染色体15と染色体17の間の転座を伴うAPL（M3）、染色体6と染色体9の間の転座を伴うAML、染色体3における転座または逆位を伴うAML、染色体1と染色体22の間の転座を伴うAML（巨核芽球性）でありうる。

本発明は、これらの特定の細胞遺伝学的マーカーと関連するAMLの処置に、とりわけ有用である。

本発明は、AMLの特異的細胞遺伝学的サブセットを持つ患者、例えば全トランス型レチノイン酸（ATRA）16-19を使って同定されるt（15;17）（q22;q21）を持つ患者を処置するための、および高用量シタラビンの反復投与を使って同定されるt（8;21）（q22;q22）またはinv（16）（p13q22）/t（16;16）（p13;q22）を持つ患者を処置するための、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CAR発現T細胞も提供する。

好ましくは、本発明は、完全寛解率および生存率が低いことが示されている、-5/del（5q）、-7、3qの異常、または複合的核型（complex karyotype）などといった異形を持つ患者を、FLAGと組み合わせて処置するための、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CAR発現T細胞を提供する。

患者群
好ましい一態様において、本発明は、60歳超の患者または20歳未満の患者におけるAMLの処置として、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CAR発現T細胞を提供する。

より好ましい一態様において、本発明は、小児科処置として使用するための、特にAML、またはAML関連疾患もしくは合併症に対する小児科処置として使用するための、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CAR発現T細胞を提供する。

さらに別の好ましい態様において、本発明は、状況がよくない、不良な、または好ましくないAML患者、つまり五年生存率未満の予測生存期間を持つ患者における処置として使用される。この群では、以下の細胞遺伝学的特徴:-5; 5q;-7; 7q-;11q23; non t（9;11）; inv（3）; t（3;3）; t（6;9）; t（9;22）を持つAMLを患っている患者が、予後不良状況（poor risk status）に関連し（Byrd J.C. et al., December 15, 2002; Blood: 100（13）、本発明にしたがって処置されること、または本発明の対象で処置されることが、とりわけ考えられる。

一態様において、本発明の抗CD123 CAR発現T細胞は、導入療法として、またはAMLの寛解後療法として、またはAML患者における強化療法として使用することができる。好ましくは、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するTRC KO細胞またはTCR KOおよびdck KO T細胞は、AMLの寛解後療法として、またはAML患者における強化療法として使用される。

一態様において、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現する本発明のTCR KO, dck KO T細胞は、AML再発症例、または難治性もしくは抵抗性AMLの症例において使用することができる。好ましくは、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の本発明のCD123 CARを発現する本発明のTCR KO T dck KO T細胞は、AML再発患者または難治性もしくは抵抗性AMLを持つ患者において、より好ましくは少なくとも1つの他の抗がん薬と組み合わせて使用される。

別の好ましい一態様において、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現する本発明のTCR KO, dck KO T細胞は、特に抗がん処置後、骨髄枯渇中、または骨髄移植前、骨髄破壊後に起こる、がん細胞の発生を防止するために使用される。

AML合併症
一特定態様において、本発明は、患者の、特にAMLに関係する合併症を起こしている患者の、健康状態を改良する医薬を提供する。より好ましくは、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するTCR KO, dck KO T細胞は、AMLに関係する合併症を処置するための医薬として、好ましくはFLAGと共に使用される。

AMLに関係する合併症または疾患は、先行する骨髄異形成相、続発性白血病、特に続発性AML、高い白血球数、およびアウエル小体の非存在を含みうる。なかんずく、白血球停滞および中枢神経系（CNS）の関与、白血球増加症、残存病変も、AMLに関係する合併症または疾患とみなされる。

AML関連疾患
一態様において、本発明は、AMLに関係する病理学的状態を処置するための、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するTCR KO, dck KO T細胞も提供する。好ましくは、本発明は、AMLに関係する病理学的状態を処置するための、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するTCR KO, dck KO T細胞を提供する。

本発明は、AML関連骨髄性新生物、急性骨髄性白血病および骨髄異形成症候群の治療法（好ましくはSEQ ID NO：160、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191; SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193,SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197から選択される配列を有する、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160の抗CD123 CARを発現するTCR KO, dck KO T細胞）、再発性または難治性急性骨髄性白血病の処置、成人における再発性または難治性急性前骨髄球性白血病の処置、急性前骨髄性白血病（acute promyeloid leukaemia）の処置、60歳超の成人における急性骨髄性白血病の処置を提供する。

別の局面によると、本発明は、AML関連疾患、具体的には、AMLに関係する血液悪性疾患の処置のための組成物を提供する。

AML状態に関係する血液悪性疾患には、無効な骨髄系血液細胞の産生（または異形成）、およびAMへの形質転換のリスクと合併した血液状態の多様なコレクションである骨髄異形成症候群（MDS、以前は「前白血病」として公知であった）が含まれる。

別の態様において、本発明は、多発性骨髄腫に罹患している患者の健康状態を改善する医薬を提供する。

AMLのリスクに関連した他の病理学的状態または遺伝的症候群も、本発明の適切な使用によって改善され得、それらの遺伝的症候群には、ダウン症、トリソミー、ファンコニー貧血、ブルーム症候群、毛細血管拡張性運動失調、ダイヤモンド・ブラックファン貧血、シュワックマン・ダイヤモンド症候群、リー・フラウメニ症候群、1型神経繊維腫症、重度先天性好中球減少症（コストマン症候群とも呼ばれる）が含まれる。

他のCD123によって媒介される病理学的状態
別の局面によると、本発明は、CD123+細胞によって媒介される疾患の処置のための組成物を提供する。これらのCD123+細胞によって媒介される疾患には、炎症、自己免疫疾患が含まれる。

具体的には、本発明は、胃腸粘膜の炎症、より具体的には、炎症性腸疾患、鼻アレルギー、若年性皮膚筋炎のような皮膚の炎症、血液皮膚疾患（hematodermia）のようなCD123+細胞によって媒介される疾患の処置のために使用され得る。

本発明は、自己免疫疾患、具体的には、キクシ（Kikushi）病のような、CD123+細胞によって媒介される疾患の処置のための医薬として使用され得る。

好ましくは、本発明は、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、具体的には、腫瘍ウイルス、HHV-8、HHV-6、HTLV、またはHIVのようなウイルスによる感染、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、または四日熱マラリア原虫による感染のような寄生虫感染を含む再発性感染の処置を提供する。

具体的には、本発明は、エプスタイン・バーウイルスリンパ節炎、単純ヘルペスウイルスリンパ節炎の処置を提供する。

別の局面において、本発明は、全身性エリテマトーデスリンパ節炎、結核、嚢胞性繊維症、肝炎、胆道閉鎖症、具体的には、子供におけるウイルスによって誘導された肝炎または胆道閉鎖症、自己免疫性肝炎；原発性胆汁性肝硬変の処置のための組成物を提供する。

