CN115175929A

CN115175929A - 活性增强的bcma car-t细胞

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Publication number: CN115175929A
Application number: CN202180016621.7A
Authority: CN
Inventors: R·J·林; S·帕诺斯基; C·A·萨默; T·J·范布拉康; B·J·萨苏; A·巴拉库马兰
Original assignee: Allogene Therapeutics Inc
Current assignee: Allogene Therapeutics Inc
Priority date: 2020-02-24
Filing date: 2021-02-24
Publication date: 2022-10-11
Also published as: AU2021227191A1; CO2022011684A2; EP4110805A1; JP2023514407A; WO2021173630A1; IL295470A; TW202146439A; PE20221757A1; KR20220145846A; MX2022010340A; US20210260118A1; CA3167065A1; BR112022016657A2

Abstract

本文提供了工程化免疫细胞，其包含组成型活性嵌合细胞因子受体(CACCR)和B细胞成熟抗原(BCMA)特异性嵌合抗原受体(CAR)。本文还提供了包含编码所述CACCR和BCMACAR的一种或多种核酸，例如双顺反子载体如病毒载体的工程化免疫细胞，以及从所述核酸表达CACCR和BCMACAR两者的工程化免疫细胞，例如工程化自体或同种异体T细胞。当存在于携带嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫细胞上时，所述CACCR允许增加免疫细胞的活化、增殖、持久性和/或效力。本文还提供了制备和使用本文所述的工程化免疫细胞的方法，诸如通过向患有病症的患者施用至少一个适当剂量的所述细胞来治疗疾病或所述病症的方法。

Description

活性增强的BCMA CAR-T细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年2月24日提交的美国临时申请号62/980,914；2020年5月6日提交的美国临时申请号63/020,713；2020年7月17日提交的美国临时申请号63/053,409；和2020年10月16日提交的美国临时申请号63/092,681的优先权权益，所有这些申请的内容特此通过引用整体并入。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交并特此通过引用整体并入。于2021年2月2日创建的所述ASCII副本命名为AT-034-05WO_SL.txt且大小为312,069字节。

技术领域

本公开涉及CAR-T细胞，尤其是活性增强的BCMA特异性CAR-T细胞，及其制备方法和用途。

背景技术

经遗传修饰以识别恶性肿瘤相关抗原的免疫细胞(例如T细胞)的过继转移正显示出作为治疗癌症的新方法的前景。例如，T细胞可以进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体是由抗原识别部分和T细胞活化结构域组成的融合蛋白。

一种将有用的CAR-T细胞是识别B细胞成熟抗原(BCMA、CD269或TNFRSF17)的细胞。BCMA是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员并且参与促存活信号传导。BCMA是在含有at(4；16)易位的人恶性T细胞淋巴瘤中鉴定的。在多发性骨髓瘤(MM)和一些其他浆细胞恶性肿瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤，DLBCL)的所有阶段，BCMA在正常浆细胞和恶性浆细胞上高水平表达。BCMA也在大多数或所有骨髓瘤细胞上表达，而在非B细胞谱系中不存在表达。示例性的BCMA CAR在美国专利号10,294,304中公开并描述，该专利整体特此通过引用并入本文。BCMA CAR-T细胞可用于治疗多种疾病，包括多发性骨髓瘤(MM)，一种以克隆浆细胞积聚为特征的恶性肿瘤。MM在很大程度上仍然是不可治愈的，且大多数受试者随着时间的推移会产生抗性。

T细胞增殖、细胞毒性效力和持久性是由信号转导途径驱动的。常规的CAR设计提供两种信号：CD3ζ活化(信号1)和共刺激(信号2，例如，通过4-1BB、OX40和/或CD28表达)。在一些情况下，第三种信号(信号3)，细胞因子诱导的细胞因子受体信号传导(例如，用于免疫增强的细胞因子支持)可能是令人期望的。然而，提供信号3的方法已经受到显著的限制。

一般来说，提供细胞因子支持的一种方法包括将CAR-T细胞疗法与重组细胞因子/细胞因子模拟物的全身性输注相结合，并工程化CAR-T细胞以在细胞外分泌/表达细胞因子。由于细胞因子具有多效性作用并且还可以影响其他细胞类型的功能，通过CAR-T细胞全身性施用或产生免疫增效细胞因子具有至少两个主要缺点：(i)这些方法可以在人类中引起全身性毒性，和(ii)在同种异体CAR-T细胞治疗的情况下，这些方法可以引起旁观者宿主免疫活化，旁观者宿主免疫活化可以加速同种异体CAR-T细胞的排斥，从而损害治疗功效。提供细胞因子支持的另一种方法基于引入组成性活化的二聚化细胞因子受体IL-7Ra，这限制了信号传导输出的性质(仅IL-7信号传导)和量级。提供细胞因子支持的又一种方法涉及将信号3直接掺入到CAR分子中(Nat Med.2018年3月；24(3):352-359)。这种方法的局限性在于信号3的强度取决于CAR活化的强度。在靶标(和CAR活化)不存在的情况下，信号3不会被转导。

需要通过以可调节的方式使细胞因子信号特异性靶向BCMA CAR-T细胞来克服这些缺点的解决方案，从而提高安全性和治疗功效。

发明内容

本发明提供了含有组成型活性嵌合细胞因子受体(CACCR)的BCMA CAR免疫细胞，诸如BCMA CAR-T细胞。当存在于具有BCMA嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞(CAR-I细胞，例如BCMA CAR-T细胞)上时，此类CACCR允许增加免疫细胞的活化、增殖、持久性和/或效力。BCMACAR-T细胞活性的增强依赖于靶BCMA的存在。还提供了在BCMA CAR免疫细胞诸如BCMA CAR-T细胞中制备和使用本文所述的CACCR的方法。

因此，在一个方面，本文提供了含有由两种单体组成的CACCR的BCMA CAR-I细胞，例如BCMA CAR-T细胞，每种单体包含：(a)跨膜结构域；(b)Janus激酶(JAK)结合结构域；和(c)募集结构域，其中所述单体组成型二聚化。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域和/或JAK结合结构域源自TPOR/MPLR受体。在一些实施例中，该跨膜结构域和/或该JAK结合结构域源自SEQ ID NO:6的天然存在的TPOR/MPLR受体的氨基酸478-582。在一些实施例中，该TPOR/MPLR受体包含选自H499L、S505N、W515K和G509N的一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，该TPOR/MPLR受体包含H499L、S505N和W515K取代，或S505N和W515K取代。

在一些实施例中，该募集结构域是STAT募集结构域。在一些实施例中，该募集结构域包括来自IL7Ra的STAT募集结构域，例如IL7Ra(316-459)。在一些实施例中，该募集结构域包括来自IL2Rb的STAT募集结构域，例如IL2Rb(333-551)、IL2Rb(393-433,518-551)、IL2Rb(339-379,393-433,518-551)、IL2Rb(333-551,Y381S,Y384S,Y387S)或IL2Rb(333-551,Y364S,Y381S,Y384S,Y387S)。在一些实施例中，该募集结构域包括来自IL12Rb1的STAT募集结构域，例如IL12Rb1(622-662)。在一些实施例中，该募集结构域包括来自IL12Rb2的STAT募集结构域，例如IL12Rb2(714-862)或IL12Rb2(775-825)。在一些实施例中，该募集结构域包括来自IL21R的STAT募集结构域，例如IL21R(322-538)。

在相关方面，本文提供了编码本公开的CACCR中的任何一种的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的表达载体。在一些实施例中，该多核苷酸进一步编码嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR结合BCMA(“BCMA CAR”或“BCMA特异性CAR”)(例如，人BCMA，Uniprot登录号：Q02223-2)。

另一方面，本文提供了包含至少一种BCMA嵌合抗原受体和本公开的至少一种CACCR的工程化免疫细胞。在一些实施例中，该免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，该免疫细胞是同种异体免疫细胞。在其它实施例中，该免疫细胞是自体免疫细胞。该免疫细胞可以选自由以下组成的组：T细胞、树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞和源自干细胞的免疫细胞。在相关方面，本文提供了一种药物组合物，其包括本公开的工程化免疫细胞中的任何工程化免疫细胞；以及包括此类药物组合物的试剂盒。在相关方面，该工程化免疫细胞包含编码本发明的BCMA CAR和CACCR的一种或多种多核苷酸。在相关方面，该工程化免疫细胞包含编码BCMA CAR和本公开的一种或一种以上CACCR的双顺反子或多顺反子多核苷酸。

在另一方面，本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的工程化免疫细胞中的任何工程化免疫细胞。

另一方面，提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，该方法包括提供细胞，例如免疫细胞、T细胞、树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞和源自干细胞的免疫细胞，并且向该细胞中引入编码BCMA CAR的至少一种多核苷酸和编码本公开的CACCR的至少一种多核苷酸。在一些实施例中，为该细胞引入编码BCMA CAR和CACCR的一种或多种多核苷酸分子。在一些实施例中，第一载体包含BCMA CAR多核苷酸且第二载体包含CACCR多核苷酸。在一些实施例中，一种载体包含BCMA CAR多核苷酸和CACCR多核苷酸两者。在一些实施例中，该载体是病毒载体，诸如慢病毒载体。在一些实施例中，该细胞是自体细胞，这可以意味着它源自将用从该细胞制备的工程化免疫细胞治疗的同一个人。在其它实施例中，该细胞是同种异体细胞，这可以意味着它源自除了将用例如来自健康供体的工程化免疫细胞治疗的人以外的人。在一些实施例中，同种异体工程化免疫细胞进一步在TCRα恒定(TRAC)基因座处包含一个或多个遗传修饰，以减少或消除内源性TCRα受体的表达。在一些实施例中，该工程化免疫细胞进一步在CD52基因处包含一个或多个遗传修饰，以减少或消除CD52的表达。在各个实施例中，BCMA CAR多核苷酸和/或CACCR多核苷酸，以及可包含任一种或两种多核苷酸的任何载体受EF1α启动子驱动。在一些实施例中，BCMA CAR多核苷酸、CACCR多核苷酸以及包含任一种或两种多核苷酸的一种或多种载体中的至少一者进一步编码至少一种选择标记，该选择标记促进和/或使得能够鉴定含有BCMA CAR多核苷酸和/或CACCR多核苷酸的细胞。在各个实施例中，BCMA CAR多核苷酸和/或CACCR多核苷酸，以及可包含任一种或两种多核苷酸的任何载体进一步包含野生型或突变WPRE。在一些实施例中，该载体进一步包含突变WPRE。在各个实施例中，BCMA CAR多核苷酸和/或CACCR多核苷酸，以及可包含任一种或两种多核苷酸的任何载体，可通过本领域已知的方法引入细胞中，包括但不限于电穿孔、转染和病毒转导的各种方法。在一些实施例中，需要用工程化细胞治疗的患者是患有可用工程化细胞治疗的疾病或病症，或者可能受益于工程化细胞治疗的人。在一些实施例中，该病症是多发性骨髓瘤。在一些实施例中，该疾病或病症是复发性/难治性多发性骨髓瘤。在一些实施例中，该疾病是复发性多发性骨髓瘤。在一些实施例中，该疾病是浆细胞恶性肿瘤，例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在某些实施例中，向已接受工程化免疫细胞的患者施用有效量的利妥昔单抗(rituximab)或达沙替尼(dasatinib)，以减少或除去工程化免疫细胞。

附图说明

图1示出了本公开的示例性工程化CACCR的示意图。

图2A示出了本公开的CACCR的示例性募集结构域的示意图，该示例性募集结构域包含IL2Rb细胞内结构域的一个或多个多肽亚区。图2B-图2D示出了可用于共表达本公开的CACCR和BCMA CAR的某些组合的示例性载体的示意图。图2B和图2C各自示出了从启动子表达CD8信号序列、CACCR、P2A肽、CD8信号序列和BCMA-CAR的载体，有或没有突变WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)，所描绘的CACCR包含TpoR(478-582；H499L；S505N；W515K)和IL2Rb(339-379,393-433,518-551)。该示意图显示了含有克隆P5A2的scFv，具有两个拷贝的利妥昔单抗模拟表位(R2)、41BB和CD3ζ的BCMA CAR。图2D示出了从启动子表达CD8信号序列、CACCR、P2A肽、CD8信号序列、BCMA CAR和突变WPRE的载体，该CACCR包含TpoR(478-582；H499L；S505N；W515K)和IL2Rb(393-433、518-551)。

图3A-图3C显示具有截短的IL2Rb细胞尾的CACCR CAR-T细胞更接近地模拟IL-15而不是IL-2信号传导。

图4显示CACCR提高了TRAC/CD52 dKO CAR-T细胞针对液体肿瘤靶BCMA的细胞毒活性。

图5A-图5E显示CACCR提高了BCMA CAR-T细胞对原位多发性骨髓瘤的短期和长期体内抗肿瘤活性和持久性。

图6A-图6E示出CACCR-BCMA TRAC/CD52 dKO CAR T细胞在体外对表达BCMA的靶细胞系的效力。

图7A-图7B示出CACCR-BCMA TRAC/CD52 dKO CAR T细胞在体内的效力。

图8A-图8C示出在1×10⁶或3×10⁶的剂量下，两种IL2Rb来源的CACCR-BCMA CAR T细胞相对于未修饰的BCMA CAR T细胞的抗肿瘤活性。

图9A-图9C示出与未修饰的BCMA CAR相比，具有CACCR-BCMA CAR的T细胞的CAR+百分比和收率，CACCR-BCMA CAR和未修饰的BCMA CAR两者都在慢病毒构建体中被转导至T细胞。

图10A-图10E示出具有野生型或突变WPRE的CACCR-BCMA CAR T细胞的可制造性和功能分析结果。图10F示出源自PBMC的CAR T细胞的相似结果。

图11A-图11H示出从慢病毒构建体中去除WPRE的任何效果的分析结果。

图12A-图12D示出全长EF1a启动子和EF1a短启动子的效果的分析结果。

图13A-图13G示出全长EF1a启动子和MND启动子的效果的分析结果。没有CACCR的EF1a启动子驱动的BCMA CAR T的数据(空心圆)与MND启动子驱动的BCMA CAR T和CACCR的数据(实心正方形)重叠(图13F)。

图14示出与未修饰的BCMA CAR T细胞相比，CACCR-BCMA CAR T细胞在重复靶标暴露时的增殖曲线。

图15A-图15B示出随着对靶细胞的暴露增加，CAR T细胞对活化诱导的细胞死亡(AICD)的敏感性：mWPRE，突变WPRE；restim，再刺激。

图16A-图16B示出基于测定第7天的细胞内细胞因子染色的CAR T细胞的细胞因子表达谱。

图17示出在测定第15天CAR T细胞的记忆表型。

图18A-图18B示出在已接受5×10⁶个CAR T细胞的具有Molp8-Luc-GFP的小鼠中BCMA CART细胞的扩增和持久性。

图19A-图19B示出已接受1×10⁶个或5×10⁶个CAR T细胞的小鼠到第60天(图19A)和经过第100天(图19B)的总生存期。

图20示出如图19所示已接受5×10⁶个CAR T细胞的单个小鼠的肿瘤负荷。

图21A描绘了示出CACCR-BCMA CAR T细胞和未修饰的BCMA CAR T细胞的靶标依赖性细胞毒性的数据。图21B描绘了示出CACCR-BCMA CAR T细胞和未修饰的BCMA CAR T细胞的靶标依赖性细胞因子分泌谱的数据。

图22A-图22B示出在靶标或外源细胞因子IL-15(图22A)或IL-2(图22B)不存在的情况下，缺乏CACCR-BCMA CAR T细胞扩增。图22C示出在靶标不存在的情况下CAR T细胞培养物的Ki-67染色结果，而图22D显示CAR T细胞能够在经过辐照的靶细胞(iTarget)和IL2的存在下扩增。呈现的数据是来自三个供体的平均值±SD。

图23A示出最近活化的BCMA CAR T细胞的扩增谱，所述细胞不断地用靶细胞刺激，或者将靶细胞取回。图23B-图23D描绘的数据证明，CACCR BCMA CAR T细胞在靶标不存在的情况下不能在体内长期持久，并且不会对非荷瘤小鼠产生负面影响。图23E-图23F示出的结果证明，CACCR BCMA CAR T细胞的体内扩增是靶标依赖性的，并且它们在靶标清除后恢复静止。接受BCMA CAR或CACCR BCMA CAR T细胞的小鼠的体重增加是同等的(图23G)。

图24A-图24D示出体外(图24A-图24B)或体内(图24C-图24D)BCMA CAR或CACCRBCMA CAR T细胞的利妥昔单抗介导的耗竭测定的结果。

图25A-图25B示出酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼对BCMA CAR T细胞活性的影响。

图26A-图26C显示CACCR BCMA CAR T细胞的活性扩增是靶标依赖性的。

图27A-图27D显示在多发性骨髓瘤的原位模型中，CACCR改善抗肿瘤功效和BCMACAR T细胞的扩增。

具体实施方式

本公开提供了BCMA CAR和组成型活性嵌合细胞因子受体(CACCR)的组合。本文公开的BCMA CAR和CACCR是各自包含不同蛋白质和氨基酸序列的结构域的多肽，如本文进一步详述。组成型活性、可调嵌合细胞因子受体的存在允许信号3的免疫增强满足免疫增强的需要。因此，当存在于如本文所公开的具有BCMA嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞(CAR-I细胞，例如CAR-T细胞)上时，此类CACCR允许增加免疫细胞的活化、增殖、持久性和/或效力。本文还提供了制备本文所述的CACCR并将其与BCMA特异性CAR组合使用的方法。

如本文所公开的那样使用的CACCR是可调的，并且具有用于增强BCMA CAR-T细胞活性、持久性等的灵活的细胞因子信号输出。下面依次描述这些组分、制备方法和使用方法。

I.组成型活性嵌合细胞因子受体(CACCR)

本公开的CACCR由两种单体组成，每种单体包含：(a)跨膜结构域；(b)JAK结合结构域；和(c)募集结构域，其中单体是组成型二聚化的。在一些实施例中，本公开的CACCR不包含细胞外配体结合结构域。

在一些实施例中，单体是相同的，产生组成型活性同型二聚体。在此类实施例中，需要在载体中表达的蛋白质数目减少。在一些实施例中，单体不相同，产生组成型活性异二聚体，这在某些情况下可能是期望的。

本公开的CACCR的单体能够自发地二聚化，并且可以在不存在任何外源刺激或配体的情况下活化信号传导(配体非依赖性二聚化)。活性水平可以通过引入CACCR跨膜结构域中的突变来控制。本领域技术人员将会理解，CACCR的单体并非100％的时间都是二聚化的，并且可以作为单体存在。

A.跨膜结构域

本发明的CACCR包含跨膜结构域。本公开的跨膜结构域包含这样的序列，使得它们允许两种单体的组成型二聚化，从而允许在细胞内部分上的组成型JAK活化，以及例如在受体胞质区上的STAT的组成型募集和磷酸化。

跨膜结构域处于N端并与C端的细胞内/胞质结构域偶联。在一些实施例中，偶联任选地是通过接头实现的。

如本文所使用的，跨膜结构域能够插入到细胞的膜中，在所述细胞中，所述跨膜结构域被表达。在一些实施例中，本公开的CACCR跨膜结构域跨越细胞膜，并且包含细胞外部分和/或细胞内部分。在一些实施例中，本公开的CACCR跨膜结构域跨越细胞膜，包含细胞内部分，而不包含细胞外配体结合部分。

在一些实施例中，本公开的跨膜结构域是工程化的(合成的)并且不类似于任何天然存在的跨膜结构域，例如它们是非天然存在的。

在其它实施例中，本公开的跨膜结构域源自天然存在的受体。

在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或JAK活化结构域源自例如以下的一种或多种受体：促红细胞生成素受体(EpoR)、白细胞介素6信号转导因子(GP130或IL6ST)、催乳素受体(PrlR)、生长激素受体(GHR)、粒细胞集落刺激因子受体(GCSFR)和血小板生成素受体/骨髓增生性白血病蛋白受体(TPOR/MPLR)。当源自天然存在的受体时，整个受体或受体的整个跨膜序列可能不是实现细胞内部分上的组成型活化和组成型JAK结合/活化所必需的。因此可以利用天然存在的受体的片段。此外，可以将某些突变引入源自天然存在的受体的跨膜结构域中，以进一步调节下游信号传导。

在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或JAK活化结构域源自天然存在的EpoR受体。

在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或JAK活化结构域源自天然存在的GP130受体。

在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或JAK活化结构域源自天然存在的PrlR受体。

在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或JAK活化结构域源自天然存在的GHR受体。

在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或JAK活化结构域源自天然存在的GCSF受体。

在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或JAK活化结构域源自天然存在的TPOR受体。

表1a提供了本公开中提供的天然存在的受体的示例性全长序列，跨膜蛋白源自该天然存在的受体。表1a中提供的序列是参考序列，例如表1b和表1c中，表达后来的突变与参考序列有关。

表1a：示例性的天然存在的受体

在一些实施例中，本公开的跨膜结构域源自表1a所示的天然存在的TPOR/MPLR(骨髓增生性白血病蛋白)受体的截短型式。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含表1a的TPOR受体的氨基酸478-582。

表1b提供了本公开的示例性跨膜结构域氨基酸序列，其中该跨膜结构域源自天然存在的TPOR受体。在表1b所列的序列中，TPOR受体跨膜氨基酸序列包含SEQ ID NO:7(“天然存在的跨膜序列”)，或者与SEQ ID NO:7的不同之处在于包含SEQ ID NO:7的一个或多个氨基酸取代(“经修饰的跨膜序列”)。

表1b：示例性跨膜结构域氨基酸序列

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及至少在H499处的氨基酸取代。在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代H499L。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及至少在S505处的氨基酸取代。在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代S505N。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及至少在G509处的氨基酸取代。在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代G509N。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及至少在W515处的氨基酸取代。在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代W515K。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及在H499和S505处的氨基酸取代(表1b中提供的序列)。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及在H499和W515处的氨基酸取代(表1b中提供的序列)。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及在H499、S505和W515处的氨基酸取代(表1b中提供的序列)。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及在S505和W515处的氨基酸取代(表1b中提供的序列)。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及在H499和G509处的氨基酸取代(表1b中提供的序列)。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代H499L和S505N(表1b中提供的序列)。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代H499L和W515K(表1b中提供的序列)。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代H499L和G509N(表1b中提供的序列)。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代S505N和W515K(表1b中提供的序列)。

在一些实施例中，CACCR的跨膜结构域包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代H499L、S505N和W515K(表1b中提供的序列)。

本公开的CACCR是可调的，以达到具有BCMA CAR的免疫细胞(例如，BCMA CAR-T细胞)中所需以及在特定环境或条件下所期望的信号3/免疫增强水平。

在一些实施例中，在具有BCMA CAR的免疫细胞(例如，BCMA CAR-T细胞)中期望低水平的STAT5活化。举例来说，在此类实施例中，可以引入包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代S505N、W515K或H499L/G509N的CACCR跨膜结构域。

在一些实施例中，在具有BCMA CAR的免疫细胞(例如，BCMA CAR-T细胞)中期望增加水平的STAT5活化。举例来说，在此类实施例中，可以引入包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代H499L、S505N和W515K的CACCR跨膜结构域。再举例来说，在此类实施例中，可以引入包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代S505N和W515K的CACCR跨膜结构域。

在一些实施例中，在具有BCMA CAR的免疫细胞(例如，BCMA CAR-T细胞)中期望增加向记忆T细胞的分化。举例来说，在此类实施例中，可以引入包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代W515K或H499L/G509N的CACCR跨膜结构域。

在一些实施例中，在具有BCMA CAR的免疫细胞(例如，BCMA CAR-T细胞)中期望增加向记忆T细胞的分化。举例来说，在此类实施例中，可以引入包含TPOR受体的氨基酸478-582，以及氨基酸取代S505N/W515K和H499L/S505N/W515K的CACCR跨膜结构域。

本文还提供了增加细胞毒性效力、应答持续性和增加持久性的取代，例如S505N/W515K和H499L/S505N/W515K取代。

表1c：示例性跨膜+JAK2结合结构域序列

B.Janus激酶(JAK)结合结构域

本公开的CACCR包含细胞内JAK结合结构域。JAK结合结构域直接或通过接头与跨膜结构域的C端偶联。JAK结合结构域与嵌合细胞因子受体的细胞内侧上的跨膜结构域偶联。

在一些实施例中，JAK结合结构域是JAK-1结合结构域、JAK-2结合结构域、JAK-3结合结构域或TYK2结合结构域。

在一些实施例中，本公开的CACCR的JAK结合结构域是天然存在的，并且源自天然存在的受体。

在一些实施例中，本公开的CACCR的JAK结合结构域是合成的。

表1b和表1c提供了本公开的跨膜和JAK2结合结构域的示例性氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的CACCR包含跨膜和JAK2结合结构域，该结构域包含选自表1b和表1c中的序列的氨基酸序列。构成跨膜和JAK2结合结构域的氨基酸序列是一种多肽，在本文中可称为“TM/JAK多肽”因此，例如，表1c列出了示例性的TM/JAK多肽，诸如TPOR/MPLR(478-582)，并且类似地表1b列出了也是TM/JAK多肽的TPOR/MPLR(478-582)的变体，诸如TPOR/MPLR(478-582；H499L、S505N、W515K)和TPOR/MPLR(478-582；S505N、W515K)。在一些实施例中，本公开的CACCR包含跨膜和JAK2结合结构域，该结构域包含与表1b和表1c中的序列中的任一个有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

C.募集结构域

本公开的CACCR包含胞质募集结构域。募集结构域可以是STAT募集结构域、AP1募集结构域、Myc/Max募集结构域或NFkB募集结构域。在一些实施例中，募集结构域是信号转导因子和转录活化因子(STAT)募集(STAT活化)结构域，例如，来自受体尾(细胞尾)或来自细胞因子受体尾。本公开的CACCR的这些细胞内募集结构域允许信号3在包含BCMA CAR和嵌合细胞因子受体的免疫细胞(例如，具有本公开的嵌合细胞因子受体的BCMA CAR-T细胞)中传播。通过STAT募集结构域传播的细胞因子信号传导允许细胞的基于细胞因子的免疫增强。在一些实施例中，免疫增强是稳态的，例如信号传导导致具有CAR的免疫细胞增加。在一些实施例中，免疫增强是炎性的，例如信号传导导致具有CAR的免疫细胞的效力增加。在一些实施例中，免疫增强防止衰竭，例如信号传导保持具有CAR的免疫细胞的长期功能性。

在一些实施例中，本公开的募集结构域是合成的并且不类似于任何天然存在的受体片段。在一些实施例中，免疫增强防止衰竭，例如信号传导保持具有BCMA CAR的免疫细胞的长期功能性。

