TW202413432A - 針對程式化死亡-1蛋白的單株抗體及其於醫學上的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明是有關能夠結合至免疫檢查點蛋白程式化死亡-1 (PD-1) (諸如人類PD-1)的抗體，或編碼此等抗體的核酸，其中該等抗體在Fc區中包含消除或減少抗體之Fc媒介的效應子功能的修飾。本發明還有關包含該等抗體或核酸的組成物或套組，以及這些抗體或核酸或組成物在醫學領域中、較佳在免疫治療領域中例如用於治療癌症的用途。本發明進一步有關在個體中誘導免疫反應的方法，包含向個體提供本發明抗體或一或多種編碼此一抗體的核酸，或包含該抗體或核酸的組成物。

Description

針對程式化死亡-1蛋白的單株抗體及其於醫學上的用途
本發明是有關能夠結合、較佳特異地結合至免疫檢查點蛋白程式化死亡-1(PD-1) (諸如人類PD-1)的抗體，或編碼此等抗體的核酸，其中該等抗體在Fc區中包含消除或減少抗體之Fc媒介的效應子功能的修飾。本發明還有關包含該等抗體或核酸的組成物或套組，以及這些抗體或核酸或組成物在醫學領域、較佳在免疫治療領域中用於治療癌症的用途。本發明進一步有關在個體中誘導免疫反應的方法，包含向個體提供能夠結合至免疫檢查點蛋白PD-1(諸如人類PD-1)的抗體，或編碼此一抗體的核酸，或包含該抗體或核酸的組成物。
免疫療法旨在患者體內增強或誘導特異性免疫反應，以便控制傳染病或惡性疾病。越來越多的病原體和腫瘤相關抗原(TAA)的辨認能夠廣泛收集免疫治療的合適目標。呈遞衍生自這些抗原的免疫原性肽(表位)的細胞可以透過主動性或被動性免疫策略而被特異地靶向。主動性免疫傾向於誘導並擴增患者體內的抗原特異性T細胞，這些T細胞能夠特異地辨識並殺死罹病細胞。相比之下，被動性免疫可能仰賴於T細胞的授受性轉移，這些T細胞在活體外進行擴增並視情況進行基因改造(授受性T細胞治療)。
在脊椎動物中，免疫系統的演化產生了基於以下兩種防禦類型的高效網絡：先天性免疫和授受性免疫。演化的古老先天性免疫系統依賴於辨識與病原體相關的常見分子模式的不變受體，與之相反，授受性免疫是基於B細胞(B淋巴細胞)和T細胞(T淋巴細胞)上的高度特異性抗原受體和純系選擇。免疫系統在癌症的發展、進展和治療期間扮演著至關重要的角色。CD8 +T細胞和NK細胞可以直接溶解腫瘤細胞，而這些細胞的高腫瘤浸潤通常被認為有利於各種腫瘤疾病的結局。CD4 +T細胞透過分泌IFNγ或允許抗原呈遞樹突狀細胞(DC)來促進抗腫瘤免疫反應，從而啟動且活化CD8 +T細胞(Kreiter S. et al.Nature 520, 692-6 (2015))。CD8 +T細胞對腫瘤細胞的辨識和消除取決於經由第I類主要組織相容性複合體(MHC)呈遞抗原。抗原特異性T細胞反應可以因為疫苗接種而被引發 。疫苗接種可以透過施用疫苗RNA來實現，疫苗RNA也就是編碼被誘導之免疫反應所要針對的抗原或表位的RNA。
不僅透過抗原受體(TCR)進行刺激，透過結合的刺激分子基團(例如CD28)進行額外的刺激誘導也是活化T細胞所必需的。癌細胞可以透過上調抑制性免疫檢查點蛋白(諸如T細胞上的PD-1和CTLA-4，或腫瘤細胞、腫瘤基質或腫瘤微環境中的其他細胞上的PD-L1)來避免和抑制免疫反應。CTLA4和PD-1已知可傳遞抑制T細胞活化的信號。用單株抗體阻斷這些蛋白質的活性，從而恢復T細胞功能，已經為對抗癌症帶來突破性治療。
PD-1 (也稱為CD279)是一種表現於經活化T細胞、B細胞與單核細胞表面上的免疫調節受體。蛋白質PD-1有兩個天然存在的配體，稱為PD-L1 (也稱為CD274)和PD-L2 (也稱為CD273)。許多癌症都表現PD-L1，包括黑色素瘤、肺癌、腎癌、膀胱癌、食道癌、胃癌和其他癌症。因此，在癌症中，PD-1/PD-L1系統可以在PD-L1與PD-1交互作用後抑制T淋巴細胞的增生、細胞介素的釋放和細胞毒性，從而為癌細胞提供避免T細胞媒介的免疫反應。
適於調節PD-1/PD-L1軸活性的單株抗體是已知的。PD-1/PD-L1交互作用可以受到派姆單抗(pembrolizumab) (也稱為MK-3475、蘭博利珠單抗(lambrolizumab)或Keytruda)所抑制。另一種適合這個目的之單株抗體是納武單抗(nivolumab) (也稱為ONO-4538、BMS-936558或Opdivo)。
與傳統藥物相比，基於抗體的癌症治療具有特異性更高且副作用更低的潛力，因此可能比傳統治療更為有利。但是因為活化免疫系統，免疫檢查點抑制劑也可能在一些患者中引起自體免疫副作用。其他患者可能對治療沒有反應。
此外，抗PD-1抗體有減輕自體免疫疾病的潛力，同時不會附帶抑制正常免疫。例如，與免疫毒素偶聯的抗PD-1結合片段能夠延遲自體免疫糖尿病的疾病發作，並在小鼠中改善自體免疫腦脊髓炎模型的症狀(Zhao P. et al.Nat Biomed Eng. 3(4): 292–305 (2019))。
導致Fc區與例如Fc-γ受體和C1q的交互作用被消除的抗體Fc區的修飾是本領域已知的。例如，在IgG1同型抗體中，可受到修飾的胺基酸位置的實例包括位置L234、L235和P331。其組合(諸如L234F/L235E/P331S)可以引起與人類CD64、CD32、CD16和C1q的結合顯著降低(Xu et al., 2000, Cell Immunol. 200(1):16-26；Oganesyan et al., 2008, Acta Cryst. (D64):700-4)。另外，L234F和L235E胺基酸取代可導致Fc區與Fc-γ受體和C1q的交作用被消除(Canfield et al., 1991, J. Exp. Med. (173):1483-91；Duncan et al., 1988, Nature (332):738-40)。D265A胺基酸取代可以減少與所有Fcγ受體的結合並防止ADCC (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276):6591-604)。透過使位置D270、K322、P329和P331突變可以消除與C1q的結合。將這些位置突變成D270A或K322A或P329A或P331A可以使抗體缺乏CDC活性(Idusogie EE, et al., 2000, J Immunol. 164: 4178-84)。
因此，儘管與免疫檢查點抑制劑治療相關的益處令人印象深刻，但對開發出靶向這些檢查點的改良抗體並為免疫治療(特別是癌症免疫治療)提供進一步益處仍有需求。
本發明大體上提供可用作為治療劑的抗體，其用於治療及/或預防疾病，諸如癌症或傳染病。治療旨在活化免疫系統及/或誘導免疫反應。
本發明的抗體顯示出對PD-1，較佳地對人類PD-1的結合特徵，以及阻斷PD-1/PD-L1交互作用的能力，使得它們能夠誘導免疫反應。
本發明的抗體可能具有以下性質中的一或多者：本發明抗體(i)結合，較佳特異地結合至PD-1；(ii)可能對免疫細胞上的PD-1具有結合性質；(iii)可能對PD-1表位具有結合性質；(iv)可能對非人類PD-1變體(特別是與來自小鼠、大鼠、兔和靈長類動物的PD-1變體)具有結合性質；(v)可防止或減少PD-1誘導抑制性信號；(vi)可能抑制PD-1的配體與PD-1，較佳配體PD-L1與PD-1的交互作用/結合，從而阻斷抑制性PD-1/PD-L1軸，例如它們可抑制人類PD-L1結合至人類PD-1；(vii)可抑制PD-L1或PD-L2的免疫抑制信號；(viii)可增強或啟動免疫功能，較佳藉由增強或啟動T細胞媒介的免疫反應，較佳藉由誘導CD8 +細胞增生；(ix)可抑制癌症增生；(x)可消耗腫瘤細胞及/或抑制癌症轉移；及/或(xi)可消耗免疫細胞及/或改善自體免疫疾病。因此，能夠結合至PD-1的本發明抗體可抑制PD-1的免疫抑制信號及/或可消耗活化的免疫細胞，從而可以改善自體免疫疾病。
本發明抗PD-1抗體具有降低或耗盡的Fc媒介的效應子功能。消除或減少抗體Fc區結合至Fcγ受體對於避免對治療性抗體的不樂見發炎反應可能是理想的。例如，Fc媒介的效應子功能降低或耗盡可幫助避免對例如通常表現PD-1的T細胞的潛在毒性。儘管可以透過使用scFv或抗體的Fab片段來消除或降低Fcγ受體的結合，但如果出於治療目的需要以增加抗體半衰期形式的藥物動力學活性，則可能偏好全長抗體。因此，包含提供Fc媒介的效應子功能降低或耗盡的經修飾Fc區的抗體可能是理想的。
在第一態樣中，提供一種能夠結合至PD-1的抗體，其中該抗體包含具有重鏈恆定區(CH)和重鏈可變區(VH)的重鏈，其中重鏈恆定區根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234的位置處包含芳族或非極性胺基酸，以及根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置236的位置處包含甘胺酸以外的胺基酸。
第一態樣的抗體在Fc區中包含至少兩個修飾。當抗體包含此等修飾時，它可能變成惰性或非活化抗體。如本文所用，術語「惰性(inertness、inert)」或「非活化」是指至少不能更結合任何Fcγ受體、誘導Fc媒介的FcR交聯，或經由個別抗體的兩個Fc區誘導FcR媒介的目標抗原交聯，或者不能結合C1q的Fc區。
在第一態樣的一個具體例中，提供一種能夠結合至PD-1的抗體，該抗體包含具有重鏈恆定區(CH)和重鏈可變區(VH)的重鏈，其中重鏈恆定區根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234的位置處包含芳族或非極性胺基酸，以及根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置236的位置處包含甘胺酸以外的胺基酸，其中重鏈可變區(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中HCDR1序列選自具有或包含SYN、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的序列，HCDR2序列選自具有或包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的序列，而HCDR3序列選自具有或包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的序列。
在第一態樣的一個具體例中，提供一種能夠結合至PD-1的抗體，該抗體包含具有重鏈恆定區(CH)和重鏈可變區(VH)的重鏈，其中重鏈恆定區根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234的位置處包含芳族或非極性胺基酸，以及根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置236的位置處包含甘胺酸以外的胺基酸，其中抗體包含具有輕鏈可變區(VL)的輕鏈，該輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中LCDR1序列選自具有或包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的序列，LCDR2序列選自具有或包含QAS或SEQ ID NO:15的序列，而LCDR3序列是具有或包含SEQ ID NO:14的序列。
在第一態樣的一個具體例中，提供一種能夠結合至PD-1的抗體，該抗體包含具有重鏈恆定區(CH)和重鏈可變區(VH)的重鏈，以及具有輕鏈可變區(VL)的輕鏈，其中重鏈恆定區根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234的位置處包含芳族或非極性胺基酸，以及根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置236的位置處包含甘胺酸以外的胺基酸，重鏈可變區(VH)包含HCDRl、HCDR2和HCDR3序列，其中HCDRl序列選自具有或包含SYN、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的序列，HCDR2序列選自具有或包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的序列，而HCDR3序列選自具有或包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的序列，且輕鏈可變區(VL)包含LCDRl、LCDR2和LCDR3序列，其中LCDRl序列選自具有或包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的序列，LCDR2序列選自具有或包含QAS或SEQ ID NO：15的序列，而LCDR3序列是具有或包含SEQ ID NO：14的序列。
例如，第一態樣之能夠結合至PD-1的抗體可包含具有重鏈恆定區(CH)和重鏈可變區(VH)的重鏈，以及具有輕鏈可變區(VH)的輕鏈，其中重鏈恆定區根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234的位置處包含芳族或非極性胺基酸(例如苯丙胺酸(F))，視情況根據EU編號在人類IgG1重鏈中對應於位置235的位置處包含酸性胺基酸(例如麩胺酸(E))，以及根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置236的位置處包含甘胺酸以外的胺基酸(例如精胺酸(R))，其中重鏈可變區(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中HCDR1序列選自具有或包含SYN、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的序列，HCDR2序列選自具有或包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的序列，而HCDR3序列選自具有或包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的序列，及/或其中輕鏈可變區(VL)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中LCDR1序列選自具有或包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的序列，LCDR2序列選自具有或包含QAS或SEQ ID NO：15的序列，而LCDR3序列是具有或包含SEQ ID NO：14的序列。
在第二態樣中，提供一種能夠生產第一態樣之抗體的融合瘤。
在第三態樣中，提供一種包含偶聯至某個部分或藥劑的第一態樣之抗體的接合物。
在第四態樣中，提供一種多聚體，其包含至少兩個第一態樣的抗體或至少兩個第三態樣的接合物或第一態樣的一或多個抗體與第三態樣的一或多個接合物的混合物。
在第五態樣中，提供一種包含編碼以下的基因或核酸序列的核酸： -第一態樣的抗體或其片段； -第一態樣的抗體的抗體重鏈或其片段；或 -第一態樣的抗體的抗體輕鏈或其片段。
所編碼的抗體及/或所編碼的抗體重鏈或輕鏈可能各自是如本文所述的鏈，例如如根據第一態樣之具體例所描述的。
在第六態樣中，提供一種包含第五態樣之一或多個核酸的載體。
在第七態樣中，提供一種包含第五態樣之核酸或包含第六態樣之載體的宿主細胞。
在第八態樣中，提供一種包含第五態樣之核酸或包含第六態樣之載體的病毒。
在第九態樣中，提供一種組成物，較佳為醫藥組成物，其包含活性劑和醫藥上可接受的載劑，其中活性劑是選自以下中的至少一者： (i)第一態樣的抗體； (ii)第三態樣的接合物； (iii)第四態樣的多聚體； (iv)第五態樣的核酸或第五態樣的核酸的組合； (v)第六態樣的載體或第六態樣的載體的組合； (vi)第七態樣的宿主細胞或第七態樣的宿主細胞的組合；及/或 (vii)第八態樣的病毒或第八態樣的病毒的組合。
在第十態樣中，提供一種第九態樣的醫藥組成物，其用於預防性及/或治療性治療疾病。
在第十一態樣中，提供一種在個體中治療或預防疾病的方法，包含向個體投予至少一種活性劑，其中活性劑是選自以下中的至少一者： (i)第一態樣的抗體； (ii)第三態樣的接合物； (iii)第四態樣的多聚體； (iv)第五態樣的核酸或第五態樣的核酸的組合； (v)第六態樣的載體或第六態樣的載體的組合； (vi)第七態樣的宿主細胞或第七態樣的宿主細胞的組合；及/或 (vii)第八態樣的病毒或第八態樣的病毒的組合。
在第十二態樣中，提供一種在樣品中用於定性或定量偵測PD-1的套組，其中套組包含第一態樣的抗體或第三態樣的接合物或第四態樣的多聚體。
在第十三態樣中，提供第一態樣的抗體或第三態樣的接合物或第四態樣的多聚體或第十二態樣的套組在確定於樣品中表現之PD-1的存在或數量的方法中的用途，該方法包含以下步驟： (i)使樣品與抗體或接合物或多聚體接觸，以及 (ii)偵測抗體或接合物或多聚體與PD-1之間複合物的形成及/或測定複合物數量。
本發明的上述態樣的具體例、其他特徵和優點將從以下詳細說明和申請專利範圍變得清晰。涉及一個態樣的具體例可以按照任何方式並按照任何數量與本文描述的任何其他態樣組合。除非上下文另有指示，否則本件申請案中所有描述的元素和特徵的任何排列和組合應被認為由本件申請案的發明說明所揭示。
下面提供序列和SEQ ID NO的參考內容，其特別顯示在序列表中。另外，參考本文所述第一態樣的抗體的特定實例，但不限於本公開內容： MAB-19-0202和MAB-19-0618。第一態樣的這些例示性但非限制性抗體在本文中藉由參考抗體的名稱來指定。 表1-序列
儘管下面詳細說明了本發明，但是應當理解，本發明不限於本文所述的特定方法、方案和試劑，因為這些可能都會改變。還應理解，本文所使用的術語僅作為說明特定具體例為目的，並不希望限制本發明的範疇，本發明的範疇將僅由隨附申請專利範圍所囿限。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語與技藝中具有通常技術者一般理解的含義相同。
在下文中，將說明本發明的元件。這些元件與特定具體例一起列出，然而應當理解，它們可以按任何方式並按任何數量組合以創造出更多具體例。不同描述的實例和具體例不應被解釋為將本發明僅侷限於明確描述的具體例。此說明應當被理解為支持並含括將明確描述的具體例與任何數量的揭示及/或較佳元件相組合的具體例。此外，除非上下文另有說明，否則本件申請案中所有描述元件的任何排列與組合都應被認為是本說明書所揭示的。
較佳地，本文使用的術語定義如「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland中所述。
除非另有說明，否則本發明的實施將採用化學、生物化學、細胞生物學、免疫學和重組DNA技術的常規方法，這些方法在該領域的文獻中予以解釋(參見例如 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989)。
除非上下文另有要求，否則本說明書和隨後申請專利範圍通篇單詞「包含」以及諸如「包含(comprises)」和「包含(comprising)」的變化形式將被理解為暗示包括所規定的成員、整數或步驟或成組成員、整數或步驟，但不排除任何其他成員、整數或步驟或成組成員、整數或步驟，儘管在一些具體例中可以排除這樣的其他成員、整數或步驟或成組成員、整數或步驟，即請求標的在於包含規定的成員、整數或步驟或成組成員、整數或步驟。除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，否則在說明本發明的上下文中(尤其是在申請專利範圍的上下文中)所用的術語「一(a和an)」和「該(the)」以及類似的參考用語將被解釋為涵蓋單數和複數。本文引用的數值範圍僅希望用作單獨提及落入該範圍內的每個單獨數值的速記方法。除非本文另有指明，否則每個單獨數值都被併入說明書中，如同其在本文中被單獨列舉一樣。
除非本文另有指明或與上下文明顯矛盾，否則本文描述的所有方法可以按任何合適的順序進行。本文提供的任何和所有實例或例示性語言(例如「諸如」)的使用僅希望更為充分闡明具體例，且不對申請專利範圍的範疇構成限制。說明書中的任何語言都不應被解釋為指示任何未要求保護的元件對實施本發明是必不可少的。
在本說明書的全文通篇中引用了若干份文件。本文引用的每份文件(包括所有專利、專利申請案、科學出版物、製造商的說明書、說明等)，無論是上文還是下文，均以全文引用的方式併入本文。本文中的任何內容均不應被解釋為承認本發明無權先於這些揭示內容。
諸如「減少」或「抑制」的術語是有關造成整體降低的能力，在層度上較佳5%或更大、10%或更大、20%或更大、更佳50%或更大，以及最佳75%或更大。術語「抑制」或類似片語包括完全或基本上完全抑制，即減少至零或基本上至零。
諸如「增加」、「增強」、「促進」或「延長」的術語較佳是有關增加、增強、促進或延長約至少10%，較佳至少20%，較佳至少30%，較佳至少40%，較佳至少50%，較佳至少80%，較佳至少100%，較佳至少200%，特別是至少300%。這些術語還可能有關從零或不可測量到或不可偵測的程度增加、增強、促進或延長到大於零的程度或可測量到或可偵測到的程度。
術語「PD-1」是有關程式化細胞死亡-1並且包括由細胞天然表現或由經PD-1基因轉染的細胞表現的PD-1的任何變體、構形、同型和物種同系物。較佳地，「PD-1」是有關人類PD-1，特別是具有序列表的SEQ ID NO：22中所示胺基酸序列(NCBI參考序列：NP_005009.2)的蛋白質，或較佳由如序列表的SEQ ID NO：24中所示核酸序列(NCBI參考序列：NM_005018.2)編碼的蛋白質。「PD-1」的替代名稱包括CD279和SLEB2。
術語「PD-1」包括人類PD-1的轉譯後修飾變體、同型和物種同系物，其由細胞天然表現或在經PD-1基因轉染的細胞中/上表現。
術語 「PD-1變體 」應含括(i)PD-1剪接變體、(ii)PD-1轉譯後修飾變體，特別包括具有不同N-醣基化狀態的變體、(iii)PD-1構形變體。此類變體可能包括PD-1的可溶形式。
PD-1是屬於免疫球蛋白超家族的第I型膜蛋白(The EMBO Journal (1992), vol.11, issue 11, p.3887-3895)。人類PD-1蛋白包含由如序列表的SEQ ID NO：22中所示序列位置24至170的胺基酸組成的細胞外結構域、跨膜結構域(如SEQ ID NO：22所示序列位置171至191處的胺基酸)，以及細胞質結構域(如SEQ ID NO：22中所示序列位置192至288處的胺基酸)。如本文所用，術語「PD-1片段」應含括PD-1蛋白的任何片段，較佳免疫原性片段。該術語還含括例如全長蛋白質的上述結構域或這些結構域的任何片段，特別是免疫原性片段。人類PD-1蛋白的較佳細胞外結構域的胺基酸序列示於序列表的SEQ ID NO：23中。
如本文所用，上下文中的術語「細胞外部分」或「細胞外結構域」較佳是指分子(諸如蛋白質)的一部分，其面向細胞的細胞外空間並且較佳可從該細胞的外部接近(例如藉由結合分子，諸如位於細胞外的抗體)。較佳地，該術語指一或多個細胞外環或結構域或其片段。
在第一態樣中，本發明提供一種能夠結合至PD-1的抗體，其中該抗體包含具有重鏈恆定區，其中重鏈恆定區根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234的位置處包含芳族或非極性胺基酸，以及根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置236的位置處包含甘胺酸以外的胺基酸。
如本文所用，術語「抗體」(Ab)是指能夠在典型生理條件下，較佳以顯著時段的半衰期特異地結合至抗原(特別是抗原上的表位)的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一者的衍生物，該段時間為諸如至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約一小時、至少約兩小時、至少約四小時，至少約8小時、至少約12小時、約24小時或更長、約48小時或更長、約3、4、5、6、7或更多天等，或任何其他相關功能定義的時段(諸如足以誘導、促進、增強及/或調節與抗體結合至抗原相關的生理反應的時間及/或足以使抗體招募效應子活性的時間)。具體而言，術語「抗體」是指包含藉由二硫鍵互連的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的醣蛋白。術語「抗體」包括單株抗體、重組抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體以及任何前述抗體的組合。每條重鏈由重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH)組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)組成。可變區和恆定區在本文中也分別稱為可變結構域和恆定結構域。VH區和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，散佈有更保守的區域，稱為框架區(FR)。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。VH的CDR被稱為HCDR1、HCDR2和HCDR3 (或CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)，VL的CDR被稱為LCDR1、LCDR2和LCDR3 (或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原交互作用的結合結構域。抗體的恆定區包含重鏈恆定區(CH)和輕鏈恆定區(CL)，其中CH可進一步細分為恆定結構域CH1、鉸鏈區以及恆定結構域CH2與CH3(從胺基端到羧基端按以下順序排列：CH1、CH2、CH3)。抗體的恆定區可媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統的各種細胞(例如效應子細胞)及補體系統的組分(諸如C1q)。抗體可以是衍生自天然來源或重組來源的完整免疫球蛋白，並且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗體通常是免疫球蛋白分子的四聚體。抗體可能以多種形式存在，包括例如多株抗體、單株抗體、Fv、Fab和F(ab) 2以及單鏈抗體和人源化抗體。
免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原交互作用的結合結構域。術語「結合區」、「抗原結合區」和「抗原結合部分」在本文中可互換使用，且是指與抗原交互作用並包含VH區和VL區兩者的區域。如本文所用的抗體不僅包含單特異性抗體，而且包含多特異性抗體，其包含多個(諸如兩個或更多個，例如三個或更多個)不同的抗原結合區。
在一個具體例中，抗體可以是全長抗體。當在抗體的上下文中使用時，術語「全長」表示抗體不是片段，但含有通常在自然界同型中發現的特定同型的所有結構域，例如IgG1抗體的VH、CH1、CH2、CH3、鉸鏈、VL和CL結構域。
如本文所用，術語「人源化抗體」是指具有基本上衍生自非人類物種的免疫球蛋白的抗原結合位點的分子，其中該分子的其餘免疫球蛋白結構是基於人類免疫球蛋白的結構及/或序列。抗原結合位點可能包含融合到恆定結構域上的完整可變結構域，或者僅包含被移植到可變結構域中之適當框架區上的互補決定區(CDR)。抗原結合位點可能是野生型的或藉由一或多個胺基酸取代進行修飾，例如被修飾成更接近類似於人類免疫球蛋白。一些形式的人源化抗體保有所有CDR序列(例如人源化小鼠抗體，其含有小鼠抗體的全部六個CDR)。其他形式相對於原始抗體具有一或多個已改變的CDR。
如本文所用，術語「嵌合抗體」是指那些其中重鏈和輕鏈的胺基酸序列中每一者的一部分與衍生自特定物種或屬於特定類別的抗體中的對應序列同源的，而鏈的其餘區段與另一者的對應序列同源的抗體。通常，輕鏈和重鏈的可變區模擬衍生自一種哺乳動物物種的抗體的可變區，而恆定部分與衍生自另一種哺乳動物物種的抗體的序列同源。這種嵌合形式的一個明顯優點是可變區可方便地從目前已知的來源衍生而來，使用容易獲得之來自非人類宿主生物體的B細胞或融合瘤與衍生自例如人類細胞製劑的恆定區組合。雖然可變區具有易於製備的優點且特異性不受來源影響，但恆定區是人類的，當注射抗體時，比來自非人類來源的恆定區更不可能引發人類個體的免疫反應。但是，該定義不限於此特定實例。
如本文所用，術語抗體的「抗原結合部分」(或簡稱為「結合部分」)是指保有抗體特異地結合至抗原的能力的一或多個片段。已經證明，抗體的抗原結合功能可以透過全長抗體的片段來執行。術語抗體的「抗原結合部分」中所含括的結合片段之實例包括(i)由VL、VH、CL和CH結構域組成的單價片段；(ii)由VH和CH結構域組成的Fd片段。另一個實例是結合結構域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)融合至免疫球蛋白鉸鏈區多肽的結合結構域多肽、(ii)融合至鉸鏈區的免疫球蛋白重鏈CH2恆定區，以及(iii)融合至CH2恆定區的免疫球蛋白重鏈CH3恆定區。結合結構域多肽可以是重鏈可變區或輕鏈可變區。結合結構域免疫球蛋白融合蛋白進一步揭示於US 2003/0118592和US 2003/0133939中。使用那些習於技藝者熟知的常規技術獲得這些抗體片段，並以與完整抗體相同的方式針對用途來篩選片段。
術語「表位」表示能夠結合至抗體的蛋白質決定子(protein determinant)，其中術語「結合」在本文較佳是有關特異性結合。表位通常由分子的化學活性表面基團(諸如胺基酸或糖側鏈)組成，且通常具有特定的三維結構特徵與特定的電荷特徵。構形表位和非構形表位的區別在於，在變性溶劑存在的情況下，與前者的結合會喪失，而與後者的結合則否。術語「表位」較佳指分子中的抗原性決定子，即分子的部分或片段(諸如被免疫系統辨識的抗原)。例如，表位可能被T細胞、B細胞或抗體辨識。抗原的表位可能包括抗原的連續或不連續部分，而長度可能在約5和約100個胺基酸之間，諸如在約5和約50個胺基酸之間，更佳在約8和約30個胺基酸之間，最佳在約10和約25個胺基酸之間，例如，表位的長度較佳可能為9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個胺基酸。在一個具體例中，表位的長度為約10至約25個胺基酸之間。術語「表位」包括B細胞表位和T細胞表位。
術語「T細胞表位」是指一個當在MHC分子的背景下被呈遞時受T細胞辨識的蛋白質的部分或片段。術語「主要組織相容性複合體」和縮寫「MHC」包括第I類MHC分子和第II類MHC分子，並有關存在於所有脊椎動物中的基因複合體。MHC蛋白質或分子在免疫反應中對淋巴細胞與抗原呈遞細胞或罹病細胞之間的信號傳導很重要，其中MHC蛋白質或分子結合肽表位並將其呈遞以供T細胞上的T細胞受體辨識。MHC編碼的蛋白質在細胞表面上表現，並向T細胞展示自身抗原(來自細胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如入侵微生物的片段)。在第I類MHC/肽複合物的情況下，結合肽的長度通常為約8至約10個胺基酸，儘管更長或更短的肽也可能是有效的。在第II類MHC/肽複合物的情況下，結合肽的長度通常為約10至約25個胺基酸，特別是約13至約18個胺基酸長，而更長和更短的肽也可能是有效的。
如本文所用，術語「對應於位置…的胺基酸」和類似用語是指人類IgG1重鏈中的胺基酸位置號碼。透過與人類IgG1比對，可以找到其他免疫球蛋白中的對應胺基酸位置。因此，一個序列中「對應於」另一個序列中的胺基酸或區段的胺基酸或區段是使用標準序列比對程式(諸如ALIGN、ClustalW或類似程式)在預設下與另一胺基酸或區段比對，且與人類IgG1重鏈具有至少50%、至少80%、至少90%或至少95%一致性者。如何比對序列或序列中的區段並由此確定序列中與本發明胺基酸位置相對應的位置被認為是本領域眾所周知的。
參考例如根據本發明序列表SEQ ID NO.2的胺基酸序列，根據EU編號在人類IgG1重鏈中對應於位置234至236的胺基酸位置是SEQ ID NO.2的胺基酸位置117至119，其中F位於位置117處(根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234)，E位於位置118處(根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置235)而R位於位置119處(根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置236)。在如下所示的序列中，FER胺基酸序列劃底線並以粗體字顯示。
除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，否則本發明通篇中所有提及的胺基酸位置均指根據EU編號在人類IgG1重鏈中對應於相應位置的位置。
在第一態樣的一個具體例中，抗體包含重鏈恆定區，與包含相同抗原結合區和含有人類IgG1鉸鏈區、CH2與CH3區的重鏈恆定區(CH)的另一種抗體相比，該重鏈恆定區的Fc媒介的效應子功能降低或耗盡或以較小程度誘導Fc媒介的效應子功能。
在根據第一態樣的抗體的一個特定具體例中，該重鏈恆定區(CH)經修飾，使得與除了包含未經修飾重鏈恆定區(CH)以外均相同的抗體相比，該抗體以較小的程度誘導Fc媒介的效應子功能。
如本文使用，術語「Fc媒介的效應子功能」指特別選自是IgG Fc受體(Fc加瑪R、FcγR)結合、C1q結合、ADCC、CDC及其任何組合的列表的此類功能。
在本發明的上下文中，有關抗體(包括多特異性抗體)所用的術語「Fc媒介的效應子功能降低或耗盡」表示相較於包含(i)與該抗體相同的CDR序列，特別是包含相同的第一和第二抗原結合區和(ii)包含人類IgG1鉸鏈、CH2和CH3區的兩個重鏈的人類IgG1抗體，該抗體引起Fc媒介的效應子功能在程度上整體降低，效應子功能為諸如特別是選自IgG Fc受體(Fc加瑪R，FcγR)結合、C1q結合、ADCC或CDC的列表的功能，較佳5%或更多、10%或更多、20%或更多、更佳50%或更多，且最佳75%或更多。「Fc媒介的效應子功能耗盡」或類似片語包括完全或基本上完全抑制，即降低至零或基本上降低至零。
在本發明的上下文中，有關抗體(包括多特異性抗體)所用的術語「以較小程度誘導Fc媒介的效應子功能」表示相較於包含(i)與該抗體相同的CDR序列，特別是包含相同的第一和第二抗原結合區和(ii)包含人類IgG1鉸鏈、CH2和CH3區的兩個重鏈的人類IgG1抗體，該抗體以較小程度誘導Fc媒介的效應子功能，效應子功能為諸如特別是選自IgG Fc受體(Fc加瑪R，FcγR)結合、C1q結合、ADCC或CDC的列表的功能。
Fc媒介的效應子功能可透過測量結合劑與Fcγ受體的結合、與C1q的結合或誘導Fc媒介的Fcγ受體交聯來確定。具體地，可以透過測量結合劑與C1q及/或IgG FC-加瑪RI的結合來確定Fc媒介的效應子功能。
根據EU編號，在人類IgG1重鏈中對應於位置236的位置處的胺基酸是鹼性胺基酸。
術語「胺基酸」和「胺基酸殘基」在本文中可以互換使用，並且不應理解為限制性的。胺基酸是含有胺(-NH 2)和羧基(-COOH)官能基以及每種胺基酸特有的側鏈(R基團)的有機化合物。在本發明的上下文中，胺基酸可基於結構和化學特徵進行分類。
在本發明中，胺基酸殘基是透過使用以下縮寫來表現。另外，除非另有明確說明，否則肽和蛋白質的胺基酸序列從N端到C端(左端到右端)進行鑑定，N端被鑑定為第一個殘基。胺基酸由其3字母縮寫、1字母縮寫或全名指定，如下。Ala：A：丙胺酸；Asp：D：天冬胺酸；Glu：E：麩胺酸；Phe：F：苯丙胺酸；Gly：G：甘胺酸；His：H：組胺酸；Ile：I：異白胺酸；Lys：K：離胺酸；Leu：L：白胺酸；Met：M：甲硫胺酸；Asn：N：天冬醯胺酸；Pro：P：脯胺酸；Gln：Q：麩醯胺酸；Arg：R：精胺酸；Ser：S：絲胺酸；Thr：T：蘇胺酸；Val：V：纈胺酸；Trp：W：色胺酸；Tyr：Y：酪胺酸；Cys：C：半胱胺酸。
天然存在的胺基酸通常也可分為四個家族：酸性(天冬胺酸、麩胺酸)、鹼性(離胺酸、精胺酸、組胺酸)、非極性(丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)，以及不帶電荷的極性胺基酸(甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸)。苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸有時被一起歸類為芳族胺基酸。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，根據EU編號在人類IgG1重鏈中對應於位置236的位置處的鹼性胺基酸選自由離胺酸、精胺酸和組胺酸組成之群。在一個具體例中，根據EU編號在人類IgG1重鏈中對應於位置236的位置處的鹼性胺基酸是精胺酸(G236R)。這樣的胺基酸取代在本文中也稱為G236R。術語「G236R」表示根據EU編號在人類IgG1重鏈中的位置236處，胺基酸甘胺酸(G)被精胺酸(R)取代。在本發明中，類似的術語用於其他胺基酸位置和胺基酸。除非指示為相反，否則這些術語中所提及的胺基酸位置是根據EU編號在人類IgG1重鏈中的胺基酸位置。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，根據EU編號在人類IgG1重鏈中對應於位置234的位置處的胺基酸是芳族胺基酸。在一個具體例中，這個位置處的芳族胺基酸選自由苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸組成之群。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，根據EU編號在人類IgG1重鏈中對應於位置234的位置處的胺基酸是非極性胺基酸。在一個具體例中，這個位置處的非極性胺基酸選自由丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸和色胺酸組成之群。在一個具體例中，這個位置處的非極性胺基酸選自由異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸和色胺酸組成之群。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，根據EU編號在人類IgG1重鏈中對應於位置234的位置處的胺基酸是苯丙胺酸(L234F)。
根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234和236的位置處的可能胺基酸的例示性組合如下表所示： 表2：
胺基酸位置234 胺基酸位置236
苯丙胺酸(F) 精胺酸(R)
色胺酸(W) 精胺酸(R)
酪胺酸(Y) 精胺酸(R)
丙胺酸(A) 精胺酸(R)
纈胺酸(V) 精胺酸(R)
白胺酸(L) 精胺酸(R)
異白胺酸(I) 精胺酸(R)
脯胺酸(P) 精胺酸(R)
甲硫胺酸(M) 精胺酸(R)
苯丙胺酸(F) 離胺酸(K)
色胺酸(W) 離胺酸(K)
酪胺酸(Y) 離胺酸(K)
丙胺酸(A) 離胺酸(K)
纈胺酸(V) 離胺酸(K)
白胺酸(L) 離胺酸(K)
異白胺酸(I) 離胺酸(K)
脯胺酸(P) 離胺酸(K)
甲硫胺酸(M) 離胺酸(K)
苯丙胺酸(F) 組胺酸(H)
色胺酸(W) 組胺酸(H)
酪胺酸(Y) 組胺酸(H)
丙胺酸(A) 組胺酸(H)
纈胺酸(V) 組胺酸(H)
白胺酸(L) 組胺酸(H)
異白胺酸(I) 組胺酸(H)
脯胺酸(P) 組胺酸(H)
甲硫胺酸(M) 組胺酸(H)
例如，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234和236的位置處，特別是以下胺基酸可能存在於第一態樣之抗體的重鏈恆定區中：234F/236R、234W/236R、234Y/236R、234A/236R、234L/236R、234F/236K、234W/236K、234Y/236K、234A/236K、234L/236K、234F/236H、234W/236H、234Y/236H、234A/236H，或234L/236H。
位置234和236處的上述胺基酸或胺基酸取代可能僅存在於抗體的一條重鏈中或存在於抗體的兩條重鏈中。抗體的第一和第二重鏈中存在的對應胺基酸可能彼此獨立地選定。
例如，第一態樣的抗體的至少一條重鏈可包含以下序列(SEQ ID NO：2)：
在第一態樣的抗體的一個具體例中，其中根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234和236的位置處的胺基酸如上所述，此外根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置235的位置處是酸性胺基酸。在一個具體例中，這個位置處的酸性胺基酸選自天冬胺酸或麩胺酸。在一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置235的位置處的胺基酸是麩胺酸(L235E)。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，於重鏈恆定區中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234、235和236的位置處的胺基酸是非極性或芳族胺基酸(位置234處)、酸性胺基酸(位置235處)，以及鹼性胺基酸(位置236處)。
根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234、235和236的位置處的可能胺基酸的例示性組合如下表所示： 表3：
胺基酸位置234 胺基酸位置235 胺基酸位置236
苯丙胺酸(F) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 精胺酸(R)
色胺酸(W) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 精胺酸(R)
酪胺酸(Y) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 精胺酸(R)
丙胺酸(A) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 精胺酸(R)
纈胺酸(V) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 精胺酸(R)
白胺酸(L) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 精胺酸(R)
異白胺酸(I) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 精胺酸(R)
脯胺酸(P) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 精胺酸(R)
甲硫胺酸(M) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 精胺酸(R)
苯丙胺酸(F) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 離胺酸(K)
色胺酸(W) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 離胺酸(K)
酪胺酸(Y) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 離胺酸(K)
丙胺酸(A) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 離胺酸(K)
纈胺酸(V) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 離胺酸(K)
白胺酸(L) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 離胺酸(K)
異白胺酸(I) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 離胺酸(K)
脯胺酸(P) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 離胺酸(K)
甲硫胺酸(M) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 離胺酸(K)
苯丙胺酸(F) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 組胺酸(H)
色胺酸(W) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 組胺酸(H)
酪胺酸(Y) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 組胺酸(H)
丙胺酸(A) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 組胺酸(H)
纈胺酸(V) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 組胺酸(H)
白胺酸(L) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 組胺酸(H)
異白胺酸(I) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 組胺酸(H)
脯胺酸(P) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 組胺酸(H)
甲硫胺酸(M) 天冬胺酸(D)或麩胺酸(E) 組胺酸(H)
