CN106834228A - 一种体外扩增cd8+t细胞及其细胞亚群的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明建立了一种体外快速扩增CD8+T细胞及其功能性细胞亚群的方法。在常规培养扩增CD8+T细胞的体外培养体系中，增加TLR1/2激动剂、TLR2/6激动剂、TLR5激动剂或联合使用上述激动剂可显著提升CD8+T细胞的扩增效率；此外，TLR激动剂的使用可以使常规培养条件下难以扩增的功能性CD8+T细胞亚群得以扩增，如PD‑1+CD8+T细胞、TEM CD8+T细胞等；CD8+T细胞及其功能性细胞亚群在TLRs激动剂和重组细胞因子IL‑2、IL‑7、IL‑15以及抗人CD3抗体和抗人CD28抗体包被的磁珠的共同持续刺激下快速大量增殖。

Description

一种体外扩增CD8+T细胞及其细胞亚群的方法
技术领域
本发明属细胞生物学领域，具体涉及一种体外诱导扩增CD8+T细胞及其功能性细胞亚群的方法。
背景技术
CD8+T 细胞是参与抗肿瘤与抗感染免疫的重要效应细胞，活化的CD8+T 细胞可以迅速释放高浓度的IFN-γ、IL-2 等细胞因子，具有广泛的免疫调节作用。在急性感染中，CD8+T细胞接受抗原刺激后，活化并大量增殖，分化成效应性CD8+T细胞（CTL），通过分泌穿孔素和颗粒酶（Granzyme B）杀伤被感染的细胞，或通过Fas-FasL通路诱导被感染的细胞凋亡。当病原清除后，一小部分效应性CD8+T细胞分化成记忆性CD8+T细胞，当相同抗原再次出现时，机体里的记忆性CD8+T细胞会迅速增殖、分化成为效应CTL，进而清除感染的病原体。
CD8+T细胞也是机体抗肿瘤免疫的主要效应细胞之一，通过疫苗主动免疫诱导针对肿瘤特异抗原的CD8+T细胞应答是现代肿瘤免疫治疗的发展方向之一。然而，在正常机体能激发有效的CD8+T细胞应答的疫苗，在荷瘤机体中效果并不理想，这与多种免疫调节细胞或因子在肿瘤局部高度富集或高表达，导致肿瘤局部CD8+T细胞无能或耗竭进而形成免疫抑制的微环境相关。肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL)是从肿瘤组织中发现的肿瘤抗原特异性CD4+T与CD8+T等淋巴细胞群，其中CD8+T细胞具有肿瘤杀伤作用。TIL在肿瘤周围浸润的程度及CD8+T细胞所占的比例与肿瘤患者的良好预后呈明显正相关。
在慢性感染和肿瘤发生发展的过程中，抗原特异性的CD8+T细胞由于受到抗原持久的刺激，不能有效分化成记忆性T细胞而逐步演变成功能紊乱的一群细胞，称之为耗竭性CD8+T细胞。这群细胞表面持续性高表达PD-1抑制性受体，及CD244(2B4)，LAG-3，CD160，TIM-3，CTLA-4等抑制性受体。PD-1已被公认为是耗竭性T淋巴细胞的表面标志。研究发现：在慢性感染性疾病中，联合阻断PD-1与CTLA-4、PD-1与LAG-3、PD-1与Tim-3可部分恢复CD8+T细胞的生物学功能；对于肿瘤抗原特异性的CD8+T细胞，联合阻断PD-1和Tim-3，或PD-1和LAG-3，也同样可部分恢复CD8+T细胞功能。尽管阻断这些通路后可部分恢复耗竭性T细胞的功能，但未能使这些耗竭性T细胞逆转成非耗竭性T细胞，从而导致肿瘤复发与转移，不能达到根治的目的。
最近Rosenberg SA的研究表明：外周血中循环的PD1+CD8+T细胞能够特异性识别黑色素瘤抗原，并且与肿瘤局部表达PD-1的肿瘤侵润的特异性CD8+T具有相似的T细胞抗原受体（T cell receptor ,TCR），因此PD-1可以作为从外周血获取肿瘤特异性T细胞的一个生物标记。这为使用肿瘤特异性的淋巴细胞或TCR治疗癌症提供了新的非侵入性策略，并为发展个性化的治疗提供新的方法。
近几年, 免疫治疗发展非常迅速, 许多经体外扩增后回输患者体内的细胞疗法,如CAR-T、DC-CIK、NKT、NK细胞等不断涌现，相应细胞的培养和扩增方法也不断的改进和完善。目前扩增患者细胞主要的技术是使用一种或多种细胞因子如白细胞介素IL-2、IL-17、IL-15配合抗CD3抗体以及CD28抗体刺激细胞的增殖。如将艾滋病患者或肿瘤患者体内的CD8+T细胞分离出来，用CD3抗体、IL-2和IL-7刺激记忆性CD8+T细胞的体外扩增。与200 IU/ml 的IL-2 相比，在TIL体外扩增的培养体系中加入IL-15、IL-7各5 ng /ml 就可得到相同扩增倍数和体外功能的TIL。IL-15与IL-7够刺激T淋巴细胞的体外增殖，促进CD8+T细胞产生IFN-γ，维持中央记忆性CD8+T细胞的表型，并减少调节性T细胞（CD4+CD25+Treg）的数量，对肿瘤细胞能起到很好的控制作用。因此，低剂量IL-15与IL-7联合使用可代替高剂量IL-2 应用于TIL的体外扩增。黑素瘤TIL 扩增培养体系中加入抗CD3 抗体后可显著提高TIL扩增倍数。
