CN105219726A - 一种高效制备一型极化树突状细胞的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的提供了一种利用T细胞培养基上清高效的制备DC1细胞的方法，处理肿瘤病人或健康人的外周血，分离未成熟的DC细胞，经过定向诱导获得富集DC1细胞的产物；由此制备的产物具有高效的诱导肿瘤特异性CTL细胞和Th1细胞的能力，可用于优化肿瘤免疫治疗技术的临床效果；此外，同时本发明还提供了将制备的DC1细胞用于制备肿瘤抗原特异性CTL细胞的方法，DC1细胞负载肿瘤特异性抗原之后，一部分细胞回输至患者体内，另一部分用于体外肿瘤抗原特异性的诱导细胞毒性T细胞(CTL)，通过体内/体外，主动诱导/被动诱导相结合的方式激活肿瘤特异性的免疫反应。

Description

一种高效制备一型极化树突状细胞的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高效制备一型极化树突状细胞的方法及其应用。

背景技术

DC细胞是哺乳类动物体内具有抗原提呈能力的一类细胞，其主要功能是摄取、加工处理和递呈抗原，激活或调节适应性免疫应答。活化的DC细胞高表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，肿瘤抗原被细胞捕获，加工之后与MHC分子结合，形成肽-MHC分子复合物。随后DC细胞表面的肽-MHC分子复合物，与T细胞表面一系列分子结合，完成抗原递呈过程，T细胞因此被激活而生成MHC-I类限制性CD8阳性细胞毒性T细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)和MHC-Ⅱ类限制性的CD4阳性的一型T辅助细胞(type1Thelper,Th1)。活化的DC细胞高表达CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等刺激分子，为T细胞激活提供第二信号。成熟的DC细胞在激活T细胞过程中还大量白介素12(interleukin12，IL12)等因子，促进活化的T细胞迅速增殖。

一型极化树突状细胞(Type1PolarizedDendriticcell,DC1)是成熟DC细胞的一类亚群，具有强有力的免疫激活能力。DC1细胞的重要的特征是高表达IL12p70以及免疫激活共刺激分子，可高效的激活抗原特异性的CD8+T细胞和CD4+Th1细胞相关的免疫反应。RobbieB.Mailliard等证实了DC1体外诱导黑色素瘤抗原特异性的CTL细胞的能力可达到正常的成熟DC细胞的40倍以上ref.1α-Type-1PolarizedDendriticCellsANovelImmunizationToolwithOptimizedCTL-inducingActivity。AdrianaTLarregina等人还发现DC1细胞诱导B16黑色素瘤抗原特异性CD4+辅助性T细胞，并且促进CD4+辅助性T细胞对肿瘤组织的浸润。Ref.2Tumorcellloadedtype-1polarizeddendriticcellsinduceTh1-mediatedtumorimmunity.DC1细胞的上述特性为增强肿瘤疫苗的治疗效果提供了一种更为有效的选择，DC1细胞可以作为一种佐剂促进肿瘤特异性的免疫反应激活。目前已经有多个基于DC1细胞的治疗性肿瘤疫苗已经进入临床研究阶段。

目前体外制备DC细胞方案都多数基于Jonuleit等人提出方案，诱导试剂包含了干扰素、脂多糖、肿瘤坏死因子等。经过这类方案制备的成熟DC细胞具有肿瘤抗原特异性CTL细胞的诱导能力，但是大量临床试验数据显示基于DC细胞的癌症疫苗的治疗效果无法令人满意。因此，对于高效的DC细胞癌症疫苗或DC细胞癌症免疫治疗技术来说，需要进一步提高体外获得的DC细胞免疫反应诱导能力。XiZhao等人用慢病毒感染的DC细胞使其持续性高表达外源性IL12，发现DC.IL12细胞能够高效的诱导抗原特异性CTL细胞的产生，将DC.IL12与肿瘤抗原肽回输至小鼠体内可显著性的缩小肿瘤肿块。该研究提示了高表达IL12的DC细胞对于肿瘤疫苗发挥其抗癌临床作用的重要性。因此，IL12高表达的DC1细胞可以用来提高肿瘤疫苗临床治疗作用。美国专利US7972847B2公开了一种无血清的DC1细胞制备方法，可获得高表达IL12的DC1细胞，但是该方案需要大量的细胞因子，成本较为昂贵。由于细胞因子批次间可能存在效价差别，对于制备的质量控制工作带来了大量的负担。

