JP2022529741A - 同種ｃａｒ ｔ細胞を製造する方法 - Google Patents

同種ｃａｒ ｔ細胞を製造する方法 Download PDF

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Abstract

本明細書では、免疫細胞を培養するための改善された培地、およびそれらの使用方法を記載する。特に、本明細書に記載の細胞増殖培地は、特にＴ細胞増殖に適し、キメラ抗原受容体を使用する療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法）を含む養子細胞療法に有用な細胞の製造に使用することができる。【選択図】図１

Description

相互参照
本出願は、２０１９年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８３９，４４９号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む操作された免疫細胞の製造のための細胞増殖培地および方法、ならびにそれを使用して患者の癌を治療する方法に関する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年４月１７日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＡＴ－０２５＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズは１５，４０５バイトである。
悪性腫瘍関連抗原を認識するように遺伝子改変された免疫細胞の養子移入は、癌を治療するための新しいアプローチとして有望視されている（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２２（２）：２５１－２５７（２０１０）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ、８（４）：２９９－３０８（２００８）を参照されたい）。免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変され得る（例えば、Ｅｓｈｈａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０（２）：７２０－７２４（１９９３）、およびＳａｄｅｌａｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２１（２）：２１５－２２３（２００９）を参照されたい）。ＣＡＲを含有する免疫細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）は、標的細胞を認識および殺傷する能力を保持または強化しながら、抗原特異性を有するように操作される。効果的な免疫細胞増殖培地およびその使用方法は、ＣＡＲ－Ｔなどの操作された免疫細胞の製造に特に有用であり得る。本明細書において、この必要性に対処する細胞増殖培地および製造方法が提供される。
本明細書では、免疫細胞を培養するための改善された培地、および使用方法が記載されている。例えば、本明細書において、キメラ抗原受容体を使用する療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法）を含む養子細胞療法に有用な細胞の製造に使用され得る、Ｔ細胞増殖に特に好適な培地が記載される。
一態様では、本開示は、それぞれ独立してＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１５からなる群から選択される、細胞増殖の第一の刺激剤および第二の刺激剤を含むＴ細胞増殖のための細胞増殖培地を提供し、第一の刺激剤および第二の刺激剤は、約１０００：１～約４：１の濃度比で存在する。
一態様では、本開示は、約４ｍＭ～約４０ｍＭの濃度の細胞外カリウムである細胞代謝の細胞外調節因子を含む、Ｔ細胞増殖のための細胞増殖培地を提供する。
一態様では、本開示は、それぞれ独立してＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１５からなる群から選択される、細胞増殖の第一の刺激剤および第二の刺激剤を含むＴ細胞増殖のための細胞増殖培地、ならびに約４ｍＭ～約４０ｍＭの濃度の細胞外カリウムである細胞代謝の細胞外調節因子を提供し、第一の刺激剤および第二の刺激剤は、約１０００：１～約４：１の濃度比で存在する。
いくつかの実施形態では、細胞増殖の第一の刺激剤は、ＩＬ７である。
いくつかの実施形態では、細胞増殖の第二の刺激剤は、ＩＬ１５である。
いくつかの実施形態では、第一の刺激剤および第二の刺激剤は、約５００：１～約１０：１、約２５０：１～約１０：１、約２００：１～約１０：１、約１５０：１～約１０：１、約１００：１～約１０：１、約５００：１～約５０：１、約２５０：１～約５０：１、約２００：１～約５０：１、約１５０：１～約５０：１、約１００：１～約５０：１、約５００：１～約７５：１、約２５０：１～約７５：１、約２００：１～約７５：１、約１５０：１～約７５：１、約１００：１～約７５：１、約１０：１～４：１、約８：１～４：１、または約７：１～約６：１の濃度比で存在する。
いくつかの実施形態では、第一の刺激剤および第二の刺激剤は、約１５０：１、約１４０：１、約１３０：１、約１２０：１、約１１０：１、約１００：１、約９０：１、約８０：１、または約７０：１の濃度比で存在する。
いくつかの実施形態において、第一の刺激剤は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在するＩＬ－７であり、第二の刺激剤は、約１ＩＵ／ｍＬ～約１００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在するＩＬ－１５である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－７は、約３００ＩＵ／ｍＬ～約５０００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ－１５は、約２５ＩＵ／ｍＬ～約５０ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－７は、約５０００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ－１５は、約５０ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、第一の刺激剤および第二の刺激剤は、同時にまたは順次細胞培養物に添加される。
いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは、約４ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、約２０ｍＭ～約３５ｍＭ、約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、または約２０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは、約２０ｍＭまたは約２５ｍＭの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは、４０ｍＭ未満かつ４ｍＭ超、４０ｍＭ未満かつ１０ｍＭ超、４０ｍＭ未満かつ２０ｍＭ超、または４０ｍＭ未満かつ２５ｍＭ超の濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは、ＫＣｌとして存在する。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の取得された集団は、ＴCM細胞および／またはＴSCM細胞に富化される。
別の態様では、本開示は、それぞれ独立してＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、およびＩＬ １５からなる群から選択される、細胞増殖の第一の刺激剤および第二の刺激剤を含む細胞増殖培地でＴ細胞の初期集団を培養することを含むＴ細胞の集団をインビトロに得る方法、ならびに約４ｍＭ～約４０ｍＭの濃度の細胞外カリウムである細胞代謝の細胞外調節因子を提供し、第一の刺激剤および第二の刺激剤は、約１０００：１～約４：１の濃度比で存在し、Ｔ細胞の取得された集団は、ＴCM細胞および／またはＴSCM細胞に富化される。
いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、上述の細胞増殖培地である。
いくつかの実施形態では、取得されたＴ細胞集団は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、または４５％のＴSCM細胞を含む。
いくつかの実施形態では、取得されたＴ細胞集団は、少なくとも約４０％のＴSCM細胞を含む。
いくつかの実施形態では、取得されたＴ細胞集団は、約７～１６日の期間にわたって測定された場合、Ｔ細胞の初期集団の約１００倍～約１０００倍である。
いくつかの実施形態では、取得されたＴ細胞集団は、約１０～１４日の期間にわたって測定された場合、Ｔ細胞の初期集団の約１００倍～約１０００倍である。
いくつかの実施形態では、取得されたＴ細胞集団は、Ｔ細胞の初期集団の少なくとも約１００倍～約２００倍である。
いくつかの実施形態では、取得されたＴ細胞集団は、約７～１６日の期間にわたって測定された場合、Ｔ細胞の初期集団のＴCMおよび／またはＴSCMより、ＴCMおよび／またはＴSCMに約１００倍～約１０００倍富化される。
いくつかの実施形態では、取得されたＴ細胞集団は、約１０～１４日の期間にわたって測定された場合、Ｔ細胞の初期集団のＴCMおよび／またはＴSCMより、ＴCMおよび／またはＴSCMに約１００倍～約１０００倍富化される。
いくつかの実施形態では、取得されたＴ細胞集団は、測定されたＴ細胞の初期集団のＴCMおよび／またはＴSCMより、ＴCMおよび／またはＴSCMに少なくとも約１００倍または少なくとも約２００倍富化される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の初期集団は、操作されたＴ細胞集団である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の初期集団は、一つ以上のキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞集団である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、同種Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞である。
一態様では、本開示は、操作された免疫細胞の集団を提供し、集団は、一つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ Ｔ細胞）を発現するＴ細胞を含み、前述のＣＡＲ Ｔ細胞は、上述の細胞増殖培地を使用して取得される。
一態様では、本開示は、操作された免疫細胞の集団を提供し、前述の集団は、一つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ Ｔ細胞）を発現するＴ細胞を含み、前述の（ＣＡＲ Ｔ細胞）は、上述の方法を使用して取得される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、または４５％のＴSCM細胞を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも約４０％のＴSCM細胞を含む。
一態様では、本開示は、上述の操作された免疫細胞の集団を含む医薬組成物を提供する。
一態様では、本開示は、上述の操作された免疫細胞、または上述の医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、疾患または障害は、癌である。
一態様では、本開示は、上述の操作された免疫細胞、または上述の医薬組成物を含む製造の物品を提供する。
本明細書に提示される全ての実施形態は、本開示全体を通して開示される全ての態様に適用される。
図１Ａは、連続ＩＬ－２刺激、ＩＬ－２刺激に続くＩＬ－７＋ＩＬ－１５刺激、および連続ＩＬ－７＋ＩＬ－１５刺激を含むプロセスを使用したＣＡＲ Ｔ+表現型の比較を示す。ＩＬ－７＋ＩＬ－１５に基づくプロセスは、ＴSCM ＣＡＲ Ｔ細胞の量を増加させる。
図１Ｂは、標的細胞曝露時のＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン放出能力を示しており、ここで、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＩＬ－２刺激、ＩＬ－２刺激に続くＩＬ－７＋ＩＬ－１５刺激、および連続ＩＬ－７＋ＩＬ－１５刺激を含む製造工程を使用して調製された。
図２Ａは、正常（４ｍＭ）のカリウム濃度（塗りつぶされたバー）と比較して、ＩＬ－２とＩＬ－７＋１５プロセスの両方でＴSCM細胞の量を増加させるために増加した細胞外カリウム（４０ｍＭ、塗りつぶされていないバー）の効果を示す。
図２Ｂは、正常のカリウム濃度（４ｍＭ、塗りつぶされたバー）と比較して、ＩＬ－２とＩＬ－７＋１５プロセスの両方における増加した細胞外カリウム（４０ｍＭ、塗りつぶされていないバー）の同種ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖能力に対する影響を示す。
図３は、２５ｍＭおよび１０ｍＭの細胞外カリウム濃度の影響を示し、これらの濃度は、より高い濃度と比較して、同種ＣＡＲ Ｔ細胞製造中のヒトＴ細胞の増殖に負の影響を与えなかった。
図４は、ＴSCM細胞の最大保存が２５ｍＭの細胞外カリウムで達成されたことを示す。
図５は、Ｆｌｔ３特異的ＣＡＲ Ｔ細胞（Ａｌｌｏ－８１９）の改善された能力が、２５ｍＭの細胞外カリウム補充を有するＩＬ－７＋１５ベースのプロセスの組み合わせを使用して得られたことを示す。
本明細書において、特に免疫細胞の培養に有用な細胞増殖培地および方法が記載されている。
操作された免疫細胞を使用した養子細胞療法は、癌治療のための特に有望な新しいアプローチとして浮上してきた免疫療法の一種である。操作された免疫細胞の生産および製造は、対象からの免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の採取と、それに続く細胞のインビトロでの細胞増殖とを含む。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）のインビトロでの増殖の成功は、十分な細胞増殖と望ましい細胞表現型の獲得の両方によって特徴付けられる。
例えば、Ｔ細胞増殖は、ナイーブＴ細胞（ＴN）、メモリーＴ細胞（幹細胞様メモリー（ＴSCM）、中央メモリー（ＴCM）、およびエフェクターメモリー（ＴEM）Ｔ細胞、およびエフェクター（ＴEFF）Ｔ細胞のサブセットを含む、Ｔ細胞の混合物をもたらし得る。種々の量の異なるＴ細胞サブセットは、結果として生じる操作されたＴ細胞の治療プロファイルおよび有効性に影響を与えることができる。特に、早期分化段階で濃縮された量のＴ細胞をもたらすＴ細胞増殖方法は、治療的に望ましい。
したがって、本明細書に記載される細胞増殖培地は、ＴSCMおよび／またはＴCMの割合が濃縮されるＴ細胞増殖に特に有益であり得る。ＴSCM細胞は、最小分化型のメモリーＴ細胞であり、養子Ｔ細胞療法のために、操作された細胞の患者への投与後の長期にわたるインビボでのＴ細胞増殖を促進するのに特に有利であり得る。したがって、かかる培地を使用して調製されたかかる細胞培養培地および免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、本明細書に記載されるＣＡＲ－Ｔ療法を含む、より強力な養子細胞移入療法をもたらし得る。
特に、細胞代謝の細胞外調節因子と組み合わせた細胞増殖の異なる刺激剤（例えば、第一および第二のＴ細胞増殖因子）の組み合わせを含む細胞増殖培地は、望ましい細胞増殖および細胞表現型をもたらすことができる。
一態様では、本開示は、
細胞増殖の第一の刺激剤（例えば、Ｔ細胞増殖を刺激する第一のサイトカイン）と、
細胞増殖の第二の刺激剤（例えば、Ｔ細胞増殖を刺激する第二のサイトカイン）と、
細胞代謝（例えば、Ｔ細胞代謝）の細胞外調節因子を含む、細胞増殖培地（例えば、Ｔ細胞増殖に適した培地）を特徴とする。
特に、本明細書に記載されるサイトカインおよび代謝調節因子の組み合わせおよび濃度は、新しいＴ細胞増殖培地を提供し、遺伝子改変同種細胞療法産物および自己細胞療法産物を含む免疫細胞療法産物の効力の増加をもたらし得る。一つの実施形態では、ＩＬ－７およびＩＬ－１５刺激剤と増加した細胞外カリウムとの組み合わせは、古典的なＩＬ－２に基づく増殖条件と比較して、同種ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＴSCM細胞集団の増加）および／または自己細胞療法産物の望ましい表現型の獲得の改善を達成することができる。
１．免疫細胞
本明細書に記載の培地および方法を使用した培養に適した細胞には、免疫細胞が含まれる。
インビトロ操作または遺伝子改変（例えば、本明細書に記載されるように）の前に、本明細書に記載される方法（例えば、免疫細胞）で使用するための細胞を、対象から取得することができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、幹細胞またはｉＰＳＣ由来免疫細胞、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な供給源から取得することができる。いくつかの実施形態では、当分野の当業者に利用可能かつ公知の任意の数のＴ細胞株を使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、健康なドナー、癌と診断された患者、または感染症と診断された患者に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、異なる表現型特徴を示す細胞の混合集団の一部であってもよい。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、最終的に操作された免疫細胞を受ける対象から取得される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、操作された免疫細胞を受ける対象とは異なる個体である、ドナーから取得される。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、幹細胞またはｉＰＳＣ由来Ｔ細胞、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、いくつかの供給源から取得することができる。特定のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から採取された血液の量から取得することができる。
細胞は、アフェレーシスによって個体の循環血液から取得することができる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。特定のいくつかの実施形態では、アフェレーシスによって収集される細胞は、血漿分画を除去するために洗浄されてもよく、その後の処理のために適切な緩衝液または培地中に置かれてもよい。
ＰＢＭＣは、本明細書に記載される方法を使用して、免疫細胞（ＣＡＲまたはＴＣＲなど）との遺伝子改変に直接使用することができる。特定のいくつかの実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後、Ｔリンパ球をさらに単離することができ、細胞傷害性およびヘルパーＴリンパ球の両方を、遺伝子改変および／または増殖の前または後に、ナイーブ、メモリー、およびエフェクターＴ細胞亜群に分類することができる。
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通した遠心分離を使用して、ＰＢＭＣから単離される。ＣＣＲ７＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ１２２、ＣＤ２７＋、ＣＤ６９＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の亜集団は、当技術分野で公知のポジティブまたはネガティブ選択技術によってさらに単離され得る。例えば、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを用いて達成することができる。本明細書で使用するための一つの方法は、ネガティブに選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負磁気免疫付着（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）またはフローサイトメトリーを介した細胞ソーティングおよび／または選択である。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞について濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。フローサイトメトリーおよび細胞ソーティングを使用して、本開示で使用するための対象となる細胞集団を単離することもできる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団は、Ｃ４＋細胞に対して濃縮される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団は、ＣＤ８＋細胞に対して濃縮される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、これらのタイプのＣＤ８＋細胞のそれぞれに関連する細胞表面抗原を特定することによって、ナイーブ、中央メモリー、およびエフェクター細胞へとさらにソートされる。いくつかの実施形態では、中央メモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、およびＣＤ１２７を含み、グランザイムＢに対して陰性である。いくつかの実施形態では、中央メモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、および／またはＣＤ１２７に対して陰性であり、グランザイムＢおよびパーフォリンに対して陽性である。特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、さらに亜集団に分類される。例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することによって、ナイーブ、中央メモリー、およびエフェクター細胞に分類することができる。
ＰＢＭＣは、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞などの他の細胞傷害性リンパ球をさらに含み得ることが理解されよう。本明細書に開示されるキメラ受容体のコード配列を担持する発現ベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞の集団に導入され得る。発現ベクターを担持する形質導入に成功したＴ細胞は、フローサイトメトリーを使用してソートされてＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離し、次いでさらに増殖されて、抗－ＣＤ３抗体およびＩＬ－２または本明細書の別に記載される当技術分野で既知の他の方法を使用した細胞活性化に加えて、これらのＣＡＲ発現Ｔ細胞の数を増加させることができる。標準的な手順は、ヒト対象における使用のための保管および／または調製のためのＣＡＲを発現するＴ細胞の凍結保存に使用される。一実施形態では、Ｔ細胞のインビトロ形質導入、培養、および／または増殖は、胎児仔ウシ血清および胎児ウシ血清などの非ヒト動物由来産物の非存在下で実施される。
２．操作された免疫細胞
本明細書に記載される細胞増殖培地および使用方法は、操作された免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む免疫細胞のインビトロ増殖において特に有用であり得る。
操作された免疫細胞は、同種または自己であり得る。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、炎症性Ｔリンパ球細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ））、ＮＫ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、ＴＣＲ発現細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、またはＢ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ－リンパ球及びＣＤ８＋Ｔ－リンパ球からなる群から生じることができる。いくつかの例示的な実施形態では、操作された免疫細胞はＴ細胞である。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、例えば限定されないが幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より詳細には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、分化全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血から取得または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から取得または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄から取得または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、臍帯血から取得または調製される。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、パーティクルガン（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）（例えば、Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群から選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される。
ａ．結合剤（抗体を含む）