在一些实施例中，本公开的Stat募集结构域是合成的并且不类似于任何天然存在的受体片段。

在其它实施例中，本公开的Stat募集结构域源自天然存在的受体的细胞质尾区，例如源自天然存在的细胞因子受体。天然存在的受体的这些细胞质尾区可能是位于受体的跨膜结构域的JAK活化结构域下游的区域。嵌合细胞因子受体的Stat募集结构域包括来自至少一个受体的至少一个STAT募集结构域。在一些实施例中，Stat募集结构域包括至少一个STAT1募集结构域。在一些实施例中，Stat募集结构域包括至少一个STAT2募集结构域。在一些实施例中，Stat募集结构域包括至少一个STAT3募集结构域。在一些实施例中，Stat募集结构域包括至少一个STAT4募集结构域。在一些实施例中，Stat募集结构域包括至少一个STAT5募集结构域。在一些实施例中，Stat募集结构域包括至少一个STAT6募集结构域。在一些实施例中，Stat募集结构域包括至少一个STAT7募集结构域。

在一些实施例中，Stat募集结构域所源自的天然存在的受体不是细胞因子受体。

在一些实施例中，Stat募集结构域所源自的天然存在的受体是细胞因子受体。T细胞免疫增强细胞因子信号所通过的示例性细胞因子受体包括但不限于IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-15受体和IL-21受体。在替代性实施例中，Stat募集结构域所源自的受体不是细胞因子受体。通过选择CACCR的Stat募集结构域，受体可以重定向到选择的信号传导。

在一些实施例中，本公开的CACCR包含用或不用接头与跨膜/JAK2结合结构域的C端连接的募集结构域。在一些实施例中，接头包含一个或多个氨基酸残基。

表2a提供了本公开的CACCR的募集结构域所源自的示例性受体。表2b提供了本公开的募集结构域的示例性氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的CACCR包含募集结构域，该募集结构域包含选自表2b中的受体序列中的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的CACCR包含募集结构域，该募集结构域包含与表2b中的序列中的任一个有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

表2a示例性受体

表2b募集结构域(细胞尾)序列

在一些实施例中，本公开的CACCR的Stat募集结构域包含来自一个受体的Stat募集结构域。

为了生成多种输出，两个或更多个STAT募集结构域可以串联联接，以模拟来自一种或多种细胞因子的信号传导。

在一些实施例中，该两个或更多个STAT募集结构域可以用或不用接头串联联接。在一些实施例中，接头包含一个或多个氨基酸残基。

在一些实施例中，STAT募集结构域包括多于一个受体的部分，例如包括多于一个STAT募集结构域。在此类实施例中，提供串联的细胞因子信号传导结构域，从而允许增强的信号传导。因此，在一些实施例中，本公开的CACCR的单体的STAT募集结构域包含来自一个以上受体的STAT募集结构域，例如包含来自两个、三个、四个、五个或甚至六个受体的STAT募集结构域。例如，在一些实施例中，STAT募集结构域可以串联连接以刺激多种途径(例如，用于促持续性STAT5和促炎性STAT4的IL7R(316-459)-IL12Rb2(775-825)片段融合；用于促持续性IL7R(316-459)-IL2Rbsmall(393-433,518-551)；用于促持续性和抗衰竭的IL7R(316-459)-EGFR(1122-1165)；用于促持续性和抗衰竭的IL2Rbsmall(393-433,518-551)-EGFR(1122-1165))。

当生成多个输出时，单个STAT募集结构域与细胞膜的接近度可以影响其相应的信号传导输出的强度。表2c示出具有双输出的CACCR的实例，其中每个输出可以放置在细胞膜的近端或远端。在一些实施例中，本公开的CACCR包含具有选自表2c的双输出的募集结构域。

表2c：具有双输出的CACCR的实例

不受理论或机制的束缚，在一些实施例中，JAK蛋白(JAK1、JAK2、JAK3或TYK2)与本公开的二聚化CACCR结合。两个结合的JAK蛋白被活化，能够磷酸化CACCR募集结构域上的酪氨酸残基。然后，磷酸化募集结构域能够与募集的蛋白质结合(例如，磷酸化STAT募集结构域与STAT蛋白结合)，这进而在细胞核中实现转录事件。

D.示例性CACCR

表3示出本公开的示例性CACCR序列。受体可以随信号序列，例如序列MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:89)的CD8SS一起表达。

在一些实施例中，本公开的CACCR包含表3中的任一序列。在一些实施例中，CACCR包含与SEQ ID NO:90-98和107-139的任一氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的CACCR包含SEQID NO:90-100、107-139、143和180-186的任一氨基酸序列。

在一些实施例中，CACCR包含源自TPOR/MPLR受体的跨膜结构域和/或JAK结合结构域。在一些实施例中，本公开的CACCR包含SEQ ID NO:6的天然存在的TPOR/MPLR受体的氨基酸478-582。在一些实施例中，本公开的CACCR包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的CACCR包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR还包含募集结构域，该募集结构域包含表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR还包含选自由来自IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2和IL21R的STAT募集结构域组成的组的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含与SEQID NO:67、86或87的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含SEQID NO:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL21R的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR包含表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb1的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，该CACCR包含与SEQ ID NO:90或119的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，有或没有信号序列。在一些实施例中，该CACCR包含SEQ ID NO:90或119的氨基酸序列，有或没有信号序列。

在一些实施例中，本公开的CACCR包含来自TPOR/MPLR受体的跨膜结构域和/或JAK结合结构域，所述受体包含在H499、S505、G509或W515处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，TPOR/MPLR受体包含H499L取代。在一些实施例中，TPOR/MPLR受体包含S505N取代。在一些实施例中，TPOR/MPLR受体包含G509N取代。在一些实施例中，TPOR/MPLR受体包含W515K取代。在一些实施例中，该CACCR还包含募集结构域，该募集结构域包含表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR还包含选自由来自IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2和IL21R的STAT募集结构域组成的组的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:67、86或87的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL21R的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR包含表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb1的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，该CACCR包含与SEQ ID NO:92、94、121或123的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，有或没有信号序列。在一些实施例中，该CACCR包含SEQ ID NO:92、94、121或123的氨基酸序列，有或没有信号序列。

在一些实施例中，本公开的CACCR包含来自TPOR/MPLR受体的跨膜结构域和/或JAK结合结构域，所述受体包含H499L和S505N取代。在一些实施例中，该CACCR还包含募集结构域，该募集结构域包含表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR还包含选自由来自IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2和IL21R的STAT募集结构域组成的组的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含与SEQID NO:67、86或87的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含SEQID NO:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL21R的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR包含表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb1的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，该CACCR包含与SEQ ID NO:91、98、120或127的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，有或没有信号序列。在一些实施例中，该CACCR包含SEQ ID NO:91、98、120或127的氨基酸序列，有或没有信号序列。

在一些实施例中，本公开的CACCR包含来自TPOR/MPLR受体的跨膜结构域和/或JAK结合结构域，所述受体包含H499L和W515K取代或H499L和G509N取代。在一些实施例中，该CACCR还包含募集结构域，该募集结构域包含表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR还包含选自由来自IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2和IL21R的STAT募集结构域组成的组的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含与SEQID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含SEQID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含SEQ IDNO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:67、86或87的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL21R的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含与SEQID NO:54的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR包含表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb1的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，该CACCR包含与SEQ ID NO:97或126的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，有或没有信号序列。在一些实施例中，该CACCR包含SEQ ID NO:97或126的氨基酸序列，有或没有信号序列。

在一些实施例中，本公开的CACCR包含来自TPOR/MPLR受体的跨膜结构域和/或JAK结合结构域，所述受体包含S505N和W515K取代。在一些实施例中，该CACCR还包含募集结构域，该募集结构域包含表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR还包含选自由来自IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2和IL21R的STAT募集结构域组成的组的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含与SEQID NO:67、86或87的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含SEQID NO:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL21R的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR包含表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb1的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，该CACCR包含与SEQ ID NO:96、107、109、111、113、115、117、125、128、129、132、134、136或138的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，有或没有信号序列。在一些实施例中，该CACCR包含SEQID NO:96、107、109、111、113、115、117、125、128、129、132、134、136或138的氨基酸序列，有或没有信号序列。

在一些实施例中，本公开的CACCR包含来自TPOR/MPLR受体的跨膜结构域和/或JAK结合结构域，所述受体包含H499L和W515K取代。在一些实施例中，该CACCR还包含募集结构域，该募集结构域包含表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR还包含选自由来自IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2和IL21R的STAT募集结构域组成的组的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含与SEQID NO:67、86或87的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含SEQID NO:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL21R的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR包含表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb1的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，该CACCR包含与SEQ ID NO:93的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，有或没有信号序列。在一些实施例中，该CACCR包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列，有或没有信号序列。

在一些实施例中，本公开的CACCR包含来自TPOR/MPLR受体的跨膜结构域和/或JAK结合结构域，所述受体包含H499L、S505N和W515K取代。在一些实施例中，该CACCR还包含募集结构域，该募集结构域包含表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR还包含选自由来自IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2和IL21R的STAT募集结构域组成的组的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL7Ra的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL2Rb的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:47、73、74、75、76、77、78、106或142的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含与SEQ ID NO:67、86或87的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL12Rb1或IL12Rb2的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL21R的STAT募集结构域。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含与SEQ IDNO:54的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自IL21R的STAT募集结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR包含表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL2Rb的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb1的STAT募集结构域。在一些实施例中，募集结构域包括来自IL7Ra和IL12Rb2的STAT募集结构域。在一些实施例中，该CACCR包含与SEQ ID NO:95、108、110、112、114、116、118、124、130、131、133、135、137、139、180、181、182、184、185或186的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，有或没有信号序列。在一些实施例中，该信号序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR包含SEQ ID NO:95、108、110、112、114、116、118、124、130、131、133、135、137、139、180、181、182、184、185或186的氨基酸序列，有或没有信号序列。在一些实施例中，该信号序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施例中，该CACCR包含细胞外配体结合结构域。在一些实施例中，该CACCR不包含细胞外配体结合结构域。在共同未决的申请US2020/0291090中描述了CACCR，该申请特此通过引用整体并入。

表3示例性CACCR序列

*加下划线的LE和SR是可插入两个结构域之间的示例性任选接头。

E.CACCR的表达

本文提供了编码本文提供的任一CACCR的多核苷酸。同样，本文提供了包括此类多核苷酸的表达载体。在一些实施例中，载体是病毒载体。在一些实施例中，载体不是病毒载体。在一些实施例中，载体是慢病毒载体。在一些实施例中，表达载体包含启动子，该启动子可以选自本领域已知的那些启动子。可用于本发明的示例性启动子是人延长因子-1α(EF-1alpha或EF-1α)启动子，其可以以其全长形式或截短形式或其它变体形式使用(如文献中所述，并公开于例如Wakabayashi-Ito,N.等人,J.Biol.Chem.1994:269(47):29831-29837；Montiel-Equihua,C.A.等人,Mol.Therapy,2012,20(7):1400-1409)。任何型式的EF1α启动子都合适并且可以用作唯一的启动子或与其它启动子元件一起使用。在一些实施例中，表达载体是慢病毒载体并且启动子是全长EF-1α启动子。示例性的全长EF1α启动子如下所示：GCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACGCCCCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA(SEQ ID NO:187)

示例性的EF1α短启动子如下所示：GCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAG(SEQ ID NO:188)

在一些实施例中，表达载体包含表达CACCR的多核苷酸和表达嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。

在一些实施例中，CACCR和CAR表达为由接头隔开的单条多肽链。图2B-图2D示出了可用于共表达本公开的CACCR和BCMA CAR的载体的示意图。一个或多个募集结构域可以在CACCR中串联联接，以模拟来自一种或多种细胞因子的信号传导。

II.具有CAR的免疫细胞

本文提供了包含编码本公开的B细胞成熟抗原(BCMA)嵌合抗原受体(CAR)和CACCR的多核苷酸的工程化免疫细胞；并且本文提供了表达本公开的BCMA嵌合抗原受体(BCMACAR-T细胞)和CACCR的工程化免疫细胞。免疫细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、不变NKT细胞、肥大细胞、髓源性吞噬细胞、树突细胞、杀伤树突细胞、巨噬细胞和单核细胞。在一些实施例中，工程化免疫细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。在一些实施例中，工程化免疫细胞是发挥一种或多种T细胞效应子功能的T细胞(或效应T细胞)。免疫细胞还指源自，例如但不限于，干细胞的细胞。干细胞可以是成体干细胞、非人胚胎干细胞，更具体地非人干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。根据本领域已知的方法，免疫细胞可以从天然来源获得，诸如从人类患者获得，或者可以从例如供体细胞、干细胞或非干细胞制备。

因此，在一些实施例中，本文提供了包含本公开的CACCR的BCMA CAR-T细胞。

在一些实施例中，BCMA CAR可以包含细胞外配体结合结构域(例如，单链可变片段(scFv))、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域在一个多肽中，即在单链中。本文还提供了多链BCMACAR和多肽。在一些实施例中，多链BCMA CAR包含：包含跨膜结构域和至少一个细胞外配体结合结构域的第一多肽，和包含跨膜结构域和至少一个细胞内信号传导结构域的第二多肽，其中所述多肽组装在一起形成多链CAR。

BCMA CAR的细胞外配体结合结构域与BCMA特异性结合。

在一些实施例中，BCMA CAR的细胞外配体结合结构域包含scFv，该scFv包含BCMA特异性单克隆抗体的通过柔性接头联接的轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区。单链可变区片段是通过使用短连接肽(Bird等人,《科学(Science)》242:423-426,1988)(例如，含有甘氨酸-丝氨酸的接头)连接轻链和/或重链可变区来制备的。通常，接头可以是短的柔性多肽并且通常包含约20个或更少的氨基酸残基。接头可以进而被修饰以实现另外的功能，如附着药物或附着在固体支持物上。单链变体可以通过重组或合成产生。对于scFv的合成生产，可以使用自动合成仪。对于scFv的重组产生，可以将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入到合适的宿主细胞(如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞等真核细胞或如大肠杆菌等原核细胞)中。编码所关注scFv的多核苷酸可以通过如多核苷酸的连接等常规操作来制备。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得scFv。

根据本发明的BCMA CAR的细胞内信号传导结构域负责细胞外配体结合结构域与靶标结合后的细胞内信号传导，引起免疫细胞的活化和免疫反应(信号1和/或信号2)。细胞内信号传导结构域能够活化表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包含细胞因子的分泌)。

在一些实施例中，用于BCMA CAR的细胞内信号传导结构域可以是例如但不限于T细胞受体和共同作用以在抗原受体接合后引发信号转导的辅助受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。细胞内信号传导结构域包含两类不同的细胞质信号传导序列：引发抗原依赖性初级活化的序列和以抗原非依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的序列。初级细胞质信号传导序列可包含称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或“ITAM”的信号传导基序。ITAM是在充当syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点的各种受体的胞质内尾区发现的明确定义的信号传导基序。作为非限制性实例，本发明中使用的ITAM的实例可以包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一些实施例中，BCMA CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ信号传导结构域。在一些实施例中，本发明的BCMA CAR的细胞内信号传导结构域包含共刺激分子的结构域。

在一些实施例中，本发明的BCMA CAR的细胞内信号传导结构域包含选自由4-1BB片段(GenBank：AAA53133)和CD28(NP_006130.1)组成的组的共刺激分子的一部分。

CAR在细胞的表面膜上表达。因此，BCMA CAR包含跨膜结构域。本文公开的BCMACAR的合适跨膜结构域具有以下能力：(a)在细胞的表面表达，该细胞优选免疫细胞，如例如但不限于淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞，和(b)与配体结合结构域和细胞内信号传导结构域相互作用，以指导免疫细胞针对预定义靶细胞的细胞应答。跨膜结构域可以源自天然的或合成的来源。跨膜结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。作为非限制性实例，跨膜多肽可以是T细胞受体的亚基，如α、β、γ或δ；构成CD3复合物的多肽；IL-2受体p55(a链)、p75(β链)或γ链；Fc受体，具体地Fcγ受体III，的亚基链；或CD蛋白。可替代地，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要包括疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，所述跨膜结构域源自人类CD8α链(例如，NP_001139345.1)。

BCMA CAR的跨膜结构域还可包含介于细胞外配体结合结构域与所述跨膜结构域之间的茎结构域。茎结构域可以包括多达300个氨基酸，优选地10到100个氨基酸，并且最优选地25到50个氨基酸。茎区域可以源自天然存在的分子的全部或部分，如源自CD8、CD4或CD28的细胞外区域的全部或部分，或源自抗体恒定区的全部或部分。可替代地，茎结构域可以是对应于天然存在的茎序列的合成序列，或者可以是完全合成的茎序列。在一些实施例中，所述茎结构域是人CD8α链的一部分(例如，NP_001139345.1)。

在另一个特定实施例中，BCMA CAR的所述跨膜结构域和铰链结构域包含人CD8α链的一部分。

表4提供了可用于本文公开的BCMA CAR中的CAR组分的示例性序列和本文举例说明的抗体和/或CAR序列。

表4：与BCMA CAR有关的氨基酸序列

在BCMA CAR的一些实施例中，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域。在BCMA CAR的一些实施例中，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域且另外包括第二信号传导结构域。在BCMA CAR的一些实施例中，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域。在一些实施例中，本文公开的BCMA CAR包含特异性结合BCMA的细胞外配体结合结构域、人CD8α铰链和跨膜结构域、CD3ζ信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域。在一些实施例中，BCMA特异性CAR包含SEQ ID NO:140或141的氨基酸序列。在一些实施例中，BCMA特异性CAR包含与SEQ ID NO:140的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施例中，BCMA特异性CAR包含与SEQ ID NO:141的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施例中，BCMA CAR包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列，没有CD8α前导序列或信号序列(MALPVTALLLPLALLLHAARP，SEQ ID NO:89)。在一些实施例中，BCMA CAR包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列。

在一些实施例中，SEQ ID NO:141的BCMA CAR由SEQ ID NO:171的DNA序列编码。

表5.BCMA CAR核苷酸序列

在一个实施例中，本发明的BCMA CAR多肽包含以下结构域：任选地前导序列、重链可变(VH)区、接头、轻链可变(VL)区、关闭开关、CD8铰链、CD8跨膜结构域、4-1BB信号传导结构域和CD3-zeta(CD3z或CD3ζ)结构域。在该实施例的一些方面，BCMA CAR多肽任选包含：包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列的前导序列，包含SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列的VH区，包含SEQ ID NO:167所示的氨基酸序列的接头序列，包含SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列的VL区，包含SEQ ID NO:168所示的氨基酸序列的关闭开关区，包含SEQ ID NO:169所示的氨基酸序列的CD8铰链区，包含SEQ ID NO:170所示的氨基酸序列的CD8 TM区，包含SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列的4-1BB信号传导结构域，和包含SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列的CD3z信号传导结构域。在该实施例的一些方面，BCMA CAR多肽任选包含：包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列的前导序列，包含SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列的VH区，包含SEQ ID NO:167所示的氨基酸序列的接头序列，包含SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列的VL区，包含SEQ ID NO:168所示的氨基酸序列的关闭开关区，包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列的CD8铰链区和TM区，包含SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列的4-1BB信号传导结构域，和包含SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列的CD3z信号传导结构域。在一些实施例中，使用不同的前导序列。

在该实施例的其它方面，BCMA CAR多肽任选包含：包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列的前导序列，包含SEQ ID NO:155所示的氨基酸序列的VH区，包含SEQ ID NO:167所示的氨基酸序列的接头序列，包含SEQ ID NO:156所示的氨基酸序列的VL区，包含SEQ IDNO:168所示的氨基酸序列的关闭开关区，包含SEQ ID NO:169所示的氨基酸序列的CD8铰链区，包含SEQ ID NO:170所示的氨基酸序列的CD8 TM区，包含SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列的4-1BB信号传导结构域，和包含SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列的CD3z信号传导结构域。

在另一个实施例中，本发明的BCMA CAR多肽包含以下结构域：任选地前导序列、重链可变(VH)区、接头、轻链可变(VL)区、关闭开关、CD8铰链、CD8跨膜结构域、4-1BB信号传导结构域和CD3-zeta(CD3z或CD3ζ)结构域，其中关闭开关任选地省略和/或4-1BB信号传导结构域和CD3z信号传导结构域中仅一个或另一个存在，但不是两个都存在。

在这些实施例中的任一个的方面，BCMA CAR的细胞外结合区包含：VH区，该VH区包含VH CDR1，其包含SEQ ID NO:146、147或148所示的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ IDNO:149或150所示的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含SEQ ID NO:151所示的氨基酸序列；并且包含VL区，该VL区包含：VL CDR1，其包含SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列。

在这些实施例中的任一个的替代性方面，BCMA CAR的细胞外结合区包含：VH区，该VH区包含：VH CDR1，其包含SEQ ID NO:157、158或159所示的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO:160或161所示的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含SEQ ID NO:162所示的氨基酸序列；并且包含VL区，该VL区包含：VL CDR1，其包含SEQ ID NO:163所示的氨基酸序列；VLCDR2，其包含SEQ ID NO:164所示的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，BCMA CAR可以作为转基因通过载体引入免疫细胞中。在一些实施例中，载体还可以含有例如选择标志物，该选择标志物提供了对接受该载体的细胞的鉴定和/或选择。

在本发明的一些实施例中，包含SEQ ID NO:172的核苷酸序列的双顺反子载体编码具有SEQ ID NO:173的预测氨基酸序列的预测CACCR BCMA CAR多肽，该多肽包含以下结构域：CD8α信号序列(例如SEQ ID NO:89)、跨膜/JAK2结合结构域-TpoR(478-582；S505N,W515K)(例如SEQ ID NO:13)、IL2Rb(393-433,518-551)(例如SEQ ID NO:77)、P2A(例如SEQID NO:105)、CD8α信号序列(例如SEQ ID NO:89)和带安全开关的P5A2抗BCMA CAR(例如SEQID NO:166)。在该实施例的方面，双顺反子载体在多肽编码序列之后还包含例如核苷酸序列SEQ ID NO:174的野生型土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE，或例如SEQ ID NO:175的核苷酸序列的突变WPRE(“mWPRE”)。在该实施例的其他方面，双顺反子载体不包括野生型WPRE或突变WPRE。在一些方面，本公开提供了一种工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞包含SEQ ID NO:172的多核苷酸序列，并且表达包含SEQ ID NO:184或99的氨基酸序列的CACCR，以及包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的BCMA CAR。在一些实施例中，本公开提供了一种工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞表达包含SEQ ID NO:180、184或99的氨基酸序列的CACCR，和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的BCMA CAR。在一些实施例中，该工程化免疫细胞是工程化T细胞。在一些实施例中，该工程化T细胞是同种异体T细胞。在一些实施例中，该工程化T细胞是自体T细胞。

SEQ ID NO:172：

atggccctgccagtgaccgccctgctgctgccactggccctgctgctgcacgcagcaaggccatcagaccctactagagtcgagaccgctaccgagaccgcttggatctctctggtgaccgccctgcacctggtgctgggcctgaacgccgtgctgggcctgctgctgctgaggaagcagttcccagcacactaccggagactgaggcacgcactgtggccaagcctgcccgacctgcacagggtgctgggacagtatctgagggatacagccgccctgagcccacctaaggcaaccgtgtccgacacatgcgaggaggtggaaccaagtctgctggaaatcctgccaaaatcctctgagcggacacccctgcccctgctcgaggacgagggagtggcaggagcaccaaccggcagctccccccagcctctgcagccactgtccggagaggacgatgcatactgcacattcccttctcgggacgatctgctgctgttctctccaagcggacagggagagtttcgggccctgaacgccagactgcccctgaataccgacgcctatctgagcctgcaggagctgcagggacaggaccccacacacctggtgggatccggagccaccaacttctccctgctgaagcaggccggcgatgtggaggagaatccaggccccatggctctgcccgtcaccgcactgctgctgcccctggctctgctgctgcacgccgcaagacccgaggtccagctgctggaatctgggggaggactggtgcagcctggaggcagcctgagactgtcctgcgcagcatctggcttcaccttcagctcctacgccatgaactgggtgaggcaggcaccaggcaagggactggagtgggtgtctgccatctccgactctggcggcagcacctactatgccgattccgtgaagggccgcttcacaatcagccgggataactccaagaataccctgtacctgcagatgaattccctgagagccgaggatacagccgtgtactattgcgccaggtattggcccatggacatctggggccagggcacactggtgaccgtgtcttccggaggaggaggctccggaggaggaggctctggcggcggcggcagcgagatcgtgctgacacagtctcctggcaccctgagcctgtccccaggagagagagccaccctgagctgtagggcctctcagagcgtgtcctctagctacctggcctggtatcagcagaagcccggccaggcccctagactgctgatgtacgacgccagcatcagggcaacaggcatccctgatcggttctccggctctggcagcggaaccgactttacactgaccatcagcaggctggagcccgaggacttcgccgtgtactattgccagcagtatggctcctggcctctgacatttggccagggcaccaaggtggagatcaagggctccggcggcggaggctcttgcccatacagcaacccatccctgtgctctggaggaggaggctcctgtccttatagcaatcctagcctgtgctccggcggaggaggctctaccacaaccccagcaccaaggccacctacacctgcaccaaccatcgcctctcagccactgagcctgagacccgaggcctgtaggcctgcagcaggaggagcagtgcacacccggggactggactttgcctgcgatatctacatctgggcaccactggcaggaacatgtggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgcaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagccctttatgcgccctgtgcagacaacccaggaggaggatggctgctcctgtcggttcccagaggaggaggagggaggatgtgagctgcgcgtgaagttttcccggtctgccgacgcaccagcataccagcagggccagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggaggggaagagatcccgagatgggaggcaagccacggagaaagaacccccaggagggcctgtacaatgagctgcagaaggataagatggccgaggcctatagcgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgctaccaaagacacctatgatgctctgcacatgcaggctctgccaccaagatga

SEQ ID NO:173：

MALPVTALLLPLALLLHAARPSDPTRVETATETAWISLVTALHLVLGLNAVLGLLLLRKQFPAHYRRLRHALWPSLPDLHRVLGQYLRDTAALSPPKATVSDTCEEVEPSLLEILPKSSERTPLPLLEDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAISDSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSWPLTFGQGTKVEIKGSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO:174：wt WPRE

aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg

SEQ ID NO:175：mWPRE

aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg

在本发明的实施例中，包含SEQ ID NO:176的核苷酸序列的双顺反子载体编码具有SEQ ID NO:177的预测氨基酸序列的预测CACCR BCMA CAR多肽，该多肽包含以下结构域：CD8信号肽(例如SEQ ID NO:89)、跨膜/JAK2结合结构域-TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K)(例如SEQ ID NO:12)、IL2Rb(339-379,393-433,518-551)(例如SEQ ID NO:78)、P2A(例如SEQ ID NO:105)、CD8α信号序列(例如SEQ ID NO:89)和带安全开关的P5A2 BCMA CAR(例如SEQ ID NO:166)。在该实施例的方面，双顺反子载体在多肽编码序列之后还包含例如SEQ ID NO:174的野生型WPRE或例如SEQ ID NO:175的核苷酸序列的突变WPRE(“mWPRE”)。在该实施例的其他方面，双顺反子载体不包括野生型WPRE或突变WPRE。在一些方面，本公开提供了一种工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞包含SEQ ID NO:176的多核苷酸序列，并且表达包含SEQ ID NO:185或100的氨基酸序列的CACCR，以及包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的BCMA CAR。在一些实施例中，本公开提供了一种工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞表达包含SEQ ID NO:181、185或100的氨基酸序列的CACCR，和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的BCMA CAR。在一些实施例中，该工程化免疫细胞是工程化T细胞。在一些实施例中，该工程化T细胞是同种异体T细胞。在一些实施例中，该工程化T细胞是自体T细胞。