发明内容

针对现有技术的种种不足，本发明利用T细胞在DC细胞分化与成熟过程中的辅助作用，建立了一种新的DC1细胞制备方法。通过采集癌症病人外周血，从中分离DC细胞，使用T细胞培养上清的培养基对其进行体外诱导，获得富集DC1细胞的产物。这些细胞不仅显现出成熟DC细胞表型，IL12p70的表达量也显著性提高，而且其体外诱导肿瘤细胞特异性CTL的能力也获得加强。

为了解决上述的技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种高效制备一型极化树突状细胞的方法，包括以下步骤：

步骤1，制备T细胞的培养基上清；

步骤2，分离外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞，加入诱导剂GM-CSF和IL-4培养；

步骤3，步骤2中培养物加入10％-40％比例的T细胞的培养基上清继续培养，获得DC1细胞。

为了进一步优化上述技术方案，本发明提供的技术措施还包括：

上述步骤1中制备T细胞的培养基上清时，首先分离外周血单核细胞，淋巴细胞分离液分理单个核细胞，用CD8磁珠分选出CD8+T细胞后，接种至培养基中，加入CD3CD28Beads，24h后加入等量培养基，48h后收集T细胞培养上清，经30μm滤网过滤后，-80℃度保存备用或直接用于DC1细胞的诱导。

用CD8磁珠分选出CD8+T细胞后，接种至TakaraGT551-H3培养基中。

上述步骤2中，分离外周血中的单核细胞按密度3.0×10⁶/ml接种至T75培养瓶中培养，培养3h后，洗去悬浮的淋巴细胞，加入含GM-CSF和IL-4以及10％血浆的培养基，贴壁细胞培养第3天、第5天更换一半量的培养基。

上述步骤2中所述的贴壁培养是指在培养基中加入10％血浆，置于37.0℃、饱和湿度、5％CO₂环境条件下的培养。

另一方面，本发明还提供一种上述方法制备的一型极化树突状细胞。

另一方面，本发明还提供一种治疗肿瘤的组合物，由上述制备一型极化树突状细胞的方法获得的DC1细胞进行肿瘤抗原肽负载而得到。

另一方面，本发明还提供一种制备肿瘤抗原特异性CTL细胞的方法，包括以下操作：

分离外周血中的单核细胞，细胞在培养瓶中短暂培养之后，悬浮细胞转移新培养瓶，按细胞密度1.0～3.0×10⁶个/ml添加扩增培养基，培养基中添加1000U/ml的IL-2，每隔两天倍比添加培养基，至第五天加入诱导剂IFN-γ培养24小时，然后加入诱导试剂IL-1α及CD3并与权利要求7所述的负载了抗原肽的DC1细胞混合培养；混合培养开始后第四天，再次负载肿瘤特异性抗原肽；培养15-20天，收集细胞。

最后一方面，本发明提供了上述的方法制备的肿瘤抗原特异性CTL细胞在制备抗癌药物中的应用。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

首先，本发明提供了一种体外制备成熟DC1细胞的方法。由本发明制备的细胞产物显现出的成熟细胞DC表型，其多个表面标志物呈阳性。由本发明提供的制备方法而得的细胞产物IL12p70表达量大大高于目前常用的方案，提示本方法制备的DC细胞具有DC1细胞的特征。体外诱导实验显示经过本方案制备的DC1诱导之后，活化的T细胞即IFNγ表达阳性的T细胞显著性升高。

其次，本发明提供了一种经济易用的DC1细胞制备方法。一般效率稍高的DC1细胞培养方法均需要多达六到八种诱导因子；本方案利用T细胞的培养基上清做为重要的诱导试剂，减少了制备过程细胞因子的使用。这一改进不仅降低了制备成本，而且简化了整个系统的不确定度，有利于质量控制。

