JP2022538397A - キメラ抗原受容体設計で実施するためのウルトラモジュラー（ｕｌｔｒａｍｏｄｕｌａｒ） ＩｇＧ３ベーススペーサードメイン及び多機能部位 - Google Patents

キメラ抗原受容体設計で実施するためのウルトラモジュラー（ｕｌｔｒａｍｏｄｕｌａｒ） ＩｇＧ３ベーススペーサードメイン及び多機能部位 Download PDF

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Abstract

本発明は概して、キメラ抗原受容体(CAR)改変T細胞等の免疫細胞を使用する免疫療法に関する。特に、本発明は、新規のIgG3ヒンジベーススペーサードメインを有し、標的抗原に対する微細に調節された応答を可能にするキメラ抗原受容体(CAR)改変T細胞を使用する免疫療法に関する。更に、本発明は、1つ又は複数のIgG3ヒンジベースの多機能部位(MFS)をCAR及び他の免疫受容体に導入し、CAR T細胞の精製、刺激、拡大及び枯渇を可能にすることに関する。本発明は、このモチーフを標的にし、前述の機能の遂行を可能にする抗体の配列も含む。

Description

本発明は概して、キメラ抗原受容体(CAR)改変T細胞等の免疫細胞を使用する免疫療法に関する。特に、本発明は、新規のIgG3ヒンジベーススペーサードメインを有し、標的抗原に対する微細に調節された応答を可能にする、キメラ抗原受容体(CAR)改変T細胞を使用する免疫療法に関する。更に、本発明は、1つ又は複数のIgG3ヒンジベースの多機能部位(MFS)をCAR及び他の免疫受容体に導入し、CAR T細胞の精製、刺激、拡大及び枯渇を可能にすることに関する。本発明は、このモチーフを標的にし、前述の機能の遂行を可能にする抗体の配列も含む。
キメラ抗原受容体(CAR)は、腫瘍細胞の表面抗原を認識するようにT細胞に再指示することを意図して開発された合成免疫受容体である。そのほとんどの基本フォーマットでは、CARは、膜貫通ドメイン及びCD3ζのシグナル伝達ドメインに融合されたモノクローナル抗体の可変重鎖及び可変軽鎖を(シスで、すなわち一本鎖可変断片、scFvとして)含む1。この基本CAR設計を改善する方法は、CARによる抗原結合を促進するために範囲及び柔軟性を提供するようにscFvと膜貫通ドメインの間に位置するスペーサードメインを含めることであった2。結局、いくつかのスペーサードメインが、IgG1及びIgG4、IgD、CD4、CD7、CD8α及びCD28に由来するFc領域及び免疫グロブリン様ドメインを含むCAR構築物において使用された3-6。
本分野における従来のアプローチは、たとえ所与の抗原の異なるエピトープ、又は異なる抗原を認識できるとしても、全てのCAR構築物に単一スペーサー設計を使用することである(「1つのCARが全てに適合しなければならない」)。しかし、CARは腫瘍細胞の表面抗原に結合するため、最適な抗原結合、及びCAR修飾T細胞と腫瘍細胞の間の最適な相互作用を可能にする空間要件は、エピトープ及び標的抗原に応じて異なり得る。したがって、全てのエピトープ及び抗原に対して単一スペーサー設計を使用する従来のアプローチは、単純で最適以下のように思われる。最適以下のCAR結合及び/又はCAR修飾T細胞と腫瘍細胞の間の最適以下の相互作用があるならば、続いて起こるCAR-T細胞刺激及び抗腫瘍応答も最適以下になる可能性がある3、7。より最適化されたCAR標的分子相互作用を達成する機会を増やすために、本発明者らは、長さ及び組成が異なるIgG4由来スペーサーのバリアントを以前に研究した。浮上したパラダイムは、スペーサー長と有効性の間には相関関係があり、それにより標的細胞の膜近位エピトープはより長いスペーサーを含有するCARによってより良好に到達され、膜遠位エピトープはより短いスペーサーを含有するCARによってより良好に到達されるということであった7。IgG4分子の構造に基づき、>100aaずつサイズが異なる3つのIgG4ヒンジベーススペーサーバリアントが利用可能である(IgG4_短: IgG4ヒンジ、12aa; IgG4_中央部: IgG4ヒンジ+CH3、119aa; IgG4_長: IgG4ヒンジ+CH2+CH3、228aa)7。
全てのヒトIgG分子のうち、IgG3は、最も高いFab-Fab折り畳み柔軟性及びFab Fc折り畳み柔軟性を示す。全ての他の免疫グロブリンとは対照的に、IgG3のヒンジとしてのIgG3の構造は独特であり、エクソン重複に起因する15aaモチーフの3コピーを組み込んでいる8-11。ヒンジ領域中にこのモチーフの1又は2コピーのみを有するIgG3の天然に存在するバリアントは、はるかに短いFabとFcの距離を示す(105Åと比べて45Å及び65Å)8。これらの段階的違い、並びにこの15aaモチーフの1つ又は複数のコピーの付加又は除去によってスペーサー領域を延長及び短縮する機会により、本発明は、スペーサーの長さを標的ごとに最適設定に微調整し得ることを利用してIgG3ヒンジライブラリーを構築するに至った。更に、本発明者らは、IgG3中央部ヒンジモチーフに特異的なモノクローナル抗体を同定し、CAR T細胞の精製、刺激、拡大及び枯渇を含む、抗原非依存性であるがCAR特異的な追加の機能の利用を可能にした。
本発明は概して、キメラ抗原受容体(CAR)改変T細胞等の免疫細胞を使用する免疫療法に関する。特に、本発明は、新規のIgG3ヒンジベーススペーサードメインを有し、標的抗原に対する微細に調節された応答を可能にするキメラ抗原受容体(CAR)改変T細胞を使用する免疫療法に関する。更に、本発明は、1つ又は複数のIgG3ヒンジベースの多機能部位(MFS)をCAR及び他の免疫受容体に導入し、CAR T細胞の精製、刺激、拡大及び枯渇を可能にすることに関する。本発明は、このモチーフを標的にし、前述の機能の遂行を可能にする抗体の配列も含む。
本発明は、特に以下の項目を提供し、以下の項目を特徴とする。
1. 1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフを含む免疫受容体であって、IgG3 CH2及び/又はCH3ドメインを含まない前記免疫受容体。
2. [A-Bn]
(式中、
Aは配列番号2のアミノ酸配列であり、
Bは前記IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフであり、前記モチーフは配列番号1のアミノ酸配列を有し、
nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及び15からなる群から選択され、好ましくは1～15の間の整数、より好ましくは1～10の間の整数、更により好ましくは1～5の間の整数、最も好ましくは3～5の間の整数である)
のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、又は最も好ましくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目1に記載の免疫受容体。
3. [A-Bn]のアミノ酸配列を有する100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目2に記載の免疫受容体。
4. nが1～10の間の整数である、項目2又は3に記載の免疫受容体。
5. nが1～5の間の整数である、項目2又は3に記載の免疫受容体。
6. nが3～5の間の整数である、項目2又は3に記載の免疫受容体。
7.細胞外抗原結合ドメインと、
スペーサードメインと、
膜貫通ドメインと、
細胞内シグナル伝達ドメインと
を含み、スペーサードメインが、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置し、
場合によりスペーサードメインが、1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む、項目1から6のいずれか一項に記載の免疫受容体。
8.膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインが共に、配列番号109、110、111、112、113、114、115及び174からなる群から選択される配列からなる、項目7に記載の免疫受容体。
9.第1のドメインと、
リンカーと、場合により、
第2のドメインと
を含む細胞外抗原結合ドメインを含み、
場合により、リンカーが第1のドメインと第2のドメインの間に位置し、
場合によりリンカーが、1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む、項目1から8のいずれか一項に記載の免疫受容体。
10.スペーサードメインが、1つ若しくは複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含み、
及び/又は
細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカーが、1つ若しくは複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む、
項目7、8又は9に記載の免疫受容体。
11.T細胞受容体(TCR)、好ましくは組換えTCR; B細胞受容体(BCR)、好ましくは組換えBCR;及びキメラ抗原受容体(CAR)からなる群から選択される、項目1から10のいずれか一項に記載の免疫受容体。
12.免疫受容体が抗原結合ドメインを含み、
I)第1のドメインが重鎖可変ドメインを含む、
II)第1のドメインが軽鎖可変ドメインを含む、
III)第1のドメインが重鎖可変ドメインを含み、第2のドメインが軽鎖可変ドメインを含む、
IV)第1のドメインが重鎖可変ドメインを含み、第2のドメインが重鎖可変ドメインを含む、又は
V)第1のドメインが軽鎖可変ドメインを含み、及び第2のドメインが軽鎖可変ドメインを含む、項目9から11のいずれか一項に記載の免疫受容体。
13.免疫受容体が抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、一本鎖可変断片(scFv)の一部である第1のドメイン、リンカー、及び第2のドメインを含み、
scFvが場合により、第1/第2のドメインに含まれる重鎖/軽鎖可変配列として、以下の抗原:
A) CD19、場合により、
i)重鎖可変ドメインは、配列番号27に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号28に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、CD19に特異的に結合することができる、又は
ii)重鎖可変ドメインは配列番号27のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号28のアミノ酸配列を有する;
B) CD20、場合により、
i)重鎖可変ドメインは、配列番号30に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号29に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、CD20に特異的に結合することができる、又は
ii)重鎖可変ドメインは配列番号30のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号29のアミノ酸配列を有する;
C) ROR1、場合により、
i)それぞれ、重鎖可変ドメインは、配列番号31、33、35、若しくは37に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号32、34、36、若しくは38に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、ROR1に特異的に結合することができる、又は
ii)それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号31、33、35、若しくは37のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号32、34、36、38のアミノ酸配列を有する;
D) ROR2、場合により、
i)重鎖可変ドメインは、配列番号39に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号40に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、ROR2に特異的に結合することができる、又は
ii)重鎖可変ドメインは配列番号39のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号40のアミノ酸配列を有する;
E) SLAMF7、場合により、
i)それぞれ、重鎖可変ドメインは、配列番号41若しくは43に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号42若しくは44に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、SLAMF7に特異的に結合することができる、又は
ii)それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号41若しくは43のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号42若しくは44のアミノ酸配列を有する;
F) FLT3、場合により、
i)それぞれ、重鎖可変ドメインは、配列番号45若しくは47に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号46若しくは48に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、FLT3に特異的に結合することができる、又は
ii)それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号45若しくは47のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号46若しくは48のアミノ酸配列を有する;
G) Siglec-6、場合により、
i)重鎖可変ドメインは、配列番号49に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号50に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、Siglec-6に特異的に結合することができる、又は
ii)重鎖可変ドメインは配列番号49のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号50のアミノ酸配列を有する;
H)αvβ3インテグリン、場合により、
i)それぞれ、重鎖可変ドメインは、配列番号51若しくは53に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号52若しくは54に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、αvβ3インテグリンに特異的に結合することができる、又は
ii)それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号51若しくは53のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号52若しくは54のアミノ酸配列を有する;
又は
I) BCMA、場合により、
i)それぞれ、重鎖可変ドメインは、配列番号55若しくは57に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号56若しくは58に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、BCMAに特異的に結合することができる、又は
ii)それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号55若しくは57のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号56若しくは58のアミノ酸配列を有する
の1つに特異的なscFvの重鎖/軽鎖可変配列を含む、項目9から12のいずれか一項に記載の免疫受容体。
14.免疫受容体が抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが:
I) CD19に特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号3若しくは71に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CD19に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号3若しくは71のアミノ酸配列を有する;
II) CD20に特異的なSCFV、場合により、前記scFvは、配列番号4若しくは72に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CD20に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号4若しくは72のアミノ酸配列を有する;
III) ROR1に特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号5、6、7、8、73、74、75、76、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99若しくは100に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ROR1に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号5、6、7、8、73、74、75、76、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99若しくは100のアミノ酸配列を有する;
IV) ROR2に特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号9、77、101、102、103、104、105、106、107若しくは108に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ROR2に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号9、77、101、102、103、104、105、106、107若しくは108のアミノ酸配列を有する;
V) SLAMF7に特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号10、11、78若しくは79に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、SLAMF7に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号10、11、78若しくは79のアミノ酸配列を有する;
VI) FLT3に特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号12、13、80若しくは81に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、FLT3に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号12、13、80若しくは81のアミノ酸配列を有する;
VII) Siglec-6に特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号14若しくは82に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Siglec-6に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号14若しくは82のアミノ酸配列を有する;
VIII)αvβ3インテグリンに特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号15、16、83若しくは84に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、αvβ3インテグリンに特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号15、16、83若しくは84のアミノ酸配列を有する;
IX) BCMAに特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号17、18、85若しくは86に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、BCMAに特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号17、18、85若しくは86のアミノ酸配列を有する
を含む、項目9から13のいずれか一項に記載の免疫受容体。
15.キメラ抗原受容体(CAR)である、項目1から14のいずれか一項に記載の免疫受容体。
16.1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフが、
I)ヒトIgG3中央部ヒンジ由来であり、並びに/又は
II)配列番号1のアミノ酸配列からなり、並びに/又は
III) IgG1ヒンジドメイン及び/若しくはIgG4ヒンジドメインのリピートと比べて免疫原性が低減している、項目1から15のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCAR。
17. I)ヒトIgG3ヒンジドメインの下部ヒンジドメイン配列の全部若しくは一部を含まず、
II) [A-Bn]
(式中、
Aは配列番号2のアミノ酸配列であり、
Bは前記IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフであり、前記モチーフは配列番号1のアミノ酸配列を有し、
nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及び15からなる群から選択され、好ましくは1～15の間の整数、より好ましくは1～10の間の整数、更により好ましくは1～5の間の整数、最も好ましくは3～5の間の整数である)
のアミノ酸配列と
少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、若しくは最も好ましくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
III) IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10回含み、及び/又は
IV)前記1つ若しくは複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まないという点で第1のCARと異なる第2のCARと比べて免疫原性が低減している、項目1から16のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCAR。
18.互いに隣接する前記IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフの少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つを含む、項目1から17のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCAR。
19.配列番号116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、及び171からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目1から18のいずれか一項に記載のCAR。
20.項目1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARをコードする核酸。
21.項目20に記載の核酸を含む、細胞。
22. I)細胞が、免疫細胞、好ましくはB細胞、マクロファージ、NK細胞若しくはT細胞、より好ましくはT細胞、更により好ましくはCD4+及び/若しくはCD8+ T細胞であり、
II)細胞が、項目1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現し、
III)細胞が、ゲノムに安定に組み込まれた核酸を含み、並びに/又は
IV)細胞に含まれる核酸がエピソームベクターに含まれる、項目21に記載の細胞。
23.癌、自己免疫疾患、感染症又は変性疾患を処置する方法において使用するための、項目1から22のいずれか一項に記載の核酸、核酸を含む細胞、免疫受容体、又はCAR。
24.疾患が癌であり、癌が血液癌又は固形癌であり、
場合により、血液癌が白血病又はリンパ腫、好ましくは急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、又はびまん性大細胞型B細胞リンパ腫であり、
場合により、固形癌が乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓若しくは前立腺癌又は神経膠芽腫である、項目23に記載の使用のための免疫受容体、CAR、核酸又は核酸を含む細胞。
25.配列番号1のアミノ酸配列の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つのリピートからなる配列によって含まれるエピトープに結合することができ、場合により、少なくとも2つのリピートが互いに隣接している、抗原結合タンパク質、ストレプタマー(streptamer)又はアプタマー。
26.項目1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARに結合することができる、項目25に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマー。
27.項目1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを刺激することができる、項目26に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマー。
28.抗体又はその断片、好ましくはモノクローナル抗体又はその断片である抗原結合タンパク質である、項目25から27のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマー。
29. a)配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変領域であって、配列番号20のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号21のアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号22のアミノ酸配列を有するCDR3を好ましくは含有する前記重鎖可変領域と、
b)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変領域であって、配列番号24のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号25のアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号26のアミノ酸配列を有するCDR3を好ましくは含有する前記軽鎖可変領域と
を含む、項目25から28のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
30.項目1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞の精製、検出、枯渇、刺激、拡大、又は濃縮のための、項目25から29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマーの使用。
31.抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマーを、項目1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞に結合させる工程を含む方法であって、好ましくは、結合が、前記免疫受容体若しくはCARに含まれるIgG3中央部ヒンジリピートドメインへの特異的結合であり、及び/又は、抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーが、項目25から29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーである、前記方法。
32.項目1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞の精製方法であって、
A)キメラ抗原受容体を発現している細胞を場合により得る工程と、
B)細胞によって発現された免疫受容体又はCARに抗体、ストレプタマー又はアプタマーが結合できるようにする条件下で、項目25から29のいずれか一項に記載の前記抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマーである一次抗体、ストレプタマー又はアプタマーと前記細胞をインキュベートする工程と、
C)抗体結合細胞、ストレプタマー結合細胞又はアプタマー結合細胞を非結合細胞から分離して、精製細胞を得る工程と
を含む、前記方法である、項目31に記載の方法。
33.工程Cが、工程Bの細胞を、抗体、ストレプタマー又はアプタマーに結合することができる実体とインキュベートする工程を含み、
I)実体が、より好ましくは蛍光マーカー;若しくはビーズ、より好ましくは磁気ビーズで標識された好ましくは二次抗体であり、
II)一次抗体、ストレプタマー若しくはアプタマーが標識され、標識は好ましくはタグ若しくは蛍光色素であり、
III)工程Cの分離がMACS若しくはFACSの手段によって実施され、及び/又は
IV)分離がストレプタマー若しくはアプタマーを使用して実施される、
項目32に記載の精製方法。
34.項目1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞の枯渇方法であって、
A)免疫受容体又はCARを発現している細胞を場合により得る工程と、
B)前記細胞を、細胞傷害性分子に結合された項目25から29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマーとインキュベートする工程と
を含む、前記方法である、項目31に記載の方法。
35.項目1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞のa)刺激及び/又はb)拡大方法であって、
A)免疫受容体又はCARを発現している細胞を場合により得る工程と、
B)場合により、抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーが固相に結合される、又は抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーが細胞の表面で発現される、項目25から29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマーと前記細胞をインキュベートする工程と
を含む、前記方法である、項目31に記載の方法。
36. I)固相が、組織培養表面若しくはビーズ、好ましくは磁気ビーズであり、及び/又は
II)固相が、ポリマー、好ましくはデンプン若しくは糖からなる足場である、
項目35に記載の刺激又は拡大方法。
37.項目1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞の濃縮方法であって、
A)項目35又は36に記載の方法により細胞を刺激及び/又拡大する工程と
B)項目32又は33に記載の方法により工程Aの細胞を精製する工程と
を含む、前記方法である、項目31に記載の方法。
38.インビトロでの方法又は使用である、項目30から37のいずれか一項に記載の方法又は使用。
39.手術若しくは治療によるヒト若しくは動物の身体を処置するための方法、又はヒト若しくは動物の身体で行われる診断法を含まない、項目30から38のいずれか一項に記載の方法又は使用。
40.項目25から29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマー、又は前記抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーの全部若しくは一部を含むキメラ抗原受容体を発現している細胞を含む医薬組成物であって、薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤を場合により更に含む前記組成物。
41.項目25から29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマー、又は前記抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーの全部若しくは一部を含むキメラ抗原受容体を発現している細胞、又は項目40に記載の医薬組成物であって、細胞傷害性分子に結合された前記抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマー、又は前記抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーの前記全部若しくは一部を含む前記キメラ抗原受容体を発現している細胞を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、項目1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞枯渇の治療法において使用するための、前記抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマー、又は前記細胞、又は前記医薬組成物。
42.項目1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARと、項目25から27のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマーとを含む、キット。
43. 1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフを含む、二重特異性抗体。
44. 1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフが、
I)ヒトIgG3中央部ヒンジ由来であり、並びに/又は
II)配列番号1のアミノ酸配列からなり、並びに/又は
III) IgG1ヒンジドメイン及び/若しくはIgG4ヒンジドメインのリピートと比べて免疫原性が低減している、項目43に記載の二重特異性抗体。
