CN112175903B - 一种高效的细胞毒性t淋巴细胞激活增殖制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法，属于免疫治疗技术领域。包括:1）采集健康单个核细胞；2）调整细胞浓度,孵育,收集未贴壁细胞；3）调整细胞浓度,加入A磁珠和B磁珠与悬浮细胞混合；4）将混合悬液的上清液过滤，为CTL细胞激活液；5）取患者单个核细胞，用AIM‑V培养液调整浓度，孵育；6）孵育后，收集洗涤细胞，分离得到CTL细胞；7）将CTL细胞调整浓度,孵育；8）孵育结束后离心收集所有CTL细胞。上述一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法，培养出的CTL细胞纯度可达99%以上，14天内的增殖倍率在1200倍以上。

Description

一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法
技术领域
本发明属于免疫治疗技术领域，具体为一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法。
背景技术
细胞毒性T淋巴细胞是肿瘤免疫的主要效应细胞之一。现有传统CTL细胞培养主要使用IL-2细胞因子，在CD3单克隆抗体的刺激下进行体外增殖培养，其细胞增殖率低下，耗费时间长。体外大规模的高效制备被树突状细胞诱导的CTL细胞有助于治疗癌症。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法的技术方案，其通过模拟人自身体内环境，安全有效的激活CTL细胞，极大增加了CTL细胞的增殖率，培养出的CTL细胞纯度可达99%以上，14天内的增殖倍率在1200倍以上。本发明相较于传统方法极大地缩短了培养CTL细胞的时间和成本。
所述的一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）准备健康人外周血200-400ml，使用白细胞分离液去除红细胞、血小板和粒细胞，采集单个核细胞，台盼蓝染色计数，得到单个核细胞的数量；
2）用含有5%人白蛋白的AIM-V培养基重悬单个核细胞，调整细胞浓度为0.5x10^6/ml- 1.5 x10^6/ml，转移到组织培养瓶中；在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中孵育1.8-2.2小时，孵育结束后洗涤收集未贴壁细胞，台盼蓝染色计数未贴壁细胞；
3）将收集的未贴壁细胞用含有5%人白蛋白的AIM-V培养基重悬并调整细胞浓度为1x10^6 /ml，并加入A磁珠和B磁珠与悬浮细胞混合；悬浮细胞、A磁珠、B磁珠的体积比为0.8-1.2:0.6-1.0:0.1-0.3；所述的A磁珠为人类T细胞激活磁珠CD3/CD28，所述的B磁珠为人类T细胞激活磁珠CD3/CD28/CD137；
4）将细胞与磁珠的混合悬液转移到组织培养瓶中，在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中孵育70-74小时；孵育结束后，离心去除所有细胞与磁珠，将上清液用0.22微米滤芯过滤除菌，过滤后保存，将其命名为CTL细胞激活液；
5）采用常规方法配置含有50%的CTL细胞激活液，2%自体血清和48%的AIM-V培养液；取患者1x10^8个单个核细胞，用AIM-V培养液调整到8x10^6 /ml，转移到组织培养瓶中；在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中孵育22-24小时；
6）孵育结束后，收集洗涤细胞，用人类阴性CD8细胞分离试剂盒分离得到CTL细胞；
7）采用常规方法制备10% CTL细胞激活液、10%自体血清、80%AIM-V培养液，将步骤6）分离得到的CTL细胞调整到0.5x10^6 /ml-1.5 x10^6/ml，在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中孵育13-15天；每隔三天加入与现有培养液的量同等的10% CTL细胞激活液、10%自体血清、80%AIM-V培养液；
8）孵育结束后离心收集所有CTL细胞，即为最终产品细胞毒性T淋巴细胞。
所述的一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法，其特征在于步骤2）中：用含有5%人白蛋白的AIM-V培养基重悬单个核细胞，调整细胞浓度为0.8 x10^6-1x10^6 /ml。
所述的一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法，其特征在于步骤3）中：悬浮细胞、A磁珠、B磁珠的体积比为为1:0.8:0.2；步骤4）中：孵育时间为72-73小时。
所述的一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法，其特征在于步骤5）中：培养箱中孵育时间为23小时。
