ES2964746T3

ES2964746T3 - Métodos de producción de linfocitos T y linfocitos T producidos mediante el mismo

Info

Publication number: ES2964746T3
Application number: ES16882676T
Authority: ES
Inventors: Bitao Liang; Xiaohua Lu; Wei Liu; Kathy Karasciewicz-Mendez; Christopher Wiwi; Kruti Shah
Original assignee: Celgene Corp
Current assignee: Celgene Corp
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2036-12-29
Also published as: US11834675B2; EP3397263A1; TW201734204A; US20210163890A1; JP7019578B2; AR107278A1; WO2017117418A1; EP3397263A4; JP2019500045A; CN109310709A; EP3397263B1

Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para generar células T, por ejemplo, linfocitos T citotóxicos a partir de células mononucleares de sangre periférica sin una etapa separada de generación y aislamiento de células presentadoras de antígeno, y con una única ronda de estimulación antigénica. También se proporcionan en el presente documento métodos para usar dichos linfocitos T citotóxicos, por ejemplo, para tratar el cáncer y/o la infección viral. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de producción de linfocitos T y linfocitos T producidos mediante el mismo

1. CAMPO

La divulgación de la presente está relacionada con el campo de la inmunología y, más específicamente, con la generación de linfocitos T específicos de antígeno y los métodos de uso de los mismos.

2. ANTECEDENTES

La generación de células T específicas de antígeno, por ejemplo, linfocitos T citotóxicos (CTL),ex vivoimplica la activación de células T específicas de antígeno seguida, por ejemplo, de la proliferación de células T. La activación completa de tales células T implica la ligación del receptor de células T (TCR) con complejos MHC-péptido relacionados presentados por células presentadoras de antígenos (APC), incluyendo células dendríticas (DC), macrófagos y células B, y ligaciones de moléculas coestimuladoras entre células T y APC. A veces, se usan complejos CMH-péptido libres de células en lugar de complejos MHC-péptido presentados por APC. Si la activación de la coestimulación es deficiente, las células T se activarán parcialmente, experimentarán apoptosis o entrarán en estado de anergia.

Tanto las células B como los monocitos expresan típicamente moléculas HLA necesarias para la formación de complejos MHC-péptido, pero carecen de una expresión elevada de moléculas coestimuladoras, como CD80 y CD86. Sin una activación o maduración adicionales para obtener APC plenamente activadas, puede producirse un cebado y amplificación de células T específicas de antígeno fallido o subóptimo. Por tanto, habitualmente es necesario un paso separado de inducción y aislamiento de APC antes del cebadoex vivode células T específicas de antígeno, mediante la producción de células dendríticas maduras (mDC) a partir de los monocitos precursores o de células B activadas. Ramos et al., J Immunother, Enero 2013, 36(1), pp. 66 a 76, estimularon células T de sangre periférica con células dendríticas derivadas de monocitos cargadas con pepmixes que abarcaban E6/E7, en presencia o ausencia de citoquinas evaluadoras específicas. Las líneas de células T resultantes se expandieron adicionalmente con blastos de células B activadas cargados con pepmix.

3. SUMARIO

En la presente se proporcionan métodos para generar células T específicas de antígeno, por ejemplo, linfocitos T citotóxicos (células T), a partir de células mononucleares de sangre periférica sin un paso separado de generación y aislamiento de células presentadoras de antígeno, como células dendríticas, macrófagos y células B, y con una sola ronda de estimulación de antígeno, como se define en las reivindicaciones.

En la presente se proporciona un método para producir una población celular que comprende células T específicas de antígeno, opcionalmente linfocitos T citotóxicos (CTL), que comprende los pasos de: (a) cultivar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de un sujeto en un medio de inducción de células presentadoras de antígeno (APC) que comprende interleucina 4 (IL-4) y ligando de CD40 soluble (sCD40L) y/o que comprende factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) e interferón a (IFN-a), para producir una primera población de células; (b) cultivar la primera población de células en presencia de uno o más antígenos, para producir una segunda población de células; y (c) cultivar la segunda población de células en un medio de expansión de células T que comprende interleucina 7 (IL-7), interleucina 15 (IL-15) e IL-4, para producir una tercera población de células; en donde la tercera población de células comprende células T que son CD3+ y específicas para el uno o más antígenos añadidos en el paso (b).

En una realización, en la que la tercera población de células comprende células T que son adicionalmente CD4+; y/o adicionalmente CD8+. En una realización, el método comprende además un paso de cultivar la tercera población de células en un segundo medio de expansión de células T que comprende IL-7 e IL-15, pero que no comprende IL-4, para crear una cuarta población de células; en donde la cuarta población de células comprende células T que son CD3+ y específicas para uno o más antígenos añadidos en el paso (b). En una realización, el uno o más antígenos son un conjunto de péptidos; preferiblemente en donde: (i) el conjunto de péptidos cubre la secuencia completa de las proteínas<H p V 1 6 e 6 ,>HPV16E7, HPV18E6, y HPV18E7 humanas, y/o (ii) los péptidos están a una concentración de 1 pg/ml. En una realización, el medio de inducción de APC comprende IL-4 y sCD40L; preferiblemente en donde el medio de inducción de APC comprende 8-12 ng/ml de IL-4 y 0,8-1,2 pg/ml de sCD40L; o preferiblemente en donde el medio de inducción de APC comprende 10 ng/ml de IL-4 y 1 pg/ml de sCD40L. En una realización, el medio de inducción de APC comprende además oligonucleótidos sintéticos con motivos de dinucleótidos CpG no metilados; y/o en donde el medio de inducción de APC comprende además GM-CSF e IFN-a. En una realización, el medio de expansión de células T comprende 40-60 ng/ml de IL-7, 7-11 ng/ml de IL-15, y 45-65 ng/ml de IL-4; preferiblemente, en donde el medio de expansión de células T comprende 50 ng/ml de IL-7, 9 ng/ml de IL-15, y 55 ng/ml de IL-4. En una realización, el segundo medio de expansión de células T comprende 40-60 ng/ml de IL-7 y 7-11 ng/ml de IL-15; preferiblemente, en donde el segundo medio de expansión de células T comprende 50 ng/ml de IL-7 y 9 ng/ml de IL-15. En una realización, la duración del paso (a) es de 1-3 días, preferiblemente 1 día. En una realización, las PBMC: (i) se aíslan de sangre completa, capa leucocitaria o un producto de leucaféresis enriquecido; y/o (ii) se siembran en el medio de inducción de APC a una densidad de 4-6 x 106/cm2, preferiblemente a una densidad de 5 x 106/cm2. En una realización, el método comprende además un paso de aislamiento de células T que son CD3+ de la tercera población de células o de la cuarta población de células. En una realización, las células CD3+ específicas de antígeno se identifican mediante tinción intracelular de citoquinas (ICCS). En una realización, el paso (b) se lleva a cabo en el medio de inducción de APC. En una realización, los pasos de cultivo se llevan a cabo en un dispositivo G-REX®. En una realización, la duración del paso (c) es de 8-16 días, preferiblemente 12 días.

En la presente se divulgan métodos para producir una población celular que comprende células T específicas de antígeno, por ejemplo, CTL, que comprenden los pasos de: (a) aislar células mononucleares sanguíneas, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o células mononucleares de sangre de cordón umbilical, de un sujeto; (b) cultivar dichas células mononucleares sanguíneas, por ejemplo, PBMC o células mononucleares de sangre de cordón umbilical, en un medio de inducción de células presentadoras de antígeno (APC) que comprende interleucina 4 (IL-4) y ligando CD40 soluble (sCD40L) y/o que comprende factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) e interferón, por ejemplo, interferón a (IFN-a), para producir una primera población de células; (c) cultivar la primera población de células en presencia de uno o más antígenos, para producir una segunda población de células; y (d) cultivar la segunda población de células en un medio de expansión de células T que comprende interleucina 7 (IL-7), interleucina 15 (lL-15), y, opcionalmente, IL-4, para producir una tercera población de células; en donde la tercera población de células comprende células T que son CD3+ y específicas para un antígeno añadido en el paso (c). En ciertos ejemplos, el método divulgado en la presente comprende además un paso de cultivar la tercera población de células en un segundo medio de expansión de células T que comprende IL-7 e IL-15, pero que no comprende IL-4, para crear una cuarta población de células; en donde la cuarta población de células comprende células T que son c D3+ y específicas para un antígeno añadido en el paso (c). En ciertos ejemplos, el método divulgado en la presente comprende además un paso de aislar células T que son CD3+ de la tercera población de células o de la cuarta población de células. En ciertos aspectos, el paso (c) se realiza en medio de inducción de APC. En ciertos ejemplos, el medio de expansión de células T comprende IL-4. En ciertos aspectos, el sujeto es un humano. En ciertos aspectos, el antígeno es un antígeno humano. En ciertos aspectos, el antígeno es una proteína de longitud completa. En ciertos aspectos, el antígeno es un fragmento de una proteína. En ciertos aspectos, el antígeno es un péptido que representa una parte de la proteína. En ciertos aspectos, las APC producen el antígeno a partir de material genético exógeno.

En ciertos aspectos, la tercera población de células comprende células T que son además CD4+. En ciertos aspectos, la tercera población de células comprende células T que son además CD8+. En ciertos aspectos, la tercera población de células comprende células T que son además CD4+ y CD8+.

En ciertos aspectos, la cuarta población de células comprende células T que son además CD4+. En ciertos aspectos, la cuarta población de células comprende células T que son además CD8+. En ciertos aspectos, la cuarta población de células comprende células T que son además CD4+ y CD8+.

En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende IL-4 y sCD40L. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende 1-50 ng/ml de IL-4 y 0,1-5 pg/ml de sCD40L. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende 8-12 ng/ml de IL-4 y 0,8-1,2 pg/ml de sCD40L. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende 10 ng/ml de IL-4 y 1 pg/ml de sCD40L.

En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende además oligonucleótidos sintéticos con uno o más motivos dinucleótidos CpG no metilados. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende además GM-CSF e IFN-a. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC consiste esencialmente en GM-CSF e IFN-a.

En ciertos aspectos, el uno o más antígenos son, o están contenidos en, un conjunto de péptidos, por ejemplo, péptidos liofilizados. En aspectos específicos, el conjunto de péptidos liofilizados cubre las secuencias de las proteínas humanas HPV16E6, HPV16E7, HPV18E6, y/o HPV18E7. En aspectos específicos, los péptidos están a una concentración de 1 pg/ml.

En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 10-100 ng/ml de IL-7, 2-20 ng/ml de IL-15, y 10-100 ng/ml de IL-4. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 40-60 ng/ml de IL-7, 7-11 ng/ml de IL-15, y 45-65 ng/ml de IL-4. En aspectos específicos, el medio de expansión de células T comprende 50 ng/ml de IL-7, 9 ng/ml de IL-15, y 55 ng/ml de IL-4.

En ciertos aspectos, el segundo medio de expansión de células T comprende 10-100 ng/ml de IL-7 y 2-20 ng/ml de IL-15. En ciertos aspectos, el segundo medio de expansión de células T comprende 40-60 ng/ml de IL-7 y 7 11 ng/ml de IL-15. En aspectos específicos, el segundo medio de expansión de células T comprende 50 ng/ml de IL-7 y 9 ng/ml de IL-15.

En ciertos aspectos, la duración del paso (a) es de 1-3 días. En aspectos específicos la duración del paso (a) es de 1 día. En ciertos aspectos, la duración del paso (c) es de 8-16 días. En aspectos específicos, la duración del paso (c) es de 12 días.

En ciertos aspectos, las PBMC se aíslan de sangre completa, capa leucocitaria o un producto de leucaféresis enriquecido. En ciertos aspectos, las PBMC se siembran en el medio de inducción de APC a una densidad de 4-6 x 106/cm2 En aspectos específicos, las PBMC se siembran a una densidad de 5 x 106/cm2 En aspectos específicos, las PBMC se siembran a una densidad de más de 5 x 106/cm2.

En ciertos aspectos, las células CD3+ específicas de antígeno se identifican mediante tinción intracelular de citoquinas (ICCS), o son identificables mediante dicha tinción. En ciertos aspectos, los pasos de cultivo se realizan en un recinto permeable al gas, por ejemplo, un dispositivo G-REX®. En ciertos aspectos, uno o más pasos de cultivo se realizan en matraces T. En ciertos aspectos, uno o más pasos de cultivo se realizan en bolsas. En aspectos específicos, las bolsas son bolsas estáticas. En ciertos aspectos, las bolsas son permeables al gas. En ciertos aspectos, uno o más pasos de cultivo se realizan en un biorreactor WAVE™ (GE Healthcare Life Sciences). En ciertos aspectos, uno o más pasos de cultivo se realizan en matraces de centrifugado.

En la presente se divulgan y no forman parte de la invención poblaciones de células T específicas de antígeno producidas mediante un método que comprende los pasos de: (a) aislar células mononucleares sanguíneas, por ejemplo, PBMC o células mononucleares de sangre de cordón umbilical, de un sujeto; (b) cultivar dichas células mononucleares sanguíneas, por ejemplo, PBMC o células mononucleares de sangre de cordón umbilical, en un medio de inducción de células presentadoras de antígenos (APC) que comprende interleucina 4 (IL-4) y ligando de CD40 soluble (sCD40L) y/o que comprende factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) e interferón a (IFN-a), para producir una primera población de células; (c) cultivar la primera población de células en presencia de uno o más antígenos, para producir una segunda población de células; y (d) cultivar la segunda población de células en un medio de expansión de células T que comprende interleucina 7 (IL-7), interleucina 15 (IL-15), e IL-4, para producir una tercera población de células; en donde la tercera población de células comprende células T que son CD3+ y específicas para un antígeno añadido en el paso (c). En ciertos ejemplos, las poblaciones de células se producen mediante un método que comprende además un paso de cultivar la tercera población de células en un segundo medio de expansión de células T que comprende IL-7 e IL-15, pero no comprende IL-4, para crear una cuarta población de células; en donde la cuarta población de células comprende células T que son CD3+ y específicas para un antígeno añadido en el paso (c). En ciertos ejemplos, las poblaciones de células se producen mediante un método que comprende además un paso de aislar células T que son CD3+ a partir de la tercera población de células o la cuarta población de células. En ciertos ejemplos, el paso (c) se realiza en un medio de inducción de APC.

En la presente se divulgan y no forman parte de la invención composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que comprenden las células T específicas de antígeno descritas en la presente. En ciertos aspectos, el 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, o 45% o más de las células en la composición son células T específicas de antígeno. En ciertos ejemplos, el 50% de las células de la composición son células T específicas de antígeno. En ciertos ejemplos, las composiciones comprenden un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En la presente se divulgan y no forman parte de la invención métodos de tratamiento de un cáncer o una infección vírica que comprenden administrar a un paciente que lo necesite una población de células T específicas de antígeno producidas mediante los métodos descritos en la presente, en donde las células mononucleares sanguíneas aisladas, por ejemplo, PBMC o células mononucleares de sangre de cordón umbilical, son autólogas del paciente. También se divulgan en la presente métodos para tratar un cáncer o una infección vírica que comprenden la administración a un paciente que lo necesita una población de células T específicas de antígeno producidas mediante los métodos descritos en la presente, en donde las células mononucleares sanguíneas aisladas, por ejemplo, PBMC o células mononucleares de sangre de cordón umbilical, no son autólogas del paciente. En ciertos ejemplos, la infección vírica es una infección por el virus del papiloma humano (VPH). En ciertos ejemplos, la infección vírica es una infección por VPH y el antígeno es un antígeno de VPH. En ciertos otros ejemplos, la infección vírica es una infección por el virus de Epstein-Barr (VEB). En ciertos ejemplos, la infección vírica es una infección por VEB y el antígeno es un antígeno de VEB. En ejemplos específicos de los ejemplos anteriores, los antígenos se expresan en células tumorales que comprenden la infección vírica. En ciertos ejemplos, se divulgan en la presente métodos para administrar una población de células T específicas de antígeno a un paciente que lo necesita. En ciertos ejemplos, el método comprende además administrar a dicho paciente un fármaco inmunomodulador o un modificador epigenético. En ejemplos específicos, el método comprende además administrar a dicho paciente un inhibidor del punto de control inmunitario. En ejemplos más específicos, el inhibidor del punto de control inmunitario se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PD1 y un anticuerpo anti-PD-L1.

En la presente se divulgan y no forman parte de la invención métodos para tratar un cáncer que comprenden administrar a un paciente que lo necesita una población de células T específicas de antígeno producidas mediante los métodos descritos en la presente, en donde las células mononucleares de sangre aisladas, por ejemplo, PBMC o células mononucleares de sangre de cordón umbilical, son autólogas del paciente. En ciertos ejemplos, el cáncer es un cáncer VPH positivo (VPH+). En ciertos ejemplos, el cáncer VPH+ es un cáncer de cabeza y cuello. En ciertos ejemplos, el cáncer de cabeza y cuello es un carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. En ciertos ejemplos, el cáncer de cabeza y cuello es un cáncer orofaríngeo. En ciertos ejemplos, el cáncer VPH+ es un cáncer de pene. En ciertos ejemplos, el cáncer VPH+ es un cáncer de cuello uterino. En ciertos ejemplos, el cáncer VPH+ es un cáncer anal. En ciertos ejemplos, el cáncer VPH+ es un cáncer de vulva. En ciertos ejemplos, el cáncer VPH+ es un cáncer vaginal. En ciertos ejemplos, el cáncer VPH+ es un cáncer de pulmón. En ciertos ejemplos, el cáncer VPH+ es metastásico. En ciertos ejemplos, el cáncer VPH+ es recurrente. En ciertos ejemplos, el cáncer VPH+ es metastásico y recurrente. En ciertos ejemplos, el método comprende además administrar a dicho paciente un fármaco inmunomodulador o un modificador epigenético. En ciertos ejemplos, el método comprende además administrar a dicho paciente un inhibidor del punto de control inmunitario. En ciertos ejemplos, el inhibidor del punto de control inmunitario se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PD1 y un anticuerpo anti-PD-L1.

4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1: Cambio de veces de expansión de las células de todos los donantes en varias condiciones de citoquinas de inducción de APC descritas en el Ejemplo 1.

FIG. 2: Frecuencia de células T de VPH de todos los donantes bajo varias condiciones de citoquinas de inducción de APC descritas en el Ejemplo 1.

FIG. 3: Rendimiento de células T de VPH en todos los donantes bajo varias condiciones de citoquinas de inducción de APC descritas en el Ejemplo 1.