45. I)ヒトIgG3ヒンジドメインの下部ヒンジドメインの配列の全部若しくは一部を含まず、
II) [A-Bn]
(式中、
Aは配列番号2のアミノ酸配列であり、
Bは前記IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフであり、前記モチーフは配列番号1のアミノ酸配列を有し、
nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及び15からなる群から選択され、好ましくは1～15の間の整数、より好ましくは1～10の間の整数、更により好ましくは1～5の間の整数、最も好ましくは3～5の間の整数である)
のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、若しくは最も好ましくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
III) IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10回含み、及び/又は
IV)前記1つ若しくは複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まないという点で第1の二重特異性抗体とは異なる第2の二重特異性抗体と比べて免疫原性が低減している、項目43又は44に記載の二重特異性抗体。
46.免疫受容体が、[A-Bn]のアミノ酸配列と100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目43から45のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
47. nが1～10の間の整数である、項目45又は46に記載の二重特異性抗体。
48. nが1～5の間の整数である、項目45又は46に記載の免疫受容体。
49. nが3～5の間の整数である、項目45又は46に記載の免疫受容体。
50.少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つのIgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフを含み、場合により、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフの少なくとも2つが互いに隣接している、項目43から49のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
51.IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフが、マウスIgG3中央部ヒンジリピートドメインではない、項目1から24又は31から50のいずれか一項に記載の免疫受容体、CAR、核酸、細胞、方法、医薬組成物、キット又は二重特異性抗体。
CARの設計。A. 異なる長さのIgG3由来スペーサーを有するCARの概略説明図。 IgG3由来スペーサーを備えるCD19 CAR T細胞はin vitroで機能的である。A. 抗原特異的増殖。CD8+ T細胞をCFSEで標識し、CD19の発現を伴う又は伴わない照射したK562腫瘍細胞を用いて4:1のE:T比で刺激した。CFSEの希釈によって可視化した増殖を、72時間後に判定した。外因性サイトカインは添加しなかった。n=3の独立した実験についての代表的な例。B. 生物発光系アッセイ(5時間のインキュベーション)における、CD19+ Jeko-1細胞に対する様々なスペーサードメインを備えるCD8+ CD19-CAR T細胞及び形質導入していないT細胞の特異的細胞溶解活性。アッセイは、三重測定ウェルで標的細胞5,000個/ウェルとして実施した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。C. CD8+ CD19 CAR T細胞と、CD19の発現を伴う又は伴わないK562標的細胞との24時間の共培養から得られた上清中のIFNγを検出するELISA。T細胞(50,000/ウェル)及び標的細胞(12,500/ウェル)を、三重測定ウェルに播種した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。 IgG3由来スペーサーを備えるROR1 CAR T細胞はin vitroで機能的である。scFv 4-2に基づくROR1特異的CARのin vitro機能の評価。A. 抗原特異的増殖。CD8+ T細胞をCFSEで標識し、ROR1の発現を伴う又は伴わない照射したK562腫瘍細胞(K562_ROR1)を用いて4:1のE:T比で刺激した。CFSEの希釈によって可視化した増殖を、72時間後に判定した。外因性サイトカインは添加しなかった。n=3の独立した実験についての代表的な例。B. 生物発光系アッセイ(5時間のインキュベーション)における、K562_ROR1に対する様々なスペーサードメインを備えるCD8+ ROR1-CAR T細胞及び形質導入していないT細胞の特異的細胞溶解活性。アッセイは、三重測定ウェルで標的細胞5,000個/ウェルとして実施した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。C. CD8+ ROR1 CAR T細胞と、ROR1の発現を伴う又は伴わないK562標的細胞との24時間の共培養から得られた上清中のIFNγを検出するELISA。T細胞(50,000/ウェル)及び標的細胞(12,500/ウェル)を、三重測定ウェルに播種した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。 IgG3由来スペーサーを備えるROR1 CAR T細胞はin vitroで機能的である。scFv R11に基づくROR1特異的CARのin vitro機能の評価。A. 抗原特異的増殖。CD8+ T細胞をCFSEで標識し、ROR1の発現を伴う若しくは伴わない照射したK562腫瘍細胞(K562_ROR1)又はR11エピトープと腫瘍細胞膜との距離を増大させたROR1の改変されたバージョン(K562_ROR1/E3AK)を用いて4:1のE:T比で刺激した。CFSEの希釈によって可視化した増殖を、72時間後に判定した。外因性サイトカインは添加しなかった。n=3の独立した実験についての代表的な例。B. 生物発光系アッセイ(5時間のインキュベーション)における、K562_ROR1 (B)に対する様々なスペーサードメインを備えるCD8+ ROR1-CAR T細胞及び形質導入していないT細胞の特異的細胞溶解活性。アッセイは、三重測定ウェルで標的細胞5,000個/ウェルとして実施した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。C. CD8+ ROR1 CAR T細胞と、K562_ROR1(C)との24時間の共培養から得られた上清中のIFNγを検出するELISA。T細胞(50,000/ウェル)及び標的細胞(12,500/ウェル)を、三重測定ウェルに播種した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。D. ROR1におけるR11エピトープがE3AKリンカーを用いて腫瘍細胞膜からどのように遠くに移動させられるかを説明する概略図。E. 抗原特異的増殖。CD8+ T細胞をCFSEで標識し、ROR1の発現を伴う若しくは伴わない照射したK562腫瘍細胞(K562_ROR1)又はR11エピトープと腫瘍細胞膜との距離を増大させたROR1の改変されたバージョン(K562_ROR1/E3AK)を用いて4:1のE:T比で刺激した。CFSEの希釈によって可視化した増殖を、72時間後に判定した。外因性サイトカインは添加しなかった。n=3の独立した実験についての代表的な例。F. 生物発光系アッセイ(5時間のインキュベーション)における、K562_ROR1/E3AK (F)に対する様々なスペーサードメインを備えるCD8+ ROR1-CAR T細胞及び形質導入していないT細胞の特異的細胞溶解活性。アッセイは、三重測定ウェルで標的細胞5,000個/ウェルとして実施した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。G. CD8+ ROR1 CAR T細胞と、K562_ROR1/E3AK (G)との24時間の共培養から得られた上清中のIFNγを検出するELISA。T細胞(50,000/ウェル) 及び標的細胞(12,500/ウェル)を、三重測定ウェルに播種した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。 IgG3由来スペーサーを備えるCD20 CAR T細胞はin vitroで機能的である。A. 抗原特異的増殖。CD8+ T細胞をCFSEで標識し、CD20の発現を伴う又は伴わない照射したK562腫瘍細胞を用いて4:1のE:T比で刺激した。CFSEの希釈によって可視化した増殖を、72時間後に判定した。外因性サイトカインは添加しなかった。n=3の独立した実験についての代表的な例。B. 生物発光系アッセイ(3時間のインキュベーション)における、CD20+ Raji細胞に対する様々なスペーサードメインを備えるCD8+ CD20-CAR T細胞及び形質導入していないT細胞の特異的細胞溶解活性。アッセイは、三重測定ウェルで標的細胞5,000個/ウェルとして実施した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。C. CD8+ CD20 CAR T細胞と、CD20の発現を伴う又は伴わないK562標的細胞との24時間の共培養から得られた上清中のIFNγを検出するELISA。T細胞(50,000/ウェル)及び標的細胞(12,500/ウェル)を、三重測定ウェルに播種した。値はn=2の独立した実験からの平均±SEMとして表す。 IgG3由来スペーサーを備えるSLAMF7 CAR T細胞はin vitroで機能的である。A. 抗原特異的増殖。CD4+ T細胞をCFSEで標識し、SLAMF7の発現を伴う又は伴わない照射したK562腫瘍細胞を用いて4:1のE:T比で刺激した。CFSEの希釈によって可視化した増殖を、72時間後に判定した。外因性サイトカインは添加しなかった。n=3の独立した実験についての代表的な例。B. 生物発光系アッセイ(3時間のインキュベーション)における、SLAMF7+ MM.1S細胞に対する様々なスペーサードメインを備えるCD8+ SLAMF7-CAR T細胞及び形質導入していないT細胞の特異的細胞溶解活性。アッセイは、三重測定ウェルで標的細胞5,000個/ウェルとして実施した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。C. CD4+ SLAMF7 CAR T細胞と、K562又はMM.1S標的細胞との24時間の共培養から得られた上清中のIFNγを検出するELISA。T細胞(50,000/ウェル) 及び標的細胞(12,500/ウェル) を、三重測定ウェルに播種した。値はn=2の独立した実験からの平均±SEMとして表す。 IgG3由来スペーサーを備えるROR2 CAR T細胞はin vitroで機能的である。A. 抗原特異的増殖。CD8+ T細胞をCFSEで標識し、ROR2の発現を伴う又は伴わない照射したMDA-MB231腫瘍細胞を用いて4:1のE:T比で刺激した。CFSEの希釈によって可視化した増殖を、72時間後に判定した。外因性サイトカインは添加しなかった。n=3の独立した実験についての代表的な例。B. 生物発光系アッセイ(3時間のインキュベーション)における、ROR2+ U266細胞に対する様々なスペーサードメインを備えるCD8+ ROR2-CAR T細胞及び形質導入していないT細胞の特異的細胞溶解活性。アッセイは、三重測定ウェルで標的細胞5,000個/ウェルとして実施した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。C. CD8+ ROR2 CAR T細胞と、ROR2の発現を伴う又は伴わないMDA-MB231標的細胞との24時間の共培養から得られた上清中のIFNγを検出するELISA。T細胞(50,000/ウェル)及び標的細胞(12,500/ウェル)を、三重測定ウェルに播種した。値はn=2の独立した実験からの平均±SEMとして表す。 IgG3由来スペーサーを備えるCD19 CAR T細胞はin vivoで機能的である。NSGマウスに1×106個のRaji細胞(ffluc+ GFP+)を接種し、7日目に5×106個のCD8+ CD19-CAR T細胞で処置するか又は未処置のままとした。A. 各処置群における白血病の進行/退縮を評価するための連続生物発光イメージング。B. CD19-CAR T細胞(n=3)又は形質導入していないT細胞(n=2)によって処置したマウスの群におけるマウスの生存のKaplan-Meier解析をパネルAに示す。統計解析はログ-ランク検定を用いて行った。* p<0.01。C. 更に6匹のマウスに1×106個のRaji細胞(ffluc+ GFP+)を接種し、7日目に5×106個のCD8+ CD19-CAR T細胞(IgG3_MiH3バリアント又はIgG4対照CAR)で処置した。7日後にマウスを犠牲死させ、末梢血、骨髄、及び脾臓におけるCAR T細胞の存在について解析した。 IgG3由来スペーサーを備えるROR1 CAR T細胞はin vivoで機能的である。NSGマウスに1×106個のJeko-1細胞(ffluc+ GFP+)を接種し、7日目に5×106個のCD8+ ROR1-CAR T細胞(R11 scFv)で処置するか又は未処置のままとした。R11 ROR1-CAR T細胞(n=5)又は形質導入していないT細胞(n=5)によって処置したマウスの群における生存のKaplan-Meier解析。 さらなる多機能部位を有するCARの設計及び検出。A. 様々なIgG3スペーサーを備えるCD19 CAR又はIgG4対照CARを形質導入したCD8+ T細胞における抗MiH抗体#1を用いるCAR表面発現の直接染色。B. IgG4参照CAR及び第1世代IgG3スペーサーCAR又はさらなる多機能部位を有する新型IgG3フォーマットの概略説明図。 さらなるMFSを有する新型IgG3 CARフォーマットはin vitro及びin vivoにおいて強力なCD19 CAR T抗腫瘍機能を提供する。A. 抗原特異的増殖。CD8+ T細胞をCFSEで標識し、CD19の発現を伴う又は伴わない照射したK562腫瘍細胞を用いて4:1のE:T比で刺激した。CFSEの希釈によって可視化した増殖を、72時間後に判定した。外因性サイトカインは添加しなかった。n=3の独立した実験についての代表的な例。B. 生物発光系アッセイ(3時間のインキュベーション)における、CD19+ Jeko-1細胞に対する様々なスペーサードメイン±scFv VHとVLとの間のさらなるIgG3系多機能部位を備えるCD8+ CD19-CAR T細胞又は形質導入していないT細胞の特異的細胞溶解活性。アッセイは、三重測定ウェルで標的細胞5,000個/ウェルとして実施した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。C. CD8+ CD19 CAR T細胞と、CD19の発現を伴う又は伴わないK562標的細胞との24時間の共培養から得られた上清中のIFNγを検出するELISA。T細胞(50,000/ウェル)及び標的細胞(12,500/ウェル)を、三重測定ウェルに播種した。値はn=2の独立した実験からの平均±SEMとして表す。D. NSGマウスに1×106個のRaji細胞(ffluc+ GFP+)を接種し、7日目に5×106個のCD19-CAR T細胞(CD4+:CD8+ 比1:1)で処置するか又は未処置のままとした。各処置群における白血病の進行/退縮を評価するために連続生物発光イメージングを行なった。E. CD19-CAR T細胞(n=5)又は形質導入していないT細胞(n=5)によって処置したマウスの群におけるマウスの生存のKaplan-Meier解析をパネルDに示す。 多機能部位を標的とすることによるCAR T細胞の富化。CD8+ CAR T細胞を模擬T細胞と1:1の比で混合し、いずれもビオチン化した形態の抗MiH抗体#1又は抗EGFRt抗体で標識した。細胞を洗浄し、抗ビオチン-マイクロビーズで標識し、再び洗浄し、Miltenyi社MACS LSカラムを用いて単離し、翌日にフローサイトメトリーによって解析した。A. IgG3-スペーサーCARS対IgG4フォーマットについてのCD8+ EGFRt+細胞のパーセンテージとしてのソーティング後の陽性分画の純度(n=4の独立した実験)。B. Aにおける富化の効率、陽性分画中のEGFRt+細胞の数を陽性+陰性の分画中のEGFRt+細胞の全数で除したパーセントとして示す(n=4の独立した実験)。上のパネルは、フローサイトメトリーによって測定したソーティング後のCD19_IgG3_MiH5 CAR T細胞の純度についての例を示す。C. 第1世代IgG3-スペーサーCAR (R11_IgG3_MiH3)又は新型IgG3フォーマット(R11_IgG3_MiH5/MiH3)についてのCD8+ EGFRt+細胞のパーセンテージとしてのソーティング後の陽性分画の純度(n=3の独立した実験)。D. Cにおける富化の効率、陽性分画中のEGFRt+細胞の数を陽性+陰性の分画中のEGFRt+細胞の全数で除したパーセントとして示す(n=3の独立した実験)。示した値は、培地のみで処理した細胞に対する倍数変化として計算する。 IgG3スペーサーを標的とすることによるCAR T細胞の活性化及び拡大。様々なIgG3系スペーサーを備えるCD8+ CAR T細胞を、5μg/mlの抗MiH抗体#1でプレコートした96ウェルのプレートに三重測定で播種して24時間(A、B)培養し、続いてCD25(A)及びCD69(B)の発現のフローサイトメトリー解析を行なうか、又は拡大アッセイ(C、上パネル)のために7日間培養し、続いて細胞の計数(C、下パネル)を行なった。アステリスクはWilcoxon検定によって確立された統計的有意を示す。p<0.05。 多機能部位を標的とすることによるCAR Tの増殖の誘起。CD8+ T細胞をCFSEで標識し、抗IgG3ヒンジCARの発現を伴う若しくは伴わない照射したK562腫瘍細胞(K562_抗CAR)を用いて4:1のE:T比で、又は抗CD3/抗CD28、抗MiH抗体#1、抗MiH抗体#1/抗CD28若しくは抗MiH抗体#1/抗4-1BBでコートしたDynabeads(登録商標)を用いてビーズ対T細胞の比1.6で、刺激した。CFSEの希釈によって可視化した増殖を、72時間後に判定した。外因性サイトカインは添加しなかった。A. 増殖を誘起するために用いた試薬の概略図。B. 第1世代IgG3-スペーサーCAR(CD19_IgG3_MiH1(左パネル))、又は新型IgG3フォーマット(CD19_IgG3_MiH5/MiH1、右パネル)についてのn=3の独立した実験からの代表的な例。 IgG3スペーサーを標的とすることによるCAR T細胞のADC媒介枯渇。様々な長さのIgG3由来スペーサー又はIgG4参照CARを備える5×104個のCD8+ CAR T細胞、並びに形質導入していないT細胞を三重測定ウェルに播種し、様々な濃度の抗MiH抗体#1-ADC(アンスラサイクリン系細胞傷害性ペイロードにコンジュゲートした抗MiH抗体#1)で処理した。50IUのIL-2の存在下に細胞を72時間培養し、洗浄して、フローサイトメトリー解析に供した。示した生存細胞のパーセンテージは、処理した試料の正規化した細胞数を、培地のみで培養したそれぞれの細胞の正規化した細胞数で除したものである(n=5の独立した実験)。 多機能部位をin vitroで標的とすることによるCAR T細胞のADC媒介枯渇。最適化されたIgG3スペーサーバージョン、最適化されたIgG3スペーサーバージョン+ scFv VHとVLとの間のさらなる多機能部位、又はIgG4参照CARを備える5×104個のCD8+ CAR T細胞、並びに形質導入していないT細胞を三重測定ウェルに播種し、様々な濃度の抗MiH抗体#1-ADC(アンスラサイクリン系細胞傷害性ペイロードにコンジュゲートした抗MiH抗体#1)で処理した。50IUのIL-2の存在下に細胞を72時間培養し、洗浄して、フローサイトメトリー解析に供した。示した生存細胞のパーセンテージは、処理した試料の正規化した細胞数を、培地のみで培養したそれぞれの細胞の正規化した細胞数で除したものである。A. CD19 CARを用いるADCアッセイ(CD19_IgG3_MiH1対CD19_IgG3_MiH5/MiH1対CD19_IgG4)。n=3の独立した実験からのデータ。B. CD20 CARを用いるADCアッセイ(CD20_IgG3_MiH3対CD20_IgG3_MiH5/MiH3対CD20_IgG4)。n=2の独立した実験からのデータ。C. ROR1 CARを用いるADCアッセイ(R11_IgG3_MiH3対R11_IgG3_MiH5/MiH3対R11_IgG4)。n=2の独立した実験からのデータ。 抗IgG3ヒンジCARでin vitroで標的とすることによるCAR発現細胞の枯渇。生物発光系アッセイ(5時間のインキュベーション)における、CD19-CAR CD19_MiH5を形質導入したK562細胞(A)又はK562細胞(B)に対する抗CAR(IgG4スペーサーを有する抗MiH抗体#1系CAR)を備えるCD8+ T細胞の特異的細胞溶解活性。アッセイは、三重測定ウェルで標的細胞5,000個/ウェルとして実施した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。 in vivoにおけるCAR T細胞のADC媒介枯渇。NSGマウスに、新型バージョンのIgG3系CD19 CAR(CD19_IgG3_MiH5/MiH1)並びにffluc_GFP融合タンパク質を形質導入した4.5×106個のCD4+ T細胞を接種した。8日目にマウスの半分(1群あたり動物n=8)を100μgの抗MiH抗体#1 ADC(4.5mg/kg体重に対応)で処置した。11日目に、抗MiH抗体#1系抗CARを備える照射したK562細胞(マウスあたり1×106の照射したK562_抗CAR細胞)でT細胞を再刺激した。A. 連続生物発光イメージングによってT細胞の持続性の速度論を評価した。B. 18日目におけるエンドポイント生物発光。 in vivoにおけるCAR T細胞のCAR特異的刺激。NSGマウスに、増殖染料eFluor670で標識した新型バージョンのIgG3系CD19 CAR(CD19_IgG3_MiH5/MiH1)を形質導入した4.5×106個のCD4+ T細胞を接種した。T細胞を移送した後、続いてn=5のマウスの群を様々な時点で3×106個の照射したK562又はK562_抗CAR細胞で処置した。1つの群にはT細胞の注射の日(d0)のT移送の3時間後にK562_抗CAR細胞を投与した。第2の群にはT細胞の注射の後3日目に、照射したK562_抗CAR細胞のさらなる投薬を行なった(d0+d3)。他の2群はそれぞれ、T細胞の移送後1日目(d1)又はd1+d3に、照射したK562_抗CAR細胞で処置した。対照群には照射したK562細胞をd0+d3に投与した。T細胞の移送後4日目にマウスを犠牲死させ、骨髄細胞を収集した。CD4、CD45、及びEGFRtに対する抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリー解析に供した。CD45+/CD4+/EGFR+骨髄由来T細胞を、eFluor 670希釈について解析した。 さらなるMFSを有する新型IgG3 CARフォーマットはin vitroで強力なROR1 CAR T抗腫瘍機能を提供する。A. 抗原特異的増殖。CD8+ T細胞をCFSEで標識し、ROR1の発現を伴う又は伴わない照射したK562腫瘍細胞を用いて4:1のE:T比で刺激した。CFSEの希釈によって可視化した増殖を72時間後に判定した。外因性サイトカインは添加しなかった。n=3の独立した実験についての代表的な例。B. 生物発光系アッセイ(5時間のインキュベーション)における、ROR1+ K562_ROR1細胞に対する様々なスペーサードメイン±scFv VHとVLとの間のさらなるIgG3系多機能部位を備えるCD8+ ROR1-CAR T細胞又は形質導入していないT細胞の特異的細胞溶解活性。アッセイは、三重測定ウェルで標的細胞5,000個/ウェルとして実施した。値はn=4の独立した実験からの平均±SEMとして表す。C. CD8+ ROR1 CAR T細胞と、ROR1の発現を伴う又は伴わないK562標的細胞との24時間の共培養から得られた上清中のIFNγを検出するELISA。T細胞(50,000/ウェル)及び標的細胞(12,500/ウェル)を、三重測定ウェルに播種した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。 さらなるMFSを有する新型IgG3 CARフォーマットはin vitroで強力なCD19 CAR T抗腫瘍機能を提供する。A. 抗原特異的増殖。CD8+ T細胞をCFSEで標識し、CD19の発現を伴う又は伴わない照射したK562腫瘍細胞を用いて4:1のE:T比で刺激した。CFSEの希釈によって可視化した増殖を72時間後に判定した。外因性サイトカインは添加しなかった。n=3の独立した実験についての代表的な例。B. 生物発光系アッセイ(3時間のインキュベーション) における、CD19+ Jeko-1細胞に対する様々なスペーサードメイン±scFv VHとVLとの間のさらなるIgG3系多機能部位を備えるCD8+ CD19-CAR T細胞又は形質導入していないT細胞の特異的細胞溶解活性。アッセイは、三重測定ウェルで標的細胞5,000個/ウェルとして実施した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。C. CD8+ CD19 CAR T細胞と、CD19の発現を伴う又は伴わないK562標的細胞との24時間の共培養から得られた上清中のIFNγを検出するELISA。T細胞(50,000/ウェル)及び標的細胞(12,500/ウェル)を、三重測定ウェルに播種した。値はn=3の独立した実験からの平均±SEMとして表す。 さらなるMFSを有する新型IgG3 CARフォーマットはin vitroで強力な細胞傷害性効果を提供する。生物発光系アッセイにおける、抗原+腫瘍細胞に対する様々なスペーサードメイン±scFv VHとVLとの間のさらなるIgG3系多機能部位を備えるCD8+ CAR T細胞又は形質導入していないT細胞の特異的細胞溶解活性。アッセイは、三重測定ウェルで標的細胞5,000個/ウェルとして実施した。値はn=2の独立した実験からの平均±SEMとして表す。A. ROR1+ Jeko-1細胞に対するROR1特異的CAR T細胞(4-2 scFv) (3時間のインキュベーション)。B. FLT3+ MOLM-13細胞に対するFLT3特異的CAR T細胞(4G8 scFv) (5時間のインキュベーション)。C. FLT3+ MOLM-13細胞に対するFLT3特異的CAR T細胞(BV10 scFv) (5時間のインキュベーション)。D. Siglec-6+ MV4-11細胞に対するSiglec-6特異的CAR T細胞(JML-1 scFv) (3時間のインキュベーション)。 さらなるMFSを有する新型IgG3 CARフォーマットはin vitroで強力なCD19 CAR T抗腫瘍機能を提供する。A. NSGマウスに1×106個のRaji細胞(ffluc+ GFP+)を接種し、7日目に5×106個のCD19-CAR T細胞(CD4+:CD8+比1:1)で処置するか又は未処置のままとした。各処置群における白血病の進行/退縮を評価するために連続生物発光イメージングを行なった。B. NSGマウスに1×106個のRaji細胞(ffluc+ GFP+)を接種し、7日目に5×106個のCD19-CAR T細胞(CD4+:CD8+比1:1)で処置するか又は未処置のままとした。各処置群における白血病の進行/退縮を評価するために連続生物発光イメージングを行なった。C. D19-CAR T細胞(n=7)又は形質導入していないT細胞(n=4)によって処置したマウスの群におけるマウスの生存のKaplan-Meier解析をパネルA～Bに示す。 IgG3 MFSを標的とすることによるin vitroにおけるCAR T細胞の拡大。5×105個のCD4+若しくはCD8+の形質導入していない対照T細胞、又は新型IgG3フォーマットのCD19特異的CARを備えるCD4+若しくはCD8+のT細胞を、5×106個の照射したTM-EBV-LCL(CD19+)若しくはK562_抗CAR(CD19-)フィーダー細胞及び50IUのIL-2の存在下で14日間拡大させ、14日間の拡大の後にT細胞を計数した。形質導入していないT細胞のみについては、拡大の設定に30ng/mlのOKT3が含まれていた。値は、開始時の計数に対して14日後のx倍拡大として表す(n=2の独立した実験からの平均±SEM)。 IgG3 MFSを標的とすることによるin vivoにおけるCAR T細胞の拡大。NSGマウスにCD19-CAR CD19_MiH5/MiH1を形質導入した1×107個のffluc+ GFP+ T細胞を接種し(CD4+:CD8+比2.7:1)、8日目に1×107個のK562_抗CAR細胞又は形質導入していない対照のK562細胞で処置した。処置群におけるT細胞の持続性/拡大を評価するため、連続生物発光イメージングを行なった。 in vitro及びin vivoにおいて抗IgG3ヒンジCARで標的とすることによるCAR発現細胞の枯渇。A～D. 生物発光系アッセイ(5時間のインキュベーション)における、抗CAR(IgG4スペーサーを有する抗MiH抗体#1系CAR)を備える3匹の異なるドナーからのCD8+ T細胞の、ホタルルシフェラーゼ(A、C)又はホタルルシフェラーゼ及び抗CD19-CAR CD19_MiH5/MiH1(B、D)を形質導入した同じ3匹のドナーからのCD4+ T細胞に対する特異的細胞溶解活性。アッセイは、三重測定ウェルで標的細胞5,000個/ウェルとして実施した。値は、それぞれドナー1(A、B)及びドナー2(C、D)からのCD8+エフェクター抗CAR T細胞を用いたn=1の実験からの三重測定ウェルの平均として表す。E～F. 1群あたり4匹のNSGマウスにドナー2からの2.2×106個の標的T細胞(CD4+:CD8+比1:1) (ffluc+ GFP+ + 抗CD19-CAR CD19_MiH5/MiH1)を接種し、24時間後に4×106個のCD8+ 抗CAR-CAR T細胞(ドナー2)又は同じドナーからの形質導入していない対照T細胞で処置した。各処置群におけるT細胞の持続性/枯渇を評価するため、連続生物発光イメージングを行なった。注:1日目のみの形質導入していない群の左側のマウスは、実験に含めなかった。
過去数十年の間に、キメラ抗原受容体(CAR) (以前はT-Bodyとも呼ばれた)の設計は、やや単純な構築物から、異なるタンパク質ドメインから組み立てられるより複雑な分子へと進化した。今日では第一世代CARとも呼ばれるその最も単純な形態では、CARはCD3ζサブユニットのシグナル伝達ドメインに融合されたモノクローナル抗体のscFvからなった1。その後、完全なT細胞エフェクター機能を誘導するには、ほとんどのCAR構築物がscFvと膜貫通ドメインの間にスペーサーを必要とすることが明らかになった2。1990年代半ばから現在まで、Fc領域又は免疫グロブリン様ドメインは異なるタンパク質(CD4、CD7、CD8α、CD28、IgD、IgG1及びIgG4を含み、CD8αヒンジが最も一般的に使用され、最もよく調べられているものである3-6)に由来したが、当分野のほとんどの研究者はそのCAR構築物の全てにスペーサー1つのみのフォーマットを使用している。使用されるCAR設計は、最も機能的なものとは限らない場合があるにもかかわらず、これは有効な結果をもたらした。異なる抗体は、その標的分子上の異なるエピトープを結合する。本発明者らは以前の研究において、標的エピトープに最適に適合するように組成及び長さを調整されたスペーサーが最大の抗腫瘍機能をもたらすことを示した7。
本発明は、遺伝子改変免疫受容体に組み込む、例えば、CAR構築物にスペーサードメインとして組み込むための、ヒトIgG3のヒンジドメインの新規バリアントを提供する。
本発明者らは、scFv及び膜貫通ドメインがヒトIgG3ヒンジドメインのバリアントによって連結された、IgG3由来スペーサーを有するCARのライブラリーを生成した。これは、天然には上部ヒンジ(12aa、ELKTPLGDTTHT、配列番号2)、中央部ヒンジ(50aa、CPRCP、配列番号59 + 15aaモチーフEPKSCDTPPPCPRCP、配列番号1の3リピート)及び下部ヒンジ(8aa、APELLGGP、配列番号60)からなり、IgG3_UMLH (上部、中央部及び下部ヒンジ)と呼ばれるこの野生型スペーサーに70aaの総スペーサーサイズをもたらす。本発明者らは、上部ヒンジ(ELKTPLGDTTHT、配列番号2)からなるバリアントを構築したことから、中央部ヒンジのn末端部分(CPRCP、配列番号59)及びEPKSCDTPPPCPRCPモチーフ(配列番号1)の0～10コピーは、IgG3_MiH0～IgG3_MiH10と称する、15aaステップ中17～167aaに及ぶスペーサードメインをもたらした。
他の研究者らは以前に、CAR設計におけるスペーサードメインとしてIgG3のCH2-CH3ヒンジバージョンを実践している12、13。本発明とは対照的に、これらの研究者は、上部ヒンジ(ELKTPLGDTTHT、配列番号2)及び中央部ヒンジの開始部分(CPRCP、配列番号59)を除去したが、代わりにIgG3 CH2及びCH3ドメインを追加で使用した2種類の長さのバリアントを使用している。CH2-CH3-ヒンジ及びCH2-CH3-ヒンジ-ヒンジと呼ばれるこれらの2つのバージョンは、どちらもはるかに長く(232aa又は247aa)、免疫原性の原因となる可能性があるFC結合モチーフを有し、比較的硬いCH2及びCH3領域を含めたため、本発明者らが本IgG3スペーサーライブラリーに含めたどのバリアントよりも柔軟性がはるかに低い12、13。
本発明者のデータは、最適なIgG3スペーサー立体配置が、標的分子内のscFvエピトープの位置に応じたスイートスポットで、調査される標的ごとに生成できることを示している。一般的原理は、腫瘍膜遠位に位置するエピトープに対しては、より短いバリアントが最も強力なT細胞エフェクター機能をもたらし、膜近位に位置するエピトープに対しては、より長いバリアントがより良好な機能をもたらすというものである。概して、本発明者らは、IgG3ベースのスペーサーが、他のフォーマットの柔軟性を上回る優れた柔軟性を受け継ぐことを示す。特に、62aaのみの比較的短いIgG3ベースのスペーサー(IgG3_MiH3)を有するCARは、228aaの極めて長いスペーサーで最良の機能性を示すIgG4バリアントより優れており、それによってCARのサイズ、及び送達されなければならない遺伝子カーゴを低減する。遺伝子カーゴの低減は、トランスフェクション又は形質導入効率の向上、遺伝的安全性の改善、及び特定の最大サイズに限定されるベクターの使用可能化等のいくつかの有利な効果を伴う。CD19特異的scFv FMC63のような強力なscFvに関して、本発明者らは、ほとんどのバリアントが大体において機能すること、及びIgG3スペーサーの最適化バージョンが、増殖、サイトカイン分泌及び細胞傷害性の誘導において同様に有効であることを示す。ほとんどの他の標的に関して、インビトロでもインビボでも最良の抗腫瘍効力をもたらす最適な立体配置が同定され得る。