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、抗原結合剤を含む（例えば、抗原結合ドメインを含むか、または抗体またはその断片を含む）。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、特定の標的抗原に特異的結合を付与するのに十分な標準的な免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当技術分野で公知であるように、自然界で生産される無傷の抗体は、二つの同一の重鎖ポリペプチド（各約５０ｋＤ）と、互いに会合し、通称“Ｙ字型”構造と呼ばれるものに結合する二つの同一の軽鎖ポリペプチド（各約２５ｋＤ）とからなる、およそ１５０ｋＤの四量体剤である。各重鎖は、少なくとも四つのドメイン（それぞれ約１１０アミノ酸長）－アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）、続いて三つの定常ドメイン、ＣＨＩ、ＣＨ２、およびカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙのステムの基部に位置する）からなる。“スイッチ”として知られる短い領域は、重鎖可変領域および定常領域に接続する。「ヒンジ」は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを抗体の残りの部分に接続する。このヒンジ領域の二つのジスルフィド結合は、インタクトな抗体において二つの重鎖ポリペプチドを互いに結合させる。各軽鎖は、二つのドメイン、すなわちアミノ末端可変（ＶＬ）ドメインと、それに続くカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインとで構成され、それらは互いに別の「スイッチ」によって分離されている。当業者は、抗体構造および配列要素に精通しており、提供される配列の中の「可変」領域および「定位」領域を認識し、同じ抗体鎖配列の異なる提示が、例えば、同じ抗体鎖配列の異なる提示に対して一つまたは少数の残基がシフトした位置でのかかる境界を示すことができるように、そのようなドメイン間の「境界」の定義にいくらかの柔軟性がある可能性があると理解している。
インタクトな抗体四量体は、重鎖－軽鎖二量体二つから成り、この重鎖および軽鎖は、一つのジスルフィド結合によって互いに連結され、二つの他のジスルフィド結合は、重鎖ヒンジ領域を互いに連結し、二量体が互いに連結され、四量体が形成される。天然産生抗体もグリコシル化され、典型的にはＣＨ２ドメイン上にある。天然抗体中の各ドメインは、圧縮された逆平行ベータバレル中に互いにパックされた二つのベータシート（例えば、３、４、または５鎖シート）から形成される「免疫グロブリン折り目」によって特徴付けられる構造を有する。各可変ドメインは、「補体決定領域」（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）として知られる三つの超可変ループと、四つのやや不変の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）とを含む。天然抗体が折り畳まれると、ＦＲ領域は、ドメインの構造フレームワークを提供するベータシートを形成し、重鎖および軽鎖の両方からのＣＤＲループ領域は、三次元空間にまとめて、Ｙ構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位を生成する。天然起源の抗体のＦｃ領域は、補体系の要素に結合し、エフェクター細胞上の受容体にも結合し、例えば、細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞を含む。当技術分野で公知のように、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性および／または他の結合特性は、グリコシル化または他の改変を介して調節され得る。いくつかの実施形態では、本開示に従って作製および／または利用される抗体は、修飾または操作されたそのようなグリコシル化を有するＦｃドメインを含む、グリコシル化Ｆｃドメインを含む。
本開示の目的のために、特定のいくつかの実施形態では、天然抗体中に見られる十分な免疫グロブリンドメイン配列を含むポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、そのようなポリペプチドが天然に産生される（例えば、抗原に反応する生物によって生成される）か、または組換え工学、化学合成、もしくは他の人工システムもしくは方法論によって産生されるかどうかに関わらず、参照され、および／または「抗体」として使用され得る。いくつかの実施形態では、抗体はポリクローナルであり、いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナルである。いくつかの実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体に特徴的な定常領域配列を有する。いくつかの実施形態では、抗体配列要素は、当該技術分野で公知のように、ヒト化、霊長化、キメラなどである。
さらに、本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、適切な実施形態で、代替的提示において抗体の構造および機能的特徴を利用するための、当技術分野で公知または開発された構築物またはフォーマットのいずれかを指すことができる（別段の記載または文脈から明らかでない限り）。例えば、いくつかの実施形態において、本開示に従って利用される抗体は、限定されるものではないが、インタクトＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体；二重特異性または多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）等）；Ｆａｂ断片などの抗体断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離されたＣＤＲまたはそのセットと、単鎖Ｆｖｓ；ポリペプチド－Ｆｃ融合；単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片などのサメ単一ドメイン抗体）；ラクダ様抗体；マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））；Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（“ＳＭＩＰｓ（商標））；単鎖またはタンデム体ダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））；ＶＨＨ；アンチカリン（登録商標）；ナノボディ（登録商標）ミニボディ；ＢｉＴＥ（登録商標）；アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）；アビマー（登録商標）；ＤＡＲＴ；ＴＣＲ様抗体；、アドネクチン（登録商標）；アフィリン（登録商標）；Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；トリマーＸ（登録商標）；マイクロタンパク質；フィノマー（登録商標）、センチリン（登録商標）；およびＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択される形式にある。いくつかの実施形態では、抗体は、天然に産生された場合に有する共有結合性修飾（例えば、グリカンの付着）を欠くことがある。いくつかの実施形態では、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカン、ペイロード（例えば、検出可能な部分、治療用部分、触媒部分など）、または他のペンダント基（例えば、ポリエチレングリコールなど）の付着）を含有してもよい。
いくつかの実施形態では、抗体または結合剤は、「対称的」とすることができる。「対称」とは、抗体または結合剤が、同じ種類のＦｖ領域を有することを意味する（例えば、抗体が二つのＦａｂ領域を有する）。いくつかの実施形態では、抗体または結合剤は、「非対称」とすることができる。「非対称」とは、抗体または結合剤が、少なくとも二つの異なる種類のＦｖ領域（例えば、抗体が、ＦａｂおよびｓｃＦｖ領域、ＦａｂおよびｓｃＦｖ２領域、またはＦａｂ－ＶＨＨ領域を有する）を有することを意味する。様々な非対称抗体または結合剤アーキテクチャが当該技術分野で公知である（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら、２０１７ Ｍａｂｓ（９）（２）：１８２～２１２）。
本明細書で使用される場合、用語「抗体剤」は、特定の抗原に特異的に結合する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、特異的結合を付与するのに十分な免疫グロブリン構造要素を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチド複合体を包含する。例示的な抗体剤としては、限定されないが、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体に特徴的な一つ以上の定常領域配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、抗体剤は、当該技術分野で公知のように、ヒト化、霊長類化、キメラなどである一つ以上の配列要素を含み得る。多くの実施形態では、用語「抗体剤」は、代替的な提示において抗体の構造および機能の特徴を利用するための、当技術分野で公知または開発された構築物またはフォーマットのうちの一つまたは複数を指すために使用される。例えば、本開示に従って利用される抗体剤は、限定されるものではないが、インタクトＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体；二重特異性または多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）等）；Ｆａｂ断片などの抗体断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離されたＣＤＲまたはそのセットと、単鎖Ｆｖｓ；ポリペプチド－Ｆｃ融合；単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片などのサメ単一ドメイン抗体）；ラクダ様抗体；マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））；Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（“ＳＭＩＰｓ（商標））；単鎖またはタンデム体ダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））；ＶＨＨ；アンチカリン（登録商標）；ナノボディ（登録商標）ミニボディ；ＢｉＴＥ（登録商標）；アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）；アビマー（登録商標）；ＤＡＲＴ；ＴＣＲ様抗体；アドネクチン（登録商標）；アフィリン（登録商標）；Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；Ａｆｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；トリマーＸ（登録商標）；マイクロタンパク質；フィノマー（登録商標）、センチリン（登録商標）；およびＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択される形式にある。
本開示のコードされる抗体または抗原結合分子は、一本鎖または二本鎖であってもよい。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合分子は、単鎖である。特定のいくつかの実施形態では、抗原結合分子は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）2、ｄＡｂ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
抗体には、抗体断片が含まれる。抗体断片は、例えば、インタクト抗体の抗原結合領域または可変領域などのインタクト抗体の一部分を含む。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ダイアボディ、線形抗体、抗体断片抗体およびｓｃＦｖ断片から形成される多重特異性、ならびに以下に記載されるその他の断片から形成される、が含まれるが、これらに限定されない。抗体はまた、限定されるものではないが、ポリクローナルモノクローナル、キメラｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆab、Ｆa、Ｆ(ab）２断片、ｓｃＦｖ、およびＦab発現ライブラリーを含む。抗体は、全抗体、または免疫グロブリン、または抗体断片であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、完全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧｌ抗体、または本明細書に記載される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。（例えば、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：１２９－１３４（２００３）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．１１３、ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４－６４４８（１９９３）；ＷＯ９３／０１１６１；および米国特許第 第５，５７１，８９４号、第５，８６９，０４６号、第６，２４８，５１６号、および第５，５８７，４５８号を参照されたい。）完全長抗体、インタクト抗体、または全抗体は、生来の抗体構造と実質的に類似した構造を有する抗体、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体である。抗体断片は、当技術分野で公知のように、インタクト抗体のタンパク質分解消化、ならびに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生を含むがこれに限定されない、様々な技術によって作製され得る。
いくつかの実施形態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体であるか、またはこれを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗原特異的抗体剤は、キメラ抗体であってもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１－６８５５（１９８４）を参照されたい）。キメラ抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体であってもよい。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えばサルなどに由来する可変領域）およびヒト定常領域を含み得る。さらなる実施例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変更された、「クラス切り替え」抗体であってもよい。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体とすることができる（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１３：１６１９－１６３３（２００８）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許 第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、および第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２８：４８９－４９８（１９９１）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６：４３－６０（２００５）；Ｏｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６：６１－６８（２００５）；およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００））を参照されたい。ヒト化抗体は、非ヒト超可変領域由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体である。ある特定のいくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、実質的に、少なくとも一つのおよび典型的には二つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、超可変領域（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト抗体のそれに相当し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてが、ヒト抗体のそれに相当する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。
非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を減少させるためにヒト化されてもよく、一方で親非ヒト抗体の特異性および親和性は保持される。ヒト化抗体は、非ヒト抗体に由来する一つまたは複数のＣＤＲ、またはその一部を含む一つまたは複数の可変ドメインを含み得る。ヒト化抗体は、ヒト抗体配列に由来する一つ以上のＦＲ、またはその一部を含む一つ以上の可変ドメインを含み得る。ヒト化抗体は、ヒト定常領域の少なくとも一部を任意に含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体中の一つ以上のＦＲ残基は、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が誘導される抗体）からの対応する残基で置換される。
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、以下が含まれるが、これらに限定されない：「最良適合」方法を使用して選択されたフレームワーク領域；軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定の部分集団のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域；およびフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５１：２２９６（１９９３）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５１：２６２３（１９９３）；Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）；およびＲｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体剤は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して作製することができる（例えば、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、５：３６８－７４（２００１）；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０：４５０－４５９（２００８）を参照されたい。ヒト抗体は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される、またはヒト抗体レパートリーまたは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に除外する。ヒト抗体は、抗原攻撃に応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変された遺伝子改変動物に免疫原を投与することによって調製することができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３：１１１７－１１２５（２００５）；米国特許第６，０７５，１８１号、第６，１５０，５８４号、第５，７７０，４２９号、および第７，０４１，８７０号、ならびに米国特許出願公報第ＵＳ２００７／００６１９００号を参照されたい）。そのような動物によって生成されたインタクト抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変することができる。
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法によって作製されてもよい。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、および他の方法を使用して、ヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株からヒト抗体を産生することができる（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．５１－６３（１９８７）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７：８６（１９９１）；Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７－３５６２（２００６）；米国特許第７，１８９，８２６号；Ｎｉ、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５－２６８（２００６）；Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０（３）：９２７－９３７（２００５）；およびＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２７（３）：１８５－９１（２００５）を参照のこと）。ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージ表示ライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても作製することができる。次いで、かかる可変ドメイン配列を、所望のヒト定常領域と組み合わせることができる。
抗体中のオリゴ糖の修飾は、例えば、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作製するために作製され得る。例えば、抗体グリコシル化バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、全部ではないが一部のエフェクター機能を有する抗体バリアントを企図することができ、それにより、抗体のインビボでの半減期が重要だが特定のエフェクター機能（補体など）が、不要または有害である用途のための望ましい候補にすることができる。ＣＤＣ活性の減少／枯渇を確認するために、インビトロおよび／またはインビボの細胞傷害性アッセイを実施することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体剤は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に利用可能である追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修正され得る。抗体の誘導体化に好適な部分は、水溶性ポリマーを含み得るが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－ｌ，３－ジオキソラン、ポリ－ｌ，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン酸化物／エチレン酸化物コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびその混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中の安定性のため、製造において利点を有し得る。
ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐または非分岐であってもよい。抗体に付着されるポリマーの数は異なり得、二つ以上のポリマーが付着している場合、それらは同一または異なる分子であり得る。
いくつかの実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体および非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブであってもよい（例えば、Ｋａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０２：１１６００－１１６０５（２００５）を参照のこと）。放射線は、任意の波長であってもよく、限定されないが、通常の細胞に害を及ぼさないが、非タンパク質性部分を、抗体－非タンパク質性部分の近位の細胞が死滅する温度に加熱する波長を含み得る。
ｂ．キメラ抗原受容体
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＡＲの集団を含み、各ＣＡＲは細胞外抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲの集団を含み、各ＣＡＲは細胞外抗原結合ドメインを含む。
本明細書で使用される場合、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、標的抗原（例えば、癌細胞上の標的抗原）を特異的に認識するタンパク質である。標的抗原に結合すると、ＣＡＲは免疫細胞を活性化して、その抗原を有する細胞（例えば、癌細胞）を攻撃および破壊することができる。ＣＡＲはまた、共刺激ドメインまたはシグナル伝達ドメインを組み込み、それらの効力を増加させることができる。Ｋｒａｕｓｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、Ｖｏｌｕｍｅ １８８、Ｎｏ．４、１９９８（６１９－６２６）；Ｆｉｎｎｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９８、１６１：２７９１－２７９７、Ｓｏｎｇら、Ｂｌｏｏｄ １１９：６９６－７０６（２０１２）；Ｋａｌｏｓら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：９５（２０１１）；Ｐｏｒｔｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５－３３（２０１１）、およびＧｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５６：５９－８３（２０１６）；米国特許第７，７４１，４６５号、および第６，３１９，４９４号を参照されたい。