FIG. 4A-B: Veces de expansión celular total en la recogida bajo varias condiciones de citoquinas de expansión de células T descritas en el Ejemplo 2. (A) Gráfico resumen de los 4 donantes. (B) Gráfico individual de cada donante. FIG. 5A-B: Frecuencia de células T en la recogida bajo varias condiciones de citoquinas de expansión de células T descritas en el Ejemplo 2. (A) Gráfico resumen de los 4 donantes. (B) Gráfico individual para cada donante. FIG. 6A-B: Rendimiento de células T en la recogida bajo varias condiciones de citoquinas de expansión de células T descritas en el Ejemplo 2. (A) Gráfico resumen de los 4 donantes. (B) Gráfico individual para cada donante. FIG. 7: Porcentajes de Tcm, Tern y Teff dentro de las poblaciones de células T CD45RO+ bajo varias condiciones de citoquinas de expansión de células T descritas en el Ejemplo 2 para dos donantes diferentes. Las series C1-C17 para cada población (Tcm, Tern y Teff) se muestran en orden numérico de izquierda a derecha.

FIG. 8: Poblaciones de células T CD45RO+CD62Lhi bajo varias condiciones de citoquinas de expansión de células T descritas en el Ejemplo 2 para dos donantes diferentes.

FIG. 9: Cambio de veces de expansión de las células de todos los donantes bajo varias condiciones de duración de inducción de APC descritas en el Ejemplo 3.

FIG. 10: Frecuencia de células T de VPH de todos los donantes bajo varias condiciones de duración de inducción de APC descritas en el Ejemplo 3.

FIG. 11: Rendimiento de células T de VPH de todos los donantes en las distintas condiciones de duración de la inducción de APC descritas en el Ejemplo 3.

FIG. 12: Curva de crecimiento celular y tiempo de duplicación en las condiciones descritas en el Ejemplo 4. FIG. 13A-B: Cambios en la viabilidad celular (A) y el tamaño celular (B) con la extensión de la expansión en las condiciones descritas en el Ejemplo 4.

FIG. 14A-D: Expansión celulartotal (A), veces de cambio (B), frecuencia de células T (C) y rendimiento de células T (D) en la recogida de los días 12, 14 y 16 después de la estimulación con antígeno en las condiciones descritas en el Ejemplo 4.

FIG. 15: Pureza de células T y porcentaje de células CD4/CD8 en la recogida del día 12 al día 16 en las condiciones descritas en el Ejemplo 4.

FIG. 16: Población de células no-T en la recogida desde el día 12 al día 16 en las condiciones descritas en el Ejemplo 4.

FIG. 17: Cambios del porcentaje de células T de memoria y CD45RO+CD62Lhi con la extensión del cultivo en las condiciones descritas en el Ejemplo 4. La significancia estadística se determinó mediante un análisis ANOVA unidireccional.

FIG. 18: Cambios de los porcentajes de las poblaciones de células T de memoria central, de memoria efectora y efectoras con la extensión del cultivo de 12 a 16 días en las condiciones descritas en el Ejemplo 4. Dentro de la población CD45RO+, se observó una reducción de la población de células T de memoria central y un aumento de la población de células T efectoras desde el día 12 hasta el día 16 de cultivo. La significancia estadística se determinó mediante un análisis ANOVA unidireccional.

FIG. 19: Frecuencia de células T de VPH de todos los donantes en las varias condiciones de densidad de siembra y concentración del cóctel de citoquinas APC descritas en el Ejemplo 5.

FIG. 20: Rendimiento de células T de VPH de todos los donantes en las varias condiciones de densidad de siembra y concentración del cóctel de citoquinas APC descritas en el Ejemplo 5.

FIG. 21: Cambio de veces de expansión celular de todos los donantes en las condiciones descritas en el Ejemplo 6. Los resultados se agrupan con el tipo de medio de inducción de APC en el eje x. La leyenda de los gráficos se muestra en la esquina inferior derecha. "IL-4 Disc." significa interrupción de IL-4.

FIG. 22: Frecuencia de células T de VPH de todos los donantes en las condiciones descritas en el Ejemplo 6. Los resultados se agrupan con el tipo de medio de inducción de APC en el eje x. La leyenda de los gráficos se muestra en la esquina inferior derecha. "IL-4 Disc." significa interrupción de IL-4.

FIG. 23: Rendimiento de células T de VPH de todos los donantes en las condiciones descritas en el Ejemplo 6. Los resultados se agrupan con el tipo de medio de inducción de APC en el eje x. La leyenda de los gráficos se muestra en la esquina inferior derecha. "IL-4 Disc." significa interrupción de IL-4.

FIG. 24: Frecuencia de células T de IFN-<y>-VPH de todos los donantes en las condiciones descritas en el Ejemplo 6. Los resultados se agrupan con el tipo de medio de inducción de APC en el eje x. La leyenda de los gráficos se muestra en la esquina inferior derecha. "IL-4 Disc." significa interrupción de IL-4. Los resultados se obtienen a partir de células agrupadas dentro de la población CD3+.

FIG. 25: Proporción de Th1/Th2 basada en la secreción de citoquinas de todos los donantes en las condiciones descritas en el Ejemplo 6. Se presenta el nivel de IFN-y, el nivel de IL-5 y la proporción de IFN-y/IL-5 como proporción de Th1/Th2. Los resultados se agrupan con el tipo de medio de inducción de APC en el eje x. La leyenda de los gráficos se muestra en la parte inferior. "IL-4 Disc." significa interrupción de IL-4.

FIG. 26: Análisis de subconjuntos de Th1, Th2, Treg basado en la expresión de factores de transcripción de todos los donantes en las condiciones descritas en el Ejemplo 6. Los resultados se agrupan con el tipo de medio de inducción de APC en el eje x. La leyenda de los gráficos se muestra a la derecha. D#1: Donante #1; D#2: Donante#2; D#3: Donante#3. "IL-4 Conc." significa continuación de IL-4. "IL-4 Disc." significa interrupción de IL-4.

FIG. 27: Se generaron células T a partir de cinco pacientes con cáncer de cuello uterino, un donante sano positivo para el VPH 16 y el VPH 18, y tres donantes sanos de estado desconocido respecto al VPH. A continuación, las células T se activaron con péptidos antigénicos E6 o E7 del VPH 16 o del VPH 18, o con péptidos antigénicos E6 y E7 tanto del VPH 16 como del VPH 18, y se midió el porcentaje de células T.

FIG. 28A-B: Se probó la citotoxicidad de las células T contra objetivos autólogas u objetivos coincidentes HLA-A2in vitroen proporciones de efector a objetivo de 2,5:1, 5:1, 10: 1,20: 1 y 40: 1.

FIG. 29A-D: Se analizaron células de siete donantes individuales antes (PBMC) y después (células T) de la generación de células T. La especificidad del antígeno del VPH se comprobó midiendo la expresión superficial de CD137 (Fig. 29A). La actividad efectora se midió en las PBMC estimuladas por el VPH y en las células T estimuladas o no por el VPH midiendo la secreción de IFN-y (Fig. 29B), GM-CSF (Fig. 29C) y TNF-a (Fig. 29D).

5. DESCRIPCIÓN DETALLADA

En la presente se proporcionan métodos para generar células T, por ejemplo, linfocitos T citotóxicos (células T) a partir de PBMC, sin un paso separado de generación y aislamiento de células presentadoras de antígeno, como células dendríticas, macrófagos y células B, y con una única ronda de estimulación de antígeno, como se define en las reivindicaciones. Como se usa en la presente, el término "células T" significa linfocitos T, e incluye linfocitos T citotóxicos (células T).

Tabla 1.Lista de abreviaturas de términos clave.

5.1 Producción de células T y poblaciones de células T

En un aspecto, se proporcionan en la presente métodos para producir una población celular que comprende células T específicas de antígeno, por ejemplo, linfocitos T citotóxicos (CTL), que comprenden los pasos de: (a) cultivar PBMC aisladas de un sujeto en un medio de inducción de células presentadoras de antígeno (APC) que comprende interleucina 4 (IL-4) y ligando de CD40 soluble (sCD40L) y/o que comprende factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) e interferón a (IFN-a), para producir una primera población de células; (b) cultivar la primera población de células en presencia de uno o más antígenos, para producir una segunda población de células; y (c) cultivar la segunda población de células en un medio de expansión de células T que comprende interleucina 7 (IL-7), interleucina 15 (IL-15), e IL-4, para producir una tercera población de células; en donde la tercera población de células comprende células T que son CD3+ y específicas para un antígeno añadido en el paso (b). En ciertos aspectos, el método comprende además un paso de cultivar la tercera población de células en un segundo medio de expansión de células T que comprende IL-7 e IL-15, pero que no comprende IL-4, para crear una cuarta población de células; en donde la cuarta población de células comprende células T que son CD3+ y específicas para un antígeno añadido en el paso (b). En ciertos aspectos, el método comprende además un paso de aislamiento de células T que son CD3+ de la tercera población de células o de la cuarta población de células. En ciertos aspectos, el paso (b) se realiza en un medio de inducción de APC. En ciertos aspectos, el sujeto es un humano. En ciertos aspectos, el antígeno es un antígeno humano. En ciertos aspectos, el antígeno es una proteína de longitud completa. En ciertos aspectos, el antígeno es un fragmento de una proteína. En ciertos aspectos, el antígeno es un péptido que representa una parte de una proteína. En ciertos aspectos, las APC producen el antígeno a partir de material genético exógeno. En ciertos aspectos, se repiten uno o más pasos para aumentar el rendimiento de la población objetivo de células generadas por esos uno o más pasos. En ciertos aspectos, un paso se repite con células que permanecen sin modificar después de dicho paso. En ciertos aspectos, uno o más pasos se repiten con células que permanecen sin modificar después de dichos pasos. En ciertos aspectos, los pasos (a) a (c) se repiten una vez. En ciertos aspectos, los pasos (a) a (c) se repiten dos veces. En ciertos aspectos, las etapas (a) a (c) se repiten tres veces. En ciertos aspectos, los pasos (a) a (c) se repiten cuatro veces. En ciertos aspectos, los pasos (a) a (c) se repiten cinco veces. En ciertos aspectos, los pasos (a) a (c) se repiten con PBMC restantes después del paso (c). En ciertos aspectos, uno o más de los pasos (a), (b) y (c) se repiten una, dos, tres, cuatro o cinco veces.

En ciertos aspectos, la tercera población de células comprende células T que son además CD4+. En ciertos aspectos, la tercera población de células comprende células T que son además CD8+. En ciertos aspectos, la tercera población de células comprende células T que son adicionalmente CD4+ y CD8+.

En ciertos aspectos, la cuarta población de células comprende células T que son además CD4+. En ciertos aspectos, la cuarta población de células comprende células T que son además CD8+. En ciertos aspectos, la cuarta población de células comprende células T que son adicionalmente CD4+ y CD8+.

En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende además oligonucleótidos sintéticos con uno o más motivos dinucleótidos de CpG no metilados. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende además GM-CSF e IFN-a. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende GM-CSF e IFN-a. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC consiste esencialmente en GM-CSF e IFN-a.

En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende además IMDM, 2-mercaptoetanol, Pen Strep y/o suero humano. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende además RPMI-1640, medio de Click, suero humano, L-GLUTAMAX™ (Life Technologies), Pen Strep, y/o 2-mercaptoetanol. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende además RPMI-1640, medio de Click, suero humano, glutamina, Pen Strep, y/o 2-mercaptoetanol.

En ciertos aspectos, la IL-4 en el medio de inducción de APC está a una concentración de 40 ng/ml. En ciertos aspectos, la IL-4 en el medio de inducción de APC tiene una concentración de 10 ng/ml. En ciertos aspectos, el CD40L en el medio de inducción de APC está a una concentración de 1 pg/ml. En ciertos aspectos, los motivos dinucleótidos de CpG en el medio de inducción de APC están a una concentración de 4 pg/ml. En ciertos aspectos, el GM-CSF en el medio de inducción de APC está a una concentración de 800 U/ml. En ciertos aspectos, la IFN-a en el medio de inducción de APC está a una concentración de 1000 U/ml.

En ciertos aspectos, el uno o más antígenos son un conjunto de péptidos, por ejemplo, un conjunto de péptidos liofilizados. En ciertos aspectos, el uno o más antígenos son una mezcla de péptidos del VPH, por ejemplo, PEPMIX™. En ciertos aspectos, el uno o más antígenos son un conjunto de 15-mers solapados que abarcan las proteínas E6 y E7 de los tipos 16 y 18 del VPH. En aspectos específicos, el conjunto de péptidos cubre las secuencias de una o más de, o todas, las proteínas humanas HPV16E6, HPV16E7, HPV18E6, y/o HPV18E7. En ciertos aspectos, el uno o más antígenos comprenden uno o más antígenos de un único virus, por ejemplo, sólo de HPV16 o sólo de HPV18. En ciertos aspectos, los péptidos están a una concentración de 0,5-1 pg/ml. En aspectos específicos, los péptidos están a una concentración de 1 pg/ml. En aspectos específicos, los péptidos están a una concentración de 0,5 pg/ml.

En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 10-100 ng/ml de IL-7, 2-20 ng/ml de IL-15, y 10-100 ng/ml de IL-4. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 40-60 ng/ml de IL-7, 7-11 ng/ml de IL-15, y 45-65 ng/ml de IL-4. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 50 ng/ml de IL-7, 9 ng/ml de IL-15, y 55 ng/ml de IL-4. En ciertos aspectos, la adición de las citoquinas del medio de expansión de células T se realiza 2 horas, 24 horas o 48 horas después de la adición de uno o más antígenos. En aspectos específicos, la adición de las citoquinas del medio de expansión de células T se realiza 2 horas después de la adición de uno o más antígenos. En aspectos específicos, la adición de las citoquinas del medio de expansión de células T se realiza 24 horas después de la adición de uno o más antígenos. En aspectos específicos, la adición de las citoquinas del medio de expansión de células T se realiza 48 horas después de la adición de uno o más antígenos.

En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 1 ng/ml de IL-15, 15 ng/ml de IL-4 y 10 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 1 ng/ml de IL-15, 15 ng/ml de IL-4 y 50 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 1 ng/ml de IL-15, 35 ng/ml de IL-4 y 30 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 1 ng/ml de IL-15, 55 ng/ml de IL-4 y 10 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 1 ng/ml de IL-15, 55 ng/ml de IL-4 y 50 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 5,5 ng/ml de IL-15, 15 ng/ml de IL-4 y 10 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 5,5 ng/ml de IL-15, 15 ng/ml de IL-4 y 50 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 5,5 ng/ml de IL-15, 35 ng/ml de IL-4 y 30 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 5,5 ng/ml de IL-15, 55 ng/ml de IL-4 y 10 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 5,5 ng/ml de IL-15, 55 ng/ml de IL-4 y 50 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 10 ng/ml de IL-15, 15 ng/ml de IL-4 y 10 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 10 ng/ml de IL-15, 15 ng/ml de IL-4 y 50 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 10 ng/ml de IL-15, 35 ng/ml de IL-4 y 30 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 10 ng/ml de IL-15, 55 ng/ml de IL-4 y 10 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 10 ng/ml de IL-15, 55 ng/ml de IL-4 y 50 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 55 ng/ml de IL-4 y 50 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 5,5 ng/ml de IL-15 y 50 ng/ml de IL-7. En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T consiste esencialmente en 5,5 ng/ml de iL-15 y 50 ng/ml de IL-7.

En ciertos aspectos, la duración del paso (a) es de 1-3 días. En aspectos específicos, la duración del paso (a) es de 1 día. En ciertos aspectos, la duración del paso (c) es de 8-16 días. En aspectos específicos, la duración del paso (c) es de 12 días. En ciertos aspectos, la IL-4 se retira del medio de expansión de células T antes del final de la expansión de células T. En ciertos aspectos, la IL-4 no se retira del medio de expansión de células T antes del final de la expansión de células T.

En ciertos aspectos, las PBMC se aíslan a partir de sangre completa, capa leucocitaria o un producto de leucaféresis enriquecido. En ciertos aspectos, las PBMC se siembran en el medio de inducción de APC a una densidad de 4-6 x 106/cm2. En aspectos específicos, las PBMC se siembran a una densidad de 5 x 106/cm2. En aspectos específicos, las PBMC se siembran a una densidad superior a 5 x 106/cm2.

En ciertos aspectos, las células CD3+ específicas de antígeno se identifican mediante tinción intracelular de citoquinas (ICCS). En ciertos aspectos, los pasos de cultivo se realizan en un recipiente permeable al gas, por ejemplo, una bolsa de plástico o un dispositivo G-REX®. En ciertos aspectos, se realizan uno o más pasos de cultivo en matraces T. En ciertos aspectos, se realizan uno o más pasos de cultivo en bolsas. En aspectos específicos, las bolsas son bolsas estáticas. En ciertos aspectos, las bolsas son permeables al gas. En ciertos aspectos, uno o más pasos de cultivo se realizan en un biorreactor WAVE™. En ciertos aspectos, se realizan uno o más pasos de cultivo en un matraz de centrifugación.

5.2 Aislamiento y caracterización de células Tdivulgados en la presente como referencia; los "aspectos" o "realizaciones" divulgados en esta sección no son aspectos o realizaciones de la invención

En la técnica se conocen métodos de aislamiento de células T y pueden usarse para aislar (por ejemplo, purificar) las células T producidas usando los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, las células T pueden aislarse o enriquecerse tiñendo las células, en una realización, con anticuerpos contra CD3, y seleccionando las células CD3+. Las células T también pueden aislarse con anticuerpos contra CD4 y/o CD8, y seleccionando células de CD4+ y/o CD8+. Las células T, por ejemplo, las células T producidas mediante los métodos descritos en la presente también pueden aislarse o enriquecerse mediante la eliminación de células distintas de las células T en una población de células que comprenden las células T, por ejemplo, las células T producidas mediante los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, las células T, por ejemplo, células producidas usando los métodos descritos en la presente, pueden aislarse o enriquecerse mediante el agotamiento de células que muestran marcadores de células que no son células T. Las células aisladas por estos métodos pueden clasificarse adicionalmente.

Las células T específicas de antígeno, por ejemplo, las CTL específicas de antígeno, por ejemplo, las células T y CTL específicas de VPH, pueden, por ejemplo, identificarse usando un ensayo ICCS, un ensayo basado en citometría de flujo que detecta la producción y acumulación de citoquinas dentro del retículo endoplásmico tras la estimulación celular. La ICCS puede usarse en combinación con otros protocolos de citometría de flujo para inmunofenotipado usando marcadores de superficie celular para detectar la reactividad a antígenos de las células T. En realizaciones específicas, se usa un ensayo ICCS para medir la frecuencia de células T específicas de antígeno, por ejemplo, células T de VPH, en varios puntos temporales del proceso de cultivo de las células T. El ICCS funciona mediante los siguientes principios 1) las células T específicas de antígeno pueden activarse mediante la misma reestimulación específica de antígeno, 2) en respuesta a la reestimulación específica de antígeno, la célula T puede producir citoquinas (como IFN-y, TNF-a, IL-2, etc.) y expresar marcadores de activación (como CD154, CD137, etc.), 3) se añade un inhibidor del transporte de proteínas (por ejemplo, brefeldina A) durante la reestimulación para retener las citoquinas dentro de la células 4) las células se fijan luego en paraformaldehído y se permeabilizan, y 5) se añade el anticuerpo anticitoquinas y las células pueden analizarse mediante citómetro de flujo.

