JP7213976B2 - 単核細胞由来のｎｋ細胞 - Google Patents

Description

本開示は、特にそれが臍帯血（ＣＢ）又は全血からの末梢血（ＰＢ）ＮＫ細胞に関する際の、免疫能細胞を産生及び培養するための組成物、方法、及びデバイスに関する。

背景技術の説明は、本開示を理解するのに有用であり得る情報を含む。それは、本明細書に示される情報のいずれも、先行技術であるか若しくは本出願で権利請求される発明に関連すると認めるものではなく、又は具体的に若しくは暗示的に参照されるいずれの刊行物も、先行技術であると認めるものではない。

本明細書における全ての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が具体的に及び個別に参照により援用されることが示されるのと同程度に参照により援用される。援用される参照文献中の用語の定義又は使用が、一貫性がないか又は本明細書に示されるその用語の定義と矛盾する場合、本明細書に示されるその用語の定義が適用され、参照文献中のその用語の定義は適用されない。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫細胞の一群であり、これは、グラニュライシン及びパーフォリンの標的指向性の放出によって抗体依存性細胞傷害を示す細胞傷害性リンパ球として特徴付けられることが多い。ほとんどのＮＫ細胞は、様々な活性化及び阻害性受容体の一群に加えて、特異的な細胞表面マーカープロファイル（例えば、ＣＤ３^－、ＣＤ５６^＋、ＣＤ１６^＋、ＣＤ５７^＋、ＣＤ８^＋）を有する。より最近では、ＮＫ細胞は、ある種の癌治療の重要な要素になっているが、大量のＮＫ細胞（特に、自己ＮＫ細胞）の産生は、全血中のＮＫ細胞の割合が比較的低いため、かなりの障害がある。

治療的に有意な量のＮＫ及びＮＫ様細胞を得るために、ＮＫ細胞は、様々な前駆細胞から産生され得る。例えば、様々な幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５が、臍帯血由来のサイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞を誘導及び増殖するための様々なインビトロ手法において報告されている（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３４９３－３５００（２０１０））。同様に、米国特許出願公開第２０１８／００４４６３６号明細書に報告されるように、ＣＤ３４^＋造血細胞が、ＩＬ－１２及び他の作用物質に曝露され得る。さらに他の手法において、ヒト血管芽細胞を、国際公開第２０１１／０６８８９６号パンフレットに記載されるように２つの異なるサイトカインカクテルに連続して曝露し、異なるサイトカインカクテルを、国際公開第２０１２／１２８６２２号パンフレットに教示されるように後胚造血幹細胞とともに使用した。これらの方法の少なくともいくつかが、ＮＫ細胞の有意なｎ倍の増殖を提供する一方、このような増殖のための方法及び試薬は、時間及び資源の両方を要する。さらに、公知の方法の多くが、支持細胞層におけるＮＫ細胞の培養も必要とし、これは、多くの場合、技術的及び規制上の観点から問題になることに留意されたい。

より簡素化された方法において、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞は、ＮＫ細胞を形成するようにＡＭＬ細胞を誘導するようにＴｐｏＲアゴニストに曝露され得る。しかしながら、このような手法は、治療用細胞調製物の供給源として通用しない可能性が高い。代替的な方法はまた、国際公開第２０１１／１０３８８２号パンフレットに開示されるように、様々なインターロイキン、幹細胞因子、及びＦＬＴ３リガンドの存在下で末梢血細胞を培養することに依拠する。さらに別の方法において、米国特許出願公開第２０１３／０２９５６７１号明細書には、既に存在するＮＫ細胞を、サイトカインとともに抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ３抗体で刺激する方法が教示されている。手順的に比較的単純であるが、このような方法は、細胞の複雑な操作をさらに必要とし、必要とされる特定の試薬により、かなりのコストを増加させる。

さらに他の公知の方法において、米国特許出願第１０，１２５，３５１号明細書には、インターフェロン、インターロイキン、ＣＤ３抗体及びヒトアルブミンを含む培地でその後培養される有核細胞を単離するために密度勾配分離に供される細胞の供給源としての臍帯血又は末梢血の使用が記載されている。最も有利には、このような方法は、バイオリアクターにおけるかん流培養に適しており、したがって、操作上の問題を著しく軽減する。しかしながら、残念なことに、ＮＫ細胞の収率は比較的低い。