本明細書に記載されるキメラ抗原受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含み、細胞外ドメインは、標的に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、抗原特異的ＣＡＲは、安全スイッチおよび／または一つ以上のモノクローナル抗体特異的エピトープをさらに含む。
ｉ．抗原結合ドメイン
上述のように、本明細書に記載のＣＡＲは、抗原結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」は、指定された標的抗原に結合する任意のポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、腫瘍細胞上の抗原に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、過増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に記載される可変重鎖、可変軽鎖、および／または一つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに重鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
抗原結合ドメインのバリアント（例えば、ＣＤＲ、ＶＨおよび／またはＶＬのバリアント）も、本開示の範囲内であり、例えば、可変軽鎖および／または可変重鎖であって、各々が抗原結合ドメイン配列のアミノ酸配列と少なくとも７０～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、９７～９９％、または９９％を超える同一性を有することも、本開示の範囲内である。いくつかの例では、こうした分子は、少なくとも一つの重鎖および一つの軽鎖を含むが、他の例では、バリアント形態は、二つの可変軽鎖および二つの可変重鎖（またはそれらのサブ部分）を含む。当業者は、周知の技術を使用して、本明細書に記載する抗原結合ドメインの好適なバリアントを決定することができる。ある特定のいくつかの実施形態において、当業者は、活性に重要とは考えられない領域を標的化することによって、活性を破壊することなく変化させることができる、分子の好適な領域を特定することができる。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインのポリペプチド構造は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣体」と呼称される場合もある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（本明細書では「抗体コンジュゲート」と呼称される場合もある）、およびそれらの断片をそれぞれ含むが、これらに限定されない、抗体に基づく。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、アビマーを含むか、またはアビマーからなる。
抗原結合ドメインは、第二の標的に結合するよりも、一つの標的に結合する場合に、より強く結合する場合に「選択性」であると言われる。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態では、抗原選択性ＣＡＲは、リーダーまたはシグナルペプチドを含む。
他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される抗原結合ドメインのいずれか一つをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＡＲをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。また、ポリヌクレオチドを含むベクター、およびポリヌクレオチドを作製する方法も本明細書において提供される。
ｉｉ．セーフティスイッチおよびモノクローナル抗体特異的エピトープ
有害事象は、免疫細胞（一つまたは複数のＣＡＲを含有する）を自殺遺伝子で形質導入することによって最小化され得ることがわかる。また、誘導性「オン」または「促進剤」スイッチを免疫細胞に組み込むことが望ましい場合もある。適切な技術としては、誘導性カスパーゼ－９（Ｕ．Ｓ．Ａｐｐｌ．２０１１／０２８６９８０）またはチミジンキナーゼの使用を、細胞が本開示のＣＡＲ構築物で形質導入される前、後、または同時に含む。自殺遺伝子および／または「オン」スイッチを導入するための追加の方法には、ＴＡＬＥＮＳ、亜鉛フィンガー、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス技術、および当技術分野で公知の他の技術が含まれる。
本開示によれば、追加のオン－オフまたは他のタイプの制御スイッチ技術が本明細書に組み込まれることができる。これらの技術は、こうしたドメイン二量体化の二量体化ドメインおよび任意のアクチベーターの使用を採用することができる。これらの技術には、例えば、特定の細胞におけるＦＫＢＰ／ラパログ二量体化システムを利用するＷｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１４ ３５０（６２５８）によって記載されるものが含まれ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。追加の二量体化技術は、例えば、Ｆｅｇａｎら Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１０、１１０、３３１５－３３３６、ならびに米国特許 第５，８３０，４６２号、第５，８３４，２６６号、第５，８６９，３３７号、および第６，１６５，７８７号に記載されており、その内容も参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。追加の二量体化対には、シクロスポリン－Ａ／シクロフィリン、受容体、エストロゲン／エストロゲン受容体（任意選択でタモキシフェンを使用する）、グルココルチコイド／グルココルチコイド受容体、テトラサイクリン／テトラサイクリン受容体、ビタミンＤ／ビタミンＤ受容体が含まれ得る。二量体化技術のさらなる例は、例えば、ＷＯ２０１４／１２７２６１、ＷＯ２０１５／０９０２２９、ＵＳ２０１４／０２８６９８７、ＵＳ２０１５／０２６６９７３、ＵＳ２０１６／００４６７００、米国特許第８，４８６，６９３号、ＵＳ２０１４／０１７１６４９、およびＵＳ２０１２／０１３００７６に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、例えば、ＲＱＲ８などの自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、ＷＯ２０１３１５３３９１Ａを参照のこと、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ポリヌクレオチドを含むＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）では、自殺ポリペプチドは、ＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の表面で発現される。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、配列番号１．
ＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰ ＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳ ＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号１）に示されるアミノ酸配列を含む。
自殺ポリペプチドはまた、アミノ末端にシグナルペプチド、例えば、ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＡ（配列番号２）を含むことができる。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、配列番号 ２のシグナル配列を含む。
ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号３）。
自殺ポリペプチドがＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の表面に発現されると、リツキシマブがポリペプチドのＲエピトープに結合すると、細胞の溶解が生じる。細胞表面で発現されるポリペプチド当たり、リツキシマブの複数の分子が結合することができる。ポリペプチドの各Ｒエピトープは、別個のリツキシマブ分子に結合することができる。抗原特異的ＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の欠失は、例えばリツキシマブを患者に投与することによって、インビボで発生し得る。導入された細胞を削除するという決定は、例えば、許容できないレベルの毒性が検出される場合など、導入された細胞に起因する、患者に検出される望ましくない効果から生じ得る。
いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、ＣＡＲ構築物に含まれる。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドはＣＡＲ構築物の一部ではない。
いくつかの実施形態では、抗原特異的ＣＡＲの細胞外ドメインは、モノクローナル抗体に特異的な（すなわち、モノクローナル抗体によって特異的に認識される）一つまたは複数のエピトープを含み得る。これらのエピトープは、本明細書ではｍＡｂ特異的エピトープとも呼称される。ｍＡｂ特異的エピトープの例は、国際特許公開第ＷＯ２０１６／１２０２１６号に開示されており、その全体が本明細書に組み込まれる。これらの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインと、一つ以上のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合する一つ以上のエピトープとを含む。ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲは、単鎖または複数鎖であり得る。
本明細書に記載されるＣＡＲの細胞外ドメインにおけるモノクローナル抗体に特異的なエピトープの含有は、ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞のソーティングおよび枯渇を可能にする。いくつかの実施形態では、この機能はまた、ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞の投与によって枯渇された内因性抗原発現細胞の回復を促進する。いくつかの実施形態において、枯渇を可能にすることは、例えば、対象への投与時に、有害な効果の場合のセーフティスイッチを提供する。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲに授けられた操作された免疫細胞をソーティングおよび／または枯渇する方法、ならびに内因性抗原発現細胞の回復を促進する方法に関する。
いくつかのエピトープ－モノクローナル抗体結合を使用して、モノクローナル抗体特異的エピトープを含むＣＡＲを生成することができ、特に、非限定的な例としてＣＤ２０エピトープ／リツキシマブなどの医療用途のために既に承認されているＣＡＲを生成することができる。
抗原はまた、ｍＡｂ特異的エピトープを発現する抗原特異的ＣＡＲに授けられた操作された免疫細胞をソーティングする方法、およびこれらのＣＡＲに授けられた操作された免疫細胞の活性化が、前述のＣＡＲの外部リガンド結合ドメインを標的とする抗体を使用して細胞を枯渇させることによって調節される治療方法を包含する。表１は、本開示のＣＡＲのいずれか一つの細胞外ドメインに挿入され得る、例示的なミモトープ配列を提供する。
Figure 2022529741000001
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、以下の配列を含む。
Ｖ1-Ｌ1-Ｖ2-（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－；
Ｖ1-Ｌ1-Ｖ2-（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x－；
Ｖ1-Ｌ1-Ｖ2-（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x－エピトープ３－（Ｌ）x－；
（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－Ｖ1-Ｌ1-Ｖ2；
（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x－Ｖ1-Ｌ1-Ｖ2；
エピトープ１（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x－エピトープ３－（Ｌ）x－Ｖ1-Ｌ1-Ｖ2；
（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－Ｖ1-Ｌ1-Ｖ2-（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x；
（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－Ｖ1-Ｌ1-Ｖ2-（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x－エピトープ３－（Ｌ）x－；
（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－Ｖ1-Ｌ1-Ｖ2-（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x－エピトープ３－（Ｌ）x－エピトープ４－（Ｌ）x－；
（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x－Ｖ1-Ｌ1-Ｖ2-（Ｌ）x－エピトープ３－（Ｌ）x－；
（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x－Ｖ1-Ｌ1-Ｖ2-（Ｌ）x－エピトープ３－（Ｌ）x－エピトープ４－（Ｌ）x－；
Ｖ1-（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－Ｖ2；
Ｖ1-（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－Ｖ2-（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x；
Ｖ1-（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－Ｖ2-（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x－エピトープ３－（Ｌ）x；
Ｖ1-（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－Ｖ2-（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x－エピトープ３－（Ｌ）x－エピトープ４－（Ｌ）x；
（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－Ｖ1-（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x－Ｖ2；または
（Ｌ）x－エピトープ１－（Ｌ）x－Ｖ1-（Ｌ）x－エピトープ２－（Ｌ）x－Ｖ2-（Ｌ）x－エピトープ３－（Ｌ）x；
式中、
Ｖ1はＶLであり、Ｖ2はＶHであるか、またはＶ1はＶHであり、Ｖ2はＶLであり、
Ｌ1は、ＶH鎖をＶL鎖に連結するのに好適なリンカーであり、
エピトープ１、エピトープ２、エピトープ３、およびエピトープ４はｍＡｂ特異的エピトープであり、同一であっても異なっていてもよく、ＶHは重鎖可変断片であり、ＶLは軽鎖可変断片である。
ｉｉｉ．ヒンジドメイン
本開示のＣＡＲの細胞外ドメインは、「ヒンジ」ドメイン（またはヒンジ領域）を含み得る。ＣＡＲ中の膜貫通ドメインを、ＣＡＲ中の細胞外抗原結合ドメインに連結するように機能する任意のポリペプチドに対する用語を一般的に含む。特に、ヒンジドメインを使用して、細胞外抗原結合ドメインに対してより柔軟性およびアクセス可能性を提供することができる。
ヒンジドメインは、最大３００個のアミノ酸を含むことができ、いくつかの実施形態では１０～１００個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態では２５～５０個のアミノ酸を含む。ヒンジドメインは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、またはＩｇＧの細胞外部領域（特に、ＩｇＧのヒンジ領域の全てまたは一部、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等の免疫グロブリンのメンバーのいくつかもしくはすべてまたはその断片を含み得ることが理解される）または抗体重鎖定常領域のすべてまたは一部に由来する天然の分子のすべてまたは一部から生じることができる。あるいは、Ａドメインは、天然由来のＡ配列に対応する合成配列であってもよく、または完全合成Ａ配列であってもよい。いくつかの実施形態において、前述のＡドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）の一部である。別の特定の実施形態では、前述のヒンジドメインおよび膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖の一部を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲのヒンジドメインは、ＣＤ８α、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＰＤ－１、またはＦｃγＲＩＩＩαのサブ配列、特にＣＤ８α、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＰＤ－１、またはＦｃγＲＩＩＩαのいずれかのヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８αヒンジ、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ヒトＩｇＧ４、ヒトＰＤ－１、またはヒトＦｃγＲＩＩＩαヒンジを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒトヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、および４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む。表２は、本明細書に提供される例示的なヒンジのアミノ酸配列を提供する。
Figure 2022529741000002
ｉｖ．膜貫通ドメイン
本開示のＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを用いて設計される。これは同様に、ＣＡＲの細胞内ドメインに融合され得る。いくつかの例では、膜貫通ドメインは、アミノ酸置換によって選択または改変されて、かかるドメインの、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化することができる。いくつかの実施形態では、短いリンカーは、ＣＡＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインのいずれかまたは一部の間に結合を形成することができる。
本明細書に開示されるＣＡＲの好適な膜貫通ドメインは、（ａ）例えば、例えば、Ｔヘルパー（Ｔh）細胞、細胞傷害性Ｔ（Ｔc）細胞、Ｔ調節性（Ｔreg）細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球細胞などの免疫細胞の表面で発現する能力、および／または（ｂ）標的細胞に対して免疫細胞の細胞応答を指示するために、細胞外抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用して細胞応答を誘導する能力を有する。
膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。
本開示における特定の使用の膜貫通領域は、ＣＤ２８、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激体（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤ１－１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、トールリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２，ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１ １ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１ １ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１ １ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１ １ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドと、を含み、またはそれらの任意の組み合わせに由来する（含むまたは対応する）。
非限定的な例として、膜貫通領域は、特にＦｃγ受容体ＩＩＩまたはＣＤタンパク質において、例えば、ＣＤ３複合体を構成するα、β、γまたはδポリペプチド、ＩＬ－２受容体ｐ５５（ａ鎖）、ｐ７５（β鎖）、またはγ鎖、Ｆｃ受容体のサブユニット鎖に由来してもよく、またはＴ細胞受容体の一部であってもよい。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、主にロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含み得る。いくつかの実施形態において、前述の膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）に由来する。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ中の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ中の膜貫通ドメインは、アミノ酸配列ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ（配列番号１７）を含むＣＤ８α膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８α膜貫通ドメインは、配列番号１７の膜貫通アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ中のヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインである。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ中の膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ中の膜貫通ドメインは、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＣＤ２８膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１８の膜貫通アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
ｖ．細胞内ドメイン
本開示のＣＡＲの細胞内（細胞質）ドメインは、ＣＡＲを含む免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも一つの活性化を提供することができる。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性を指すことができる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲで使用するための活性化細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、限定されないが、抗原受容体の係合後にシグナル伝達を開始するように協働して作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、ならびに同じ機能を有する任意の合成配列であってもよい。
適切な（例えば活性化）細胞内ドメインとして、限定されないが、ＣＤ２８、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激体（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤ１－１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、トールリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１ １ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１ １ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１ １ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１ １ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせに由来する（または対応する）シグナル伝達ドメインを含む。
本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、上述の活性化ドメインに加えて、共刺激シグナル伝達ドメイン（本明細書では、共刺激分子として交換可能に示される）を組み込み、それらの効力を増加させることができる。共刺激ドメインは、本明細書に記載される活性化分子によって提供される一次シグナルに加えてシグナルを提供することができる。
