CN113005084A - 一种将体外富集的pbmc扩增活化cd8+t细胞群的方法 - Google Patents

一种将体外富集的pbmc扩增活化cd8+t细胞群的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供的一种将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法，包括以下步骤：从外周血中获取PBMC；采用无血清培养基将PBMC的密度调整为0.9×106～1.4×106cells/ml，吹打均匀接种到预包被细胞接种瓶中；然后向预包被细胞接种瓶中加入IFN‑γ，扩增第0天，将预包被细胞接种瓶放入培养箱中诱导刺激24h；扩增第1天，向预包被细胞接种瓶中加入IL‑2，至IL‑2的浓度为700U/ml；扩增第4天，加入新鲜X‑VIVO15无血清培养基，同时加入IL‑2和NaHCO3，至预包被细胞接种瓶中IL‑2的浓度为1000U/ml、NaHCO3的浓度为1.97g/ml；维持预包被细胞接种瓶中的PH值为7.35～7.45；然后用地西他滨活化CD8+T细胞群即可；本发明具有工艺简单、成本低，安全性好的优点，具有将体外富集的PBMC定向、高效的扩增活化为CD8+T细胞群的有益效果，适用于PBMC扩增活化的领域。

Description

一种将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法
技术领域
本发明涉及PBMC扩增活化的技术领域，具体涉及一种将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法。
背景技术
PBMC(外周血单个核细胞)，是指来源于外周血中的、具有单个核的白细胞。单个核细胞以淋巴细胞为主，包括少数单核细胞、浆细胞等。单个核细胞可以通过淋巴细胞分离液Ficoll-hypaque(聚蔗糖－泛影葡胺)密度梯度离心法或者6％羟乙基淀粉沉降法，从外周血中分离获得。
T细胞，又名T淋巴细胞，由一群功能不同的异质性淋巴细胞组成，其成分不均一、又不断在体内更新，在同一时间可以存在不同发育阶段或功能的亚群，分类原则和命名比较混乱，尚未统一。按照功能和表面标志可以分成辅助/抑制T细胞(CD4+)、细胞毒T细胞(CD8+)、自然杀伤性T细胞(CD3+CD56+)和记忆T细胞(Tcm)等组分。根据CD3、CD4、CD8、CD56等4个表型标志可以区分上述细胞亚群和组分。
CD8+T细胞又称细胞毒T淋巴细胞(CTL)。是发挥抗病毒、抗肿瘤最主要的一种特异T细胞。CD8+T细胞通过T细胞受体(TCR)特异性识别抗原，通过Fasl介导靶细胞的凋亡和释放各种细胞因子(例穿孔素，颗粒酶)杀伤靶细胞，参与免疫作用。是适应性免疫系统构建抗原特异性免疫保护机制的一条重要防线。
当前，在肿瘤免疫医学领域，各生物公司、三甲医院和科研院所等通过从人体外周血中分离富集单个核细胞，利用细胞工程、基因编辑等技术诱导、改造T细胞，并规模化扩增，然后静脉输注给患者进行抗病毒抗肿瘤的治疗，这种治疗选项称为过继性T细胞治疗。例如DC-CIK细胞技术、CAR-T细胞技术、TCR-T细胞技术。临床资料揭示，这种T细胞治疗可以使难治性的病毒感染(如CMV和EB病毒等)和恶性肿瘤(如黑色素瘤等)得到控制，取得明显的临床疗效。这种新颖的T细胞治疗被誉为是引领肿瘤治疗发展的一个前沿领域，受到了肿瘤医药界的高度关注。
然而，不管是一代LAK细胞、二代DC-CIK细胞还是三代CAR-T、TCR-T细胞技术，都是以高质量、高活性的CD8+T细胞为基础。除去以磁珠分选从外周血中获得高纯度的CD8+T细胞是很好的方法，然而这种制备方法成本高。临床更多以外周血来源规模化制备T细胞群。这样获得T细胞群包括粒细胞、B细胞、CD4+T细胞、血小板、NK细胞。而真正获得CD8+T细胞占淋巴细胞不足40％,占整体细胞比例将更低。