本発明者は、IgG3中央部ヒンジ領域を特異的に結合することができる抗MiH抗体 #1と呼ばれる抗体を同定したが、それらのデータは、適切な結合は3つ以上のIgG3_MiHリピートを必要とすることを示唆している。この抗体及びその誘導体を使用して、本発明者らは、CAR T細胞が抗原非依存的だがCAR特異的に標的化され得ることを示すことができた。本発明者らは、利用され得る追加の機能には、CAR非依存性形質導入マーカーの代わりにCAR自体を直接介するCAR T細胞の刺激、拡大及び枯渇並びに濃縮が含まれることを明らかにしている。
本発明者らのデータは、CAR scFvの大多数が3つのIgG3_MiHリピートの下を切り取るやや短いスペーサーで最良の機能を示すことを示唆しているため、本発明者らは、scFvの第1と第2のドメインの間に5つのIgG3_MiHリピートを含む第2の多機能部位を含め、それによって一般的に使用されている(G4S)3リンカーを置き換えた。
本発明者らは、scFv VHとVLの間のこの代替リンカーがCAR構築物の標的認識を損なわず、追加の機能の利用を可能にすることを示す。本発明者らのデータは、多機能部位の標的化が、効率の良い、抗原非依存性であるがCAR特異的なCAR T細胞の刺激及び増殖、並びに特定の濃縮及び枯渇をもたらすことを証明している。
以前の試みでは、StrepTag IIがスペーサーの一部の及びタグとして使用され14、又はmycタグがスペーサードメインの一部及びタグとして使用された15。それとは対照的に、本発明者らが提供する概念は、非修飾形態の完全ヒトタンパク質に由来し、免疫原性の発生をそのような人工タンパク質に関して起こり得るよりもはるかに少なくする。更に、これらのタグに関して、スペーサー長及び柔軟性を最適化するためにモチーフのいくつかのコピーを次々に配置することが可能であることは示されていない。
要約すると、本発明者らのデータは、CAR設計において実施するためのIgG3ヒンジ由来スペーサードメインの使用を促している。CAR構築物の低い免疫原性を伴う、スペーサー標的化抗体を使用した抗原非依存性であるがCAR特異的な機能の特有の利用に関連するそれらの優れた機能性は、このアプローチを前臨床的、臨床的及び商業的利用のための魅力的な選択肢にしている。
定義及び実施形態
特に以下に定義されない限り、本発明で使用される用は、当業者に公知の一般的な意味に従って理解されるものとする。
本明細書で引用される各刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、本発明と矛盾しない程度にその全体が参照により組み込まれる。参考文献は、参照番号及び「参考文献」セクションに提供される対応する参考文献詳細によって示される。
本発明によるIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、IgG3クラスの抗体の中央部ヒンジに位置するモチーフであり、該ヒンジ領域中に2回以上発生し得る。好ましい実施形態では、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、配列番号1のアミノ酸配列と一致する。
本発明による免疫受容体は膜貫通受容体であり、免疫細胞によって発現されると免疫応答を媒介することができる。免疫受容体は、内因性免疫受容体であってもよく、又は非天然免疫受容体、すなわち遺伝子改変されていてもよい。本発明による例示的な免疫受容体は、B細胞受容体(BCR)、T細胞受容体(TCR)、及びキメラ抗原受容体(CAR)である。単量体形態の免疫受容体は、そのドメインの全てを含む単一分子からなるか、又はそのドメインの全てを含むヘテロ二量体からなるかのいずれであってもよい。免疫受容体は、その抗原に直接結合してもよく、又はアダプターを通じて間接的に結合してもよい。
本発明による免疫受容体は、第1のドメイン、リンカー、及び場合により第2のドメインを含む抗原結合ドメインを含んでもよい。第1及び第2のドメインは、特定の分子配向に限定されず、すなわち、第1のドメインも第2のドメインも、互いのN末端又はC末端に位置することができる。場合により、第2のドメインはなくてもよく、すなわち、抗原結合ドメインは、N末端又はC末端配向に関してどの配向でも第1のドメイン及びリンカーからなってもよい。抗原結合ドメインの例示的な実施形態は、一本鎖可変断片(scFv)である。この場合、第1のドメインが、ペプチドリンカーによって連結された軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインを含んでもよく、第2のドメインが、ペプチドリンカーによって連結された軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインを含んでもよい。第1のドメインも第2のドメインも、scFvのN末端又はscFvのC末端のいずれに位置してもよい。
1つの実施形態では、免疫受容体は抗原、好ましくは癌抗原、より好ましくは癌細胞表面抗原に結合することができる。好ましい実施形態では、免疫受容体は癌抗原の細胞外ドメインに結合することができる。好ましい実施形態では、免疫受容体はキメラ抗原受容体である。好ましい実施形態では、免疫受容体は遺伝子改変T細胞受容体である。
好ましい実施形態では、免疫受容体はT細胞で発現される。本発明の好ましい実施形態では、免疫受容体はT細胞で発現され、前記T細胞が抗原発現癌細胞に高特異性で特異的に結合して、増殖阻害効果、好ましくは細胞傷害効果を前記癌細胞で発揮できるようにする。
本発明による好ましい実施形態では、免疫細胞は、健康なドナー又は癌を有する患者から単離され、前記癌によって発現される抗原に結合することができる、1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフを含む免疫受容体をコードする遺伝子導入ベクターを用いて形質導入され、前記癌を処置するために患者に投与される。好ましい実施形態では、免疫細胞はB細胞、NK細胞、マクロファージ又はT細胞である。より好ましい実施形態では、T細胞はCD8+ T細胞又はCD4+ T細胞である。
抗体という用語は、本明細書で使用される場合、目的とする抗原に特異的に結合することができる任意の機能的抗体を指す。特に限定することなく、抗体という用語は、ニワトリ等のトリ並びにマウス、ヤギ、ウサギ、非ヒト霊長類及びヒト等の哺乳動物を含む、任意の適当な供給源種由来の抗体を包含する。好ましくは、抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、ヒト配列及び、目的とする抗原(例えば、ヒトFLT3)に対する結合特異性を付与する非ヒト配列のごく一部を含有する抗体である。抗体は、好ましくは、当技術分野で周知の方法によって調製することができるモノクローナル抗体である。抗体という用語は、IgG-1、-2、-3、若しくは-4、IgE、IgA、IgM、又はIgDアイソタイプ抗体を包含する。抗体という用語は、単量体抗体(IgD、IgE、IgG等)又はオリゴマー抗体(IgA又はIgM等)を包含する。抗体という用語は、単離抗体、及び遺伝子改変抗体、例えばキメラ抗体又は二重特異性抗体等の修飾抗体も、特に限定することなく包含する。
抗体断片又は抗体の断片は、本明細書で使用される場合、抗原(例えば、IgG3中央部ヒンジリピートドメイン)に特異的に結合する抗体の能力を保持する抗体の一部を指す。この能力は、例えば、抗原への特異的結合をめぐって抗体と競合する抗原結合部分の能力を、当技術分野で公知の方法によって決定することによって決定することができる。特に限定することなく、抗体断片は、組換えDNA法及び抗体の化学的又は酵素的断片化による調製を含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって製造することができる。抗体断片は、Fab断片、F(ab')断片、F(ab')2断片、一本鎖抗体(scFv)、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、又は抗原に特異的に結合する抗体の能力を保持する抗体の任意の他の部分であってもよい。
本明細書に記載される「抗体」(例えば、モノクローナル抗体)又は「その断片」は、誘導体化されていても又は異なる分子に連結されていてもよい。例えば、抗体に連結され得る分子は、他のタンパク質(例えば他の抗体)、分子標識(例えば、蛍光、発光、有色又は放射性分子)、医薬品及び/又は毒物である。抗体又は抗原結合部分は、直接(例えば、2つのタンパク質間の融合の形態で)、又はリンカー分子(例えば、当技術分野で公知の任意の適切なタイプの化学的リンカー)を介して連結されてもよい。
「二重特異性抗体」は、互いに異なる2つの抗原に特異的に結合することができる、本明細書に記載される抗体又はその断片である。二重特異性抗体の例示的な実施形態は、癌細胞表面抗原(例えば、CD19又はCD20)及び免疫細胞表面抗原(例えば、CD3)に特異的に結合することができる抗体である。二重特異性抗体は、好ましくは、免疫細胞を癌細胞等の標的細胞に動員することができ、それによって抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)を媒介する。二重特異性抗体は、Fc受容体と相互作用する部分を含んでもよい。
本発明による「癌の処置(treatment of cancer)」又は「癌の処置(treating cancer)」等の用語は、治療的処置を指す。治療的処置が奏効し得るか否かの評価は、例えば、処置された患者における癌増殖を処置が阻害するか否かを評価することによってなされ得る。好ましくは、阻害は、当技術分野で公知の適当な統計的検定によって評価される場合、統計的に有意である。癌増殖の阻害は、本発明により処置された患者群における癌増殖を非処置患者対照群と比較することによって、又は当技術分野の標準的な癌処置プラス本発明による処置を受ける患者群を、当技術分野の標準的な癌処置しか受けない患者対照群と比較することによって評価され得る。癌増殖の阻害を評価するためのそのような試験は、臨床試験用に受け入れられている基準、例えば、十分な統計的検出力を有する二重盲検、ランダム化試験に従って設計される。用語「癌の処置(treating cancer)」は、癌増殖が部分的に阻害される(すなわち、患者における癌増殖が患者対照群と比べて遅れる)癌増殖の阻害、癌増殖が完全に阻害される(すなわち、患者における癌増殖が止まる)阻害、及び癌増殖が逆転される(すなわち、癌が縮小する)阻害を含む。治療的処置が奏効するか否かの評価は、癌進行の公知の臨床指標に基づきなされ得る。
本発明による癌の処置は、追加の又は副次的治療利益も患者に生じることを排除しない。例えば、追加の又は副次的利益は、癌の処置の前、同時、又は後で実施される移植された造血幹細胞の生着の増強であってもよい。しかし、保護が求められる主要な処置は、癌自体を処置するためであり、いずれの副次的又は追加の利益も癌増殖の処置の任意選択の追加の利点を反映するにすぎないことが理解される。
本発明による癌の処置は、第1選択治療、第2選択治療、第3選択治療、又は第4選択治療であってもよい。処置はまた、第4選択治療を超える治療であってもよい。これらの用語の意味は当技術分野で公知であり、米国立癌研究所によって一般的に使用される用語法に従っている。
感染症、自己免疫疾患及び変性疾患の処置は、それぞれ、第1選択治療、第2選択治療、第3選択治療、又は第4選択治療であってもよい。処置はまた、第4選択治療を超える治療であってもよい。これらの用語の意味は当技術分野で公知である。
用語「結合することができる」は、本明細書で使用される場合、結合される分子(例えば、IgG3中央部ヒンジリピートドメイン)と複合体を形成する能力を指す。結合は典型的には、イオン結合、水素結合及びファンデルワールス力等の分子間力によって非共有的に生じ、典型的には可逆的である。結合能を決定するための様々な方法及びアッセイは当技術分野で公知である。結合は通常、高親和性での結合であり、KD値で測定される場合の親和性は、好ましくは1μM未満、より好ましくは100nM未満、更により好ましくは10nM未満、更により好ましくは1nM未満、更により好ましくは100pM未満、更により好ましくは10pM未満、更により好ましくは1pM未満である。
本明細書で使用される場合、「含む(comprising)」又は「含む(comprises)」等の用語が出現するごとに、場合により「からなる(consisting of)」又は「からなる(consists of)」で置き換えられてもよい。
本明細書で使用される場合、「1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む」「リンカー」、又は「1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む」「スペーサードメイン」等の用語は、前記1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフが、本発明の免疫受容体の前記1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフに加えて存在するリンカー又はスペーサードメインを指すことができる。或いは、「1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む」「リンカー」、又は「1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む」「スペーサードメイン」等の用語は、前記1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフが、本発明の免疫受容体の前記1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフと同一であるリンカー又はスペーサードメインを指すことができる。
免疫受容体又はCAR又は二重特異性抗体と関連する用語「免疫原性の低減」は、当技術分野における一般的な意味に従って理解されるべきである。本発明の全ての他の実施形態による好ましい実施形態では、免疫受容体又はCARと関連する「免疫原性の低減」は、前記免疫受容体又はCARがHLA/A2陽性腫瘍細胞株で発現され、その後、細胞株をHLA/A2陽性ドナーのPBMCと共インキュベートし、その後、免疫受容体又はCARがPBMCによるサイトカイン産生の低減をもたらすかどうかの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)ベースの決定を行うアッセイにおける第2の免疫受容体又はCARとの比較において、免疫受容体又はCARは免疫原性が低減していることを意味する。本発明の全ての他の実施形態による好ましい実施形態では、二重特異性抗体と関連する「免疫原性の低減」は、二重特異性抗体が、第2の二重特異性抗体と比較してヒト患者における抗薬物抗体レベルの低減をもたらすことを意味する。抗薬物抗体レベルは、ELISAベースの方法を含む当技術分野で公知の方法によって決定することができる。
任意の適切な希釈剤を含む薬学的に許容される担体は、当技術分野で公知のように本明細書で使用され得る。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、哺乳動物、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府若しくは州政府の規制当局によって承認されていること、又は米国薬局方、欧州薬局方、若しくは他の一般的に認められている薬局方に収載されていることを意味する。薬学的に許容される担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、滅菌等張性水性緩衝液、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。製剤は、投与様式に合うように適切に適合されることが理解されるであろう。
本発明による組成物及び製剤は、医薬組成物及び製剤の調製のための公知の基準に従って調製される。例えば、組成物及び製剤は、例えば担体、賦形剤又は安定化剤等の薬学的に許容される成分を使用して、適切に保存及び投与できる方法で調製される。そのような薬学的に許容される成分は、医薬組成物又は製剤を患者に投与するときに使用される量において毒性ではない。医薬組成物又は製剤に添加される薬学的に許容される成分は、組成物又は製剤中に存在する阻害剤及び標的化剤の化学的性質(標的化剤が、例えば、抗体若しくはその断片であるか又はキメラ抗原受容体を発現している細胞であるかに依存)、医薬組成物の特定の意図された用途、及び投与経路に依存し得る。
本発明による好ましい実施形態では、組成物又は製剤はヒトへの投与に適し、好ましくは製剤は無菌及び/又は非発熱性である。
好ましい実施形態では、本発明は、免疫受容体がIgG3 CH2及び/又はCH3ドメインを含まない、1つ又は複数のIgG3ヒンジリピートドメインモチーフを含む免疫受容体を提供する。
代替の実施形態では、免疫受容体はIgG3 CH2ドメインを含む。さらなる代替の実施形態では、免疫受容体はIgG3 CH3ドメインを含む。さらなる代替の実施形態では、免疫受容体はIgG3 CH2及びCH3ドメインを含む。さらなる代替の実施形態では、免疫受容体はIgG3 CH1ドメインを含む。さらなる代替の実施形態では、免疫受容体はIgG3 CH1、CH2及びCH3ドメインを含む。
用語「IgG3 CH2ドメイン」及び「IgG3 CH3ドメイン」は、当技術分野で公知のそれらの意味に従って理解されるべきである。本発明の全ての他の実施形態による好ましい実施形態では、IgG3 CH2ドメインは、配列番号172の配列からなるヒトIgG3のCH2ドメインであり、IgG3 CH3ドメインは、配列番号173の配列からなるヒトIgG3のCH3ドメインである。
好ましい実施形態では、本発明による免疫受容体は、細胞外抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、及び膜貫通ドメインを含み、スペーサードメインは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置する。好ましい実施形態では、スペーサードメインは、1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。好ましい実施形態では、免疫受容体の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは共に、配列番号109、110、111、112、113、114、115及び174からなる群から選択される配列からなる。好ましい実施形態では、免疫受容体はキメラ抗原受容体であり、抗原結合ドメインは、1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフ、好ましくは2つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフ、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む前記スペーサーによってキメラ抗原受容体に連結された一本鎖可変断片である。この実施形態では、抗原結合タンパク質(例えば、抗体又はその断片)は、免疫受容体に含まれる1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフに特異的に結合することによって免疫受容体に結合することができる。前記IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフの認識による前記免疫受容体への前記抗原結合タンパク質の結合は、免疫受容体のエフェクター機能、例えば、前記免疫受容体を発現する細胞の特性、例えば、その増殖又は他の免疫細胞との相互作用を調節するその下流シグナル伝達に影響を与え得る。この実施形態では、前記免疫受容体に含まれる前記スペーサードメインに含まれる前記IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフのリピートの数は、標的細胞の表面に存在する特定の標的抗原(例えば、CD19、CD20、ROR1、ROR2、SLAMF7、FLT3、Siglec-6、αvβ3インテグリン、又はBCMA)に選択的及び効率的に結合する前記免疫受容体の能力に影響を与え得る。好ましくは、標的細胞は癌細胞であり、標的抗原は癌抗原、すなわち、非疾患細胞よりも癌細胞で高度に発現される細胞表面マーカーである。例示的な実施形態では、本発明の免疫受容体は、膜貫通ドメインとして配列番号65のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体である。この実施形態では
、キメラ抗原受容体は、配列番号66に記載されるアミノ酸配列を有する4-1BBドメイン、及び配列番号67に記載されるアミノ酸配列を有するCD3ゼータドメインを更に含んでもよい。例示的な実施形態では、免疫受容体は、配列番号68に記載されるアミノ酸配列を有するCD19 キメラ抗原受容体である。
別の好ましい実施形態では、免疫受容体はキメラ抗原受容体であり、抗原結合ドメインは、第1のドメイン、リンカー、及び第2のドメインを含む一本鎖可変断片であり、リンカーは、1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフ、好ましくは2つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフ、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。この実施形態では、抗原結合タンパク質(例えば、抗体又はその断片)は、免疫受容体に含まれる1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフに特異的に結合することによって免疫受容体に結合することができる。この実施形態では、抗原結合タンパク質(例えば、抗体又はその断片)は、免疫受容体に含まれる1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフに特異的に結合することによって免疫受容体に結合することができる。前記IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフの認識による前記免疫受容体への前記抗原結合タンパク質の結合は、免疫受容体のエフェクター機能、例えば、前記免疫受容体を発現する細胞の特性、例えば、その増殖又は他の免疫細胞との相互作用を調節するその下流シグナル伝達に影響を与え得る。
好ましい実施形態では、前記免疫受容体中の1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフの存在は、前記免疫受容体を発現している細胞に対する非特異的又はさもなければ望まれない免疫原性反応を引き起こさない。
本発明による抗原結合ドメインは一般的に、所与の標的抗原に特異的に結合することができる。好ましい実施形態では、抗原結合ドメインは、細胞表面抗原、好ましくは癌抗原、すなわち、非疾患細胞よりも癌細胞で高度に発現される細胞表面マーカーに特異的に結合することができる。抗原結合ドメインは、本発明による免疫受容体に組み込まれる場合、抗原結合ドメインが特異的に結合することができる標的抗原を、前記免疫受容体が特異的に認識及び結合できるようにする。この実施形態では、前記抗原結合ドメインを含む前記免疫受容体が細胞によって発現されると、前記細胞は、前記標的抗原を発現する標的細胞を特異的に認識する能力を獲得する。好ましい実施形態では、免疫受容体はキメラ抗原受容体であり、抗原結合ドメインは、前記キメラ抗原受容体の一部である一本鎖可変断片である。
一実施形態では、本発明による免疫受容体は、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置するスペーサードメインを含むキメラ抗原受容体であり、スペーサードメインは、1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含み、細胞外抗原結合ドメインは、CD19、CD20、ROR1、ROR2、SLAMF7、FLT3、Siglec-6、αvβ3インテグリン、又はBCMAに特異的なscFvであり、scFvは、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まない。
一実施形態では、本発明による免疫受容体は、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置するスペーサードメインを含むキメラ抗原受容体であり、スペーサードメインは、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含み、細胞外抗原結合ドメインは、CD19、CD20、ROR1、ROR2、SLAMF7、FLT3、Siglec-6、αvβ3インテグリン、又はBCMAに特異的なscFvであり、scFvは、第1のドメイン、リンカー、及び第2のドメインを含み、前記リンカーは、1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、CD19に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、配列番号27に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号28に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。1つの実施形態では、重鎖可変ドメインは配列番号27のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号28のアミノ酸配列を有する。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。1つの実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する。別の実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体に含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカー内に位置し、細胞外抗原結合ドメインはscFvである。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、CD20に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、配列番号30に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号29に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。1つの実施形態では、重鎖可変ドメインは配列番号30のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号29のアミノ酸配列を有する。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。1つの実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する。別の実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体に含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカー内に位置し、細胞外抗原結合ドメインはscFvである。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、ROR1に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、それぞれ、配列番号31、33、35、又は37に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号32、34、36、又は38に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。1つの実施形態では、それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号31、33、35、又は37のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号32、34、36、又は38のアミノ酸配列を有する。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。1つの実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する。別の実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体に含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカー内に位置し、細胞外抗原結合ドメインはscFvである。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、ROR2に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、配列番号39に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号40に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。1つの実施形態では、重鎖可変ドメインは配列番号39のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号40のアミノ酸配列を有する。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。1つの実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する。別の実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体に含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカー内に位置し、細胞外抗原結合ドメインはscFvである。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、SLAMF7に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、それぞれ、配列番号41又は43に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号42又は44に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。1つの実施形態では、それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号41又は43のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号42又は44のアミノ酸配列を有する。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。1つの実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する。別の実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体に含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカー内に位置し、細胞外抗原結合ドメインはscFvである。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、FLT3に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、それぞれ、配列番号45又は47に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号46又は48に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。1つの実施形態では、それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号45又は47のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号46又は48のアミノ酸配列を有する。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。1つの実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する。別の実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体に含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカー内に位置し、細胞外抗原結合ドメインはscFvである。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、Siglec-6に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、配列番号49に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号50に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。1つの実施形態では、重鎖可変ドメインは配列番号49のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号50のアミノ酸配列を有する。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。1つの実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する。別の実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体に含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカー内に位置し、細胞外抗原結合ドメインはscFvである。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、αvβ3インテグリンに特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、それぞれ、配列番号51又は53に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号52又は54に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。