医薬として使用するための本発明による操作されたT細胞を含む組成物および方法
本発明は、遺伝子操作された免疫TCR KO-dCK KO-SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：160に対応する配列を有するCD123 CAR T細胞を含む、またはSEQ ID NO：160、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191; SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193,SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197から選択される配列を賦与された、または遺伝子操作された免疫TCR KO-dCK KO SEQ ID NO：34〜SEQ ID NO：159から選択される、好ましくはSEQ ID NO：34、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：78; SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：79,SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：8）、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96およびSEQ ID NO：97から選択される配列のいずれか1つを有するCD123 CAR T細胞を含む組成物も提供する。

好ましくは、本発明は、遺伝子操作された免疫TCR KO-dCK KO-SEQ ID NO：31に対応する配列を有するCD123 CAR T細胞を含む組成物を提供する。

好ましくは、本発明は、遺伝子操作された免疫TCR KO-dCK KO-SEQ ID NO：32に対応する配列を有するCD123 CAR T細胞を含む組成物を提供する。

好ましくは、本発明は、遺伝子操作された免疫TCR KO-dCK KO-SEQ ID NO：160に対応する配列を有するCD123 CAR T細胞を含む組成物を提供する。

または、BPDNLなどのがんを処置するための方法におけるその使用、または骨髄移植前の処置としてのその使用のための、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191; SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197から選択される配列のいずれか一つ。一つの局面において、疾患は、血液癌、具体的には、幹細胞癌であり、（急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群のような）白血病、ならびに（多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに小細胞型および大細胞型の濾胞性リンパ腫のような）リンパ腫を含む悪性リンパ増殖性状態、またはそれらの合併症（難治性再発性のAML）を含むが、これらに限定されない。

本発明は、患者におけるCD123発現細胞集団の増殖を阻害するかもしくはその活性を低下させるために使用するための前記の組成物、またはその方法も提供する。例示的な方法は、CD123発現細胞を含む細胞の集団を、CD123発現細胞に結合する本発明のCD123 CART細胞と接触させる工程を含む。

より具体的な局面において、本発明は、患者におけるCD123を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害するかもしくはそれを低下させるために使用するための組成物、または本発明のCD123 CART細胞のCD123発現癌細胞との結合がCD123発現癌細胞の破壊をもたらすよう、CD123発現癌細胞集団をCD123発現細胞に結合する本発明のCD123 CART細胞と接触させる工程を含む、その方法を提供する。

ある種の局面において、本発明のCD123 CART細胞は、骨髄白血病またはCD123発現細胞に関連した別の癌を有する対象またはその動物モデルにおいて、細胞および／または癌細胞の含量、数、量、または率を、陰性対照と比べて、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも65％、少なくとも75％、少なくとも85％、少なくとも95％、または少なくとも99％（検出不可能なレベルにまで）低下させる。

本発明は、（例えば、血液癌に関連した）CD123発現細胞に関連した障害もしくは状態を防止し、処置し、かつ／もしくは管理するために使用するための組成物、またはCD123発現細胞に結合する本発明のCD123 CART細胞をその必要のある対象へ投与する工程を含む、その方法を提供する。一つの局面において、対象はヒトである。CD123発現細胞に関連した障害の非限定的な例には、（ループスのような）自己免疫障害、（アレルギー、IBD、および喘息のような）炎症性障害、ならびに（血液癌、具体的には、AMLまたはAML合併症のような）癌が含まれる。

本発明は、CD123発現細胞に関連した疾患を防止し、処置し、かつ／もしくは管理するために使用するための組成物、またはCD123発現細胞に結合する本発明のCD123 CART細胞をその必要のある対象へ投与する工程を含む、その方法も提供する。一つの局面において、対象はヒトである。CD123発現細胞に関連した疾患の非限定的な例には、急性骨髄白血病（AML）、骨髄異形成、B細胞急性リンパ性白血病、T細胞急性リンパ性白血病、毛様細胞性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（BPDCN）、慢性骨髄白血病、ホジキンリンパ腫が含まれる。

本発明は、CD123発現細胞に関連した癌の再発を処置するかもしくは防止するために使用するための組成物、またはCD123発現細胞に結合する本発明のCD123 CART細胞をその必要のある対象へ投与する工程を含む、その方法を提供する。別の局面において、本発明は、有効量の別の治療と組み合わせて、CD123発現細胞に結合する本発明のCD123 CART細胞を、有効量、その必要のある対象へ投与する工程を含む。

一つの局面において、CD123は、AMLにおける「癌幹細胞」マーカーであると考えられている。従って、本発明のCD123 CART細胞は、AMLの再発を防止することができるか、または大部分がCD123陰性であるがCD123+細胞（CD123発現細胞）の「幹」集団を含むAMLを処置することすらできる。

一つの局面において、本発明は、CD19の発現レベルの上昇に関連した疾患または障害のための処置を受けたことがあって、CD123のレベルの上昇に関連した疾患または障害を示す対象を処置するための組成物および方法を提供する。

一つの局面において、B細胞急性リンパ性白血病（ALL）は、CART細胞を使用した連続処置を必要とする疾患の例である。例えば、抗CD19 CAR T細胞による処置は、時に、CD19陰性再発をもたらす場合があり、それは本発明の抗CD123 CAR T細胞によって処置され得る。あるいは、本発明は、抗CD19 CARおよび抗CD123 CARを含むCART細胞を使用したB-ALLの二重ターゲティングを含む。

本発明による操作された免疫細胞による処置は、抗体治療、化学療法、サイトカイン治療、樹状細胞治療、遺伝子治療、ホルモン治療、レーザー光線治療、および放射線治療の群より選択される、癌に対する1種以上の治療と組み合わせられてもよい。

好ましくは、本発明による操作された免疫細胞による処置は、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（VP16）、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸の組み合わせ、メクロレタミン、プロカルバジン、クロラムブシル、およびそれらの組み合わせより選択される、癌に対する1種以上の治療と組み合わせて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）投与され得る。

本発明の好ましい態様によると、処置は、免疫抑制処置を受けている患者に施すことができる。実際、本発明は、好ましくは、そのような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化のため、少なくとも1種の免疫抑制剤に対して抵抗性にされた細胞または細胞の集団に依拠する。この局面において、免疫抑制処置は、患者における本発明によるT細胞の選択および増大を支援するべきである。

本発明による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口、輸液、植え込み、または移植を含む、便利な様式で実施され得る。本明細書に記載された組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者へ投与され得る。一つの態様において、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈注射によって投与される。

細胞または細胞の集団の投与は、これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む、体重1kg当たり10⁴〜10⁹個の細胞、好ましくは、体重1kg当たり10⁵〜10⁶個の細胞の投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の態様において、有効量の細胞が、単回投与される。別の態様において、有効量の細胞が、ある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断にあり、患者の臨床状態に依る。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の起源から入手され得る。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内にある。有効量とは、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存するであろう。