したがって、大量のＮＫ細胞を産生する様々な方法が、当該技術分野において公知であるが、それらの全て又はほぼ全てに、様々な欠点がある。その結果、大量のＮＫ細胞、特に、自己ＮＫ細胞を産生する改良されたシステム及び方法を提供することが必要とされている。さらに、改良されたシステム及び方法はまた、細胞培養の自動化を可能にし、試薬の要件をかなり低減するため、このような方法は臨床的に及び商業的に実現可能である。

本発明者らは、概念的に簡単で且つ効率的な方法でＮＫ細胞の産生及び増殖を可能にする組成物、方法、及びデバイスを発見した。有利には、ＮＫ細胞は、好ましくは、Ｎ－８０３及び任意選択的に抗ＣＤ１６アゴニスト抗体及び抗ＣＤ３抗体を使用する富化プロセスによって、ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）又はＮＫ細胞のいずれも単離せずに、及び支持細胞層を使用せずに、臍帯血又は全血から得られた血液単核細胞（ＭＮＣ）から産生され得る。

本発明の主題の一態様において、本発明者らは、ＮＫ細胞を産生する方法であって、体液から、単核細胞の混合物を単離する工程と、単核細胞の混合物を、抗ＣＤ１６抗体及びＮ－８０３と接触させて、ＮＫ細胞を活性化する工程と、活性化されたＮＫ細胞に、Ｎ－８０３を含む培地を連続して供給する別の工程とを含む方法を想定している。

最も典型的な例において、単核細胞の混合物を単離する工程は、密度勾配遠心分離を用いて行われ、及び／又は体液は、全血又は臍帯血である。したがって、単核細胞の混合物は、一般に、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及びダブルネガティブ（ＤＮ）Ｔ細胞を含む。全く除外されるわけではないが、単核細胞の混合物は、ＮＫ細胞を富化するためにさらに処理されないことが一般に好ましい。

想定される抗ＣＤ１６抗体に関して、抗体が、ヒトＣＤ１６に対する特異性を有するモノクローナル抗体であることが一般に好ましい。最も典型的に、抗ＣＤ１６抗体は、０．０５～０．５ｍｃｇ／ｍｌの濃度で存在し、及び／又はＮ－８０３は、０．１～１．０ｎＭの濃度で存在する。必要な場合、想定される方法は、単核細胞の混合物を、抗ＣＤ３抗体と（例えば、０．１～１．０ｎｇ／ｍｌの濃度で）接触させることをさらに含む、混合物を接触させる工程も含み得る。

ある実施形態において、単核細胞の混合物は、約１００～５００×１０^６個の細胞を含有し、及び／又は混合物を接触させる工程は、約１００～３００ｍｌの体積で又は約１×１０^６個の細胞／ｍｌの細胞密度で行われる。好ましくは、必ずしもではないが、Ｎ－８０３を含む培地は、ヒトＡＢ血清及び／又はＮＫ ＭＡＣＳ（商標）培地（Ｍｉｌｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ－Ｅｂｅｒｔ－Ｓｔｒａｓｓｅ ６８，５１４２９ Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている）及びヒドロコルチゾン（０．１～５ｕＭ）を含む。さらに、連続して供給する工程が、約７２時間置きに行われること、及び／又は連続して供給する工程が、約０．５～５．０×１０^９個の細胞の総細胞数に達するまで行われると考えられる。さらに、活性化されたＮＫ細胞に連続して供給する工程は、単一の容器中で行われてもよく、混合物を単核細胞と接触させる工程は、同じ容器中で行われてもよい。

他の実施形態において、活性化されたＮＫ細胞に連続して供給する工程は、ＮＫ細胞が少なくとも１００倍の増殖に富化されるまで、及び／又はＮＫ細胞が、全生細胞の少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％を占めるまで行われる。

したがって、異なる観点から見ると、本発明者らはまた、単核細胞の混合物からＮＫ細胞を増殖する方法であって、５％以下のＮＫ細胞を含有する単核細胞の混合物を提供する工程を含む方法を想定している。別の工程において、単核細胞の混合物は、次に、抗ＣＤ１６抗体及びＮ－８０３と接触されて、ＮＫ細胞を活性化し、さらなる工程において、活性化されたＮＫ細胞に、Ｎ－８０３を含む培地が供給される。