Como las células T se activarán en respuesta a una amplia variedad de señales estimuladoras además de la estimulación específica del antígeno, la tinción positiva (especialmente la tinción de baja intensidad) no demuestra inequívocamente la verdadera especificidad del antígeno cuando se usa ICCS. Por tanto, en una realización, se establece un control de estimulación no antigénica junto con las condiciones de estimulación antigénica específica. El número de células T específicas de antígeno, por ejemplo, de VPH, se cuenta midiendo las células T que tienen por lo menos uno de los marcadores de producción de citoquinas o de activación regulada por incremento, y restando el número del control de estimulación sin antígeno. En ciertas realizaciones, el panel usado para la citometría de flujo es un panel de 6 marcadores, que incluye CD3, CD4, CD8, CD154 (CD40L), IFN-<y>y TNF-a. CD3, CD4 y CD8 son marcadores de linaje de células T que pueden definir una población total de células T, incluyendo opcionalmente células T asesinas naturales (NKT), y la proporción de células T CD4/CD8. IFN-y y TNF-a son citoquinas que las células T producen tras la reactivación nocturna. CD154 es un marcador de activación de células T que se regula por incremento en las células T recién activadas por antígeno.

La determinación y/o aislamiento de células T puede realizarse, por ejemplo, usando un panel de pureza de células T que comprenda anticuerpos contra CD19, CD56, CD3, CD11a, CD4 y CD8. La determinación y/o aislamiento de células T en una cierta etapa de diferenciación puede realizarse usando un panel de diferenciación de células T que comprenda anticuerpos contra CD3, CD62L, CD4, CD27, CCR7 y CD45RO. Para determinar si las células comprenden células T, también pueden medirse las citoquinas secretadas, por ejemplo, mediante un panel de perlas 8-plex cytometrix (CBA). El panel puede incluir uno o más conjuntos de citoquinas seleccionadas del grupo que consiste en citoquinas Th1 (por ejemplo, IL-2, IFN-y y TNF-a), citoquinas Th2 (por ejemplo, IL-5, IL-13), citoquinas Treg (por ejemplo, IL-10) y citoquinas relacionadas con la función efectora de células T (por ejemplo, granzima B y GM-CSF). Para determinar si las células comprenden células T, pueden medirse factores de transcripción, por ejemplo, uno o más de T-bet, GATA-3 y FoxP3.

La separación celular, por ejemplo, separación de las células T producidas mediante los métodos descritos en la presente de las células no T, puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, citometría de flujo, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o, en una realización, clasificación magnética de células usando microperlas conjugadas con anticuerpos específicos. Las células pueden aislarse, por ejemplo, usando una técnica de clasificación celular activada magnéticamente (MACS), un método para separar partículas basado en su capacidad para unirse a perlas magnéticas (por ejemplo, de aproximadamente 0,5-100 pm de diámetro) que comprenden uno o más anticuerpos específicos, por ejemplo, anticuerpos anti-CD3. La separación celular magnética puede realizarse y automatizarse usando, por ejemplo, un separador AUTOMACS™ (Miltenyi) o un sistema CLINIMACS® (Miltenyi). Pueden realizarse una variedad de modificaciones útiles en las microesferas magnéticas, incluyendo la adición covalente de anticuerpos que reconozcan específicamente una molécula o hapteno particular de la superficie celular. Luego, las perlas se mezclan con las células para permitir la unión. Luego, las células se hacen pasar por un campo magnético para separar las que tienen el marcador específico de la superficie celular. En una realización, estas células pueden aislarse luego y volver a mezclar con perlas magnéticas acopladas a un anticuerpo contra marcadores adicionales de la superficie celular. Las células se hacen pasar de nuevo por un campo magnético, aislando las células que se unieron a ambos anticuerpos. A continuación, estas células pueden diluirse en placas separadas, como placas de microtitulación, para el aislamiento clonal.

5.3 Células T y poblaciones de células T

En un aspecto, las poblaciones de células T específicas de antígeno divulgadas en la presente y que no forman parte de la invención son específicas de un antígeno específico o de un conjunto de antígenos relacionados, por ejemplo, específicas de antígenos de la misma proteína. En un aspecto, las poblaciones de células T específicas de antígeno son específicas para un conjunto de antígenos no relacionados, por ejemplo, específicas para antígenos de diferentes proteínas. De acuerdo con la invención, las células T se producen por el método de la invención que comprende los pasos de: (a) cultivar PBMC aisladas de un sujeto en un medio de inducción de células presentadoras de antígeno (APC) que comprende interleucina 4 (IL-4) y ligando de CD40 soluble (sCD40L) y/o que comprende factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) e interferón a (IFN-a), para producir una primera población de células; (b) cultivar la primera población de células en presencia de uno o más antígenos, para producir una segunda población de células; y (c) cultivar la segunda población de células en un medio de expansión de células T que comprende interleucina 7 (IL-7), interleucina 15 (IL-15), e IL-4, para producir una tercera población de células; en donde la tercera población de células comprende células T que son CD3+ y específicas para un antígeno añadido en el paso (b). En ciertos aspectos, las poblaciones de células se producen mediante un método de la invención que comprende además un paso de cultivar la tercera población de células en un segundo medio de expansión de células T que comprende IL-7 e IL-15, pero que no comprende IL-4, para crear una cuarta población de células; en donde la cuarta población de células comprende células T que son<c>D3+ y específicas para un antígeno añadido en el paso (b). En ciertos aspectos, las poblaciones de células divulgadas en la presente y que no forman parte de la invención se producen mediante un método de la invención que comprende además un paso de aislar células T que son CD3+ a partir de la tercera población de células o la cuarta población de células. En ciertos aspectos, las poblaciones de células se producen por un método de la invención en donde el paso (b) se realiza en medio de inducción de APC.

En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende IL-4 y sCD40L. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende 8-12 ng/ml de IL-4 y 0,8-1,2 pg/ml de sCD40L. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende 10 ng/ml de IL-4 y 1 pg/ml de sCD40L.

En ciertos aspectos, el uno o más antígenos son, o están comprendidos en, un conjunto de péptidos, por ejemplo, péptidos liofilizados. Preferiblemente, cada uno de los péptidos se deriva de, por ejemplo, representa una parte de, una secuencia de una proteína contra la que se van a activar las células T. En ciertas realizaciones, los péptidos son de 10 mer, 11 mer, 12 mer, 13 mer, 14 mer, 15 mer, 16 mer, 17 mer, 18 mer, 19 mer o 20 mer. En determinadas realizaciones, el conjunto de péptidos no se solapa a través de una secuencia de proteínas específica de la que se derivan. En ciertas otras realizaciones, el conjunto de péptidos se solapa a través de una secuencia de proteínas específica de la que se derivan. En realizaciones específicas, tales péptidos pueden solaparse sucesivamente en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos. En ciertas realizaciones, la proteína es un antígeno asociado atumor(TAA). En otras realizaciones, la proteína es un Antígeno Tumoral Específico (TSA). En aspectos específicos, los péptidos cubren las secuencias de las proteínas HPV16E6, HPV16E7, HPV18E6, y/o HPV18E7 humanas. En ciertos aspectos, tales péptidos comprenden cada residuo de aminoácido presente en las proteínas HPV16E6, HPV16E7, HPV18E6, y/o HPV18E7 humanas. En ciertos aspectos, tales péptidos comprenden una parte de los residuos de aminoácidos presentes en las proteínas HPV16E6, HPV16E7, HPV18E6 y/o HPV18E7 humanas. En una realización específica, los péptidos cubren las secuencias de las proteínas HPV16E6, HPV16E7, HPV18E6y HPV18E7 humanas. En una realización específica, los péptidos cubren las secuencias de las proteínas HPV16E6 y/o HPV16E7 humanas y no cubren las proteínas HPV18E6, y/o HPV18E7. En otra realización específica, los péptidos cubren las secuencias de las proteínas HPV18E6 y/o HPV18E7 humanas y no cubren las proteínas HPV16E6, y/o HPV16E7. En aspectos específicos, los péptidos están a una concentración de 1 pg/ml. En ciertos aspectos, el uno o más antígenos son producidos a partir de material genético exógeno por las APC.

En ciertas realizaciones, el antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígeno de maduración de células B (BCMA), II,13Ra2, Her2, antígeno de células madre de próstata (PSCA), alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno del cáncer-125 (CA-125), CA19-9, calretinina, MUC-1, proteína de membrana epitelial (EMA), antígeno de tumor epitelial (ETA), tirosinasa, antígeno asociado al melanoma (MAGE), CD19, CD34, CD45, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína del líquido de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno de HMB-45, antígeno asociado al melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), proteína melan-A (antígeno del melanoma reconocido por los linfocitos T; MART-1), mio-D1, actina específica de músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neurona (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisis, tiroglobulina, factor 1 de transcripción tiroideo, la forma dimérica de la isoenzima piruvato quinasa tipo M2 (tumor M2-PK), una proteína ras anormal, una proteína p53 anormal, fuc-GM1, GM2 (antígeno oncofetal-inmunogénico-1; OFA-I-1);<g>D2 (OFA-I-2), GM3, GD3, alfa-actinina-4, Bage-1, BCR-ABL, proteína de fusión Bcr-Abl, beta-catenina, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, Casp-8, cdc27, cdk4, cdkn2a, coa-1, proteína de fusión dek-can, EBNA, EF2, antígenos del virus de Epstein Barr, proteína de fusión ETV6-AML1, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, Mart2, Mum-1,2, y 3, neo-PAP, miosina clase I, OS-9, proteína de fusión pml-RARa, PTPRK, triosafosfato isomerasa, Gage 3,4,5,6,7, GnTV, Herv-K-mel, Lage-1, NA-88, NY-Eso-1/Lage-2, SP17, SSX-2, TRP2-Int2, gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, RAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15(58), RAGE, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, HER-2/neu, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos E6 y E7 del virus del papiloma humano (VPH), TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, 13-Catenina, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, CT7, telomerasa, 43-9F, ST4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TAG72, TLP, TPS, CD19, CD22, CD27, CD30, CD70, EGFRvIlI (variante III del factor de crecimiento epidérmico), proteína espermática 17 (Sp17), mesotelina, PAP (fosfatasa ácida prostática), prosteína, TARP (proteína del marco de lectura alternativo del receptor gamma de células T), Trp-p8, STEAP1 (antígeno epitelial de seis transmembranas de la próstata 1), integrina avp3 (CD61), galactina y Ral-B.

En ciertas realizaciones, el antígeno es un antígeno asociado al tumor o un antígeno específico del tumor. En varias realizaciones específicas, sin limitación, el antígeno asociado a tumor o el antígeno específico de tumor es Her2, antígeno de células madre de próstata (PSCA), alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno de cáncer-125 (CA-125), CA19-9, calretinina, MUC-1, proteína de membrana epitelial (EMA), antígeno de tumor epitelial (ETA), tirosinasa, antígeno asociado al melanoma (MAGE), CD19, CD34, CD45, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína del líquido de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, antígeno asociado al melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), proteína melan-A (antígeno del melanoma reconocido por los linfocitosT; MART-1), myo-D1, actina específica de músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neurona (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisis, tiroglobulina, factor 1 de transcripción tiroideo, la forma dimérica de la isoenzima piruvato quinasa tipo M2 (tumor M2-PK), una proteína ras anormal o una proteína p53 anormal.

En ciertas realizaciones, el TAA o TSA es un antígeno de cáncer/testículo (CT), por ejemplo, BAGE, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-ESO-1, NY-SAR-35, OY-TES-1, SPANXB1, SPA17, SSX, SYCP1, o TPTE.

En ciertas otras realizaciones, el TAA o TSA es un carbohidrato o gangliósido, por ejemplo, fuc-GM1, GM2 (antígeno oncofetal-inmunogénico-1; OFA-I-1); GD2 (OFA-I-2), GM3, GD3, y similares.

En ciertas otras realizaciones, el TAA o TSA es alfa-actinina-4, Bage-1, BCR-ABL, proteína de fusión Bcr-Abl, beta-catenina, C A 125, C A 15-3 (CA27.29\BCAA), C A 195, CA242, CA-50, CAM43, Casp-8, cdc27, cdk4, cdkn2a, CEA, coa-1, proteína de fusión dek-can, EBNA, EF2, antígenos del virus de Epstein Barr, proteína de fusión ETV6-AML1, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, Mart2, Mum-1, 2, y 3, neo-PAP, miosina clase I, OS-9, proteína de fusión pml-RARa, PTPRK, K-ras, N-ras, triosefosfato isomerasa, Gage 3,4,5,6,7, GnTV, Herv-K-mel, Lage-1, NA-88, NY-Eso-1/Lage-2, SP17, SSX-2, TRP2-Int2, gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, RAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15(58), RAGE, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos E6 y E7 del virus del papiloma humano (VPH), TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 13-Catenina, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, CT7, telomerasa, 43-9F, ST4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TAG72, TLP, TPS, CD19, CD22, CD27, CD30, CD70, GD2 (gangliósido G2), EGFRvIII (variante III del factor de crecimiento epidérmico), proteína espermática 17 (Sp17), mesotelina, PAP (fosfatasa ácida prostática), prosteína, TARP (proteína del marco de lectura alternativo del receptor gamma de células T), Trp-p8, STEAP1 (antígeno epitelial de seis transmembranas de la próstata 1), una proteína ras anormal o una proteína p53 anormal. En otra realización específica, dicho antígeno asociado a tumor o antígeno específico de tumor es la integrina avp3 (CD61), galactina, K-Ras (oncogén viral del sarcoma de rata V-Ki-ras2 Kirsten), o Ral-B. Los expertos en la técnica conocen otros antígenos asociados a tumores y específicos de tumores.

En ciertas realizaciones específicas, el antígeno es un antígeno que no se considera un TSA o un TAA, pero que sin embargo está asociado a células tumorales o a daños provocados por un tumor. En ciertas realizaciones específicas, el antígeno es un neoantígeno. En ciertas realizaciones, por ejemplo, el antígeno es, por ejemplo, un factor de crecimiento, citoquina o interleucina, por ejemplo, un factor de crecimiento, citoquina o interleucina asociados con la angiogénesis o vasculogénesis. Tales factores de crecimiento, citoquinas o interleucinas pueden incluir, por ejemplo, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) o la interleucina-8 (IL-8). Los tumores también pueden crear un entorno hipóxico local al tumor. Como tal, en otras realizaciones específicas, el antígeno es un factor asociado a la hipoxia, por ejemplo, HIF-1a, HIF-1p, HIF-2a, HIP-2p, HIF-3a o HIP-3p. Los tumores también pueden provocar daño localizado al tejido normal, provocando la liberación de moléculas conocidas como moléculas de patrón molecular asociado a daño (DAMPs; también conocidas como alarminas). En ciertas otras realizaciones específicas, por lo tanto, el antígeno es un DAMP, por ejemplo, una proteína de choque térmico, cuadro 1 del grupo de alta movilidad de proteínas asociadas a la cromatina<( H m G b 1 ) ,>S100A8 (MRP8, calgranulina A), S100A9 (MRP14, calgranulina B), amiloide sérico A (SAA), o puede ser un ácido desoxirribonucleico, adenosina trifosfato, ácido úrico o sulfato de heparina.

En ciertas realizaciones, el antígeno está asociado a virus, por ejemplo, al VPH. En realizaciones específicas, el antígeno está asociado al VPH. En realizaciones específicas, el antígeno está asociado al VEB.

En ciertos aspectos, el medio de expansión de células T comprende 40-60 ng/ml de IL-7, 7-11 ng/ml de IL-15, y 45-65 ng/ml deEn aspectos específicos, el medio de expansión de células T comprende 50 ng/ml de IL-7, 9 ng/ml de IL-15, y 55 ng/ml de IL-4.

En ciertos aspectos, el segundo medio de expansión de células T comprende 40-60 ng/ml de IL-7 y 7-11 ng/ml de IL-15. En aspectos específicos, el segundo medio de expansión de células T comprende 50 ng/ml de IL-7 y 9 ng/ml de IL-15.

En ciertos aspectos, la duración del paso (a) es de 1-3 días. En aspectos específicos, la duración del paso (a) es de 1 día. En ciertos aspectos, la duración del paso (c) es de 8-16 días. En aspectos específicos, la duración del paso (c) es de 12 días.

En ciertos aspectos, las células CD3+ específicas de antígeno se identifican mediante tinción intracelular de citoquinas (ICCS). En ciertos aspectos, los pasos de cultivo se realizan en un dispositivo G-REX®. En ciertos aspectos, se realizan uno o más pasos de cultivo en frascos T. En ciertos aspectos, uno o más pasos de cultivo se realizan en bolsas. En determinados aspectos, las bolsas son bolsas estáticas. En ciertos aspectos, las bolsas son permeables al gas. En ciertos aspectos, uno o más pasos de cultivo se realizan en un biorreactor WAVE™. En ciertos aspectos, uno o más pasos de cultivo se realizan en un matraz de centrifugación.

En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende además oligonucleótidos sintéticos con motivos de dinucleótidos CpG no metilados. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende además GM-CSF e IFN-a. En ciertos aspectos, el medio de inducción de APC comprende GM-CSF e IFN-a.

En una realización específica, dicha población de células T comprende aproximadamente el 70% o más, en algunas realizaciones, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de células CD3+. En otra realización específica, dicha población de células T comprende no menos del 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de células<C d 3 .>En otra realización específica, dicha población de células T comprende entre un 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 90%-95%, o 95%-99% de células CD3+.

En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ en dicha población de células T comprenden células CD3+ que son además CD4+. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ en dicha población de células T comprenden células CD3+ que son además CD8+. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ en dicha población de células T comprenden células CD3+ que son además CD4+ y CD8+. En ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células CD137+. En ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células CD154+. En ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células que expresan citoquinas Th1. En ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células que expresanEn ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células que expresan TNF-a. En ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células que expresan GM-CSF. En ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células que expresan granzima B. En ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células CD3+, CD137+ y CD154+. En ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células CD3+, CD4+, CD137+ y CD154+. En ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células CD3+, CD8+, CD137+ y CD154+. En ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células CD3+, CD4+, CD8+, CD137+ y CD154+. En ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células CD3+, CD137+, CD154+ y células que expresan una o más citoquinas Th1. En ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células CD3+, CD4+, CD137+, CD154+ y células que expresan una o más citoquinas Th1. En ciertas realizaciones, dicha población de células T comprende células CD3+, CD8+, CD137+, CD154+ y células que expresan una o más citoquinas Th1.