此外，通过传统制备方法获得的T细胞群抗肿瘤活性和功能有限，且不能避免肿瘤免疫耐受的缺陷和免疫“耗竭”的现象，使得对肿瘤细胞杀伤能力有限。人为设计基因编码、引入过多外源抗体、蛋白虽能提高T细胞的抗瘤活性，但造成成本、副作用的增加。
目前一些新型的引入外源刺激因子、工艺复杂、成本较高的特异性CD8+T制备方法。比如由特异性CD8相关抗原蛋白肽段激活CD8+T细胞TCR第1信号，或者由工程细胞等激活CD8+T细胞共刺激受体的第二2信号，或者通过磁珠富积CD8+T再扩增等方法。新型的抗原特异性CD8+T细胞制备方法复杂的体外操作、过多的外源性干预增加了CD8+T细胞的质量控制和安全性风险，不利于临床的大范围推广和研究。
因此，本领域迫切需要开发出一种新的低成本、高效率的方法，获得由PBMC向CD8+T细胞定向分化的足够数量、足够纯度的CD8+T细胞，同时体外增强其抗肿瘤活性和功能，提高治疗效果。
发明内容
针对相关技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题在于：提供一种工艺简单、成本低，安全性好的，能够将体外富集的PBMC定向、高效扩增活化CD8+T细胞群的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：本发明提供了一种将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法，包括以下步骤：1)从外周血中获取PBMC；
2)采用无血清培养基将PBMC的密度调整为0.9×106cells/ml～1.4×106cells/ml，吹打均匀，接种到预包被细胞接种瓶中；3)然后向预包被细胞接种瓶中加入IFN-γ，至预包被细胞接种瓶中IFN-γ的浓度为1000U/ml，同时按体积比加入10％的灭活自体血清；扩增第0天，将预包被细胞接种瓶放入培养箱中诱导刺激24h，所述培养箱中的温度为37℃，CO2的浓度为7.5％；扩增第1天，向预包被细胞接种瓶中加入IL-2，至预包被细胞接种瓶中IL-2的浓度为700U/ml，在温度为37℃、CO2浓度为5％的条件下继续培养；扩增第4天，T细胞异质群扩增开始，加入新鲜X-VIVO15无血清培养基，同时加入IL-2和NaHCO3，至预包被细胞接种瓶中IL-2的浓度为1000U/ml、NaHCO3的浓度为1.97g/ml；维持预包被细胞接种瓶中的PH值为7.35～7.45；4)活化CD8+T细胞群。
优选地，所述活化CD8+T细胞群的方法包括以下步骤：扩增第7天，T细胞大量分裂增值，进入对数生长期，向预包被细胞接种瓶中加入地西他滨，至预包被细胞接种瓶中地西他滨的浓度为10umol/L，继续培养5天，期间补充加入培养基和地西他滨，维持预包被细胞接种瓶中地西他滨的浓度为10umol/L。
优选地，所述从外周血中获取PBMC的方法包括以下步骤：1)采集60～80ml外周血；将采集的外周血均分至2个50ml的离心管中，以2000rmp的速度离心10min，得到上层血浆和下层血细胞；2)将上层血浆采集到50ml的离心管中，在温度为56℃的条件下水浴处理30min进行灭活；然后以3000rmp的速度离心10min；收集上清液A，将其置于温度为4℃的条件下保存；将沉淀物舍弃；所述上清液A即为灭活自体血清；
3)取步骤1)中得到的下层血细胞，按照下层血细胞：生理盐水为1：2的比例配制45ml，吹打均匀；然后鸡尾酒式的方法加入到3个盛有15ml Ficoll液的50ml离心管中，以2000rmp的速度离心20min；得到上清液B和白膜层；将上清液B舍弃，吸取白膜层的PBMC于50ml离心管中，以1600rmp的速度离心8min，收集离心管底部细胞；将离心管底部细胞用PBS溶液洗涤1次；然后以1200rmp的速度离心8min；再次收集离心管底部细胞；将再次收集的离心管底部细胞用PBS溶液洗涤2次；即可获得PBMC。
