CN102822332A - 从源于人胚胎干细胞的成血管细胞产生自然杀伤细胞和树突细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供产生自然杀伤（NK）细胞和树突细胞（DC）的方法。方法利用人成血管细胞作为中间体细胞以产生NK细胞和DC。在各种实施方式中，方法不需要使用间质滋养层。

Description

从源于人胚胎干细胞的成血管细胞产生自然杀伤细胞和树突细胞的方法

【技术领域】

本发明涉及从成血管细胞产生自然杀伤（NK）细胞和树突细胞（DC）。

【背景技术】

本文的所有出版物都通过引用并入，其引用程度就如同将每一个别出版物或专利申请特定且个别地指出通过引用并入。以下描述包括在理解本发明时可能有用的信息。并不承认：本文提供的任何信息是现有技术或与要求保护的本发明相关，或明确或暗中提到的任何出版物是现有技术。

用人和小鼠胚胎干细胞（ESC）的研究显示，血管（内皮和平滑肌细胞）和称之为成血管细胞的造血细胞系二者的共同前体可在培养中从源于ESC的胚状体产生。发明人组开发了简单策略以在无血清的及无间质的条件下自多种hESC系有效和可再现地产生成血管细胞，这对于它们在再生医学中的生产用途是重要的。之前工作显示，源于hESC的成血管细胞可有效分化为红细胞系和骨髓样系，但它们产生淋巴样系细胞，包括具有免疫治疗潜能的那些的能力是相对未知的。

自然杀伤（NK）细胞，其通过淋巴样系发生，且是先天性免疫系统的部分，可用于抗-癌治疗，由于它们已被发现检测及杀特定类型的肿瘤细胞。树突细胞（DC），其通常通过骨髓样系（自单核细胞）发生，且是适应性免疫系统的部分，可用于通过它们呈递抗原及刺激幼稚和记忆T细胞的能力增强抗原-特异性免疫应答（例如,基于DC的疫苗治疗）。

考虑到免疫治疗潜能，本领域中存在对产生自然杀伤（NK）细胞和树突细胞（DC）的方法的需求。

【发明概述】

连同组合物和方法描述和阐释以下实施方案和其方面，这意为示例性和说明性的，并非对范围的限制。

本发明的各种实施方式提供产生自然杀伤（NK）细胞的方法，包括：提供成血管细胞；在甲基纤维素和包含IL2，IL3，IL6，IL7，IL15，SCF和FL的第1细胞因子混合物上培养所述成血管细胞；收获培养的细胞；及在包含人血清，及包含IL7，IL15，SCF和FL的第2细胞因子混合物的液体培养基中培养收获的细胞以产生NK细胞。

在各种实施方式中，甲基纤维素可为H4236甲基纤维素。在其他实施方式中，甲基纤维素可为H4536甲基纤维素。

在各种实施方式中，IL2的浓度可为约5～10ng/ml，IL3的浓度可为约1～10ng/ml，IL6的浓度可为约1～10ng/ml，IL7的浓度可为约5～20ng/ml，IL15的浓度可为约5～10ng/ml，SCF的浓度可为约10～50ng/ml，及FL的浓度可为约10～50ng/ml。

在各种实施方式中，培养成血管细胞可持续约6～8天。在各种实施方式中，培养收获的细胞可持续约14～21天。在各种实施方式中，方法可还包括每周更换培养基以更新第2细胞因子混合物。

在各种实施方式中，成血管细胞可分化自人胚胎干细胞（hESC）。在其他实施方式中，成血管细胞可分化自诱导的多能（iPS）细胞。

在各种实施方式中，NK细胞可为未成熟的NK细胞，且可为CD56+和CD16-。在其他实施方式中，NK细胞可为成熟NK细胞，且可为CD56-和CD16+，或CD56lo和CD16+。

本发明的各种实施方式提供产生自然杀伤（NK）细胞的方法，包括：提供成血管细胞；在包含人血清，及包含IL2，IL3，IL6，IL7，IL15和SCF的第1细胞因子混合物的液体培养基中培养所述成血管细胞；收获培养的细胞；及在包含人血清，及包含IL7，IL15，SCF和FL的第2细胞因子混合物的液体培养基中培养收获的细胞以产生NK。

在各种实施方式中，IL2的浓度可为约5～10ng/ml，IL3的浓度可为约1～10ng/ml，IL6的浓度可为约1～10ng/ml，IL7的浓度可为约5～20ng/ml，IL15的浓度可为约5～10ng/ml，SCF的浓度可为约10～50ng/ml，及FL的浓度可为约10～50ng/ml。

在各种实施方式中，培养成血管细胞可持续约6～8天。在各种实施方式中，培养收获的细胞可持续约14～21天。

在各种实施方式中，方法可还包括每周更换培养基以更新第2细胞因子混合物。

在各种实施方式中，成血管细胞可分化自人胚胎干细胞（hESC）。在其他实施方式中，成血管细胞可分化自诱导的多能（iPS）细胞。

在各种实施方式中，NK细胞可为未成熟的NK细胞，且可为CD56+和CD16-。在其他实施方式中，NK细胞可为成熟NK细胞，且可为CD56-和CD16+，或CD56lo和CD16+。

本发明的各种实施方式提供由本发明的任何方法产生的自然杀伤（NK）细胞。本发明的其他实施方式提供药学可接受的组合物，其包含一定量的由本发明的任何方法产生的NK细胞。

本发明的各种实施方式提供产生树突细胞（DC）的方法，包括：提供成血管细胞；在包含人血清，SCF，FL，IL3和GM-CSF的液体培养基中培养所述成血管细胞；将IL4添加到所述液体培养基；及进一步培养所述成血管细胞以产生DC。

在各种实施方式中，培养成血管细胞可持续约7～11天。在各种实施方式中，在添加IL4之后培养成血管细胞可持续约8～10天。

在各种实施方式中，方法可还包括添加包含IL1b，TNFα和IL6的细胞因子混合物以诱导DC的成熟。在各种实施方式中，可添加细胞因子混合物持续约48小时。在各种实施方式中，细胞因子混合物可还包含选自下列的细胞因子：PGE2，IFNα2b，聚I:C，IFNγ和其组合。