En ciertas realizaciones, las células T, por ejemplo, las células T producidas mediante cualquiera de los métodos proporcionados en la presente, por ejemplo, las células T que son específicas del VPH, muestran una expresión aumentada de uno o más genes en comparación con las PBMC, por ejemplo PBMC coincidentes, a partir de las que se producen, en donde dicho uno o más genes son uno o más de ACSLS, ACSL6, ACTA2, AHRR, ALDH18A1, ALDH6A1, ANAPC11, AP2B1, BAX, BCL6, BRCA1, C5, CCL13, CCL17, CCL18, CCL20, CCL22, CCL4, CCNA1, CCNA2, CCNB1, CCNB2, CCND3, CCNE2, CD40LG, CD80, CD86, CDC20, CDC25A, CDC25A, CDC25C, CDC45, CDC6, CDK1, CDK1, CDK2, CDK2, CDK4, CDK5, CDK6, CDT1, CHEK2, CKLF, COPG2, CXADR, CXCL16, CXCL2, CXCL8, CXCR5, CXCR5, CYBSA, CYP1A1, CYP1B1, DHFR, E2F1, ESPL1, FADS1, FADS2, FAS, FBXOS, FGFR1, FGFR1, FLOT1, FN1, FOS, FYN, FYN, GADD45B, GALK1, GALK2, GMDS, GMPPA, GSTA4, GSTM4, HLADMB, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, IFNGR1, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL1B, IL1B, IL21R, IL2RA, IL2RG, IL4, IL5, IL6ST, IRS2, IRS2, ITGA1, ITGA4, ITGA5, ITGA6, ITGAL, ITGAX, ITGB1, ITGB7, JAM3, JUN, KIF11, KIF23, MAP3K2, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MGST2, MGST3, MMP25, MYL6B, NQO1, NQO2, NRIP1, PCNA, PHGDH, PIK3C2A, PIK3CA, PLK2, PLK3, PLK4, POLA1, PPM1L, PPP2R3B, PRC1, PRIM1, PRKD3, PSAT1, PSPH, PTTG1, RAC2, RAC3, RAD50, RAD51, RARA, RBBP8, RRAS, SDC4, SELPLG, SHMT1, SHMT2, SLC27A2, SMC2, STAT1, TFDP1, TGFB1, TGFBR2, TGM2, TOP2A, TSTA3, UGDH, XCL1, XCL2, ZEB1, y/o ZNF420. En ciertas realizaciones, la expresión aumentada es 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o más. En ciertas otras realizaciones, las células T, por ejemplo, las células T producidas por cualquiera de los métodos proporcionados en la presente, por ejemplo, células T que son específicas del VPH, muestran una expresión aumentada de uno o más genes en comparación con células no pulsadas que de otro modo han sido producidas mediante los métodos descritos en la presente (es decir, células T no expuestas a un PepMix), en donde dicho uno o más genes son uno o más de CCL18 (Ligando 18 de quimioquina (motivo C-C)); CH13L1 (proteína similar a quitinasa-3); FN1 (Fibronectina 1); LYZ (Lisozima); RCHY1 (Dedo anular y dedo de zinc CHY 1); y PALLD (Paladino, proteína asociada a citoesqueleto). Dichas células T pueden usarse, por ejemplo, en cualquiera de los métodos de tratamiento descritos en la presente.

5.4 Composiciones que comprenden células Tdivulgadas en la presente como referencia; los "aspectos o "realizaciones" divulgados en esta sección no son aspectos o realizaciones de la invención

En la presente se divulga una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende una población de células T producida usando los métodos descritos en la presente. En una realización específica, dicha población de células T comprende por lo menos el 50% de las células de la composición. En otra realización específica, dicha población de células T, por ejemplo, células CD3 , comprende por lo menos el 80%, 85%, 90%. 95%, 98% o 99% de las células de la composición. En ciertas realizaciones, no más del 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% o 45% de las células de dicha población de células T son células CD3+. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ son CD4+ y/o CD8+. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ son CD137+. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ son CD154+. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ expresan citoquinas Th1. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ expresan IFN-<y>. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ expresan TNF-a. En ciertas realizaciones, las células<c>D3+ expresan GM-CSF. En ciertas realizaciones, las células CD3+ expresan granzima B. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ son CD137+ y CD154+. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ son CD4+, CD137+ y CD154+. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ son CD8+, CD137+ y CD154+. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ son CD4+, CD8+, CD137+ y CD154+. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ son CD137+, CD154+ y expresan una o más citoquinas Th1. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ son CD4+, CD137+, CD154+ y expresan una o más citoquinas Th1. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ son CD8+, CD137+, CD154+ y expresan una o más citoquinas Th1. En ciertas realizaciones, dichas células CD3+ son CD4+, CD8+, CD137+, CD154+ y expresan una o más citoquinas Th1.

En una realización específica, dichas células T en dicha composición son del mismo individuo que el individuo para el que se pretende la reintroducción de, por ejemplo, el tratamiento con, las células T (es decir, las células T son autólogas para el receptor previsto). En otra realización específica, dichas células T en dicha composición proceden de un individuo diferente del individuo para el que se pretende la reintroducción de, por ejemplo, el tratamiento con, las células T (es decir, las células T no son autólogas del receptor previsto). En otra realización específica, dicha composición comprende además un compuesto inmunomodulador o talidomida. En ciertas realizaciones, el compuesto inmunomodulador es un compuesto descrito a continuación. Consultar, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 7.498.171. En ciertas realizaciones, el compuesto inmunomodulador es una isoindolina sustituida con amino. En una realización, el compuesto inmunomodulador es 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)-piperidina-2,6-diona; 3-(4'aminoisolindolina-1'-ona)-1-piperidina-2,6-diona; 4-(amino)-2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-isoindolina-1,3-diona; o 4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindol-1,3-diona. En otra realización, el compuesto inmunomodulador es pomalidomida o lenalidomida. En otra realización, dicho compuesto inmunomodulador es un compuesto que tiene la estructura

en donde uno de X e Y es C=O, el otro de X e Y es C=O o CH2, y R2 es hidrógeno o alquilo inferior, o una sal farmacéuticamente aceptable, hidrato, solvato, clatrato, enantiómero, diastereómero, racemato o mezcla de estereoisómeros del mismo. En otra realización, dicho compuesto inmunomodulador es un compuesto que tiene la estructura

en donde uno de X e Y es C=O y el otro es CH<2>o C=O;

R<1>es H, (C-C<8>)alquilo, (C<3>-C<7>)cicloalquilo, (C<2>-C<8>)alquenilo, (C<2>-C<8>)alquinilo, bencilo, arilo, (C<0>-C<4>)alquilo-(C<r>C<6>)heterocicloalquilo, (C<0>-C<4>)alquilo-(C<2>-C<5>)heteroarilo, C(O)R<3>, C(S)R<3>, C(O)OR<4>, (C<1>-C<8>)alquilo-N(R)<62>, (C<1>-C<8>)alquilo-OR<5>, (C<1>-C<8>)alquilo-C(O)OR<5>, C(O)NHR<3>, C(S)NHR<3>, C(O)NR<3>R<3>', C(S)NR<3>R<3>' o (C ^ a lq u ilo -O(CO)R<5>;

R<2>es H, F, bencilo, (C<1>-C<8>)alquilo, (C<2>-C<8>)alquenilo, o (C<2>-C<8>)alquinilo;

R<3>y R<3'>son independientemente (C<1>-C<8>)alquilo, (C<3>-C<7>)cicloalquilo, (C<2>-C<8>)alquenilo, (C<2>-C<8>)alquino, bencilo, arilo, (C<0>-C<4>)alquilo-(C<1>-C<6>)heterocicloalquilo, (C<0>-C<4>)alquilo-(C<2>-C<5>)heteroarilo, (C<0>-C<8>)alquilo-N(R)<62>, (C<1>-C<8>)alquilo-OR<5>, (C<1>-C<8>)alquilo-C(O)OR<5>, (Cr C<8>)alquilo-O(CO)R<5>, o C(O)OR<5>;

R<4>es (C<1>-C<8>)alquilo, (C<2>-C<8>)alquenilo, (C<2>-C<8>)alquinilo, (C<1>-C<4>)alquilo-OR<5>, bencilo, arilo, (C<0>-C<4>)alquilo-(C<r>C<6>)heterocicloalquilo, o (C<0>-C<4>)alquilo-(C<2>-C<5>)heteroarilo;

R<5>es (C<1>-C<8>)alquilo, (C<2>-C<8>)alquenilo, (C<2>-C<8>)alquinilo, bencilo, arilo o (C<2>-C<5>)heteroarilo;

cada aparición de R<6>es independientemente H, (C<1>-C<8>)alquilo, (C<2>-C<8>)alquenilo, (C<2>-C<8>)alquinilo, bencilo, arilo, (C<2>-C<5>)heteroarilo, o (C<0>-C<8>)alquilo-C(O)O-R<5>o los grupos R<6>pueden unirse para formar un grupo heterocicloalquilo;

n e s 0 o 1;y

* representa un centro de carbono quiral; ;o unasal farmacéuticamente aceptable, hidrato, solvato, clatrato, enantiómero, diastereómero, racemato o mezcla de estereoisómeros del mismo. En otra realización, dicho compuesto inmunomodulador es un compuesto que tiene la estructura ;;; ;;; en donde: ;;uno d e X e Yes C=O y el otro es CH<2>o C=O; ;R e s H o CH<2>OCOR'; ;;(i) cada uno de R1, R2, R3, o R4, independientemente de los otros, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono o (ii) uno de R1, R2, R3, o R4 es nitro o -NHR5 y el resto de R1, R2, R3, o R4 son hidrógeno; ;;R<5>es hidrógeno o alquilo de 1 a8 carbonos ;R<6>hidrógeno, alquilo de 1a 8 átomos de carbono, benzo, cloro o fluoro; ;R' es R<7>-CHR<10>-N(R<8>R<9>); ;R<7>es m-fenileno o p-fenileno o -(C<n>H<2n>)- en el que n tiene un valor de 0a4 ; ;cada uno de R<8>y R<9>tomados independientemente del otro es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, o R<8>y R<9>tomadosjuntos son tetrametileno, pentametileno, hexametileno, ;o -CH<2>CH<2>X<1>CH<2>CH<2>- en el que Xi es -O-, -S-, o -NH-; ;R<10>es hidrógeno, alquilo de hasta 8 átomos de carbono o fenilo; y ;* representa un centro de carbono quiral;

o una sal farmacéuticamente aceptable, hidrato, solvato, clatrato, enantiómero, diastereómero, racemato o mezcla de estereoisómeros del mismo.

En otra realización específica, la composición comprende adicionalmente uno o más compuestos anticancerígenos, por ejemplo, uno o más de los compuestos anticancerígenos descritos a continuación. En otra realización específica, la composición comprende además un fármaco inmunomodulador o un modificador epigenético. En otra realización específica, la composición comprende un inhibidor del punto de control inmunitario. En realizaciones más específicas, el inhibidor del punto de control inmunitario se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PD1 y un anticuerpo anti-PD-L1.

En ciertas realizaciones, las células T específicas de antígeno se formulan en una solución farmacéuticamente aceptable. En realizaciones preferidas, la solución farmacéuticamente aceptable es adecuada para la administración de células vivas. En realizaciones específicas, la solución farmacéuticamente aceptable es, por ejemplo, una solución salina (como la solución de Ringer), gelatinas, carbohidratos (por ejemplo, lactosa, amilosa, almidón o similares), ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa o polivinilpirolidina. En realizaciones más específicas, la solución farmacéuticamente aceptable se esteriliza antes de la adición a las células. En otras realizaciones más específicas, la solución farmacéuticamente aceptable puede mezclarse con agentes auxiliares como lubricantes, conservantes, estabilizantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones y colorantes. Los portadores farmacéuticos adecuados para su uso en la formulación de las células son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la WO 96/05309. En realizaciones específicas, la solución farmacéuticamente aceptable comprende uno o más de dextrano-40, albúmina sérica humana, Plasma Lyte A, cloruro sódico y dimetilsulfóxido. En ciertas realizaciones, las células T específicas de antígeno se formulan en una solución con un crioprotector. En realizaciones específicas, el crioprotector es dimetilsulfóxido (DMSO).

En ciertas realizaciones, las células T específicas de antígeno producidas mediante los métodos descritos en la presente se proporcionan en una o más bolsas de infusión.

5.5 Usos de las células T específicas de antígenodivulgados en la presente como referencia; los "aspectos" o "realizaciones" divulgados en esta sección no son aspectos o realizaciones de la invención

En la presente se divulgan métodos para tratar un cáncer o una infección vírica que comprenden la administración a un paciente con necesidad de ello una población de células T específicas de antígeno producidas mediante los métodos descritos en la presente, por ejemplo, a partir de células mononucleares sanguíneas aisladas, por ejemplo, PBMC o células mononucleares de sangre de cordón umbilical. En ciertas realizaciones, las células mononucleares sanguíneas aisladas, por ejemplo, PBMC o células mononucleares de sangre de cordón umbilical, son autólogas del paciente. En ciertas realizaciones, las células mononucleares sanguíneas aisladas, por ejemplo, PBMC o células mononucleares de sangre de cordón umbilical, no son autólogas del paciente.

Las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente pueden usarse en métodos de tratamiento de individuos que tienen cáncer, por ejemplo, individuos que tienen células tumorales sólidas y/o células cancerosas de la sangre, o personas con una infección vírica. Las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente también pueden usarse en métodos de tratamiento de individuos con riesgo de desarrollar cáncer o para prevenir el desarrollo de cáncer.

5.5.1 Tratamiento de individuos que tienen cáncerdivulgados en la presente como referencia; los "aspectos" o "realizaciones" divulgados en esta sección no son aspectos o realizaciones de la invención) invención

En la presente se divulga un método para tratar a un individuo que tiene un cáncer, por ejemplo, un cáncer de la sangre o un tumor sólido, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. También se divulga en la presente un método de tratamiento de un individuo con riesgo de desarrollar cáncer, por ejemplo, un cáncer de la sangre o un tumor sólido, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En realizaciones específicas, las células T son específicas de un antígeno expresado por el cáncer. En realizaciones más específicas, las células T son específicas para uno o más de los antígenos asociados al tumor o antígenos específicos del tumor descritos en la Sección 5.3 anterior. En ciertas realizaciones, las células T son células T específicas de antígeno producidas mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, el individuo tiene una deficiencia de células T, por ejemplo, una deficiencia de células T activas contra el cáncer del individuo. En ciertas realizaciones, el individuo tiene demasiado pocas células T. En ciertas realizaciones, el individuo tiene células T con actividad suprimida. Como se usa en la presente, una "cantidad eficaz" es una cantidad que, por ejemplo, produce una mejora detectable, una disminución de la progresión o la eliminación de uno o más síntomas del cáncer que padece el individuo.

En aspectos específicos, el individuo tiene carcinoma ductal primario, leucemia, leucemia aguda de células T, linfoma mieloide crónico, leucemia mielógena aguda, mieloma múltiple, leucemia mielógena crónica, carcinoma de pulmón, adenocarcinoma de colon, linfoma histiocítico, mieloma múltiple, retinoblastoma o carcinoma colorrectal.

En la presente se divulgan métodos para tratar a un individuo que tiene un cáncer VPH positivo (VPH+). En realizaciones específicas, el cáncer VPH+ es un cáncer de cabeza y cuello. En realizaciones más específicas, el cáncer VPH+ es un carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN). En realizaciones específicas, el cáncer VPH+ es un cáncer orofaríngeo. En ciertos aspectos, el cáncer VPH+ es un cáncer de pene. En ciertos aspectos, el cáncer VPH+ es cáncer de cuello uterino. En ciertos aspectos, el cáncer VPH+ es un cáncer anal. En ciertos aspectos, el cáncer VPH+ es un cáncer de vulva. En ciertos aspectos, el cáncer VPH+ es un cáncer de vagina. En ciertos aspectos, el cáncer VPH+ es cáncer de pulmón. En realizaciones específicas, el cáncer VPH+ es VPH-16+. En realizaciones específicas, el cáncer VPH+ es VPH-18+. En realizaciones específicas, el cáncer VPH+ es VPH-16+ y VPH-18+. En realizaciones específicas, el cáncer VPH+ es metastásico. En ciertas realizaciones, el cáncer VPH+ es recurrente. En ciertas realizaciones, el cáncer VPH+ es metastásico y recurrente. También se divulgan en la presente métodos para tratara un individuo que tiene un cáncer VPH+, determinado por inmunohistoquímica. También se divulgan en la presente métodos de tratamiento de un individuo que tiene un cáncer VPH+, determinado por reacción en cadena de la polimerasa. También se divulgan en la presente métodos de tratamiento de un individuo que tiene un cáncer VPH+, determinado por hibridación fluorescentein situde ARN. También se divulgan en la presente métodos de tratamiento de un individuo con un cáncer VPH+ que ha sido tratado previamente con cetuximab. También se divulgan en la presente métodos de tratamiento de un individuo con un cáncer VPH+ que ha sido tratado previamente con un doblete basado en platino. También se divulgan en la presente métodos de tratamiento de un individuo con un cáncer VPH+ que ha sido tratado previamente con cetuximab y un doblete basado en platino. En ciertas realizaciones, el doblete basado en platino es cisplatino/5-FU. En ciertas realizaciones, el doblete basado en platino es carboplatino/5-FU. También se divulgan en la presente métodos para tratar a una persona con un cáncer VPH+ que ha sido tratada previamente con un inhibidor de PD-1. En ciertas realizaciones, el inhibidor de PD-1 es pembrolizumab (KEYTRUDA®; Merck). En ciertas realizaciones, el inhibidor de PD-1 es nivolumab (OPDIVO®; Bristol-Myers Squibb). En la presente también se divulgan métodos para tratar a una persona con cáncer VPH+ que ha sido tratada previamente con un inhibidor de PD-L1. En ciertas realizaciones, el inhibidor de PD-L1 es durvalumab (MedImmune).

En ciertos aspectos, el método comprende además administrar a cualquiera de dichos individuos un fármaco inmunomodulador o un modificador epigenético. En aspectos específicos, el método comprende además administrar a dicho individuo un inhibidor del punto de control inmunitario. En más aspectos específicos, el inhibidor del punto de control inmunitario se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PD1 y un anticuerpo anti-PD-L1. En ciertas realizaciones, el inhibidor de PD-1 es pembrolizumab (KEYTRUDA®; Merck). En ciertas realizaciones, el inhibidor de PD-1 es nivolumab (OPDIVO®; Bristol-Myers Squibb). En ciertas otras realizaciones, el inhibidor de PD-L1 es durvalumab (MedImmune). En otra realización específica, el anticuerpo anti-CTLA4 es ipilimumab (YERVOY®; Bristol-Meyers Squibb).

