CN107406516B - 用于癌症免疫治疗的抗CLL1特异性单链嵌合抗原受体(scCAR) - Google Patents

用于癌症免疫治疗的抗CLL1特异性单链嵌合抗原受体(scCAR) Download PDF

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Abstract

本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)，其是能够重新定向对于CLL1阳性细胞的免疫细胞特异性和反应性的重组嵌合蛋白。具有这样的CAR的工程化的免疫细胞特别适合用于治疗癌症，特别是白血病的免疫治疗。

Description

用于癌症免疫治疗的抗CLL1特异性单链嵌合抗原受体 (scCAR)
技术领域
相比与正常造血干细胞或其他细胞类型，C型凝集素样分子-1(C-type lectin-like molecule-1)(CLL1)已被确定为频繁过度表达在大多数急性骨髓性白血病(AML)干细胞(LSC)上。本发明涉及利用嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor)(抗CLL1-CAR)来靶向CLL1阳性恶性细胞的方法，其中上述嵌合抗原受体是重组嵌合蛋白，其能够重新定向对于所选择的膜抗原CLL1的免疫细胞特异性和反应性。这些抗CLL1 CAR更特别地包含细胞外配体结合(其包含衍生自一些特异性抗CLL1单克隆抗体的scFV)。具有(endow with)这样的CAR的工程化免疫细胞(engineered immune cell)提供针对CLL1阳性细胞的过继免疫(adoptive immunity)，作为用于效率更高地治疗癌症的各种细胞疗法的一部分，尤其是血液癌。
背景技术
过继免疫治疗(其涉及离体生成的抗原特异性T细胞的转移)，是一种很有前途的策略来治疗病毒感染和癌症。用于过继免疫治疗的T细胞可以通过抗原特异性T细胞的扩增或T细胞的重新定向(通过基因工程)来产生(Park,Rosenberg et al.2011)。病毒抗原特异性T细胞的转移是用于治疗移植相关的病毒感染和罕见病毒相关的恶性肿瘤(rare viral-related malignancy)的完善建立的程序。类似地，肿瘤特异性T细胞的分离和转移已被证明可成功用于治疗黑色素瘤。
通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(scCAR)的基因转移，已经在T细胞中成功生成新型特异性(Jena,Dotti et al.2010)。scCAR是合成受体，上述合成受体由靶向部分构成，该靶向部分与在单个融合分子(single fusion molecule)中的一个或多个信号结构域相关。一般来说，scCAR的结合部分由单链抗体(scFv)(其包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻和可变片段)的抗原结合结构域构成。还已成功使用基于受体或配体结构域的结合部分。用于第一代scCAR的信号结构域衍生自CD3ζ或Fc受体γ链的胞质区。已显示第一代scCAR会成功地重新定向T细胞细胞毒性，然而，它们未能提供延长的扩增和体内抗肿瘤活性。已单独添加(第二代)或联合添加(第三代)来自共刺激分子的信号结构域(包括CD28、OX-40(CD134)、和4-1BB(CD137))，以增强scCAR修饰T细胞的生存和增加scCAR修饰T细胞的增殖。scCAR已成功地允许T细胞针对表达在来自各种恶性肿瘤的肿瘤细胞的表面上的抗原重新定向，其中上述恶性肿瘤包括淋巴瘤和实体瘤(Jena,Dotti et al.2010)。
同时，近五十年来，用于急性骨髓性白血病(AML)的诱导治疗基本没有变化，以及AML仍然是预后不良的疾病。AML是一种疾病，其特征在于不成熟髓样细胞在骨髓中的快速增殖，从而导致造血功能失调。虽然标准诱导化疗可以诱导完全缓解(completeremission)，但许多患者最终复发并死于(succumb)上述疾病(其呼吁开发用于AML的新型治疗)。AML细胞的免疫表型分型的最新进展已经揭示了几种AML相关细胞表面抗原(其可以作为用于未来疗法的靶)。
其中，CLL1(C型凝集素样分子-1)似乎是感兴趣的肿瘤抗原靶，因为通过在诊断时的白血病爆发，它表达自85-92％的所分析的AML患者。它是C型凝集素样受体家族分子的V组的75千道尔顿成员。V组分子具有凝集素样结构域，其结合于非糖配体。CLL1是265个氨基酸II型跨膜糖蛋白(Uniprot数据库：Q5QGZ9，用于由在“Entrez Gene”数据库中的基因n°160364编码的人蛋白)，其含有200个AA胞外结构域。在文献和数据库中，CLL1还被称为MICL、CLEC12和KLRL1。
Bakker等2004已经表明，CLL1抗原与AML干细胞相关。像一些其他抗原(如CD33)，CLL1是细胞表面蛋白，其特异性地表达在大多数恶性淋巴样干细胞(AML LSC)上，同时不表达在正常HSC上(Van Rhenen et al,2007)。同时，揭示了CLL1是在AML中的诊断标志物(Larsen et al,2012)。在诊断时和在缓解时，抗CLL-1抗体使AML特异性干细胞检测和可能抗原靶向成为可能(因为可以区别恶性细胞与正常干细胞)(van Rhenen et al,2007)。然而，迄今为止，还没有在临床试验中报道过这些抗体被测试为治疗性抗体。
单克隆抗体已经常被用来治疗淋巴瘤，但它们在白血病中的应用一直更为有限。吉姆单抗奥佐米星
Figure BDA0001358281550000021
是具有附于它的细胞毒物的单克隆抗体。以前被批准用于治疗老年患者的AML，在研究发现与产品相关联的一些毒性(在PMLIVE“ASH:Pfizer eyesre-launch of Mylotarg”中2010年12月10日的新闻稿)以后，它从市场撤出。在过去十年中，其它单克隆治疗性抗体已表现出不良影响(Klastersky,J.(2006)“Adverse effectsof the humanized antibodies used as cancer therapeutics”Current Opinion inOncology.18(4):316–320)。
在Zhang等(2011)的出版物中，已描述用CLL1靶向肽共价装饰的胶束纳米颗粒用于靶向药物递送(柔红霉素)；这些"靶向纳米胶束"将药物负荷转运到表达CLL1的细胞的内部以及转运到从体外临床标品中分离出的LSC。表明，CLL1-靶向纳米胶束具有用于靶向药物递送到白血病干细胞的潜力。然而，没有治疗效果可归因于CCL-1靶向肽本身。
鉴于上述情况,发明人已追求一种用来靶向CCL1的新方法，其中利用具有基于抗CLL1单克隆抗体的特异性嵌合抗原受体的免疫细胞，其重新定向对于CLL1阳性细胞的免疫细胞特异性。
使用这种方法获得的工程化免疫细胞已被证明有效消除CLL1阳性恶性细胞。尤其是，在同种异体TCR阴性工程化免疫细胞的生产的上下文中，它们似乎是特别有用的，从而允许减少副作用，如GvHD。
因而，本发明开辟了以下道路：利用过继免疫治疗来治疗患有特征在于过多的CLL1-表达细胞的病症的患者。甚至更多地，本发明提供了工程化同种异体免疫细胞，其可以用作“现成的(off-the-shelf)”同种异体治疗产品。作为本发明的进一步优点，可以使CAR阳性工程化细胞与化疗或免疫耗尽治疗相容(即耐受)，从而实现在化疗和免疫治疗之间的协同效应。
发明内容
本发明人已经产生CLL1特异性单链scCAR，其具有不同的设计并且包含衍生自抗CLL1特异性抗体的不同的scFV。
尤其是，本发明人已经开发了抗CLL1特异性单链CAR(scCAR)，上述抗CLL1特异性单链CAR包含衍生自SC02-357、SC02-378、SCO2-161、M26、M31、G4、M22、M29、M2、M5、G12、21.26和1075.7抗体的VL和VL链，具有不同的架构和确定的高度特异性的和非常有选择性的scCAR结构(其结合于CLL1表达细胞并选择性地摧毁CLL1表达癌细胞)。
在体外非特异性激活(例如借助于抗CD3/CD28涂层珠和重组IL2)以后，利用病毒转导，借助于表达这些scCAR的多核苷酸，来转化来自供体的原代T细胞。在某些情况下，进一步工程化T细胞以产生较少或非同种异体反应性T细胞，更特别地通过TCR(αβ–T细胞受体)的组件的破坏，以防止移植物抗宿主反应。
进一步工程化T细胞以产生耐抗癌药物的T细胞，以连同所述经典的抗癌药物一起使用。
所得工程化T细胞，在不同程度上，显示针对CLL1阳性细胞的体外反应性，表明本发明的scCAR有助于T细胞的抗原依赖性活化以及增殖，从而使它们可用于免疫治疗。
所得工程化T细胞显示针对CLL1阳性细胞的体内反应性并显著减少体内癌细胞的数量。
本发明的工程化T细胞被设计成显示针对CLL1阳性细胞的体内反应性，可以伴随抗癌药物一起加以使用，并且是耐受性良好的。在特定实施方式中，即使经过多次给予，本发明的工程化T细胞仍然是有效的，从而使它们可用于免疫治疗，作为首次治疗(诱导)，作为巩固性治疗，作为连同经典抗癌化疗一起的治疗。在本说明书中详细描述编码本发明的CAR的多肽和多核苷酸序列。
本发明的工程化免疫细胞特别可用于治疗性应用如急性骨髓瘤白血病(AML)治疗。
附图说明
图1:根据本发明的工程化免疫细胞的示意图。在图中呈现的工程化免疫细胞是用编码CLL1-scCAR的逆转录病毒载体加以转导的T细胞。进一步工程化此T细胞以允许更好和更安全植入患者，其在本发明的框架内是可选的。X基因可以是例如这样的基因，其表达TCR的组件(TCRα或TCRβ)，Y可以是这样的基因，其涉及T细胞对免疫抑制药物的敏感性，如CD52(相对于Campath)或HPRT(相对于6-硫鸟嘌呤)。
图2:本发明(抗CLL1 scCAR)的不同scCAR结构(V1至V6)的示意图，其中组件(component)在下面的表1给出。
图3A和图3B:根据本发明的示例性CLL1特异性CAR的示意图，其涉及用于T细胞清除(T cell depletion)的不同的mAb-表位标记，尤其是CD20模拟表位，其旨在减轻与CAR阳性细胞注射相关的可能的副作用。
(A)根据本发明的CLL1特异性CAR原型，其不涉及用于分选或或清除细胞的表位标记序列：V1和v2分别表示抗体结合CLL1的VH或VL链，TM：跨膜结构域，L：接头，TM：跨膜结构域(优选CD8α跨膜结构域)，4-1BB：细胞内共刺激结构域，CD3ITAM：活化结构域。
(B)根据本发明的CLL1特异性CAR结构，其进一步包括至少一个插入在CAR的细胞外配体结合结构域中的表位，其中所述表位被插入在VH和VL链之间；所述表位毗邻不同的接头；
(C)：根据本发明的CLL1特异性CAR结构，其中两个表位被插入在CAR的细胞外配体结合结构域中，一个被插入在CAR的N末端和VH链之间，所述表位毗邻至少一个或两个接头；第二表位被插入在VH和VL链之间，所述第二表位也毗邻2至少一个或两个接头。这里示出的结构差别在于所使用的毗邻第二表位的接头。
(D)：根据本发明的CLL1特异性CAR结构，其中两个表位被插入在CAR的细胞外配体结合结构域中，一个被插入在VH和VL链之间；另一表位被插入在VL链和铰链之间，每个所述表位还毗邻至少一个或两个接头。这里示出的结构差别在于所使用的毗邻第一表位的接头。
(E)：根据本发明的CLL1特异性CAR结构，其中两个表位被插入在CAR的胞外结构域中，一个被插入在CAR的N末端和VH链之间，所述表位毗邻至少一个或两个接头；第二表位被插入在VL链和铰链之间，所述第二表位也毗邻这样的接头。
(F)：根据本发明的CLL1特异性CAR结构，其中三个表位被插入在CAR的胞外结构域中，一个被插入在CAR的N末端和VH链之间，所述表位毗邻至少一个或两个接头；第二表位被插入在VH和VL链之间，所述表位也毗邻这样的接头，以及第三表位被插入在VL链和铰链之间。这两种结构差别在于所使用的毗邻第二表位的接头。
(G)：根据本发明的CLL1特异性CAR结构，其中至少两个表位(优选CD20表位)被插入在在铰链与抗CLL1VH和VL链之间的细胞外配体结合结构域中。在第三示例性结构中，一个CD34表位被包括在两个CD20表位之间。可以考虑进一步的结构，其中CD34替代任何其它先前的CD20表位。
(H)：根据本发明的CLL1特异性CAR结构，其中至少两个表位被插入在细胞外配体结合结构域的末端。
表1：除scFv之外的不同scCAR组件的序列
Figure BDA0001358281550000051
Figure BDA0001358281550000061
表2：示例性抗CLL1VH和VL链的可变区以及它们各自的CDR的序列
Figure BDA0001358281550000062
Figure BDA0001358281550000071
Figure BDA0001358281550000081
Figure BDA0001358281550000091
Figure BDA0001358281550000101
表3：结构V-1的scCAR
Figure BDA0001358281550000102
Figure BDA0001358281550000111
表4：结构V-2的scCAR
Figure BDA0001358281550000112
Figure BDA0001358281550000121
表5:结构V-3的scCAR
Figure BDA0001358281550000122
表6：结构V-4的scCAR
Figure BDA0001358281550000123
Figure BDA0001358281550000131
表7：结构V-5的scCAR
Figure BDA0001358281550000132
Figure BDA0001358281550000141
表8:结构V-6的scCAR
Figure BDA0001358281550000142
Figure BDA0001358281550000151
具体实施方式
除非在此特别定义,所使用的所有技术和科学术语与在基因治疗、生物化学、遗传学、和分子生物学领域中的技术人员通常理解的含义相同。
类似或等同于本文描述的那些方法和材料的所有的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，其中本文描述了合适的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、和其它参考文献的全部内容以引用方式结合于本文。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，除非另有规定，材料、方法、和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
除非另有说明，本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、组DNA、和免疫学的常规技术，其是在本领域的技术范围内。这些技术在文献中得到充分解释。见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(FrederickM.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.,1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York),specifically,Vols.154and 155(Wu et al.eds.)and Vol.185,"Gene expression Technology"(D.Goeddel,ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；以及Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
本发明提供了：
1.一种CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)，至少包含：
-细胞外配体结合结构域抗CLL1，
-跨膜结构域，以及
-细胞质信号结构域。
2.根据实施方式1的CLL1特异性嵌合抗原受体，进一步包含共刺激结构域。
3.根据实施方式1的CLL1特异性嵌合抗原受体，进一步包含CD28或4-1BB共刺激结构域。
4.根据实施方式1至3中任一实施方式的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域是CD8α跨膜结构域。
5.根据实施方式1至4中任一实施方式的CLL1特异性嵌合抗原受体，进一步包含铰链。
6.根据实施方式1至5中任一实施方式的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中所述细胞质信号结构域是T细胞激活结构域。
7.根据实施方式1至6中任一实施方式的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中以单一多肽的形式来表达所述嵌合抗原受体。
8.根据实施方式1至7中任一实施方式的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中所述细胞外配体结合结构域是来自单克隆抗CLL1抗体。
9.根据实施方式8的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中细胞外配体结合结构域包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL结构域的CDR。
10.根据实施方式9的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中所述CDR选自SEQ ID NO.109至190。
11.根据实施方式1至10中任一实施方式的CLL1特异性scCAR，具有选自V1、V3或V5的多肽结构的一种，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，铰链，CD8α跨膜结构域，细胞质结构域(其包括CD3ζ信号结构域，以及4-1BB共刺激结构域)。
12.根据实施方式1至11中任一实施方式的CLL1特异性scCAR，其中所述结构V1包含FcγRIIIα铰链和CD8α跨膜结构域。
13.根据实施方式1至11中任一实施方式的CLL1特异性scCAR，其中所述结构V3包含CD8α铰链和CD8α跨膜结构域。
14.根据实施方式1至11中任一实施方式的CLL1特异性scCAR，其中所述结构V5包含IgG1铰链和CD8α跨膜结构域。
15.根据实施方式1至14中任一实施方式的CLL1特异性scCAR，其中所述VH和VL与选自SEQ ID NO.11至34的多肽序列具有至少80％一致性。
16.根据实施方式1至15中任一实施方式的CLL1特异性scCAR，其中来自4-1BB的共刺激结构域与SEQ ID NO.8具有至少80％一致性。
17.根据实施方式1至16中任一实施方式的CLL1特异性scCAR，其中所述CD3ζ信号结构域与SEQ ID NO.9具有至少80％一致性。
18.根据实施方式1至12或15至17中任一实施方式的CLL1特异性scCAR，其中所述FcγRIIIα铰链与SEQ ID NO.3具有至少80％一致性。
19.根据实施方式1至11、13或15至17中任一实施方式的CLL1特异性scCAR，其中所述CD8α铰链与SEQ ID NO.4具有至少80％一致性。
20.根据实施方式1至11或14至19中任一实施方式的CLL1特异性scCAR，其中所述IgG1铰链与SEQ ID NO.5具有至少80％一致性。
21.根据实施方式1至20中任一实施方式的CLL1特异性scCAR，其中所述CD8α跨膜结构域与SEQ ID NO.6具有至少80％一致性。
22.根据实施方式1至21中任一实施方式的CLL1特异性scCAR，进一步包含对于CLL1不具有特异性的另一细胞外配体结合结构域。
23.根据实施方式1至12、15至17或21至22中任一实施方式的结构V1的CLL1特异性scCAR，其包含多肽序列，上述多肽序列与SEQ ID NO.35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101或107具有至少80％一致性。
24.根据实施方式1至11、13、15至17或21至22中任一实施方式的结构V3的CLL1特异性scCAR，其包含多肽序列，其中上述多肽序列与SEQ ID NO.37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103或109具有至少80％一致性。
25.根据实施方式1至11、14至19或21至22中任一实施方式的结构V5的CLL1特异性scCAR，其包含多肽序列，其中上述多肽序列与SEQ ID NO.39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105或111具有至少80％一致性。
26.根据实施方式1至25中任一实施方式的CLL1特异性scCAR，进一步包含信号肽。
27.根据实施方式26的CLL1特异性scCAR，其中所述信号肽与SEQ ID NO.1或SEQID NO.2具有至少80％序列一致性。
28.根据实施方式1至27中任一实施方式的多肽，其中胞外结合结构域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个mAb-特异性表位。
29.根据实施方式1至28中任一实施方式的多肽，其中胞外结合结构域包含1、2、3或、4个mAb-特异性表位。
30.根据实施方式1至29中任一实施方式的多肽，其中胞外结合结构域包含2、3或、4个mAb-特异性表位。
31.根据实施方式1至30中任一实施方式的多肽，其中胞外结合结构域包含以下序列
V1-L1-V2-(L)x-表位1-(L)x-；
V1-L1-V2-(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-；
V1-L1-V2-(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x-；
(L)x-表位1-(L)x-V1-L1-V2；
(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-V1-L1-V2；
表位1-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x-V1-L1-V2；
(L)x-表位1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位2-(L)x；
(L)x-表位1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x-；
(L)x-表位1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x-表位4-(L)x-；
(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位3-(L)x-；
(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位3-(L)x-表位4-(L)x-；
V1-(L)x-表位1-(L)x-V2；
V1-(L)x-表位1-(L)x-V2-(L)x-表位2-(L)x；
V1-(L)x-表位1-(L)x-V2-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x；
V1-(L)x-表位1-(L)x-V2-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x-表位4-(L)x；
(L)x-表位1-(L)x-V1-(L)x-表位2-(L)x-V2；或
(L)x-表位1-(L)x-V1-(L)x-表位2-(L)x-V2-(L)x-表位3-(L)x；
其中，
V1是VL以及V2是VH或V1是VH以及V2是VL；
L1是适合于将VH链连接于VL链的接头；
L是包含甘氨酸和丝氨酸残基的接头，以及在胞外结合结构域中L的每次出现可以与在相同的胞外结合结构域中L的其它出现相同或不同，以及
x是0或1以及x的每次出现独立地选自其它；以及，
表位1、位2和表位3是mAb-特异性表位并且可以是相同或不同的。32.根据实施方式31的多肽，其中胞外结合结构域包含以下序列
V1-L1-V2-L-表位1；V1-L1-V2-L-表位1-L；V1-L1-V2-L-表位1-L-表位2；V1-L1-V2-L-表位1-L-表位2-L；V1-L1-V2-L-表位1-L-表位2-L-表位3；V1-L1-V2-L-表位1-L-表位2-L-表位3-L；V1-L1-V2-表位1；V1-L1-V2-表位1-L；V1-L1-V2-表位1-L-表位2；V1-L1-V2-表位1-L-表位2-L；V1-L1-V2-表位1-L-表位2-L-表位3；V1-L1-V2-表位1-L-表位2-L-表位3-L；表位1-V1-L1-V2；表位1-L-V1-L1-V2；L-表位1-V1-L1-V2；L-表位1-L-V1-L1-V2；表位1-L-表位2-V1-L1-V2；表位1-L-表位2-L-V1-L1-V2；L-表位1-L-表位2-V1-L1-V2；L-表位1-L-表位2-L-V1-L1-V2；表位1-L-表位2-L-表位3-V1-L1-V2；表位1-L-表位2-L-表位3-L-V1-L1-V2；L-表位1-L-表位2-L-表位3-V1-L1-V2；L-表位1-L-表位2-L-表位3-L-V1-L1-V2；V1-L-表位1-L-V2；L-表位1-L-V1-L-表位2-L-V2；V1-L-表位1-L-V2-L-表位2-L；V1-L-表位1-L-V2-L-表位2-L-表位3；V1-L-表位1-L-V2-L-表位2-表位3；V1-L-表位1-L-V2-L-表位2-L-表位3-表位4；L-表位1-L-V1-L-表位2-L-V2-L-表位3-L；表位1-L-V1-L-表位2-L-V2-L-表位3-L；L-表位1-L-V1-L-表位2-L-V2-L-表位3；L-表位1-L-V1-L1-V2-L-表位2-L；L-表位1-L-V1-L1-V2-L-表位2-L-表位3；L-表位1-L-V1-L1-V2-L-表位2-表位3；或表位1-L-V1-L1-V2-L-表位2-L-表位3-表位4
其中
V1是VL以及V2是VH或V1是VH以及V2是VL；
L1是适合于将VH链连接于VL链的任何接头；
L是包含甘氨酸和丝氨酸残基的接头，以及在胞外结合结构域中L的每次出现可以与在相同的胞外结合结构域中L的其它出现相同或不同，以及，
表位1、表位2和表位3是mAb-特异性表位并且可以是相同或不同的。
33.根据实施方式31或32的多肽，其中L1是包含甘氨酸和/或丝氨酸的接头。
34.根据实施方式33的多肽，其中L1是包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n或(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n的接头，其中n是1、2、3、4或5。
35.根据实施方式34的多肽，其中L1是包含氨基酸序列(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)的接头。
36.根据实施方式31至35中任一实施方式的多肽，其中L是包含甘氨酸和/或丝氨酸的接头。
37.根据实施方式36的多肽，其中L是接头，上述接头具有选自以下各项的氨基酸序列：SGG、GGS、SGGS、SSGGS、GGGG、SGGGG、GGGGS、SGGGGS、GGGGGS、SGGGGGS、SGGGGG、GSGGGGS、GGGGGGGS、SGGGGGGG、SGGGGGGGS、或SGGGGSGGGGS。
38.根据实施方式37的多肽，其中L是SGGGG、GGGGS或SGGGGS。
39.根据实施方式31至38中任一实施方式的多肽，其中表位1、表位2、表位3和表位4独立地选自被以下各项特异性地识别的mAb-特异性表位：替伊莫单抗、伊莫单抗、莫罗单抗-CD3、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、妥珠单抗、达克珠单抗、依库珠单抗、依法利珠单抗、吉姆单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、兰尼单抗、托珠单抗、曲妥单抗、维多珠单抗、阿达木单抗、贝利单抗、康纳单抗、地诺单抗、戈利木单抗、易普利单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、QBEND-10、阿仑单抗或优特克单抗。
40.根据实施方式31至38中任一实施方式的多肽，其中表位1、表位2、表位3和表位4独立地选自mAb-特异性表位，其具有SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 191、SEQ ID NO 192、SEQID NO 193、SEQ ID NO 194、SEQ ID NO 195、SEQ ID NO 195、SEQ ID NO 196、SEQ ID NO197、SEQ ID NO 198或SEQ ID NO 199的氨基酸序列。
41.根据实施方式31至40中任一实施方式的多肽，其中表位1是mAb-特异性表位，其具有SEQ ID NO 113的氨基酸序列。
42.根据实施方式31至41中任一实施方式的多肽，其中表位2是mAb-特异性表位，其具有SEQ ID NO 113的氨基酸序列。
43.根据实施方式31至42中任一实施方式的多肽，其中表位3是mAb-特异性表位，其具有SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 198或SEQ ID NO 199的氨基酸序列。
44.根据实施方式31至43中任一实施方式的多肽，其中表位4是mAb-特异性表位，其具有SEQ ID NO 113的氨基酸序列。
45.一种编码实施方式1至44中任一实施方式的嵌合抗原受体的多核苷酸。
46.一种表达载体，包含实施方式39的核酸。
47.一种工程化淋巴样免疫细胞，在细胞表面膜上表达实施方式1至44中任一实施方式的抗CLL1 CAR。
48.根据实施方式41的工程化淋巴样免疫细胞，衍生自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞。
49.根据实施方式47或48的工程化细胞，用于治疗。
50.根据实施方式41至43中任一实施方式的工程化细胞，用于治疗，其中患者是人。
51.根据实施方式47至50中任一实施方式的工程化细胞，用于治疗，其中病症是恶化前或恶性癌症病症，其特征在于CLL1-表达细胞。
52.根据实施方式47至51中任一实施方式的工程化细胞，用于治疗，其中病症是这样的病症，其特征在于过多的CLL1-表达细胞。
53.根据实施方式51至52中任一实施方式的工程化细胞，用于治疗，其中病症是血液癌症病症。
54.根据实施方式53的工程化细胞，用于治疗，其中血液癌症病症是白血病。
55.根据实施方式54的工程化细胞，用于治疗，其中白血病是急性髓性白血病(AML)。
56.根据实施方式47至55中任一实施方式的工程化细胞，其中在所述免疫细胞中TCR的表达被抑制。
57.根据实施方式47至55中任一实施方式的工程化细胞，其中在所述免疫细胞中，至少一种MHC蛋白，优选β2m或HLA，的表达被压制或抑制。
58.根据实施方式47至57中任一实施方式的工程化细胞，其中突变所述细胞以赋予对至少一种免疫抑制或化疗药物的抗性。
59.一种用于损害血液癌细胞的方法，包括使所述细胞接触有效量的实施方式47至58中任一实施方式的工程化细胞，以造成所述癌细胞的损害。
60.一种用于工程化免疫细胞的方法，包括：
(a)提供免疫细胞，
(b)在所述细胞的表面上表达实施方式1至44中任一实施方式的至少一种CLL1单链特异性嵌合抗原受体。
61.实施方式60的工程化免疫细胞的方法，包括：
(a)提供免疫细胞，
(b)将至少一种编码所述CLL1单链特异性嵌合抗原受体的多核苷酸引入所述细胞，
(c)将所述多核苷酸表达进入所述细胞。
62.实施方式61的工程化免疫细胞的方法，包括：
(a)提供免疫细胞，
(b)将至少一种编码所述抗CLL1单链特异性嵌合抗原受体的多核苷酸引入所述细胞，
(c)引入至少一种其它嵌合抗原受体，其对于CLL1不具有特异性。
63.一种用于治疗需要其的受试者的方法，包括：
(a)提供在表面上表达实施方式1至44中任一实施方式的抗CLL1单链特异性嵌合抗原受体的免疫细胞；
(b)将所述免疫细胞给予所述患者。
64.根据实施方式63的方法，其中所述免疫细胞由供体提供。
65.根据实施方式63的方法，其中所述免疫细胞由患者自己提供。
CLL1单链特异性嵌合抗原受体
本发明涉及CLL1特异性嵌合抗原受体，其包含特异性地针对CLL1抗原的一部分的胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域。
嵌合抗原受体(CAR)是指这样的分子，其结合针对在靶细胞上存在的组件的胞外结合结构域(例如对于所期望的抗原(例如，肿瘤抗原)的基于抗体的特异性)与免疫细胞受体组件，以生成嵌合蛋白，其将向着细胞免疫活性转导激活或抑制信号。
本发明更具体地涉及CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)，其至少包含：
-细胞外配体结合结构域抗CLL1，
-跨膜结构域，以及
-细胞质信号结构域。
优选地，根据本发明的CLL1特异性嵌合抗原受体进一步包含共刺激结构域，以及更优选CD28或4-1BB共刺激结构域，如例如由Jena,B.,G.Dotti,et al.(2010)所描述的。它还可以包含跨膜结构域，其可以是CD8α跨膜结构域，以及可选的铰链。
根据本发明的CAR的信号转导结构域或“细胞质信号结构域”负责在细胞外配体结合结构域结合于靶以后的细胞内信号，从而导致免疫细胞和免疫反应的激活或抑制。换句话说，信号转导结构域负责其中表达CAR的免疫细胞的正常效应子功能的至少一种的激活或失活。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。因而，术语“细胞质信号结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应子信号功能信号并引导细胞进行专门功能。
细胞质信号结构域(其优选来自参与信号转导途径的人蛋白)，确定是否抗CLL1CAR是阳性CAR(PCAR)或阴性CAR(NCAR)，其取决于信号的特性。分别地，当细胞外配体结合结构域结合于CLL1时，当信号结构域，如来自人TCR受体的CD3ζ，具有刺激免疫细胞的细胞免疫活性的效果时，CAR是PCAR。反过来，当信号结构域，如人免疫抑制受体CTLA-4和PD-1的信号结构域，具有减少细胞免疫活性的效果时，抗CLL1 CAR是NCAR或抑制性CAR(iCAR)(Federov et al.,Sci Transl Med.2013 Dec 11；5(215):215ra172)。用于抗CLL1 CAR的信号转导结构域的优选实例可以是T细胞受体和共受体的胞质序列，其协力作用以在抗原受体接合以后引发信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体，和具有相同的功能能力的任何合成序列。信号转导结构域包含两种不同类的胞质信号序列：引发抗原依赖性初级活化的那些胞质信号序列，和以抗原非依赖方式来提供次级或共刺激信号的那些胞质信号序列。初级胞质信号序列可以包含信号基序，其被称为ITAM的基于免疫受体酪氨酸的激活基序。ITAM是在各种受体的细胞质内尾部中发现的明确的信号基序，其充当syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。在本发明中使用的ITAM的实例可以包括，作为非限制性实例，衍生自以下各项的那些ITAM：TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在优选实施方式中，抗CLL1 CAR的信号转导结构域可以包含CD3ζ信号结构域，其具有与选自由SEQ ID NO:9组成的组的氨基酸序列至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列一致性的氨基酸序列。
共刺激分子是不同于抗原受体或它们的配体的细胞表面分子，其是有效的免疫反应所需要的。“共刺激配体”是指在抗原呈递细胞上的分子，其特异性地结合在T细胞上的关联共刺激分子，从而提供信号，除通过例如TCR/CD3复合物与借助于肽加载的MHC分子的结合所提供的原始信号之外，其介导T细胞反应，包括但不限于增殖激活、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及特异性地结合B7-H3的配体。除其他外，共刺激配体还包括特异性地结合在T细胞上存在的共刺激分子的抗体，如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、特异性地结合CD83的配体。“共刺激分子”是指在T细胞上的相关结合配偶体，其特异性地结合与共刺激配体，从而介导通过细胞的共刺激反应，如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。共刺激分子的实例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性地结合CD83的配体等。
在优选实施方式中，本发明的抗CLL1 CAR的共刺激结构域包含共刺激信号分子的一部分，其选自由4-1BB的片段(GenBank:AAA53133)和CD28(NP_006130.1)组成的组。尤其是，本发明的抗CLL1 CAR的信号转导结构域包含氨基酸序列，其包含与选自由SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％的序列一致性。
根据本发明的抗CLL1 CAR一般进一步包含跨膜结构域(TM)。适当的跨膜结构域的明显特征包括在细胞表面上表达的能力，在本发明中优选为免疫细胞，尤其是淋巴细胞或天然杀伤(NK)细胞，以及能够在一起相互作用以引导免疫细胞针对预定义靶细胞的细胞反应。跨膜结构域可以衍生自天然源或合成源。跨膜结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。作为非限制性实例，跨膜多肽可以是T细胞受体的亚基，如α、β、g或ζ、构成CD3复合物的多肽、IL2受体p55(α链)、p75(β链)或γ链、Fc受体的亚基链，尤其是Fcγ受体III或CD蛋白。可替换地，跨膜结构域可以是合成的并且可以包含主要为疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。在优选实施方式中，所述跨膜结构域衍生自人CD8α链(例如NP_001139345.1)。跨膜结构域可以进一步包含在所述胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链区。
这里所用的术语“铰链区”通常是指任何寡或多肽，其用来将跨膜结构域连接于胞外配体结合结构域。尤其是，铰链区用来为胞外配体结合结构域提供更大的柔性和可达性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸以及最优选25至50个氨基酸。铰链区可以衍生自全部或部分的自然发生分子，如衍生自全部或部分的CD8、CD4或CD28的胞外区，或衍生自全部或部分的抗体恒定区。可替换地，铰链区可以是合成序列，其对应于天然存在的铰链序列，或可以是完全合成铰链序列。在优选实施方式中，所述铰链结构域包含一部分的人CD8α链、FcγRIIIα受体或IgG1，其在本说明书中分别称为SEQ ID NO.3、SEQID NO.4和SEQ ID NO.5，或铰链多肽，其与这些多肽显示优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％的序列一致性。根据一种实施方式，铰链还可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链，例如，PD-1铰链、IgG4铰链。
根据优选实施方式，根据本发明的抗CLL1 CAR包含跨膜结构域，更特别选自CD8α和4-1BB，其显示与SEQ ID NO.6或7的多肽的一致性。
根据本发明的抗CLL1 CAR一般进一步包含跨膜结构域(TM)，更特别选自TM，其选自CD8α和4-1BB，以及甚至更特别地显示与SEQ ID NO.6或7的多肽的一致性。
在优选实施方式中，根据本发明的抗CLL1 CAR进一步包含来自具有SEQ ID NO.6的CD8α的TM结构域，或显示与SEQ ID NO.6至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。
在癌细胞中通常观测到靶抗原的下调或突变，从而产生抗原损失逃避突变(antigen-loss escape variant)。因而，为了抵消肿瘤逃逸和使免疫细胞对靶更具特异性，根据本发明的CLL1特异性抗CLL1 CAR可以包含另一个胞外配体结合结构域，以同时结合在靶中的不同元件，从而增强免疫细胞激活和功能。在一种实施方式中，可以串联地将胞外配体结合结构域放置在相同跨膜多肽上，并且可以可选地通过接头加以分开。在另一种实施方式中，可以将所述不同的胞外配体结合结构域放置在构成抗CLL1 CAR的不同的跨膜多肽上。在另一种实施方式中，本发明涉及抗CLL1 CAR的群体，其各自包含一个不同的细胞外配体结合结构域。尤其是，本发明涉及用于工程化免疫细胞的方法，包括提供免疫细胞并在所述细胞的表面上表达抗CLL1 CAR的群体，其各自包含不同的细胞外配体结合结构域。在另一特定实施方式中，本发明涉及用于工程化免疫细胞的方法，包括提供免疫细胞以及将编码多肽的多核苷酸引入所述细胞，其中上述多肽构成抗CLL1 CAR的群体，各自包含不同的细胞外配体结合结构域。抗CLL1 CAR的群体是指至少两种、三种、四种、五种、六种或更多种抗CLL1 CAR，各自包含不同的细胞外配体结合结构域。根据本发明的不同的细胞外配体结合结构域可以优选同时结合在靶中的不同元件，从而增强免疫细胞激活和功能。本发明还涉及分离的免疫细胞，上述分离的免疫细胞包含抗CLL1 CAR的群体，各自包含不同的细胞外配体结合结构域。
根据本发明的CLL1特异性嵌合抗原受体可以具有不同的架构，因为它们可以，例如，在单链嵌合蛋白(scCAR)的形式或以包括至少一个这样的嵌合蛋白的多种多肽(多链)的形式，加以表达。上述多链CAR结构披露于WO2014/039523，尤其披露于图2至4，以及从14至21页，其以引用方式结合于本文。
一般来说，抗CLL1 CAR包含融合于T细胞抗原受体复合物ζ链(scFvFc:ζ)的细胞内信号结构域的胞外单链抗体(scFv Fc)，当表达在T细胞中时，其具有基于单克隆抗体的特异性来重新定向抗原识别的能力。
本申请披露了针对CLL1抗原的多种抗CLL1单链CAR，其包含，作为非限制性实例，氨基酸序列：SEQ ID NO:35至112。
本发明的CLL1 CAR还可以是如前所述的“多链CAR”，其是指胞外结合结构域和信号结构域被优选定位在不同多肽链上，而共刺激结构域可以定位在相同的或第三多肽上。这样的多链CAR可以衍生自FcεRI(Ravetch et al,1989)，其中通过用胞外配体结合结构域如scFv来替代FcεRIα链的高亲和力IgE结合结构域，而FcεRIβ和/或γ链的N和/或C端尾则分别融合于信号转导结构域和共刺激结构域。细胞外配体结合结构域具有向着细胞靶重新定向T细胞特异性的作用，同时信号转导结构域激活或减小免疫细胞反应。衍生自来自FcεRI的α、β和γ多肽的不同的多肽是位于膜并列位置的跨膜多肽的事实为CAR提供了更柔性的结构，从而改善针对靶向分子的特异性并减小免疫细胞的背景激活，如在WO2014/039523中所描述的。
胞外配体结合结构域
如在本文中所使用的，术语“胞外配体结合结构域”被定义为能够结合配体的寡或多肽。优选地，上述结构域将能够与细胞表面分子相互作用。例如，可以选择胞外配体结合结构域以识别这样的配体，其作为在与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记物。它可以是例如衍生自配体、受体、人或小鼠抗体的结合结构域，或衍生自骆驼或软骨鱼的抗原识别结构域。
在优选实施方式中，所述胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含靶抗原特异性单克隆抗CLL1抗体的轻(VL)和重(VH)可变片段(通过柔性接头连接)。所述VL和VH优选选自在文献中称为SCO02-357、SC02-378和SC02-161的抗体，在WO2005/00894(申请人：Crucell Holland BV)中；M26、M31、G4、M22、M29、M2、M5、G12，在WO2013/169625(申请人：Cellerant Therapeutics)中；以及21.26、1075.7，在WO2009/051974(申请人：NuveloInc)中，以及更特别如包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL结构域的CDR，其中上述单克隆抗CLL1抗体选自下文所述的SEQ ID NO.119至190。
来自单克隆抗CLL1抗体的VH链的CDR序列可以选自GSISSSNWWS(SEQ ID NO 119)、WIGEIYHSGSPDY(SEQ ID NO 120)、KVSTGGFFDY(SEQ ID NO 121)、和GSISSSNWWS(SEQ ID NO122)、WIGEIYHSGSPNY(SEQ ID NO 123)、RSSSGGFFDY(SEQ ID NO 124)、和GSISSSNWWS(SEQID NO 125)、WIGEIYHSGSPNY(SEQ ID NO 126)、RQTTAGSFDY(SEQ ID NO 127)、和GYTFTSYFIH(SEQ ID NO 131)、WIGFINPYNDGSKY(SEQ ID NO 132)、TRDDGYYGYAMDY(SEQ IDNO 133)、和GYTFTSYVMH(SEQ ID NO 137)、WIGYINPYNDGTKY(SEQ ID NO 138)、ARPIYFDNDY(SEQ ID NO 139)、和QQNNYDPW(SEQ ID NO 143)、WIGPINPYNDGTI(SEQ ID NO 144)、ARTDDYDDYTMDY(SEQ ID NO 145)、和GYTFTRYWMH(SEQ ID NO 149)、WIGNIDPSDTETHY(SEQID NO 150)、AIYYGNPSYYAMDY(SEQ ID NO 151)、和GYIFTSYVMY(SEQ ID NO 155)、WIGYINPY(SEQ ID NO 156)、ARYYDYDYYFDY(SEQ ID NO 157)、和GYTFTSYFMH(SEQ ID NO 161)、WIGFINPYNDGTKY(SEQ ID NO 162)、TRDDGYYDYAMDY(SEQ ID NO 163)、和GFNIKDDYIH(SEQID NO 167)、WIGWIDPEKGDTAYA(SEQ ID NO 168)、TLTGRFDY(SEQ ID NO 169)、和GYTFPSSNIH(SEQ ID NO 173)、WIGVIYPGNGDTSY(SEQ ID NO 174)、AIYFVYNWHFDV(SEQ IDNO 175)、和GYTFTRYWMH(SEQ ID NO 179)、MIHPSSGSTSYNEKVK(SEQ ID NO 180)、RDGDYYYGTGDY(SEQ ID NO 181)、和GYSITSAYYWN(SEQ ID NO 185)、YISYDGRNNYNPSLKN(SEQID NO 186)和AKEGDYDVGNYYAMDY(SEQ ID NO 187)。
类似地，来自单克隆抗CLL1抗体的VL链的CDR序列可以选自：QSISSYLN(SEQ ID NO128)、LLIYAASSLQS(SEQ ID NO 129)、QQSYSTPP(SEQ ID NO 130)、和QELSGYLS(SEQ ID NO134)、RLIYAASTLDS(SEQ ID NO 135)、LQYAIYPY(SEQ ID NO 136)、和ESVDSYGNSFMH(SEQ IDNO 140)、LLIYLASNLES(SEQ ID NO 141)、QQNNYDPW(SEQ ID NO 142)、HDISNYLN(SEQ ID NO146)、LLIYYTSRLHS(SEQ ID NO 147)、QQGKTLLW(SEQ ID NO 148)、和QNLLNSGNQKKYLN(SEQID NO 152)、LLIYWASTRES(SEQ ID NO 153)、QNDYSYPF(SEQ ID NO 154)、和QDINKYIA(SEQID NO 158)、LLIHYTSTLQP(SEQ ID NO 159)、LQYDYLW(SEQ ID NO 160)、和QEISVYLS(SEQID NO 164)、RLIYAASTLDS(SEQ ID NO 165)、LQYASYPY(SEQ ID NO 166)、和QSLLYSSNQKNNLA(SEQ ID NO 170)、LLIYWASTRES(SEQ ID NO 171)、QQYYSYR(SEQ ID NO172)、和ESVDGYGDIFML(SEQ ID NO 176)、LLIYFASNLES(SEQ ID NO 177)、QQNNEDPY(SEQ IDNO 178)、和RASSSINYMH(SEQ ID NO 182)、PWIFATSNLAS(SEQ ID NO 183)、QQWRSDRALT(SEQID NO 184)、和RASSNVISSYVH(SEQ ID NO 188)、LWIYSTSNLAS(SEQ ID NO 189)和QQYSGYPLT(SEQ ID NO 190)。
优选通过包含序列SEQ ID NO.10的柔性接头将胞外结构域和跨膜结构域连接在一起。换句话说，所述抗CLL1 CAR优先包含胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含多肽序列，其显示与选自由SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:34组成的组的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％的一致性(见表2)。
如在本文中所使用的，术语"重组抗体"是指利用重组DNA技术所生成的抗体或抗体片段，如，例如，由噬菌体、酵母表达系统或哺乳动物细胞表达系统所表达的抗体或抗体片段。上述术语还应解释为指这样的抗体或抗体片段，其是通过编码抗体或抗体片段的DNA分子的合成所生成，以及上述DNA分子表达抗体或抗体片段蛋白、或指定抗体或抗体片段的氨基酸序列，其中已利用重组或合成DNA或氨基酸序列技术(其在本领域是可获得的和众所周知的)来获得DNA或氨基酸序列。
本发明披露了如上所述的CLL1特异性单链嵌合抗原受体(抗CLL1 scCAR)，其中所述细胞外配体结合结构域包含VH和VL链(其是人源化的)。
如在本文中所使用的，术语"人源化抗体"是指多肽包括人源化重链可变区和人源化轻链可变区。例如，多肽可以包括人抗体的轻和重链可变区的构架区(FR)，同时基本上保持亲代单克隆抗体的抗原结合特异性。人源化重链可变区和/或人源化轻链可变区是至少约87％人源化的，至少约90％人源化的，至少约95％人源化的，至少约98％人源化的，或至少约100％人源化的，排除互补决定区(CDR)。抗原结合多肽分子可以衍生自单克隆抗体供体(例如，小鼠单克隆抗体供体)并且可以包括来自单克隆抗体的CDR(例如，小鼠单克隆CDR)。
如在本文中所使用的，术语"单克隆抗体"是指通过杂交瘤或病毒转化的淋巴细胞的实验室生长的细胞克隆所产生的抗体，其是比天然抗体更加丰富和均匀的并且能够特异性地结合于在CLL1抗原上的单一位点。它们是单特异性抗体，其是由相同的免疫细胞所产生(其都是独特的亲代细胞的克隆)，与多克隆抗体相反(其产生自多种不同的免疫细胞)。单克隆抗体具有单价亲和力，因为它们结合于相同表位。应用于人源化的现行方法是依据Lefranc MP et al(Lefranc,MP,Ehrenmann F,Ginestoux C,Giudicelli V,Duroux P“Useof IMGT
Figure BDA0001358281550000291
databases and tools for antibody engineering and humanization”,Methods Mol Biol.2012；907:3-37)。在其中指出四个序列对比。
可以利用本领域已知的各种技术来产生人源化抗体，包括但不限于CDR移植(见，例如，欧洲专利号EP239,400；国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101、和5,585,089，其各自的全部内容以引用方式结合于本文)，覆盖或重铺(veneeringand resurfacing)(见，例如，欧洲专利号EP592,106和EP519,596；Padlan,1991,MolecularImmunology,28(4/5):489-498；Studnicka et al.,1994,Protein Engineering,7(6):805-814；以及Roguska et al.,1994,PNAS,91:969-973，其各自的全部内容以引用方式结合于本文)，链改组(chain shuffling)(见，例如，美国专利号5,565,332，其全部内容以引用方式结合于本文)，以及在例如美国专利申请公开号US2005/0042664、美国专利申请公开号US2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公开号WO9317105、Tan et al.,J.Immunol.,169:1119-25(2002)、Caldas et al.,Protein Eng.,13(5):353-60(2000)、Morea et al.,Methods,20(3):267-79(2000)、Baca et al.,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)、Roguska et al.,Protein Eng.,9(10):895-904(1996)、Couto et al.,Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995)、Couto et al.,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)、以及Pedersen et al.,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)(其各自的全部内容以引用方式结合于本文)中披露的技术。经常，将用来自CDR供体抗体的相应残基来取代在构架区中的构架残基，以改变，例如改善抗原结合。通过本领域中众所周知的方法来确定这些构架取代，例如，通过CDR和构架残基的相互作用的建模以确定对于抗原结合重要的构架残基以及序列比较以确定在特定位置处的不寻常的构架残基(见，例如，Queen等，美国专利号5,585,089；以及Riechmann et al.,1988,Nature,332:323，其全部内容以引用方式结合于本文)。
保守氨基酸取代是这样的氨基酸取代，其中用具有类似侧链的氨基酸残基来替代氨基酸残基。已经在本领域中定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括以下具有以下各项的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，可以用来自同样侧链家族的其它氨基酸残基来替代在本发明的抗CLL1 CAR内的一个或多个氨基酸残基，并且可以利用本文中所描述的功能测定来测试改变的抗CLL1 CAR结合CLL1的能力。
本发明的抗CLL1 CAR可选地包括自杀结构域，其旨在随后在其将在体内引起不良反应的情况下，清除(deplete，耗尽)具有CAR的免疫细胞。可以例如通过在CAR多肽序列中包括两个拷贝的CD20模拟表位，优选具有序列CPYSNPSLCS(SEQ ID NO.113)，来获得这样的自杀结构域。可以彼此连接所述两个拷贝的CD20模拟表位以及还通过接头连接到VL。通过使用可选接头，还可以将它们插入在抗CLL1 scFv和铰链(如CD8α)之间。可以通过抗CD20抗体，如利妥昔单抗，来结合CD20模拟表位(McLaughlin P,et al.1998)。因而本发明的抗CLL1 CAR可以包含VH和VL链，其能够结合于CLL1细胞表面抗原(可选人源化的)、接头L、自杀结构域、铰链或其一部分、跨膜结构域、共刺激结构域和刺激结构域。