在各种实施方式中，方法可还包括添加LPS，IFNγ和/或S-28463以刺激IL12p70自DC产生和/或HLA-DR自DC表达。

在各种实施方式中，SCF的浓度可为约20～100ng/ml，FL的浓度可为约10～50ng/ml，IL3的浓度可为约5～50ng/ml，GM-CSF的浓度可为约50～100ng/ml，且IL4的浓度可为约50～100ng/ml。在各种实施方式中，IL1b的浓度可为约10ng/ml，TNFγ的浓度可为约10ng/ml，且IL6的浓度可为约150ng/ml。在各种实施方式中，PGE2的浓度可为约1μg/ml，IFNα2b的浓度可为约3000U/ml，聚I:C的浓度可为约20μg/ml，且IFNγ的浓度可为约20ng/ml。

在各种实施方式中，DC可为成熟DC且表达CD83。在其他实施方式中，DC可为成熟DC，且CD209，HLA DR和/或CD11c的表达增加。

本发明的各种实施方式提供树突细胞（DC），其由本发明的任何方法产生。本发明的其他实施方式提供药学可接受的组合物，其包含一定量的由本发明的任何方法产生的DC。

本发明的其他特征和益处将从以下详述并连同考虑附图而变得明显，附图以示例的方式阐释本发明实施方案的多种特征。

【附图说明】

在提到的附图中阐释示例性的实施方案。预期本文公开的实施方案和附图应被认为是阐释性而非限制性的。

图1显示，根据本发明的各种实施方式，成血管细胞是可产生造血（A-C）和血管（D-F）系二者的双潜能的前体细胞。

图2显示，根据本发明的各种实施方式，具有免疫治疗潜能的细胞，诸如树突细胞可分化自成血管细胞。A.树突细胞表面标记物在分化的第28天表达。B.条形图显示，48小时暴露于成熟细胞因子可增加DC表面标记物表达。C.直方图显示，在30分钟测定中，DC可获取及加工DQ-卵白蛋白抗原。D.DC的Wright-Giemsa染色剂，20x。E.DC的Wright-Giemsa染色剂，100x。

图3显示，根据本发明的各种实施方式，在暴露于淋巴样-诱导细胞因子后，源于hESC的成血管细胞可在无滋养层的培养系统中产生CD56low/CD16+自然杀伤细胞。A.在甲基纤维素培养期间，成血管细胞的亚组获取共同的白细胞抗原，CD45。B.将成血管细胞转移到液体培养物（含人血清和细胞因子的混合物）允许获取NK细胞标记物，CD56。C.在总共28～40天分化之后出现CD56low/CD16+NK细胞。

图4显示，根据本发明的各种实施方式，类似于典型51Cr释放测定，细胞内流式细胞术可用于评定NK-介导的细胞毒性。

图5显示，根据本发明的一实施方式，在标准4小时共培养之后，源于成血管细胞的NK效应细胞可在K562红白血病靶细胞中诱导凋亡。

图6显示根据本发明的一实施方式产生NK细胞的方法。

【发明详述】

本文提及的所有参考文献通过引用全文并入（如同完全列出）。除非另外指明，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等，Dictionaryof Microbiology and Molecular Biology（微生物学和分子生物学词典）第3版，J.Wiley & Sons(New York，NY 2001)；March，AdvancedOrganic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure（高级有机化学反应、机理和结构）第5版，J.Wiley & Sons(New York，NY 2001)；以及Sambrook和Russel，Molecular Cloning:A Laboratory Manual（分子克隆实验手册）第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor，NY 2001)，为本领域技术人员提供本申请中使用的许多术语的一般指导。

本领域技术人员将认识到与本文描述的方法和材料相似或相当的许多方法和材料可用于实践本发明。事实上，本发明不以任何方式限制于所描述的方法和材料。为了本发明的目的，下面定义以下术语。

如在本文的说明书和在整个随后的权利要求书中所用，″a″，″an″和″the″的含义包括复数个参照物，除非情景明显另外指明。而且，如本文所用，″in″的含义包括″in″和″on″，除非情景明显另外指明。

术语″胚胎干细胞″（ES细胞）用在本文如同其用于本领域。此术语包括源于人胚泡或桑椹胚的内细胞团的细胞，包括已连续传代为细胞系的那些。ES细胞可源于卵细胞与精子的受精，以及使用DNA，核转移，孤雌生殖或通过手段产生在HLA区中具有纯合性的ES细胞。ES细胞也是源于通过精子和卵细胞的融合，核转移，孤雌生殖，雄核发育，或染色质的重编程和随后重编程的染色质并合入质膜而产生细胞所产生的合子，卵裂球或胚泡-阶段的哺乳动物胚胎的细胞。胚胎干细胞，无论它们的来源或产生它们使用的特定方法，可基于以下鉴定：（i）分化为全部3个胚层的细胞的能力，（ii）至少Oct-4和碱性磷酸酶的表达，及（iii）当移植进免疫缺陷型动物时产生畸胎瘤的能力。