En realizaciones específicas, la administración de una población aislada de células T o una composición farmacéutica de la misma a un sujeto se realiza mediante inyección, infusión, administración intravenosa (IV), administración intrafemoral o administración intratumoral. En realizaciones específicas, la administración de una población aislada de células T o una composición farmacéutica de la misma a un sujeto se realiza con un dispositivo, una matriz o un andamiaje.

5.5.2 Tratamiento de cánceres usando células T y otros agentes anticancerígenosdivulgados en la presente como referencia

El tratamiento de un individuo que tiene cáncer usando las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente puede formar parte de un régimen de terapia contra el cáncer que incluye uno o más agentes anticancerígenos. Además, o alternativamente, el tratamiento de un individuo que tiene cáncer usando las células T producidas usando los métodos descritos en la presente puede usarse para suplementar una terapia anticancerosa que incluye uno o más agentes anticancerígenos. Tales agentes anticancerígenos son bien conocidos en la técnica e incluyen agentes antiinflamatorios, agentes inmumoduladores, agentes citotóxicos, vacunas contra el cáncer, agentes quimioterapéuticos, inhibidores de HDAC y ARNip. Los agentes anticancerígenos específicos que pueden administrarse a un individuo con cáncer, por ejemplo, un individuo que tiene células tumorales, además de las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente incluyen, pero no se limitan a: acivicina; aclarubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; adriamicina; adrucil; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa (por ejemplo, de Erwinia chrysan; Erwinaze); asperlin; avastin (bevacizumab); azacitidina; azetepa; azotomicina batimastat; benzodepa; bicalutamide; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesin; bleomicina sulfato; brequinar sódico; bropirimina; busulfán; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; celecoxib (inhibidor de COX-2); cerubidina; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; clorhidrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; doxorrubicina; clorhidrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflomitina; elsamitrucin; Elspar; enloplatino; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirubicina; erbulozol; clorhidrato de esorubicina; estramustina; estramustina fosfato sódico; etanidazol; etopósido; etopósido fosfato; etofós; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fludarabina fosfato; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; idamicina; clorhidrato de idarubicina; ifosfamida; ilmofosina; iproplatino; irinotecán; clorhidrato de irinotecán; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalán; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcin; mitocromina; mitogillina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisuran; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobromán; piposulfán; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfimer sódico; porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbazina; Proleucina; Purinetol; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; Rheumatrex; riboprina; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato sódico; esparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; Tabloid; talisomicina; tecogalán sódico; taxotere; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; teniposida; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; Toposar; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; Trexall; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato detrimetrexato; triptorelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; y clorhidrato de zorubicina.

Otros fármacos anticancerígenos incluyen, pero no se limitan a: 20-epi-1,25 dihidroxivitamina D3; 5-azacitidina; 5-etiluracilo; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas de ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolida; inhibidores de la angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína 1 morfogenética antidorsalizante; antiandrógeno, carcinoma prostático; antiestrógeno; antineoplastón; oligonucleótidos antisentido; glicinato de afhidicolina; moduladores génicos de la apoptosis; reguladores de la apoptosis; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina deaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetrón; azatoxina; azatirosina; derivados de la bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilstaurosporina; derivados de beta lactámicos; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilspermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; camptosar (también llamado Campto; irinotecán) derivados de la camptotecina; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado del cartílago; carzelesina; inhibidores de la caseína quinasa (ICOS); castanospermina; CC-122; CC-486; cecropina B; cetrorelix; clorlns; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de la combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de la criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; dehidrodidenmina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamilo; diaziquona; didemnina B; didox; dietilnorspermina; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetrón; doxifluridina; doxorrubicina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflomitina; elemene; emitefur; epirubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrógenos; antagonistas de estrógenos; etanidazol; fosfato de etopósido; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina (por ejemplo, Fludara); clorhidrato de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; texafirina de gadolinio; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de la gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de la glutatión; hepsulfam; heregulina; bisacetamida de hexametileno; hipericina; ácido ibandrónico; idarubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imatinib (por ejemplo, GLEEVEC®), imiquimod; péptidos inmunoestimulantes; inhibidor del receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina; agonistas del interferón; interferones; interleucinas; iobenguano; yododoxorrubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetrón; jasplakinolida; kahalalida F; lamellarin-N triacetato; lanreotide; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinan; leptolstatin; letrozol; factor de inhibición de leucemia; interferón alfa leucocitario; leuprolida estrógeno progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo lineal de poliamina; péptido disacárido lipofílico; compuestos lipofílicos de platino; lisoclinamida 7; lobaplatino; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; loxoribina; lurtotecán; lutecio texafirina; lisofilina; péptidos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspin; inhibidores de la matrilisina; inhibidores de la metaloproteinasa de la matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; mitoguazona; mitolactol; análogos de la mitomicina; mitonafida; mitotoxina factor de crecimiento de fibroblastos-saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo anti-EGFR (por ejemplo, Erbitux (cetuximab)); anticuerpo anti-CD19; anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, rituximab); anticuerpo anti-disialogangliósido (GD2) (por ejemplo, anticuerpo monoclonal 3F8 o ch14>18); anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo, herceptina); gonadotrofina coriónica humana; lípido monofosforil A+pared celular de micobacteria sk; mopidamol; agente anticancerígeno de mostaza; micaperóxido B; extracto de pared celular de micobacteria; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorubicina; ácido neridronico; nilutamida; nisamicina; moduladores del óxido nítrico; antioxidante nitróxido; nitrulina; oblimersen (GENASENSE®); O6-bencilguanina; octreotida; okicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetrón; ondansetrón; oracina; inductor oral de citoquinas; ormaplatino; osaterona; oxaliplatino (por ejemplo, Floxatin); oxaunomicina; paclitaxel; análogos del paclitaxel; derivados del paclitaxel; palauamina; palmitoilrhizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa; peldesina; pentosán polisulfato sódico; pentostatina; pentrozol; perflubrón; perfosfamida; alcohol perilílico; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de la fosfatasa; picibanil; clorhidrato de pilocarpina; pirarubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidor del activador del plasminógeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina; porfimer sódico; porfiromicina; prednisona; propil bisacridona; prostaglandina J2; inhibidores del proteasoma; modulador inmunitario a base de proteína A; inhibidor de la proteína quinasa C; inhibidores de la proteína quinasa C, microalgal; inhibidores de la proteína tirosina fosfatasa; inhibidores de la purina nucleósido fosforilasa; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de polioxietileno de hemoglobina piridoxilada; antagonistas del raf; raltitrexed; ramosetrón; inhibidores de la ras farnesil proteína transferasa; inhibidores de la ras; inhibidor de ras-GAP; reteliptina desmetilada; renio Re 186 etidronato; rizoxina; ribozimas; retinamida RII; rohitukina; romurtida; roquinimex; rubiginona B 1; ruboxilo; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidor derivado de la senescencia 1; oligonucleótidos de sentido; inhibidores de la transducción de señales; sizofiran; sobuzoxano; borocaptato sódico; fenilacetato sódico; solverol; proteína de unión a somatomedina; sonermin; ácido esparfosico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; estipiamida; inhibidores de la estromelisina; sulfinosina; antagonista del péptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramina; swainsonina; tallimustina; metoduro de tamoxifeno; tauromustina; tazaroteno; tecogalán sódico; tegafur; telurapirilio; inhibidores de la telomerasa; temoporfina; teniposida; tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; mimético de la trombopoyetina; timalfasina; agonista del receptor de la timopoyetina; timotrinan; hormona estimulante del tiroides; etiopurpurina de estaño; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno; inhibidores de la traducción; tretinoína; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetrón; turosterida; inhibidores de la tirosina quinasa; trifostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor del crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas del receptor de la uroquinasa; vapreotida; variolina B; Vectibix (panitumumab)velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; Welcovorina (leucovorina); Xeloda (capecitabina); zanoterona; zeniplatino; zilascorb; y zinostatina stimalamer.

5.5.3 Tratamiento de la infección víricadivulgado en la presente como referencia; los "aspectos" o "realizaciones" divulgados en esta sección no son aspectos o realizaciones de la invención.

En la presente se divulga un método para tratar a un individuo que tiene una infección vírica, por ejemplo, una infección vírica activa o una infección vírica latente, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, el individuo tiene una deficiencia de células T, por ejemplo, una deficiencia de células T activas contra la infección vírica del individuo. En ciertas realizaciones, el individuo tiene demasiado pocas células T. En ciertas realizaciones, el individuo tiene células T con actividad suprimida. En ciertas otras realizaciones específicas, dicha administración comprende administrar un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, un compuesto inmunomodulador descrito anteriormente, o talidomida, a dicho individuo además de dichas células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente, en donde dicha cantidad es una cantidad que, por ejemplo, da como resultado una mejora detectable de, disminución de la progresión de, o eliminación de, uno o más síntomas de dicha infección vírica. En realizaciones específicas, la infección vírica es una infección por un virus de la familia del virus del papiloma humano (VPH). En realizaciones específicas, la infección vírica es el VPH. En realizaciones específicas, la infección vírica es un miembro de la familia del herpes. En realizaciones específicas, la infección vírica es el VEB. En ciertas realizaciones, la infección vírica es un miembro de la familia del virus de la hepatitis C (VHC). En ciertas realizaciones, la infección vírica es el VHC.

En otras realizaciones, las células T específicas de antígeno producidas mediante los métodos descritos en la presente se administran a un individuo que tiene una infección vírica como parte de un régimen de terapia antiviral que incluye uno o más agentes antivirales. En otras realizaciones, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente se administran a un individuo en riesgo de desarrollar una infección vírica como parte de un régimen de terapia antiviral que incluye uno o más agentes antivirales. Los agentes antivirales específicos que pueden administrarse a un individuo que tiene una infección vírica incluyen, pero no se limitan a: imiquimod, podofilox, podofilina, interferón alfa (IFNa), reticolos, nonoxinol-9, aciclovir, famciclovir, valaciclovir, ganciclovir, cidofovir; amantadina, rimantadina; ribavirina; zanamavir y oseltaumavir; inhibidores de la proteasa como indinavir, nelfinavir, ritonavir o saquinavir; inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa, como didanosina, lamivudina, estavudina, zalcitabina o zidovudina; e inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa, como nevirapina o efavirenz.

5.5.4 Administracióndivulgada en la presente como referencia; los "aspectos" o "realizaciones" divulgados en esta sección no son aspectos o realizaciones de la invención

Como se divulga en la presente, las células T, por ejemplo, células T específicas de antígeno, producidas usando los métodos descritos en la presente se usan, por ejemplo, se administran a un individuo, en cualquier cantidad 0 número que resulte en un beneficio terapéutico detectable para el individuo, por ejemplo, una cantidad eficaz, en donde el individuo tiene una infección vírica, cáncer o células tumorales, por ejemplo, un individuo que tiene células tumorales, un tumor sólido o un cáncer de la sangre, por ejemplo, un paciente con cáncer. Tales células pueden administrarse a dicho individuo en cantidades absolutas de células, por ejemplo, a dicho individuo se le pueden administrar aproximadamente, aproximadamente, por lo menos aproximadamente o como máximo aproximadamente, 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, o 1 x 1011 células T producidas usando los métodos descritos en la presente. En otras realizaciones, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente pueden administrarse a dicho individuo en números relativos de células, por ejemplo, pueden administrarse a dicho individuo aproximadamente, por lo menos aproximadamente, o como máximo aproximadamente, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, o 1 x 1011 células T producidas usando lo presente por kilogramo del individuo. En otras realizaciones, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente pueden administrarse a dicho individuo mediante números relativos de células, por ejemplo, a dicho individuo se le pueden administrar aproximadamente, por lo menos aproximadamente, o como máximo aproximadamente, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, o 5 x 108 células T producidas usando los métodos descritos en la presente por kilogramo del individuo.

En ciertas realizaciones, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente se administran a un sujeto de acuerdo con el área superficial del cuerpo del sujeto. En ciertas realizaciones, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente se administran a un sujeto a una dosis de 1 x 107 a 1 x 1010 células/m2. En ciertas realizaciones, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente se administran a un sujeto a una dosis de 5 x 107, 1,5 x 108,

4,5 x 108, 1,3 x 109, o 2 x 109 células/m2. En una realización específica, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente se administran a un sujeto a una dosis de 5 x 107 células/m2.

En una realización específica, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente se administran a un sujeto a una dosis de 1,5 x 108 células/m2. En una realización específica, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente se administran a un sujeto a una dosis de 4,5 x 108 células/m2. En una realización específica, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente se administran a un sujeto a una dosis de 1,3 x 109 células/m2. En una realización específica, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente se administran a un sujeto a una dosis de 2 x 109 células/m2. En otras realizaciones, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente se administran a un sujeto a una dosis de 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, o 1 x 1010 células por kilogramo.

En ciertas realizaciones, el sujeto se somete a leucaféresis antes de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, el sujeto recibe una primera terapia antes de la administración de las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, la primera terapia es quimioterapia. En realizaciones específicas, la primera terapia es 1, 2, 3, 4, 5 o 6 rondas de quimioterapia. En realizaciones más específicas, el sujeto recibe una ronda de quimioterapia antes de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En realizaciones más específicas, el sujeto recibe dos rondas de quimioterapia antes de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En realizaciones más específicas, el sujeto recibe tres rondas de quimioterapia antes de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En realizaciones más específicas, el sujeto recibe cuatro rondas de quimioterapia antes de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En realizaciones más específicas, el sujeto recibe cinco rondas de quimioterapia antes de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En realizaciones más específicas, el sujeto recibe seis rondas de quimioterapia antes de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente.

En ciertas realizaciones, después de la leucaféresis, las células T que se van a administrar al sujeto se fabrican, prueban y liberan para su uso en el transcurso de 28 días. En ciertas realizaciones, el sujeto se somete a un régimen de linfodepleción antes de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, el régimen de linfodepleción es de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 días. En realizaciones específicas, el régimen de linfodepleción es de 3 días. En ciertas realizaciones, el régimen de linfodepleción es un régimen de linfodepleción de único agente. En ciertas realizaciones, el régimen de linfodepleción es un régimen de linfodepleción de dos agentes. En ciertas realizaciones, el agente único es la ciclofosfamida. En ciertas realizaciones, los dos agentes son ciclofosfamida y fludarabina. En ciertas realizaciones, la ciclofosfamida se administra a 300 mg/m2/día. En realizaciones específicas, la ciclofosfamida se administra a 300 mg/m2/día durante tres días. En ciertas realizaciones, la ciclofosfamida se administra a 900 mg/m2/día. En realizaciones específicas, la ciclofosfamida se administra a 900 mg/m2/día durante tres días. En ciertas realizaciones, la ciclofosfamida se administra a 300 mg/m2/día y la fludarabina se administra a 30 mg/kg/día. En realizaciones específicas, la ciclofosfamida se administra a 300 mg/m2/día durante tres días y la fludarabina se administra a 30 mg/kg/día durante dos días. En ciertas realizaciones, la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente comienza 1, 2, 3, 4 o 5 días después del último día del régimen de linfodepleción.

En realizaciones específicas, la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente comienza dos días después del último día del régimen de linfodepleción.

En ciertas realizaciones, se administra acetaminofeno al sujeto antes de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, se administra difenhidramina al sujeto antes de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, se administran acetaminofeno y difenhidramina al sujeto

antes de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, se administra acetaminofeno al sujeto después de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En realizaciones específicas, el acetaminofeno se administra cuatro horas después de la administración de las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, se administra difenhidramina al sujeto después de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En realizaciones específicas, la difenhidramina se administra cuatro horas después de la administración de las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, el acetaminofeno y la difenhidramina se administran al sujeto después de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En realizaciones específicas, el acetaminofeno y la difenhidramina se administran cuatro horas después de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, se administra acetaminofeno al sujeto antes y después de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, se administra difenhidramina al sujeto antes y después de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, se administran acetaminofeno y difenhidramina al sujeto antes y después de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, el acetaminofeno se administra por vía oral. En ciertas realizaciones, la difenhidramina se administra por vía oral. En ciertas realizaciones, la difenhidramina se administra por vía intravenosa. En ciertas realizaciones, la difenhidramina se administra por vía intramuscular. En ciertas realizaciones, el acetaminofeno se administra a una dosis de 300-1000 mg. En realizaciones específicas, el acetaminofeno se administra a una dosis de 650 mg. En ciertas realizaciones, la difenhidramina se administra a una dosis de 10-40 mg. En realizaciones específicas, la difenhidramina se administra a una dosis de 25 mg. En una realización específica, el acetaminofeno se administra por vía oral a 650 mg y la difenhidramina se administra por vía oral a 25 mg tanto antes como después de la administración de células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente.

Las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente pueden administrarse una vez a un individuo que tiene una infección vírica, un individuo que tiene cáncer, o un individuo que tiene células tumorales (ya sean detectables o indetectables), durante un curso de terapia contra el cáncer; o pueden administrarse múltiples veces, por ejemplo, una vez cada 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 horas, o una vez cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, o una vez cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 24, 36 o más semanas durante la terapia. En realizaciones específicas, las células T producidas usando los métodos descritos en la presente se administran una vez a un individuo que tiene una infección vírica, un individuo que tiene cáncer, o un individuo que tiene células tumorales, durante un curso de terapia contra el cáncer. En realizaciones específicas, las células T producidas usando los métodos descritos en la presente se administran una vez a un individuo con riesgo de desarrollar una infección vírica, un individuo con riesgo de desarrollar cáncer, o un individuo con riesgo de desarrollar células tumorales, durante un curso de terapia contra el cáncer. En realizaciones específicas, las células T producidas usando los métodos descritos en la presente se administran una vez a un individuo para prevenir la recurrencia de una infección vírica, cáncer o células tumorales, durante un curso de terapia contra el cáncer. En realizaciones específicas, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente pueden administrarse una vez a un individuo que tiene una infección vírica cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 horas. En realizaciones específicas, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente pueden administrarse una vez a un individuo que tenga una infección vírica cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días. En realizaciones específicas, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente pueden administrarse una vez a un individuo que tenga una infección vírica cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 24, 36 o más semanas. En realizaciones específicas, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente pueden administrarse una vez a un individuo que tiene cáncer cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 horas. En realizaciones específicas, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente pueden administrarse una vez a un individuo que tiene cáncer cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días. En realizaciones específicas, las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente pueden administrarse una vez a un individuo que tiene cáncer cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 24, 36 o más semanas. En las realizaciones en las que se usan células y un compuesto antivírico o anticancerígeno, el compuesto antivírico o el compuesto anticancerígeno, y las células, pueden administrarse al individuo juntos, por ejemplo, en la misma formulación; por separado, por ejemplo, en formulaciones separadas, aproximadamente al mismo tiempo; o pueden administrarse por separado, por ejemplo, en diferentes programas de dosificación o a diferentes horas del día. Las células T específicas de antígeno producidas usando los métodos descritos en la presente pueden administrarse sin tener en cuenta si las células T producidas usando los métodos descritos en la presente se han administrado al individuo en el pasado. En una realización, las células T se administran al individuo antes de un segundo agente. En otra realización, se administra un segundo agente antes de las células T. En otra realización, las células T y el segundo agente se administran simultáneamente.