1つの実施形態では、それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号51又は53のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号52又は54のアミノ酸配列を有する。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。1つの実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する。別の実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体に含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカー内に位置し、細胞外抗原結合ドメインはscFvである。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、BCMAに特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、それぞれ、配列番号55又は57に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号56又は58に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。1つの実施形態では、それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号55又は57のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号56又は58のアミノ酸配列を有する。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。1つの実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する。別の実施形態では、前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは、前記キメラ抗原受容体に含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカー内に位置し、細胞外抗原結合ドメインはscFvである。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、CD19に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、配列番号3又は71に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、場合により100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体に含まれる前記scFvに含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカーは、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まない。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、CD20に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、配列番号4又は72に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、場合により100%の配列同一性を有するscFvを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体に含まれる前記scFvに含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカーは、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まない。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、ROR1に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、配列番号5、6、7、8、73、74、75、76、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、場合により100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体に含まれる前記scFvに含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカーは、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まない。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、ROR2に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、配列番号9、77、101、102、103、104、105、106、107又は108に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、場合により100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体に含まれる前記scFvに含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカーは、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まない。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、SLAMF7に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、配列番号10、11、78又は79に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、場合により100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体に含まれる前記scFvに含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカーは、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まない。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、FLT3に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、配列番号12、13、80又は81に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、場合により100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体に含まれる前記scFvに含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカーは、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まない。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、Siglec-6に特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、配列番号14又は82に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、場合により100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体に含まれる前記scFvに含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカーは、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まない。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、αvβ3インテグリンに特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、配列番号15、16、83又は84に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、場合により100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体に含まれる前記scFvに含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカーは、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まない。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
1つの実施形態では、本発明による免疫受容体は、BCMAに特異的なキメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体は、配列番号17、18、85又は86に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、場合により100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、前記キメラ抗原受容体のスペーサードメイン内に位置する1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。この実施形態では、前記キメラ抗原受容体に含まれる前記scFvに含まれる細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカーは、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まない。好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体(前記1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフは含まないが、さもなければ同様である、すなわち、同じ細胞内、細胞外、及び膜貫通ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体に含まれるscFvに含まれるスペーサードメイン及び/又はリンカーにおいてのみ本発明の前記キメラ抗原受容体と異なる)と比べて、非特異的又は望まれない免疫反応を引き起こさない。
別の態様では、本発明は、
細胞外抗原結合ドメインと、
スペーサードメインと、
膜貫通ドメインと
細胞内シグナル伝達ドメインと
を含み、スペーサードメインが、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置し、スペーサードメインが、[A-Bn]
(式中、
Aは配列番号2のアミノ酸配列であり、
Bは配列番号1のアミノ酸配列を有し、
nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及び15からなる群から選択され、好ましくは1～15の間の整数、より好ましくは1～10の間の整数、更により好ましくは1～5の間の整数、最も好ましくは3～5の間の整数である)
のアミノ酸配列と100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体も提供する。
この態様の好ましい実施形態では、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは共に、配列番号109、110、111、112、113、114、115及び174からなる群から選択される配列からなる。
本発明の免疫受容体又はCARについて上記に定義した本発明の全ての実施形態は、本発明のこの態様のキメラ抗原受容体にも適用される。
好ましい実施形態では、本発明のこの態様を含む本発明のキメラ抗原受容体は、CD19に特異的であってもよく(前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号3若しくは71に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む)、又はキメラ抗原受容体はCD20に特異的であってもよく(前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号4又は72に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む)、又はキメラ抗原受容体はROR1に特異的であってもよく(前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号5、6、7、8、73、74、75、76、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む)、又はキメラ抗原受容体はROR2に特異的であってもよく(前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号9、77、101、102、103、104、105、106、107又は108に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む)、又はキメラ抗原受容体はSLAMF7に特異的であってもよく(前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号10、11、78又は79に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む)、又はキメラ抗原受容体はFLT3に特異的であってもよく(前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号12、13、80又は81に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む)、又はキメラ抗原受容体はSiglec-6に特異的であってもよく(前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号14又は82に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む)、又はキメラ抗原受容体はαvβ3インテグリンに特異的であってもよく(前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号15、16、83又は84に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む)、又はキメラ抗原受容体はBCMAに特異的であってもよい(前記細胞外抗原結合ドメインは、配列番号17、18、85又は86に対して100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するscFvを含む)。
本発明の極めて好ましい実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体は、配列番号116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、及び171からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
1つの実施形態では、1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む本発明による免疫受容体は、治療において使用される。一実施形態では、本発明は、1つの活性成分として、本発明による免疫受容体を発現している細胞、例えばT細胞等の免疫細胞を含む医薬を提供する。
好ましい実施形態では、本発明による1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含むCD19特異的キメラ抗原受容体は、癌の処置において使用され、該方法では、前記CD19特異的キメラ抗原受容体を発現している細胞が、それを必要とする患者に投与され、それによって前記癌を治療する。1つの実施形態では、細胞は自家細胞であり、すなわち治療される同じ患者から得られる。1つの実施形態では、細胞は同種細胞である(細胞は治療される患者以外の供給源から得られるため)。好ましい実施形態では、CD19特異的キメラ抗原受容体は、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及びびまん性大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用される。
好ましい実施形態では、本発明による1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含むCD20特異的キメラ抗原受容体は、癌の処置において使用され、該方法では、前記CD20特異的キメラ抗原受容体を発現している細胞が、それを必要とする患者に投与され、それによって前記癌を治療する。1つの実施形態では、細胞は自家細胞であり、すなわち治療される同じ患者から得られる。1つの実施形態では、細胞は同種細胞である(細胞は治療される患者以外の供給源から得られるため)。好ましい実施形態では、CD20特異的キメラ抗原受容体は、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及びびまん性大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用される。
好ましい実施形態では、本発明による1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含むROR1特異的キメラ抗原受容体は、癌の処置において使用され、該方法では、前記ROR1特異的キメラ抗原受容体を発現している細胞が、それを必要とする患者に投与され、それによって前記癌を治療する。1つの実施形態では、細胞は自家細胞であり、すなわち治療される同じ患者から得られる。1つの実施形態では、細胞は同種細胞である(細胞は治療される患者以外の供給源から得られるため)。好ましい実施形態では、ROR1特異的キメラ抗原受容体は、乳癌、肺癌、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病及びびまん性大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用される。
好ましい実施形態では、本発明による1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含むROR2特異的キメラ抗原受容体は、癌の処置において使用され、該方法では、前記ROR2特異的キメラ抗原受容体を発現している細胞が、それを必要とする患者に投与され、それによって前記癌を治療する。1つの実施形態では、細胞は自家細胞であり、すなわち治療される同じ患者から得られる。1つの実施形態では、細胞は同種細胞である(細胞は治療される患者以外の供給源から得られるため)。好ましい実施形態では、ROR2特異的キメラ抗原受容体は、乳癌、結腸癌、前立腺癌、骨肉腫及び多発性骨髄腫の処置において使用される。
好ましい実施形態では、本発明による1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含むSLAMF7特異的キメラ抗原受容体は、癌の処置において使用され、該方法では、前記SLAMF7特異的キメラ抗原受容体を発現している細胞が、それを必要とする患者に投与され、それによって前記癌を治療する。1つの実施形態では、細胞は自家細胞であり、すなわち治療される同じ患者から得られる。1つの実施形態では、細胞は同種細胞である(細胞は治療される患者以外の供給源から得られるため)。好ましい実施形態では、SLAMF7特異的キメラ抗原受容体は、多発性骨髄腫、T細胞及びB細胞白血病、又はリンパ腫の処置において使用される。
好ましい実施形態では、本発明による1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含むFLT3特異的キメラ抗原受容体は、癌の処置において使用され、該方法では、前記FLT3特異的キメラ抗原受容体を発現している細胞が、それを必要とする患者に投与され、それによって前記癌を治療する。1つの実施形態では、細胞は自家細胞であり、すなわち、治療される同じ患者から得られる。1つの実施形態では、細胞は同種細胞である(細胞は治療される患者以外の供給源から得られるため)。好ましい実施形態では、FLT3特異的キメラ抗原受容体は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病及び骨髄異形成症候群の処置において使用される。
好ましい実施形態では、本発明による1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含むSiglec-6特異的キメラ抗原受容体は、癌の処置において使用され、該方法では、前記Siglec-6特異的キメラ抗原受容体を発現している細胞が、それを必要とする患者に投与され、それによって前記癌を治療する。1つの実施形態では、細胞は自家細胞であり、すなわち治療される同じ患者から得られる。1つの実施形態では、細胞は同種細胞である(細胞は治療される患者以外の供給源から得られるため)。好ましい実施形態では、Siglec-6特異的キメラ抗原受容体は、急性骨髄性白血病の処置において使用される。
好ましい実施形態では、本発明による1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含むαvβ3インテグリン特異的キメラ抗原受容体は、癌の処置において使用され、該方法では、前記αvβ3インテグリン特異的キメラ抗原受容体を発現している細胞が、それを必要とする患者に投与され、それによって前記癌を治療する。1つの実施形態では、細胞は自家細胞であり、すなわち治療される同じ患者から得られる。1つの実施形態では、細胞は同種細胞である(細胞は治療される患者以外の供給源から得られるため)。好ましい実施形態では、αvβ3インテグリン特異的キメラ抗原受容体は、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、メラノーマ及び神経膠芽腫の処置において使用される。
好ましい実施形態では、本発明による1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含むBCMA特異的キメラ抗原受容体は、癌の処置において使用され、該方法では、前記BCMA特異的キメラ抗原受容体を発現している細胞が、それを必要とする患者に投与され、それによって前記癌を治療する。1つの実施形態では、細胞は自家細胞であり、すなわち治療される同じ患者から得られる。1つの実施形態では、細胞は同種細胞である(細胞は治療される患者以外の供給源から得られるため)。好ましい実施形態では、BCR特異的キメラ抗原受容体は、多発性骨髄腫及びアミロイドーシスの処置において使用される。
1つの実施形態では、免疫受容体はT細胞受容体(TCR)、好ましくは組換えTCR; B細胞受容体(BCR)、好ましくは組換えBCR;又はキメラ抗原受容体(CAR)である。1つの実施形態では、免疫受容体は、組換え、すなわち非天然の遺伝子改変T細胞受容体(TCR)である。1つの実施形態では、免疫受容体は、組換え、すなわち非天然の遺伝子改変B細胞受容体(BCR)である。好ましい実施形態では、免疫受容体は、キメラ抗原受容体(CAR)である。
好ましい実施形態では、本発明によるIgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、ヒトIgG3中央部ヒンジ由来である。好ましい実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、配列番号1の少なくとも10、11、12、13、又は14個の隣接アミノ酸を含む。1つの実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、配列番号1の少なくとも10個の隣接アミノ酸を含む。1つの実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、配列番号1の少なくとも11個の隣接アミノ酸を含む。1つの実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、配列番号1の少なくとも12個の隣接アミノ酸を含む。1つの実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、配列番号1の少なくとも13個の隣接アミノ酸を含む。1つの実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、配列番号1の少なくとも14個の隣接アミノ酸を含む。1つの実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、配列番号1の少なくとも15個の隣接アミノ酸を含む。好ましい実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、5個、4個、3個、2個、又は1個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列からなる。1つの実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、5個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列からなる。1つの実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、4個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列からなる。1つの実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、3個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列からなる。1つの実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、2個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列からなる。1つの実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、1個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列からなる。好ましい実施形態では、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフは、配列番号1のアミノ酸配列を有する。
好ましい実施形態では、本発明による免疫受容体は、IgG3ヒンジドメインの下部ヒンジドメインの配列の全部又は一部を含まず、好ましくは前記IgG3ヒンジドメインはヒトである。
一実施形態では、本発明による免疫受容体は、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10回含む。一実施形態では、本発明による免疫受容体は、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを1回含む。一実施形態では、本発明による免疫受容体は、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを2回含む。一実施形態では、本発明による免疫受容体は、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを3回含む。一実施形態では、本発明による免疫受容体は、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを4回含む。一実施形態では、本発明による免疫受容体は、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを5回含む。好ましい実施形態では、本発明による免疫受容体は、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを少なくとも3つ回含む。好ましい実施形態では、本発明による免疫受容体は、IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを5回以下含む。
好ましい実施形態では、本発明による免疫受容体は、[A-Bn](式中、Aは配列番号2のアミノ酸配列であり; Bは前記IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフであり、前記モチーフは配列番号1のアミノ酸配列を有し; nは1～15の間の整数、好ましくは1～10の間、より好ましくは1～5の間、最も好ましくは3～5の間である)のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、又は場合により100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。1つの実施形態では、nは1である。1つの実施形態では、nは2である。1つの実施形態では、nは3である。1つの実施形態では、nは4である。1つの実施形態では、nは5である。好ましい実施形態では、nは3～5の間である。好ましい実施形態では、本発明による免疫受容体は、互いに隣接する少なくとも2つのIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む。好ましい実施形態では、本発明による免疫受容体は、 互いに隣接する少なくとも3つのIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーを含む。
本発明は、本発明による免疫受容体をコードする核酸を提供する。本発明の核酸、及び核酸がどのように発現され得るかに特に制限はない。例えば、本発明による免疫受容体をコードする核酸は、安定又は一過性に発現されてもよい。好ましい実施形態では、核酸はウイルスベクターである。1つの実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。好ましい実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、第1、第2、第3、又は第4世代レンチウイルスベクターであってもよい。好ましくは、レンチウイルスベクターは、第3又は第4世代レンチウイルスベクターである。例示的な実施形態では、免疫受容体をコードするレンチウイルスベクターは、配列番号61及び配列番号62の核酸配列を含み、配列番号61の核酸配列は免疫受容体をコードする配列の5'に位置し、配列番号62の核酸配列は免疫受容体をコードする配列に対して3'に位置し、ベクターは環状化される。1つの実施形態では、ウイルスベクターはエピソームベクターである。1つの実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。1つの実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。1つの実施形態では、核酸は、逆方向反復等の転移による宿主細胞のゲノムへの安定な組み込みを可能にする核酸配列を含む。例示的な実施形態では、核酸は、配列番号63及び配列番号64の核酸配列を含む免疫受容体をコードするベクターであり、配列番号63の核酸配列は免疫受容体をコードする配列の5'に位置し、配列番号64の核酸配列は免疫受容体をコードする配列に対して3'に位置し、ベクターは環状化される。
好ましい実施形態では、核酸は、CRISPR/Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はTALEN等の部位特異的ゲノム改変法により宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。一実施形態では、核酸はDNAである。1つの実施形態では、核酸はRNAである。1つの実施形態では、核酸は非天然ヌクレオチドを含む。1つの実施形態では、核酸は非天然ヌクレオチドを含まない。
本発明は、本発明による免疫受容体をコードする核酸を含む細胞を提供する。好ましい実施形態では、細胞は免疫受容体を発現する。1つの実施形態では、細胞は、免疫受容体を発現するように誘導されてもよい。好ましい実施形態では、細胞は免疫細胞である。より好ましい実施形態では、細胞はT細胞である。好ましい実施形態では、T細胞はCD4+ T細胞である。好ましい実施形態では、T細胞はCD8+ T細胞である。好ましい実施形態では、T細胞は細胞傷害性T細胞(CTL)である。1つの実施形態では、細胞は、そのゲノムに安定に組み込まれた本発明による免疫受容体をコードする核酸の全部又は一部を含む。好ましい実施形態では、細胞は、そのゲノムに安定に組み込まれた本発明の免疫受容体をコードする配列全体を含む。1つの実施形態では、細胞は、エピソームとして本発明による免疫受容体をコードする核酸の全部又は一部を含む。好ましい実施形態では、細胞はエピソームとして本発明の免疫受容体を安定にコードする配列全体を含む。
好ましい実施形態では、本発明による免疫受容体を含む核酸及び細胞は、癌又は自己免疫疾患、感染症又は変性疾患の処置において使用するために提供される。
好ましい実施形態では、癌は血液癌である。好ましい実施形態では、血液癌は白血病又はリンパ腫、好ましくは急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、又はびまん性大細胞型B細胞リンパ腫である。1つの実施形態では、癌は固形癌である。一実施形態では、固形癌は乳癌、結腸癌、肺癌、又は前立腺癌である。
本発明は、IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つのリピートからなる配列からなるエピトープに特異的に結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、本発明による抗原結合タンパク質は、2つの隣接しているIgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフの接合部からなるエピトープに特異的に結合することができる。好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は抗体又はその断片である。
好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域に含まれる相補性決定領域(CDR)として、配列番号20のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号21のアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号22のアミノ酸配列を有するCDR3、並びに軽鎖可変領域に含まれる相補性決定領域(CDR)として、配列番号24のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号25のアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号26のアミノ酸配列を有するCDR3を含む抗体又はその断片である。