別の態様において、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。投与は、静脈内投与であり得る。投与は、腫瘍内への注射によって直接行われてもよい。

本発明のある種の態様において、細胞は、抗ウイルス治療、シドホビル、およびインターロイキン2、シタラビン（ARA-Cとしても公知）のような薬剤による処置、またはMS患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のためのその他の処置を含むが、これらに限定されない、多数の関連する処置モダリティと共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびFK506のような免疫抑制剤、抗体、またはCAMPATH、抗CD3抗体、もしくはその他の抗体治療のようなその他の免疫除去（immunoablative）剤、シトキシン（cytoxin）、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用されてもよい。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Henderson,Naya et al.1991；Liu,Albers et al.1992；Bierer,Hollander et al.1993）。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外部照射治療（XRT）、シクロホスファミドのような化学療法剤、またはOKT3もしくはCAMPATHのような抗体のいずれかを使用したT細胞除去治療と共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなB細胞除去治療の後に投与される。その場合、本発明のT細胞において発現されるCD123 CARは、それがリツキサンの前に投与されない限り、SEQ ID NO：160から構成されない。

例えば、一つの態様において、対象は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある種の態様において、移植の後、対象は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。付加的な態様において、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。

本発明のある種の態様において、抗CD123 CAR発現細胞は、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（VP16）、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸、メクロレタミン、プロカルバジン、クロラムブシル、およびそれらの組み合わせより選択される薬物と共に（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者へ投与される。これらの態様において、抗CD123 CAR発現細胞は、抗CD123 CAR発現細胞と共に投与される特定の薬物または薬物の組み合わせに対して耐性であり得る。

本発明の他の態様において、抗CD123 CAR発現細胞は、シタラビン、アントラサイクリン、6-チオグアニン、ヒドロキシ尿素、プレドニゾン、およびそれらの組み合わせより選択される薬物と共に患者へ投与される。

他の定義
他に特記されない限り、「1つの（a）」、「1つの（an）」、「その（the）」、および「少なくとも1」は、交換可能に使用され、1または複数を意味する。ポリペプチド配列内のアミノ酸残基は、1文字コードによって本明細書において表記され、例えば、QはGln、すなわちグルタミン残基を意味し、RはArg、すなわちアルギニン残基を意味し、DはAsp、すなわちアスパラギン酸残基を意味する。

アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への交換を意味し、例えば、ペプチド配列内のアルギニン残基のグルタミン残基への交換は、アミノ酸置換である。

ヌクレオチドは以下のように表記される：1文字コードがヌクレオシドの塩基を表記するために使用される：anはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドのため、rはgまたはa（プリンヌクレオチド）を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dはg、a、またはtを表し、vはg、a、またはcを表し、bはg、t、またはcを表し、hはa、t、またはcを表し、nはg、a、t、またはcを表す。

本明細書において使用されるように、「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）のようなヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片をさす。核酸分子は、（DNAおよびRNAのような）天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）、または両方の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾型ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾には、例えば、1つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基への交換が含まれ、または糖がエーテルもしくはエステルとして官能化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、アザ糖および炭素環式糖類似体のような立体的かつ電子的に類似した構造に交換されてもよい。塩基部分の修飾の例には、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、またはその他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結され得る。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。

キメラ抗原受容体（CAR）とは、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するため、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体に基づく特異性を、T細胞受容体を活性化する細胞内ドメインと組み合わせた分子を表す。CARは通常、細胞外単鎖抗体（scFvFc）がT細胞抗原受容体複合体ζ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合したもの（scFvFc:ζ）からなり、T細胞において発現された時に、モノクローナル抗体の特異性に基づき、抗原認識を向け直す能力を有している。本発明において使用されるCARの一例は、CD123抗原に対するCARであり、非限定的な例として、アミノ酸配列：SEQ ID NO:23〜48および160を含み得る。

「エンドヌクレアーゼ」という用語は、DNA分子またはRNA分子、好ましくは、DNA分子の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる野生型酵素またはバリアント酵素をさす。エンドヌクレアーゼは、その配列に関係なくDNA分子またはRNA分子を切断するのではなく、「標的配列」または「標的部位」とさらに呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列においてDNA分子またはRNA分子を認識し切断する。エンドヌクレアーゼは、典型的には、12塩基対（bp）より長い、より好ましくは、14〜55bpのポリヌクレオチド認識部位を有する時、レアカットエンドヌクレアーゼとして分類され得る。レアカットエンドヌクレアーゼは、定義された場所においてDNA二本鎖切断（DSB）を誘導することによって、HRを有意に増加させる（Perrin,Buckle et al.1993；Rouet,Smih et al.1994；Choulika,Perrin et al.1995；Pingoud and Silva 2007）。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ（Paques and Duchateau 2007）、操作したジンクフィンガードメインとFokIのような制限酵素の触媒ドメインとの融合に起因するキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）（Porteus and Carroll 2005）、 CRISPR系に由来するCas9エンドヌクレアーゼ（Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yang et al.2013）、または化学的エンドヌクレアーゼ（Eisenschmidt,Lanio et al.2005；Arimondo,Thomas et al.2006）であり得る。化学的エンドヌクレアーゼにおいては、化学的なまたはペプチド性の切断剤が、核酸のポリマーまたは特定の標的配列を認識する他のDNAのいずれかにコンジュゲートされ、それによって、切断活性を特定の配列へターゲティングする。化学的エンドヌクレアーゼには、特定のDNA配列に結合することが公知の、オルトフェナントロリン、DNA切断分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（TFO）のコンジュゲートのような合成ヌクレアーゼも包含される（Kalish and Glazer 2005）。そのような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による「エンドヌクレアーゼ」という用語に含まれる。