5.6 KITSdivulgados en la presente como referencia; los "aspectos" o "realizaciones" divulgados en esta sección no son aspectos o realizaciones de la invención

En la presente se divulga un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que comprenden una o más de las composiciones descritas en la presente, por ejemplo, una composición que comprende células T específicas de antígeno producidas por un método descrito en la presente. El kit puede usarse de manera independiente o puede usarse con maquinaria de producción celular automatizada para producir las células T descritas en la presente. Opcionalmente, asociado a dicho recipiente o recipientes puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, dicho aviso refleja la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, uso o venta para administración humana.

Los kits divulgados en la presente pueden usarse de acuerdo con los métodos descritos en la presente, por ejemplo, métodos de tratamiento del cáncer y/o métodos de tratamiento de infecciones víricas. En una realización, un kit comprende células T específicas de antígeno producidas mediante un método descrito en la presente o una composición del mismo, en uno o más recipientes. En una realización específica, en la presente se proporciona un kit que comprende una población de células T producida mediante un método descrito en la presente, o una composición del mismo. También se divulga en la presente un kit que comprende los componentes, por ejemplo, los medios o los componentes de los mismos, necesarios para producir las células T específicas de antígeno mediante los métodos descritos en la presente.

En una realización, un kit comprende (i) células T producidas por un método descrito en la presente o una composición del mismo, en uno o más recipientes, y (ii) acetaminofeno en uno o más recipientes, y/o (iii) difenhidramina en uno o más recipientes. En una realización, un kit comprende (i) células T producidas mediante un método descrito en la presente o una composición del mismo, en uno o más recipientes, y (ii) ciclofosfamida en uno o más recipientes, y/o (iii) fludarabina en uno o más recipientes. En una realización, un kit comprende (i) células T producidas por un método descrito en la presente o una composición del mismo, en uno o más recipientes, y (ii) acetaminofeno en uno o más recipientes, y/o (iii) difenhidramina en uno o más recipientes, y (iv) ciclofosfamida en uno o más recipientes, y/o (v) fludarabina en uno o más recipientes.

6. EJEMPLOS

En la presente se proporcionan datos sobre varios procesos descritos en la presente que pueden usarse para establecer una amplia variedad de posibles condiciones descritas en la presente. Los ejemplos específicos proporcionados no excluyen la posibilidad de otros ejemplos de trabajo.

6.1 Ejemplo 1: cócteles de inducción de APC

Se evaluaron combinaciones de cócteles de inducción de APC en la generación de células T del VPH (Tabla 2).

Tabla 2. Combinaciones de cócteles de inducción de APC

Las PBMC se cultivaron en G-REX® -24 desde la siembra inicial hasta la recogida final de células T. Se eliminó del proceso la PGE2. Las PBMC se incubaron con la citoquina de inducción de APC durante 3 días antes de la estimulación con HPV PEPMIX™. Los otros elementos del proceso en este experimento se enumeran en la Tabla 3.

T l . r r m r r l x rim n l l in i n AP .

continuación

El número de células se contó usando ViCELL XR después de la recogida en el día 13 después de la carga de antígeno. Como se muestra en la Figura 1, las células se expandieron en distinta medida bajo las mismas condiciones de inducción de APC en distintos donantes, variando entre aproximadamente 2 veces y 6 veces de expansión. La frecuencia y el rendimiento de las células T del VPH se muestran en las Figuras 2 y 3, respectivamente. El rendimiento de células T de VPH tiene en cuenta tanto el rendimiento celular total como la frecuencia de células T de VPH, lo que lo convierte en un factor razonable para la evaluación de las condiciones de cultivo. Por consiguiente, el rendimiento medio de células T de VPH se obtiene promediando el rendimiento de células T de las réplicas para la misma condición.

6.2 Ejemplo 2: Citoquinas de expansión

El diseño experimental de definición de las citoquinas de expansión usó los siguientes intervalos de concentración para cada citoquina: IL-4, 15ng/ml a 55ng/ml; IL-7, 10ng/ml a 50ng/ml; IL-15, 1ng/ml a 10ng/ml. También se incluyeron sin IL-4 (sólo IL-7+IL-15) y sin IL-15 (sólo IL-4+IL-7). Las condiciones detalladas se enumeran en la Tabla 4. El proceso usó 1 día de inducción de APC con CpG, sCD40L e IL-4 como se muestra en la Tabla 5. La dosis de PEPMIX™ usada fue de 1|jg/ml.

T l 4. m in i n

T l . n i i n in i n AP r l x rim n m in i n i in x n i n.

En la Figura 4 se ilustra la expansión celular total en el momento de la recogida. Las células T tuvieron una expansión significativamente menor a menor concentración de IL-15 (IL-15 =1ng/ml) que a concentraciones más altas (IL-15=5,5 o 10 ng/ml). No hubo diferencias entre la concentración de IL-15 a 5,5 ng/ml y 10 ng/ml. La condición sin IL-15 tuvo la menor expansión, mientras que la condición sin IL-4 no afectó a la expansión de las células T.

La frecuencia de células T se midió mediante ICCS (Figura 5). La ICCS mostró un amplio intervalo de variación en la frecuencia de células T en todos los donantes en diferentes condiciones de expansión de citoquinas. En todos los donantes, la condición sin IL-15 generó con éxito células T, pero a una frecuencia menor que en las demás condiciones. La condición con tres citoquinas en sus concentraciones más elevadas (IL-4=55ng/ml, IL-7=50ng/ml e IL-15=10ng/ml) tuvo menos variación en los duplicados y se situó en la lista superior de frecuencia de células T.

En la Figura 6 se ilustró el rendimiento de células T teniendo en cuenta tanto la expansión de células T como la frecuencia de células T,. Las condiciones sin IL-15 o con una concentración más baja (1ng/ml) de IL-15 generaron menos células T del VPH en todos los donantes. La condición con tres citoquinas en sus concentraciones más altas (IL-4=55ng/ml, IL-7=50ng/ml e IL-15=10ng/ml) tuvo el mayor rendimiento de células T y menos variación en los duplicados.

Además del ensayo ICCS, las citoquinas secretadas se midieron mediante una matriz de perlas 8-plex cytometrix (CBA). El panel incluía citoquinas Th1 (IL-2, IFN-<y>y TNF-a), citoquinas Th2 (IL-5, IL-13), Treg (IL-10) y citoquinas relacionadas con la función efectora de las células T (granzima B y GM-CSF). Las variaciones de los donantes se observaron en la cantidad y las variedades relativas a las citoquinas secretadas. La condición sin IL-4 secretaba una cantidad relativamente mayor de IFN-y, mientras que la condición sin IL-15 tenía la menor cantidad de IFN-y. La condición con tres citoquinas en sus concentraciones más altas (IL-4=55ng/ml, IL-7=50ng/ml e IL-15=10ng/ml) era una de las condiciones que presentaba citoquinas Th1 más altas y citoquinas Th2 o Treg más bajas.

También se midieron los marcadores de diferenciación de células T en 2 de los 4 donantes mediante tinción con anticuerpos y análisis con citómetro de flujo. Se determinó el porcentaje de Tcm, Tern y Teff dentro de la población de células T CD45RO positivas, como se muestra en la Figura 7. También se determinó la población de células T CD45RO+CD62Lhi (Figura 8), ya que se ha informado de que tiene una correlación positiva con la eficacia clínica en la terapia de células T adoptivas. Después de 12 días de expansión, la mayoría de las células T eran células T de efecto en uno de los donantes. Era difícil observar diferencias en sus marcadores de diferenciación en diferentes condiciones de citoquinas, ya que más del 80% de las células T eran efectoras. En el otro donante, se demostró claramente que una mayor concentración de IL-15 había impulsado una mayor diferenciación de las células T. La condición sin IL-15 tuvo mayor Tcm y menor Teff. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en las poblaciones CD45RO+CD62Lhi.

6.3 Ejemplo 3: Duración de la inducción de APC

Las PBMC congeladas se descongelan tres días seguidos y se tratan con el cóctel de inducción de APC como se muestra en la Tabla 6 para la estimulación simultánea de HPV PEPMIX™ tras diferentes duraciones de inducción de APC. Las PBMC se estimulan con el cóctel de inducción de APC durante 3 días en presencia o ausencia de 2ng/ml de IL-7. Las condiciones de inducción de APC se muestran en la Tabla 6. Las condiciones de inducción de APC se muestran en la Tabla 6, y las condiciones generales del experimento se enumeran en la Tabla 7.

Tabla 6. Condiciones de inducción de APC.

continuación

T l 7. r r m r x rim n l r l x rim n r i n l in i n APC.

El número de células se contó usando ViCELL XR tras la recogida en el día 12 después de la carga del antígeno. Como se muestra en la Figura 9, las células tratadas con IL-4 y CD40L generan el mayor rendimiento tras la estimulación con HPV PEPMIX™, mientras que las condiciones inducidas con GM-CSF e IFN-a muestran la menor expansión celular, independientemente de la duración de la inducción de APC. No hubo diferencias significativas en la capacidad de expansión celular entre las distintas duraciones de inducción de APC para un cóctel de inducción determinado, salvo que el rendimiento celular del donante N° 4 tras una inducción de 1 día es notablemente inferior al obtenido tras una inducción de 2 o 3 días (Figura 9). La adición secuencial de componentes en el cóctel de IL-4/CD40L/CpG/GMCSF/IFN-a parece comprometer la expansión celular en comparación con la adición simultánea. La presencia de IL-7 durante la inducción de APC mejora mínimamente el rendimiento celular, si es que lo hace.

Las células T del VPH se identificaron usando ICCS. Frente a la tendencia de expansión celular, las células T generadas a partir de PBMC inducidas con GM-CSF e IFN-a mostraron la mayor frecuencia de células T del VPH en comparación con las células procedentes de otros tratamientos con cócteles de inducción de APC para una duración determinada de la inducción de APC (Figura 10). La adición secuencial del componente del cóctel de IL-4/CD40L/CpG/GMCSF/IFN-a mejora en mayor o menor medida la frecuencia de células T de VPH en presencia o ausencia de IL-7.

En la Figura 11 se muestra el rendimiento de células T del VPH. El patrón de rendimiento de células T en diferentes condiciones es similar al de la frecuencia de células T que se muestra en la Figura 10, aunque las diferencias son generalmente menores.

6.4 Ejemplo 4: Definición de la curva de crecimiento

El experimento se diseñó para abordar los siguientes objetivos mediante el uso de PBMC de 11 donantes sanos: definir la curva de crecimiento del proceso actual de células T, definir la duración de las señales de células T, definir la pureza de las células T en las recogidas de células T en diferentes días, explorar la dinámica de los marcadores de diferenciación de células T y generar materiales de producto para el análisis de micromatrices y la composición IP en múltiples donantes.

Para determinar la curva de crecimiento y el tiempo de duplicación celular, se trazó la media del número total de células de 11 donantes ±SD como se muestra en la Figura 12. El eje Y representa el número total de células y el eje X representa los días posteriores a la carga del antígeno. El tiempo de duplicación celular se calculó usando software en línea (http://www.doubling-time.com/compute.php?lang=en).

La viabilidad y el tamaño de las células se midieron mediante ViCell, y los resultados se muestran en la Figura 13. La viabilidad celular empezó a disminuir a partir del día 12 y fue mucho menor el día 16. El tamaño celular también disminuyó con la extensión del cultivo. El diámetro medio de las células en el día 12 era de aproximadamente 9 a 10 |jm, y descendió a 8 jm en el día 16.

El número de células, las veces de expansión, la frecuencia de células T y el rendimiento de células T se muestran en la Figura 14. El número total de células o las veces de expansión aumentaron con la extensión del cultivo de 12 a 16 días. El cambio medio de veces fue de aproximadamente 7 en el día 12 y alcanzó más de 10 veces en el día 16. No hubo cambios significativos sobre la frecuencia de células T entre el día 12 y el día 16. El rendimiento total de células T fue más alto el día 16 que el día 12 o el día 14, ya que la expansión celular fue mayor.

La pureza de las células T se definió mediante tinción con anticuerpos y análisis de citometría de flujo, usando el panel de pureza de células T CD19, CD56, CD3, CD11c, CD4 y CD8. Los resultados demostraron que la pureza de las células T era mayor del 85% en todos los donantes en el día 12 y aumentaba ligeramente con la extensión del cultivo. El pequeño porcentaje de células no T era principalmente de células NK y NKT. Las células B de todos los donantes fueron inferiores al 1%. La mayoría de las células T generadas a partir de este proceso fueron células T CD4, representando aproximadamente el 80%. La proporción de células T CD4/CD8 disminuyó con la extensión del cultivo. Consultar las Figuras 15 y 16.

También se comprobó el estado de diferenciación de las células T mediante tinción con anticuerpos y análisis de citometría de flujo usando el panel de diferenciación de células T CD3, CD62L, CD4, CD27, CCR7 y Cd 45r O. Del día 12 al día 16 aumentó la población de células T de memoria CD45RO+. No hubo diferencias significativas en la población CD45RO+CD62Lhi entre el día 12, el día 14 y el día 16 (Figura 17). Dentro de la población CD45RO+, el porcentaje de células T de memoria central disminuyó, mientras que la población de células T efectoras aumentó (Figura 18).

Se generaron células T específicas para el antígeno del VPH a partir de los 11 donantes. Se determinó la curva de crecimiento; la fase logarítmica se situó entre 8 y 13 días. La pureza de las células T aumenta con la extensión del cultivo. La pureza de 10/11 donantes era mayor del 85% en el día 12. Después del día 14 fueron mayores del 90% para todos los donantes. Las poblaciones de células no T eran principalmente células NK y NK T, menos del 1% de células B. Hubo un aumento significativo de la expansión de células T y del rendimiento de células T desde el día 12 hasta el día 16, sin embargo acompañado de la disminución de la viabilidad celular y del tamaño celular, así como de un fenotipo más diferenciado.

6.5 Ejemplo 5: Densidad de siembra y concentraciones del cóctel de citoquinas

El propósito de este experimento era determinar la densidad óptima de siembra de PBMC y las concentraciones de trabajo del cóctel de citoquinas de inducción de APC para el cebado y la proliferación de células T de VPH. Se siembran PBMC nuevas a diferentes densidades en los pocillos de G-REX® -24 como se muestra en la Tabla 8.

Tabla 8. Condiciones de densidad de siembra de PBMC.

Como el área de la superficie inferior de un pocilio G-REX® -24 es de 2 cm2, la densidad de siembra de 1x107/pocillo, 5x106/pocillo y 2,5x106/pocillo equivale a 5x106/cm2, 2,5x106/cm2 y 1,25x106/cm2, respectivamente. Las células se tratan con el cóctel de inducción de APC IL-4 y CD40L a varias concentraciones durante 24 horas antes de la estimulación con HPV PEPMIX™. En la Tabla se enumeran 9 las condiciones generales del experimento.

T l . r r m r r l x rim n n i i m r PBM .

Los tres donantes muestran la misma tendencia de que el rendimiento celular total es positivamente proporcional a la densidad de siembra, mientras que las veces de expansión es inversamente proporcional a la densidad de siembra. No se observa un impacto significativo de las diferentes concentraciones de lL-4 y CD40L en el cambio de veces de expansión.

También se analiza la frecuencia de células T de VPH (Figura 19). En general, la mayor frecuencia de células T del VPH se genera a partir de la condición en la que las PBMC se siembran a la densidad más alta (1x107/pocillo). La frecuencia de células T de VPH es positivamente proporcional a la densidad de siembra. No hay un patrón claro en cuanto a la influencia de las diferentes concentraciones de IL-4 o CD40L en la frecuencia de células T de VPH en los tres donantes.

En la Figura 20 se muestra el rendimiento de las células T del VPH. El patrón de rendimiento de células T del VPH es comparable al de la frecuencia de células T del VPH. El impacto de la diferente densidad de siembra es más pronunciado en el rendimiento de células T que en la frecuencia de células T, lo que se atribuye al efecto añadido tanto del rendimiento de células como de la frecuencia de células T. Todas las condiciones con una densidad de siembra de 1x107/pocillo son superiores a otras condiciones con densidades de siembra más bajas en todos los donantes excepto en una condición del donante N° 1. El análisis estadístico realizado entre las 6 condiciones de inducción de APC con la densidad de siembra a 1x107/pocillo no muestra diferencias significativas (P>0,05).

Los resultados presentados en la presente muestran que la densidad de siembra a 5x106/cm2 (1x107/pocillo) genera el mayor rendimiento de células T de VPH, y la concentración de trabajo de IL-4 y sCD40L es de 10-40ng/ml y 0,25-4|jg/ml, respectivamente.

6.6 Ejemplo 6: Caracterización del proceso

En la presente se investigaron ciertos elementos del proceso. Los medios IMDM y de células T se usan durante la inducción de APC a efectos comparativos. HPV PEPMIX™ se ha usado a 1jg/ml para cada uno de los 4 tipos de HPV PEPMIX™ en experimentos de definición anteriores. En este experimento, las HPV PEPMIX™ se dosifican a 0,5, 1 y 2 jg/m l para determinar la dosis óptima. El momento de la suplementación inicial de citoquinas para la expansión de células T también se define retrasando la adición de IL-4/IL-7/IL-15 hasta 2 horas, 24 horas y 48 horas después de la carga de HPV PEPMIX™. También se evalúa la presencia de IL-4 durante toda la expansión de células T, o su interrupción tras la alimentación inicial cuando se añade la citoquina de expansión de células T tras un retraso de 48 horas. El diseño del experimento se resume en la Tabla 10. Las condiciones generales del experimento se muestran en la Tabla 11.

T l 1 . n i i n x rim n l r l r n r l.

T l 11. r r m r r l x rim n l r l l.

Para el cóctel de inducción de APC, se usan IL-4 y CD40L a 10ng/ml y 1jg/ml, respectivamente. Además, se siembran PBMC a 1x107/pocillo. Las células T de VPH se expanden durante 12 días.

Además de la ICCS, también se mide el perfil de citoquinas en las células T tras la reestimulación con antígeno usando una matriz de perlas citométricas. En la Tabla 12 se enumeran las citoquinas medidas.

T l 12. i in m i n l rfil i in r l im l i n n ní n

El factor de transcripción para Th1 (T-bet), Th2 (GATA-3), y Treg (FoxP3) también se analizan en las células T recogidas después de la finalización del proceso.

Las células T se recogen el día 12 tras la estimulación con HPV PEPMIX™. Las células viables se cuentan usando ViCell como se describe en el procedimiento del experimento. Los resultados de las veces de expansión celular se muestran en la Figura 21.