如本文所用，术语″多能干细胞″包括胚胎干细胞，源于胚胎的干细胞，及诱导的多能干细胞，无论衍生多能干细胞的方法。多能干细胞被功能性地定义为这样的干细胞：（a）当移植进免疫缺陷型（SCID）小鼠时能诱导畸胎瘤；（b）能分化为全部3个胚层的细胞类型（例如,可分化为外胚层,中胚层和内胚层细胞类型）；及（c）表达胚胎干细胞的一种或更多标记物（例如,表达Oct4,碱性磷酸酶,SSEA-3表面抗原,SSEA-4表面抗原,nanog,TRA-1-60,TRA-1-81,SOX2,REX1,等）。例示多能干细胞可使用，例如本领域知道的方法产生。例示多能干细胞包括源于胚泡阶段胚胎的ICM的胚胎干细胞，以及源于卵裂阶段的一个或更多卵裂球或桑椹胚阶段胚胎的胚胎干细胞（任选地不毁坏胚胎其余部分）。该胚胎干细胞可产生自由受精或由无性手段产生的胚胎物质，所述无性手段包括体细胞核转移（SCNT），孤雌生殖和雄核发育。还例示多能干细胞包括由通过表达因子（在本文称之为重编程因子）的组合重编程体细胞产生的诱导的多能干细胞（iPS细胞）。iPS细胞可使用胚胎，出生后，新生儿，青少年或成年体细胞产生。在特定实施方式中，可用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括，例如，Oct4（有时称之为Oct3/4），Sox2，c-Myc和Klf4的组合。在其他实施方式中，可用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括，例如，Oct4，Sox2，Nanog和Lin28的组合。在其他实施方式中，通过表达至少2种重编程因子，至少3种重编程因子，或4种重编程因子来重编程体细胞。诱导的多能干细胞可通过表达体细胞中重编程因子的组合来产生。在特定实施方式中，在体细胞中表达至少2种重编程因子来成功地重编程体细胞。在其他实施方式中，在体细胞中表达至少3种重编程因子来成功地重编程体细胞。在其他实施方式中，在体细胞中表达至少4种重编程因子来成功地重编程体细胞。诱导的多能干细胞可由体细胞中重编程因子的蛋白转导产生。在特定实施方式中，将至少2种重编程蛋白转导进体细胞来成功地重编程体细胞。在其他实施方式中，将至少3种重编程蛋白转导进体细胞来成功地重编程体细胞。在其他实施方式中，将至少4种重编程蛋白转导进体细胞来成功地重编程体细胞。

在其他实施方式中，鉴定额外的重编程因子及单独使用或与一种或更多知道的重编程因子组合使用来将体细胞重编程为多能干细胞。诱导的多能干细胞功能性地定义，及包括使用任何各种方法（整合载体,非-整合载体,化学手段,等）重编程的细胞。

多能干细胞可来自任何物种。胚胎干细胞已成功地来源于，例如，小鼠，多种非-人灵长类动物物种，及人和胚胎干-样细胞已产生自多种另外的物种。由此，本领域技术人员可自任何物种产生源于胚胎干细胞和胚胎的干细胞，所述物种包括但不限于，人，非-人灵长类动物，啮齿动物（小鼠,大鼠），有蹄动物（牛,绵羊,等），犬科动物（家养和野生犬科动物），猫科动物（家养和野生猫科动物诸如狮,虎,猎豹），兔，仓鼠，沙鼠，松鼠，豚鼠，山羊，象，熊猫（包括大熊猫），猪，浣熊，马，斑马，海洋哺乳动物（海豚,鲸,等）等。在特定实施方式中，物种是濒危的物种。在特定实施方式中，物种是目前灭绝的物种。

类似地，iPS细胞可来自任何物种。已使用小鼠和人细胞成功地产生iPS细胞。已使用胚胎，胚胎，新生儿和成年组织成功地产生iPS细胞。因此，可容易使用自任何物种的供体细胞产生iPS细胞。由此，可自任何物种产生iPS细胞，所述物种包括但不限于，人，非-人灵长类动物，啮齿动物（小鼠,大鼠），有蹄动物（牛,绵羊,等），犬科动物（家养和野生犬科动物），猫科动物（家养和野生猫科动物诸如狮,虎,猎豹），兔，仓鼠，山羊，象，熊猫（包括大熊猫），猪，浣熊，马，斑马，海洋哺乳动物（海豚,鲸,等）等。在特定实施方式中，物种是濒危的物种。在特定实施方式中，物种是目前灭绝的物种。

诱导的多能干细胞可使用，实际上是任何发育阶段的任何体细胞作为起点产生。例如，细胞可来自胚胎，胎儿，新生儿，青少年或成年供体。可使用的例示体细胞包括成纤维细胞，诸如由皮肤样品或活组织检查获得的真皮成纤维细胞，自滑膜组织的滑膜细胞，包皮细胞，颊细胞或肺成纤维细胞。尽管皮肤和颊提供适当的细胞的容易可利用的和容易可得到的来源，但可使用实际上是任何细胞。在特定实施方式中，体细胞不是成纤维细胞。

术语″成血管细胞″和″血管-集落形成细胞″将贯穿本申请互换使用。所述细胞具有多种结构和功能特征。这些细胞的特征中尤其是当施用于宿主时移入骨髓的能力。这些细胞可基于多种结构和功能性质描述，包括但不限于一种或更多标记物的表达（RNA或蛋白）或表达（RNA或蛋白）缺乏。血管-集落形成细胞能分化而产生至少造血细胞类型或内皮细胞类型。血管-集落形成细胞是优选双-潜能的，且能分化而产生至少造血细胞类型和内皮细胞类型。像这样，本发明的血管-集落形成细胞是至少单-潜能的，且优选双-潜能的。然而另外，血管-集落形成细胞可具有更大程度的发育潜能，且可，在特定实施方式中，分化而产生其他系的细胞类型。在特定实施方式中，血管-集落形成细胞能分化而产生其他中胚层衍生物，诸如心脏细胞（例如,心肌细胞）和/或平滑肌细胞。

术语″非-移入成血管细胞″或″非-移入血管细胞″贯穿本申请用来指称共享血管-集落形成细胞的一些特征的细胞群。但是，非-移入血管细胞是可区分的，因为它们当施用于免疫缺陷型宿主时不移入骨髓。尽管有此差异，非-移入血管细胞可共享一种或多于一种（2,3,4,5,6,7,8,9,10）血管-集落形成细胞的功能或结构特征和性质。例如，在特定实施方式中，非-移入血管细胞松散地彼此附着。在其他实施方式中，非-移入血管细胞不表达一种或多于一种（2,3,4）下列蛋白：CD34，KDR，CD133，CD31。不受限于理论，非-移入血管细胞可提供相比血管-集落形成细胞多少更定型，且仍能产生一系列造血细胞类型的不同的干细胞群。

发明人开发了体外培养系统，以自人ESC产生具有免疫治疗潜能的细胞。此策略不同于现有技术，因为其涉及源于hESC的成血管细胞作为中间体细胞来源的使用。发明人已能使用无滋养层的培养条件直接将成血管细胞分化为自然杀伤（NK）和树突细胞（DC）。NK细胞通过淋巴样系发生，且是先天性免疫系统的部分，可用于抗-癌治疗，由于它们已被发现检测及杀特定类型的肿瘤细胞。DC通常通过骨髓样系（自单核细胞）发生，且是适应性免疫系统的部分，可用于通过它们呈递抗原及刺激幼稚和记忆T细胞二者的能力来增强抗原-特异性免疫应答（例如基于DC的疫苗治疗）。