「TALEヌクレアーゼ」（TALEN）とは、典型的には、転写活性化因子様（Transcription Activator Like）エフェクター（TALE）に由来する核酸結合ドメイン、および核酸標的配列を切断する1つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質を表す。触媒ドメインは、好ましくは、ヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは、例えば、I-TevI、ColE7、NucA、Fok-Iのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。具体的な態様において、TALEドメインは、例えば、I-CreIおよびI-OnuIまたはそれらの機能的バリアントのようなメガヌクレアーゼに融合され得る。より好ましい態様において、ヌクレアーゼは単量体TALEヌクレアーゼである。単量体TALEヌクレアーゼとは、WO2012138927に記載された、操作されたTALリピートとI-TevIの触媒ドメインとの融合のような、特異的な認識および切断のために二量化を必要としないTALEヌクレアーゼである。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、複数の反復配列を含む、細菌種ザントモナス（Xanthomonas）由来のタンパク質であり、各リピートは、核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に対して特異的な2残基（RVD）を12位および13位に含む。類似したモジュラー塩基対塩基核酸結合（modular base-per-base nucleic acid binding）特性を有する結合ドメイン（MBBBD）も、異なる細菌種において出願人によって最近発見された新しいモジュラータンパク質に由来し得る。新しいモジュラータンパク質は、TALリピートより多くの配列可変性を示すという利点を有する。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連したRVDは、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNN、A、C、G、またはTを認識するためのNS、Tを認識するためのHG、Tを認識するためのIG、Gを認識するためのNK、Cを認識するためのHA、Cを認識するためのND、Cを認識するためのHI、Gを認識するためのHN、Gを認識するためのNA、GまたはAを認識するためのSN、Tを認識するためのYG、Aを認識するためのTL、AまたはGを認識するためのVT、およびAを認識するためのSWである。別の態様において、重要なアミノ酸12および13は、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対する特異性をモジュレートするため、具体的には、この特異性を増強するため、他のアミノ酸残基に変異させてもよい。TALEヌクレアーゼは、既に記載され、遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変を刺激するために使用されている（Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010；Li,Huang et al.2011）。操作されたTALヌクレアーゼは、商標TALEN（商標）の下で市販されている（Cellectis,8 rue de la Croix Jarry,75013 Paris,France）。

本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼは、Cas9エンドヌクレアーゼでもあり得る。最近、II型原核生物CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats）適応免疫系（概説については（Sorek,Lawrence et al.2013）を参照されたい）から、RNAガイド（RNA-guided）Cas9ヌクレアーゼ（Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yang et al.2013）に基づき、新しいゲノム操作ツールが開発された。CRISPR関連（Cas）系は、細菌において最初に発見され、外来DNA、ウイルスまたはプラスミドに対する防御として機能する。CRISPRによって媒介されるゲノム操作は、まず、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる短い配列モチーフがしばしば隣接している標的配列の選択によって進行する。標的配列選択の後、この標的配列に相補的な特異的なcrRNAが操作される。CRISPR II型系において必要とされるトランス活性化crRNA（tracrRNA）は、crRNAと対合し、供給されたCas9タンパク質へ結合する。Cas9は、tracRNAのcRNAとの塩基対合を容易にする分子アンカーとして作用する（Deltcheva,Chylinski et al.2011）。この三元複合体において、二重tracrRNA:crRNA構造は、同族標的配列にエンドヌクレアーゼCas9を差し向けるガイドRNAとして作用する。Cas9-tracrRNA:crRNA複合体による標的認識は、標的配列とcrRNAとの間の相同性について標的配列を走査することによって開始される。標的配列-crRNA相補性に加えて、DNAターゲティングは、プロトスペーサーに隣接した短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ−PAM）の存在を必要とする。その後、二重RNAと標的配列との間の対合に続き、Cas9が、PAMモチーフの3塩基上流に平滑末端二本鎖切断を導入する（Garneau,Dupuis et al.2010）。

レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称でも公知のホーミングエンドヌクレアーゼであってもよい。そのようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当技術分野において周知である（Stoddard 2005）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、DNA標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖の切断を生成する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、12〜45塩基対（bp）長、通常14〜40bp長の範囲のDNA標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ、またはGIY-YIGエンドヌクレアーゼに相当し得る。本発明による好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、I-CreIバリアントであり得る。

「送達ベクター」とは、本発明において必要とされる薬剤／化学物質および分子（タンパク質または核酸）を、細胞と接触させるため（即ち、「接触」）、または細胞もしくは細胞内区画へ送達するため（即ち、「導入」）、本発明において使用され得る送達ベクターを表す。それには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学的担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、微小気泡（超音波造影剤）、ナノ粒子、乳濁液、またはその他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されない。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、高分子（遺伝子、タンパク質）、またはプラスミド、Diatosによって開発されたペプチドのようなその他のベクターの送達を可能にする。これらのケースにおいて、送達ベクターは分子担体である。「送達ベクター」とは、トランスフェクションを実施するための送達方法も表す。

「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子をさす。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなり得る直鎖状もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、これらに限定されない。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律複製が可能なもの（エピソームベクター）および／または発現が可能なもの（発現ベクター）である。多数の適当なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。

ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）のようなマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる（Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996）。

「レンチウイルスベクター」とは、比較的大きいパッケージング能力、低下した免疫原性、および広範囲の異なる細胞型を高い効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達のために極めて有望である、HIVに基づくレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは通常、3種（パッケージング、エンベロープ、および移入）またはそれ以上のプラスミドを産生細胞に一過性トランスフェクションした後、生成される。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用を通して標的細胞に侵入する。侵入後、ウイルスRNAが、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、感染細胞のDNAへのウイルス組み込みのための基質となる二本鎖の直鎖状ウイルスDNAである。「組込みレンチウイルスベクター（またはLV）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るそのようなベクターを意味する。反対に、「非組込みレンチウイルスベクター（またはNILV）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用を通して標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。

送達ベクターおよびベクターは、ソノポレーション（sonoporation）もしくは電気穿孔のような細胞透過処理技術、またはこれらの技術の変法と関連しているかまたは組み合わせられていてよい。

細胞とは、真核生物の生存細胞、初代細胞、およびインビトロ培養のためのこれらの生物に由来する細胞株を表す。

「初代細胞」とは、集団倍化をほとんど受けておらず、従って、腫瘍形成性の連続細胞株または人為的に不死化された細胞株と比較して、それが由来した組織の主な機能的成分および特徴をよりよく表している、生存組織（即ち、生検材料）から直接採取され、インビトロでの増殖のために確立された細胞を表す。

非限定的な例として、細胞株は、CHO-K1細胞；HEK293細胞；Caco2細胞；U2-OS 細胞；NIH 3T3細胞；NSO細胞；SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞；K-562細胞、U-937細胞；MRC5細胞；IMR90細胞；ジャーカット細胞；HepG2細胞；HeLa細胞；HT-1080細胞；HCT-116細胞；Hu-h7細胞；Huvec細胞；Molt 4細胞からなる群より選択される。

これらの細胞株は、全て、関心対象の遺伝子またはタンパク質を作製し、発現させ、定量化し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するため、本発明の方法によって改変され得；これらのモデルは、研究および作製、ならびに非限定的な例としての化学物質、生物燃料、治療薬、および農学のような様々な領域において、関心対象の生理活性分子をスクリーニングするためにも使用され得る。

「変異」とは、ポリヌクレオチド（cDNA、遺伝子）またはポリペプチドの配列における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、またはそれ以上までのヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を表す。変異は、遺伝子のコード配列またはその制御配列に影響を与える場合がある。また、ゲノム配列の構造またはコードされたmRNAの構造／安定性に影響を与える場合もある。

「バリアント」とは、親分子のアミノ酸配列における少なくとも1個の残基の変異または交換によって入手されたリピートバリアント、バリアント、DNA結合バリアント、TALEヌクレアーゼバリアント、ポリペプチドバリアントを表す。