然而，抗肿瘤免疫必备的特定功能性细胞亚群如PD-1+CD8+T细胞、TEM CD8+T细胞等，在常规培养条件下却难以扩增，迄今为止尚缺乏体外快速扩增PD1+CD8+T细胞的方法。文献报道从癌症患者中分选的PD1+CD8+T细胞体外扩增效率有限，而且扩增出的细胞具有分泌IFN-γ的能力的一般不足20%，难以满足抗肿瘤免疫与抗感染免疫的需求。如何进一步提升CD8+T细胞及其PD1+CD8+T细胞亚群的扩增效率、特别是有效扩增功能性CD8+T细胞的能力，以增强抗感染和抗肿瘤疗效是亟待解决的难题。
因此，快速高效的扩增CD8+T细胞及其功能亚群并回输至患者体内，将是疾病治疗的安全有效的方法，在保障技术安全性的同时，进一步提升肿瘤治疗的有效性。
发明内容
本发明所解决的技术问题是：建立一种CD8+T细胞及其功能性细胞亚群的扩增方法，尤其是对被认为是耗竭性的PD-1+CD8+T细胞进行扩增的方法。通过添加Toll样受体（Toll like receptor，TLR）激动剂，如TLR1/2激动剂、TLR2/6激动剂、TLR5激动剂或多种组合等，极大提升CD8+T细胞体外扩增效率，并有效扩增PD-1+CD8+T细胞等功能性细胞亚群。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供一种体外诱导扩增CD8+T细胞及其功能性CD8+T细胞亚群的方法，在CD8+T细胞及功能性CD8+T细胞亚群培养体系中添加一种Toll样受体激动剂或联合使用多种Toll样受体激动剂，配合抗人CD3抗体或抗人CD28抗体以及各种细胞因子刺激，能够显著提升CD8+T细胞及其功能性细胞亚群的扩增效率与功能修复。
其中，Toll样受体激动剂包括但不限于TLR1/2激动剂、TLR2/6激动剂、TLR5激动剂，以及TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9激动剂，所述激动剂可单独使用，也可联合使用。TLR1/2激动剂包括但不限于 Pam3CK4，TLR2/6激动剂包括但不限于FSL-1与Pam2CGDPKHPKSF，TLR5激动剂包括但不限于Flagellin。所述抗人CD3抗体或抗人CD28抗体包被于磁珠上进行使用。所述抗人CD3抗体可单独与TLR激动剂联合使用，也可与抗CD28抗组合后与TLR激动剂联合使用。所述细胞因子包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15，所述细胞因子可单独使用，也可联合使用，可同一时间加入培养，也可时间上先后加入培养体系。
此外，所述功能性CD8+T细胞亚群为分选纯化的PD-1+CD8+T细胞、分选纯化的CD137+CD8+T细胞、分选纯化的CD160+CD8+T细胞、分选纯化的纯真CD8+T细胞、分选纯化的中央记忆型CD8+T细胞、分选纯化的效应记忆型CD8+T细胞、分选纯化的效应CD8+T细胞、分选纯化的过渡记忆型CD8+T细胞、分选纯化的效应干细胞CXCR5+CD8+T细胞、分选纯化的组织记忆型CD8+T细胞。
优选的，对功能性CD8+T细胞亚群中的PD-1+CD8+T细胞进行体外扩增时，需要抗人CD3抗体和抗CD28抗体在培养体系中持续存在以持续刺激该亚群的扩增。
体外扩增CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞的具体步骤如下：
a.分离PBMC,使用不同荧光标记的抗人CD3抗体、抗人CD8抗体、抗人PD-1抗体标记PBMC;室温避光染色，使用染色液重悬细胞，离心清洗，用染色液重悬细胞；
b.使用流式细胞仪分选外周血单个核细胞中的CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞;
c.将上述细胞分选至96孔板中的细胞静置1小时，加入Pam3CK4（ 1-300ng/ml）、FSL-1（1-100ng/ml）、Flagellin（10-100ng/ml）、IL-7（20ng/ml~200ng/ml）、IL-2（10U/ml~100U/ml）、IL-15（10ng/ml~100ng/ml），抗人CD3抗体和抗人CD28抗体包被的磁珠，磁珠与细胞比例为1:1。放置37℃培养箱培养一周;
d. 第二周将96孔板中的细胞转移至24孔板，后续根据细胞生长多少，依次将细胞转移到T25细胞培养瓶、T75细胞培养瓶、T175细胞培养瓶; 每次更换培养皿时补充相应培养基和刺激剂,直至培养到所需的细胞数量。