各种活化及抑制性信号之间的相互作用控制NK细胞的3种主要功能，其为细胞因子释放，天然的细胞毒性和抗体-依赖性细胞毒性。使用自H7和HuES-3hESC系产生的成血管细胞，发明人已能产生成熟CD56low/-，CD16+NK细胞，并发现，它们的产生不需要使用间质滋养层。分化过程涉及初始4天培养，以产生胚状体，之后是在补充了一组用于产生和扩展成血管细胞群的细胞因子和生长因子的甲基纤维素中的10～14天培养。在加人血清和细胞因子混剂的液体培养中另外的14～21天允许NK细胞的分化，入由流式细胞术评定。类似于51Cr释放测定的非-放射性细胞毒性测定显示，源于这些成血管细胞的NK细胞包含天然的细胞毒性功能，由于它们在标准4小时共培养之后能在靶K562成红细胞白血病细胞中有效诱导凋亡。使用成血管细胞作为中介细胞来源可增强hESC体外分化的能力和/或效率，且重要地，允许开发用于产生具有免疫治疗潜能的细胞的无滋养层的系统。

本发明的实施方式提供产生淋巴样系细胞的方法。在各种实施方式中，本发明提供产生自然杀伤（NK）细胞的方法。

在各种实施方式中，产生NK细胞的方法包括：提供成血管细胞；在甲基纤维素和IL2，IL3，IL6，IL7，IL15，SCF和FL上平铺及培养成血管细胞；收获细胞；及在包含人血清，IL7，IL15，SCF和FL的液体培养基中再平铺/培养收获的细胞。

在各种实施方式中，液体培养基每周更换。在各种实施方式中，甲基纤维素是H4236甲基纤维素。在其他实施方式中，甲基纤维素是H4536甲基纤维素。在各种实施方式中，细胞因子的浓度是IL2（5～10ng/ml），IL3（1～10ng/ml），IL6（1～10ng/ml），IL7（5～20ng/ml），IL15（5～10ng/ml），SCF（10～50ng/ml）和FL（10～50ng/ml）。在各种实施方式中，收获细胞在6～8天的培养细胞之后进行。在各种实施方式中，在细胞再平铺之后将细胞培养另外的14～21天。在各种实施方式中，液体培养基是αMEM或DMEM:F12。

在另一实施方式中，产生自然杀伤（NK）细胞的方法包括：提供成血管细胞；在包含IL2，IL3，IL6，IL7，IL15，SCF和人血清的液体培养基中培养成血管细胞；收获细胞；及在包含人血清，IL7，IL15，SCF和FL的液体培养基中培养收获的细胞。

在各种实施方式中，液体培养基每周更换。类似于上述，在各种实施方式中细胞因子的浓度是IL2（5～10ng/ml），IL3（1～10ng/ml），IL6（1～10ng/ml），IL7（5～20ng/ml），IL15（5～10ng/ml），SCF（10～50ng/ml）和FL（10～50ng/ml）。在各种实施方式中，收获细胞在6～8天的培养细胞之后进行。在各种实施方式中，在细胞再平铺之后将细胞培养另外的14～21天。在各种实施方式中，液体培养基是αMEM或DMEM:F12。

本发明的各种实施方式提供由本发明的方法产生的自然杀伤细胞。在各种实施方式中，NK细胞提供在包含一定量的由本发明的方法产生的NK细胞的药学可接受的组合物中。

本发明的其他实施方式提供产生树突细胞（DC）的方法。在一实施方式中，所述产生DC的方法包括：提供成血管细胞；在包含人血清，SCF，FL，IL3和GM-CSF的液体培养基中平铺及培养所述成血管细胞；将IL4添加到所述液体培养基；及进一步培养所述细胞。

在其他实施方式中，方法还包括添加包含IL1b，TNFα和IL6的细胞因子混剂以诱导DC的成熟。在进一步实施方式中，细胞因子混剂还包含选自下列的细胞因子：PGE2，IFNα2b，聚I:C，IFNγ和其组合。在其他实施方式中，方法还包括添加LPS，IFNγ和/或S-28463以刺激IL12p70自DC产生和/或HLA-DR自DC表达。

在各种实施方式中，液体培养基每6～7天更换。在各种实施方式中液体培养基是αMEM或DMEM:F12。在各种实施方式中，细胞培养7～11天。在各种实施方式中，在细胞培养7～11天之后添加IL4。在各种实施方式中，在添加IL4之后将细胞培养另外的8～10天。

在各种实施方式中，人血清，SCF，FL，IL3和GM-CSF的浓度是：人血清（10～20%），SCF（20～100ng/ml），FL（10～50ng/ml），IL3（5～50ng/ml）和GM-CSF（50～100ng/ml）。在另一实施方式中，IL4的浓度是50～100ng/ml。在各种实施方式中，IL1b，TNFα和IL6的浓度是：IL1b（10ng/ml），TNFα（10ng/ml）和IL6（150ng/ml）。在各种实施方式中，PGE2，IFNα2b，聚I;C，及IFNγ的浓度是：PGE2（1μg/ml），IFNα2b（3000U/ml），聚I:C（20μg/ml），及IFNγ（20ng/ml）。

由于自成血管细胞产生树突细胞的效率相对良好，用DC的未来工作可涉及优化用于各种新功能测定的条件及开发用于各种新功能测定。例如，改变包含DC成熟混剂的组分可改善IL12p70分泌测定。而发明人目前使用6种不同的用于成熟的细胞因子的混剂，可需要LPS和/或IFNγ的添加，以便刺激IL12p70自源于胚细胞的DC产生。类似地，合成化合物，S-28463可辅助增加IL12p70产生和HLA-DR表达。

本发明的各种实施方式提供由本发明的方法产生的树突细胞。在各种实施方式中，DC提供在包含一定量的由本发明的方法产生的DC的药学可接受的组合物中。

在本发明的各种实施方式中，成血管细胞可由包括下列步骤的方法获得：提供hESC；在包含细胞因子的培养基中培养hESC以产生胚状体（EB）；解聚EB；过滤个体细胞；将个体细胞接种于包含TPO，VEGF，FL和bFGF的甲基纤维素；及自甲基纤维素收获胚细胞-样细胞。