「機能的バリアント」とは、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性変異体を表し；そのような変異体は、その親のタンパク質またはタンパク質ドメインと比較して、同一の活性、または付加的な特性、またはより高いかもしくはより低い活性を有し得る。

「同一性」とは、2種の核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性をさす。同一性は、比較の目的のために整列化され得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列のある位置が同一の塩基によって占有される時、それらの分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有している位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ（University of Wisconsin,Madison,Wis.）の一部として入手可能であるFASTAまたはBLASTを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、2種の配列の間の同一性を計算するために使用され得、例えば、デフォルト設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載された特定のポリペプチドとの少なくとも70％、85％、90％、95％、98％、または99％の同一性を有しており、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。

「類似性」とは、2種以上のポリペプチドのアミノ酸配列の間の関係を記載する。BLASTPも、BLOSUM45、BLOSUM62、またはBLOSUM80のような類似性マトリックスを使用して、参照アミノ酸配列との少なくとも70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％の配列類似性を有するアミノ酸配列を同定するために使用され得る。他に示されない限り、類似性スコアは、BLOSUM62の使用に基づくであろう。BLASTPが使用される時、パーセント類似性は、BLASTP陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、BLASTP同一性スコアに基づく。BLASTP「同一性」は、同一である高スコア配列対における全残基の数および画分を示し；BLASTP「陽性」は、アライメントスコアが正の値を有しており、相互に類似している残基の数および画分を示す。本明細書に開示されたアミノ酸配列との同一性もしくは類似性のこれらの程度または同一性もしくは類似性の中間の程度を有するアミノ酸配列が、本開示によって企図され包含される。類似したポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号を使用して推定され、従来の手段によって入手され得る。例えば、pTαの機能的バリアントは、SEQ ID NO：107のアミノ酸配列と70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％の配列類似性を有し得る。そのような機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、遺伝暗号を使用して、そのアミノ酸配列を逆翻訳することによって作製されるであろう。

「シグナル伝達ドメイン」または「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むがこれらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。

「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが、増殖のような、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。

「共刺激シグナル」とは、本明細書において使用されるように、TCR/CD3ライゲーションのような一次シグナルと組み合わせて、T細胞増殖および／または重要分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションをもたらすシグナルをさす。

「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するよう選択され得る。従って、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌、および寄生虫の感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連したものが含まれる。

「対象」または「患者」という用語には、本明細書において使用されるように、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界の全てのメンバーが含まれる。

「再発」という用語は、治療後、癌の寛解を有していた対象または哺乳動物が癌細胞の復帰を有する状況をさす。

「難治性または耐性」という用語は、対象または哺乳動物が、集中的な処置の後ですら、体内に残存癌細胞を有する環境をさす。

「薬剤耐性」という用語は、疾患が薬物の処置に応答しない状態をさす。薬剤耐性は、内因性（もしくは一次耐性）（疾患が薬物に全く応答性でないことを意味する）、または獲得型（二次耐性）（疾患が以前は応答した薬物に応答しなくなることを意味する）のいずれかであり得る。ある種の態様において、薬剤耐性は内因性である。ある種の態様において、薬剤耐性は獲得型である。

「血液悪性疾患」または「血液癌」という用語は、身体の血液-骨髄および／またはリンパ組織の癌をさす。血液悪性疾患の例には、例えば、急性リンパ球性白血病（ALL）、急性骨髄白血病（AML）、急性前骨髄球性白血病（APL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄白血病（CML）、慢性好中球性白血病（CNL）、急性未分化白血病（AUL）、未分化大細胞リンパ腫（ALCL）、前リンパ球性白血病（PML）、若年性骨髄単球性白血病（JMML）、成人T細胞ALL、三血球系骨髄異形成を伴うAML（AML/TMDS）、混合系統白血病（MLL）、骨髄異形成症候群（MDS）、骨髄増殖性障害（MPD）、および多発性骨髄腫（MM）のような、皮膚リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病（ホジキンリンパ腫とも呼ばれる）、および骨髄腫のような、骨髄異形成、白血病、リンパ腫が含まれる。

「白血病」という用語は、造血組織の悪性新生物をさし、慢性リンパ球性白血病または慢性リンパ性白血病、慢性骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄白血病または急性骨髄性白血病（AML）、および急性骨髄芽球性白血病を含むが、これらに限定されない。

初代細胞は概して、血液試料または生検から単離され、次に任意でさらにインビトロ培養された、細胞である。細胞株は、形質転換細胞（すなわちがん性細胞）の細胞培養物、好ましくは形質転換細胞（すなわちがん性細胞）の均質な細胞培養物である（ここではマーカーがガウス曲線によって表される）。

上記の本発明の説明は、当業者が本発明を作成し使用することが可能になるよう、本発明を作成し使用する様式および過程を提供するものであり、この可能性は、当初明細書の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題のために特に提供される。

本明細書において数的な限度または範囲が記述される場合、その終点が含まれる。数的な限度または範囲に含まれる全ての値および部分範囲も、明示的に記載されたかのごとく、具体的に含まれる。

上記の説明は、当業者が本発明を作成し使用することを可能にするために提示され、特定の適用およびその必要条件に関して提供される。好ましい態様に対する様々な改変は、当業者に容易に明白になり、本明細書において定義された一般原理は、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、他の態様および適用に適用され得る。従って、本発明は、示された態様に限定されず、本明細書に開示された原理および特色と一致する最も広い範囲を与えられるものとする。

本発明を全般的に説明したが、ある種の具体例を参照することによって、さらなる理解を得ることができる。それらの具体例は、例示目的のために本明細書に提供されるに過ぎず、他に特記されない限り、限定するためのものではない。

概略法
本発明のCD123 CAR T細胞は概して、さまざまなドナーからのバフィーコート試料から精製されたT細胞を使って調製された。本プロセスおよび本生成物は、適正製造規範（FDA 21 CFRおよびEU GMP）の要件を満たす。臨床アッセイ（clinical essay）は臨床試験実施基準（UK GCPまたはUSA GCP）Blood 2014; 124（21）:4689の下で行った。

前臨床試験
初代T細胞培養物
フィコール勾配密度媒体を使用して、EFS（Etablissement Francais du Sang,Paris,France）によって提供されたバフィーコート試料から、T細胞を精製した。PBMC層を回収し、T細胞を市販されているT細胞濃縮キットを使用して精製した。精製されたT細胞を、20ng/mLヒトIL-2、5％ヒト、およびビーズ:細胞比1:1のDynabeads Human T activator CD3/CD28（Life Technologies）が補足されたX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において活性化した。