本開示の範囲内の適切な共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ３（アルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ゼータ）、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１（ＣＤ１ １ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４；ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦＲ、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１－１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１－１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１－１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１－１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３リガンド、またはその断片もしくは組み合わせに由来し得ることが理解される。上記に列挙されていない追加の共刺激性分子またはその断片は、本開示の範囲内にあることが理解される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内／細胞質ドメインは、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７ドメインをそれ自体で含むように設計されてもよく、または本開示のＣＡＲの文脈で有用な任意の他の所望の細胞内ドメインと組み合わせられてもよい。４－１ＢＢ／ＣＤ１３７の完全な天然アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１５５２．２に記載される。完全な天然４－１ＢＢ／ＣＤ１３７核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿ ００１５６１．５に記載される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内／細胞質ドメインは、ＣＤ２８ドメインをそれ自体で含むように設計されてもよく、または本開示のＣＡＲの文脈で有用な任意の他の所望の細胞内ドメインと組み合わせられてもよい。ＣＤ２８の完全な天然アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００６１３０．１に記載される。完全な天然ＣＤ２８核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００６１３９．１に記載される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内／細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインをそれ自体で含むように設計されてもよく、または本開示のＣＡＲの文脈で有用な任意の他の所望の細胞内ドメインと組み合わせられてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１９または配列番号２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み得る。
ＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１９）

ＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２６）

例えば、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達分子の一部分を含み得る。本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムまたは特定の順序で互いに連結することができる。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータの活性化ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータの活性化ドメインおよび４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ（細胞内ドメイン）は、アミノ酸配列を含む。
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号２０）。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ（細胞内ドメイン）は、核酸配列：ＡＡＧＣＧＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＧＣＡＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＡＧＧＣＣＣＧＴＡＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＣＴＧ（配列番号２１）によってコードされる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータの一部分を含むように設計され、細胞内ＣＤ２８は、配列番号２２に記載される核酸配列を含む。
ＡＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴＴＡＣＡＴＧＡＡＴＡＴＧＡＣＴＣＣ ＡＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＧＧＡＧＣ（配列番号２２）。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、アミノ酸配列ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号 ２３）を含むように設計される。ＣＤ３ゼータアミノ酸配列は配列番号２３を含むことができ、核酸配列は配列番号２４を含むことができる。
ＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＣＣＴＧＧＧＡＣＧＣＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＣＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＡＧＧＣＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＡＣＧＡＡＧＧＡＴＡＣＴＴＡＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＧＧ（配列番号２４）。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３．）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）の断片からなる群から選択される共刺激分子の一部を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２０および配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性、および／または配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。
ｃ．ＣＡＲを含む免疫細胞
本開示のＣＡＲ（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）を発現する操作された免疫細胞が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＡＲの集団を含み、各ＣＡＲは細胞外抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＡＲの集団を含み、各ＣＡＲは異なる細胞外抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲの集団を含み、各ＣＡＲは細胞外抗原結合ドメインを含む。
操作された免疫細胞は、同種または自己であり得る。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、炎症性Ｔリンパ球細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ））、ＮＫ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、ＴＣＲ発現細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、またはＢ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ－リンパ球及びＣＤ８＋Ｔ－リンパ球からなる群から生じることができる。いくつかの例示的な実施形態では、操作された免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの例示的な実施形態では、操作された免疫細胞はガンマデルタＴ細胞である。いくつかの例示的な実施形態では、操作された免疫細胞はマクロファージである。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、例えば限定されないが幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より詳細には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、分化全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血から取得または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から取得または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄から取得または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、臍帯血から取得または調製される。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、ウイルストランスフェクション（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、ＡＡＶ）またはポリプレックスからなる群から選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される。
いくつかの実施形態では、本開示の抗原特異的ＣＡＲをその細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％より大きい幹細胞メモリーおよび中央メモリー細胞の割合を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の抗原特異的ＣＡＲをその細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞は、約１０％～約１００％、約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約１０％～約３０％、約１０％～約２０％、約１５％～約１００％、約１５％～約９０％、約１５％～約８０％、約１５％～約７０％、約１５％～約６０％、約１５％～約５０％、約１５％～約４０％、約１５％～約３０％、約２０％～約１００％、約２０％～約９０％、約２０％～約８０％、約２０％～約７０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２０％～約４０％、約２０％～約３０％、約３０％～約１００％、約３０％～約９０％、約３０％～約８０％、約３０％～約７０％、約３０％～約６０％、約３０％～約５０％、約３０％～約４０％、約４０％～約１００％、約４０％～約９０％、約４０％～約８０％、約４０％～約７０％、約４０％～約６０％、約４０％～約５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約５０％～約６０％、約６０％～約１００％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、約６０％～約７０％、約７０％～約９０％、約７０％～約８０％、約８０％～約１００％、約８０％～約９０％、約９０％～約１００％、約２５％～約５０％、約７５％～約１００％、または約５０％～約７５％の幹細胞メモリーおよび中央メモリー細胞の割合を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の抗原特異的ＣＡＲをその細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％より大きい幹細胞メモリーおよび中央メモリー細胞の割合を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の抗原特異的ＣＡＲをその細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞は、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約１５％～約５０％、約１５％～約４０％、約２０％～約６０％、または約２０％～約７０％の幹細胞メモリーおよび中央メモリー細胞の割合を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の抗原特異的ＣＡＲをその細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞は、ＴCM細胞および／またはＴSCM細胞に富化され、それにより、操作された免疫細胞は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％の結合したＴCMおよびＴSCM細胞を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗原特異的ＣＡＲをその細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞は、ＴCM細胞および／またはＴSCM細胞に富化され、それにより、操作された免疫細胞は、少なくとも約７０％の結合したＴCMおよびＴSCM細胞を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗原特異的ＣＡＲをその細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞は、ＴCM細胞および／またはＴSCM細胞に富化され、それにより、操作された免疫細胞は、少なくとも約７５％の結合したＴCMおよび／またはＴSCM細胞を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の抗原特異的ＣＡＲをその細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞は、ＴCM細胞および／またはＴSCM細胞に富化され、それにより、操作された免疫細胞は、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％の結合したＴSCM細胞を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗原特異的ＣＡＲをその細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞は、ＴCM細胞および／またはＴSCM細胞に富化され、それにより、操作された免疫細胞は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、の結合したＴSCM細胞を含む。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか一つを発現する炎症性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか一つを発現する細胞傷害性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか一つを発現する制御Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか一つを発現するヘルパーＴリンパ球である。
また、上述の方法のいずれかに従って、形質転換された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）から得られた細胞株が本明細書に提供される。また、本明細書では、免疫抑制治療に耐性の改変細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本開示による単離細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本開示による操作された免疫細胞は、一つ以上の破損された遺伝子または不活化された遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示による操作された免疫細胞は、ＣＤ５２、ＤＬＬ３、ＧＲ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、２Ｂ４、ＨＬＡ、ＴＣＲα、およびＴＣＲβからなる群から選択される一つの破損または不活化された遺伝子を含み、および／またはＣＡＲ、多鎖ＣＡＲ、および／またはｐＴα導入遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、単離細胞は、多鎖ＣＡＲを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示による単離細胞は、以下からなる群から選択される二つの破損または非活性化遺伝子を含む：ＣＤ５２およびＧＲ、ＣＤ５２およびＴＣＲα、ＣＤＲ５２およびＴＣＲβ、ＤＬＬ３およびＣＤ５２、ＤＬＬ３およびＴＣＲα、ＤＬＬ３およびＴＣＲβ、ＧＲおよびＴＣＲα、ＧＲおよびＴＣＲβ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ、ＰＤ－１およびＴＣＲα、ＰＤ－１およびＴＣＲβ、ＣＴＬＡ－４およびＴＣＲα、ＣＴＬＡ－４およびＴＣＲβ、ＬＡＧ３およびＴＣＲα、ＬＡＧ３およびＴＣＲβ、ＴＩＭ３ａｎｄ ＴＣＲα、Ｔｉｍ３およびＴＣＲβ、ＢＴＬＡおよびＴＣＲα、ＢＴＬＡおよびＴＣＲβ、ＢＹ５５およびＴＣＲα、ＢＹ５５およびＴＣＲβ、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲα、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲβ、Ｂ７Ｈ５およびＴＣＲα、Ｂ７Ｈ５およびＴＣＲβ、ＬＡＩＲ１およびＴＣＲα、ＬＡＩＲ１およびＴＣＲβ、ＳＩＧＬＥＣ１０およびＴＣＲα、ＳＩＧＬＥＣ１０およびＴＣＲβ、２Ｂ４およびＴＣＲα、２Ｂ４およびＴＣＲβ および／またはＣＡＲ、多鎖ＣＡＲおよびｐＴα導入遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞内にエンドヌクレアーゼを導入することによって、選択的なＤＮＡ切断によって遺伝子を選択的に不活化することができることにより、一つ以上の遺伝子を破壊または不活化することを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガＴＡＬヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）、またはＣＲＩＰＲ（例えば、Ｃａｓ９）エンドヌクレアーゼであってもよい。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲα遺伝子および／またはＴＣＲβ遺伝子を破壊または不活化することによって、本開示による細胞内で機能しない。いくつかの実施形態では、個体に由来する改変細胞を取得する方法が提供され、ここにおいて、細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）シグナル伝達経路とは独立して増殖することができる。ＭＨＣシグナル伝達経路から独立して増殖することができる改変細胞は、本方法によって取得され易いので、本開示の範囲に包含される。本明細書に開示される改変細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対するそれを必要とする患者の治療に使用することができ、したがって、本開示の範囲内において、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対してそれを必要とする患者を治療する方法は、破壊されたまたは不活化されたＴＣＲα遺伝子および／またはＴＣＲβ遺伝子を含む改変細胞の有効量を前述の患者に投与することによって前述の患者を治療することを含む。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、一つ以上の化学療法剤に耐性であるように操作される。化学療法薬は、例えば、プリンヌクレオチド類似体（ＰＮＡ）であってもよく、したがって、養子免疫療法と化学療法とを組み合わせた癌治療に適した免疫細胞を作る。例示的なＰＮＡとしては、例えば、クロファラビン、フルダラビン、シクロホスファミド、およびシタラビンが単独でまたは組み合わせて含まれる。ＰＮＡは、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）によってモノリン酸ＰＮＡ、ジリン酸ＰＮＡ、およびトリリン酸ＰＮＡに代謝される。それらの三リン酸形態は、ＤＮＡ合成のためにＡＴＰと競合し、アポトーシス促進剤として作用し、トリヌクレオチド生成に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）の強力な阻害剤である。
いくつかの実施形態では、本開示の単離された細胞または細胞株は、ｐＴαまたはその機能的バリアントを含み得る。いくつかの実施形態では、単離された細胞または細胞株は、ＴＣＲα遺伝子を破壊または不活化することによってさらに遺伝子改変され得る。
本開示はまた、本明細書に記載されるＣＡＲポリヌクレオチドのいずれかを含む操作された免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、プラスミドベクターを介して導入遺伝子として免疫細胞内に導入され得る。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターはまた、例えば、ベクターを受容した細胞の識別および／または選択を提供する選択マーカーを含有してもよい。
ＣＡＲポリペプチドは、細胞内へのＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの導入後に細胞内でｉｎ ｓｉｔｕで合成され得る。あるいは、ＣＡＲポリペプチドは、細胞の外部で産生され、次いで細胞内に導入され得る。ポリヌクレオチド構築物を細胞内に導入する方法は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、（例えばレンチウイルスベクターを使用して）安定的形質転換方法を使用して、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノム内に統合することができる。他の実施形態では、一過性形質転換法を使用して、ポリヌクレオチド構築物、および細胞のゲノム内に組み込まれていないポリヌクレオチド構築物を一過性に発現することができる。他の実施形態では、ウイルス媒介方法を使用できる。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどの任意の適切な手段によって細胞内に導入され得る。一過性形質転換方法には、例えば、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、または粒子衝撃が含まれる。ポリヌクレオチドは、例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクターなどのベクターに含まれてもよい。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン、少なくとも一つの共刺激性分子、および活性化ドメインをコードする第一のポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーターを含む単離核酸が提供される。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、ウイルスベクター内に含有される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルスベクター、ＳＦＧベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸はプラスミド内に含有される。
３．免疫細胞のインビトロ増殖のための細胞増殖培地
細胞のインビトロ増殖（遺伝子改変Ｔ細胞などの免疫細胞の増殖を含む）は、
細胞増殖の第一の刺激剤（例えば、Ｔ細胞増殖を刺激する第一のサイトカイン）と、
細胞増殖の第二の刺激剤（例えば、Ｔ細胞増殖を刺激する第二のサイトカイン）と、
細胞代謝（例えば、Ｔ細胞代謝）の細胞外調節因子を含む細胞増殖培地を使用して達成することができる。
本開示の免疫細胞は、免疫細胞の遺伝子改変の前または後のいずれかで、概して既知であり、かつ本明細書に概して記述される方法を使用して、活性化および増殖することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、免疫細胞の遺伝子改変の前に活性化および増殖される。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、免疫細胞の遺伝子改変（例えば、本明細書に記載されるものを含む、操作された免疫細胞）後に活性化され、増殖される。