在各种实施方式中，在解聚EB之前，首先将hESC培养4天。在各种实施方式中，用以产生胚状体的细胞因子包含VEGF和BMP4。在各种实施方式中，在EB形成的整个过程中使用VEGF和BMP4。在另一实施方式中，用以产生胚状体的细胞因子还包含bFGF。在一实施方式中，在头2天的培养hESC之后添加bFGF。在各种实施方式中，EB的解聚包括用胰蛋白酶解聚EB，然后用含血清的培养基灭活胰蛋白酶。在一实施方式中，胰蛋白酶是0.05%。在各种实施方式中，过滤个体细胞包括经40μΜ细胞粗滤器过滤个体细胞。在各种实施方式中，甲基纤维素是H4436或H4536甲基纤维素。在各种实施方式中，细胞因子的浓度是：TPO（50μg/ml），VEGF（50μg/ml），FL（50μg/ml）和bFGF（20～50μg/ml）。在各种实施方式中，在第6天和第10天之间自甲基纤维素收获胚细胞-样细胞。

在特定实施方式中，诸如制备用于在产生NK细胞中使用的成血管细胞，甲基纤维素可包含另外的细胞因子。这些另外的细胞因子选自：IL2，IL7，IL15和其组合。在各种实施方式中，这些细胞因子的浓度是：IL2（1～10μg/ml），IL7（1～20μg/ml）和IL15（1～10μg/ml）。在各种实施方式中，以50,000～150,000细胞/ml的浓度平铺甲基纤维素培养物。

在特定实施方式中，在无红细胞生成素的甲基纤维素中产生成血管细胞。在一实施方式中，无红细胞生成素的甲基纤维素是H4536甲基纤维素。

在替代实施方式中，多能干细胞（包括iPS细胞和人iPS细胞）用于代替hESC。在其他实施方式中，成血管细胞可为非-移入成血管细胞。

2009年5月6日提交且通过引用整体并入本文的国际申请No.PCT/US09/43050和PCT/US09/43043提供另外的产生成血管细胞和非-移入成血管细胞的教导。

在各种实施方式中，本发明提供药物组合物，其包含药学可接受的赋形剂，以及治疗有效量的本发明的自然杀伤细胞或树突细胞。″药学可接受的赋形剂″是指通常安全的，非-毒性和期望的在制备药物组合物中有用的赋形剂，且包括用于兽医学用途以及人药物用途的可接受的赋形剂。该赋形剂可为固体，液体，半固体，或，在气雾剂组合物的情况中是气体。

在各种实施方式中，根据本发明的药物组合物可配制为用于经任何施用途径递送。″施用途径″可指称本领域知道的任何施用通路，包括但不限于气雾剂，鼻，口腔，经粘膜，经皮或肠胃外。

″肠胃外″指称通常与注射，包括眶内，输注，动脉内，囊内，心内，真皮内，肌内，腹膜内，肺内，脊柱内，胸骨内，鞘内，子宫内，静脉内，蛛网膜下，囊下，皮下，经粘膜或经气管注射关联的施用途径。经肠胃外途径，组合物可为用于输注或注射的溶液或悬浮液，或作为冷冻干燥的粉形式。

根据本发明的药物组合物也可含有任何药学可接受的载体。本文所用的″药学可接受的载体″指称涉及将目的化合物从身体的一种组织，器官或部分携带或运输到身体的另一组织，器官或部分的药学可接受的材料，组合物或媒质。例如，载体可为液体或固体填料，稀释剂，赋形剂，溶剂或包裹材料，或其组合。载体的各组分必需是″药学可接受的″，因为其必需与制剂的其他成分相容。其必需也适合于与其可接触的任何组织或器官接触使用，这是指，其必需不携带盖过其治疗性益处的毒性，刺激，过敏性应答，免疫原性或任何其他并发症的风险。

【实施例】

提供以下实施例以更好地说明所要求保护的发明，并不解释为限制本发明的范围。在提及具体材料的程度，仅是为了说明的目的而不意为限制本发明。本领域技术人员可开发等价的手段或反应物，而无需创造性活动，也不偏离本发明的范围。

【实施例1：初始分化】

两种细胞类型的初始分化过程是相同的，且涉及hESC在加细胞因子的Stemline II（Sigma）中的4天培养以便产生胚状体（EB）。贯穿EB培养使用细胞因子，VEGF和BMP4，而在头2天之后添加bFGF。共4天之后，将得到的EB用0.05%胰蛋白酶解聚，然后将胰蛋白酶用含血清的培养基灭活。将个体细胞随后经40μΜ细胞粗滤器过滤，计数及接种于含有另外的细胞因子，诸如TPO（50μg/ml），VEGF（50μg/ml），FL（50μg/ml）和bFGF（20～50μg/ml）的H4436或H4536甲基纤维素（Stem Cell Technologies）。对于NK分化，也可在此阶段添加细胞因子IL2（1～10μg/ml），IL7（1～20μg/ml）和/或IL15（1～10μg/ml）。以50,000～150,000细胞/ml的浓度平铺甲基纤维素培养物，用于产生和扩展成血管细胞群。在第6和10天之间从甲基纤维素收获胚细胞-样细胞，并通过下列过程之一进一步分化。

【实施例2：NK分化】

胚细胞可再平铺于加IL2（5～10ng/ml），IL3（1～10ng/ml），IL6（1～10ng/ml），IL7（5～20ng/ml），IL15（5～10ng/ml），SCF（10～50ng/ml）和FL（10～50ng/ml）的H4236甲基纤维素中或含有相同的细胞因子和10～20%人血清的液体培养中。在6～8天培养之后，收获细胞并再平铺于加10～20%人血清和细胞因子IL7（5～20ng/ml），IL15（5～10ng/ml），SCF（10～50ng/ml）和FL（10-50ng/ml）的液体培养基（αMEM或DMEM:F12）中经历另外的14～21天。每周更换培养基用于更新细胞因子混剂。