好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は抗体又はその断片であり、1つ又は複数、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフに特異的に結合することができる、配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、場合により100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、場合により100%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。好ましい実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号20、21、22、24、25、及び26に対して100%の配列同一性をそのCDRにおいて維持する。
1つの実施形態では、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つのIgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフからなるエピトープに結合することができる抗原結合タンパク質は、配列番号19及び/又は配列番号23を含まない抗原結合タンパク質である。
本発明による抗原結合タンパク質は、本発明の免疫受容体を発現している細胞の精製、検出、枯渇、刺激、拡大、又は濃縮に使用することができる。
本発明は、本発明による免疫受容体を発現している細胞に本発明の抗原結合タンパク質を結合する工程を含む方法を提供する。
1つの実施形態では、本発明の方法は、本発明の免疫受容体を発現している細胞の精製に使用される。この実施形態では前記細胞は、細胞の表面で発現される免疫受容体に一次抗体を結合できるようにする条件下で、本発明による抗原結合タンパク質である一次抗体とインキュベートされ、その後前記細胞は、非抗体結合細胞からの抗体結合細胞の分離によって精製される。1つの実施形態では、インキュベーションは、抗体に結合することができる実体と前記細胞をインキュベートする工程を更に含む。好ましい実施形態では、実体は、蛍光マーカー;又はビーズ、好ましくは磁気ビーズで好ましくは標識された二次抗体である。1つの実施形態では、一次抗体は好ましくはタグ又は蛍光色素で標識される。好ましい実施形態では、分離はMACS若しくはFACSの手段によって実施される。
1つの実施形態では、本発明の方法は、本発明の免疫受容体を発現している細胞の枯渇に使用される。この実施形態では、前記細胞は、細胞傷害性分子に結合された本発明による抗原結合タンパク質とインキュベートされる。1つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、別の細胞、好ましくはT細胞によって発現されるキメラ抗原受容体に含まれる。
1つの実施形態では、本発明の方法は、本発明の免疫受容体を発現している細胞の刺激に使用される。この実施形態では、前記細胞は、本発明による抗原結合タンパク質とインキュベートされ、それによって前記細胞を刺激する。好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は固相に結合される。好ましい実施形態では、固相は組織培養表面である。好ましい実施形態では、固相はビーズ、好ましくは磁気ビーズである。1つの実施形態では、抗原結合タンパク質は別の細胞の表面で発現される。
1つの実施形態では、本発明の方法、本発明の免疫受容体を発現している細胞の拡大に使用される。この実施形態では、前記細胞は、本発明による抗原結合タンパク質とインキュベートされ、それによって増殖を増大させ、故に前記細胞を拡大させる。好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は固相に結合される。好ましい実施形態では、固相は組織培養表面である。好ましい実施形態では、固相はビーズ、好ましくは磁気ビーズである。1つの実施形態では、抗原結合タンパク質は別の細胞の表面で発現される。
本発明は、本発明による免疫受容体を発現している細胞の濃縮方法であって、本発明の刺激方法を用いて該細胞を刺激又は拡大する工程と、その後、本発明の精製方法を用いて前記細胞を精製する工程とを含む前記方法を提供する。
1つの実施形態では、本発明の方法又は使用は、インビトロでの使用又は方法である。1つの実施形態では、本発明の方法又は使用は、インビボでの使用又は方法である。1つの実施形態では、本発明の方法又は使用は、手術若しくは治療によるヒト若しくは動物の身体を処置するための方法、又はヒト若しくは動物の身体で行われる診断法を含まない。
本発明は、本発明の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、本発明の核酸を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、本発明の免疫受容体を発現している細胞を含む医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体、及び/又は賦形剤を更に含んでもよい。医薬組成物は、追加の活性成分を更に含んでもよい。好ましい実施形態では、医薬組成物は治療に有用である。
本発明は、本発明の免疫受容体を発現している細胞の枯渇治療法において使用するための、抗原結合タンパク質又は本発明による抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。該方法では、場合により医薬組成物に含まれる、細胞傷害性分子に結合された抗原結合タンパク質、又はキメラ抗原受容体の一部として抗原結合タンパク質を発現している細胞が、本発明の免疫受容体を発現している細胞を枯渇させるために、前記細胞を投与された患者に投与される。
本発明は、本発明の免疫受容体と、本発明の抗原結合タンパク質とを含むキットを提供する。本発明は、本発明の免疫受容体及び本発明の抗原結合タンパク質をコードする核酸を含む細胞を含むキットを提供する。
配列
配列番号1 (15aa MiHリピート配列)
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
配列番号2 (上部ヒンジ)
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
配列番号3 (scFv CD19_FMC63 VH_リンカー_VL)
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
配列番号27 (scFv CD19_FMC63 VH)
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
配列番号28 (scFv CD19_FMC63 VL)
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
配列番号4 (scFv CD20_Leu16 VL_リンカー_VH)
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
配列番号29 (scFv CD20_Leu16 VL)
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号30 (scFv CD20_Leu16 VH)
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
配列番号5 (scFv ROR1_2A2 VH_4GS3_VL)
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr Glu Met His Trp Val Ile Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Ile Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ala Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号31 (scFv ROR1_2A2 VH)
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr Glu Met His Trp Val Ile Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
配列番号32 (scFv ROR1_2A2 VL)
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Ile Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ala Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号6 (scFv ROR1_4-2 VH_4GS3_VL)
Gln Glu Gln Gln Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Gly Ile Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp His Pro Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Glu Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ala Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Gly Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Asp Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly
配列番号33 (scFv ROR1_4-2 VH)
Gln Glu Gln Gln Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Gly Ile Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp His Pro Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
配列番号34 (scFv ROR1_4-2 VL)
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Glu Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ala Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Gly Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Asp Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly
配列番号7 (scFv ROR1_ R11 VH_4GS3_VL)
Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Asp Leu Val Thr Pro Ala Gly Asn Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ser Asp Ile Asn Asp Tyr Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Gly Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Val Gly Asn Val Ser Tyr Arg Thr Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
配列番号35 (scFv ROR1_ R11 VH)
Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Asp Leu Val Thr Pro Ala Gly Asn Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ser Asp Ile Asn Asp Tyr Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
配列番号36 (scFv ROR1_ R11 VL)
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Gly Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Val Gly Asn Val Ser Tyr Arg Thr Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
配列番号8 (scFv ROR1_ R12 VH_リンカー_VL)
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly
配列番号37 (scFv ROR1_ R12 VH)
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
配列番号38 (scFv ROR1_ R12 VL)
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly
配列番号9 (scFv ROR2_4-1 VH_4GS3_VL)
Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gly Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Thr Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr Val Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Trp Thr Ser Leu Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Pro Met Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr Ala Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ala Asp Ala Ser Tyr Arg Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号39 (scFv ROR2_4-1 VH)
Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gly Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Thr Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr Val Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Trp Thr Ser Leu Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
配列番号40 (scFv ROR2_4-1 VL)
Asp Pro Met Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr Ala Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ala Asp Ala Ser Tyr Arg Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号10 (scFv SLAMF7_ERCS409 VH_4GS3_VL)
Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Tyr Gly Val Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Tyr Ile Gly Ile Ile Gly Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Arg Leu Asn Thr Val Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Gly Asp Ser Gly Phe Asp Ser Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Val Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Gly Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ala Ser Pro Asn Gly Trp Ala Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys
配列番号41 (scFv SLAMF7_ERCS409 VH)
Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Tyr Gly Val Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Tyr Ile Gly Ile Ile Gly Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Arg Leu Asn Thr Val Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Gly Asp Ser Gly Phe Asp Ser Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
配列番号42 (scFv SLAMF7_ERCS409 VL)
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Val Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Gly Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ala Ser Pro Asn Gly Trp Ala Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys
配列番号11 (scFv SLAMF7_huLuc63 VH_4GS3_VL)
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
配列番号43 (scFv SLAMF7_huLuc63 VH)
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
配列番号44 (scFv SLAMF7_huLuc63 VL)
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
配列番号12 (scFv FLT3_BV10 VH_4GS3_VL)
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Gly Gly Ile Tyr Tyr Ala Asn His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp His Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
配列番号45 (scFv FLT3_BV10 VH)
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Gly Gly Ile Tyr Tyr Ala Asn His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
配列番号46 (scFv FLT3_BV10 VL)
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp His Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
配列番号13 (scFv FLT3_4G8 VH_4GS3_VL)
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
配列番号47 (scFv FLT3_4G8 VH)
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
配列番号48 (scFv FLT3_4G8 VL)
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
配列番号14 (scFv Siglec-6_JML-1 VH_4GS3_VL)
Lys Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gln Thr Ile Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
配列番号49 (scFv Siglec-6_JML-1 VH)
Lys Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gln Thr Ile Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
配列番号50 (scFv Siglec-6_JML-1 VL)
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
配列番号15 (scFv avb3_LM609v7 VH_4GS3_VL)
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile His His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ala Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Asn Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Glu Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Pro Val Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号51 (scFv avb3_LM609v7 VH)
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile His His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ala Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Asn Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
配列番号52 (scFv avb3_LM609v7 VL)
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Glu Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Pro Val Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号16 (scFv avb3_LM609v11 VH_4GS3_VL)
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ser Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Gly Phe Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Phe Glu Trp Leu Gly Gly Ile Val Ala Ser Leu Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Asp Lys Leu Thr Ile Thr Val Asp Glu Ser Thr Ala Thr Val Tyr Met Glu Met Arg Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Asn Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Glu Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Thr Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Pro Val Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Tyr Ser Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号53 (scFv avb3_LM609v11 VH)
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ser Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Gly Phe Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Phe Glu Trp Leu Gly Gly Ile Val Ala Ser Leu Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Asp Lys Leu Thr Ile Thr Val Asp Glu Ser Thr Ala Thr Val Tyr Met Glu Met Arg Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Asn Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
配列番号54 (scFv avb3_LM609v11 VL)
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Glu Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Thr Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Pro Val Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Tyr Ser Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号17 (scFv BCMA_BCMA30 VH_4GS3_VL)
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Thr Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号55 (scFv BCMA_BCMA30 VH)
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
配列番号56 (scFv BCMA_BCMA30 VL)
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Thr Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号18 (scFv BCMA_BCMA50 VH_4GS3_VL)
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号57 (scFv BCMA_BCMA50 VH)
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
配列番号58 (scFv BCMA_BCMA50 VL)
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号19 (anti MiHリピート重鎖可変領域)
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Phe Thr Asn Tyr Asp Leu His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Val Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Glu Asp Tyr Arg Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
配列番号20 (anti MiHリピート重鎖CDR1)
Gly Phe Ser Phe Thr Asn Tyr
配列番号21 (anti MiHリピート重鎖CDR2)
Trp Ala Val Gly Ser
配列番号22 (anti MiHリピート重鎖CDR3)
Glu Glu Asp Tyr Arg Tyr Gly Met Asp Tyr
配列番号23 (anti MiHリピート軽鎖可変領域)
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号24 (anti MiHリピート軽鎖CDR1)
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
配列番号25 (anti MiHリピート軽鎖CDR2)
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
配列番号26 (anti MiHリピート軽鎖CDR3)
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr
配列番号59 (CPRCP)
CPRCP
配列番号60 (IgG3下部ヒンジ)
APELLGGP
配列番号61 (レンチウイルスベクター骨格5')
GTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACATCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTGATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGATCTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGGGATCAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACGGCTAGCGCCGCCACCATGCTGCTGCTCGTGACATCTCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCC
配列番号62 (レンチウイルスベクター骨格3')
CTCGAGGGCGGAGGCGAAGGCAGAGGCAGCCTGCTGACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACCCAGGCCCCAGAATGCTGCTGCTCGTGACCAGCCTGCTGCTGTGTGAACTGCCTCATCCTGCTTTTCTGCTGATTCCTCGGAAAGTGTGCAACGGCATCGGCATCGGAGAGTTCAAGGACTCCCTGAGCATCAACGCCACCAACATCAAGCACTTCAAGAACTGCACCAGCATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCTGTGGCCTTTAGAGGCGACAGCTTCACCCACACACCCCCCCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGTGAGCGGCCGCTCTAGACCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGATACCGTCGACTAGCCGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCTCGAGGTCGAGATCCGGTCGACCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTCGACGGTATCGATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGAATTCGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTG
配列番号63 (Sleeping Beautyベクター骨格5')
CAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCGGGTCCCTATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACTTAAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACAATTGTTTACAGACAGATTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATTCCAGTGGGTCAGAAGTTTACATACACTAAGTTGACTGTGCCTTTAAACAGCTTGGAAAATTCCAGAAAATGATGTCATGGCTTTAGAAGCTTGATATCCATGGAATTCGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACGGCTAGCGCCGCCACCATGCTGCTGCTCGTGACATCTCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCC
配列番号64 (Sleeping Beautyベクター骨格3')