例如，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234、235和236的位置處，特別是以下胺基酸可能存在於第一態樣之抗體的重鏈恆定區中：234F/235E/236R、234W/235E/236R、234Y/235E/236R、234A/235E/236R、234L/235E/236R、234F/235D/236R、234W/235D/236R、234Y/235D/236R、234A/235D/236R、234L/235D/236R、234F/235L/236R、234W/235L/236R、234Y/235L/236R、234A/235L/236R、234L/235L/236R、234F/235A/236R、234W/235A/236R、234Y/235A/236R、234A/235A/236R、234L/235A/236R、234F/235E/236K、234W/235E/236K、234Y/235E/236K、234A/235E/236K、234L/235E/236K、234F/235D/236K、234W/235D/236K、234Y/235D/236K、234A/235D/236K、234L/235D/236K、234F/235L/236K、234W/235L/236K、234Y/235L/236K、234A/235L/236K、234L/235L/236K、234F/235A/236K、234W/235A/236K、234Y/235A/236K、234A/235A/236K、234L/235A/236K、234F/235E/236H、234W/235E/236H、234Y/235E/236H、234A/235E/236H、234L/235E/236H、234F/235D/236H、234W/235D/236H、234Y/235D/236H、234A/235D/236H、234L/235D/236H、234F/235L/236H、234W/235L/236H、234Y/235L/236H、234A/235L/236H、234L/235L/236H、234F/235A/236H、234W/235A/236H、234Y/235A/236H、234A/235A/236H，或234L/235A/236H。
在位置234、235和236處的上述胺基酸或胺基酸取代可能僅存在於抗體的一條重鏈中或存在於抗體的兩條重鏈中。抗體的第一和第二重鏈中存在的對應胺基酸可彼此獨立地選定。
例如，第一態樣之抗體的至少一條重鏈可包含以下序列(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：55)：
除非上下文另有表示，否則在本件申請案案中，位置234、236與235處的全部所述胺基酸取代的任何排列與組合(若適用的話，例如如表2和3中所示)應當被認為由本件申請案的發明說明所揭示。例如，在抗體的一個具體例中，第一重鏈根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234至236的位置處包含胺基酸FER，或者第一重鏈包含SEQ ID NO：2中所示胺基酸序列或基本上由其組成或由其組成，而該抗體的第二重鏈根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234至236的位置處包含其他胺基酸(例如胺基酸AAG或LLG)，或包含或該抗體的第二重鏈根據EU編號包含SEQ ID NO：1或7中所示胺基酸序列或基本上由其組成或由其組成。在抗體的另一個具體例中，第一和第二重鏈根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234至236的位置處包含相同的胺基酸(諸如FER或FLR的特定組合)，即根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234的位置處包含相同的芳族或非極性胺基酸(例如F)，以及根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置236的位置處包含甘胺酸以外的相同胺基酸(例如R)。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含至少一個或兩個重鏈恆定區，對應於位置234的胺基酸是苯丙胺酸，對應於位置235的胺基酸是麩胺酸，而對應於位置236的胺基酸是精胺酸(L234F/L235E/G236R=FER)。
在第一態樣的抗體的更多具體例中，除了根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置236的位置處的胺基酸取代外，至少一個或兩個重鏈恆定區可以在恆定區中包含一或多個更多突變，例如根據EU編號在人類IgG1重鏈中對應於位置L234、L235、G237、D265、D270、K322、P329和P331的位置的一或多個胺基酸。
在一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234的胺基酸不是L，而是例如選自F或A，及/或根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置235的胺基酸不是L，而是選自E或A。
在一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置237的胺基酸不是G，而是例如A，即抗體的至少一個或兩個重鏈恆定區可以包含例如胺基酸取代G236R/G237A。
在一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置265的胺基酸不是D，而是例如A，即抗體的至少一個或兩個重鏈恆定區可以包含例如胺基酸取代G236R/D265A。
在一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置270的胺基酸不是D，而是例如A，即抗體的至少一個或兩個重鏈恆定區可以包含例如胺基酸取代G236R/D270A。
在一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置322的胺基酸不是K，而是例如A，即抗體的至少一個或兩個重鏈恆定區可以包含例如胺基酸取代G236R/K322A。
在一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置329的胺基酸不是P，而是例如A，即抗體的至少一個或兩個重鏈恆定區可以包含例如胺基酸取代G236R/P329A。
在一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置331的胺基酸不是P，而是例如A或S，即抗體的至少一個或兩個重鏈恆定區可以包含例如胺基酸取代G236R/P331A或G236R/P331S。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234、236和G327的位置已經被取代，抗體的至少一個或兩個重鏈恆定區可以包含例如胺基酸取代L234F/G236R/G237A。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234、236和265的位置已經被取代，抗體的至少一個或兩個重鏈恆定區可以包含例如胺基酸取代L234F/G236R/D265A。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234、236和270的位置已經被取代，抗體的至少一個或兩個重鏈恆定區可以包含例如，胺基酸取代L234F/G236R/D270A。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234、236和322的位置已經被取代，抗體的至少一個或兩個重鏈恆定區可以包含例如胺基酸取代L234F/G236R/K322A。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234、236和329的位置已經被取代，抗體的至少一個或兩個重鏈恆定區可以包含例如胺基酸取代L234F/G236R/P329A。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234、236和331的位置已經被取代，抗體的至少一個或兩個重鏈恆定區可以包含例如胺基酸取代L234F/G236R/P331A或L234F/G236R/P331S。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含一或多個重鏈恆定區(CH)，其包含與如SEQ ID NO：2中所示CH序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。
本文提供關於特定胺基酸序列(例如，序列表中所示的那些)的教示應被解釋為還涉及該特定序列的變體，其產生與該等特定序列在功能上等效的序列，例如展現出與特定胺基酸序列相同或相似性質的胺基酸序列。
出於本發明之目的，胺基酸序列(肽、蛋白質或多肽)的「變體」包括胺基酸插入變體、胺基酸添加變體、胺基酸缺失變體及/或胺基酸取代變體。術語「變體」包括所有突變體、剪接變體、轉譯後修飾變體、構形、同型、等位基因變體、物種變體和物種同系物，特別是天然存在的那些。術語「變體」特別包括胺基酸序列的片段。
在一個具體例中，重鏈恆定區的胺基酸變體包含位置234和236處以及視情況位置235處的對應胺基酸，如說明書和隨附申請專利範圍中所指定的。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含一或多個(例如兩個)重鏈恆定區(CH)，其中該重鏈恆定區包含如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：55中所示的序列。
第一態樣的抗體可以是免疫球蛋白分子的任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。
如本文所用，術語「同型」是指免疫球蛋白類別(例如IgG (諸如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgD、IgA (諸如IgA1、IgA2)、IgE、IgM或IgY)，其為由重鏈恆定區基因編碼。當本文提及特定同型(例如IgGl)時，術語不限於特定同型序列(例如特定IgGl序列)，而是用來指抗體在序列上比其他同型更為接近那個同型(例如IgGl)。因此，例如本文揭示的IgG1抗體可以是天然存在的IgG1抗體的序列變體，包括恆定區中的變化。
IgG1抗體可以多個被稱為異型的多形變體存在(在Jefferis and Lefranc 2009. mAbsVol 1 Issue 4 1-7中評論)，其中任何一者都適於本文的一些具體例中。人類群體中常見的異型變體是由字母a、f、n、z或其組合指定的那些。在本文的任何具體例中，抗體可包含含有人類IgG Fc區的重鏈Fc區。在進一步的具體例中，人類IgG Fc區包含人類IgG1。
哺乳動物免疫球蛋白重鏈有五種類型(即α、δ、ε，γ和μ)，它們導致抗體的不同同型(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。與可溶性免疫球蛋白的重鏈相反，膜或表面免疫球蛋白的重鏈在其羧基端包含跨膜結構域和短細胞質結構域。
在哺乳動物體內有兩種類型的輕鏈，即拉目達和卡帕。免疫球蛋白鏈包含可變區與恆定區。恆定區在免疫球蛋白的不同同型中基本上是保守的，其中可變部分高度多樣化並負責抗原辨識。
例如或在一個具體例中，本發明的抗體(較佳單株抗體)是IgG1，κ同型或λ同型，較佳包含人類IgG1/κ或人類IgG1/λ恆定部分，或者該抗體(較佳單株抗體)衍生自IgG1，λ(拉目達)，或IgG1、κ(卡帕)抗體，較佳衍生自人類IgG1，λ(拉目達)或人類IgG1，κ(卡帕)抗體。
在第一態樣的一個具體例中，抗體包含具有輕鏈恆定區的輕鏈，該輕鏈恆定區包含與SEQ ID NO：6中所示LC序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。在一個具體例中，抗體包含具有輕鏈恆定區的輕鏈，該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO：6中所示的序列
在本發明的一個具體例中，結合劑是全長IgG1抗體，例如IgG1，κ。在本發明的一個具體例中，結合劑是全長人類IgG1抗體，例如IgG1，κ。
透過同型轉換可以獲得其他同型。如本文所用，「同型轉換」是指抗體的類別或同型從一種Ig類別改變為其他Ig類別之一的現象。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，第一態樣的抗體可以衍生出、連接至或共表現出其他結合特異性。在另一個具體例中，第一態樣的抗體可以衍生出、連接至另一種功能分子或與另一種功能分子共表現，另一種功能分子為例如另一種肽或蛋白質(例如Fab'片段)。例如，第一態樣的抗體可在功能上連接(例如藉由化學偶聯、基因融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他分子實體，諸如另一個抗體(例如產生雙特異性或多特異性抗體)。
術語「抗體衍生物」指任何經修飾形式的抗體，例如抗體與另一個藥劑或抗體的接合物。如本文所用，如果抗體是透過免疫動物或透過篩選免疫球蛋白基因庫而從系統獲得的，則抗體是「衍生自」特定生殖系序列，且其中所選抗體在胺基酸序列上與生殖系免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列是至少90%、更佳至少95%、甚至更佳至少96%、97%、98%或99%一致。通常，衍生自特定生殖系序列的抗體將展現出與生殖系免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列相差不超過10個胺基酸的差異，更佳不超過5個，或甚至更佳不超過4個、3個、2個或1個胺基酸的差異。
第一態樣的抗體可能是人類抗體。如本文所用，術語「人類抗體」意欲包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。第一態樣的人類抗體可能包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變引入的突變)。
如本文所用，術語「單株抗體」是指具有單一分子組成的抗體分子製劑。單株抗體對特定表位展現出單一的結合特異性與親和力。在一個具體例中，單株抗體由融合瘤生產，該融合瘤包括與永生化細胞融合的B細胞(獲自非人類動物，例如小鼠)。
第一態樣的抗體可能是重組抗體。如本文所用，術語「重組抗體」包括透過重組手段及/或基因工程製備、表現、創造或分離的所有抗體，諸如(a)從動物(例如小鼠)分離的抗體，該動物就免疫球蛋白基因或由其製備而來的融合瘤來說是轉基因或轉染色體的；(b)從被轉形成表現該抗體的宿主細胞分離的抗體，例如從轉染瘤分離的抗體；(c)從重組組合抗體庫分離的抗體；以及(d)透過涉及剪接免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列的任何其他方式製備、表現、創造或分離的抗體。較佳地，「重組物」(諸如本發明上下文中的重組細胞)不是天然存在的。本文所述的胺基酸變體可由習於技藝者容易地製備，例如藉由重組DNA操作。例如，Sambrook et al. (1989)中詳細說明了操作用於製備具有取代、添加、插入或缺失的蛋白質和肽的核苷酸序列。
如本文所用，「異源性抗體」是相對於產生此一抗體的轉基因生物體所定義的。這個術語指具有與不由轉基因生物體組成的生物體中發現的胺基酸序列或編碼核酸序列相對應的胺基酸序列或編碼核酸序列的抗體，並且通常衍生自轉基因生物體以外的物種。
如本文所用，「異源雜交抗體」是指具有不同生物體來源的輕鏈和重鏈之抗體。例如，具有與鼠輕鏈締合的人類重鏈的抗體是異源雜交抗體。
第一態樣的抗體較佳經分離。如本文所用，「經分離的抗體」意欲指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，特異地結合至PD-1的經分離抗體基本上不含特異地結合PD-1以外抗原的抗體)。然而，特異地結合至人類PD-1的表位、同型或變體的經分離抗體可能與其他相關抗原(例如來自其他物種的抗原(例如，PD-1物種同系物))具有交叉反應性。此外，經分離抗體可能基本上不含其他細胞材料及/或化學物質。在第一態樣的一個具體例中，「經分離」單株抗體的組合是有關具有不同特異性並且按明確組成進行組合的抗體。
如本文所用，應用於物體的術語「天然存在的」是指物體可以在自然界中被發現到。例如，存在於生物體(包括病毒)中的、可以從自然界來源分離並且未經人類在實驗室有意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
如本文所用，術語「經重排」是指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構型，其中V區段緊鄰D-J或J區段以分別編碼基本上完整的VH或VL結構域的構型定位。透過與生殖系DNA比較，可以鑑定經過重排的免疫球蛋白(抗體)基因座；經重排的基因座將具有至少一個重組的七聚體/九聚體同源元件。
如本文所用，提到V區段的術語「未經重排」或「生殖系構型」是指其中V區段未經重組以便緊鄰D或J區段的構型。 I.    抗體作用的機制
儘管下文提供了關於第一態樣抗體治療功效的機制的考慮，但不應認為以任何方式限制本發明。
本文所述抗體較佳與免疫檢查點PD-1交互作用。透過結合至PD-1，PD-1與其配體(PD-L1和PD-L2)的交互作用受到抑制。PD-L1表現在例如腫瘤細胞和腫瘤微環境的抗原呈遞細胞上。PD-1和PD-L1的交互作用將導致免疫反應(較佳T細胞媒介的免疫反應)消除，因此藉由用第一態樣的抗體阻斷PD-1，這樣的免疫反應消除得以預防或至少減少，或者換句話說誘導免疫反應。
儘管PD-1及其配體在預防或降低免疫反應方面交互作用，但為了實現這種效果，PD-1阻斷可能比配體阻斷更加有利。這是因為阻斷例如PD-L1仍可能導致免疫反應降低，因為表現PD-L2的罹病細胞和表現PD-1的淋巴細胞之間的抑制性信號傳導可能有助於抑制免疫系統的免疫反應。
免疫系統能夠經由兩種不同的方式辨識並摧毀罹病細胞：先天性免疫和適應性免疫。先天性成分由巨噬細胞、天然殺手(NK)細胞、單核細胞和顆粒球組成。這些細胞辨識涉入細胞轉化的分子模式並釋放各種細胞介素與發炎性媒介因子。先天性反應對外來抗原缺乏記憶能力，這是適應性免疫反應中存在的一個特徵。免疫系統的後者組分還具有對外來抗原的特異性，這是由淋巴細胞上存在的受體所賦予。抗原呈遞細胞(APC)也在適應性反應中發揮作用(它們吞噬外來抗原，並在主要組織相容性複合體的背景下將其呈遞給淋巴細胞)。CD4 +T細胞攜帶的受體會辨識第II類MHC分子中的抗原，從而使它們能夠釋放細胞介素並進一步活化CD8 +淋巴細胞(CTL)或B細胞。CTL是細胞媒介的免疫的一部分，能夠在辨識第I類MHC分子中呈遞的抗原後，經由細胞凋亡或穿孔素媒介的細胞溶解來消除細胞。普遍認為，T細胞媒介的免疫在抗腫瘤反應中發揮著至關重要的作用。B細胞涉及免疫球蛋白的釋放，因此是體液性免疫系統的一部分。
術語「免疫反應」是指對目標(諸如抗原或表現抗原的細胞)的綜合身體反應，並且較佳是指細胞性免疫反應或細胞性以及體液性免疫反應。免疫反應可能是保護性的/預防性的/防治性的及/或治療性的。
「誘導免疫反應」可能表示著在誘導前沒有免疫反應，但也可能表示在誘導前存在一定程度的免疫反應，並且在誘導後該免疫反應得以增強。因此，「誘導免疫反應」還包括「增強免疫反應」。較佳地，在個體中誘導免疫反應後，保護該名個體免於發生疾病(諸如癌症疾病)，或者透過誘導免疫反應來改善疾病狀況。在這種情況下誘導免疫反應可能表示著個體的疾病狀況得以改善、個體沒有發生轉移，或者處於發生癌症疾病風險下的個體並未發生癌症疾病。
術語「細胞性免疫反應」和「細胞性反應」或類似術語是指針對細胞的免疫反應。先天性細胞性免疫反應是受到巨噬細胞、自然殺手(NK)細胞、單核細胞和顆粒球所驅動。適應性細胞性免疫反應的特徵是在第I類或第II類MHC背景下呈遞抗原，這涉及到充當「輔助者」或「殺手」的T細胞或T淋巴細胞。輔助T細胞(也稱為CD4 +T細胞)透過調節免疫反應發揮核心作用，而殺手細胞(也稱為細胞毒性T細胞、溶細胞性T細胞、CD8 +T細胞或CTL)殺死罹病細胞(諸如癌細胞)，防止產生更多罹病細胞。在具體例中，本發明是有關刺激針對表現一或多種腫瘤抗原並且較佳地在第I類MHC上呈遞此類腫瘤抗原的腫瘤細胞的抗腫瘤CTL反應。
如本文所用，「腫瘤抗原」涵蓋任何物質，較佳為肽或蛋白質，其為免疫反應的目標及/或誘導免疫反應，諸如與抗體或T淋巴細胞(T細胞)的特異性反應。較佳地，抗原包含至少一個表位，諸如T細胞表位。腫瘤抗原或其T細胞表位較佳在MHC分子的背景下由細胞呈遞，較佳由抗原呈遞細胞呈遞，抗原呈遞細胞包括罹病細胞(特別是癌細胞)，這導致針對抗原(包括表現抗原的細胞)的免疫反應。
第一態樣抗體的特徵在於其與PD-1的結合性質，且較佳地其能夠抑制PD-1的免疫抑制性信號。
根據本發明，術語「結合」較佳是有關「特異性結合」。如本文所用，在抗體與預定抗原或表位結合的上下文中，當使用Bio-Layer干涉術(BLI)測定，或例如在BIAcore 3000儀器中使用表面等漿共振(SPR)技術(使用抗原作為配體，抗體作為分析物)進行測定時，術語「結合」或「能夠結合」或「能結合」通常是以對應K D為於約10- 7M或更小的親和力的結合，諸如約10- 8M或更小，諸如約10- 9M或更小、約10- 10M或更小，或約10 -11M或更小。抗體以對應於比其結合至預定抗原或密切相關抗原以外之非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)的K D低至少十倍，諸如低至少100倍，例如低至少1,000倍，例如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍之K D的親和力結合至預定抗原。親和力越高的程度取決於抗體的K D，因此當抗體的K D非常低時(即抗體具有高度特異性)，那麼對抗原的親和力低於比對非特異性抗原的親和力低在程度上為至少10,000倍。
術語「k d」(sec ‑1)是指特定抗體-抗原交互作用的解離速率常數。該值也稱為k off值。
如本文所用，術語「K D」(M)是指特定抗體-抗原交互作用的解離平衡常數。
如果兩個抗體結合到相同抗原和相同表位，則它們具有「相同的特異性」。待測試抗體是否辨識與某種抗原結合抗體相同的表位，即抗體是否結合相同的表位，可以藉由習於技藝者熟知的不同方法來進行測試。
抗體之間的競爭可以藉由交叉阻斷分析予以偵測。例如，競爭性ELISA分析可用作為交叉阻斷分析。例如，可以將目標抗原塗覆在微量滴定盤的孔上，並可添加抗原結合抗體與候選競爭測試抗體。與孔中的抗原結合的抗原結合抗體的量和與其競爭結合至相同表位的候選競爭測試抗體的結合能力間接相關。具體而言，候選競爭測試抗體對同一表位的親和力越大，則與抗原塗覆孔結合的抗原結合抗體的量越少。與孔結合的抗原結合抗體的量可以透過用可偵測或可測量的標記物質來標記抗體予以測量。
與另一個抗體(例如包含如本文所述的重鏈和輕鏈可變區的抗體)競爭結合至抗原的抗體，或具有另一抗體對另一個抗原具有特異性的抗體(例如包含如本文所述的重鏈和輕鏈可變區的抗體)可能是包含如本文所述該等重鏈及/或輕鏈可變區的變體的抗體，例如CDR中的修飾及/或如本文所述的某個程度的一致性。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，提供一種能夠結合至PD-1的抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含互補決定區3(HCDR3)，HCDR3具有或包含如SEQ ID NO：8中任一者所示的序列。在第一態樣的抗體的一個具體例中，提供一種能夠結合至PD-1的抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含有具有或包含如SEQ ID NO：9中任一者所示序列的互補決定區3 (HCDR3)。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，該抗體的重鏈可變區(VH)包含互補決定區2 (HCDR2)，其具有或包含如SEQ ID NO：10中任一者所示的序列。在一個具體例中，重鏈可變區(VH)的HCDR2具有或包含如SEQ ID NO：11中任一者所示的序列。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，該抗體的重鏈可變區(VH)包含有具有或包含選自SYN的序列的互補決定區1 (HCDR1)。在一個具體例中，重鏈可變區(VH)的HCDR1具有或包含如SEQ ID NO：12中任一者所示的序列。在一個具體例中，重鏈可變區(VH)的HCDR1具有或包含如SEQ ID NO：13中任一者所示的序列。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含有具有或包含如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9中所示序列的HCDR3序列，且較佳進一步包含有具有或包含SYN、如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13中所示序列的HCDRl序列，及/或具有或包含如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示序列的HCDR2序列。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(VH)，其中HCDR1序列選自具有或包含SYN，SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的序列，HCDR2序列選自具有或包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的序列，而HCDR3序列選自具有或包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的序列。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別是或包含SYN，SEQ ID NO：10與SEQ ID NO：8。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別是或包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：8。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別是或包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：9。
在第一態樣的一個具體例中，抗體包含具有輕鏈可變區(VL)的輕鏈。
第一態樣抗體的特徵在於包含重鏈可變區(VH)，較佳包含具有或包含如本文所示序列的互補決定區3 (HCDR3)。在較佳具體例中，進一步指定了VH的互補性決定區1和2。在一個具體例中，第一態樣的這些抗體還包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含以下中的至少一者： -   互補決定區3 (LCDR3)，其具有或包含如SEQ ID NO：14中任一者所示的序列； -   互補決定區2 (LCDR2)，其具有或包含序列QAS。在一個具體例中，輕鏈可變區(VL)包含互補決定區2 (LCDR2)，其具有或包含如SEQ ID NO：15中任一者所示的序列，及/或 -   互補決定區1 (LCDR1)，其具有或包含如SEQ ID NO：16中任一者所示的序列。在一個具體例中，輕鏈可變區(VL)包含互補決定區1 (LCDR1)，其具有或包含如SEQ ID NO：17中任一者所示的序列。
在第一態樣的該等抗體的一個具體例中，抗體包含輕鏈可變區(VL)，該VL包含具有或包含SEQ ID NO：14的LCDR3序列，且較佳進一步包含具有或包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的LCDR1序列，及/或具有或包含SEQ ID NO：15的LCDR2序列。
在一個具體例中，第一態樣的抗體包含輕鏈可變區(VL)，該VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中LCDR1序列選自具有或包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的序列，LCDR2序列選自具有或包含QAS或SEQ ID NO：15的序列，而LCDR3序列是具有或包含SEQ ID NO：14的序列。
在一個具體例中，第一態樣的抗體包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分別是或包含SEQ ID NO：16、QAS和SEQ ID NO：14。
在一個具體例中，第一態樣的抗體包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分別是或包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：14。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(VH)，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別包含或具有序列SYN、如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：8中所示的序列，而LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：10、QAS和SEQ ID NO：14中所示的序列。此一抗體的具體但非限制性實例是MAB-19-0202。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，該抗體包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(VH)，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中HCDRl、HCDR2和HCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：8中所示的序列，而LCDRl、LCDR2和LCDR3序列包含或具有如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：14中所示的序列。此一抗體的具體但非限制性實例是MAB-19-0202。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，該抗體包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(VH)，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：9中所示的序列，而LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：16、QAS和SEQ ID NO：14中所示的序列。此一抗體的具體但非限制性實例是MAB-19-0202。
術語「重鏈可變區」(也稱為「VH」)和「輕鏈可變區」(也稱為「VL」)在此以其最普遍的含義使用，並且包含能夠包含散佈有其他區域(也稱為框架區(FR))的互補決定區(CDR)的任何序列。框架區尤其隔開CDR，使得它們能夠形成抗原結合位點，特別是在折疊和VH與VL配對之後。較佳地，每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。也就是說，術語「重鏈可變區」和「輕鏈可變區」不應被解釋為侷限於這樣的序列，因為它們可以在天然抗體中或在如本文例示的VH和VL序列中被發現到(序列表的SEQ ID NO：18至21)。這些術語包括能夠包含並充分定位CDR的任何序列，例如衍生自天然抗體的VL和VH區的序列或衍生自序列表的SEQ ID NO：18至21中所示序列的序列。那些習於技藝者應當理解，特別是可以修飾框架區的序列(包括關於胺基酸取代的變體和關於序列長度的變體，即插入或缺失變體)而分別未失去VH和VL的特徵。在一個較佳具體例中，任何修飾都侷限於框架區。但是，習於技藝者還知曉：CDR、高變區和可變區也可以受到修飾而不喪失結合PD-1的能力。例如，CDR區將與本文指定的區域相同或高度同源。「高度同源」預期可在CDR中進行1至5個、較佳1至4個、例如1至3個或1或2個取代。另外，高變區和可變區可以被修飾，使得它們與本文具體揭示之區域顯示出實質同源性。
如本文指定的CDR已藉由使用兩種不同的CDR鑑定方法進行鑑定。本文使用的第一種編號方案是根據Kabat (Wu and Kabat, 1970；Kabat et al., 1991)，第二種方案是IMGT編號方案(Lefranc, 1997；Lefranc et al., 2005)。在第三種方法中，使用了兩種鑑定方案的交點。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含如本文所述的一或多個CDR、一組CDR或CDR組的組合，其包含該等CDR連同其插入框架區(本文也稱為框架區或FR)或該等框架區的部分。較佳地，該部分將包括第一和第四框架區之一或兩者的至少約50%，該50%是第一框架區的C端50%和第四框架區的N端50%。藉由重組DNA技術製得的第一態樣的抗體的構建可以導致藉由連接子將殘基引入到所編碼可變區的N端或C端，該等連接子被引入以促進選殖或其他操作步驟，包括引入連接子將本發明可變區連接至其他蛋白質序列(包括免疫球蛋白重鏈、其他可變結構域(例如在生產雙功能抗體時)或蛋白質標記)。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含與如SEQ ID NO：18中任一者中所示VH序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。
重鏈可變區(VH)較佳地包含抗體重鏈可變區的至少一個、更佳兩個、又更佳全部三個CDR序列，該抗體重鏈可變區分別具有或包含如SEQ ID NO：8至13中任一者所示的序列，或具有序列SYN。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含重鏈可變區(VH)，其中VH包含如SEQ ID NO：18中任一者所示的序列。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含輕鏈可變區(VL)，該VL包含與如SEQ ID NO：19中任一者所示VL序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。
輕鏈可變區(VL)較佳包含抗體輕鏈可變區的至少一個、更佳兩個、又更佳全部三個CDR序列，抗體輕鏈可變區分別具有或包含如SEQ ID NO：14至17中任一者所示的序列，或具有序列QAS。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含輕鏈可變區(VL)，其中VL包含如SEQ ID NO：19中任一者所示的序列。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中VH包含或具有如SEQ ID NO：18中所示的序列，而VL包含或具有如SEQ ID NO：19中所示的序列。此一抗體的具體但非限制性實例是MAB-19-0202。本發明還含括該等重鏈可變區(VH)和該等輕鏈可變區(VL)的變體以及這些變體VH和VL的對應組合。
第一態樣的抗體可以衍生自不同物種，包括但不限於兔、小鼠、大鼠、天竺鼠和人類。抗體可以是多株或單株的。在一個具體例或較佳具體例中，第一態樣的抗體是單株的。在一個具體例中，第一態樣的抗體可能包括嵌合分子，其中衍生自一個物種(較佳人類)的抗體恆定區與衍生自另一物種的抗原結合位點組合。在一個具體例中，抗體是單株嵌合抗體，其中恆定區較佳是人類免疫球蛋白恆定部分，例如人類IgG1/κ恆定部分。此外，在一個具體例中，第一態樣的抗體包括人源化分子，較佳單株人源化分子，其中衍生自非人類物種的抗體的抗原結合位點與人類來源之恆定區和框架區組合。在一個具體例中，第一態樣的抗體包含如本文所述的一或多個CDR、一組CDR或CDR組的組合，其包含在人類抗體框架中的該等CDR。在一個或較佳具體例中，第一態樣的抗體是單株人源化抗體，其中恆定區較佳是人類免疫球蛋白恆定部分，例如人類IgG1/κ恆定部分。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含與如SEQ ID NO：20中任一者所示VH序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。在一個具體例中，抗體包含重鏈可變區(VH)，其中該VH包含如SEQ ID NO：20中任一者所示的序列。在一個具體例中，抗體包含輕鏈可變區(VL)，該VL包含與如SEQ ID NO：21中任一者所示VL序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。在一個具體例中，抗體包含輕鏈可變區(VL)，其中該VL包含如SEQ ID NO：21中任一者所示的序列。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中VH包含或具有如SEQ ID NO：20中所示的序列，而VL包含或具有如SEQ ID NO：21中所示的序列，或這些序列的相應變體。第一態樣的抗體的另一個實例可包含有包含或具有如SEQ ID NO：20中所示序列或其變體的VH，以及包含或具有如SEQ ID NO：21中所示序列或其變體的VL。此一抗體的具體但非限制性實例是MAB-19-0618。抗體MAB-19-0618衍生自MAB-19-0202。本發明還含括該重鏈可變區(VH)和該輕鏈可變區(VL)的變體以及這些變體VH和VL的相應組合。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含有包含或具有如SEQ ID NO：2或55中所示序列的重鏈恆定區和包含或具有如SEQ ID NO：20中所示序列的重鏈可變區(VH)，且該輕鏈包含有包含或具有如SEQ ID NO：6中所示序列的輕鏈恆定區和包含或具有如SEQ ID NO：21中所示序列的輕鏈可變區。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含有包含或具有如SEQ ID NO：2或55中所示序列的重鏈恆定區和包含如SEQ ID NO：20中所示序列的CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(VH)，且該輕鏈包含有包含或具有如SEQ ID NO：6中所示序列的輕鏈恆定區和包含如SEQ ID NO：21中所示序列的CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區。例如，CDR1、CDR2和CDR3序列如本文指定。
參考第一態樣的單株嵌合抗體(MAB-19-0202)和單株人源化抗體的具體實例，各自的序列如實例的表3、表4、表6和表7中所示。例示性人源化抗體MAB-19-0618是MAB-19-0202的人源化變體。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體是單株嵌合抗體、或單株人源化抗體，或此一抗體的片段。抗體可以是完整抗體或其抗原結合片段，包括例如雙特異性抗體。此外，抗原結合片段可包括結合結構域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)融合至免疫球蛋白鉸鏈區多肽的結合結構域多肽(諸如重鏈可變區或輕鏈可變區)、(ii)融合至鉸鏈區的免疫球蛋白重鏈CH2恆定區，以及(iii)融合至CH2恆定區的免疫球蛋白重鏈CH3恆定區。此類結合結構域免疫球蛋白融合蛋白進一步揭示於US 2003/0118592和US 2003/0133939中。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體或其抗原結合部分包含至少兩條重鏈以及至少兩條輕鏈，其中抗體包含相同的重鏈及/或相同的輕鏈，例如，如上文或下文指定的重鏈及/或輕鏈。例如，第一態樣的抗體可包含具有如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：2或55中所示序列或這些序列的相應變體的兩條重鏈，以及具有如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：6中所示序列或這些序列的相應變體的兩條輕鏈。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，一或多個，較佳兩個重鏈恆定區已被修飾，使得與野生型抗體相比，C1q與該抗體的結合降低，較佳降低至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%。在一個具體例中，C1q結合可以藉由ELISA來測定。
本文中的「野生型」或「WT」或「天然」表示在自然界中發現的胺基酸序列，包括等位基因變異。野生型胺基酸序列、肽或蛋白質具有未經有意修飾的胺基酸序列。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，一或多個，較佳兩個重鏈恆定區已被修飾，使得與野生型抗體相比，抗體與一或多個IgG Fc-加瑪受體的結合降低，較佳至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%。在一個具體例中，一或多個IgG Fc-加瑪受體選自Fc-加瑪RI、Fc-加瑪RII和Fc-加瑪RIII中的至少一者。在一個具體例中，IgG Fc-加瑪受體是Fc-加瑪RI。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體不能誘導Fc-加瑪RI媒介的效應子功能，或者其中所誘導的Fc-加瑪RI媒介的效應子功能相較於野生型抗體降低，較佳至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體不能誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)媒介的溶解、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)媒介的溶解、細胞凋亡、同型黏附及/或吞噬作用中的至少一者，或其中補體依賴性細胞毒性(CDC)媒介的溶解、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)媒介的溶解、細胞凋亡、同型黏附及/或吞噬作用中的至少一者受到誘導的程度降低，較佳降低至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%。
抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性在本文中也稱為「ADCC」。ADCC描述了如本文所述效應子細胞(特別是淋巴細胞)殺傷細胞的能力，其較佳需要透過抗體標記目標細胞。
當抗體結合至腫瘤細胞上的抗原且抗體Fc結構域接合在免疫效應子細胞表面上的Fc受體(FcR)時，較佳發生ADCC。已鑑定出幾個Fc受體家族，而特定細胞群各具特徵地表現明確的Fc受體。ADCC可以被視為一種直接誘導程度不等的立即腫瘤破壞的機制，從而導致抗原呈遞並誘導腫瘤定向T細胞反應。較佳地，ADCC的活體內誘導將導致腫瘤定向的T細胞反應和宿主衍生的抗體反應。
補體依賴性細胞毒性在本文中也稱為「CDC」。CDC是另一種可以由抗體定向的細胞殺傷方法。IgM是補體活化最有效的同型。IgG1和IgG3在經由經典補體活化路徑定向CDC方面也非常有效。較佳地，在這個級聯中，抗原-抗體複合物的形成導致參與抗體分子(諸如IgG分子)的C H2結構域上緊密接近的多個C1q結合位點暴露(C1q是補體C1的三個亞組分之一)。較佳地，這些暴露出來的C1q結合位點將先前的低親和力C1q-IgG交互作用轉化為高親和力交互作用，這觸發涉及一系列其他補體蛋白的級聯事件，並導致效應子細胞趨化/活化劑C3a和C5a的蛋白水解釋放。較佳地，補體級聯結束於膜攻擊複合物形成，其在細胞膜中產生孔，促進水和溶質自由進出細胞並可導致細胞凋亡。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體的效應子功能降低或耗盡。在一個具體例中，抗體不媒介ADCC或CDC或兩者。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體的一或多個，較佳兩個重鏈恆定區已被修飾，使得與野生型相比，新生兒Fc受體(FcRn)與抗體的結合不受影響。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體能夠結合的PD-1是人類PD-1。在一個具體例中，PD-1具有或包含如SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23中所示的胺基酸序列，或者PD-1的胺基酸序列與SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23中所示胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性，或其免疫原性片段。在一個具體例中，抗體能夠結合至活細胞表面上存在的PD-1的天然表位。
第一態樣的抗體可以與攻擊腫瘤的傳統化療劑或其他免疫治療協同使用，例如透過採用靶向腫瘤抗原的其他抗體從而誘導針對這些腫瘤細胞的免疫反應，或者透過採用其他檢查點抑制劑或活化因子或血管生成抑制劑。 II.   抗體的生產