贯穿分化过程间歇性地使用流式细胞术，以评定细胞的免疫表型和NK细胞表面标记物的获取。细胞表面标记物包括：CD34，CD45，CD56，CD16，CD94，NKG2D，CD3，CD7，CD4，CD8a和CD45RA。用于检查源于成血管细胞的NK细胞的功能的测试包括：（1）使用K562红白血病靶细胞的天然的细胞毒性测定，（2）应答IL12/IL18或佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯处理的IFNγ产生，（3）穿孔素和粒酶B酶存在的细胞内流式细胞术，及（4）使用Raji细胞和抗-CD20抗体的抗体-依赖性细胞毒性测定。

迄今，发明人已能自H7和HuES3hESC二者产生NK细胞。类似于⁵¹Cr释放测定的非-放射性细胞毒性测定显示，源于我们的成血管细胞的NK细胞包含天然的细胞毒性功能，由于它们在标准4小时共培养之后能在靶K562成红细胞白血病细胞中有效诱导凋亡。

【实施例3：DC分化】

将胚细胞平铺于加10～20%人血清和细胞因子SCF（20～100ng/ml），FL（10～50ng/ml），IL3（5～50ng/ml），及GM-CSF（50～100ng/ml）的液体培养基（αMEM或DMEM:F12）中。在7～11天培养之后，也将IL4（50～100ng/ml）添加到培养物，并允许细胞生长另外的8～10天。每6～7天进行培养基更换。可将另外的细胞因子混剂（10ng/ml IL1b,10ng/ml TNFγ,150ng/ml IL6）加入培养持续48小时，以便诱导DC的成熟。

贯穿分化过程间歇性地使用流式细胞术，以评定细胞的免疫表型和DC表面标记物的获取。细胞表面标记物包括：CD11c，CD209（DC-SIGN），HLA ABC（I类MHC），HLA DR（II类MHC），CD1a和CD14。成熟通过T-细胞共刺激受体CD83的获取来评定，而CD209，HLA DR和CD11c的表达也可在成熟后增加。在特定测定中，可将另外的细胞因子诸如1μg/ml PGE2，3000U/ml IFNα2b，20μg/ml聚I:C，或IFNγ20ng/ml加入成熟混剂，以增强DC功能应答。解决源于成血管细胞的DC的功能性的测定包括：（1）经DQ-卵白蛋白（BDBiosciences）处理的抗原摄取，（2）应答化学吸引物MIP-3b的转孔迁移，（3）用于测定DC增加HLA-错配的T细胞增殖的能力的同种异体混合的淋巴细胞反应测定，（4）DC刺激后的IL12-p70分泌，及（5）用于测定是否抗原-装载的DC可在之前抗原-激发的外周血单核细胞中诱导IFNγ产生的抗原呈递测定。

发明人已能自HuES3和MA01hESC二者产生DC。观察到CD83，HLA-DR，CD11c，及CD209应答48小时成熟细胞因子混剂的上调。发现这些DC能在30分钟测定中摄取及蛋白水解DQ-卵白蛋白。

【实施例4：成血管细胞生长条件的改变】

使用在H4436甲基纤维素中生长的成血管细胞进行以上NK和DC分化过程。但是，自Stem Cell Technologies的无红细胞生成素的甲基纤维素H4536也可用于有效产生成血管细胞。这些″epo^-″成血管细胞相当类似于原″epo⁺″胚细胞；它们能分化为各种造血和血管细胞类型。初步结果提示，对于成血管细胞分化为各种造血系，包括NK细胞和DC，H4536的使用可提供超过H4436甲基纤维素的显著优势。胚细胞生长培养基中epo的缺失已发现减少表达红细胞标记物CD235a的细胞的百分率，及增加表达CD34，CD45和CD41a的细胞的百分率。由于细胞表面标记物表达中的此差异，″epo^-″生长条件可增强向骨髓样和/或淋巴样系的分化。

【实施例5：自iPS细胞的MK产生】

使用OP9共培养系统，发明人显示，MK可自iPS细胞产生。自数十万iPS细胞产生数千CD41a+MK。

【实施例6：自人ESC的NK细胞分化】

【分化过程如下进行】

将H7ESC经4天分化为胚状体（EB）。收获EB及转移到富含细胞因子的甲基纤维素持续10～15天，用于成血管细胞产生和扩展。收获成血管细胞，并放入加10～20%人AB血清，和一组细胞因子的无滋养层的液体培养培养基持续另外的14～17天，每3～4天更换一半培养基。

【免疫表型分型（使用流式细胞术）】

未成熟的NK细胞是CD56bright，CD16lo，KIRlo，CD117+，CD94-，NKG2D+。通过使用以上过程的变化形式，在32天的分化之后20～30%的活细胞是CD56+CD16-。成熟NK细胞是CD56dim，CD16hi，KIRhi，CD117lo/-，CD94+，NKG2D+。通过使用以上过程，在31天的分化之后20%的活细胞是CD56-CD16+，且5%的活细胞是CD56loCD16+。

【功能测定】

天然的细胞毒性：成熟NK细胞可引发靶细胞诸如人K562红白血病，MCF7，U87，PC3，NTERA2细胞的凋亡。″3FC″测定用于评定细胞毒性的效率。其类似于51Cr释放测定，但不需要放射性。见Derby et al.,Immunol.Letters 78:35-39（2001）。在标准4小时实验中发现，上述成熟NK细胞的异源群（项目B2-a）引发65～70%的K562细胞的凋亡。

抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)：NK细胞表面上的FcyRIII（CD16）结合于附接于靶细胞的抗-CD20抗体的fc区，并诱导ADCC。将Raji细胞（源于Burkett氏淋巴瘤）与抗-CD20抗体预温育，并用作ADCC测定中的靶。（Tsirigotis et al.,J of SteroidBiochem and Mol Bio 108:267-271(2008)）。

IFNγ细胞因子产生：未成熟的NK细胞应答用加离子霉素或IL12加IL18的PMA（佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯）过夜处理而产生大量的IFNγ。用布雷菲德菌素a阻断IFNγ分泌，将细胞就细胞表面标记物染色，并使用细胞内流式细胞术测量IFNγ。见Woll et al.J.ofImmunol.175:5095-5103（2005）。