したがって、Ｔ細胞増殖に適切な条件として、細胞増殖の第一および第二刺激剤（例えば、ＩＬ－７およびＩＬ－１５）、ならびに細胞代謝の細胞外調節因子（例えば、細胞外カリウム）を含む適切な培地（例えば、基礎培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ－ｖｉｖｏ １５、（Ｌｏｎｚａ））が挙げられ、さらに、血清（例えば、ウシ胎仔またはヒト血清）、ＩＬ－２、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＴＧＦベータ、およびＴＮＦ、または当業者に周知の細胞の増殖のための任意のその他の添加物を含む、増殖および生存能に必要なさらなる因子をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞培養用の培地は、外因性ＩＬ－２を含まない。細胞の増殖のための他の添加物としては、限定されるものではないが、界面活性剤、プラスマネート、およびＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノール等の還元剤が挙げられる。培地は、追加のアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを有するＲＰＭＩ １６４０、Ａ１Ｍ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５、およびＸ－Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを負含むことができ、血清を含まないか、または適切な量の血清（または血漿）もしくは定義されたホルモンのセット、および／またはＴ細胞（例えば、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１５）の増殖に十分な量のサイトカインが補充される。例えばペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％のＣＯ2）などの増殖を支持するために必要な条件下で維持される。
様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈することができる。
本明細書に記載される方法は、Ｔ細胞の表面にＣＤ３ ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激する薬剤に細胞を接触させて、Ｔ細胞に対する活性化シグナルを作製することをさらに含むことができる。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボル１２－ミリスチン酸１３－酢酸塩（ＰＭＡ）、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの有糸分裂性レクチンなどの化学物質を使用して、Ｔ細胞の活性化シグナルを作製することができる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団はまた、例えば、抗－ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または表面に固定化された抗－ＣＤ２抗体と接触することによって、またはカルシウムイオンフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）と接触することによって、インビトロで刺激することができる。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗－ＣＤ３抗体および抗－ＣＤ２８抗体と接触することができる。抗－ＣＤ３抗体および抗－ＣＤ２８抗体は、ビーズもしくはプレートまたは他の基材上に配置され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、組織または細胞と共培養することによって増殖することができる。細胞はまた、インビボで、例えば、対象に細胞を投与した後の対象の血液中で増殖され得る。
特に、細胞増殖培地およびその使用方法は、同種ＣＡＲ－Ｔ細胞などのＣＡＲ－Ｔ細胞を含むＴ細胞の製造に特に有用であり得る。
ａ．細胞増殖の刺激剤
いくつかの実施形態では、第一および第二の刺激剤は、ＣＤ３ ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤、抗－ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片、抗－ＣＤ２抗体またはその抗原結合断片、タンパク質キナーゼＣ活性化因子、または成長因子（例えば、Ｔ細胞成長因子）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞または操作された免疫細胞）の刺激剤は、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３ ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激して、Ｔ細胞に対する活性化シグナルを生成する薬剤である。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボル１２－ミリスチン酸１３－酢酸塩（ＰＭＡ）、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの有糸分裂性レクチンなどの化学物質を使用して、Ｔ細胞の活性化シグナルを作製することができる。
いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞または操作された免疫細胞）の刺激剤は、抗－ＣＤ３抗体、またはその抗原結合断片、または表面上に固定された抗－ＣＤ２抗体、またはカルシウムイオンフォアと併せてプロテインキナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）である。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗－ＣＤ３抗体および抗－ＣＤ２８抗体と接触することができる。抗－ＣＤ３抗体および抗－ＣＤ２８抗体は、ビーズもしくはプレートまたは他の基材上に配置され得る。
いくつかの実施形態では、細胞の刺激剤は成長因子である。いくつかの実施形態では、細胞の刺激剤はＴ細胞成長因子である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞成長因子はサイトカインである。いくつかの実施形態では、第一の刺激剤は第一のサイトカインであり、第二の刺激剤は第二のサイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカインはインターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、またはＩＬ－１５）である。いくつかの実施形態では、第一の刺激剤および第二の刺激剤は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１５からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第一の刺激剤はＩＬ－７であり、第二の刺激剤はＩＬ－１５である。
いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、ＩＬ－２を除外する（例えば、細胞増殖培地は、外因性ＩＬ－２を除外し、ＩＬ－２は、第一の刺激剤および／または第二の刺激剤として細胞増殖培地中に存在しない）。
いくつかの実施形態において、第一および第二の刺激剤の使用量は、濃度で記載される（例えば、ＩＵ／ｍＬを使用して）。したがって、第二の刺激剤の濃度（例えば、ＩＬ－１５のｙＩＵ／ｍＬ）に対する第一の刺激剤の濃度（例えば、ＩＬ－７のｘＩＵ／ｍＬ）との比を記述するために、「ｘ：ｙの濃度比」を使用することができる。
いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）および第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）は、約１００００：１～約１：１００００、約１０００：１～約１：１０００、約１００：１～約１：１００、または約１０：１～約１：１０の濃度比で存在する。
いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）は、第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）よりも大きい量で存在する。いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）および第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）は、約１０００：１～約１０：１、約９００：１～約１０：１、約８００：１～約１０：１、約７００：１～約１０：１、約６００：１～約１０：１、約５００：１～約１０：１、約４００：１～約１０：１、約３００：１～約１０：１、約２５０：１～約１０：１、約２００：１～約１０：１、約１５０：１～約１０：１、または約１００：１～約４：１の濃度比で存在する。いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）および第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）は、約１０００：１～約５０：１、約９００：１～約５０：１、約８００：１～約５０：１、約７００：１～約５０：１、約６００：１～約５０：１、約５００：１～約５０：１、約４００：１～約５０：１、約３００：１～約５０：１、約２５０：１～約５０：１、約２００：１～約５０：１、約１５０：１～約５０：１、または約１００：１～約５０：１の濃度比で存在する。いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）および第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）は、約２００：１～約１０：１、約１５０：１～約１０：１、約１２５：１～約１０：１、または約１００：１～約４：１の濃度比で存在する。いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）および第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）は、約１００：１の濃度比で存在する。いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）および第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）は、約５：１、約６：１または約７．１の濃度比で存在する。いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）および第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）は、６．２５：１の濃度比で存在する。
いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約２０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）は、約１ＩＵ／ｍＬ～約２００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約１０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）は、約１ＩＵ／ｍＬ～約１００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約１，０００ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ＩＵ／ｍＬ、または約３，０００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）は、約３，０００ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）は、約２５００ＩＵ／ｍＬ～約７５００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）は、約２５ＩＵ／ｍＬ～約７５ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）は、約４０００ＩＵ／ｍＬ～約６０００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）は、約４０ＩＵ／ｍＬ～約６０ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）は、約２５ＩＵ／ｍＬ～約１００ＩＵ／ｍＬまたは約５０ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）は、約５０００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）は、約５０ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、遺伝子改変Ｔ細胞などのＴ細胞）は、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）および第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）と、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または８日ごとに接触する。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、遺伝子改変Ｔ細胞などのＴ細胞）は、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）および第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）と、約１週間ごとに接触する。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、遺伝子改変Ｔ細胞などのＴ細胞）は、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）および第二の刺激剤（例えば、例えばＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）と、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日（例えば、約１週間）、約２週間、約３週間、または約４週間続く増殖プロセスの間、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回または８回接触する。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、遺伝子改変Ｔ細胞などのＴ細胞）は、第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）および第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）と、約２週間接触する。
ｂ．細胞代謝の細胞外調節因子
いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、本明細書に記載される第一の刺激剤（例えば、ＩＬ－７などの第一のサイトカイン）および第二の刺激剤（例えば、ＩＬ－１５などの第二のサイトカイン）に加えて、細胞代謝の細胞外調節因子をさらに含む。
いくつかの実施形態では、細胞外調節因子は、細胞外カリウム（Ｋ+）である。いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは、約４ｍＭ～約５０ｍＭ、約４ｍＭ～約４０ｍＭ、約４ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約４０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３５ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約２０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、または約２０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは、約８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、または３０ｍＭの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは約１５ｍＭよりも大きい濃度で存在する。いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは約２０ｍＭ以上の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは、約２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、または３０ｍＭの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは、約１０ｍＭ以上の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは、約２０ｍＭ以上の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは、約３０ｍＭ以下の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは、約２５ｍＭの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、細胞外カリウムは、ＫＣｌとして提供される。
ｃ．細胞増殖培地の追加の特徴および構成要素
本明細書に記載される細胞増殖培地（例えば、ＩＬ－７である第一の刺激剤、ＩＬ－１５である第二の刺激剤、および細胞外カリウムである細胞外調節因子を含む細胞増殖培地）は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，９０５，８７４号、米国特許第６，８６７，０４１号、米国特許第６，７９７，５１４号、およびＰＣＴ ＷＯ２０１２／０７９０００に記載される、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔ細胞を活性化および増殖させる様々な方法に使用することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、ＩＬ－２などの適切なサイトカインを有する培養培地に、ビーズまたは他の表面に一般的に付着した抗－ＣＤ３抗体および抗－ＣＤ２８抗体などのさらなる刺激分子および共刺激性分子と、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞を接触させることをさらに含む。このビーズに結合された抗－ＣＤ３抗体および抗－ＣＤ２８抗体は、「サロゲート」抗原提示細胞（ＡＰＣ）としての役目を果たす。一つの例は、ヒトＴ細胞の生理学的活性化のためのＣＤ３／ＣＤ２８アクチベーター／刺激因子であるＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システムである。他の実施形態では、Ｔ細胞は、米国特許第６，０４０，１７７号、米国特許第５，８２７，６４２号、およびＷＯ２０１２１２９５１４に記載される方法、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、を使用して、Ｔ細胞は活性化および刺激されて、フィーダー細胞および適切な抗体およびさらにその他のサイトカイン（例えばＩＬ－７およびＩＬ－１５の他に）と増殖することができる。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地およびその使用方法は、Ｔ細胞増殖因子として外因性ＩＬ－２を除外する。
Ｔ細胞培養に適切な他の条件として、例えば、細胞増殖のために、増殖および生存能のために第一および第二の刺激剤を含むことができ、血清（ウシ胎仔またはヒト血清）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ、または当業者に周知の細胞の増殖のための任意の添加物に追加の因子を含むことができる適切な培地（例えば、基礎培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ－ｖｉｖｏ（商標）培地、（Ｌｏｎｚａ））が挙げられる。細胞の増殖のための他の添加物としては、限定されるものではないが、界面活性剤、プラスマネート、およびＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノール等の還元剤が挙げられる。培地は、ＲＰＭＩ １６４０、Ａ１Ｍ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ（商標）１０、Ｘ－Ｖｉｖｏ（商標）１５およびＸ－Ｖｉｖｏ（商標）２０、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）を含むことができ、付加アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および／またはビタミンを含んでもよく、血清を含まないか、または適切な量の血清（または血漿）および／または定義されたホルモンのセットが補充され得る。例えばペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％のＣＯ2）などの増殖を支持するために必要な条件下で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈する場合がある。
いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、組織または細胞と共培養することによって増殖することができる。細胞はまた、インビボで、例えば、対象に細胞を投与した後の対象の血液中で増殖され得る。
いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、血清を含有する。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、血清を含まない。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、異物を含まない。一部の実施形態では、細胞増殖培地は化学的に定義される。
ｄ．細胞増殖
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞増殖培地（例えば、ＩＬ－７である第一の刺激剤、ＩＬ－１５である第二の刺激剤、および細胞外カリウムである細胞外調節因子を含む細胞増殖培地）を使用してインビトロに増殖するための細胞（Ｔ細胞等の免疫細胞を含む）の培養、または本明細書に記載の任意の方法は、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日（例えば、約１週間）、約２週間、約３週間、または約４週間、継続される。いくつかの実施形態において、期間は、約１週間～約３週間または約１週間～約２週間（例えば、約７～１５日または約１０～１４日）である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞増殖培地（例えば、ＩＬ－７である第一の刺激剤、ＩＬ－１５である第二の刺激剤、および細胞外カリウムである細胞外調節因子を含む細胞増殖培地）または本明細書に記載の方法のいずれかは、約１週間～約３週間にわたって測定された場合に約１０～約１００００倍である細胞増殖をもたらす。いくつかの実施形態では、約１００倍～約１０００倍の細胞増殖が、約７～１５日（例えば、約１０～１４日または約２週間）にわたって観察される。いくつかの実施形態では、少なくとも約１００倍の細胞増殖が、約７～１５日（例えば、約１０～１４日または約２週間）にわたって観察される。いくつかの実施形態では、少なくとも約２００倍の細胞増殖が、約７～１５日（例えば、約１０～１４日または約２週間）にわたって観察される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞増殖培地（例えば、ＩＬ－７である第一の刺激剤、ＩＬ－１５である第二の刺激剤、および細胞外カリウムである細胞外調節因子を含む細胞増殖培地）または細胞増殖の方法のいずれかは、約８～１６日間にわたって少なくとも約５０×１０6～約１００×１０6の細胞数になる。いくつかの実施形態では、細胞数は、約１０～１４日の期間にわたって少なくとも約１００×１０6（例えば、約１０～１４日の期間にわたって少なくとも約１００×１０6、約１２５×１０6、約１５０×１０6、または約１００×１０6）である。
ｅ．細胞表現型
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞増殖培地（例えば、ＩＬ－７である第一の刺激剤、ＩＬ－１５である第二の刺激剤、および細胞外カリウムである細胞外調節因子を含む細胞増殖培地）またはその任意の使用方法は、操作された免疫細胞の産生のための望ましい表現型を生成する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞増殖培地（例えば、ＩＬ－７である第一の刺激剤、ＩＬ－１５である第二の刺激剤、および細胞外カリウムである細胞外調節因子を含む細胞増殖培地）またはその任意の使用方法は、ＴCMおよびＴSCM細胞に富むＴ細胞（例えば、遺伝子改変されたＴ細胞）の集団を産生する。
いくつかの実施形態では、ＴCM細胞および／またはＴSCM細胞に富むＴ細胞（例えば、遺伝子改変Ｔ細胞）の集団は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％のＴCMとＴSCMとの結合細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＴCM細胞および／またはＴSCM細胞に富むＴ細胞の集団は、少なくとも約７０％のＴCMとＴSCMとの結合細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＴCM細胞および／またはＴSCM細胞に富むＴ細胞（例えば、遺伝子改変Ｔ細胞）の集団は、少なくとも約７５％のＴCMとＴSCMとの結合細胞を含む。
いくつかの実施形態では、ＴCM細胞および／またはＴSCM細胞に富むＴ細胞（例えば、遺伝子改変Ｔ細胞）の集団は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％のＴSCM細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＴCM細胞および／またはＴSCM細胞に富むＴ細胞の集団は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、または４５％のＴSCM細胞細胞を含む。
４．操作された免疫細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞を含む）の製造
本明細書において、免疫細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞などの操作された免疫細胞を含む）の製造のために本明細書に記載される細胞増殖培地を使用する方法が提供される。