优选地，所述预包被细胞接种瓶的制备方法包括以下步骤：向T175培养瓶中加入包被液10ml；轻轻摇晃使包被液铺满培养瓶瓶底；将培养瓶用锡纸包裹起来，在温度为4℃的条件下放置24h，然后去除包被液；加入10ml不含Ca2+、Mg2+离子的PBS溶液洗涤瓶底两次即可。
优选地，所述预包被细胞接种瓶的制备方法中，包被液为浓度为0.5ug/ml的OKT3抗体和浓度为25ug/ml的重组纤维链接蛋白的PBS溶液。
本发明的有益技术效果在于：
1、在碱性环境PH为7.35～7.45的培养体系中，PBMC趋向CD8+T细胞方向分化，碱性环境有利于CD8+T细胞的生长。培养体系处于弱碱性环境中，不影响T细胞的生长，培养基颜色为浅红色。此外，弱碱环境还有利于代谢物质的排泄。
采用本发明的方法使得由PBMC培养制备的细胞群主要为CD8+T细胞群。其中T细胞占淋巴细胞群的比例在90％以上，CD8+T细胞占T细胞的70％以上，同时细胞总数量达到1×1010cells。高效地获得由PBMC向CD8+T细胞定向分化的足够数量、足够纯度的CD8+T细胞，同时体外增强其抗肿瘤活性和功能，可以进行大范围推广和研究。
采用本发明提供的将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法，具有工艺简单、成本低、引入外源蛋白少、有效性增强、安全性好的优点，能够将体外富集PBMC定向、高效扩增活化CD8+T细胞群。
2、本发明中加入了地西他滨，地西他滨是一种DNA甲基转移酶抑制剂，被批准用于治疗骨髓增生异常综合征和急性髓性白血病。体外低剂量地西他滨可持续诱导T细胞DNMT3a降解，它提供了一种修改耗竭相关DNA甲基化程序的方法，触发了T细胞的DNA重编程效应，使得T细胞表面不表达PD-1蛋白分子，同时增强T细胞释放IFN-γ、Gzma、PF/PFP等炎症因子的功能。从而能够提高肿瘤免疫原性，促进T细胞活化与增殖，增强机体抗肿瘤免疫应答。
3、本发明采用的从外周血中获取PBMC的方法简单，方便操作，能够将PBMC更好的从外周血中分离出来。
4、重组纤维链接蛋白片段和OKT3抗体可分别与T淋巴细胞上的VLA和TCR结合，两者共同作用激活酪氨酸激酶pp125FAK，通过Ras途径刺激T细胞的增殖和分化，使其获得上千倍的增殖。
附图说明
图1是本发明制备的CD8+T细胞群的表型特征图；
图2是普通CIK细胞群对人肝癌BEL-7402杀伤24h镜下10×形态图；
图3是本发明制备的CD8+T细胞群对人肝癌BEL-7402杀伤24h镜下10×形态图；
图4是本发明制备的CD8+T细胞群、传统方法制备的CIK细胞不同时间段对人肝癌BEL-7402杀伤率图；
图5是本发明制备的CD8+T细胞群释放细胞因子IFN-γ图；
图6是本发明制备的CD8+T细胞群镜下的形态图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
具体地，实施例中所采用的试剂均为市售。
本发明提供了一种将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法，包括以下步骤：
1)从外周血中获取PBMC；
2)采用无血清培养基将PBMC的密度调整为0.9×106cells/ml～1.4×106cells/ml，吹打均匀，接种到预包被细胞接种瓶中；
3)然后向预包被细胞接种瓶中加入IFN-γ，至预包被细胞接种瓶中IFN-γ的浓度为1000U/ml，同时按体积比加入10％的灭活自体血清；
所述灭活自体血清可以由从外周血中获取PBMC过程中得到；
扩增第0天，将预包被细胞接种瓶放入培养箱中诱导刺激24h，所述培养箱中的温度为37℃，CO2的浓度为7.5％；