使用异种移植物小鼠模型，NK细胞的体内免疫治疗潜能：将生物发光的（含有萤光素酶的）K562细胞注入NOD/SCID小鼠用于肿瘤移入，之后是NK细胞的药团和每天IP注射IL2和IL15。生物发光成像用于经时监控体内NK免疫治疗潜能。见：Woll et al.Blood 113(24):6094-6101（2009）。

【实施例7】

通过使用成血管细胞作为骨髓-群体恢复细胞或通过将它们分化为树突细胞，自然杀伤细胞，T细胞和/或间叶干细胞（MSC），我们可产生对抗癌，HIV和/或自身免疫疾病的大规模，有效的基于细胞的治疗。发明人能以40～55%效率实现树突细胞（DC）自hESC和iPS细胞的分化。除了2种新功能测定之外，源于人骨髓的DC的并排比较现在已确认，源于hESC的DC与源于人BM的DC共享许多可比较的特征，并也鉴定需要进一步优化的区。对于自然杀伤细胞分化，与源于人骨髓的NK细胞的并排比较确认，体外NK细胞分化不是非常有效，即便当使用骨髓细胞来源时。发明人发现，源于胚细胞的NK细胞显示天然的细胞毒性能力。进行抗体-依赖性细胞毒性测定。对于T细胞分化，发明人已成功地创建了表达人δ-配体的OP9间质细胞系，以刺激Notch信号传导，且使用此间质细胞系以刺激成血管细胞的T细胞分化。

【源于成血管细胞的树突细胞（40～55%效率）】

细胞表面标记物：CD11c，45，209显示在源于胚细胞的DC和源于人骨髓的DC上可比较的表达，而HLA-DR相比人BM DC，在胚细胞DC上以低得多的水平表达。

功能测定（之前在抗原摄取和迁移测定报道的）。IL12-p70分泌：IL12p70由成熟DC分泌，以便引发自CD4+T细胞的Th1-导向的应答。源于人BM的DC可产生>500pg/ml的IL12p70，而源于胚细胞的DC在成熟后未产生任何可检测的IL12p70。混合的淋巴细胞反应（MLR）测定：MLR测定测定DC刺激同种异体T细胞增殖的能力。将脐带血单核细胞（CBMC,其包括T细胞）用作荧光标记的应答者，并在与源于未成熟的或成熟胚细胞的DC的4～5天共培养之后测量它们的增殖。初步结果显示，应答者细胞应答成熟(m)DC而增殖。

源于成血管细胞的自然杀伤细胞：在源于胚细胞和源于人骨髓的NK细胞中评价细胞表面标记物CD45，CD7，CD94，CD56，CD16，及NKG2D。

NK分化效率：研究重组人Sox7蛋白的增加用于NK分化的CD34+起始祖先库的能力。结果提示，rhSox7不显著影响CD34+细胞的%。研究鼠AFT024作为间质滋养层，其可提供关键细胞间接触及用于NK细胞分化的分泌的因子。如通过细胞表面标记物表达指示，AFT024间质共培养未增强人BM或胚细胞的NK分化。

源于成血管细胞的T细胞：Notch信号传导对于T细胞分化是关键的。像这样，将人δ-样配体1（hDLL1）的cDNA克隆进基于MSCV-ires-GFP的反转录病毒载体，并使用得到的病毒上清液感染OP9间质细胞。在病毒整合之后，OP9细胞会在它们的细胞表面表达hDLL1，且是gfp阳性。基于FACS的分选用于自感染的OP9细胞的异源库纯化最高gfp-阳性细胞。将这些OP9-hDLlS（″S″代表分选的）扩展及表征。Q-RT-PCR，免疫荧光和流式细胞术全部确认这些细胞中hDLL1蛋白的表达。

【实施例8】

将脐带血和外周血单核细胞二者用作应答者，且发明人使用源于人骨髓的DC作为阳性对照效应子。

已显示E4BP4对于NK系开发是关键的（见Gascoyne et al.Nature Immunology 10(10):1118-1125,2009），且可提供对于体外更有效必需的转录程序。

NK细胞分化。发明人将E4BP4cDNA克隆进用于其在成血管细胞中过表达的反转录病毒载体，并评价其增加NK分化的能力。RT-PCR用于监控对于细胞功能性关键的各种KIR受体同种型和酶，穿孔素和粒酶B的表达。对于功能测定，发明人显示，源于胚细胞的NK细胞显示天然的细胞毒性，因此评定它们的抗体-依赖性细胞毒性（ADCC）能力。ADCC测定需要的试剂包括源于伯基特淋巴瘤的Raji细胞和抗-CD20抗体。CD20-标记的Raji细胞与NK细胞的共培养应引发特定ADCC应答，其将通过流式细胞手段监控。

【NK参考文献】

1.Woll,P et al.,J.of Immunology.175:5095-5103(2005).

2.Woll,P et al.,Blood113(24):6094-101(2009).

3.Bordoni et al.,Hepatology 39:1508-1516(2004).

4.Tabatoabaei-Zavareh et al.,PLOS One Issue 2,e232(2007).

5.McCullar,V et al.,Exp.Hematology 36(5):598-608(2008).

6.Freud,AG et al.,Immunity 22:295-304(2005).

7.Yu,H et al.,Blood 92(10):3647-3657(1998).

【DC参考文献】

1.Su et al.,Clinical Cancer Research 14(19):6207-6217(2008).

2.Tseng et al.,Regenerative Medicine 4(4):513-526(2009).

3.Bandi et al.,AIDS Research and Therapy 5:1(2008).(开放获取)

4.Slukvin,II et al.,J of Immunology 176:2924-2932(2006).