CD8+T细胞和其它功能性CD8+T细胞亚群的来源包括但不限于健康人、HIV-1感染者或肿瘤患者外周静脉血，还包括各种淋巴细胞白血病、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、子宫癌、子宫颈癌、肾癌、胰腺癌、鼻咽癌、小肠癌、大肠癌、结直肠癌、膀胱癌、骨癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、横纹肌瘤、平滑肌瘤、脑瘤，以及HIV感染、HBV感染、HCV感染、结核杆菌感染。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明提供了一种体外扩增CD8+T细胞及其功能性细胞亚群的方法，通过添加一种TLR激动剂或联合使用多种TLR激动剂、重组人细胞因子IL-7、IL-2、IL-15、抗人CD3抗体以及抗人CD28抗体包被的磁珠，并维持上述刺激剂的持续刺激，能够显著提升CD8+T细胞扩增效率与功能修复，并且使得常规培养条件下难以扩增的CD8+T细胞亚群（如PD-1+CD8+T细胞、效应记忆性CD8+T细胞（TEM））得以扩增，获得可以维持该细胞亚群功能的细胞，且对扩增后的CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞进行细胞因子分泌能力检测结果显示能同时分泌CD107a和IFN-γ的CD8细胞比例有93.30%,能同时分泌CD107a和GranzymeB的CD8细胞比例有90.17%，远远高于现有技术。
附图说明
图1为 Toll样受体激动剂刺激健康人CD8+T细胞增殖情况示意图；其中，图A为空白对照和抗人CD3抗体+抗人CD28抗体条件下CD8细胞增殖的流式细胞仪检测图例；图B为不同刺激条件下增殖CD8细胞在总CD8+T细胞中所占比例，比例越高说明其增殖能力越强；
图2为Toll样受体激动剂刺激健康人CD8+T细胞亚群TCM、TEM的增殖情况示意图；纵坐标为增殖CD8细胞在总CD8+T细胞中所占比例，比例越高说明其增殖能力越强。TNaive: Naive Tcell、TCM: central memory T cell、TEM: effector memory T cell；
图3为Toll样受体激动剂刺激HIV-1感染者CD8+T细胞亚群TCM、TEM的增殖情况示意图；其中图A为抗人CD3抗体刺激增殖与加上不同TLR激动剂的增殖比较；图B为抗人CD3抗体、抗人CD3/28抗体及抗人CD3/CD28抗体联合不同TLR激动剂的增殖比较。A、B图纵坐标均代表增殖CD8细胞在总CD8+T细胞中所占比例，比例越高说明其增殖能力越强。
图4为分选后的健康人PD-1+CD8+T细胞在不同培养体系下的细胞增殖曲线；
图5显示了TLRs激动剂配合细胞因子和抗人CD3/28抗体刺激PD-1+CD8+T细胞和CD8+T细胞的增殖曲线；
图6分选的PD-1+CD8+T细胞体外增殖后分泌IFN-γ,Granzyme B,CD107a能力检测
A、PBMC分选PD-1+CD8+细胞的示意图。B、增殖产物中CD8+T细胞染色示意图。C、增殖产物分泌IFN-γ和CD107a的能力检测示意图。D、增殖产物分泌IFN-γ和Granzyme B的能力检测示意图；
图7. 间断刺激与连续刺激下PD-1+CD8+T细胞培养21天细胞增殖和功能检测示意图；其中图A为不同组别各群细胞占CD8细胞的比例，图B是不同组别各群细胞的绝对计数。分组说明见实施例10表1；
图8显示了肺癌患者PD-1+CD8+T细胞的扩增曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种体外扩增CD8+T细胞及其功能性细胞亚群的方法，通过添加一种TLR激动剂或联合使用多种TLR激动剂、重组人细胞因子IL-7、IL-2、IL-15、抗人CD3抗体以及抗人CD28抗体包被的磁珠，并维持上述刺激剂的持续刺激，能够显著提升CD8+T细胞扩增效率与功能修复，并且使得常规培养条件下难以扩增的CD8+T细胞亚群（如PD-1+CD8+T细胞、效应记忆性CD8+T细胞（TEM））得以扩增，获得可以维持该细胞亚群功能的细胞。
本发明中用于刺激CD8+T细胞的刺激剂有：TLR1/2激动剂、TLR2/6激动剂、TLR5激动剂，重组人细胞因子有IL-7、IL-2、IL-15，抗人CD3抗体和抗人CD28抗体包被的磁珠；CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞及其它功能性CD8+T细胞亚群的来源包括但不限于健康人、HIV-1感染者或肿瘤患者外周血；本扩增技术同样适用于利用其它分离方法获得的CD8+T细胞以及其它功能性CD8+T细胞亚群，如分选纯化的CD137+CD8+T细胞、分选纯化的CD160+CD8+T细胞、分选纯化的纯真CD8+T细胞（Tnaive）、分选纯化的中央记忆型CD8+T细胞（TCM）、分选纯化的效应记忆型CD8+T细胞（TEM）、分选纯化的效应CD8+T细胞（TEMRA）、分选纯化的过渡记忆型CD8+T细胞（Transitional Memory CD8+ T cells，TTM）、分选纯化的效应干细胞CXCR5+CD8+T细胞、分选纯化的组织记忆型CD8+T细胞（Tissue residential memoryCD8+Tcells，TRM）；