CAR mRNAトランスフェクション
T細胞の精製および活性化の後、4日目または11日目に、トランスフェクションを行った。5百万個の細胞に、異なるCAR構築物をコードする15μgのmRNAをトランスフェクトした。最終体積200μlの「Cytoporation buffer T」（BTX Harvard Apparatus）において、0.4cmギャップキュベットにおいて、3000V/cmで0.1mSパルスを2回適用した後、325V/cmで0.2mSパルスを4回適用することによって、Cytopulseテクノロジーを使用して行われたT7 mRNAポリメラーゼトランスフェクションを使用して、CAR mRNAを作製した。細胞をX-Vivo（商標）-15培地で直ちに希釈し、5％CO₂と共に37℃でインキュベートした。IL-2を、20ng/mLで、電気穿孔の2時間後に添加した。

T細胞形質導入
CARを発現する組換えレンチウイルスベクターによるT細胞の形質導入は、T細胞精製/活性化の3日後に実行した。レンチウイルスベクターは、HEK-293細胞へのゲノムプラスミドおよびヘルパープラスミドのトランスフェクションにより、Vectalys SA（フランス国トゥールーズ）によって作成された。形質導入は、形質導入1回あたり10⁶個の細胞を使って、感染多重度5で実行した。T細胞表面におけるCAR検出は、ヒトCD123タンパク質の細胞外ドメインとマウスIgG1 Fcフラグメントとの融合物からなる組換えタンパク質（LakePharmaが作成したもの）を使って行った。CAR分子へのこのタンパク質の結合を、タンパク質のマウスFc部分を標的とするPEコンジュゲート二次抗体（Jackson Immunoresearch）で検出し、フローサイトメトリーで分析した。

脱顆粒アッセイ（CD107a動員）
96穴プレートにおいて、様々なレベルのCD123タンパク質を発現する等量の細胞と共に、T細胞をインキュベートした（40,000細胞/ウェル）。共培養を、5％CO₂で37℃で6時間、100μlの最終体積のX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において維持した。共培養の開始時に、1μg/mlの抗CD49d、1μg/mlの抗CD28、および1×モネンシン溶液と共に蛍光性抗CD107a抗体を添加することによって、細胞刺激中にCD107a染色を行った。6時間のインキュベーション期間の後、細胞を、固定可能な生死細胞判定色素および蛍光色素結合型抗CD8によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した。CD8+/CD107a+細胞の％として、そしてCD8+細胞におけるCD107a染色についての平均蛍光強度シグナル（MFI）を決定することによって、脱顆粒活性を決定した。脱顆粒アッセイは、mRNAトランスフェクションの24時間後に実施された。

IFNγ放出アッセイ
96穴プレートにおいて、様々なレベルのCD123タンパク質を発現する細胞株と共に、T細胞をインキュベートした（40,000細胞/ウェル）。共培養を、5％CO₂で37℃で24時間、100μlの最終体積のX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において維持した。このインキュベーション期間の後、プレートを5分間1500rpmで遠心分離し、上清を新しいプレートに回収した。細胞培養上清中のIFNγ検出をELISAアッセイによって行った。IFNγ放出アッセイは、mRNAトランスフェクションの24時間後に細胞共培養を始めることによって実施された。

細胞傷害アッセイ
96穴プレートにおいて、同一のウェルにおいて、10,000個の標的細胞（CD123発現）および10,000個の対照細胞（CD123陰性）と共に、T細胞をインキュベートした（100,000細胞/ウェル）。標的細胞および対照細胞は、CAR+T細胞との共培養の前に、蛍光性の細胞内色素（CFSEまたはCell Trace Violet）によって標識された。共培養物を5％CO₂で37℃で4時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、細胞を固定可能な生死細胞判定色素によって標識し、フローサイトメトリーによって分析した。各細胞集団（標的細胞またはCD123陰性対照細胞）の生存率を決定し、特異的細胞溶解の％を計算した。細胞傷害アッセイは、mRNAトランスフェクションの48時間後に実施された。

T細胞形質導入
CARの発現のための組換えレンチウイルスベクターによるT細胞の形質導入を、T細胞精製／活性化の3日後に実施した。T細胞の表面のCAR検出を、ヒトCD123タンパク質の細胞外ドメインのマウスIgG1 Fc断片との融合からなる組換えタンパク質を使用して行った。このタンパク質のCAR分子との結合を、タンパク質のマウスFc部分を標的とする蛍光色素結合型二次抗体によって検出し、フローサイトメトリーによって分析した。

抗腫瘍マウスモデル
AML異種移植片マウスモデルとして、免疫不全NOGマウスに、CD123発現MOLM13-ルシフェラーゼ細胞を静脈内（iv）注射した。任意で、マウスは、PNAまたはFLAGである抗癌処置を受容した。次いで、異なる用量の試験されるCAR+T細胞、またはCARレンチウイルスベクターによって形質導入されていないT細胞を、（腫瘍細胞株の注射の2日後または7日後のいずれかに）マウスにiv注射した。異なる動物における腫瘍進行を追跡するため、T細胞注射の当日（D0）、T細胞注射後7日目、14日目、21日目、28日目、および40日目に生物発光シグナルを決定した。

臨床試験
再発性/難治性急性骨髄性白血病（AML）、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、移植へのブリッジを有する患者において、CD123分子を標的とする人工的T細胞受容体（CAR）（CD123CAR）を発現するように遺伝子修飾された同種異系TCR KO特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の安全性および生物学的効力を評価するために、第I相用量漸増治験をデザインする。

各患者にドナー由来の遺伝子修飾CTLを少なくとも1回は与え、各患者を、形質導入されたCTLの毒性および検出ならびに疾患特異的マーカーについてモニターする。

以下はいずれも、医学的適応により、個別に変動しうる。

試験タイプ:介入
試験デザイン:
エンドポイントの種類:安全性/効力試験
介入モデル:単一群割り当て
マスキング:オープンラベル
主目的:処置

公式試験名:A Phase I Dose Escalation Trial Using In Vitro Expanded Allogeneic Cytotoxic T-Lymphocytes（CTLs）Genetically Targeted to the B-Cell Specific Antigen CD123 Positive Residual Or Relapsed Acute myeloid Leukemia, Blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm, during Bridge to transplant（移植へのブリッジ中の、B細胞特異的抗原CD123陽性残存または再発性急性骨髄性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物を標的とするように遺伝子改変されたインビトロ増加同種異系Tリンパ球（CTL）を用いた第I相用量漸増治験）
キーワード
急性骨髄性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、移植へのブリッジ

主要アウトカム評価項目:
AMLの残留または再発に対して、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物に対して、または移植へのブリッジにおいて与えられた、漸増する用量の、CD123分子を標的とする人工的T細胞受容体を発現するように修飾された同種異系特異的CTLの安全性/残留性を評価する。

副次アウトカム評価項目:
・養子移入されたCD123特異的T細胞がAMLの進行に及ぼす効果を評価すること。
・注入後、所定の間隔で、血中のCD123キメラ抗原受容体（CD123 CAR）陽性T細胞の数を定量することで、宿主におけるそれらの生存および増殖を決定すること。