第一態樣的抗體可以透過多種技術生產，包括常規單株抗體方法，例如Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)的標準體細胞雜交技術。雖然體細胞雜交程序較佳的，但原則上也可以採用生產單株抗體的其他技術，例如B淋巴細胞的病毒或致癌轉形或使用抗體基因庫的噬菌體展示技術。
用於製備分泌單株抗體的融合瘤的較佳動物系統是鼠類系統。在小鼠體內產生融合瘤是一個非常成熟的程序。用於分離經免疫的脾細胞以進行融合的免疫方案和技術是本領域已知的。融合伴侶(例如，鼠類骨髓瘤細胞)和融合程序也是已知的。
用於製備分泌單株抗體的融合瘤的其他較佳動物系統是大鼠和兔系統(例如，描述於S Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995)，也參見Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005))。
在另一個較佳具體例中，定向針對PD-1的人類單株抗體可以使用攜帶部分人類免疫系統而不是小鼠系統的轉基因或轉染色體小鼠來生成。這些轉基因和轉染色體小鼠包括分別已知為HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，並且在本文中統稱為「轉基因小鼠」。可以如WO 2004/035607中針對CD20詳細說明那般在此類轉基因小鼠中生產人類抗體。
用於生成單株抗體的又一個策略是直接從產生明確策略的抗體的淋巴細胞中分離編碼抗體的基因，例如參見Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy。有關重組抗體工程的細節，另參見Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8與Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1。 免疫接種
為了生產針對PD-1的抗體，可以如所述用衍生自PD-1序列之結合載體的肽、重組表現的PD-1抗原或其片段的富集製劑及/或表現PD-1的細胞來免疫動物(例如兔或小鼠)。或者，可以用編碼全長人類PD-1或其片段的DNA免疫兔或小鼠。如果使用經純化或富集的PD-1抗原製劑進行免疫並未產生抗體的情況下，則也可以用表現PD-1的細胞(例如細胞株)免疫兔或小鼠以促進免疫反應。
可以在免疫方案的整個過程中透過尾靜脈或眼眶後採血獲得血漿和血清樣品來監測免疫反應。具有足夠效價的抗PD-1免疫球蛋白的兔或小鼠可用於融合。兔或小鼠可在犧牲與摘除脾臟前3天腹膜內或靜脈內用表現PD-1的細胞追加免疫，以增加融合瘤分泌特異性抗體的速率。 生成生產單株抗體的融合瘤
為了生禪生產針對PD-1的單株抗體的融合瘤，可以分離來自經免疫動物(例如兔或小鼠)的脾細胞和淋巴結細胞，並將其與適當的永生化細胞株(諸如小鼠或兔骨髓瘤細胞株)融合。然後可以針對生產抗原特異性抗體來篩選所得融合瘤。接著可以透過ELISA篩選各個孔中分泌抗體的融合瘤。藉著使用表現PD-1的細胞進行免疫螢光和FACS分析，可以鑑定出對PD-1具有特異性的抗體。分泌抗體的融合瘤可以重新鋪盤，再次篩選，且如果抗PD-1單株抗體仍然呈陽性，則可以藉由有限稀釋進行次選殖。接著可以在活體外培養穩定的次殖株，以在組織培養基中生成抗體進行特徵鑑定。 生成生產單株抗體的轉染瘤
還可以使用例如本領域熟知的重組DNA技術和基因轉染方法的組合在宿主細胞轉染瘤中生產第一態樣的抗體(Morrison, S. (1985) Science 229: 1202)。
如本文所用，術語「轉染瘤」包括表現抗體的重組真核宿主細胞，諸如CHO細胞、NS/0細胞、HEK293細胞、HEK293T細胞、HEK293T/17植物細胞或真菌，包括酵母細胞。
例如，在一個具體例中，感興趣的基因(例如抗體基因)可以接合到表現載體(諸如真核表現質體，諸如WO 87/04462、89/01036和EP 338 841中揭示的GS基因表現系統所使用的質體，或本領域眾所周知的其他表現系統)中。可以將具有經選殖抗體基因的純化質體引入真核宿主細胞(諸如CHO細胞、NS/0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、Vero細胞、HeLa細胞、HEK293T細胞、HEK293T/17或HEK293細胞，或者可替代地其他真核細胞，像是植物來源的細胞、真菌或酵母細胞)中。用於引入這些基因的方法可以是本領域描述的方法，諸如電穿孔、lipofectine、lipofectamine或其他。將這些抗體基因引入宿主細胞後，可以鑑定並挑出表現抗體的細胞。這些細胞代表轉染瘤，然後可以擴增其表現量並放大規模以生產抗體。可以從這些培養物上清液及/或細胞中分離和純化重組抗體。
或者，經選殖的抗體基因可以在其他表現系統中表現，包括原核細胞，諸如微生物，例如大腸桿菌。此外，抗體可以在轉基因非人類動物中生產，諸如在綿羊和兔的乳汁中或在母雞的蛋中，或在轉基因植物中生產；參見Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181；Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157；以及Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839。
習於技藝者可以容易地製備本文所述的胺基酸序列變體，例如藉由重組DNA操作。例如Sambrook et al. (1989)中詳細說明了操作用於製備具有取代、添加、插入或缺失的蛋白質和肽的DNA序列。
第一態樣的抗體還可以使用習於技藝者熟知的重組DNA技術在經遺傳修飾的病毒(諸如RNA病毒)中生產。可用於拯救表現抗體或其片段的病毒顆粒的重組病毒基因體可例如藉由稱為「反向遺傳學」的方法獲得。 使用部分抗體序列來表現完整抗體(即人源化和嵌合化)。 a) 嵌合化
鼠類或兔單株抗體可用作為人類的治療性抗體，但由於這些抗體在重複施用時於人類體內有高度免疫原性，這可能會導致治療效果降低。主要的免疫原性是由重鏈恆定區媒介的。如果將相應抗體嵌合或人源化，便可以降低或完全避免鼠類或兔抗體在人體中的免疫原性。嵌合抗體是其不同部分衍生自不同動物物種的抗體，諸如那些具有衍生自鼠類或兔抗體的可變區和人類免疫球蛋白恆定區的抗體。抗體的嵌合化是透過將鼠類或兔抗體重鏈和輕鏈的可變區與人類重鏈和輕鏈的恆定區接合來實現的(例如，如Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy, ISBN-0-89603-918-8中所描述的)。在一個較佳具體例中，藉由將人類卡帕輕鏈恆定區接合至鼠類或兔輕鏈可變區來生成嵌合抗體。在另一個較佳具體例中，可以藉由將人類拉目達-輕鏈恆定區接合至鼠類或兔輕鏈可變區來生成嵌合抗體。用於生成嵌合抗體的較佳重鏈恆定區是IgG1、IgG3和IgG4。用於生成嵌合抗體的其他較佳重鏈恆定區是IgG2、IgA、IgD和IgM。 b) 人源化
抗體主要透過位於六個重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)中的胺基酸殘基與目標抗原交互作用。因此，個別抗體之間CDR內的胺基酸序列比CDR外的序列更加多樣化。由於CDR序列負責大多數抗體-抗原交互作用，因此可以藉由構建包括來自特定天然存在抗體的CDR序列並移植到具有不同性質之不同抗體的框架序列上的表現載體來表現模擬特定天然存在抗體的性質的重組抗體(參見例如Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327；Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525；及Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033)。此類框架序列可以從包括生殖系抗體基因序列的公共DNA數據庫獲得。這些生殖系序列將不同於成熟抗體基因序列，因為它們不包括完全組裝的可變基因，這些基因是在B細胞成熟期間因為V(D)J接合形成的。生殖系基因序列也將與個體的高親和力二級譜抗體的序列在整個可變區平均不同。例如，體細胞突變在框架區1的胺基端部分和框架區4的羧基端部分相對較少。此外，許多體細胞突變不會顯著改變抗體的結合性質。為此，沒有必要獲得特定抗體的完整DNA序列來重建結合性質與原始抗體相似的完整重組抗體(參見WO 99/45962)。橫跨CDR區的部分重鏈和輕鏈序列通常就足以用於此目的。部分序列用於確定哪些生殖系可變和接合基因片段對重組抗體可變基因有貢獻。然後使用生殖系序列來填充可變區的缺失部分。重鏈和輕鏈前導序列在蛋白質成熟期間被切下，不會影響最終抗體的性質。為了添加缺失的序列，可以透過接合或PCR擴增將經選殖的cDNA序列與合成寡核苷酸合併。或者，整個可變區可以合成為一組短的、重疊的寡核苷酸，並透過PCR擴增合併而創造出完全合成的可變區純系。這個過程具有某些優點，諸如消除或納入特定限制位點，或特定密碼子的優化。
來自融合瘤的重鏈和輕鏈轉錄本的核苷酸序列被用來設計一組重疊的合成寡核苷酸，以創造出具有與天然序列相同的胺基酸編碼能力的合成V序列。合成的重鏈和卡帕鏈序列可能在三個方面與天然序列不同：重複的核苷酸鹼基串被打斷以促進寡核苷酸合成和PCR擴增；根據Kozak規則併入最佳轉譯起始位點(Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870)；以及HindIII位點被設計在轉譯起始位點的上游。
對於重鏈和輕鏈可變區來說，優化的編碼股和對應的非編碼股序列大約在對應非編碼寡核苷酸的中點處被分解成30-50個核苷酸。因此，就每條鏈來說，寡核苷酸可以組裝成橫跨150-400個核苷酸區段的重疊雙股組。然後使用池作為模板來產生具有150-400個核苷酸的PCR擴增產物。通常，單個可變區寡核苷酸組將被分成兩個池，分別擴增以生成兩個重疊的PCR產物。然後藉由PCR擴增將這些重疊產物合併起來，形成完整的可變區。還可能需要在PCR擴增中納入重鏈或輕鏈恆定區的重疊片段，以生成可以容易地被選殖到表現載體構建體中的片段。
接著將重建的嵌合或人源化重鏈與輕鏈可變區與選殖的啟動子、前導序列、轉譯起始序列、恆定區、3'非轉譯序列、聚腺苷酸化和轉錄終止序列組合而形成表現載體構建體。重鏈和輕鏈表現構建體可以組合成單個載體、共轉染、連續轉染或個別轉染到宿主細胞中，然後融合以形成表現兩條鏈的宿主細胞。用於構建人類IgGκ表現載體的質體對習於技藝者來說是可獲得的。可以構建質體，使得經PCR擴增的V重鏈和V卡帕輕鏈cDNA序列可以用於重建完整的重鏈和輕鏈袖珍基因。這些質體可用來完整表現人類源或嵌合IgG1卡帕或IgG4卡帕抗體。可以構建類似的質體以供表現其他重鏈同型，或表現包含拉目達輕鏈的抗體。
因此，根據本發明，第一態樣的抗PD-1抗體的結構特徵可用於創建出結構上相關的人源化抗PD-1抗體，其保有第一態樣抗體的至少一個功能性值，諸如與PD-1結合。更具體地，如本文揭示的一或多個CDR區可以與已知的人類構架區和CDR重組合併以創建第一態樣的額外經重組工程改造的人源化抗PD-1抗體。
第一態樣的抗體可藉由包含以下步驟的方法獲得：用具有如SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23中所示胺基酸序列的蛋白質或肽，或其免疫原性片段，或表現該蛋白質或肽或其免疫原性片段的核酸或宿主細胞或病毒免疫動物(例如轉基因小鼠)。較佳地，由此獲得的抗體對前述蛋白質、肽或其免疫原性片段具有特異性。核酸或宿主細胞或病毒可能是本文揭示的核酸或宿主細胞或病毒。
本發明還提供了來自如上所述之非人類動物的經分離B細胞。然後可以藉由與永生化細胞融合使經分離的B細胞永生化，以提供第一態樣的抗體來源(例如融合瘤)。此類融合瘤(即，其生產第一態樣的抗體)也包括在本發明的範疇內。
因此，在第二態樣中，提供一種能夠生產第一態樣抗體的融合瘤。如本文所例示的，第一態樣的抗體可以直接從表現該抗體的融合瘤獲得，或者可以在宿主細胞(例如CHO細胞或淋巴細胞)中選殖和重組表現。或者，它們可以在轉基因非人類動物或植物中重組生產。 III.  抗體的特徵鑑定 與抗原表現細胞的結合
抗體結合PD-1及/或阻斷PD-1/配體交互作用的能力可以使用標準結合分析、報導基因阻斷分析、T細胞增生分析等來測定，諸如在實例中所示。 抗體結合的特徵鑑定
為了純化抗PD-1抗體，可以將選定的融合瘤培養在兩公升旋轉燒瓶中以純化單株抗體。或者，抗PD-1抗體可以在基於透析的生物反應器中生產。可過濾上清液，如果需要的話，可以在用蛋白G-瓊脂糖或蛋白A-瓊脂糖進行親和力層析之前予以濃縮。經溶析的IgG可以藉由凝膠電泳和高效液相層析進行檢查，以確保純度。可以將緩衝溶液更換為PBS，並且可以使用消光係數1.43藉由OD280測定濃度。單株抗體可以等分並儲存在-80℃下。為了確定所選的抗PD-1單株抗體是否結合至獨有的表位，可以使用定點或多定點誘變。 測定PD-1結合特異性
抗PD-1抗體對PD-1的結合效力可以藉由ELISA技術確定。例如，PD-1/Fc嵌合體可以塗覆在微量滴定盤上。阻斷後，可加入待測試的抗PD-1抗體並進行培育。然後，在進行洗滌程序之後，可以添加與例如辣根過氧化物酶偶聯的抗人類IgG用於偵測。
抗PD-1抗體對細胞表面表現之PD-1的結合能力可以使用異位表現PD-1的HEK-293細胞進行分析。可以將不同濃度的抗PD-1抗體添加到這些細胞中並進行培育。然後可以添加與螢光標籤結合的抗Ig抗體，並可以記錄細胞相關的免疫螢光信號。 測定阻斷能力
抗PD-1抗體阻斷PD-1/PD-L1交互作用的效力可以使用PD-1/PD-L1阻斷生物分析進行分析。表現PD-L1的細胞可以與不同濃度的待測試抗體一起培育。添加表現PD-1的效應子細胞並培育由此獲得的混合物後，例如，可以添加螢光素酶分析試劑並且可以測定發光。可以如按照製造商所述使用PD-1/PD-L1阻斷生物分析(Promega，目錄號J12150)或類似套組。
為了對抗PD1抗體在具有活性PD-1/PD-L1軸的抗原特異性分析中誘導T細胞增生的能力進行特徵鑑定，可以進行表現腫瘤抗原的樹突狀細胞(DC)。這個分析以非限制性方式詳述於下面實例5中。 流式細胞測量分析和免疫螢光顯微鏡
為了證明經免疫動物血清中存在抗PD-1抗體或單株抗體結合至表現PD-1的活細胞，可以按照習於技藝者熟知的方式使用流式細胞分析術或免疫螢光顯微術進行分析。 表位測繪
如“ Epitope Mapping Protocols”, Methods in Molecular Biology by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9中以及„ Epitope Mapping: A Practical Approach“, Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay中所詳述，對第一態樣抗體所辨識之表位進行測繪。 IV.  結合至PD-1的雙特異性/多特異性抗體
在第一態樣的抗體的一個具體例中，針對PD-1的抗體可以衍生化或連接至另一個功能分子，例如另一個肽或蛋白質(例如Fab'片段)以生成結合至多個結合位點或目標表位的雙特異性或多特異性分子。例如，第一態樣的抗體可以在功能上連接(例如藉由化學偶聯、基因融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他結合分子(諸如另一個抗體、肽或結合模擬物)。
因此，本發明包括雙特異性和多特異性分子，其包含至少一個針對PD-1的第一結合特異性和針對第二目標表位(或針對其他目標表位)的第二結合特異性(或其他結合特異性)。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，抗體是多特異性抗體，其包含結合至PD-1的第一抗原結合區以及結合至另一個抗原的至少一個其他抗原結合區。在一個具體例中，抗體是雙特異性抗體，其包含結合至PD-1的第一抗原結合區以及結合至另一抗原的第二抗原結合區。
術語「雙特異性分子」意欲包括具有兩種不同結合特異性的任何試劑，例如蛋白質、肽或者蛋白質或肽複合物。例如，分子可以與(a)細胞表面抗原，以及(b)效應子細胞表面上的Fc受體結合或交互作用。術語「多特異性分子」或「異特異性分子」意欲包括具有超過兩種不同結合特異性的任何試劑，例如蛋白質、肽、或蛋白質或肽複合物。例如，分子可以與(a)細胞表面抗原、(b)效應子細胞表面上的Fc受體以及(c)至少一種其他組分結合或交互作用。因此，本發明包括但不限於針對PD-1和其他目標(諸如效應子細胞上的Fc受體)的雙特異性、三特異性、四特異性和其他多特異性分子。術語「雙特異性抗體」還包括雙功能抗體。雙功能抗體是二價雙特異性抗體，其中VH和VL結構域在單條多肽鏈上表現，但使用短到不允許同一鏈上的兩個結構域配對的連接子，從而迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448；Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123)。
如本文所用，術語「異源抗體」是指兩個或更多個抗體、其衍生物，或連接在一起的抗原結合區，其中至少兩者具有不同的特異性。這些不同的特異性包括針對效應子細胞上的Fc受體的結合特異性，以及針對目標細胞(例如腫瘤細胞)上的抗原或表位的結合特異性。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，結合至PD-1的多特異性抗體的第一抗原結合區包含如本文中所示的重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)。
在第一態樣的抗體的一個具體例中，多特異性抗體的第一和第二結合臂衍生自全長抗體，諸如衍生自如上文提到的全長IgG1，λ(拉目達)或IgG1，κ(卡帕)抗體。在一個具體例中，第一和第二結合臂衍生自單株抗體。例如或在一個較佳具體例中，第一及/或第二結合臂衍生自IgG1κ同型或λ同型，較佳包含人類IgG1/κ或人類IgG1/λ恆定部分。
本發明的多特異性或雙特異性抗體結合至PD-1的該第一抗原結合區可能包含與PD-L1及/或PD-L2競爭PD-1結合的抗體的重鏈和輕鏈可變區。在多特異性或雙特異性抗體的一個具體例中，結合至PD-1的第一抗原結合區包含如本文中所示的重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)。
在多特異性或雙特異性抗體的一個具體例中，第二結合特異性可以針對另一個免疫檢查點，從而抑制或活化/刺激相應檢查點。其他可靶向的檢查點抑制劑包括但不限於CTLA4、PD-L1、TIM-3、KIR或LAG-3。可以被第二結合特異性靶向的檢查點活化因子包括但不限於CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR或ICOS。因此，包括能夠結合到至少一個其他檢查點並透過相應結合抑制PD-1的雙特異性和多特異性分子。第二結合特異性可以是拮抗性的，諸如抗-CTLA4、抗-PD-L1、抗-TIM-3、抗-KIR或抗-LAG-3，或者可以是促效性的，諸如抗-CD27、抗-CD28、抗-CD40、抗-CD122、抗-CD137、抗-OX40、抗-GITR或抗-ICOS。除了至少一種其他免疫檢查點之外，還含括能夠結合至PD-1的多特異性分子。結合特異性的較佳組合包括抗PD1和抗PD-L1或抗PD-1和抗CTLA4。
例如，CD28提供了T細胞活化所必需的刺激誘導。這同樣適用於例如CD137。CD137 (4-1BB、TNFRSF9)是腫瘤壞死因子(TNF)受體(TNFR)超家族的一個成員。CD137是CD8 +和CD4 +T細胞、調節性T細胞(Treg)、自然殺手(NK)和NKT細胞、B細胞和嗜中性球上的共刺激分子。在T細胞上，CD137不是組成型表現，而是在T細胞受體(TCR)活化後被誘導。經由其天然配體4-1BBL或促效抗體刺激會導致使用TNFR相關因子(TRAF)-2和TRAF-1作為轉接因子的信號傳導。CD137的早期信號傳導涉及K-63聚泛素化反應，最終導致核因子(NF)-κB和促分裂原活化蛋白(MAP)-激酶路徑的活化。信號傳導會導致T細胞共刺激、增生、細胞介素生產、成熟增加以及CD8 +T細胞存活時間延長。針對CD137的促效抗體已顯示在各種臨床前模型中促進T細胞的抗腫瘤控制(Murillo et al. 2008 Clin. Cancer Res. 14(21): 6895-6906)。刺激CD137的抗體可以誘導T細胞的存活與增生，從而增強抗腫瘤免疫反應。刺激CD137的抗體已揭示在先前技術中，並且包括烏瑞蘆單抗(urelumab) (一種人類IgG4抗體) (WO 2005/035584)和烏托魯單抗(utomilumab) (一種人類IgG2抗體) (Fisher et al. 2012 Cancer Immunol. Immunother. 61: 1721-1733)。
在多特異性或雙特異性抗體的一個具體例中，第二結合特異性可以提供抗血管生成活性。因此，第二結合特異性能夠靶向血管內皮生長因子(VEGF)或其受體VEGFR (例如VEGFR1、2、3)。或者或另外，第二結合特異性可能會靶向PDGFR、c-Kit、Raf及/或RET。
在多特異性或雙特異性抗體的一個具體例中，第一態樣的雙特異性或多特異性分子的第二或其他結合特異性可以定向至腫瘤抗原並且能夠結合至腫瘤抗原，這使得抗體有針對癌細胞的特異性。在一個具體例中，癌細胞可以選自由黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、乳癌、胃和胃食道接合處癌、胰臟腺癌、卵巢癌和淋巴瘤組成之群。腫瘤抗原可以是表面抗原或MHC背景下所呈遞的抗原。例如，結合特異性可以基於B細胞受體(抗體)或T細胞受體。
如本文所用，術語「腫瘤抗原」是指可能衍生自細胞質、細胞表面和細胞核的癌細胞組分。特別地，它是指在細胞內產生的抗原或如腫瘤細胞上的表面抗原。腫瘤抗原通常偏好由癌細胞表現(例如，其在癌細胞中表現之量高於在非癌細胞中表現)，且在一些情況下，其僅由癌細胞表現。腫瘤抗原的實例包括但不限於p53、ART-4、BAGE、β-鏈蛋白/m、Bcr-abL CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、密連蛋白家族的細胞表面蛋白(諸如CLAUDIN-6、CLAUDIN-18.2和CLAUDIN-12)、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap 100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT (或hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A (較佳MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12)、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1R、肌凝蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、pl90小BCR-abL、Pml/RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE，WT和WT-1。
在一個具體例中，被靶向的第二抗原選自由以下組成之群：NY-ESO-1 (UniProt P78358)、酪胺酸酶(UniProt P14679)、MAGE-A3 (UniProt P43357)、TPTE (UniProt P56180)、KLK2 (UniProt P20151)、PSA(KLK3) (UniProt P07288)、PAP(ACPP、UniProt P15309)、HOXB13 (UniProt Q92826)、NKX3-1 (UniProt Q99801)、HPV16 E6/E7 (UniProt P03126/P03129)；HPV18 E6/E7 (UniProt P06463/P06788)；HPV31 E6/E7 (UniProt P17386/P17387)；HPV33 E6/E7 (UniProt P06427/P06429)；HPV45 E6/E7 (UniProt P21735/P21736)；HPV58 E6/E7 (UniProt P26555/P26557)、PRAME (UniProt P78395)、ACTL8 (UniProt Q9H568)、CXorf61 (KKLC1、UniProt Q5H943)、MAGE-A9B (UniProt P43362)、CLDN6 (UniProt P56747)、PLAC1 (UniProt Q9HBJ0)，以及p53 (UniProt P04637)。
涉及這些抗原的治療方法可能旨在治療癌症，其中癌細胞的特徵在於表現對應抗原。還可以使用本文所述的抗原，特別是呈組合形式的NY-ESO-1、酪胺酸酶、MAGE-A3、TPTE、KLK2、PSA(KLK3)、PAP(ACPP)、HOXB13、NKX3-1、HPV16 E6/E7；HPV18 E6/E7；HPV31 E6/E7；HPV33 E6/E7；HPV45 E6/E7；HPV58 E6/E7、PRAME、ACTL8、CXorf61 (KKLC1)、MAGE-A9B、CLDN6、PLAC1和p53。涉及此類抗原組合的治療方法可能旨在治療癌症，其中癌細胞的特徵在於表現對應抗原組合中的兩個或更多個抗原，或者其中患有某種待治療癌症之患者的大部分(例如至少80%、至少90%或甚至更多)癌細胞表現組合中的一或多種對應抗原。此類組合可能包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種或至少6種抗原的組合。因此，該組合可以包含3、4、5、6、7或8種抗原。
關於皮膚黑色素瘤的治療，進一步的結合特異性可以至少靶向以下抗原之一者：NY-ESO-1、酪胺酸酶、MAGE-A3及/或TPTE。
關於前列腺癌的治療，進一步的結合特異性可以至少靶向以下抗原之一者：KLK2、PSA(KLK3)、PAP(ACPP)、HOXB13及/或NKX3-1。
關於乳癌的治療，進一步的結合特異性可以至少靶向以下抗原之一者：PRAME、ACTL8、CXorf61 (KKLC1)、MAGEA3、MAGE-A9B、CLDN6、NY-ESO-1及/或PLAC1。
關於卵巢癌的治療，進一步的結合特異性可以至少靶向以下抗原之一者：CLDN6、p53及/或PRAME。
如本文所用，術語「效應子細胞」是指涉入免疫反應的效應子階段的免疫細胞，與免疫反應的認識階段和活化階段相反。例示性免疫細胞包括骨髓或淋巴來源的細胞，例如淋巴細胞(例如B細胞和T細胞，包括溶細胞性T細胞(CTL)、殺手細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸性球、嗜中性球、多形核細胞、顆粒球、肥大細胞和嗜鹼性球)。
「目標細胞」應表示個體(例如人類或動物)中可以被第一態樣抗體靶向的任何不樂見的細胞。在較佳具體例中，目標細胞是腫瘤細胞。
第一態樣的雙特異性和多特異性分子可以使用化學技術(參見例如D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807)、「多源融合瘤(polydoma)」技術(參見Reading的US 4,474,893)，或重組DNA技術來製造。
具體地，第一態樣的雙特異性和多特異性分子可以藉由使用本領域已知的方法結合組分結合特異性(例如抗CTLA4和抗PD-1結合特異性)來製備。例如，雙特異性和多特異性分子的各個結合特異性可以單獨生成，然後彼此結合。當結合特異性是蛋白質或肽時，可以使用多種偶聯劑或交聯劑進行共價結合。交聯劑的實例包括蛋白A、碳二亞胺、N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) (DTNB)、鄰亞苯基二馬來醯亞胺(oPDM)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，和磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC) (參見例如Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686；Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648)。其他方法包括Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78,118-132)；Brennan et al. (Science (1985) 229: 81-83)和Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375)所述的那些。較佳的結合劑是SATA和磺基-SMCC，兩者均購自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。
當結合特異性是抗體時，它們可以經由兩條重鏈的C端鉸鏈區的巰基鍵結來結合。在一個尤佳的具體例中，在接合之前，鉸鏈區被修飾為含有奇數個巰基殘基，較佳一個。
或者，兩種結合特異性可以在同一載體中編碼並在同一宿主細胞中表現和組裝。當雙特異性和多特異性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab') 2或配體x Fab融合蛋白時，這個方法特別管用。第一態樣的雙特異性和多特異性分子(例如雙特異性分子)可以是單鏈分子，諸如單鏈雙特異性抗體、包含一個單鏈抗體和結合決定子的單鏈雙特異性分子，或包含兩個結合決定子的單鏈雙特異性分子。雙特異性和多特異性分子也可以是單鏈分子或可能包含至少兩個單鏈分子。用於製備雙特異性和多特異性分子的方法描述於例如US 5,260,203；US 5,455,030；US 4,881,175；US 5,132,405；US 5,091,513；US 5,476,786；US 5,013,653；US 5,258,498；以及US 5,482,858。因此，本發明含括所有這些抗體形式。
雙特異性和多特異性分子與其特定目標的結合可以藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如，生長抑制)或西方墨點分析來確認。這些分析中的每一者通常透過採用對感興趣的複合物具特異性的經標記試劑(例如抗體)來偵測特別感興趣的蛋白質-抗體複合物的存在。例如，可以使用例如辨識並特異地結合至抗體-FcR複合物的酶聯抗體或抗體片段來偵測FcR-抗體複合物。或者，可以使用多種其他免疫分析中的任何一者來偵測複合物。例如，抗體可以經放射性標記並用於放射免疫分析(RIA) (參見例如Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986)。放射性同位素可以藉由如使用γ計數器或閃爍計數器的方法或者藉由自動放射攝影術來偵測。 V.   免疫接合物
第一態樣的抗PD-1抗體可以接合至某一個部分或試劑。此類接合物在本文中也稱為「免疫接合物」。
在第三態樣中，提供包含偶聯至某一個部分或試劑的第一態樣抗體的接合物。在第三態樣的一個具體例中，該部分或試劑選自由放射性同位素、酶、染料、藥物、毒素和細胞毒性劑組成之群。染料可以是例如螢光染料或螢光標籤。在一個具體例中，該部分或試劑能夠實現免疫細胞活化。例如，該部分或試劑可以是與T細胞上的CD28交互作用的CD80。
第一態樣的抗體可以偶聯或在功能上連接(例如，藉由化學偶聯、基因融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他分子實體，諸如對PD-1具有結合特異性的另一種抗體。一或多種其他抗體較佳是第一態樣的抗體。
該部分或藥劑可以是結合至抗體的酶。此類抗體可用於酶免疫分析，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)或酶倍增免疫分析技術(EMIT)，或例如西方墨點。
或者或另外，放射性核種(放射性同位素)可以作為部分或試劑結合至抗體。此類接合物可用於治療，但也可用於診斷目的(放射免疫分析、正電子發射斷層攝影術(「免疫-PET」))。放射性核種可以經由複合劑結合至抗體。第一態樣的抗體還可以結合至放射性同位素，例如碘131、釔90或銦111，以生成用於治療病症(諸如癌症)的細胞毒性放射性藥劑。根據第一態樣的抗體可以附接至連接子-螯合劑(例如tiuxetan)，其允許抗體接合至放射性同位素。
或者或另外，該部分或試劑可能是標籤，例如螢光標籤，也稱為螢光標記或螢光探針。溴化乙錠、螢光素和綠色螢光蛋白是常見的標籤。
第三態樣還含括包含治療部分或治療劑的接合物。治療部分或治療劑可能是細胞介素或CD80，其結合至CD28，在T細胞反應中產生共刺激信號。治療部分或治療劑還可能是細胞毒素或藥物(例如免疫抑制劑)。包括一或多種細胞毒素的免疫接合物被稱為「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害並且特別是殺死細胞的任何試劑。實例包括紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素、依托泊苷、替諾泊苷、長春新鹼、長春花鹼、秋水仙素、多柔比星、柔紅黴素、二羥基蒽二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤黴素，及其類似物或同系物。
用於形成第三態樣之免疫接合物的合適治療劑包括但不限於抗代謝物(例如甲胺蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達拉濱、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪)、烷化劑(例如氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法崙、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂黴素C和順式二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑)、蒽環類(例如柔紅黴素(以前稱為柔紅黴素)和阿黴素)、抗生素(例如放線菌素D (以前的放線菌素)、博來黴素、光神黴素和蒽黴素(AMC))，以及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼和長春花鹼)。在一個較佳具體例中，治療劑是細胞毒性劑或放射性毒性劑。在另一個具體例中，治療劑是免疫抑制劑。在另一個具體例中，治療劑是GM-CSF。在一個較佳具體例中，治療劑是阿黴素、順鉑、博來黴素、硫酸鹽、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環磷醯胺或蓖麻毒蛋白A。
第三態樣的抗體接合物可用於修飾給定的生物反應，並且藥物部分不應被解釋為限於典型的化學治療劑。例如，藥物部分可能是具有所需生物活性的蛋白質或多肽。此類蛋白質可包括例如酶活化毒素或其活性片段，諸如相思子素(abrin)、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質，諸如腫瘤壞死因子或干擾素γ；或生物反應調節劑，諸如淋巴激素、介白素-1 (「IL-1」)、介白素-2 (「IL-2」)、介白素-6 (「IL-6」)、顆粒球巨噬細胞群落刺激劑因子(「GM-CSF」)、顆粒球群落刺激因子(「G-CSF」)或其他生長因子。
用於將此等治療部分結合至抗體的技術是眾所周知的，參見例如Arnon et al., " Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom et al., " Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, " Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；" Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)，以及Thorpe et al., " The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)。接合物的部分(例如治療部分)或藥劑可以藉由連接子序列結合至抗體。合適的連接子序列是習於技藝者已知的。
在第四態樣中，提供一種多聚體，其包含第一態樣的至少兩種抗體，或第三態樣的至少兩個接合物，或第一態樣的一或多個抗體與第三態樣的一或多個接合物的混合物。在一個具體例中，多聚體包含4至8個第一態樣的抗體或4至8個第三態樣的接合物。這些態樣的多聚體的抗體或接合物可以藉由肽彼此連接。第四態樣的多聚體的特徵在於與PD-1的抗原結合位點數量增加。
因此，含括了多種抗體接合物、雙特異性和多特異性分子以及融合蛋白，所有這些都與表現PD-1的細胞結合且可以用於將其他分子靶向至此等細胞。 VI.  編碼抗體的核酸
在第五態樣中，本發明還有關核酸或核酸分子，其包含編碼抗體或其部分的基因或核酸序列，該抗體或其部分為例如本文所述之抗體鏈，例如有關第一態樣如本文所述能夠結合至PD-1的抗體的抗體重鏈，及/或有關第一態樣如本文所述能夠結合至PD-1的抗體的抗體輕鏈。
如本文所用，術語「核酸分子」或「核酸」意欲包括去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)分子，例如活體外轉錄的RNA (IVT RNA)。如本文所用，核酸包括基因體DNA、cDNA、mRNA、重組生產的和化學合成的分子。根據第四態樣，核酸可能以單股或雙股且線性或共價環狀閉合分子存在。例如，核酸是雙股DNA。核酸可例如以RNA的形式用於引入(即轉染)細胞，其可藉由活體外轉錄從DNA模板製備。此外，RNA可以在施用前藉由穩定序列、加帽和聚腺苷酸化進行修飾。
如本文所用，術語「核酸編碼」表示核酸如果存在於適當的環境中(較佳細胞內)，便可以被表現以生產其編碼的蛋白質或肽。
可以分離根據第五態樣的核酸。如本文所用，術語「經分離的核酸」表示核酸(i)在活體外擴增，例如藉由聚合酶鏈反應(PCR)、(ii)藉由選殖重組生產、(iii)純化，例如藉由切割和凝膠電泳分級分離，或(iv)合成，例如藉由化學合成。經分離的核酸是可用於藉由重組DNA技術操作的核酸。
在第五態樣的一個具體例中，核酸(例如RNA)與至少一種對核酸具有穩定作用的試劑結合。穩定作用可包含防止RNA降解。在這個態樣的一個具體例中，至少一種試劑與該RNA形成複合物及/或包圍該RNA。在一個具體例中，至少一種試劑包含至少一種選自由RNA複合脂質、RNA複合聚合物和RNA複合肽或蛋白質組成之群的試劑。例如，至少一種試劑選自由聚乙烯亞胺、魚精蛋白、聚-L-離胺酸、聚-L-精胺酸和組蛋白組成之群中的至少一者。
根據第五態樣，核酸可能單獨存在或與其他核酸組合存在，其他核酸可以是同源的或異源的。在較佳的具體例中，核酸在功能上連接至表現控制序列，該表現控制序列與該核酸可能是同源或異源的。術語「同源」表示核酸也天然在功能上連接至表現控制序列，而術語「異源」表示核酸並未天然在功能上連接至表現控制序列。
如果核酸(諸如表現RNA及/或蛋白質或肽的核酸)和表現控制序列以使得該核酸的表現或轉錄受到該表現控制序列控制或影響的方式彼此共價連接的話，則它們「在功能上」彼此連接。如果核酸要被轉譯成功能性蛋白質，則利用與編碼序列在功能上連接的表現控制序列，誘導該表現控制序列導致該核酸轉錄，而不引起編碼序列中的框移或者該編碼序列不能被轉譯成所需的蛋白質或肽。
如本文所用，術語「表現控制序列」包含啟動子、核醣體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA轉譯的其他控制元件。在特定具體例中，可以調節表現控制序列。表現控制序列的確切結構可能隨物種或細胞類型的不同而改變，但通常包含分別涉及轉錄與轉譯起始的5'-非轉錄序列以及5'-和3'-非轉譯序列(5'-UTR；3'-UTR)，諸如TATA匣、加帽序列、CAAT序列與類似者。更具體地，5'-非轉錄表現控制序列包含啟動子區域，該啟動子區域包括用於在功能上連接的核酸的轉錄控制的啟動子序列。表現控制序列還可以包含增強子序列或上游活化子序列。表現控制序列或調節序列相對於核酸可以是同源或異源的。
如本文所用，術語「啟動子」或「啟動子區」是有關位於被表現的核酸序列的上游(5')並透過提供RNA-聚合酶的辨識和結合位點來控制該序列表現的核酸序列。「啟動子區」可能包括涉入基因轉錄調節的其他因子的更多辨識和結合位點。啟動子可能控制原核或真核基因的轉錄。此外，啟動子可能是「誘導性的」並且可以回應於誘導劑而啟動轉錄，或者如果轉錄不受誘導劑控制則可能是「組成性的」。如果不存在誘導劑，則受到誘導性啟動子控制的基因不表現或僅小程度表現。在誘導劑存在的情況下，基因被開啟或轉錄量增加。一般來說，這是透過結合特定轉錄因子所媒介的。
根據第五態樣，偏好的啟動子包括SP6、T3和T7聚合酶的啟動子、人類U6 RNA啟動子、CMV啟動子及其人工雜合啟動子(例如CMV)，其中一部分或多個部分融合至其他細胞蛋白(諸如人類GAPDH (甘油醛-3-磷酸去氫酶))的基因的啟動子的一部分或多個部分，並且包括或不包括額外內含子。
術語「表現」在本文中以其最普遍的含義使用並且包含RNA或RNA和蛋白質/肽的產生。它還包含核酸的部分表現。此外，表現可以瞬時或穩定地進行。
在第五態樣的一個具體例中，核酸是RNA，更佳活體外轉錄的RNA(IVT RNA)或合成RNA。
核酸(諸如RNA)可以用於引入(即轉染)細胞，特別是以RNA的形式，其可以藉由活體外轉錄從DNA模板製備。此外，RNA可以在施用前藉由穩定序列、加帽和聚腺苷酸化進行修飾。
如本文所用，術語「RNA」是有關包含核糖核苷酸殘基且較佳完全或基本上由核糖核苷酸殘基組成的分子。「核糖核苷酸」是有關在β-D-呋喃核糖基的2'-位置處具有羥基的核苷酸。術語「RNA」包括雙股RNA、單股RNA、經分離的RNA(諸如部分或完全純化的RNA)、基本上純的RNA、合成RNA和重組生成的RNA(諸如經修飾的RNA，其因為一或多個核苷酸的添加、缺失、取代及/或改變而不同於天然存在的RNA)。此等改變可以包括添加非核苷酸材料，諸如添加到RNA的末端或內部，例如添加到RNA的一或多個核苷酸處。RNA分子中的核苷酸還可以包含非標準核苷酸，諸如非天然存在的核苷酸或化學合成的核苷酸或去氧核苷酸。這些經過改變的RNA可以稱為類似物或天然存在的RNA的類似物。
如本文所用，術語「RNA」包括並較佳是有關「mRNA」。術語「mRNA」表示「信使-RNA」並且有關藉由使用DNA模板生成並編碼肽或多肽的「轉錄本」。用於控制轉錄的啟動子可以是任何RNA聚合酶的任何啟動子。用於活體外轉錄的DNA模板可透過選殖核酸(特別是cDNA)，並將其引入到用於活體外轉錄的合適載體中來獲得。cDNA可以藉由RNA的逆轉錄獲得。通常，mRNA包含5'-UTR、蛋白質編碼區，以及3'-UTR。mRNA在細胞內和活體外僅具有受限的半衰期。mRNA可能透過活體外轉錄從DNA模板生成。活體外轉錄方法是技術人員熟知的。例如，有多種市售活體外轉錄套組可用。如本文所用，術語「轉錄」是有關一個其中DNA序列中的遺傳密碼被轉錄成RNA的過程。
RNA的穩定性和轉譯效率可根據需要進行修改。穩定性增加和轉譯效率獲得改善的RNA分子可能例如對於本發明RNA編碼的抗體是有利的。例如，可以透過具有穩定作用及/或增加RNA轉譯效率的一或多種修飾來穩定RNA並增加其轉譯。例如，在PCT/EP2006/009448中描述了此等修飾，PCT/EP2006/009448以引用的方式併入本文。為了增加根據本發明使用的RNA的表現，可以在編碼區(即編碼所表現的肽或蛋白質的序列)內對其進行修飾，較佳地不改變所表現的肽或蛋白質的序列，以便增加GC含量來增加mRNA穩定性並執行密碼子優化，從而增強細胞中的轉譯。
如本文所用，在RNA上下文中的術語「修飾」包括非天然存在於RNA中的該RNA的任何修飾。
根據第五態樣的RNA可能具有經修飾的核糖核苷酸，以增加其穩定性及/或降低細胞毒性。例如，在一個具體例中，RNA包含5-甲基胞苷，其部分或完全取代，較佳完全取代胞苷。
在一些具體例中，本文所述RNA中的一或多個尿苷被經修飾的核苷取代。在一些具體例中，經修飾的核苷是經修飾的尿苷。在一些具體例中，取代尿苷的經修飾尿苷獨立地選自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。RNA的尿苷可以部分或完全被取代，較佳完全被取代。
在一些具體例中，至少一個RNA包含取代至少一個尿苷的經修飾核苷。在一些具體例中，至少一個RNA包含取代每個尿苷的經修飾核苷。在一些具體例中，每個RNA包含取代至少一個尿苷的經修飾核苷。在一些具體例中，每個RNA包含取代每個尿苷的經修飾核苷。
在一個具體例中，RNA包含其他經修飾的核苷或包含進一步修飾的核苷，例如經修飾的胞苷。例如，在一個具體例中，在RNA中，5-甲基胞苷部分或完全取代，較佳完全取代胞苷。在一個具體例中，RNA包含5-甲基胞苷和選自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m 1ψ)和5-甲基-尿苷(m 5U)中的一或多者。在一個具體例中，RNA包含5-甲基胞苷和N1-甲基-假尿苷(m 1ψ)。在一些具體例中，RNA包含代替每個胞苷的5-甲基胞苷和代替每個尿苷的N1-甲基-假尿苷(m 1ψ)。
在一個具體例中，術語「修飾」是有關提供具有5'-帽或5'-帽類似物的RNA。術語「5'-帽」是指在mRNA分子的5'端上發現到的帽結構，並且通常由經由不尋常的5'至5'三磷酸酯鍵聯連接至mRNA的鳥苷核苷酸組成。
提供具有5'-帽或5'-帽類似物的RNA可以藉由在該5'-帽或5'-帽類似物存在下活體外轉錄DNA模板來實現，其中該5'-帽是被共-轉錄併入到所生成的RNA股中，或者可以例如藉由活體外轉錄來生成RNA，並且可以使用加帽酶(例如牛痘病毒的加帽酶)在轉錄後將5'-帽附接至RNA。