SEQ ID NO:176：

atggccctgccagtgaccgccctgctgctgccactggccctgctgctgcacgcagcaaggccatcagaccctactagagtcgagaccgctaccgagaccgcttggatctctctggtgaccgccctgctgctggtgctgggcctgaacgccgtgctgggcctgctgctgctgaggaagcagttcccagcacactaccggagactgaggcacgcactgtggccaagcctgcccgacctgcacagggtgctgggacagtatctgagggatacagccgccctgagcccacctaaggcaaccgtgtccgacacatgcgaggaggtggaaccaagtctgctggaaatcctgccaaaatcctctgagcggacacccctgcccctgctcgagcagcaggacaaggtgcccgagcctgcctccctgagctccaaccacagcctgacctcctgctttacaaatcagggctacttctttttccacctgcctgacgccctggagatcgaggcctgtcaggatgagggagtggcaggagcacctaccggctctagcccacagccactgcagccactgtctggagaggacgatgcctactgcacattccccagccgggacgatctgctgctgttttccccttctggacagggagagttccgggccctgaacgcaagactgccactgaataccgacgcctatctgtctctgcaggagctgcagggccaggaccccacacacctggtgggatccggagccaccaacttctccctgctgaagcaggccggcgatgtggaggagaatccaggccccatggctctgcccgtcaccgcactgctgctgcccctggctctgctgctgcacgccgcaagacccgaggtccagctgctggaatctgggggaggactggtgcagcctggaggcagcctgagactgtcctgcgcagcatctggcttcaccttcagctcctacgccatgaactgggtgaggcaggcaccaggcaagggactggagtgggtgtctgccatctccgactctggcggcagcacctactatgccgattccgtgaagggccgcttcacaatcagccgggataactccaagaataccctgtacctgcagatgaattccctgagagccgaggatacagccgtgtactattgcgccaggtattggcccatggacatctggggccagggcacactggtgaccgtgtcttccggaggaggaggctccggaggaggaggctctggcggcggcggcagcgagatcgtgctgacacagtctcctggcaccctgagcctgtccccaggagagagagccaccctgagctgtagggcctctcagagcgtgtcctctagctacctggcctggtatcagcagaagcccggccaggcccctagactgctgatgtacgacgccagcatcagggcaacaggcatccctgatcggttctccggctctggcagcggaaccgactttacactgaccatcagcaggctggagcccgaggacttcgccgtgtactattgccagcagtatggctcctggcctctgacatttggccagggcaccaaggtggagatcaagggctccggcggcggaggctcttgcccatacagcaacccatccctgtgctctggaggaggaggctcctgtccttatagcaatcctagcctgtgctccggcggaggaggctctaccacaaccccagcaccaaggccacctacacctgcaccaaccatcgcctctcagccactgagcctgagacccgaggcctgtaggcctgcagcaggaggagcagtgcacacccggggactggactttgcctgcgatatctacatctgggcaccactggcaggaacatgtggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgcaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagccctttatgcgccctgtgcagacaacccaggaggaggatggctgctcctgtcggttcccagaggaggaggagggaggatgtgagctgcgcgtgaagttttcccggtctgccgacgcaccagcataccagcagggccagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggaggggaagagatcccgagatgggaggcaagccacggagaaagaacccccaggagggcctgtacaatgagctgcagaaggataagatggccgaggcctatagcgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgctaccaaagacacctatgatgctctgcacatgcaggctctgccaccaagatga

SEQ ID NO:177：

MALPVTALLLPLALLLHAARPSDPTRVETATETAWISLVTALLLVLGLNAVLGLLLLRKQFPAHYRRLRHALWPSLPDLHRVLGQYLRDTAALSPPKATVSDTCEEVEPSLLEILPKSSERTPLPLLEQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAISDSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSWPLTFGQGTKVEIKGSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

在本发明的实施例中，包含SEQ ID NO:178的核苷酸序列的双顺反子载体编码具有SEQ ID NO:179的预测氨基酸序列的预测CACCR BCMA CAR多肽，该多肽包含以下结构域：CD8信号肽(例如SEQ ID NO:89)、跨膜/JAK2结合结构域-TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K)(例如SEQ ID NO:12)、IL2Rb(393-433,518-551)(例如SEQ ID NO:77)、P2A(例如SEQID NO:105)、CD8α信号序列(例如SEQ ID NO:89)和带安全开关的P5A2 BCMA CAR(例如SEQID NO:141)。在该实施例的方面，双顺反子载体在多肽编码序列之后还包含例如SEQ IDNO:174的野生型WPRE或例如SEQ ID NO:175的核苷酸序列的突变WPRE(“mWPRE”)。在该实施例的其他方面，双顺反子载体不包括野生型WPRE或突变WPRE。

在一些实施例中，本公开提供了一种工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞包含SEQID NO:178的多核苷酸序列，并且表达包含SEQ ID NO:186或143的氨基酸序列的CACCR，以及包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的BCMA CAR。在一些实施例中，本公开提供了一种工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞表达包含SEQ ID NO:182、186或143的氨基酸序列的CACCR，和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的BCMA CAR。在一些实施例中，该工程化免疫细胞是工程化T细胞。在一些实施例中，该工程化T细胞是同种异体T细胞。在一些实施例中，该工程化T细胞是自体T细胞。

SEQ ID NO:178：

atggccctgccagtgaccgccctgctgctgccactggccctgctgctgcacgcagcaaggccatcagaccctactagagtcgagaccgctaccgagaccgcttggatctctctggtgaccgccctgctgctggtgctgggcctgaacgccgtgctgggcctgctgctgctgaggaagcagttcccagcacactaccggagactgaggcacgcactgtggccaagcctgcccgacctgcacagggtgctgggacagtatctgagggatacagccgccctgagcccacctaaggcaaccgtgtccgacacatgcgaggaggtggaaccaagtctgctggaaatcctgccaaaatcctctgagcggacacccctgcccctgctcgaggacgagggagtggcaggagcaccaaccggcagctccccccagcctctgcagccactgtccggagaggacgatgcatactgcacattcccttctcgggacgatctgctgctgttctctccaagcggacagggagagtttcgggccctgaacgccagactgcccctgaataccgacgcctatctgagcctgcaggagctgcagggacaggaccccacacacctggtgggatccggagccaccaacttctccctgctgaagcaggccggcgatgtggaggagaatccaggccccatggctctgcccgtcaccgcactgctgctgcccctggctctgctgctgcacgccgcaagacccgaggtccagctgctggaatctgggggaggactggtgcagcctggaggcagcctgagactgtcctgcgcagcatctggcttcaccttcagctcctacgccatgaactgggtgaggcaggcaccaggcaagggactggagtgggtgtctgccatctccgactctggcggcagcacctactatgccgattccgtgaagggccgcttcacaatcagccgggataactccaagaataccctgtacctgcagatgaattccctgagagccgaggatacagccgtgtactattgcgccaggtattggcccatggacatctggggccagggcacactggtgaccgtgtcttccggaggaggaggctccggaggaggaggctctggcggcggcggcagcgagatcgtgctgacacagtctcctggcaccctgagcctgtccccaggagagagagccaccctgagctgtagggcctctcagagcgtgtcctctagctacctggcctggtatcagcagaagcccggccaggcccctagactgctgatgtacgacgccagcatcagggcaacaggcatccctgatcggttctccggctctggcagcggaaccgactttacactgaccatcagcaggctggagcccgaggacttcgccgtgtactattgccagcagtatggctcctggcctctgacatttggccagggcaccaaggtggagatcaagggctccggcggcggaggctcttgcccatacagcaacccatccctgtgctctggaggaggaggctcctgtccttatagcaatcctagcctgtgctccggcggaggaggctctaccacaaccccagcaccaaggccacctacacctgcaccaaccatcgcctctcagccactgagcctgagacccgaggcctgtaggcctgcagcaggaggagcagtgcacacccggggactggactttgcctgcgatatctacatctgggcaccactggcaggaacatgtggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgcaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagccctttatgcgccctgtgcagacaacccaggaggaggatggctgctcctgtcggttcccagaggaggaggagggaggatgtgagctgcgcgtgaagttttcccggtctgccgacgcaccagcataccagcagggccagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggaggggaagagatcccgagatgggaggcaagccacggagaaagaacccccaggagggcctgtacaatgagctgcagaaggataagatggccgaggcctatagcgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgctaccaaagacacctatgatgctctgcacatgcaggctctgccaccaagatga

SEQ ID NO:179：

MALPVTALLLPLALLLHAARPSDPTRVETATETAWISLVTALLLVLGLNAVLGLLLLRKQFPAHYRRLRHALWPSLPDLHRVLGQYLRDTAALSPPKATVSDTCEEVEPSLLEILPKSSERTPLPLLEDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAISDSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSWPLTFGQGTKVEIKGSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

在本发明的一些实施例中，双顺反子载体编码与SEQ ID NO:173、177或179的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施例中，本发明还提供了一种含有双顺反子载体的细胞，诸如免疫细胞，例如T细胞，该双顺反子载体编码与SEQ ID NO:173、177或179的氨基酸序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施例中，本发明还提供了一种治疗以BCMA表达为特征的疾病诸如多发性骨髓瘤的方法，该方法包括将此类细胞施用于患有该疾病的患者。

在一些实施例中，本公开的CAR免疫细胞(例如，CAR-T细胞)包含编码自杀多肽(例如RQR8或R2)的多核苷酸。参见，例如WO 2013153391A，所述文献特此通过引用整体并入本文。在一些实施例中，自杀多肽在细胞表面上表达。在一些实施例中，自杀多肽包含在CAR构建体中。在一些实施例中，自杀多肽不是CAR构建体的一部分。

在一些实施例中，本文公开的任何一种CAR的细胞外结构域可以包含一个或多个对单克隆抗体具有特异性的(被单克隆抗体特异性识别的)表位。这些表位在本文中也被称为mAb特异性表位。在国际专利公开第WO2016/120216号中公开了示例性mAb特异性表位，所述国际专利以其整体并入本文。在这些实施例中，CAR的细胞外结构域包括与目标靶标特异性结合的抗原结合结构域和与一种或多种单克隆抗体(mAb)结合的一个或多个表位。包括mAb特异性表位的CAR可以是单链或多链的。

在本文所述的CAR的细胞外结构域中包含对单克隆抗体具有特异性的表位允许分选和耗竭表达CAR的工程化免疫细胞。在一些实施例中，允许耗竭在有害影响的情况下，例如在施用于受试者时提供安全开关。

本文还提供了制备用于免疫疗法的工程化免疫细胞的方法。在一些实施例中，所述方法包括将CACCR和CAR引入免疫细胞中，并扩增所述细胞。在一些实施例中，本发明涉及一种将免疫细胞工程化的方法，该方法包括：提供细胞并表达CACCR，以及在细胞表面表达至少一种CAR。在一些实施例中，该方法包括：用编码CACCR的至少一种多核苷酸和编码CAR的至少一种多核苷酸转染细胞，并在细胞中表达所述多核苷酸。在一些实施例中，该方法包括：用编码CACCR的至少一种多核苷酸、编码CAR的至少一种多核苷酸转染细胞，并在细胞中表达所述多核苷酸。

在一些实施例中，编码CACCR和CAR的多核苷酸存在于一种或多种表达载体中，以在细胞中稳定表达。在一些实施例中，多核苷酸存在于病毒载体中，以在细胞中稳定表达。在一些实施例中，病毒载体可以是例如慢病毒载体或腺病毒载体。

在一些实施例中，编码根据本公开的多肽的多核苷酸可以是例如通过电穿孔被直接引入到细胞中的mRNA。在一些实施例中，如PulseAgile等CytoPulse电穿孔技术可以用于瞬时渗透活细胞以将材料递送到细胞中(例如，US 6,078,490；PCT/US2011/000827；和PCT/US2004/005237)。可以修改参数以确定高转染效率和最低死亡率的条件。

本文还提供了转染免疫细胞例如T细胞的方法。在一些实施例中，该方法包括：将T细胞与RNA接触，并向T细胞施加敏捷脉冲序列。在一些实施例中，转染免疫细胞(例如T细胞)的方法包括将免疫细胞与RNA接触，并向细胞施加敏捷脉冲序列。

在一些实施例中，所述方法可以进一步包括以下步骤：通过使表达例如但不限于TCR的组分、免疫抑制剂的靶标、HLA基因和/或免疫检查点蛋白(如例如PDCD1或CTLA-4)的至少一个基因灭活来对细胞进行基因修饰。使基因灭活旨在使所关注基因不以功能性蛋白质形式表达。在一些实施例中，待灭活的基因选自由例如但不限于TCRα、TCRβ、CD52、GR、脱氧胞苷激酶(DCK)、PD-1和CTLA-4组成的组。在一些实施例中，所述方法包括通过将能够通过选择性DNA切割选择性灭活基因的稀切核酸内切酶引入细胞来使一个或多个基因灭活。在一些实施例中，稀切核酸内切酶可以是例如转录活化因子样效应物核酸酶(TALE-核酸酶)或基于CRISPR的核酸内切酶(例如，Cas-9或Cas12a)。

在另一方面，对细胞进行基因修饰的步骤可包括：通过灭活至少一种表达免疫抑制剂的靶标的基因来修饰免疫细胞(例如T细胞)，并且；任选地在免疫抑制剂的存在下扩增细胞。

在一些实施例中，相对于不表达CACCR的工程化免疫细胞，本文提供的工程化免疫细胞(例如T细胞)表现出改善的细胞毒性、增加的扩增和/或增加的记忆表型标志物水平。

在一些实施例中，相对于不表达CACCR的工程化免疫细胞，本文提供的工程化免疫细胞(例如T细胞)表现出(i)增加的体内持久性，(ii)增加的STAT活化，(iii)增加的细胞毒性，(iv)增加的记忆表型标志物水平，(v)增加的扩增(增殖)，或这些功能特征的组成型组合。在一些实施例中，本文所述的一种或多种功能特征的改善是可调的，取决于引入CACCR的突变/修饰。在一些实施例中，由公开的包含一种或多种CACCR的工程化免疫细胞活化的STAT是STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6或它们的组合。在一个实施例中，由包含CACCR的免疫细胞增加或维持的记忆表型标志物包括干细胞记忆(Tscm)标志物和中央记忆(Tcm)标志物。

在一些实施例中，与不表达CACCR的免疫细胞相比，本文提供的包含CACCR的工程化免疫细胞所表现出的一种或多种功能特征改善至少约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、125倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍或甚至约500倍，包括介于之间的值和范围。

在一些实施例中，与不表达CACCR的工程化免疫细胞相比，本文提供的包含CACCR的工程化免疫细胞所表现出的一种或多种功能特征改善至少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、125％、150％、200％、250％、300％、350％、400％或甚至约500％，包括介于之间的值和范围。

III.治疗方法

本文提供了包含具有本公开的CACCR和CAR的细胞的药物组合物。

通过上述方法获得的具有CACCR且具有BCMA CAR的工程化免疫细胞(例如BCMACAR-T细胞)，或源自此类工程化免疫细胞的细胞系，可用作药物。在一些实施例中，此类药物可用于治疗病症，如例如病毒性疾病、细菌性疾病、癌症、炎性疾病、免疫性疾病或衰老相关的疾病。在一些实施例中，癌症是实体癌。在一些实施例中，癌症是液体癌。癌症可选自由以下项组成的组：胃癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃部癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、B细胞恶性肿瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌和黑素瘤。在一些实施例中，受试者是先前经治疗的患有局部晚期或转移性黑素瘤、鳞状细胞头颈癌(SCHNC)、卵巢癌、肉瘤或复发性或难治性经典霍奇金氏淋巴瘤(classic Hodgkin’s Lymphoma，cHL)的成年受试者。

在一些实施例中，工程化免疫细胞或源自工程化免疫细胞的细胞系可用于制造用于治疗有此需要的受试者的病症的药物。在一些实施例中，病症可以是例如癌症、自身免疫病症或感染。

本文还提供了用于治疗需要这种治疗的受试者的方法。

如本文所使用的，术语“受试者”是指任何脊椎动物，所述任何脊椎动物包含但不限于人和其它灵长类动物(例如，黑猩猩、食蟹猴和其它猿和猴物种)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如，狗和猫)、实验室动物(例如，兔、啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠)和鸟类(例如，家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡以及其它鸡类鸟类、鸭、鹅等)。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在示例性实施例中，受试者是人。

在一些实施例中，该方法包括向有此需要的受试者提供本公开的免疫细胞，所述免疫细胞具有本文所述的CACCR和CAR(例如，BCMA CAR)。

在一些实施例中，本发明的具有CACCR和CAR的T细胞可以进行稳健的体内T细胞扩增并且可以长时间持续。

本发明的治疗方法可以是改善、治愈或预防。本发明的方法可以是自体免疫疗法的一部分或同种异体免疫疗法治疗的一部分。

在另一方面，本发明提供了一种抑制患有肿瘤的受试者的肿瘤生长或进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的表达CACCR和表达CAR(例如，表达BCMA CAR)的免疫细胞。在另一方面，本发明提供了一种抑制或预防受试者的癌细胞的转移的方法，所述方法包括包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的工程化免疫细胞。在另一方面，本发明提供了一种诱导患有肿瘤的受试者的肿瘤消退的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的工程化免疫细胞。

在一些实施例中，本文的工程化T细胞可在受试者中胃肠外施用。在一些实施例中，本文的工程化T细胞可以在受试者中静脉内施用。

还提供了本文提供的任何工程化T细胞在制造用于在有此需要的受试者中治疗癌症或抑制肿瘤生长或进展的药物中的用途。

在一些实施例中，治疗可以施用于经历免疫抑制性治疗的受试者。实际上，本发明优选地依赖于由于编码此类免疫抑制剂的受体的基因失活而对至少一种免疫抑制剂产生抗性的细胞或细胞群。在这个方面，免疫抑制性治疗应该有助于对受试者体内根据本发明的T细胞的选择和扩增。根据本发明的细胞或细胞群的施用可以以任何方便的方式进行，所述方式包含气溶胶吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。可以将本文所述的组合物皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内或淋巴管内注射或腹膜内施用于受试者。具有本公开的CACCR和CAR(例如BCMA CAR)的细胞或其药物组合物可以通过以下的一种或多种施用途径施用：静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、植入、吸入、鞘内、心室内、经耳或鼻内。

在一些实施例中，细胞或细胞群(具有本公开的CACCR和CAR，例如BCMA CAR)的施用可以包括例如每kg体重约10⁴至约10⁹个细胞的施用，包括那些范围内的所有细胞数目的整数值。在一些实施例中，细胞或细胞群的施用可以包括每kg体重约10⁴至10⁵个细胞、每kg体重10⁵至10⁶个细胞、每kg体重10⁶至10⁷个细胞、每kg体重10⁷至10⁸个细胞或每kg体重10⁸至10⁹个细胞的施用。细胞或细胞群可以按一个或多个剂量施用。在一些实施例中，所述有效量的细胞可以作为单剂量施用。在一些实施例中，所述有效量的细胞可以在一段时间内作为一个以上的剂量施用。施用时间在主治医师的判断范围内并且取决于受试者的临床状况。细胞或细胞群可以从任何来源获得，如血库或供体。虽然个体需要不同，但是确定用于特定疾病或病症的给定细胞类型的有效量的最佳范围在本领域的技术范围内。有效量意指提供治疗或预防益处的量。所施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、同期治疗(如果有的话)的种类、治疗频率以及所期望的效果的性质。在一些实施例中，肠胃外施用有效量的细胞或包含那些细胞的组合物。在一些实施例中，施用可以是静脉内施用。在一些实施例中，施用可以通过注射到肿瘤内直接进行。

与上述一致，本发明的细胞(例如，表达CACCR和表达BCMA CAR的同种异体或自体T细胞)的适当剂量可以在约7×10^6个细胞至约480×10^6个细胞之间。在某些实施例中，适当剂量的范围可以为约20×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量，更具体地约20×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量、约60×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量、约100×10^6个细胞/剂量、约120×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量、约240×10^6个细胞/剂量、约300×10^6个细胞/剂量、约320×10^6个细胞/剂量、约360×10^6个细胞/剂量、约400×10^6个细胞/剂量、约440×10^6个细胞/剂量或约480×10^6个细胞/剂量。

在某些实施例中，当受试者的体重为50kg或更高，并且将要向患者施用至少一剂细胞时，适当剂量的范围可以为约20×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量，更具体地约20×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量、约120×10^6个细胞/剂量、约240×10^6个细胞/剂量、约320×10^6个细胞/剂量、约360×10^6个细胞/剂量或约480×10^6个细胞/剂量。在某些实施例中，当受试者的体重小于50kg，并且将要向患者施用至少一剂细胞时，适当剂量的范围可以为约7×10^6个细胞/剂量至约360×10^6个细胞/剂量，更具体地约7×10^6个细胞/剂量、约14×10^6个细胞/剂量、约20×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量、约240×10^6个细胞/剂量或约360×10^6个细胞/剂量。

所述方法还可包括在施用本文提供的具有CAR(例如，BCMA CAR)和CACCR的工程化免疫细胞之前，向受试者施用一种或多种药剂。在某些实施例中，药剂是淋巴细胞清除(预调节)方案。例如，淋巴细胞清除需要这种疗法的受试者的方法包括向所述受试者施用指定的有益剂量的环磷酰胺(在200mg/m²/天与2000mg/m²/天之间、约100mg/m²/天与约2000mg/m²/天；例如，约100mg/m²/天、约200mg/m²/天、约300mg/m²/天、约400mg/m²/天、约500mg/m²/天、约600mg/m²/天、约700mg/m²/天、约800mg/m²/天、约900mg/m²/天、约1000mg/m²/天、约1500mg/m²/天或约2000mg/m²/天)；以及指定剂量的氟达拉滨(在20mg/m²/天与900mg/m²/天之间、在约10mg/m²/天与约900mg/m²/天之间；例如，约10mg/m²/天、约20mg/m²/天、约30mg/m²/天、约40mg/m²/天、约40mg/m²/天、约50mg/m²/天、约60mg/m²/天、约70mg/m²/天、约80mg/m²/天、约90mg/m²/天、约100mg/m²/天、约500mg/m²/天或约900mg/m²/天)。示例性给药方案涉及治疗受试者，其包括：在向患者施用治疗有效量的工程化免疫细胞之前三天，组合地或在施用约30mg/m²/天的氟达拉滨之前或之后，每天向患者施用约300mg/m²/天的环磷酰胺。

在一些实施例中，特别是在本文提供的工程化细胞已经进行基因编辑以消除或最小化CD52的表面表达的情况下，淋巴细胞清除还包括施用抗CD52抗体，诸如阿仑单抗(CAS(化学文摘社)登记号#216503-57-0)。在一些实施例中，CD52抗体以约1-20mg/天的剂量IV施用，例如，约13mg/天IV施用1天、2天、3天或更多天，或约20mg/天IV施用1天、2天、3天或更多天。在一些实施例中，CD52抗体以约20-30mg/天的剂量IV施用，例如约30mg/天IV施用1天、2天、3天或更多天。抗体可以与淋巴细胞清除方案的其它要素(例如，环磷酰胺和/或氟达拉滨)组合施用、在施用所述其它要素之前或之后施用。

在一些实施例中，有效量的工程化免疫细胞可以在初始给药或第一次给药后施用于患者(即，再给药)。第二次给药或后续给药可以与先前给药的工程化免疫细胞的量相同，或者高于或低于先前给药的工程化免疫细胞的量。在一些实施例中，在工程化免疫细胞的第二次给药或后续给药之前，对患者施用淋巴细胞清除方案。在一些实施例中，第二次给药或后续给药之前没有进行淋巴细胞清除方案。

在某些实施例中，本文公开的包含表达CACCR和CAR(例如，表达BCMA CAR)的免疫效应细胞的组合物可以连同任意数目的化学治疗剂施用。

在某些实施例中，已经接受本公开的CACCR BCMA CAR T细胞的患者后续施用有效量的利妥昔单抗和/或达沙替尼，以减少或减轻CAR T治疗过程中任何潜在的安全性问题。在某些实施例中，患者接受用于治疗多发性骨髓瘤或其它BMCA阳性癌症的BCMA CAR T疗法。

IV.试剂盒和制品

本公开提供了包含本文所述的任何一种或多种具有CACCR和CAR的细胞(例如，具有CACCR和BCMA CAR的细胞，例如免疫细胞如T细胞)及其药物组合物的试剂盒。本公开还提供了包含本文所述的任何一种或多种具有CACCR和CAR(例如，具有BCMA CAR)的CAR-I细胞(例如，具有CACCR和BCMA CAR的细胞，例如免疫细胞如T细胞)、其药物组合物和本文所述的试剂盒的制品。

以下实例被包含用于说明性目的，并且不旨在限制本公开的范围。

贯穿本公开引用的所有专利和非专利文件出于所有目的通过引用整体并入本文。

图1示出了如本文公开的并且在以下实例中使用的工程化的组成型活性嵌合细胞因子受体的示意图。图2示出了在以下实例中作为CACCR组分的本公开的截短细胞尾多肽的示意图。图2B-图2D示出了用于表达CACCR和CAR的示例性双顺反子载体，其可用于如下所述的实验和程序中，用于生成共表达CAR和CACCR的细胞。

实例

实例1：优化的IL2Rb来源的细胞尾更接近地模拟IL-15而不是IL-2的信号传导

IL-2和IL-15是两种细胞因子，它们天然地通过由共同γ链和IL2Rb组成的异二聚体细胞因子受体进行信号传导。尽管共有相同的天然受体，但是IL-2和IL-15对T细胞分化和持久性产生不同的影响。IL-2诱导短期效应细胞分化，而IL-15促进长期记忆T细胞的生成。此外，已经证实IL-15血清浓度增加与患者对CAR-T细胞疗法的应答正相关。因此，优选模拟IL-15而不是IL-2的信号传导和效应的CACCR。我们试图确定截短的IL2Rb细胞尾是否更接近地模拟IL-2或IL-15信号传导。