リツキシマブ（375mg/m2）の注入後、所定の間隔で、血中のCD123キメラ抗原受容体（CD123 CAR）陽性T細胞の数を定量すること。

適格性
試験に適格な性別:両性
健常被験者の組入れ:なし

基準
組み入れ基準:
・骨髄再発または残留の証拠があるCD123+白血病の病歴
・少なくとも1週間を隔てた少なくとも2回の逐次試験で、残留する微小残存病変が、形態学的検査、FISH、フローサイトメトリーまたはRT-PCRによって証明されなければならない
・患者の年齢制限はない
・40以上のKPSスコアまたはLanskyスコア
・腎機能（移植前化学療法に先だって測定）
・肝機能（移植前化学療法に先だって測定）
・白血病関与（leukemic involvement）に続発する施設ULNの5倍以下のAST上昇は除外基準ではない。白血球関与は、過去一ヶ月内の骨髄または末梢血白血病芽球の増加および公知の肝毒性薬物治療（例えばアゾール類）の開始がないことによって定義される進行性再発の存在によって決定される
・総ビリルビン≦施設ULNの2.5倍
・登録の1ヶ月以内に行われるエコーもしくはMUGAまたは他の類似の心イメージングによる評価で、十分な心機能（例えばLVEF≧40％）
・肺機能（移植前化学療法に先だって測定）:
・酸素飽和度≧室内気で90％。

ドナー適格性
・ドナーは、第三者ドナーを含めて、全体として、成人の場合で合計約250mlに達し、小児ドナーからは1回の採血あたり5ml/kgを越えない、1回または複数回の静脈切開で得られる白血球アフェレーシスまたは全血献血に同意しなければならない。
・白血球アフェレーシスカテーテルの設置を必要とする18歳未満の血縁ドナーは、静脈切開によって収集される末梢血（体重が許すなら1単位の血液を含む）を献血し、白血球アフェレーシスのためのカテーテルの設置が最小リスクを上回ると医師にみなされた場合には、これを受けない。
・ドナーに年齢の上限はない。ただし、血縁ドナーの最低年齢は7歳である。これが、調査研究に参加することに同意する能力があるとみなしうる最も低い年齢だからである。
・審査用にドナーの高解像度HLAタイピングが利用可能でなければならない。
・献血の1週間以内のCBC。試験の結果は、献血または白血球アフェレーシスを受けるのを不可能にしない範囲内になければならない。
・現存のNMDPガイドラインおよびFACTガイドラインから採用された施設ガイドラインに従って伝染性疾患に関する血清検査が行われる。ドナーは、これらのガイドライン（すなわち献血ガイドライン）に基づいて白血球アフェレーシスまたは血液の供与に適格であるとみなされるべきである。

除外基準:
・活動性のHIV感染、B型肝炎感染またはC型肝炎感染を持つ患者。
・待機的観察以外の何らかの治療を必要とする悪性疾患によって定義される何らかの活動性悪性疾患を併発している患者。
・妊娠中の女性。
・ALLの単独骨髄外再発を有する患者は除外される。
・処置としてグルココルチコステロイド処置（＞0.5mg/kg/日プレドニゾンまたはその等価物）を必要とする活動性（グレード2〜4）急性移植片対宿主病（GVHD）、慢性GVHDまたは顕性自己免疫疾患（例えば溶血性貧血）を持つ患者。
・処置の28日以内に、脳脊髄液（CSF）中のリンパ芽球の明白な形態学的証拠によって定義される活動性中枢神経系（CNS）白血病、または症候性CNS白血病（すなわち脳神経麻痺または他の著しい神経機能障害）。予防的髄腔内薬物治療は除外の理由にはならない。
・以下の心臓病を持つ成人患者（≧18歳）は除外される:
・ニューヨーク心臓協会（NYHA）ステージIIIまたはIVうっ血性心不全
・登録前6ヶ月以内の心筋梗塞
・血管迷走神経性であるもの、または脱水によるものとは考えられない、臨床的に有意な不整脈歴または原因不明の失神歴
・EF≦20％の重症虚血性心筋症歴。

最初のデータは、本発明の操作されたT細胞が10⁷細胞/kgの用量で再発難治性AML患者にiv注入されて、少なくとも11ヶ月にわたってCD123発現がん性細胞を選択的に除去できることを証明する。

実施例1：CD123-CARを発現するTCRα不活性化細胞の増殖
T細胞受容体α定常鎖領域（TRAC）遺伝子内の15bpスペーサーによって分離された2個の17bp長配列（半標的と呼ばれる）を標的とする異種二量体TALEヌクレアーゼを設計し作製した。各半標的は、表10にリストされた半TALEヌクレアーゼのリピートによって認識される。

（表１０）TCRα遺伝子を標的とするTALヌクレアーゼ

各TALEヌクレアーゼ構築物を、T7プロモーターの調節下となるよう、制限酵素消化を使用して哺乳動物発現ベクターへサブクローニングした。TRACゲノム配列を切断するTALEヌクレアーゼをコードするmRNAを、T7プロモーターの下流にコード配列を保持しているプラスミドから合成した。

抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズによって72時間予め活性化された精製されたT細胞に、両方の半TRAC_T01 TALEヌクレアーゼをコードする2種のmRNAの各々をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、同一のドナーに由来するT細胞の異なる群に、以前に記載されたCD-123 CAR（SEQ ID NO:23〜48）のうちの1種をコードするレンチウイルスベクターによってそれぞれ形質導入した。形質導入の2日後、CD3陰性細胞を抗CD3磁気ビーズを使用して精製し、形質導入の5日後、細胞を可溶性抗CD28（5μg/ml）によって再活性化した。

週に2回、細胞を計数することによって、再活性化の30日後まで細胞増殖を追跡した。特に、抗CD28によって再活性化された時、非形質導入細胞と比較して、TCRα不活性化CD-123 CAR発現細胞の増殖の増加が観察された。

CD123-CAR発現ヒトT細胞が活性化状態を示すか否かを調査するため、活性化マーカーCD25の発現を、形質導入の7日後に、FACSによって分析する。CD-123 CARをコードするレンチウイルスベクターによって形質導入された精製された細胞を、非形質導入細胞と比較して、活性化を査定するため、表面におけるCD25発現についてアッセイする。CD28再活性化条件または非再活性化条件の両方において、CD25発現の増加が予想される。

実施例2：
Klon43から誘導される抗CD123 scFv抗体断片を使ったCD123 CARの構築、TCR KOおよびdCK KO TCR CD123発現細胞における機能分析
VH（SEQ ID NO：12、L（SEQ ID NO：10）、VL SEQ ID NO：11、またはSEQ ID NO：24〜SEQ ID NO：30から選択されるVH、リンカーL、およびSEQ ID NO：18〜SEQ ID NO：23から選択されるVLの組み合わせをそれぞれ使ってKlon43からのscFvまたはヒト化scFvを調製し、それを使ってCD123キメラ抗原受容体（本発明のCD123 CAR）を作製し、それらをスクリーニングして、パフォーマント（performant）（抗腫瘍活性を持ち、副作用が少ないもの）を選択した。