在一些具體例中，根據第五態樣的RNA包含5'-UTR及/或3'-UTR。
術語「非轉譯區」或「UTR」是有關DNA分子中被轉錄但不被轉譯成胺基酸序列的區域，或是有關RNA分子中的對應區域(諸如mRNA分子)。非轉譯區(UTR)可以存在於開放讀框(5'-UTR)的5' (上游)及/或開放讀框(3'-UTR)的3' (下游)。5'-UTR (如果存在)位於5'端處，蛋白質編碼區起始密碼子的上游。5'-UTR在5'-帽(如果存在)的下游，例如直接鄰接5'-帽。3'-UTR (如果存在)位於3'端處，蛋白質編碼區終止密碼子的下游，但術語「3'-UTR」較佳不包括聚A序列。因此，3'-UTR在聚-A序列(如果存在)的上游，例如直接鄰接聚A序列。
將3'-UTR併入到RNA分子的3'-非轉譯區中可以導致轉譯效率提高。藉由併入兩個或更多個這樣的3'-非轉譯區可以實現協同效應。3'-非轉譯區對於它們所引入的RNA可以是自體的或異體的。在一個特定具體例中，3'-非轉譯區衍生自人類β-球蛋白基因。
為了增加根據第五態樣的RNA的穩定性及/或表現，可以對其進行修飾以便與聚A序列連接存在，聚A序列較佳具有10至500、更佳30至300，甚至更佳65至200個，特別是100至150個腺苷殘基的長度。聚A序列可以是未遮蔽的。
如本文所用，術語「聚(A)尾」或「聚A序列」是有關未中斷或中斷的腺苷酸基(A)殘基序列，其通常位於RNA分子的3'-端，且「未遮蔽的聚A序列」表示RNA分子3'端處的聚-A序列以該聚-A序列的A結尾，且其後在聚-A序列的3'-端(即下游)處不跟隨A以外的核苷酸。
在一些具體例中，基於在與編碼股互補的股中包含重複dT核苷酸(去氧胸苷酸)的DNA模板，在RNA轉錄期間(例如在製備活體外轉錄的RNA期間)，附接聚A尾。編碼聚A尾(編碼股)的DNA序列稱為聚(A)匣。
在一些具體例中，DNA編碼股中存在的聚(A)匣基本上由dA核苷酸組成，但被四種核苷酸(dA、dC、dG和dT)的隨機序列中斷。這種隨機序列的長度可以是5至50、10至30或10至20個核苷酸。這樣的匣揭示於WO 2016/005324 A1中，其以引用的方式併入。WO 2016/005324 A1中揭示的任何聚(A)匣均可用於本發明。基本上由dA核苷酸組成但被具有平均分布四個核苷酸(dA、dC、dG、dT)且具有例如5至50個核苷酸長度的隨機序列中斷的聚(A)匣顯示，在DNA層次上，質體DNA在大腸桿菌中不斷增生，並且在RNA層次上仍然與支持RNA穩定性和轉譯效率方面的有益特性相關。因此，在一些具體例中，本文所述的RNA分子中所含的聚A尾基本上由A核苷酸組成，但被四個核苷酸(A、C、G、U)的隨機序列所中斷。這種隨機序列的長度可以是5至50、10至30或10至20個核苷酸。
在本文中，「基本上由…組成」表示聚A尾中的大多數核苷酸，通常以數量計至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的核苷酸是A核苷酸，但允許剩餘的核苷酸是A核苷酸之外的核苷酸，諸如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鳥苷酸)，或C核苷酸(胞苷酸)。在本文中，「由…組成」表示聚A尾中的所有核苷酸(即以數量計聚A尾中的100%核苷酸)是A核苷酸。術語「A核苷酸」或「A」是指腺苷酸。
在一些具體例中，聚A尾在其3'-端並未側接A核苷酸以外的核苷酸，即聚A尾在其3'-端沒有被A以外的核苷酸遮蔽或跟隨。
上述修飾(即併入聚A序列、聚腺苷酸序列未遮蔽和併入一或多個3'-非轉譯區)的組合對RNA的穩定性和增加RNA轉譯效率具有協同影響。
術語RNA的「穩定性」是有關RNA的「半衰期」。「半衰期」是有關消除分子的一半活性、量或數量所需的時段。在如本文所用的上下文中，RNA的半衰期表示該RNA的穩定性。RNA的半衰期可能影響到RNA的「表現持續時間」。具有長半衰期的RNA預期將表現一段較長的時間。
當然，如果根據本發明需要降低RNA的穩定性及/或轉譯效率，則可以修飾RNA來干擾如上所述元件的功能，從而增加RNA的穩定性及/或轉譯效率。
術語「表現」在本文中以其最普遍的含義使用並且包含例如藉由轉錄及/或轉譯生產RNA及/或肽、多肽或蛋白質。關於RNA，術語「表現」或「轉譯」特別是有關肽、多肽或蛋白質的生產。它還包含核酸的部分表現。此外，表現可以是瞬時的或穩定的。根據本發明，如果可以透過蛋白質偵測的常規技術(諸如使用特異地結合至PD-1抗體的抗體的技術)在細胞或其溶解產物中偵測到抗體，則抗體在細胞中表現。
在上下文中，如本文所用，術語「轉錄」是有關一種其中DNA序列中的遺傳密碼被轉錄成RNA的過程。隨後，RNA可被轉譯成蛋白質。如本文所用，術語「轉錄」包括「活體外轉錄」，其中術語「活體外轉錄」是有關一種其中RNA (特別是mRNA)，在無細胞系統中活體外合成的過程，較佳使用適當的細胞萃取物。較佳地，應用選殖載體來生成轉錄本。這些選殖載體通常被稱為轉錄載體並且被術語「載體」所含括。根據本發明，所用的RNA較佳是活體外轉錄的RNA (IVT-RNA)，並且可以透過活體外轉錄適當的DNA模板獲得。用於控制轉錄的啟動子可以是任何RNA聚合酶的任何啟動子。RNA聚合酶的具體實例是T7、T3和SP6 RNA聚合酶。較佳地，活體外轉錄是受到T7或SP6啟動子控制。用於活體外轉錄的DNA模板可以藉由選殖核酸(特別是cDNA)，並將其引入到用於活體外轉錄的合適載體中而獲得。cDNA可以藉由RNA的逆轉錄獲得。
如本文所用，術語「轉譯」是有關在細胞核醣體中信使RNA的一股指導胺基酸序列組裝以製造出肽、多肽或蛋白質的過程。
諸如「能夠表現…的RNA」和「編碼…的RNA」的術語在本文中可互換使用，並且就特定的肽或多肽而言，表示RNA如果存在於適當的環境中，較佳地存在於細胞內，則可以被表現以生產該肽或多肽。較佳地，根據第五態樣的RNA能夠與細胞轉譯機器交互作用以提供其能夠表現的肽或多肽。
諸如「轉移」、「引入」或「轉染」的術語在本文中可互換使用，並且有關將核酸(特別是外源性或異源性核酸、特別是RNA)引入細胞中。根據本發明，細胞可以形成器官、組織及/或生物體的一部分。根據本發明，核酸的投予是以裸核酸實現或者與投予試劑組合來實現。較佳地，核酸以裸核酸的形式投予。較佳地，RNA與穩定物質(諸如RNA酶抑制劑)組合投予。本發明還設想將核酸重複引入細胞中以允許持續表現歷時延長時段。
在第六態樣中，本發明供一種包含第五態樣之一或多個核酸的載體。
在適當的情況下，第六態樣的載體可進一步包含控制核酸表現的啟動子。術語「載體」在本文中以其最普遍的含義使用，並且包含用於核酸的任何中間載體(vehicle)，其使得該核酸能夠(例如)被引入原核及/或真核細胞中，並且在適當的情況下，能夠被整合到一個基因體中。這種載體較佳在細胞中複製及/或表現。載體包括質體、噬菌體質體、噬菌體或病毒基因體(諸如腺病毒或桿狀病毒載體)、黏質體或其他載體(例如基因工程中常規的載體)，而且還包括脂質體。該等載體包括表現載體以及選殖載體。表現載體包含質體以及病毒載體，並且通常含有所需的編碼序列和在特定宿主生物體(例如細菌、酵母、植物、昆蟲或哺乳動物)中或在活體外表現系統中表現可操作地連接的編碼序列所必需的適當DNA序列。選殖載體通常用於改造和擴增特定的所需DNA片段，且可能缺乏表現期望DNA片段所需的功能序列。如本文所用，術語「質體」通常是有關染色體外遺傳物質的構建體，通常是環狀DNA雙股螺旋，其可以獨立於染色體DNA進行複製。
第六態樣的載體可包含更多基因，諸如允許在合適的宿主細胞中和合適的條件下篩選載體的標記基因。此外，載體可包含允許編碼區在合適宿主中正確表現的表現控制元件。此類控制元件是習於技藝者已知的並且可以包括啟動子、剪接匣和轉譯起始密碼子。例如，第五態樣的核酸在功能上連接至以上表現控制序列，允許在真核或原核細胞中表現。確保在真核或原核細胞中表現的控制元件是那些習於技藝者熟知的。用於構建根據第五態樣的核酸分子、用於構建包含上述核酸分子的載體、用於將載體引入適當挑選的宿主細胞，用於引起或實現表現的方法是本領域中周知的。
使用重組技術進行選殖或表現的載體是本領域已知的，並且包括例如基於質體的表現載體、腺病毒載體、逆轉錄病毒載體或桿狀病毒載體。載體的實例包括pGEX、pET、pLexA、pBI、pVITRO、pVIVO和pST (諸如pST4)。
用於表現第一態樣之抗體的載體類型可以是其中抗體重鏈和輕鏈存在於不同載體的載體類型，或是其中重鏈和輕鏈存在於同一載體中的載體類型。
在第六態樣的一個具體例中，載體是多層囊泡、單層囊泡或其混合物。
在第六態樣的一個具體例中，載體是脂質體。在一個具體例中，載體是陽離子脂質體。脂質體或陽離子脂質體可以包含磷脂(諸如磷脂醯膽鹼)及/或固醇(諸如膽固醇)。在一個具體例中，脂質體或陽離子脂質體的粒徑在約50 nm至約200 nm的範圍內。
在第六態樣的一個具體例中，囊泡、脂質體或陽離子脂質體進一步包含用於位點特異性靶向的配體。該配體例如是抗體。在一個具體例中，配體(例如抗體)能夠結合至癌細胞，特別是如本文所述的癌細胞。在一個具體例中，載體在腫瘤細胞處釋放RNA及/或進入腫瘤細胞。在一個具體例中，配體(例如抗體)結合至與罹病細胞(諸如腫瘤細胞)表面締合的蛋白質。例如，配體或抗體可結合至疾病相關抗原的細胞外部分。
在第六態樣的一個具體例中，第五態樣的RNA可能存在於RNA脂質複合物顆粒中。本文所述的RNA脂質複合物顆粒與包含RNA脂質複合物顆粒的組成物可用於在非經腸投藥後，特別是在靜脈內投藥後將RNA遞送至目標組織。RNA脂質複合物顆粒可使用脂質體並將脂質體與RNA混合來製備。RNA脂質複合物顆粒可例如藉由將RNA與脂質體或與至少一種陽離子脂質混合(例如透過使用乙醇注射技術)來獲得。
術語「乙醇注射技術」是指一個其中透過針頭將包含脂質的乙醇溶液快速注射到水溶液中的過程。這個作用將脂質分散在整個溶液中並促進脂質結構形成，例如脂質囊泡形成(諸如脂質體形成)。一般而言，本文所述的RNA脂質複合物顆粒可藉由將RNA添加至膠體脂質體分散體而獲得。在一個具體例中，使用乙醇注射技術，這樣的膠體脂質體分散體如下形成：邊攪拌邊將包含脂質(諸如陽離子脂質，像是DOTMA和額外脂質)的乙醇溶液注射到水溶液中。在一個具體例中，本文所述的RNA脂質複合物顆粒無需擠出步驟即可獲得。
術語「擠出(extruding或extrusion)」是指創造出具有固定橫截面輪廓的顆粒。具體而言，它指的是顆粒尺寸的縮小，由此顆粒被迫通過具有限定孔的過濾器。
在一個具體例中，RNA脂質複合物顆粒的平均直徑範圍為約200 nm至約1000 nm、約200 nm至約800 nm、約250至約700 nm、約400至約600 nm、約300 nm至約500 nm，或約350 nm至約400 nm。在一個具體例中，RNA脂質複合物顆粒的平均直徑範圍為約250 nm至約700 nm。在另一個具體例中，RNA脂質複合物顆粒的平均直徑範圍為約300 nm至約500 nm。在例示性具體例中，RNA脂質複合物顆粒的平均直徑為約400nm。
RNA脂質複合物顆粒可展現出小於約0.5、小於約0.4或小於約0.3的多分散性指數。舉例來說，RNA脂質複合物顆粒可展現出範圍約0.1至約0.3的多分散性指數。
術語「多分散性指數」在本文中用作顆粒集合(例如奈米顆粒)的尺寸分佈的一個量度。多分散性指數是依照所謂累積量分析(cumulant analysis)基於動態光散射測量來計算的。
包含RNA脂質複合物顆粒的組成物可包含至少一種緩衝劑及/或穩定劑及/或螯合劑。例如，穩定劑可避免產品品質明顯喪失，特別是在冷凍、凍乾、噴霧乾燥或儲存(諸如冷凍、凍乾或噴霧乾燥組成物的儲存)期間的RNA活性明顯喪失。螯合劑是指能夠與金屬離子形成至少兩個配位共價鍵，從而生成穩定水溶性複合物的化合物。在不希望受理論囿限的情況下，螯合劑降低游離二價離子的濃度，這可能會誘導RNA加速降解。合適螯合劑的實例包括但不限於乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA的鹽、去鐵胺B、去鐵胺、二乙胺基二硫代甲酸鈉(dithiocarb sodium)、青黴胺、噴替酸鈣、噴替酸的鈉鹽、二巰丁二酸(succimer)、曲恩汀(trientine)、氮基三乙酸、反式-二胺基環己烷四乙酸(DCTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、雙(胺基乙基)乙二醇醚-N,N,N',N'-四乙酸、亞胺基二乙酸、檸檬酸、酒石酸、富馬酸或其鹽。
凍乾或噴霧乾燥的組成物可以在使用前還原。在一個具體例中，穩定劑是碳水化合物。如本文所用，術語「碳水化合物」是指並含括單醣、雙醣、三醣、寡醣和多醣。在本發明的具體例中，穩定劑為甘露糖、葡萄糖、蔗糖或海藻糖。根據本發明，RNA脂質複合物顆粒組成物可具有用於組成物的穩定性，特別是用於RNA脂質複合物顆粒的穩定性和用於RNA的穩定性的穩定劑濃度。
術語「冷凍」是有關液體的凝固，通常伴隨著移除熱量。
術語「凍乾(lyophilizing)或(lyophilization)」是指藉由將物質冷凍然後降低周邊壓力，使得物質中的冷凍介質直接從固相昇華至氣相來冷凍乾燥該物質。
術語「噴霧乾燥」是指藉由將(加熱的)氣體在容器(噴霧乾燥器)內與霧化(噴霧)的流體混合來噴霧乾燥物質，其中形成的液滴中的溶劑蒸發，從而得到乾燥粉末。
術語「還原」是有關將溶劑(諸如水)添加到乾燥產品中，使其恢復到液態(諸如其原始液態)。
包含RNA脂質複合物顆粒的組成物可以呈液體或固體。固體的非限制性實例包括冷凍形式或凍乾形式。
在本發明的上下文中，術語「顆粒」是有關由分子或分子複合物形成的結構實體。在一個實施例中，術語「顆粒」是有關微米或奈米尺寸的結構，諸如微米或奈米尺寸的緻密結構。
本文所用的術語「RNA脂質複合物顆粒」是有關含有脂質(特別是陽離子脂質)和RNA的顆粒。帶正電荷的脂質體與帶負電荷的RNA之間的靜電交互作用導致RNA脂質複合物顆粒的複合並自發形成。帶正電荷的脂質體通常可以使用陽離子脂質(諸如DOTMA)和額外脂質(例如DOPE)來合成。在一個具體例中，RNA脂質複合物顆粒是奈米顆粒。
如本發明中所用，「奈米顆粒」是指包含RNA和至少一種陽離子脂質並且具有適於靜脈內投藥之平均直徑的顆粒。
術語「平均直徑」是指如藉由動態光散射(DLS)，使用所謂累積量演算法利用數據分析所測得之顆粒的平均流體動力學直徑平均值，其以具有長度尺寸的所謂Z 平均值，以及無因次的多分散性指數(PI)的結果提供(Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321)。在此，顆粒的「平均直徑」、「直徑」或「尺寸」與Z 平均值的這個值同義。
在一個具體例中，第五態樣的核酸或第六態樣的載體包含編碼如第一態樣中所述抗體鏈的核酸序列。例如，編碼抗體或抗體鏈的核酸序列可包含編碼如本文所述抗體(例如MAB-19-0202、MAB-19-0618)，或這些抗體之一者的重鏈或輕鏈的核酸序列。
抗體鏈可以是重鏈(H鏈＝HC)或輕鏈(L鏈＝LC)，各自較佳地如本文所述。在一個具體例中，H鏈包含重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區，其中重鏈恆定區可包含重鏈CH 1恆定區或重鏈CH 1恆定區，重鏈CH 2恆定區和重鏈CH 3恆定區的組合。在一個具體例中，CH 1恆定結構域和CH 2恆定結構域可以透過位於CH 1恆定結構域和CH 2恆定結構域之間的鉸鏈區連接。
在一個具體例中，L鏈包含輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區，其中輕鏈恆定區可以是CL卡帕恆定結構域或CL拉目達恆定結構域。例如，輕鏈恆定區可以具有或包含如SEQ ID NO：6中所示的序列或其變體。
在一個具體例中，編碼第一態樣的抗體或抗體鏈的核酸包含編碼重鏈可變區(VH)的核酸序列，該重鏈可變區(VH)包含如本文例舉的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列中的至少一者(序列表的SEQ ID NO：8-13，SYN)。也就是說，第五態樣的核酸可包含編碼如本文例舉的HCDR1、HCDR2或HCDR3序列的核酸序列，或者該核酸可包含編碼重鏈可變區(VH)的核酸序列，該重鏈可變區(VH)包含如本文定義之HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的組合中的任一者。個別HCDR1至HCDR3序列的較佳組合如上文關於第一態樣之相應胺基酸序列所指定的。此教示內容相應地適用於第五態樣的核酸序列。
在一個具體例中，第五態樣的核酸包含編碼輕鏈可變區(VL)的核酸序列，該輕鏈可變區(VL)包含如本文例舉的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的至少一者(序列表的SEQ ID NO：14-17，QAS)。也就是說，核酸可以包含編碼如本文例舉的LCDR1、LCDR2或LCDR3序列的核酸序列，或者核酸可以包含編碼輕鏈可變區(VL)的核酸序列，該輕鏈可變區(VL)包含如本文所定義之LCDR1、LCDR2或LCDR3的組合中的任一者。個別LCDR1至LCDR3序列的較佳組合如上文關於第一態樣的相應胺基酸序列所指定的。此教示內容相應地適用於第五態樣的核酸序列。
在一個具體例中，第五態樣的核酸包含編碼如本文例舉的VH和VL序列的核酸序列(序列表的SEQ ID NO：18-21)。
在一個具體例中，提供了一種核酸或包含核酸的載體，諸如RNA或基於RNA的載體，或適於活體外轉錄的載體，其包含編碼根據第一態樣結合至PD-1的抗體的重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)的核酸序列。
在一個具體例中，變體核酸序列包含/編碼如本文指定的相應CDR1、CDR2和CDR3胺基酸序列中的一或多者。也就是說，編碼重鏈可變區(VH)的變體核酸序列可包含/編碼如本文指定的HCDR1、HCDR2和HCDR3胺基酸序列中的一或多者，其中對於CDR序列的特定組合來說，參考本文相應揭示內容。例如，變體核酸序列可包含/編碼如本文指定的HCDR1、HCDR2和HCDR3胺基酸序列。
編碼輕鏈可變區(VL)的變體核酸序列可包含/編碼如本文指定的LCDR1、LCDR2和LCDR3胺基酸序列中的一或多者，其中對於CDR序列的特定組合來說，參考本文相應揭示內容。例如，變體核酸序列可包含/編碼如本文指定的LCDR1、LCDR2和LCDR3胺基酸序列。
變體核酸序列可編碼能夠提供分別與親本序列的重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)所提供的相同結合特異性及/或功能性的重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)。
用於生成抗PD-1抗體之第五態樣的核酸或第六態樣的載體(諸如RNA或基於RNA的載體)可藉由活體外轉錄方法來生產。
這樣一個方法包含使用標準選殖技術，將如上文所定義的重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)的DNA序列插入IVT-載體(例如pST4載體)中的步驟。載體可包含如本文定義的5'-UTR、如本文定義的3'-UTR、如上文定義的聚(A)尾(例如包含30個腺嘌呤核苷酸的聚(A)尾)、連接子(L)以及更多(A30LA70)。另外，IVT載體可視情況包含編碼分泌信號肽(例如如本文定義的分泌信號肽)的核酸序列。
為了生成用於活體外轉錄的模板，可以使用例如限制核酸內切酶在聚(A)尾編碼區的下游將質體DNA線性化，從而生成例如藉由使用T7 RNA聚合酶轉錄mRNA的模板。
在活體外轉錄期間，RNA可能被修飾成使得免疫原性降至最低，且RNA可在其5'端處加帽。
由此獲得視情況經加帽的RNA被用來轉染宿主細胞，例如NS0細胞、Sp2/0細胞、HEK293細胞或其衍生物，諸如HEK293T、HEK293T/17及/或HEK293F、COS細胞、Vero細胞及/或HeLa細胞。在一種具體例中，哺乳動物宿主細胞選自HEK293、HEK293T及/或HEK293T/17細胞。就轉染來說，可以使用例如如上所述的脂質體。
經轉染的細胞被用來表現抗體或抗體鏈或其片段。為了表現抗PD-1抗體的H鏈和L鏈，較佳用兩種類型的RNA轉染宿主細胞，兩種類型的RNA即各自編碼抗PD-1抗體的H鏈和L鏈的個別RNA。
抗PD-1抗體可以在細胞內、周質空間中生產，或者可以直接分泌到培養基中。如果抗體在細胞內生產，則之後可溶解細胞並例如藉由離心或超濾去除細胞碎片。習於技藝者熟知用於分離細胞內生產之抗體的合適方法。這同樣適用於分離被分泌到周質空間的抗體的方法。當抗體例如藉由使用分泌信號肽被分泌到培養基中時，首先可濃縮來自此類表現系統的上清液，例如藉由使用市售的蛋白質濃縮過濾器。蛋白酶抑制劑(例如PMSF)可以被納入在任何前述步驟中以抑制蛋白水解，並且可以納入抗生素以防止污染物的生長。從經轉染的宿主細胞製備而來的抗PD-1抗體可以例如藉由使用層析來純化，諸如親和力層析、凝膠電泳、流式細胞測量術及/或透析。
本文提供關於特定核酸和胺基酸序列(例如序列表中所示的那些)的教示內容應被解釋為也關於該等特定序列的修飾，從而產生與該等特定序列在功能上相當的序列。例如，展現出與特定胺基酸序列的性質相同或相似的胺基酸序列，以及編碼展現出與由特定核酸序列編碼的胺基酸序列的性質相同或相似之胺基酸序列的核酸序列。一個重要的性質是保有抗體與其目標的結合或維持抗體所期望的效應子功能。較佳地，相對於特定序列進行修飾的序列，當其取代抗體中的特定序列時，保有該抗體與PD-1的結合，並且較佳保有如本文所述該抗體的功能，例如抑制在表現PD-1之細胞上的PD-1免疫抑制、CDC媒介的溶解或ADCC媒介的溶解。
例如，如本文所述的核酸與胺基酸序列的變體編碼或提供抗體或抗原結合片段，其提供以下性質中的至少一者： (i)        能夠結合，較佳特異地結合至PD-1，例如人類PD-1； (ii)       能夠阻斷PD-1結合至其配體； (iii)      能夠結合至親本抗體所結合的相同抗原，較佳地具有足以提供診斷及/或治療用途的親和力；及/或 (iv)      能夠提供降低或耗盡的效應子功能。
那些習於技藝者應當理解，特別是CDR、高變區和可變區的序列可以受到修飾而不喪失結合PD-1的能力。例如，CDR區將與本文指定的區域相同或高度同源。「高度同源」預期可在CDR中進行1至5個，較佳1至4個、諸如1至3個或1或2個取代。另外，高變區和可變區可以受到修飾，使得它與本文具體揭示之區域顯示出實質同源性。
如本文所用，術語「變體」還指突變體、剪接變體、構形、同型、等位基因變體、物種變體和物種同系物，特別是天然存在的那些。等位基因變體與基因正常序列的改變有關，其意義通常不明。完整的基因定序通常可以辨識給定基因的許多等位基因變體。物種同系物是與給定核酸或胺基酸序列具有不同物種來源的核酸或胺基酸序列。術語「變體」應含括任何轉譯後修飾的變體和構形變體。
出於本發明之目的，胺基酸序列(肽、蛋白質或多肽)的「變體」包含胺基酸插入變體、胺基酸添加變體、胺基酸缺失變體及/或胺基酸取代變體。術語「變體」包括所有突變體、剪接變體、轉譯後修飾變體、構形、同型、等位基因變體、物種變體和物種同系物，特別是天然存在的那些。術語「變體」特別包括胺基酸序列的片段。
胺基酸插入變體包含在特定胺基酸序列中插入單個或兩個或更多個胺基酸。在具有插入的胺基酸序列變體的情況下，一或多個胺基酸殘基被插入到胺基酸序列中的特定位點，儘管隨機插入並對所得產物進行適當篩選也是可行的。
胺基酸添加變體包含一或多個胺基酸(諸如1、2、3、5、10、20、30、50或更多個胺基酸)的胺基端及/或羧基端融合體。
胺基酸缺失變體的特徵在於從序列移除一或多個胺基酸，諸如移除1、2、3、5、10、20、30、50或更多個胺基酸。缺失可以在蛋白質的任何位置。在蛋白質N端及/或C端處包含缺失的胺基酸缺失變體也稱為N端及/或C端截短變體。
胺基酸取代變體的特徵在於序列中的至少一個殘基被移除而另一個殘基被插入其位置。一個胺基酸取代另一個胺基酸可分為保守性或非保守性取代。修飾偏好位於胺基酸序列中同源蛋白質或肽之間不保守的位置及/或用具有相似性質的其他胺基酸替換胺基酸。較佳地，肽和蛋白質變體中的胺基酸變化是保守胺基酸變化，即相似帶電荷或不帶電荷胺基酸的取代。保守胺基酸變化涉及其側鏈相近的胺基酸家族中的一者的取代。在本發明的上下文中，「保守取代」是一個胺基酸被具有相似結構及/或化學特徵的另一個胺基酸取代，一個胺基酸殘基被如上兩個表格任一者中所定義之相同類別的另一個胺基酸殘基取代：例如，白胺酸可用異白胺酸取代，因為它們都是脂族分支鏈疏水物。同樣，天冬胺酸可以用麩胺酸取代，因為它們都是小型、帶負電荷的殘基。在一個具體例中，保守胺基酸取代包括以下群組內的取代： -   甘胺酸、丙胺酸； -   纈胺酸、異白胺酸、白胺酸； -   天冬胺酸、麩胺酸； -   天冬醯胺酸、麩醯胺酸； -   絲胺酸、蘇胺酸； -   離胺酸、精胺酸；和 -   苯丙胺酸、酪胺酸。
較佳地，給定胺基酸序列和作為該給定胺基酸序列之變體的某個胺基酸序列之間的相似性(較佳一致性)程度將會是至少約60%、65%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，或99%。較佳地提供某個胺基酸區域的相似性或一致性程度為參考胺基酸序列全長的至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。例如，如果參考胺基酸序列由200個胺基酸組成，則較佳提供至少約20個、至少約40個、至少約60個、至少約80個、至少約100個、至少約120個、至少約140個、至少約160個、至少約180個或約200個胺基酸，較佳連續胺基酸的相似性或一致性程度。在較佳具體例中，針對參考胺基酸序列全長提供相似性或一致性程度。用於確定序列相似性(較佳序列一致性)的比對可以使用本領域已知的工具進行，較佳使用最佳序列比對，例如使用Align、使用標準設定，較佳EMBOSS::needle、Matrix:Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend0.5。
「序列相似性」表示相同或代表保守胺基酸取代的胺基酸的百分比。兩個胺基酸序列之間的「序列一致性」表示序列之間相同的胺基酸的百分比。
術語「一致性百分比」意欲表示在最佳比對後獲得的兩個待比較序列之間相同的胺基酸殘基的百分比，這個百分比純粹是統計性的，且兩個序列之間的差異隨機分佈且分佈於整個長度上。兩個胺基酸序列之間的序列比較通常透過在最佳比對後比較這些序列來進行，該比較是按照區段或按照「比較範圍」進行，以便鑑定並比較局部區域的序列相似性。除了手動之外，還可以藉由Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482的局部同源性演算法、藉由Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443的局部同源性算法、藉由Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444的相似性檢索方法，或藉由使用這些演算法(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)的電腦程式來產生比較用序列的最佳比對。
一致性百分比是透過確定兩個待比較序列之間相同位置的數目，將此數目除以所比較位置的數目，並將所得結果乘上100來計算，以獲得這兩個序列之間的一致性百分比。
就核酸分子而言，術語「變體」包括簡併核酸序列，其中如本文所用的簡併核酸是因為遺傳密碼的簡併性而在密碼子序列上有別於參考核酸的核酸。
此外，如本文所用，給定核酸序列的「變體」包括包含單個或多個(諸如至少2個、至少4個或至少6個，且較佳至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多10個、至多15個，或至多20個)核苷酸取代、缺失及/或添加的核酸序列。
較佳地，給定核酸序列和作為該給定核酸序列的變體的核酸序列之間的一致性程度將為至少70%，較佳至少75%，較佳至少80%，更佳至少85%，甚至更佳至少90%或最佳至少95%、96%、97%、98%或99%。較佳提供某個區域的一致性程度為至少約30個、至少約50個、至少約70個、至少約90個、至少約100個、至少約150個、至少約200個、至少約250個、至少約300個、或至少約400個核苷酸。在較佳具體例中，針對參考核酸序列的全長提供一致性程度。
兩個核酸序列之間的「序列一致性」表示序列之間相同的核苷酸的百分比。
術語「一致性百分比」意欲表示在最佳比對後獲得的兩個待比較序列之間相同的核苷酸的百分比，這個百分比純粹是統計性的，且兩個序列之間的差異隨機分佈且分佈於整個長度上。兩個核苷酸序列之間的序列比較通常透過在最佳比對後比較這些序列來進行，該比較是依照區段或依照「比較範圍」進行，以便鑑定並比較局部區域的序列相似性。除了手動之外，還可以藉由Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482的局部同源性演算法、藉由Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443的局部同源性算法、藉由Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444的相似性檢索方法，或藉由使用這些演算法(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)的電腦程式來產生比較用序列的最佳比對。
一致性百分比是透過確定兩個待比較序列之間相同位置的數目，將此數目除以所比較位置的數目，並將所得結果乘上100來計算，以獲得這兩個序列之間的一致性百分比。
術語「部分(part)」、「片段」和「部分(portion)」在本文中可互換使用，並且是指結構的連續或不連續部分。對於特定結構(諸如胺基酸序列或蛋白質或核酸序列)來說，術語其「部分」、「片段」和「部分」可能指該結構的連續或不連續部分。較佳地，結構(諸如胺基酸序列或核酸序列)的「部分」、「片段」和「部分」較佳包含整個結構或胺基酸序列或核酸序列的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%，至少98%、至少99%，較佳由其組成。結構的一部分、一部分或一個片段較佳地包含該結構的一或多種功能性質。例如，表位、肽或蛋白質的一部分、一部分或一個片段較佳地在免疫學上相當於其所衍生而來的表位、肽或蛋白質。如果該部分、部分或片段是不連續部分，則該不連續部分較佳地由結構的2、3、4、5、6、7、8或更多個部分組成，每個部分是該結構的連續元件。例如，胺基酸序列的不連續部分可以由該胺基酸序列的2、3、4、5、6、7、8或更多個，較佳不超過4個部分組成，其中每個部分較佳包含胺基酸序列的至少5個連續胺基酸、至少10個連續胺基酸，較佳至少20個連續胺基酸，較佳至少30個連續胺基酸。
應當理解，本文所述的核酸還包括為了優化在特定宿主細胞或生物體中的密碼子使用而進行修飾的核酸。生物體之間密碼子使用的差異可能導致與異源性基因表現有關的各種問題。透過改變原始序列的一或多個核苷酸進行的密碼子優化可以導致核酸表現的優化，特別是在該核酸要表現的同源或異源宿主中的轉譯效率優化。例如，如果要使用衍生自人類並編碼抗體恆定區及/或框架區的核酸，例如用於製備嵌合或人源化抗體，則可能偏好為了優化密碼子使用而修飾該核酸，特別是如果視情況與異源性核酸(諸如衍生自本文所述的其他生物體的核酸)融合的核酸要在來自不同於人類的生物體(諸如小鼠或倉鼠)的細胞中表現的話。例如，編碼人類輕鏈和重鏈恆定區的核酸序列可以被修飾成納入一或多個，較佳至少1、2、3、4、5、10、15、20個且較佳至多10、15、20、25、30、50、70或100個或更多個核苷酸替換導致優化的密碼子使用，但未導致胺基酸序列的改變。
術語「遺傳物質」包括經分離的核酸(DNA或RNA)、雙螺旋的一段、染色體的一段，或生物體或細胞的整個基因體，特別是其外顯子體或轉錄體。
術語「突變」是指與參考品相比，核酸序列中的變化或差異(核苷酸取代、添加或刪除)。「體細胞突變」可以發生在生殖細胞(精子和卵子)之外的身體任何細胞中，因此不會傳給兒童。這些改變可能(但並不總是)導致癌症或其他疾病。較佳地突變是非同義突變。術語「非同義突變」指一種突變，較佳核苷酸取代，其確實導致胺基酸改變，諸如轉譯產物中的胺基酸取代。
如本文所用，術語「突變」包括點突變、插入缺失、融合、染色體破碎(chromothripsis)和RNA編輯。如本文所用，術語「插入缺失」描述一種特殊的突變類別，定義為一種導致共定位插入和缺失以及核苷酸淨增加或損失的突變。在基因體的編碼區中，除非插入缺失的長度是3的倍數，否則它們會產生框移突變。插入缺失可能與點突變相反；當插入缺失插入序列並從序列刪除核苷酸時，點突變是一種替換一個核苷酸的形式。如本文所用，術語「染色體破碎」是指基因體的特定區域破碎，然後經由單一破壞性事件被縫合在一起的遺傳現象。如本文所用，術語「RNA編輯(RNA edit或NA editing)」是指一個其中RNA分子中的訊息內容透過鹼基組成中的化學變化而被改變的分子過程。RNA編輯包括核苷修飾，諸如胞苷(C)到尿苷(U)和腺苷(A)到肌苷(I)去胺基化，以及非模板核苷酸添加和插入。mRNA中的RNA編輯有效改變了編碼蛋白質的胺基酸序列，使其與依據基因體DNA序列所預測者不同。
根據本發明，「參考品」可用於與從腫瘤樣本獲得的結果進行關聯並比較。通常，「參考品」可能基於一種或多種正常樣本(特別是未罹患癌症疾病的樣本)獲得，其可以從患者或一或多名不同個體獲得，較佳為健康個體，特別是相同物種的個體。「參考品」可以透過測試足夠大量的正常樣本憑經驗進行確定。
在第七態樣中，提供包含第五態樣之核酸或第六態樣之載體的細胞或宿主細胞。
細胞可以用任何載體(第五態樣之核酸可與其締合，例如RNA可與其締合)轉染，例如藉由與RNA形成複合物或形成RNA被包封或囊封其中的囊泡，從而使得與裸RNA相比，RNA的穩定性增加。根據本發明可用的載體包括例如含脂質載體(例如陽離子脂質、脂質體，特別是陽離子脂質體，和微胞)，以及奈米顆粒(諸如脂質複合物顆粒)。陽離子脂質可能與帶負電荷的核酸形成複合物。根據本發明可使用任何陽離子脂質。
可被轉染的細胞還包含將成為重組性的宿主細胞。如本文所用，術語「重組宿主細胞」意欲表示已引入重組表現載體的細胞。應當理解，此類術語不僅意指特定的實驗細胞(subject cell)，還指此一細胞的後代。因為由於突變或環境影響，某些修飾可能在後續世代中出現，因此後代事實上可能與親代細胞不同，但仍包括在如本文所用術語「重組宿主細胞」的範疇內。宿主細胞可以是原核及/或真核宿主細胞。可以將外源性核酸及/或載體引入這些宿主細胞中。在一個具體例中，宿主細胞是真核宿主細胞，較佳哺乳動物宿主細胞。在一個具體例中，哺乳動物宿主細胞是CHO (中國倉鼠卵巢)細胞、CHO細胞株的衍生物(諸如CHO-K1和CHO pro-3)，或淋巴細胞。在一個具體例中，哺乳動物宿主細胞選自小鼠骨髓瘤細胞(諸如NS0和Sp2/0)、HEK293(人類胚腎)細胞或其衍生物(諸如HEK293T、HEK293T/17及/或HEK293F)、COS和Vero細胞(均為非洲綠猴腎)，及/或HeLa (人類子宮頸癌)細胞。在一個具體例中，哺乳動物宿主細胞選自HEK293、HEK293T及/或HEK293T/17細胞。宿主細胞的更多實例是微生物(諸如大腸桿菌)，和真菌(諸如酵母，例如釀酒酵母，或絲狀真菌，諸如紅黴菌屬和麴菌屬)宿主。宿主細胞和重組宿主細胞包括例如轉染瘤(諸如CHO細胞、NS/0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、Vero細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、HEK293T細胞、HEK293T/17細胞)，以及淋巴細胞。
用於生產如本文定義之抗體的宿主細胞可以培養在多種培養基中，這些培養基是市售可得的並且是習於技藝者周知的。任何這些培養基都可以根據需要補充激素及/或其他生長因子。
在第八態樣中，提供一種包含第五態樣之核酸或第六態樣之載體的病毒。
根據本發明，代替藉由使用載體提供/投予所包括的核酸，載體包括例如含脂質載體(諸如陽離子脂質、脂質體、特別是陽離子脂質體，和微胞)，以及奈米顆粒(諸如脂質複合物顆粒)，感興趣的核酸還可以藉由使用重組宿主細胞(較佳如上所述的那些)，或編碼抗體或衍生自抗體之抗體片段的重組病毒來提供/投予。
這些病毒可能是DNA或RNA病毒。幾種病毒載體在其增強惡性疾病免疫治療的潛力方面已被證實有望。可以使用有複製能力的病毒和無複製能力的病毒，後者較佳。皰疹病毒、腺病毒、痘苗病毒、呼腸孤病毒和新城雞瘟病毒是根據本發明可用的較佳病毒的實例。在一個具體例中，病毒或病毒載體是選自由腺病毒、腺相關病毒、痘病毒(包括牛痘病毒和減毒痘病毒)、Semliki森林病毒、呼腸孤病毒、逆轉錄病毒、新城雞瘟病毒、辛德比病毒和Ty病毒樣顆粒組成之群。特別偏好提供腺病毒和逆轉錄病毒。逆轉錄病毒通常是複製缺陷的(即它們不能生成感染性顆粒)。
將核酸在活體外或活體內引入細胞的方法包含核酸磷酸鈣沉澱的轉染、與DEAE締合的核酸的轉染、用攜帶感興趣核酸的上述病毒轉染或感染、脂質體媒介的轉染，以及類似者。在特定具體例中，偏好將核酸引導至特定細胞。在此類具體例中，用於向細胞投予核酸的載體(例如逆轉錄病毒或脂質體)可能具有結合的目標控制分子。例如，分子(諸如對目標細胞上的表面膜蛋白具特異性的抗體或目標細胞上的受體具特異性的配體)可以被併入或附接至核酸載體。較佳的抗體包含選擇性地結合腫瘤抗原的抗體。如果希望經由脂質體投予核酸，則可以將與胞吞作用相關的表面膜蛋白結合的蛋白質併入脂質體配製物中，以便可以能夠靶向控制及/或攝取。此類蛋白質包含對特定細胞類型具有特異性的衣殼蛋白或其片段、針對內化蛋白質的抗體、尋址細胞內位點的蛋白質，以及類似者。
較佳地，將編碼肽或多肽的RNA引入細胞中，特別是引入活體內存在的細胞中，使得該肽或多肽在細胞中表現。在特定具體例中，偏好將核酸靶向至特定細胞。在此類具體例中，應用於向細胞投予核酸的載體(例如逆轉錄病毒或脂質體)的載體展示靶向分子。例如，諸如對目標細胞上的表面膜蛋白具特異性的抗體或目標細胞上的受體的配體的分子可以併入或附接至核酸載體。在藉由脂質體投予核酸的情況下，可以將與胞吞作用相關的表面膜蛋白結合的蛋白質併入脂質體配製物中，以便能夠靶向及/或攝取。此類蛋白質包含對特定細胞類型具有特異性的衣殼蛋白或其片段、針對內化蛋白質的抗體、尋址細胞內位點的蛋白質等。
應當理解，除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，否則本文第VI點關於編碼抗體之核酸所提供的教示內容相應地適用於編碼包含抗原表位的肽或蛋白質的核酸/多核苷酸。可有益地用於在抗原呈遞細胞中表現RNA的脾臟靶向RNA脂質複合物顆粒描述於WO 2013/143683中，其以引用的方式併入。 VII. 醫藥組成物
在第九態樣中，本發明提供一種組成物(例如醫藥組成物)，其包含一種抗體或抗體組合，包括第一、第三及/或第四態樣之接合物及/或多聚體、及/或包含有包含編碼抗體之核酸序列的一個核酸或核酸組合，包括包含第五、第六及/或第七態樣之該核酸的宿主細胞或載體。醫藥組成物可以用醫藥上可接受的載劑或稀釋劑以及任何其他已知的佐劑和賦形劑根據常規技術配製，例如那些在Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995所揭示者。在一個具體例中，組成物包括多個(例如，兩個或更多個)經分離抗體的組合。在另一個具體例中，組成物包括多個(例如，兩個或更多個)核酸、載體或宿主細胞的組合。
如本文所用，「醫藥上可接受的載劑」包括生理上相容的任何與所有溶劑、分散介質、膜衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑，以及類似物。較佳地，載劑適用於心血管(例如，靜脈內或動脈內)、肌肉內、皮下、非經腸、脊髓或表皮投藥(例如，藉由注射或輸注)。根據投藥路徑，活性化合物(即抗體、雙特異性和多特異性分子、核酸、載體)可以包被在材料中以保護化合物免受酸和其他可能使化合物不活化的其他自然條件作用。
「醫藥上可接受的物質」是指保有母化合物的所需生物活性並且不賦予任何不樂見的毒理學作用的物質(參見例如Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19)。
載劑可以是溶劑或分散介質，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇，以及類似者)、鹽水和水性緩衝溶液、植物油(諸如橄欖油)，以及可注射的有機酯(諸如油酸乙酯及其合適的混合物)。可以例如透過使用膜衣(諸如卵磷脂)、透過在分散體的情況下維持所需的粒度以及透過使用表面活性劑來維持適當的流動性。
第九態樣的載劑或組成物還可包含醫藥上可接受之鹽。可包含的醫藥上可接受之鹽的實例包括酸加成鹽和鹼加成鹽。酸加成鹽包括衍生自無毒無機酸(諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸與類似者)的彼等，以及衍生自無毒有機酸(諸如脂族一元和二元羧酸、經苯基取代的烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸與類似者)的彼等。鹼加成鹽包括衍生自鹼土金屬(諸如鈉、鉀、鎂、鈣，與類似者)的彼等，以及衍生自無毒有機胺(諸如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普魯卡因、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因，與類似者)的彼等。
第九態樣的組成物還可能包含抗氧化劑。醫藥上可接受的抗氧化劑的實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉與類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基羥基苯甲醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚與類似物；以及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸，與類似者。
第九態樣的組成物還可能含有佐劑，諸如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可以透過滅菌程序以及透過納入各種抗菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸與類似者)來確保防止微生物的出現。組成物中還可能需要納入等滲劑(例如糖)、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。此外，可藉由納入延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來延長可注射醫藥形式的吸收。
醫藥上可接受的載劑包括無菌水溶液或分散體，以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。此類介質和試劑用於醫藥活性物質的用途是本領域已知的。除非任何常規介質或試劑與活性化合物不相容，否則考慮其使用在第九態樣的醫藥組成物中。補充性活性化合物也可併入組成物中。
醫藥組成物通常在製造和儲存條件下必須是無菌的且穩定的。組成物可以配製為溶液、微乳液、脂質體或其他適合高藥物濃度的有序結構。
在第九態樣的一個具體例中，醫藥組成物被配製成用於非經腸投藥，較佳用於心血管，特別是靜脈內或動脈內投藥。
第九態樣的組成物可以透過本領域熟知的多種方法投予。如習於技藝者將理解的，投藥路徑及/或模式將根據期望的結果而有不同。活性化合物可以與保護化合物免於快速釋放的載劑一起製備，諸如控制釋放配製物，包括植入物、經皮貼劑和微囊封遞送系統。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用於製備此類配製物的方法通常是那些習於技藝者已知的。參見，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
為了透過某些投藥路徑投予化合物(例如上述態樣的抗體或核酸或載體或核酸或載體的組合)，可能需要用防止化合物不活化的材料包覆該化合物或共投予。例如，化合物可以在適當的載劑(例如脂質體)或稀釋劑中被投予給個體。醫藥上可接受的稀釋劑包括鹽水和緩衝水溶液。脂質體包括水包油包水CGF乳液以及常規脂質體(Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27)。
無菌可注射溶液可藉由將所需量的活性化合物與上文列舉成分中的一者或組合併入適當的溶劑中，隨後根據需要進行滅菌微濾來製備。
一般而言，透過將活性化合物併入無菌載體中來製備分散體，該無菌載體含有基本分散介質和來自上面列舉的那些的所需其他成分。在製備無菌可注射溶液用的無菌粉末的情況下，較佳的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥(凍乾)，其產生活性成分加上來自其先前無菌過濾溶液的任何額外所需成分的粉末。
調整劑量方案以提供最佳的期望反應(例如治療反應)。例如，可以施用單次推注(single bolus)，可隨著時間投予數個分次劑量，或者可以根據治療情況的緊急情況按比例減少或增加劑量。為便於投藥和劑量的均勻性，將非經腸組成物配製為劑量單位形式尤其有利。如本文所用的劑量單位形式是指適於作為待治療個體的單一劑量的物理上離散單位；每個單位含有預定量的活性化合物，經計算可與所需的醫藥載劑一起產生期望的治療效果。本發明有關劑量單位形式的規格是由以下因素決定，並直接取決於(a)活性化合物的獨特特徵和要實現的特定治療效果，以及(b)配製此類用於治療個體敏感性的活性化合物技藝中固有的限制。
第九態樣的醫藥配製物或組成物包括適於經口、經鼻、局部(包括經頰和舌下)、直腸、陰道及/或非經腸投藥的那些。配製物可以方便地以單位劑量形式存在並且可能藉由藥學領域已知的任何方法來製備。生產單一劑型的活性成分量將根據待治療個體和特定投藥模式而有不同。生產單一劑型的活性成分量通常將會是產生治療效果的組成物量。