在优选实施方式中，本发明披露了抗CLL1特异性单链嵌合抗原受体(“抗CLL1scCAR”或“scCAR”)，其具有选自V1至V6的多肽结构之一，如图2和表3-8所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL、铰链、跨膜结构域、包括信号结构域以及共刺激结构域的细胞质结构域。
在更优选的实施方式中，本发明披露了如上所述的CLL1特异性scCAR，其中所述结构V1、V3或V5包含FcγRIIIα、CD8α或IgG1铰链以及CD8α跨膜结构域。
在另一种更优选的实施方式中，所述CLL1特异性scCAR包含共刺激结构域4-1BB或CD28，或更优选4-1BB共刺激结构域。
本发明披露了如上所述的CLL1特异性scCAR，其中所述结构V1、V3或V5包含FcγRIIIα、CD8α或IgG1铰链以及4-1BB跨膜结构域。
本发明披露了如上所述的CLL1特异性scCAR，其中所述结构V1、V3或V5包含FcγRIIIα、CD8α或IgG1、4-1BB细胞质结构域以及CD8α跨膜结构域。
根据优选实施方式，本发明的抗CLL1 scCAR具有选自V1至V6的多肽结构之一，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，铰链，跨膜结构域，包括CD3ζ信号结构域以及共刺激结构域的细胞质结构域，所述CD3ζ信号结构域优选具有序列SEQ ID NO.9。
根据另一种优选实施方式，本发明的抗CLL1 scCAR具有选自V1至V6的多肽结构之一，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，铰链，跨膜结构域，包括CD3ζ信号结构域以及4-1BB共刺激结构域的细胞质结构域，所述4-1BB共刺激结构域优选具有序列SEQ ID NO.8。
本发明披露了抗CLL1 scCAR，其具有选自V1至V6的多肽结构之一，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，FcγRIIIα铰链，CD8α跨膜结构域(优选具有SEQ ID NO.6)，包括CD3ζ信号结构域以及共刺激结构域的细胞质结构域。
本发明披露了抗CLL1 scCAR，其具有选自V1至V6的多肽结构之一，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，CD8α铰链，CD8α跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.6)，包括CD3ζ信号结构域以及共刺激结构域的细胞质结构域。
本发明披露了抗CLL1 scCAR，其具有选自V1至V6的多肽结构之一，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，IgG1铰链、CD8α跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.6)，包括CD3ζ信号结构域以及共刺激结构域的细胞质结构域。
本发明披露了抗CLL1 scCAR，其具有选自V1至V6的多肽结构之一，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，FcγRIIIα铰链，4-1BB跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.7)，包括CD3ζ信号结构域以及共刺激结构域的细胞质结构域。
本发明披露了抗CLL1 scCAR，其具有选自V1至V6的多肽结构之一，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，CD8α铰链，4-1BB跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.7)，包括CD3ζ信号结构域以及共刺激结构域的细胞质结构域。
本发明披露了抗CLL1 scCAR，其具有选自V1至V6的多肽结构之一，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，IgG1铰链，4-1BB跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.7)，包括CD3ζ信号结构域以及共刺激结构域的细胞质结构域。
在特定方面，本发明披露了抗CLL1特异性scCAR，其具有V1多肽结构，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，FcγRIIIα铰链(其优选具有SEQ ID NO.3)，CD8α跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.6)，包括CD3ζ信号结构域(其优选具有SEQ ID NO.9)的细胞质结构域，以及4-1BB共刺激结构域(其优选具有SEQ ID NO.8)。
更具体地，本发明披露了抗CLL1特异性scCAR，其具有V1多肽结构，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，FcγRIIIα铰链(其优选具有SEQ ID NO.3)，CD8α跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.6)，包括CD3ζ信号结构域(其优选具有SEQ ID NO.9)的细胞质结构域，以及4-1BB共刺激结构域(其优选具有SEQ ID NO.8)，其中所述VH链与SEQ ID NO.11-13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33具有至少80％一致性，以及所述VL与SEQ ID NO.14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34具有至少80％一致性。
在另一特定方面，本发明披露了抗CLL1特异性scCAR，其具有V3多肽结构，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，CD8α铰链(其优选具有SEQ ID NO.4)，CD8α跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.6)，包括CD3ζ信号结构域(其优选具有SEQ ID NO.9)，以及4-1BB共刺激结构域(其优选具有SEQ ID NO.8)的细胞质结构域。
更具体地，本发明披露了抗CLL1特异性scCAR，其具有V3多肽结构，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，CD8α铰链(其优选具有SEQ ID NO.4)，CD8α跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.6)，包括CD3ζ信号结构域(其优选具有SEQ ID NO.9)，以及4-1BB共刺激结构域(其优选具有SEQ ID NO.8)的细胞质结构域，其中所述VH链与SEQ ID NO.11-13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33具有至少80％一致性，以及所述VL链与SEQ ID NO.14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34具有至少80％一致性。
在又一特定方面，本发明披露了抗CLL1特异性scCAR，其具有V5多肽结构，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，IgG1铰链(其优选具有SEQ ID NO.5)，CD8α跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.6)，包括CD3ζ信号结构域(其优选具有SEQ ID NO.9)的细胞质结构域，以及4-1BB共刺激结构域(其优选具有SEQ ID NO.8)。
更具体地，本发明披露了抗CLL1特异性scCAR，其V5多肽结构，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，IgG1铰链(其优选具有SEQ ID NO.5)，CD8α跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.6)，包括CD3ζ信号结构域(其优选具有SEQ ID NO.9)的细胞质结构域，以及4-1BB共刺激结构域(其优选具有SEQ IDNO.8)，其中所述VH链与SEQ ID NO.11-13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33具有至少80％一致性，以及所述VL链与SEQ ID NO.14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34具有至少80％一致性。
本发明披露了具有V1多肽结构的抗CLL1特异性scCAR，如图2所示，所述多肽与SEQID NO.35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101或107具有至少80％一致性。
尤其是，所述抗CLL1特异性scCAR具有V1多肽结构，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，FcγRIIIα铰链(其优选具有SEQ ID NO.3)，CD8α跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.6)，包括CD3ζ信号结构域(其优选具有SEQ ID NO.9)，以及4-1BB共刺激结构域(其优选具有SEQ ID NO.8)的细胞质结构域，其中所述VH链与SEQ ID NO.11、3、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33具有至少80％一致性，以及所述VL与SEQ ID NO.14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34具有至少80％一致性，以及其中所述多肽与SEQ ID NO.35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101或107具有至少80％一致性。
本发明披露了结构V3的抗CLL1特异性scCAR，如图2所示，所述多肽与SEQ IDNO.37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103或109具有至少80％一致性。
更具体地，本发明披露了抗CLL1特异性scCAR，其具有V3多肽结构，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，CD8α铰链(其优选具有SEQ ID NO.4)，CD8α跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.6)，包括CD3ζ信号结构域(其优选具有SEQ ID NO.9)的细胞质结构域，以及4-1BB共刺激结构域(其优选具有SEQ IDNO.8)，其中所述VH链与SEQ ID NO.11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33具有至少80％一致性以及所述VL链与SEQ ID NO.14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34具有至少80％一致性，以及其中所述多肽与SEQ ID NO.37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103或109具有至少80％一致性。
本发明披露了结构V5的抗CLL1特异性scCAR，如图2所示，所述多肽与SEQ IDNO.39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105或111具有至少80％一致性。
更具体地，本发明披露了抗CLL1特异性scCAR，其具有V5多肽结构，如图2所示，所述结构包含细胞外配体结合结构域，其包含来自单克隆抗CLL1抗体的VH和VL，IgG1铰链(其优选具有SEQ ID NO.5)，CD8α跨膜结构域(其优选具有SEQ ID NO.6)，包括CD3ζ信号结构域(其优选具有SEQ ID NO.9)的细胞质结构域，以及4-1BB共刺激结构域(其优选具有SEQ IDNO.8)，其中所述VH链与SEQ ID NO.11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33具有至少80％一致性以及所述VL链与SEQ ID NO.14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34具有至少80％一致性，以及其中所述多肽与SEQ ID NO.39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105或111具有至少80％一致性。
本发明更特别地披露了CLL1单链特异性嵌合抗原受体(scCAR)，其具有多肽结构V1、V3或V5，如图2所示，以及上文描述的所述结构包含来自单克隆抗CLL1抗体的细胞外配体结合结构域VH，其包含以下CDR序列：GSISSSNWWS(SEQ ID NO 119)、WIGEIYHSGSPDY(SEQID NO 120)、KVSTGGFFDY(SEQ ID NO 121)、和GSISSSNWWS(SEQ ID NO 122)、WIGEIYHSGSPNY(SEQ ID NO 123)、RSSSGGFFDY(SEQ ID NO 124)、和GSISSSNWWS(SEQ ID NO125)、WIGEIYHSGSPNY(SEQ ID NO 126)、RQTTAGSFDY(SEQ ID NO 127)、和GYTFTSYFIH(SEQID NO 131)、WIGFINPYNDGSKY(SEQ ID NO 132)、TRDDGYYGYAMDY(SEQ ID NO 133)、和GYTFTSYVMH(SEQ ID NO 137)、WIGYINPYNDGTKY(SEQ ID NO 138)、ARPIYFDNDY(SEQ ID NO139)、和QQNNYDPW(SEQ ID NO 143)、WIGPINPYNDGTI(SEQ ID NO 144)、ARTDDYDDYTMDY(SEQID NO 145)、和GYTFTRYWMH(SEQ ID NO 149)、WIGNIDPSDTETHY(SEQ ID NO 150)、AIYYGNPSYYAMDY(SEQ ID NO 151)、和GYIFTSYVMY(SEQ ID NO 155)、WIGYINPY(SEQ ID NO156)、ARYYDYDYYFDY(SEQ ID NO 157)、和GYTFTSYFMH(SEQ ID NO 161)、WIGFINPYNDGTKY(SEQ ID NO 162)、TRDDGYYDYAMDY(SEQ ID NO 163)、和GFNIKDDYIH(SEQ ID NO 167)、WIGWIDPEKGDTAYA(SEQ ID NO 168)、TLTGRFDY(SEQ ID NO 169)、和GYTFPSSNIH(SEQ ID NO173)、WIGVIYPGNGDTSY(SEQ ID NO 174)、AIYFVYNWHFDV(SEQ ID NO 175)、和GYTFTRYWMH(SEQ ID NO 179)、MIHPSSGSTSYNEKVK(SEQ ID NO 180)、RDGDYYYGTGDY(SEQ ID NO 181)、和GYSITSAYYWN(SEQ ID NO 185)、YISYDGRNNYNPSLKN(SEQ ID NO 186)、AKEGDYDVGNYYAMDY(SEQ ID NO 187)、以及优选地
细胞外配体结合结构域VL，其来自单克隆抗CLL1抗体，其包含以下CDR序列：QSISSYLN(SEQ ID NO 128)、LLIYAASSLQS(SEQ ID NO 129)、QQSYSTPP(SEQ ID NO 130)、和QELSGYLS(SEQ ID NO 134)、RLIYAASTLDS(SEQ ID NO 135)、LQYAIYPY(SEQ ID NO 136)、和ESVDSYGNSFMH(SEQ ID NO 140)、LLIYLASNLES(SEQ ID NO 141)、QQNNYDPW(SEQ ID NO142)、HDISNYLN(SEQ ID NO 146)、LLIYYTSRLHS(SEQ ID NO 147)、QQGKTLLW(SEQ ID NO148)、和QNLLNSGNQKKYLN(SEQ ID NO 152)、LLIYWASTRES(SEQ ID NO 153)、QNDYSYPF(SEQID NO 154)、和QDINKYIA(SEQ ID NO 158)、LLIHYTSTLQP(SEQ ID NO 159)、LQYDYLW(SEQID NO 160)、和QEISVYLS(SEQ ID NO 164)、RLIYAASTLDS(SEQ ID NO 165)、LQYASYPY(SEQID NO 166)、和QSLLYSSNQKNNLA(SEQ ID NO 170)、LLIYWASTRES(SEQ ID NO 171)、QQYYSYR(SEQ ID NO 172)、和ESVDGYGDIFML(SEQ ID NO 176)、LLIYFASNLES(SEQ ID NO 177)、QQNNEDPY(SEQ ID NO 178)、和RASSSINYMH(SEQ ID NO 182)、PWIFATSNLAS(SEQ ID NO183)、QQWRSDRALT(SEQ ID NO 184)、和RASSNVISSYVH(SEQ ID NO 188)、LWIYSTSNLAS(SEQID NO 189)、QQYSGYPLT(SEQ ID NO 190)，
以及其中所述结构通常包含：
铰链、跨膜结构域和细胞质结构域，其包括CD3ζ信号结构域和来自4-1BB的共刺激结构域。
本发明披露了如上所述的抗CLL1单链特异性嵌合抗原受体(抗CLL1scCAR)，其中所述细胞外配体结合结构域VH和VL是人源化的。
本发明披露了如上所述的CLL1单链特异性嵌合抗原受体(scCAR)，其中来自单克隆抗CLL1抗体的所述细胞外配体结合结构域VH包含以下序列的至少一种：
-QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSPNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYSSSGGFFDYWGQGTLVTVSS(对应于SC02-357)，
-QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSPNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSSSGGFFDYWGQGTLVTVSS(对应于SC02-378)，
-QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSPNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARQTTAGSFDYWGQGTLVTVSS(对应于SC02-161)，
-EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYFIHWVKQKPGQGLEWIGFINPYNDGSKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCTRDDGYYGYAMDYWGQGTSVTVSS(对应于M26)，
-EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDTSSSTAYMELNSLTSEDSAVYFCARPIYFDNDYFDYWGQGTTLKVSS(对应于M31)，
-EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHEKNLEWIGPINPYNDGTIYNPNFKGKATLTVDKASSTAYMELLSLTSDDPAVYYCARTDDYDDYTMDYWGQGTSVTVSS(对应于G4)，
-QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTRYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIDPSDTETHYNQQFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAIYYGNPSYYAMDYWGQGTSVTVSS(对应于M22)，
-EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYIFTSYVMYWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARYYDYDYYFDYWGQGTTLTVSS(对应于M29)，
-EVQLRQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYFMHWVKQKPGQGLEWIGFINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCTRDDGYYDYAMDYWGQGTSVTVSS(对应于M2)，
-EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYIHWVKQRPEQGLEWIGWIDPEKGDTAYASKFQDKATITSDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTLTGRFDYWGQGTTLTVSS(对应于M5)，
-QVQLQQPGAELVKPGASMKMSCKASGYTFPSSNIHWLKQTPGQGLEWIGVIYPGNGDTSYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAIYFCARVYNWHFDVWGAGTTVTVSS(对应于G12)，
-QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYTFTRYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPSSGSTSYNEKVKNKATLTVDRSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDGDYYYGTGDYWGQGTTLTVSS(对应于21.26)，
-DIQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSAYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGRNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCAKEGDYDVGNYYAMDYWGQGTSVTVSS(对应于1075.7)，
以及来自单克隆抗CLL1抗体的VL包含以下序列的至少一种：
-DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIK(对应于SC02-357，SC02-378和SC02161)，
-DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRATQELSGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGNRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYAIYPYTFGGGTKLEIKR(对应于M26)，
-TIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNYDPWTFGGGTKLEIK(对应于M31)，
-EIQMTQTPSSLSASLGDRVTISCRASHDISNYLNWYQQKPDGTLKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGKTLLWTFGGGTKLEIK(对应于G4)，
-DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQNLLNSGNQKKYLNWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCQNDYSYPFTFGAGTKLELK(对应于M22)，
-DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDYLWTFGGGTKLEIK(对应于M29)，
-DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISVYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPERFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPYTFGGGTKLEIKR(对应于M2)，
-DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNNLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIK(对应于M5)，
-NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDGYGDIFMLWYQQKPGQPPKLLIYFASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKLEIKR(对应于G12)，
-QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSINYMHWYQQKPGSSPKPWIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWRSDRALTFGAGTKLEL(对应于21.26)，
-DIQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSAYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGRNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCAKEGDYDVGNYYAMDYWGQGTSVTVSS(对应于1075.7)
本发明还披露了如前面所定义的CLL1特异性scCAR，进一步包含另一个细胞外配体结合结构域，其对于CLL1不是特异性的，如CD33抗原、CD44抗原、CD47抗原、CD123抗原、CD96抗原以及T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3)。
本发明披露了如上所述的CLL1特异性scCAR，进一步包含信号肽，其优选具有SEQID NO 1或SEQ ID NO 2，以帮助CAR多肽到达免疫细胞的膜。
本发明披露了如上所述的CLL1特异性scCAR，其中将SEQ ID NO 10的接头插入在VH和VL之间。
多核苷酸，载体
本发明还涉及多核苷酸和载体，允许异源表达本发明的抗CLL1 CAR进入细胞，从而编码以前已经详述的多肽序列。
可以在表达盒或表达载体中包括多核苷酸(例如，用于引入细菌宿主细胞的质粒，或病毒载体如用于转染昆虫宿主细胞的杆状病毒载体，或质粒或病毒载体如用于转染哺乳动物宿主细胞的慢病毒)。
在特定实施方式中，可以将不同的核酸序列包括在一种多核苷酸或包含核酸序列的载体中，其中上述核酸序列编码核糖体跳过序列(ribosomal skip sequence)如编码2A肽的序列。2A肽(其在微小RNA病毒的口疮病毒(Aphthovirus)亚类被确定)，引起核糖体从一个密码子"跳跃"到下一个密码子而没有在由密码子编码的两个氨基酸之间形成肽键(见(Donnelly and Elliott 2001；Atkins,Wills et al.2007；Doronina,Wu et al.2008))。"密码子"是指在mRNA上(或在DNA分子的有义链上)的三个核苷酸，其通过核糖体被翻译成一个氨基酸残基。因而，当多肽由在框中的2A寡肽序列分开时，两个多肽可以由在mRNA内的单一的连续开放阅读框合成。这样的核糖体跳跃机制是本领域众所周知的并且已知被多种载体用于表达由单信使RNA编码的多种蛋白质。
为了将跨膜多肽导入宿主细胞的分泌途径，在多核苷酸序列或载体序列中提供分泌信号序列(还称为前导序列、前原序列(prepro sequence)或前序列(pre sequence))。将分泌信号序列可操作地连接到跨膜核酸序列，即，在正确的阅读框中连接两个序列并加以定位以将新合成的多肽导入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常定位于编码感兴趣的多肽的核酸序列的5'，虽然某些分泌信号序列可以位于在感兴趣的核酸序列中的别处(见，例如，Welch等,美国专利号5,037,743；Holland等,美国专利号5,143,830)。在优选实施方式中，信号肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和2或与SEQ ID NO:1和/或2具有至少90％、95％、97％或99％序列一致性。
本领域技术人员将明了，鉴于遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中显著的序列变化是可能的。优选地，对本发明的核酸序列进行密码子优化，用于在哺乳动物细胞中表达，优选用于在人细胞中表达。密码子优化是指在感兴趣的序列中在给定物种的高度表达的基因中一般罕见的密码子与在上述物种的高度表达的基因中一般频繁的密码子的交换，编码氨基酸的这样的密码子作为被交换的密码子。
递送方法
本发明包括在免疫细胞中表达本文中所描述的抗CLL1嵌合抗原受体(CAR)的不同的方式。
用于将多核苷酸构建体引入细胞的方法在本领域中是已知的并且包括，作为非限制性实例，稳定的转化方法，其中将编码所述CAR的多核苷酸构建体整合进入细胞的基因组，瞬时转化方法，其中没有将多核苷酸构建体整合进入细胞的基因组，以及病毒介导方法。
可以通过例如，重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等，将所述多核苷酸引入细胞。例如，瞬时转化方法包括例如微注射、电穿孔或粒子轰击、细胞融合。鉴于被表达在细胞中，可以将所述多核苷酸包括在载体中，更特别是质粒或病毒。所述质粒载体可以包含选择标记，其提供接收所述载体的细胞的识别和/或选择。
在一种载体中可以包括不同的转基因。所述载体可以包含编码核糖体跳过序列的核酸序列如编码2A肽的序列。2A肽(其被确定在微小RNA病毒的口疮病毒亚类中)，引起核糖体从一个密码子"跳跃"到下一个密码子，而没有在由密码子编码的两个氨基酸之间形成肽键(见Donnelly et al.,J.of General Virology 82:1013-1025(2001)；Donnelly etal.,J.of Gen.Virology78:13-21(1997)；Doronina et al.,Mol.And.Cell.Biology 28(13):4227-4239(2008)；Atkins et al.,RNA 13:803-810(2007))。
"密码子"是指在mRNA上(或在DNA分子的有义链上)的三个核苷酸，借助于核糖体，其被翻译成一个氨基酸残基。因而，当多肽被在框中的2A寡肽序列所分开时，两个多肽可以由在mRNA内的单一的连续开放阅读框合成。这样的核糖体跳跃机制是本领域众所周知的并且已知被多种载体用于表达由单信使RNA编码的多种蛋白质。
在本发明的更优选的实施方式中，根据本发明的编码多肽的多核苷酸可以是mRNA，例如通过电穿孔，其被直接引入细胞。本发明人确定了用于在T细胞中的mRNA电穿孔的最佳条件。本发明人使用了cytoPulse技术，通过使用脉冲电场，其允许瞬时渗透活细胞，用于将材料递送进入细胞。基于PulseAgile(BTX Havard Apparatus,84October HillRoad,Holliston,MA 01746,美国)电穿孔波形的使用，上述技术会给予脉冲持续时间、强度以及脉冲之间的间隔的精准控制(美国专利6,010,613和国际PCT申请WO2004083379)。可以修改所有这些参数以达到获得高转染效率且最低死亡率的最佳条件。基本上，第一高电场脉冲允许孔形成，而随后的较低电场脉冲则允许将多核苷酸移动进入细胞。
上述不同的方法涉及将scCAR引入细胞。作为非限制性实例，可以引入所述scCAR，作为由一种质粒载体编码的转基因。所述质粒载体还可以含有选择标记，其提供接收所述载体的细胞的识别和/或选择。
由于将编码所述多肽的多核苷酸引入细胞的结果，可以在细胞中原位合成多肽。可替换地，可以在细胞外产生所述多肽并然后引入其中。用于将多核苷酸构建体引入细胞的方法在本领域中是已知的并且包括，作为非限制性实例，稳定转化方法，其中将多核苷酸构建体整合进入细胞的基因组，瞬时转化方法，其中不将多核苷酸构建体整合进入细胞的基因组，以及病毒介导方法。可以通过例如，重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等，将所述多核苷酸引入细胞。例如，瞬时转化方法包括例如微注射、电穿孔或粒子轰击。鉴于被表达在细胞中，可以将所述多核苷酸包括在载体中，更特别地质粒或病毒。
T细胞的激活和扩增
不管在T细胞的基因修饰之前或以后，即使独立于抗原结合机制来激活和增殖本发明的基因修饰的免疫细胞，一般地可以利用以下方法来进一步激活和扩增免疫细胞，特别是本发明的T细胞，上述方法如例如描述于美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开号20060121005。可以体外或体内扩增T细胞。
通常，通过接触刺激在T细胞的表面上的CD3TCR复合物和共刺激分子的试剂来产生针对T细胞的激活信号，以扩增本发明的T细胞。例如，化学品如钙离子载体A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)、或有丝分裂凝集素像植物血凝素(PHA)可以用来产生针对T细胞的激活信号。
作为非限制性实例，可以如通过接触抗CD3抗体或其抗原结合片段，或固定在表面上的抗CD2抗体，或通过接触蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓虫素(bryostatin))连同钙离子载体一起，来体外刺激T细胞群体。对于在T细胞的表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以，在适合于刺激T细胞的增殖的条件下，使T细胞的群体接触抗CD3抗体和抗CD28抗体。适合于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640，或X-vivo 5，(Lonza))，其可以含有增殖和活力所必要的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、和TNF-或本领域技术人员已知的用于细胞的生长的任何其他添加剂。用于细胞的生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、血浆蛋白(plasmanate)、和还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640，A1M-V，DMEM，MEM，a-MEM，F-12，X-Vivo 1，和X-Vivo 20，Optimizer，具有添加的氨基酸，丙酮酸钠，和维生素，无血清的或补充有适量的血清(或血浆)或固定组的激素，和/或一定量的足够用于T细胞的生长和扩增的细胞因子。仅在实验培养物中但不在待注入受试者的细胞的培养物中包括抗生素，例如，青霉素和链霉素。将靶细胞维持在支持生长所必要的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。已暴露于不同的刺激时间的T细胞可表现出不同的特性。
在另一特定实施方式中，可以通过连同组织或细胞一起的共培养来扩增所述细胞。还可以体内扩增所述细胞，例如在将所述细胞给予受试者以后在受试者的血液中。
工程化免疫细胞
根据本发明的“细胞”通常是指造血起源的细胞，其功能上参与先天性和/或适应性免疫反应的起始和/或执行。根据本发明的细胞优选是分离的免疫细胞，以及更优选获自供体的T细胞。根据本发明的所述免疫细胞还可以衍生自干细胞。干细胞可以是成体干细胞、非人胚胎干细胞，更特别选自非人干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。代表性的人细胞是CD34+细胞。所述分离的细胞还可以是树突状细胞、杀伤树突状细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞或T细胞，其选自由炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞组成的组。在另一种实施方式中，所述细胞可以衍生自由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。在本发明的细胞的扩增和基因修饰以前，可以通过各种非限制性方法从受试者获得细胞源。细胞可以获自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织、和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可以使用本领域技术人员可用的和已知的任何数目的T细胞系。
在另一种实施方式中，所述细胞可以源自健康供体、源自诊断为癌症的患者或源自诊断为感染的患者。在另一种实施方式中，所述细胞是呈现不同的表型特征的细胞的混合群体的一部分。在本发明的范围中，还包括获自根据先前描述的方法转化的T细胞的细胞系。耐免疫抑制治疗并且通过以前的方法容易获得的修饰细胞被包括在本发明的范围中。
作为优选实施方式，本发明提供了T细胞或原代T细胞的群体，其具有如上所述的CLL1 CAR，其并不表达功能性TCR和对于CLL1阳性细胞的反应性，用于它们同种异体移植进入患者。
作为更优选的实施方式，本发明提供了T细胞或T细胞的群体，其具有CLL1 scCAR以及对于如上所述的CLL1阳性细胞的反应性，其并不表达功能性TCR并且耐所选药物，用于它们同种异体移植进入用所述所选药物加以治疗的患者。本发明包括制备用于免疫治疗的工程化免疫细胞的方法，包括根据如先前在通过引用并入本文的WO2014/130635、WO2013176916、WO2013176915中所描述的转化方法，将编码CLL1 CAR的多核苷酸或载体离体引入所述免疫细胞。
在优选实施方式中，鉴于被稳定整合进入细胞基因组，通过逆转录病毒载体，将所述多核苷酸引入免疫细胞。
工程化具有本发明的CAR的免疫细胞的方法
本发明还旨在产生具有抗CLL1 CAR的免疫细胞，其是较少或无同种异体反应的，其可以用于同种异体治疗(即具有降低的诱导移植物抗宿主反应的风险)和/或使得耐各种护理治疗的标准)。
如在本说明书中进一步描述的，所述方法可以进一步包括通过使用至少一种核酸内切酶来基因修饰所述免疫细胞的步骤。
术语“核酸内切酶”是指任何野生型或变体酶，其能够催化在DNA或RNA分子，优选DNA分子内核酸之间的键的水解(切割)。核酸内切酶并不切割DNA或RNA分子而不管它的序列如何，但识别和切割在特定多核苷酸序列处的DNA或RNA分子，其进一步称为“靶序列”或“靶位点”。当通常具有长度大于12个碱基对(bp)，更优选14-55bp，的多核苷酸识别位点时，核酸内切酶可以被归类为稀切核酸内切酶(rare-cutting endonuclease)。
优选地，根据本发明的方法涉及稀切核酸内切酶。稀切核酸内切酶可以例如是归巢核酸内切酶(homing endonuclease)(Paques and Duchateau2007)，嵌合锌指核酸酶(ZFN)，其来自工程化锌指结构域与限制酶的催化结构域的融合，如FokI(Porteus andCarroll 2005)，TALE核酸酶，Cas9核酸内切酶，其来自如下所述的CRISPR系统(Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yanget al.2013)或化学核酸内切酶(Eisenschmidt,Lanio et al.2005；Arimondo,Thomas etal.2006)。在化学核酸内切酶中，化学或肽切割子(cleaver)结合于核酸的聚合物或结合于识别特异性靶序列的另一DNA，从而将切割活性靶向特异性序列。化学核酸内切酶还包括合成核酸酶如正菲咯啉的结合物、DNA切割分子、和形成三链体的寡核苷酸(triplex-formingoligonucleotide)(TFO)，其已知结合特异性DNA序列(Kalish and Glazer 2005)。稀切核酸内切酶可以用于失活在基因座处的基因或用来整合转基因，其中通过同源重组(HR)，即通过在基因座处诱导DNA双链断裂(DSB)以及通过基因修复机制在此基因座处插入外源性DNA(Perrin,Buckle et al.1993；Rouet,Smih et al.1994；Choulika,Perrin etal.1995；Pingoud and Silva 2007)。
“TALE核酸酶”(TALEN)是指融合蛋白，其由核酸结合结构域(其通常衍生自转录激活物样效应子(TALE))，和一个核酸酶催化结构域组成，以切割核酸靶序列。催化结构域优选是核酸酶结构域以及更优选具有核酸内切酶活性的结构域，如例如I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。在特定实施方式中，TALE结构域可以融合至大范围核酸酶(meganuclease)如例如I-CreI和I-OnuI或其功能性变体。在更优选的实施方式中，所述核酸酶是单体TALE核酸酶。单体TALE核酸酶是这样的TALE核酸酶，其不需要用于特异性识别和切割的二聚化，如工程化TAL重复序列与在WO2012138927中描述的I-TevI的催化结构域的融合。转录激活物样效应子(TALE)是来自细菌菌种黄单胞菌属的蛋白质，其包含多个重复序列，其中每个重复序列包含在位置12和13(RVD)处的二残基，其对于核酸靶向序列的每个核苷酸碱基是特异的。具有类似的模块碱基每碱基核酸结合性能(MBBBD)的结合结构域还可以衍生自由本申请人在不同细菌菌种中最近发现的新模块蛋白。新模块蛋白(modular protein)具有以下优点：显示比TAL重复序列更大的序列变异性。优选地，与不同核苷酸的识别有关的RVD是用于识别C的HD，用于识别T的NG，用于识别A的NI，用于识别G或A的NN，用于识别A、C、G或T的NS，用于识别T的HG，用于识别T的IG，用于识别G的NK，用于识别C的HA，用于识别C的ND，用于识别C的HI，用于识别G的HN，用于识别G的NA，用于识别G或A的SN以及用于识别T的YG，用于识别A的TL，用于识别A或G的VT以及用于识别A的SW。在另一种实施方式中，可以针对其它氨基酸残基来突变关键的氨基酸12和13，以调节它们对于核苷酸A、T、C和G的特异性，以及尤其是增强这种特异性。TALE核酸酶已被描述并用来刺激基因靶向和基因修饰(Boch,Scholze etal.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010；Li,Huang etal.2011)。工程化TAL核酸酶可以以商品名TALENTM(Cellectis,8rue de la Croix Jarry,75013巴黎,法国)来获得并且可以订购自制造商，如Life Technologies(Carlsbad,加利福尼亚,美国)。
识别和切割靶序列的优选TALE核酸酶描述于PCT/EP2014/075317。尤其是，可以进一步将另外的催化结构域引入具有所述稀切核酸内切酶的细胞来增加诱变以增强它们失活靶基因的能力。更特别地，所述另外的催化结构域是DNA末端加工酶。DNA末端加工酶的非限制性实例包括5-3’核酸外切酶、3-5’核酸外切酶、5-3’碱性核酸外切酶、5’翻板核酸内切酶(5’flap endonuclease)、解旋酶、磷酸酶(hosphatase)、水解酶和不依赖模板的DNA聚合酶。上述催化结构域的非限制性实例包含蛋白质结构域或蛋白质结构域的催化活性衍生物，其选自由hExoI(EXO1_人)、酵母ExoI(EXO1_酵母)、大肠杆菌ExoI、人TREX2、小鼠TREX1、人TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、TdT(末端脱氧核苷酸基转移酶)人DNA2、酵母DNA2(DNA2_酵母)组成的组。在优选实施方式中，所述另外的催化结构域具有3’-5’-核酸外切酶活性，以及在更优选的实施方式中，所述另外的催化结构域是TREX，更优选TREX2催化结构域(WO2012/058458)。在另一优选实施方式中，所述催化结构域是由单链TREX2多肽编码的。可选地通过肽接头，所述另外的催化结构域可以融合至根据本发明的核酸酶融合蛋白或嵌合蛋白。
“Cas9核酸内切酶”是指任何基因组工程化工具，其是基于来自II型原核CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats)适应性免疫系统(参见综述(Sorek,Lawrence et al.2013))的RNA引导的Cas9核酸酶(Gasiunas,Barrangou etal.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yang et al.2013)所开发。CRISPR相关(Cas)系统在细菌中首次被发现并作为针对外来DNA(病毒或质粒)的防御起作用。CRISPR介导的基因组工程化首先通过经常旁侧有短序列基序(其被称为原间隔相邻基序(PAM))的靶序列的选择来进行。在靶序列选择以后，工程化与此靶序列互补的特异性crRNA。在CRISPR II型系统中需要的反式激活crRNA(tracrRNA)与crRNA配对并结合至提供的Cas9蛋白。Cas9作为分子锚起作用，其促进tracRNA与cRNA的碱基配对(Deltcheva,Chylinski et al.2011)。在这种三元复合物中，双重tracrRNA:crRNA结构作为指导RNA起作用，其将核酸内切酶Cas9导向同源靶序列。通过扫描靶序列在靶序列和crRNA之间的同源性，来开始通过Cas9-tracrRNA:crRNA复合物的目标识别。除靶序列-crRNA互补性之外，DNA靶向还需要存在相邻于原间隔区(protospacer)(原间隔区相邻基序-PAM)的短基序。在双重RNA和靶序列之间配对以后，Cas9随后在PAM基序的上游引入钝双链断裂3个碱基(Garneau,Dupuis et al.2010)。Cas9在免疫细胞，尤其是在T细胞中的应用先前已经描述于WO2014191128。
通过失活编码T细胞受体(TCR)组件的至少一种基因来修饰T细胞
根据一个方面，例如，通过失活表达T细胞受体(TCR)的一种或多种组件的至少一种基因(如在WO 2013/176915中所描述的)，可以使具有本发明的抗CLL1 CAR的T细胞是较少同种异体反应的。这种失活可以与另一基因的失活结合，如编码或调节HLA或β2m蛋白表达的基因。因此，显著降低移植物抗宿主综合征和移植物排斥的风险。
使细胞较少同种异体的方法可以包括以下步骤：失活编码T细胞受体(TCR)组件的至少一种基因，尤其是TCRα和/或TCRβ基因。
在WO2013/176915中披露的用来制备适用于同种异体移植的CAR表达免疫细胞的方法(其中通过失活T细胞受体(TCR)的一种或多种组件)，均通过引用并入本文。
本发明包括抗CLL1 CAR表达免疫细胞，其中已失活表达T细胞受体(TCR)的一种或多种组件的至少一种基因。因而，本发明提供了抗CLL1 CAR表达T细胞，其中失活表达T细胞受体(TCR)的一种或多种组件的至少一种基因。
失活TCR基因，意图是不以功能蛋白形式来表达感兴趣的基因。在特定实施方式中，上述方法的基因修饰依赖于在提供的待工程化的细胞中一种稀切核酸内切酶的表达，以致所述稀切核酸内切酶特异性地催化在一种靶基因内的切割，从而失活所述靶基因。通常通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的独特的机制来修复由稀切核酸内切酶所引起的核酸链断裂。然而，NHEJ是不完善的修复方法，其经常导致在切割的位点处DNA序列变化。这些机制涉及通过直接再连接(Critchlow and Jackson 1998)或通过所谓的微同源性介导的末端连接(Betts,Brenchley et al.2003；Ma,Kim etal.2003)来重新连接两个DNA末端的剩余物。通过非同源末端连接(NHEJ)的修复经常导致小插入或缺失并且可以用于特异性基因敲除的产生。所述修饰可以是至少一个核苷酸的替代、缺失、或加入。可以通过本领域中公知的方法来确定和/或选择其中已经发生切割诱导的诱变事件(即与NHEJ事件连续的诱变事件)的细胞。在特定实施方式中，至少失活编码T细胞受体(TCR)的组件的基因进入每个单独样品的细胞的步骤包括将能够破坏编码T细胞受体(TCR)的组件的至少一种基因的稀切核酸内切酶引入细胞。在更具体的实施方式中，用编码稀切核酸内切酶(其能够破坏至少一种编码T细胞受体(TCR)的组件的基因)的核酸来转化每个单独样品的所述细胞，以及将所述稀切核酸内切酶表达于所述细胞中。
在优选实施方式中，进一步工程化免疫细胞的所述方法涉及将多核苷酸引入所述T细胞，尤其是mRNA，其编码特异性稀切核酸内切酶以通过DNA切割来选择性地失活上文提到的基因。在更优选的实施方式中，所述稀切核酸内切酶是TALE核酸酶或Cas9核酸内切酶。TAL核酸酶迄今已证实了具有比其他类型的稀切核酸内切酶更高的特异性和切割效率，从而使它们成为所选的核酸内切酶，用于在大规模上并具有恒定周转量(turn-over)地产生工程化免疫细胞。
根据本发明，被失活的具有T细胞受体(TCR)的一种或多种组件的抗CLL1 CAR免疫细胞旨在用作药物。
耐药T细胞
根据另一方面，可进一步基因工程化本发明的抗CLL1 CAR表达免疫细胞以使它们耐免疫抑制药物或化疗治疗，其用作用于治疗与CLL1阳性恶性细胞(尤其是AML)相关的癌症的标准护理。
已开发了多种细胞毒性剂(抗癌药物)如抗代谢物、烷基化剂、蒽环霉素、DNA甲基转移酶抑制剂、铂化合物和纺锤体毒素来杀伤癌细胞。然而，连同新疗法(如免疫疗法)一起这些药剂的引入是有问题的。例如，由于药剂的非特异性毒性曲线，化疗剂对于强大的抗肿瘤免疫活性细胞的建立可能是有害的。靶向细胞增殖途径的基于小分子的疗法还可能阻碍抗肿瘤免疫性的建立。如果瞬时有效的化疗方案可以与新型免疫活性细胞疗法结合，那么可以实现抗肿瘤治疗的显著改善(关于综述，见(Dasgupta,McCarty et al.2011))。
为了改善同种异体免疫细胞的癌症治疗和选择性移植，将耐药性赋予所述同种异体细胞，以保护它们免受化疗剂的毒副作用。免疫细胞的耐药性还允许它们的体内或离体富集，因为表达耐药性基因的T细胞相对于药物敏感细胞将存活和繁殖。
用于工程化耐化疗剂的免疫细胞的方法披露于PCT/EP2014/075317，其通过引用完全并入本文。
尤其是，本发明涉及用于工程化适用于免疫治疗的同种异体细胞的方法，其中失活编码T细胞受体(TCR)组件的至少一种基因以及修饰一种基因以提供耐药性，包括：
-提供抗CLL1 scCAR表达T细胞；表达T细胞，
-通过失活编码T细胞受体(TCR)组件的至少一种基因，来修饰所述抗CLL1 scCAR表达T细胞；
-修饰所述抗CLL1 scCAR表达T细胞，优选人源化CLL1 scCAR，以将耐药性提供给所述抗CLL1 scCAR表达T细胞；
-在所述药物的存在下，扩增所述工程化抗CLL1 scCAR表达T细胞。
可替换地，本发明涉及以下方法，包括：
-提供抗CLL1 scCAR表达T细胞；优选人源化CLL1 scCAR；
-修饰所述抗CLL1 scCAR表达T细胞，以将耐药性提供给所述抗CLL1 scCAR表达T细胞；
-通过失活编码T细胞受体(TCR)组件的至少一种基因，来修饰所述抗CLL1 scCAR表达T细胞；
-在所述药物的存在下，扩增所述工程化抗CLL1 scCAR表达T细胞。
尤其是，本发明还涉及用于工程化适用于免疫治疗的同种异体细胞的方法，其中失活编码T细胞受体(TCR)组件的至少一种基因以及修饰一种基因以提供耐药性，包括：
-提供抗CLL1 scCAR表达T细胞；优选人源化CLL1 scCAR；
-通过失活编码T细胞受体(TCR)组件的至少一种基因。来修饰所述抗CLL1 scCAR表达T细胞；
-修饰所述抗CLL1 scCAR表达T细胞以将耐药性提供给所述抗CLL1 scCAR表达T细胞；
-在所述药物的存在下，扩增所述工程化抗CLL1 scCAR表达T细胞。
可替换地，本发明涉及以下方法，包括：
-提供抗CLL1 scCAR表达T细胞；优选人源化CLL1 scCAR；
-修饰所述抗CLL1 scCAR表达T细胞以将耐药性提供给所述抗CLL1 scCAR表达T细胞；
-通过失活编码T细胞受体(TCR)组件的至少一种基因来修饰所述抗CLL1 scCAR表达T细胞；
-在所述药物的存在下，扩增所述工程化抗CLL1 scCAR表达T细胞。
在抗CLL1 scCAR-表达免疫细胞中耐药性基因的表达
在特定实施方式中，可以通过至少一种耐药性基因的表达来将所述耐药性赋予T细胞。所述耐药性基因是指核酸序列，其编码对药剂，如化疗剂(例如氨甲喋呤)，的"抗性"。换句话说，在细胞中耐药性基因的表达允许在药剂的存在下在比增殖没有耐药性基因的相应细胞更大程度上增殖细胞。在细胞中耐药性基因的表达允许在药剂的存在下增殖细胞并且不影响其活性。本发明的耐药性基因可以编码对抗代谢药、氨甲喋呤、长春碱、顺铂、烷基化剂、蒽环霉素、细胞毒性抗生素、抗亲免素(anti-immunophilin)、它们的类似物或衍生物等的抗性。
在一种实施方式中，本发明的耐药性基因可以提供对药物(或药剂)的抗性，尤其是抗癌药物，其选自阿糖胞嘧啶(aracytine)、胞嘧啶(cytosine)、阿糖胞苷(arabinoside)、安吖啶(amsacrine)、柔红霉素(daunorubicine)、伊达比星(idarubicine)、诺消灵(novantrone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、凡必士(vepeside)、依托泊苷(VP16)、三氧化二砷、反式视黄酸、三氧化二砷、反式视黄酸、氮芥、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷(cytarabine)、蒽环霉素、6-硫鸟嘌呤、羟基脲、泼尼松的组合、和它们的组合。
已确定了多种耐药性基因，其可以潜在地用来将耐药性提供给靶细胞(Takebe,Zhao et al.2001；Sugimoto,Tsukahara et al.2003；Zielske,Reese et al.2003；Nivens,Felder et al.2004；Bardenheuer,Lehmberg et al.2005；Kushman,Kabler etal.2007)。