Los resultados muestran que se obtiene un mayor número de veces de expansión celular en la condición en la que se usa el medio de células T como medio de inducción de APC en todos los donantes. Además, las veces de expansión celular es inversamente proporcional a la duración del retraso de la citoquina. Además, la interrupción de la IL-4 mejora ligeramente la expansión celular. En los donantes N° 1 y N° 2, el VpH PEPMIX™ dosificado a 0,5 y 1|jg/ml no muestra un efecto evidente sobre la capacidad de expansión celular, mientras que 2|jg/ml de VPH PEPMIX™ parece comprometer el rendimiento celular. La primera alimentación de citoquina de expansión de células T y de medio a las células que reciben 0,5 y 2jg/m l de PEPMIX™, se omite en el donante N° 3, por lo que la comparación con 1jg/ml no se realiza en todo el experimento para este donante.

Se analiza la frecuencia de células T de VPH y se muestra en la Figura 22. Se obtiene una mayor frecuencia de células T de VPH en muchas condiciones en las que se usa el medio IMDM como medio de inducción de APC en todos los donantes, especialmente en el caso de que la frecuencia de células T de VPH sea generalmente baja para un donante dado, como el donante N° 2. Además, la frecuencia de células T del VPH es positivamente proporcional a la duración del retraso de la citoquina en el donante N° 1. Para el donante N° 2 y el N° 3, las diferencias de la frecuencia de células T del VPH entre los distintos retrasos de citoquinas no son evidentes, excepto que los retrasos de 24 y 48 horas generan células T del VPH ligeramente superiores que los retrasos de 2 horas en el donante N° 3. La interrupción de IL-4 mejora ligeramente la frecuencia de células T del VPH cuando se usa IMDM para la inducción de APC, pero esta mejora no se muestra en la condición en la que se usa medio de células T para la inducción de APC. HPV PEPMIX™ a 2jg/m l estimula la mayor frecuencia de células T de VPH en los donantes N° 1 y N° 2. La estimulación con HPV PEPMIX™ a 0,5jg/ml genera la frecuencia de células T de VPH más baja entre todas las condiciones probadas en el donante N° 1.

En la Figura 23 se muestra el rendimiento de células T del VPH. El rendimiento de células T muestra un patrón similar al de la frecuencia de células T de VPH. Se obtiene un rendimiento de células T del VPH ligeramente superior en muchas condiciones en las que se usa el medio IMDM como medio de inducción de APC en todos los donantes, especialmente en el caso de que la frecuencia de células T del VPH sea generalmente baja para un donante dado, como el donante N° 2. Además, el rendimiento de células T del VPH es positivamente proporcional a la duración del retraso de citoquinas en el donante N° 1. Para el donante N° 2 y N° 3, las diferencias de frecuencia de células T del VPH entre los distintos retrasos de citoquinas no son evidentes, excepto que los retrasos de 24 y 48 horas generan células T del VPH ligeramente superiores a los retrasos de 2 horas en el donante N° 3. La interrupción de IL-4 mejora ligeramente el rendimiento de células T del VPH cuando se usa IMDM para la inducción de APC, pero esta mejora no se muestra en la condición en la que se usa medio de células T para la inducción de APC. HPV PEPMIX™ a 2jg/m l estimula un rendimiento de células T de VPH ligeramente superior al de su homólogo a 1jg/ml en los donantes N° 1 y N° 2. La estimulación con HPV PEPMIX™ a 0,5jg/ml genera la frecuencia de células T de VPH más baja entre todas las condiciones probadas en el donante N° 1.

Varias condiciones de este experimento están diseñadas específicamente para evaluar la producción de IFN-Y de citoquina Th1 por parte de las células T del VPH cebadas; por lo tanto, además del análisis de las células T del VPH totales, también realizamos un análisis de las células T del VPH productoras de IFN-<y>. En la Figura 24 se muestran los resultados de la frecuencia de células T del VPH productoras de IFN-y. A diferencia de la tendencia en la frecuencia total de células T de VPH de la Figura 22, la mayoría de las células cultivadas con IMDM para la inducción de APC generan una frecuencia de células T productoras de IFN-<y>mayor que su cultivo homólogo con medios de células T durante la inducción de APC. Las células T productoras de IFN-<y>son casi indetectables en las células del donante N° 2. En las condiciones de inducción IMDM, el retraso de 24 horas en la adición de citoquinas muestra una influencia comparable en la frecuencia de células productoras de IFN-y a la del retraso de 48 horas en la adición de citoquinas, si no superior. La retirada de IL-4 durante la expansión de células T en condiciones de inducción de IMDM mejora ligeramente la frecuencia de células T productoras de IFN-y en todos los donantes analizados.

También se miden las citoquinas secretadas por las células T del VPH tras la reestimulación con antígenos. Para descubrir qué subconjunto de células T auxiliares, células Th1 o Th2 auxiliares, es dominante en el producto de células T del VPH en diferentes condiciones de cultivo, se obtiene la proporción Th1/Th2 dividiendo el nivel representativo dede la citoquina Th1 por el nivel representativo de IL-5 de la citoquina Th2 (Figura 25). Cuanto mayor sea la relación Th1/Th2, más dominante será la respuesta de Th1 en el microambiente. En general, las células cultivadas con IMDM para la inducción de APC muestran una relación Th1/Th2 mayor que las cultivadas con medios de células T. Las células cuya adición de citoquinas de expansión se retrasó hasta 24 horas muestran una relación Th1/Th2 más elevada que las cultivadas con un retraso de 48 horas.

Para evaluar adicionalmente el efecto de los medios de inducción de APC e IL-4 continua presente durante la expansión de células T en la diferenciación de subconjuntos de células T, se examinan los factores de transcripción para Th1 (T-bet), Th2 (GATA-3) y Treg (FoxP3) en condiciones en las que no se proporciona el cóctel de citoquinas de expansión de células T hasta 48 horas después de la estimulación con HPV(Figura 26). Las células cultivadas con medios de células T durante la inducción de APC muestran una frecuencia ligeramente más alta de células CD4+T-bet+ Th1 que las cultivadas con IMDM. No hay un patrón claro en cuanto al impacto de los medios de inducción de APC sobre la frecuencia de células CD4+GATA-3+ Th2, por lo que el patrón de la proporción de Th1/Th2 también es compatible con la frecuencia de Th1. Además, se obtiene un porcentaje ligeramente más alto de Treg en cultivos con IMDM como medio de inducción de APC. El efecto de la retirada de la IL-4 durante la expansión de células T muestra una clara mejora de la frecuencia de Th1 y una reducción de la frecuencia de Th2, lo que resulta en una elevada proporción de Th1/Th2 en comparación con la condición de contrapartida en la que la IL-4 está presente durante toda la fase de expansión de células T. Esto sugiere que la retirada de IL-4 sesga la respuesta de las células T hacia Th1.

6.7 Ejemplo 7:Ejemplo de protocolos de producción de células T

Este Ejemplo describe varios protocolos para producir células T específicas de antígeno.

Protocolo 1: Se obtiene una unidad de leucaféresis de un individuo. Las PBMC se aíslan de la unidad y se congelan en una formulación que comprende un 40% v/v de HSA y un 5% de DMSO en Plasma-Lyte™. En el Día 0, las PBMC se descongelan, se cultivan y se inicia la inducción de APC en placas de 6 pocillos en medio IMDM que comprende IL-4 (10 ng/ml) y CD40L (1 pg/ml). El día 1, las células T de las PBMC se activan usando un medio de células T que comprende una PepMix derivada de por lo menos un antígeno viral o tumoral a 1 pg/ml. El día 2, las células T se expanden en un medio de células T que contiene 55 ng/ml de IL-4, 50 ng/ml de IL-7 y 9 ng/ml de IL-15. Los días 5, 8 y 11, el medio se sustituye por medio de células T que comprende 50 ng/ml de IL-7 y 9 ng/ml de IL-15. El día 13, las células T se recogen, se concentran en una centrifugadora y se lavan por lo menos una vez en Plasma-Lyte™ con un 10% v/v de HSA. A continuación, las células se vuelven a suspender en Plasma-Lyte™ con un 10% v/v de HSA y un 6% p/v de Dextran-40, y se diluyen hasta una concentración celular final de 1-20 x 106 células/ml en una solución con medio RPMI (32% v/v), 12,5% p/v de HSA y 5% v/v de DMSO. A continuación, las células se congelan para su envío al punto de entrega.

Protocolo 2: Se obtiene una unidad de leucaféresis de un individuo. Las PBMC se aíslan de la unidad y se congelan en una formulación que comprende un 40% v/v de HSA y un 5% p/v de DMSO en Plasma-Lyte™. El Día 0, las PBMC se descongelan y se cultivan y se inicia la inducción de APC en un matraz de cultivo G-REX de 100 ml en medio IMDM que comprende IL-4 (10 ng/ml) y CD40L (1 pg/ml). El día 1, las células T de las PBMC se activan usando un medio de células T que contiene una PepMix derivada de por lo menos un antígeno viral o tumoral a 1 pg/ml. El día 2, se retira el medio y las células T se expanden en un medio de células T de reemplazo que contiene 55 ng/ml de IL-4, 50 ng/ml de IL-7 y 9 ng/ml de IL-15. El día 5, el medio se sustituye por medio de células T que contiene 50 ng/ml de IL-7 y 9 ng/ml de IL-15, y las células se cultivan durante siete días más. El día 13, se recogen las células T, se concentran en una centrífuga y se lavan por lo menos una vez en Plasma-Lyte™ con un 10% v/v de HSA. A continuación, las células se vuelven a suspender en Plasma-Lyte™ con un 10% v/v de HSA yun 6% p/v de Dextrano-40, y se diluyen en la misma solución hasta una concentración celular intermedia de 8-35 x 106 células/ml. Después de pasar las células por un colador en línea de 60 pm, las células se llevan a una concentración celular final de 1-20 x 106 células/ml en una solución que comprende Plasma-Lyte™ (32% v/v), 0,17% p/v de NaCl, 5,5% p/v de Dextran-40, 10% de p/v HSA, y 5% v/v de DMSO. A continuación, las células se congelan para su envío al punto de entrega.

Protocolo 3: Se obtiene una unidad de leucaféresis de un individuo. Las PBMC se aíslan de la unidad, se lavan y se congelan en una formulación que contiene un 40% v/v de HSA y un 5% p/v de DMSO en Plasma-Lyte™. El día 0, las PBMC se descongelan y se cultivan y se inicia la inducción de APC en un biorreactor WAVE de 100 ml en medio IMDM que comprende IL-4 (10 ng/ml) y CD40L (1 pg/ml). El día 1, las células T de las PBMC se activan usando un medio de células T que contiene una PepMix derivada de por lo menos un antígeno viral o tumoral a 1 pg/ml. El día 2, se retira el medio y las células T se expanden en un medio de células T de reemplazo que contiene 55 ng/ml de IL-4, 50 ng/ml de IL-7 y 9 ng/ml de IL-15. El día 5, el medio se sustituye por medio de células T que comprende 50 ng/ml de IL-7 y 9 ng/ml de IL-15, y las células se cultivan durante siete días más. El día 13, las células T se recogen, se concentran y se lavan por lo menos una vez en Plasma-Lyte™ con un 10% v/v de HSA usando un sistema de procesamiento celular Lovo (Fresenius Kabi). A continuación, las células se vuelven a suspender en Plasma-Lyte™ que contiene un 10% v/v de HSA y un 6% p/v de Dextran-40, y se diluyen hasta una concentración celular intermedia de 8-35 x 106 células/ml en la misma solución. Después de pasar las células por un colador en línea de 60 |jm, las células se llevan a una concentración celular final de 1-20 x 106 células/ml en una solución que comprende Plasma-Lyte™ (32% v/v), 0,17% p/v de NaCl, 5,5% p/v de Dextran-40, 10% p/v de HSA, y 5% v/v de DMSO. A continuación, las células se congelan para su envío al punto de entrega.

Protocolo 4: Se obtiene una unidad de leucaféresis de un individuo. Las PBMC se aíslan de la unidad, se lavan usando una centrífuga Cell Saver 5 y se congelan en una formulación que contiene un 10% p/v de HSA y un 5% v/v de DMSO en Plasma-Lyte™ (32% v/v). El Día 0, se descongelan las PBM<c>, se cultivan y se inicia la inducción de APC en un dispositivo de cultivo Grex de 100ml en medio IMDM que comprende IL-4 (10 ng/ml) y CD40L (1 jg/ml). El Día 1, las células T dentro de las PBMC se activan en el dispositivo Grex usando un medio de células T que comprende una PepMix derivada de por lo menos un antígeno viral o tumoral a 1 jg/ml, por ejemplo, PepMixes de proteínas HPV16 y HPV18 E6 y E8 a 1 jg/m l cada una. En el Día 2, las células T se expanden en medio de células T de reemplazo (añadido al medio existente) que comprende 55 ng/ml de IL-4, 50 ng/ml de IL-7 y 9 ng/ml de IL-15. En los días 5, 8 y 11, el medio se suplementa en el mismo dispositivo Grex con medio de células T que comprende 50 ng/ml de IL-7 y 9 ng/ml de IL-15. En el Día 13, se recogen las células T y se lavan por lo menos una vez en Plasma-Lyte™ con un 10% v/v de HSA usando un sistema de procesamiento celular Lovo (Fresenius Kabi). A continuación, las células se vuelven a suspender en Plasma-Lyte™ que contiene un 10% p/v de HSA y un 6% p/v de Dextran-40, y se diluyen hasta una concentración celular intermedia de 8-35 x 106 células/ml en la misma solución. A continuación, la suspensión celular resultante se filtra a través de un colador en línea de 60 jm y se diluye a -20 x 106 células/ml en una solución que comprende Plasma-Lyte™ al 32% v/v, Dextran-40 al 5,5% p/v, HAS al 10% p/v, NaCl al 0,17% p/v y DMSO al 5% v/v. A continuación, la suspensión celular se transfiere a una bolsa de almacenamiento celular y se congela para su uso posterior. Para los pasos anteriores, el dispositivo Grex puede sustituirse por un biorreactor WAVE™, una bolsa estática o similar.

6.8 Ejemplo 8: Caracterización funcional de células T

Se comprobaron las células T generadas como en el Ejemplo 7para determinar sus propiedades funcionales.

VPH16/18 en pacientes normales y con cáncer.Se generaron células T como se describe en el Ejemplo 7 a partir de cinco pacientes con cáncer de cuello de útero, un donante sano positivo para VPH 16 y VPH 18, y tres donantes sanos de estado desconocido respecto al VPH. A continuación, las células T se activaron con péptidos antigénicos E6 o E7 de tanto VPH 16 como VPH 18, o con péptidos antigénicos E6 y E7 tanto de VPH 16 como de VPH 18 (Fig. 27). Las células T de las pacientes con cáncer de cuello de útero respondieron tanto a los antígenos de VPH 16 como de VPH 18, pero especialmente a los antígenos de VPH 16. Las células T de los donantes sanos respondieron a los antígenos de VPH 18. Las células T de donantes sanos respondieron tanto a los antígenos de VPH 16 como a los de VPH 18, pero particularmente a los antígenos de VPH 16.

Eliminación de tumores in vitro.Se generaron células T como se describe en el Ejemplo 7 y luego se probaron contra objetivos autólogos u objetivos coincidentes con HLA-A2in vitroen proporciones de efector a objetivo de 2,5:1, 5:1, 10:1, 20:1 y 40: 1 (Fig. 28). Cuando los objetivos autólogos o coincidentes con HLA-A2 fueron pulsados con VPH, las células T mataron a los objetivos autólogos (Fig. 28A) y coincidentes con HLA-A2 (Fig. 28B). Sin embargo, cuando las células objetivo no fueron pulsadas con VPH, se observó poca o ninguna elimianción.

Especificidad del antígeno del VPH y actividad efectora.Se analizaron células de siete donantes antes (PBMC) y después (células T) de la generación de células T mediante los protocolos descritos en el Ejemplo 7. Se analizó la especificidad del antígeno de VPH midiendo la expresión de superficie de CD137 (Fig. 29A). La especificidad del antígeno de VPH se comprobó midiendo la expresión superficial de CD137 (Fig. 29A). La actividad efectora se midió en PBMC estimuladas por VPH y en células T estimuladas o no por VPH midiendo la secreción de IFN-y (Fig. 29B), GM-CSF (Fig. 29C) y TNF-a (Fig. 29D). Sólo las células T, y no las PBMC de las que derivaban, secretaban citoquinas Th1 proinflamatorias.

6.9 Ejemplo 9: Expresión génica por células T

Este Ejemplo detalla las diferencias de expresión génica entre PBMC obtenidas de pacientes y las células T específicas del VPH producidas por el método del Ejemplo 7, anterior, usando una PepMix que comprende péptidos derivados de las proteínas E6 y E7 del VPH16 y del VPH18.

El ARN se aisló de PBMC de pacientes y de células T obtenidas a partir de PBMC del mismo paciente. Los datos se generaron a partir del análisis de matrices de expresión génica usando una matriz Affymetrix U133A Plus 2.0 GeneChip®. Brevemente, se generaron perfiles de expresión génica de 20 líneas de células T (10 de células T de VPH y 10 de sus PBMC emparejadas). Los cambios de veces de la expresión génica se obtuvieron mediante la normalización con genes de mantenimiento (beta-2-microglobulina (B2M), hipoxantina fosforribosilotransferasa (HPRT) y proteína ribosómica grande (RPLPO)), seguida de la comparación de los niveles de expresión entre muestras. Se realizó una comparación por pares de la expresión génica entre las células T procedentes del VPH y las de PBMC emparejadas. Los genes que se expresaban diferencialmente entre los dos grupos se identificaron mediante análisis estadístico. Dentro de estos genes identificados, los que demostraron una diferencia de más de 5 veces (usado como punto de corte para eliminar algunos genes y cumplir el límite del software para el análisis) se introdujeron en IPA (Ingenuity Pathway Analysis-Biostatistic), que clasifica los genes en diferentes vías basándose en su base de datos de conocimientos.

Los genes sobreexpresados en las células T frente a las PBMC se enumeran en la Tabla 13 a continuación, y se identifican por el símbolo estándar del gen, el nombre del gen Entrez, el número de ID de Affymetrix y el ID del gen Entrez. La columna "Veces de cambio Exp" identifica el cambio de veces en la expresión del gen indicado en las células T frente a las PBMC. Además, los genes se agrupan de acuerdo con la vía particular de la que forman parte los genes.