好ましくは、必ずしもではないが、単核細胞の混合物は、全血又は臍帯血から得られ、又は単核細胞の混合物は、ＮＫ細胞を与えられる個体に対して、ＭＨＣ適合した自己起源から得られる。典型的な例において、単核細胞の混合物は、３％以下のＮＫ細胞を含有し、及び／又はＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＤＮ細胞をさらに含み得る。培地、抗ＣＤ１６抗体、Ｎ－８０３、及び抗ＣＤ３抗体に関して、上述されるのと同じ考慮事項が適用される。

さらに、供給する工程が、約７２時間置きの間隔で連続して供給することを含むこと、供給する工程が、約０．５～５．０×１０^９個の細胞の総細胞数に達するまで行われること、及び／又は活性化されたＮＫ細胞に供給する工程が、ＮＫ細胞が少なくとも１００倍の増殖に富化されるまで行われると考えられる。さらなる実施形態において、活性化されたＮＫ細胞に供給する工程が、好ましくは単一の容器中で、自動化された方法で行われると考えられる。

したがって、本発明の主題のさらに別の態様において、本発明者らはまた、自動化されたバイオリアクター中でＮＫ細胞を増殖する方法を想定している。このような方法は、典型的に、ＮＫ細胞を活性化するのに十分な時間にわたって、Ｎ－８０３及び抗ＣＤ１６抗体を含む活性化培地中で、単核細胞の混合物をインキュベートする工程を含み、単核細胞の混合物が、混合物をインキュベートしながら細胞培養容器に含まれる。別の工程において、細胞の増殖は、細胞が容器に入っている状態で測定され、所定のスケジュール及び／又は細胞の増殖を測定する工程からの結果に従って、細胞に、Ｎ－８０３を含む培地が自動的に供給される。さらに別の工程において、細胞に供給する工程は、所定のスケジュール及び／又は細胞の増殖を測定する工程からの結果に従って停止される。

例えば、好適な容器は、約２００ｍｌ～約２，５００ｍｌの体積を有し、及び／又は細胞の増殖を測定する工程は、（例えば、光学的測定を用いて）容器の壁を通して行われる。最も好ましくは、活性化培地は、０．１～１．０ｎＭの濃度のＮ－８０３及び０．０５～０．５ｍｃｇ／ｍｌの濃度の抗ＣＤ１６抗体を含む。他の例において、Ｎ－８０３を含む培地は、０．１～１．０ｎＭの濃度のＮ－８０３を含む。最も典型的に、ＮＫ細胞を活性化するのに十分な時間は、２４時間～９６時間であり、細胞は、約０．５～５．０×１０^９個の細胞の総細胞数に達するまで、及び／又はＮＫ細胞が少なくとも１００倍の増殖に富化されるまで供給される。

本発明の主題のさらに別の態様において、本発明者らはまた、異なるタイプの免疫能細胞を含む培地を含む細胞培養容器（例えば、約２００ｍｌ～約２，５００ｍｌの体積を有する）を想定している。最も好ましくは、培地は、全生細胞の少なくとも８０％の量のＮＫ細胞、全生細胞の１０％以下の量のＮＫＴ細胞、全生細胞の５％以下の量のＴ細胞、及び全生細胞の３％以下の量のＤＮ Ｔ細胞を含む。好ましくは、容器の少なくとも１つの壁は、光学的に透明な部分を有し、及び／又はＮＫ細胞は、全生細胞の少なくとも約９０％の量で存在する。

様々な目的、特徴、態様、及び利点が、類似の符号が類似の構成要素を表す添付の図面とともに、好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。

後にＮＫ細胞の富化／増殖の種を構成するＣＢＭＣの単離によって臍帯血から開始するプロセスを示す例示的な概略図を示す。 自動化環境（ボックス中の「ＧＭＰ」）における代表的なプロセスの例示的な詳細及び様々な成分の添加のスケジュールを示す。 数及び選択されたフローサイトメトリー特性による、ＮＫ細胞についての図２のプロセスの富化動態（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）の例示的な結果を示す。 マーカー発現、特に、ＮＫ活性化受容体の大部分の有意な発現についての結果とともに、図２のプロセスの様々な細胞集団の動態についての例示的な結果を示す。