耐药性基因的一个实例还可以是二氢叶酸还原酶(DHFR)的突变或修饰形式。DHFR是酶，其参与调节在细胞中四氢叶酸的量并且对于DNA合成是必不可少的。叶酸类似物如氨甲喋呤(MTX)抑制DHFR并因而在临床上用作抗肿瘤剂。已描述了DHFR的不同的突变形式，通过在治疗中使用的抗叶酸，其具有增加的对抑制的抗性。在特定实施方式中，根据本发明的耐药性基因可以是编码人野生型DHFR(GenBank:AAH71996.1)的突变形式的核酸序列，其包含至少一个突变，其赋予对抗叶酸治疗的抗性，如氨甲喋呤。在特定实施方式中，DHFR的突变形式包含在位置G15、L22、F31或F34处的至少一个突变氨基酸，优选在位置L22或F31处(Schweitzer,Dicker et al.1990)；国际申请WO94/24277；美国专利US6,642,043)。在特定实施方式中，所述DHFR突变形式包含在位置L22和F31处的两个突变氨基酸。依据在GenBank:AAH71996.1中阐述的野生型DHFR多肽的形式的氨基酸的位置，频繁表达本文中所描述的氨基酸位置的对应。在特定实施方式中，用色氨酸残基优选替代在位置15处的丝氨酸残基。在另一特定实施方式中，用将破坏突变DHFR与抗叶酸的结合的氨基酸优选替代在位置22处的亮氨酸残基，优选用不带电荷的氨基酸残基如苯丙氨酸或酪氨酸。在另一特定实施方式中，用小的亲水性氨基酸如丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸，优选替代在位置31或34处的苯丙氨酸残基。
如在本文中所使用的，"抗叶酸(antifolate)剂"或“叶酸(folate)类似物”是指分子，其被定向来在一定程度上干扰叶酸代谢途径。抗叶酸剂的实例包括，例如，氨甲喋呤(MTX)；氨基蝶呤；三甲曲沙(NeutrexinTM)；依达曲沙；N10-炔丙基-5,8-二脱氮叶酸(CB3717)；ZD1694(Tumodex)，5,8-二脱氮异叶酸(IAHQ)；5,10-二脱氮四氢叶酸(DDATHF)；5-脱氮叶酸；PT523(Nα-(4-氨基-4-脱氧蝶酰)-Nδ-半邻苯二甲酰-L-鸟氨酸)；10-乙基-10-脱氮氨基蝶呤(DDATHF，洛美曲索)；吡曲克辛；10-EDAM；ZD1694；GW1843；培美曲塞和PDX(10-炔丙基-10-脱氮氨基蝶呤)。
耐药性基因的另一实例还可以是肌苷-5’-单磷酸脱氢酶II(IMPDH2)的突变或修饰形式，在鸟苷核苷酸的从头合成中的限速酶。IMPDH2的突变或修饰形式是MPDH抑制剂抗性基因。IMPDH抑制剂可以是霉酚酸(MPA)或其前药麦考酚酸吗乙酯(mycophenolatemofetil)(MMF)。突变IMPDH2可以包含至少一个，优选两个在野生型人IMPDH2(NP_000875.2)的MAP结合位点处的突变，其导致对IMPDH抑制剂的显著增加的抗性。突变优选是在位置T333和/或S351处(Yam,Jensen et al.2006；Sangiolo,Lesnikova et al.2007；Jonnalagadda,Brown et al.2013)。在特定实施方式中，用异亮氨酸残基来替代在位置333处的苏氨酸残基以及用酪氨酸残基来替代在位置351处的丝氨酸残基。依据在NP_000875.2中阐述的野生型人IMPDH2多肽的形式的氨基酸的位置来频繁表达本文中所描述的氨基酸位置的对应。
另一种耐药性基因是钙调磷酸酶的突变形式。钙调磷酸酶(calcineurin)(PP2B)是广泛表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，其参与许多生物过程以及其对于T细胞激活是重要的。钙调磷酸酶是异二聚体，其由催化亚基(CnA；三种同种型)和调节亚基(CnB；两种同种型)组成。在T细胞受体的接合以后，钙调磷酸酶去磷酸化转录因子NFAT，从而允许它转运到细胞核和活性关键靶基因如IL2。在与FKBP12的复合物中的FK506、或在与CyPA的复合物中的环孢素A(CsA)阻止NFAT进入钙调磷酸酶的活性位点，进而防止它的去磷酸化并从而抑制T细胞激活(Brewin,Mancao et al.2009)。本发明的耐药性基因可以是核酸序列，该核酸序列编码钙调磷酸酶的突变形式，其耐钙调磷酸酶抑制剂如FK506和/或CsA。在特定实施方式中，所述突变形式可以包含在位置V314、Y341、M347、T351、W352、L354、K360处的野生型钙调磷酸酶异二聚体的至少一个突变氨基酸，优选在位置T351和L354或V314和Y341处的双突变。在特定实施方式中，可以用赖氨酸或精氨酸残基来替代在位置341处的缬氨酸残基，可以用苯丙氨酸残基来替代在位置341处的酪氨酸残基；可以用谷氨酸、精氨酸或色氨酸残基来替代在位置347处的蛋氨酸；可以用谷氨酸残基来替代在位置351处的苏氨酸；可以用半胱氨酸、谷氨酸或丙氨酸残基来替代在位置352处的色氨酸残基，可以用组氨酸或天冬酰胺残基来替代在353位置处的丝氨酸，可以用丙氨酸残基来替代在位置354处的亮氨酸；可以用对应于GenBank:ACX34092.1的序列的丙氨酸或苯丙氨酸残基来替代在位置360处的赖氨酸。依据野生型人钙调磷酸酶异二聚体(在(GenBank:ACX34092.1)中阐述的多肽)的形式的氨基酸的位置来频繁表达本文中所描述的氨基酸位置的对应。
在另一特定实施方式中，所述突变形式可以包含在位置V120、N123、L124或K125处的野生型钙调磷酸酶异二聚体b的至少一个突变氨基酸，优选在L124和K125位置处的双突变。在特定实施方式中，可以用丝氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸残基来替代在位置120处的缬氨酸；可以用色氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、组氨酸或丝氨酸来替代在位置123处的天冬酰胺；可以用苏氨酸残基来替代在位置124处的亮氨酸；可以用丙氨酸、谷氨酸、色氨酸来替代在位置125处的赖氨酸，或在对应于GenBank:ACX34095.1的氨基酸序列中可以在位置125处的赖氨酸以后添加两个残基如亮氨酸-精氨酸或异亮氨酸-谷氨酸。依据在(GenBank:ACX34095.1)中阐述的野生型人钙调磷酸酶异二聚体b多肽的形式的氨基酸的位置，频繁表达在本文中所描述的氨基酸位置的对应。
另一种耐药性基因是0(6)-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)，其编码人烷基鸟嘌呤转移酶(hAGT)。AGT是DNA修复蛋白，其赋予对烷基化剂的细胞毒性效应的抗性，如亚硝基脲和替莫唑胺(TMZ)。6-苄基鸟嘌呤(6-BG)是AGT的抑制剂，其增强亚硝基脲毒性并且连同TMZ一起来共同给予以增强此药剂的细胞毒性效应。编码AGT的变体的MGMT的多种突变形式是高度耐通过6-BG的失活，但仍然保留它们修复DNA损伤的能力(Maze,Kurpad et al.1999)。在特定实施方式中，在如在数据库Uniprot中根据参考P16455所披露的氨基酸序列中，AGT突变形式可以包含野生型AGT位置P140的突变氨基酸。在优选实施方式中，用赖氨酸残基来替代在位置140处的所述脯氨酸。
另一种耐药性基因可以是多药耐药性蛋白1(MDR1)基因。此基因编码膜糖蛋白，被称为P-糖蛋白(P-GP)，其参与代谢副产物穿过细胞膜的转运。P-Gp蛋白显示对于一些结构上无关的化疗剂的广泛特异性。
已描述了过度表达多药耐药性蛋白1以赋予对药物的抗性，如米托蒽醌(CharlesS.Morrow,Christina Peklak-Scott,Bimjhana Bishwokarma,Timothy E.Kute,PamelaK.Smitherman,and Alan J.Townsend.Multidrug Resistance Protein 1(MRP1,ABCC1)Mediates Resistance to Mitoxatrone via Glutathione-Dependent Drug Efflux MolPharmacol April 200669:1499-1505)。
因而，可以通过编码MDR-1(NP_000918)的核酸序列的表达，将耐药性赋予细胞。
制备耐药细胞的又一种方式是制备具有特定突变的细胞，如在人拓扑异构酶II基因中在Arg486和Glu571处的突变，以赋予对安吖啶的抗性(S.PATEL,B.A.KELLER,andL.M.FISHER.2000.MOLECULAR PHARMACOLOGY.Vol 57:p784–791(2000)。
制备耐药细胞的又一种方式是制备这样的细胞，其过度表达微RNA-21，以赋予对柔红霉素的抗性(在对柔红霉素的抗性中，涉及miR-21，其中通过调节在白血病K562细胞系中的PTEN表达，Bai,Haitao et al.FEBS Letters,Volume 585,Issue 2,402–408)。
在优选实施方式中，携带这样的耐药性赋予mRNA或蛋白的细胞还包含抑制性mRNA或基因，其表达被调节，从而允许在所述药物的存在下或在给予所述药物以后选择性地破坏所述抗药细胞。
耐药性基因还可以赋予对细胞毒性抗生素的抗性，并且可以是ble基因或mcrA基因。当暴露于化学剂(分别为博来霉素或丝裂霉素C)时，在免疫细胞中ble基因或mcrA的异位表达(ectopic expression)给出选择性优势。
基因治疗的最实用的方法是通过利用借助于载体，优选病毒载体，的有效的基因递送，来添加基因，以工程化T细胞。因而，在特定实施方式中，可以通过将优选由至少一种载体编码的转基因引入细胞，来在细胞中表达所述耐药性基因。
在一种实施方式中，携带耐药性基因或赋予对药物的抗性的修饰基因的细胞还包含可诱导自杀基因，其诱导引起细胞死亡，从而允许它们的选择性破坏。
基因随机插入基因组可能导致插入基因或在插入位点附近的基因的不恰当的表达。具体的基因治疗(利用包含内源性序列的外源性核酸的同源重组来使基因靶向在基因组内的特定位点)，可以允许工程化安全T细胞。如上所述，上述方法的基因修饰步骤可以包括以下步骤：将外源性核酸引入细胞，其中上述外源性核酸包含至少编码耐药性基因和一部分的内源性基因的序列，以致在内源性基因和外源性核酸之间发生同源重组。在特定实施方式中，所述内源性基因可以是野生型“耐药性”基因，以致在同源重组以后，由赋予对药物的抗性的基因的突变形式来替代野生型基因。
已知内切核酸裂解断裂会刺激同源重组的速率。因而，在特定实施方式中，本发明的的方法进一步包括以下步骤：在细胞中表达稀切核酸内切酶，其能够切割在内源性基因内的靶序列。所述内源性基因可以编码例如DHFR、IMPDH2、钙调磷酸酶或AGT。所述稀切核酸内切酶可以是TALE核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas9核酸内切酶、MBBBD核酸酶或大范围核酸酶。
在抗CLL1 CAR表达免疫细胞中药物敏感基因的失活
在另一特定实施方式中，可以通过药物敏感基因的失活，将所述耐药性赋予本发明的细胞(抗CLL1 CAR表达免疫细胞)。
本发明人寻求失活潜在药物敏感基因以工程化用于免疫治疗的T细胞，尤其是工程化抗CLL1 CAR表达免疫细胞，其可以连同治疗剂(抗癌药物)一起加以使用。
失活基因是指，并不以功能蛋白形式来表达感兴趣的基因。在特定实施方式中，上述方法的基因修饰依赖于，在提供的用来工程化的细胞中一种稀切核酸内切酶的表达，以致所述稀切核酸内切酶特异性地催化在一种靶基因中的切割，从而失活所述靶基因。在特定实施方式中，失活至少一种药物敏感基因的步骤包括在细胞中引入稀切核酸内切酶，其能够破坏至少一种药物敏感基因。在更具体的实施方式中，用编码稀切核酸内切酶的核酸来转化所述细胞，其中上述稀切核酸内切酶能够破坏药物敏感基因，以及将所述稀切核酸内切酶表达进入所述细胞。所述稀切核酸内切酶可以是大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas9核酸酶、MBBBD核酸酶或TALE核酸酶。在优选实施方式中，所述稀切核酸内切酶是TALE核酸酶。
在优选实施方式中，可以被失活以将耐药性授予T细胞的药物敏感基因是人脱氧胞苷激酶(dCK)基因。此酶是脱氧核糖核苷、脱氧胞苷(dC)、脱氧鸟苷(dG)和脱氧腺苷(dA)的磷酸化所需要的。通过dCK，将嘌呤核苷酸类似物(PNA)代谢成单、二和三磷酸PNA。它们的三磷酸形式以及特别是三磷酸氯法拉滨与ATP竞争DNA合成，作为促细胞凋亡剂并且是参与三核苷酸生产的核糖核苷酸还原酶(RNR)的有效的抑制剂。
优选地，通过TALE核酸酶来介导在T细胞中dCK的失活。为了实现这一目标，已设计，在多核苷酸水平上组装以及通过测序来确认了多对dCK TALE-核酸酶。根据本发明可以使用的TALE-核酸酶对的实例描述于PCT/EP2014/075317。
在T细胞中这种dCK失活赋予对嘌呤核苷类似物(PNA)的抗性，如氯法拉滨、氟达拉滨或地西他滨(Dacogen)。
在另一优选实施方式中，在T细胞中的dCK失活与TRAC基因的失活结合，从而使得这些双敲除(KO)T细胞耐药物如氯法拉滨并且较少同种异体的。这种双重特征对于治疗目标是特别有用的，其允许用于免疫治疗的“现成的”同种异体细胞连同化疗一起来治疗癌症患者。可以同时或顺序地进行这种双KO失活dCK/TRAC。在本发明中取得成功的TALE-核酸酶dCK/TRAC对的一个实例描述于PCT/EP2014/075317，尤其是，在2个基因座(dCK和TRAC)处的靶序列。
可以被失活的酶的另一实例是人次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因(Genbank:M26434.1)。尤其是，在工程化T细胞中，HPRT可以被失活以赋予对抑制细胞生长的代谢产物，6-硫鸟嘌呤(6TG)，的抗性，通过HPRT，其被转化成细胞毒性硫鸟嘌呤核苷酸并且其目前用来治疗癌症患者，特别是白血病(Hacke,Treger et al.2013)。通过HPRT转移酶来代谢鸟嘌呤类似物，其中上述HPRT转移酶催化磷酸核糖基部分的加成并且使得能够形成TGMP鸟嘌呤类似物，其包括6巯基嘌呤(6MP)，以及6硫鸟嘌呤(6TG)通常用作淋巴细胞清除药物来治疗白血病。通过HPRT(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)来代谢它们，其中上述HPRT催化磷酸核糖基部分的加成并且使得能够形成TGMP。它们的随后磷酸化导致形成它们的三磷酸化形式，其被最终整合进入DNA。在并入DNA以后，硫代GTP会妨害DNA复制的保真度(通过它的硫醇盐群体性)并产生随机点突变(其对于细胞完整性是非常有害的)。
因而，本发明提供了抗CLL1 scCAR表达细胞，尤其是抗CLL1 scCAR表达T细胞，其中scCAR具有按照SEQ ID NO.35至112(可选人源化的)的多肽序列以及其中dCK基因被失活。
在另一种实施方式中，通常表达在T细胞的表面上的CD3的失活可以赋予对抗CD3抗体如替利珠单抗的抗性。
抗CLL1 scCAR表达免疫细胞的多耐药性
在另一特定实施方式中，本发明人试图开发“现成的”免疫治疗策略，其中利用同种异体的T细胞，尤其是耐多种药物的同种异体抗CLL1 scCAR表达T细胞，以便当用不同药物来治疗患者时，调节工程化T细胞的选择。可以通过基因工程化多耐药性同种异体的T细胞来显著增强治疗效率。这样的策略可以特别有效治疗对表现出协同效应的药物组合作出反应的肿瘤。此外，可以利用最小剂量的药剂来扩增和选择多重耐药工程化T细胞。
因而，根据本发明的方法可以包括修饰T细胞以将多耐药性提供给所述T细胞。可以通过表达一种以上的耐药性基因或通过失活一种以上的药物敏感基因来提供所述多耐药性。在另一特定实施方式中，可以通过表达至少一种耐药性基因以及失活至少一种药物敏感基因来将多耐药性提供给所述T细胞。尤其是，可以通过表达至少一种耐药性基因如DHFR的突变形式、IMPDH2的突变形式、钙调磷酸酶的突变形式、MGMT的突变形式、ble基因，和mcrA基因以及失活至少一种药物敏感基因如HPRT基因，来将多耐药性提供给所述T细胞。在优选实施方式中，可以通过失活HPRT基因和表达DHFR的突变形式；或通过失活HPRT基因和表达IMPDH2的突变形式；或通过失活HPRT基因和表达钙调磷酸酶的突变形式；通过失活HPRT基因和表达MGMT的突变形式；通过失活HPRT基因和表达ble基因；通过失活HPRT基因和表达mcrA基因，来赋予多耐药性。
在一种实施方式中，本发明提供了同种异体抗CLL1 scCAR表达T细胞，其表达一种以上的耐药性基因或其中失活一种以上的药物敏感基因。
在抗CLL1 scCAR表达免疫细胞中的自杀基因
在一些情况下，因为在给予以后工程化T细胞可以扩增和坚持多年，所以可取的是，包括安全机制，以允许所给予的T细胞的选择性缺失。因而，在一些实施方式中，本发明的方法可以包括用重组自杀基因来转化所述T细胞。所述重组自杀基因用来降低在受试者中给予以后所述T细胞的直接毒性和/或不受控制的增殖的风险(Quintarelli C,Vera F,blood 2007；Tey SK,Dotti G.,Rooney CM,boil blood marrow transplant 2007)。自杀基因使得能够体内转化细胞的选择性缺失。尤其是，自杀基因具有将无毒的前体药物转化成细胞毒性药物或表达毒性基因表达产物的能力。换句话说，“自杀基因"是编码产物的核酸，其中产物独自地或在其它化合物的存在下引起细胞死亡。
这样的自杀基因的代表性的实例是一种自杀基因，其编码单纯疱疹病毒的胸苷激酶。另外的实例是水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶和细菌基因胞嘧啶脱氨酶，其可以将5-氟胞嘧啶转化成高毒性化合物5-氟尿嘧啶。自杀基因还包括，作为非限制性实例，胱冬裂酶(caspase)-9或胱冬裂酶-8或胞嘧啶脱氨酶。可以利用特定的二聚化的化学诱导剂(CID)来激活胱冬裂酶-9。自杀基因还可以是多肽，其被表达在细胞的表面上并且可以使得细胞对治疗性单克隆抗体敏感。如在本文中所使用的，"前体药物"是指可用于本发明的方法的任何化合物，其可以转化成毒性产物。在本发明的方法中，通过自杀基因的基因产物，将前体药物转化成毒性产物。这样的前体药物的代表性的实例是更昔洛韦，通过HSV-胸苷激酶，其被体内转化成毒性化合物。更昔洛韦衍生物随后对于肿瘤细胞是有毒的。前体药物的其它代表性实例包括阿昔洛韦、FIAU[1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶]、用于VZV-TK的6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷、以及用于胞嘧啶脱氨酶的5-氟胞嘧啶。
一种优选的自杀基因系统采用重组抗原多肽，其包含由抗CD20mAb利妥昔单抗，尤其是QBen10，所识别的抗原基序，如在WO2013153391中描述的所谓的RQR8多肽中，其独立地表达自抗CLL1 CAR。当需要的时候，利妥昔单抗，一种批准的抗体药物，然后可以用于细胞清除(cell depletion，细胞耗竭)。
在一种实施方式中，本发明提供了同种异体抗CLL1 scCAR表达T细胞，其表达一种以上的耐药性基因或其中一种以上的药物敏感基因被失活，以及允许所述细胞被摧毁的自杀基因。
尤其是，本发明涉及同种异体的T细胞，尤其是同种异体的抗CLL1 scCAR表达T细胞，以及优选同种异体的抗CLL1 scCAR表达T细胞，其包含具有与来自SC02-357、SC02-378、SCO2-161、M26、M31、G4、M22、M29、M2、M5、G12、21.26或1075.7抗体的scfv 80％至100％一致性的肽，所述同种异体的抗CLL1 scCAR表达T细胞(包含具有与来自SC02-357、SC02-378、SCO2-161、M26、M31、G4、M22、M29、M2、M5、G12、21.26和1075.7抗体的scfv 80％至100％一致性的肽)，是更特别地耐药物，并且特别适用于免疫治疗。
可以通过药物敏感基因的失活或通过耐药性基因的表达来赋予药物的抗性。适合本发明的药物的一些实例是嘌呤核苷类似物(PNA)如氯法拉滨或氟达拉滨，或其它药物如6-巯基嘌呤(6MP)和6-硫代鸟嘌呤(6TG)。
在一个方面，本发明提供了用于工程化免疫细胞的方法以使它们耐嘌呤核苷酸类似物(PNA)，如氯法拉滨或氟达拉滨，以致它们可以在经这些常规化学疗法预治疗的患者中用于癌症免疫治疗。
可以通过失活负责细胞对药物的感受性的一种或多种基因(药物敏感基因)，如dcK和/或HPRT基因，来将对药物的抗性赋予T细胞。
根据另一方面，可以通过表达耐药性基因来将对药物的抗性赋予T细胞。已确定多种基因的变化的等位基因，如二氢叶酸还原酶(DHFR)、肌苷单磷酸脱氢酶2(IMPDH2)、钙调磷酸酶或甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)，会将耐药性提供给本发明的细胞。
例如，可以失活CD52和糖皮质激素受体(GR)(其是
Figure BDA0001358281550000561
(阿仑单抗)或利妥昔单抗以及糖皮质激素治疗的药物靶)，以使得细胞耐这些治疗并给予它们相对于患者自己的不具有特异性抗CLL1 scCAR的T细胞的竞争优势。还可以抑制或减小CD3基因的表达以赋予对替利珠单抗的抗性，其是另一种免疫抑制药物。根据本发明还可以抑制或减少HPRT的表达，以赋予对6-硫鸟嘌呤的抗性，其是常用于化疗的细胞抑制剂，尤其用于急性淋巴细胞白血病的治疗。
免疫检查点工程化细胞
根据本发明的进一步的方面，可以进一步操作免疫细胞以使它们更加活性或极限衰竭(exhaustion，耗尽)，其中通过失活编码作为“免疫检查点”的蛋白质的基因，其作为T细胞激活的调节物，如选自以下各项的基因：CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1(orblimp1)、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3，优选地，所述基因是PDCD1或CTLA-4。基因的实例(其表达可以被减少或抑制)，还示于表9。
本发明还提供了表达抗CLL1 scCAR，尤其是抗CLL1，的同种异体的T细胞，其中表达T细胞受体(TCR)的一种或多种组件的至少一种基因被失活和/或选自基因CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1(orblimp1)、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3的一种基因被失活，如在WO2014/184741中所提到的。
在一种实施方式中，所述基因是这样的基因，其作为编码β2微球蛋白的T细胞激活的调节物。
根据本发明的进一步的方面，可以进一步操作本发明的抗CLL1scCAR免疫细胞以使它们耐药物，尤其是在抗癌化疗期间所使用的药物，尤其是CLL1表达细胞介导癌症如AML。这可以通过引入赋予对所述药物抗性的基因来实现。可以通过使用如前所述的基因诱导抑制/表达系统来打开和关闭此相同的基因(Garcia EL,Mills AA(2002)Gettingaround lethality with inducible Cre-mediared excision.Semin Cell Dev Biol 13:151–8,Lewandoski M(2001)Conditional control ofgene expression in themouse.Nat Rev Genet 2:743–55；Scharfenberger L,Hennerici T,Kirly G et al.(2014)Transgenic mouse technology in skin biology:Generation of complete ortissue-specific knockout mice.J Invest Dermatol 134:e16；Schwenk F,Kuhn R,Angrand PO et al.(1998)Temporally and spatially regulated somatic mutagnesisin mice.Nucleic Acids Res 26:1427–32。
因而，抗CLL1 scCAR表达、耐药免疫细胞(其中(i)表达T细胞受体(TCR)的一种或多种组件的至少一种基因被失活(ii)赋予对药物抗性的至少一种基因被加入或赋予对所述药物敏感性的基因被删除或突变以被失活(iii)可选地，选自披露在以下表9中的基因的另一基因被失活)，是本发明的一个目标。
本发明包括通过本发明的方法可以获得的分离的抗CLL1 scCAR免疫细胞或细胞系，更特别地分离的细胞(包含本文中所描述的任何蛋白质、多肽、等位变体、改变或删除的基因或载体)。
本发明的免疫细胞或细胞系可以进一步包含外源性重组多核苷酸，尤其是scCAR或自杀基因，或它们可以包含改变或删除的基因(其编码检查点蛋白质或它们的配体)，其贡献它们作为治疗性产物的效率，理想地作为“现成的(off the shelf)”产物。在另一方面，本发明涉及用于在患者中治疗或预防癌症的方法，其中通过给予至少一次通过上述方法可获得的工程化免疫细胞。
表9:编码免疫检查点蛋白质的基因的列表
Figure BDA0001358281550000581
Figure BDA0001358281550000591
用于测试耐药同种异体scCAR T细胞的细胞毒性的CLL1+/luc+耐药的Daudi细胞
本发明还包括用于制造靶细胞的方法，其中上述靶细胞表达对于scCAR T细胞特异的表面受体和抗性基因。这些靶细胞特别可用于测试scCAR T细胞的细胞毒性。这些细胞容易地耐临床上相关剂量的氯法拉滨并保护荧光素酶活性。特点的这种组合能够在小鼠模型中体内跟踪它们或摧毁它们(必要时)。
更特别地，在小鼠中在氯法拉滨或其它PNA的存在下它们可以用来评估耐药T细胞的细胞毒性性能。耐氯法拉滨的Daudi细胞模拟急性骨髓瘤白血病(AML)患者复发形式诱导治疗的生理状态，其保护耐药性B细胞恶性肿瘤。因而，这些细胞具有很大的兴趣来评估耐药性scCAR T细胞的可靠性和细胞毒性。优选地，这些靶细胞是CLL1+荧光素酶+Daudi细胞。
在抗CLL1-单链CAR的胞外结构域中至少一个表位的插入
本发明的抗CLL1 CAR可以至少包括在所述CAR的胞外结构域中至少一个表位的插入。这是为了在体内不良反应如细胞因子风暴的情况下暂时地耗尽具有CAR的免疫细胞。此外，表位或“表位标记”的上述插入可以用来在它们的制造过程中体外分类或纯化工程化免疫细胞。所述至少一个表位可以是任何抗原肽，其是足够免疫原性的以由识别上述肽的特异性抗体所结合。例如，这可以例如通过将至少一个，以及优选两个拷贝的CD20模拟表位，优选具有序列CPYSNPSLCS(SEQ ID NO.113)，插入CAR多肽序列来获得。为了下文简化的目的，scFv从N末端到C末端的次序表示如下：VH链以及然后VL链。然而，在本发明的范围中可以设想颠倒此次序：VL链以及然后VL链。
在本发明的抗CLL1 CAR内至少一个CD20模拟表位的不同位置示于图3。通过接头，所述两个拷贝的CD20模拟表位可以彼此连接以及还连接于VL。通过利用可选接头，还可以将它们插入在抗CLL1 scFv和铰链(如CD8α)之间。可以通过抗CD20抗体，如利妥昔单抗来结合CD20模拟表位(McLaughlin P,et al.1998)。
因此，本发明的抗CLL1 CAR可以包含VH和VL链，其能够结合于CLL1细胞表面抗原(可选人源化的)，接头L，自杀结构域，铰链或其一部分，跨膜结构域，共刺激结构域和刺激结构域。
根据另一种实施方式，表位是模拟表位。作为高分子，经常为肽，其模仿表位的结构，模拟表位具有以下优点：比常规表位更小，因而可以有利于非构象序列并且更容易在长多肽中复制这样的CAR。已知模拟表位用于多种药物批准的mAb，如用于西妥昔单抗的两种10个氨基酸肽(Riemer et al.,2005)，或用于帕利珠单抗的24aa(Arbiza et al,1992)。因为可以通过噬菌体展示来确定这些模拟表位，所以可以尝试其中的多种以获得并不干扰用于相同mAb的scFv的序列。此外，它们的使用可以增强补体依赖性细胞毒性(CDC)。
这样的表位和模拟表位(具有它们的对应的结合的mAb)的一些实例在下面的表10中给出。
表10:具有它们的相应mAb的模拟表位和表位
Figure BDA0001358281550000601
Figure BDA0001358281550000611
在优选实施方式中，在嵌合scFv内引入的表位是CD20模拟表位(mimotope)(SEQID NO.113)以及为此模拟表位提供亲和力(用于分选和/或耗尽目的)的注入的mAb是利妥昔单抗。
在一种实施方式中，将所述至少一个表位插入在抗CLL1.1 CAR的VH和VL链之间，可选地通过一个接头连接于所述VH和VL链。
在一些实施方式中，如在scFv的上下文中所使用的，术语“接头"是指肽接头，其由氨基酸如甘氨酸和/或丝氨酸残基(单独或组合使用)组成，以将可变重链区和可变轻链区连接在一起。在一种实施方式中，柔性多肽接头是甘氨酸/丝氨酸接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n或(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10。在一种实施方式中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。在另一种实施方式中，接头包括(GlyxSer)n的多次重复，其中x＝1、2、3、4或5以及n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，如(GlySer)、(Gly2Ser)或(Gly5Ser)的多次重复。在本发明的范围内还包括描述于WO2012/138475中的接头，其通过引用并入本文。
在优选实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有选自V1、V3或V5的多肽结构之一，如图2所示，其中一个CD20模拟表位被插入在抗CLL1.1 CAR的VH和VL链之间，可选地通过一个接头连接于所述VH和VL链。
在更优选的实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有如图2所示的V3版本的多肽结构之一，所述结构包含至少一个抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域，以及其中一个CD20模拟表位被插入在抗CLL1.1 CAR的VH和VL链之间，可选地通过一个接头连接于所述VH和VL链。
在另一种实施方式中，所述至少一个表位被插入在CAR的N末端，所以在scFv的最前面，可选地通过一个接头连接于VH链以及连接于CAR的N末端。
在优选实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有选自V1、V3或V5的多肽结构之一，如图2所示，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域，以及其中一个表位被插入在CAR的N末端，所以在scFv的最前面，可选地通过一个接头连接于VH链以及连接于CAR的N末端。
在更优选的实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有如图2所示的V3版本的多肽结构之一，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域，以及其中一个表位被插入CAR的N末端，所以在scFv的最前面，可选地通过一个接头连接于VH链以及连接于CAR的N末端。
在另一种实施方式中，所述至少一个表位被插入在CAR的scFv和铰链之间，可选地通过一个接头连接于VL链以及连接于铰链。
在优选实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有选自V1、V3或V5的多肽结构之一，如图2所示，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域，以及其中一个表位被插入在CAR的scFv和铰链之间，可选地通过一个接头连接于VL链以及连接于铰链。
在更优选的实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有如图2所示的V3版本的多肽结构之一，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域，以及其中一个表位被插入在CAR的scFv和铰链之间，可选地通过一个接头连接于VL链以及连接于铰链。
在优选实施方式中，至少两个表位被插入在本发明的抗CLL1 CAR的胞外结构域中。
在一种实施方式中，CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有选自V1、V3或V5的多肽结构之一，如图2所示，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域、以及两个CD20模拟表位，
所述外结合结构域包含VH和VL链，其针对CLL1和FcγRIIIα或CD8α或IgG1铰链；
其中所述2个表位被串联插入在scFv和所述铰链之间，以及可选地
接头(SEQ ID NO.10)被间隔在2个表位之间和/或在VH和2个表位之间。
在一种实施方式中，CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有选自V1、V3或V5的多肽结构之一，如图2所示，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域、以及两个CD20模拟表位，
所述外结合结构域包含VH和VL链，其针对CLL1和FcγRIIIα或CD8α或IgG1铰链；
其中所述2个表位被串联插入在scFv的最前面，即在CAR-的N末端
以及可选地，接头(SAQ ID NO.10)被间隔在2个表位之间和/或在CAR的N末端处。
根据一种实施方式，至少两个表位以这样的方式被插入在胞外结构域中，以致VH位于它们之间，所有这些组件可选地由至少一个接头间隔。
在优选实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有选自V1、V3或V5的多肽结构之一，如图2所示，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域，以及其中两个表位以这样的方式被插入在胞外结构域中，以致VH位于它们之间，所有这些组件可选地由至少一个接头间隔。
在更优选的实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有如图2所示的V3版本的多肽结构之一，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域，以及其中两个表位以这样的方式被插入在胞外结构域中以致VL位于它们之间，所有这些组件可选地由至少一个接头间隔。
根据另一种实施方式，两个表位以这样的方式被插入在胞外结构域中，以致VL位于它们之间，所有这些组件可选地由至少一个接头间隔。
在优选实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有选自V1、V3或V5的多肽结构之一，如图2所示，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域，以及其中两个表位以这样的方式被插入在胞外结构域中，以致VL位于它们之间，所有这些组件可选地由至少一个接头间隔。
在更优选的实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有如图2所示的V3版本的多肽结构之一，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域，以及其中两个表位以这样的方式被插入在胞外结构域中，以致VL位于它们之间，所有这些组件可选地由至少一个接头间隔。
根据另一种实施方式，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)包含胞外结合结构域，其中至少两个表位以这样的方式被插入在胞外结构域中，以致VH和VL链位于它们之间，所有这些组件可选地由至少一个接头间隔。
在优选实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有选自V1、V3或V5的多肽结构之一，如图2所示，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域，以及其中两个表位以这样的方式被插入在胞外结构域中，以致VH和VL链位于它们之间，所有这些组件可选地由至少一个接头间隔。
在更优选的实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有如图2所示的V3版本的多肽结构之一，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域，以及其中两个表位以这样的方式被插入在胞外结构域中，以致VH和VL链位于它们之间，所有这些组件可选地由至少一个接头间隔。
在另一种实施方式中，三个表位被插入在本发明的抗CLL1 CAR的胞外结构域中。
根据特定实施方式，本发明的所述CLL1特异性CAR含有胞外结合结构域，其中三个表位以这样的方式被插入在胞外结构域中，以致VH和VL链位于它们之间，所有这些组件可选地由至少一个接头间隔。
在优选实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有选自V1、V3或V5的多肽结构之一，如图2所示，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域，以及其中三个表位以这样的方式被插入在胞外结构域中，以致VH和VL链位于它们之间，所有这些组件可选地由至少一个接头间隔。
在更优选的实施方式中，所述CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有如图2所示的V3版本的多肽结构之一，所述结构至少包含细胞外配体结合结构域抗CLL1、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域，以及其中三个表位以这样的方式被插入在胞外结构域中，以致VH和VL链位于它们之间，所有这些组件可选地由至少一个接头间隔。
在另一种实施方式中，CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有选自V1、V3或V5的多肽结构之一，如图2所示，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域。以及三个CD20表位，
所述外结合结构域包含VH和VL链，其针对CLL1和FcγRIIIα或CD8α或IgG1铰链；
其中所述3个表位被串联插入在scFv和所述铰链之间，以及可选地
接头(SEQ ID NO.10)被间隔在3个表位之间和/或在VH和3个表位之间。
在另一种实施方式中，CLL1特异性嵌合抗原受体(抗CLL1 CAR)具有选自V1、V3或V5的多肽结构之一，如图2所示，所述结构至少包含抗CLL1细胞外配体结合结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号结构域、两个CD20表位、以及一个CD34表位；
所述外结合结构域包含VH和VL链，其针对CLL1和FcγRIIIα或CD8α或IgG1铰链；
所述2个表位被串联插入在scFv和所述铰链之间，
以及所述CD34表位被插入在所述2个CD20表位之间，通过接头(SEQ ID NO.10)以及在表位和之间以及在VH和3个表位之间的接头，所有组件被间隔在它们之间。
在所有上述涉及含有表位的抗CLL1 CAR的实施方式中，VH和VL链(其用作胞外结合结构域)，优选结合于人膜CLL1-1。
在优选实施方式中，所述以上抗CLL1 CAR，其至少包含细胞外配体结合结构域(其包括衍生自抗CLL1单克隆抗体的VH和VL链)。
更具体地，可以在本发明的CAR中包括表位，具体如下：
在一些实施方式中，胞外结合结构域包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个mAb特异性表位。
在一些实施方式中，胞外结合结构域包含至少1、2或3个mAb特异性表位。
在一些实施方式中，当胞外结合结构域包含多个mAb特异性表位时，所有mAb特异性表位是相同的。
在一些实施方式中，当胞外结合结构域包含多个mAb特异性表位时，mAb特异性表位是不相同的。例如，胞外结合结构域可以包含三个mAb特异性表位，其中两个是相同的以及第三个是不同的。
在一些实施方式中，胞外结合结构域包含VH、VL、一外或多个mAb特异性表位，优选1、2或3个，更优选2或3个mAb特异性表位。
在一些实施方式中，胞外结合结构域包含以下序列(N端位于左手侧)：
V1-L1-V2-(L)x-表位1-(L)x；
V1-L1-V2-(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x；
V1-L1-V2-(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x；
(L)x-表位1-(L)x-V1-L1-V2；
(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-V1-L1-V2；
表位1-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x-V1-L1-V2；
(L)x-表位1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位2-(L)x；
(L)x-表位1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x；
(L)x-表位1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x-表位4-(L)x；
(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位3-(L)x；
(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位3-(L)x-表位4-(L)x；
V1-(L)x-表位1-(L)x-V2；
V1-(L)x-表位1-(L)x-V2-(L)x-表位2-(L)x；
V1-(L)x-表位1-(L)x-V2-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x；
V1-(L)x-表位1-(L)x-V2-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x-表位4-(L)x；
(L)x-表位1-(L)x-V1-(L)x-表位2-(L)x-V2；
(L)x-表位1-(L)x-V1-(L)x-表位2-(L)x-V2-(L)x-表位3-(L)x；
V1-L1-V2-L-表位1；
V1-L1-V2-L-表位1-L；
V1-L1-V2-L-表位1-L-表位2；
V1-L1-V2-L-表位1-L-表位2-L；
V1-L1-V2-L-表位1-L-表位2-L-表位3；
V1-L1-V2-L-表位1-L-表位2-L-表位3-L；
V1-L1-V2-表位1；
V1-L1-V2-表位1-L；
V1-L1-V2-表位1-L-表位2；
V1-L1-V2-表位1-L-表位2-L；
V1-L1-V2-表位1-L-表位2-L-表位3；
V1-L1-V2-表位1-L-表位2-L-表位3-L；
表位1-V1-L1-V2；
表位1-L-V1-L1-V2；
L-表位1-V1-L1-V2；
L-表位1-L-V1-L1-V2；
表位1-L-表位2-V1-L1-V2；
表位1-L-表位2-L-V1-L1-V2；
L-表位1-L-表位2-V1-L1-V2；
L-表位1-L-表位2-L-V1-L1-V2；
表位1-L-表位2-L-表位3-V1-L1-V2；
表位1-L-表位2-L-表位3-L-V1-L1-V2；
L-表位1-L-表位2-L-表位3-V1-L1-V2；
L-表位1-L-表位2-L-表位3-L-V1-L1-V2；
V1-L-表位1-L-V2；
L-表位1-L-V1-L-表位2-L-V2；
V1-L-表位1-L-V2-L-表位2-L；
V1-L-表位1-L-V2-L-表位2-L-表位3；
V1-L-表位1-L-V2-L-表位2-表位3；
V1-L-表位1-L-V2-L-表位2-L-表位3-表位4；
L-表位1-L-V1-L-表位2-L-V2-L-表位3-L；
表位1-L-V1-L-表位2-L-V2-L-表位3-L；
L-表位1-L-V1-L-表位2-L-V2-L-表位3；
L-表位1-L-V1-L1-V2-L-表位2-L；
L-表位1-L-V1-L1-V2-L-表位2-L-表位3；
L-表位1-L-V1-L1-V2-L-表位2-表位3，或
表位1-L-V1-L1-V2-L-表位2-L-表位3-表位4。
其中，
V1和V2是ScFv的VH和VL(即，V1是VL和V2是VH或V1是VH以及V2是VL)；
L1是任何接头，其适合于在ScFv中将VH链连接于VL链；
L是接头，优选包含甘氨酸和丝氨酸残基，以及在胞外结合结构域中L的每次出现可以与在相同的胞外结合结构域中L的其它出现相同或不同，以及，
x是0或1以及x的每次出现是独立于其它；以及，
表位1、表位2和表位3是mAb特异性表位并且可以是相同的或不同的。
在一些实施方式中，胞外结合结构域包含以下序列(N端位于左手侧)：
VH-L1-VL-L-表位1-L-表位2-L；
L-表位1-L-VH-L-表位2-L-VL-L-表位3-L；
VL-L1-VH-L-表位1-L-表位2-L；或，
L-表位1-L-VL-L-表位2-L-VH-L-表位3-L。
其中L、L1、表位1、表位2和表位3是如上文所定义。
在一些实施方式中，L1是接头，其包含甘氨酸和/或丝氨酸。在一些实施方式中，L1是接头，其包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n或(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是1、2、3、4或5。在一些实施方式中，L1是(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。
在一些实施方式中，L是柔性接头，优选包含甘氨酸和/或丝氨酸。在一些实施方式中，L具有选自以下的氨基酸序列：SGG、GGS、SGGS、SSGGS、GGGG、SGGGG、GGGGS、SGGGGS、GGGGGS、SGGGGGS、SGGGGG、GSGGGGS、GGGGGGGS、SGGGGGGG、SGGGGGGGS、或SGGGGSGGGGS，优选SGG、SGGS、SSGGS、GGGG、SGGGGS、SGGGGGS、SGGGGG、GSGGGGS或SGGGGSGGGGS。在一些实施方式中，当胞外结合结构域包含L的多次出现时，所有L是相同的。在一些实施方式中，当胞外结合结构域包含L的多次出现时，L不是都相同的。在一些实施方式中，L是SGGGGS。在一些实施方式中，胞外结合结构域包含L的多次出现以及所有L是SGGGGS。
在一些实施方式中，表位1、表位2和表位3是相同的或不同的并且选自mAb特异性表位，其具有SEQ ID NO 33至SEQ ID NO 42的任何一种的氨基酸序列。
在一些实施方式中，表位1、表位2和表位3是相同的或不同的并且选自被以下各项特异性地识别的mAb特异性表位：替伊莫单抗、伊莫单抗、莫罗单抗-CD3、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、本妥昔单抗(本妥昔单抗)、西妥昔单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、妥珠单抗、达克珠单抗、依库珠单抗、依法利珠单抗、吉姆单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、兰尼单抗、托珠单抗、曲妥单抗、维多珠单抗、阿达木单抗、贝利单抗、康纳单抗、地诺单抗、戈利木单抗、易普利单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、QBEND-10、阿仑单抗或优特克单抗。
在一些实施方式中，表位1是mAb特异性表位，其具有SEQ ID NO 33的氨基酸序列。
在一些实施方式中，表位2是mAb特异性表位，其具有SEQ ID NO 35的氨基酸序列。
在一些实施方式中，表位3是mAb特异性表位，其具有SEQ ID NO 36的氨基酸序列。
在一些实施方式中，表位4是mAb特异性表位，其具有SEQ ID NO 37的氨基酸序列。
在一些实施方式中，表位4是mAb特异性表位，其具有SEQ ID NO 38的氨基酸序列。
在一些实施方式中，表位2是mAb特异性表位，其具有SEQ ID NO 33的氨基酸序列，以及表位3是mAb特异性表位，其具有SEQ ID NO 41或42的氨基酸序列。
在一些实施方式中，表位1、表位2、表位3和表位4之一是CD34表位，优选SEQ ID 41或42的表位。在一些实施方式中，表位1、表位2、表位3和表位4之一是CD34表位，优选SEQ ID41或42的表位，以及其它mAb特异性表位是CD20模拟表位，优选SEQ ID NO 33的模拟表位。
用于耗尽CAR表达免疫细胞的方法
根据本发明的表达CLL1特异性CAR的免疫细胞可以包含如上所述的在它们的胞外结构域中的表位，以致通过给予所述患者抗体，优选针对所述表位的单克隆特异性抗体，在患者中，在不利或太急性免疫反应(例如细胞因子风暴)的情况下，它们可以被耗尽。
在本发明中，“体内耗尽(in vivo depletion，体内清除)”是指，给予哺乳动物生物体治疗，其旨在通过抑制或消除来停止CAR表达免疫细胞的增殖。
本发明的一个方面涉及用于体内耗尽表达包含如前所述的m-Ab特异性表位的CAR的工程化免疫细胞的方法，包括使所述工程化免疫细胞或所述CAR表达免疫细胞接触至少一种表位特异性mAb。本发明的另一方面涉及用于体内耗尽免疫CAR表达免疫细胞(其包含上述嵌合scFv(通过mAb特异性表位的插入所形成))的方法，其中通过使所述工程化免疫细胞接触表位特异性抗体。
优选地，所述免疫细胞是T细胞和/或抗体是单克隆的。
根据一种实施方式，对工程化免疫细胞(其以前已利用本发明的体外方法被分选)，进行免疫工程化细胞的体内耗尽。在这种情况下，这将是使用相同的注入的mAb。
根据优选实施方式，mAb特异性抗原是CD20抗原以及表位特异性mAb是利妥昔单抗。
在一些实施方式中，本发明涉及用于在患者中体内耗尽工程化免疫细胞(其表达包含如前所述的mAb特异性表位的CAR(CAR表达免疫细胞))的方法，包括使所述CAR表达免疫细胞接触至少一种表位特异性mAb。
在一些实施方式中，所述mAb特异性表位是CD20表位或模拟表位，优选SEQ ID NO35以及表位特异性mAb是利妥昔单抗。
在一些实施方式中，使所述工程化免疫细胞或所述CAR表达免疫细胞接触至少一种表位特异性mAb的步骤包括用表位特异性mAb来注入患者，优选利妥昔单抗。
在一些实施方式中，当在使用表位特异性mAb的CDC测定中，耗尽免疫细胞(其表达包含mAb特异性表位的CAR(CAR表达免疫细胞))时，能生存的CAR表达免疫细胞的量降低，优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。优选地，CDC测定是在实施例3、实施例4或实施例7.4中披露的测定。在一些实施方式中，所述mAb特异性表位是CD20表位或模拟表位，优选SEQ ID NO 35以及表位特异性mAb是利妥昔单抗。
除了体内耗尽根据本发明的免疫细胞的可能性以外，插入CAR的胞外结构域中的表位还可以用于以下步骤：分拣或纯化表达所述CAR的免疫细胞，作为生产它们的方法的一部分。
分离的细胞
产生的细胞是工程化免疫细胞，其在细胞表面膜上表达如前所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，尤其是工程化免疫细胞，其衍生自原代T淋巴细胞，可选地耐受抗癌药物，以及携带编码αTCR或βTCR的基因的缺失。
本发明披露了如上所述的工程化免疫细胞，其中TCR的表达受到抑制。
本发明披露了如上所述的工程化免疫细胞，其中，在所述工程化免疫细胞中，至少一种MHC蛋白，优选β2m或HLA，的表达，受到减少或抑制。β2m代表β2微球蛋白和HLA代表人白细胞抗原。MHC蛋白是I类或II类的MHC蛋白。
本发明披露了如上所述的工程化免疫细胞，其中突变所述工程化免疫细胞以赋予对至少一种免疫抑制药物、化疗药物、或抗癌药物的抗性。
本发明披露了如上所述的工程化免疫细胞，用于治疗。
本发明披露了如上所述的工程化免疫细胞，用于治疗，其中患者是人。
本发明披露了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中病症是特征在于CLL1表达细胞的恶化前或恶性癌症病症。
本发明披露了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中病症是这样的病症，其特征在于过多的CLL1表达细胞。
本发明披露了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中恶性肿瘤病症是血液癌症病症。
本发明披露了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中血液癌症病症是白血病或恶性淋巴增生性疾病。
本发明披露了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中所述白血病选自由急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴样白血病、慢性淋巴样白血病、和骨髓增生异常综合征组成的组。
本发明披露了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中白血病是急性髓性白血病(AML)。
本发明披露了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中所述血癌是恶性淋巴增生性疾病。
本发明披露了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中所述恶性淋巴增生性疾病是淋巴瘤。
本发明披露了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中所述淋巴瘤选自由多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)组成的组。
本发明披露了用于损害血液癌细胞的方法，包括使所述血液癌细胞接触工程化细胞，其至少以有效量表达如上述暴露的抗CLL1 CAR，以造成所述癌细胞的损害。
本发明因而公开了工程化免疫细胞的方法，包括：
(a)提供免疫细胞，
(b)在所述细胞表面上表达至少一种如先前公开的CLL1单链特异性嵌合抗原受体。
本发明披露了工程化如上所述的免疫细胞的方法，包括：
(a)提供免疫细胞，
(b)将至少一种编码所述CLL1单链特异性嵌合抗原受体的多核苷酸引入所述细胞，
(c)将所述多核苷酸表达进入所述细胞。
本发明披露了工程化如上所述的免疫细胞的方法，包括：
(a)提供免疫细胞，
(b)将至少一种编码所述CLL1单链特异性嵌合抗原受体的多核苷酸引入所述细胞，
(c)引入至少一种对于CLL1不是特异性的其它嵌合抗原受体。
本发明披露了用于治疗需要其的受试者的方法，包括：
(a)提供免疫细胞，其在表面上表达如上述公开的CLL1单链特异性嵌合抗原受体，
(b)将所述免疫细胞给予所述患者。
本发明披露了如上所述的用于治疗对其需要的受试者的方法，其中所述免疫细胞提供自供体。
本发明披露了如上所述的用于治疗对其需要的受试者的方法，其中所述免疫细胞提供自患者自己。
治疗应用
在另一种实施方式中，通过不同的方法获得的分离的细胞或衍生自如前所述的所述分离的细胞的细胞系可以用作药剂。
在另一种实施方式中，在对其需要的患者中，所述药剂可以用于治疗癌症，特别是用于白血病的治疗。
在另一种实施方式中，根据本发明的所述分离的细胞或衍生自所述分离的细胞的细胞系可以用于制造用于在对其需要的患者中治疗癌症的药剂。
在特定实施方式中，抗CLL1 CAR表达T细胞被提供为药剂，用于治疗AML、AML亚型、AML相关并发症、AML相关病症。
在另一种实施方式中，所述药剂可以用于治疗CLL1表达细胞介导的病理状况或病症，其特征在于CLL1表达细胞的直接或间接活性。
在另一方面，本发明依赖于用于治疗对其需要的患者的方法，所述方法包括以下步骤的至少一个步骤：
(a)提供可以通过先前描述的方法的任何一种方法获得的免疫细胞；
(b)将所述转化免疫细胞给予所述患者。
在一种实施方式中，本发明的所述T细胞可以经受强大的体内T细胞扩增并且可以持续延长的时间。