以上在详述中描述了本发明的多种实施方案。尽管这些描述直接描述了以上实施方案，但是应理解的是，本领域技术人员可设想对本文显示和描述的具体实施方案的修改和/或变化。落入本描述的范围之内的任何这样的修改或变化意指也包括在本文中。除非具体指明，否则发明人的意图是，说明书和权利要求书中的字词和语句以对于适用领域中的普通技术人员而言是普通且习惯的含义提供。

已经呈现了申请人在提交本申请时所知的本发明的多种实施方案的以上描述，且意指用于阐释和描述的目的。本描述不意为穷尽的，也不意为限制本发明为公开的确切形式，且鉴于以上教导，许多修改和变化是可能的。描述的实施方案用于解释本发明的精神和其实际应用，并使得本领域其他技术人员能够以多种实施方案和适合预期的具体用途的多种修改利用本发明。因此，预期本发明不限于为了进行本发明而公开的具体实施方案。

尽管已经显示和描述了本发明的具体实施方案，但是对本领域技术人员明显的是，基于本文的教导，可进行改变和修改而不偏离本发明和其更宽泛的方面，且因此所附的权利要求书是为了在其范围中涵盖所有这样改变和修改，因为它们在本发明的实际精神和范围中。本领域技术人员应理解的是，通常本文使用的术语一般预期为“开放”术语(如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”、等)。

Claims (38)

1.产生自然杀伤（NK）细胞的方法，包括：

提供成血管细胞；

在甲基纤维素和包含IL2，IL3，IL6，IL7，IL15，SCF和FL的第1细胞因子混合物上培养所述成血管细胞；

收获培养的细胞；以及

在包含：

人血清，及

包含IL7，IL15，SCF和FL的第2细胞因子混合物的液体培养基中培养收获的细胞以产生NK细胞。

2.权利要求1的方法，其中甲基纤维素是H4236甲基纤维素。

3.权利要求1的方法，其中甲基纤维素是H4536甲基纤维素。

4.权利要求1的方法，其中

IL2的浓度是约5～10ng/ml，

IL3的浓度是约1～10ng/ml，

IL6的浓度是约1～10ng/ml，

IL7的浓度是约5～20ng/ml，

IL15的浓度是约5～10ng/ml，

SCF的浓度是约10～50ng/ml，且

FL的浓度是约10～50ng/ml。

5.权利要求1的方法，其中培养所述成血管细胞持续约6～8天。

6.权利要求1的方法，其中培养收获的细胞持续约14～21天。

7.权利要求1的方法，还包括每周更换培养基以更新第2细胞因子混合物。

8.权利要求1的方法，其中成血管细胞分化自人胚胎干细胞（hESC）。

9.权利要求1的方法，其中成血管细胞分化自诱导的多能（iPS）细胞。

10.权利要求1的方法，其中NK细胞是未成熟的NK细胞，且是CD56+和CD16-。

11.权利要求1的方法，其中NK细胞是成熟NK细胞，且是CD56-和CD16+，或CD56lo和CD16+。

12.自然杀伤（NK）细胞，其由权利要求1～11之任一项的方法产生。

13.药学可接受的组合物，其包含一定量的权利要求12的NK细胞。

14.产生自然杀伤（NK）细胞的方法，包括：

提供成血管细胞；

在包含人血清，及包含IL2，IL3，IL6，IL7，IL15和SCF的第1细胞因子混合物的液体培养基中培养所述成血管细胞；

收获培养的细胞；以及

在包含：

人血清，及

包含IL7，IL15，SCF和FL的第2细胞因子混合物的液体培养基中培养收获的细胞以产生NK。

15.权利要求14的方法，其中

IL2的浓度是约5～10ng/ml，

IL3的浓度是约1～10ng/ml，

IL6的浓度是约1～10ng/ml，

IL7的浓度是约5～20ng/ml，

IL15的浓度是约5～10ng/ml，

SCF的浓度是约10～50ng/ml，且

FL的浓度是约10～50ng/ml。

16.权利要求14的方法，其中培养所述成血管细胞持续约6～8天。

17.权利要求14的方法，其中培养收获的细胞持续约14～21天。

18.权利要求14的方法，还包括每周更换培养基以更新第2细胞因子混合物。

19.权利要求14的方法，其中成血管细胞分化自人胚胎干细胞（hESC）。

20.权利要求14的方法，其中成血管细胞分化自诱导的多能（iPS）细胞。

21.权利要求14的方法，其中NK细胞是未成熟的NK细胞，且是CD56+和CD16-。

22.权利要求14的方法，其中NK细胞是成熟NK细胞，且是CD56-和CD16+，或CD56lo和CD16+。

23.自然杀伤（NK）细胞，其由权利要求14～22之任一项的方法产生。

24.药学可接受的组合物，其包含一定量的权利要求24的NK细胞。

25.产生树突细胞（DC）的方法，包括：

提供成血管细胞；

在包含人血清，SCF，FL，IL3和GM-CSF的液体培养基中培养所述成血管细胞；

将IL4添加到所述液体培养基；以及

进一步培养所述成血管细胞以产生DC。

26.权利要求25的方法，其中培养所述成血管细胞持续约7～11天。

27.权利要求25的方法，其中在添加IL4之后进一步培养所述成血管细胞持续约8～10天。

28.权利要求25的方法，还包括添加包含IL1b，TNFα和IL6的细胞因子混合物以诱导DC的成熟。

29.权利要求28的方法，其中添加细胞因子混合物持续约48小时。

30.权利要求28的方法，其中细胞因子混合物还包含选自下列的细胞因子：PGE2，IFNα2b，聚I:C，IFNγ和其组合。

31.权利要求25的方法，还包括添加LPS，IFNγ和/或S-28463以刺激IL12p70自DC产生和/或HLA-DR自DC表达。

32.权利要求25的方法，其中

SCF的浓度是约20～100ng/ml，

FL的浓度是约10～50ng/ml，

IL3的浓度是约5～50ng/ml，

GM-CSF的浓度是约50～100ng/ml，且

IL4的浓度是约50～100ng/ml。

33.权利要求28的方法，其中

IL1b的浓度是约10ng/ml，

TNFγ的浓度是约10ng/ml，且

IL6的浓度是约150ng/ml。

34.权利要求30的方法，其中

PGE2的浓度是约1μg/ml，

IFNα2b的浓度是约3000U/ml，

聚I:C的浓度是约20μg/ml，且

IFNγ的浓度是约20ng/ml。

35.权利要求25的方法，其中DC是成熟DC，且表达CD83。

36.权利要求25的方法，其中DC是成熟DC，且CD209，HLADR和/或CD11c的表达增加。

37.树突细胞（DC），其由权利要求25～36之任一项的方法产生。

38.药学可接受的组合物，其包含一定量的权利要求37的DC细胞。

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