癌の治療における免疫療法の使用が連続して増加するのに伴い、十分な量のＮＫ細胞、特に、治療エンティティとしての自己ＮＫ細胞の産生が、重要になっている。残念なことに、現行の方法の多くは、支持細胞層の使用又は単離されたＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の分化を必要とし、これには、時間及び資源の両方がかかる。さらに、様々な操作工程が必要とされるため、このような方法は、典型的に、人的交流を必要とし、汚染を受けやすい。

ＮＫ細胞の産生方法を改善しようとして、本発明者らは、図１に概略的に示されるように単核細胞が得られたら、さらに完全に自動化され得る簡単且つ有効な方法で、単核細胞（例えば、全血、臍帯血）を含む体液から治療的に有意な量（例えば、少なくとも０．５×１０^９個のＮＫ細胞）を産生するための様々なシステム、組成物、及び方法をここで発見した。好ましくは、バイオリアクターは、自己完結型のユニットであり、様々な作業（例えば、体液の移動のためのポンプ、温度及びガス調節の操作、画像処理など）のためのプログラム可能なプロトコルを実行するため、及び規制対応報告書を作成するための中央処理装置及びオンボードメモリ、並びに細胞培養をモニターするための顕微鏡（又は他の光学ユニット）を有する。

例えば、本明細書において想定される１つのプロセスにおいて、全末梢血又は臍帯血が、出発材料として使用され、それが処理されて、単核細胞が得られる。最も典型的に、処理は、（例えば、ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されているＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（商標）（親水性の可溶性多糖、密度１．０７７ｇ／ｍＬ）を用いた）従来の密度勾配遠心分離を用いて行われ得る。単核細胞が、遠心分離管から分離されたら、細胞は、洗浄され、活性化培地（例えば、１０％のヒトＡＢ血清が補充されたＮＫ ＭＡＣＳ）で再懸濁される。活性化培地は、約０．４ｎＭの濃度のＮ－８０３、及び約１．０ｍｃｇ／ｍｌの濃度の抗ＣＤ１６抗体をさらに含む。

最も典型的に、単核細胞は、約２００ｍｌの総体積中、１～２×１０^６個の細胞／ｍｌの密度を有し、細胞及び培地は、単一の容器中である。約３～４日後、細胞に、Ｎ－８０３を含む新鮮な培地が供給され、さらなる供給サイクルが、図２に例示的に示されるように、回収、急速な増殖、及び培養の最盛期を通して、約３日置きに行われる。所望の量、典型的に、約０．５～５．０×１０^９個の総細胞に達したら、及び／又は所望の増殖（例えば少なくとも１００倍の増殖）に達したら、細胞は収集される。特に、明らかな簡単さにかかわらず、このように得られた細胞培養物は、約３週間後に、約８５％を超えるＮＫ細胞を、約８％未満のＮＫＴ細胞、及び約２．５％未満のＴ細胞、及び約１．２％未満のダブルネガティブ（ＤＮ）Ｔ細胞とともに含有する。さらに、全培養プロセスは、自己完結型のバイオリアクター内の単一の容器中で行われ得、これにより、汚染のリスクを大幅に低下させ、培養工程中の試薬及び細胞の処理をなくすことが認識されるべきである。図３は、約４８０ｍｌの総体積から収集された合計で１．１７×１０^９個の細胞で、２３日間でＮＫ細胞の約１３６倍の増殖をもたらしたＮＫ産生の例示的な結果を示す。図４は、（ＣＤ１６の結果；左側のパネルとともに）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＤＮ細胞を追跡する、細胞組成を経時的に示すさらなる実験データを示す。図２及び図３のプロセスにおいて収集された細胞についての最終的な表現型検査の結果が、図４の右側のパネルに示される。容易に分かるように、検出されたマーカーは、ＮＫ細胞を示していた。

好適な体液に関して、体液は、本明細書に示される方法において単離されたＮＫ細胞を与えられる予定の個体に対して自己であり得ると一般に考えられる。したがって、特に好ましい体液としては、新鮮な全血、（凍結された若しくは新鮮な）臍帯血、及び白血球除去輸血手順で分離された細胞が挙げられる。しかしながら、体液はまた、（典型的に、他の細胞型の中でも特に）ＮＫ細胞を含む任意の体液であり得ることが理解されるべきである。例えば、好適な別の体液としては、同種異系ドナー由来の全血が挙げられ、これは、適合ＭＨＣ型に対して一致していても又は一致していなくてもよい。したがって、ＮＫ細胞レシピエント以外の個体による提供されたばかりの全血又は貯蔵された臍帯血だけでなく、使用期限が近い血液バンク中のサンプルが、使用するのに好適であると考えられる。