所述治疗可以是改善、治愈或预防。它可以是自体免疫治疗的一部分或同种异体免疫治疗的一部分。术语“自体的(autologous)”是指，用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群体源自于所述患者或源自于相容与供体的人白细胞抗原(HLA)。术语“同种异体的(allogeneic)”是指用于治疗患者的细胞或细胞群体不是源于所述患者而是源于供体。
在上一节中描述了可以用于披露的方法的细胞。所述治疗可以用来治疗确诊的患者，其中恶化前或恶性癌症病症特征在于CLL1表达细胞，尤其是过多的CLL1表达细胞。在血液癌，如白血病，中发现这样的病症。
在一种实施方式中，本发明提供了组合物，其用于治疗CLL1表达细胞介导的疾病，尤其是CLL1表达细胞介导的血癌，所述组合物包含本发明的所述抗CLL1 scCAR表达T细胞。
借助于本发明的抗CLL1 CAR表达细胞，可以改善本文所公开的任何其它CLL1介导的或涉及CLL1的恶性淋巴增生性疾病。
在优选实施方式中，可以利用本发明的抗CLL1 CAR表达细胞加以治疗的癌症是白血病，与白血病关联的疾病或其并发症。
可以利用本发明的抗CLL1 CAR表达细胞加以治疗的白血病可以是急性髓性白血病(AML)。可以利用本发明的抗CLL1 scCAR表达细胞加以治疗的AML或AML亚型可以尤其是急性成骨髓性白血病、最小分化的急性成骨髓性白血病、急性成骨髓性白血病(没有成熟)、具有粒细胞成熟的急性成骨髓性白血病、前髓细胞或急性前骨髓性白血病(APL)、急性髓细胞单核细胞白血病、髓细胞单核细胞以及骨髓嗜伊红细胞增多、急性成单核细胞白血病(M5a)或急性单核细胞白血病(M5b)、急性红细胞样白血病，包括红白血病(M6a)和非常罕见的纯红细胞样白血病(M6b)、急性成巨核细胞白血病、急性嗜碱细胞白血病、具有骨髓纤维化的急性全骨髓增生，不管是否涉及CLL1阳性细胞。
AML的亚型还包括多毛细胞白血病、费城染色体阳性急性成淋巴细胞白血病。AML可以被归类为具有特定遗传异常的AML。分类是基于核型预测对诱导治疗的反应、复发风险、存活的能力。
因此，可以利用本发明的抗CLL1 CAR表达细胞加以治疗的AML可以是在染色体8和21之间具有易位的AML、在染色体16中具有易位或倒位的AML、在染色体9和11之间具有易位的AML、在染色体15和17之间具有易位的APL(M3)、在染色体6和9之间具有易位的AML、在染色体3中具有易位或倒位的AML、在染色体1和22之间具有易位的AML(原巨核细胞)。
本发明特别可用于治疗与这些特定的细胞遗传学标记相关的AML。
本发明还提供了抗CLL1 CAR表达T细胞，用于治疗具有AML的特定的细胞遗传学亚群的患者，如具有利用全反式视黄酸(ATRA)16-19所确定的t(15；7)(q22；q21)的患者，以及用于治疗具有利用重复剂量的高剂量阿糖胞苷所确定的t(8；21)(q22；q22)或inv(16)(p13q22)/t(16；16)(p13；q22)的患者。
优选地，本发明提供了抗CLL1 CAR表达T细胞，用于治疗具有畸变，如-5/del(5q)、-7、3q的异常、或复合核型的患者，其已显示具有较低的完全缓解率和存活。
如在本文中所使用的，术语“治疗剂”、“化疗剂”、或“药物”或“抗癌药物”是指药剂，优选化合物或其衍生物，其可以与癌细胞相互作用，从而减弱细胞的增殖状态和/或杀伤细胞。化疗剂或“抗癌药物”的实例包括但不限于烷基化剂(例如，白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、氮芥、奥沙利铂、乌拉莫司汀、替莫唑胺、福莫司汀)、代谢拮抗剂(例如，嘌呤核苷抗代谢物如氯法拉滨、氟达拉滨或2’-脱氧腺苷、氨甲喋呤(MTX)、5-氟尿嘧啶或它们的衍生物、硫唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、氨甲喋呤、培美曲塞)、抗肿瘤抗生素(例如，丝裂霉素、阿霉素、博来霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、羟基脲、伊达比星、丝裂霉素C、米托蒽醌)、植物来源的抗肿瘤剂(例如，长春新碱、长春地辛、泰素、长春碱、长春瑞滨、多西他赛、紫杉醇)、拓扑异构酶抑制剂(伊立替康、托泊替康、依托泊苷)。
在优选实施方式中，如在本文中所使用的，治疗剂、化疗药物是指化合物或其衍生物，其可以用来治疗癌症，尤其是用来治疗造血癌细胞以及更特别地AML，从而减弱癌细胞的增殖状态和/或杀伤癌细胞。化疗剂的实例包括但不限于阿糖胞苷(aracytine)、胞嘧啶、阿糖胞苷(arabinoside)、安吖啶、柔红霉素、伊达比星、诺消灵、米托蒽醌、凡必士、依托泊苷(VP16)、三氧化二砷、反式视黄酸、氮芥、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、和它们的组合。
在本发明的其它实施方式中，连同药物(或药剂)一起将本发明的细胞给予患者，其中上述药物(或药剂)选自阿糖胞苷(aracytine)、胞嘧啶、阿糖胞苷(arabinoside)、安吖啶、柔红霉素、伊达比星、诺消灵、米托蒽醌、凡必士、依托泊苷(VP16)、三氧化二砷、反式视黄酸、阿糖胞苷(cytarabine)、蒽环霉素、6-硫鸟嘌呤、羟基脲、泼尼松、和它们的组合。
这样的药剂可以进一步包括但不限于抗癌剂TRIMETHOTRIXATETM(TMTX)、TEMOZOLOMIDETM、RALTRITREXEDTM、S-(4-硝基苄基)-6-硫代肌苷(NBMPR)、6-苄基胍(6-BG)、二氯亚硝基脲(BCNU)和CAMPTOTHECINTM、或其任何的治疗衍生物。
在更优选的实施方式中，连同至少一种治疗剂一起，将抗CLL1 scCAR表达T细胞给予患者，其中上述治疗剂选自阿糖胞苷、胞嘧啶、阿糖胞苷、安吖啶、柔红霉素、伊达比星、诺消灵、米托蒽醌、凡必士、依托泊苷(VP16)、三氧化二砷、反式视黄酸和它们的组合。
如在本文中所使用的，"耐或耐受"药剂的细胞是指已被基因修饰的细胞，以致在一定量的抑制或防止没有修饰的细胞的增殖的药剂的存在下细胞增殖。
患者组
在优选实施方式中，本发明提供了在60岁以上的患者中或在不到20岁的患者中对AML的治疗。
在更优选的实施方式中，本发明提供了儿科治疗，尤其是针对AML、或AML相关疾病或并发症的儿科治疗。
在又一种优选实施方式中，本发明用于治疗这样的AML患者，其具有低、差的或不利状态，也就是说，具有不到5年存活率的预测的存活。在此组中，患有AML并具有以下细胞遗传学特征：-5；5q；-7；7q-；11q23；non t(9；11)；inv(3)；t(3；3)；t(6；9)；t(9；22)的患者与风险较低的状态相关(Byrd J.C.et al.,December 15,2002；Blood:100(13))并且特别设想根据本发明或借助于本发明的目的加以治疗。
在一种实施方式中，在AML患者中，本发明的抗CLL1 CAR表达T细胞可以用作诱导治疗，用作AML的缓解后治疗或用作巩固治疗。
在一种实施方式中，在AML复发的情况下，或在难治或耐药的AML的情况下，以及更优选，连同至少一种其它抗癌药物一起，可以使用本发明的抗CLL1 CAR表达T细胞。
在另一优选实施方式中，本发明的至少一种抗CLL1 CAR表达细胞用于防止发生癌细胞发展，尤其是在抗癌治疗以后，在骨髓衰竭期间或在骨髓移植以前，在骨髓破坏以后。
AML并发症
在一种特定的实施方式中，本发明提供了药剂，其改善患者的健康状况，尤其是经历与AML有关的并发症的患者。更优选地，本发明的所述工程化抗CLL1 CAR表达T细胞表达本发明的至少一种抗CLL1 CAR并且用作药剂，用于治疗与AML有关的并发症。
与AML有关的并发症或疾病可以包括髓细胞发育不良前期(precedingmyelodysplasia phase)，继发性白血病(secondary leukemia)，尤其是继发性AML(secondary AML)，高白细胞计数，以及奥尔杆的缺乏(absence of Auer rod)。其中，白细胞淤滞和中枢神经系统(CNS)的参与、白细胞过多、残留病，也被认为是与AML有关的并发症或疾病。
AML相关疾病
在一种实施方式中，本发明还提供了抗CLL1 CAR表达T细胞，用于治疗与AML有关的病理状况。
本发明提供了AML相关骨髓肿瘤、急性骨髓性白血病和骨髓增生异常综合征的治疗，复发或难治急性骨髓性白血病的治疗，在成人中复发或难治急性前骨髓性白血病的治疗，急性前髓白血病的治疗，在60岁以上的成人中急性骨髓性白血病的治疗。
根据另一方面，本发明提供了组合物，用于治疗AML相关疾病，尤其是与AML有关的恶性血液病。
与AML病症有关的恶性血液病包括骨髓增生异常综合征(MDS，以前称为"白血病前期(preleukemia)")，其是由髓样血细胞的无效生产(或发育不良)和转化成AML的风险所联合的血液病症的多种多样的集合。
借助于本发明的适当应用，可以改善与AML的风险相关的其它病理状况或遗传性综合征，所述遗传性综合征包括唐氏综合征、三体性、范科尼贫血、布卢姆综合征、毛细血管扩张性共济失调、戴-布贫血、舒-戴综合征、利-弗综合征、神经纤维瘤病1型、重症先天性中性白细胞减少(还被称为科斯特曼综合征)。
其它CLL1介导的病理状况
根据另一方面，本发明提供了用于治疗CLL1+细胞介导疾病的组合物。这些CLL1+细胞介导疾病包括炎症，如类风湿性关节炎。
尤其是，本发明可以用于治疗CLL1+细胞介导疾病如炎症以及更特别地类风湿性关节炎。
组合物
本发明还提供了组合物，其包含根据本发明的工程化T细胞，用于治疗疾病的用途或方法。
在一个方面，疾病是血癌，尤其是干细胞癌，包括但不限于白血病(如急性髓性白血病(AML)或其并发症。
本发明还提供了供其应用的组合物或在患者中用于抑制增殖或减小CLL1表达细胞群体或活性的方法。示例性方法包括使包含CLL1表达细胞的细胞群体接触本发明的抗CLL1 CART细胞，以及尤其是scCART，其结合于CLL1表达细胞。
在更具体的方面，本发明提供了供它应用的组合物或在患者中用于抑制增殖或减小表达CLL1的癌细胞群体的方法，上述方法包括使CLL1表达癌细胞群体接触本发明的抗CLL1 CART细胞，以及尤其是scCART，其结合于CLL1表达细胞，结合本发明的抗CLL1 CAR细胞，以及尤其是scCART与CLL1表达癌细胞，从而导致CLL1表达癌细胞的损坏。
在某些方面，相对于阴性对照，在患有骨髓白血病或与CLL1表达细胞相关的另一种癌症的受试者中或在骨髓白血病或与CLL1表达细胞相关的另一种癌症的动物模型中，本发明的抗CLL1 CART细胞，以及尤其是scCART，降低细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分比至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％、或至少99％(到无法检测的水平)。
本发明还提供了供其应用的组合物或用于预防、治疗和/或管理与CLL1表达细胞相关的(例如，与血癌相关的)疾病或病症的方法，上述方法包括给予需要的受试者本发明的抗CLL1 CART细胞，以及尤其是scCART，其结合于CLL1表达细胞。在一个方面，受试者是人。与CLL1表达细胞相关的疾病的非限制性实例包括炎症性疾病(如类风湿性关节炎)和癌症(如血癌，尤其是AML或AML并发症)。
本发明还提供了供其应用的组合物或用于预防、治疗和/或管理与CLL1表达细胞相关的疾病的方法，上述方法包括给予需要的受试者本发明的抗CLL1 CART细胞，以及尤其是scCART，其结合于CLL1表达细胞。在一个方面，上述受试者是人。与CLL1表达细胞相关的疾病的非限制性实例尤其包括急性骨髓性白血病(AML)。
本发明提供了供其应用的组合物或用于治疗或预防与CLL1表达细胞相关的癌症的复发的方法，上述方法包括给予对其需要的受试者本发明的抗CLL1 CART细胞，以及尤其是scCART，其结合于CLL1表达细胞。在另一方面，上述方法包括给予对其需要的受试者有效量的本发明的抗CLL1 CART细胞，以及尤其是scCART，其结合于CLL1表达细胞并连同于有效量的另一种疗法。
在一个方面，CLL1被认为是在AML中的"癌症干细胞"标记。因此，本发明的抗CLL1CART细胞，以及尤其是scCART，可以防止AML的复发，或甚至治疗AML，其大多是CLL1阴性但具有CLL1+细胞(CLL1表达细胞)的"干"群体。
在一个方面，本发明提供了用于治疗受试者的组合物和方法，上述受试者已经历对与CD 19的升高的表达水平相关的疾病或障碍的治疗并且呈现出与CLL1的升高水平相关的疾病或障碍。
借助于根据本发明的工程化免疫细胞的治疗可以连同于选自以下各项的组的一种或多种抗癌治疗：抗体治疗、化疗、细胞因子治疗、树突状细胞疗法、基因治疗、激素治疗、激光治疗和放射治疗。
优选地，可以连同(例如，以前、同时或以后)选自以下各项的一种或多种抗癌治疗一起来给予借助于根据本发明的工程化免疫细胞的治疗：阿糖胞苷、胞嘧啶、阿糖胞苷、安吖啶、柔红霉素、伊达比星、诺消灵、米托蒽醌、凡必士、依托泊苷(VP16)、三氧化二砷、反式视黄酸、三氧化二砷、反式视黄酸、氮芥、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥的组合、和它们的组合。
根据本发明的优选实施方式，可以将所述治疗给予经历免疫抑制治疗的患者。确实，本发明优选依靠细胞或细胞群体，其已被变得耐至少一种免疫抑制剂，这是由于编码针对上述免疫抑制剂的受体的基因的失活。在这方面，免疫抑制治疗应该帮助在患者内根据本发明的T细胞的选择和扩增。
可以以任何方便的方式来给予根据本发明的细胞或细胞群体，包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输入、植入或移植。可以皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉注射或淋巴内注射、或腹腔内，来将本文中所描述的组合物给予患者。在一种实施方式中，优选通过静脉注射来给予本发明的细胞组合物。
细胞或细胞群体的给予可以由以下组成，给予104-109个细胞/公斤体重，优选105至106个细胞/公斤体重，包括在这些范围内的细胞数量的所有整数值。可以以一种或多种剂量来给予细胞或细胞群体。在另一种实施方式中，作为单剂量，来给予所述有效量的细胞。在另一种实施方式中，在一段时间内，作为一个以上剂量，来给予所述有效量的细胞。给予的时间是在管理医师的判断之内并且取决于患者的临床状况。可以从任何来源获得细胞或细胞群体，如血库或供体。虽然个人需求不同，但对于特定的疾病或病症，有效量的给定细胞类型的最佳范围的确定是在本领域的技术范围内。有效量是指提供治疗或预防益处的量。给予的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所需效果的特性。
在另一种实施方式中，胃肠道外给予所述有效量的细胞或包含那些细胞的组合物。所述给予可以是静脉给予。可以通过在肿瘤内的注射来直接完成所述给予。
在本发明的某些实施方式中，连同(例如，之前、同时或之后)任何数目的相关治疗方式一起来将细胞给予患者，包括但不限于借助于药剂的治疗如抗病毒治疗，用于MS患者的西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(还称为ARA-C)或那他珠单抗治疗，或用于银屑病患者的依法利珠单抗治疗，或用于PML患者的其它治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可以连同化疗、辐射、免疫抑制剂一起使用，如环孢素、硫唑嘌呤、氨甲喋呤、麦考酚酯、和FK506、抗体、或其它免疫清除剂如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体治疗、细胞毒素、氟达拉滨、环孢素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子、和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢素和FK506)或抑制p70S6激酶，其对于生长因子诱导信号(雷帕霉素)是重要的(Henderson,Naya et al.1991；Liu,Albers et al.1992；Bierer,Hollander et al.1993)。
在进一步的实施方式中，连同(例如，之前、同时或之后)骨髓移植，T细胞消融疗法(其中使用化疗剂如，氟达拉滨，外束放射治疗(XRT)，环磷酰胺，或抗体如OKT3或CAMPATH)一起，将本发明的细胞组合物给予患者。
在另一种实施方式中，在B细胞消融疗法如药剂(其与CD20，例如，利妥昔单抗反应)以后，给予本发明的细胞组合物。例如，在一种实施方式中，受试者可以经受高剂量化疗的标准治疗，接着外周血干细胞移植。在某些实施方式中，移植后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的注入。在另外的实施方式中，手术前或手术后，给予扩增的细胞。
在本发明的某些实施方式中，连同(例如，之前、同时或之后)药物一起来将抗CLL1scCAR表达细胞给予患者，其中上述药物选自阿糖胞苷、胞嘧啶、阿糖胞苷、安吖啶、柔红霉素、伊达比星、诺消灵、米托蒽醌、凡必士、依托泊苷(VP16)、三氧化二砷、反式视黄酸、三氧化二砷、反式视黄酸、氮芥、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥的组合、和它们的组合。在这些实施方式中，抗CLL1 scCAR表达细胞可以耐连同抗CLL1 scCAR表达细胞一起给予的特定药物或药物的组合。
在本发明的其它实施方式中，连同药物一起将抗CLL1 scCAR表达细胞给予患者，其中上述药物选自阿糖胞苷、蒽环霉素、6-硫鸟嘌呤、羟基脲、泼尼松、和它们的组合。
其它定义
除非另有规定，可互换使用"一"、"一种"、"该"、和"至少一种"并且是指一个或多于一个。本文按照单字母代码来指定在多肽序列中的氨基酸残基，其中，例如，Q表示Gln或谷氨酰胺残基，R表示Arg或精氨酸残基，以及D表示Asp或天冬氨酸残基。
氨基酸替代是指用另一个氨基酸残基来替代一个氨基酸残基，例如在肽序列中用谷氨酰胺残基对精氨酸残基的替代是氨基酸替代。
指定核苷酸如下：单字母代码用于指定核苷的碱基：A是腺嘌呤，T是胸腺嘧啶，C是胞嘧啶，以及G是鸟嘌呤。对于简并核苷酸，r表示g或a(嘌呤核苷酸)，k表示g或t，s表示g或c，w表示a或t，m表示a或c，y表示t或c(嘧啶核苷酸)，d表示g、a或t，v表示g、a或c，b表示g、t或c，h表示a、t或c，以及n表示g、a、t或c。
如在本文中所使用的，“核酸”或“多核苷酸”是指核苷酸和/或多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通过聚合酶链反应(PCR)所产生的片段、以及通过连接、切割、核酸内切酶作用、和核酸外切酶作用的任何一种所产生的片段。核酸分子可以由单体组成，其中上述单体是自然发生的核苷酸(如DNA和RNA)、或自然发生的核苷酸的类似物(例如，自然发生的核苷酸的对映体形式)，或两者的组合。修饰核苷酸可以具有在糖部分中和/或在嘧啶或嘌呤碱基部分中的变化。糖修饰包括，例如，用卤素、烷基、胺、和叠氮基来替代一个或多个羟基，或糖可以被官能化为醚或酯。此外，可以用空间和电子相似的结构，如氮杂糖和碳环糖类似物，来替代整个糖部分。在碱基部分中的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、或其它公知的杂环替代物。可以通过磷酸二酯键或上述键的类似物来连接核酸单体。核酸可以是单链或双链。
“递送载体(delivery vector)”或“递送载体(delivery vectors)”是指任何递送载体，其可以在本发明中用来实现细胞接触(即“接触”)或在细胞或亚细胞室内递送(即“引入”)在本发明中需要的药剂/化学品和分子(蛋白质或核酸)。它包括但不限于脂质体递送载体、病毒递送载体、药物递送载体、化学载体、聚合物载体、阳离子脂质体(lipoplex)、聚合复合物、树枝状聚合物、微泡(超声造影剂)、纳米颗粒、乳液或其它适当的转移载体。这些递送载体允许递送分子、化学品、大分子(基因、蛋白质)、或其它载体如质粒、肽(由Diatos开发的)。在这些情况下，递送载体是分子载体。“递送载体(delivery vector)”或“递送载体(delivery vectors)”还旨在用来进行转染的递送方法。
术语“载体(vector)”或“载体(vectors)”是指核酸分子，其能够将另一核酸转运到已连接的核酸。在本发明中的“载体”包括但不限于病毒载体、质粒、RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子，其可以由以下组成：染色体、非染色体、半合成或合成核酸。优选的载体是那些载体，其能够自主复制(附加型载体(episomal vector))和/或表达它们所连接的核酸(表达载体)。大量的适宜的载体是本领域技术人员已知的并且可商购的。
病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒，细小病毒(例如腺相关病毒)，冠状病毒，负链RNA病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)，弹状病毒(例如，狂犬病和水泡性口炎病毒)，副粘病毒(例如麻疹和仙台)，正链RNA病毒如微小RNA病毒和α病毒，和双链DNA病毒，其包括腺病毒，疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒类型1和2、EB病毒、巨细胞病毒)，和痘苗病毒(例如，牛痘、鸡痘和金丝雀痘)。其它病毒包括，例如，诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒、和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒，HTLV-BLV组，慢病毒，泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:Theviruses and their replication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。
“慢病毒载体”是指基于HIV的慢病毒载体，其用于基因递送是非常有前途的，这是由于它们的相对较大的包装能力、降低的免疫原性以及它们高效率地稳定转导大范围的不同细胞类型的能力。通常在三种(包装、包膜和转运)或更多种质粒瞬时转染进入生产者细胞以后生成慢病毒载体。像HIV，通过病毒表面糖蛋白与在细胞表面上的受体的相互作用，慢病毒载体进入靶细胞。在进入以后，病毒RNA经历逆转录，其是由病毒逆转录酶复合物所介导。逆转录的产物是双链线性病毒DNA，其是在感染细胞的DNA中用于病毒整合的底物。“整合型慢病毒载体(或LV)”是指这样的载体，作为非限制性实例，其能够整合靶细胞的基因组。相反，“非整合型慢病毒载体(或NILV)”是指有效的基因递送载体，其并不通过病毒整合酶的作用来整合靶细胞的基因组。
可以借助于任何细胞透化技术如声致孔或电穿孔或这些技术的衍生技术来关联或组合递送载体和载体。
细胞(cell or cells)是指任何真核生物活细胞、原代细胞和细胞系，其衍生自这些生物，用于体外培养。
“原代细胞(primary cell)”或“原代细胞(primary cells)”是指直接取自活组织(即活检材料)并建立用于体外生长的细胞，其已经历极少数的群体倍增并因此，相较于连续致瘤或人工永生化细胞系，更为代表地它们所从其衍生的组织的主要功能组件和特性。
作为非限制性实例，细胞系可以选自由CHO-K1细胞；HEK293细胞；Caco2细胞；U2-OS细胞；NIH 3T3细胞；NSO细胞；SP2细胞；CHO-S细胞；DG44细胞；K-562细胞；U-937细胞；MRC5细胞；IMR90细胞；Jurkat细胞；HepG2细胞；HeLa细胞；HT-1080细胞；HCT-116细胞；Hu-h7细胞；Huvec细胞；Molt 4细胞组成的组。
可以通过本发明的方法来修饰所有这些细胞系来提供细胞系模型以产生、表达、量化、检测、研究感兴趣的基因或蛋白质；这些模型还可以用来筛查在研究和生产以及各种领域如化学、生物燃料、治疗学和农艺学(作为非限制性实例)中感兴趣的生物活性分子。
“突变”是指在多核苷酸(cDNA，基因)或多肽序列中最多达一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、二十个、二十五个、三十个、四十个、五十个、或更多核苷酸/氨基酸的替代、缺失、插入。突变可以影响基因的编码序列或它的调节序列。它还可能影响基因组序列的结构或编码的mRNA的结构/稳定性。
“变体”是指通过在母体分子的氨基酸序列中至少一个残基的突变或替代所获得的重复变体、变体、DNA结合变体、TALE核酸酶变体、多肽变体。
“功能变体”是指蛋白质或蛋白质结构域的催化活性突变体；相比与它的母蛋白质或蛋白质结构域或另外的性能，这样的突变体可能具有相同的活性，或更高或更低的活性。
"一致性"是指在两个核酸分子或多肽之间的序列一致性。可以通过比较在为比较目的可以加以对齐的每个序列中的位置来确定一致性。当在比较序列中的位置由相同碱基占据时，那么在上述位置处分子是相同的。在核酸或氨基酸序列之间的相似性或一致性的程度是在由核酸序列共享的位置处相同或匹配的核苷酸的数目的函数。多种比对算法和/或程序可以用来计算在两个序列之间的一致性，包括FASTA、或BLAST，其可用作GCG序列分析包(University of Wisconsin,Madison,Wis.)的一部分，并且可以连同，例如，默认设置一起加以使用。例如，设想，与本文中所描述的具体多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％一致性并且优选表现出基本相同的功能的多肽，以及编码这样的多肽的多核苷酸。
“相似性”描述在两种或更多种多肽的氨基酸序列之间的关系。BLASTP还可以用来确定，与参比氨基酸序列，具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％序列相似性的氨基酸序列，其中利用相似性矩阵如BLOSUM45、BLOSUM62或BLOSUM80。除非另有说明，相似性得分将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，百分比相似性是基于BLASTP阳性得分以及百分比序列一致性是基于BLASTP一致性得分。BLASTP“一致性”显示在相同的高得分序列对中总残基的数量和分数；以及BLASTP“阳性”显示对其对齐得分具有正值以及是彼此相似的残基的数量和分数。本发明预期和包括这样的氨基酸序列，其与本文所公开的氨基酸序列，具有这些程度的一致性或相似性或任何中等程度的一致性或相似性。类似多肽的多核苷酸序列是利用遗传密码加以推导并且可以通过常规方法来获得。例如，相对于如在WO2013176916中披露的SEQ ID NO:107的氨基酸序列，pTα的功能变体可以具有70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％序列相似性。将通过利用遗传密码来反向翻译它的氨基酸序列以产生编码这样的功能变体的多核苷酸。
如在本文中所使用的，术语"受试者"或“患者”包括动物界的所有成员，其包括非人类灵长类动物和人类。
术语"复发的"是指这样的情况，其中在治疗以后已经有了癌症的缓解的受试者或哺乳动物具有癌细胞的返回。
术语"难治的或耐受的"是指这样的情况，其中甚至在强化治疗以后，受试者或哺乳动物在其体内仍然具有残余癌细胞。
术语"耐药性"是指这样的病症，其中疾病并不对药物的治疗作出反应。耐药性可以是内在的(或原始耐药)，其意味着疾病从未对药物作出反应，或它可以是获得性的，其意味着疾病停止对疾病先前对其作出反应的药物作出反应(继发性抗性)。在某些实施方式中，耐药性是内在的。在某些实施方式中，耐药性是获得性的。
术语"恶性血液病"或“血癌”是指身体的血液-骨髓和/或淋巴组织的癌症。血液恶性肿瘤的实例尤其包括急性骨髓性白血病(AML)、具有三系脊髓发育不良的AML(AML/TMDS)、混合系白血病(MLL)、和其它AM相关疾病。
术语"白血病"是指血液形成组织的恶性肿瘤，尤其包括急性骨髓性白血病或急性髓性白血病(AML)。
本发明的以上书面说明提供了制作和使用它的方式和方法，以致任何本领域技术人员能够制作和使用它，此实现被尤其提供用于所附权利要求的主题，其构成原始描述的一部分。
在本文中陈述数值限制或范围的情况下，包括端点。此外，具体包括在数值限制或范围内的所有值和子范围，好像明确写出。
提供以上描述以使本领域技术人员能够实施和应用本发明，并提供在特定申请和其要求的上下文中。对于本领域技术人员而言，对于优选实施方式的各种改变将是容易明了的，以及本文定义的一般原则可以适用于其它实施方式和应用而不偏离本发明的精神和范围。因而，本发明并不旨在限于示出的实施方式，而是包括与本文所公开的原理和特点一致的最广泛的范围。
已通常描述了本发明，通过参考某些具体实施例，可以获得进一步理解，其中本文中提供的上述具体实施例仅用于说明的目的而不是限制性(除非另有规定)。
实施例
一般方法
原代T细胞培养
利用菲可梯度密度介质(Ficoll gradient density medium)，由EFS(Etablissement
Figure BDA0001358281550000851
du Sang,巴黎,法国)提供的白细胞层(buffy coat)样品中纯化T细胞。回收PBMC层并利用市售T细胞富集试剂盒来纯化T细胞。在补充有20ng/mL人IL-2、5％人、和Dynabeads人T激活子CD3/CD28(珠:细胞比率为1:1(Life Technologies))，的X-VivoTM-15培养基(Lonza)中激活纯化的T细胞。
scCAR mRNA转染
在T细胞纯化和激活以后的第4天或第11天进行转染。用15μg的编码不同scCAR构建体的mRNA来转染5百万个细胞。利用通过使用Cytopulse技术所完成的T7mRNA聚合酶转染来产生scCAR mRNA，其中通过在0.4cm间隙小池中在200μl的“Cytoporation缓冲液T”(BTXHarvard Apparatus)的最终体积中，以3000V/cm施加两个0.1mS脉冲，接着以325V/cm施加四个0.2mS脉冲。在X-VivoTM-15培养基中立即稀释细胞并在37℃和5％CO2下加以温育。在20ng/mL下电穿孔以后2小时，添加IL-2。
脱粒作用测定(CD107a移动)
在96孔板(40,000个细胞/孔)中，连同等量的表达各种水平的CLL1蛋白的细胞一起，来温育T细胞。在37℃和5％CO2下，将共培养物保持在100μl的X-VivoTM-15培养基(Lonza)的最终体积中6小时。在细胞刺激期间进行CD107a染色，其中通过在共培养开始时添加荧光抗CD107a抗体、以及1μg/ml的抗CD49d、1μg/ml的抗CD28、和1x莫能菌素(Monensin)溶液。在6小时温育期以后，用可固定的活力染料和荧光色素-结合抗CD8来染色细胞并通过流式细胞术加以分析。脱粒作用活性被确定为CD8+/CD107a+细胞的％，以及通过确定在CD8+细胞中针对CD107a染色的平均荧光强度信号(MFI)。在mRNA转染以后24小时，进行脱粒作用测定。
IFNγ释放测定
在96孔板(40,000个细胞/孔)中，连同表达各种水平的CLL1蛋白的细胞系一起，来温育T细胞。在37℃和5％CO2下，将共培养物保持在100μl的X-VivoTM-15培养基(Lonza)的最终体积中24小时。在此温育期以后，在1500rpm下离心上述板5分钟并在新板中回收上清。通过ELISA测定来进行在细胞培养上清中的IFNγ检测。通过在mRNA转染以后24小时，开始细胞共培养，来进行IFNγ释放测定。
细胞毒性测定
在96孔板(100,000个细胞/孔)中，连同在相同孔中的10,000个靶细胞(表达CLL1)和10,000个对照(CLL1阴性(CLL1neg))细胞一起，来温育T细胞。在连同scCAR+T细胞一起共培养它们以前，用荧光细胞内染料(CFSE或Cell Trace Violet)来标记靶细胞和对照细胞。在37℃和5％CO2下温育共培养物4小时。在此温育期以后，用可固定的活力染料来标记细胞并通过流式细胞术加以分析。确定每个细胞群体(靶细胞或CLL1阴性对照细胞)的活力并计算特异性细胞裂解的％。在mRNA转染以后48小时，进行细胞毒性测定。
T细胞转导
在T细胞纯化/激活以后三天，进行用scCAR转导具有重组慢病毒载体表达的T细胞。利用重组蛋白(其由人CLL1蛋白的胞外结构域的融合连同鼠IgG1Fc片段组成)，进行在T细胞的表面上的scCAR检测。借助于靶向蛋白质的小鼠Fc部分的荧光色素-结合二抗来检测这种蛋白质与scCAR分子的结合，并通过流式细胞术加以分析。
抗肿瘤小鼠模型
用(CLL1表达_MOLM13-荧光素酶细胞来静脉内(iv)注射免疫缺陷NOG小鼠，作为AML异种移植小鼠模型。可选地，小鼠接受抗癌治疗。然后，用不同剂量的待测试的scCAR+T细胞，或使用没有用scCAR慢病毒载体加以转导的T细胞，来iv注射小鼠(在肿瘤细胞系的注射以后的2或7天)。在T细胞注射的当天(D0)、在T细胞注射以后的第7、14、21、28和40天，确定生物发光信号，以在不同动物上进行肿瘤进展。
实施例1：表达CLL1-scCAR的TCRα失活细胞的增殖
设计和生产了异二聚体TALE核酸酶，该核酸酶靶向两个17-bp长序列(称为半靶(half target))，其由在T细胞受体α恒定链区(TRAC)基因内的15-bp间隔子(spacer)分开。每个半靶由列于表10的半TALE核酸酶的重复序列所识别。
表10：靶向TCRα基因的TAL核酸酶
Figure BDA0001358281550000871
在哺乳动物表达载体中，在T7启动子的控制下，利用限制酶消化，来亚克隆每种TALE核酸酶构建体。编码TALE核酸酶切割TRAC基因组序列的mRNA由质粒合成，所述质粒携带T7启动子下游的编码序列。
用编码两个半TRAC_T01 TALE核酸酶的2种mRNA的每一种来转染在72小时期间用抗CD3/CD28涂层珠预先激活的纯化T细胞。转染后48小时，用编码先前描述的抗CLL1 scCAR(SEQ ID NO:35至112)之一的慢病毒载体来分别地转导来自相同供体的T细胞的不同组。转导后2天，利用抗CD3磁珠来纯化CD3阴性细胞以及用可溶抗CD28(5μg/ml)来重新激活转导后5天的细胞。
在重新激活以后最长达30天通过计数细胞每周2次来进行细胞增殖。相比与非转导的细胞，观测到，在表达CLL1 scCAR的TCRα失活的细胞中，尤其是当用抗CD28加以重新激活时，增加的增殖。
为了研究表达CLL1-scCAR的人T细胞是否显示激活状态，转导后7天，通过FACS来分析激活标记CD25的表达。测定用编码CLL1 scCAR的慢病毒载体转导的纯化细胞在它们的表面上的CD25表达，以与非转导细胞比较来评估它们的激活。预期在CD28重新激活或没有重新激活条件中均有增加的CD25表达。
实施例2：利用各种抗CLL1抗体片段来构建CLL1 scCAR
原代T细胞培养
利用菲可梯度密度介质(Ficoll gradient density medium)(Ficoll PaquePLUS/GE Healthcare Life Sciences)，由EFS(Etablissement
Figure BDA0001358281550000872
du Sang,巴黎,法国)提供的白细胞层(buffy coat)样品纯化T细胞。回收PBMC层并利用市售T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)来纯化T细胞。在补充有20ng/mL人IL-2(MiltenyiBiotech)、5％人血清(Sera Laboratories)、和Dynabeads人T激活子CD3/CD28，珠:细胞比率为1:1(Life Technologies)，的X-VivoTM-15培养基(Lonza)中来激活纯化T细胞。在激活以后，在补充有20ng/mL人IL-2(Miltenyi Biotec)和5％人血清(Sera Laboratories)的X-VivoTM-15培养基(Lonza)中生长和保持细胞。
scCAR mRNA转染
在T细胞纯化和激活以后第4天或第11天进行转染。用15μg的编码不同scCAR构建体的mRNA来转染5百万个细胞。利用mMESSAGE mMACHINE T7试剂盒(Life Technologies)来产生scCAR mRNA并利用RNeasy Mini Spin柱(Qiagen)加以纯化。利用Cytopulse技术来进行转染，其中通过在0.4cm间隙小池中并在200μl的“Cytoporation缓冲液T”(BTX HarvardApparatus)的最终体积中施加两个3000V/cm的0.1mS脉冲，接着325V/cm的四个0.2mS脉冲。将细胞立即稀释于X-VivoTM-15培养基(Lonza)中并在37℃和5％CO2下温育。在电穿孔以后2小时，以20ng/mL，添加IL-2(来自Miltenyi Biotec)。
脱粒作用测定(CD107a移动)
在96孔板(40,000个细胞/孔)中，连同等量的表达或不表达CLL1蛋白的细胞一起，温育T细胞。在37℃和5％CO2下，将共培养物保持在100μl的X-VivoTM-15培养基(Lonza)的最终体积中6小时。在细胞刺激期间进行CD107a染色，其中通过在共培养的开始时添加荧光抗CD107a抗体(APC结合的，来自Miltenyi Biotec)，以及1μg/ml的抗CD49d(BD Pharmingen)、1μg/ml的抗CD28(Miltenyi Biotec)、和1x莫能菌素(Monensin)溶液(eBioscience)。在6小时温育期以后，用可固定的活力染料(eFluor 780，来自eBioscience)和荧光色素-结合抗CD8(PE结合的，Miltenyi Biotec)来染色细胞并通过流式细胞术加以分析。脱粒作用活性被确定为CD8+/CD107a+细胞的％，以及通过确定在CD8+细胞中CD107a染色的平均荧光强度信号(MFI)。在mRNA转染以后24小时进行脱粒作用测定。
IFNγ释放测定
在96孔板(40,000个细胞/孔)中，以及连同表达或不表达CLL1蛋白的细胞系一起，来温育T细胞。在37℃和5％CO2下，将共培养物保持在100μl的X-VivoTM-15培养基(Lonza)的最终体积中24小时。在此温育期以后，在1500rpm下离心孔板5分钟并在新板中回收上清。通过ELISA测定(Human IFN-γQuantikine ELISA试剂盒，来自R&D Systems)，在细胞培养上清中进行IFNγ检测。通过在mRNA转染以后24小时，开始细胞共培养来进行IFNγ释放测定。
细胞毒性测定
在96孔板(100,000个细胞/孔)中，以及连同在相同孔中的10,000个靶细胞(表达CLL1)和10,000个对照(CLL1阴性)细胞一起，来温育T细胞。在连同scCAR+T细胞一起来共培养它们以前，用荧光细胞内染料(CFSE或Cell Trace Violet，来自Life Technologies)来标记靶细胞和对照细胞。在37℃和5％CO2下，温育共培养物4小时。在此温育期以后，用可固定的活力染料(eFluor 780，来自eBioscience)来标记细胞并通过流式细胞术加以分析。确定每个细胞群体(靶细胞或CLL1阴性对照细胞)的活力以及计算特异性细胞裂解的％。在mRNA转染以后48小时，进行细胞毒性测定。
示例性抗CLL1单链嵌合抗原受体
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sc G12 CAR-v5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.99)
Figure BDA0001358281550001075
Figure BDA0001358281550001081
sc G12 CAR-v6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.100)
Figure BDA0001358281550001082
sc 21.26 CAR-v1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.101)
Figure BDA0001358281550001083
sc 21.26 CAR-v2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.102)
Figure BDA0001358281550001084
Figure BDA0001358281550001091
sc 21.26 CAR-v3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.103)
Figure BDA0001358281550001092
sc 21.26 CAR-v4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.104)
Figure BDA0001358281550001093
sc 21.26 CAR-v5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.105)
Figure BDA0001358281550001094
sc 21.26 CAR-v6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.106)
Figure BDA0001358281550001101
sc 1075.7 CAR-v1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.107)
Figure BDA0001358281550001102
sc 107S.7 CAR-v2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.108)
Figure BDA0001358281550001103
sc 107５.7 CAR-v3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.109)
Figure BDA0001358281550001104
Figure BDA0001358281550001111
sc 1075.7 CAR-v4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.110)
Figure BDA0001358281550001112
sc 1075.7 CAR-v5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.111)
Figure BDA0001358281550001113
sc 1075.7 CAR-v6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.112)
Figure BDA0001358281550001114
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序列表
<110> 塞勒克提斯公司;雷纳
<120> 用于癌症免疫治疗的抗CLL1特异性单链嵌合抗原受体(scCAR)
<130> P81504846PCT00
<150> PA201570044
<151> 2015-01-26
<160>?199
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 1
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> FcgRIIIa 铰链
<400> 3
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
1 5 10 15
<210> 4
<211> 45
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD8α 铰链
<400> 4
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 5
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> IgG1 铰链
<400> 5
Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD8α 跨膜结构域
<400> 6
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 7
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 41BB 跨膜结构域
<400> 7
Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val
20 25
<210> 8
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 4-1BB的片段 (残基 214-255)
<400> 8
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> T-细胞表面糖蛋白CD3ζ链的片段
<400> 9
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 11
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 重链可变区
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser
85 90 95
Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-378 重链可变区
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-161 重链可变区
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Thr Thr Ala Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 & SC02-378 & SC02-161 轻链可变区
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M26 重链可变区
<400> 15
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Phe Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M26 轻链可变区
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Thr Gln Glu Leu Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Asn Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M31 重链可变区
<400> 17
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Asn Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Lys Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M31 轻链可变区
<400> 18
Thr Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Tyr Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4 重链可变区
<400> 19
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Glu Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Pro Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Ile Tyr Asn Pro Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ala Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Pro Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Asp Asp Tyr Asp Asp Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4 轻链可变区
<400> 20
Glu Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M22 重链可变区
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Glu Thr His Tyr Asn Gln Gln Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Pro Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M22 轻链可变区
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 23
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M29 重链可变区
<400> 23
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met Tyr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M29 轻链可变区
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 重链可变区
<400> 25
Glu Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Phe Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 轻链可变区
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 27
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M5 重链可变区
<400> 27
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Lys Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M5 轻链可变区
<400> 28
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 29
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G12 重链可变区
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Ser
20 25 30
Asn Ile His Trp Leu Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Asn Trp His Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G12 轻链可变区
<400> 30
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr
20 25 30
Gly Asp Ile Phe Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21.26 重链可变区
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Val
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21.26 轻链可变区
<400> 32
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asp Arg Ala Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105
<210> 33
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 重链可变区
<400> 33
Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 轻链可变区
<400> 34
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105
<210> 35
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 scCAR-v1 多肽
<400> 35
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn
65 70 75 80
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
85 90 95
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
195 200 205
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe
260 265 270
Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
275 280 285
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
290 295 300
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
305 310 315 320
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
325 330 335
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
340 345 350
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
355 360 365
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
370 375 380
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
405 410 415
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
420 425 430
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
435 440 445
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455
<210> 36
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 scCAR-v2 多肽
<400> 36
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn
65 70 75 80
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
85 90 95
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