扩增第1天，向预包被细胞接种瓶中加入IL-2，至预包被细胞接种瓶中IL-2的浓度为700U/ml，在温度为37℃、CO2浓度为5％的条件下继续培养；
扩增第4天，T细胞异质群扩增开始，加入新鲜X-VIVO15无血清培养基，同时加入IL-2和NaHCO3，至预包被细胞接种瓶中IL-2的浓度为1000U/ml、NaHCO3的浓度为1.97g/ml；维持预包被细胞接种瓶中的PH值为7.35～7.45；
4)活化CD8+T细胞群。
在碱性环境PH为7.35～7.45的培养体系中，PBMC趋向CD8+T细胞方向分化，碱性环境有利于CD8+T细胞的生长。培养体系处于弱碱性环境中，不影响T细胞的生长，培养基颜色为浅红色。此外，弱碱环境还有利于代谢物质的排泄。
采用本发明的方法使得由PBMC培养制备的细胞群主要为CD8+T细胞群。其中T细胞占淋巴细胞群的比例在90％以上，CD8+T细胞占T细胞的70％以上，同时细胞总数量达到1×1010cells。高效地获得由PBMC向CD8+T细胞定向分化的足够数量、足够纯度的CD8+T细胞，同时体外增强其抗肿瘤活性和功能，可以进行大范围推广和研究。
采用本发明提供的将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法，具有工艺简单、成本低、引入外源蛋白少、有效性增强、安全性好的优点，能够将体外富集PBMC定向、高效扩增活化CD8+T细胞群。
进一步地，所述活化CD8+T细胞群的方法包括以下步骤：扩增第7天，T细胞大量分裂增值，进入对数生长期，向预包被细胞接种瓶中加入地西他滨，至预包被细胞接种瓶中地西他滨的浓度为10umol/L，继续培养5天，期间补充加入培养基和地西他滨，维持预包被细胞接种瓶中地西他滨的浓度为10umol/L。
本发明中加入了地西他滨，地西他滨是一种DNA甲基转移酶抑制剂，被批准用于治疗骨髓增生异常综合征和急性髓性白血病。体外低剂量地西他滨可持续诱导T细胞DNMT3a降解，它提供了一种修改耗竭相关DNA甲基化程序的方法，触发了T细胞的DNA重编程效应，使得T细胞表面不表达PD-1蛋白分子，同时增强T细胞释放IFN-γ、Gzma、PF/PFP等炎症因子的功能。从而能够提高肿瘤免疫原性，促进T细胞活化与增殖，增强机体抗肿瘤免疫应答。
进一步地，所述从外周血中获取PBMC的方法包括以下步骤：
1)采集60～80ml外周血；将采集的外周血均分至2个50ml的离心管中，以2000rmp的速度离心10min，得到上层血浆和下层血细胞；
2)将上层血浆采集到50ml的离心管中，在温度为56℃的条件下水浴处理30min进行灭活；然后以3000rmp的速度离心10min；收集上清液A，将其置于温度为4℃的条件下保存；将沉淀物舍弃；所述上清液A即为灭活自体血清；
3)取步骤1)中得到的下层血细胞，按照下层血细胞：生理盐水为1：2的比例配制45ml，吹打均匀；
然后鸡尾酒式的方法加入到3个盛有15ml Ficoll液的50ml离心管中，以2000rmp的速度离心20min；得到上清液B和白膜层；
将上清液B舍弃，吸取白膜层的PBMC于50ml离心管中，以1600rmp的速度离心8min，收集离心管底部细胞；
将离心管底部细胞用PBS溶液洗涤1次；然后以1200rmp的速度离心8min；再次收集离心管底部细胞；将再次收集的离心管底部细胞用PBS溶液洗涤2次；即可获得PBMC。
本发明采用的从外周血中获取PBMC的方法简单，方便操作，能够将PBMC更好地从外周血中分离出来。
进一步地，所述预包被细胞接种瓶的制备方法包括以下步骤：
向T175培养瓶中加入包被液10ml；
轻轻摇晃使包被液铺满培养瓶瓶底；
将培养瓶用锡纸包裹起来，在温度为4℃的条件下放置24h，然后去除包被液；
加入10ml不含Ca2+、Mg2+离子的PBS溶液洗涤瓶底两次即可。
进一步地，所述预包被细胞接种瓶的制备方法中，所述包被液为浓度为0.5ug/ml的OKT3抗体和浓度为25ug/ml的重组纤维链接蛋白的PBS溶液。