用於局部或經皮投藥之第九態樣的組成物的劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠、溶液、貼劑和吸入劑。活性化合物可以在無菌條件下與醫藥上可接受的載劑以及可能需要的任何防腐劑或其他佐劑或賦形劑混合。
如本文所用，片語「非經腸投予」和「非經腸地投予」是指除了經腸和局部投藥之外的投藥模式，通常藉由注射，並且包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蜘蛛膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射，以及輸注。
在一個具體例中，抗PD-1抗體以蛋白質投予，其中抗體可如本文所述自融合瘤、轉染瘤或藉由活體外轉錄獲得。在一個具體例中，抗PD-1抗體如本文定義以一或多個核酸或以一或多個載體投予，例如以編碼抗體或抗體鏈或此抗體或鏈的片段的RNA、或包含該RNA的脂質體，或一或多個RNA。
在一個具體例中，第一態樣的抗體是藉由皮下注射以結晶形式投予，參見Yang et al. (2003) PNAS, 100 (12): 6934-6939。
當本發明的化合物以藥劑被投予給人類與動物時，它們可以單獨給予或以醫藥組成物給予，該醫藥組成物包含例如約0.01%至約九十九%的活性成分，較佳約0.1%至約90%，最佳約1%至約50%的活性成分，組合以醫藥上可接受的載劑，較佳如上所指出的醫藥上可接受的載劑。另外，可又再包含佐劑及/或賦形劑，諸如抗氧化劑或防腐劑。
無論選擇的投藥路徑為何，可以按合適的水合形式使用的本發明化合物及/或第九態樣的醫藥組成物是藉由那些習於技藝者已知的常規方法被配製成醫藥上可接受的劑型。
醫藥組成物可以用本領域已知的醫療裝置投予。例如，在一個較佳具體例中，第九態樣的醫藥組成物可以用無針皮下注射裝置投藥，諸如US 5,399,163；US 5,383,851；US 5,312,335；US 5,064,413；US 4,941,880；US 4,790,824；或US 4,596,556中揭示的裝置。可用於本發明的周知植入物和模組的實例包括在以下中描述的那些：US 4,487,603，其揭示一種用於以控制速率分配用藥的可植入微輸注泵；US 4,486,194，其揭示一種用於穿過皮膚投予藥物的治療裝置；US 4,447,233，其揭示一種用於以精確的輸注速率遞送用藥的用藥輸注泵；US 4,447,224，其揭示一種用於連續藥物遞送的可變流量植入式輸注裝置；US 4,439,196，其揭示一種具有多室隔室的滲透藥物遞送系統；以及US 4,475,196，其揭示一種滲透藥物遞送系統。
許多其他這樣的植入物、輸送系統和模組是本領域技術人員已知的。在某些具體例中，可以配製上述態樣的抗體以確保在活體內適當的分佈。例如，血腦屏障(BBB)排除了許多高親水性化合物。為了確保本發明的治療化合物穿過BBB (如果需要的話)，它們可以配製在例如脂質體中。關於製造脂質體的方法，參見例如US 4,522,811；US 5,374,548；和US 5,399,331。脂質體可包含一或多種選擇性地運送至特定細胞或器官中的部分，並因此增強靶向藥物遞送(參見例如V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685)。例示性的靶向部分包括葉酸或生物素(參見例如Low等人的US 5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038)；抗體(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140；M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180)；和表面活性劑蛋白A受體(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134)。
在一個具體例中，本發明的治療化合物被配製在脂質體中。在一個更佳的具體例中，脂質體包括靶向部分。在最佳具體例中，藉由推注將脂質體中的治療化合物遞送至接近期望區域的部位，例如腫瘤部位。組成物的流動性必須達到易於注射的程度。它在製造和儲存條件下必須是穩定的，並且必須防止微生物(諸如細菌和真菌)的污染作用。
在一個進一步的具體例中，可以配製上述態樣的抗體以防止或減少它們運輸穿過胎盤。這可以藉由本領域已知的方法來完成，例如藉由抗體的聚乙二醇化或藉由使用F(ab)2'片段。進一步參考Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992), " Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation." J. Immunol. Methods, 152: 177-190；以及Landor M. (1995), " Maternal-fetal transfer of immunoglobulins", Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-28。
組成物必須是無菌的且其流動性達到使組成物可以透過注射器遞送的程度。除了水之外，載劑還可以是等滲緩衝鹽水溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇，以及類似者)及其合適的混合物。可以例如透過使用膜衣(諸如卵磷脂)、透過在分散體的情況下維持所需的粒度以及透過使用表面活性劑來維持適當的流動性。在許多情況下，偏好在組成物中納入等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇或山梨醇)，以及氯化鈉。可透過在組成物中納入延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)來實現可注射組成物的長期吸收。
當活性化合物受到適當保護時，如上所述，化合物可以例如與惰性稀釋劑或可同化的食用載劑一起經口投予。 VIII.      本發明的用途和方法
上述態樣的抗體、接合物、多聚體、核酸、載體、宿主細胞和病毒具有許多治療用途，其涉及治療表現PD-1或其配體(PD-L1及/或PD-L2)的細胞的疾病。
因此，在另一個態樣中，本發明涉及上述態樣之抗體、接合物、多聚體、核酸、載體、宿主細胞、病毒或組成物的醫學用途。在這方面，本發明提供用於治療疾病(例如用於腫瘤/癌症治療)的抗體、接合物、多聚體、核酸、載體、宿主細胞、病毒或組成物(較佳為醫藥組成物)。本文使用的用詞「用於治療疾病，例如用於腫瘤/癌症治療」也可替換為「用作藥劑，尤其是在癌症治療方法中」；或該產品在製備用於在人類(或更普遍有需要的個體)中所述治療方法的醫藥配製物的用途。
在下文中，當說明本發明的較佳用途和方法時，參考第一態樣的抗體。但是應當理解，除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，否則該教示內容也適用於包含抗體或編碼該抗體的其他活性劑，即第三態樣的接合物、第四態樣的多聚體、第五態樣的核酸、第六態樣的載體、第七態樣的宿主細胞、第八態樣的病毒或第九態樣的組成物。
例如，可以將抗體或核酸例如在活體外或離體投予至培養物中的細胞，或例如在活體內投予給個體(較佳人類個體)，以治療或預防多種疾病(諸如本文所述的那些疾病)。
在第十態樣中，提供第九態樣的醫藥組成物，其用於預防性及/或治療性治療疾病。
如本文所用，術語「疾病」是指任何病理學狀態，包括癌症或腫瘤(特別是本文所述那些形式的腫瘤或癌症)，或自體免疫疾病。
「腫瘤」或「癌症」表示因為快速、不受控制的細胞增生而生長並且在引發新生長的刺激停止後仍持續生長的一群異常細胞或組織。腫瘤顯示部分或完全缺乏結構組織還有與正常組織的功能協調，通常形成明顯的組織塊，可能是良性或惡性的。如本文所用，這些術語還包含轉移。如本文所用，術語「癌症」和「癌症疾病」與術語「腫瘤」和「腫瘤疾病」可互換使用。
「轉移」表示癌細胞從其原始部位擴散到身體的另一部分。轉移的形成是一個非常複雜的過程，仰賴於惡性細胞從原發性腫瘤脫離、侵入細胞外基質、穿透內皮基底膜進入體腔和血管、然後由血液運輸，浸潤目標器官。最後，目標部位處的新腫瘤生長取決於血管生成。即使在切除原發性腫瘤後，也還是經常發生腫瘤轉移，因為腫瘤細胞或組分可能殘留著並發展出轉移潛力。在一個具體例中，術語「轉移」是有關「遠端轉移」，其有關遠離原發腫瘤和區域淋巴結系統的轉移。
「治療」表示向個體投予化合物或組成物以預防或消除疾病，包括在個體體內減小腫瘤的大小或腫瘤的數量；在個體體內阻止或減緩疾病；在個體體內抑制或減緩新疾病的發展；在目前患有或先前患有疾病的個體體內減少症狀的頻率或嚴重程度及/或復發；及/或延長(即增加)個體的壽命。
具體地，術語「治療疾病」包括治癒、縮短持續時間、改善、預防疾病或其症狀、減緩或抑制其進展或惡化，或者預防或延遲疾病或其症狀的發生。
「處於風險下」是指與一般群體相比，被鑑定為發生疾病(特別是癌症)的機會高於正常的個體(即患者)。另外，曾經患有或目前患有疾病(特別是癌症)的個體是發生疾病風險增加的個體，因為這樣的個體可能繼續發生疾病。目前患有或曾經患有癌症的個體發生癌症轉移的風險也增加。
在第十態樣的一個具體例中，疾病是癌症生長及/或癌症轉移。在一個具體例中，疾病的特徵在於包含罹病細胞或癌細胞，其特徵為表現PD-L1及/或特徵為PD-L1與其表面締合。
在第十態樣的一個具體例中，第九態樣的醫藥組成物用於預防或治療癌症或腫瘤疾病的方法中。
這些腫瘤包括實性瘤及/或血液惡性腫瘤。可以受到治療及/或預防的腫瘤疾病的實例含括所有癌症和腫瘤實體，其包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤與白血病。更具體地，此類癌症的實例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰臟癌、皮膚癌、頭部或頸部癌症、皮膚或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前列腺癌、子宮癌、性和生殖器官癌瘤、霍奇金氏病(霍奇金氏淋巴瘤)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、膀胱癌、腎癌、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、神經外胚層癌、脊柱腫瘤、神經膠質瘤、腦膜瘤和垂體腺瘤。這些癌症可能處於早期、中期或晚期，例如轉移。在一個具體例中，待治療的癌症處於晚期。
對PD-1路徑阻斷治療尤其敏感的癌症的實例包括但不限於黑色素瘤，包括轉移性黑色素瘤，淋巴瘤(包括霍奇金氏淋巴瘤)、肺癌(包括非小細胞肺癌(NSCLC)，例如晚期NSCLC，和小細胞肺癌)、腎細胞癌、膀胱癌、乳癌(包括晚期三陰性乳癌)、胃和胃食道接合處癌、胰臟腺癌，與卵巢癌。在第十態樣的一個具體例中，癌症選自由黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、乳癌、胃和胃食道接合處癌、胰臟腺癌、卵巢癌、腎腫瘤、膠質母細胞瘤和淋巴瘤組成之群，較佳為霍奇金氏淋巴瘤。
在第十態樣的一個具體例中，第九態樣的醫藥組成物被特異地遞送至目標器官或組織、積累在目標器官或組織中及/或滯留在目標器官或組織中。在一個具體例中，載體或病毒在目標器官或組織處釋放核酸及/或進入目標器官或組織處的細胞。在一個具體例中，抗體在目標器官或組織的細胞中表現。
在第十態樣的一個具體例中，治療是單藥療法或組合療法。較佳地，組合治療是選自由化療、分子靶向療法、放射療法和其他形式的免疫療法組成之群的至少一種治療。術語「免疫療法」是有關涉及特異性免疫反應的治療。
第一態樣的抗體、第三態樣的接合物、第四態樣的多聚體、第五態樣的核酸、第六態樣的載體、第七態樣的宿主細胞、第八態樣的病毒，或第九態樣的組成物(較佳醫藥組成物)意欲用於在有需要的個體中治療疾病。
如本文所用，術語「個體」意欲包括對針對PD-1之抗體有反應的人類和非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、馴養動物(諸如綿羊、狗、貓、牛、馬、山羊、雞、兩棲動物、爬行動物等)、實驗動物(諸如小鼠、大鼠、兔、天竺鼠等)。較佳的個體包括患有可透過殺死罹病細胞來改正或改善的病症，及/或患有疾病，較佳如本文所述疾病的人類患者。術語「個體(subject)」、「個體(individual)」、「生物體」或「患者」可互換使用。
術語「活體內」是有關個體體內的情況。
在第十態樣的一個具體例中，個體是人類個體。
在第十一態樣，提供一種在個體體內治療或預防疾病的方法，包含向個體投予至少一種活性劑，其中該活性劑是選自以下中的至少一者： (i)        第一態樣的抗體； (ii)       第三態樣的接合物； (iii)      第四態樣的多聚體； (iv)      第五態樣的核酸或第五態樣的核酸的組合； (v)       第六態樣的載體或第六態樣的載體的組合； (vi)      第七態樣的宿主細胞或第七態樣的宿主細胞的組合；及/或 (vii)     第八態樣的病毒或第八態樣的病毒的組合。
在第十一態樣的方法的一個具體例中，編碼第一態樣之抗體重鏈的核酸、載體、宿主細胞或病毒與編碼第一態樣之抗體輕鏈的另一核酸、載體、宿主細胞或病毒組合投予。
在第十一態樣的方法的一個具體例中，所投予的核酸、載體、宿主細胞或病毒可以編碼第一態樣的抗體之重鏈和輕鏈兩者。
在第十一態樣的方法的一個具體例中，向個體投予第十態樣的醫藥組成物。
在第十一態樣的方法的一個具體例中，個體具有以細胞表現PD-L1為特徵及/或以PD-L1與其表面締合為特徵的罹病器官或組織。
在第十一態樣的方法的一個具體例中，疾病是癌症生長及/或癌症轉移。
在第十一態樣的方法的一個具體例中，該方法用於在有發展癌症及/或癌症轉移風險或處於風險下的個體中治療或預防癌症生長及/或癌症轉移。
在第十一態樣的方法的一個實施例中，提供有效量的活性劑。較佳地，抗體以0.1至20 mg/kg範圍內、更佳0.3至10 mg/kg範圍內的劑量，以一劑或多劑提供。該劑量可以例如每1至4週、還更佳每2至3週，例如每2或3週提供。
在第十一態樣的方法的一個具體例中，癌症選自由黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、乳癌、胃癌和胃食道接合處癌、胰臟腺癌、卵巢癌、腎腫瘤、膠質母細胞瘤和淋巴瘤組成之群，較佳霍奇金氏淋巴瘤。
在第十一態樣的方法的一個具體例中，將活性劑或醫藥組成物投予到心血管系統中，較佳藉由靜脈內或動脈內投藥(諸如投予至周邊靜脈中)來投予活性劑或醫藥組成物。在方法的一個具體例中，活性劑或醫藥組成物被特異地遞送至目標器官或組織、積累在目標器官或組織中及/或滯留在目標器官或組織中。在方法的一個具體例中，目標器官或組織是癌組織，特別是本文指出的癌組織。例如，罹病器官或組織可以細胞表現疾病相關抗原為特徵及/或疾病相關抗原與其表面締合為特徵。疾病相關抗原可以是腫瘤相關抗原。疾病相關抗原可以與罹病細胞(諸如腫瘤細胞)的表面締合。在方法的一個具體例中，載體、宿主細胞或病毒在目標器官或組織處釋放核酸，及/或進入目標器官或組織處的細胞，較佳其中抗體在目標器官或組織的細胞中表現。
在第十一態樣的方法的一個具體例中，治療是單藥療法或組合療法。較佳地，組合治療是選自由化療、分子靶向療法、放射療法和其他形式的免疫療法組成之群的至少一種治療。其他形式的免疫療法包括疫苗接種(例如RNA疫苗接種)及/或可以靶向其他檢查點抑制劑，從而抑制(拮抗)或活化/刺激(促效)相應的其他檢查點。其他可靶向的檢查點抑制劑包括但不限於CTLA4、PD-L1、TIM-3、KIR或LAG-3。可以被第二結合特異性靶向的檢查點活化因子包括但不限於CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR或ICOS。例如：結合特異性的較佳組合包括抗PD1和抗PD-L1或抗PD-1和抗CTLA4。或者或另外，免疫療法可以提供抗血管生成活性。例如，透過靶向血管內皮生長因子(VEGF)或其受體VEGFR (例如VEGFR1、2、3)。或者或另外，它可能能夠靶向PDGFR、c-Kit、Raf及/或RET。
在第十一態樣的方法的一個具體例中，治療是組合療法，其中治療包括向個體投予： (i)        肽或蛋白質，其包含用於在個體中誘導針對抗原的免疫反應的表位；或編碼該肽或蛋白質的多核苷酸；及 (ii)       選自第一態樣的抗體、第三態樣的接合物、第四態樣的多聚體、第五態樣的核酸、第六態樣的載體、第七態樣的宿主細胞，及/或第七態樣的病毒中的至少一者。
在一個具體例中，依序投予肽或蛋白質(包含用於在個體中誘導針對抗原的免疫反應的表位)或編碼該肽或蛋白質的多核苷酸，以及(ii)中指出的至少一種活性化合物。在一個具體例中，在投予肽或蛋白質(包含用於在個體中誘導針對抗原的免疫反應的表位)或編碼該肽或蛋白質的多核苷酸之後，投予如(ii)中指出的至少一種活性化合物。在一個具體例中，在投予肽或蛋白質(包含用於在個體中誘導針對抗原的免疫反應的表位)或編碼該肽或蛋白質的多核苷酸後6小時或更久、12小時或更久，或24小時或更久投予如(ii)中指出的至少一種活性化合物。在一個具體例中，在投予肽或蛋白質(包含用於在個體中誘導針對抗原的免疫反應的表位)或編碼該肽或蛋白質的多核苷酸後12小時至48小時之間投予如(ii)中指出的至少一種活性化合物。
在第十一態樣的方法的一個具體例中，方法包含向個體投予編碼包含用於在個體中誘導針對抗原的免疫反應的表位之肽或蛋白質的RNA。
如本文所用，樣品可以是根據本發明可用的任何樣品，特別是生物樣品，諸如組織樣品(包括體液)及/或細胞樣品，並且可以按常規方式獲得，諸如透過組織生檢(包括穿刺生檢)，以及透過採集血液、支氣管抽吸物、痰、尿液、糞便或其他體液。如本文所用，術語「生物樣品」還包括生物樣品的部分。
本文探討在治療和用途中的治療效果較佳透過第一態樣的抗體媒介殺傷細胞的功能性質而實現，例如透過抑制在表現PD-1的細胞上的PD-1免疫抑制信號(較佳藉由形成抗體和PD-1的複合物)，及/或透過誘導免疫反應(更佳T細胞媒介的免疫反應)。
在一個具體例中，抗PD-1抗體以蛋白質投予，其中抗體可如本文所述自融合瘤、轉染瘤或藉由活體外轉錄獲得。在一個具體例中，抗PD-1抗體如本文定義以一或多個核酸或以一或多個載體投予，例如以編碼抗體或抗體鏈或此抗體或鏈的片段的RNA、或包含該RNA的脂質體，或一或多個RNA。
第一態樣的抗體可以首先測試其在活體外治療或診斷用途相關的結合活性。例如，可以使用如本文所述的結合分析、報導基因阻斷分析及/或T細胞增生分析來測試抗體。
第一態樣的抗體可用於在活體內或活體外引發以下生物活性中的一或多者：結合，較佳特異地結合至PD-1；對癌細胞或正常細胞上的PD-1具有結合性質；對PD-1表位有結合性質；對非人類PD-1變體，特別是來自小鼠、大鼠、兔和靈長類動物的PD-1變體具有結合性質；防止或減少PD-1誘導抑制信號；抑制PD-1的配體(較佳PD-L1)與PD-1交互作用/結合，例如抑制人類PD-L1結合至人類PD-1；抑制PD-L1或PD-L2的免疫抑制信號；增強或啟動免疫功能(透過這個機制)，較佳透過增強或啟動T細胞媒介的免疫反應；抑制癌症增生；及/或消耗腫瘤細胞及/或抑制癌症轉移。
在癌症治療中，組合策略可能是樂見的，因為由此產生的協同效應可能比單藥治療方法的影響更為強烈。因此，本發明還含括第一態樣的抗體、第三態樣的接合物、第四態樣的多聚體、第五態樣的核酸、第六態樣的載體、第七態樣的宿主細胞、第八態樣的病毒，及/或第九態樣的醫藥組成物也可以在組合療法中施用，即與其他藥劑組合。
例如，第一態樣的抗PD-1抗體可以與一或多種治療劑(例如細胞毒性劑、放射性毒性劑、抗血管生成劑或和免疫抑制劑)共投予以減少誘導針對第一態樣之抗體的免疫反應。抗體可以連接至藥劑(作為免疫複合物)或者可以與藥劑分開投予。在後者情況(分開投予)中，抗體可以在藥劑之前、之後或共投予，或者可以與其他已知療法(例如抗癌療法，例如放射)共投予。此類治療劑尤其包括抗腫瘤劑，諸如上文所列的抗腫瘤劑。第一態樣的抗PD-1抗體與化療劑的共投藥提供了兩種抗癌劑，其經由不同機制運作，對腫瘤細胞產生細胞毒性作用。這種共投藥可以解決由於產生對藥物的耐藥性或腫瘤細胞的抗原性改變導致它們與抗體不反應的問題。
上述態樣的抗體或組成物可以與化療結合使用。用於化療的治療劑包括但不限於一種或多種化療劑，例如紫杉醇衍生物、泰素帝(taxotere)、吉西他濱、抗代謝物(例如甲胺蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達拉濱、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪)、烷化劑(例如氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法崙、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂黴素C和順式二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑)、蒽環類(例如柔紅黴素(以前稱為柔紅黴素)和阿黴素)、抗生素(例如，放線菌素D (以前稱為放線菌素)、博來黴素、光神黴素和蒽黴素(AMC))，以及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼和長春花鹼)。在一個較佳具體例中，治療劑是細胞毒性劑或放射性毒性劑。在另一個具體例中，治療劑是免疫抑制劑。在又另一個具體例中，治療劑是GM-CSF。在較佳具體例中，治療劑是阿黴素、順鉑(Platinol)、博來黴素、硫酸鹽、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環磷醯胺(Cytoxan、Procytox、Nesar)或蓖麻毒蛋白A。
在另一個具體例中，第一態樣的抗體可與化療劑組合投予，化療劑較佳在罹患對PD-1路徑阻斷尤為敏感的癌症的患者中表現出治療功效，該癌症為諸如黑色素瘤(包括轉移性黑色素瘤)、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌(包括非小細胞肺癌(NSCLC)，例如晚期NSCLC，以及小細胞肺癌)、腎細胞癌、膀胱癌、晚期三陰性乳癌(包括晚期三陰性乳癌)、胃和胃食道接合處癌症、胰臟腺癌或卵巢癌。
在一個具體例中，上述態樣的抗體或醫藥組成物與免疫治療劑一起投予。如本文所用，「免疫治療劑」有關可能涉及活化特異性免疫反應及/或免疫效應子功能的任何藥劑。本發明考慮了抗體作為免疫治療劑的用途。在不希望受理論囿限的情況下，抗體能夠透過多種機制實現針對癌細胞的治療效果，包括誘導細胞凋亡、阻斷信號傳導路徑的組分或抑制腫瘤細胞的增生。在某些具體例中，抗體是單株抗體。可與本發明組合使用的抗癌抗體和潛在抗體目標(括號中)的非限制性實例包括：阿巴戈沃單抗(Abagovomab) (CA-125)、阿昔單抗(Abciximab) (CD41)、阿德卡木單抗(Adecatumumab) (EpCAM)、阿夫妥珠單抗(Afutuzumab) (CD20)、培戈阿拉賽珠單抗(Alacizumab pegol) (VEGFR2)、噴替酸阿妥莫單抗(Altumomab pentetate) (CEA)、阿麥妥昔單抗(Amatuximab) (MORAb-009)、馬安那莫單抗(Anatumomab mafenatox) (TAG-72)、阿泊珠單抗(Apolizumab) (HLA-DR)、阿西莫單抗(Arcitumomab) (CEA)、阿特利珠單抗(Atezolizumab) (PD-L1)、巴維昔單抗(Bavituximab) (磷脂醯絲胺酸)、貝妥莫單抗(Bectumomab) (CD22)、貝利尤單抗(Belimumab) (BAFF)、貝伐珠單抗(VEGF-A)、比伐珠單抗美坦辛(Bivatuzumab mertansine) (CD44 v6)、博納土單抗(Blinatumomab) (CD19)、維布妥昔單抗(Brentuximab vedotin) (CD30 TNFRSF8)、坎妥珠單抗美坦辛(Cantuzumab mertansin) (黏蛋白CanAg)、坎妥珠單抗拉坦辛(Cantuzumab ravtansine) (MUC1)、卡羅單抗噴地肽(Capromab pendetide) (前列腺癌細胞)、卡蘆單抗(Carlumab) (CNT0888)、卡妥索單抗(Catumaxomab) (EpCAM、CD3)、西妥昔單抗(Cetuximab) (EGFR)、泊西他西妥珠單抗(Citatuzumab bogatox) (EpCAM)、西妥木單抗(Cixutumumab) (IGF-1受體)、克勞地昔單抗(Claudiximab) (密連蛋白)、克利妥珠單抗四氮芥(Clivatuzumab tetraxetan) (MUC1)、康納木單抗(Conatumumab) (TRAIL-R2)、達西珠單抗(Dacetuzumab) (CD40)、達洛妥珠單抗(Dalotuzumab) (胰島素樣生長因子I受體)、地諾單抗(Denosumab) (RANKL)、地莫單抗(Detumomab) (B淋巴瘤細胞)、德羅圖單抗(Drozitumab) (DR5)、依美昔單抗(Ecromeximab) (GD3神經節苷脂)、依決洛單抗(Edrecolomab) (EpCAM)、埃洛妥珠單抗(Elotuzumab) (SLAMF7)、依那妥珠單抗(Enavatuzumab) (PDL192)、恩斯妥昔單抗(Ensituximab) (NPC-1C)、依帕妥珠單抗(Epertuzumab) (CD22)、顎托莫單抗(Ertumaxomab) (HER2/neu、CD3)、埃達珠單抗(Etaracizumab) (整合素ανβ3)、法妥珠單抗(Farletuzumab) (葉酸受體1)、FBTA05 (CD20)、非拉妥珠單抗(Ficlatuzumab) (SCH 900105)、芬妥木單抗(Figitumumab) (IGF-1受體)、法蘭妥單抗(Flanvotumab) (醣蛋白75)、非蘇木單抗(Fresolimumab) (TGF-β)、加利昔單抗(Galiximab) (CD80)、加尼妥單抗(Ganitumab) (IGF-I)、吉妥珠單抗奧左米星(Gemtuzumab ozogamicin) (CD33)、吉伏珠單抗(Gevokizumab) (ILIβ)、吉瑞昔單抗(Girentuximab)(碳酸酐酶9 (CA-IX))、格倫巴妥尤單抗維多丁(Glembatumumab vedotin) (GPNMB)、替伊莫單抗澤瓦林(Ibritumomab tiuxetan) (CD20)、艾蘆庫單抗(Icrucumab) (VEGFR-1)、Igovoma (CA-125)、拉坦辛伊坦新單抗(Indatuximab ravtansine) (SDC1)、英妥木單抗(Intetumumab) (CD51)、伊珠單抗奧左米星(Inotuzumab ozogamicin) (CD22)、伊匹單抗(Ipilimumab) (CD152)、伊妥木單抗(Iratumumab) (CD30)、拉貝妥珠單抗(Labetuzumab) (CEA)、來沙木單抗(Lexatumumab) (TRAIL-R2)、利韋單抗(Libivirumab) (B型肝炎表面抗原)、林妥珠單抗(Lintuzumab) (CD33)、洛伏妥珠單抗美坦辛(Lorvotuzumab mertansine) (CD56)、蘆卡木單抗(Lucatumumab) (CD40)、魯昔單抗(Lumiliximab) (CD23)、馬帕木單抗(Mapatumumab) (TRAIL-R1)、馬妥珠單抗(Matuzumab) (EGFR)、美泊利單抗(Mepolizumab) (IL5)、米拉妥珠單抗(Milatuzumab) (CD74)、米妥莫單抗(Mitumomab) (GD3神經節苷脂)、莫格利珠單抗(Mogamulizumab) (CCR4)、帕舒妥莫單抗(Moxetumomab pasudotox) (CD22)、那可洛單抗他非那妥(Nacolomab tafenatox) (C242抗原)、納妥單抗埃斯塔芬妥(Naptumomab estafenatox) (5T4)、南瑪妥單抗(Namatumab) (RON)、耐妥昔珠單抗(Necitumumab) (EGFR)、尼妥珠單抗(Nimotuzumab) (EGFR)、納武單抗(IgG4)、奧法木單抗(Ofatumumab) (CD20)、奧拉單抗(Olaratumab) (PDGF-R a)、奧那妥珠單抗(Onartuzumab) (人類散射因子受體激酶)、莫奧朴珠單抗(Oportuzumab monatox) (EpCAM)、奧戈沃單抗(Oregovomab) (CA-125)、歐西魯單抗(Oxelumab) (OX-40)、帕尼單抗(Panitumumab) (EGFR)、帕瑞妥單抗(Patritumab) (HER3)、潘妥莫單抗(Pemtumoma) (MUC1)、帕妥珠單抗(Pertuzuma) (HER2/neu)、平妥單抗(Pintumomab) (腺癌抗原)、帕妥珠單抗(Pritumumab) (波形蛋白)、雷庫圖單抗(Racotumomab) (N-乙二醇神經胺酸)、雷德圖單抗(Radretumab) (纖連蛋白外結構域-B)、雷韋單抗(Rafivirumab) (狂犬病病毒醣蛋白)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab) (VEGFR2)、利妥木單抗(Rilotumumab) (HGF)、利妥昔單抗(Rituximab) (CD20)、羅妥木單抗(Robatumumab) (IGF-1受體)、沙瑪立珠單抗(Samalizumab) (CD200)、西羅珠單抗(Sibrotuzumab) (FAP)、西圖希單抗(Siltuximab) (IL6)、他貝魯單抗(Tabalumab) (BAFF)、他珠單抗四氮芥(Tacatuzumab tetraxetan) (α胎蛋白)、帕他莫單抗(Taplitumomab paptox) (CD19)、替妥莫單抗(Tenatumomab) (肌腱蛋白C)、替普單抗(Teprotumumab) (CD221)、替西木單抗(Ticilimumab) (CTLA4)、替加妥珠單抗(Tigatuzumab) (TRAIL-R2)、TNX-650 (IL13)、托西莫單抗(Tositumomba) (CD20)、曲妥珠單抗(Trastuzumab) (HER2/neu)、TRBS07 (GD2)、曲美木單抗(Tremelimumab) (CTLA4)、西莫介白素妥妥珠單抗(Tucotuzumab celmoleukin)  (EpCAM)、烏布妥昔單抗(Ublituximab) (MS4A1)、烏瑞魯單抗(Urelumab) (4-1 BB)、伏洛昔單抗(Volociximab) (整合素α5β1)、伏妥昔單抗(Votumumab) (腫瘤抗原CTAA 16.88)、紮蘆木單抗(Zalutumumab) (EGFR)和紮木單抗(Zanolimumab) (CD4)。
例如，根據第十或第十一態樣，投予第一態樣之抗體的個體另外用一或多種靶向另一免疫檢查點的抗體治療。透過中斷抗原呈遞細胞和T淋巴細胞之間的抑制性交互作用來活化腫瘤防禦的免疫檢查點抑制劑包括但不限於抗PD-L1、抗CTLA4、抗TIM-3、抗KIR及/或抗LAG-3。還含括刺激活化檢查點(諸如CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、0X40、GITR或ICOS)的免疫治療劑，即諸如抗CD27、抗CD28、抗CD40、抗CD122、抗CD137、抗OX40、抗GITR及/或抗ICOS。尤佳的組合療法包括但不限於抗PD1和抗PD-L1的組合，從而透過靶向兩種組分來提高效率並阻斷PD1路徑，或者抗PD-1和抗CTLA4的組合以防止PD1路徑和CTLA4路徑的阻斷。例如，結合特異性的組合包括抗PD1和抗PD-L1或抗PD-1和抗CTLA4。或者或另外，免疫療法可以提供抗血管生成活性。例如，透過靶向血管內皮生長因子(VEGF)或其受體VEGFR (例如VEGFR1、2、3)。或者或另外，它可能能夠靶向PDGFR、c-Kit、Raf及/或RET。
在第十或第十一態樣的另一個具體例中，投予抗體的個體另外用抗血管生成劑治療，包括靶向血管內皮生長因子(VEGF)或其受體VEGFR的抗體，以及一或多種抑制血管生成的化學化合物。這些藥物的預處理或並行施用可以提高抗體在大塊腫瘤中的滲透。
例如，抗血管生成劑可靶向VEGF。合適的VEGF抑制劑是貝伐珠單抗。其他實例包括但不限於抑制VEGFR1、2、3、PDGFR、c-Kit、Raf及/或RET的多激酶抑制劑(例如舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼)。
在第十或第十一態樣的另一個具體例中，投予抗體的個體另外用抑制生長因子受體信號傳導的化合物治療，抑制生長因子受體信號傳導的化合物包括結合至EGFR受體的單株抗體以及抑制由EGFR受體引發的信號傳導的化學化合物。
在第十或第十一態樣的另一個具體例中，此類治療劑包括導致調節性T細胞消耗或功能不活化的藥劑，像是低劑量環磷醯胺及/或抗IL2或抗IL2受體抗體。
在第十或第十一態樣的又另一個具體例中，第一或第二態樣的抗體可以與選自抗CD25抗體、抗EPCAM抗體和抗CD40抗體中的一或多種抗體組合投予。
在第十或第十一態樣的又再一個具體例中，第一態樣的抗體可以與抗C3b(i)抗體組合投予以增強補體活化。
第一態樣的抗體還可以與一或多種疫苗組合使用，其中疫苗用於刺激針對由罹病細胞(諸如腫瘤細胞)表現之抗原的免疫系統。例如，抗原可以是如本文指出之腫瘤抗原中的一或多者。疫苗接種可以透過投予疫苗RNA來實現，疫苗RNA即編碼要針對其誘導免疫反應的抗原或表位的RNA。或者，可以投予包含用於誘導針對抗原的免疫反應之表位的肽或蛋白質。
因此，在第十或第十一態樣的另一個具體例中，第一態樣的抗體可與疫苗接種療法組合投予，即與包含用於在個體中誘導針對抗原的免疫反應的表位的至少一種肽或蛋白質，或至少一種編碼肽或蛋白質的多核苷酸/核酸組合。
因此，本發明還提供了一種組成物(較佳醫藥組成物)，其包含(i)包含用於在個體中誘導針對抗原之免疫反應的表位的肽或蛋白質，或編碼該肽或蛋白質的多核苷酸；以及(ii)選自第一態樣的抗體、第三態樣的接合物、第四態樣的多聚體、第五態樣的核酸、第六態樣的載體、第七態樣的宿主細胞，及/或第八態樣的病毒中的至少一者。在一個具體例中，組成物包含編碼用於在個體中誘導針對抗原之免疫反應的表位的肽或蛋白質的RNA。
術語「抗原」是有關包含免疫反應或免疫效應分子(諸如抗體)針對及/或要針對其之表位的藥劑。術語「抗原」尤其包括蛋白質和肽。在一個具體例中，抗原是疾病相關抗原，諸如腫瘤抗原。
術語「疾病相關抗原」以其最為普遍的含義使用，指與疾病相關的任何抗原，其較佳含有將會刺激宿主免疫系統製造細胞抗原特異性免疫反應及/或體液性抗體對抗疾病的表位。因此，疾病相關抗原、其表位或藥劑(諸如誘導免疫反應的肽或蛋白質)、靶向疾病相關抗原或表位可用於治療目的，特別是用於疫苗接種。疾病相關抗原可能與微生物感染(通常為微生物抗原)相關，或與癌症(通常為腫瘤)相關。
在一個具體例中，免疫反應所針對的抗原(即疾病相關抗原)是腫瘤抗原，較佳如本文所指出的。更佳地，至少一種腫瘤抗原選自由NY-ESO-1 (UniProt P78358)、酪胺酸酶(UniProt P14679)、MAGE-A3 (UniProt P43357)、TPTE (UniProt P56180)、KLK2 (UniProt P20151)、PSA(KLK3) (UniProt P07288)、PAP (ACPP、UniProt P15309)、HOXB13 (UniProt Q92826)、NKX3-1 (UniProt Q99801)、HPV16 E6/E7 (UniProt P03126/P03129)；HPV18 E6/E7 (UniProt P06463/P06788)；HPV31 E6/E7 (UniProt P17386/P17387)；HPV33 E6/E7 (UniProt P06427/P06429)；HPV45 E6/E7 (UniProt P21735/P21736)；HPV58 E6/E7 (UniProt P26555/P26557)、PRAME (UniProt P78395)、ACTL8 (UniProt Q9H568)、CXorf61 (KKLC1、UniProt Q5H943)、MAGE-A9B (UniProt P43362)、CLDN6 (UniProt P56747)、PLAC1 (UniProt Q9HBJ0)和p53 (UniProt P04637)組成之群。用於疫苗接種的肽或蛋白質(即疫苗抗原)可包含該抗原或其表位。在一個具體例中，疫苗抗原呈編碼疫苗抗原的RNA形式投予。涉及這些抗原的治療方法可能旨在治療癌症，其中癌細胞的特徵在於表現對應抗原。還可以使用本文所述的抗原，特別是呈組合形式的NY-ESO-1、酪胺酸酶、MAGE-A3、TPTE、KLK2、PSA(KLK3)、PAP(ACPP)、HOXB13、NKX3-1、HPV16 E6/E7；HPV18 E6/E7；HPV31 E6/E7；HPV33 E6/E7；HPV45 E6/E7；HPV58 E6/E7、PRAME、ACTL8、CXorf61 (KKLC1)、MAGE-A9B、CLDN6、PLAC1和p53。涉及此類抗原組合的治療方法可能旨在治療癌症，其中癌細胞的特徵在於表現對應抗原組合的兩個或更多個抗原，或者其中患有某種待治療癌症之患者的大部分(例如至少80%、至少90%或甚至更多)癌細胞表現一或多種組合的對應抗原。此類組合可能包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種或至少6種抗原的組合。因此，該組合可以包含3、4、5、6、7或8種抗原。在這種情況下，組合中的各個抗原可以投過投予包含該抗原或其表位的肽或蛋白質(即疫苗抗原)，或編碼該肽或蛋白質的RNA來處理。在一個尤佳的具體例中，藉由投予編碼包含該抗原的肽或蛋白質的RNA來處理組合中的各個抗原。因此，疫苗接種可能含括投予不同的RNA分子，其中該等不同RNA分子中的每一者編碼包含抗原組合的某個抗原的肽或蛋白質。組合的不同疫苗抗原或編碼不同疫苗抗原的RNA可以按混合物、依序或其組合的形式投予。
在一個具體例中，抗原組合包含NY-ESO-1、酪胺酸酶、MAGE-A3和TPTE，較佳由其組成。這個組合可用於治療皮膚黑色素瘤。
在一種具體例中，抗原組合包含KLK2、PSA(KLK3)、PAP(ACPP)、HOXB13和NKX3-1，較佳由其組成。這個組合可用於治療前列腺癌。
在一個具體例中，抗原組合包含PRAME、ACTL8、CXorf61(KKLC1)、MAGEA3、MAGE-A9B、CLDN6、NY-ESO-1和PLAC1，較佳由其組成。這個組合可用於治療乳癌，諸如三陰性乳癌，特別是雌激素受體陰性和助孕素受體陰性和HER2陰性乳癌。
在一種具體例中，抗原組合包含CLDN6、p53和PRAME，較佳由其組成。這個組合可用於治療卵巢癌，諸如上皮卵巢癌。
本文所述的疫苗可能由靶向在疾病(諸如癌症)中表現之一或多種抗原的一或多個RNA組成。活性成分可能是單股RNA，其在進入抗原呈遞細胞(APC)後可被轉譯成相應蛋白質。除了編碼抗原序列的野生型或密碼子經優化序列外，RNA還可能含有一或多種結構元件，這些元件針對RNA在穩定性和轉譯效率方面的最大功效進行優化(5'-帽、5'-UTR、3'-UTR、聚(A)-尾)。在一個具體例中，RNA含有所有這些元件。在一個具體例中，β-S-ARCA(D1)可用作為在RNA原料藥5'端處的特定加帽結構。作為5'-UTR序列，可以使用人類α-球蛋白mRNA的5'-UTR序列，視情況可使用經優化的「Kozak序列」以提高轉譯效率。作為3'-UTR序列，可使用位於編碼序列和聚(A)尾之間的人類β-球蛋白mRNA的兩個重複3'-UTR，以確保最大蛋白含量更高且mRNA持續更久。或者，可以使用兩個衍生自「胺基端分裂強化子」(AES) mRNA(稱為F)和粒線體編碼的12S核醣體RNA (稱為I)的序列元件組合(FI元件)，以確保最大蛋白質含量更高且mRNA持續更久。這些是透過一個離體挑選出對RNA賦予穩定性和增加總蛋白質表現的序列的方法來進行鑑定(參見WO 2017/060314，以引用的方式併入本文)。此外，可以使用長度為110個核苷酸的聚(A)尾，其由一段30個腺苷殘基，隨後是10個核苷酸的連接子序列(隨機核苷酸)和另外70個腺苷殘基組成。這個聚(A)尾序列被設計成在樹突狀細胞中提高RNA穩定性和轉譯效率。
此外，sec (分泌訊息肽)及/或MITD (MHC第I類運輸結構域)可以按照對應元件被分別轉譯為N-端或C-端標籤的方式融合至抗原編碼區。衍生自編碼人類MHC第I類複合體(HLA-B51、單倍型A2、B27/B51、Cw2/Cw3)的序列的融合蛋白標籤已被證明會增進抗原加工與呈遞。sec可能對應於編碼分泌訊息肽的78 bp片段，它指引新生多肽鏈易位到內質網中。MITD可能對應於MHC第I類分子的跨膜結構域和細胞質結構域，也稱為MHC第I類運輸結構域。具有自身分泌訊息肽和跨膜結構域的抗原(諸如CLDN6)可能不需要添加融合標籤。編碼主要由胺基酸甘胺酸(G)和絲胺酸(S)組成的短連接子肽的序列通常在用於融合蛋白時可用作為GS/連接子。
抗原可以與輔助表位組合投予以打破免疫耐受。輔助表位可能是破傷風類毒素衍生的，例如衍生自破傷風梭菌的破傷風類毒素(TT)的P2P16胺基酸序列。這些序列可能藉由在促發期間提供腫瘤非特異性T細胞輔助，幫助克服自身耐受性機制來有效誘導對自身抗原的免疫反應。破傷風類毒素重鏈包括可混雜結合至MHC第II類等位基因，並在幾乎所有接種破傷風疫苗的個體體內誘導CD4+記憶T細胞的表位。此外，與單獨投予腫瘤相關抗原相比，已知TT輔助表位與腫瘤相關抗原的組合透過在促發期間提供CD4+媒介的T細胞輔助來增進免疫刺激。為了降低刺激CD8+ T細胞的風險，已知含有混雜結合輔助表位的兩個肽序列(例如P2和P16)可用於確保與盡可能多的MHC第II類等位基因結合。
在一個具體例中，疫苗抗原包含破壞免疫耐受性的胺基酸序列。破壞免疫耐受性的胺基酸序列包含輔助表位，較佳破傷風類毒素衍生的輔助表位。破壞免疫耐受性的胺基酸序列可以直接或受到連接子分隔而融合至疫苗序列(即抗原肽)的C-端。視情況，破壞免疫耐受性的胺基酸序列可以將疫苗序列和MITD相連接。在疫苗抗原是以編碼疫苗抗原之RNA形式投予的情況下，破壞免疫耐受性的胺基酸序列可能是RNA編碼的。在一個具體例中，靶向抗原的RNA與輔助表位的RNA一起施用以加強所形成的免疫反應。針對編碼抗原的RNA，這種編碼輔助表位的RNA可能含有就RNA在穩定性和轉譯效率方面的最大功效而進行優化的上述結構元件(5'-帽、5'-UTR、3'-UTR、聚(A)-尾)。此外，sec (分泌訊息肽)及/或MITD (MHC第I類運輸結構域)可以按照對應元件被分別轉譯為N-端或C-端標籤的方式融合至輔助表位編碼區，如上文有關抗原編碼RNA所述。在一個具體例中，RNA與編碼破傷風類毒素(TT)衍生的輔助表位P2和P16 (P2P16)的額外RNA共投予，以加強所生成的免疫反應。
疫苗RNA可以與脂質體複合以生成血清穩定的RNA-脂質複合體(RNA (LIP))供用於靜脈內(i.v.)投藥。如果使用不同RNA的組合，則RNA可以分別與脂質體複合而生成血清穩定的RNA-脂質體(RNA (LIP))供用於靜脈內(i.v.)投藥。RNA (LIP)靶向淋巴器官中的抗原呈遞細胞(APC)，從而有效刺激免疫系統。
在一個具體例中，疫苗RNA與編碼破壞免疫耐受性的胺基酸序列的RNA一起配製為脂質複合物顆粒。
如本文所用，「腫瘤抗原」或「癌抗原」包括(i)腫瘤特異性抗原、(ii)腫瘤相關抗原、(iii)腫瘤上的胚胎抗原、(iv)腫瘤特異性膜抗原、(v)腫瘤相關膜抗原、(vi)生長因子受體，以及(xi)與癌症相關的任何其他類型的抗原或物質。
任何腫瘤抗原(較佳由腫瘤細胞表現)可以透過本文揭示的疫苗接種來靶向。在一個具體例中，腫瘤抗原由腫瘤細胞呈遞，因此可以被T細胞靶向。如本文所揭示的疫苗接種較佳地活化對MHC呈遞之腫瘤抗原具有特異性的T細胞。腫瘤抗原可能是腫瘤特異性抗原(TSA)或腫瘤相關抗原(TAA)。TSA是腫瘤細胞所特有的，不會出現在體內的其他細胞上。TAA並非腫瘤細胞所獨有，相反，在無法誘導對抗原的免疫耐受狀態的條件下，TAA也會在正常細胞上表現。腫瘤上的抗原表現可在使免疫系統能夠對抗原有所反應的條件下發生。TAA可能是胎兒發育期間免疫系統不成熟且無法反應時在正常細胞上表現的抗原，也可能是正常細胞上通常以極低量正常存在但在腫瘤細胞上以高出許多的量表現的抗原。
肽和蛋白質抗原的長度可以是2-100個胺基酸，包括例如至少5個胺基酸、至少10個胺基酸、至少15個胺基酸、至少20個胺基酸、至少25個胺基酸、至少30個胺基酸、至少35個胺基酸、至少40個胺基酸、至少45個胺基酸，或至少50個胺基酸。在一些具體例中，肽可以多於50個胺基酸。在一些具體例中，肽可以多於100個胺基酸。
肽或蛋白質抗原可以是任何肽或蛋白質，其能誘導或增加免疫系統產生針對目標抗原(例如疾病相關抗原)的抗體和T細胞反應的能力。
在又另一個具體例中，第一態樣的抗體可與放射療法及/或自體周邊幹細胞或骨髓移植結合投予。
本發明還含括組合療法，其包括第九態樣的組成物與至少一種消炎劑或至少一種免疫抑制劑。在一個具體例中，此類治療劑包括一或多種消炎劑，諸如類固醇藥物或NSAID (非類固醇消炎藥物)。較佳的藥劑包括例如阿司匹靈和其他水楊酸鹽、Cox-2抑制劑，諸如羅非昔布(Vioxx)和塞來昔布(Celebrex))、NSAID (諸如布洛芬(Motrin，Advil)、非諾洛芬(Nalfon)、萘普生(Naprosyn)、舒林酸(Clinoril)、雙氯芬酸(Voltaren)、吡羅昔康(Feldene)、酮洛芬(Orudis)、二氟尼柳(Dolobid)、萘丁美酮(Relafen)、依托度酸(Lodine)、奧沙普秦(Daypro)和吲哚美辛(Indocin)。根據本發明的組合療法還可以包含(i)第一態樣的抗體與(ii)如上所指出的疫苗接種治療/療法，以及(iii)至少一種消炎劑或至少一種免疫抑制劑的組合。