CTCGAGGGCGGAGGCGAAGGCAGAGGCAGCCTGCTGACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACCCAGGCCCCAGAATGCTGCTGCTCGTGACCAGCCTGCTGCTGTGTGAACTGCCTCATCCTGCTTTTCTGCTGATTCCTCGGAAAGTGTGCAACGGCATCGGCATCGGAGAGTTCAAGGACTCCCTGAGCATCAACGCCACCAACATCAAGCACTTCAAGAACTGCACCAGCATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCTGTGGCCTTTAGAGGCGACAGCTTCACCCACACACCCCCCCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCAAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTAGGGATCGGCCTCTTCATGTGAGCGGCCGCTCTAGATGGCCAGATCTAGCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCCAAGTTAAACAATTTAAAGGCAATGCTACCAAATACTAATTGAGTGTATGTAAACTTCTGACCCACTGGGAATGTGATGAAAGAAATAAAAGCTGAAATGAATCATTCTCTCTACTATTATTCTGATATTTCACATTCTTAAAATAAAGTGGTGATCCTAACTGACCTAAGACAGGGAATTTTTACTAGGATTAAATGTCAGGAATTGTGAAAAAGTGAGTTTAAATGTATTTGGCTAAGGTGTATGTAAACTTCCGACTTCAACTGTATAGGGGTCCTCTAGCTAGAGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTG
配列番号65 (CAR膜貫通ドメイン)
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
配列番号66 (CAR 4-1BBドメイン)
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
配列番号67 (CAR CD3 zetaドメイン)
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号68 (CD19 CAR)
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号69 (CD19 CAR SBベクター、CARインサートに下線を付した)
Figure 2022538397000001
Figure 2022538397000002
配列番号70 (CD19 CAR LVベクター、挿入されたCARに下線を付した)
Figure 2022538397000003
Figure 2022538397000004
Figure 2022538397000005
配列番号71 (scFv CD19_FMC63 VH_MiH5_VL)
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
配列番号72 (scFv CD20_Leu16 VL_MiH5_VH)
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
配列番号73 (scFv ROR1_2A2 VH_MiH5_VL)
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr Glu Met His Trp Val Ile Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Ile Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ala Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号74 (scFv ROR1_4-2 VH_MiH5_VL)
Gln Glu Gln Gln Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Gly Ile Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp His Pro Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Glu Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ala Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Gly Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Asp Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly
配列番号75 (scFv ROR1_ R11 VH_MiH5_VL)
Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Asp Leu Val Thr Pro Ala Gly Asn Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ser Asp Ile Asn Asp Tyr Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
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配列番号93 (scFv ROR1_ R12/V16-20 VH_リンカー_VL)
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配列番号94 (scFv ROR1_ R12/V16-20 VH_MiH5_VL)
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配列番号95 (scFv ROR1_ huR12/V16 VH_リンカー_VL)
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配列番号98 (scFv ROR1_ huR12/V20 VH_MiH5_VL)
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配列番号99 (scFv ROR1_ huR12/V16-20 VH_リンカー_VL)
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser Ser Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Ala Gly Gln Ala Pro Arg Tyr Leu Met Tyr Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Glu Lys Arg Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Ser Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Glu Ser Arg Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Gly
配列番号100 (scFv ROR1_ huR12/V16-20 VH_MiH5_VL)
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Gly Glu Asp Leu Gly Leu Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser Ser Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Ala Gly Gln Ala Pro Arg Tyr Leu Met Tyr Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Glu Lys Arg Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Ser Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Glu Ser Arg Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Gly
配列番号101 (scFv ROR2_X3.12 VH_4GS3_VL)
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Pro Met Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr Ala Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ala Asp Ala Ser Tyr Arg Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号102 (scFv ROR2_X3.12 VH_MiH5_VL)
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Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Asp Pro Met Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr Ala Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ala Asp Ala Ser Tyr Arg Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号103 (scFv ROR2_XBR2-401-DM VH_4GS3_VL)
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Pro Met Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr Ala Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ala Asp Ala Ser Tyr Arg Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号104 (scFv ROR2_XBR2-401-DM VH_MiH5_VL)
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Pro Met Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ala Asp Ala Ser Tyr Arg Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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配列番号107(scFv ROR2_huX3.12.6 VH_4GS3_VL)
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Pro Met Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ala Asp Ala Ser Tyr Arg Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号108 (scFv ROR2_huX3.12.6 VH_MiH5_VL)
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Asp Pro Met Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ala Asp Ala Ser Tyr Arg Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
配列番号109 (CD28tm+CD28/ゼータ)
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Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
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配列番号110 (CD28tm+4-1BB/ゼータ)
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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配列番号111 (CD28tm+CD28/4-1BB/ゼータ)
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配列番号112 (CD28tm+4-1BB/CD28/ゼータ)
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Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号113 (CD28tm+ゼータ)
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号114 (ICOStm+ゼータ)
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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号115 (OX40tm+OX40/ゼータ)
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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号174 (CD4tm+細胞内)
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配列番号116 (scFv CD19_FMC63 VH_MiH5_VL_MiH0_ CD28tm+4-1BB/ゼータ)
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Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号117 (scFv CD19_FMC63 VH_MiH5_VL_MiH1_ CD28tm+4-1BB/ゼータ)
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Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
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配列番号118 (scFv CD20_Leu16 VL_MiH5_VH_MiH3_ CD28tm+4-1BB/ゼータ)
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Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号119 (scFv ROR1_2A2 VH_MiH5_VL_MiH1_ CD28tm+4-1BB/ゼータ)
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr Glu Met His Trp Val Ile Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Ile Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ala Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号120 (scFv ROR1_4-2 VH_MiH5_VL_MiH1_ CD28tm+4-1BB/ゼータ)
Gln Glu Gln Gln Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Gly Ile Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp His Pro Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Glu Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ala Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Gly Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Asp Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号121 (scFv ROR1_R11 VH_MiH5_VL_MiH3_ CD28tm+4-1BB/ゼータ)
Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Asp Leu Val Thr Pro Ala Gly Asn Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ser Asp Ile Asn Asp Tyr Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Gly Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Val Gly Asn Val Ser Tyr Arg Thr Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
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Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号165 (scFv FLT3_BV10 VH_4GS3_VL_MiH1_ CD28tm+4-1BB/ゼータ)
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp His Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号166 (scFv FLT3_4G8 VH_4GS3_VL_MiH1_ CD28tm+4-1BB/ゼータ)
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配列番号167 (scFv Siglec-6_JML-1 VH_4GS3_VL_MiH1_ CD28tm+4-1BB/ゼータ)
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配列番号168 (scFv avb3_LM609v7 VH_4GS3_VL_MiH1_ CD28tm+4-1BB/ゼータ)
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号169 (scFv avb3_LM609v11 VH_4GS3_VL_MiH1_ CD28tm+4-1BB/ゼータ)
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配列番号170 (scFv BCMA_BCMA30 VH_4GS3_VL_MiH1_ CD28tm+4-1BB/ゼータ)
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
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配列番号171 (scFv BCMA_BCMA50 VH_4GS3_VL_MiH1_ CD28tm+4-1BB/ゼータ)
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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配列番号172 (ヒトIgG3のCH2ドメイン)
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
配列番号173 (ヒトIgG3のCH3ドメイン)
PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLS
本発明のさらなる態様及び詳細を、以下の非限定的な例によって例示する。特に、実施例は以下のように行なった。
ヒト対象
CAR改変のためのT細胞は、健常ドナーの末梢血から単離した。全ての参加者は、University of Wurzburgの施設内審査委員会によって承認された研究プロトコルに参加するための書面によるインフォームドコンセントを提供した。
細胞株及び細胞培養培地
Jeko-1、K562、MDA-MB231、Raji、MM.1S、T-47D、及びU266 (全てATCC, Manassas, VA, USA)並びにOPM-2 (DSMZ, Braunschweig, Germany)細胞は、8%のウシ胎児血清(FCS)、2mMのL-グルタミン、及び100U/mLのペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI-1640培地中に維持した(全ての成分はGibco社, Thermo Scientific社, Schwerte, Germanyから入手)。K562_CD19、K562_CD20、K562_SLAMF7、及びK562_ROR1細胞は、それぞれ全長のヒトCD19、CD20、SLAMF7、又はROR1をレンチウイルスで形質導入することによって生成した。K562_IgG3_MiH5は、CD19 CAR構築物CD19_IgG3_MiH5をレンチウイルスで形質導入することによって生成した(「T細胞の生成」の部に記載)。K562_ROR1/E3AK細胞は、アミノ酸391と392の間に導入した非可撓性リンカー(AEAAAKA)16を有するヒトROR1タンパク質(UniProtKB - Q01973, アミノ酸312～440)の切断形をレンチウイルスで形質導入することによって生成した。MDA-MB231_hROR2細胞は、全長のヒトROR2をレンチウイルスで形質導入することによって生成した。マウスにおけるフローサイトメトリー(GFP)及び生物発光イメージング(ffLuc)による検出を可能にするため、及び生物発光系細胞傷害性アッセイに用いるため、ホタルルシフェラーゼ(ffluc)/緑色蛍光タンパク質(GFP)のトランスジーンをコードするレンチウイルスベクターを全ての腫瘍細胞株に形質導入した。T細胞は、8%のヒト血清、2mMのGlutamax、0.1%のβ-メルカプトエタノール、及び100U/mLのペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI-1640培地(T細胞培地;全ての成分はGibco社から入手)、又は記述している場合には2mMのGlutamax、0.1%のβ-メルカプトエタノール、及び100U/mLのペニシリン/ストレプトマイシンを含むX-VIVO(商標)15無血清培地(Lonza社, Basel, Switzerland) (無血清培地)中で維持した。T細胞培養には50U/mlのIL-2 (Proleukin, Novartis社, Basel, Switzerland)を補充した。
CAR T細胞の生成
ベクターの設計及び実験手順は以前の研究17に記載している。簡単に述べると、健常ドナーからの末梢血単核球細胞(PBMC)を、50mLのLeukoSepチューブ(Greiner Bio One)中でFicoll-hypaque密度遠心を用いて精製し、ネガティブマグネティックソーティング(CD4+及びCD8+ T細胞Isolation Kits, human, Miltenyi社)によってCD4+及びCD8+ T細胞を単離した。T細胞を抗CD3/CD28磁性ビーズ(Dynabeads(登録商標) Human T-Activator CD3/CD28、ThermoScientific社)で刺激し、レンチウイルス(epHIV7レンチウイルス)による形質導入又は非ウイルス性Sleeping Beauty遺伝子移送によって遺伝子改変した。用いたCAR構築物は以下の、モノクローナル抗体から誘導された抗原特異的一本鎖可変断片、IgG4又はIgG3ヒンジ由来のスペーサー、CD28膜貫通領域、4-1BB_CD3ζシグナル伝達モジュール、及び切断された上皮細胞成長因子受容体(EGFR)形質導入マーカー18を含む。T細胞は、メーカーの説明書に従って施設内でビオチン化(EZ-Link(商標)Sulfo-NHS-SS-Biotin, ThermoFisher Scientific社, IL)した抗EGFRモノクローナル抗体(mAb) Cetuximab (Merck社, Darmstadt, Germany)及び抗ビオチンMicrobeads (Miltenyi社)を用いてEGFRt+のために富化した。精製したCAR T細胞及び形質導入していない対照T細胞を、迅速拡大プロトコル7,19によって、又は(CD19、CD20、及びSLAMF7-CAR T細胞については)照射した(80Gy)CD19+/CD20+/SLAMF7+フィーダー細胞による抗原特異的刺激7,19によって、拡大させた。
本発明の好ましい実施形態では、キメラ抗原受容体は配列番号68のアミノ酸配列を有するCD19 CARである。より好ましい実施形態では、配列番号68のアミノ酸配列を有するCD19 CARは、配列番号70のヌクレオチド配列を有するレンチウイルスベクターを用いて、又は配列番号69のヌクレオチド配列を有するSleeping Beautyベクターを用いて、発現することができる。
配列番号61及び62 (CARレンチウイルス骨格、それぞれCAR挿入の前及び後の5'及び3'配列)。
配列番号63及び64 (CAR Sleeping Beauty骨格、それぞれCAR挿入の前及び後の5'及び3'配列)。
CAR生成に用いたscFv
以下の抗体のVH及びVLセグメントを含むコドン最適化された標的ドメインを合成し(GeneArt ThermoFisher社, Regensburg, Germany)、CAR構築物のための標的ドメインとして用いた: CD19: FMC6320; CD20: Leu1621; SLAMF7: huLuc6322; ROR1: R1123及び 4-224; ROR2: 4-124; IgG3ヒンジ: 抗MiH抗体#1 (本発明)。
CD19 (FMC63) scFv: 配列番号27のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、配列番号28のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン。
CD20 (Leu16) scFv: 配列番号30のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、配列番号29のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン。
SLAMF7 (huLuc63) scFv: 配列番号43のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、配列番号44のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン。
ROR1 (R11) scFv: 配列番号35のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、配列番号36のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン。
ROR1 (4-2) scFv: 配列番号33のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、配列番号34のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン。
ROR2 (4-1) scFv: 配列番号39のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン。
抗MiH #1 scFv: 配列番号19のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、配列番号23のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン。
抗体及びフローサイトメトリー
CAR形質導入(即ち、EGFRt+) T細胞は、Alexa Fluor (商標) 647 Protein Labeling Kit (ThermoFisher社)を用いてAF647にコンジュゲートした抗EGFRモノクローナル抗体Cetuximab (Merck社, Darmstadt, Germany)又は抗Her2モノクローナル抗体Trastuzumab (Roche社, Penzberg, Germany)による染色によって検出した。
BioLegend社(London, United Kingdom)のCD19に対する抗体(クローン HIB19; AF647)、CD20に対する抗体(クローン 2H7; PE, AF647, APC)、SLAMF7/CD319に対する抗体(クローン 162.1; PE) ; Miltenyi社のCD4に対する抗体(クローン M-T466; VioBlue & PE-Vio770)、CD8に対する抗体(クローン BW135/80; VioBlue & PE-Vio770)、ROR1に対する抗体(クローン 2A2; PE & APC)、ROR2に対する抗体(ポリクローナル、ヤギ; BioTeche社, Minneapolis, MN, USA)、並びに死細胞を解析から除外するための7-AAD (BD Biosciences社, Heidelberg, Germany)を用いた。
抗MiH抗体#1 (配列番号19のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号23のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインによって特徴付けられ、マウスIgG1骨格を有する)は、evitria社(Zurich-Schlieren, Switzerland)によって合成された。フローサイトメトリー解析をFACS Canto II (BD社)装置で実施し、FlowJoソフトウェア(TreeStar社, Ashland, OR)を用いて解析した。
in vitroにおけるCAR T細胞機能の解析
機能解析は既に記載5, 7, 25-27したように実施した。簡単に述べると、ホタルルシフェラーゼ(ffLuc)を発現する標的細胞を、三重測定で5×103細胞/ウェルとしてエフェクターT細胞とともに種々のエフェクター:標的(E:T)比でインキュベートした。共培養にルシフェリン基質を加え、標的細胞とT細胞とを含むウェルにおける発光シグナルの低下を、ルミノメーター(Tecan社, Mannedorf, Switzerland)を用いて測定し、標的細胞単独と比較した。特異的細胞溶解は、標準的な式を用いて計算した。サイトカイン分泌の解析のため、5×104個のT細胞を三重測定ウェルに標的細胞とともに4:1の比で播種し、24時間のインキュベーション後に取り出した上清中のIFNγ及びIL-2の産生をELISA (Biolegend社)によって測定した。増殖を解析するため、5×104個のT細胞を0.2μMのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE, ThermoFisher社)で標識し、洗浄して、三重測定ウェルに、外因性サイトカインを含まない培地中、標的細胞とともに4:1の比で播種した。72時間のインキュベーション後、死細胞を解析から除外するため、細胞を抗CD8/CD4 mAb及び7-AADで染色した。試料をフローサイトメトリーによって解析し、生存T細胞の分裂をCFSE希釈によって評価した。
in vivoにおけるCAR T細胞機能の解析
全ての実験は、管轄権のあるInstitutional Animal Care and Use Committeesによって承認された。NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)マウス(雌、6～8週齢)はCharles River社(Sulzfeld, Germany)から購入し、又は施設内で飼育した。0日目にマウスに1×106個のffluc_GFP+ 腫瘍細胞を尾静脈注射によって接種し、処置群と対照群とにランダムに割り付けた。7日目にマウスに5×106個のT細胞(即ち、200μLのPBS/0.5% FCS中2.5×106個のCD4+及び2.5×106個のCD8+)の単回用量を尾静脈注射した。腫瘍の進行/縮退を、D-ルシフェリン基質(0.3mg/g体重) (Biosynth社, Staad, Switzerland)のi.p.投与後、IVIS Lumina イメージングシステム(PerkinElmer社, Waltham, Massachusetts, USA)を用いる連続生物発光イメージングによって評価した。データは、LivingImage ソフトウェア(PerkinElmer社)を用いて解析した。
in vitroにおける多機能部位のターゲティング
1×106個のCAR T細胞と1×106個の形質導入していない対照T細胞とを混合し、メーカーの説明書に従って施設内でビオチン化(EZ-Link (商標) Sulfo-NHS-SS-Biotin, ThermoFisher Scientific社, IL)した抗MiH抗体#1又は抗EGFR抗体(Cetuximab, Merck社, Darmstadt, Germany)、及び抗ビオチンMicrobeads (Miltenyi社)で標識し、続いてLSカラム(Miltenyi社)を用いるMACSシステムによって精製した。陰性及び陽性の分画を、CD4、CD8、及びEGFRtに対する抗体で染色した。123 Count eBeads(ThermoFisher社)を測定前に直接加えた。以下のフローサイトメトリー解析において、収率の定量的比較を可能にするため、試料あたり1000個の123 Count eBeadsを取り出した。
プレートに結合した抗体を用いる、抗原には依存しないがCARに特異的な活性化及び拡大のため、5μg/mlの抗MiH抗体#1でプレコートした96ウェルのプレートの三重測定ウェルに5×104個のT細胞を播種し、無血清培地中で、24時間の培養の後にCD25及びCD69の発現のフローサイトメトリー解析、又は拡大アッセイのため7日間の培養後に細胞計数を行なった。