重组纤维链接蛋白片段和OKT3抗体可分别与T淋巴细胞上的VLA和TCR结合，两者共同作用激活酪氨酸激酶pp125FAK，通过Ras途径刺激T细胞的增殖和分化，使其获得上千倍的增殖。
具体地，所述扩增第0天的期间不加入IL-2。
IL-2主要由T细胞或T细胞系产生，可分别促进T、B淋巴细胞、NK细胞等增殖与分化。但对静止T细胞作用较弱，且高剂量使用会产生自身免疫抑制，有利于刺激CD4+T(Th)、CD25、CD4T细胞的生长扩增。而体外富集的PBMC为T、B淋巴细胞、粒细胞、NK细胞、单核细胞等多种细胞组合，在OKT3、IFN-γ前过早加入不利于CD8+T细胞的分化和扩增。
具体地，所述重组纤维链接蛋白为RetroNection，由TAKARA公司制备。
为了证明本发明提供的体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法的有益效果，对制备的CD8+T细胞进行了检测。
1、制备的CD8+T细胞群的表型特征如表1所示：
表1 CD8+T细胞群的表型特征
细胞表面抗原 细胞类型 检测值(％) 标准要求
Lym 淋巴细胞 60.2 ≥50％
CD3+ 总T细胞 93.0 ≥80％
CD3+CD4+ T辅助/诱导细胞 3.58 ＜40％
CD3+CD8+(CD4-) T抑制/细胞毒细胞 89.2 ≥60％
CD4+/CD8+ CD4+与CD8+比值 0.04 ＜0.5
CD56+ 总NK细胞 34.9 ≥10％
CD3+CD56+ NK样T细胞 33.3 10％～30％
CD3+/HLA-DR+ 活化总T细胞 88.4 ≥80％
CD3+/HLA-DR- 静止总T细胞 4.50 ＜20％
HLA-DR+ MHC-Ⅱ类分子 93.47 ≥50％
图1是本发明制备的CD8+T细胞群的表型特征；如图1和表1所示，根据CD8+T细胞群的表型特征的检测结果可知，除NK样T细胞检测值稍高外，制备的CD8+T细胞群中各细胞的类型基本上能够达到标准的要求。
2、CD8+T细胞群质量检验
1)无菌检测：
吸取生长至第10天的CD8+T细胞群悬液0.5ml；移液管划S线接种于血平板琼脂培养基表面；血平板琼脂培养基可供绝大多数的具有不同代谢类型的微生物生长；将接种后的血平板琼脂培养基倒置放于霉菌培养箱内，在35℃～37℃的条件下培养72小时观察结果。
判断标准：阴阳性判断：有菌落生长或溶血环出现为阳性，反之则为阴性。
2)细菌内毒素检测：取生长第12天CD8+T细胞群进行内毒素检测；
取4支鲎试剂，分别标记阴性对照液、样本1、样本2、样本3，再取1支内毒素检查用水，向4支鲎试剂中分别加入0.2ml、0.1ml、0.1ml、0.1ml检查用水，轻轻振摇使鲎试剂完全溶解；向标记为样本1、样本2、样本3的3个试管中均加入待测样本液0.1ml，封闭管口，轻轻摇匀；垂直放入37℃的恒温器中温育60分钟±2分钟，温育期间避免振动。
判断标准：将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°。若管中的内容物呈坚实凝胶，不变形，不从管壁滑脱为阳性，记录为(+)；不呈凝胶或虽生成凝胶但不能保持完整并从管壁滑脱为阴性，记录为(-)。只有阴性对照管为阴性，3个样本管中两个以上为阳性，结果为阳性。
3)支原体检测：PCR法检测
取三个反应管，分别标记为阳性对照管、测试管和阴性对照管，各加入25μL的水化溶液，吹吸数次直到所有冻干粉剂彻底溶解；往阳性对照管中加入1μL阳性支原体DNA，测试管中加入1μL待测细胞培养液，阴性对照管不加；PCR仪上反应：参数如下：61℃，60min；20℃,∞；热盖温度，100℃。
注：在带热盖的PCR仪上进行反应，无需在反应管内加入矿物油。