为此，我们利用包含具有朝向BCMA的P5A2 scFv的示例性BCMA CAR，与利妥昔单抗模拟表位、4-1BB和CD3z信号传导结构域偶联的CAR-T细胞(参见美国专利10,294,304，通过引用并入本文)。生成共表达截短的IL2Rb尾的BCMA特异性CAR-T细胞，并将它们的基因表达谱与已经暴露于外源重组人IL-2或IL-15的对照CAR-T细胞进行比较。为了制备编码CACCR和BCMA CAR的慢病毒，在转染前一天，将HEK293T细胞以45万个细胞/mL平板接种在6孔板的每个孔中补充有10％FBS(Hyclone)的2mL DMEM(Gibco)中。在转染当天，通过将慢病毒包装载体1.5ug psPAX2、0.5ug pMD2G和0.5ug的适当转移CAR载体一起混合在6孔板的每个孔中的250uL Opti-MEM(Gibco)中来制备慢病毒(“DNA混合物”)。将在250uL Opti-MEM中的10uLLipofectamine 2000(Invitrogen)在室温下孵育5分钟，然后添加到DNA混合物中。将混合物在室温下孵育20分钟并将500uL总体积缓慢添加到含有HEK293T的孔的侧面。转染后一天，用每孔2mL细胞转导培养基，即补充有10％FBS的X-Vivo-15，更换6孔板中每孔HEK293T细胞的培养基。转染后两天，收获来自HEK293T细胞的慢病毒上清液并使其通过0.45微米过滤器(EMD Millipore)以去除细胞碎片，并将粗制慢病毒上清液直接用于T细胞转导。第0天，在Grex-24板(Wilson Wolf，目录号#80192M)中，在补充有100IU/mL人IL-2(MiltenyiBiotec)、10％FBS(Hyclone)和人T TransAct(Miltenyi Biotec，目录号#130-111-160，1:100稀释)的X-Vivo-15培养基(Lonza)中活化纯化的T细胞。第2天，将T细胞以50万个细胞/mL重悬于T细胞转导培养基中，在Grex-24板中用等体积的粗制慢病毒上清液和100IU/mL人IL-2进行转导。第5天，通过用T细胞扩增培养基，即补充有5％人AB血清(Gemini Bio)和100IU/mL人IL-2的X-Vivo-15更换用过的培养基来饲养表达CACCR的CAR-T细胞。此时，缺乏CACCR的对照CAR-T细胞仅在100U/mL人IL-2中或在100U/mL人IL-2和10ng/mL人IL-15(Miltenyi Biotec)中扩增。根据需要，使用T细胞扩增培养基和相应浓度的重组细胞因子将细胞扩增到更大的G-Rex容器(Wilson Wolf)中。第13天，将细胞用Zombie NIR可固定活力试剂盒(Biolegend)进行染色，用BUV395缀合的CD3抗体(Biolegend)和对P5A2 scFv具有特异性的抗独特型抗体进行标记，然后进行FACS分选以富集CAR+T细胞。然后将分选的CAR+T细胞在Grex-24板中在T细胞扩增培养基中再培养2天，CACCR BCMA CAR+T细胞在外源细胞因子不存在的情况下留下，且分选的对照CAR+T细胞在外源细胞因子不存在的情况下留下，用100U/mL人IL-2处理，或者用10ng/mL人IL-15处理。第15天，使用Easy Sep死细胞去除试剂盒(StemCell Technologies)富集活的CAR+T细胞，并将细胞沉淀快速冷冻用于后续RNA提取和NanoString基因表达分析(人CAR-T小组；NanoString Technologies)。参见图3A。

图3B-图3C中的数据显示具有截短的IL2Rb尾的CACCR BCMA CAR-T细胞更接近地模拟IL-15而不是IL-2信号传导。例如，测试了CACCR TpoR(478-582；S505N,W515K).IL2Rb(393-433,518-551)和TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,518-551)。图3A是样品制备的实验设计和工作流程的示意图。图3B示出了从第13-15天开始，用IL-2处理的CACCR BCMA CAR-T细胞与对照CAR-T细胞相比的基因表达谱。图3C示出了从第13-15天开始，用IL-15处理的CACCR CAR-T细胞与对照CAR-T细胞相比的基因表达谱。通过相对于从第13-15天开始未处理的对照CAR-T细胞进行归一化来计算每个样品的Log2倍数变化(FC)。每个图表上示出了通过线性回归分析确定的R2值和最佳拟合线(实线)。所示数据是两个供体中的一个代表。虽然CACCR CAR-T细胞的基因表达谱显示与经过IL-2处理的样品没有相关性(图3B)，但它们与经过IL-15处理的样品正相关(图3C)。这些表明具有截短的IL2Rb尾的CACCR更接近地模拟IL-15而不是IL-2的下游信号传导和转录反应。

实例2：组成型细胞因子受体增强CAR针对液体肿瘤靶标的体外细胞毒性

将CACCR克隆到针对血液恶性肿瘤标志物(即BCMA)的CAR构建体中，并且评价对BCMA阳性靶细胞系的长期细胞毒性。

通过慢病毒转导生成稳定表达萤火虫荧光素酶和GFP报告因子的靶细胞。将10,000个Luc-GFP标记的靶细胞平板接种在白色平底96孔组织培养板中的每孔100uL中。将冷冻保存的CAR-T细胞(具有TRAC/CD52双敲除)解冻，计数，并通过添加未转导的(NTD)T细胞，将所有样品中CAR-T细胞的百分比相对于转导效率最低的样品进行归一化。然后将100uL体积的CAR-T细胞以标明的效应细胞:靶细胞(E:T)比率添加到每个孔的靶细胞中，一式三份。作为“仅靶标”的阴性对照，向靶细胞中添加100uL培养基，而不是T细胞。两天或三天后，通过温和移液将孔混合，并且将每个含有T细胞的孔的100uL转移到新的白色平底96孔组织培养板中，该培养板在100uL中含有10,000个新鲜平板接种的Luc-GFP标记的靶细胞。“仅靶标”的孔接受新鲜培养基代替T细胞。将新板在37℃下孵育，同时根据制造商的说明，使用ONE-Glo荧光素酶测定系统(Promega)测定旧的96孔板中剩余的活靶细胞的数目。通过将荧光素酶信号相对于“仅靶标”的孔的荧光素酶信号进行归一化来计算活靶细胞的百分比，并且按照100％-％活靶细胞计算细胞毒性百分比。每两天或三天进行一次向新鲜靶细胞的连续转移和荧光素酶读数，直到所有细胞毒活性停止。

图4显示CACCR提高了CAR-T细胞针对液体肿瘤靶标BCMA的细胞毒活性。图4示出了BCMA CAR(P5A2 scFv)在E:T＝10:1时对MM.1S多发性骨髓瘤细胞系的细胞毒性，表明CACCR在具有TRAC/CD52双敲除(dKO)的BCMA CAR T细胞中的共表达增加了CAR-T细胞的长期细胞毒性。以下实例中使用的CAR T细胞全部含有TRAC/CD52 dKO。

实例3：CACCR增强CAR-T细胞的体内活性

CAR-T细胞疗法，如那些靶向CD19和BCMA的疗法，在血液恶性肿瘤的治疗中取得了前所未有的临床成功。虽然已经实现了高比例的完全应答，但这是短暂的，因为大多数患者最终会复发。此外，CAR-T细胞在实体瘤治疗方面取得更加有限的成功。复发和缺乏应答的原因包括CAR-T细胞扩增和持久性不足，以及免疫抑制性微环境对CAR-T细胞功能的抑制。由于我们对CACCR CAR-T细胞的体外表征揭示了靶标驱动的增殖、持久性、效力和衰竭特征的改善，我们接下来研究了这些功能增强是否转化为体内抗肿瘤活性的改善。

为了研究CACCR CAR-T细胞在血液恶性肿瘤的情况下的体内活性，我们在多发性骨髓瘤的原位异种移植模型中利用具有与4-1BB和CD3信号传导结构域偶联的BCMA特异性P5A2 scFv的TRAC/CD52 dKO的CAR-T细胞。T细胞受体(TCR)缺陷型BCMA CAR-T细胞通过转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)介导的敲除来生成，以避免TCR驱动的异种反应性的潜在混淆。8-10周龄雌性NSG小鼠在静脉接种5×10⁶个MM.1S-Luc-GFP前一天用1Gy辐照。肿瘤植入后14天，基于肿瘤负荷对小鼠进行随机分组，并静脉给药1×10⁶或3×10⁶个标明的CAR-T细胞(每组n＝10)。通过生物发光成像监测肿瘤进展。在T细胞给药后第30天，对接受3×10⁶个CAR-T细胞的小鼠放血，以进行外周BCMA CAR-T细胞的计数。具体地，使用ACK裂解缓冲液(Gibco)对来自每只小鼠的50uL全血进行红细胞裂解，Fc封闭并用以下稀释于PBS+1％BSA中的抗体混合物进行染色：FITC缀合的抗小鼠CD45(Biolegend)、BV421缀合的抗人CD45(Biolegend)和对P5A2 scFv具有特异性的抗独特型抗体。最后，在FACS分析之前，将样品在PBS中洗涤并将细胞沉淀重悬于含有123count eBeads计数珠粒(Thermo Fisher)的130uLPBS+1％BSA中(10uL计数珠粒在120uL PBS+1％BSA中)。

图5A-图5C显示CACCR提高了BCMA CAR-T细胞对原位多发性骨髓瘤的体内抗肿瘤活性和持久性。图5A-图5B分别示出响应于用1×10⁶或3×10⁶个标明的CAR-T细胞治疗的肿瘤进展。虽然对照BCMA CAR-T细胞能够介导初始肿瘤消退，但这种应答是短期的，因为细胞输注后5天肿瘤复发。然而，共表达CACCR的CAR-T细胞显著延迟了肿瘤复发并改善了应答的持续时间。图5A-图5B中的统计数据表示第6-34天(图5A)和第6-44天(图5B)基于单因素ANOVA与Tukey多重比较的重复测量**p<0.01和***p<0.001。图5C示出在T细胞输注后30天，用3×10⁶个CAR-T细胞治疗的小鼠的外周血中存在的BCMA CAR-T细胞的数目。与在用对照BCMA CAR-T细胞治疗的小鼠中观察到的肿瘤复发一致，在外周不再能够检测到对照BCMACAR-T细胞。相比之下，在预防肿瘤复发方面优良的CACCR BCMA CAR-T细胞在体内也显著更丰富。图5C中的统计数据表示基于普通的单因素ANOVA与Tukey多重比较*p<0.05和****p<0.0001。这些表明，改善的CACCR CAR-T细胞持久性部分介导了增强的长期肿瘤控制并延长了应答的持久性。

图5D-图5E分别示出了已经接受1×10⁶或3×10⁶个CAR T细胞的小鼠的长期存活率。在两种CAR T细胞剂量下，具有TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)CACCR的BCMA CAR T细胞显著延长总生存期。

实例4：评价BCMA CAR T细胞的CACCR

CACCR的模块性质提供了融合源自不同的目标细胞因子受体的信号传导结构域的灵活性。其中，IL-7、IL-2和IL-15在促进T细胞存活、扩增和效应子功能方面具有公认的作用。因此，我们假设BCMA CAR T细胞可在功能上受益于具有IL7Ra或IL2/15Rb信号传导结构域的CACCR，并试图鉴定这些CACCR中的哪些(如果有的话)可以对BCMA CAR T细胞提供最大的增强作用。

通过慢病毒转导生成稳定表达萤火虫荧光素酶和GFP报告因子的表达BCMA的MM.1S或Molp8靶细胞。将10,000个Luc-GFP标记的靶细胞平板接种在白色平底96孔组织培养板中的每孔100uL中。将冷冻保存的TRAC/CD52 dKO CAR T细胞解冻，计数，并通过添加未转导的(NTD)T细胞，将所有样品中CART细胞的百分比相对于转导效率最低的样品进行归一化。然后将100uL体积的CAR T细胞以E:T＝10:1或3:1添加到每个孔的靶细胞中，一式三份。作为“仅靶标”的阴性对照，向靶细胞中添加100uL培养基，而不是T细胞。两天或三天后，通过温和移液将孔混合，并且将每个含有T细胞的孔的100uL转移到新的白色平底96孔组织培养板中，该培养板在100uL中含有10,000个新鲜平板接种的Luc-GFP标记的靶细胞。“仅靶标”的孔接受新鲜培养基代替T细胞。将新板在37℃下孵育，同时根据制造商的说明，使用ONE-Glo荧光素酶测定系统(Promega)测定旧的96孔板中剩余的活靶细胞的数目。通过将荧光素酶信号相对于“仅靶标”的孔的荧光素酶信号进行归一化来计算活靶细胞的百分比，并且按照100％-％活靶细胞计算细胞毒性百分比。每两天或三天进行一次向新鲜靶细胞的连续转移和荧光素酶读数，直到所有细胞毒活性停止。

图6示出了使用体外连续杀伤测定对具有标明的CACCR的TRAC/CD52dKO CACCR-BCMA CAR T细胞的功能筛选。使用两种表达不同水平的内源性BCMA的靶细胞系—中等表达MM.1S-Luc-GFP(高BCMA表达细胞系)和低表达Molp8-Luc-GFP(低BCMA表达细胞系)。图6A示出了双顺反子CACCR-BCMA CAR慢病毒构建体的示意图。含有克隆P5A2 scFv和R2的BCMACAR构建体在整个该实例中使用。将CACCR克隆在EF1a启动子的下游和第2代BCMA CAR的上游。包括野生型WPRE序列以稳定转录物表达。图6B和图6C分别示出了具有IL2Rb来源的CACCR的CACCR-BCMA CAR对MM.1S-Luc-GFP和Molp8-Luc-GFP的连续杀伤活性。测试的所有IL2Rb来源的CACCR提高了BCMA CAR T细胞的活性，并且TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)CACCR赋予最强的增强作用。图6D和图6E示出了具有活性最高的IL2Rb来源的CACCR和具有IL7Ra的CACCR的CACCR-BCMA CAR的连续杀伤活性。与IL2Rb来源的CACCR不同，具有IL7Ra的CACCR在两种靶细胞系中都没有增强BCMA CART细胞的活性。

为了评价CACCR-BCMA CAR的体内抗肿瘤活性，我们利用多发性骨髓瘤的原位异种移植模型，其中疾病最初建立于骨髓中，随后在髓外部位发生复发。简言之，8-10周龄雌性NSG小鼠在静脉接种5×10⁶MM.1S-Luc-GFP的前一天用1Gy辐照。肿瘤植入后15天，基于肿瘤负荷对小鼠进行随机分组并且对每只小鼠静脉输注标明数目的TRAC/CD52 dKO CACCR-BCMA CAR T细胞(每组n＝10只小鼠)。此后，通过生物发光成像每周两次监测肿瘤负荷。

图7示出了相对于未修饰的BCMA CAR，5×10⁶个具有IL7Ra或IL2Rb来源的CACCR的CACCR-BCMA CAR T细胞的抗肿瘤活性。图7A示出了每组的肿瘤进展。在实验条件下，尽管未修饰的BCMA CAR T细胞能够介导初始肿瘤消退，但疾病最终复发。IL7Ra来源的CACCR未增强BCMA CAR T细胞的活性。虽然TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(393-433,528-551)CACCR显示肿瘤复发有一定延迟，但是TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)CACCR提供了最持久的应答。这些CACCR的体内性能证实了图6中体外活性的等级排序。图表示出了平均值±sem；基于第6-48天的RM单因素ANOVA和Tukey多重比较，*p<0.05和*p<0.001。图7B示出了每组中单个小鼠的应答。已接受未修饰的BCMACAR T细胞的小鼠最初应答不一致，并且最终都复发了髓外肿瘤。相比之下，已接受具有TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)CACCR的CACCR-BCMA CAR最初应答一致，并显示出持久的长期应答，其中9/10的小鼠在研究结束时保持无肿瘤。

图8示出了在1×10⁶或3×10⁶的剂量下，IL2Rb来源的CACCR相对于未修饰的BCMACAR的抗肿瘤活性，全部为TRAC/CD52 dKO。每组测试10只雌性NSG小鼠。每只小鼠接受5x10⁶个MM.1S luc2 GFP细胞。图8A示出了接受低剂量1×10⁶个CAR T细胞的小鼠的总生存期。虽然TpoR(478-582；S505N,W515K).IL2Rb(393-433,528-551)CACCR相对于未修饰的BCMA CART细胞对总生存期没有影响，但是TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)CACCR明显延长了总生存期。图8B示出了已接受3×10⁶个CAR T细胞的小鼠的肿瘤进展。虽然所有组都经历了初始肿瘤消退，但已接受未修饰的BCMA CAR T细胞的小鼠很快复发。两种CACCR都能够延迟复发，TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)CACCR引起最持久的应答。图8C示出了已接受3×10⁶个CAR T细胞的单个小鼠的应答。与经过未修饰的BCMA CAR T处理的组中1/10的无肿瘤小鼠相比，共表达TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)CACCR的BCMA CAR T细胞到研究结束时在5/10小鼠中介导肿瘤清除。总的来说，这些数据证明在测试的IL7Ra和IL2Rb来源的CACCR中，TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)CACCR赋予BCMA CART细胞最强的增强作用。

实例5：CACCR-BCMA CAR的可制造性和功能活性

CAR T细胞通常是通过基于病毒的基因递送生成的，这为载体货物大小施加了上限。虽然在同一载体中与CAR共表达另外的修饰可以增强CAR T细胞活性，但是增加货物大小可能会损害转导效率和产品的可制造性。接下来，我们检查了大量CACCR-BCMA CAR的功能活性和CAR⁺T细胞收率，并与它们未修饰的对应物进行比较。

如下生成BCMA CAR T细胞。为了制备编码相应BCMA CAR的慢病毒，在转染前一天，将HEK293T细胞以45万个细胞/mL平板接种在6孔板的每个孔中补充有10％FBS(Hyclone)的2mL DMEM(Gibco)中。在转染当天，通过将慢病毒包装载体1.5ug psPAX2、0.5ug pMD2G和0.5ug的适当转移CAR载体一起混合在6孔板的每个孔中的250uL Opti-MEM(Gibco)中来制备慢病毒(“DNA混合物”)。将在250uL Opti-MEM中的10uL Lipofectamine 2000(Invitrogen)在室温下孵育5分钟，然后添加到DNA混合物中。将混合物在室温下孵育20分钟并将500uL总体积缓慢添加到含有HEK293T的孔的侧面。转染后1天，用每孔2mL的T细胞转导培养基，即补充有10％FBS的X-Vivo-15，更换6孔板中每个孔的HEK293T细胞的培养基。转染后2天，收获来自HEK293T细胞的慢病毒上清液并使其通过0.45微米过滤器(EMDMillipore)以去除细胞碎片，并将粗制慢病毒上清液直接用于T细胞转导。第0天，在Grex-24板(Wilson Wolf，目录号#80192M)中，在补充有100IU/mL人IL-2(Miltenyi Biotec)、10％FBS(Hyclone)和人T TransAct(Miltenyi Biotec，目录号#130-111-160，1:100稀释)的X-Vivo-15培养基(Lonza)中活化纯化的T细胞。第2天，将T细胞以50万个细胞/mL重悬于T细胞转导培养基中，在Grex-24板中用等体积的粗制慢病毒上清液和100IU/mL人IL-2进行转导。第5天，通过用T细胞扩增培养基，即补充有5％人AB血清(Gemini Bio)和100IU/mL人IL-2的X-Vivo-15更换用过的培养基来饲养细胞。第6天，TCRa恒定(TRAC)和CD52基因通过转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)介导的基因编辑敲除。参见例如，US2016/0145337。根据需要，使用T细胞扩增培养基和100IU/mL人IL-2将细胞扩增到更大的G-Rex容器(WilsonWolf)中。第14天，使用EasySep人TCRa/b耗竭试剂盒(Stem Cell Technologies)纯化TCRa/b^-细胞，并在第15天冷冻保存之前在T细胞扩增培养基和100IU/mL人IL-2中静置过夜。第5天和第15天，通过流式细胞术使用PE缀合的抗独特型抗体检测P5A2 scFv来确定CAR阳性。

图9示出了具有在慢病毒构建体中转导的CACCR-BCMA CAR的T细胞的可制造性和收率。图9A示出了CACCR-BCMA CAR慢病毒构建体的示意图，其中强EF1a启动子驱动CACCR和BCMA CAR从双顺反子开放阅读框的表达，并且转录物表达被野生型(wt)WPRE序列稳定。图9B示出了CAR T细胞生产过程的第5天(转导后3天)和第15天(最后一天)的初始转导效率。正如预期的，CACCR-BCMA CAR在第5天转导效率较低，因为它们的货物大小较大。然而，CACCR赋予CACCR-BCMA CAR增殖优势，允许CACCR-BCMA CAR⁺T细胞更快地富集并在第15天生产结束时达到同等CAR阳性水平。图9C显示CACCR-BCMA CAR⁺T细胞的收率等于或大于未修饰的BCMA CAR⁺T细胞的收率。收率定义为生产结束时获得的CAR+T细胞的最终数目/生产第0天每百万个泛T细胞原材料。图9B和图9C中的数据示出了3个供体的平均值±sem。尽管CACCR-BCMA CAR具有较大的货物大小，但CACCR-BCMA CAR较低的初始转导效率被其在生产过程中更快的富集所抵消，使其保持与未修饰的对应物同等的可制造性。

据报道，野生型WPRE可编码截短的X蛋白，该蛋白可能具有致癌风险。为了减轻这种安全性风险，野生型WPRE可以突变(例如通过使起始密码子失活)以消除X蛋白表达。由于最初测试的CACCR-BCMA CAR慢病毒载体含有野生型WPRE序列，我们试图确定对突变序列的取代是否会影响CACCR-BCMA CAR的表达和功能性。

如下生成BCMA CAR T细胞。为了制备编码相应BCMA CAR的慢病毒，在转染前一天，将HEK293T细胞以45万个细胞/mL平板接种在6孔板的每个孔中补充有10％FBS(Hyclone)的2mL DMEM(Gibco)中。在转染当天，通过将慢病毒包装载体1.5ug psPAX2、0.5ug pMD2G和0.5ug的适当转移CAR载体一起混合在6孔板的每个孔中的250uL Opti-MEM(Gibco)中来制备慢病毒(“DNA混合物”)。将在250uL Opti-MEM中的10uL Lipofectamine 2000(Invitrogen)在室温下孵育5分钟，然后添加到DNA混合物中。将混合物在室温下孵育20分钟并将500uL总体积缓慢添加到含有HEK293T的孔的侧面。转染后一天，用每孔2mL的T细胞转导培养基，即补充有10％FBS的X-Vivo-15，更换6孔板中每个孔的HEK293T细胞的培养基。转染后2天，收获来自HEK293T细胞的慢病毒上清液并使其通过0.45微米过滤器(EMDMillipore)以去除细胞碎片，并将粗制慢病毒上清液直接用于T细胞转导。第0天，在Grex-24板(Wilson Wolf，目录号#80192M)中，在补充有100IU/mL人IL-2(Miltenyi Biotec)、10％FBS(Hyclone)和人T TransAct(Miltenyi Biotec，目录号#130-111-160，1:100稀释)的X-Vivo-15培养基(Lonza)中活化纯化的T细胞。第2天，将T细胞以50万个细胞/mL重悬于T细胞转导培养基中，在Grex-24板中用等体积的粗制慢病毒上清液和100IU/mL人IL-2进行转导。第5天，通过用T细胞扩增培养基，即补充有5％人AB血清(Gemini Bio)和100IU/mL人IL-2的X-Vivo-15更换用过的培养基来饲养细胞。第6天，TCRa恒定(TRAC)和CD52基因通过转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)介导的基因编辑敲除。根据需要，使用T细胞扩增培养基和100IU/mL人IL-2将细胞扩增到更大的G-Rex容器(Wilson Wolf)中。第14天，使用EasySep人TCRa/b耗竭试剂盒(Stem Cell Technologies)纯化TCRa/b^-细胞，并在第15天冷冻保存之前在T细胞扩增培养基和100IU/mL人IL-2中静置过夜。第5天和第15天，通过流式细胞术使用PE缀合的抗独特型抗体检测P5A2 scFv来确定CAR阳性。

在如下的连续杀伤测定中评价BCMA CAR T细胞的体外细胞毒性。通过慢病毒转导生成稳定表达萤火虫荧光素酶和GFP报告因子的表达BCMA的MM.1S或Molp8靶细胞。将10,000个Luc-GFP标记的靶细胞平板接种在白色平底96孔组织培养板中的每孔100uL中。将冷冻保存的TRAC/CD52 dKO CAR T细胞解冻，计数，并通过添加未转导的(NTD)T细胞，将所有样品中CART细胞的百分比相对于转导效率最低的样品进行归一化。然后将100uL体积的CART细胞以E:T＝3:1添加到每个孔的靶细胞中，一式三份。作为“仅靶标”的阴性对照，向靶细胞中添加100uL培养基，而不是T细胞。两天或三天后，通过温和移液将孔混合，将各100uL含有T细胞的孔转移到新的白色平底96孔组织培养板中，该培养板含有100uL的10,000个新鲜平板接种的Luc-GFP标记的靶细胞。“仅靶标”的孔接受新鲜培养基代替T细胞。将新板在37℃下孵育，同时根据制造商的说明，使用ONE-Glo荧光素酶测定系统(Promega)测定旧的96孔板中剩余的活靶细胞的数目。通过将荧光素酶信号相对于“仅靶标”的孔的荧光素酶信号进行归一化来计算活靶细胞的百分比，并且按照100％-％活靶细胞计算细胞毒性百分比。每两天或三天进行一次向新鲜靶细胞的连续转移和荧光素酶读数，直到所有细胞毒活性停止。

图10示出了对突变(mut)WPRE序列的取代对CACCR-BCMA CART细胞可制造性和功能性的影响。图10A示出了与野生型或突变WPRE序列一起使用的载体的示意图。图10B示出了CACCR-BCMA CAR的初始和最终CAR积极性。CACCR-BCMA CAR转导效率(第5天)和富集(第15天)不受向mutWPRE转换的影响。图10C显示CACCR-BCMA CAR的最终CAR⁺收率不受向mutWPRE转换的影响。图10D显示尽管CACCR-BCMA CAR T细胞的CAR表达低于其未修饰的对应物，但CACCR-BCMA CAR T细胞上的CAR表达水平不受向mutWPRE转换的影响。图10B-图10D中的数据示出了3个供体的平均值±sem。图10E示出了CACCR-BCMA CAR对MM.1S-Luc-GFP和Molp8-Luc-GFP细胞系的体外连续杀伤活性。与未修饰的BCMA CAR T细胞相比，具有野生型或突变WPRE的CACCR-BCMA CAR T细胞均显示出增强的连续杀伤活性，证明向mutWPRE转换并不损害CACCR-BCMA CAR功能。所示数据是来自产生相似结果的两个供体之一的平均值±sem。