同様に、単核細胞を単離又は富化する方法は、かなり変化し得ることが留意されるべきであり、当業者は、単離及び富化の最も好適な方法を容易に認識するであろう。例えば、体液が、全血又は臍帯血である場合、体液が、任意の好適な培地（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ）を用いて密度勾配遠心分離によって処理されることが好ましい。或いは、単核細胞は、白血球除去輸血によって患者から直接得られ、又は体液は、抗体を用いた赤血球の除去に供され得る。さらに他の方法において、単核細胞は、電磁ビーズ分離を用いて単離されてもよく、ここで、ビーズは、コーティングされ、或いは単核細胞に結合する抗体に結合される。

同様に、活性化及び供給のための培地の特定の性質は、ＮＫ ＭＡＣＳ培地に限定される必要はなく、ＮＫ細胞の増殖を補助することが知られているあらゆる培地が、本明細書において使用するのに好適であると考えられることが認識されるべきである。しかしながら、最も好ましくは、規定される培地が、使用され、ヒトＡＢ血清を補充され得る。

単核細胞の混合物中のＮＫ細胞の活性化は、好ましくは、抗ＣＤ１６抗体及びＮ－８０３、及び任意選択的に抗ＣＤ３抗体と組み合わせて行われる。当該技術分野において公知の／市販されている、抗ＣＤ１６抗体のための様々な供給源があり、特に好ましい抗ＣＤ１６抗体は、アゴニスト（活性化）活性を有し、ヒトＣＤ１６に対して特異的である。しかしながら、抗ＣＤ１６抗体以外の活性化因子も、本明細書において使用するのに好適であると考えられ、これには、抗ＣＤ１６抗体断片及び抗ＣＤ１６抗体断片との融合タンパク質が含まれる。それに加えて、又はその代わりに、考えられる活性化因子としては、ＣＤ３１４又はＮＫＧ２Ｄ、天然細胞毒性受容体ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）、ＣＤ３３６（ＮＫｐ４４）及びＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ－１）、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＣＤ１５８又は短い細胞質尾部を有するキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリーのメンバー（ＫＩＲ２ＤＳ及びＫＩＲ３ＤＳ）及びＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃも挙げられる。

抗ＣＤ１６抗体の濃度は、典型的に、ＮＫ細胞の活性化について当該技術分野において既知のものに従う。したがって、抗ＣＤ１６抗体の好適な濃度は、約０．０１～５．０ｍｃｇ／ｍｌ、より典型的に、約０．０１～０．３ｍｃｇ／ｍｌ、又は約０．０５～０．５ｍｃｇ／ｍｌ、又は約０．１～１．０ｍｃｇ／ｍｌ、又は約１．０～５．０ｍｃｇ／ｍｌであろう。抗ＣＤ１６抗体への曝露の持続時間に関して、最も典型的に、単核細胞が単離され、１回目（及び／２回目、及び／又は３回目）に活性化培地と接触される場合、単核細胞の混合物が、単回のみ、２回、又は３回用量の抗ＣＤ１６抗体に曝露されると一般に考えられる。当業者は、ＮＫ細胞活性化を達成するための適切なスケジュール及び投与量を容易に認識することができるであろう。最も典型的に、抗ＣＤ１６抗体への単核細胞の曝露は、Ｎ－８０３を用いた単核細胞の曝露と同時である。しかしながら、あまり好ましくない実施形態において、抗ＣＤ１６抗体への単核細胞の曝露は、Ｎ－８０３を用いた単核細胞の曝露と連続的である（抗ＣＤ１６抗体への単核細胞の曝露が先であるのが、好ましい順序である）。