Tabla 13. Genes sobreex resados en las células T frente a las PBMC

continuación

En un experimento separado, se generaron diez líneas de células T de VPH y células de control del proceso (células T no expuestas a una PepMix de VPH) usando PBMC de 10 donantes sanos. Las células T Pan se purificaron a partir de células T de VPH, células de control del proceso y PBMC de donantes coincidentes. Se realizó la extracción de ARN de las 30 muestras. El perfil de expresión génica de las células T purificadas se caracterizó usando la matriz U133A Plus 2.0 de Affymetrix. Las veces de cambio de la expresión génica se obtuvieron mediante la normalización con genes de mantenimiento (beta-2-microglobulina (B2M), hipoxantina fosforribosilotransferasa (HPRT) y proteína ribosómica grande (RPLPO)), seguido de comparación de los niveles de expresión entre muestras. Miles de genes se expresaron diferencialmente en las células T del VPH en comparación con sus PBMC coincidentes y/o las células de control del proceso. Se eligieron seis de los genes expresados diferencialmente para validarlos mediante PCR cuantitativa en tiempo real con ensayos de expresión génica TaqMan. Como comparador, se usaron células T no pulsadas (es decir, células T generadas en ausencia de las proteínas E6 y E7 de HPV16 y HPV18). En este experimento se identificaron seis genes con expresión diferencial: CCL18 (ligando 18 de quimiocina (motivo C-C)); CH13L1 (proteína similar a quitinasa 3); FN1 (Fibronectina 1); LYZ (Lisozima); RCHY1 (Dedo del anillo y dedo de zinc de CHY 1); y PALLD (proteína asociada a citoesqueleto, Paladina). CCL18,<c>H3L1, FN1 y P<a>LLD fueron significativamente (por lo menos 5 veces) regulados por incremento en la población de células T de VPH, y LYZ y RCHY1 fueron significativamente regulados por disminución (por lo menos 5 veces), en comparación con las células T de control no estimuladas de sus donantes correspondientes.

6.10 Ejemplo 10: Ensayo ELISPOT para células T en muestras de PBMC de pacientes

Este Ejemplo describe un ensayo para cuantificar células T específicas del VPH en muestras de PBMC de pacientes. El ensayo también puede usarse para revelar frecuencias y firmas de citoquinas de células T específicas de antígeno, por ejemplo, linfocitos T citotóxicos, y para cuantificar células T específicas de antígeno en respuesta a la estimulación de antígeno del VPH en PBMC.

Materiales: PBMC crioconservadas de pacientes; solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH7,2 (Invitrogen, N° de Cat. 20012027); Tween-20 (Sigma, N° de Cat. P2287); medio RPMI 1640 (ATCC, N° de Cat. ATCC30-2001); conjunto ELISPOT de IFN-y humano (BD Biosciences, N° de Cat. 551849) - componentes del conjunto: IFN-y antihumano NA/LE 51-2555KC purificado; IFN-y antihumano 51-1890KC biotinilado; Placas 51-2447KC ELISPOT BD; y Estreptavidina-HRP 51-9000209; Conjunto de reactivos de sustrato de AEC BD™ (BD Biosciences, N° de Cat. 551951); Medio CTL Anti-Aggregate Wash™ (CTL, N° de Cat. CTL-AA-005); Medio CTL-Test Plus (CTL, N° de Cat. CTLTP-005); y suero AB humano (Sigma, N° de Cat. :H3667-100ML).

Antígenos: Se prepara una solución de antígeno TAA en 100ug/ml cada uno en agua destilada usando cantidades iguales de PepTivator HPV16E6 (Miltenyi, N° de Cat. 130-095-998); PepTivator HPV16E7 (Miltenyi, N° de Cat. 130-096-000); PepTivator HPV18E6 (Miltenyi, N° de Cat. 130-096-006); PepTivator HPV18E7 (Miltenyi, N° de Cat. 130-096-007).

Equipo: ViCell (Beckman Coulter, Fullerton, CA); AID EliSpot Reader (AID GmbH, Strassberg, Alemania).

Preparación del medio y del tampón. Tampón de recubrimiento: el stock de anticuerpo de captura se diluye a 1:200 en PBS (Stock: IPNy antihumano NA/LE purificado, 1mg/ml). Tampón de Bloqueo: Se prepara suero Ab humano al 5% v/v en RPMI1640. Tampón de lavado I: se prepara 1x PBS con 0,05% de Tween-20, por ejemplo, añadiendo 0,5 ml de Tween-20 en 1 L de PBS. Tampón de lavado II: 1x PBS. Tampón de dilución: 1x PBS con 5% de suero AB humano. Solución de sustrato: No más de 15 minutos antes del uso, se mezcla una gota (20pl) de cromógeno AEC con cada 1 ml de sustrato AEC, y se mezcla concienzudamente.

Procedimientos experimentales: Los anticuerpos de captura específicos para IFN<y>se recubren en una placa de PVDF de 96 pocillos como se indica a continuación. El tampón de recubrimiento se prepara diluyendo el stock de anticuerpo de captura a 1:200 en PBS (Stock: IFNy antihumano NA/LE purificado, 1mg/ml). Las placas se recubren añadiendo 100pl de tampón de recubrimiento a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. A continuación, la placa se almacena a 4° C durante la noche. A continuación, la placa se bloquea con tampón de bloqueo. El tampón de bloqueo se prepara como suero AB humano al 5% en RPMI1640, por ejemplo, añadiendo 25 ml de suero AB humano en 475 ml de RPMI1640. El exceso de anticuerpo de recubrimiento se desecha. Se añaden 200 pl/pocillo de solución de bloqueo a cada pocillo y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente.

Luego, las células se activan con el antígeno del VPH. Placa de solución de antígeno: El antígeno del VPH se diluye en el medio CTL-Test Plus a 2 pg/ml, por ejemplo, para elaborar 5 ml de solución de antígeno añadiendo 25ul de solución madre de antígeno en 5 ml de medio. Se decanta el tampón de bloqueo y se añaden 50 pl de solución de antígeno en cada pocillo de la placa de 96 pocillos, y se incuba la placa a 37° C durante 10-20 minutos antes de colocar las células. Las PBMC se siembran descongelando las PBMC en un tubo cónico de 50 ml y diluyendo las células añadiendo lentamente medio antiagregante precalentado a 37° C. Las PBMC se centrifugan durante 5 minutos a 400 g, se decanta el sobrenadante y el sedimento celular resultante se vuelve a suspender en medio antiagregante. El número de células se determina usando el ViCell. Las PBMC se centrifugan y se vuelven a suspender en medio CTL-Test Plus a 20 millones de células por ml. Se realizan diluciones en serie 1,5 veces de la suspensión de PBMC de la concentración más alta en una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U, como se indica en la Tabla 14 a continuación. Cada concentración celular se realiza preferiblemente por triplicado.

Tabla 14. Dilución en serie de la sus ensión de PBMC

Se transfieren 50pl de PBMC en una densidad diferente a la placa de ensayo y se colocan inmediatamente en una incubadora a 37° C. A continuación, las placas se incuban durante 48 horas sin alteración. La citoquina capturada (IFNA<y>) se detecta usando IFN<y>antihumano biotinilado (anticuerpo de detección). La suspensión celular se aspira, los pocillos se lavan 2 veces con agua desionizada y 3 veces con 200 pl/pocillo de tampón de lavado I. El anticuerpo de detección a 1:250 se prepara en tampón de dilución para obtener una solución de anticuerpo de detección de 2 |jg/ml, añadiendo 400 |jl de 0,5 mg/ml de anticuerpo de detección en 100 ml de tampón de dilución. Se añaden 100 j l por pocillo y se incuba durante 2 h a temperatura ambiente.

La citoquina secretada se visualiza mediante el desarrollo de color usando conjugado enzimático 1:100 (estreptavidina-HRP) en tampón de dilución, añadiendo 100 jl/pocillo de reactivo enzimático diluido e incubando durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se desecha la solución de conjugado enzimático y se lavan los pocillos 4 veces con 200 jl/pocillo de tampón de lavado I, y 2 veces con 200 jl/pocillo de tampón de lavado II. A continuación, se añaden 100 j l de solución de sustrato final a cada pocillo y se monitoriza el desarrollo del color de 5 a 60 minutos. La reacción se detiene lavando los pocillos con agua desionizada y las placas se secan al aire hasta que estén completamente secas. Las manchas resultantes se enumeran con AID EliSpot Reader con un programa de lectura de manchas de IFNy seleccionado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

6.11 Ejemplo 11: Protocolo de estudio clínico

Este Ejemplo describe un estudio de seguridad de fase 1, multicéntrico, abierto, con escalado de dosis, de infusión de células T humanas derivadas de sangre periférica, expandidas en cultivo, autólogas, en sujetos con carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC) recurrente y/o metastásico VPH+ después de quimioterapia de primera línea con o sin radioterapia.

La terapia de primera línea a efectos de este estudio es el primer tratamiento administrado para el diagnóstico de enfermedad recurrente o enfermedad metastásica. El estudio inscribe hasta 84 sujetos. El estudio consiste en un Período de Selección Previo al Tratamiento Estándar, un Período de Tratamiento Estándar, un Período de Selección con Células T, un Período de Tratamiento con Células T (Día -4 a Día 0), que incluye un tratamiento de acondicionamiento de 3 días (Día -4 a Día -2), y una infusión de células T el Día 0, y un Período de Seguimiento que comienza el Día 1 hasta el momento de la enfermedad progresiva (PD). Un Período de Seguimiento a Largo Plazo comienza después de la PD o del inicio de la nueva terapia e incluye la recopilación de información para la supervivencia y las terapias adicionales administradas para el SCCHN cada tres meses hasta la muerte, la pérdida del seguimiento o la retirada del consentimiento, lo que se produzca primero. El tiempo de participación previsto para los sujetos es de cinco años.

Los sujetos tienen cáncer orofaríngeo recurrente y/o metastásico que es p16 y/o VPH-16 y/o VPH-18 positivo según se determina por inmunohistoquímica, reacción en cadena de la polimerasa o hibridación fluorescente in situ con ácido ribonucleico.

El objetivo primario del estudio es evaluar la seguridad y determinar la dosis máxima tolerada (MTD de las células T administradas por vía intravenosa (IV) en sujetos con HPV+ SCCHN recurrente y/o metastásico según la definición de las directrices de la National Comprehensive Cancer Network (NCCN).

Los objetivos secundarios del estudio son explorar la posible eficacia clínica evaluando la respuesta tumoral según las directrices de los Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST v 1.1), y evaluando la duración y la tasa de control de la enfermedad, la supervivencia sin progresión (PFS) y la supervivencia global (OS), y evaluar la tolerabilidad de los regímenes de linfodepleción preespecificados medidos según la seguridad.

El estudio investiga hasta 5 cohortes de niveles de dosis que utilizan un régimen de sólo ciclofosfamida baja (LD-Cy) para la linfodepleción. Una vez identificada la MTD de las células T, se investigan dos regímenes alternativos de linfodepleción, ciclofosfamida a dosis altas (HD-Cy) y ciclofosfamida y fludarabina (Cy-Flu).

Los sujetos se someten a leucaféresis con el propósito de fabricar células T. Después de que el sujeto se haya sometido a la leucaféresis, recibe terapia de primera línea según indicación médica, a discreción del médico tratante; por ejemplo, los sujetos pueden recibir hasta 6 ciclos de quimioterapia siguiendo las prácticas de atención estándar. Durante la terapia de primera línea, el sujeto se somete a una evaluación clínica y radiológica de la enfermedad por parte del médico tratante. Basándose en la totalidad de los datos, el médico tratante puede aconsejar al promotor que proceda a la fabricación de células T para el sujeto.

A continuación, las células T específicas del sujeto se fabrican, prueban y liberan para su uso en el transcurso de aproximadamente 28 días. La fabricación de las células T se realiza de acuerdo con los métodos descritos en la presente. Una vez que las células T se han fabricado y liberado con éxito para su uso, el sujeto puede iniciar el tratamiento, momento en el que queda a discreción del médico tratante, pero que tiene lugar una vez finalizada la quimioterapia de primera línea. Para tener en cuenta las variaciones en la duración de la terapia de primera línea y la posibilidad de progresión temprana, los sujetos pueden inscribirse en el estudio para leucaféresis sin una fecha conocida de tratamiento con células T.

El estudio inscribe hasta un máximo de 84 sujetos tratados con células T. No menos de 3 sujetos evaluables por toxicidad limitante de la dosis (DLT) son investigados en cada cohorte de nivel de dosis antes de cualquier recomendación de aumento de dosis. En caso de DLT, se amplía la cohorte y se investigan no menos de 6 sujetos evaluables por DLT antes de escalar la cohorte de nivel de dosis. En el caso de que se produzcan 2 DLT, se interrumpe la inscripción en esa cohorte específica, momento en el que se evalúa la recomendación de MTD. Debido a la variabilidad de la duración de la terapia de primera línea, y la posibilidad de que los sujetos no sean tratados con células T, no más de 18 sujetos pueden someterse a leucaféresis sin tratamiento de células T o terminación temprana en cualquier momento dado durante la fase de escalada del estudio. Una vez identificados el régimen de acondicionamiento y la MTD de células T, se inscribe una expansión de 18 sujetos para proporcionar información adicional de seguridad y contribuir a datos adicionales de eficacia.

El periodo de tratamiento con células T comienza con un régimen de linfodepleción de tres días que se inicia el Día -4 al Día -2. Inicialmente se utiliza un régimen de agente único, concretamente LD-Cy que incluye ciclofosfamida a 300 mg/m2/día administrada del Día -4 al -2. Las células T se administran el Día 0. Cada sujeto recibe una dosis única de células T, que puede requerir múltiples bolsas de infusión.

Los sujetos se asignan secuencialmente a una de hasta cinco cohortes de dosificación, sobre la base de la hora de entrada en el estudio:

• Nivel de dosis 1: 5,0 x 107 células/m2

• Nivel de dosis 2: 1,5 x 108 células/m2

• Nivel de dosis 3: 4,5 x 108 células/m2

• Nivel de dosis 4: 1,3 x 109 células/m2

• Nivel de dosis 5: 2,0 x 109 células/m2

Una vez identificada la MTD para las células T, se investigan en paralelo dos regímenes alternativos de linfodepleción basados en el momento de entrada en el periodo de tratamiento. HD-Cy, que incluye ciclofosfamida a una dosis más alta de 900 mg/m2/día durante tres días a partir del Día -4 al -2, o Cy-Flu, que incluye ciclofosfamida a 300 mg/m2/día durante tres días en combinación con fludarabina 30 mg/kg/día durante dos días a partir del Día -4 al Día-3.

Los sujetos se premedican con 650 mg de acetaminofeno por vía oral (PO) y 25 mg de difenhidramina (PO/IV/intramuscular [IM]) antes y aproximadamente 4 horas después de la infusión de células T. Se monitoriza a los sujetos durante por lo menos 24 horas tras finalizar la infusión de células T.

La decisión de aumentar el tamaño de la cohorte se basa en el número de acontecimientos DLT. Para la primera cohorte, no más de 1 sujeto puede comenzar el tratamiento en cualquier período de 14 días.

Se monitoriza a los sujetos estrechamente para detectar reacciones adversas durante la administración del régimen de tratamiento del estudio. Si se producen eventos adversos (AE) durante la infusión de células T, con potencial de convertirse en graves (definidos como criterios terminológicos Comunes para eventos adversos [CTCAE] National Cancer Institute [NCI]) Versión 4.03 de Grado 3 o superior; o intervención urgente indicada para prevenir el aumento de la gravedad con potencial de convertirse en potencialmente mortal), se interrumpe la infusión y se continúa el seguimiento de los sujetos.

Después de finalizar la administración de células T, se realiza un seguimiento de los sujetos hasta la PD. A partir de entonces, se realiza un seguimiento de la supervivencia de los sujetos hasta su fallecimiento, la pérdida del seguimiento o la retirada del consentimiento, lo que se produzca primero.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una población celular que comprende células T específicas de antígeno, opcionalmente linfocitos T citotóxicos (CTLs), que comprende los pasos de:

(a) cultivar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de un sujeto en un medio de inducción de células presentadoras de antígenos (APC) que comprende interleucina 4 (IL-4) y ligando de CD40 soluble (sCD40L) y/o que comprende factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) e interferón a (IFN-a), para producir una primera población de células;

(b) cultivar la primera población de células en presencia de uno o más antígenos, para producir una segunda población de células; y

(c) cultivar la segunda población de células en un medio de expansión de células T que comprende interleucina 7 (IL-7), interleucina 15 (IL-15) e IL-4, para producir una tercera población de células;

en donde la tercera población de células comprende células T que son CD3+ y específicas para el uno o más antígenos añadidos en el paso (b).

2. El método de la reivindicación 1, en donde la tercera población de células comprende células T que son adicionalmente CD4+; y/o adicionalmente CD8+.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende además un paso de cultivar la tercera población de células en un segundo medio de expansión de células T que comprende IL-7 e IL-15, pero que no comprende IL-4. para crear una cuarta población de células; en donde la cuarta población de células comprende células T que son CD3+ y específicas para uno o más antígenos añadidos en el paso (b).

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el uno o más antígenos son un conjunto de péptidos; preferiblemente en donde:

(i) el conjunto de péptidos cubre la secuencia completa de las proteínas humanas HPV16E6, HPV16E7, HPV18E6 y HPV18E7, y/o

(ii) los péptidos están a una concentración de 1 pg/ml.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el medio de inducción de APC comprende IL-4 y sCD40L; preferiblemente en donde el medio de inducción de APC comprende 8-12 ng/ml de IL-4 y 0,8-1,2 pg/ml de sCD40L; o preferiblemente en donde el medio de inducción de APC comprende 10 ng/ml de IL-4 y 1 pg/ml de sCD40L.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el medio de inducción de APC comprende además oligonucleótidos sintéticos con motivos de dinucleótidos de CpG no metilados; y/o en donde el medio de inducción de APC comprende además GM-CSF e IFN-a.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el medio de expansión de células T comprende 40 60 ng/ml de IL-7, 7-11 ng/ml de IL-15, y 45-65 ng/ml de IL-4; preferiblemente en donde el medio de expansión de células T comprende 50 ng/ml de IL-7, 9 ng/ml de IL-15, y 55 ng/ml de IL-4.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en donde el segundo medio de expansión de células T comprende 40-60 ng/ml de IL-7 y 7-11 ng/ml de IL-15; preferiblemente, en donde el segundo medio de expansión de células T comprende 50 ng/ml de IL-7 y 9 ng/ml de IL-15.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la duración del paso (a) es de 1-3 días, preferiblemente 1 día.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde las PBMC:

(i) se aíslan de sangre completa, capa leucocitaria o un producto de leucaféresis enriquecido; y/o

(ii) se siembran en el medio de inducción de APC a una densidad de 4-6 x 106/cm2, preferiblemente a una densidad de 5 x 106/cm2.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende además un paso de aislar células T que son CD3+ de la tercera población de células o de la cuarta población de células.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde las células CD3+ específicas de antígeno se identifican mediante tinción intracelular de citoquinas (ICCS).

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el paso (b) se realiza en el medio de inducción de APC.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde los pasos de cultivo se realizan en un dispositivo G-REX®.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde la duración del paso (c) es de 8-16 días, preferiblemente 12 días.