本開示によるポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、抗原結合ドメイン、免疫細胞、組成物などの作製には、様々な公知の技術を利用することができる。
本明細書に記載される免疫細胞のインビトロ操作または遺伝子改変の前に、細胞は対象から取得することができる。ＣＡＲを発現する細胞は、同種プロセスまたは自己プロセスに由来し得る。
ａ．原材料
本明細書に記載される細胞増殖培地（例えば、ＩＬ－７＋ＩＬ－１５および増加した細胞外カリウムを含む）を使用して、様々な免疫細胞（例えば、遺伝子改変Ｔ細胞）のインビトロ増殖を含む、様々な細胞を培養することができる。例示的な細胞が本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の供給源から取得することができる。特定のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から採取された血液の量から取得することができる。
細胞は、アフェレーシスによって個体の循環血液から取得することができる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。特定のいくつかの実施形態では、アフェレーシスによって収集される細胞は、血漿画分を除去するために洗浄され、その後、後続の処理のために適切な緩衝剤または培地中に置かれ得る。
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通した遠心分離を使用して、ＰＢＭＣから単離される。Ｔ細胞（例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ－、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞またはＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤＳ＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋、およびＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞）の特定の亜集団は、当技術分野で公知のポジティブまたはネガティブ選択技術によってさらに単離され得る。例えば、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを用いて達成することができる。本明細書で使用するための一つの方法は、ネガティブに選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負磁気免疫付着（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）またはフローサイトメトリーを介した細胞ソーティングおよび／または選択である。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞について濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。フローサイトメトリーおよび細胞ソーティングを使用して、本開示で使用するための対象となる細胞集団を単離することもできる。
ＰＢＭＣは、本明細書に記載される方法を使用して、免疫細胞（ＣＡＲまたはＴＣＲなど）との遺伝子改変に直接使用することができる。特定のいくつかの実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後、Ｔリンパ球をさらに単離することができ、細胞傷害性およびヘルパーＴリンパ球の両方を、遺伝子改変および／または増殖の前または後に、ナイーブ、メモリー、およびエフェクターＴ細胞亜群に分類することができる。
一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、これらのタイプのＣＤ８＋細胞のそれぞれに関連する細胞表面抗原を特定することによって、ナイーブ、幹細胞メモリー、中央メモリー、およびエフェクター細胞へとさらにソートされる。いくつかの実施形態では、中央メモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現は、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、およびＣＤ１２７を含み、グランザイムＢに対して陰性である。いくつかの実施形態では、幹細胞メモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、中央メモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ１２７に対して陰性であり、グランザイムＢおよびパーフォリンに対して陽性である。特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、さらに亜集団に分類される。例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することによって、ナイーブ、中央メモリー、およびエフェクター細胞に分類することができる。
ｂ．幹細胞由来免疫細胞
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に由来し得る。適切なＨＳＣ、間葉系、ｉＰＳ細胞、および他の種類の幹細胞は、不死細胞株を培養するか、または患者から直接単離することができる。幹細胞を単離、発現、および／または培養するための様々な方法が当技術分野で公知であり、本開示の実践に使用することができる。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、再プログラムされたＴ細胞に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、原料物質は、Ｔ細胞または非Ｔ細胞に由来する誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。原料物質は胚性幹細胞とすることができる。原料物質は、Ｂ細胞、または末梢血単核細胞単離物、造血前駆細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、脂肪幹細胞、または任意の他の体細胞タイプの任意の他の細胞であってもよい。
ｃ．単離細胞の遺伝子改変
Ｔ細胞などの免疫細胞は、公知の方法を使用した単離後に遺伝子改変され得るか、または遺伝子改変される前に、インビトロで免疫細胞を活性化および増殖（または前駆細胞の場合に分化）させることができる。いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、内因性ＴＣＲαおよび／またはＣＤ５２の発現を低減または除去するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬ、メガヌクレアーゼ）を使用して遺伝子改変され、内因性タンパク質（例えば、ＴＣＲαおよび／またはＣＤ５２）の発現を低減または除去する。別の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫細胞は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体（例えば、ＣＡＲをコードする一つ以上のヌクレオチド配列を含むウイルスベクターで形質導入される）で遺伝子改変され、次いでインビトロで活性化および／または拡大される。
本開示の構築物および操作された免疫細胞を作製するための特定の方法は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１５／１４５２０に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＰＢＭＣは、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞などの他の細胞傷害性リンパ球をさらに含み得ることが理解されよう。本明細書に開示されるキメラ受容体のコード配列を担持する発現ベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞の集団に導入され得る。発現ベクターを担持する形質導入に成功したＴ細胞は、フローサイトメトリーを使用してソートされてＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離し、次いでさらに増殖されて、抗－ＣＤ３抗体およびＩＬ－２または本明細書の別に記載される当技術分野で既知の他の方法を使用した細胞活性化に加えて、これらのＣＡＲ発現Ｔ細胞の数を増加させることができる。標準的な手順は、ヒト対象における使用のための保管および／または調製のためのＣＡＲを発現するＴ細胞の凍結保存に使用される。一実施形態では、Ｔ細胞のインビトロ形質導入、培養、および／または増殖は、胎児仔ウシ血清および胎児ウシ血清などの非ヒト動物由来産物の非存在下で実施される。
ポリヌクレオチドのクローニングのために、ベクターを宿主細胞（単離された宿主細胞）に導入して、ベクター自体の複製を可能にし、それによってその中に含有されるポリヌクレオチドのコピーを増幅することができる。クローニングベクターは、配列構成要素を概して含むことができ、限定されるものではないが、複製の起源、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、および選択マーカーを含む。これらの要素は、当業者によって適宜選択され得る。例えば、複製の起源は、宿主細胞中のベクターの自律的複製を促進するために選択され得る。
特定のいくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に提供されるベクターを含有する単離宿主細胞を提供する。ベクターを含有する宿主細胞は、ベクター中に含有されるポリヌクレオチドの発現またはクローニングに有用であり得る。適切な宿主細胞には、限定されるものではないが、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞、特にヒト細胞などのより高次の真核細胞が含まれ得る。
ベクターは、限定されるものではないが、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介送達、リン酸カルシウム沈殿法、カチオン性脂質媒介送達、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃、受容体媒介遺伝子送達、ポリリジン、ヒストン、キトサン、およびペプチドによって媒介される送達を含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して宿主細胞に導入され得る。対象となるベクターの発現のための細胞のトランスフェクションおよび形質転換のための標準的な方法は、当該技術分野で周知である。さらなる実施形態では、異なる発現ベクターの混合物は、免疫エフェクター細胞のドナー集団を遺伝子改変する際に使用することができ、各ベクターは、本明細書に開示される異なるＣＡＲをコードする。結果として生じる形質導入免疫エフェクター細胞は、操作された細胞の混合集団を形成し、操作された細胞の割合は、一つ以上の異なるＣＡＲを発現する。
一つの実施形態では、本開示は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する遺伝子操作された細胞を保存する方法を提供する。これは、細胞が解凍時に生存し続けるように、免疫細胞を凍結保存することを伴う。ＣＡＲを発現する免疫細胞の画分は、当該技術分野で公知の方法によって凍結保存され、悪性腫瘍に罹患した患者の将来の治療のためのそのような細胞の永久的な供給源を提供することができる。必要な場合、凍結保存された形質転換免疫細胞を解凍し、増殖させ、増殖させて、より多くのそのような細胞を得ることができる。
いくつかの実施形態では、細胞は、まずその培養培地から細胞を回収し、次いで治療有効量での投与（医薬的に許容可能な担体）に適した培地および容器システムで細胞を洗浄および濃縮することによって製剤化される。適切な注入媒体は、任意の等張性媒体製剤、典型的には生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ（商標）Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ社）またはＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ（商標）Ａ（Ｂａｘｔｅｒ社）であるが、水中の５％デキストロースまたはリンゲル乳酸も利用することができる。注入培地は、ヒト血清アルブミンで補充され得る。
ｄ．同種ＣＡＲ Ｔ（ＡＬＬＯＣＡＲ Ｔ（商標））細胞
同種ＣＡＲ Ｔ療法、またはＡｌｌｏＣＡＲｓ（商標）を製造するためのプロセスは、健康なドナーから健康な、選択された、スクリーニングされた、および試験されたＴ細胞を採取することを含む。次に、Ｔ細胞は、血液学的腫瘍または固形腫瘍に発現される特定の細胞表面タンパク質を認識するＣＡＲを発現するように操作される。同種Ｔ細胞は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを減少させ、同種拒絶反応を予防するための遺伝子編集である。Ｔ細胞受容体遺伝子（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ）は、ＧｖＨＤを避けるためにノックアウトされる。ＣＤ５２遺伝子をノックアウトして、抗－ＣＤ５２抗体治療に対してＣＡＲ Ｔ産物を抵抗性にすることができる。したがって抗－ＣＤ５２抗体治療は、宿主免疫系を抑制し、ＣＡＲ Ｔが生着したままで完全な治療的効果を達成できるように使用することができる。次いで、操作されたＴ細胞は精製工程を受け、最終的に患者に送達するためにバイアル中で凍結保存される。
ｅ．自家ＣＡＲ Ｔ（ＡＵＴＯＣＡＲ Ｔ（商標））細胞
自家キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、患者自身の細胞（例えば、Ｔ細胞を含む白血球）を収集し、Ｔ細胞を遺伝子操作して、一つ以上の特定の癌細胞の細胞表面に発現された標的を認識し、癌細胞を殺すＣＡＲを発現することを含む。次いで、操作された細胞を凍結保存し、その後患者に投与する。
５．医薬組成物および治療
いくつかの実施形態では、細胞は、まずその培養培地から細胞を回収し、次いで治療有効量での投与（医薬的に許容可能な担体）に適した培地および容器システムで細胞を洗浄および濃縮することによって製剤化される。適切な注入媒体は、任意の等張性媒体製剤、典型的には生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ（商標）Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ社）またはＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ（商標）Ａ（Ｂａｘｔｅｒ社）であるが、水中の５％デキストロースまたはリンゲル乳酸も利用することができる。注入培地は、ヒト血清アルブミンで補充され得る。
実施形態では、組成物中の細胞の所望の治療量は、概して、少なくとも２個の細胞（例えば、少なくとも１個のＣＤ８＋中央または幹細胞メモリーＴ細胞、および少なくとも１個のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセット、または二つ以上のＣＤ８＋中央または幹細胞メモリーＴ細胞、または二つ以上のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセット）であるか、またはより一般的には、１０2個超の細胞、１０6個以下、１０7、１０8または１０9個以下の細胞であり、１０10個超の細胞であってもよい。細胞数は、組成物が意図される望ましい使用、およびその中に含まれる細胞のタイプに依存する。所望の細胞の密度は、典型的には、１０6細胞／ｍｌ超であり、概して、１０7細胞／ｍｌ超、概して、１０8細胞／ｍｌ超である。臨床的に意義のある数の免疫細胞を、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、または１０12細胞に累積的に等しいか、またはそれを超える複数の注入に分配することができる。本開示のいくつかの態様では、特に、注入されたすべての細胞は、特定の標的抗原に再指示されるため、約１０5／キログラムまたは約１０6／キログラム（患者あたり１０6～１０11）の範囲のより少ない数の細胞を投与することができる。ＣＡＲ治療は、これらの範囲内の用量で複数回投与することができる。細胞は、療法を受けている患者に対し、自己、同種、または異種であり得る。
本開示のＣＡＲ発現細胞集団は、単独で、または希釈剤と組み合わせて、および／またはＩＬ－２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の構成要素と組み合わせて医薬組成物として投与することができる。本開示の医薬組成物は、本明細書に記載のＴ細胞などのＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞集団を、一つ以上の薬学的または生理学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含むことができる。こうした組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝剤、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストランなどの炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、および保存剤を含み得る。本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化されることが好ましい。
医薬組成物（溶液、懸濁液など）は、以下のうちの一つ以上を含み得る：注射用水などの滅菌希釈剤、生理食塩水、好ましくは、生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒として役立ち得る合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤と、アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤と、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性の調整のための薬剤。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックで作製された複数回用量バイアルに封入され得る。注射用医薬組成物は、滅菌であることが好ましい。
６．治療方法
本開示は、患者における疾患（例えば、癌）を治療または予防するための方法を含み、有効量の少なくとも一つのＣＡＲ、または本明細書に開示されるＣＡＲを含む免疫細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む。
癌を含む疾患または障害を治療するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本開示は、対象におけるＴ細胞介在性免疫反応の生成に関し、本出願の操作された免疫細胞の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞介在性免疫反応は、標的細胞に対して向けられる。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は腫瘍細胞である。いくつかの態様では、本開示は、悪性腫瘍を治療または予防するための方法を含み、前述の方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の少なくとも一つの単離された抗原結合ドメインの有効量を投与することを含む。いくつかの態様では、本開示は、悪性腫瘍を治療または予防するための方法を含み、前述の方法は、それを必要とする対象に、少なくとも一つの免疫細胞の有効量を投与することを含み、免疫細胞は、少なくとも一つのキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、および／または本明細書に記載の単離された抗原結合ドメインを含む。本開示の免疫細胞を含有するＣＡＲは、バイオマーカーの異常発現に関与する悪性腫瘍を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞を含有するＣＡＲは、小細胞肺癌、黒色腫、低悪性度神経膠腫、膠芽腫、甲状腺髄様癌、カルチノイド、膵臓における分散神経内分泌腫瘍、膀胱および前立腺、精巣癌、ならびに神経内分泌の特徴を有する肺腺がんを治療するために使用され得る。例示的な実施形態では、例えば、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞などの免疫細胞を含有するＣＡＲは、小細胞肺癌を治療するために使用される。
また、対象における腫瘍のサイズを縮小する方法であって、本開示の操作された細胞を対象に投与することを含み、細胞が抗原結合ドメインを含み、腫瘍上の抗原に結合するキメラ抗原受容体を含む。
いくつかの実施形態では、対象は、固形腫瘍、またはリンパ腫または白血病などの血液悪性腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、操作された細胞は腫瘍床に送達される。いくつかの実施形態では、癌は、対象の骨髄中に存在する。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、自己免疫細胞、例えば、自己Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、同種免疫細胞、例えば、同種Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、異種免疫細胞、例えば、異種Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、本出願の操作された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される。他の実施形態では、本出願の操作された細胞は、エクスビボでトランスフェクトまたは形質導入される。本明細書で使用される場合、用語「インビトロ細胞」は、エクスビボで培養される任意の細胞を指す。
「治療有効量」、「有効用量」、「有効量」または治療剤の「治療有効用量」の治療薬、例えば、操作されたＣＡＲＴ細胞は、単独で、または別の治療剤と組み合わせて使用された場合、疾患の発症に対して対象を保護する、または疾患の症状の重症度の減少によって示されるまたは疾患退縮を促進する、疾患無症状期間の頻度および期間を増加させる、または疾患による障害もしくは障害を予防する任意の量である。疾患退縮を促進する治療剤の能力は、例えば、臨床試験中のヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデルシステムにおいて、またはインビトロアッセイにおける薬剤の活性をアッセイすることによって、当業者に公知の様々な方法を用いて評価することができる。
用語「患者」および「対象」は互換的に使用され、ヒトおよび非ヒト動物の対象、ならびに正式に診断された障害を有するもの、正式に認識された障害を有していないもの、医学的な注意を引くもの、障害を発症するリスクを有するものなどを含む。
用語「治療する」および「治療」は、治療的治療、予防的治療、および対象が障害または他のリスク因子を発症するリスクを減少させる用途を含む。治療は、障害の完全な治癒を必要とせず、症状または根底にあるリスク因子を減少させる実施形態を包含する。用語「予防する」は、事象の可能性の１００％除去を必要としない。むしろ、化合物または方法の存在下で事象の発生の可能性が低減されたことを示す。
組成物中の細胞の所望の治療量は、概して、少なくとも２個の細胞（例えば、少なくとも１個のＣＤ８＋中央メモリーＴ細胞および少なくとも１個のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセット）であるか、またはより典型的には１０2細胞超、最大１０6個、最大１０8細胞または１０9細胞を含み、１０10細胞以上とすることができる。細胞数は、組成物が意図される望ましい使用、およびその中に含まれる細胞のタイプに依存する。所望の細胞の密度は、典型的には、１０6細胞／ｍｌ超であり、概して、１０7細胞／ｍｌ超、概して、１０8細胞／ｍｌ超である。臨床的に意義のある数の免疫細胞を、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、または１０12細胞に累積的に等しいか、またはそれを超える複数の注入に分配することができる。本開示のいくつかの態様では、特に、注入されたすべての細胞は特定の標的抗原に再指示されるため、１０6／キログラム（患者あたり１０6～１０11）の範囲のより少ない細胞数を投与することができる。ＣＡＲ治療は、これらの範囲内の用量で複数回投与することができる。細胞は、療法を受けている患者に対し、自己、同種、または異種であり得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効量は約１Ｘ１０5細胞／ｋｇ、約２Ｘ１０5細胞／ｋｇ、約３Ｘ１０5細胞／ｋｇ、約４Ｘ１０5細胞／ｋｇ、約５Ｘ１０5細胞／ｋｇ、約６Ｘ１０5細胞／ｋｇ、約７Ｘ１０5細胞／ｋｇ、約８Ｘ１０5細胞／ｋｇ、約９Ｘ１０5細胞／ｋｇ、２Ｘ１０6細胞／ｋｇ、約３Ｘ１０6細胞／ｋｇ、約４Ｘ１０6細胞／ｋｇ、約５Ｘ１０6細胞／ｋｇ、約６Ｘ１０6細胞／ｋｇ、約７Ｘ１０6細胞／ｋｇ、約８Ｘ１０6細胞／ｋｇ、約９Ｘ１０6細胞／ｋｇ、約１Ｘ１０7細胞／ｋｇ、約２Ｘ１０7細胞／ｋｇ、約３Ｘ１０7細胞／ｋｇ、約４Ｘ１０7細胞／ｋｇ、約５Ｘ１０7細胞／ｋｇ、約６Ｘ１０7細胞／ｋｇ、約７Ｘ１０7細胞／ｋｇ、約８Ｘ１０7細胞／ｋｇ、または約９Ｘ１０7細胞／ｋｇである。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ＋／ＣＡＲ－Ｔ＋／ＴＣＲ＋細胞の標的用量は、１×１０6～２×１０8細胞／ｋｇ、例えば、２×１０6細胞／ｋｇの範囲である。この範囲を超える用量および下回る用量は、特定の対象に適切であり得、必要に応じて、適切な用量レベルを医療従事者によって決定することができる。さらに、本開示に従って細胞の複数回用量を提供することができる。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の少なくとも一つの抗原結合ドメインと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、追加の活性薬剤をさらに含む。