最后本方案提供了一种用于肿瘤治疗的DC1临床应用方案。DC1细胞负载肿瘤特异性抗原之后，一部分细胞回输至患者体内，另一部分用于体外肿瘤抗原特异性的诱导细胞毒性T细胞(CTL)，通过体内/体外，主动诱导/被动诱导相结合的方式激活肿瘤特异性的免疫反应。

附图说明

图1为本发明方法制备的DC1细胞(10％和40％比例的T细胞上清)与常规方案制备的对照DC细胞相比，CD11C，CD70，HLA-DR，CD83，CD86等DC细胞与免疫激活相关的标志物表达量情况。

图2为经过CD40L激活之后，本发明诱导的DC1细胞(10％和40％比例的T细胞上清)所分泌的IL-12与常规方案制备的成熟DC细胞分泌量之对比；

图3为本发明制备的DC1细胞(10％和40％比例的T细胞上清)诱导T细胞之后，IFNγ分泌水平与常规方案制备的DC细胞诱导之对比(ELISPOT检测)。

具体实施方式

本发明的提供了一种制备DC1细胞的方案，处理肿瘤病人或健康人的外周血，分离未成熟的DC细胞，经过定向诱导获得富集DC1细胞的产物。由此制备的产物具有高效的诱导肿瘤特异性CTL细胞和Th1细胞的能力，可用于优化肿瘤免疫治疗技术的临床效果。此外，本发明还可用于肿瘤治疗性疫苗和肿瘤预防性疫苗的大规模制备。

具体而言，本发明提供了一种体外制备DC1细胞的方案：

首先，制备T细胞的培养基上清。分离健康供者外周血单核细胞，淋巴细胞分离液分理单个核细胞，用CD8磁珠分选出CD8+T细胞后，接种至TakaraGT551-H3培养基中，加入CD3CD28Beads，24h后加入等量培养基，48h后收集T细胞培养上清，经30μm滤网过滤后，-80℃度保存备用，或直接用于DC1细胞的诱导。

接着，进行DC1细胞的制备：分离外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞，更换培养基并加入诱导剂GM-CSF(1000U/ml)与IL-4(1000U/ml)培养。至第五天，加入10％比例的T细胞上清继续培养。至第六天，即可获得富含DC1细胞的制备产物，如图1所示，经过6天的诱导，制备产物显示出了明显的DC细胞的表型，流式细胞术检测结果显示CD83，CD86等与免疫激活相关的标志物达到了95％以上，说明制备产物中DC细胞纯度极高。

上述过程均在体外进行，产物DC1细胞经过sCD40L刺激之后，高表达IL12。由图2可以看出，制备产物经过sCD40L激活之后，由本方案制备的DC细胞表达的IL12量大约是常规方案的10倍。IL12在T细胞特异性免疫激活过程中有至关重要的作用，显示本发明方案诱导的DC1激活特异性免疫反应的能力较常规方案的DC细胞要更强。同时，与激活肿瘤抗原特异性CTL免疫反应相关的共刺激分子的表达阳性的细胞比例也显著性提高，显示获得的细胞产物中DC1含量上升，其激活特异性CTL相关的能力得到了提高。

另一方面，由于本发明制备的细胞产物显示了DC1细胞的表型，表明其强有力的诱导CTL细胞的能力，负载特异性肿瘤抗原的短肽之后，可以用多种肿瘤治疗。负载肿瘤抗原的制备产物可以单独进行肿瘤治疗，也可以与其他肿瘤治疗方法组合使用来治疗肿瘤，如，肿瘤外科手术、化疗(细胞毒性药物，凋亡试剂，抗体等等)、放射疗法、冷冻疗法、近距疗法和其他免疫疗法之一种或多种来组合使用。

另一方面，本发明还提供了一种体外诱导肿瘤特异性的CTL的制备方法。由本发明提供的方案所制备的T细胞中肿瘤抗原特异性的CTL的含量显著性高于由常规成熟DC细胞诱导量，因此可用于癌症治疗，使用方式与上面的阐述相同。如图3所示，第五天加入10％或40％T细胞上清诱导，获得的DC1细胞经过sCD40L激活之后与T细胞共培养。ELIspot试验显示IFNγ表达阳性的T细胞的数量高于普通DC细胞诱导的数量。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1：