使用基于PBMC的TRAC/CD52 dKO CAR T细胞以E:T＝10:1进行连续杀伤。在PBMC来源的CACCR BCMA CAR T细胞中保持了增强的连续杀伤活性。参见图10F。所示数据表示3个供体的平均值±sem。

如图9所示，CACCR-BCMA CAR较低的初始转导效率被经过转导的CAR T细胞更快的富集和生长优势所抵消，导致CAR T细胞与未修饰的CAR T细胞同等的收率。然而，我们试图通过探索减小货物大小的替代载体设计，同时保持CACCR-BCMA CAR功能增强来进一步提高CACCR-BCMA CAR T细胞转导效率和收率。通过将收率和功能活性与图10A所示的原始载体进行比较，研究了三种载体设计:(i)没有3’WPRE序列的EF1a驱动的载体，(ii)由最小EF1a(短)启动子驱动的载体，和(iii)由MND启动子驱动的载体(骨髓增生性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失，dl587rev引物结合位点被取代)。

生成TRAC/CD52 dKO CACCR-BCMA CAR T细胞并如先前所述进行表征。

为了评价CACCR信号传导，将生产过程结束时的CACCR-BCMA CAR T细胞在湿润培养箱中在37℃和5％CO₂下在100uL无血清RPMI(Corning)中进行血清饥饿4小时。作为阳性对照，在4小时血清饥饿的最后30分钟期间将外源重组人IL-2(10ng/mL；Miltenyi)添加到未修饰的CAR T细胞中。4小时后，向细胞中添加包含BUV395缀合的抗人CD3(Biolegend)和FITC缀合的v5标签单克隆抗体(Thermo Fisher)的抗体混合物，并允许孵育最后20分钟。然后通过向每100uL样品中添加35uL的16％多聚甲醛来固定细胞，并允许在37℃下孵育15分钟。然后将细胞用PBS洗涤三次，并在-20℃下在100％冷甲醇中透化1夜或2夜。在FACS分析当天，将细胞用PBS洗涤三次，Fc封闭，并用稀释于PBS+1％BSA中的AlexaFluor647缀合的抗小鼠/人Stat5(pY694)(BD Biosciences)进行染色。在室温下黑暗中孵育1小时后，在FACS分析前洗涤细胞3次。

如先前所述，在标明的E:T比率下进行连续杀伤测定。

在一些情况下，使用多发性骨髓瘤的原位模型评估体内抗肿瘤活性。8-10周龄雌性NSG小鼠在静脉接种5×10⁶个MM.1S-Luc-GFP前一天用1Gy辐照。肿瘤植入后14天，基于肿瘤负荷对小鼠进行随机分组，并静脉给药3×10⁶个标明的CAR-T细胞(每组n＝10)。通过生物发光成像监测肿瘤进展。

图11示出了从原始载体中去除WPRE的影响。图11A是所使用的CACCR-BCMA CAR载体的示意图。图11B和图11C分别示出了标明的构建体的最终CAR阳性和CAR⁺收率。尽管载体货物减小，但去除WPRE并未显著提高最终的CACCR-BCMA CAR百分比或收率。图11C和图11D分别示出了正如通过pSTAT5染色强度确定的CAR表达水平和CACCR信号传导强度。在静止的CACCR-BCMA CAR T细胞产物中，去除WPRE并未降低CAR表达或CACCR信号传导强度。图11B-图11D中的数据示出了3个供体的平均值±sem。图11F-图11H示出了有或没有WPRE的三种不同的IL2Rb来源的CACCR-BCMA CAR的连续杀伤活性。虽然TpoR(478-582；S505N,W515K).IL2Rb(393-433,528-551)(图11F)和TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(393-433,528-551)CACCR的细胞毒性在去除WPRE后略有降低，但活性最高的TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)CACCR不受WPRE去除的影响。图11F-图11H中的数据是来自产生相似结果的两个供体之一的平均值±sem。

图12示出了用全长(FL)EF1a启动子取代较弱的最小EF1a(短)(S)启动子的作用。图12A是所使用的CACCR-BCMA CAR载体的示意图。图12B示出了由全长(FL)或短(S)EF1a启动子驱动的标明的构建体的最终CAR阳性。对于未修饰的和CACCR-BCMA CAR T细胞两者，利用较小的EF1a(短)启动子提高了总转导效率和最终CAR百分比。图12C和图12D分别示出了由EF1a或EF1a(短)启动子驱动的CAR T细胞对MM.1S-Luc-GFP和Molp8-Luc-GFP靶细胞的连续杀伤活性。虽然对EF1a(短)启动子的取代并不影响未修饰的BCMA CAR T细胞的活性，但是EF1a(短)驱动的CACCR-BCMA CAR T细胞不如它们的EF1a(全长)驱动的对应物有效。尽管具有EF1a(短)启动子的构建体改善了CACCR-BCMA CAR的可制造性，但是CACCR-BCMA CAR活性的伴随损失破坏了EF1a(短)CACCR CAR构建体的进一步使用。所示数据来自一个代表性供体。

图13示出了用全长(FL)EF1a启动子取代MND启动子的作用。图13A是所使用的CACCR-BCMA CAR载体的示意图。图13B和图13C示出了由EF1a或MND启动子驱动的标明的构建体的最终CAR阳性和收率。利用较小的MND启动子提高了CACCR-BCMA CART细胞的总转导效率、最终CAR百分比和收率。图13D示出了CAR表达水平。由MND启动子驱动的CACCR-BCMACAR T细胞具有更高的CAR表达，表明MND启动子比EF1a启动子更强。图13B-图13D中的数据示出了2个供体的平均值±sd。图13E和图13F示出了由EF1a或MND启动子驱动的CAR T细胞对MM.1S-Luc-GFP和Molp8-Luc-GFP靶细胞的连续杀伤活性。图13E显示TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)CACCR在由MND启动子驱动时活性降低。这一点用图13F中的替代CACCR得以证实，其中对MND启动子的取代消除了TpoR(478-582；S505N,W515K).IL2Rb(393-433,528-551)CACCR的增强作用。图13E和图13F中的数据是来自产生相似结果的两个供体之一的平均值±sem。图13G示出了由EF1a或MND启动子驱动的CACCR-BCMA CAR的体内抗肿瘤活性。与增强抗肿瘤功效的EF1a驱动的CACCR-BCMA CAR T细胞相比，对MND启动子的取代消除了所有功能增强。图13G中的数据示出了平均值±sem；基于第5-48天的RM单因素ANOVA和Tukey多重比较，***p<0.01和****p<0.0001。

总的来说，EF1a-TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)-BCMA CAR.WPRE的原始载体形式仍然是功能活性最高的，同时保留了与未修饰的BCMA CAR对应物同等的可制造性。由于使用野生型或突变WPRE不影响CACCR-BCMA CAR活性(图10)并且mutWPRE减轻了与X蛋白表达相关的潜在安全性风险，所以选择EF1a-TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)-BCMA CAR.mutWPRE进一步研究。

实例6：CACCR-BCMA CAR效力和持久性的功能表征

为了阐明CACCR-BCMA CAR提高CAR T细胞活性的机制，我们在体外重复靶标暴露后表征了CACCR-BCMA CART细胞的功能和表型。

如先前所述生成TRAC/CD52 dKO CAR T细胞。在测定的第0天，将冷冻保存的TRAC/CD52 dKO CAR T细胞解冻，并通过添加未转导的(NTD)T细胞，将所有样品中CART细胞的百分比相对于转导效率最低的样品进行归一化。将3×10⁵个CAR+T细胞和1×10⁵个MM.1S-Luc-GFP-靶细胞以3:1的E:T平板接种在48孔组织培养板中，每孔总体积为750uL。为每种条件设置重复孔。作为比较，将10ng/mL重组人IL-15(Miltenyi)添加到未修饰的CAR T细胞和靶细胞的共培养物中。此后每2天或3天，通过温和移液将孔彻底混合，并且从每个孔中取出200uL，丢弃或用于如下所述的流式细胞仪分析。然后为孔补充2×10⁵个新鲜MM.1S-Luc-GFP-靶细胞，体积为200uL。在经过IL-15处理的孔中，每周补充两次10ng/mL重组人IL-15。

为了评估CAR T细胞扩增和记忆T细胞分化，从48孔板的每个孔中取出200uL，并重新平板接种在96孔U形底板的一个孔中。将细胞用PBS洗涤并用Zombie-NIR可固定活力试剂盒(Biolegend)染色。然后将细胞用PBS洗涤，Fc封闭，并用稀释于PBS+1％BSA中的用于检测P5A2 scFv的PE缀合的抗独特型抗体，BV605缀合的抗人CD4(Biolegend)、BV510缀合的抗人CD8(Biolegend)、PE/Cy7缀合的抗人CD62L(Biolegend)和BV785缀合的抗人CD45RO进行染色。洗涤后，在流式细胞术分析之前，将细胞重悬于含有123count eBeads计数珠粒(ThermoFisher)的100uL PBS+1％BSA中(10uL计数珠粒在90uL PBS+1％BSA中)。

为了评价活化诱导的细胞死亡(AICD)，从48孔板的每个孔中取出200uL，并重新平板接种在96孔U形底板的两个孔中，每孔100uL。将体积为100uL的1×10⁵个MM.1S-Luc-GFP-个靶细胞添加到96孔U形底板中的这些孔中的一个孔中，而另一个孔未刺激作为基线比较。4小时后，通过流式细胞术测定死亡的CAR T细胞的百分比。简言之，将细胞用PBS洗涤并用Zombie-NIR可固定活力试剂盒(Biolegend)染色。然后将细胞用PBS洗涤，Fc封闭，并用稀释于PBS+1％BSA中的用于检测P5A2 scFv的PE缀合的抗独特型抗体，BV605缀合的抗人CD4(Biolegend)和BV510缀合的抗人CD8(Biolegend)进行染色。

对于细胞内细胞因子染色，从48孔板的每个孔中取出200uL，并将100uL重新平板接种到96孔U形底板的一个孔中。将体积为100uL的1×10⁵个MM.1S-Luc-GFP-个靶细胞与蛋白转运抑制剂混合物(Invitrogen)一起添加到96孔U形底板中的这些孔中的一个孔中。4小时后，对细胞进行表面标志物和细胞内细胞因子染色。简言之，将细胞用PBS洗涤并用Zombie-NIR可固定活力试剂盒(Biolegend)染色。然后将细胞用PBS洗涤，Fc封闭，并用稀释于PBS+1％BSA中的用于检测P5A2 scFv的PE缀合的抗独特型抗体，BV605缀合的抗人CD4(Biolegend)和BV510缀合的抗人CD8(Biolegend)进行染色。洗涤后，使用BD Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)根据制造商的说明固定和透化细胞，并在流式细胞术分析前用PE/Cy7缀合的抗人IFNg(Biolegend)、BV785缀合的抗人TNFa(Biolegend)和PE/Dazzle594缀合的抗人IL-2(Biolegend)进行染色。

图14示出了在两个供体中重复靶标暴露后的CAR T细胞扩增。所示插图是在测定的前15天期间的CAR T细胞扩增谱。在两个供体中，CACCR-BCMA CAR(EF1a-TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)-BCMA CAR_mutWPRE)均展现出最强的靶标驱动扩增能力。数据以平均值±sem呈现。

图15示出了随着对靶细胞暴露的增加，CAR T细胞对AICD的敏感性。图15A显示已经经历了前一轮靶标暴露(在第0天)的CAR T细胞在第二次靶暴露后对AICD具有同等敏感性，而与CACCR表达或IL-15处理无关。图15B显示在第7天多轮靶标暴露后，未修饰的BCMACAR T细胞对AICD高度敏感，而CACCR-BCMA CART细胞和经过IL-15处理的BCMA CAR T细胞受到保护免于AICD。不打算限于特定机制，数据表明细胞因子信号传导–通过CACCR或补充的IL-15–可以帮助CAR T细胞抵抗AICD并提高存活率，特别是在长期靶标暴露后。数据作为来自产生相似结果的两个供体之一的平均值±sem呈现。

图16示出基于测定第7天细胞内细胞因子染色的CAR T细胞的细胞因子表达谱。图16A示出表达标明的细胞因子的CAR+T细胞的百分比。与未修饰的BCMA CAR相比，CACCR-BCMA CART细胞和经过IL-15处理的CAR T细胞表达更高水平的效应细胞因子。图16B示出了CAR T细胞的多功能性，正如通过它们共表达2种或3种效应细胞因子的能力所确定的。与未修饰的BCMA CAR T细胞相比，具有EF1a-TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)-BCMA CAR mutWPRE构建体的细胞展现出最大程度的多功能性。数据示出来自产生相似结果的两个供体之一的平均值±sd。

图17示出在测定第15天CAR T细胞的记忆表型。与未修饰的BCMA CAR T细胞相比，CACCR-BCMA CART细胞示出干细胞记忆(T_SCM)和中央记忆(T_CM)群体的略微富集，已知这些群体会介导长期CAR T细胞的持久性。

为了监测CACCR-BCMA CART细胞的体内药代动力学，我们使用Molp8-Luc-GFP细胞系在多发性骨髓瘤的原位模型中追踪CAR T细胞的扩增和持久性。Molp8-Luc-GFP细胞系比MM.1S-Luc-GFP表达更低水平的BCMA，并且代表对治疗高度耐受的多发性骨髓瘤模型。简言之，8-10周龄雌性NSG小鼠在静脉接种2×10⁶个Molp8-Luc-GFP的前一天用1Gy辐照。肿瘤植入后8天，基于肿瘤负荷对小鼠进行随机分组并且对每只小鼠静脉输注1×10⁶或5×10⁶个TRAC/CD52 dKO BCMA CAR T细胞(每组n＝10只小鼠)。此后，通过生物发光成像每周两次监测肿瘤负荷，并在标明的时间点对已接受5×10⁶个CAR T细胞的小鼠放血，以进行外周BCMACAR T细胞的计数。具体地，使用ACK裂解缓冲液(Gibco)对来自每只小鼠的50uL全血进行红细胞裂解，Fc封闭并用以下稀释于PBS+1％BSA中的抗体混合物进行染色：FITC缀合的抗小鼠CD45(Biolegend)、BV421缀合的抗人CD45(Biolegend)和用于检测P5A2 scFv的PE缀合的抗独特型抗体。最后，在流式细胞术分析之前，将样品在PBS中洗涤并将细胞沉淀重悬于含有123count eBeads计数珠粒(Thermo Fisher)的250uL PBS+1％BSA中(10uL计数珠粒在240uL PBS+1％BSA中)。

图18示出在已接受5×10⁶个CAR T细胞的具有Molp8-Luc-GFP的小鼠中BCMA CART细胞的扩增和持久性。图18A显示虽然未修饰的BCMA CAR T细胞经历了初始扩增，但其数目在CAR T细胞输注的2周内快速下降。相比之下，CACCR-BCMA CAR T细胞的扩增与未修饰的对应物同等或更好，并在体内显示出延长的持久性。图18B示出了来自外周血的BCMA CART细胞中的CAR表达水平(gMFI)。尽管在体外CAR T细胞产物中没有检测到CAR表达的差异(图11D)，但是EF1a-TpoR(478-582；H499L,S505N,W515K).IL2Rb(339-379,393-433,528-551)-BCMA CAR_noWPRE构建体在体内相对于其具有WPRE的对应物显示出更低的CAR表达。数据示出平均值±sem。

图19A-图19B示出了已经接受1×10⁶或5×10⁶个CAR T细胞的小鼠的总生存期。图19B示出了扩展结果。在两种剂量下，CACCR-BCMA CAR T细胞延长总生存期。值得注意的是，经过1×10⁶个CACCR-BCMA CAR治疗的小鼠的中位生存期为61天，是与用5×10⁶个未修饰的BCMA CAR T细胞治疗的小鼠中57天的中位生存期同等的。

图20示出了已接受5×10⁶个CAR T细胞的单个小鼠的肿瘤负荷。用未修饰的BCMACART细胞治疗的小鼠在第36天以后一致显示出疾病进展。相比之下，输注CACCR-BCMA CART细胞能够大幅延迟一部分小鼠中的疾病进展。因此，CACCR-BCMA CAR T细胞的更大持久性与改善的肿瘤控制相关。

实例7：CACCR-BCMA CART细胞的活性是靶标依赖性的

为了使CACCR-BCMA CAR T细胞有效且安全，我们接下来研究了它们的活性是否受CAR介导的靶标识别控制，以及在CAR不存在的情况下CACCR信号传导是否不足以诱导细胞毒性应答。

为了评价CACCR-BCMA CAR T细胞的细胞毒性和效应子应答，使用稳定地过表达BCMA(REH-BCMA)的REH-Luc-GFP或亲本BCMA阴性REH-Luc-GFP作为靶细胞进行过夜细胞毒性测定。如先前所述生成TRAC/CD52 dKO CAR T细胞。将冷冻保存的TRAC/CD52 dKO CAR T细胞解冻，并通过添加未转导的(NTD)T细胞，将所有样品中CAR T细胞的百分比相对于转导效率最低的样品进行归一化。将体积为100uL的10,000个靶细胞添加到白色平底96孔组织培养板的每个孔中。然后将100uL体积的CAR T细胞以标明的E:T比率添加到每个孔的靶细胞中，一式三份。作为“仅靶标”的阴性对照，向靶细胞中添加100uL培养基，而不是T细胞。24小时后，使用ONE-Glo荧光素酶测定系统(Promega)根据制造商的说明确定剩余活的靶细胞的数目。通过将荧光素酶信号相对于“仅靶标”的孔的荧光素酶信号进行归一化来计算活靶细胞的百分比，并且按照100％-％活靶细胞计算细胞毒性百分比。

为了评价CACCR-BCMA CAR T细胞的细胞因子分泌谱，将体积为250uL的2.5×10⁵个REH-BCMA或亲本REH细胞平板接种在24孔板的每个孔中。将冷冻保存的TRAC/CD52 dKOCAR T细胞解冻，并通过添加未转导的(NTD)T细胞，将所有样品中CART细胞的百分比相对于转导效率最低的样品进行归一化。然后将250uL体积的CAR T细胞以E:T＝1:1添加到每个孔的靶细胞中，一式两份。为了评估CACCR-BCMA CAR T细胞是否分泌升高的基础水平的细胞因子，将CAR T细胞单独培养，并添加250uL培养基代替靶细胞。24小时后，将板离心并且从每个孔中收获200uL上清液，并储存在-80℃下用于Luminex分析。在Luminex分析当天，将冷冻的培养物上清液解冻并稀释4倍或16倍，之后使用MILLIPLEX MAP人高灵敏度T细胞组预混21-plex-免疫学多重测定，根据制造商的说明进行分析。

图21显示在BCMA不存在的情况下，CACCR-BCMA CAR T细胞不发挥细胞毒性效应子功能。图21A示出了CACCR-BCMA CAR T细胞在与REH-BCMA或BCMA阴性REH共培养24小时后的细胞毒性。正如预期的，未修饰的BCMA CAR和CACCR-BCMA CART细胞显示出对REH-BCMA靶细胞的剂量依赖性杀伤。相比之下，无论是未经修饰的BCMA CAR还是CACCR-BCMA CAR T细胞都不能杀伤BCMA阴性REH细胞。图21B示出了CACCR-BCMA CAR T细胞在暴露于REH-BCMA、BCMA阴性REH或单独的培养基(仅T细胞)24小时后的细胞因子分泌谱。正如预期的，所有BCMA CAR T细胞分泌高和同等水平的IFN和GM-CSF，并在较低程度上响应于REH-BCMA分泌IL-2。响应于BCMA阴性REH，或单独用CAR T细胞，所有BCMA CAR T细胞几乎不分泌细胞因子，CACCR-BCMA CAR T细胞显示出与其未修饰的对应物非常相似的特征。这些数据证明，CACCR不会增加CACCR-BCMA CAR T细胞的BCMA非依赖性细胞毒性或效应子功能。

为了评估单独的CACCR信号传导是否足以驱动CACCR-BCMA CAR T细胞的明显扩增，我们进行了生长因子非依赖性测定，其中CACCR-BCMA CAR T细胞在靶标或外源细胞因子不存在的情况下培养。如先前所述生成TRAC/CD52 dKO CAR T细胞。将冷冻保存的TRAC/CD52 dKO CAR T细胞解冻，并通过添加未转导的(NTD)T细胞，将所有样品中CART细胞的百分比相对于转导效率最低的样品进行归一化。将2.5×10⁵个CAR T细胞/mL以1.5-2mL的体积平板接种在24孔组织培养板中，一式两份。作为阳性对照，在每周补充的10ng/mL重组人IL-15的存在下培养未修饰的BCMA CAR T细胞。在标明的时间点，通过移液将孔彻底混合，并从每个孔中收获100uL，用于通过流式细胞术分析进行CAR T细胞计数。简言之，将细胞用PBS洗涤并用Zombie-NIR可固定活力试剂盒(Biolegend)染色。然后将细胞用PBS洗涤，Fc封闭，并用，稀释于PBS+1％BSA中的用于检测P5A2 scFv的PE缀合的抗独特型抗体，BV605缀合的抗人CD4(Biolegend)和BV510缀合的抗人CD8(Biolegend)进行染色。洗涤后，在流式细胞术分析之前，将细胞重悬于含有123count eBeads计数珠粒(Thermo Fisher)的100uL PBS+1％BSA中(10uL计数珠粒在90uL PBS+1％BSA中)。在测定的第70天，通过添加培养基将每个孔稀释2倍，并通过乘以2倍相应地归一化后续时间点的CAR T细胞计数。

图22A示出在靶标和外源细胞因子不存在的情况下，CACCR-BCMA CAR T细胞比未修饰的BCMA CAR T细胞更持久。与在3周内下降的未修饰的CAR T细胞相比，CACCR-BCMACAR T细胞在生长因子非依赖性测定中显示出延长的持久性。然而，CACCR-BCMA CAR T细胞并未显示出明显增殖，而是经历了缓慢但平稳的下降。数据标明，虽然CACCR信号传导可以延长CACCR-BCMA CAR T细胞生存期，但单独的CACCR信号传导不足以驱动CACCR-BCMA CART细胞扩增，也不能维持无限期生存。使用IL2作为生长因子重复生长因子非依赖性测定，并且进一步在体外通过细胞计数和Ki-67分析评估CACCR BCMA CAR T细胞在靶标和外源细胞因子刺激不存在的情况下扩增的能力。

简言之，第0天将TRAC/CD52 dKO CAR T细胞悬浮在测定培养基(含有10％FBS(Hyclone)的X-VIVO15培养基(Lonza))中，达到1x 10⁶个细胞/ml的最终浓度。将各500μl(5x 10⁵个细胞)的样品平板接种在24孔组织培养板的一式四份的孔中。向每个孔中添加1ml测定培养基以使最终体积达到1.5ml。将1.5ml的PBS添加到24孔板的外孔中以防止培养基蒸发。一周两次，将每个孔中的细胞混合并将每个孔的750l转移到含有750l新鲜测定培养基的新24孔板中。作为阳性对照，添加1ml以5x 10⁵个细胞/ml的最终浓度悬浮的经过辐照的MM.1S细胞代替测定培养基，同时添加最终浓度为50IU/ml的IL-2。一周两次，将每个阳性孔中的细胞混合并将每个孔的750l转移到含有750l新鲜测定培养基的新24孔板中，同时添加最终浓度为50IU/ml的IL-2。每个孔中剩余的体积用于使用NC-200分析仪测量总活细胞(TVC)。继续测定，直到每个试验样品中的所有细胞计数在NC-200仪器上读数为零。通过将特定时间点的TVC除以第0天的TVC来计算活细胞的倍数扩增。对于第0天之后的每个时间点。TVC值通过乘以2归一化，以说明每周发生两次的样品稀释倍数。

对于评估活性细胞周期中的细胞的Ki-67分析，在第0、3、7和14天，收获细胞并用2mL含BSA的染色缓冲液(BD Biosciences)洗涤。将细胞悬浮在100L含预滴定量的每种一抗的染色缓冲液中。对于CAR检测，添加5L的FITC缀合的可溶性BCMA蛋白。将细胞在4C下染色30分钟并用2mL的PBS洗涤两次。最后一次洗涤之后，抽吸上清液并使用涡旋使细胞沉淀松散。将两毫升冷的70％乙醇滴加到细胞沉淀中，同时涡旋，然后再将混合物涡旋30秒。在70％乙醇中的细胞在-20C下孵育1小时，然后用BioLegend细胞染色缓冲液洗涤三次。将细胞悬浮在100L的BioLegend细胞染色缓冲液中并添加预滴定量的人抗Ki-67抗体。将细胞在室温下黑暗中染色30分钟，然后用BioLegend细胞染色缓冲液洗涤两次。最后，将细胞沉淀悬浮在BioLegend细胞染色缓冲液中，用于流式细胞术分析。

数据显示CACCR BCMA CAR T细胞在体外未展示出靶标和IL-2非依赖性生长。图22B显示BCMA和CACCR BCMA CAR T细胞在前3天期间展示出最低限度的扩增或没有扩增。在这之后，CACCRBCMA CAR T细胞持续～2周，接着随时间推移逐渐下降。到第42天，BCMA CART细胞和CACCR BCMA CAR T细胞不能检测到。图22C显示所有三个供体中大约30-40％的CAR⁺细胞在第0天表达Ki-67⁺。然而，Ki-67表达到IL-2非依赖性培养的第3天大幅降低并且到第14天不能检测到。图22D显示当与经过辐照的靶细胞和IL-2一起培养时，BCMA CAR T细胞和CACCR BCMA CAR T细胞都能够稳健和同等扩增。

该数据证实，在源自多个供体的基于T细胞的或基于PBMC的CAR T细胞中，CACCR都不能维持在IL2或靶标不存在的情况下生长的CACCR-BCMA CAR T细胞的无限生存。