上述態樣的雙特異性和多特異性分子可用於與另一個免疫檢查點交互作用。從而抑制或活化/刺激相應的其他檢查點。其他可被靶向的檢查點抑制劑包括但不限於CTLA4、PD-L1、TIM-3、KIR或LAG-3。可以被第二結合特異性靶向的檢查點活化因子包括但不限於CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR或ICOS。結合特異性的較佳組合包括抗PD1和抗PD-L1或抗PD-1和抗CTLA4。
或者或另外，上述態樣的雙特異性或多特異性分子可用以提供抗血管生成活性，透過靶向例如血管內皮生長因子(VEGF)或其受體VEGFR(例如VEGFR1、2、3)。第二結合特異性還可能能夠靶向PDGFR、c-Kit、Raf及/或RET。
或者或另外，上述態樣的雙特異性或多特異性分子可用於靶向腫瘤抗原，較佳如上文所指出的腫瘤抗原，其使得第一態樣的抗體對癌細胞具有特異性。
關於第十和第十一態樣的用途與方法，可以改變可能被包含在醫藥組成物(較佳如上所述的醫藥組成物)中的活性成分的實際劑量含量，以獲得如下活性成分的量：對於特定患者、組成物和投藥模式而言，可有效實現期望的治療反應，且對患者無毒性。所選的劑量含量將取決於多種藥物動力學因素，包括所採用的本發明具體組成物的活性、投藥路徑、投藥時間、所採用的具體化合物的排泄速率、治療的持續時間、與所採用的特定組成物組合使用的其他藥物、化合物及/或材料、接受治療的患者的年齡、性別、體重、病況、一般健康狀況和既往病史、以及醫學領域中眾所周知的類似因素。
具有本領域通常技術的醫師或獸醫可以容易地決定並開立所需醫藥組成物的有效量。例如，醫師或獸醫可以按照低於實現期望治療效果所需的程度開始醫藥組成物中所用的本發明化合物的劑量，並逐漸增加劑量直至實現期望的效果。一般而言，本發明組成物的合適日劑量將是有效產生治療效果的最低劑量的化合物量。這種有效劑量通常取決於上述因素。較佳的是靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下投藥，較佳在目標位點附近投藥。如果需要，治療組成物的有效日劑量可以作為兩個、三個、四個、五個、六個或更多個子劑量在一天中以適當間隔分別投藥，視情況以單位劑型投予。雖然本發明的化合物可以單獨投予，但較佳將該化合物以醫藥組成物(配製物)投予。
在一個具體例中，第一態樣的抗體可以藉由輸注投藥，較佳在一段長時間內(諸如超過24小時)緩慢連續輸注，以減少毒性副作用。投藥還可以透過在一段2至24小時，諸如2至12小時的時間內連續輸注來進行。此類方案可根據需要例如在6個月或12個月後重複一次或多次。可以藉由使用靶向抗PD-1抗體的抗個體基因型抗體在投藥後測量生物樣品中的循環抗PD-1抗體量來決定或調整劑量。
在又另一個具體例中，藉由維持療法投予抗體，諸如一週一次，持續一段6個月或更長的時間。
腫瘤療法的「治療有效劑量」可以透過客觀腫瘤反應來測量，客觀腫瘤反應可以是完全的或部分的。完全反應(CR)定義為沒有臨床、放射學或其他疾病證據。部分反應(PR)是由於腫瘤總大小減少50%以上所致。中位進展時間是特徵鑑定客觀腫瘤反應持久性的量度。
腫瘤療法的「治療有效劑量」也可以透過其穩定疾病進展的能力來測量。化合物抑制癌症的能力可以在預測人類腫瘤功效的動物模型系統中進行評估。或者，可以透過本領域技術人員已知的活體外分析檢查化合物抑制細胞生長或細胞凋亡的能力來評估組成物的這個性質。治療有效量的治療化合物可以減小個體的腫瘤大小，或以其他方式改善症狀。本領域普通技術人員將能夠基於諸如個體的身材、個體症狀的嚴重程度以及所選擇的特定組成物或投藥路徑來確定這樣的量。
本文使用的用詞「用於治療疾病，例如用於腫瘤/癌症治療」也可替換為「用作藥劑，尤其是在癌症治療方法中」；或該產品在製備用於在人類(或更普遍有需要的個體)中所述治療方法的醫藥配製物的用途。
作為上述態樣的抗體、接合物、多聚體、核酸、載體、宿主細胞、病毒或組成物在腫瘤/癌症治療中的用途的替代方案，上述態樣的抗體、接合物、多聚體、核酸、載體、宿主細胞、病毒或組成物可以用於治療需要誘導免疫反應的治療的其他疾病。因此，上述態樣的抗體、接合物、多聚體、核酸、載體、宿主細胞、病毒或組成物可有效治療感染。感染治療可包括例如人類肝炎病毒(B型肝炎、C型肝炎、A型肝炎或E型肝炎)、人類逆轉錄病毒、人類免疫不全病毒(HIV1、HIV2)、人類T白血病病毒(HTLV1、HTLV2)，或人類淋巴細胞型病毒、單純皰疹病毒第1或2型、EB二氏病毒、巨細胞病毒、水痘帶狀皰疹病毒、人類皰疹病毒(包括人類皰疹病毒6)、脊髓灰白質炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、日本腦炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、腺病毒、腸病毒、鼻病毒、嚴重急性呼吸系統症候群(SARS)病毒、伊波拉病毒、西尼羅病毒或人工修飾的這些病毒的感染。
上述態樣的抗體、接合物、多聚體、核酸、載體、宿主細胞、病毒或組成物在腫瘤/癌症治療中的用途的又一替代方案是上述態樣的抗體、接合物、多聚體、核酸、載體、宿主細胞，病毒或組成物可以用於治療需要消耗活化的免疫細胞的治療的其他疾病。因此，上述態樣的抗體、接合物、多聚體、核酸、載體、宿主細胞、病毒或組成物可有效治療自體免疫疾病。自體免疫疾病可包括例如乳糜瀉、發炎性腸病、多發性硬化症、類風濕性關節炎和全身性紅斑狼瘡。
除非上下文另有說明，否則關於上文揭示本發明的用途和方法的較佳具體例的揭示內容相對於治療癌症也適用於治療傳染病或自體免疫疾病。
包含上述態樣的抗體、接合物或多聚體和使用說明的套組也在本發明的範疇內。套組可進一步含有一或多種額外藥劑，諸如靶向第一態樣的抗PD-1抗體的抗體、酶受質或其他受質、用於獲得顯色的酶等。
因此，在第十二態樣中，提供用於在樣品中定性或定量偵測PD-1的套組，其中該套組包含第一或第二態樣的抗體或第四態樣的接合物或第五態樣的多聚體。
第十二態樣的套組可以用於在樣品中定性或定量偵測PD-1。
在一個具體例中，提供用於在樣品中偵測PD-1抗原的存在或測量PD-1抗原量的方法，包含使樣品和對照樣品與特異地結合至PD-1的抗體(抗體較佳如本文所揭示的抗體)在允許抗體或其部分與PD-1之間形成複合物的條件下接觸。然後偵測複合物的形成，其中與對照樣品相比，樣品間複合物形成的差異指示樣品中存在PD-1抗原。
在又另一具體例中，提供一種在活體內或活體外偵測表現PD-1的細胞的存在或定量表現PD-1的細胞量的方法。該方法包含(i)向個體投予結合至可偵測標記的第一態樣的抗體；(ii)使個體暴露於用於偵測該可偵測標記的工具以辨識含有表現PD-1的細胞的區域。
如上所述的方法尤其可用於診斷PD-1相關疾病及/或定位PD-1相關疾病。較佳地，樣品中的PD-1量高於對照樣品中的PD-1量指示個體(特別是人類，樣品是由其衍生而來)中存在PD-1相關疾病。
在又另一個具體例中，第三態樣的接合物可用於藉由將化合物(諸如治療劑、標記等)連接至抗體，將化合物靶向至其表面上表現有PD-1的細胞。因此，本發明還提供了用於離體或活體外定位表現PD-1的細胞的方法。
透過下面的附圖和實例詳細說明上述態樣，其僅用於說明目的並且不應被解釋為限制本發明的範疇。由於發明說明和實例，本領域技術人員可以獲得同樣包括在本發明中的更多具體例。
本發明尤其是關於以下項目： 1.  一種能夠結合至PD-1的抗體，其中該抗體包含具有重鏈恆定區(CH)和重鏈可變區(VH)的重鏈，其中重鏈恆定區根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234的位置處包含芳族或非極性胺基酸，以及根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置236的位置處包含甘胺酸以外的胺基酸。 2.  如項目1之抗體，其中該抗體具有降低或耗盡的Fc媒介的效應子功能。 3.  如項目1或2之抗體，其中對應於位置236的位置處的胺基酸是鹼性胺基酸。 4.  如項目2或3之抗體，其中鹼性胺基酸選自由離胺酸、精胺酸和組胺酸組成之群。 5.  如項目1至4中任一項之抗體，其中鹼性胺基酸是精胺酸(G236R)。 6.  如項目1至5中任一項之抗體，其中對應於位置234的位置處的胺基酸是芳族胺基酸。 7.  如項目6之抗體，其中芳族胺基酸選自由苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸組成之群。 8.  如項目1至5中任一項之抗體，其中對應於位置234的位置處的胺基酸是非極性胺基酸。 9.  如項目8之抗體，其中非極性胺基酸選自由丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸和色胺酸組成之群。 10.      如項目8或9之抗體，其中非極性胺基酸選自由異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸和色胺酸組成之群。 11.      如項目1至10中任一項之抗體，其中對應於位置234處的胺基酸是苯丙胺酸(L234F)。 12.      如項目1至11中任一項之抗體，其中於該重鏈恆定區中根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置235的位置處的胺基酸是酸性胺基酸。 13.      如項目12之抗體，其中酸性胺基酸是天冬胺酸或麩胺酸。 14.      如項目1至13中任一項之抗體，其中對應於位置235的位置處的胺基酸是麩胺酸(L235E)。 15.      如項目1至14中任一項之抗體，其中在重鏈恆定區中對應於位置234、235和236的位置處的胺基酸是位置234處的非極性胺基酸或芳族胺基酸、位置235處的酸性胺基酸，以及位置236處的鹼性胺基酸。 16.      如項目1至15中任一項之抗體，其中對應於位置234的胺基酸是苯丙胺酸，對應於位置235的胺基酸是麩胺酸，而對應於位置236的胺基酸是精胺酸(L234F/L235E/G236R)。 17.      如項目1至16中任一項之抗體，其中重鏈恆定區包含與如SEQ ID NO：2中所示重鏈恆定區序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。 18.      如項目1至17中任一項之抗體，其中重鏈恆定區包含如SEQ ID NO：2或55中所示的序列。 19.      如項目1至18中任一項之抗體，其中重鏈恆定區的同型是IgG1。 20.      如項目1至19中任一項之抗體，其中重鏈可變區(VH)包含具有或包含如SEQ ID NO：8中所示序列的互補決定區3 (HCDR3)。 21.      如項目1至20中任一項之抗體，其中重鏈可變區(VH)的HCDR3具有或包含如SEQ ID NO：9中所示的序列。 22.      如項目1至21中任一項之抗體，其中重鏈可變區(VH)包含互補決定區2 (HCDR2)，該HCDR2具有或包含如SEQ ID NO：10中所示的序列。 23.      如項目22之抗體，其中重鏈可變區(VH)的HCDR2具有或包含如SEQ ID NO：11中所示的序列。 24.      如項目1至23中任一項之抗體，其中重鏈可變區(VH)包含具有或包含選自SYN之序列的互補決定區1 (HCDR1)。 25.      如項目24的抗體，其中重鏈可變區(VH)的HCDR1具有或包含如SEQ ID NO：12中所示的序列。 26.      如項目24的抗體，其中重鏈可變區(VH)的HCDR1具有或包含如SEQ ID NO：13中所示的序列。 27.      如項目1至26中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中HCDR1序列選自具有或包含SYN、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的序列，HCDR2序列選自具有或包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的序列，而HCDR3序列選自具有或包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的序列。 28.      如項目1至27中任一項之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別是或包含SYN、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：8。 29.      如項目1至28中任一項之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別是或包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：8。 30.      如項目1至28中任一項之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別是或包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：9。 31.      如項目1至30中任一項之抗體，其中抗體包含具有輕鏈可變區(VL)的輕鏈。 32.      如項目1至31中任一項之抗體，其中抗體包含輕鏈可變區(VL)，該VL包含以下中的至少一者： -   互補決定區3 (LCDR3)，其具有或包含如SEQ ID NO：14中所示的序列； -   互補決定區2 (LCDR2)，其具有或包含選自QAS的序列或如SEQ ID NO：15中所示的序列；及/或 -   互補決定區1 (LCDR1)，其具有或包含如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17中所示的序列。 33.      如項目32之抗體，其中抗體包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中LCDR1序列選自具有或包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：16的序列，LCDR2序列選自具有或包含QAS或SEQ ID NO：15的序列，而LCDR3序列是具有或包含SEQ ID NO：14的序列。 34.      如項目31至33中任一項之抗體，其中抗體包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分別是或包含SEQ ID NO：16、QAS和SEQ ID NO：14。 35.      如項目31至34中任一項之抗體，其中抗體包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分別是或包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：14。 36.      如項目1至19中任一項之抗體，其包含如項目20至30中任一項所指定的重鏈可變區(VH)以及項目31至35中任一項所指定的輕鏈可變區(VL)。 37.      如項目1至36中任一項之抗體，其中抗體包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(VH)，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別包含或具有SYN、如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：8中所示序列，而LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：16、QAS和SEQ ID NO：14中所示序列。 38.      如項目1至36中任一項之抗體，其中抗體包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(VH)，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中HCDRl、HCDR2和HCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：8中所示序列，而LCDRl、LCDR2和LCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：14中所示序列。 39.      如項目1至36中任一項之抗體，其中抗體包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(VH)，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：9中所示序列，而LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：16、QAS和SEQ ID NO：14中所示序列。 40.      如項目1至39中任一項之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含與如SEQ ID NO：18中所示VH序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。 41.      如項目1至39中任一項之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)，其中該VH包含如SEQ ID NO：18中所示的序列。 42.      如項目1至41中任一項之抗體，其中抗體包含輕鏈可變區(VL)，該VL包含與如SEQ ID NO：19中所示VL序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。 43.      如項目1至42中任一項之抗體，其中抗體包含輕鏈可變區(VL)，其中該VL包含如SEQ ID NO：19中所示的序列。 44.      如項目1至43中任一項之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中VH包含或具有如SEQ ID NO：18中所示的序列，而VL包含或具有如SEQ ID NO：19中所示的序列。 45.      如項目1至39中任一項之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含與如SEQ ID NO：20中所示VH序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。 46.      如項目45之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其中該VH包含如SEQ ID NO：20中所示的序列。 47.      如項目45之抗體，其中該抗體包含重鏈，該重鏈包含有包含如SEQ ID NO：20中所示序列的VH，以及包含如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：55中所示序列的重鏈恆定區。 48.      如項目45之抗體，其中該抗體包含有包含如SEQ ID NO：56中所示序列的重鏈。 49.      如項目1至48中任一項之抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區(VL)，該VL包含與如SEQ ID NO：21中所示VL序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。 50.      如項目49之抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區(VL)，其中該VL包含如SEQ ID NO：21中所示的序列。 51.      如項目49之抗體，其中該抗體包含輕鏈，該輕鏈包含有包含如SEQ ID NO：21中所示序列的VL，以及包含如SEQ ID NO：6中所示序列的輕鏈恆定區。 52.      如項目49之抗體，其中該抗體包含有包含如SEQ ID NO：57中所示序列的輕鏈。 53.      如項目1至48中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含或具有如SEQ ID NO：20中所示的序列，而VL包含或具有如SEQ ID NO：21中所示的序列。 54.      如項目1至53中任一項之抗體，其中該抗體包含 (i) 重鏈，其具有包含如SEQ ID NO：2或55中所示序列的重鏈恆定區(CH)以及包含如SEQ ID NO：20中所示序列的重鏈可變區(VH)，和 (ii)       輕鏈，其具有包含如SEQ ID NO：6中所示序列的輕鏈恆定區(CL)以及包含如SEQ ID NO：21中所示序列的輕鏈可變區(VL)。 55.      如項目1至53中任一項之抗體，其中抗體包含具有如SEQ ID NO：56中所示序列的重鏈以及具有如SEQ ID NO：57中所示序列的輕鏈。 56.      如項目1至55中任一項之抗體，其為單株、嵌合或人源化抗體或此一抗體的片段。 57.      如項目1至56中任一項之抗體，其中與對應野生型抗體相比，補體蛋白C1q與該抗體恆定區的結合降低，較佳至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%。 58.      如項目1至57中任一項之抗體，其中與對應野生型抗體相比，一或多個IgG Fc-加瑪受體與抗體的結合降低，較佳至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%。 59.      如項目58之抗體，其中該一或多個IgG Fc-加瑪受體選自Fc-加瑪RI、Fc-加瑪RII和Fc-加瑪RIII中的至少一者。 60.      如項目58之抗體，其中IgG Fc-加瑪受體是Fc-加瑪RI。 61.      如項目1至60中任一項之抗體，其中抗體不能誘導Fc-加瑪RI媒介的效應子功能，或者其中所誘導的Fc-加瑪RI媒介的效應子功能相較於對應野生型抗體降低，較佳至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%。 62.      如項目1至61中任一項之抗體，其中抗體不能誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)媒介的溶解、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)媒介的溶解、細胞凋亡、同型黏附及/或吞噬作用中的至少一者，或其中補體依賴性細胞毒性(CDC)媒介的溶解、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)媒介的溶解、細胞凋亡、同型黏附及/或吞噬作用中的至少一者受到誘導的程度降低，較佳降低至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%。 63.      如項目1至62中任一項之抗體，其中與對應野生型抗體相比，新生兒Fc受體(FcRn)與抗體的結合不受影響。 64.      如項目1至63中任一項之抗體，其中PD-1是人類PD-1。 65.      如項目64之抗體，其中PD-1具有或包含如SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23中所示的胺基酸序列，或者PD-1的胺基酸序列與如SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23中所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性，或其免疫原性片段。 66.      如項目1至65中任一項之抗體，其結合至活細胞表面上存在的PD-1的天然表位。 67.      如項目1至66中任一項之抗體，其中抗體是多特異性抗體，包含結合至PD-1的第一抗原結合區和結合至另一抗原的至少又一個抗原結合區。 68.      如項目67之抗體，其中抗體是雙特異性抗體，包含結合至PD-1的第一抗原結合區和結合至另一抗原的第二抗原結合區。 69.      如項目67或68之抗體，其中結合至PD-1的第一抗原結合區包含如項目1至60中任一項所示的重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)。 70.      一種融合瘤，其能夠生產如項目1至69中任一項之抗體。 71.      一種接合物，其包含偶聯至某個部分或藥劑的如項目1至69中任一項之抗體。 72.      如項目71之接合物，其中該部分或藥劑選自由放射性同位素、酶、染料、藥物、毒素和細胞毒性劑組成之群。 73.      一種多聚體，其包含如項目1至69中任一項之至少兩種抗體，或如項目71或72之至少兩種接合物，或如項目1至69中任一項之一或多種抗體與如項目71或72之一或多種接合物的混合物。 74.      如項目73之多聚體，其包含如項目1至69中任一項之4至8個抗體或如項目71或72之接合物。 75.      一種核酸，其包含編碼如項目1至69中任一項之抗體，或編碼如項目1至30或37至66中任一項之抗體重鏈及/或編碼如項目31至39、42、43或49至66中任一項之抗體輕鏈的核酸序列，或其片段。 76.      如項目75之核酸，其中核酸是RNA。 77.      一種載體，其包含如項目75或76之一或多種核酸。 78.      如項目77之核酸，其中載體是多層囊泡、單層囊泡或其混合物。 79.      如項目77或78之載體，其中載體是脂質體。 80.      如項目79之載體，其中脂質體是陽離子脂質體。 81.      如項目79或80之載體，其中脂質體具有範圍約50 nm至約200 nm的粒徑。 82.      一種宿主細胞，其包含如項目75或76之核酸或包含如項目77至81中任一項之載體。 83.      一種病毒，其包含如項目75或76之核酸或包含如項目77至81中任一項之載體。 84.      一種醫藥組成物，其包含活性劑及醫藥上可接受的載劑，其中活性劑是選自以下中的至少一者： (i) 項目1至69中任一項之抗體； (ii)       項目71或72之接合物； (iii)      項目73或74之多聚體； (iv)      項目75或76之核酸或其組合； (v)       項目77至81中任一項之載體或其組合； (vi)      項目82之宿主細胞或其組合；及/或 (vii)     項目83之病毒或其組合。 85.      如項目84之醫藥組成物，其被配製成用於非經腸投藥。 86.      如項目85之醫藥組成物，其被配製成用於心血管，特別是靜脈內或動脈內投藥。 87.      如項目84至86中任一項之醫藥組成物，其用於預防性及/或治療性治療疾病。 88.      如項目87之醫藥組成物，其中疾病是癌症生長及/或癌症轉移。 89.      如項目87或88之醫藥組成物，其中疾病的特徵在於包含罹病細胞或癌細胞，其特徵為表現PD-L1及/或特徵為PD-L1與其表面締合。 90.      如項目84至89中任一項之醫藥組成物，其用於預防或治療癌症的方法中。 91.      如項目88至90中任一項之醫藥組成物，其中癌症選自由黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、乳癌、胃和胃食道接合處癌、胰臟腺癌、卵巢癌和淋巴瘤組成之群。 92.      如項目84至91中任一項之醫藥組成物，其中醫藥組成物被特異地遞送至目標器官或組織、積累在目標器官或組織中及/或滯留在目標器官或組織中。 93.      如項目84至92中任一項之醫藥組成物，其中載體或病毒在目標器官或組織處釋放核酸及/或進入目標器官或組織處的細胞。 94.      如項目84至93中任一項之醫藥組成物，其中抗體在目標器官或組織的細胞中表現。 95.      如項目84至94中任一項之醫藥組成物，其中治療是單藥療法或組合療法。 96.      如項目95之醫藥組成物，其中組合治療是選自由化療、分子靶向療法、放射療法和其他形式的免疫療法組成之群的至少一種治療。 97.      如項目84至96中任一項之醫藥組成物，其中個體是人類。 98.      一種在個體體內治療或預防疾病的方法，包含向個體投予至少一種活性劑，其中該活性劑是選自以下中的至少一者： (i)        項目1至69中任一項之抗體； (ii)       項目71或72之接合物； (iii)      項目73或74之多聚體； (iv)      項目75或76之核酸或其組合； (v)       項目77至81中任一項之載體或其組合； (vi)      項目82之宿主細胞或其組合；及/或 (vii)     項目83之病毒或其組合。 99.      如項目98之方法，其中向個體投予如項目84至86中任一項之醫藥組成物。 100.    如項目98或99之方法，其中個體具有以細胞表現PD-L1為特徵及/或以PD-L1與其表面締合為特徵的罹病器官或組織。 101.    如項目98至100中任一項之方法，其中疾病是癌症生長及/或癌症轉移。 102.    如項目101之方法，其中癌症選自由黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、乳癌、胃和胃食道接合處癌、胰臟腺癌、卵巢癌和淋巴瘤組成之群。 103.    如項目98至102中任一項之方法，其中將活性劑或醫藥組成物投予至心血管系統中。 104.    如項目103之方法，其中藉由靜脈內或動脈內投藥，諸如投藥至周邊靜脈中來投予活性劑或醫藥組成物。 105.    如項目98至104中任一項之方法，其中活性劑或醫藥組成物被特異地遞送至目標器官或組織、積累在目標器官或組織中及/或滯留在目標器官或組織中。 106.    如項目98至105中任一項之方法，其中載體、宿主細胞或病毒在目標器官或組織處釋放核酸，及/或進入目標器官或組織處的細胞。 107.    如項目106之方法，其中抗體在目標器官或組織的細胞中表現。 108.    如項目98至107中任一項之方法，其中治療是單藥療法或組合療法。 109.    如項目108之方法，其中組合治療是選自由化療、分子靶向療法、放射療法和其他形式的免疫療法組成之群的至少一種治療。 110.    如項目98至109中任一項之方法，其中個體是人類。 111.    一種在樣品中用於定性或定量偵測PD-1的套組，其中套組包含如項目1至69中任一項之抗體，或如項目71或72之接合物，或如項目73或74之多聚體。 112.    一種如項目1至69中任一項之抗體或如項目71或72之接合物或如項目73或74之多聚體或如項目111之套組在確定於樣品中表現之PD-1的存在或數量的方法中的用途，該方法包含以下步驟： (i)使樣品與抗體或接合物或多聚體接觸，以及 (ii)偵測抗體或接合物或多聚體與PD-1之間複合物的形成及/或測定複合物數量。 實例
本文所用的技術和方法描述於本文中，或以本身已知的方式以及如例如Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ndEdition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.中所述進行。除非特別說明，否則所有方法(包括套組和試劑的使用)均根據製造商的資訊進行。 實例 1 ： IgG1-PD1 的生成和篩選材料PD-1和FcγR構建體
生成編碼各種全長PD-1變體的質體：人類(智人；UniProtKB ID：Q15116)、食蟹猴(食蟹獼猴(Macaca fascicularis)；UniProtKB ID：B0LAJ3)、狗(家犬(Canis familiaris)；UniProtKB ID：E2RPS2)、兔(家兔(Oryctolagus cuniculus)；UniProtKB ID：G1SUF0)、豬(豬(Sus scrofa)；UniProtKB ID：A0A287A1C3)、大鼠(褐鼠(Rattus norvegicus)；UniProtKB ID：D3ZIN8)和小鼠(小鼠(Mus musculus)；UniProtKB ID：Q02242)；以及編碼人類FcγRIa的質體(UniProt KB ID：P12314)。 瞬時表現全長PD-1或FcγR變體的CHO-S細胞株的生成
根據製造商的說明，使用FreeStyle™ MAX Reagent (ThermoFisher Scientific，目錄號16447100)和OptiPRO™無血清培養基(ThermoFisher Scientific，目錄號12309019)，用PD-1或FcγR質體轉染CHO-S細胞(適應於懸浮生長的一個CHO細胞亞殖株；ThermoFisher Scientific，目錄號R800-07)。 抗體變體的生產 IgG1-PD1
用重組人類經His標籤PD-1蛋白(R&D Systems，目錄號8986-PD)對三隻紐西蘭白兔進行免疫。對血液中的單個B細胞進行分選，並藉由人類PD-1酶聯免疫吸附分析(ELISA)、細胞人類PD-1結合分析以及藉由人類PD-1/PD-L1阻斷生物分析來篩選生產PD-1特異性抗體的上清液。從篩選陽性的B細胞萃取RNA並進行定序。重鏈和輕鏈的可變區是經基因合成並選殖含有突變L234A和L235A (LALA)的人類免疫球蛋白恆定部分(IgG1/κ)的N端，其中胺基酸位置編號是根據Eu編號(SEQ ID NO：7)以盡量減少與Fcγ受體交互作用。
使用不含293的轉染試劑(Novagen/Merck)，藉由Tecan Freedom Evo裝置對HEK293-FreeStyle細胞執行瞬時轉染。在帶有培養盤自動進樣器在Dionex Ultimate 3000 HPLC上，使用蛋白A親和力層析從細胞上清液中純化所生產的嵌合抗體。經純化的抗體用於進一步分析，特別是藉由人類PD-1 ELISA、細胞人類PD-1結合分析、人類PD-1/PD-L1阻斷生物分析和T細胞增生分析進行再測試。嵌合兔抗體MAB-19-0202 (SEQ ID NO：18和19)被鑑定為表現最佳的殖株，隨後被人源化。
嵌合PD-1抗體MAB-19-0202的可變區序列如下表中所示。表4顯示重鏈的可變區，而表5顯示輕鏈的可變區。在這兩種情況下，都根據Kabat編號定義了框架區(FR)以及互補決定區(CDR)。劃底線的胺基酸表示根據IMGT編號的CDR。粗體字表示Kabat和IMGT編號的交集。 表4： 表5：
使用不含293的轉染試劑(Novagen/Merck)，藉由Tecan Freedom Evo裝置對HEK293-FreeStyle細胞執行瞬時轉染。在帶有培養盤自動進樣器的Dionex Ultimate 3000 HPLC上，使用蛋白A親和力層析從細胞上清液中純化所生產的嵌合抗體。經純化的抗體用於進一步分析，特別是藉由人類PD-1 ELISA、細胞人類PD-1結合分析、人類PD-1/PD-L1阻斷生物分析和T細胞增生分析進行再測試。嵌合兔抗體MAB-19-0202 (SEQ ID NO：18和19)被鑑定為表現最佳的殖株，隨後被人源化。
透過結構建模輔助的CDR移植、基因合成與選殖的人類免疫球蛋白恆定部分(帶有LALA突變的IgG1/κ)的N端，生成人源化重鏈和輕鏈可變區抗體序列。人源化抗體用於進一步分析，特別是藉由人類PD-1 ELISA、細胞人類PD-1結合分析、人類PD-1/PD-L1阻斷生物分析和T細胞增生分析進行再測試。人源化抗體MAB-19-0618 (SEQ ID NO：20和21)被鑑定為表現最佳的殖株。
對重組人源化序列ID分派的人源化輕鏈和重鏈對抗體列於表6中。人源化輕鏈和重鏈的可變區序列顯示於表7和表8中。表7顯示重鏈的可變區序列，而表8顯示輕鏈的可變區。在這兩種情況下，都根據Kabat編號定義了框架區(FR)以及互補決定區(CDR)。劃底線的胺基酸表示根據IMGT編號的CDR。 表6： 表7： 表8：
MAB-19-0618的重鏈和輕鏈可變區序列是經基因合成的，並藉由非接合依賴性選殖(LIC)被選殖到帶有編碼人類IgG1m(f)重鏈恆定結構域和人類卡帕輕鏈恆定結構域(SEQ ID NO：6)的密碼子優化序列的表現載體中，該重鏈恆定結構域含有Fc靜默突變L234F、L235E和G236R (FER)，其中胺基酸位置編號是根據Eu編號(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：55)。所得抗體被命名為IgG1-PD1。
GS Xceed ®Expression System (Lonza)被用來生成表現IgG1-PD1的穩定細胞株。依據Lonza Biologics plc.，將編碼IgG1-PD1之重鏈和輕鏈的序列分別選殖到表現質體pXC-18.4和pXC-Kappa (含有麩醯胺酸合成酶[GS]基因)中。接下來，藉由將重鏈載體的完整表現匣接合到輕鏈載體中來構建編碼IgG1-PD1的重鏈和輕鏈的雙基因載體(DGV)。這個DGV的DNA用限制酶PvuI-HF (New England Biolabs, R3150L)線性化，並用於穩定轉染CHOK1SV ®GS-KO ®細胞。純化IgG1-PD1用於功能特徵鑑定。 IgG1-CD52-E430G
在C1q結合和FcγR信號傳導實驗中，在Fc結構域(SEQ ID NO：4)中帶有E430G六聚化增強突變(WO2013/004842 A2)和與CAMPATH-1H (CD52特異性抗體)相同的抗原結合結構域的人類IgGl抗體被用作為陽性對照(Crowe et al., 1992 Clin Exp Immunol. 87(1):105-110) (SEQ ID NO.25和29)。 對照抗體
帶有與b12 (一種HIV1 gp120特異性抗體)相同的抗原結合結構域的人類IgG1抗體在多個實驗中備用作為陰性對照(Barbas et al., J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-2)。b12的V H和V L結構域(SEQ ID NO.32和36)是藉由從頭基因合成製備(GeneArt Gene Synthesis; ThermoFisher Scientific, Germany)，並被選殖到含有人類IgG1m(f)異型(SEQ ID NO：1)的人類IgG1重鏈恆定區(即CH1、鉸鏈，CH2和CH3區)，或其變體(於Fc結構域中含有L234F/L235E/G236R突變，以及在本研究中功能不相關的額外K409R突變，縮寫為FERR突變) (SEQ ID NO：3)，或含有人類IgG4重鏈恆定區(SEQ ID NO：5)；或人類卡帕輕鏈(LC)的恆定區(SEQ ID NO：6)的表現載體中，視所選結合結構域而定。藉由在生產細胞株中轉染重鏈和輕鏈表現載體獲得抗體，並進行純化供進行功能特徵鑑定。 實例 2 ： IgG1-PD1 與不同物種的 PD-1 的 結合
使用瞬時表現不同動物物種的PD-1的CHO-S 細胞，藉由流式細胞測量術評估IgG1-PD1對常用於非臨床毒理學研究的物種的PD-1的結合。
CHO-S細胞(5×10 4個細胞/孔)接種於圓底96孔盤中。在Genmab (GMB)螢光活化細胞分選(FACS)緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽水[PBS；Lonza，目錄號BE17-517Q，在蒸餾水中稀釋至1 × PBS]，補充有0.1% [w/v]牛血清白蛋白[BSA；Roche，目錄號10735086001]和0.02% [w/v]疊氮化鈉[NaN 3；bioWORLD，目錄號41920044-3])中製備IgG1-PD1、IgG1-ctrl-FERR和派姆單抗的抗體稀釋液(1.7 × 10 -4- 30 μ g/mL或5.6 × 10 -5- 10 μg/mL，3倍稀釋)。僅在最高測試濃度(30 µg/mL或10 µg/mL)下納入派姆單抗的IgG4同型對照(BioLegend，目錄號403702)。離心細胞，去除上清液，並將細胞在50 μL抗體稀釋液中於4℃下培育30分鐘。用GMB FACS緩衝液洗滌細胞兩次，並與50 μL二級抗體結合R-藻紅蛋白(PE)-的山羊抗人類IgG F(ab') 2(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-116-098；在GMB FACS緩衝液中1：500稀釋)在4℃下避光一起培育30分鐘。細胞用GMB FACS緩衝液洗滌兩次，重新懸浮於補充有2 mM乙二胺四乙酸(EDTA；Sigma-Aldrich，目錄號03690)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)成活力標記(1：5,000；BD Pharmingen，目錄號564907)的GMB FACS緩衝液中。使用FlowJo軟體在Intellicyt ®iQue PLUS Screener (Intellicyt Corporation)上藉由流式細胞測量術分析與活細胞結合的抗體(透過DAPI排除法鑑定)。在GraphPad Prism中使用非線性回歸分析(四參數劑量反應曲線擬合)對結合曲線進行分析。
使用經瞬時轉染以在細胞表面表現人類、食蟹猴、狗、兔、豬、大鼠或小鼠PD-1蛋白的CHO-S細胞，藉由流式細胞測量術評估IgG1-PD1與不同物種的PD-1的結合。就人類和食蟹猴PD-1觀察到IgG1-PD1的劑量依賴性結合(圖1A-B)。派姆單抗證實有不相上下的結合。觀察到IgG1-PD1與囓齒動物PD-1 (小鼠、大鼠；圖1C-D)的交叉反應性顯著降低(僅在最高濃度下)，並且未觀察到結合至毒理學研究中常用的其他物種的PD-1 (兔子、狗、豬；圖1E)。沒有觀察到IgG1-PD1結合至未經轉染的對照細胞(圖1E)，也沒有觀察到IgG1-ctrl-FERR (納入作為陰性對照)結合至任何測試物種的PD-1 (圖1)。
總之，IgG1-PD1對膜表現的人類和食蟹猴PD-1證明有不相上下的結合，而對小鼠、大鼠、兔、狗和豬PD-1的結合顯著降低或沒有結合。 實例 3 ：藉由表面電漿共振測定與人類和食蟹猴 PD-1 的結合
使用Biacore 8K SPR系統，藉由表面電漿共振(SPR)分析固定化IgG1-PD1、派姆單抗和納武單抗對人類和食蟹猴PD-1的結合。帶有C端His標籤的重組人類和食蟹猴PD-1細胞外結構域(ECD)是得自Sino Biological (目錄號分別為HPLC 10377-H08H和90311-C08H)。
根據製造商的說明，使用胺偶聯和Human Antibody Capture Kit, Type 2 (Cytiva，目錄號BR100050和BR100839)，將Biacore Series S Sensor Chips CM5 (Cytiva，目錄號29149603)共價塗覆抗Fc抗體。
隨後，在HBS-EP+緩衝液(Cytiva，目錄號BR100669；在蒸餾水中稀釋至1 × [B Braun，目錄號00182479E])中稀釋的IgG1-PD1 (2 nM)、納武單抗(Bristol-Myers Squibb，批號ABP6534；1.25 nM)和派姆單抗(Merck Sharp & Dohme，批號T019263；1.25 nM)在25℃下捕獲到表面，流速為10 µL/min而接觸時間為60秒。這導致捕獲量為約50個共振單位(RU)。
在HBS-EP+緩衝液的三個啟動循環後，注射人類或食蟹猴PD-1 ECD樣品(0.19 - 200 nM；在HBS-EP+緩衝液中2倍稀釋；12個循環)以生成結合曲線。在經抗體塗覆的表面(活性表面)上分析的每個樣品也在沒有抗體的平行流動槽(參考表面)上進行分析，其用於背景校正。
在每個循環結束時，使用10 mM 甘胺酸-HCl pH 1.5 (Cytiva，目錄號BR100354)對表面進行再生。使用Biacore Insight Evaluation軟體(Cytiva)中預定義的「使用捕獲的多個循環動力學」評估方法對數據進行分析。分析中省略了人類或食蟹猴PD-1濃度最高(200 nM)的樣品，以便曲線更為充分地擬合數據。
固定化IgG1-PD1以1.45 ± 0.05 nM的結合親和力( K D)結合至人類PD-1 ECD (表 9)。納武單抗和派姆單抗以與IgG1-PD1的 K D不相上下的結合親和力結合人類PD-1 ECD，即 K D值在低奈莫耳範圍內(分別為4.43 ± 0.08 nM和3.59 ± 0.10 nM) (表9)。
固定化IgG1-PD1以2.74 ± 0.58 nM的 K D結合至食蟹猴PD-1 ECD (表10)，與IgG1-PD1對人類PD-1的親和力相當。納武單抗和派姆單抗以與IgG1-PD1對蟹猴PD-1 ECD的 K D相當，以及與納武單抗和派姆單抗對人類PD-1 ECD的 K D相當的結合親和力結合食蟹猴PD-1 ECD，即 K D值在低奈莫耳範圍內(分別為2.93 ± 0.58 nM和0.90 ± 0.06 nM) (表10)。 表9. 以藉由表面電漿共振測定，PD-1抗體對人類PD-1細胞外結構域的結合親和力。 IgG1-PD1、納武單抗和派姆單抗對人類PD-1之ECD的締合速率常數 k a(1/Ms)，解離速率常數 k d(1/s)和平衡解離常數 K D(M)是藉由SPR測定。 a三次獨立實驗的平均值和SD。 b兩次獨立實驗的平均值和SD。 縮寫： K D＝平衡解離常數； k a＝締合速率常數； k d＝解離速率常數或解離速率；SD＝標準差。 表10：以藉由表面電漿共振測定，PD-1抗體對食蟹猴PD-1細胞外結構域的結合親和力。 IgG1-PD1、納武單抗和派姆單抗對食蟹猴PD-1之ECD的締合速率常數 k a(1/Ms)，解離速率常數 k d(1/s)和平衡解離常數 K D(M)是藉由SPR測定。 a三次獨立實驗的平均值和SD。 b兩次獨立實驗的平均值和SD。 縮寫： K D＝平衡解離常數； k a＝締合速率常數； k d＝解離速率常數或解離速率；SD＝標準差。 實例 4 ： IgG1-PD1 對 PD-1 配體結合和 PD-1/PD-L1 信號傳導的影響
為了確認IgG1-PD1作為典型免疫檢查點抑制劑所發揮的作用，在活體外評估IgG1-PD1破壞PD-1配體結合和PD-1檢查點功能的能力。