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：外周血单个核细胞的分离
1.取肝素抗凝的人外周血20ml于离心管中，采用生理盐水对外周血血液进行1:1 稀释，混合均匀；
2.另取新的50mL离心管，加入15ml淋巴细胞分离液（ficoll），然后按ficoll: 血液稀释液体积比1:2，把混匀的血液稀释液缓慢沿管壁加入淋巴细胞分离液上层，使两者形成清晰分层，3000rpm离心30min，；
3.离心结束后，吸取单个核细胞层至新的50ml离心管中，加入30mlX-VIVO-15培养基清洗一遍，800g离心5min，弃上清。
4.加入20ml X-VIVO-15培养基，吹吸混匀，室温200g离心10分钟，弃上清。加入10ml X-VIVO-15培养基重悬计数。
实施例2：Toll样受体激动剂有效刺激CD8+T细胞的增殖。
1.按照实施例1分离健康人外周血PBMC。
2.使用EasySep™ Negative Selection Human CD8+ T cell Enrichment kit（Stemcell：19053）分选CD8+T细胞。
3.使用Cell Proliferation Dye eFluor 670 （ebioscience: 65-0840-90）对分选的CD8细胞进行染色。
4.将细胞放置96孔U底板，每孔1×105细胞。
5.分组加入如下刺激剂和Toll样受体激动剂（invivogen：tlr-kit1hw，humanTLR1-9 Agonist KIT）
（1）Blank；
（2）抗人CD3抗体；
（3）抗人CD3抗体+抗人CD28抗体；
（4）抗人CD3抗体+TLR1/2 agonist-Pam3CSK4 （0.1-1μg/ml）；
（5）抗人CD3抗体+TLR2 agonist-HKLM（ 108cells/ml）；
（6）抗人CD3抗体+TLR3 agonist-Poly(I:C)（ 10ng-10ug/ml）；
（7）抗人CD3抗体+TLR3 agonist-Poly(I:C) LMW （30ng-10ug/ml）；
（8）抗人CD3抗体+TLR4 agonist-E.coli K12 LPS （10ng-10μg/ml）；
（9）抗人CD3抗体+TLR5 agonist-S.typhimuriumFlagellin （10ng-10μg/ml）；
（10）抗人CD3抗体+TLR6/2 agonist-FSL-1 （1ng-1μg/ml）；
（11）抗人CD3抗体+TLR7 agonist-Imiquimod（ 0.25-10ug/ml）；
（12）抗人CD3抗体+TLR8 agonist-ssRNA40（ 0.25-10ug/ml）；
（13）抗人CD3抗体+TLR9 agonist-ODN2006（ 5μM）。
（所用抗人CD3抗体和抗人CD28抗体为使用抗体包被的磁珠（CELLection PanMouse IgG Kit , invitrogen: 11531D ），细胞与磁珠比例为1：1）
6.在96孔U底板培养，在细胞培养箱培养7天。
7.使用流式细胞仪检测不同Toll 样受体激动剂刺激条件下CD8+T的增殖。如图1A显示了空白对照（左图）和抗人CD3抗体+抗人CD28抗体条件下（右图）CD8细胞增殖的图例。图1B显示了不同刺激条件下CD8细胞增殖比例的统计图。结果显示与单独抗人CD3抗体包被的磁珠刺激的细胞增殖相比，TLR1/2激动剂（Pam3CK4）、TLR2/6激动剂（FSL-1）、TLR5激动剂（Flagellin）能与抗人CD3抗体联合有效刺激CD8+T细胞的增殖。
实施例3： Toll样受体激动剂有效刺激CD8+T细胞亚群的增殖。
Toll样受体激动剂能有效刺激CD8+T细胞亚群中心记忆T细胞（TCM:Centralmemory T cell和效应记忆T细胞（TEM:effector memory T cell）的增殖。
1.分离健康人外周血PBMC
2.使用EasySep™ Negative Selection Human CD8+ T cell Enrichment kit （stemcell：19053）分选CD8+T细胞。
3.使用Cell Proliferation Dye eFluor 670 （ebioscience: 65-0840-90）对分选的CD8细胞进行染色.