T细胞培养上清的制备

外周血单个核细胞分离参照根据Jonuleit等(GeneTher.200310(3))所述的方法。首先用通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞。

T细胞上清培养流程：

a)单个核细胞的分离

i.血液转移：先将外周血转移至50ml离心管中，每管20～30ml，并留取血样计血液成分。标记，配平，1300g，离心10min。

ii.准备淋巴细胞分离液：每个50ml离心管加入15ml淋巴细胞分离液。

iii.加分离液：离心结束后，将上层血浆转移到离心管中，留取适量用于病原体检测，其余血浆封口膜封好，56℃水浴30min。转移血浆后，用0.9％氯化钠注射液稀释血细胞(氯化钠注射液与外周血细胞的稀释比例为2：1～3:1)，吹打混匀，缓慢加至淋巴细胞分离液管中，每管加至45ml。保持分离液与稀释血液界面清晰，600g离心25min(慢升慢降).

iv.转移血浆：将水浴后的血浆1300g，离心10min，离心后将上清转移至新的50ml离心管，标记日期和体积，4℃保存待用。

v.分离后收集单个核细胞：离心结束后，吸取单核细胞层移入离心管中，然后加0.9％氯化钠注射液至45ml，吹打混匀，标记，600g离心10min。

b)CD8+T细胞分选：

vi.将获得的细胞沉淀，取一定量的缓冲液重悬，使细胞密度为1×10⁸/ml。

vii.向细胞悬液中加入1/10的CD8MicroBeads，混匀，放于冰箱(2-8℃)避光孵育15min。

viii.孵育后，向细胞悬液中，加入10-20倍的缓冲液，清洗细胞，300g，离心10min。

ix.离心后弃上清，按照2×10⁸/ml的密度，将沉淀用缓冲液重悬。

x.将分离柱(LSColumns)放于磁场，并在柱子下端接离心管，用3ml缓冲液润洗柱子。

xi.把细胞悬液加入到柱子中，细胞过完之后，用缓冲液清洗柱子三次，每次3ml。

xii.将柱子移出磁场，加入5ml缓冲液，迅速用活塞将CD8+细胞推入一个新的离心管中，300g，离心10min。

c)CD8+T细胞培养：

xiii.将细胞接种至培养瓶中，添加10％自体血浆。

xiv.向培养瓶中加入DynabeadshumanT-ActivatorCD3/CD28(用之前先摇匀5min或涡旋振荡30sec)。

xv.将培养瓶置CO₂培养箱中培养(37.0℃、饱和湿度、5.0％CO₂浓度)。

xvi.次日，等体积补充扩增培养基，相应添加10％的自体血浆。

d)T细胞培养上清的收集、储存和运输：

xvii.收集：T细胞培养48h后，将细胞培养液倒入离心管中，300g，离心10min，离心后，将上清收集于无菌瓶中。

xviii.储存：储存于-80℃冰箱。

实施例2：

成人外周血来源的一型极化树突状细胞的制备(type1polarizeddendriticcell，DC1)：

外周血单个核细胞分离参照根据Jonuleit等(GeneTher.200310(3))所述的方法。首先用通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞，并收集血浆用于后续的培养。

按密度3.0×10⁶/ml，将细胞接种至T75培养瓶中，并在TakaraGT551-H3培养基中加入10％血浆，置于37.0℃、饱和湿度、5％CO₂环境中培养。培养3h后，洗去悬浮的淋巴细胞，加入含GM-CSF和IL-4以及10％血浆的培养基。贴壁细胞培养第3天，第5天更换一半量的培养基。半量换液后，加入10％T细胞上清。培养至第六天收集细胞即为DC1细胞。DC1s细胞培养至第六天，将CTL-TP试剂盒中的肿瘤抗原肽段粉剂离心后(300g，10min)，每支分别溶于200ul培养基中(每个肽2ug/ml)，充分混匀后加入到DC1中，孵育2h。孵育后即可收集抗原肽负载的DC1s细胞。