由于CAR T细胞从未见过靶细胞并且因此是静止的，因此所提出的生长因子非依赖性测定只是一种评估异常生长的方式。另外，我们还试图评价一旦靶标被清除，在最近活化的CACCR-BCMA CAR T细胞中，CACCR-BCMA CART细胞的扩增和持久性是否仍然有限。为此，首先将CACCR-BCMA CAR T细胞重复暴露于表达BCMA的靶细胞，以驱动其完全活化和扩增，然后从这些培养物中取回靶细胞。简言之，如先前所述生成TRAC/CD52 dKO CAR T细胞。在测定的第0天，将冷冻保存的TRAC/CD52 dKO CAR T细胞解冻，并通过添加未转导的(NTD)T细胞，将所有样品中CART细胞的百分比相对于转导效率最低的样品进行归一化。将3×10⁵个CAR+T细胞和1×10⁵个MM.1S-Luc-GFP-靶细胞以3:1的E:T平板接种在48孔组织培养板中，每孔总体积为750uL。作为比较，将10ng/mL重组人IL-15(Miltenyi)添加到未修饰的CART细胞和靶细胞的共培养物中。在前7天的每2天或3天，通过温和移液将孔彻底混合，并从每个孔中弃去200uL。然后为孔补充2×10⁵个新鲜MM.1S-Luc-GFP-靶细胞，体积为200uL。第9天，继续每2天或3天添加靶细胞用于测定的剩余部分，或者完全取回。在经过IL-15处理的孔中，每周补充两次10ng/mL重组人IL-15。为每种条件设置重复孔。在标明的时间点，通过移液将孔彻底混合，并从每个孔中收获50-200uL，用于通过流式细胞术分析进行CAR T细胞计数。简言之，将细胞用PBS洗涤并用Zombie-NIR可固定活力试剂盒(Biolegend)染色。然后将细胞用PBS洗涤，Fc封闭，并用，稀释于PBS+1％BSA中的用于检测P5A2 scFv的PE缀合的抗独特型抗体，BV605缀合的抗人CD4(Biolegend)和BV510缀合的抗人CD8(Biolegend)进行染色。洗涤后，在流式细胞术分析之前，将细胞重悬于含有123count eBeads计数珠粒(ThermoFisher)的100uL PBS+1％BSA中(10uL计数珠粒在90uL PBS+1％BSA中)。

图23A示出最近活化的BCMA CAR T细胞的扩增谱，所述细胞不断地用靶细胞刺激，或者将靶细胞取回。不断地用靶标刺激的BCMA CAR T细胞展示出增殖潜力。然而，当取回靶标时，CACCR-BCMA CAR T细胞停止增殖，而是经历缓慢而平稳的下降。这证明，即使在稳健的活化后，CACCR-BCMA CAR T细胞的连续扩增和持久性仍然依赖于靶标诱导的CAR活化。

接下来在非荷瘤小鼠体内评价在靶标不存在的情况下CACCR BCMA CAR T细胞的长期持久性。为了利于经由生物发光成像进行长期的体内追踪，生成了用点击甲虫红(CBR)荧光素酶报告因子标记的CAR T细胞。简言之，如上所述生成编码BCMA CAR和BFP-CBR的慢病毒。如上所述生成TRAC/CD52 dKO人CAR T细胞并冷冻保存，除了在第2天，以50万个细胞/mL重悬的T细胞用等体积的CAR和BFP-CBR粗制慢病毒上清液共转导外。分别使用对BCMAscFv有特异性的PE缀合的抗独特型抗体和BFP荧光报告因子，通过流式细胞术测定经CAR和CBR转导的细胞的百分比。在T细胞给药的当天，将冷冻保存的CAR T细胞解冻，并通过添加未转导的(NTD)T细胞相对于转导效率较低的样品进行归一化。将7×10⁶个TRAC/CD52 CAR⁺T细胞静脉输注给8-10周龄的雌性NSG非荷瘤小鼠。从T细胞给药当天开始并且此后每周1-3次，通过生物发光成像确定体内T细胞的药代动力学。在标明的时间点，给小鼠放血进行外周BCMA CAR T细胞的计数。具体地，使用ACK裂解缓冲液(Gibco)对来自每只小鼠的50uL全血进行红细胞裂解，Fc封闭并用以下稀释于PBS+1％BSA中的抗体混合物进行染色：FITC缀合的抗小鼠CD45(Biolegend)、AlexaFluor647缀合的抗人CD45(Biolegend)、对BCMA scFv有特异性的PE缀合的抗独特型抗体和BUV395缀合的抗人CD3(用作人T细胞受体的替代物；BD Biosciences)。最后，在流式细胞术分析之前，将样品在PBS中洗涤并将细胞沉淀重悬于含有123count eBeads计数珠粒(Thermo Fisher)的250uL PBS+1％BSA中(10uL计数珠粒在240uL PBS+1％BSA中)。

图23B显示CACCR BCMA CAR T细胞在非荷瘤小鼠中并未展示出异常的靶标非依赖性生长。与NTD和BCMA CAR T细胞相比，CACCR BCMA CAR T细胞具有增加的持久性和生存期。然而，CACCR BCMA CAR T细胞未显示出明显的靶标非依赖性扩增的证据，而是经历最终下降。每个时间点的T细胞发光表示为相对于第0天的倍数变化。图23C示出了已接受CACCRBCMA CAR T细胞和BCMA CAR T细胞的小鼠之间的同等体重增加。图23D显示没有观察到表达T细胞受体(TCR)的T细胞的富集，表明CACCR未增加BCMA CAR T细胞的异种反应性潜力。这些数据表明，表达CACCR的BCMA CAR T施用于患者时将不可能增加GvHD的潜力。

最近经历了稳健的靶标诱导活化的CAR T细胞可能具有更高的恢复静止的阈值。为了确定一旦靶细胞被清除，CACCR BCMA CAR T细胞的活性是否可以控制，通过生物发光成像来评价CBR标记的TRAC/CD52 dKO CAR T细胞在具有皮下肿瘤的小鼠中的扩增和长期持久性。

CBR标记的TRAC/CD52 dKO CAR T细胞如上所述通过双载体共转导生成，除了CAR+CBR+双转导的T细胞基于用对BCMA scFv有特异性的PE缀合的抗独特型抗体以及BFP报告因子染色进行FACS分选。并行地，生成未标记的TRAC/CD52 dKO CAR T细胞。8-10周龄的雌性NSG小鼠皮下植入3×10⁶个未标记的Molp8细胞。肿瘤植入后17天，基于肿瘤负荷对小鼠进行随机分组，并且每只小鼠静脉输注总共10×10⁶个(9.5×10⁶个未标记的掺入0.5×10⁶个CBR标记的)TRAC/CD52 dKO CAR T细胞(每组n＝7或8只小鼠)。T细胞给药后1天开始并且此后每周1次或2次，通过生物发光成像确定体内T细胞的药代动力学，并且通过卡尺测量确定皮下肿瘤负荷。使用公式肿瘤体积＝(宽度^2x长度/2)计算肿瘤负荷。

图23E-图23G中的数据证明CACCR BCMA CAR T细胞的体内扩增是靶标依赖性的，并且它们在靶标清除后恢复静止。图23E示出了经过CAR T细胞治疗的小鼠中的初始肿瘤进展，接着是从第11天开始的肿瘤消退。在8/8的小鼠中CACCR BCMA CAR T细胞有效地消除肿瘤。相比之下，在5/7的小鼠中BCMA CAR T细胞介导肿瘤清除。图23F示出了荷瘤小鼠的长期CAR T细胞药代动力学。响应于肿瘤靶标，BCMA和CACCR BCMA CAR T细胞两者都经历了稳健扩增，在第11天达到峰值扩增。在这之后BCMA和CACCR BCMA CAR T细胞两者中有同等速率的下降。图23G示出了已接受CACCR BCMA CAR T细胞和BCMA CAR T细胞的小鼠之间的同等体重增加。

实例8 CACCR-BCMA CAR T细胞的抑制

为了最大限度地减少临床开发中的任何潜在安全性问题，将BCMA CAR构建体设计成并入两个利妥昔单抗模拟表位，这将使BCMA CAR T细胞对利妥昔单抗介导的耗竭敏感。接下来我们测试了利妥昔单抗在有或没有CACCR的情况下对BCMA CAR T细胞的影响。结果证明，两种类型的BCMA CAR T细胞暴露于利妥昔单抗以剂量应答性方式显著减少了存活的CAR T细胞，如补体依赖性细胞毒性测定(图24A)或NK细胞介导的抗体依赖性细胞毒性测定(图24B)所示。

接下来，我们在体内测试了在有或没有CACCR的情况下，利妥昔单抗对减少BCMACAR T细胞的影响。简言之，8-10周龄雌性NSG小鼠在静脉接种5×10⁶个MM.1S-Luc-GFP的前一天用1Gy辐照。肿瘤植入后14天，基于肿瘤负荷对小鼠进行随机分组并且对每只小鼠静脉输注3×10⁶个TRAC/CD52dKO CAR T细胞(每组n＝10只小鼠)。利妥昔单抗(10mg/kg)或PBS媒介物对照从CAR T细胞给药当天开始经腹膜内给药，然后每天给药，再持续4天(每组n＝9或10)。通过生物发光成像每周两次监测肿瘤负荷。CAR T细胞给药后7天，给小鼠放血，进行外周BCMA CAR T细胞的计数。具体地，使用ACK裂解缓冲液(Gibco)对来自每只小鼠的50uL全血进行红细胞裂解，Fc封闭并用以下稀释于PBS+1％BSA中的抗体混合物进行染色：FITC缀合的抗小鼠CD45(Biolegend)、BV421缀合的抗人CD45(Biolegend)和对P5A2 scFv具有特异性的PE缀合的抗独特型抗体。最后，在流式细胞术分析之前，将样品在PBS中洗涤并将细胞沉淀重悬于含有123count eBeads计数珠粒(Thermo Fisher)的250uL PBS+1％BSA中(10uL计数珠粒在240uL PBS+1％BSA中)。

图24C-图24D示出了利妥昔单抗治疗对CAR T细胞数目和肿瘤生长动力学的影响。图24C示出了CAR T细胞给药后7天外周血中的CAR T细胞计数。在经PBS治疗的荷瘤小鼠中，与BCMA CAR T细胞相比，CACCR BCMA CAR T细胞显示出扩增增加。然而，用利妥昔单抗治疗导致两种CAR T细胞的有效完全消除，证明CACCR BCMA CAR T细胞仍然对利妥昔单抗介导的体内耗竭敏感。图24D示出了利妥昔单抗介导的CAR T细胞耗竭后的肿瘤负荷。虽然CAR T细胞有效地控制经过PBS治疗的小鼠中的肿瘤生长，但通过利妥昔单抗消除CAR T细胞损害了抗肿瘤功效，如次优肿瘤清除和后续肿瘤进展所示。

图25A-图25B中的数据证明BCMA CAR T细胞和CACCRBCMA CAR T细胞两者的活性也可以被酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼抑制。据报道，达沙替尼抑制TCR信号传导、T细胞增殖和效应子功能。我们在体外细胞杀伤测定中测试了150nM达沙替尼在有或没有CACCR的情况下对BCMA CAR T细胞活性的影响。图25A-图25B中的结果显示，达沙替尼消去两种类型的BCMA CAR T细胞的细胞毒性(图25A)并抑制其细胞因子分泌(图25B)，但是我们观察到当从培养物中洗出达沙替尼时，这种作用是可逆的(数据未示出)。

实例9 CACCR BCMA CAR T细胞的长期体内药代动力学

另外在多发性骨髓瘤的原位模型中，对CACCR BCMA CAR T细胞的长期体内药代动力学进行了评价。8-10周龄雌性NSG小鼠在静脉接种5×10⁶个MM.1S-Luc-GFP的前一天用1Gy辐照。肿瘤植入后15天，基于肿瘤负荷对小鼠进行随机分组并且对每只小鼠静脉输注次优剂量的3×10⁶个TRAC/CD52dKO CACCR-BCMA CAR T细胞(每组n＝10只小鼠)。此后，通过生物发光成像每周两次监测肿瘤负荷。从第30天开始在标明的时间点，给小鼠放血进行外周CACCR BCMA CAR T细胞的计数。具体地，使用ACK裂解缓冲液(Gibco)对来自每只小鼠的50uL全血进行红细胞裂解，Fc封闭并用以下稀释于PBS+1％BSA中的抗体混合物进行染色：FITC缀合的抗小鼠CD45(Biolegend)、BV421缀合的抗人CD45(Biolegend)和对BCMA scFv具有特异性的PE缀合的抗独特型抗体。最后，在流式细胞术分析之前，将样品在PBS中洗涤并将细胞沉淀重悬于含有123count eBeads计数珠粒(Thermo Fisher)的250uL PBS+1％BSA中(10uL计数珠粒在240uL PBS+1％BSA中)。

图26A-图26C再次证明CACCR BCMA CAR T细胞的体内扩增是靶标依赖性的。图26A示出了在用次优剂量的3×10⁶个TRAC/CD52 dKO CACCR BCMA CAR T细胞治疗后单个小鼠中的各种抗肿瘤应答，在该剂量下疾病在一些小鼠中显著复发，而在其它小鼠中完全消退。图26B显示疾病复发后CACCR BCMA CAR T细胞扩增急剧增加。图26C显示，在肿瘤被清除的小鼠中，没有观察到CACCR BCMA CAR T细胞的扩增，并且CACCR BCMA CAR T细胞的数目到第80天下降到检测极限。总的来说，这些证明CACCR BCMA CAR T细胞的活性扩增是靶标依赖性的，并且单独通过CACCR的组成型信号传导不足以驱动靶标非依赖性的CAR T细胞扩增或无限期生存。

实例10在多发性骨髓瘤的原位模型中CACCR对BCMA CAR T细胞的影响

接下来在多发性骨髓瘤的原位模型中，评价了CACCR对BCMA CAR T细胞体内活性和药代动力学的影响，其中疾病最初建立于骨髓中并且随后在髓外部位复发。8-10周龄雌性NSG小鼠在静脉接种5×10⁶个MM.1S-Luc-GFP的前一天用1Gy辐照。肿瘤植入后15天，基于肿瘤负荷对小鼠进行随机分组并且对每只小鼠静脉输注标明数目的TRAC/CD52 dKOCACCR-BCMA CAR T细胞(每组n＝10只小鼠)。此后，通过生物发光成像每周两次监测肿瘤负荷。在标明的时间点，给小鼠放血进行外周CACCR BCMA CAR T细胞的计数。

图27A-图27D显示在多发性骨髓瘤的原位模型中，CACCR改善抗肿瘤功效和BCMACAR T细胞的扩增。图27A示出了响应于标明数目的CAR T细胞的抗肿瘤功效。与到第38天复发的经过BCMA CAR T细胞治疗的组相比，已接受CACCR BCMA CAR T细胞的小鼠显示出改善的应答持续时间。图27B-图27D示出了已接受1×10⁶个(图27B)、3×10⁶个(图27C)或5×10⁶个(图27D)CAR T细胞的外周血中的CAR T细胞药代动力学。与提高的抗肿瘤功效一致，结果显示CACCR增加了体内BCMA CAR T细胞的扩增。

<110> ALLOGENE THERAPEUTICS, INC.

<120> 活性增强的BCMA CAR-T细胞

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545 550 555 560

His Tyr Thr Ile Phe Trp Thr Asn Ala Gln Asn Gln Ser Phe Ser Ala

565 570 575

Ile Leu Asn Ala Ser Ser Arg Gly Phe Val Leu His Gly Leu Glu Pro

580 585 590

Ala Ser Leu Tyr His Ile His Leu Met Ala Ala Ser Gln Ala Gly Ala

595 600 605

Thr Asn Ser Thr Val Leu Thr Leu Met Thr Leu Thr Pro Glu Gly Ser

610 615 620

Glu Leu His Ile Ile Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Thr

625 630 635 640

Cys Leu Cys Gly Thr Ala Trp Leu Cys Cys Ser Pro Asn Arg Lys Asn

645 650 655

Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala His Ser Ser Leu Gly Ser

660 665 670

Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Leu Pro Gly Pro Arg Gln Gly Gln

675 680 685

Trp Leu Gly Gln Thr Ser Glu Met Ser Arg Ala Leu Thr Pro His Pro

690 695 700

Cys Val Gln Asp Ala Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile

705 710 715 720

Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp

725 730 735

Glu Ser His Asn Ser Ser Glu Thr Cys Gly Leu Pro Thr Leu Val Gln

740 745 750

Thr Tyr Val Leu Gln Gly Asp Pro Arg Ala Val Ser Thr Gln Pro Gln

755 760 765

Ser Gln Ser Gly Thr Ser Asp Gln Val Leu Tyr Gly Gln Leu Leu Gly

770 775 780

Ser Pro Thr Ser Pro Gly Pro Gly His Tyr Leu Arg Cys Asp Ser Thr

785 790 795 800

Gln Pro Leu Leu Ala Gly Leu Thr Pro Ser Pro Lys Ser Tyr Glu Asn

805 810 815

Leu Trp Phe Gln Ala Ser Pro Leu Gly Thr Leu Val Thr Pro Ala Pro

820 825 830

Ser Gln Glu Asp Asp Cys Val Phe Gly Pro Leu Leu Asn Phe Pro Leu

835 840 845

Leu Gln Gly Ile Arg Val His Gly Met Glu Ala Leu Gly Ser Phe

850 855 860

<210> 6

<211> 635

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Met Pro Ser Trp Ala Leu Phe Met Val Thr Ser Cys Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Pro Gln Asn Leu Ala Gln Val Ser Ser Gln Asp Val Ser Leu Leu Ala

20 25 30

Ser Asp Ser Glu Pro Leu Lys Cys Phe Ser Arg Thr Phe Glu Asp Leu

35 40 45

Thr Cys Phe Trp Asp Glu Glu Glu Ala Ala Pro Ser Gly Thr Tyr Gln

50 55 60

Leu Leu Tyr Ala Tyr Pro Arg Glu Lys Pro Arg Ala Cys Pro Leu Ser

65 70 75 80

Ser Gln Ser Met Pro His Phe Gly Thr Arg Tyr Val Cys Gln Phe Pro

85 90 95

Asp Gln Glu Glu Val Arg Leu Phe Phe Pro Leu His Leu Trp Val Lys

100 105 110

Asn Val Phe Leu Asn Gln Thr Arg Thr Gln Arg Val Leu Phe Val Asp

115 120 125

Ser Val Gly Leu Pro Ala Pro Pro Ser Ile Ile Lys Ala Met Gly Gly

130 135 140

Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gln Ile Ser Trp Glu Glu Pro Ala Pro Glu

145 150 155 160

Ile Ser Asp Phe Leu Arg Tyr Glu Leu Arg Tyr Gly Pro Arg Asp Pro

165 170 175

Lys Asn Ser Thr Gly Pro Thr Val Ile Gln Leu Ile Ala Thr Glu Thr

180 185 190

Cys Cys Pro Ala Leu Gln Arg Pro His Ser Ala Ser Ala Leu Asp Gln

195 200 205

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210 215 220

Thr Ser Pro Ser Arg Glu Ala Ser Ala Leu Thr Ala Glu Gly Gly Ser

225 230 235 240

Cys Leu Ile Ser Gly Leu Gln Pro Gly Asn Ser Tyr Trp Leu Gln Leu

245 250 255

Arg Ser Glu Pro Asp Gly Ile Ser Leu Gly Gly Ser Trp Gly Ser Trp

260 265 270

Ser Leu Pro Val Thr Val Asp Leu Pro Gly Asp Ala Val Ala Leu Gly

275 280 285

Leu Gln Cys Phe Thr Leu Asp Leu Lys Asn Val Thr Cys Gln Trp Gln

290 295 300

Gln Gln Asp His Ala Ser Ser Gln Gly Phe Phe Tyr His Ser Arg Ala

305 310 315 320

Arg Cys Cys Pro Arg Asp Arg Tyr Pro Ile Trp Glu Asn Cys Glu Glu

325 330 335

Glu Glu Lys Thr Asn Pro Gly Leu Gln Thr Pro Gln Phe Ser Arg Cys

340 345 350

His Phe Lys Ser Arg Asn Asp Ser Ile Ile His Ile Leu Val Glu Val

355 360 365

Thr Thr Ala Pro Gly Thr Val His Ser Tyr Leu Gly Ser Pro Phe Trp

370 375 380

Ile His Gln Ala Val Arg Leu Pro Thr Pro Asn Leu His Trp Arg Glu

385 390 395 400

Ile Ser Ser Gly His Leu Glu Leu Glu Trp Gln His Pro Ser Ser Trp

405 410 415

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420 425 430

Gln Asp Trp Lys Val Leu Glu Pro Pro Leu Gly Ala Arg Gly Gly Thr

435 440 445

Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg Ala Arg

450 455 460

Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly Pro Trp Ser Ser Trp Ser Asp Pro

465 470 475 480

Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr

485 490 495

Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu

500 505 510

Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu

515 520 525

Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg

530 535 540

Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys

545 550 555 560

Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu

565 570 575

Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys Ser Ser Gln Ala Gln Met Asp Tyr Arg

580 585 590

Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu Gly Thr Met Pro Leu Ser Val Cys Pro

595 600 605

Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His

610 615 620

Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr Trp Gln Gln Pro

625 630 635

<210> 7

<211> 105

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105

<210> 8

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 8

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105

<210> 9

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 9

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105

<210> 10

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 10

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105

<210> 11

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 11

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105

<210> 12

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 12

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105

<210> 13

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 13

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105

<210> 14

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 14

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Asn

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105

<210> 15

<211> 97

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“未知序列的描述：GCSFR(614-710)序列”

<400> 15

Leu Thr Leu Met Thr Leu Thr Pro Glu Gly Ser Glu Leu His Ile Ile

1 5 10 15

Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Thr Cys Leu Cys Gly Thr

20 25 30

Ala Trp Leu Cys Cys Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser

35 40 45

Val Pro Asp Pro Ala His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile

50 55 60

Met Glu Glu Asp Ala Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile

65 70 75 80

Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp

85 90 95

Glu

<210> 16

<211> 92

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Thr Thr Pro Lys Phe Ala Gln Gly Glu Ile Glu Ala Ile Val Val Pro

1 5 10 15

Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu Gly Val Leu Phe Cys

20 25 30

Phe Asn Lys Arg Asp Leu Ile Lys Lys His Ile Trp Pro Asn Val Pro

35 40 45

Asp Pro Ser Lys Ser His Ile Ala Gln Trp Ser Pro His Thr Pro Pro

50 55 60

Arg His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gln Met Tyr Ser Asp Gly Asn Phe

65 70 75 80

Thr Asp Val Ser Val Val Glu Ile Glu Ala Asn Asp

85 90

<210> 17

<211> 105

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105

<210> 18

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 18

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Trp Ile Ser Leu

1 5 10 15

Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu

20 25 30

Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His

35 40 45

Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr

50 55 60

Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp

65 70 75 80

Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser

85 90 95

Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100

<210> 19

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 19

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ile Ser Leu Val

1 5 10 15

Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu

20 25 30

Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala

35 40 45

Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu

50 55 60

Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr

65 70 75 80

Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser

85 90 95

Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100

<210> 20

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 20

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Leu Ile Ser Leu

1 5 10 15

Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu

20 25 30

Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His

35 40 45

Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr

50 55 60

Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp

65 70 75 80

Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser

85 90 95

Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100

<210> 21

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 21

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ser Leu Val Thr

1 5 10 15

Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu

20 25 30

Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu

35 40 45

Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg

50 55 60

Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys

65 70 75 80

Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu

85 90 95

Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100

<210> 22

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 22

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Leu Val Thr Ala

1 5 10 15

Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu

20 25 30

Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp

35 40 45

Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp

50 55 60

Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu

65 70 75 80

Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg

85 90 95

Thr Pro Leu Pro Leu

100

<210> 23

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 23

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ile Leu Val Thr

1 5 10 15

Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu

20 25 30

Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu

35 40 45

Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg

50 55 60

Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys

65 70 75 80

Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu

85 90 95

Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100

<210> 24

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 24

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Val Thr Ala Leu

1 5 10 15

His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg

20 25 30

Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro

35 40 45

Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr

50 55 60

Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu

65 70 75 80

Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr

85 90 95

Pro Leu Pro Leu

100

<210> 25

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 25

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Thr Ala Leu His

1 5 10 15

Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp

20 25 30

Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser

35 40 45

Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala

50 55 60

Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val

65 70 75 80

Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro

85 90 95

Leu Pro Leu

<210> 26

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 26

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Leu His Leu

1 5 10 15

Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln

20 25 30

Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu

35 40 45

Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala

50 55 60

Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu

65 70 75 80

Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu

85 90 95

Pro Leu

<210> 27

<211> 97

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 27

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Leu His Leu Val

1 5 10 15

Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe

20 25 30

Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro

35 40 45

Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu

50 55 60

Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro

65 70 75 80

Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro

85 90 95

Leu

<210> 28

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 28

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr His Leu Val Leu

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro

20 25 30

Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp

35 40 45

Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser

50 55 60

Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser

65 70 75 80

Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

85 90 95

<210> 29

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 29

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Leu Val Leu Gly

1 5 10 15

Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala

20 25 30

His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu

35 40 45

His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro

50 55 60

Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu

65 70 75 80

Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

85 90 95

<210> 30

<211> 94

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 30

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Val Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His

20 25 30

Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His

35 40 45

Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro

50 55 60

Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu

65 70 75 80

Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

85 90

<210> 31

<211> 93

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 31

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Leu Gly Leu Ser

1 5 10 15

Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr

20 25 30

Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg

35 40 45

Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys

50 55 60

Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu

65 70 75 80

Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

85 90

<210> 32

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 32

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Gly Leu Ser Ala

1 5 10 15

Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg

20 25 30

Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val

35 40 45

Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala

50 55 60

Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile

65 70 75 80

Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

85 90

<210> 33

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 33

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Leu Ser Ala Val

1 5 10 15

Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg

20 25 30

Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu

35 40 45

Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr

50 55 60

Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu

65 70 75 80

Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

85 90

<210> 34

<211> 90

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 34

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ser Ala Val Leu

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu

20 25 30

Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly

35 40 45

Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val

50 55 60

Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro

65 70 75 80

Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

85 90

<210> 35

<211> 89

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 35

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Val Leu Gly

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

20 25 30

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

35 40 45

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

50 55 60

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

65 70 75 80

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

85

<210> 36

<211> 88

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 36

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Val Leu Gly Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His

20 25 30

Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr

35 40 45

Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp

50 55 60

Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser

65 70 75 80

Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

85

<210> 37

<211> 87

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 37

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Leu Gly Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala

20 25 30

Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu

35 40 45

Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr

50 55 60

Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser

65 70 75 80

Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

85

<210> 38

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 38

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Leu Ile

1 5 10 15

Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu

20 25 30

Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu

35 40 45

Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly

50 55 60

Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val

65 70 75 80

Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro

85 90 95

Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105

<210> 39

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 39

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Val Leu

1 5 10 15

Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val

20 25 30

Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg

35 40 45

Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu

50 55 60

Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr

65 70 75 80

Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu

85 90 95

Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105

<210> 40

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 40

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Leu Val

1 5 10 15

Leu Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala

20 25 30

Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg

35 40 45

Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val

50 55 60

Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala

65 70 75 80

Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile

85 90 95

Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105

<210> 41

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 41

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Leu

1 5 10 15

Val Leu Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser

20 25 30

Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr

35 40 45

Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg

50 55 60

Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys

65 70 75 80

Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu

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Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105

<210> 42

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 42

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu

20 25 30

Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His

35 40 45

Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His

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Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro

65 70 75 80

Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu

85 90 95

Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

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<210> 43

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 43

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Leu Leu

1 5 10 15

Ile Leu Val Leu Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly

20 25 30

Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala

35 40 45

His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu

50 55 60

His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro

65 70 75 80

Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu

85 90 95

Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105 110

<210> 44

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 44

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Val Leu

1 5 10 15

Leu Ile Leu Val Leu Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu

20 25 30

Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro

35 40 45

Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp

50 55 60

Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser

65 70 75 80

Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser

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Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu

100 105 110

<210> 45

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 45

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Leu Val

1 5 10 15

Leu Leu Ile Leu Val Leu Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val

20 25 30

Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe

35 40 45

Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro

50 55 60

Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu

65 70 75 80

Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro

85 90 95

Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro

100 105 110

Leu

<210> 46

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 46

Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln

1 5 10 15

Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro

20 25 30

Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg

35 40 45

Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala

50 55 60

Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys

65 70 75 80

Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr

85 90 95

Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr

100 105 110

Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser

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Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln

130 135 140

<210> 47

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 47

Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser

1 5 10 15

Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr

20 25 30

Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val

35 40 45

Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val

50 55 60

Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser

65 70 75 80

Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu

85 90 95

Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala

100 105 110

Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln

115 120 125

Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr

130 135 140

Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val

145 150 155 160

Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly

165 170 175

Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala

180 185 190

Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln

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Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val

210 215

<210> 48

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 48

Ile Ser Thr Ile Ala Thr Val Glu Glu Thr Asn Gln Thr Asp Glu Asp

1 5 10 15

His Lys Lys Tyr Ser Ser Gln Thr Ser Gln Asp Ser Gly Asn Tyr Ser

20 25 30

Asn Glu Asp Glu Ser Glu Ser Lys Thr Ser Glu Glu Leu Gln Gln Asp

35 40 45

Phe Val

50

<210> 49

<211> 206

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 49

Lys Lys Lys Val Trp Asp Tyr Asn Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Ser Asp

1 5 10 15

Thr Glu Ala Ala Pro Arg Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Met His Gly

20 25 30

Leu Thr Val Arg Pro Leu Gly Gln Ala Ser Ala Thr Ser Thr Glu Ser

35 40 45

Gln Leu Ile Asp Pro Glu Ser Glu Glu Glu Pro Asp Leu Pro Glu Val

50 55 60

Asp Val Glu Leu Pro Thr Met Pro Lys Asp Ser Pro Gln Gln Leu Glu

65 70 75 80

Leu Leu Ser Gly Pro Cys Glu Arg Arg Lys Ser Pro Leu Gln Asp Pro

85 90 95

Phe Pro Glu Glu Asp Tyr Ser Ser Thr Glu Gly Ser Gly Gly Arg Ile

100 105 110

Thr Phe Asn Val Asp Leu Asn Ser Val Phe Leu Arg Val Leu Asp Asp

115 120 125

Glu Asp Ser Asp Asp Leu Glu Ala Pro Leu Met Leu Ser Ser His Leu

130 135 140

Glu Glu Met Val Asp Pro Glu Asp Pro Asp Asn Val Gln Ser Asn His

145 150 155 160

Leu Leu Ala Ser Gly Glu Gly Thr Gln Pro Thr Phe Pro Ser Pro Ser

165 170 175

Ser Glu Gly Leu Trp Ser Glu Asp Ala Pro Ser Asp Gln Ser Asp Thr

180 185 190

Ser Glu Ser Asp Val Asp Leu Gly Asp Gly Tyr Ile Met Arg

195 200 205

<210> 50

<211> 256

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 50

Ile Ser Thr Ile Ala Thr Val Glu Glu Thr Asn Gln Thr Asp Glu Asp

1 5 10 15

His Lys Lys Tyr Ser Ser Gln Thr Ser Gln Asp Ser Gly Asn Tyr Ser

20 25 30

Asn Glu Asp Glu Ser Glu Ser Lys Thr Ser Glu Glu Leu Gln Gln Asp

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Phe Val Lys Lys Lys Val Trp Asp Tyr Asn Tyr Asp Asp Glu Ser Asp

50 55 60

Ser Asp Thr Glu Ala Ala Pro Arg Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Met

65 70 75 80

His Gly Leu Thr Val Arg Pro Leu Gly Gln Ala Ser Ala Thr Ser Thr

85 90 95

Glu Ser Gln Leu Ile Asp Pro Glu Ser Glu Glu Glu Pro Asp Leu Pro

100 105 110

Glu Val Asp Val Glu Leu Pro Thr Met Pro Lys Asp Ser Pro Gln Gln

115 120 125

Leu Glu Leu Leu Ser Gly Pro Cys Glu Arg Arg Lys Ser Pro Leu Gln

130 135 140

Asp Pro Phe Pro Glu Glu Asp Tyr Ser Ser Thr Glu Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Arg Ile Thr Phe Asn Val Asp Leu Asn Ser Val Phe Leu Arg Val Leu

165 170 175

Asp Asp Glu Asp Ser Asp Asp Leu Glu Ala Pro Leu Met Leu Ser Ser

180 185 190

His Leu Glu Glu Met Val Asp Pro Glu Asp Pro Asp Asn Val Gln Ser

195 200 205

Asn His Leu Leu Ala Ser Gly Glu Gly Thr Gln Pro Thr Phe Pro Ser

210 215 220

Pro Ser Ser Glu Gly Leu Trp Ser Glu Asp Ala Pro Ser Asp Gln Ser

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Asp Thr Ser Glu Ser Asp Val Asp Leu Gly Asp Gly Tyr Ile Met Arg

245 250 255

<210> 51

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 51

Arg Gly Val Arg Pro Thr Pro Arg Val Arg Ala Pro Ala Thr Gln Gln

1 5 10 15

Thr Arg Trp Lys Lys Asp Leu Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu

20 25 30

Glu Asp Thr Glu Asp Gly Val Ser Phe Gln Pro Tyr Ile Glu Pro Pro

35 40 45

Ser Phe Leu Gly Gln Glu His Gln Ala Pro Gly His Ser Glu Ala Gly

50 55 60

Gly Val Asp Ser Gly Arg Pro Arg Ala Pro Leu Val Pro Ser Glu Gly

65 70 75 80

Ser Ser Ala Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Trp Ala Ser Thr Val Asp

85 90 95

Ser Ser Trp Asp Arg Ala Gly Ser Ser Gly Tyr Leu Ala Glu Lys Gly

100 105 110

Pro Gly Gln Gly Pro Gly Gly Asp Gly His Gln Glu Ser Leu Pro Pro

115 120 125

Pro Glu Phe Ser Lys Asp Ser Gly Phe Leu Glu Glu Leu Pro Glu Asp

130 135 140

Asn Leu Ser Ser Trp Ala Thr Trp Gly Thr Leu Pro Pro Glu Pro Asn

145 150 155 160

Leu Val Pro Gly Gly Pro Pro Val Ser Leu Gln Thr Leu Thr Phe Cys

165 170 175

Trp Glu Ser Ser Pro Glu Glu Glu Glu Glu Ala Arg Glu Ser Glu Ile

180 185 190

Glu Asp Ser Asp Ala Gly Ser Trp Gly Ala Glu Ser Thr Gln Arg Thr

195 200 205

Glu Asp Arg Gly Arg Thr Leu Gly His Tyr Met Ala Arg

210 215 220

<210> 52

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 52

Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro

1 5 10 15

Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys

20 25 30

Pro Glu Thr

35

<210> 53

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 53

Thr Ala Leu Leu Thr Cys Gly Pro Ala Arg Pro Trp Lys Ser Val Ala

1 5 10 15

Leu Glu Glu Glu Gln Glu Gly Pro Gly Thr Arg Leu Pro Gly Asn Leu

20 25 30

Ser Ser Glu Asp Val Leu Pro Ala Gly Cys Thr Glu Trp Arg Val Gln

35 40 45

Thr Leu Ala Tyr Leu Pro Gln Glu Asp Trp Ala Pro Thr Ser Leu Thr

50 55 60

Arg Pro Ala Pro Pro Asp Ser Glu Gly Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser

65 70 75 80

Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Cys Ala Leu Gly Cys Tyr Gly Gly

85 90 95

Trp His Leu Ser Ala Leu Pro Gly Asn Thr Gln Ser Ser Gly Pro Ile

100 105 110

Pro Ala Leu Ala Cys Gly Leu Ser Cys Asp His Gln Gly Leu Glu Thr

115 120 125

Gln Gln Gly Val Ala Trp Val Leu Ala Gly His Cys Gln Arg Pro Gly

130 135 140

Leu His Glu Asp Leu Gln Gly Met Leu Leu Pro Ser Val Leu Ser Lys

145 150 155 160

Ala Arg Ser Trp Thr Phe

165

<210> 54

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 54

Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu Pro

1 5 10 15

Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp Pro

20 25 30

Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg

35 40 45

Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala Glu

50 55 60

Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala

65 70 75 80

Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp Pro

85 90 95

Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Ala

100 105 110

Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu

115 120 125

Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro Trp

130 135 140

Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro

145 150 155 160

Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly Ser

165 170 175

Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp Glu

180 185 190

Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro Pro

195 200 205

Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser

210 215

<210> 55

<211> 286

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 55

Pro Asp Glu Lys Thr Glu Glu Ser Asp Thr Asp Arg Leu Leu Ser Ser

1 5 10 15

Asp His Glu Lys Ser His Ser Asn Leu Gly Val Lys Asp Gly Asp Ser

20 25 30

Gly Arg Thr Ser Cys Cys Glu Pro Asp Ile Leu Glu Thr Asp Phe Asn

35 40 45

Ala Asn Asp Ile His Glu Gly Thr Ser Glu Val Ala Gln Pro Gln Arg

50 55 60

Leu Lys Gly Glu Ala Asp Leu Leu Cys Leu Asp Gln Lys Asn Gln Asn

65 70 75 80

Asn Ser Pro Tyr His Asp Ala Cys Pro Ala Thr Gln Gln Pro Ser Val

85 90 95

Ile Gln Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gln Pro Leu Pro Thr Glu Gly Ala

100 105 110

Glu Ser Thr His Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser

115 120 125

Leu Ser Asn Ile Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala

130 135 140

Gly Ser Val Val Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser

145 150 155 160

Gln Cys Asp Met His Pro Glu Met Val Ser Leu Cys Gln Glu Asn Phe

165 170 175

Leu Met Asp Asn Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile

180 185 190

Pro Val Ala Pro His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu

195 200 205

Asn Gln Glu Asp Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala

210 215 220

Gly Arg Pro Gly Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val

225 230 235 240

Pro Asp Tyr Thr Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Gly Leu Ile

245 250 255

Leu Asn Ala Thr Ala Leu Pro Leu Pro Asp Lys Glu Phe Leu Ser Ser

260 265 270

Cys Gly Tyr Val Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met Pro

275 280 285

<210> 56

<211> 170

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 56

Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu Gly Pro

1 5 10 15

Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr Leu Val

20 25 30

Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp Leu Pro

35 40 45

Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly Ser Glu

50 55 60

Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro Glu Gly

65 70 75 80

Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser Ser Gln

85 90 95

Leu Leu Arg Pro Trp Thr Leu Cys Pro Glu Leu Pro Pro Thr Pro Pro

100 105 110

His Leu Lys Tyr Leu Tyr Leu Val Val Ser Asp Ser Gly Ile Ser Thr

115 120 125

Asp Tyr Ser Ser Gly Asp Ser Gln Gly Ala Gln Gly Gly Leu Ser Asp

130 135 140

Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala Ala Glu

145 150 155 160

Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser

165 170

<210> 57

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 57

Ala Val Gln Leu Leu Leu Leu Gln Lys Asp Ser Ala Pro Leu Pro Ser

1 5 10 15

Pro Ser Gly His Ser Gln Ala Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe

20 25 30

Phe Phe His Leu Pro Asn Ala Leu Glu Ile Glu Ser Cys Gln Val Tyr

35 40 45

Phe Thr Tyr Asp Pro Cys Val Glu Glu Glu Val Glu Glu Asp Gly Ser

50 55 60

Arg Leu Pro Glu Gly Ser Pro His Pro Pro Leu Leu Pro Leu Ala Gly

65 70 75 80

Glu Gln Asp Asp Tyr Cys Ala Phe Pro Pro Arg Asp Asp Leu Leu Leu

85 90 95

Phe Ser Pro Ser Leu Ser Thr Pro Asn Thr Ala Tyr Gly Gly Ser Arg

100 105 110

Ala Pro Glu Glu Arg Ser Pro Leu Ser Leu His Glu Gly Leu Pro Ser

115 120 125

Leu Ala Ser Arg Asp Leu Met Gly Leu Gln Arg Pro Leu Glu Arg Met

130 135 140

Pro Glu Gly Asp Gly Glu Gly Leu Ser Ala Asn Ser Ser Gly Glu Gln

145 150 155 160

Ala Ser Val Pro Glu Gly Asn Leu His Gly Gln Asp Gln Asp Arg Gly

165 170 175

Gln Gly Pro Ile Leu Thr Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln

180 185 190

Glu Leu Gln Ala Gln Asp Ser Val His Leu Ile

195 200

<210> 58

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 58

Ala Arg Asp Glu Val Glu Ser Phe Leu Pro Asn Asp Leu Pro Ala Gln

1 5 10 15

Pro Glu Glu Leu Glu Thr Gln Gly His Arg Ala Ala Val His Ser Ala

20 25 30

Asn Arg Ser Pro Glu Thr Ser Val Ser Pro Pro Glu Thr Val Arg Arg

35 40 45

Glu Ser Pro Leu Arg Cys Leu Ala Arg Asn Leu Ser Thr Cys Asn Ala

50 55 60

Pro Pro Leu Leu Ser Ser Arg Ser Pro Asp Tyr Arg Asp Gly Asp Arg

65 70 75 80

Asn Arg Pro Pro Val Tyr Gln Asp Leu Leu Pro Asn Ser Gly Asn Thr

85 90 95

Asn Val Pro Val Pro Val Pro Gln Pro Leu Pro Phe Gln Ser Gly Ile

100 105 110

Leu Ile Pro Val Ser Gln Arg Gln Pro Ile Ser Thr Ser Ser Val Leu

115 120 125

Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Lys

130 135 140

<210> 59

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 59

Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser

1 5 10 15

Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val

20 25 30

Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro

35 40 45

Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asn

50 55 60

Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys Pro

65 70 75 80

Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly

85 90 95

Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu

100 105 110

Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn

115 120 125

Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro

130 135 140

His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu

145 150 155 160

Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala

165 170 175

His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp

180 185 190

Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe

195 200 205

Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln

210 215 220

Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala

225 230

<210> 60

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 60

Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser

1 5 10 15

Asn Phe Phe Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val

20 25 30

Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro

35 40 45

Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asn

50 55 60

Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys Pro

65 70 75 80

Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro

85 90 95

Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser

100 105 110

Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser

115 120 125

Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro

130 135 140

Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp

145 150 155 160

Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp

165 170 175

Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn

180 185 190

Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val

195 200 205

Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala

210 215

<210> 61

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 61

Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser

1 5 10 15

Asn Phe Phe Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val

20 25 30

Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro

35 40 45

Ser Thr Ser Arg Thr Pro

50

<210> 62

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 62

Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys

1 5 10 15

Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Ile Asp Asp Thr Phe Leu

20 25 30

Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly

35 40 45

Ser Val Gln Asn Pro Val

50

<210> 63

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 63

Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro Val

1 5 10 15

Pro Glu Phe Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val

20 25 30

Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg

35 40 45

Asp Pro His Phe Gln Asp

50

<210> 64

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 64

Val Pro Glu Phe Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser

1 5 10 15

Val Gln Asn Pro Val Phe His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser

20 25 30

Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro

35 40 45

Glu Tyr Leu Asn Thr Val

50

<210> 65

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 65

Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe

1 5 10 15

Asp Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu

20 25 30

Asp Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro

35 40 45

Asn Gly Ile Phe Lys Gly

50

<210> 66

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 66

Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Phe

1 5 10 15

Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys

20 25 30

Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln Ser

35 40 45

Ser Glu Phe Ile Gly Ala

50

<210> 67

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 67

Ser Asp Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Cys Pro Trp Thr Val Leu Pro

1 5 10 15

Ala Gly Asp Leu Pro Thr His Asp Gly Tyr Leu Pro Ser Asn Ile Asp

20 25 30

Asp Leu Pro Ser His Glu Ala Pro Leu Ala Asp Ser Leu Glu Glu Leu

35 40 45

Glu Pro Gln

50

<210> 68

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 68

Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg

1 5 10 15

Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser

20 25 30

Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro

35 40

<210> 69

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 69

Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe

20 25 30

Tyr Gln Asn Gln

35

<210> 70

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 70

Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg

1 5 10 15

Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser

20 25 30

Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr

35 40 45

Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe

50 55 60

Tyr Gln Asn Gln

65

<210> 71

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 71

Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe

20 25 30

Phe Gln Asn Gln

35

<210> 72

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 72

Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg

1 5 10 15

Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser

20 25 30

Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr

35 40 45

Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe

50 55 60

Phe Gln Asn Gln

65

<210> 73

<211> 75

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 73

Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu

1 5 10 15

Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg

20 25 30

Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala

35 40 45

Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln

50 55 60

Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val

65 70 75

<210> 74

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 74

Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr

1 5 10 15

Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His

20 25 30

Leu Val

<210> 75

<211> 82

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 75

Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro

20 25 30

Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala

35 40 45

Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp

50 55 60

Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser

65 70 75 80

Pro Ser

<210> 76

<211> 75

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 76

Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro

20 25 30

Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala

35 40 45

Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln

50 55 60

Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val

65 70 75

<210> 77

<211> 75

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 77

Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu

1 5 10 15

Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg

20 25 30

Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala

35 40 45

Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln

50 55 60

Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val

65 70 75

<210> 78

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 78

Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro

20 25 30

Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala

35 40 45

Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp

50 55 60

Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser

65 70 75 80

Pro Ser Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu

85 90 95

Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro

100 105 110

Thr His Leu Val

115

<210> 79

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 79

Lys Lys Lys Val Trp Asp Tyr Asn Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Ser Asp

1 5 10 15

Thr Glu Ala Ala Pro Arg Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Met His Gly

20 25 30

Leu Thr Val Arg Pro Leu Gly Gln Ala Ser Ala

35 40

<210> 80

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 80

Glu Gly Leu Trp Ser Glu Asp Ala Pro Ser Asp Gln Ser Asp Thr Ser

1 5 10 15

Glu Ser Asp Val Asp Leu Gly Asp Gly Tyr Ile Met Arg

20 25

<210> 81

<211> 72

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 81

Lys Lys Lys Val Trp Asp Tyr Asn Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Ser Asp

1 5 10 15

Thr Glu Ala Ala Pro Arg Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Met His Gly

20 25 30

Leu Thr Val Arg Pro Leu Gly Gln Ala Ser Ala Glu Gly Leu Trp Ser

35 40 45

Glu Asp Ala Pro Ser Asp Gln Ser Asp Thr Ser Glu Ser Asp Val Asp

50 55 60

Leu Gly Asp Gly Tyr Ile Met Arg

65 70

<210> 82

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 82

Ala Ser Glu Ser Pro Ala Asp Glu Glu Glu Gln Trp Ser Asp Asp Phe

1 5 10 15

Asp Ser Asp Tyr Glu Asn Pro Asp Glu His Ser Asp Ser Glu Met Tyr

20 25 30

Val Met Pro Ala Glu Glu Asn Ala Asp Asp Ser Tyr Glu Pro Pro Pro

35 40 45

Val Glu Gln Glu Thr Arg Pro Val His Pro Ala Leu Pro Phe Ala Arg

50 55 60

Gly Glu Tyr Ile Asp Asn Arg Ser Ser Gln Arg His Ser Pro Pro Phe

65 70 75 80

Ser Lys Thr Leu Pro Ser Lys Pro Ser Trp Pro Ser Glu Lys Ala Arg

85 90 95

Leu Thr Ser Thr Leu Pro Ala Leu Thr Ala Leu Gln Lys Pro Gln Val

100 105 110

Pro Pro Lys Pro Lys Gly Leu Leu Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Val Val

115 120 125

Pro Val Glu Asp Asn Asp Glu Asn Tyr Ile His Pro Thr Glu Ser Ser

130 135 140

Ser Pro Pro Pro Glu Lys Ala Pro Met Val Asn Arg

145 150 155

<210> 83

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 83

Ala Ser Glu Ser Pro Ala Asp Glu Glu Glu Gln Trp Ser Asp Asp Phe

1 5 10 15

Asp Ser Asp Phe Glu Asn Pro Asp Glu His Ser Asp Ser Glu Met Tyr

20 25 30

Val Met Pro Ala Glu Glu Asn Ala Asp Asp Ser Tyr Glu Pro Pro Pro

35 40 45

Val Glu Gln Glu Thr Arg Pro Val His Pro Ala Leu Pro Phe Ala Arg

50 55 60

Gly Glu Tyr Ile Asp Asn Arg Ser Ser Gln Arg His Ser Pro Pro Phe

65 70 75 80

Ser Lys Thr Leu Pro Ser Lys Pro Ser Trp Pro Ser Glu Lys Ala Arg

85 90 95

Leu Thr Ser Thr Leu Pro Ala Leu Thr Ala Leu Gln Lys Pro Gln Val

100 105 110

Pro Pro Lys Pro Lys Gly Leu Leu Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Val Val

115 120 125

Pro Val Glu Asp Asn Asp Glu Asn Tyr Ile His Pro Thr Glu Ser Ser

130 135 140

Ser Pro Pro Pro Glu Lys Ala Pro Met Val Asn Arg

145 150 155

<210> 84

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 84

Ala Ser Glu Ser Pro Ala Asp Glu Glu Glu Gln Trp Ser Asp Asp Phe

1 5 10 15

Asp Ser Asp Phe Glu Asn Pro Asp Glu His Ser Asp Ser Glu Met Tyr

20 25 30

Val Met Pro Ala Glu Glu Asn Ala Asp Asp Ser Phe Glu Pro Pro Pro

35 40 45

Val Glu Gln Glu Thr Arg Pro Val His Pro Ala Leu Pro Phe Ala Arg

50 55 60

Gly Glu Tyr Ile Asp Asn Arg Ser Ser Gln Arg His Ser Pro Pro Phe

65 70 75 80

Ser Lys Thr Leu Pro Ser Lys Pro Ser Trp Pro Ser Glu Lys Ala Arg

85 90 95

Leu Thr Ser Thr Leu Pro Ala Leu Thr Ala Leu Gln Lys Pro Gln Val

100 105 110

Pro Pro Lys Pro Lys Gly Leu Leu Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Val Val

115 120 125

Pro Val Glu Asp Asn Asp Glu Asn Tyr Ile His Pro Thr Glu Ser Ser

130 135 140

Ser Pro Pro Pro Glu Lys Ala Pro Met Val Asn Arg

145 150 155

<210> 85

<211> 170

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 85

Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu Gly Pro

1 5 10 15

Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr Leu Val

20 25 30

Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp Leu Pro

35 40 45

Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly Ser Glu

50 55 60

Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro Glu Gly

65 70 75 80

Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser Ser Gln

85 90 95

Leu Leu Arg Pro Trp Thr Leu Cys Pro Glu Leu Pro Pro Thr Pro Pro

100 105 110

His Leu Lys Tyr Leu Tyr Leu Val Val Ser Asp Ser Gly Ile Ser Thr

115 120 125

Asp Tyr Ser Ser Gly Asp Ser Gln Gly Ala Gln Gly Gly Leu Ser Asp

130 135 140

Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala Ala Glu

145 150 155 160

Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser

165 170

<210> 86

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 86

Val Thr Pro Val Phe Arg His Pro Pro Cys Ser Asn Trp Pro Gln Arg

1 5 10 15

Glu Lys Gly Ile Gln Gly His Gln Ala Ser Glu Lys Asp Met Met His

20 25 30

Ser Ala Ser Ser Pro Pro Pro Pro Arg Ala Leu Gln Ala Glu Ser Arg

35 40 45

Gln Leu Val Asp Leu Tyr Lys Val Leu Glu Ser Arg Gly Ser Asp Pro

50 55 60

Lys Pro Glu Asn Pro Ala Cys Pro Trp Thr Val Leu Pro Ala Gly Asp

65 70 75 80

Leu Pro Thr His Asp Gly Tyr Leu Pro Ser Asn Ile Asp Asp Leu Pro

85 90 95

Ser His Glu Ala Pro Leu Ala Asp Ser Leu Glu Glu Leu Glu Pro Gln

100 105 110

His Ile Ser Leu Ser Val Phe Pro Ser Ser Ser Leu His Pro Leu Thr

115 120 125

Phe Ser Cys Gly Asp Lys Leu Thr Leu Asp Gln Leu Lys Met Arg Cys

130 135 140

Asp Ser Leu Met Leu

145

<210> 87

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 87

Trp Asp Lys Gly Glu Arg Thr Glu Pro Leu Glu Lys Thr Glu Leu Pro

1 5 10 15

Glu Gly Ala Pro Glu Leu Ala Leu Asp Thr Glu Leu Ser Leu Glu Asp

20 25 30

Gly Asp Arg Cys Lys Ala Lys Met

35 40

<210> 88

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 88

Val Ser Pro Glu Leu Lys Asn Leu Asp Leu His Gly Ser Thr Asp Ser

1 5 10 15

Gly Phe Gly Ser Thr Lys Pro Ser Leu Gln Thr Glu Glu Pro Gln Phe

20 25 30

Leu Leu Pro Asp Pro His Pro Gln Ala Asp Arg Thr Leu Gly Asn Arg

35 40 45

Glu Pro Pro Val Leu Gly Asp Ser Cys Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ser

50 55 60

Thr Asp Ser Gly Ile Cys Leu Gln Glu Pro Ser Leu Ser Pro Ser Thr

65 70 75 80

Gly Pro Thr Trp Glu Gln Gln Val Gly Ser Asn Ser Arg Gly Gln Asp

85 90 95

Asp Ser Gly Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Glu Gly Arg Ala Gly Asp

100 105 110

Thr Gln Gly Gly Ser Ala Leu Gly His His Ser Pro Pro Glu Pro Glu

115 120 125

Val Pro Gly Glu Glu Asp Pro Ala Ala Val Ala Phe Gln Gly Tyr Leu

130 135 140

Arg Gln Thr Arg Cys Ala Glu Glu Lys Ala Thr Lys Thr Gly Cys Leu

145 150 155 160

Glu Glu Glu Ser Pro Leu Thr Asp Gly Leu Gly Pro Lys Phe Gly Arg

165 170 175

Cys Leu Val Asp Glu Ala Gly Leu His Pro Pro Ala Leu Ala Lys Gly

180 185 190

Tyr Leu Lys Gln Asp Pro Leu Glu Met Thr Leu Ala Ser Ser Gly Ala

195 200 205

Pro Thr Gly Gln Trp Asn Gln Pro Thr Glu Glu Trp Ser Leu Leu Ala

210 215 220

Leu Ser Ser Cys Ser Asp Leu Gly Ile Ser Asp Trp Ser Phe Ala His

225 230 235 240

Asp Leu Ala Pro Leu Gly Cys Val Ala Ala Pro Gly Gly Leu Leu Gly

245 250 255

Ser Phe Asn Ser Asp Leu Val Thr Leu Pro Leu Ile Ser Ser Leu Gln

260 265 270

Ser Ser Glu

275

<210> 89

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 89

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 90

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 90

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly

100 105 110

Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln

115 120 125

Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val

130 135 140

Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu

145 150 155 160

Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg

165 170 175

Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln

180 185 190

Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro

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Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly

210 215 220

Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val

225 230 235 240

Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln

245

<210> 91

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 91

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

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Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

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Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly

100 105 110

Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln

115 120 125

Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val

130 135 140

Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu

145 150 155 160

Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg

165 170 175

Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln

180 185 190

Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro

195 200 205

Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly

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Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val

225 230 235 240

Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln

245

<210> 92

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 92

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

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Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly

100 105 110

Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln

115 120 125

Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val

130 135 140

Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu

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Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg

165 170 175

Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln

180 185 190

Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro

195 200 205

Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly

210 215 220

Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val

225 230 235 240

Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln

245

<210> 93

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 93

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

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Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

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Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly

100 105 110

Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln

115 120 125

Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val

130 135 140

Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu

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Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg

165 170 175

Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln

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210 215 220

Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val

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Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln

245

<210> 94

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 94

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly

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Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

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Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

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Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly

100 105 110

Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln

115 120 125

Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val

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Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu

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Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val

225 230 235 240

Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln

245

<210> 95

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 95

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

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Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

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Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

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Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly

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Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln

115 120 125

Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val

130 135 140

Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu

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Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln

245

<210> 96

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 96

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

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Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

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Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly

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Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln

115 120 125

Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val

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Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu

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Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln

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Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro

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210 215 220

Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val

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Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln

245

<210> 97

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 97

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

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Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Asn

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Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val

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Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln

245

<210> 98

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 98

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

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Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

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Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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210 215 220

Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val

225 230 235 240

Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln

245

<210> 99

<211> 182

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 99

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

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Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

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Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

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Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Leu Glu Asp Glu Gly Val Ala

100 105 110

Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly

115 120 125

Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu

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180

<210> 100

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 100

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

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Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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50 55 60

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65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

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Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Leu Glu Gln Gln Asp Lys Val

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Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile

130 135 140

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180 185 190

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<210> 101

<211> 69

<212> PRT

<213> 智人

<400> 101

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

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Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

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Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

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65

<210> 102

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人

<400> 102

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 103

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 103

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1 5 10 15

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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

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Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

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Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

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Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

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<210> 104

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 104

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1 5 10 15

Gly Thr Val Asp Asn His His Phe Lys Cys Thr Ser Glu Gly Glu Gly

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Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys Val Val Glu Gly

35 40 45

Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Leu Tyr

50 55 60

Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile Pro Asp Phe Phe

65 70 75 80

Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Val Thr Thr Tyr

85 90 95

Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp

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Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gly Val Asn Phe Thr Ser

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Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Val

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Pro Ser Lys Leu Gly His Lys Leu Asn

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<210> 105

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 105

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 106

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 106

Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser

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Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr

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<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 107

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<213> 人工序列

<220>

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<400> 108

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Leu Met Leu

275

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<213> 人工序列

<220>

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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 109

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Gln

<210> 110

<211> 177

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<220>

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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 110

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Gln

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

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<211> 345

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<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 112

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 113

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<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 114

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 116

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<213> 人工序列

<220>

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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

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Gln

<210> 118

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 118

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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

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210 215 220

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225 230 235 240

Lys Leu Thr Leu Asp Gln Leu Lys Met Arg Cys Asp Ser Leu Met Leu

245 250 255

<210> 132

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 132

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

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Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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130 135 140

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<210> 133

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 133

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

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Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

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65 70 75 80

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100 105 110

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130 135 140

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145 150 155

<210> 134

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 134

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

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Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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65 70 75 80

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<210> 135

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<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 135

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<210> 136

<211> 326

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<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

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<400> 136

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 137

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

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Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

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325

<210> 138

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 138

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

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Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

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Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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<210> 139

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 139

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Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

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Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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325

<210> 140

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<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 140

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 141

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

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His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu

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Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

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Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr

195 200 205

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

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Gln Gln Tyr Gly Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

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Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser

275 280 285

Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

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<210> 142

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 142

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Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Ser

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<210> 143

<211> 182

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 143

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

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Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

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Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

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Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Leu Glu Asp Glu Gly Val Ala

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<210> 144

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 144

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 145

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 145

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Trp Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 146

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 146

Ser Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 147

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 147

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 148

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 148

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn

1 5 10

<210> 149

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 149

Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 150

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 150

Ser Asp Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 151

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 151

Tyr Trp Pro Met Asp Ile

1 5

<210> 152

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

peptide"

<400> 152

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 153

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 153

Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr

1 5

<210> 154

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 154

Gln Gln Tyr Gly Ser Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 155

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 155

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Pro Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 156

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 156

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Trp Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 157

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 157

Ser Tyr Pro Met Ser

1 5

<210> 158

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 158

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 159

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 159

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Pro Met Ser

1 5 10

<210> 160

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 160

Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Pro Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 161

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 161

Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 162

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 162

Tyr Trp Pro Met Asp Ile

1 5

<210> 163

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

peptide"

<400> 163

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 164

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 164

Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr

1 5

<210> 165

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 165

Gln Gln Tyr Gln Ser Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 166

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 166

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser

130 135 140

Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser

145 150 155 160

Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

165 170 175

Leu Leu Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg

195 200 205

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser

210 215 220

Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly

245 250 255

Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

275 280 285

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

290 295 300

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

305 310 315 320

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

325 330 335

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

340 345 350

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

355 360 365

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

370 375 380

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

385 390 395 400

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

405 410 415

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

420 425 430

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

435 440 445

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

450 455 460

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

465 470 475 480

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

485 490 495

Pro Arg

<210> 167

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 167

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 168

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 168

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ser

35

<210> 169

<211> 45

<212> PRT

<213> 智人

<400> 169

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 170

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 170

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr

20

<210> 171

<211> 1560

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”

<400> 171

atggcactgc ccgtgaccgc cctgctgctg cctctggccc tgctgctgca cgccgcccgg 60

cctgaggtgc agctgctgga gagcggagga ggcctggtgc agccaggagg cagcctgaga 120

ctgtcctgcg cagcctctgg cttcaccttc agcagctacg ccatgaactg ggtgaggcag 180

gcacctggca agggcctgga gtgggtgagc gccatctccg actctggcgg cagcacctac 240

tatgccgatt ccgtgaaggg ccgcttcaca atcagccggg ataactccaa gaataccctg 300

tacctgcaga tgaacagcct gagagccgag gatacagccg tgtactattg cgccaggtat 360

tggccaatgg acatctgggg ccagggcaca ctggtgaccg tgtctagcgg cggaggaggc 420

tccggaggag gaggctctgg cggcggcggc agcgagatcg tgctgacaca gtctccaggc 480

accctgagcc tgtccccagg agagagagcc accctgagct gtagggcctc tcagagcgtg 540

tcctctagct acctggcctg gtatcagcag aagccaggcc aggcccccag actgctgatg 600

tacgacgcca gcatcagggc aacaggcatc cccgatcggt tctccggctc tggcagcggc 660

accgacttta cactgaccat cagcaggctg gagcccgagg acttcgccgt gtactattgc 720

cagcagtatg gctcctggcc tctgacattt ggccagggca ccaaggtgga gatcaagggc 780

tccggcggcg gaggctcttg cccttacagc aacccatccc tgtgctctgg aggaggaggc 840

tcctgtccct atagcaatcc cagcctgtgc tccggcggag gaggctctac cacaacccct 900

gcaccacgcc cccctacacc agcacctacc atcgcctctc agcctctgag cctgcggccc 960

gaggcctgta ggcccgccgc cggcggcgcc gtgcacacac ggggcctgga ctttgcctgc 1020

gacatctaca tctgggcacc cctggccggc acatgtggcg tgctgctgct gagcctggtc 1080

atcaccctgt actgcaagag aggcaggaag aagctgctgt atatcttcaa gcagcccttc 1140

atgcggcccg tgcagacaac ccaggaggag gatggctgct cctgtcggtt cccagaggag 1200

gaggagggag gatgtgagct gcgcgtgaag ttttcccggt ctgccgacgc accagcatac 1260

cagcagggcc agaaccagct gtataacgag ctgaatctgg gccggagaga ggagtacgac 1320

gtgctggata agcggcgggg ccgggacccc gagatgggag gcaagcctcg gagaaagaac 1380

ccacaggagg gcctgtacaa tgagctgcag aaggataaga tggccgaggc ctattctgag 1440

atcggcatga agggagagag gcgccggggc aagggacacg acggcctgta ccagggcctg 1500

tccacagcca ccaaggacac ctatgatgcc ctgcacatgc aggccctgcc acccagatga 1560

<210> 172

<211> 2235

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”

<400> 172

atggccctgc cagtgaccgc cctgctgctg ccactggccc tgctgctgca cgcagcaagg 60

ccatcagacc ctactagagt cgagaccgct accgagaccg cttggatctc tctggtgacc 120

gccctgcacc tggtgctggg cctgaacgcc gtgctgggcc tgctgctgct gaggaagcag 180

ttcccagcac actaccggag actgaggcac gcactgtggc caagcctgcc cgacctgcac 240

agggtgctgg gacagtatct gagggataca gccgccctga gcccacctaa ggcaaccgtg 300

tccgacacat gcgaggaggt ggaaccaagt ctgctggaaa tcctgccaaa atcctctgag 360

cggacacccc tgcccctgct cgaggacgag ggagtggcag gagcaccaac cggcagctcc 420

ccccagcctc tgcagccact gtccggagag gacgatgcat actgcacatt cccttctcgg 480

gacgatctgc tgctgttctc tccaagcgga cagggagagt ttcgggccct gaacgccaga 540

ctgcccctga ataccgacgc ctatctgagc ctgcaggagc tgcagggaca ggaccccaca 600

cacctggtgg gatccggagc caccaacttc tccctgctga agcaggccgg cgatgtggag 660

gagaatccag gccccatggc tctgcccgtc accgcactgc tgctgcccct ggctctgctg 720

ctgcacgccg caagacccga ggtccagctg ctggaatctg ggggaggact ggtgcagcct 780

ggaggcagcc tgagactgtc ctgcgcagca tctggcttca ccttcagctc ctacgccatg 840

aactgggtga ggcaggcacc aggcaaggga ctggagtggg tgtctgccat ctccgactct 900

ggcggcagca cctactatgc cgattccgtg aagggccgct tcacaatcag ccgggataac 960

tccaagaata ccctgtacct gcagatgaat tccctgagag ccgaggatac agccgtgtac 1020

tattgcgcca ggtattggcc catggacatc tggggccagg gcacactggt gaccgtgtct 1080

tccggaggag gaggctccgg aggaggaggc tctggcggcg gcggcagcga gatcgtgctg 1140

acacagtctc ctggcaccct gagcctgtcc ccaggagaga gagccaccct gagctgtagg 1200

gcctctcaga gcgtgtcctc tagctacctg gcctggtatc agcagaagcc cggccaggcc 1260

cctagactgc tgatgtacga cgccagcatc agggcaacag gcatccctga tcggttctcc 1320

ggctctggca gcggaaccga ctttacactg accatcagca ggctggagcc cgaggacttc 1380

gccgtgtact attgccagca gtatggctcc tggcctctga catttggcca gggcaccaag 1440

gtggagatca agggctccgg cggcggaggc tcttgcccat acagcaaccc atccctgtgc 1500

tctggaggag gaggctcctg tccttatagc aatcctagcc tgtgctccgg cggaggaggc 1560

tctaccacaa ccccagcacc aaggccacct acacctgcac caaccatcgc ctctcagcca 1620

ctgagcctga gacccgaggc ctgtaggcct gcagcaggag gagcagtgca cacccgggga 1680

ctggactttg cctgcgatat ctacatctgg gcaccactgg caggaacatg tggcgtgctg 1740

ctgctgagcc tggtcatcac cctgtactgc aagagaggca ggaagaagct gctgtatatc 1800

ttcaagcagc cctttatgcg ccctgtgcag acaacccagg aggaggatgg ctgctcctgt 1860

cggttcccag aggaggagga gggaggatgt gagctgcgcg tgaagttttc ccggtctgcc 1920

gacgcaccag cataccagca gggccagaac cagctgtata acgagctgaa tctgggccgg 1980

agagaggagt acgacgtgct ggataagagg aggggaagag atcccgagat gggaggcaag 2040

ccacggagaa agaaccccca ggagggcctg tacaatgagc tgcagaagga taagatggcc 2100

gaggcctata gcgagatcgg catgaaggga gagaggcgcc ggggcaaggg acacgacggc 2160

ctgtatcagg gcctgtccac cgctaccaaa gacacctatg atgctctgca catgcaggct 2220

ctgccaccaa gatga 2235

<210> 173

<211> 744

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 173

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu

20 25 30

Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu

35 40 45

Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His

50 55 60

Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His

65 70 75 80

Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro

85 90 95

Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu

100 105 110

Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Leu Glu

115 120 125

Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu

130 135 140

Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg

145 150 155 160

Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala

165 170 175

Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln

180 185 190

Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val Gly Ser Gly Ala Thr

195 200 205

Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

210 215 220

Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu

225 230 235 240

Leu His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

245 250 255

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

260 265 270

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

275 280 285

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Thr

290 295 300

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

305 310 315 320

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

325 330 335

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ile Trp Gly

340 345 350

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

355 360 365

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro

370 375 380

Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

385 390 395 400

Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

405 410 415

Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala

420 425 430

Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

435 440 445

Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr

450 455 460

Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

465 470 475 480

Val Glu Ile Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn

485 490 495

Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro

500 505 510

Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

515 520 525

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

530 535 540

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

545 550 555 560

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

565 570 575

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg

580 585 590

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

595 600 605

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

610 615 620

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

625 630 635 640

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

645 650 655

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

660 665 670

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

675 680 685

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

690 695 700

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

705 710 715 720

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

725 730 735

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

740

<210> 174

<211> 592

<212> DNA

<213> 土拨鼠肝炎病毒

<400> 174

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120

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<210> 175

<211> 592

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”

<400> 175

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120

atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180

tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240

ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300

attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360

ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420

gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480

aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540

cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg 592

<210> 176

<211> 2358

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”

<400> 176

atggccctgc cagtgaccgc cctgctgctg ccactggccc tgctgctgca cgcagcaagg 60

ccatcagacc ctactagagt cgagaccgct accgagaccg cttggatctc tctggtgacc 120

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tgctctggag gaggaggctc ctgtccttat agcaatccta gcctgtgctc cggcggagga 1680

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<210> 177

<211> 785

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 177

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu

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Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu

35 40 45

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50 55 60

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Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro

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Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu

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Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Leu Glu

115 120 125

Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser

130 135 140

Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro

145 150 155 160

Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala

165 170 175

Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp

180 185 190

Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser

195 200 205

Pro Ser Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu

210 215 220

Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro

225 230 235 240

Thr His Leu Val Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln

245 250 255

Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr

260 265 270

Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Glu

275 280 285

Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

290 295 300

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

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Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

325 330 335

Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

340 345 350

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

355 360 365

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

370 375 380

Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

385 390 395 400

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

405 410 415

Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro

420 425 430

Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser

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Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu

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Leu Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe

465 470 475 480

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu

485 490 495

Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Trp

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Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Gly

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Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly

530 535 540

Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly

545 550 555 560

Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

565 570 575

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

580 585 590

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

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Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

610 615 620

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

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Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

645 650 655

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

660 665 670

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

675 680 685

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

690 695 700

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

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Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

725 730 735

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

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Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

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770 775 780

Arg

785

<210> 178

<211> 2235

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”

<400> 178

atggccctgc cagtgaccgc cctgctgctg ccactggccc tgctgctgca cgcagcaagg 60

ccatcagacc ctactagagt cgagaccgct accgagaccg cttggatctc tctggtgacc 120

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ctgccaccaa gatga 2235

<210> 179

<211> 744

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 179

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu

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Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala

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Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln

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Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val Gly Ser Gly Ala Thr

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Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

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Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu

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Leu His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

245 250 255

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

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275 280 285

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Thr

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Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

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Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

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Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala

420 425 430

Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

435 440 445

Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr

450 455 460

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Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro

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Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

515 520 525

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

530 535 540

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

545 550 555 560

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

565 570 575

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg

580 585 590

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

595 600 605

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

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Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

625 630 635 640

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

645 650 655

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

660 665 670

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

675 680 685

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

690 695 700

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

705 710 715 720

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

725 730 735

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

740

<210> 180

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 180

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

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Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

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Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala

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Thr His Leu Val

180

<210> 181

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 181

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

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Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

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Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu

100 105 110

Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn

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145 150 155 160

Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro

165 170 175

Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Gly Gln Gly Glu Phe

180 185 190

Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser

195 200 205

Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val

210 215 220

<210> 182

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 182

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala

100 105 110

Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp

115 120 125

Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser

130 135 140

Pro Ser Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu

145 150 155 160

Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro

165 170 175

Thr His Leu Val

180

<210> 183

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 183

Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys

1 5

<210> 184

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 184

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Leu Glu Asp Glu Gly Val Ala

100 105 110

Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly

115 120 125

Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu

130 135 140

Phe Ser Pro Ser Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu

145 150 155 160

Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln

165 170 175

Asp Pro Thr His Leu Val Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu

180 185 190

Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

195 200

<210> 185

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 185

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Leu Glu Gln Gln Asp Lys Val

100 105 110

Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe

115 120 125

Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile

130 135 140

Glu Ala Cys Gln Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser

145 150 155 160

Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr

165 170 175

Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Gly Gln Gly

180 185 190

Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr

195 200 205

Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val Gly

210 215 220

Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu

225 230 235 240

Glu Asn Pro Gly

<210> 186

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 186

Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Arg Lys Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

35 40 45

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

50 55 60

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

65 70 75 80

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Leu Glu Asp Glu Gly Val Ala

100 105 110

Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly

115 120 125

Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu

130 135 140

Phe Ser Pro Ser Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu

145 150 155 160

Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln

165 170 175

Asp Pro Thr His Leu Val Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu

180 185 190

Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

195 200

<210> 187

<211> 1189

<212> DNA

<213> 智人

<400> 187

gcgtgaggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag 60

ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg 120

gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata 180

agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta 240

agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct 300

tgaattactt ccacgcccct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg 360

aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt 420

tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg 480

tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct 540

ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt 600

ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg 660

gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc 720

tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg 780

gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc 840

aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag 900

ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag 960

gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt 1020

ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca 1080

cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa 1140

gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1189

<210> 188

<211> 237

<212> DNA

<213> 智人

<400> 188

gcgtgaggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag 60

ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg 120

gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata 180

agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacag 237

Claims

1.一种包含抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)和组成型活性嵌合细胞因子受体(CACCR)的工程化免疫细胞，其中所述CACCR包含两种单体，每种单体包含：

跨膜结构域；

Janus激酶(JAK)结合结构域；和

募集结构域。

2.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述跨膜结构域和JAK结合结构域存在于多肽(“TM/JAK多肽”)中，所述多肽包含与天然存在的TPOR/MPLR受体的氨基酸478-582(SEQID NO:7的氨基酸序列)有至少约90％同一性的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的工程化免疫细胞，其中所述TM/JAK多肽包含所述天然存在的TPOR/MPLR受体的所述氨基酸478-582序列(SEQ ID NO:7的氨基酸序列)的经修饰型式，其中所述经修饰型式在选自H499、S505和W515的氨基酸位置处包含至少一个氨基酸取代。

4.如权利要求3所述的工程化免疫细胞，其中所述天然存在的TPOR/MPLR受体的所述氨基酸478-582序列的所述经修饰型式包含选自由H499L、S505N和W515K组成的组的至少一个氨基酸取代。

5.如权利要求1-4中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述募集结构域包含与来自IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2或IL21R的STAT募集结构域有至少约90％同一性的氨基酸序列。

6.如前述权利要求中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述募集结构域包含与来自IL2Rb的所述STAT募集结构域有至少约90％同一性的氨基酸序列。

7.如前述权利要求中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述募集结构域包含与包含IL2Rb的氨基酸339-379、393-433和518-551的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)有至少约90％同一性的氨基酸序列，或与包含IL2Rb的氨基酸393-433和518-551的氨基酸序列(SEQ ID NO:77)有至少约90％同一性的氨基酸序列。

8.如权利要求7所述的工程化免疫细胞，其中所述募集结构域包含IL2Rb的氨基酸339-379、393-433和518-551(SEQ ID NO:78)或IL2Rb的氨基酸393-433和518-551(SEQ ID NO:77)。

9.如权利要求4所述的工程化免疫细胞，其中所述TM/JAK多肽包含氨基酸取代S505N和W515K(SEQ ID NO:13)，并且进一步地，其中所述募集结构域包含IL2Rb的氨基酸393-433和518-551(SEQ ID NO:77)。

10.如权利要求4所述的工程化免疫细胞，其中所述TM/JAK多肽包含氨基酸取代H499L、S505N和W515K(SEQ ID NO:12)，并且进一步地，其中所述募集结构域包含IL2Rb的氨基酸339-379、393-433和518-551(SEQ ID NO:78)。

11.如权利要求4所述的工程化免疫细胞，其中所述TM/JAK多肽包含氨基酸取代H499L、S505N和W515K，并且进一步地，其中所述募集结构域包含IL2Rb的氨基酸393-433和518-551(SEQ ID NO:77)。

12.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述CACCR包含与SEQ ID NO:99、100、143、180、181、182、184、185或186的氨基酸序列有至少约90％同一性的氨基酸序列。

13.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述CACCR包含SEQ ID NO:99、100、143、180、181、182、184、185或186的氨基酸序列。

14.如权利要求1-13中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述BCMA CAR包含细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

15.如权利要求14所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞外配体结合结构域特异性识别并结合人BCMA。

16.如权利要求15所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞外配体结合结构域包含单链可变片段(scFv)。

17.如权利要求16所述的工程化免疫细胞，其中所述scFv包含通过柔性接头连接的重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。

18.如权利要求17所述的工程化免疫细胞，其中所述VH区包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列并且所述VL区包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列，或所述VH区包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列并且所述VL区包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。

19.如权利要求17或18所述的工程化免疫细胞，其中所述VH区包含：VHCDR1，其包含SEQID NO:146、147或148的氨基酸序列；VHCDR2，其包含SEQ ID NO:149或150的氨基酸序列；和VHCDR3，其包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列；并且所述VL区包含：VLCDR1，其包含SEQ IDNO:152的氨基酸序列；VLCDR2，其包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含SEQID NO:154的氨基酸序列。

20.如权利要求15-18中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述VH区包含：VHCDR1，其包含SEQ ID NO:157、158或159的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO:160或161的氨基酸序列；和VHCDR3，其包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列；并且所述VL区包含：VLCDR1，其包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列；VLCDR2，其包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列；和VLCDR3，其包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列。

21.如权利要求14-20中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述BCMA CAR的所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ(CD3zeta)信号传导结构域和/或4-1BB信号传导结构域。

22.如权利要求14-21中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所BCMA CAR包含含有CD20模拟表位的安全开关。

23.如权利要求1-19中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述BCMA CAR包含与SEQID NO:140、141或166的氨基酸序列有至少约90％同一性的氨基酸序列。

24.如权利要求1-19中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述BCMA CAR包含SEQ IDNO:140、141或166的氨基酸序列。

25.一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:140、141或166的氨基酸序列的BCMACAR多肽和包含SEQ ID NO:99、100、180、181、182、184、185或186的氨基酸序列的CACCR多肽。

26.如权利要求25所述的工程化免疫细胞，其中单个多核苷酸编码包含SEQ ID NO:140、141或166的氨基酸序列的所述多肽和包含SEQ ID NO:99、100、180、181、182、184、185或186的氨基酸序列的所述多肽两者。

27.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:172或176的核酸序列。

28.如权利要求25-27中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述多核苷酸包含启动子。

29.如权利要求28所述的工程化免疫细胞，其中所述启动子包含EF-1α启动子。

30.如权利要求1-29中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述CACCR不包含细胞外配体结合结构域。

31.如权利要求1-30中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞为工程化T细胞。

32.如权利要求31所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化T细胞为自体T细胞或同种异体T细胞。

33.如权利要求1-32中任一项所述的工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞进一步在T细胞受体α恒定区(TRAC)和/或CD52基因中包含一个或多个遗传修饰以减少或消除TCRα和/或CD52的表达。

34.一种治疗患有疾病或病症的患者的方法，其中所述方法包括施用有效量的如权利要求1-33和46中任一项所述的工程化免疫细胞。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述疾病或病症为多发性骨髓瘤。

36.如权利要求34或35所述的方法，其中所述工程化免疫细胞对于所述患者是同种异体的。

37.如权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述患者施用至少一个剂量的所述工程化免疫细胞，并且进一步地，其中一个剂量含有约7×10^6个细胞至约480×10^6个细胞。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述剂量范围为约20×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量，或者所述至少一个剂量为约20×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量、约120×10^6个细胞/剂量、约240×10^6个细胞/剂量、约320×10^6个细胞/剂量、约360×10^6个细胞/剂量或约480×10^6个细胞/剂量。

39.至少一种分离的多核苷酸，所述至少一种分离的多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:140、141或166的氨基酸序列有至少约90％同一性的氨基酸序列的BCMACAR，并且编码包含与SEQ ID NO:99、100、180、181、182、184、185或186的氨基酸序列有至少约90％同一性的多肽的CACCR。

40.一种载体，所述载体包含如权利要求39的所述的分离的多核苷酸。

41.如权利要求40所述的载体，其中所述BCMACAR包含SEQ ID NO:140、141或166的氨基酸序列，和/或所述CACCR包含SEQ ID NO:99、100、180、181、182、184、185或186的氨基酸序列。

42.如权利要求40或41所述的载体，其中所述载体进一步包含启动子。

43.如权利要求40-42中任一项所述的载体，其中所述启动子包含EF-1α启动子。

44.如权利要求40-43中任一项所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。

45.如权利要求40-44中任一项所述的载体，所述载体进一步包含突变WPRE。

46.一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞包含如权利要求39所述的多核苷酸或如权利要求40-45中任一项所述的载体。

47.一种制备如权利要求1-33和46中任一项所述的工程化免疫细胞的方法，所述方法包括向细胞中引入：

a)编码BCMACAR的至少一种多核苷酸和编码CACCR的至少一种多核苷酸，

b)如权利要求39所述的至少一种多核苷酸，

c)如权利要求40所述的载体，

d)如权利要求41所述的载体，

e)如权利要求42所述的载体，

f)如权利要求43所述的载体，

g)如权利要求44所述的载体，或

h)如权利要求45所述的载体，

其中所述工程化免疫细胞表达BCMACAR和CACCR。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞或源自干细胞的免疫细胞。

49.如权利要求47或48所述的方法，其中所述细胞是自体的。

50.如权利要求47或48所述的方法，其中所述细胞是同种异体的。

51.如权利要求47-50中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸或载体进一步编码至少一个选择标记。

52.如权利要求47-50中任一项所述的方法，其中通过电穿孔、转染和/或病毒转导将所述多核苷酸或载体引入所述细胞中。