本開示のＣＡＲ発現細胞集団は、単独で、または希釈剤と組み合わせて、および／またはＩＬ－２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の構成要素と組み合わせて医薬組成物として投与することができる。本開示の医薬組成物は、本明細書に記載のＴ細胞などのＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞集団を、一つ以上の薬学的または生理学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含むことができる。こうした組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝剤、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストランなどの炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、および保存剤を含み得る。本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化されることが好ましい。
医薬組成物（溶液、懸濁液など）は、以下のうちの一つ以上を含み得る：注射用水などの滅菌希釈剤、生理食塩水、好ましくは、生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒として役立ち得る合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤と、アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤と、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性の調整のための薬剤。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックで作製された複数回用量バイアルに封入され得る。注射用医薬組成物は、滅菌であることが好ましい。
いくつかの実施形態は、患者に投与すると、その細胞表面で本明細書に記載される抗原特異的ＣＡＲのいずれか一つを発現する操作された免疫細胞は、患者の内因性抗原発現細胞を減少させ、死滅させ、または溶解することができる。一実施形態では、本明細書に記載の抗原特異的ＣＡＲのいずれか一つを発現する操作された免疫細胞によって抗原を発現する細胞株の抗原発現内因性細胞または細胞の減少または溶解の割合は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％超である。一つの実施形態では、抗原特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞による抗原を発現する細胞株の抗原発現内因性細胞または細胞の還元または溶解の割合は約５％～約９５％であり、約１０％～約９５％であり、約１０％～約９０％であり、約１０％～約８０％であり、約１０％～約７０％であり、約１０％～約６０％であり、約１０％～約５０％であり、約１０％～約４０％であり、約２０％～約９０％であり、約２０％～約８０％であり、約２０％～約７０％であり、約２０％～約６０％であり、約２０％～約５０％であり、約２５％～約７５％であり、または約２５％～約６０％である。一実施形態では、内因性抗原発現細胞は、内因性抗原発現骨髄細胞である。
一実施形態は、本開示の抗原特異的ＣＡＲをその細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞による標的細胞、例えば抗原を発現する細胞株の減少または溶解の割合を、本明細書に開示されるアッセイを使用して測定することができる。
方法は、一つ以上の化学療法剤を投与することをさらに含むことができる。特定のいくつかの実施形態では、化学療法剤は、リンパ球枯渇（前処理）化学療法である。例えばシクロホスファミドの特定の有益な用量（２００ｍｇ／ｍ2／日～２０００ｍｇ／ｍ2／日、約１００ｍｇ／ｍ2／日～約２０００ｍｇ／ｍ2／日、例えば、約１００ｍｇ／ｍ2／日、約２００ｍｇ／ｍ2／日、約３００ｍｇ／ｍ2／日、約４００ｍｇ／ｍ2／日、約５００ｍｇ／ｍ2／日、約６００ｍｇ／ｍ2／日、約７００ｍｇ／ｍ2／日、約８００ｍｇ／ｍ2／日、約９００ｍｇ／ｍ2／日、約１０００ｍｇ／ｍ2／日、約１５００ｍｇ／ｍ2／日または約２０００ｍｇ／ｍ2／日）および特定用量のフルダラビン（２０ｍｇ／ｍ2／日～９００ｍｇ／ｍ2／日、約１０ｍｇ／ｍ2／日～約９００ｍｇ／ｍ2／日；例えば、約１０ｍｇ／ｍ2／日、約２０ｍｇ／ｍ2／日、約３０ｍｇ／ｍ2／日、約４０ｍｇ／ｍ2／日、約４０ｍｇ／ｍ2／日、約５０ｍｇ／ｍ2／日、約６０ｍｇ／ｍ2／日、約７０ｍｇ／ｍ2／日、約８０ｍｇ／ｍ2／日、約９０ｍｇ／ｍ2／日、約１００ｍｇ／ｍ2／日、約５００ｍｇ／ｍ2／日または約９００ｍｇ／ｍ2／日）を患者に投与することを含むＴ細胞療法を必要とする患者を条件づける方法である。好ましい用量レジメンは、患者に治療有効量の操作されたＴ細胞を患者に投与する前に、約３００ｍｇ／ｍ2／日のシクロホスファミドと約３０ｍｇ／ｍ2／日のフルダラビンを３日間投与することを含む、患者の治療を含む。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、ＣＤ５２抗体の投与をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ５２抗体は、約１３ｍｇ／日の静脈投与用量で投与される。
他の実施形態では、抗原結合ドメイン、形質導入（または他の方法で操作された）細胞、および化学療法剤は、それぞれ、対象の疾患または病態を治療するために有効な量で投与される。
特定のいくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の順序で投与され得る任意の数の化学療法剤と併せて投与することができる。化学療法剤の例としては、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；アルキルスルホン酸塩、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メテウレドパ、およびウレドパ；エチルエニミンおよびメチルアメラミンであって、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスファミド、トリエチレンチオホスファミドおよびトリメチロールオメラミンの再開を含み；窒素マスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロルエタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン等のニトロソウレア；抗生物質、例えば、アラシノミシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、サクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、チュベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝産物、例えばメトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセート；例えばフルダラビンなどのプリン類似体、６－メルカプトプリン、チアミプリン，チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５－ＦＵ；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタンオール、メピチオスタン、テストステロン；抗副腎、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えば、フロリン酸、アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸、アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート、デフファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム、エトグルシド；硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン、ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸、２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）、ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸、トリアジコン；２，２’，２’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミタルアクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）、シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；プラチナ類似体、例えば、メルカプトプリン、メトトレキサート シスプラチンおよびカルボプラチンな；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ－１６）、イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦ Ｓ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ＤＭＦＯ）；タルグレチン（商標）（ベキサロテン）などのレチノイン酸誘導体、パンレチン（商標）、（アリトレチノイン）；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトックス）；エスペラマイシン、カペシタビン；ならびに前述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）などの抗エストロゲン；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害する抗ホルモン剤；ならびに前述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体も含まれる。化学療法剤の組み合わせはまた、適切な場合に投与され、ＣＨＯＰ、すなわちシクロホスファミド（シトキサン（登録商標））、ドキソルビシン（ヒドロキシドキソルビシン）、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、およびプレドニゾンを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、操作された細胞、ポリペプチド、または核酸の投与後、同時に、または１週間以内に投与される。他の実施形態では、化学療法剤は、操作された細胞、ポリペプチド、または核酸の投与後、１～４週間、または１週間～１か月、１週間～２か月、１週間～３か月、１週間～６か月、１週間～９か月、または１週間～１２か月で投与される。他の実施形態では、化学療法剤は、細胞、ポリペプチド、または核酸を投与する少なくとも１か月前に投与される。いくつかの実施形態では、方法は、二つ以上の化学療法剤を投与することをさらに含む。
様々な追加の治療薬を、本明細書に記載される組成物と併せて使用することができる。例えば、潜在的に有用な追加の治療薬としては、ニボルマブ（オプジーボ（登録商標））、ペムブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびアテゾリズマブなどのＰＤ－１阻害剤が挙げられる。
本開示と組み合わせた使用に適した追加の治療薬には、限定されるものではないが、イブルチニブ（イムブルビカ（登録商標））、オファツムマブ（アーゼラ（登録商標）、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、トラスツズマブエムタンシン（カドサイラ（登録商標）、イマチニブ（グリベック（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（登録商標）、パニツムマブ）（ベクティビックス（登録商標））、カツマキソマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、トシツモマブ，ブレンツキシマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アキシチニブ、マシチニブ、パゾパニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、トセラニブ，レスタウルチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、セマキサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ，バンデタニブ、エントレクチニブ、カボザンチニブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、ラドチニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、ルキソリチニブ、パクリチニブ、コビメチニブ、セルメチニブ、トラメチニブ、ビニメチニブ、アレクチニブ、セリチニブ、クリゾチニブ、アフリベルセプト、アジポチド、デニロイキンジフチトックス、エベロリムスおよびテムシロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ソニデギブおよびビスモデギブなどのヘッジホッグ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤（パルボシクリブ）などのＣＤＫ阻害剤が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ含有免疫細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または神経毒性を予防するための治療レジメンで投与することができる。サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または神経毒性を予防するための治療レジメンには、レンジルマブ、トシリズマブ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、アナキンラ、ｉＮＯＳ阻害剤（例えば、Ｌ－ＮＩＬまたは１４００Ｗ）が含まれ得る。追加の実施形態では、ＣＡＲ含有免疫細胞を含む組成物は、抗炎症剤で投与することができる。抗炎症剤または薬剤には、以下に限定されないが、ステロイドおよびグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミドおよびミコフェノール酸を含む非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）が挙げられる。例示的なＮＳＡＩＤとしては、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、Ｃｏｘ－２阻害剤、およびシアル酸が挙げられる。例示的な鎮痛剤としては、アセトアミノフェン、オキシコドン、プロポルキシフェン塩酸塩のトラマドールが挙げられる。例示的なグルココルチコイドとしては、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンが挙げられる。例示的な生物学的応答調節剤としては、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５など）、サイトカイン阻害剤、例えばＴＮＦ拮抗薬（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アドミン（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、およびインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）））、ケモカイン阻害剤、および接着分子阻害剤が挙げられる。生物学的応答調節剤は、モノクローナル抗体ならびに分子の組み換え型を含む。例示的なＤＭＡＲＤには、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金（経口（オーラノフィン）および筋肉内）およびミノサイクリンが挙げられる。
特定のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、サイトカインと併せて投与される。サイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンが挙げられる。サイトカインには、ヒト成長ホルモンなどの成長ホルモンが含まれ、Ｎ－メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラクシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）などの糖タンパク質ホルモン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝増殖因子（ＨＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；ミューラー阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ－ベータなどの神経成長因子（ＮＧＦ）；血小板成長因子；ＴＧＦ－アルファおよびＴＧＦ－ベータなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子－Ｉおよび－ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン－アルファ、ベータ、および－ガンマ；マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）；および顆粒球－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ－１、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１；ＴＮＦ－アルファまたはＴＮＦ－ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子を含む。本明細書で使用される場合、サイトカインという用語は、天然源または組換え細胞培養由来のタンパク質、ならびに天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
７．ソートおよび枯渇の方法
いくつかの実施形態では、免疫細胞集団のインビトロでのソーティング方法が提供され、免疫細胞集団のサブセットは、モノクローナル抗体に特異的なエピトープ（例えば、例示的なミモトープ配列）を含む抗原特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞を含む。方法は、免疫細胞集団をエピトープに特異的なモノクローナル抗体と接触させることと、モノクローナル抗体に結合する免疫細胞を選択して、抗原特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞に富む細胞集団を得ることとを含む。
いくつかの実施形態では、前述のエピトープに特異的な前述のモノクローナル抗体は、フルオロフォアに任意でコンジュゲートされる。この実施形態では、モノクローナル抗体に結合する細胞を選択する工程は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって行うことができる。
いくつかの実施形態では、前述のエピトープに特異的な前述のモノクローナル抗体は、磁性粒子に任意でコンジュゲートされる。この実施形態では、モノクローナル抗体に結合する細胞を選択する工程は、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）によって行うことができる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫細胞をソーティングする方法で使用されるｍＡｂは、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ，アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アドミタミン、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ＱＢＥＮＤ－１０および／またはウステキヌマブから選択される。いくつかの実施形態では、前述のｍＡｂはリツキシマブである。別の実施形態では、前述のｍＡｂはＱＢＥＮＤ－１０である。別の実施形態では、ｍＡｂはＴＣＲまたはＴＣＲに結合する。
いくつかの実施形態では、上述のＣＡＲ発現免疫細胞をインビトロでソーティングする方法を使用する場合に取得される、ＣＡＲ発現免疫細胞集団は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のＣＡＲ発現免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現免疫細胞のインビトロソーティング方法を使用する場合に取得されたＣＡＲ発現免疫細胞の集団は、少なくとも８５％のＣＡＲ発現免疫細胞を含む。
いくつかの実施形態では、上述のＣＡＲ発現免疫細胞のインビトロ選別方法を使用した場合に得られたＣＡＲ発現免疫細胞の集団は、初期（非ソーティング）細胞集団と比較して、インビトロでの細胞傷害活性の増加を示す。いくつかの実施形態では、前述の細胞傷害活性は、インビトロで１０％、２０％、３０％、または５０％増加する。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。
いくつかの実施形態では、ｍＡｂは、支持体または表面上に以前に結合されている。固体支持体の非限定的な例としては、ビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、プラスチック接合プレート、ガラス接合プレート、セラミック接合プレート、カラム、または細胞培養バッグを挙げることができる。
レシピエントに投与されるＣＡＲ発現免疫細胞は、供給源集団からインビトロで濃縮され得る。供給源集団の拡大の方法には、密度遠心分離、免疫磁気ビーズ精製、親和性クロマトグラフィー、および蛍光活性化細胞ソーティングの組み合わせを使用して、ＣＤ３４抗原などの抗原を発現する細胞を選択することが含まれ得る。
フローサイトメトリーを使用して、細胞集団内の特定の細胞型を定量化することができる。概して、フローサイトメトリーは、主に光学的手段によって細胞の構成要素または構造特徴を定量化するための方法である。構造特徴を定量化することによって異なる細胞タイプを区別することができるため、フローサイトメトリーおよび細胞ソーティングを使用して、混合物中の異なる表現型の細胞をカウントおよびソートすることができる。
フローサイトメトリー解析には、二つの主要なステップ、１）一つ以上の標識マーカーで選択された細胞タイプを標識すること、およびＴ）集団内の細胞の総数に対して標識細胞の数を決定すること、を伴う。いくつかの実施形態では、細胞型を標識する方法は、特定の細胞型によって発現されるマーカーに標識された抗体を結合することを含む。抗体は、蛍光化合物で直接標識されるか、または例えば、第一の抗体を認識する蛍光標識された第二の抗体で間接的に標識され得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現するＴ細胞をソーティングするために使用される方法は、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）である。磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）は、超常磁性ナノ粒子およびカラムを使用して、その表面抗原（ＣＤ分子）に応じて様々な細胞集団を分離するための方法である。ＭＡＣＳを使用して、純細胞集団を取得することができる。単一細胞懸濁液中の細胞は、マイクロビーズで磁気標識され得る。試料は、強磁性球体からなるカラムに適用され、細胞にやさしいコーティングで覆われ、細胞の迅速かつ穏やかな分離を可能にする。標識されていない細胞は通過し、一方で磁気標識された細胞はカラム内に保持される。フロースルーは、非標識細胞画分として収集され得る。洗浄工程の後、カラムは分離器から除去され、磁気標識された細胞はカラムから溶出される。
Ｔ細胞などの特定の細胞集団の精製のための詳細なプロトコルは、Ｂａｓｕ Ｓら（２０１０）に見ることができる。（Ｂａｓｕ Ｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＨＭ、Ｄｉｔｔｅｌ ＢＮ、Ｒａｙ Ａ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（４１）：１５４６）を参照されたい。
いくつかの態様では、本開示は、インビボ枯渇によって抗原特異的ＣＡＲ発現免疫細胞を枯渇させる方法を提供する。インビボ枯渇は、阻害または除去によってＣＡＲ発現免疫細胞の増殖を止めることを目指して、哺乳類生物体に治療薬（例えば、ＣＡＲ上のエピトープに結合する分子）を投与することを含み得る。
本開示の一態様は、ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲを発現する操作された免疫細胞をインビボで枯渇させる方法に関し、前述の操作された免疫細胞または前述のＣＡＲ発現免疫細胞を少なくとも一つのエピトープ特異的ｍＡｂと接触させることを含む。本開示の別の態様は、前述の操作された免疫細胞をエピトープ特異的抗体と接触させることによってキメラｓｃＦｖ（例えば、ｍＡｂ特異的エピトープの挿入によって形成される）を含む、ＣＡＲ発現免疫細胞をインビボで枯渇させる方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞であり、および／または抗体はモノクローナル抗体である。
一つの実施形態によると、免疫操作された細胞のインビボでの枯渇は、本開示のインビトロ方法を使用して以前にソーティングされた操作された免疫細胞上で実施される。この場合、注入されたｍＡｂを使用することができる。いくつかの実施形態では、ｍＡｂ特異的抗原は、ＣＤ２０抗原であり、エピトープ特異的ｍＡｂは、リツキシマブである。いくつかの実施形態では、開示は、患者において、ｍＡｂ特異的エピトープ（ＣＡＲ発現免疫細胞）を含むＣＡＲを発現する操作された免疫細胞をインビボで枯渇させる方法に関し、前述のＣＡＲ発現免疫細胞を少なくとも一つのエピトープ特異的ｍＡｂに接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、前述の操作された免疫細胞または前述のＣＡＲ発現免疫細胞を少なくとも一つのエピトープ特異的ｍＡｂと接触させる工程は、患者にエピトープ特異的ｍＡｂ（例えば、リツキシマブ）を注入することを含む。いくつかの実施形態では、患者に投与されるエピトープ特異的ｍＡｂの量は、患者におけるＣＡＲ発現免疫細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を除去するのに十分である。