4.将细胞放置96孔U底板，每孔1×105个细胞。
5.分组加入如下刺激剂和Toll样受体激动剂（invivogen：tlr-kit1hw，humanTLR1-9 Agonist KIT。）
（1）抗人CD3抗体；
（2）抗人CD3抗体+TLR1/2 agonist-Pam3CSK4 （0.1-1μg/ml）；
（3）抗人CD3抗体+TLR6/2 agonist-FSL-1 （1ng-1μg/ml）；
（4）抗人CD3抗体+TLR5 agonist-S.typhimuriumFlagellin （10ng-10μg/ml）。
（所用抗人CD3抗体为使用抗体包被的磁珠（CELLection Pan Mouse IgG Kit ,invitrogen: 11531D ），细胞与磁珠比例为1：1）
6.放置96孔U底培养，细胞培养箱培养7天。
7.使用抗体CD8（BD:561423）、CD45RA（eBioscience: 25-0458-42）、CCR7（eBioscience: 17-1979-42）标记细胞，用流式细胞仪检测不同Toll 样受体激动剂对CD8+T亚群（TNaive：naive T cell、TCM:central memory T cell、TEM:effector memory T cell、）增殖的影响。
8.结果显示：与单独抗人CD3抗体包被的磁珠刺激的细胞增殖相比，TLR1/2激动剂（Pam3CK4）、TLR2/6激动剂（FSL-1）、TLR5激动剂（Flagellin）能与抗人CD3抗体联合有效刺激中心记忆性CD8+T细胞（TCM）和效应记忆性T细胞（TEM）的增殖（如图2所示）。
实施例4：Toll样受体激动剂刺激HIV-1感染者CD8+T细胞亚群的增殖
Toll样受体激动剂能有效刺激HIV-1感染者CD8+T细胞亚群中心记忆T细胞（TCM:central memory T cell和效应记忆T细胞（TEM:effector memory T cell）的增殖。
1.分离HIV-1感染者外周血PBMC。
2.使用EasySep™ Negative Selection Human CD8+ T cell Enrichment kit（Stemcell:19053）分选CD8+T细胞。
3.使用Cell Proliferation Dye eFluor 670 （ebioscience: 65-0840-90）对分选的CD8细胞进行染色.
4.将细胞放置96孔U底板，每孔1×105细胞。
5.分组加入如下刺激剂和Toll样受体激动剂（invivogen：tlr-kit1hw，humanTLR1-9 Agonist KIT。）
（1）抗人CD3抗体
（2）抗人CD3抗体+TLR1/2 agonist-Pam3CSK4 0.1-1μg/ml
（3）抗人CD3抗体+TLR6/2 agonist-FSL-1 1ng-1μg/ml
（4）抗人CD3抗体+TLR5 agonist-S.typhimuriumFlagellin 10ng-10μg/ml
（5）抗人CD3/28抗体
（6）抗人CD3/28抗体+TLR1/2 agonist-Pam3CSK4 0.1-1μg/ml
（7）抗人CD3/28抗体+TLR6/2 agonist-FSL-1 1ng-1μg/ml
（8）抗人CD3/28抗体+TLR5 agonist-S.typhimuriumFlagellin 10ng-10μg/ml
（所用抗人CD3抗体和抗人CD28抗体以包被的磁珠（CELLection Pan Mouse IgG Kit ,invitrogen: 11531D）形式来刺激细胞，细胞与磁珠比例为1：1）
6.放置96孔U底培养，细胞培养箱培养7天。
7.使用抗体CD8（BD: 561423）、CD45RA（eBioscience: 25-0458-42）、CCR7（eBioscience: 17-1979-42）标记细胞，用流式细胞仪检测不同Toll 样受体激动剂对CD8+T亚群（TNaive: Naive T cell、TCM: central memory T cell、TEM:effector memory Tcell、）增殖的影响。
8.结果显示：与单独抗人CD3抗体包被的磁珠刺激的细胞增殖相比，添加TLR1/2激动剂（Pam3CK4）、TLR2/6激动剂（FSL-1）、TLR5激动剂（Flagellin）后能更有效的刺激中心记忆性CD8+T细胞（TCM）和效应记忆性T细胞（TEM）的增殖（如图3A所示）;与抗人CD3/28抗体包被的的磁珠刺激的细胞增殖相比，添加TLR1/2激动剂（Pam3CK4）、TLR2/6激动剂（FSL-1）、TLR5激动剂（Flagellin）后也能进一步提升中心记忆性CD8+T细胞（TCM）和效应记忆性T细胞（TEM）的增殖（如图3B所示）。
实施例5：CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞的分选
1.按照实施例1分离健康人外周血PBMC。
2.取1×107分离的PBMC,使用不同荧光标记的抗人CD3抗体、抗人CD8抗体、抗人PD-1抗体标记PBMC;
3.在室温避光染色20分钟，使用染色液（1×PBS+2%FBS）重悬细胞，500G离心5分钟，洗2遍，用染色液重悬细胞至浓度1×107/ml。
4.使用流式细胞仪分选CD3+CD8+T细胞和CD3+CD8+PD-1+T细胞，分选至96孔板，96孔板中预先放置100μlX-VIVO15培养基。每孔分选1~3×104个细胞。
实施例6：Toll样受体激动剂能有效提升抗人CD3/CD28抗体刺激PD-1+CD8+T细胞的增殖作用。
1.分离健康人外周血PBMC.