抗MiH抗体#1を連結したビーズ又は抗CARを有するK562に応答する増殖を解析するため、5×104個のT細胞を0.2μMのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE, ThermoFisher社)で標識し、洗浄して、三重測定ウェルで、外因性サイトカインを含まない無血清培地中、ビーズ:T細胞の比1.6:1でDynaBeads (登録商標) (抗CD3/抗CD28、抗MiH抗体#1、抗MiH抗体#1+抗CD28、抗MiH抗体#1+抗4-1BBと連結)と、又は比4:1で標的細胞とともに播種した。72時間のインキュベーション後、死細胞を解析から除外するため、細胞を抗CD8/CD4 mAb及び7-AADで標識した。試料をフローサイトメトリーによって解析し、生存T細胞の分裂をCFSE希釈によって評価した。
抗MiH抗体#1由来の抗体と薬物のコンジュゲート(ADC)を用いて細胞を枯渇させる可能性を評価するため、5×104個のT細胞を三重測定ウェルに播種し、アンスラサイクリン系細胞傷害性ペイロード(NBE Therapeutics社, Basel, Switzerland)にコンジュゲートした様々な濃度の抗MiH抗体#1で処理した。細胞を、50IUのIL-2の存在下、無血清培地中で72時間培養して洗浄し、CD4、CD8、及びEGFRtに対する抗体並びに7AADで染色した。123 Count eBeads (ThermoFisher社)を測定前に直接加えた。以下のフローサイトメトリー解析において、細胞傷害効果の定量的比較を可能にするため、試料あたり1000個の123 Count eBeadsを取り出した。
in vivoにおける多機能部位のターゲティング
in vivoにおける追跡のため、CD4+ T細胞に、新型バージョンのIgG3系CD19 CAR(CD19_IgG3_MiH5/MiH1)並びにffluc_GFP融合タンパク質を形質導入し、上記のように富化及び拡大した。
NSGマウス(雌、6～8週齢、Charles River社(Sulzfeld, Germany)から購入)に、4.5×106個のffluc_GFP+ CAR T細胞を尾静脈注射によって0日目に接種した。8日目にマウスの半分を100μgの抗MiH抗体#1 ADC (ほぼ4.5mg/kg体重)で処置した。11日目に抗MiH抗体#1系抗CARを備える照射したK562細胞(マウスあたり照射したK562細胞1×106個)でT細胞を再刺激した。T細胞の持続性の速度論を、D-ルシフェリン基質(0.3mg/g体重)(Biosynth社, Staad, Switzerland)のi.p.投与後、IVIS Luminaイメージングシステム(PerkinElmer社, Waltham, Massachusetts, USA)を用いる連続生物発光イメージングによって評価した。データは、LivingImageソフトウェア(PerkinElmer社)を用いて解析した。
in vivo増殖の解析のため、CD4+ T細胞に、新型バージョンのIgG3系CD19 CAR(CD19_IgG3_MiH5/MiH1)を形質導入し、上記のように富化及び拡大して、メーカーの説明書に従って5μMの増殖色素eFluor 670(ThermoFisher社)で標識した。
NSGマウス(雌、6～8週齢、Charles River社(Sulzfeld, Germany)から購入)に、4.5×106個のCAR T細胞を尾静脈注射によって0日目に接種した。続いてn=5のマウスの群に、照射した刺激細胞(K562又はK562_抗CAR)を、上記のように様々な時点で尾静脈注射によって投与した。T細胞の移送後4日目にマウスを犠牲死させ、骨髄細胞を単離し、CD4、CD45、及びEGFRtに対する抗体で染色し、上記のようにフローサイトメトリー解析に供した。CD45+/CD4+/EGFR+骨髄由来T細胞を、eFluor 670希釈について解析した。
(実施例1) IgG3ヒンジライブラリーの構築
本発明者らは、IgG3ヒンジ系CARスペーサーライブラリーを生成した。この中でscFvと膜貫通ドメインは、ヒトIgG3ヒンジドメインのバリアントによって連結されている。これは天然にはアッパーヒンジ(12アミノ酸、ELKTPLGDTTHT、配列番号2)、ミドルヒンジ(50アミノ酸、CPRCP、配列番号59 + EPKSCDTPPPCPRCP、配列番号1の3回リピート)、及びロワーヒンジ(8アミノ酸、APELLGGP、配列番号60)からなっており、IgG3_UMLH(アッパー、ミドル、及びロワーヒンジ)と命名されるこの野生型スペーサーについての70アミノ酸の全スペーサーサイズがもたらされる。このことから、本発明者らは、アッパーヒンジ、ミドルヒンジの開始部(CPRCP、配列番号59)、及びEPKSCDTPPPCPRCPモチーフ(配列番号1)の0～10コピーからなり、15アミノ酸のステップで17から167アミノ酸にわたってIgG3_MiH0からIgG3_MiH10と命名されるスペーサードメインをもたらすバリアントを構築した(図1)。
(実施例2) IgG3由来スペーサーを有するCD19特異的CAR T細胞のin vitro機能
第1の組の実験は、よく特徴解析されているCD19 scFv FMC637を用いて行なった。5種類のIgG3ヒンジバリアント(IgG3_MiH1、IgG3_MiH2、IgG3_MiH3、IgG3_MiH4、及びIgG3_MiH5)を、CD8+バルクT細胞のIgG4(12アミノ酸)からの短いスペーサーを含む最適化されたIgG4系構築物pj02459と比較した。CARの他の全ての部分を、同様にして構築した(同じscFv、CD28膜貫通ドメイン、4-1BB及びCD3ζシグナル伝達ドメイン)。機能性in vitroアッセイにおいて、全てのバリアントは、CD19発現標的細胞との遭遇に際して同様の強い特異的増殖を示した。これとは対照的に、バリアントIgG3_MiH1及びIgG3_MiH2は、IgG4 CARと同様の顕著な細胞傷害性効果を呈した一方、より長いIgG3バリアントでは細胞溶解は低減した。サイトカインの産生についても同様の結果が観察され、IgG3_MiH1及びIgG4バリアントはIFNγの最大の分泌をもたらし、より長いIgG3バリアントは全て、より少なく分泌した(図2)。
(実施例3) IgG3由来スペーサーを有するROR1特異的CAR T細胞のin vitro機能
第2の組の実験では、ROR1 CARのR11及び4-2のIgG3バリアントを、それらの最も効果のあるIgG4バージョン(R11については長いIgG4スペーサー、4-2については短いIgG4スペーサー)と比較した。
ROR1の膜遠位エピトープを標的とする4-2 scFvの場合には24、IgG3_MiH1バリアント及びIgG4は抗原との遭遇に際して同程度の増殖、細胞傷害性、及びサイトカイン分泌を示した一方、IgG3_MiH3、IgG3_MiH5、及びIgG3_UMLHは低下した抗腫瘍応答を呈した(図3A～図3C)。
対照的に、ROR1の膜近位エピトープを標的とするR11 scFvのIgG3_MiH1バリアント7は、ROR1+標的細胞との遭遇に際して抗原特異的増殖を誘起しなかった。IgG3_MiH2、IgG3_MiH4、及びIgG3_MiH5は特異的増殖を呈する一方、最適なものはIgG4バリアントと同様の様式でIgG3_MiH3によって誘起されるようであり、このscFVのIgG3スペーサー長さについての最適スポットは3つのリピートに位置していることを示唆している(図4A)。その結果、IgG3_MiH1は細胞傷害性応答を何ら呈しない一方、他の全てのバリアントは効果的な腫瘍細胞溶解をもたらし、IgG3_MiH2、IgG3_MiH3、及びIgG3_MiH4がIgG4バリアントと同様に効果的である(図4B)。サイトカインの産生に関しては、IgG3_MiH3がIFNγの分泌においてIgG4バリアントを顕著に凌駕し、IgG3_MiH2及びIgG3_MiH4がIgG4バリアントと同様の量を分泌した一方、IgG3_MiH5はあまり効果的でなく、IgG3_MiH1はIFNγを何ら分泌しなかった(図4C)。
興味あることに、IgG3_MiH1が抗原依存性T細胞エフェクター機能を誘起できないことは、標的分子中のエピトープに立体的に結合できないことに起因するのではなく、エピトープに到達するには不十分なスペーサー長さに起因する。膜貫通ドメインとクリングルドメインとの間に非可撓性の小さなA(EAAAK)Aリンカー28を導入することによって、R11の標的エピトープを担う7クリングルドメインを腫瘍細胞膜から遠ざけると、IgG3_MiH1は他の全てのバリアントと同様の増殖、細胞傷害性、及びサイトカイン分泌を呈する(図4E～図4G)。
これらの結果は一般に、IgG3のヒンジドメインがCAR T細胞における可撓性スペーサーとして用いるために効果的な選択肢であることを証明しており、scFVと標的分子との相互作用を最適化するためのより大きな可変性を提供している。
(実施例4) IgG3由来スペーサーを有するCD20特異的CAR T細胞のin vitro機能
機能の証明を他の標的に拡張するため、本発明者らはCD20特異的scFV Leu16を備えるCARのIgG3バリアント(IgG3_MiH1～IgG3_MiH5)を検討した。これはCD20の膜近位エピトープを標的としていることが報告されているので29、結果として、長いIgG4系スペーサー(ヒンジ-CH2-CH3)が最適のIgG4フォーマットであることが証明された。驚くべきことに、これはIgG3系スペーサーに1:1で置き換えられない。興味あることに、最も短いIgG3バリアント(IgG3_MiH1)は抗原との遭遇に際して最良の増殖を示し、それによりIgG4バリアントを大幅に凌駕した。一方、より長いIgG3バリアントは増殖がずっと少なかった(図5A)。対照的に、バリアントIgG3_MiH2及びIgG_MiH3は(IgG4バリアントとともに)最良の細胞傷害効果をもたらした一方、IgG3_MiH1、IgG3_MiH4、及びIgG3_MiH5はずっと少ない細胞傷害性を呈した(図5B)。IgG3_MiH1及びIgG3_MiH2は同程度の量のIFNγの放出を示した一方、より長いIgG3バリアントの放出は少なかった(図5C)。
この例はIgG3スペーサーの大きな可撓性を示し、最も短いバージョン(32アミノ酸)でさえも比較的に膜近位のエピトープに結合できるようである。一方、短いIgG4スペーサー(12アミノ酸)は長いスペーサー(228アミノ酸)29より劣ることが見いだされた。
(実施例5) IgG3由来スペーサーを有するSLAMF7特異的CAR T細胞のin vitro機能
次に、本研究者らは、SLAMF7特異的scFv huLuc63に基づくCARのIgG3バリアント(IgG3_MiH1～IgG3_MiH5、IgG3_UMLH)を検討した。本発明者らが既に報告したように、huLuc63 IgG4 CARは、長いIgG4スペーサー(ヒンジ-CH2-CH3)を有するように操作した場合に最も良く機能する30。驚くべきことに、検討した中で最も短いスペーサーバリアント(IgG3_MiH1)が最高レベルの抗原特異的増殖を示し、長いIgG4系スペーサー(ヒンジ-CH2-CH3)を備えるIgG4バリアントより優れていた。全てのCARバリアントが顕著な抗原特異的細胞傷害性及びサイトカイン分泌をもたらした。IgG3バリアントのいずれもがSLAMF7を発現する黒色腫細胞株MM.1Sを死滅させるIgG4のレベルに達しないとしても、1つ、2つ、又は3つのIgG3_MiHリピートを備えるIgG3バリアントは、顕著な細胞溶解をもたらした。IFNγの分泌に関しては、IgG3_MiH1 IgG3バリアントは最高の分泌をもたらし、IgG3_MiH2は真後ろのIgG4バリアントと等しかった(図6)。
(実施例6) IgG3由来スペーサーを有するROR2特異的CAR T細胞のin vitro機能
別の実施例で、本発明者らはROR2標的scFv 4-1を有するCARのIgG3系スペーサーバリアント(IgG3_MiH1、IgG3_MiH3、IgG3_MiH5、IgG3_UMLH)を構築した。これは、長いIgG4スペーサー(ヒンジ-CH2-CH3)を備えた場合に、短いスペーサー(ヒンジのみ)と比較してより良く機能することを本発明者らが報告している24。IgG3_MiH1は、抗原と遭遇した際の特異的増殖及びサイトカイン分泌(IFNγ)においてIgG4バリアント(IgG4長)より優れている一方、両方のバリアントは等しい細胞傷害能力を呈する。対照的に、長いIgG3バリアント(IgG3_MiH3、IgG3_MiH5、IgG3_UMLH)は低減したレベルの増殖、サイトカイン分泌、及び特に細胞傷害性を示し、IgG3_MiH5が検討した中で機能性が最小のバリアントである(図7A～図7C)。
(実施例7) in vivoにおける機能性及び持続性
本研究者らのin vitroの結果をin vivoモデルに置き換えるため、1×106個のCD19+ Raji腫瘍細胞をNSGマウスに移植し、腫瘍移植の7日後に5×106個のCD8+バルクT細胞でマウスを処置した。IgG3_MiH5バリアントを含むT細胞は、改変していない対照T細胞と比較して、腫瘍の成長及び生存に対して有益な効果を呈さなかった。IgG3_MiH3バリアントは腫瘍負荷の増大を僅かに遅らせ、生存の有意でない増大をもたらした一方、IgG3_MiH1バリアント及びIgG4 CARは腫瘍の完全な根絶をもたらした。腫瘍細胞は結果的に全てのマウスで成長したが、IgG3_MiH1バリアントはこの成長を遅延させ、IgG4バリアントと比較して有意に延長された生存率をもたらした(図8A～図8B)。
IgG3ヒンジに対する免疫原性はマウスで観察されず(T細胞の注入後35日の実験の終了まで、IgG4又はIgG3系のスペーサーを備えるT細胞で同様の数が検出可能であった)、さらなる改変(例えばIgG4についてFcRγ結合部位の除去26)の必要なしにCAR T細胞のIgG3ヒンジバリアントのin vivo機能の研究が可能になった(図8C)。
Jeko-1を7日間移植したマウスにおいてR11 scFvを備えるROR1特異的CAR T細胞を適用する別のマウス実験を実施した。IgG4スペーサーバリアントとIgG3バリアントであるIgG3_MiH1及びIgG3_MiH4のいずれもJeko-1腫瘍成長及び処置動物の生存に影響しなかった一方、IgG3_MiH3及び特にIgG3_MiH2は腫瘍細胞の減衰及び動物生存の延長をもたらした(図9)。
まとめると、これらのin vivoデータは、既にin vitro実験で詳細に検討したIgG3ヒンジ系スペーサードメインを有するCARの適合性及び機能性を確認している。
(実施例8) IgG3ヒンジ系多機能部位を用いるCARの検出及びさらなるCAR固有機能の利用
本発明者らは、ヒトIgG3のIgG3_MiHリピートを特異的に標的とする抗体(抗MiH抗体#1と命名され、配列番号19のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号23のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインによって特徴付けられる)を同定し、抗原非依存性であるがCAR特異的なさらなる機能を利用するためにこれを用いることを目的とした。
本発明者らは3つ以上のIgG3_MiHリピートからのみ抗体の適正な結合を見出し(図10A)、また試験した大部分のscFvは比較的短いIgG3系スペーサーで良好な機能を示すので、本発明者らは一般に用いられる(G4S)3リンカーを置き換えてscFvの重鎖と軽鎖との間に更に5つのIgG3_MiHリピートを導入した(「新型フォーマット」、図10B)。
(実施例9) in vitro/in vivoにおける新型フォーマットの機能性の証明
scFvの重鎖と軽鎖との間のこの多機能部位の導入(「新型フォーマット」)が抗原結合を害し、それによりCARの機能性が害されることを除外するため、本発明者らは、新型IgG3フォーマットにおいて操作したCD19 CAR T細胞を、最適の第1世代IgG3バリアント及びIgG4参照CARと比較した。バリアントのいずれの間でも、in vitroでの増殖、細胞傷害性、及びサイトカイン産生について明白な相違は起こらなかった(図11A～図11C)。同様に、全てのバリアントはNSGマウスにおいてin vivoでRaji腫瘍細胞を等しく根絶させることができ、動物の生存の増強がもたらされた(図11D～図11E)。これらの結果は、scFvのVHとVLとの間の多機能部位の導入がCARの機能性を害さず、研究者らがさらなる機能のためにこれを利用することが可能になることを示唆している。
(実施例10) 多機能部位に指向されるCAR Tの精製
最初に、本発明者らはCAR陽性T細胞の精製のために多機能部位を用いることを試みた。したがって、本発明者らは、CAR T細胞と形質導入していないT細胞との1:1混合物からCAR T細胞を精製する能力において、本発明者らのIgG3_MiH特異的抗体と、よく確立されたEGFRt(切断された上皮細胞成長因子受容体、CARトランスジーンカセットに含まれ、T2A切断部位によってCARから分離される)を標的とする抗体とを比較した。EGFRtを介する精製はIgG4及び全てのIgG3_MiHバリアント(IgG3_MiH1～IgG3_MiH5)について等しく良好に機能し、約90%の純度がもたらされたが、IgG3ヒンジを介する精製では3つ以上のIgG3_MiHリピートについてのみ良好な純度が達成された。長いIgG3_MiHバリアントについては、細胞産生物は純度においては同程度であったが、IgG3_MiHを介する精製では精製後に細胞の収率の低減がもたらされた(図12A～図12B)。
EGFRtを介する精製と比較したこれらの低減した収率のレベルは、新型フォーマットにおけるscFvのVHとVLとの間の第2の多機能部位の導入の後でも持続した。ソーティング後の高純度の細胞集団の受容を可能にしても、新型IgG3系CARについても収率はまだEGFRtに及ばなかった(図12C～図12D)。それにも関わらず、本研究者らのデータは、スペーサードメイン又は多機能部位を介する効率的なソーティングが実行可能で、高純度の細胞集団の富化がもたらされることを実証している。
(実施例11) 多機能部位に指向されるCAR T細胞の活性化及び拡大
抗原非依存的であるがCAR特異的にCAR改変T細胞を活性化することは、照射したフィーダー細胞又はCD3及びCD28を標的とすることによるバルクT細胞活性化の必要なしに、in vitroでこれらの細胞を多くの数に拡大する機会を提供する。さらなる有益な効果は、トランスジェニック細胞産生物の純度が、手作業で細胞を富化する必要なしに、それによって増大することである。したがって、本発明者らは、プレートに結合したIgG3ヒンジ特異的抗MiH抗体#1の、IgG3由来スペーサードメインを有するCAR T細胞を活性化する能力を検討した。精製について得られた結果と良好に一致して、抗体はIgG3_MiH1バリアントについてT細胞活性化マーカーであるCD25及びCD69の上方制御を誘起することができなかった。対照的に、いずれの分子もIgG3_MiH3及びIgG3_MiH5バリアントにおいて顕著に上方制御され、5リピートのバリアントの応答がより大きかった(図13A～図13B)。
これらの知見は、3つ以上のIgG3_MiHリピートを有するスペーサーを備えるCAR T細胞における増殖及び拡大を誘起する抗体の能力とも相関した。IgG3_MiH3の存在は、7日間の刺激の後で、CAR T細胞の数における2倍を超える増大をもたらし、4つ以上のリピートは1週間後に4倍の拡大をもたらした(図13C)。
プレコートした抗体を用いるよりも実施しやすい特異的刺激を可能にする方法を探索する中で、本発明者らはIgG3ヒンジ特異的抗体を単独で、又はa-CD28若しくはα-4-1BB共刺激抗体と組み合わせて、磁性ビーズ(ThermoFisher社 Dynabeads(登録商標))にコンジュゲートし、これらをよく確立されたα-CD3/α-CD28 Dynabeads(登録商標)(ThermoFisher社 Dynabeads (登録商標) Human T Activator)と比較した。更に、本発明者らは、標的ドメインとして抗MiH抗体#1 scFvを備えるIgG4由来スペーサーを有するCARを生成し、この「抗CAR」をK562細胞に安定的に導入した(図14A)。
α-CD3/α-CD28 Dynabeads(登録商標)はIgG3_MiH1スペーサーを有するCAR T細胞の増殖を誘起することができた一方、抗MiH抗体#1を連結したビーズ又は抗CARを有する照射したK562は、刺激効果を有しなかった(図14B)。対照的に、K562_抗CAR並びに抗MiH抗体#1の全てのバリアントを連結したDynabeads(登録商標)は、新型IgG3スペーサーフォーマットを有するCAR T細胞の増殖を誘起した。この効果は抗MiH抗体#1/α-CD28 ビーズで最も顕著であり、これは確立されたCD3/CD28 Dynabeads(登録商標)より優れていた(図14C)。
これらの結果は、特に新型IgG3フォーマットを有するCAR T細胞が効率的に活性化され、抗原非依存的にしかしCAR特異的に、多くの数に拡大され得ることを証明している。
(実施例12) ADCを用いるin vitroでの枯渇
本発明に記載した全てのCARトランスジーンカセットにEGFRt安全性スイッチが含まれているとしても、第2の介入の選択肢の可能性を有することは、CAR T細胞処置に際して起こり得る可能な致命的毒性を管理するために極めて望ましい。したがって、本発明者らは、CARそれ自体を直接標的とすることができる抗体薬物コンジュゲート(ADC)を得るために、本発明者らのIgG3ヒンジ特異的抗体を細胞傷害性のペイロードにコンジュゲートした。50ng/mlの濃度が既にIgG3_MiH5バリアントを有するCAR T細胞に対して僅かな細胞傷害効果を示す一方、5μg/mlのみで培養3日後にIgG3_MiH4又はIgG3_MiH5バリアントを備える全ての細胞のほぼ完全な除去がもたらされた。IgG3_MiH3バリアントは、5μg/mlで少なくとも半分を超える低減を示した。検討した中の最大濃度(10μg/ml)では、生存しているIgG4スペーサーCAR T細胞の数も減少したので、非特異的な効果も媒介しているようである(図15)。
新型IgG3スペーサーフォーマットを有するCAR T細胞に対する効果を検討すると、同様の結果が得られた。CD19についての第1世代IgG3スペーサーバリアント(IgG3_MiHリピート1個)は、10μg/mlにおいても特異的ADC効果を受けなかった一方、新型バージョンは500ng/mlで60%の低減、及び5μg/mlでほぼ完全な除去を示した(図16A)。
CD20特異的CAR Leu16 (そのスペーサードメインに3つのIgG3_MiHリピートを有する)は、ADCに対して全体としてやや弱い応答を示し、新型IgGバージョンは500ng/mlに応答した一方、大多数の細胞はf.c.5μg/mlで除去された(図16B)。
3つのIgG3_MiHリピートを備えるROR1特異的scFv R11を有するCARについては、500ng/mlで既に強い効果を示し、これは5μg/mlで更に顕著になり、全ての細胞のほぼ完全な除去がもたらされた(図16C)。
これらの結果は、ADCに基づくCAR T細胞除去の方法の可能性を証明している。
(実施例13) 抗CARを用いるin vitroでの枯渇
CAR T細胞の枯渇のための別の可能な選択肢は、上述の抗CAR(IgG4ヒンジ由来のスペーサー)を備える他のT細胞とともに、望ましくないIgG3ヒンジ系CAR t細胞を標的とすることであろう。IgG3_MiH5 IgG3 CARを形質導入したK562細胞を標的とする細胞傷害性の実験において、これらの標的細胞の特異的な認識及び除去は、抗CARを有するT細胞によって媒介され(図17)、CAR T細胞が他のCAR Tによっても標的とされ除去され得ることが示唆された。
(実施例14) in vivoにおける枯渇
次に、本発明者らは、枯渇がin vivoでも可能か否かを検討した。即ち、本発明者らは、CD19 CARの新型IgG3フォーマットバージョン(CD19_IgG3_MiH5/MiH1)をホタルルシフェラーゼ/GFP融合タンパク質とともに形質導入したCD4+ T細胞を用い、マウスにおけるT細胞の生体発光イメージングを可能にした。T細胞を主として骨髄に接種し、これは7日目までに移植されていた。8日目にマウスの半分を100μgの抗MiH抗体#1 ADC(ほぼ4.5mg/kg体重)で処置した。全体の発光シグナルは徐々に低減していたが、ADC処置群のマウスは有意に低い輝度を示した。11日目に全てのマウスを上述の抗MiH抗体#1系抗CARを備える照射したK562細胞(マウスあたり1×106個の照射した細胞)を用いる再刺激に供すると、2つの群の間の差異は更に増大した。18日目における実験の終了時に、これは最終的に生体発光シグナル(したがってT細胞のカウント)の有意な2.4分の1への低減をもたらし(図18)、それにより、必要であれば治療の状況においてCAR T細胞の数を顕著に低減させる選択肢が証明された。
(実施例15) in vivoにおける増殖
次に、本発明者らは、増殖の誘起がin vivoで達成できるか否かを検討した。即ち、本発明者らは、CD19 CARの新型IgG3フォーマットバージョンを形質導入したCD4+ T細胞(CD19_IgG3_MiH5/MiH1)を用い、増殖色素eFluor 670で標識した。T細胞を接種し、更に引き続いて様々な時点で、3×106個の照射したK562又はK562_抗CAR細胞で動物を処置した。マウスの1群(1群あたりn=5動物)には、T細胞の注射の日(d0)のT移送の3時間後に、K562_抗CAR細胞を投与した。第2の群には、T細胞の注射後3日目に追加の用量の照射したK526_抗CAR細胞を投与した(d0+d3)。他の2群はそれぞれ、T細胞の移送後1日目(d1)又は1日目及び3日目(d1+d3)に、照射したK562_抗CAR細胞で処置した。対照群にはd0+d3に、照射したK562細胞を投与した。T細胞の移送後4日目にマウスを犠牲死させ、骨髄細胞からのT細胞を収集し、eFluor 670希釈について解析した。全ての群からのT細胞は、ある程度の増殖を示した。d1若しくはd1+d3にK562_抗CARで処置したマウス、又はK562で処置したマウスは低い増殖速度を呈した一方、d0にK562_抗CAR細胞を投与したマウスは、より大きなeFluor 670希釈の速度を示した。最良の増殖は、d0+d3におけるK562_抗CAR細胞による処置の後で達成された(図19)。これらの結果は、IgG3系スペーサーを備えるCAR T細胞がin vivoで成功裡にかつ特異的に刺激され、活性化され得ることを実証している。
以下の追加的な実施例は、既述の実施例と同様に、以下の追加とともに行なった。
細胞株及び細胞培養培地
MV4-11、MOLM-13 (全てATCC, Manassas, VA, USA)、並びにTM-EBV-LCL35 (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USから恵与)細胞は、8%のウシ胎児血清 (FCS)、2mMのL-グルタミン,及び100U/mLのペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI-1640培地中で維持した(全ての成分はGibco社, Thermo Scientific社, Schwerte, Germanyから入手)。
CAR生成に用いたscFv
以下の抗体のVH及びVLセグメントを含むコドン最適化された標的ドメインを合成し(GeneArt ThermoFisher社, Regensburg, Germany)、CAR構築物のための標的ドメインとして用いた: FLT3: 4G832、BV1034、Siglec-6: JML-131。
FLT3 (BV10) scFv: 配列番号45のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、配列番号46のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン。
FLT3 (4G8) scFv: 配列番号47のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、配列番号48のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン。
Siglec-6 (JML-1) scFv: 配列番号49のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、配列番号50のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン。
抗体及びフローサイトメトリー
Miltenyi社のSiglec-6に対する抗体(clone REA852; APC)、BD Biosciences社(Heidelberg, Germany)のFLT3に対する抗体(clone 4G8; AF647)、及びBioTeche社(Minneapolis, MN, USA)のSiglec-6に対する抗体(767329; PE)を用いた。
in vitroにおける多機能部位のターゲティング
抗原非依存的であるがCAR特異的な拡大のため、5×105個のCAR T細胞を、ガンマ照射器を用いて80Gyで照射した5×106個のTM-EBV-LCL又はK562_抗CAR細胞とともに、50IUのIL-2の存在下にX-VIVO(商標)15無血清培地中で14日間、共培養した。
in vivoにおける多機能部位のターゲティング
in vivo追跡のため、CD8+ T細胞に、新型バージョンのIgG3系CD19 CAR(CD19_IgG3_MiH5/MiH1)、並びにffluc_GFP融合タンパク質を形質導入し、上記のように富化及び拡大した。
ADC枯渇のため、NSGマウス(雌、6～8週齢、Charles River社(Sulzfeld, Germany)から購入)に、4.5×106個のffluc_GFP+ CAR T細胞を尾静脈注射によって0日目に接種した。8日目にマウスの半分を100μgの抗MiH抗体#1 ADC(ほぼ4.5mg/kg体重)で処置した。11日目に抗MiH抗体#1系抗CARを備える照射したK562細胞(マウスあたり照射したK562細胞1×106個)でT細胞を再刺激した。T細胞の持続性の速度論を、D-ルシフェリン基質(0.3mg/g体重)(Biosynth社, Staad, Switzerland)のi.p.投与後、IVIS Lumina イメージングシステム(PerkinElmer社, Waltham, Massachusetts, USA)を用いる連続生物発光イメージングによって評価した。データは、LivingImageソフトウェア(PerkinElmer社)を用いて解析した。
抗CAR T細胞に媒介される枯渇のため、群あたりNSGマウス(雌、6～8週齢、Charles River社(Sulzfeld, Germany)から購入)に、2.2×106個の標的T細胞(ffluc+ GFP+ + 抗CD19-CAR CD19_MiH5/MiH1; (CD4+:CD8+比1:1)を接種し、24時間後に4×106個のCD8+抗CAR-CAR T細胞又は同じドナーからの形質導入していない対照T細胞で処置した。各処置群におけるT細胞の持続性/枯渇を評価するため、D-ルシフェリン基質のi.p.投与後、IVIS Luminaイメージングシステムを用いて連続生物発光イメージングを行なった。データは、LivingImageソフトウェアを用いて解析した。
in vivoにおける増殖の解析のため、CD4+及びCD8+ T細胞に、新型バージョンのIgG3系CD19 CAR(CD19_IgG3_MiH5/MiH1)を形質導入し、上記のように富化及び拡大して、メーカーの説明書に従って5μMの増殖色素eFluor 670(ThermoFisher社)で標識するか、未標識のままとした。
NSGマウス(雌、6～8週齢、Charles River社(Sulzfeld, Germany)から購入)に、指示した量のCAR T細胞を尾静脈注射によって0日目に接種した。続いてn=4～5のマウスの群に、照射した刺激細胞(K562又はK562_抗CAR)を、指示したように様々な時点で尾静脈注射によって投与した。T細胞の持続性/拡大の速度論を、D-ルシフェリン基質のi.p.投与後、IVIS Luminaイメージングシステムを用いる連続生物発光イメージングによって評価した。データは、LivingImageソフトウェアを用いて解析した。いくつかの実験では、T細胞の移送後4日目にマウスを犠牲死させ、骨髄細胞を単離し、CD4、CD45、及びEGFRtに対する抗体で染色し、上記のようにフローサイトメトリーに供した。CD45+/CD4+/EGFR+骨髄由来T細胞を、eFluor 670希釈について解析した。
(実施例16) 新型IgG3フォーマットROR1特異的CAR T細胞のin vitro機能及びCD8αフォーマットとの比較
さらなる実験の組において、本発明者らは、新型IgG3フォーマットで操作したROR1特異的CAR T細胞(R11 scFv)と、最適の第1世代IgG3バリアント及び広く適用されるCD8αの設定(CD8αヒンジ及び膜貫通ドメイン)33における参照CARとを比較した。新型IgG3バリアントと第1世代IgG3バリアントは同程度の良好な抗原特異的増殖を示した一方、CD8αバリアントは小さな増殖能を表したのみであった。CD8αバリアントのこの弱い応答は、顕著に低減した細胞傷害性及びサイトカイン分泌にも置き換えられた一方、第1世代及び新型IgG3バリアントは、同様に効果的な挙動を示した(図20A～図20C)。
(実施例17) 新型IgG3フォーマットCD19特異的CAR T細胞のin vitro機能及びCD8αフォーマットとの比較
さらなる実験の組において、本発明者らは、新型IgG3フォーマットで操作したCD19特異的CAR T細胞(FMC63 scFv)と、最適の第1世代IgG3バリアント及び広く適用されるCD8αの設定(CD8αヒンジ及び膜貫通ドメイン)33における参照CARとを比較した。
第1世代IgG3バリアントとCD19特異的CARの新型IgG3バリアントとの間で、in vitroの増殖、細胞傷害性、及びサイトカインの産生における明白な相違は起こらなかった一方、CD8α対照バリアントは弱い応答を表した(図21A～図21C)。
(実施例18) さらなる新型IgG3フォーマットCAR T細胞のin vitro細胞傷害機能及びCD8αフォーマットとの比較
本発明者らは、ROR1 (4-2 scFv)、FLT3(4G8及びBV10 scFv)、及びSiglec-6(JML-1_scFv)を標的とするさらなるCARの最適化されたIgG3バリアントを備えるT細胞の細胞傷害能を検討し、それらを、広く適用されるCD8αの設定(CD8αヒンジ及び膜貫通ドメイン)33において構築された同じscFvを有するCARと比較した。全ての新型IgG3バージョンは、CD8αバージョンと比較して、有意に増強された細胞傷害能を呈した(図22A～図22D)。
(実施例19) 新型IgG3フォーマットCAR T細胞のin vivo機能及びCD8αフォーマットとの比較
次に、本研究者らは、本研究者らの新型IgG3 CARフォーマットのCD8α対照に対する優位性がin vivoにおけるより良い抗腫瘍有効性に置き換えられるか否かを検討することを目的とした。即ち、NSGマウスに1×106個のffluc/GFP+ Raji腫瘍細胞を移植し、7日目に5×106個(CD8+:CD4+の比1:1)の対照T細胞又はCD19特異的CAR T細胞で処置した。臨床的に用いられるCD8α CARによる処置では対照のT細胞群と比較して腫瘍成長の遅延及び処置されたマウスの生存の中程度の延長のみがもたらされた一方、新型IgG3フォーマットCAR T細胞の適用では、有意に増強された生存を伴う完全な腫瘍の根絶がもたらされた(図23A～図23C)。