いくつかの実施形態では、前述の操作された免疫細胞または前述のＣＡＲ発現免疫細胞を少なくとも一つのエピトープ特異的ｍＡｂと接触させる工程は、患者に３７５ｍｇ／ｍ2のリツキシマブを１回または数回、注入することを含む。いくつかの実施形態では、ｍＡｂ（例えば、リツキシマブ）は、週に１回投与される。
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ特異的エピトープ（ＣＡＲ発現免疫細胞）を含むＣＡＲを発現する免疫細胞が、エピトープ特異的ｍＡｂを使用した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイで枯渇すると、生存するＣＡＲ発現免疫細胞の量が減少する。いくつかの実施形態では、生存するＣＡＲ発現免疫細胞の量は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少する。いくつかの実施形態では、前述のｍＡｂ特異的エピトープは、ＣＤ２０エピトープまたはミモトープであり、および／またはエピトープ特異的ｍＡｂは、リツキシマブである。
特定のいくつかの実施形態では、ＣＡＲ操作された免疫細胞のインビボでの枯渇は、二重特異性抗体を注入することによって実施される。定義により、二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＡｂ）は、二つの異なるモノクローナル抗体の断片から構成され、結果として二つの異なるタイプの抗原に結合する、人工タンパク質である。これらのＢｓＡｂおよびその免疫療法における使用は、Ｍｕｌｌｅｒ Ｄ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．Ｅ．（２０１０）Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２４（２）：８９－９８に概要が説明されている。
別の特定の実施形態によると、注入された二重特異性ｍＡｂは、キメラｓｃＦｖを発現する操作された免疫細胞に担持されたｍＡｂ特異的エピトープと、エフェクターおよび細胞傷害細胞（例えば、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫細胞）の表面抗原との両方を結合することができる。そうすることで、ＢｓＡｂによって誘発される操作された免疫細胞の枯渇は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して起こり得る。（Ｄｅｏ Ｙ Ｍ、Ｓｕｎｄａｒａｐａｎｄｉｙａｎ Ｋ、Ｋｅｌｅｒ Ｔ、Ｗａｌｌａｃｅ ＰＫ、ａｎｄ Ｇｒａｚｉａｎｏ ＲＦ、（２０００）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６５（１０）：５９５４－５９６１］）。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性薬剤は、ＣＡＲ発現免疫細胞を枯渇させるために使用され得るエピトープ特異的ｍＡｂに結合される。モノクローナル抗体の標的化能力と細胞傷害性薬物の癌死滅能力を組み合わせることによって、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、薬物単独の使用と比較して、健康な組織と罹患組織との間の感受性の区別を可能にする。いくつかのＡＤＣについて市場承認が下り、特にリンカー上でそれらを作製するための技術は、（Ｐａｙｎｅ、Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７－２１２；Ｔｒａｉｌら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８－３３７；Ｓｙｒｉｇｏｓ ａｎｄ Ｅｐｅｎｅｔｏ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１９：６０５－６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ－Ｄｕｖａｚ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１－１７２、米国特許第４，９７５，２７８号）に記載されている。
いくつかの実施形態では、注入されるエピトープ特異的ｍＡｂは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を促進することができる分子と事前にコンジュゲートされる。したがって、補体系は、病原体を生物から除去する抗体の能力を助けるか、または補完する。刺激されると、細胞殺傷膜攻撃複合体の応答および活性化の大規模な増幅として、活性化カスケードが駆動する。異なる分子を使用して、グリカン等のｍＡｂを結合することができる［Ｃｏｕｒｔｏｉｓ，Ａ，Ｇａｃ－Ｂｒｅｔｏｎ，Ｓ．，Ｂｅｒｔｈｏｕ，Ｃ，Ｇｕｅｚｅｎｎｅｃ，Ｊ．，Ｂｏｒｄｒｏｎ，Ａ．ａｎｄ Ｂｏｉｓｓｅｔ，Ｃ．（２０１２）、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃａｎ ｂｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｇｌｙｃａｎ ｃｏｕｐｌｉｎｇ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩＳＳＮ：０７１７－３４５８；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｊｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｉｎｆｏ ＤＯＩ：１０．２２２５／ｖｏｌｌ５－ｉｓｓｕｅ５）。
８．キットおよび製造物品
本開示は、本明細書に記載される培養免疫細胞または操作された免疫細胞のいずれか、ならびにそれらの医薬組成物を含むキットを提供する。いくつかの例示的な実施形態では、本開示のキットは、対象に投与するための同種のＣＡＲ含有Ｔ細胞を含む。
本出願はまた、本明細書に記載される治療用組成物またはキットのうちのいずれか一つを含む製造物品を提供する。製造物品の例としては、バイアル（例えば、密封バイアル）が挙げられる。
さらに、本開示は、所望の濃度のカリウムの溶液を含む一つ以上の容器、および任意にＩＬ－７またはＩＬ－１５などの一つ以上のサイトカインを含む溶液を含む一つ以上の容器を含むキットを提供する。
以下の実施例に示されるように、Ｔ細胞増殖培地におけるサイトカインおよび代謝調節因子の状態および濃度の組み合わせは、遺伝子改変同種細胞療法産物の効力の増加をもたらし得る。例えば、望ましい同種ＣＡＲ Ｔ細胞表現型は、細胞増殖の刺激剤、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、および増加した細胞外カリウムの使用によって取得することができる。
１．ＣＡＲ Ｔ細胞産生のための例示的なプロトコル
本明細書に記載されるように、ＣＡＲ Ｔ細胞は、当技術分野で公知の様々な方法に従って産生され得る。例示的な標準的な方法が本明細書に記載される。
ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するために、Ｆｉｃｏｌｌ勾配密度培地（Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して、健康なボランティアのバフィーコートサンプルからＰＢＭＣを精製することができる。Ｔ細胞は、市販のＴ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９６－５３５）を使用してＰＢＭＣから精製することができる。あるいは、初代ヒトＴ細胞は、Ｌｅｕｋｏ Ｐａｋｓ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）から直接精製することができる。
ＣＡＲをコードするレンチウイルスを作製するために、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレートのウェル当たり１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社またはＪＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で補充された２ｍＬのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）中、０日目に、４０万個の細胞／ｍＬで播種することができる。１日目に、レンチウイルスパッケージングベクターの１．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２、０．５ｕｇのｐＭＤ２Ｇ、および０．５ｕｇの適切な移入ＣＡＲベクターを、６ウェルプレートのウェル当たり２５０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）中に混合することによってレンチウイルスを調製することができる（「ＤＮＡミックス」）。２５０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中の１０ｕＬのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を室温で５分間インキュベートし、次いでＤＮＡミックスに添加することができる。混合物を室温で２０分間インキュベートすることができ、５００ｕＬの総容量をＨＥＫ－２９３Ｔを含有するウェルの側面にゆっくりと添加した。
精製されたＴ細胞は、適切な培地中で活性化することができる。２日目に、６ウェルプレートの各ウェルからの培地を、Ｔ細胞形質導入培地のウェル当たり２ｍＬ、すなわち１０％のＦＢＳで補充されたＸ－Ｖｉｖｏ－１５で置換することができる。３日目に、Ｔ細胞を、Ｇｒｅｘ－２４プレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ社、カタログ番号８０１９２Ｍ）のウェルあたり、１ｍＬのＴ細胞形質導入培地中、１ｍＬ当たり５０万個の細胞で再懸濁することができる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のレンチウイルス上清を採取し、０．４５ミクロンのフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に通して細胞片を除去し、次いで１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２と共にＴ細胞に添加することができる。
５日目に、４．５ｍＬのＴ細胞増殖培地（例えば、ＩＬ－７＋ＩＬ－１５を含み、追加の細胞外カリウムを有するかまたは有さない）を、Ｇｒｅｘ－２４プレートの各ウェルに添加することができる。９日目および１３日目に、フローサイトメトリーを使用して所望の抗原（例えば、組換え抗原）を認識するＴ細胞の割合を検出することによって、形質導入効率を決定することができる。細胞を、本明細書に記載されるＴ細胞増殖培地を使用して、必要に応じてより大きなフラスコまたはＧ－Ｒｅｘ容器（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ社）に増殖させた。
１４日目に、抗原特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞は、例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０、またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）などの培地中で細胞を凍結することによって、凍結保存することができる。組み換え抗原で染色された細胞の割合は、凍結保存直前にクローン間で正規化することができる。
２．ＩＬ－７＋１５の補充
以下の実施例のデータは、例えば、第一の刺激剤および第二の刺激剤、例えば、ＩＬ－７（５，０００ ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（５０ ＩＵ／ｍｌ）、任意に増加した細胞外カリウム（２５ｍＭ）の使用が、古典的なＩＬ－２ベースの工程と比較して、同種ＣＡＲ Ｔ細胞の非常に望ましい表現型を達成できることを示す。
我々はまず、カリウムを４ｍＭのベースラインレベルに維持した細胞培養培地においてＩＬ－７およびＩＬ－１５の補充を試験した。図 １Ａに示されるように、ＩＬ－２ベースの製造工程にベンチマークする場合（「ＩＬ－２ → ＩＬ－２」－ ５日目に１００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２全体に新鮮なＩＬ－２を加えた）、ＩＬ－７＋ＩＬ－１５ベースの工程（「ＩＬ－２ → ＩＬ－７＋１５」－ ２日目までに１００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、５日目に５０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７および５０ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を加え、または５日目に「ＩＬ－７＋１５ → ＩＬ－７＋１５」－ ５０００ ＩＵ／ｍＬ のＩＬ－７および５０ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５全体に新鮮なＩＬ－７およびＩＬ－１５を加えた）は、最終産物のＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞のＴSCM(ＣＤ６２Ｌ+ＣＤ４５ＲＯ-）の量を増加させた。図１Ｂに示されるように、ＩＬ－７＋１５培養条件はまた、標的細胞の曝露時にＣＤ１９－特異的ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン放出能力を増加させた。
３．カリウム補充および滴定試験
同種ＣＡＲ Ｔ細胞の能力をさらに改善するために、Ｔ細胞代謝を調節することが知られている細胞外栄養素を用いた以前の実験と同じ濃度で、ＩＬ－７＋１５補充の利点を組み合わせることを調査した。細胞外カリウムは、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）がインビボでエフェクターＴ細胞を抑制する抑制機序であることが示されている。一方で、養子細胞療法（ＡＣＴ）のインビトロ増殖中に細胞外カリウムが増加すると、より若い低分化表現型を有するＴ細胞の保存につながる。
図 ２Ａに示されるように、増加した細胞外カリウム（４０ｍＭ、塗りつぶされていないバー）は、正常（４ｍＭ）なカリウム濃度（塗りつぶされたバー）と比較して、ＩＬ－２とＩＬ－７＋１５の工程の両方で、同種ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のＴSCM細胞の量を増加させた。しかし、図 ２Ｂでは、予想外にも、正常なカリウム濃度（４ｍＭ、塗りつぶされたバー）と比較した場合、細胞外カリウムの増加（４０ｍＭ、塗りつぶされていないバー）の条件がＩＬ－２およびＩＬ－７＋１５ベースの工程の両方において、同種ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖能力に負の影響を与えることが分かった。
同種ＣＡＲ Ｔ細胞製造中の高い細胞外カリウムの利点をさらに強化するために、ＩＬ－７＋１５ベースの同種ＣＡＲ Ｔ細胞工程に特に有効な細胞外カリウムの量を調整した。２５ｍＭおよび１０ｍＭの細胞外カリウム濃度は、同種ＣＡＲ Ｔ細胞製造中のヒトＴ細胞の増殖に負の影響を与えなかった（図３）。さらに、２５ｍＭの細胞外カリウム（図４）において、ＴSCM細胞の最大の保存が達成された。
４．ＩＬ－７＋１５およびカリウムとの組み合わせ補充を使用した能力試験
連続殺傷アッセイは、ＣＡＲ－Ｔ細胞を標的に繰り返し曝露させることにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞を増殖させ、特定の場合、分化および消耗を生じさせる。このアッセイを使用して、異なる条件下で増殖した同種ＣＡＲ Ｔ細胞の能力を試験した。
同種ＣＡＲ Ｔ細胞製造のための細胞外カリウムの有効濃度を特定し、ＩＬ－７＋１５と２５ｍＭのカリウム濃度の組み合わせが、同種ＣＡＲ Ｔ細胞の能力を改善するかどうかの評価を進めた。ＩＬ－７＋１５ベースの工程と２５ｍＭの細胞外カリウム補充との組み合わせは、ＩＬ－２において、正常（４ｍＭ）のカリウム濃度で製造された類似製品と比較して、ＣＡＲ Ｔ細胞の最大の能力をもたらす（図 ５）。さらに、２５ｍＭの細胞外カリウムを有するＩＬ－７＋１５ベースの工程の組み合わせは、２５ｍＭのカリウムを有するＩＬ－２ベースの工程と比較して、能力を有意に改善し、さらに、ベースラインレベルのカリウム４ｍＭを有するＩＬ－７＋１５ベースの工程をさらに改善した。
結論として、同種ＣＡＲ Ｔ細胞の能力を最大化することができるサイトカイン（ＩＬ－７＋ＩＬ－１５）と代謝調節因子（細胞外カリウム）の非常に効果的な組み合わせを特定した。
本開示の教示は、様々な用途、方法、キット、および組成物を参照して記載されてきたが、本明細書の教示および以下の特許請求の範囲発明から逸脱することなく、様々な変更および修正を行うことができることが理解されよう。前述の実施例は、開示された教示をより良く例示するために提供され、本明細書に提示される教示の範囲を限定することを意図するものではない。本教示は、これらの例示的な実施形態の観点で説明されてきたが、当業者であれば、これらの例示的な実施形態の数多くの変形および修正が、過度の実験なしに可能であることを容易に理解するであろう。こうした変形および修正はすべて、本発明の教示の範囲内である。
Figure 2022529741000003
Figure 2022529741000004

Claims (31)

  1. Ｔ細胞増殖のための細胞増殖培地であって、
    ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１５からなる群から各々独立して選択される、細胞増殖の第一の刺激剤および第二の刺激剤、ならびに
    約４ｍＭ～約４０ｍＭの濃度の細胞外カリウムである細胞代謝の細胞外調節因子と、を含み、
    前記第一の刺激剤および前記第二の刺激剤が、約１０００：１～約４：１の濃度比で存在する、細胞増殖培地。
  2. 前記細胞増殖の第一の刺激剤が、ＩＬ－７である、請求項１に記載の細胞増殖培地。
  3. 前記細胞増殖の第二の刺激剤が、ＩＬ－１５である、請求項１または２に記載の細胞増殖培地。
  4. 前記第一の刺激剤および前記第二の刺激剤が、約５００：１～約１０：１、約２５０：１～約１０：１、約２００：１～約１０：１、約１５０：１～約１０：１、約１００：１～約１０：１、約５００：１～約５０：１、約２５０：１～約５０：１、約２００：１～約５０：１、約１５０：１～約５０：１、約１００：１～約５０：１、約５００：１～約７５：１、約２５０：１～約７５：１、約２００：１～約７５：１、約１５０：１～約７５：１、約１００：１～約７５：１、約１０：１～４：１、約８：１～４：１、または約７：１～約６：１の濃度比で存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞増殖培地。
  5. 前記第一の刺激剤および前記第二の刺激剤が、約１５０：１、約１４０：１、約１３０：１、約１２０：１、約１１０：１、約１００：１、約９０：１、約８０：１、または約７０：１の濃度比で存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞増殖培地。
  6. 第一の刺激剤は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在するＩＬ－７であり、
    第二の刺激剤は、約１ＩＵ／ｍＬ～約１００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在するＩＬ－１５である、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞増殖培地。
  7. ＩＬ－７は、約３００ＩＵ／ｍＬ～約５０００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ－１５は、約２５ＩＵ／ｍＬ～約５０ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する、請求項６に記載の細胞増殖培地。
  8. ＩＬ－７は、約５０００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ－１５は、約５０ＩＵ／ｍＬの濃度で存在する、請求項７に記載の細胞増殖培地。
  9. 細胞外カリウムが、約２０ｍＭ～約３５ｍＭまたは約２０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度で存在する、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞増殖培地。
  10. 細胞外カリウムが、約２０ｍＭまたは約２５ｍＭの濃度で存在する、請求項９に記載の細胞増殖培地。
  11. 細胞外カリウムがＫＣｌとして存在する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞増殖培地。
  12. インビトロでＴ細胞の集団を取得する方法であって、
    ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１５からなる群から各々独立して選択される、細胞増殖の第一の刺激剤および第二の刺激剤、ならびに
    約４ｍＭ～約４０ｍＭの濃度の細胞外カリウムである細胞代謝の細胞外調節因子と、を含む細胞増殖培地で、Ｔ細胞の初期集団を培養することを含み、
    前記第一の刺激剤および前記第二の刺激剤が、約１０００：１～約４：１の濃度比で存在する、方法。
  13. 前記細胞増殖培地が、請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞増殖培地である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記取得されたＴ細胞集団が、ＴCM細胞および／またはＴSCM細胞に富化される、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 前記取得されたＴ細胞集団が、少なくとも約３０％、３５％、４０％、または４５％のＴSCM細胞を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記取得されたＴ細胞集団が、少なくとも約４０％のＴSCM細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記取得されたＴ細胞集団は、約７～１６日の期間にわたって測定された場合、前記Ｔ細胞の初期集団のＴCMおよび／またはＴSCMより、ＴCMおよび／またはＴSCMが約１００倍～約１０００倍富化される、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記取得されたＴ細胞集団は、約１０～１４日の期間にわたって測定された場合、前記Ｔ細胞の初期集団のＴCMおよび／またはＴSCMより、ＴCMおよび／またはＴSCMが約１００～約１０００倍富化される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記取得されたＴ細胞集団は、前記Ｔ細胞の初期集団のＴCMおよび／またはＴSCMより、ＴCMおよび／またはＴSCMが少なくとも約１００倍または約２００倍富化される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記Ｔ細胞の初期集団が、操作されたＴ細胞集団である、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記Ｔ細胞の初期集団が、一つ以上のキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞集団である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記Ｔ細胞が、同種Ｔ細胞である、請求項１２～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記Ｔ細胞が、自己Ｔ細胞である、請求項１２～２１のいずれか一項に記載の方法。
  24. 操作された免疫細胞の集団であって、前記集団は一つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ Ｔ細胞）を発現するＴ細胞を含み、前記ＣＡＲ Ｔ細胞は、請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞増殖培地を使用して取得される、操作された免疫細胞の集団。
  25. 操作された免疫細胞の集団であって、前記集団は一つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ Ｔ細胞）を発現するＴ細胞を含み、前記（ＣＡＲ Ｔ細胞）は、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の方法を使用して取得される、操作された免疫細胞の集団。
  26. 前記ＣＡＲ Ｔ細胞が、少なくとも約３０％、３５％、４０％、または４５％のＴSCM細胞を含む、請求項２４または２５に記載の操作された免疫細胞集団。
  27. 前記ＣＡＲ Ｔ細胞が、少なくとも約４０％のＴSCM細胞を含む、請求項２６に記載の操作された免疫細胞集団。
  28. 請求項２４～２７のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞集団を含む、医薬組成物。
  29. それを必要とする対象における疾患または障害を治療する方法であって、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞、または請求項２８に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  30. 前記疾患または障害が癌である、請求項２９に記載の方法。
  31. 請求項２４～２７のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞、または請求項２８に記載の医薬組成物を含む、製造物品。
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