2.取1×107PBMC，加入抗人CD3抗体（BD:558117）、CD8抗体（BD:561423）、PD-1抗体（BD:565024）,室温避光孵育20分钟后，用PBS 500g 5分钟洗一遍，然后用1ml PBS重悬细胞。
3.使用流式细胞仪BD FACSAria II 分选CD3+CD8+PD-1+T细胞到96孔U底板，每孔六千个细胞。分选至96孔板中的细胞静置1小时，换新的细胞培养基X-VIVO15。
4.分组加入以下Toll样受体激动剂（invivogen：tlr-kit1hw，human TLR1-9Agonist KIT。 TLR1/2 agonist-Pam3CSK4 0.1-1μg/ml、TLR5 agonist-S.typhimuriumFlagellin 10ng-10μg/ml、TLR6/2 agonist-FSL-1 1ng-1μg/ml、）配合细胞因子IL-7（PeproTech:200-07-1000）20ng/ml~200ng/ml、IL-15（PeproTech:200-15-1000）10ng/ml~100ng/ml及抗人CD3抗体（BD:555336）和抗人CD28抗体（BD:555725）共同包被的磁珠（CELLection™ Dynabeads,invitrogen:11531D）
5孔分组加入刺激剂如下
（1）CD3/28+IL-7+IL-15+TLR1/2 agonist+TLR2/6 agonist+TLR5 agonist；
（2）CD3/28+IL-7+IL-15+TLR1/2 agonist+TLR2/6 agonist；
（3）CD3/28+IL-7+IL-15+TLR1/2 agonist+ TLR5 agonist；
（4）CD3/28+IL-7+IL-15++TLR2/6 agonist+TLR5 agonist；
（5）CD3/28+IL-7+IL-15
5.37度孵箱培养至第8天细胞转24孔培养板,15天转T25细胞培养瓶,在每次转瓶时细胞并补加CD3/28包被的磁珠，磁珠与细胞比例为1:1。每次换液计数细胞。
6.培养至19天时，检测发现，PD-1+CD8+T细胞在CD3/28+IL-7+IL-15+TLR1/2agonist+TLR2/6 agonist+TLR5 agonist的培养条件下增殖最快。实验结果如图4所示。
实施例7：CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞的扩增
1.分选至96孔板中的细胞静置1小时，换新的细胞培养基X-VIVO 15。同时加入TLR1/2激动剂（Pam3CK4，invivogen:tlrl-pms） 1-300ng/ml、TLR2/6激动剂（FSL-1，invivogen:tlrl-fsl）1-100ng/ml、TLR5激动剂（Flagellin,invivogen:tlrl-epstfla-5）10-100ng/ml、IL-7（PeproTech:200-07-1000）20ng/ml~200ng/ml、IL-2（PeproTech:200-02-1000）10U/ml~100U/ml、IL-15（PeproTech:200-15-1000）10ng/ml~100ng/ml，抗人CD3抗体（BD:555336）和抗人CD28抗体（BD:555725）包被的磁珠（CELLection™ Dynabeads,invitrogen:11531D），磁珠与细胞比例为1:1。放置37℃培养箱培养一周。
2.第二周将96孔板中的细胞转移至24孔板，后续根据细胞生长多少，依次将细胞转移到T25细胞培养瓶、T75细胞培养瓶、T175细胞培养瓶。
3.每次更换培养皿时补充相应培养基和刺激剂。直至培养到所需的细胞数量，细胞增殖如图5所示，图中列举了两个人的PD-1+CD8+T细胞的增殖曲线和两个人的CD8+T细胞的增殖曲线。细胞扩增的数量可达10000倍，甚至100000倍。
实施例8：对扩增后的CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞进行细胞因子分泌能力检测
取实施例7扩增得到的细胞，1×106个/孔细胞放96孔板，加入PMA（佛波酯）50ng/ml/ionomycin（离子霉素）5μM和抗CD107a抗体（Biolegend:328616），1小时后加入GolgiPlug（BD：555029）,继续培养5小时，然后对细胞进行IFN-γ（BD:557763）和GranzymeB（图6中简写为GrB，BD:560212,）染色，使用流式细胞仪检测细胞内CD107a、IFN-γ和GranzymeB的表达,结果如图6所示，能同时分泌CD107a和IFN-γ的CD8细胞比例有93.30%,能同时分泌CD107a和GranzymeB的CD8细胞比例有90.17%。
实施例9：对扩增后的CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞培养上清进行支原体和内毒素检测
使用LONZA试剂盒MycoAlert Mycoplasma DetectionKIT按照试剂说明书对扩增后的CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞培养上清进行支原体检测。计算酶标仪检测值B与检测值A的比值。比值小于0.9为合格，无支原体污染。大于或等于0.9为不合格。本实验比值均小于0.9，即扩增后的CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞无支原体污染。
使用LONZA试剂盒Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 kit 按照试剂说明书对扩增后的CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞培养上清进行内毒素检测。以E.coli O111:B4 的内毒素作为标准品，根据标准曲线计算样品的内毒素含量，内毒素≤0.3 EU/ml 为合格，＞0.3为不合格。本实验检测内毒素≤0.3 EU/ml ，即扩增后的CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞均合格。
实施例10：PD-1+CD8+T细胞在间断刺激和持续刺激下的增殖比较
PD-1+CD8+T细胞在间断刺激和持续刺激下显示不同的增殖能力以及不同的发挥功能的细胞数。
1.分离健康人外周血PBMC.