195 200 205
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe
260 265 270
Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr
275 280 285
Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val
290 295 300
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
305 310 315 320
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
325 330 335
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
340 345 350
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
355 360 365
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
370 375 380
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
385 390 395 400
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
405 410 415
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
420 425 430
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
435 440 445
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455
<210> 37
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 scCAR-v3 多肽
<400> 37
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn
65 70 75 80
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
85 90 95
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
195 200 205
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
275 280 285
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
290 295 300
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
305 310 315 320
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
325 330 335
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
340 345 350
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Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
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Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
385 390 395 400
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Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
435 440 445
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
450 455 460
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
465 470 475 480
Leu Pro Pro Arg
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<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 scCAR-v4 多肽
<400> 38
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
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195 200 205
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Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
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260 265 270
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
275 280 285
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
290 295 300
Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu
305 310 315 320
Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly
325 330 335
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
340 345 350
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355 360 365
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
370 375 380
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
385 390 395 400
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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485
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 scCAR-v5 多肽
<400> 39
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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35 40 45
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85 90 95
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100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr
115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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325 330 335
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<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 scCAR-v6 多肽
<400> 40
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
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325 330 335
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355 360 365
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Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Ile Ser Phe
485 490 495
Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu
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565 570 575
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
580 585 590
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610 615 620
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Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
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Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
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Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-378 scCAR-v1 多肽
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Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly
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Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
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Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
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Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
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Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
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Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-378 scCAR-v2 多肽
<400> 42
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
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Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
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Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
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Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
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Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
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Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr
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Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val
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Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
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355 360 365
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
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Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
385 390 395 400
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
405 410 415
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
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Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-378 scCAR-v3 多肽
<400> 43
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100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
195 200 205
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
275 280 285
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
290 295 300
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
305 310 315 320
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
325 330 335
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
340 345 350
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
355 360 365
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
370 375 380
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
385 390 395 400
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
405 410 415
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
420 425 430
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
435 440 445
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
450 455 460
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
465 470 475 480
Leu Pro Pro Arg
<210> 44
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-378 scCAR-v4 多肽
<400> 44
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn
65 70 75 80
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Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
195 200 205
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
275 280 285
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
290 295 300
Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu
305 310 315 320
Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly
325 330 335
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
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Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
355 360 365
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
370 375 380
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
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Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
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420 425 430
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
435 440 445
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
450 455 460
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
465 470 475 480
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 45
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-378 scCAR-v5 多肽
<400> 45
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
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Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
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100 105 110
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130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
195 200 205
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210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
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Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
275 280 285
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290 295 300
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
435 440 445
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450 455 460
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
465 470 475 480
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr Ile Trp
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<223> SC02-161 scCAR-v1 多肽
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Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
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Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
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Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<220>
<223> SC02-161 scCAR-v2 多肽
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Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
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Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
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Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr
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Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
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Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
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Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
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Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
405 410 415
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-161 scCAR-v3 多肽
<400> 49
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
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Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly
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Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly
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Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
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Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
195 200 205
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
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Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
275 280 285
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
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Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
305 310 315 320
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
325 330 335
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
340 345 350
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
355 360 365
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
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Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
385 390 395 400
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
405 410 415
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
420 425 430
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
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Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
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Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
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Leu Pro Pro Arg
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<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-161 scCAR-v4 多肽
<400> 50
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165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
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Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
195 200 205
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
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Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
275 280 285
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
290 295 300
Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu
305 310 315 320
Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly
325 330 335
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
340 345 350
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
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Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
385 390 395 400
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
405 410 415
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
420 425 430
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
435 440 445
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
450 455 460
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
465 470 475 480
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 51
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-161 scCAR-v5 多肽
<400> 51
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn
65 70 75 80
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100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Ala Gly Ser Phe Asp Tyr
115 120 125
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130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
195 200 205
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val
290 295 300
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
325 330 335
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
340 345 350
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
355 360 365
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
370 375 380
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
385 390 395 400
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
405 410 415
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
435 440 445
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
450 455 460
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
465 470 475 480
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr Ile Trp
485 490 495
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
500 505 510
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
515 520 525
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
530 535 540
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
545 550 555 560
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
565 570 575
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
580 585 590
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
595 600 605
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
610 615 620
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
625 630 635 640
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
645 650 655
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660 665 670
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<211> 673
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-161 scCAR-v6 多肽
<400> 52
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
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275 280 285
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305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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435 440 445
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450 455 460
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Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Ile Ser Phe
485 490 495
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500 505 510
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660 665 670
Arg
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<220>
<223> M26 scCAR-v1 多肽
<400> 53
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<220>
<223> M26 scCAR-v2 多肽
<400> 54
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130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
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Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser
165 170 175
Leu Thr Cys Arg Ala Thr Gln Glu Leu Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu
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325 330 335
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
340 345 350
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
355 360 365
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M26 scCAR-v3 多肽
<400> 55
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu
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115 120 125
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130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
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Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser
165 170 175
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195 200 205
Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Asn Arg Ser Gly
210 215 220
Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
245 250 255
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275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
290 295 300
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
305 310 315 320
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
325 330 335
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
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370 375 380
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385 390 395 400
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
405 410 415
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420 425 430
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M26 scCAR-v4 多肽
<400> 56
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Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln
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Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys
65 70 75 80
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser
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Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser
165 170 175
Leu Thr Cys Arg Ala Thr Gln Glu Leu Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser
195 200 205
Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Asn Arg Ser Gly
210 215 220
Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
260 265 270
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
290 295 300
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr
305 310 315 320
Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val
325 330 335
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
340 345 350
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
355 360 365
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
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Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
385 390 395 400
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
405 410 415
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Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 57
<211> 673
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M26 scCAR-v5 多肽
<400> 57
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu
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Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
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115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser
165 170 175
Leu Thr Cys Arg Ala Thr Gln Glu Leu Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser
195 200 205
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210 215 220
Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr
260 265 270
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
275 280 285
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr
290 295 300
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
305 310 315 320
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325 330 335
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
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355 360 365
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
370 375 380
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
385 390 395 400
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
405 410 415
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
420 425 430
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
435 440 445
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
450 455 460
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
465 470 475 480
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile
485 490 495
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
500 505 510
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
515 520 525
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
530 535 540
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
545 550 555 560
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
565 570 575
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
580 585 590
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
595 600 605
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
610 615 620
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
625 630 635 640
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
645 650 655
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
660 665 670
Arg
<210> 58
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M26 scCAR-v6 多肽
<400> 58
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser
165 170 175
Leu Thr Cys Arg Ala Thr Gln Glu Leu Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser
195 200 205
Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Asn Arg Ser Gly
210 215 220
Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr
260 265 270
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
275 280 285
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr
290 295 300
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
305 310 315 320
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
325 330 335
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
340 345 350
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355 360 365
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
370 375 380
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
385 390 395 400
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
405 410 415
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
420 425 430
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
435 440 445
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
450 455 460
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
465 470 475 480
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile
485 490 495
Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu
500 505 510
Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys
515 520 525
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
530 535 540
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545 550 555 560
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
565 570 575
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
580 585 590
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
595 600 605
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610 615 620
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
625 630 635 640
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
645 650 655
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
660 665 670
Leu Pro Pro Arg
675
<210> 59
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M31 scCAR-v1 多肽
<400> 59
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
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Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile
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Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg
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195 200 205
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210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val
225 230 235 240
Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Tyr Asp
245 250 255
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260 265 270
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Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
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<400> 60
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35 40 45
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Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
195 200 205
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser
275 280 285
Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe
290 295 300
Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
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325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
385 390 395 400
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
405 410 415
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
420 425 430
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435 440 445
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Pro Arg
465
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<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M31 scCAR-v3 多肽
<400> 61
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1 5 10 15
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35 40 45
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65 70 75 80
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Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
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Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile
145 150 155 160
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg
165 170 175
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180 185 190
Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
195 200 205
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
340 345 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
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Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
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Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
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450 455 460
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<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M31 scCAR-v4 多肽
<400> 62
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Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
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Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys
65 70 75 80
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser
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Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Asn Asp
115 120 125
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile
145 150 155 160
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg
165 170 175
Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn
180 185 190
Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
195 200 205
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val
225 230 235 240
Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Tyr Asp
245 250 255
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260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu
305 310 315 320
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
325 330 335
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
340 345 350
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
355 360 365
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
370 375 380
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
385 390 395 400
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
405 410 415
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
420 425 430
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
435 440 445
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
450 455 460
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
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Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<210> 63
<211> 678
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M31 scCAR-v5 多肽
<400> 63
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys
65 70 75 80
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser
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Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Asn Asp
115 120 125
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile
145 150 155 160
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg
165 170 175
Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn
180 185 190
Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
195 200 205
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val
225 230 235 240
Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Tyr Asp
245 250 255
Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys
260 265 270
Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
275 280 285
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
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Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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500 505 510
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
515 520 525
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
530 535 540
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
545 550 555 560
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
565 570 575
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Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
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Gln Ala Leu Pro Pro Arg
675
<210> 64
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M31 scCAR-v6 多肽
<400> 64
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu
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Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
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Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln
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Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys
65 70 75 80
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Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Asn Asp
115 120 125
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile
145 150 155 160
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg
165 170 175
Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn
180 185 190
Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
195 200 205
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val
225 230 235 240
Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Tyr Asp
245 250 255
Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys
260 265 270
Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
275 280 285
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
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340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
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515 520 525
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Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
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Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
580 585 590
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
595 600 605
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
610 615 620
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
625 630 635 640
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
645 650 655
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
660 665 670
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
675 680
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<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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50 55 60
Asn Leu Glu Trp Ile Gly Pro Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Ile
65 70 75 80
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<400> 67
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<220>
<223> G4 scCAR-v4 多肽
<400> 68
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<213> 人工序列
<220>
<223> G4 scCAR-v5 多肽
<400> 69
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Pro Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4 scCAR-v6 多肽
<400> 70
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Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg
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Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
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Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
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Ala Leu Pro Pro Arg
675
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<213> 人工序列
<220>
<223> M22 scCAR-v1 多肽
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145 150 155 160
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val
165 170 175
Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln
180 185 190
Lys Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
195 200 205
Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg
210 215 220
Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
225 230 235 240
Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn Asp Tyr Ser
245 250 255
Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Leu
260 265 270
Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr
275 280 285
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
290 295 300
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
305 310 315 320
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
325 330 335
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
340 345 350
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
355 360 365
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
370 375 380
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M22 scCAR-v2 多肽
<400> 72
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Glu Thr His
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Gln Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Pro Ser Tyr Tyr Ala
115 120 125
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
145 150 155 160
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val
165 170 175
Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln
180 185 190
Lys Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
195 200 205
Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg
210 215 220
Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
225 230 235 240
Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn Asp Tyr Ser
245 250 255
Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Leu
260 265 270
Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile
275 280 285
Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe
290 295 300
Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
305 310 315 320
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
325 330 335
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
340 345 350
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
355 360 365
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
370 375 380
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
385 390 395 400
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
405 410 415
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
420 425 430
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
435 440 445
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
450 455 460
Pro Pro Arg
465
<210> 73
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M22 scCAR-v3 多肽
<400> 73
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Glu Thr His
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Gln Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
145 150 155 160
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val
165 170 175
Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln
180 185 190
Lys Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
195 200 205
Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg
210 215 220
Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
225 230 235 240
Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn Asp Tyr Ser
245 250 255
Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
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450 455 460
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<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M22 scCAR-v4 多肽
<400> 74
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
145 150 155 160
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val
165 170 175
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<210> 75
<211> 679
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M22 scCAR-v5 多肽
<400> 75
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1 5 10 15
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35 40 45
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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325 330 335
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340 345 350
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420 425 430
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Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
675
<210> 76
<211> 682
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M22 scCAR-v6 多肽
<400> 76
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130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
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325 330 335
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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405 410 415
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
420 425 430
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
435 440 445
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
450 455 460
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
465 470 475 480
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
485 490 495
Leu Ser Pro Gly Lys Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr
500 505 510
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580 585 590
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M29 scCAR-v1 多肽
<400> 77
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275 280 285
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M29 scCAR-v2 多肽
<400> 78
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1 5 10 15
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100 105 110
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115 120 125
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
145 150 155 160
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val
165 170 175
Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp
180 185 190
Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr
195 200 205
Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile
225 230 235 240
Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser
260 265 270
Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr
275 280 285
Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser
290 295 300
Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
305 310 315 320
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
325 330 335
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
340 345 350
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
355 360 365
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
370 375 380
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
385 390 395 400
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
405 410 415
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
420 425 430
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
435 440 445
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
<210> 79
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M29 scCAR-v3 多肽
<400> 79
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu
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35 40 45
Ile Phe Thr Ser Tyr Val Met Tyr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys
65 70 75 80
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser
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Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Ser Cys Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Tyr
115 120 125
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
145 150 155 160
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val
165 170 175
Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp
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Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile
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245 250 255
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Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
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35 40 45
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100 105 110
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130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
145 150 155 160
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val
165 170 175
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195 200 205
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Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile
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245 250 255
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260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala
305 310 315 320
Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
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<213> 人工序列
<220>
<223> M29 scCAR-v6 多肽
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<223> M2 scCAR-v3 多肽
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Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser
165 170 175
Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr Leu Ser Trp Leu
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser
195 200 205
Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly
210 215 220
Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
260 265 270
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
290 295 300
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
420 425 430
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
435 440 445
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
450 455 460
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
465 470 475 480
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
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<213> 人工序列
<220>
<223> M2 scCAR-v4 多肽
<400> 86
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His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Glu Leu
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35 40 45
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50 55 60
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Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser
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Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser
165 170 175
Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr Leu Ser Trp Leu
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser
195 200 205
Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly
210 215 220
Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
260 265 270
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
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Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr
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325 330 335
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
340 345 350
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
355 360 365
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Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
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450 455 460
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Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 scCAR-v5 多肽
<400> 87
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35 40 45
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115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser
165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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435 440 445
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<220>
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<400> 91
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser
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Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser
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Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser
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Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu
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Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly
245 250 255
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Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
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Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
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Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
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Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
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Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
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Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
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Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
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<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M5 scCAR-v4 多肽
<400> 92
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser
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Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser
165 170 175
Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Asn Leu Ala Trp
180 185 190
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala
195 200 205
Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala
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Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
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Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
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<210> 93
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M5 scCAR-v5 多肽
<400> 93
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser
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Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Asn Leu Ala Trp
180 185 190
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala
195 200 205
Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His
260 265 270
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
275 280 285
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro
290 295 300
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
305 310 315 320
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
325 330 335
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
340 345 350
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
355 360 365
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
370 375 380
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
385 390 395 400
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
405 410 415
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
420 425 430
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
435 440 445
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
450 455 460
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
465 470 475 480
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr
485 490 495
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Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
515 520 525
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530 535 540
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
545 550 555 560
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
565 570 575
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
580 585 590
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
595 600 605
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610 615 620
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
625 630 635 640
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