藉由流式細胞測量術評估IgG1-PD1與重組人類PD-L1和PD-L2對膜表現的人類PD-1的競爭性結合。將經人類PD-1瞬時轉染的CHO-S細胞(參見實例1；5×10 4個細胞/孔)添加至圓底96孔盤(Greiner，目錄號650180)的孔中，沉澱並置於冰上。將稀釋於PBS (Cytiva，目錄號SH3A3830.03)中的生物素化重組人類PD-L1 (R&D Systems，目錄號AVI156)或PD-L2 (R&D Systems，目錄號AVI1224)添加到細胞(最終濃度：1 μg/mL)，然後立即添加稀釋於PBS中的某個濃度範圍的IgG1-PD1、派姆單抗(MSD，批號T019263和T036998)或IgG1-ctrl-FERR (最終濃度：30 μg/mL - 0.5 ng/mL，三倍稀釋步驟)。接著將細胞在RT下培育45分鐘。用PBS洗滌細胞兩次，並與50 μL鏈球親生物素蛋白-別藻藍蛋白(R&D Systems，目錄號F0050；在PBS中1：20稀釋)在4℃避光下培育30分鐘。將細胞用PBS洗滌兩次並重新懸浮於20 μL GMB FACS緩衝液中。使用FlowJo軟體在Intellicyt ®iQue Screener PLUS (Sartorius)上藉由流式細胞測量術分析鏈球親生物素蛋白-別藻藍蛋白結合。
IgG1-PD1對PD-1和PD-L1功能交互作用的影響是使用基於生物發光細胞的PD-1/PD-L1阻斷報導分析(Promega，目錄號J1255)進行測定，基本上如製造商所述。簡言之，將PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞和PD-1 Effector Cells的共培養物與經連續稀釋的IgG1-PD1、派姆單抗(MSD，批號10749880或T019263)、納武單抗(Bristol-Myers Squibb，批號11024601)或IgG1-ctrl-FERR (最終分析濃度：以3倍稀釋的15 - 0.0008 μg/mL或以5倍稀釋的10 - 0.0032 μg/mL)在37℃、5% CO 2下培育6小時。然後將細胞與還原的Bio-Glo™一起在RT下培育5 - 30分鐘，接著使用Infinite ®F200 PRO Reader (Tecan)或EnVision Multilabel Plate Reader (PerkinElmer)測量發光(以相對光單位[RLU]表示)。
使用GraphPad Prism軟體，藉由非線性回歸分析(四參數劑量反應曲線擬合)對劑量反應曲線進行分析，最大(抑制性)效用為50%時(EC 50/IC 50)觀察到的濃度是從擬合曲線推導來的。IgG1-PD1以劑量依賴性方式破壞人類PD-L1和PD-L2結合至膜表現的人類PD-1 (圖2)，PD-L1結合抑制為的IC 50值為2.059 ± 0.653 μg/mL (13.9  ± 4.4 nM)，而PD-L2結合抑制為1.659 ± 0.721 μg/mL (11.2±4.9nM)，即在奈莫耳範圍內(表11)。派姆單抗顯示出以不相上下的效力抑制PD-L1和PD-L2結合，即IC 50值在奈莫耳範圍內。
使用基於細胞的生物發光PD-1/PD-L1阻斷報導分析來測試PD-1/PD-L1軸的功能阻斷。在IgG1-PD1、派姆單抗或納武單抗連續濃度稀釋液不存在和存在的情況下，將表現人類PD-1並帶有NFAT-RE驅動的螢光素酶的報導Jurkat T細胞與表現人類PD-L1和抗原非依賴性TCR活化因子的PD-L1 aAPC/CHOK1細胞的共培養物進行培育。IgG1-ctrl-FERR被納入作為陰性對照。阻斷PD-1/PD-L1交互作用會導致PD1/PDL1媒介的抑制信號釋放，從而使得TCR活化和NFAT-RE媒介的螢光素酶表現(測得發光)。IgG1-PD1在PD-1 +報導T細胞中誘導TCR信號傳導的劑量依賴性增加(圖3)。EC 50為0.165 ± 0.056 µg/mL (1.12 ± 0.38 nM；表12)。派姆單抗同樣減輕PD-1媒介的TCR信號傳導抑制，EC 50為0.129 ± 0.051 µg/mL (0.86 ± 0.34 nM)，即具有不相上下的效力。納武單抗減輕了TCR信號傳導抑制，EC 50為0.479 ± 0.198 µg/mL (3.28 ± 1.36 nM)，即效力稍低。
總之，透過阻斷PD-1配體結合並破壞PD-1免疫檢查點功能，IgG1-PD1在活體外充當典型免疫檢查點抑制劑。 表11. IgG1-PD1媒介的PD-1配體結合抑制的IC 50值 從競爭結合曲線計算出IC 50值。 縮寫：IC 50=觀察到50%抑制作用時的濃度；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；PD-L1=程式化細胞死亡1配體1；PD-L2=程式化細胞死亡1配體2；SD=標準差。 表12：PD-/PD-L1檢查點阻斷的EC 50在PD-1/PD-L1阻斷報導分析中，將PD-1 +報導T細胞和PD-L1 aAPC/CHO-K細胞的共培養物與連續濃度的IgG1-PD1、派姆單抗或納武單抗一起培育。藉由測量發光來確定PD-1/PD-L1檢查點功能的抑制，其在報導T細胞中導致下游TCR信號傳導和螢光素酶表現。從所得的劑量-反應曲線計算出EC 50值。 縮寫：aAPC=人工抗原呈遞細胞；CHO=中國倉鼠卵巢；縮寫：IC 50=觀察到50%最大作用時的濃度；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；PD-L1=程式化細胞死亡1配體1；SD=標準差；TCR=T細胞受體。 實例 5 ： 測定 IgG1-PD1 增強經活化 T 細胞增生的能力的抗原特異性增生分析
為了測定IgG1-PD1增強T細胞增生的能力，使用過度表現PD-1的人類CD8 +T細胞進行抗原特異性增生分析。
HLA-A*02 +周邊血液單核細胞(PBMC)是獲自健康捐贈者(Transfusionszentrale, University Hospital, Mainz, Germany)。根據製造商的說明，使用抗CD14 MicroBeads (Miltenyi；目錄號130-050-201)藉由磁活化細胞分選(MACS)技術從PBMC中分離出單核細胞。將周邊血液淋巴細胞(PBL、CD14陰性部分)冷凍保存供用於T細胞分離。為了分化成未成熟DC (iDC)，將1 × 10 6個單核細胞/mL培養在含有5%混合人類血清(One Lambda Inc.，目錄號A25761)、1 mM丙酮酸鈉(Life Technologies GmbH，目錄號11360-039)、1x非必需胺基酸(Life Technologies GmbH，目錄號11140-035)、100 IU/mL青黴素-鏈黴素(Life Technologies GmbH，目錄號15140-122)、100 ng/mL顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF；Miltenyi，目錄號130-093-868)和50 ng/mL白介素4 (IL-4；Miltenyi，目錄號130-093-924)的RPMI 1640 (Life Technologies GmbH，目錄號61870-010)中歷時五天。這五天期間，將一半培養基替換為新鮮培養基。透過收集非貼壁細胞來收取iDC，並藉由與含有2 mM EDTA的Dulbecco氏磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)在37℃下培育10分鐘使貼壁細胞脫離。用DPBS洗滌後，將iDC冷凍保存在含有10% DMSO (AppliChem GmbH，目錄號A3672,0050)和10%人類白蛋白(CSL Behring，PZN 00504775)的RPMI 1640中，以供將來用於抗原特異性T細胞分析。
在抗原特異性CD8 +T細胞增生分析開始前一天，將來自同一位捐贈者的冷凍PBL和iDC解凍。根據製造商的說明，使用抗CD8 MicroBeads (Miltenyi，目錄號130-045-201)藉由MACS技術從PBL中分離出CD8 +T細胞。約10 × 10 6至15 × 10 6個CD8 +T細胞以各10 µg在250 µL X-Vivo15 培養基(Lonza，目錄號BE02-060Q)中的活體外轉譯(IVT)-RNA (編碼對人類密連蛋白-6 (CLDN6；HLA-A*02限制型；描述於WO 2015150327 A1)具特異性鼠類TCR之α鏈與β鏈)加上10 µg IVT-RNA (編碼PD-1 (UniProt Q15116))進行電穿孔。將細胞轉移至4 mm電穿孔比色管(VWR International GmbH，目錄號732-0023)，並使用BTX ECM ®830 Electroporation System (BTX；500 V，1x3 ms脈衝)進行電穿孔。電穿孔後，立即將細胞轉移至含有5%混合人類血清的新鮮IMDM GlutaMAX培養基(Life Technologies GmbH，目錄號319800-030)中，並在37℃、5% CO 2下靜置至少1小時。根據製造商的說明，使用PBS中的1.6 µM羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE；Life Technologies GmbH，目錄號V12883)標記T細胞，並在補充有5%人類AB血清的IMDM培養基中培育過夜。
使用如上所述的電穿孔系統(300 V，1x12 ms脈衝)，在250 µL X-Vivo15培養基中，用編碼全長人類CLDN6 (WO 2015150327 A1)的2 µg IVT-RNA電穿孔至多5 × 10 6個解凍的iDC，並在補充有5%混合人類血清的IMDM培養基中培育過夜。
次日，收取細胞。藉由流式細胞測量術證實CLDN6在iDC上的細胞表面表現，以及CLDN6特異性TCR和PD-1在T細胞上的細胞表面表現。為此，使用結合DyLight650的CLDN6特異性抗體(非市售；內部生產)對iDC進行染色。T細胞用結合亮紫(BV)421的抗小鼠TCR-β鏈抗體(Becton Dickinson GmbH，目錄號562839)和結合別藻藍蛋白(APC)的抗人類PD-1抗體(Thermo Fisher Scientific，目錄號17-2799-42)染色。
在IgG1-PD1、派姆單抗(Keytruda ®, MSD Sharp & Dohme GmbH, PZN 10749897)或納武單抗(Opdivo ®, Bristol- Myers Squibb，PZN 11024601) (以4倍連續稀釋，範圍0.00005至0.8 µg/mL)存在下，於96孔圓底盤中含有5%混合人類血清的IMDM培養基內，將經電穿孔iDC與經電穿孔、CFSE-標記的T細胞以1：10的比例培育。陰性對照抗體IgG1-ctrl-FERR以0.8 µg/mL的單一濃度使用。培養4天後，用結合APC的抗人類CD8抗體對細胞進行染色。使用BD FACSCelesta™流式細胞儀(Becton Dickinson GmbH)藉由流式細胞測量術分析CD8 +T細胞中的CFSE稀釋度來評估T細胞增生。
使用FlowJo軟體第10.7.1版分析流式細胞測量術數據。使用FlowJo中的增生建模工具評估CD8 +T細胞的CFSE標記稀釋度，並使用積分公式計算擴增指數。使用4參數對數擬合在GraphPad Prism第9版(GraphPad Software, Inc.)中生成劑量反應曲線。使用GraphPad Prism第9版藉由Friedman檢定和鄧恩多重比較檢定來確定統計顯著性。
IgG1-PD1以劑量依賴性方式增強CD8 +T細胞的抗原特異性增生(圖4)，EC 50值在皮莫耳範圍內(表13)。用派姆單抗或納武單抗處理也以劑量依賴性方式增強T細胞增生。派姆單抗的平均EC 50與IgG1-PD1相當，而納武單抗的EC 50(P=0.0267)顯著高於IgG1-PD1。 表13：抗原特異性增生分析中的EC 50值。 IgG1-PD1、派姆單抗和納武單抗的EC 50值是使用如藉由抗原特異性T細胞增生分析測量的CD8 +T細胞擴增指數來確定。顯示的數據是根據4參數對數擬合計算得出的值。縮寫：EC 50=半最大有效濃度；FERR=L234F/L235E/G236R-K409R；PD1=程式化細胞死亡蛋白1；SD=標準差。 實例 6 ： IgG1-PD1 在同種異體 MLR 分析中對細胞介素分泌的影響
為了研究IgG1-PD1在混合淋巴細胞反應(MLR)分析中增強細胞介素分泌的能力，在IgG1-PD1存在下，將三對獨特的同種異體人類成熟樹突狀細胞(mDC)和CD8 +T細胞共培養。使用IFNγ特異性免疫分析測量IFNγ的含量，而單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1)、GM-CSF、介白素(IL)-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL12-p40、IL-15、IL-17α和腫瘤壞死因子(TNFα)是使用訂製的Luminex多重免疫分析進行測定。
人類CD14 +單核細胞是獲自健康捐贈者(BioIVT)。為了分化為未成熟樹突狀細胞(iDC)，將單核細胞於37℃下培養在補充有10%熱不活化胎牛血清(FBS；Gibco，目錄號16140071)、100 ng/mL GM-CSF和300 ng/mL IL-4 (BioLegend，目錄號766206)的RPMI-1640完全培養基(ATCC改良配方；Thermo Fisher，目錄號A1049101)中歷時6天。第4天，用含有補充劑的新鮮培養基替換培養基。為了使iDC成熟，將細胞於37℃下培育在補充有10% FBS、100 ng/mL GM-CSF、300 ng/mL IL-4和5 µg/mL脂多醣(LPS；Thermo Fisher Scientific，目錄號00 4976 93)的RPMI-1640完全培養基中歷時24小時，然後開始MLR分析。同時，將從同種異體健康捐贈者(BioIVT)獲得的經純化CD8 +T細胞解凍並於37℃、O/N下培育在補充有10% FBS和10 ng/mL IL-2 (BioLegend，目錄號589106)的RPMI-1640完全培養基中。
次日，收取經LPS催熟的樹突狀細胞(mDC)和同種異體CD8 +T細胞，並分別以4 × 10 5個細胞/mL和4 × 10 6個細胞/mL重新懸於於預熱的AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific，目錄號12055091)中。在某個抗體濃度範圍(0.001 - 30 μg/mL)的IgG1-PD1、IgG1-ctrl-FERR或派姆單抗(MSD，目錄號T019263)存在下或在30 μg/mL IgG4同型對照(BioLegend，目錄號403702)存在下，於96孔圓底盤的AIM-V培養基中於37℃下將mDC (20,000個細胞/孔)與同種異體幼稚CD8 +T細胞(200,000個細胞/孔)一起培育。
5天後，將無細胞上清液從每個孔轉移到新的96孔盤中並儲存在-80℃下直至進一步分析細胞介素濃度。
根據製造商的說明，使用IFNγ特異性免疫分析(Alpha Lisa IFNγ套組；Perkin Elmer，目錄號AL217)在Envision儀器上測定IFNγ含量。
MCP-1、GM-CSF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL12-p40、IL-15、IL-17α和TNFα的含量是基於人類TH17 Magnetic Bead Panel (MILLIPLEX®)使用訂製的Luminex®多重免疫分析(Millipore，訂單號SPR1526)進行測定。簡言之，將無細胞上清液解凍，並將10 μL各個樣品添加到384孔盤(Greiner Bio-One，目錄號781096)的孔內的10 μL Assay Buffer，並用1× Wash Buffer預洗滌。同時，將10 μL Assay Buffer中的標準品或對照添加到孔中，然後添加10 μL分析培養基。將針對不同細胞介素的磁珠混合並在Bead Diluent中稀釋至1×濃度，接著將10 μL混合珠粒添加到每孔中。將盤密封並在4℃下培育，搖動，O/N。用60 μL 1× Wash Buffer洗滌孔3次。隨後，向每孔中添加10 μL訂製Detection Antibody，密封盤並在RT下搖動培育1小時。接下來，將10 μL鏈球親生物素蛋白-PE添加到各孔中，將盤密封並在RT下搖動培育30分鐘。如上所述，用60 μL 1× Wash Buffer洗滌孔3次，之後藉由在RT下搖動5分鐘將珠粒重新懸浮於75 μL Luminex Sheath Fluid中。在Luminex FlexMap 3D系統上運行樣品。
在MLR分析開始和結束時，使用結合PE-Cy7的抗PD-1 (BioLegend，目錄號329918；1：20)、結合別藻藍蛋白的抗PD-L1 (BioLegend，目錄號329708；1：80)、結合BUV496合的抗CD3 (BD Biosciences，目錄號612940；1：20)與結合BUV395的抗CD8 (BD Biosciences，目錄號563795；1：20)藉由流式細胞測量術確認在CD8 +T細胞上的PD-1表現和mDC上的PD-L1表現。
IgG1-PD1以劑量依賴性方式持續增強IFNγ的分泌(圖5)。IgG1-PD1還增強MCP-1、GM-CSF、IL-2、IL-6、IL-12p40、IL-17α、IL-10和TNFα的分泌(圖6)。派姆單抗對細胞介素分泌有不相上下的影響。 實例 7 ： C1q 與 IgG1-PD1 結合的評估
使用經活化人類CD8 +T細胞評估補體蛋白C1q與恆定重鏈區中帶有FER Fc靜默突變的IgG1-PD1的結合。作為陽性對照，納入IgG1-CD52-E430G，它具有基於CD52抗體CAMPATH-1H的V H和V L結構域，並且具有Fc增強骨架，已知結合至細胞表面時可有效結合C1q。作為非結合陰性對照抗體，納入IgG1-ctrl-FERR和IgG1-ctrl。
藉由負向篩選使用RosetteSep ™Human CD8 +T Cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies，目錄號15023C.2)或藉由正向篩選經由磁活化細胞分選(MACS)，使用CD8 MicroBeads (Miltenyi Biotec，目錄號130-045-201)和LS管柱(Miltenyi Biotec，目錄號130-042-401)，完全按照製造商的說明從健康志願者(Sanquin)獲得的膚色血球層中純化(富集)人類CD8 +T細胞。將經純化的T細胞重新懸浮於T細胞培養基(Roswell Park Memorial Institute [RPMI]-1640培養基，具有25 mM HEPES和L-麩醯胺酸[Lonza，目錄號BE12-115F]，補充有10%熱不活化的捐贈者含鐵牛血清[DBSI；Gibco，目錄號20731-030]和青黴素/鏈黴素[pen/strep；Lonza，目錄號DE17-603E])中。
抗CD3/CD28珠粒(Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28；ThermoFisher Scientific，目錄號11132D)用PBS洗滌並重新懸浮於T細胞培養基中。將珠粒以1：1的比例添加到經富集的人類CD8 +T細胞中，並在37℃、5% CO 2下培育48小時。接下來，使用磁鐵去除珠粒，將細胞在PBS中洗滌兩次並再次計數。
使用IgG1-PD1 (30 μg/mL)和結合R-藻紅蛋白(PE)的山羊抗人類IgG F(ab') 2(1：200稀釋於GMB FACS緩衝液中；Jackson Nutrition，目錄號109-116-098)，或商用結合PE的PD-1抗體(BioLegend，目錄號329906；稀釋1：50)，藉由流式細胞測量術確認經活化CD8 +T細胞上的PD-1表現。
將經活化的CD8 +T細胞接種到圓底96孔盤(30,000或50,000個細胞/孔)中，沉澱並重新懸浮於30 μL分析培養基(具有25 mM HEPES和L-麩醯胺酸的RPMI-1640，補充有0.1% [w/v]牛血清白蛋白組分V [BSA；Roche，目錄號10735086001]和青黴素/鏈黴素)。隨後，向各孔加入50 μL IgG1-PD1、IgG1-ctrl-FERR、IgG1-CD52-E430G或IgG1-ctrl (最終濃度為1.7 × 10 -4- 30 μg/mL，在分析培養基中進行3倍稀釋步驟)並在37℃下培育15分鐘以使抗體結合至細胞。
人類血清(20 μL/孔；Sanquin，批號20L15-02) (作為C1q來源)被添加至20%的最終濃度。將細胞在冰上培育45分鐘，然後用冷GMB FACS緩衝液洗滌兩次，並在結合別藻藍蛋白的小鼠抗CD8 (BD Biosciences，目錄號555369；1：50稀釋於GMB FACS緩衝液中)存在或不存在下，與50 μL結合異硫氰酸螢光素(FITC)的兔抗人類C1q (最終濃度為20 μg/mL [DAKO，目錄號F0254]；1：75稀釋在GMB FACS緩衝液中)在暗處、4℃下培育30分鐘。用冷GMB FACS緩衝液洗滌細胞兩次，重新懸浮於補充有2 mM乙二胺四乙酸(EDTA；Sigma-Aldrich，目錄號03690)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)成活力染料(1：5,000；BD Pharmingen，目錄號564907)的20 μL GMB FAS緩衝液中。C1q與活細胞的結合(藉由DAPI排除法鑑定)是透過流式細胞測量術在IntelliCyt ®iQue Screener PLUS (Sartorius)或iQue3 (Sartorius)上進行分析。使用GraphPad Prism軟體利用非線性回歸分析(具有可變斜率的S形劑量反應)來分析結合曲線。
儘管觀察到C1q對膜結合IgG1-CD52-E430G有劑量依賴性結合，但未觀察到C1q結合至膜結合IgG1-PD1或結合至非結合對照抗體(圖7)。
這些結果指出，IgG1-PD1的功能惰性骨架不結合C1q。 實例 8 ：以藉由 SPR 測定， IgG1-PD1 與 Fc γ 受體的結合
在活體外藉由SPR評估IgG1-PD1與固定化FcγR (FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa)的結合。納入FcγRIIa (H131和R131)與FcγRIIIa (V158和F158)的兩種多形性變體。作為FcγR結合的陽性對照，納入帶有野生型Fc區的IgG1-ctrl。
在第一個實驗中，使用Biacore 8K SPR系統分析IgG1-PD1或IgG1-ctrl與固定化人類重組FcγR變體(FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa)的結合。在第二組實驗中，使用相同的方法，分析IgG1-PD1、納武單抗(Bristol-Meyers Squibb，批號ABP6534)、派姆單抗(Merck Sharp & Dohme，批號U013442)、多塔利單抗(GlaxoSmithKline，批號1822049)、西米普利單抗(Regeneron，批號1F006A)、IgG1-ctrl或IgG4-ctrl的結合。
根據製造商的說明，使用胺偶聯和His捕獲套組(Cytiva，目錄號BR100050和目錄號29234602)，以抗組胺酸(His)抗體共價塗覆Biacore Series S Sensor Chips CM5 (Cytiva，目錄號29104988)。稀釋於HBS-EP+ (Cytiva，目錄號BR100669)中的FcγRIa、FcγRIIa (H131和R131)、FcγRIIb與FcγRIIIa (V158和F158) (SinoBiological，目錄號分別為10256-H08S-B、10374-H08H1、10374-H27H、10259-H27H、10389-H27H1和10389-H27H)分別以10 µL/min的流速和60秒的接觸時間(產生約350-600個共振單位(RU)的捕獲量)被捕獲到經抗His塗覆的感測晶片表面上。
在HBS-EP+緩衝液的三個啟動循環後，使用表14中所示的抗體範圍，注射測試抗體(IgG1-PD1、納武單抗、派姆單抗、多塔利單抗、西米普利單抗、IgG1-ctrl或IgG4-ctrl)以生成結合曲線。在捕獲有FcγR的表面(活性表面)上分析的每個樣品也同時在沒有捕獲FcγR的平行流動槽(參考表面) (用為背景校正)上進行分析。從其他傳感圖中扣除含有HBS-EP+作為(模擬)分析物的第三個啟動循環，以產生雙重參考數據。
在每個循環結束時，使用10 mM甘胺酸-HCl pH 1.5 (Cytiva，目錄號BR100354)使表面進行再生。使用Biacore Insight Evaluation軟體(Cytiva)生成傳感圖，並將四參數邏輯擬合應用於終點測量(結合平台與捕獲後基線)。第一個實驗的數據(n=1；合格的SPR分析)如圖8中所示；第二組實驗的數據(n=3)如圖9中所示。 表14：與個別FcγR結合的測試條件
第一個實驗的結果顯示IgG1-ctrl結合至所有FcγR，而未觀察到IgG1-PD1結合至FcγRIa、FcγRIIa (H131和R131)、FcγRIIb與FcγRIIIa (V158和F158) (圖8)。
第二組實驗的結果證實IgG1-PD1缺乏FcγR結合(圖9)。IgG4-ctrl和測試的其他抗PD-1抗體(納武單抗、派姆單抗、多塔利單抗和西米普利單抗；全為IgG4亞類)均證實與FcγRIa、FcγRIIa-H131、FcγRIIa-R131和FcγRIIb有明顯結合，且與FcγRIIIa-F158和FcγRIIIa-V158的結合極低至非常低。
這些數據證實FcγR與IgG1-PD1的Fc結構域缺乏結合，並證明FcγR結合至納武單抗、派姆單抗、多塔利單抗和西米普利單抗。綜上所述，這些數據表明，IgG1-PD1的Fc結構域無法誘導FcγR媒介的效應子功能(ADCC、ADCP)。 實例 9 ：以藉由流式細胞測量術測量測定， IgG1-PD1 與細胞表面表現之 Fc γRIa 的結合
使用流式細胞測量術分析IgG1-PD1、納武單抗、派姆單抗、多塔利單抗和西米普利單抗與人類細胞表面表現之FcγRIa的結合。
FcγRIa在經瞬時轉染的CHO-S細胞上表現，並且使用結合FITC的抗FcγRI抗體(BioLegend，目錄號305006；1：25)藉由流式細胞測量術證實細胞表面表現。抗PD-1抗體與經轉染CHO-S細胞的結合如實例2中所述進行評估。簡言之，IgG1-PD1、納武單抗(Bristol-Meyers Squibb，批號ABP6534)、派姆單抗(Merck Sharp & Dohme，批號U013442)、多塔利單抗(GlaxoSmithKline，批號1822049)、西米普利單抗(Regeneron，批號1F006A)、IgG1-ctrl和IgG1-ctrl-FERR的抗體溶液(最終濃度：1.69×10 -4- 10 μg/mL，3倍稀釋)在GMB FACS緩衝液中製備。離心細胞，除去上清液，將細胞(50 µL中的30,000個細胞)與50 µL抗體稀釋液在4℃下培育30分鐘。用GMB FACS緩衝液洗滌細胞兩次，並與50 µL二級抗體(結合PE的山羊抗人類IgG F(ab') 2；1：500)在4℃下避光培育30分鐘。用GMB FACS緩衝液洗滌細胞兩次，並重新懸浮於補充有2 mM EDTA和DAPI成活力標記(1：5,000)的GMB FACS緩衝液中。
藉由流式細胞測量術在Intellicyt iQue PLUS Screener (Intellicyt Corporation)上使用FlowJo軟體，透過對PE陽性、DAPI陰性細胞進行圈選來分析抗體與活細胞的結合。在GraphPad Prism中使用非線性回歸分析(四參數劑量反應曲線擬合)對結合曲線進行分析。
在流式細胞測量術結合分析中，陽性對照抗體IgG1-ctrl (具有野生型Fc區)顯示出結合至瞬時表現FcγRIa的細胞，而陰性對照抗體IgG1-ctrl-FERR (具有Fc區，含有FER惰性突變與一個在本研究中與功能無關的額外K409R突變)未觀察到結合(圖10)。未觀察到IgG1-PD1的結合，但觀察到派姆單抗、納武單抗、西米普利單抗和多塔利單抗的濃度依賴性結合。
這些數據證實FcγRIa與IgG1-PD1的Fc結構域缺乏結合，並證實FcγRIa結合至納武單抗、派姆單抗、多塔利單抗和西米普利單抗。綜上所述，這些數據表明IgG1-PD1的Fc結構域無法誘導FcγRIa媒介的效應子功能。 實例 10 ：藉由 IgG1-PD1 結合至新生兒 Fc 受體
新生兒Fc受體(FcRn)透過保護IgG免於降解，從而負責IgG的長血漿半衰期。IgG在酸性(pH 6.0)胞內體環境中結合至FcRn，但在中性pH (pH 7.4)下與FcRn解離。抗體與FcRn的這種pH依賴性結合導致抗體與FcRn一起回收，防止細胞內抗體降解，因此是彼抗體的活體內藥物動力學指標。在pH 6.0和pH 7.4下藉由表面電漿共振(SPR)在活體外評估IgG1-PD1與固定化FcRn的結合。
使用Biacore 8K SPR系統分析IgG1-PD1與固定化人類FcRn的結合。根據製造商的說明，使用胺偶聯和His捕獲套組(Cytiva，目錄號BR100050和目錄號29234602)，以抗組胺酸(His)抗體共價塗覆Biacore Series S Sensor Chips CM5 (Cytiva，目錄號29104988)。於BS-P+緩衝液pH 7.4 (Cytiva，目錄號28995084)，或在pH調整至6.0的PBS-P+緩衝液(透過添加鹽酸[Sigma-Aldrich，目錄號07102])中稀釋至5 nM塗覆濃度的FcRn (SinoBiological，目錄號CT071-H27H-B)以10 µL/min的流速和60秒的接觸時間被捕獲到經抗His塗覆的感測晶片表面上。這導致捕獲量為約50 RU。在pH 6.0或pH 7.4 PBS-P+緩衝液的三個啟動循環後，注射測試抗體(6.25 - 100 nM兩倍連續稀釋的IgG1-PD1、派姆單抗(MSD，批號T019263)或納武單抗(Bristol-Myers Squibb，批號ABP6534)或PBS-P+ 緩衝液)以生成結合曲線。在捕獲有FcRn的表面(活性表面)上分析的每個樣品也在沒有捕獲FcRn的平行流動槽(參考表面) (用作為背景校正)上進行分析。從其他傳感圖中扣除含有HBS-EP+作為(模擬)分析物的第三個啟動循環，以產生雙重參考數據。在每個循環結束時，使用10 mM甘胺酸-HCl pH 1.5 (Cytiva，目錄號BR100354)使表面進行再生。使用Biacore Insight Evaluation軟體(Cytiva)中預定義的「使用捕獲的多重循環動力學」評估方法對數據進行分析。數據是基於三個不同的技術重複實驗。
在pH 6.0下，IgG1-PD1以50 nM的平均親和力( K D)結合FcRn (表15)，這與帶有野生型Fc區的IgG1-ctrl抗體相當(據報導，野生型IgG1分子在文獻中的親和力範圍寬廣；在之前使用相同分析設定的內部實驗中，於12個數據點測得IgG1-ctrl的平均 K D為34 nM)。派姆單抗和納武單抗的親和力低大約兩倍( K D分別為116 nM和133 nM)。在pH 7.4下未觀察到FcRn結合(未顯示)。綜上所述，這些結果證實，IgG1-PD1 Fc區中的FER惰性突變不會影響FcRn結合，並表明IgG1-PD1將保有典型IgG在活體內的藥物動力學性質。 表15：以藉由SPR測定對RcRn的親和力 藉由SPR分析IgG1-PD1、派姆單抗和納武單抗與塗覆有人類FcRn的感測器晶片的結合。平均親和力和SD是基於三個技術重複的獨立測量。 縮寫： K D=平衡解離常數； k a =締合速率常數； k d =解離速率常數或解離速率；SD=標準差。 實例 11 ： 在目標結合不存在的情況下， IgG1-PD1 的藥物動力學分析
在小鼠中分析IgG1-PD1的藥物動力學性質。PD-1主要在經活化的B細胞和T細胞上表現，因此，其表現預期僅限於缺少成熟B細胞與T細胞的非荷瘤SCID小鼠。此外，IgG1-PD1顯示與瞬時過度表現小鼠PD-1的細胞的交叉反應性明顯降低(實例2)。因此，IgG1-PD1在非荷瘤SCID小鼠中的藥物動力學(PK)性質預期會反映IgG1-PD1在目標結合不存在的情況下的PK性質。
本研究中的小鼠飼養在中央實驗動物設施(Utrecht, the Netherlands)中。所有小鼠均被關在單獨通風的籠子中，並任意採食食物和水。所有實驗均符合從指令(2010/63/EU)翻譯而來的荷蘭動物保護法(WoD)，並得到荷蘭中央動物實驗委員會和當地倫理委員會的批准。SCID小鼠(C.B-17/IcrHan® Hsd-Prkdc scid, Envigo)靜脈內注射1或10 mg/kg IgG1-PD1，每組使用3隻小鼠。在抗體投予後10分鐘、4小時、1天、2天、8天、14天和21天時，從隱靜脈或臉頰靜脈收集血液樣品(40 μL)。將血液收集到含有K 2-乙二胺四乙酸的小瓶中並儲存在-65℃下直至測定抗體濃度。
透過總人類IgG (hIgG)電化學發光免疫分析(ECLIA)，測定了特定hIgG濃度。Meso Scale Discovery (MSD)標準培養盤(96孔MULTI-ARRAY培養盤，目錄號L15XA-3)用稀釋於PBS (Lonza，目錄號BE17-156Q)中的小鼠抗hIgG捕獲抗體(IgG2amm-1015-6A05)在2-8℃下塗覆16-24小時。用PBS-Tween (PBS-T；補充有0.05% (w/v) Tween-20 [Sigma，目錄號P1379]的PBS)洗滌盤以去除未結合的抗體後，將未被佔據的表面在RT下阻斷60±5分鐘(補充有3% (w/v) Blocker-A [MSD，目錄號R93AA-1]的PBS-T)，然後用PBS-T清洗。小鼠血漿樣品一開始在分析緩衝液(補充有1%(w/v)Blocker-A的PBS-T)中稀釋50倍(2%小鼠血漿)。為了創建參考品曲線，將IgG1-PD1 (與注射用材料同一批次)稀釋在Calibrator Diluent (2%小鼠血漿[K 2EDTA，混合血漿，BIIOVT，目錄號MSE00PLK2PNN]於分析緩衝液中)中(測量範圍：0.156 - 20.0 μg/mL；錨定點：0.0781和40.0 μg/mL)。為了容納樣品中存在的預期廣泛抗體濃度，樣品在Sample Diluent (分析緩衝液中的2%小鼠血漿)中另外1：10或1：50稀釋。將經塗覆和阻斷的培養盤與50 μL經稀釋的小鼠樣品、參考曲線和適當的品管樣品(摻有IgG1-PD1的混合小鼠血漿，涵蓋參考品曲線的範圍)在RT下培育90±5分鐘。用PBS-T洗滌後，將培養盤與結合SULFO-TAG的小鼠抗hIgG偵測抗體IgG2amm-1015-4A01在RT下培育90±5分鐘。用PBS-T清洗後，藉由添加Read Buffer (MSD GOLD Read Buffer，目錄號R92TG-2)並使用MSD Sector S600讀盤儀在~620 nm下測量光發射來可觀察固定化抗體。使用SoftMax Pro GxP Software v7.1進行分析數據處理。不允許外推低於運行定量下限(LLOQ)或高於定量上限(ULOQ)。
在目標結合不存在的情況下，IgG1-PD1的血漿清除概況與SCID小鼠中野生型人類IgG1抗體的清除概況相當，這是透過基於人類IgG1清除的兩室模型預測的(Bleeker et al., 2001, Blood. 98(10):3136-42) (圖11)。沒有值得注意的臨床觀察結果，也沒有觀察到體重減輕。
總之，這些數據表明，在目標結合不存在的情況下，IgG1-PD1的PK性質與正常人類IgG抗體不相上下。 實例 12 ： IgG1-PD1 在人類 PD-1 嵌入小鼠中的抗腫瘤活性
IgG1-PD1對瞬時過度表現小鼠PD-1的細胞顯示出僅有限的結合(實例2)。因此，為了評估IgG1-PD1在活體內的抗腫瘤活性，使用被工程改造成在小鼠PD-1基因座中表現人類PD-1細胞外結構域(ECD)的C57BL/6小鼠(hPD-1嵌入[KI]小鼠)。
所有動物實驗均在Crown Bioscience Inc.進行，並在執行前得到其機構動物護理和使用委員會(IACUC)的批准。動物的飼養和處理符合實驗動物護理評估和認證協會(AAALAC)規定的良好動物規範。C57BL/6背景雌性純合人類PD-1嵌入小鼠(hPD-1 KI小鼠；Beijing Biocytogen Co., Ltd; C57BL/6- Pdcd1 tm1(PDCD1) /Bcgen，庫存號110003)，7-9週大，在右下脅皮下(SC)注射同種MC38結腸癌細胞(1×10 6個細胞)。使用卡尺評估腫瘤生長(隨機分組後每週三次)，並根據卡尺測量值計算腫瘤體積(mm 3)：腫瘤體積= 0.5 ×(長度×寬度 2)，其中長度是最長的腫瘤維度，寬度是垂直於長度的最長腫瘤維度。當腫瘤達到約60 mm 3的平均體積時(表示為第0天)，根據腫瘤體積和體重將小鼠隨機分組(每組9隻小鼠)。治療開始時，小鼠靜脈內注射(IV；PBS中的給藥體積10 mL/kg) 0.5、2或10 mg/kg IgG1-PD1或派姆單抗(Crown Bioscience Inc.從Merck獲得，批號T042260)，或10 mg/kg同型對照抗體IgG1-ctrl-FERR。隨後的劑量腹膜內(IP)投予。使用每週兩劑持續三週的給藥方案(2QW×3)。每天監測動物的發病率和死亡率，並常規監測其他臨床觀察結果。當腫瘤體積超過1,500 mm 3或當動物達到其他人道終點時，結束個別小鼠的實驗。
為了比較組別之間的無進展存活期，將曲線擬合應用於個別腫瘤生長圖以確立每隻小鼠的腫瘤體積進展超過500 mm 3當日。這些日值繪製在Kaplan-Meier存活曲線中，並使用SPSS軟體在個別曲線之間進行Mantel-Cox分析。在所有組別仍然完好無損的最後一天(也就是直到研究中第一次與腫瘤相關的死亡，即第11天)，使用非參數曼-惠特尼分析(在GraphPad Prism中)比較組別之間的腫瘤體積差異。P值與中值(每組)一起呈現，包括中值差異的95%置信區間(Hodges Lehmann)。
這些小鼠沒有表現出疾病跡象，但發現兩隻小鼠死亡(一隻在2 mg/kg IgG1-PD1組，一隻在2 mg/kg派姆單抗治療組)。這些死亡的原因尚未確定。
用IgG1-PD1和派姆單抗治療在所有測試劑量下均抑制腫瘤生長(圖12A)。在第11天，即所有治療組完成的最後一天，於所有測試劑量下，用IgG1-PD1或派姆單抗治療的小鼠體內的腫瘤均顯著小於用10 mg/kg IgG1-ctrl-FERR治療的小鼠體內的腫瘤(圖12B)。此外，在10 mg/kg下，用IgG1-PD1治療的小鼠體內的腫瘤體積明顯小於用等劑量派姆單抗治療的小鼠體內的腫瘤體積(曼-惠特尼檢定，p=0.0188)。
與用10 mg/kg IgG1-ctrl-FERR治療的小鼠相比，用IgG1-PD1或派姆單抗治療在所有測試劑量下均明顯增加了無進展存活期(PFS) (圖12C)。與用派姆單抗治療的小鼠相比，在10 mg/kg下，用IgG1-PD1治療的小鼠的無進展存活期顯著延長(中位PFS 10 mg/kg IgG1-PD1：20.56天，中位PFS 10 mg/kg派姆單抗：13.94天；P值=0.0021)。
總之，IgG1-PD1在MC38荷瘤hPD-1 KI小鼠中展現出有效的抗腫瘤活性。 實例 13 ： IgG1-PD1 在人類 PD1 嵌入小鼠中的 PD 活性
IgG1-PD1在MC38荷瘤hPD-1 KI小鼠中顯示出有效的抗腫瘤活性(實例12)。為了探索IgG1-PD1治療的藥效學作用，用IgG1-PD1治療MC38荷瘤hPD-1 KI小鼠，並在預定時間點收集血液、脾臟和腫瘤樣品。使用流式細胞測量術和免疫組織化學(IHC)測定IgG1-PD1治療對免疫細胞的影響。
如實例12中所述建立MC38荷瘤的hPD-1 KI小鼠模型。當腫瘤已達到約60 mm 3的平均體積時(表示為第0天)，基於腫瘤體積將小鼠隨機分組(每組12隻小鼠)。在治療開始時，於第0、3和7天小鼠IV注射(PBS中的給藥體積10 mL/kg) 0.5或10 mg/kg IgG1-PD1、10 mg/kg派姆單抗(Crown Bioscience Inc.從Merck獲得，批號U036695)，或10 mg/kg同型對照抗體IgG1-ctrl-FERR。每天監測動物的發病率和死亡率，並常規監測其他臨床觀察結果。小鼠沒有表現出生病跡象。在第2天、第4天和第8天，對動物實施安樂死，並透過心臟穿刺收集血液(每個時間點每個治療組4隻小鼠)用於周邊血液細胞的免疫表型分析。此外，還收取了脾臟和腫瘤。將腫瘤用福馬林固定並石蠟包埋以進行IHC分析。
根據製造商的說明，使用gentleMACS™ Dissociator (130-096-427, Miltenyi)酶解脾臟。將所得細胞懸浮液通過70 μm細胞濾網(Falcon，目錄號352350)過濾，用5 mL FACS洗滌緩衝液(10% FBS [Gibco，目錄號10099-141]、40 mM EDTA [Boston BioProducts，目錄號BM-711-K]，PBS中)洗滌。使用RBC Lysing Buffer (Bio-gems，目錄號64010-00-100)溶解紅血球。用FACS洗滌緩衝液洗滌細胞兩次，並重新懸浮於PBS中進行細胞計數。
將血液樣品和解離的脾臟樣品與Mouse BD Fc Block™(BD Biosciences，目錄號553141)在暗處、4℃下培育10分鐘，然後用表16中所述稀釋於Fc阻斷緩衝液的抗體組在4℃下對細胞進行染色30分鐘。隨後，將血液樣品與RBC Lysing Buffer一起在RT下培育又再10分鐘。接下來，將來自血液和解離的脾臟樣品的細胞用洗滌緩衝液洗滌三次。向每個樣品中添加100 μL 123count eBeads (eBioscience，目錄號01-1234-42)，然後藉由流式細胞測量術對樣品進行分析。使用Kaluza Analysis Software分析流式細胞測量術數據。 表16：對抗體組進行免疫表型分析 a在單通道中組合CD19和CD11b以排除表現CD19及/或CD11b的細胞。縮寫：BUV=亮紫外；BV=亮紫；CD=分化簇；Cy=花青；eF=eFluor；FITC=異硫氰酸螢光素；IgG=免疫球蛋白G；MHC=主要組織相容性複合體；NA=不適用；PE=藻紅蛋白；PerCP=甲藻黃素-葉綠素-蛋白質。
在使用兔抗CD3ε (Ventana，純系2GV6，目錄號790-4341；最終濃度0.4 μg/mL)、兔抗CD4 (Abcam，純系EPR19514，目錄號ab183685；最終濃度5 μg/mL)、兔抗CD8 (Cell Signaling，純系D4W2Z，目錄號98941；1：200稀釋)，以及兔抗GZMB抗體(Abcam，純系EPR22645-206，目錄號ab255598；最終濃度5 μg/mL)的IHC中，於異種移植腫瘤組織中評估CD3、CD4、CD8和顆粒酶B (GZMB)的表現，然後進行抗兔特異性偵測方案(OmniMap DAB抗Rb偵測套組，Roche，目錄號05269679001用於CD8 IHC分析，組合以HQ信號放大套組，Roche，目錄號06472320001)以避免與潛在剩餘的小鼠IgG結合。使用HALO軟體(Indica Labs)利用訂製圖像分析演算法對數位圖像進行活腫瘤區域內的細胞定量。藉由計算活(非壞死)腫瘤區域內所有有核細胞的標記陽性細胞的百分比來生成細胞定量讀數。
在第8天，相較於非結合對照抗體IgG1-ctrl-FERR，用10 mg/kg IgG1-PD1治療使得周邊血液中T細胞(CD3 +、CD4 +和CD8 +)數量有明顯增加的趨勢，而用10 mg/kg派姆單抗治療導致周邊T細胞數量在統計上顯著減少(圖13)。同時，第8天，與對照治療相比，在用10 mg/kg IgG1-PD1治療的小鼠脾臟中，效應子記憶(CD44 +CD62L -) CD8 +T細胞的百分比明顯增加，但在用10 mg/kg派姆單抗治療的小鼠脾臟中則沒有(圖14A)。與對照小鼠和用10 mg/kg派姆單抗治療的小鼠相比，用10 mg/kg IgG1-PD1治療的小鼠脾臟中觀察到幼稚(CD44 -CD62L +) CD8 +T細胞百分比隨之顯著降低。在第8天，用10 mg/kg IgG1-PD1治療明顯增加了MHC第II類 +CD8 +T細胞的百分比，表明T細胞活化增加(圖14B)。在用10 mg/kg派姆單抗治療的小鼠脾臟中觀察到MHC第II類 +CD8 +T細胞百分比的增加不相上下。
在第8天，用10 mg/kg派姆單抗治療的小鼠中，腫瘤內CD3 +和CD8 +T細胞的數量顯著低於對照小鼠(圖15A-C)。此外，在第8天，用10 mg/kg IgG1-PD1治療的小鼠中表現細胞毒性效應子分子GZMB的腫瘤內細胞的百分比顯著高於用10 mg/kg派姆單抗治療的小鼠和對照小鼠(圖15D)。
總之，IgG1-PD1的活體內抗腫瘤活性與周邊血液和腫瘤內T細胞數量的增加、脾臟中效應子記憶以及經活化(MHC第II類 +) CD8 +T細胞的百分比增加，還有腫瘤內GZMB +細胞的百分比增加相關。相比之下，經派姆單抗治療的小鼠表現出的藥效學變化有限。 實例 14 ： IgG1-PD1 結合巨噬細胞
IgG1-PD1未表現出結合至FcγR，而納武單抗、派姆單抗、多塔利單抗和西米普利單抗則有(實例8)。使用流式細胞測量術在活體外評估這些抗體結合表現FcγR的M2c樣巨噬細胞的能力。