判断标准：61℃反应60分钟后，立刻取出反应管，放于室温。以一张白纸或白色泡沫盒(优选白色泡沫)为背景，通过反应管溶液颜色的变化，即可判断检测结果。如果溶液为蓝绿色，则说明有支原体污染；如果为粉红色或紫红色，则说明没有支原体污染。
4)细胞计数和活率检测：取生长第12天CD8+T细胞群进行进行血细胞计数板计数和苔盼蓝活率检测；
细胞计数：收集细胞前，取0.5-1ml细胞悬液于1.5mlEP管中，将细胞悬液混匀，用血细胞分析仪进行测定，多测几次取平均值。活细胞比例检测方法：取1ml细胞悬液，用移液器混匀，从中取20ul混匀的细胞悬液，根据血细胞计数仪上测得的细胞密度，用生理盐水稀释至1-3×106cells/ml个细胞的密度，再从稀释液中取20ul加入另一EP管中，等体积加入20ul0.4％的台盼蓝溶液，充分混匀。从上述最终混匀液体中取出10ul滴于准备好的干净的血细胞计数板，然后用计数器进行计数。以计200-800个细胞为宜，计算活细胞比例。注：被染成蓝色的为死细胞。
细胞活率(％)＝活细胞个数/总细胞个数×100％；
上述CD8+T细胞群质量检验的检测结果如表2所示，
表2 CD8+T细胞群质量检验结果
Figure BDA0002981119330000081
Figure BDA0002981119330000091
由表2可知，采用本发明的制备方法制备出的CD8+T细胞群的无菌检测、细胞内毒素检测和支原体检测均符合检测标准，细胞数量与标准相比增加的幅度很大，且细胞的活率高。说明本发明提供的制备方法能够将体外富集PBMC定向、高效扩增活化CD8+T细胞群。
5)细胞杀伤实验：CCK-8法检测T细胞对肝癌BEL-7402杀伤，杀伤时间24h，效靶比8:1，计算公式：
Figure BDA0002981119330000092
图2是普通CIK细胞群对人肝癌BEL-7402杀伤镜下10×形态图；图3是本发明制备的CD8+T细胞群对人肝癌BEL-7402杀伤镜下10×形态图；如图2和图3所示，在倒置相差显微镜下，本发明制备的CD8+T细胞群和普通CIK细胞群对人肝癌BEL-7402杀伤镜下，效靶比为8:1，杀伤时间24h。
图4是本发明制备的CD8+T细胞群、传统方法制备的CIK细胞不同时间段对人肝癌BEL-7402杀伤率图；如图4所示，相比传统方法制备的CIK细胞，本发明制备的CD8+T细胞群的杀伤率提高了40％左右。说明本发明制备的CD8+T细胞群能够在体外增强抗肿瘤活性和功能。
6)细胞因子IFN-γ释放测定:ELISA法检测：
取1ml(1×106)的细胞悬液，1800rpm、5min离心，弃上清，加入400ulCIK新鲜培养液，再加入invitrogen刺激剂1ul，震荡混匀后，37℃，5％二氧化碳培养4-6小时；孵育完后取出100ul，加入invitrogen破膜固定剂1ml，震荡室温避光放置30min；加2mlBuffe液，震荡室温避光放置5min，1800rpm、5min离心；弃上清，加入：CD3-PercP10ul、IFN-γ-APC 5ul，震荡室温避光放置30min；加2mlBuffer液，震荡，1500rpm、5min离心；弃上清，加入PBS 150ul，震荡，过滤；上机。
图5是本发明制备的CD8+T细胞群释放细胞因子IFN-γ图；如图5所示，依次为传统方法制备的T细胞(CIK)、本发明制备的CD8+T细胞群、细胞表面PD-1分子被PD-1单抗(Sintilimab)封闭后的T细胞和HLA抗体预处理T细胞；说明采用本发明提供的方法增强了T细胞释放细胞因子IFN-γ的功能。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
可以理解的是，上述方法、装置及系统中的相关特征可以相互参考。另外，上述实施例中的“第一”、“第二”等是用于区分各实施例，而并不代表各实施例的优劣。