2.取1×107PBMC，加入抗人CD3抗体（BD:558117）、CD8抗体（BD:561423）、PD-1抗体（BD:565024）,室温避光孵育20分钟后，用PBS 500g 5分钟洗一遍，然后用1ml PBS重悬细胞。
3.使用流式细胞仪BD FACSAria II 分选CD3+CD8+PD-1+T细胞到96孔U底板，每孔一万个细胞。分选至96孔板中的细胞静置1小时，换新的细胞培养基X-VIVO 15。
4.所用刺激剂为TLR1/2激动剂（Pam3CK4，invivogen:tlrl-pms） 1-300ng/ml、TLR2/6激动剂（FSL-1，invivogen:tlrl-fsl）1-100ng/ml、TLR5激动剂（Flagellin,invivogen:tlrl-epstfla-5）10-100ng/ml、IL-7（PeproTech:200-07-1000）20ng/ml~200ng/ml、IL-2（PeproTech:200-02-1000）10U/ml~100U/ml、IL-15（PeproTech:200-15-1000）10ng/ml~100ng/ml，及抗人CD3抗体（BD:555336）和抗人CD28抗体（BD:555725）包被的磁珠（CELLection™ Dynabeads,invitrogen:11531D）。细胞分为5组，如表1所示，以7-2-2组为例：第一轮加入所有刺激剂连续刺激7天，换24孔板加入所有刺激剂，刺激2天后取出CD3/28包被的磁珠，培养5天后，转T25培养瓶，补加所有刺激剂及抗人CD3/2包被磁珠，刺激2天后取出CD3/28包被磁珠，继续培养5天。其余各组刺激天数和间歇天数如表1所示。
5.在三轮培养刺激后，将5组细胞分别取1×106个细胞/孔于96孔板，100ul体系，加入抗人CD3抗体和抗人CD28抗体包被的磁珠1×106和抗CD107a抗体5μl（Biolegend:328616），1小时后加入GolgiPlug（BD：555029）,继续培养5小时，然后对细胞进行CD8 （BD:563677）、IFN-γ（biolegend:502506）、IL-2（biolegend:500307）和GranzymeB（图7中简写为GrB，BD:560212,）染色，使用流式细胞仪检测细胞内CD107a、IFN-γ、IL-2和GranzymeB的表达。
6.计数各组细胞，并计算各组细胞中不同功能细胞的比例和计数。检测结果如图7所示，7-7-7组也就是连续刺激组细胞增殖较快，并且分泌CD107a、IFN-γ、IL-2和GranzymeB的细胞比例较高，即抗人CD3抗体和抗人CD28抗体的持续刺激是最有效扩增PD-1+CD8+T细胞并维持该细胞亚群的功能。
实施例11： Toll样受体激动剂刺激肺癌患者PD-1+CD8+T细胞的增殖
1.分离肺癌患者外周血PBMC.