实施例3：

DC1细胞体外诱导肿瘤抗原特异性CTL细胞

如上述方法分离外周血单核细胞，在贴壁培养皿中短暂培养，分离能够贴壁的细胞。悬浮细胞按密度3.0×10⁶/ml接种培养，培养基中添加1000U/ml的IL-2。每隔两天倍比添加培养基。至培养第五天，加入因子IFN-γ，第六天，加入因子IL1-α与CD3。

将由实施例2获得的抗原肽负载DC1与T细胞混合培养。每隔两天倍比添加培养基。混合培养开始后第四天，再次负载肿瘤特异性抗原肽。将CTL-TP试剂盒中的肿瘤抗原肽粉剂离心后(300g，10min)，每管分别加入1ml的培养基，充分溶解混匀后，添加到培养体系中。之后，继续培养至回输，T细胞体外培养时间不应超过18天。

实施例4：

本发明方法制备的DC1细胞的临床应用

应用上述描述的方法，本发明针对肝癌，肺癌，乳腺癌等病人采用了DC1介导免疫疗法进行治疗方法简述如下：符合入选标准的患者(III或IV级)在进行化疗之前，取外周血100ml，按实施例2以及实施例3进行制备DC1以及肿瘤抗原特异性的CTL细胞。

第六天在病人的淋巴结注射抗原负载的5-10*10⁶个DC1细胞(重悬于1ml生理盐水)，培养第十六，十七，十八天每天收集至少10⁹个DC与T细胞共培养产物，在生理盐水中重悬之后，静脉回输。目前已完成6例，效果良好，随访观察中尚未发现明显的并发症，证实本方法安全可靠。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种高效制备一型极化树突状细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，制备T细胞的培养基上清；

步骤2，分离外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞，加入诱导剂GM-CSF和IL-4培养；

步骤3，步骤2中培养物加入10％-40％比例的T细胞的培养基上清继续培养，获得DC1细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中制备T细胞的培养基上清时，首先分离外周血单核细胞，淋巴细胞分离液分理单个核细胞，用CD8磁珠分选出CD8+T细胞后，接种至培养基中，加入CD3CD28Beads，24h后加入等量培养基，48h后收集T细胞培养上清，经30μm滤网过滤后，-80℃度保存备用或直接用于DC1细胞的诱导。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用CD8磁珠分选出CD8+T细胞后，按照2*10⁶/ml密度接种至TakaraGT551-H3培养基中。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，分离外周血中的单核细胞按密度3.0×10⁶/ml接种至T75培养瓶中培养，培养3h后，洗去悬浮的淋巴细胞，加入含GM-CSF和IL-4以及10％血浆的培养基，贴壁细胞培养第3天、第5天更换一半量的培养基。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述的贴壁培养是指在培养基中加入10％血浆，置于37.0℃、饱和湿度、5％CO₂环境条件下的培养。

6.一种如权利要求1-5任意一项所述方法制备的一型极化树突状细胞。

7.一种治疗肿瘤的组合物，其特征在于，由如权利要求1-5任意一项所述方法获得的DC1细胞进行肿瘤抗原肽负载而得到。

8.一种制备肿瘤抗原特异性CTL细胞的方法，其特征在于，包括以下操作：分离外周血中的单核细胞，细胞在培养瓶中短暂培养之后，悬浮细胞转移新培养瓶，按细胞密度1.0～3.0×10⁶个/ml添加扩增培养基，培养基中添加1000U/ml的IL-2，每隔两天倍比添加培养基，至第五天加入诱导剂IFN-γ培养24小时，然后加入诱导试剂IL-1α及CD3并与权利要求7所述的负载了抗原肽的DC1细胞混合培养；混合培养开始后第四天，再次负载肿瘤特异性抗原肽；培养15-20天，收集细胞。

9.如权利要求8所述的方法制备的肿瘤抗原特异性CTL细胞在制备抗癌药物中的应用。