所述领域的技术人员可以清楚地了解到，为描述的方便和简洁，上述描述的系统和模块的具体工作过程，可以参考前述方法实施例中的对应过程，在此不再赘述。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)从外周血中获取PBMC；
2)采用无血清培养基将PBMC的密度调整为0.9×106cells/ml～1.4×106cells/ml，吹打均匀，接种到预包被细胞接种瓶中；
3)然后向预包被细胞接种瓶中加入IFN-γ，至预包被细胞接种瓶中IFN-γ的浓度为1000U/ml，同时按体积比加入10％的灭活自体血清；
扩增第0天，将预包被细胞接种瓶放入培养箱中诱导刺激24h，所述培养箱中的温度为37℃，CO2的浓度为7.5％；
扩增第1天，向预包被细胞接种瓶中加入IL-2，至预包被细胞接种瓶中IL-2的浓度为700U/ml，在温度为37℃、CO2浓度为5％的条件下继续培养；
扩增第4天，T细胞异质群扩增开始，加入新鲜X-VIVO15无血清培养基，同时加入IL-2和NaHCO3，至预包被细胞接种瓶中IL-2的浓度为1000U/ml、NaHCO3的浓度为1.97g/ml；维持预包被细胞接种瓶中的PH值为7.35～7.45；
4)活化CD8+T细胞群。
2.根据权利要求1所述的一种将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法，其特征在于：
所述活化CD8+T细胞群的方法包括以下步骤：
扩增第7天，T细胞大量分裂增值，进入对数生长期，向预包被细胞接种瓶中加入地西他滨，至预包被细胞接种瓶中地西他滨的浓度为10umol/L，继续培养5天，期间补充加入培养基和地西他滨，维持预包被细胞接种瓶中地西他滨的浓度为10umol/L。
3.根据权利要求1所述的一种将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法，其特征在于：所述从外周血中获取PBMC的方法包括以下步骤：
1)采集60～80ml外周血；将采集的外周血均分至2个50ml的离心管中，以2000rmp的速度离心10min，得到上层血浆和下层血细胞；
2)将上层血浆采集到50ml的离心管中，在温度为56℃的条件下水浴处理30min进行灭活；然后以3000rmp的速度离心10min；收集上清液A，将其置于温度为4℃的条件下保存；将沉淀物舍弃；所述上清液A即为灭活自体血清；
3)取步骤1)中得到的下层血细胞，按照下层血细胞：生理盐水为1：2的比例配制45ml，吹打均匀；
然后鸡尾酒式的方法加入到3个盛有15mlFicoll液的50ml离心管中，以2000rmp的速度离心20min；得到上清液B和白膜层；
将上清液B舍弃，吸取白膜层的PBMC于50ml离心管中，以1600rmp的速度离心8min，收集离心管底部细胞；
将离心管底部细胞用PBS溶液洗涤1次；然后以1200rmp的速度离心8min；再次收集离心管底部细胞；将再次收集的离心管底部细胞用PBS溶液洗涤2次；即可获得PBMC。
4.根据权利要求1所述的一种将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法，其特征在于：所述预包被细胞接种瓶的制备方法包括以下步骤：
向T175培养瓶中加入包被液10ml；
轻轻摇晃使包被液铺满培养瓶瓶底；
将培养瓶用锡纸包裹起来，在温度为4℃的条件下放置24h，然后去除包被液；
加入10ml不含Ca2+、Mg2+离子的PBS溶液洗涤瓶底两次即可。
5.根据权利要求4所述的一种将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法，其特征在于：所述预包被细胞接种瓶的制备方法中，所述包被液为浓度为0.5ug/ml的OKT3抗体和浓度为25ug/ml的重组纤维链接蛋白的PBS溶液。
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