2.取1×107PBMC，加入抗人CD3抗体（BD:558117）、CD8抗体（BD:561423）、PD-1抗体（BD:565024）,室温避光孵育20分钟后，用PBS 500g 5分钟洗一遍，然后用1ml PBS重悬细胞。
3.使用流式细胞仪BD FACSAria II 分选CD3+CD8+PD-1+T细胞到96孔U底板，分选得到12000个细胞。分选至96孔板中的细胞静置1小时，换新的细胞培养基X-VIVO 15。
4.在X-VIVO 培养基中加入Toll样受体激动剂：TLR1/2激动剂（Pam3CK4，invivogen:tlrl-pms） 1-300ng/ml、TLR2/6激动剂（FSL-1，invivogen:tlrl-fsl）1-100ng/ml、TLR5激动剂（Flagellin,invivogen:tlrl-epstfla-5）10-100ng/ml、IL-7（PeproTech:200-07-1000）20ng/ml~200ng/ml、IL-2（PeproTech:200-02-1000）10U/ml~100U/ml、IL-15（PeproTech:200-15-1000）10ng/ml~100ng/ml，抗人CD3抗体（BD:555336）和抗人CD28抗体（BD:555725）包被的磁珠（CELLection™ Dynabeads,invitrogen:11531D），磁珠与细胞比例为1:1。
5.根据细胞生长情况第二周将96孔板中的细胞转移至24孔板，后续根据细胞生长多少，依次将细胞转移到T25细胞培养瓶、T75细胞培养瓶、T175细胞培养瓶。
6.细胞培养过程中对细胞进行计数，扩增曲线如图8所示：分选的PD-1+CD8+T细胞由最初的12000个经过三十多天的体外刺激扩增到1.51×108个细胞，扩增了12583倍。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种体外诱导扩增CD8+T细胞及其功能性CD8+T细胞亚群的方法，其特征在于，在CD8+T细胞及功能性CD8+T细胞亚群培养体系中添加一种Toll样受体激动剂或联合使用多种Toll样受体激动剂，配合抗人CD3抗体或抗人CD28抗体以及各种细胞因子刺激，能够显著提升CD8+T细胞及其功能性细胞亚群的扩增效率与功能修复。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，Toll样受体激动剂包括但不限于TLR1/2激动剂、TLR2/6激动剂、TLR5激动剂，以及TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9激动剂，所述激动剂可单独使用，也可联合使用。
3.根据权利要求2所述方法，所述TLR1/2激动剂包括但不限于 Pam3CK4，TLR2/6激动剂包括但不限于FSL-1与Pam2CGDPKHPKSF，TLR5激动剂包括但不限于Flagellin。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述抗人CD3抗体或抗人CD28抗体包被于磁珠上进行使用。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述抗人CD3抗体可单独与TLR激动剂联合使用，也可与抗CD28抗组合后与TLR激动剂联合使用。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述细胞因子包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15，所述细胞因子可单独使用，也可联合使用，可同一时间加入培养，也可时间上先后加入培养体系。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述功能性CD8+T细胞亚群为分选纯化的PD-1+CD8+T细胞、分选纯化的CD137+CD8+T细胞、分选纯化的CD160+CD8+T细胞、分选纯化的纯真CD8+T细胞、分选纯化的中央记忆型CD8+T细胞、分选纯化的效应记忆型CD8+T细胞、分选纯化的效应CD8+T细胞、分选纯化的过渡记忆型CD8+T细胞、分选纯化的效应干细胞CXCR5+CD8+T细胞、分选纯化的组织记忆型CD8+T细胞。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于对功能性CD8+T细胞亚群中的PD-1+CD8+T细胞进行体外扩增时，需要抗人CD3抗体和抗CD28抗体在培养体系中持续存在以持续刺激该亚群的扩增。
9.根据权利要求1～8所述方法，其特征在于，体外扩增CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞的具体步骤如下：
a.分离PBMC,使用不同荧光标记的抗人CD3抗体、抗人CD8抗体、抗人PD-1抗体标记PBMC;室温避光染色，使用染色液重悬细胞，离心清洗，用染色液重悬细胞；
b.使用流式细胞仪分选外周血单个核细胞中的CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞;
c.将上述细胞分选至96孔板中的细胞静置1小时，加入Pam3CK4（ 1-300ng/ml）、FSL-1（1-100ng/ml）、Flagellin（10-100ng/ml）、IL-7（20ng/ml~200ng/ml）、IL-2（10U/ml~100U/ml）、IL-15（10ng/ml~100ng/ml），抗人CD3抗体和抗人CD28抗体包被的磁珠，磁珠与细胞比例为1:1，放置37℃培养箱培养一周;
d. 第二周将96孔板中的细胞转移至24孔板，后续根据细胞生长多少，依次将细胞转移到T25细胞培养瓶、T75细胞培养瓶、T175细胞培养瓶; 每次更换培养皿时补充相应培养基和刺激剂,直至培养到所需的细胞数量。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于：CD8+T细胞和其它功能性CD8+T细胞亚群的来源包括但不限于健康人、HIV-1感染者或肿瘤患者外周静脉血，还包括各种淋巴细胞白血病、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、子宫癌、子宫颈癌、肾癌、胰腺癌、鼻咽癌、小肠癌、大肠癌、结直肠癌、膀胱癌、骨癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、横纹肌瘤、平滑肌瘤、脑瘤，以及HIV感染、HBV感染、HCV感染、结核杆菌感染。
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