根據製造商的說明，藉由密度梯度離心(以800×g進行20分鐘，有慢速制動器)在Lymphocyte Separation Medium (Promocell，目錄號C-44010)上從LeucoSep™試管(Greiner，目錄號227290)中的三名健康人類捐贈者(Sanquin血液供應基金會，荷蘭)的膚色血球層中純化人類周邊血液單核細胞(PBMC)。根據製造商的說明，使用抗CD14 MicroBeads (Miltenyi；目錄號130-050-201)藉由MACS技術從PBMC純化人類單核細胞。CD14 +單核細胞以1.0 × 10 6個細胞/mL的密度重新懸浮於補充有50 ng/mL M-CSF (Gibco，目錄號PHC9501)的CellGenix ®GMP DC培養基(CellGenix，目錄號20801-0500)中。為了使單核細胞向M2c樣巨噬細胞極化，將純化的單核細胞鋪在具有UpCell™ Surface的100 mm 2Nunc™培養皿中(8 × 10 6個細胞/培養皿，密度為1.0 × 10 6個細胞/mL；Thermo Fisher Scientific，目錄號174902)的補充有M-CSF的CellGenix GMP DC培養基中並培養(37℃，5% CO 2)歷時7天，接著在補充有50 ng/mL M-CSF、50 ng/mL IL-4 (R&D Systems，目錄號204-IL)和50 ng/mL IL-10 (R&D Systems，目錄號1064-IL/CF)的CellGenix GMP DC培養基中培養3天。接下來，將培養皿在RT下放置40至60分鐘，使巨噬細胞從培養皿表面脫離。藉由離心(300×g，5分鐘)沉澱脫離的巨噬細胞，計數，並以1.5×10 6個細胞/mL的密度重新懸浮於CellGenix GMP DC培養基中。使用結合Brilliant Violet (BV) 421的抗人類CD163 (BioLegend，目錄號333612；1：200稀釋)與結合BV711的抗人類CD206 (BioLegend，目錄號321136；1：200稀釋)的混合物，藉由流式細胞測量術確認了單核細胞衍生而來的巨噬細胞的M2c樣表型。使用結合FITC的抗人類CD64 (FcγRIa；BioLegend，目錄號305006；1：25稀釋)、結合FITC的抗人類CD32 (FcγRII；BD Pharmingen，目錄號552883；1：50稀釋)、結合PE的抗人類CD16a (FcγRIIIa；BD Pharmingen，目錄號555407；1：50稀釋)、結合PE的抗PD-1抗體(BioLegend，目錄號329906，1：50稀釋)、結合FITC的IgG1同型對照(BioLegend，目錄號400108；1：25稀釋)，以及結合PE的IgG1同型對照(BD Pharmingen，目錄號555749；1：50稀釋)評估M2c-樣巨噬細胞上的FcγR與PD-1表現。M2c樣巨噬細胞與IgG1-PD1、派姆單抗(MSD，批號U013442)、納武單抗(Bristol-Myers Squibb，批號ABP6534)、IgG4同型對照(BioLegend，目錄號403702)、IgG1-ctrl和IgG1-ctrl-FERR一起培育24小時，並用FACS緩衝液洗滌兩次。將細胞與稀釋於FACS緩衝液中的結合PE山羊抗人類IgG F(ab') 2(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-116-097；1：200稀釋)一起在4℃下培育30分鐘。用FACS緩衝液洗滌兩次後，將細胞重新懸浮於補充有成活力染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；BD Pharmingen，目錄號564907；1：5,000稀釋)的FACS緩衝液中，隨後在BD LSRFortessa™ Cell Analyzer上測量並在FlowJo中進行分析。
使用人類單核細胞衍生的M2c樣巨噬細胞(來自三名健康捐贈者)評估IgG1-PD1、派姆單抗和納武單抗與細胞膜上表現的FcγR的結合。首先藉由流式細胞測量術確認FcγRIa、FcγRII和FcγRIIIa的表現以及PD-1表現不存在(圖16A)。納入具有野生型IgG1 Fc結構域的IgG1-ctrl、Fc-惰性IgG1-ctrl-FERR和IgG4同型對照作為對照。儘管IgG1-ctrl在培育24小時後顯示出有效結合至M2c樣巨噬細胞，但對於任何測試的捐贈者均未觀察到IgG1-PD1或IgG1-ctrl-FERR的結合(圖16B)。相反，派姆單抗、納武單抗和IgG4同型對照抗體均顯示出高於背景對照的結合。總之，這些數據表明IgG1-PD1不會結合至表現FcγR的M2c樣巨噬細胞，而派姆單抗和納武單抗則會。 實例 15 ： IgG1-PD1 誘導的 Fc γR 信號傳導
IgG1-PD1顯示未結合至FcγR或M2c樣巨噬細胞，而具有IgG4骨架的抗PD-1抗體則有(實例8和14)。使用基於細胞的Fc效應子活性報導分析在活體外評估這些抗體誘導FcγR信號傳導的能力。
基本上如製造商所述，使用基於生物發光細胞的報導分析(Promega，目錄號分別為GA1341、G988A、CS178B11和G988ACS1781E01)評估IgG1-PD1、納武單抗、派姆單抗、多塔利單抗和西米普利單抗誘導的FcγRI、FcγRIIa-H131、FcγRIIa-R131和FcγRIIb信號傳導。簡言之，將用PD-1 (內部生成；實例1)轉染的CHO細胞與連續稀釋的IgG1-PD1、派姆單抗(MSD，批號W003098)、納武單抗(Bristol-Myers Squibb，批號8006768)、多塔利單抗(GlaxoSmithKline，批號1822049)、西米普利單抗(Regeneron，批號1F006A)、IgG1-ctrl-FERR或IgG4同型(BioLegend，目錄號403702) (FcγRI分析中的最終分析濃度：30 - 1.23 × 10 -7μg/mL，25倍稀釋；其他FcγR分析中的最終分析濃度：30 - 0.00192 μg/mL，5倍稀釋)在37℃、5% CO 2下預培育歷時15分鐘。納入IgG1-CD52-E430G (具有六聚化增強E430G突變)作為陽性對照。將基因改造的FcγRI、FcγRIIa-H (FcγRIIa-H131)、FcγRIIa-R (FcγRIIa-R131)和FcγRIIb效應子細胞以1：1的比例添加到培養物中，之後將樣品在37℃、5%CO 2下培育歷時5小時。接下來，將樣品與還原的Bio-Glo™一起在RT下培育10分鐘，然後使用EnVision Multilabel Plate Reader (PerkinElmer)測量發光(以RLU計)。
膜結合的IgG1-CD52-E430G (具有E430G六聚化增強突變)誘導強烈的FcγRI、FcγRIIa-R131、FcγRIIa-H131和FcγRIIb信號傳導。膜結合的派姆單抗、納武單抗、西米普利單抗和多塔利單抗(全為IgG4亞類)也誘導FcγRI、FcγRIIa-R131、FcγRIIa-H131和FcγRIIb信號傳導，但程度較小，而膜結合的IgG1-PD1和非結合對照抗體(IgG1-ctrl-FERR，IgG4同型)則無(圖17)。
總之這些數據證實，膜結合納武單抗、派姆單抗、多塔利單抗和西米普利單抗誘導FcγRI、FcγRIIa-R131、FcγRIIa-H131和FcγRIIb信號傳導。相反，膜結合的IgG1-PD1無法誘導FcγR媒介的信號傳導，證實了IgG1-PD1的Fc結構域的功能惰性。
無
圖1顯示IgG1-PD1與不同物種PD-1的結合。將用不同物種PD-1瞬時轉染的CHO-S細胞與IgG1-PD1、派姆單抗或非結合對照抗體IgG1-ctrl-FERR和IgG4-ctrl一起培育，並使用流式細胞測量術進行結合分析。與IgG1-PD1一起培育的未轉染CHO-S細胞被納入作為陰性對照。A-B，顯示的數據是四個實驗中一個代表性實驗的重複孔的幾何平均螢光強度(gMFI) ± SD。C-D，顯示的數據是兩個實驗中一個代表性實驗的重複孔的gMFI ± SD。E，顯示的數據是四個實驗中一個代表性實驗的重複孔的幾何平均螢光強度(gMFI) ± SD。縮寫：gMFI=幾何平均螢光強度；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；PE=R-藻紅蛋白。 圖2顯示在有PD-L1和PD-L2的情況下IgG1-PD1與人類PD-1的競爭性結合。在IgG1-PD1或派姆單抗存在下，將用人類PD-1瞬時轉染的CHO-S細胞與1 μg/mL生物素化重組人類PD-L1 (A)或PD-L2 (B)一起培育。IgG1-ctrl-FERR被納入作為陰性對照。用鏈球親生物素蛋白-別藻藍蛋白對細胞進行染色，並藉由使用流式細胞測量術測量鏈球親生物素蛋白-別藻藍蛋白 +細胞百分比來確定結合生物素化PD-L1或PD-L2的細胞百分比。無抗體對照和未轉染樣品中的鏈球親生物素蛋白-別藻藍蛋白 +細胞百分比用虛線表示。顯示的數據是三個個別實驗中一個代表性實驗的單次重複。縮寫：Ab=抗體；CHO-S=中國倉鼠卵巢，懸浮；ctrl=控制；FERR=L234F/L235E/G236R-K409R；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；PD-L1=程式化細胞死亡1配體1；PD-L2=程式化細胞死亡1配體2。 圖3顯示IgG1 PD1對PD-1/PD-L1檢查點的功能性抑制。使用基於細胞的生物發光PD-1/PD-L1阻斷報導分析來測試PD-1/PD-L1軸的阻斷。顯示的數據是五個(派姆單抗和IgG1-PD1)、三個實驗(IgG1-ctrl-FERR)或兩個實驗(納武單抗)中的一個代表性實驗的重複孔的平均發光± SD。縮寫：FERR=L234F/L235E/G236R- K409R；PD1=程式化細胞死亡蛋白1；PD-L1=程式化細胞死亡1配體1；RLU=相對光單位；SD=標準差。 圖4顯示在抗原特異性T細胞增生分析中，IgG1-PD1對CD8 +T細胞增生的增強作用。用編碼CLDN6特異性TCR的RNA和編碼PD-1的RNA電穿孔人類CD8 +T細胞，並用CFSE標記。然後在IgG1-PD1、派姆單抗、納武單抗或IgG1-ctrl-FERR存在的情況下，將T細胞與用編碼CLDN6的RNA電穿孔的iDC一起培養。4天後，藉由流式細胞測量術分析T細胞中的CFSE稀釋度並用於計算擴增指數。顯示在三個獨立實驗中所評估的四名捐贈者中的一名代表性捐贈者(26268_B)的數據。誤差槓代表重複孔的SD。使用GraphPad Prism藉由4參數對數擬合來擬合曲線。縮寫：CFSE=羧基螢光素琥珀醯亞胺酯；FERR=L234F/L235E/G236R-K409R；PD1=程式化細胞死亡蛋白 1；SD=標準差。 圖5顯示在同種異體MLR分析中，IgG1-PD1誘導的IFNγ分泌。將三對獨特捐贈者的同種異體人類mDC和CD8+T細胞者在IgG1-PD1或派姆單抗存在下一起培養5天。IgG1-ctrl-FERR和IgG4同型對照被納入作為陰性對照。使用IFNγ特異性免疫分析來分析上清液中的IFNγ分泌。顯示的數據是三對獨特同種異體捐贈者的平均濃度的平均值±標準差(SEM)。縮寫：FERR=L234F/L235E/G236R- K409R；IFN=干擾素；IgG=免疫球蛋白G；mDC=成熟樹突狀細胞；MLR=混合淋巴細胞反應；SEM=平均值的標準差。 圖6顯示在同種異體MLR分析中，IgG1-PD1誘導的細胞介素分泌。將三對獨特捐贈者的同種異體人類mDC和CD8 +T細胞在1 μg/mL IgG1-PD1或派姆單抗存在下一起培養5天。IgG1-ctrl-FERR被納入作為陰性對照。使用Luminex分析上清液中的細胞介素分泌。(A)細胞介素含量表示在未經處理的共培養物中進行測量，細胞介素含量的平均變化倍數。(B)顯示三對獨特同種異體捐贈者的細胞介素產生含量，水平線表示平均值、上限和下限。縮寫：FC=變化倍數；FERR=L234F/L235E/G236R-K409R；GM-CSF=顆粒球巨噬細胞群落刺激因子；IgG=免疫球蛋白G；IL=介白素；MCP-1=單核細胞趨化蛋白1；mDC=成熟樹突狀細胞；MLR=混合淋巴細胞反應；TNF=腫瘤壞死因子。 圖7顯示C1q與膜結合IgG1-PD1的結合。使用經刺激的人類CD8 +T細胞分析C1q與IgG1-PD1的結合。與IgG1-PD1、IgG1-ctrl-FERR、IgG1-ctrl或陽性對照抗體IgG1-CD52-E430G (無惰性突變且具有六聚化增強突變)一起培育後，將細胞與作為C1q來源的人類血清一起培育。使用結合FITC的兔抗C1q抗體偵測C1q的結合。顯示的數據是在三個相當實驗中，七名捐贈者中的一名代表性捐贈者之重複孔的幾何平均螢光強度(gMFI) ± 標準差(SD)。縮寫：FITC=異硫氰酸螢光素；gMFI=幾何平均螢光強度；PE=R-藻紅藍蛋白。 圖8顯示IgG1-PD1的FcγR結合。在合格分析(n=1)中藉由SPR分析IgG1-PD1與固定化人類重組FcγR構建體的結合。IgG1-PD1與FcγRIa (A)、FcγRIIa-H131 (B)、FcγRIIa-R131 (C)、FcγRIIb (D)、FcγRIIIa-F158 (E)和FcγRIIIa-V158 (F)結合。抗體IgG1-ctrl (無FER惰性突變)被納入作為結合的陽性對照。縮寫：ctrl=對照；FcγR=Fc加瑪受體；IgG=免疫球蛋白G；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；RU=共振單位。 圖9顯示IgG1-PD1和其他數種抗PD-1抗體的FcγR結合。藉由SPR (n=3)分析IgG1-PD1、納武單抗、派姆單抗、多塔利單抗(dostarlimab)和西米普利單抗(cemiplimab)與固定化人類重組FcγR構建體的結合。測試抗體與FcγRIa (A)、FcγRIIa-H131 (B)、FcγRIIa-R131 (C)、FcγRIIb (D)、FcγRIIIa-F158 (E)和FcγRIIIa-V158 (F)的結合。IgG1-ctrl和IgG4-ctrl抗體被納入作為IgG1和IgG4分子(帶有野生型Fc區)的FcγR結合的陽性對照。顯示的是三個個別實驗的結合反應± SD。縮寫：ctrl=對照；FcγR=Fc加瑪受體；IgG=免疫球蛋白G；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；RU=共振單位。 圖10顯示IgG1-PD1和其他數種抗PD-1抗體的FcγRIa結合。藉由流式細胞測量術分析IgG1-PD1、納武單抗、派姆單抗、多塔利單抗和西米普利單抗與瞬時表現人類FcγRIa的CHO-S細胞的結合。IgG1-ctrl和IgG1-ctrl-FERR分別被納入作為陽性對照和陰性對照。縮寫：ctrl=對照；FcγR=Fc加瑪受體；FERR=L234F/L235E /G236R-K409R；huIgG=人類免疫球蛋白G；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；PE=R-藻紅蛋白。 圖11顯示小鼠血漿樣品中的總人類IgG。在t=0時將小鼠靜脈內注射1或10 mg/kg IgG1-PD1，並在注射後10分鐘、4小時、1天、2天、8天、14天和21天採集連續血漿樣品。藉由ECLIA測定每隻小鼠血漿樣品中的總huIgG。數據表示為三隻獨立小鼠的平均huIgG濃度± SD。虛線表示透過基於人類IgG清除的二室模型預測的野生型(wt) huIgG的血漿濃度(Bleeker et al., 2001, Blood. 98(10):3136-42)。虛線表示LLOQ和ULOQ。縮寫：huIgG=人類IgG；IgG=免疫球蛋白G；LLOQ=定量下限；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；SD=標準差；ULOQ=定量上限。 圖12顯示IgG1-PD1在人類PD-1嵌入小鼠中的抗腫瘤活性。藉由SC植入hPD-1 KI小鼠來建立MC38結腸癌同基因腫瘤模型。小鼠投予0.5、2或10 mg/kg IgG1-PD1或派姆單抗或10 mg/kg IgG1-ctrl-FERR 2QW×3 (每組9隻小鼠)。(A)每組的平均腫瘤體積± SEM，直到該組完成最後一個時間點。(B)在所有組別均完成的最後一天(第11天)，不同組別的腫瘤體積。顯示的數據是每個治療組中個別小鼠的腫瘤體積，以及每個治療組的平均腫瘤體積± SEM。使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)分析比較治療組與經IgG1-ctrl-FERR治療組的腫瘤體積，*p＜0.05、**p＜0.01和***p＜0.001。C，無進展存活期，定義為腫瘤體積小於500 mm 3的小鼠百分比，顯示為Kaplan-Meier曲線。分析排除了2 mg/kg IgG1-PD1組中的一隻小鼠，該小鼠在第16天腫瘤體積超過500 mm 3之前因不明原因死亡。縮寫：2QW×3=每週兩次，持續三週；ctrl=對照；FERR=L234F/L235E/G236R/K409R突變；IgG=免疫球蛋白G；KI=嵌入；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；SC=皮下；SEM=平均值的標準差。 圖13顯示在用IgG1-PD1治療的人類PD-1嵌入小鼠中的周邊T細胞計數動力學。藉由SC植入hPD-1 KI小鼠建立MC38結腸癌同基因腫瘤模型。在第0、3和7天小鼠投予0.5或10 mg/kg IgG1-PD1、10 mg/kg派姆單抗，或10 mg/kg IgG1-ctrl-FERR (每組12隻小鼠)。在第2、4和8天對每組四隻小鼠進行安樂死後收集周邊血液樣本，並藉由流式細胞測量術進行分析。顯示的是活CD45 +白血球亞群中每μL血液CD3 +(A)、CD4 +(B)和CD8 +(C) T細胞數量的平均值± SD。使用曼-惠特尼分析將治療組與經IgG1-ctrl-FERR治療組，以及10 mg/kg IgG1-PD1組與10 mg/kg派姆單抗組進行比較，*p＜0.05。縮寫：ctrl=對照；FERR=L234F/L235E /G236R/K409R突變；IgG=免疫球蛋白G；KI=嵌入；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；SC=皮下；SD=標準差。 圖14顯示在用IgG1-PD1治療的人類PD-1嵌入小鼠中，脾臟T細胞亞群上的PD標記。藉由SC植入hPD-1 KI小鼠建立MC38結腸癌同基因腫瘤模型。在第0、3和7天小鼠投予0.5或10 mg/kg IgG1-PD1、10 mg/kg派姆單抗，或10 mg/kg IgG1-ctrl-FERR (每組12隻小鼠)。在第2、4和8天(每組n=4隻小鼠以及時間點)收取脾臟並藉由流式細胞測量術進行分析。顯示的是，在第8天於脾臟中，效應子記憶(CD44 +CD62L -)、中央記憶(CD44 +CD62L +)和幼稚(CD44 -CD62L +) CD8 +T細胞的百分比(A)，以及總CD8 +T細胞群中MHC第II類 +細胞的百分比(B)的平均值± SD。使用曼-惠特尼分析將治療組與經IgG1-ctrl-FERR治療組，以及10 mg/kg IgG1-PD1組與10 mg/kg派姆單抗組進行比較，*p＜0.05。縮寫：ctrl=對照；FERR=L234F/L235E/G236R/K409R突變；IgG=免疫球蛋白G；KI=嵌入；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；SC=皮下；SD=標準差。 圖15顯示在用IgG1-PD1治療的人類PD-1嵌入小鼠中瘤內細胞的變化。藉由SC植入hPD-1 KI小鼠建立MC38結腸癌同基因腫瘤模型。在第0、3和7天小鼠投予0.5或10 mg/kg IgG1-PD1、10 mg/kg派姆單抗，或10 mg/kg IgG1-ctrl-FERR (每組12隻小鼠)。第8天切除異種移植腫瘤(每組n=4隻小鼠)並藉由IHC進行分析。顯示的是在第8天所有有核細胞中CD3 +T細胞(A)、CD4 +T細胞(B)、CD8 +T細胞(C)和GZMB +細胞(D)百分比的平均值± SD。使用曼-惠特尼分析將治療組與經IgG1-ctrl-FERR治療組，以及10 mg/kg IgG1-PD1組與10 mg/kg派姆單抗組進行比較，*p＜0.05。縮寫：ctrl=對照；FERR=L234F/L235E/G236R/K409R突變；GZMB=顆粒酶B；IgG=免疫球蛋白G；KI=嵌入；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；SC=皮下；SD=標準差。 圖16顯示IgG1-PD1和其他抗PD-1抗體與人類單核細胞衍生的FcγR+ M2c樣巨噬細胞的結合。(A)相對於相關同型對照和未染色的M2c樣巨噬細胞，在標準化數據的疊加直方圖中可見FcγRIa、FcγRII、FcγRIIIa和PD-1的表現，這些數據是三名捐贈者中的一名代表性捐贈者。(B)培育24小時後，藉由流式細胞測量術分析IgG1-PD1、派姆單抗、納武單抗和對照抗體與人類單核細胞衍生的FcγR+ M2c樣巨噬細胞的結合。顯示相對於背景對照的結合(背景對照僅與二級抗體結合，由黑色虛線表示)。點代表在兩個獨立實驗中測量的三名個別捐贈者，而柱狀圖和誤差槓分別代表三名捐贈者的平均值± SD。縮寫：ctrl=對照；FERR=L234F/L235E/G236R/K409R突變；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；SD=標準差。 圖17顯示由膜結合IgG1-PD1和其他抗PD-1抗體誘導的FcγR信號傳導。使用基於細胞的生物發光FcγRI (A)、FcγRIIa-R131 (B)、FcγRIIa-H131 (C)和FcγRIIb (D)報導分析測試由膜結合IgG1-PD1和其他數種抗PD-1抗體誘導的FcγR信號傳導。帶有六聚化增強E430G突變的IgG1-CD52-E430G被納入作為陽性對照。顯示的數據是三個實驗中一個代表性實驗的重複孔中的平均相對光單位± SD。縮寫：Ab=抗體；FERR=L234F/L235E/G236R/K409R突變；PD-1=程式化細胞死亡蛋白1；RLU=相對光單位；SD=標準差。
無
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Claims (112)

  1. 一種能夠結合至PD-1的抗體，其中該抗體包含具有重鏈恆定區(CH)和重鏈可變區(VH)的重鏈，其中重鏈恆定區根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置234的位置處包含芳族或非極性胺基酸，以及根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置236的位置處包含甘胺酸以外的胺基酸。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體具有降低或耗盡的Fc媒介的效應子功能。
  3. 如請求項1或2之抗體，其中對應於位置236的位置處的胺基酸是鹼性胺基酸。
  4. 如請求項2或3之抗體，其中鹼性胺基酸選自由離胺酸、精胺酸和組胺酸組成之群。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體，其中鹼性胺基酸是精胺酸(G236R)。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體，其中對應於位置234的位置處的胺基酸是芳族胺基酸。
  7. 如請求項6之抗體，其中芳族胺基酸選自由苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸組成之群。
  8. 如請求項1至5中任一項之抗體，其中對應於位置234的位置處的胺基酸是非極性胺基酸。
  9. 如請求項8之抗體，其中非極性胺基酸選自由丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸和色胺酸組成之群。
  10. 如請求項8或9之抗體，其中非極性胺基酸選自由異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸和色胺酸組成之群。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體，其中對應於位置234處的胺基酸是苯丙胺酸(L234F)。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗體，其中於該重鏈恆定區中根據EU編號在人類IgGl重鏈中對應於位置235的位置處的胺基酸是酸性胺基酸。
  13. 如請求項12之抗體，其中酸性胺基酸是天冬胺酸或麩胺酸。
  14. 如請求項1至13中任一項之抗體，其中對應於位置235的位置處的胺基酸是麩胺酸(L235E)。
  15. 如請求項1至14中任一項之抗體，其中在重鏈恆定區中對應於位置234、235和236的位置處的胺基酸是位置234處的非極性胺基酸或芳族胺基酸、位置235處的酸性胺基酸，以及位置236處的鹼性胺基酸。
  16. 如請求項1至15中任一項之抗體，其中對應於位置234的胺基酸是苯丙胺酸，對應於位置235的胺基酸是麩胺酸，而對應於位置236的胺基酸是精胺酸(L234F/L235E/G236R)。
  17. 如請求項1至16中任一項之抗體，其中重鏈恆定區包含與如SEQ ID NO：2中所示重鏈恆定區序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。
  18. 如請求項1至17中任一項之抗體，其中重鏈恆定區包含如SEQ ID NO：2或55中所示的序列。
  19. 如請求項1至18中任一項之抗體，其中重鏈恆定區的同型是IgG1。
  20. 如請求項1至19中任一項之抗體，其中重鏈可變區(VH)包含具有或包含如SEQ ID NO：8中所示序列的互補決定區3 (HCDR3)。
  21. 如請求項1至20中任一項之抗體，其中重鏈可變區(VH)的HCDR3具有或包含如SEQ ID NO：9中所示的序列。
  22. 如請求項1至21中任一項之抗體，其中重鏈可變區(VH)包含互補決定區2 (HCDR2)，該HCDR2具有或包含如SEQ ID NO：10中所示的序列。
  23. 如請求項22之抗體，其中重鏈可變區(VH)的HCDR2具有或包含如SEQ ID NO：11中所示的序列。
  24. 如請求項1至23中任一項之抗體，其中重鏈可變區(VH)包含具有或包含選自SYN之序列的互補決定區1 (HCDR1)。
  25. 如請求項24的抗體，其中重鏈可變區(VH)的HCDR1具有或包含如SEQ ID NO：12中所示的序列。
  26. 如請求項24的抗體，其中重鏈可變區(VH)的HCDR1具有或包含如SEQ ID NO：13中所示的序列。
  27. 如請求項1至26中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中HCDR1序列選自具有或包含SYN、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的序列，HCDR2序列選自具有或包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的序列，而HCDR3序列選自具有或包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的序列。
  28. 如請求項1至27中任一項之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別是或包含SYN、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：8。
  29. 如請求項1至28中任一項所述的抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別是或包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：8。
  30. 如請求項1至28中任一項之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別是或包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：9。
  31. 如請求項1至30中任一項之抗體，其中抗體包含具有輕鏈可變區(VL)的輕鏈。
  32. 如請求項1至31中任一項之抗體，其中抗體包含輕鏈可變區(VL)，該VL包含以下中的至少一者： -      互補決定區3 (LCDR3)，其具有或包含如SEQ ID NO：14中所示的序列； -      互補決定區2 (LCDR2)，其具有或包含選自QAS的序列或如SEQ ID NO：15中所示的序列；及/或 -      互補決定區1 (LCDR1)，其具有或包含如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17中所示的序列。
  33. 如請求項32之抗體，其中抗體包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中LCDR1序列選自具有或包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：16的序列，LCDR2序列選自具有或包含QAS或SEQ ID NO：15的序列，而LCDR3序列是具有或包含SEQ ID NO：14的序列。
  34. 如請求項31至33中任一項之抗體，其中抗體包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分別是或包含SEQ ID NO：16、QAS和SEQ ID NO：14。
  35. 如請求項31至34中任一項之抗體，其中抗體包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分別是或包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：14。
  36. 如請求項1至19中任一項之抗體，其包含如請求項20至30中任一項所指定的重鏈可變區(VH)以及如請求項31至35中任一項所指定的輕鏈可變區(VL)。
  37. 如請求項1至36中任一項之抗體，其中抗體包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(VH)，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別包含或具有列SYN、如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：8中所示序列，而LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：16、QAS和SEQ ID NO：14中所示序列。
  38. 如請求項1至36中任一項之抗體，其中抗體包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(VH)，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中HCDRl、HCDR2和HCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：8中所示序列，而LCDRl、LCDR2和LCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：14中所示序列。
  39. 如請求項1至36中任一項之抗體，其中抗體包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(VH)，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：9中所示序列，而LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分別包含或具有如SEQ ID NO：16、QAS和SEQ ID NO：14中所示序列。
  40. 如請求項1至39中任一項之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含與如SEQ ID NO：18中所示VH序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。
  41. 如請求項1至39中任一項之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)，其中該VH包含如SEQ ID NO：18中所示的序列。
  42. 如請求項1至41中任一項之抗體，其中抗體包含輕鏈可變區(VL)，該VL包含與如SEQ ID NO：19中所示VL序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。
  43. 如請求項1至42中任一項之抗體，其中抗體包含輕鏈可變區(VL)，其中該VL包含如SEQ ID NO：19中所示的序列。
  44. 如請求項1至43中任一項之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中VH包含或具有如SEQ ID NO：18中所示的序列，而VL包含或具有如SEQ ID NO：19中所示的序列。
  45. 如請求項1至39中任一項之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(VH)，該VH包含與如SEQ ID NO：20中所示VH序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。
  46. 如請求項45之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其中該VH包含如SEQ ID NO：20中所示的序列。
  47. 如請求項45之抗體，其中該抗體包含重鏈，該重鏈包含有包含如SEQ ID NO：20中所示序列的VH，以及包含如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：55中所示序列的重鏈恆定區。
  48. 如請求項45之抗體，其中該抗體包含有包含如SEQ ID NO：56中所示序列的重鏈。
  49. 如請求項1至48中任一項之抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區(VL)，該VL包含與如SEQ ID NO：21中所示VL序列的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性的序列。
  50. 如請求項49之抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區(VL)，其中該VL包含如SEQ ID NO：21中所示的序列。
  51. 如請求項49之抗體，其中該抗體包含輕鏈，該輕鏈包含有包含如SEQ ID NO：21中所示序列的VL，以及包含如SEQ ID NO：6中所示序列的輕鏈恆定區。
  52. 如請求項49之抗體，其中該抗體包含有包含如SEQ ID NO：57中所示序列的輕鏈。
  53. 如請求項1至48中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含或具有如SEQ ID NO：20中所示的序列，而VL包含或具有如SEQ ID NO：21中所示的序列。
  54. 如請求項1至53中任一項之抗體，其中該抗體包含 (i)    重鏈，其具有包含如SEQ ID NO：2或55中所示序列的重鏈恆定區(CH)以及包含如SEQ ID NO：20中所示序列的重鏈可變區(VH)，和 (ii)   輕鏈，其具有包含如SEQ ID NO：6中所示序列的輕鏈恆定區(CL)以及包含如SEQ ID NO：21中所示序列的輕鏈可變區(VL)。
  55. 如請求項1至53中任一項之抗體，其中抗體包含具有如SEQ ID NO：56中所示序列的重鏈以及具有如SEQ ID NO：57中所示序列的輕鏈。
  56. 如請求項1至55中任一項之抗體，其為單株、嵌合或人源化抗體或此一抗體的片段。
  57. 如請求項1至56中任一項之抗體，其中與對應野生型抗體相比，補體蛋白C1q與該抗體恆定區的結合降低，較佳至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%。
  58. 如請求項1至57中任一項之抗體，其中與對應野生型抗體相比，一或多個IgG Fc-加瑪受體與抗體的結合降低，較佳至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%。
  59. 如請求項58之抗體，其中該一或多個IgG Fc-加瑪受體選自Fc-加瑪RI、Fc-加瑪RII和Fc-加瑪RIII中的至少一者。
  60. 如請求項58之抗體，其中IgG Fc-加瑪受體是Fc-加瑪RI。
  61. 如請求項1至60中任一項之抗體，其中抗體不能誘導Fc-加瑪RI媒介的效應子功能，或者其中所誘導的Fc-加瑪RI媒介的效應子功能相較於對應野生型抗體降低，較佳至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%。
  62. 如請求項1至61中任一項之抗體，其中抗體不能誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)媒介的溶解、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)媒介的溶解、細胞凋亡、同型黏附及/或吞噬作用中的至少一者，或其中補體依賴性細胞毒性(CDC)媒介的溶解、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)媒介的溶解、細胞凋亡、同型黏附及/或吞噬作用中的至少一者受到誘導的程度降低，較佳降低至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%。
  63. 如請求項1至62中任一項之抗體，其中與對應野生型抗體相比，新生兒Fc受體(FcRn)與抗體的結合不受影響。
  64. 如請求項1至63中任一項之抗體，其中PD-1是人類PD-1。
  65. 如請求項64之抗體，其中PD-1具有或包含如SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23中所示的胺基酸序列，或者PD-1的胺基酸序列與如SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23中所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%一致性，或其免疫原性片段。
  66. 如請求項1至65中任一項之抗體，其結合至活細胞表面上存在的PD-1的天然表位。
  67. 如請求項1至66中任一項之抗體，其中抗體是多特異性抗體，包含結合至PD-1的第一抗原結合區和結合至另一抗原的至少又一個抗原結合區。
  68. 如請求項67之抗體，其中抗體是雙特異性抗體，包含結合至PD-1的第一抗原結合區和結合至另一抗原的第二抗原結合區。
  69. 如請求項67或68之抗體，其中結合至PD-1的第一抗原結合區包含如請求項1至60中任一項所示的重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)。
  70. 一種融合瘤，其能夠生產如請求項1至69中任一項之抗體。
  71. 一種接合物接合物，其包含偶聯至某個部分或藥劑的如請求項1至69中任一項之抗體。
  72. 如請求項71之接合物接合物，其中該部分或藥劑選自由放射性同位素、酶、染料、藥物、毒素和細胞毒性劑組成之群。
  73. 一種多聚體，其包含如請求項1至69中任一項之至少兩種抗體，或如請求項71或72之至少兩種接合物接合物，或如請求項1至69中任一項之一或多種抗體與如請求項71或72之一或多種接合物接合物的混合物。
  74. 如請求項73之多聚體，其包含如請求項1至69中任一項之4至8個抗體或如請求項71或72之接合物接合物。
  75. 一種核酸，其包含編碼如請求項1至69中任一項之抗體，或編碼如請求項1至30或37至66中任一項之抗體重鏈及/或編碼如請求項31至39、42、43或49至66中任一項之抗體輕鏈的核酸序列，或其片段。
  76. 如請求項75之核酸，其中核酸是RNA。
  77. 一種載體，其包含如請求項75或76之一或多種核酸。
  78. 如請求項77之核酸，其中載體是多層囊泡、單層囊泡或其混合物。
  79. 如請求項77或78之載體，其中載體是脂質體。
  80. 如請求項79之載體，其中脂質體是陽離子脂質體。
  81. 如請求項79或80之載體，其中脂質體具有範圍為約50 nm至約200 nm的粒徑。
  82. 一種宿主細胞，其包含如請求項75或76之核酸或包含如請求項77至81中任一項之載體。
  83. 一種病毒，其包含如請求項75或76之核酸或包含如請求項77至81中任一項之載體。
  84. 一種醫藥組成物，其包含活性劑及醫藥上可接受的載劑，其中活性劑是選自以下中的至少一者： (i)    請求項1至69中任一項之抗體； (ii)   請求項71或72之接合物接合物； (iii)  請求項73或74之多聚體； (iv)  請求項75或76之核酸或其組合； (v)   請求項77至81中任一項之載體或其組合； (vi)  請求項82之宿主細胞或其組合；及/或 (vii) 請求項83之病毒或其組合。
  85. 如請求項84之醫藥組成物，其被配製成用於非經腸投藥。
  86. 如請求項85之醫藥組成物，其被配製成用於心血管，特別是靜脈內或動脈內投藥。
  87. 如請求項84至86中任一項之醫藥組成物，其用於預防性及/或治療性治療疾病。
  88. 如請求項87之醫藥組成物，其中疾病是癌症生長及/或癌症轉移。
  89. 如請求項87或88之醫藥組成物，其中疾病的特徵在於包含罹病細胞或癌細胞，其特徵為表現PD-L1及/或特徵為PD-L1與其表面締合。
  90. 如請求項84至89中任一項之醫藥組成物，其用於預防或治療癌症的方法中。
  91. 如請求項88至90中任一項之醫藥組成物，其中癌症選自由黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、乳癌、胃和胃食道接合處癌、胰臟腺癌、卵巢癌和淋巴瘤組成之群。
  92. 如請求項84至91中任一項之醫藥組成物，其中醫藥組成物被特異地遞送至目標器官或組織、積累在目標器官或組織中及/或滯留在目標器官或組織中。
  93. 如請求項84至92中任一項之醫藥組成物，其中載體或病毒在目標器官或組織處釋放核酸及/或進入目標器官或組織處的細胞。
  94. 如請求項84至93中任一項之醫藥組成物，其中抗體在目標器官或組織的細胞中表現。
  95. 如請求項84至94中任一項之醫藥組成物，其中治療是單藥療法或組合療法。
  96. 如請求項95之醫藥組成物，其中組合治療是選自由化療、分子靶向療法、放射療法和其他形式的免疫療法組成之群的至少一種治療。
  97. 如請求項84至96中任一項之醫藥組成物，其中個體是人類。
  98. 一種在個體體內治療或預防疾病的方法，包含向個體投予至少一種活性劑，其中該活性劑是選自以下中的至少一者： (i)    請求項1至69中任一項之抗體； (ii)   請求項71或72之接合物接合物； (iii)  如請求項73或74之多聚體； (iv)  如請求項75或76之核酸或其組合； (v)   如請求項77至81中任一項之載體或其組合； (vi)  如請求項82之宿主細胞或其組合；及/或 (vii) 如請求項83之病毒或其組合。
  99. 如請求項98之方法，其中向個體投予如請求項84至86中任一項之醫藥組成物。
  100. 如請求項98或99之方法，其中個體具有以細胞表現PD-L1為特徵及/或以PD-L1與其表面締合為特徵的罹病器官或組織。
  101. 如請求項98至100中任一項之方法，其中疾病是癌症生長及/或癌症轉移。
  102. 如請求項101之方法，其中癌症選自由黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、乳癌、胃和胃食道接合處癌、胰臟腺癌、卵巢癌和淋巴瘤組成之群。
  103. 如請求項98至102中任一項之方法，其中將活性劑或醫藥組成物投予至心血管系統中。
  104. 如請求項103之方法，其中藉由靜脈內或動脈內投藥，諸如投藥至周邊靜脈中來投予活性劑或醫藥組成物。
  105. 如請求項98至104中任一項之方法，其中活性劑或醫藥組成物被特異地遞送至目標器官或組織、積累在目標器官或組織中及/或滯留在目標器官或組織中。
  106. 如請求項98至105中任一項之方法，其中載體、宿主細胞或病毒在目標器官或組織處釋放核酸，及/或進入目標器官或組織處的細胞。
  107. 如請求項106之方法，其中抗體在目標器官或組織的細胞中表現。
  108. 如請求項98至107中任一項之方法，其中治療是單藥療法或組合療法。
  109. 如請求項108之方法，其中組合治療是選自由化療、分子靶向療法、放射療法和其他形式的免疫療法組成之群的至少一種治療。
  110. 如請求項98至109中任一項之方法，其中個體是人類。
  111. 一種在樣品中用於定性或定量偵測PD-1的套組，其中套組包含如請求項1至69中任一項之抗體，或如請求項71或72之接合物接合物，或如請求項73或74之多聚體。
  112. 一種如請求項1至69中任一項之抗體或如請求項71或72之接合物接合物或如請求項73或74之多聚體或如請求項111之套組在確定於樣品中表現之PD-1的存在或數量的方法中的用途，該方法包含以下步驟： (i)    使樣品與抗體或接合物接合物或多聚體接觸，以及 (ii)   偵測抗體或接合物接合物或多聚體與PD-1之間複合物的形成及/或測定複合物數量。
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