645 650 655
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
660 665 670
<210> 94
<211> 675
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M5 scCAR-v6 多肽
<400> 94
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1 5 10 15
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35 40 45
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85 90 95
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100 105 110
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165 170 175
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245 250 255
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260 265 270
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
370 375 380
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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Ile
485 490 495
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Pro Pro Arg
675
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<220>
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<400> 95
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<400> 96
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Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr Gly Asp Ile Phe Met
180 185 190
Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
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Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
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Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
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Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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355 360 365
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385 390 395 400
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405 410 415
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G12 scCAR-v3 多肽
<400> 97
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Phe Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
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Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
450 455 460
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<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G12 scCAR-v4 多肽
<400> 98
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1 5 10 15
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Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
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115 120 125
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130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ile Val Leu Thr
145 150 155 160
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165 170 175
Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr Gly Asp Ile Phe Met
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Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu
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325 330 335
Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
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Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
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465 470 475 480
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485 490
<210> 99
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G12 scCAR-v5 多肽
<400> 99
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
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130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ile Val Leu Thr
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Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile
165 170 175
Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr Gly Asp Ile Phe Met
180 185 190
Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
290 295 300
Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
355 360 365
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
370 375 380
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
385 390 395 400
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
405 410 415
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
420 425 430
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
435 440 445
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
450 455 460
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
465 470 475 480
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
485 490 495
Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
500 505 510
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
515 520 525
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
530 535 540
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
545 550 555 560
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
565 570 575
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
580 585 590
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
595 600 605
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
610 615 620
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
625 630 635 640
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
645 650 655
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
660 665 670
Leu Pro Pro Arg
675
<210> 100
<211> 679
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G12 scCAR-v6 多肽
<400> 100
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Pro Ser Ser Asn Ile His Trp Leu Lys Gln Thr Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Ile Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Val Tyr Asn Trp His Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ile Val Leu Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile
165 170 175
Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr Gly Asp Ile Phe Met
180 185 190
Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
Phe Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp
225 230 235 240
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
245 250 255
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Glu Pro Lys Ser Pro
260 265 270
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
290 295 300
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305 310 315 320
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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
420 425 430
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
435 440 445
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
450 455 460
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
465 470 475 480
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
485 490 495
Gly Lys Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu
500 505 510
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515 520 525
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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645 650 655
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660 665 670
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<220>
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<220>
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35 40 45
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Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
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115 120 125
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130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu
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Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr
165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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275 280 285
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Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg
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<220>
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Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu
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Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr
165 170 175
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Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe Ala Thr Ser Asn
195 200 205
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Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21.26 scCAR-v6 多肽
<400> 106
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165 170 175
Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln
180 185 190
Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe Ala Thr Ser Asn
195 200 205
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
210 215 220
Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asp Arg Ala Leu Thr Phe Gly Ala
245 250 255
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275 280 285
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
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565 570 575
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
580 585 590
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
595 600 605
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
610 615 620
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
625 630 635 640
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
645 650 655
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
660 665 670
Pro Arg
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<211> 460
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 scCAR-v1 多肽
<400> 107
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr
35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly
50 55 60
Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn
65 70 75 80
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser
85 90 95
Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr
115 120 125
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
145 150 155 160
Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu
165 170 175
Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser Tyr
180 185 190
Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile
195 200 205
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210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala
225 230 235 240
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu
245 250 255
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Gly Leu Ala Val Ser Thr
260 265 270
Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
290 295 300
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
305 310 315 320
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325 330 335
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
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Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 scCAR-v2 多肽
<400> 108
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
145 150 155 160
Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu
165 170 175
Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser Tyr
180 185 190
Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile
195 200 205
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala
225 230 235 240
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu
245 250 255
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Gly Leu Ala Val Ser Thr
260 265 270
Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
290 295 300
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
305 310 315 320
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325 330 335
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
340 345 350
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
355 360 365
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
370 375 380
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
385 390 395 400
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
405 410 415
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
420 425 430
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
435 440 445
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 scCAR-v3 多肽
<400> 109
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1 5 10 15
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20 25 30
Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr
35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly
50 55 60
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100 105 110
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195 200 205
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210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala
225 230 235 240
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 110
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 scCAR-v4 多肽
<400> 110
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly
50 55 60
Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
145 150 155 160
Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu
165 170 175
Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser Tyr
180 185 190
Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile
195 200 205
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala
225 230 235 240
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu
245 250 255
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr
305 310 315 320
Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser
325 330 335
Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
340 345 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
355 360 365
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
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420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 111
<211> 675
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 scCAR-v5 多肽
<400> 111
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr
35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly
50 55 60
Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn
65 70 75 80
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser
85 90 95
Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr
115 120 125
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
145 150 155 160
Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu
165 170 175
Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser Tyr
180 185 190
Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile
195 200 205
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala
225 230 235 240
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu
245 250 255
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Glu Pro Lys Ser Pro Asp
260 265 270
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala
290 295 300
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
305 310 315 320
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
325 330 335
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
340 345 350
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
355 360 365
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
405 410 415
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
420 425 430
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
485 490 495
Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
500 505 510
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
515 520 525
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
530 535 540
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
545 550 555 560
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
565 570 575
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
580 585 590
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
595 600 605
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
610 615 620
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
625 630 635 640
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
645 650 655
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
660 665 670
Pro Pro Arg
675
<210> 112
<211> 678
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 scCAR-v6 多肽
<400> 112
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr
35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly
50 55 60
Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn
65 70 75 80
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser
85 90 95
Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr
115 120 125
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
145 150 155 160
Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu
165 170 175
Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser Tyr
180 185 190
Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile
195 200 205
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala
225 230 235 240
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu
245 250 255
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Glu Pro Lys Ser Pro Asp
260 265 270
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala
290 295 300
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
305 310 315 320
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
325 330 335
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
340 345 350
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
355 360 365
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
405 410 415
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
420 425 430
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
485 490 495
Lys Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe
500 505 510
Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg
515 520 525
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
530 535 540
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
545 550 555 560
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
565 570 575
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
580 585 590
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
595 600 605
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
610 615 620
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
625 630 635 640
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
645 650 655
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
660 665 670
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
675
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20 模拟表位
<400> 113
Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser
1 5 10
<210> 114
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶 TALEN TRAC_T01
<400> 114
ttgtcccaca gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgaga 49
<210> 115
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TAL 结合结构域 TRAC_T01-L
<400> 115
Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly
35 40 45
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
50 55 60
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
65 70 75 80
Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
85 90 95
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala
100 105 110
Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
115 120 125
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala
130 135 140
Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
145 150 155 160
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val
165 170 175
Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
180 185 190
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu
195 200 205
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
210 215 220
Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
225 230 235 240
Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala
245 250 255
Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly
260 265 270
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys
275 280 285
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
290 295 300
His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly
305 310 315 320
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
325 330 335
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
340 345 350
Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val
355 360 365
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala
370 375 380
Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
385 390 395 400
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala
405 410 415
Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala
420 425 430
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val
435 440 445
Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
450 455 460
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu
465 470 475 480
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
485 490 495
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
500 505 510
Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala
515 520 525
Leu Glu
530
<210> 116
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TAL 结合结构域 TRAC_T01-R
<400> 116
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly
35 40 45
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
50 55 60
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His
65 70 75 80
Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
85 90 95
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala
100 105 110
Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu
115 120 125
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala
130 135 140
Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
145 150 155 160
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val
165 170 175
Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
180 185 190
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln
195 200 205
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
210 215 220
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
225 230 235 240
Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala
245 250 255
Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly
260 265 270
Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys
275 280 285
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
290 295 300
His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly
305 310 315 320
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
325 330 335
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
340 345 350
Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val
355 360 365
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala
370 375 380
Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
385 390 395 400
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala
405 410 415
Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala
420 425 430
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val
435 440 445
Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
450 455 460
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln
465 470 475 480
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
485 490 495
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
500 505 510
Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala
515 520 525
Leu Glu
530
<210> 117
<211> 2814
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码 TRAC_T01-L TALEN的多核苷酸
<400> 117
atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60
gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120
aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180
acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240
aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300
ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360
agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420
gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480
ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 540
acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 600
gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660
ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720
ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780
cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 840
ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900
caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960
ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020
agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080
caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1140
caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200
ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc 1260
cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1320
atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 1380
ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1440
ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500
ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 1560
acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620
gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680
ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740
attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800
cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 1860
ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920
caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980
ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040
agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100
ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160
cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220
aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280
gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340
aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400
aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460
gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520
aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580
gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640
aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700
tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760
gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814
<210> 118
<211> 2832
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码 TRAC_T01-R TALEN的多核苷酸
<400> 118
atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60
gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120
cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180
ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240
ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300
gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360
acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420
attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480
acgggtgccc cgctcaactt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 540
ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600
ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 660
acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720
gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780
ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 840
attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900
cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 960
ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1020
caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080
ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140
agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200
caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1260
caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320
ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1380
cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1440
atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1500
ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 1560
ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620
ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1680
acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1740
gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1800
ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1860
gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920
cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1980
ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040
caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100
cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160
gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220
agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280
ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340
gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400
aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460
gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520
caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580
cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640
tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700
tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760
ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820
gccgactgat aa 2832
<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 重链可变区的CDR1
<400> 119
Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser
1 5 10
<210> 120
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 重链可变区的CDR2
<400> 120
Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asp Tyr
1 5 10
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 重链可变区的CDR3
<400> 121
Lys Val Ser Thr Gly Gly Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-378 重链可变区的CDR1
<400> 122
Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser
1 5 10
<210> 123
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-378 重链可变区的CDR2
<400> 123
Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr
1 5 10
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-378 重链可变区的 CDR3
<400> 124
Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 125
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-161 重链可变区的CDR1
<400> 125
Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser
1 5 10
<210> 126
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-161 重链可变区的CDR2
<400> 126
Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr
1 5 10
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-161 重链可变区的CDR3
<400> 127
Arg Gln Thr Thr Ala Gly Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 & SC02-378 & SC02-161 轻链可变区的CDR1
<400> 128
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5
<210> 129
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 & SC02-378 & SC02-161 轻链可变区的CDR2
<400> 129
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SC02-357 & SC02-378 & SC02-161 轻链可变区的CDR3
<400> 130
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
1 5
<210> 131
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M26 重链可变区的CDR1
<400> 131
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Ile His
1 5 10
<210> 132
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M26 重链可变区的CDR2
<400> 132
Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr
1 5 10
<210> 133
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M26 重链可变区的CDR3
<400> 133
Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 134
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M26 轻链可变区的CDR1
<400> 134
Gln Glu Leu Ser Gly Tyr Leu Ser
1 5
<210> 135
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M26 轻链可变区的CDR2
<400> 135
Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser
1 5 10
<210> 136
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M26 轻链可变区的CDR3
<400> 136
Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr
1 5
<210> 137
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M31 重链可变区的CDR1
<400> 137
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His
1 5 10
<210> 138
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M31 重链可变区的 CDR2
<400> 138
Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr
1 5 10
<210> 139
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M31 重链可变区的CDR3
<400> 139
Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Asn Asp Tyr
1 5 10
<210> 140
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M31 轻链可变区的CDR1
<400> 140
Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His
1 5 10
<210> 141
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M31 轻链可变区的CDR2
<400> 141
Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5 10
<210> 142
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M31 轻链可变区的CDR3
<400> 142
Gln Gln Asn Asn Tyr Asp Pro Trp
1 5
<210> 143
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4 重链可变区的CDR1
<400> 143
Gln Gln Asn Asn Tyr Asp Pro Trp
1 5
<210> 144
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4 重链可变区的CDR2
<400> 144
Trp Ile Gly Pro Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Ile Tyr
1 5 10
<210> 145
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4 重链可变区的CDR3
<400> 145
Ala Arg Thr Asp Asp Tyr Asp Asp Tyr Thr Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 146
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4 轻链可变区的CDR1
<400> 146
His Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5
<210> 147
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4 轻链可变区的CDR2
<400> 147
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5 10
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4 轻链可变区的CDR3
<400> 148
Gln Gln Gly Lys Thr Leu Leu Trp
1 5
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M22 重链可变区的CDR1
<400> 149
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 150
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M22 重链可变区的CDR2
<400> 150
Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Glu Thr His Tyr
1 5 10
<210> 151
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M22 重链可变区的CDR3
<400> 151
Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Pro Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 152
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M22 轻链可变区的CDR1
<400> 152
Gln Asn Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 153
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M22 轻链可变区的CDR2
<400> 153
Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5 10
<210> 154
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M22 轻链可变区的CDR3
<400> 154
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe
1 5
<210> 155
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M29 重链可变区的CDR1
<400> 155
Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Val Met Tyr
1 5 10
<210> 156
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M29 重链可变区的CDR2
<400> 156
Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr
1 5
<210> 157
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M29 重链可变区的CDR3
<400> 157
Ala Arg Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 158
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M29 轻链可变区的CDR1
<400> 158
Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala
1 5
<210> 159
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M29 轻链可变区的CDR2
<400> 159
Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro
1 5 10
<210> 160
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M29 轻链可变区的CDR3
<400> 160
Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp
1 5
<210> 161
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 重链可变区的CDR1
<400> 161
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Met His
1 5 10
<210> 162
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 重链可变区的CDR2
<400> 162
Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr
1 5 10
<210> 163
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 重链可变区的CDR3
<400> 163
Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 轻链可变区的CDR1
<400> 164
Gln Glu Ile Ser Val Tyr Leu Ser
1 5
<210> 165
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 轻链可变区的CDR2
<400> 165
Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser
1 5 10
<210> 166
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 轻链可变区的CDR3
<400> 166
Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr
1 5
<210> 167
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M5 重链可变区的CDR1
<400> 167
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp Tyr Ile His
1 5 10
<210> 168
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M5 重链可变区的CDR2
<400> 168
Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Lys Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Ser
1 5 10 15
<210> 169
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M5 重链可变区的CDR3
<400> 169
Thr Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr
1 5
<210> 170
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M5 轻链可变区的CDR1
<400> 170
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 171
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M5 轻链可变区的CDR2
<400> 171
Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5 10
<210> 172
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M5 轻链可变区的CDR3
<400> 172
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg
1 5
<210> 173
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G12 重链可变区的CDR1
<400> 173
Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Ser Asn Ile His
1 5 10
<210> 174
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G12 重链可变区的CDR2
<400> 174
Trp Ile Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
1 5 10
<210> 175
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G12 重链可变区的CDR3
<400> 175
Ala Ile Tyr Phe Val Tyr Asn Trp His Phe Asp Val
1 5 10
<210> 176
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G12 轻链可变区的 CDR1
<400> 176
Glu Ser Val Asp Gly Tyr Gly Asp Ile Phe Met Leu
1 5 10
<210> 177
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G12 轻链可变区的CDR2
<400> 177
Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5 10
<210> 178
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G12 轻链可变区的CDR3
<400> 178
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr
1 5
<210> 179
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21.26 重链可变区的CDR1
<400> 179
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 180
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21.26 重链可变区的CDR2
<400> 180
Met Ile His Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Val Lys
1 5 10 15
<210> 181
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21.26 重链可变区的CDR3
<400> 181
Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 182
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21.26 轻链可变区的CDR1
<400> 182
Arg Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met His
1 5 10
<210> 183
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21.26 轻链可变区的CDR2
<400> 183
Pro Trp Ile Phe Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5 10
<210> 184
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21.26 轻链可变区的CDR3
<400> 184
Gln Gln Trp Arg Ser Asp Arg Ala Leu Thr
1 5 10
<210> 185
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 重链可变区的CDR1
<400> 185
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn
1 5 10
<210> 186
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 重链可变区的CDR2
<400> 186
Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 187
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 重链可变区的CDR3
<400> 187
Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 188
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 轻链可变区的CDR1
<400> 188
Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser Tyr Val His
1 5 10
<210> 189
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 轻链可变区的CDR2
<400> 189
Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5 10
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1075.7 轻链可变区的CDR3
<400> 190
Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 191
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕利珠单抗的表位
<400> 191
Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp
1 5 10 15
Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn
20
<210> 192
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗的模拟表位 1
<400> 192
Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys
1 5 10
<210> 193
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗的模拟表位 2
<400> 193
Cys Gln Tyr Asn Leu Ser Ser Arg Ala Leu Lys Cys
1 5 10
<210> 194
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗的模拟表位 3
<400> 194
Cys Val Trp Gln Arg Trp Gln Lys Ser Tyr Val Cys
1 5 10
<210> 195
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗的模拟表位 4
<400> 195
Cys Met Trp Asp Arg Phe Ser Arg Trp Tyr Lys Cys
1 5 10
<210> 196
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳武单抗的表位1
<400> 196
Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp
1 5 10 15
Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg
20 25
<210> 197
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳武单抗的表位 2
<400> 197
Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln
1 5 10 15
Ile Lys Glu
<210> 198
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD34的表位1
<400> 198
Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu Thr
1 5 10
<210> 199
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD34的表位2
<400> 199
Asn Thr Asn Ser Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser
1 5 10

Claims (54)

1.一种CLL1特异性嵌合抗原受体，至少包含：
-抗CLL1细胞外配体结合结构域，其包括包含通过由柔性接头连接的单克隆抗CLL1抗体M26或M2的重可变片段(VH)和轻可变片段(VL)的单链抗体片段(scFv)，分别地，其中所述单克隆抗CLL1抗体M26的重可变片段(VH)包括SEQ ID NO.131的CDR1、SEQ ID NO.132的CDR2和SEQ ID NO.133的CDR3且所述单克隆抗CLL1抗体M26的轻可变片段(VL)包括SEQ IDNO.134的CDR1、SEQ ID NO.135的CDR2和SEQ ID NO.136的CDR3，或者其中所述单克隆抗CLL1抗体M2的重可变片段(VH)包括SEQ ID NO.161的CDR1、SEQ ID NO.162的CDR2和SEQ IDNO.163的CDR3且所述单克隆抗CLL1抗体M2的轻可变片段(VL)包括SEQ ID NO.164的CDR1、SEQ ID NO.165的CDR2和SEQ ID NO.166的CDR3，
-跨膜结构域，
-细胞质信号结构域，以及
-共刺激结构域。
2.根据权利要求1所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，分别地，其中所述单克隆抗CLL1抗体M26的重可变片段(VH)具有SEQ ID NO.15的多肽序列且所述单克隆抗CLL1抗体M26的轻可变片段(VL)具有SEQ ID NO.16的多肽序列；或者其中所述单克隆抗CLL1抗体M2的重可变片段(VH)具有SEQ ID NO.25的多肽序列且所述单克隆抗CLL1抗体M2的轻可变片段(VL)具有SEQ ID NO.26的多肽序列。
3.根据权利要求1所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域为CD28或4-1BB共刺激结构域。
4.根据权利要求1所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，所述跨膜结构域是CD8α跨膜结构域。
5.根据权利要求1所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，进一步包含铰链。
6.根据权利要求1所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，所述细胞质信号结构域是T细胞激活结构域。
7.根据权利要求1所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，以单一多肽的形式来表达所述CLL1特异性嵌合抗原受体。
8.根据权利要求1所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，具有选自V1、V3或V5的多肽结构中的一种，其中V1、V3或V5的所述多肽结构从N端至C端包括信号肽、抗CLL1细胞外配体结合结构域、铰链、CD8α跨膜结构域、和细胞质结构域，
其中所述信号肽是CD8α信号肽，
其中所述抗CLL1细胞外配体结合结构域包括从N端至C端包含通过由柔性接头连接的单克隆抗CLL1抗体M26或M2的重可变片段(VH)和轻可变片段(VL)的单链抗体片段(scFv)，分别地，其中所述单克隆抗CLL1抗体M26的重可变片段(VH)包括SEQ ID NO.131的CDR1、SEQID NO.132的CDR2和SEQ ID NO.133的CDR3且所述单克隆抗CLL1抗体M26的轻可变片段(VL)包括SEQ ID NO.134的CDR1、SEQ ID NO.135的CDR2和SEQ ID NO.136的CDR3，或者其中所述单克隆抗CLL1抗体M2的重可变片段(VH)包括SEQ ID NO.161的CDR1、SEQ ID NO.162的CDR2和SEQ ID NO.163的CDR3且所述单克隆抗CLL1抗体M2的轻可变片段(VL)包括SEQ IDNO.164的CDR1、SEQ ID NO.165的CDR2和SEQ ID NO.166的CDR3；
其中，所述V1的多肽结构中的铰链为FcγRIIIα铰链；
其中，所述V3的多肽结构中的铰链为CD8α铰链；
其中，所述V5的多肽结构中的铰链为IgG1铰链；和
其中所述细胞质结构域从N端至C端包括4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号结构域。
9.根据权利要求8所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，分别地，其中所述单克隆抗CLL1抗体M26的重可变片段(VH)具有SEQ ID NO.15的多肽序列且所述单克隆抗CLL1抗体M26的轻可变片段(VL)具有SEQ ID NO.16的多肽序列；或者其中所述单克隆抗CLL1抗体M2的重可变片段(VH)具有SEQ ID NO.25的多肽序列且所述单克隆抗CLL1抗体M2的轻可变片段(VL)具有SEQ ID NO.26的多肽序列。
10.根据权利要求8所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，来自4-1BB的所述共刺激结构域具有SEQ ID NO.8的多肽序列。
11.根据权利要求8所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，所述CD3ζ信号结构域具有SEQ ID NO.9的多肽序列。
12.根据权利要求8所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，所述FcγRIIIα铰链具有SEQ ID NO.3的多肽序列。
13.根据权利要求8所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，所述CD8α铰链具有SEQ IDNO.4的多肽序列。
14.根据权利要求8所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，所述IgG1铰链具有SEQ IDNO.5的多肽序列。
15.根据权利要求8所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，所述CD8α跨膜结构域具有SEQ ID NO.6的多肽序列。
16.根据权利要求8所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，进一步包含对于CLL1不具有特异性的另一细胞外配体结合结构域。
17.根据权利要求8所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其包含的多肽序列具有SEQ IDNO.53或83的多肽序列。
18.根据权利要求8所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其包含的多肽序列具有SEQ IDNO.55或85的多肽序列。
19.根据权利要求8所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其包含的多肽序列具有SEQ IDNO.57或87的多肽序列。
20.根据权利要求1所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，进一步包含信号肽。
21.根据权利要求20所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，所述信号肽具有SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2的多肽序列。
22.根据权利要求1所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，所述抗CLL1细胞外配体结合结构域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个具有以下各项的氨基酸序列的mAb特异性表位：SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 191、SEQ ID NO 192、SEQ ID NO 193、SEQ ID NO 194、SEQ IDNO 195、SEQ ID NO 196、SEQ ID NO 197、SEQ ID NO 198或SEQ ID NO 199。
23.根据权利要求1所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，所述抗CLL1细胞外配体结合结构域包含1、2、3、或4个具有以下各项的氨基酸序列的mAb特异性表位：SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 191、SEQ ID NO 192、SEQ ID NO 193、SEQ ID NO 194、SEQ ID NO 195、SEQ IDNO 196、SEQ ID NO 197、SEQ ID NO 198或SEQ ID NO 199。
24.根据权利要求1所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，所述抗CLL1细胞外配体结合结构域包含2、3、或4个具有以下各项的氨基酸序列的mAb特异性表位：SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 191、SEQ ID NO 192、SEQ ID NO 193、SEQ ID NO 194、SEQ ID NO 195、SEQ IDNO 196、SEQ ID NO 197、SEQ ID NO 198或SEQ ID NO 199。
25.根据权利要求1所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，所述抗CLL1细胞外配体结合结构域包含以下序列
V1-L1-V2-(L)x-表位1-(L)x-；
V1-L1-V2-(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-；
V1-L1-V2-(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x-；
(L)x-表位1-(L)x-V1-L1-V2；
(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-V1-L1-V2；
表位1-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x-V1-L1-V2；
(L)x-表位1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位2-(L)x；
(L)x-表位1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x-；
(L)x-表位1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x-表位4-(L)x-；
(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位3-(L)x-；
(L)x-表位1-(L)x-表位2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-表位3-(L)x-表位4-(L)x-；
V1-(L)x-表位1-(L)x-V2；
V1-(L)x-表位1-(L)x-V2-(L)x-表位2-(L)x；
V1-(L)x-表位1-(L)x-V2-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x；
V1-(L)x-表位1-(L)x-V2-(L)x-表位2-(L)x-表位3-(L)x-表位4-(L)x；
(L)x-表位1-(L)x-V1-(L)x-表位2-(L)x-V2；或
(L)x-表位1-(L)x-V1-(L)x-表位2-(L)x-V2-(L)x-表位3-(L)x；
其中，
V1是VL以及V2是VH或V1是VH以及V2是VL；
L1是适合于将VH链连接于VL链的接头；
L是包含甘氨酸和丝氨酸残基的接头，以及在抗CLL1细胞外配体结合结构域中L的每次出现可以与在相同的抗CLL1细胞外配体结合结构域中L的其它出现相同或不同，以及，
x是0或1以及x的每次出现独立地选自其它；以及
表位1、表位2、表位3和表位4是mAb特异性表位并且可以是相同或不同的；
其中所述表位1、表位2、表位3和表位4独立地选自具有以下各项的氨基酸序列的mAb特异性表位：SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 191、SEQ ID NO 192、SEQ ID NO 193、SEQ ID NO194、SEQ ID NO 195、SEQ ID NO 196、SEQ ID NO 197、SEQ ID NO 198或SEQ ID NO 199。
26.根据权利要求25所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，所述抗CLL1细胞外配体结合结构域包含以下序列
V1-L1-V2-L-表位1；V1-L1-V2-L-表位1-L；V1-L1-V2-L-表位1-L-表位2；V1-L1-V2-L-表位1-L-表位2-L；V1-L1-V2-L-表位1-L-表位2-L-表位3；V1-L1-V2-L-表位1-L-表位2-L-表位3-L；V1-L1-V2-表位1；V1-L1-V2-表位1-L；V1-L1-V2-表位1-L-表位2；V1-L1-V2-表位1-L-表位2-L；V1-L1-V2-表位1-L-表位2-L-表位3；V1-L1-V2-表位1-L-表位2-L-表位3-L；表位1-V1-L1-V2；表位1-L-V1-L1-V2；L-表位1-V1-L1-V2；L-表位1-L-V1-L1-V2；表位1-L-表位2-V1-L1-V2；表位1-L-表位2-L-V1-L1-V2；L-表位1-L-表位2-V1-L1-V2；L-表位1-L-表位2-L-V1-L1-V2；表位1-L-表位2-L-表位3-V1-L1-V2；表位1-L-表位2-L-表位3-L-V1-L1-V2；L-表位1-L-表位2-L-表位3-V1-L1-V2；L-表位1-L-表位2-L-表位3-L-V1-L1-V2；V1-L-表位1-L-V2；L-表位1-L-V1-L-表位2-L-V2；V1-L-表位1-L-V2-L-表位2-L；V1-L-表位1-L-V2-L-表位2-L-表位3；V1-L-表位1-L-V2-L-表位2-表位3；V1-L-表位1-L-V2-L-表位2-L-表位3-表位4；L-表位1-L-V1-L-表位2-L-V2-L-表位3-L；表位1-L-V1-L-表位2-L-V2-L-表位3-L；L-表位1-L-V1-L-表位2-L-V2-L-表位3；L-表位1-L-V1-L1-V2-L-表位2-L；L-表位1-L-V1-L1-V2-L-表位2-L-表位3；L-表位1-L-V1-L1-V2-L-表位2-表位3，或表位1-L-V1-L1-V2-L-表位2-L-表位3-表位4
其中
V1是VL以及V2是VH或V1是VH以及V2是VL；
L1是适合于将VH链连接于VL链的任何接头；
L是包含甘氨酸和丝氨酸残基的接头，以及在抗CLL1细胞外配体结合结构域中L的每次出现可以与在相同的抗CLL1细胞外配体结合结构域中L的其它出现相同或不同，以及，
表位1、表位2、表位3和表位4是mAb特异性表位并且可以是相同或不同的。
27.根据权利要求25所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，L1是包含甘氨酸和/或丝氨酸的接头。
28.根据权利要求27所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，L1是包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n或(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n的接头，其中n是1、2、3、4或5。
29.根据权利要求28所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，L1是包含氨基酸序列(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3的接头。
30.根据权利要求25所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，L是包含甘氨酸和/或丝氨酸的接头。
31.根据权利要求30所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，L是具有选自以下各项的氨基酸序列的接头：SGG、GGS、SGGS、SSGGS、GGGG、SGGGG、GGGGS、SGGGGS、GGGGGS、SGGGGGS、SGGGGG、GSGGGGS、GGGGGGGS、SGGGGGGG、SGGGGGGGS、或SGGGGSGGGGS。
32.根据权利要求31所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，L是SGGGG、GGGGS或SGGGGS。
33.根据权利要求25所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，表位1、表位2、表位3和表位4独立地选自被以下各项特异性地识别的mAb特异性表位：替伊莫单抗、伊莫单抗、莫罗单抗-CD3、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、妥珠单抗、达克珠单抗、依库珠单抗、依法利珠单抗、吉姆单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、兰尼单抗、托珠单抗、曲妥单抗、维多珠单抗、阿达木单抗、贝利单抗、康纳单抗、地诺单抗、戈利木单抗、易普利单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、QBEND-10或优特克单抗。
34.根据权利要求25所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，表位1是具有SEQ ID NO113的氨基酸序列的mAb-特异性表位。
35.根据权利要求25所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，表位2是具有SEQ ID NO113的氨基酸序列的mAb-特异性表位。
36.根据权利要求25所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，表位3是具有SEQ ID NO113、SEQ ID NO 198或SEQ ID NO 199的氨基酸序列的mAb-特异性表位。
37.根据权利要求25所述的CLL1特异性嵌合抗原受体，其中，表位4是具有SEQ ID NO113的氨基酸序列的mAb-特异性表位。
38.一种编码权利要求1至37中任一项所述的CLL1特异性嵌合抗原受体的多核苷酸。
39.一种包含权利要求38所述的多核苷酸的表达载体。
40.一种在细胞表面膜上表达权利要求1至37中任一项所述的CLL1特异性嵌合抗原受体的工程化的淋巴样免疫细胞。
41.根据权利要求40所述的工程化的淋巴样免疫细胞，衍生自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞。
42.根据权利要求40所述的工程化的淋巴样免疫细胞，其中，在所述免疫细胞中抑制TCR的表达。
43.根据权利要求40所述的工程化的淋巴样免疫细胞，其中，在所述免疫细胞中压制或抑制至少一种MHC蛋白的表达。
44.根据权利要求43所述的工程化的淋巴样免疫细胞，其中，所述MHC蛋白是β2m或HLA。
45.根据权利要求40所述的工程化的淋巴样免疫细胞，其中，突变所述免疫细胞以赋予针对至少一种免疫抑制或化疗药物的抗性。
46.根据权利要求40至45中任一项所述的工程化的淋巴样免疫细胞在制备用于治疗患者的病症的药物中的用途，其中所述病症是特征在于CLL1-表达细胞的恶化前或恶性癌症病症。
47.根据权利要求46所述的用途，其中所述患者是人。
48.根据权利要求46所述的用途，其中所述病症是特征在于过多的CLL1-表达细胞的病症。
49.根据权利要求46所述的用途，其中所述病症是血液癌症病症。
50.根据权利要求49所述的用途，其中所述血液癌症病症是白血病。
51.根据权利要求50所述的用途，其中，所述白血病是急性髓性白血病(AML)。
52.一种用于工程化免疫细胞的体外方法，包括：
(a)提供免疫细胞，
(b)在所述免疫细胞的表面上表达至少一种权利要求1至37中任一项所述的CLL1特异性嵌合抗原受体。
53.根据权利要求52所述的体外方法，包括：
(a)提供免疫细胞，
(b)在所述免疫细胞中引入编码所述CLL1特异性嵌合抗原受体的至少一种多核苷酸，
(c)将所述多核苷酸表达进入所述免疫细胞。
54.根据权利要求53所述体外方法，进一步包括：
(d)引入对于CLL1不具有特异性的至少一种其它嵌合抗原受体。
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