(実施例20) in vitro及びin vivoにおけるスペーサーに指向されるCAR T細胞の活性化及び拡大
プレコートした抗体よりも実行可能な特異的な刺激及び拡大の方法の探索において、本研究者らは、標的ドメインとして抗MiH1 scFvを備えるIgG4由来スペーサーを有するCARを生成し、この「抗CAR」をK562細胞に安定的に導入した。本発明者らは、抗CARを有する照射したK562をT細胞の拡大に用い、これを、照射したTM-EBV-LCLフィーダー細胞を用いるよく確立された拡大プロトコルと比較した。CD19特異的CARの新型IgG3バージョンを備えるCD4+とCD8+のT細胞の両方は、両方のプロトコルで14日後に、250倍の拡大の範囲において同様の拡大速度論を呈した。対照的に、形質導入していない対照T細胞は、TM-EBV-LCLフィーダー細胞プロトコル及びOKT3を適用した場合のみに成功裡に拡大した(図24)。
次に、本発明者らは、T細胞がin vivoで活性化できるかを試験した。即ち、NSGマウスに1×107個のGFP/ffluc+ CAR T細胞(新型IgG3フォーマット)を接種し、8日後に、マウスに1×107個のK562又は抗CARを有するK562を注射した。K562で処置したマウスではBLIシグナルが更に低下した一方、抗CARで処置したマウスではBLIシグナルが増強された(図25)。これらの結果は、in vitro並びにin vivoにおいて、新型フォーマットのIgG3系CARを有するCAR T細胞が効率的に活性化され、抗原非依存的にしかしCAR特異的に、多くの数に拡大され得ることを示唆している。
(実施例21) in vitroにおける枯渇
本発明者らは、T細胞に上述の抗CAR(IgG4ヒンジ由来のスペーサー)を設けた。標的細胞として新型フォーマットのIgG3 CARを形質導入したT細胞を用いる細胞傷害性実験において、これらの標的細胞は、自己並びに同種の設定における抗CARを有するT細胞によって特異的に認識されて除去され(図26A～図26D)、CAR T細胞は、潜在的に「即使用可能」であっても、他のCARTによって標的とされ除去され得ることを示唆している。
(実施例22) in vivoにおける枯渇
次に本研究者らは、枯渇がin vivoでも可能か否かを検討した。即ち、本研究者らは、CD19 CARの新型IgG3フォーマットバージョンを形質導入したCD4+及びCD8+のT細胞をホタルルシフェラーゼ/GFP融合タンパク質とともに用いて、マウスのT細胞の生物発光イメージングを可能にした。標的T細胞を接種し、24時間後にマウスを模擬又は抗CAR CD8+ T細胞と2:1のE:T比で処置した。全体の発光シグナルは徐々に低減していたが、抗CAR処置群のマウスは有意に低い輝度を示し、それによりin vivoにおけるCAR T細胞の数の有意な低減が証明された。これは、必要であれば治療の状況において用いることができる(図26E～図26F)。
産業上の利用可能性
本発明による使用のための免疫細胞、並びに本発明の方法のために用いられる材料は、医薬及び診断薬の製品の製造のための既知の標準に従って工業的に製造され、特許を請求する方法及び使用のため(例えば本明細書で定義するがんの処置のため)の製品として販売され得る。したがって、本発明は産業上、利用可能である。
［参考文献］
Figure 2022538397000006
Figure 2022538397000007

Claims (51)

1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフを含む免疫受容体であって、IgG3 CH2及び/又はCH3ドメインを含まない前記免疫受容体。
[A-Bn]
(式中、
Aは配列番号2のアミノ酸配列であり、
Bは前記IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフであり、前記モチーフは配列番号1のアミノ酸配列を有し、
nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及び15からなる群から選択され、好ましくは1～15の間の整数、より好ましくは1～10の間の整数、更により好ましくは1～5の間の整数、最も好ましくは3～5の間の整数である)
のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、又は最も好ましくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の免疫受容体。
[A-Bn]のアミノ酸配列と100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の免疫受容体。
nが1～10の間の整数である、請求項2又は3に記載の免疫受容体。
nが1～5の間の整数である、請求項2又は3に記載の免疫受容体。
nが3～5の間の整数である、請求項2又は3に記載の免疫受容体。
細胞外抗原結合ドメインと、
スペーサードメインと、
膜貫通ドメインと、
細胞内シグナル伝達ドメインと
を含み、
スペーサードメインが、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置し、
場合によりスペーサードメインが、1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の免疫受容体。
膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインが共に、配列番号109、110、111、112、113、114、115及び174からなる群から選択される配列からなる、請求項7に記載の免疫受容体。
第1のドメインと、
リンカーと、場合により、
第2のドメインと
を含む細胞外抗原結合ドメインを含み、
場合により、リンカーが第1のドメインと第2のドメインの間に位置し、
場合によりリンカーが1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の免疫受容体。
スペーサードメインが、1つ若しくは複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含み、
及び/又は
細胞外抗原結合ドメインに含まれるリンカーが、1つ若しくは複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含む、
請求項7、8又は9に記載の免疫受容体。
T細胞受容体(TCR)、好ましくは組換えTCR; B細胞受容体(BCR)、好ましくは組換えBCR;及びキメラ抗原受容体(CAR)からなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の免疫受容体。
免疫受容体が抗原結合ドメインを含み、
I)第1のドメインが重鎖可変ドメインを含む、
II)第1のドメインが軽鎖可変ドメインを含む、
III)第1のドメインが重鎖可変ドメインを含み、第2のドメインが軽鎖可変ドメインを含む、
IV)第1のドメインが重鎖可変ドメインを含み、第2のドメインが重鎖可変ドメインを含む、又は
V)第1のドメインが軽鎖可変ドメインを含み、第2のドメインが軽鎖可変ドメインを含む、請求項9から11のいずれか一項に記載の免疫受容体。
免疫受容体が抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、一本鎖可変断片(scFv)の一部である第1のドメイン、リンカー、及び第2のドメインを含み、
scFvが場合により、第1/第2のドメインに含まれる重鎖/軽鎖可変配列として、以下の抗原の1つに特異的なscFvの重鎖/軽鎖可変配列を含み:
A) CD19、場合により、
i)重鎖可変ドメインは、配列番号27に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号28に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、CD19に特異的に結合することができる、又は
ii)重鎖可変ドメインは配列番号27のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号28のアミノ酸配列を有する;
B) CD20、場合により、
i)重鎖可変ドメインは、配列番号30に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号29に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、CD20に特異的に結合することができる、又は
ii)重鎖可変ドメインは配列番号30のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号29のアミノ酸配列を有する;
C) ROR1、場合により、
i)それぞれ、重鎖可変ドメインは、配列番号31、33、35、若しくは37に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号32、34、36、若しくは38に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、ROR1に特異的に結合することができる、又は
ii)それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号31、33、35、若しくは37のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号32、34、36、38のアミノ酸配列を有する;
D)ROR2、場合により、
i)重鎖可変ドメインは、配列番号39に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号40に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、ROR2に特異的に結合することができる、又は
ii)重鎖可変ドメインは配列番号39のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号40のアミノ酸配列を有する;
E) SLAMF7、場合により、
i)それぞれ、重鎖可変ドメインは、配列番号41若しくは43に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号42若しくは44に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、SLAMF7に特異的に結合することができる、又は
ii)それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号41若しくは43のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号42若しくは44のアミノ酸配列を有する;
F) FLT3、場合により、
i)それぞれ、重鎖可変ドメインは、配列番号45若しくは47に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号46若しくは48に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、FLT3に特異的に結合することができる、又は
ii)それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号45若しくは47のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号46若しくは48のアミノ酸配列を有する;
G) Siglec-6、場合により、
i)重鎖可変ドメインは、配列番号49に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号50に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、Siglec-6に特異的に結合することができる、又は
ii)重鎖可変ドメインは配列番号49のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号50のアミノ酸配列を有する;
H)αvβ3インテグリン、場合により、
i)それぞれ、重鎖可変ドメインは、配列番号51若しくは53に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号52若しくは54に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、αvβ3インテグリンに特異的に結合することができる、又は
ii)それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号51若しくは53のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号52若しくは54のアミノ酸配列を有する;
又は
I) BCMA、場合により、
i)それぞれ、重鎖可変ドメインは、配列番号55若しくは57に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
軽鎖可変ドメインは、配列番号56若しくは58に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
scFvは、BCMAに特異的に結合することができる、又は
ii)それぞれ、重鎖可変ドメインは配列番号55若しくは57のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインは配列番号56若しくは58のアミノ酸配列を有する、
請求項9から12のいずれか一項に記載の免疫受容体。
免疫受容体が、抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、以下のscFvを含み:
I) CD19に特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号3若しくは71に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CD19に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号3若しくは71のアミノ酸配列を有する;
II) CD20に特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号4若しくは72に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CD20に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号4若しくは72のアミノ酸配列を有する;
III) ROR1に特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号5、6、7、8、73、74、75、76、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99若しくは100に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ROR1に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号5、6、7、8、73、74、75、76、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99若しくは100のアミノ酸配列を有する;
IV) ROR2に特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号9、77、101、102、103、104、105、106、107若しくは108に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ROR2に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号9、77、101、102、103、104、105、106、107若しくは108のアミノ酸配列を有する;
V) SLAMF7に特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号10、11、78若しくは79に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、SLAMF7に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号10、11、78若しくは79のアミノ酸配列を有する;
VI) FLT3に特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号12、13、80若しくは81に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、FLT3に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号12、13、80若しくは81のアミノ酸配列を有する;
VII) Siglec-6に特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号14若しくは82に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Siglec-6に特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号14若しくは82のアミノ酸配列を有する;
VIII)αvβ3インテグリンに特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号15、16、83若しくは84に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、αvβ3インテグリンに特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号15、16、83若しくは84のアミノ酸配列を有する;
IX) BCMAに特異的なscFv、場合により、前記scFvは、配列番号17、18、85若しくは86に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、BCMAに特異的に結合することができる、又は前記scFvは、配列番号17、18、85若しくは86のアミノ酸配列を有する、
請求項9から13のいずれか一項に記載の免疫受容体。
キメラ抗原受容体(CAR)である、請求項1から14のいずれか一項に記載の免疫受容体。
1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフが、
I)ヒトIgG3中央部ヒンジ由来であり、並びに/又は
II)配列番号1のアミノ酸配列からなり、並びに/又は
III) IgG1ヒンジドメイン及び/若しくはIgG4ヒンジドメインのリピートと比べて免疫原性が低減している、請求項1から15のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCAR。
I)ヒトIgG3ヒンジドメインの下部ヒンジドメインの配列の全部若しくは一部を含まず、
II) [A-Bn]
(式中、
Aは配列番号2のアミノ酸配列であり、
Bは前記IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフであり、前記モチーフは配列番号1のアミノ酸配列を有し、
nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及び15からなる群から選択され、好ましくは1～15の間の整数、より好ましくは1～10の間の整数、更により好ましくは1～5の間の整数、最も好ましくは3～5の間の整数である)
のアミノ酸配列と
少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、若しくは最も好ましくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
III) IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10回含み、及び/又は
IV)前記1つ若しくは複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まないという点で第1のCARと異なる第2のCARと比べて免疫原性が低減している、請求項1から16のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCAR。
互いに隣接する前記IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフの少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つを含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCAR。
配列番号116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、及び171からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から18のいずれか一項に記載のCAR。
請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARをコードする核酸。
請求項20に記載の核酸を含む、細胞。
I)細胞が、免疫細胞、好ましくはB細胞、マクロファージ、NK細胞若しくはT細胞、より好ましくはT細胞、更により好ましくはCD4+及び/若しくはCD8+ T細胞であり、
II)細胞が、請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体若しくはCARを発現し、
III)細胞が、ゲノムに安定に組み込まれた核酸を含み、並びに/又は
IV)細胞に含まれる核酸がエピソームベクターに含まれる、請求項21に記載の細胞。
癌、自己免疫疾患、感染症又は変性疾患を処置する方法において使用するための、請求項1から22のいずれか一項に記載の核酸、核酸を含む細胞、免疫受容体、又はCAR。
疾患が癌であり、癌が血液癌又は固形癌であり、
場合により、血液癌が、白血病又はリンパ腫、好ましくは急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、又はびまん性大細胞型B細胞リンパ腫であり、
場合により、固形癌が、乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓若しくは前立腺癌、又は神経膠芽腫である、請求項23に記載の使用のための免疫受容体、CAR、核酸又は核酸を含む細胞。
配列番号1のアミノ酸配列の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つのリピートからなる配列によって含まれるエピトープに結合することができ、場合により、少なくとも2つのリピートが互いに隣接している、抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマー。
請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARに結合することができる、請求項25に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマー。
請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを刺激することができる、請求項26に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマー。
抗体又はその断片、好ましくはモノクローナル抗体又はその断片である抗原結合タンパク質である、請求項25から27のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマー。
a)配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変領域であって、配列番号20のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号21のアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号22のアミノ酸配列を有するCDR3を好ましくは含有する前記重鎖可変領域と、
b)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変領域であって、配列番号24のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号25のアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号26のアミノ酸配列を有するCDR3を好ましくは含有する前記軽鎖可変領域と
を含む、請求項25から28のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞の精製、検出、枯渇、刺激、拡大、又は濃縮のための、請求項25から29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマーの使用。
抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマーを、請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞に結合させる工程を含む方法であって、好ましくは、結合が、前記免疫受容体若しくはCARに含まれるIgG3中央部ヒンジリピートドメインへの特異的結合であり、及び/又は、抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーが、請求項25から29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーである、前記方法。
請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞の精製方法であって、
A)キメラ抗原受容体を発現している細胞を場合により得る工程と、
B)細胞によって発現された免疫受容体又はCARに抗体、ストレプタマー又はアプタマーが結合できるようにする条件下で、請求項25から29のいずれか一項に記載の前記抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマーである一次抗体、ストレプタマー又はアプタマーと前記細胞をインキュベートする工程と、
C)抗体結合細胞、ストレプタマー結合細胞又はアプタマー結合細胞を非結合細胞から分離して、精製細胞を得る工程と
を含む、前記方法である、請求項31に記載の方法。
工程Cが、工程Bの細胞を、抗体、ストレプタマー又はアプタマーに結合することができる実体とインキュベートする工程を含み、
I)実体が、より好ましくは蛍光マーカー;若しくはビーズ、より好ましくは磁気ビーズで標識された好ましくは二次抗体であり、
II)一次抗体、ストレプタマー若しくはアプタマーが標識され、標識は好ましくはタグ若しくは蛍光色素であり、
III)工程Cの分離がMACS若しくはFACSの手段によって実施され、及び/又は
IV)分離がストレプタマー若しくはアプタマーを使用して実施される、
請求項32に記載の精製方法。
請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞の枯渇方法であって、
A)免疫受容体又はCARを発現している細胞を場合により得る工程と、
B)前記細胞を、細胞傷害性分子に結合された請求項25から29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマーとインキュベートする工程と
を含む、前記方法である、請求項31に記載の方法。
請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞のa)刺激及び/又はb)拡大方法であって、
A)免疫受容体又はCARを発現している細胞を場合により得る工程と、
B)場合により、抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーが固相に結合される、又は抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーが細胞の表面で発現される、請求項25から29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマーと前記細胞をインキュベートする工程と
を含む、前記方法である、請求項31に記載の方法。
I)固相が、組織培養表面若しくはビーズ、好ましくは磁気ビーズであり、及び/又は
II)固相が、ポリマー、好ましくはデンプン若しくは糖からなる足場である、
請求項35に記載の刺激又は拡大方法。
請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞の濃縮方法であって、
A)請求項35又は36に記載の方法により細胞を刺激及び/又拡大する工程と
B)請求項32又は33に記載の方法により工程Aの細胞を精製する工程と
を含む、前記方法である、請求項31に記載の方法。
インビトロでの方法又は使用である、請求項30から37のいずれか一項に記載の方法又は使用。
手術若しくは治療によるヒト若しくは動物の身体を処置するための方法、又はヒト若しくは動物の身体で行われる診断法を含まない、請求項30から38のいずれか一項に記載の方法又は使用。
請求項25から29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマー、又は前記抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーの全部若しくは一部を含むキメラ抗原受容体を発現している細胞を含む医薬組成物であって、薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤を場合により更に含む前記組成物。
請求項25から29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマー、又は前記抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーの全部若しくは一部を含むキメラ抗原受容体を発現している細胞、又は請求項40に記載の医薬組成物であって、
細胞傷害性分子に結合された前記抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマー、又は前記抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマーの前記全部若しくは一部を含む前記キメラ抗原受容体を発現している細胞を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARを発現している細胞枯渇の治療法において使用するための、
前記抗原結合タンパク質、ストレプタマー若しくはアプタマー、又は前記細胞、又は前記医薬組成物。
請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫受容体又はCARと、請求項25から27のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、ストレプタマー又はアプタマーとを含む、キット。
1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフを含む、二重特異性抗体。
1つ又は複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフが、
I)ヒトIgG3中央部ヒンジ由来であり、並びに/又は
II)配列番号1のアミノ酸配列からなり、並びに/又は
III) IgG1ヒンジドメイン及び/若しくはIgG4ヒンジドメインのリピートと比べて免疫原性が低減している、請求項43に記載の二重特異性抗体。
I)ヒトIgG3ヒンジドメインの下部ヒンジドメインの配列の全部若しくは一部を含まず、
II) [A-Bn]
(式中、
Aは配列番号2のアミノ酸配列であり、
Bは前記IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフであり、前記モチーフは配列番号1のアミノ酸配列を有し、
nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及び15からなる群から選択され、好ましくは1～15の間の整数、より好ましくは1～10の間の整数、更により好ましくは1～5の間の整数、最も好ましくは3～5の間の整数である)
のアミノ酸配列と
少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、若しくは最も好ましくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
III) IgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10回含み、及び/又は
IV)前記1つ若しくは複数のIgG3中央部ヒンジドメインリピートモチーフを含まないという点で第1の二重特異性抗体とは異なる第2の二重特異性抗体と比べて免疫原性が低減している、請求項43又は44に記載の二重特異性抗体。
免疫受容体が、[A-Bn]のアミノ酸配列と100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項43から45のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
nが1～10の間の整数である、請求項45又は46に記載の二重特異性抗体。
nが1～5の間の整数である、請求項45又は46に記載の免疫受容体。
nが3～5の間の整数である、請求項45又は46に記載の免疫受容体。
少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つのIgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフを含み、場合により、前記IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフの少なくとも2つが互いに隣接している、請求項43から49のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
IgG3中央部ヒンジリピートドメインモチーフが、マウスIgG3中央部ヒンジリピートドメインではない、請求項1から24又は31から50のいずれか一項に記載の免疫受容体、CAR、核酸、細胞、方法、医薬組成物、キット又は二重特異性抗体。
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