所述的一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法，其特征在于步骤7）中：将分离好的CTL细胞浓度调整到0.8x10^6 /ml-1.0x10^6 /ml。
所述的AIM-V培养基为加科（Gibco）生产的A3021002型AIM-V培养基。所述的人类T细胞激活磁珠CD3/CD28（Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28），所述的人类T细胞激活磁珠CD3/CD28/CD137（Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28/CD137），所述的人类阴性CD8细胞分离试剂盒（Dynabeads™ Untouched™ Human CD8 T Cells Kit），均可从市场上直接购得。
上述一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法，通过模拟人自身体内环境，安全有效的激活CTL细胞，极大的增加CTL细胞的增殖率，培养出的CTL细胞纯度可达99%以上，CTL细胞活率在98%以上，14天内的增殖倍率在1200倍以上。本发明相较于传统方法极大地缩短了培养CTL细胞的时间和成本。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步的描述。
实施例1：
一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法，包括以下步骤：
1）准备健康人外周血300ml，使用白细胞分离液去除红细胞、血小板和粒细胞，采集单个核细胞，台盼蓝染色计数，得到单个核细胞的数量；
2）用含有5%人白蛋白的AIM-V培养基重悬单个核细胞，调整细胞浓度为1.0 x10^6/ml，转移到组织培养瓶中；在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中孵育1.8-2.2小时，孵育结束后洗涤收集未贴壁细胞，台盼蓝染色计数未贴壁细胞；
3）将收集的未贴壁细胞用含有5%人白蛋白的AIM-V培养基重悬并调整细胞浓度为1x10^6 /ml，并加入A磁珠和B磁珠与悬浮细胞混合；悬浮细胞、A磁珠、B磁珠的体积比为1.0:0.8:0.2；所述的A磁珠为人类T细胞激活磁珠CD3/CD28，所述的B磁珠为人类T细胞激活磁珠CD3/CD28/CD137；
4）将细胞与磁珠的混合悬液转移到组织培养瓶中，在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中孵育72小时；孵育结束后，离心去除所有细胞与磁珠，将上清液用0.22微米滤芯过滤除菌，过滤后保存，将其命名为CTL细胞激活液；
5）采用常规方法配置含有50%的CTL细胞激活液，2%自体血清和48%的AIM-V培养液；取患者1x10^8个单个核细胞，用AIM-V培养液调整到8x10^6 /ml，转移到组织培养瓶中；在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中孵育23小时；该孵育时间可以给细胞更多的时间充分激活，可以显著增加细胞增值率，大幅缩短后续培养时间；
6）孵育结束后，收集洗涤细胞，用人类阴性CD8细胞分离试剂盒分离得到CTL细胞，台盼蓝染色计数CTL细胞可达5-9x10^6；
7）采用常规方法制备10% CTL细胞激活液、10%自体血清、80%AIM-V培养液，将步骤6）分离得到的CTL细胞调整到1.0x10^6/ml，在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中孵育14天；每隔三天加入与现有培养液的量同等的10% CTL细胞激活液、10%自体血清、80%AIM-V培养液；由于高浓度的CTL细胞激活液无法为细胞提供足够的营养物质，所以培养时所用CTL细胞激活液需要在10%左右；
8）孵育结束后离心收集所有CTL细胞，即为最终产品细胞毒性T淋巴细胞；取样适度稀释后用台盼蓝观察计数，此时细胞可达到6-11x10^6，细胞活率达到98%以上。
实施例2：
步骤 1）准备健康人外周血200ml，采集单个核细胞；步骤2）调整细胞浓度为0.5x10^6 /ml，孵育时间为1.8小时；步骤3）悬浮细胞、A磁珠、B磁珠的体积比为0.8:0.6:0.1；步骤4）孵育时间为70小时；步骤5）孵育时间为22小时；步骤7）将CTL细胞浓度调整到0.5x10^6 /ml，孵育时间为13天；其它同实施例1。
实施例3：
步骤 1）准备健康人外周血400ml，采集单个核细胞；步骤2）调整细胞浓度为1.5x10^6 /ml，孵育时间为2.2小时；步骤3）悬浮细胞、A磁珠、B磁珠的体积比为1.2:1.0:0.3；步骤4）孵育时间为74小时；步骤5）孵育时间为24小时；步骤7）将CTL细胞浓度调整到1.5x10^6 /ml，孵育时间为15天；其它同实施例1。
以下通过相应的试验数据进一步说明本发明的有益效果。