アーキテクチャV1またはV3、好ましくはV3を使用し（図2および図3）、ヒトT細胞で発現させて活性を決定した（図4、図5、図6および図7）。

図4に図解する結果は、CAR+ T細胞をCD123発現細胞（RPMI8226）またはCD123を発現しない細胞（K562）と6時間にわたって共培養したときの、あるアーキテクチャ（v3:CD8-ヒンジ/CD8-膜貫通）に関する本発明の異なるscFvの脱顆粒活性を示している。白いバーは単独で培養したT細胞に観察される脱顆粒シグナルに対応し、黒いバーは、T細胞をRPMI8226細胞と共培養した場合に観察されるシグナルを表し、灰色のバーは、K562細胞と共培養したT細胞の脱顆粒シグナルを示す。

図5は、異なるレベルのCD123を発現する細胞（KG1aまたはRPMI8226）またはCD123を発現しない細胞（K562）と24時間にわたって共培養したときの、T細胞によって放出されるIFNガンマの量を示す。共培養物と同じ条件下で単独培養したT細胞からのIFNガンマ放出も示す。これらの実験は3人の独立したドナーについて行った。代表的なドナーからの結果をここに示す。

図6および7は、PNA（20mg/kg）ipで処置したマウスにおけるインビボでのCAR-T細胞の特異的細胞溶解活性の用量応答を示す。

非形質導入ヒトT細胞の注射または異なる用量の抗CD123 CAR+ T細胞の注射の2日前に、免疫不全マウスに、MOLM13-ルシフェラーゼ細胞を注射した。結果は、T細胞注射後の異なる時点で観察される生物発光シグナルを表す。

実施例3:臨床試験
臨床試験により、本明細書に記載の臨床試験の実行可能性を証明するデータが得られた。

難治性/再発性AMLを患っている少なくとも1人の患者に本発明の処置を施行したところ、患者の余命は16ヶ月以上有意に増加し、がん性細胞は少なくとも6ヶ月にわたって検出レベル未満に低減した。

CD123を発現する操作された免疫細胞は、注入後少なくとも3ヶ月は検出された。

リツキシマブ（Rituxan（登録商標））の投与
375mg/m2の初回リツキシマブ投与後、4日間に静脈内経路によって投与されたリツキシマブの総用量は、2,250mg/m2であった。

各注入の前に、アセトアミノフェンおよび抗ヒスタミン薬の前投薬を行った。

別の一態様では、初回注入を、50mg/時の速度で開始した。注入毒性がない場合は、注入速度を最大400mg/時まで30分ごとに50mg/時ずつ増加させた。

以降の注入については、100mg/時の速度で行った。注入毒性がない場合は、最大400mg/時まで増加させて、2,250mg/m2に到達させた。

結果は、患者の血中のCD123 CAR細胞のレベルが、最後の注入後24時間の時点で検出限界未満であったことを示している。

一態様において、Klon43-1は次のとおりである。

一態様において、Klon43-3は次のとおりである。

一態様において、Klon43-5は次のとおりである。

本発明のヒト化CD123 CARは以下の配列のうちの1つを含む。

本発明の好ましいCARとして、以下の配列が考えられる。

本発明によれば、これらの抗CD123 CARは少なくとも1つのミモトープを含むことができる。

参考文献

Claims

ヒト化されていてもよいVH、リンカー、好ましくは配列（GGGGS）nのリンカー（n＝1〜4、好ましくはn＝3）、およびヒト化されていてもよいVL、ヒンジを順に含む、細胞外リガンド結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、ならびに
細胞質ドメイン、
モノクローナル抗体に特異的な少なくとも1つのエピトープ（ミモトープ）
を含む、CD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）。
SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30から選択されるヒト化されていてもよいVH、リンカー、好ましくは配列（GGGGS）nのリンカー（n＝1〜4、好ましくはn＝3）、およびSEQ ID NO：11、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、およびSEQ ID NO：23から選択されるヒト化されていてもよいVL、ヒンジを順に含む、細胞外リガンド結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
CD8アルファからの膜貫通ドメイン、ならびに
CD3ゼータシグナリングドメインおよび4-1BBからの共刺激ドメインを含む、細胞質ドメイン
を含む、請求項1記載のCD123 CAR。
ヒトCD28 NP_006130.1との同一性を有する配列を含まない、請求項1または2記載のCD123 CAR。
SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、およびSEQ ID NO：187から選択される配列を含み、少なくとも1つのSEQ ID NO：161をさらに含んでもよい、請求項1〜3のいずれか一項記載のCD123 CAR。
細胞外ドメインが、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、およびSEQ ID NO：170、好ましくはSEQ ID NO：161およびSEQ ID NO：169からなるリストから選択される、モノクローナル抗体に特異的な少なくとも1つのエピトープ（ミモトープ）を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のCD123 CAR。
SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、およびSEQ ID NO：197から選択される配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のCD123 CAR。
請求項1〜6のいずれか一項記載のCD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）をコードする、ポリヌクレオチド。
請求項7記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
バックボーンと、請求項1〜6のいずれか一項記載のCD123 CARのうちのいずれか1つをコードする少なくとも1つの配列とを含む、発現ベクター。
バックボーン、EF1プロモーター、RQR8オープンリーディングフレーム（RQR8 ORF）、請求項1〜6のCD123 CARのうちのいずれか1つをコードする配列を含む、発現ベクター。
細胞表面膜に請求項1〜6のいずれか一項記載のCD123 CARを発現する、T細胞受容体（TCR）をノックアウト（KO）したまたはTCRとヒトデオキシシチジンキナーゼ（dCK）とをKOした操作された免疫細胞。
請求項1〜6のいずれか一項記載のCD123特異的キメラ抗原受容体（CD123 CAR）をコードするポリヌクレオチドを含む、TCR KOであるまたはTCRおよびdCK KOである操作された免疫細胞。
細胞表面に自殺ドメインをさらに発現する、請求項4記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞。
少なくとも1つのMHCタンパク質の発現が抑制されている、請求項11〜13のいずれか一項記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞。
治療において使用するための、請求項11〜14のいずれか一項記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞。
状態が、急性骨髄性白血病（AML）、好ましくは難治性/再発性AML、BPDNLである、または骨髄移植中もしくは骨髄移植前に使用するための、請求項15記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞。
処置として、好ましくはリンパ増殖性障害の処置として、より好ましくは白血病もしくはリンパ腫の処置として使用するための、または急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群、およびBPDNLからなる群より選択される処置のための、請求項15記載のTCR KOであるまたはTCR KOおよびdCK KOである操作されたCD123 CAR発現免疫細胞。