试验1：实施例1制得的CTL细胞取样后用台盼蓝观察计数，此时细胞可达到6-11x10^6，细胞活率达到98%以上；
试验2：实施例1制得的CTL细胞，取5x10^6的CTL细胞平均分成两组进行表型检测；第一组分别添加5微升FITC抗人CD8单抗、5微升PE抗人CD4单抗、5微升PE-Cy5抗人CD3单抗；第二组分别添加5微升FITC抗人CD3单抗、5微升PE抗人CD56单抗、5微升PE-Cy5抗人CD8单抗。置于冰上染色30分钟后用含有1%FBS的PBS洗涤，所得洗涤后的细胞用FACSVIA流式细胞仪分析细胞表型。经检测，CD8+/CD3+细胞为99.2%，CD56+细胞为0.6%。检测结果表明通过本发明所得细胞为CTL细胞，并且纯度在99%以上。
试验3：实施例1制得的CTL细胞，通过ELISA方法分析比对10个批次的CTL细胞激活液中的各成分含量。经检测，IL-1α为1.2-2.17ng/ml、IL-2为87.83-101.49ng/ml、IL-3为0.96-3.63ng/ml、IL-4为7.33-18.89ng/ml、IL-6为3.48-10.55ng/ml、IL-8为62.40-73.07ng/ml、IL-12为42.48-61.09ng/ml、GM-CSF为32.89-44.43ng/ml、M-CSF为85.72-94.37ng/ml、CCL2为140.02-159.34ng/ml、CCL3为137.49-154.38ng/ml、CCL4为183.87-234.17ng/ml、CCL5为102.40-113.97ng/ml、TNFα为18.55-22.56ng/ml。
以实施例2和实施例3进行相同的试验，也能达到本发明所述的有益效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰应应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）准备健康人外周血200-400ml，使用白细胞分离液去除红细胞、血小板和粒细胞，采集单个核细胞，台盼蓝染色计数，得到单个核细胞的数量；
2）用含有5%人白蛋白的AIM-V培养基重悬单个核细胞，调整细胞浓度为0.5x10^6 /ml-1.5 x10^6/ml，转移到组织培养瓶中；在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中孵育1.8-2.2小时，孵育结束后洗涤收集未贴壁细胞，台盼蓝染色计数未贴壁细胞；
3）将收集的未贴壁细胞用含有5%人白蛋白的AIM-V培养基重悬并调整细胞浓度为1x10^6 /ml，并加入A磁珠和B磁珠与悬浮细胞混合；悬浮细胞、A磁珠、B磁珠的体积比为0.8-1.2:0.6-1.0:0.1-0.3；所述的A磁珠为人类T细胞激活磁珠CD3/CD28，所述的B磁珠为人类T细胞激活磁珠CD3/CD28/CD137；
4）将细胞与磁珠的混合悬液转移到组织培养瓶中，在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中孵育70-74小时；孵育结束后，离心去除所有细胞与磁珠，将上清液用0.22微米滤芯过滤除菌，过滤后保存，将其命名为CTL细胞激活液；
5）采用常规方法配置含有50%的CTL细胞激活液，2%自体血清和48%的AIM-V培养液；取患者1x10^8个单个核细胞，用AIM-V培养液调整到8x10^6 /ml，转移到组织培养瓶中；在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中孵育22-24小时；
6）孵育结束后，收集洗涤细胞，用人类阴性CD8细胞分离试剂盒分离得到CTL细胞；
7）采用常规方法制备10% CTL细胞激活液、10%自体血清、80%AIM-V培养液，将步骤6）分离得到的CTL细胞调整到0.5x10^6 /ml-1.5 x10^6/ml，在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中孵育13-15天；每隔三天加入与现有培养液的量同等的10% CTL细胞激活液、10%自体血清、80%AIM-V培养液；
8）孵育结束后离心收集所有CTL细胞，即为最终产品细胞毒性T淋巴细胞。
2.如权利要求1所述的一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法，其特征在于步骤2）中：用含有5%人白蛋白的AIM-V培养基重悬单个核细胞，调整细胞浓度为0.8 x10^6-1x10^6 /ml。
3.如权利要求1所述的一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法，其特征在于步骤3）中：悬浮细胞、A磁珠、B磁珠的体积比为1:0.8:0.2；步骤4）中：孵育时间为72-73小时。
4.如权利要求1所述的一种高效的细胞毒性T淋巴细胞激活增殖制备方法，其特征在于步骤5）中：培养箱中孵育时间为23小时。
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