必要な場合、活性化は、典型的に、細胞を抗ＣＤ１６抗体と接触させるのと同時に、細胞を抗ＣＤ３抗体と接触させることも含み得る。上述されるように、抗ＣＤ３抗体の濃度は、典型的に、ＮＫ細胞の活性化について当該技術分野において既知のものに従う。したがって、抗ＣＤ３抗体の好適な濃度は、約０．０１～１０．０ｎｇ／ｍｌ、より典型的に、約０．０１～０．１ｎｇ／ｍｌ、又は約０．１～０．５ｎｇ／ｍｌ、又は約０．３～１．０ｎｇ／ｍｌ、又は約１．０～５．０ｎｇ／ｍｌであろう。同様に、抗ＣＤ３抗体への曝露の持続時間に関して、最も典型的に、単核細胞が、単離され、１回目（及び／２回目、及び／又は３回目）に活性化培地と接触される場合、単核細胞の混合物が、単回のみ、２回、又は３回用量の抗ＣＤ３抗体に曝露されると一般に考えられる。当業者は、ＮＫ細胞活性化を達成するための適切なスケジュール及び投与量を容易に認識することができるであろう。

Ｎ－８０３に関して、Ｎ－８０３（ヒト配列とのＩＬ－１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ－１５ＲαＳｕ／ＩｇＧ１ Ｆｃ複合体；米国特許出願公開第２０１９／００２３７６６号明細書を参照、ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏから市販されている）が、活性化及び供給培地において作用物質として好ましいと考えられる。しかしながら、ＩＬ－１５活性を有する様々な別の作用物質も、本明細書において使用するのに好適であると考えられる。これに関して、何らかの理論又は仮説によって拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、Ｎ－８０３が、連続的なシグナル伝達により、ＮＫ細胞の成長及び増殖を可能にすることを想定している。対照的に、単離されたサイトカインとしてのＩＬ－１５は、非常に短い寿命を有し、シグナル伝達活性は、典型的に非常に短い。これは、単離されたサイトカインとしてのＩＬ－１５が増殖培地に加えられる場合、シグナル伝達が間欠的又は断続的であろう。対照的に、Ｎ－８０３が提供される場合、ＩＬ－１５の安定性は、大幅に延長され、シグナル伝達が連続していると考えられる。さらに、Ｎ－８０３が、生理学的性質（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｅｘｔ）（すなわち、ＩＬ－１５ Ｒ－α鎖）及びスーパーアゴニストとして作用するＮ７２Ｄ形態も提供することが認識されるべきである。したがって、任意の安定化されたＩＬ－１５化合物も、本明細書において使用するのに好適であると明らかに考えられる。さらに他の想定される態様において、（組み換え、組み換え発現された、若しくは単離された）ＩＬ－１５及び／又はＮ－８０３は、少なくとも部分的に、ＴｘＭ型融合タンパク質複合体で交換又は補充され得、特に好ましい融合タンパク質複合体が、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１８／１６５２０８号パンフレットに記載されている。例えば、想定されるＴｘＭ型融合タンパク質複合体は、ＩＬ－７、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２１からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるサイトカインを含むであろう。したがって、他の好適な選択肢の中でも、想定されるＴｘＭ融合複合体は、ＩＬ－１８／ＩＬ－７ ＴｘＭ及び／又はＩＬ－１８／ＩＬ－２１ ＴｘＭを含む。

例えば、ＩＬ－１５シグナル伝達をもたらす全ての化合物及び複合体は、このような化合物及び複合体が、単独の単離された／組み換え及び精製されたＩＬ－１５より長い血中半減期を有する限り、本明細書において使用するのに好適であると考えられる。さらに、安定化されたＩＬ－１５化合物が、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１５ Ｒαに対するヒト配列の少なくとも一部を含むことが一般に好ましい。例えば、好適な化合物としては、Ｐ２２３３９（その半減期を増加させるためにＩＬ－１５／Ｓｕｓｈｉドメイン複合体をＩｇＧ１ Ｆｃと連結するジスルフィド結合を有する、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα鎖のＳｕｓｈｉドメインの複合体；Ｎａｔｕｒｅ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１８）８：７６７５を参照）、及びＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃヘテロ二量体であるＸｍＡｂ２４３０６（例えば、国際公開第２０１８／０７１９１９号パンフレットを参照）が挙げられる。

さらなる特に想定される実施形態において、単核細胞の混合物は、体液からの単離の後、抗ＣＤ１６（及び任意選択的に抗ＣＤ３）抗体及びＮ－８０３を含む培地と一緒に細胞培養容器に入れられて、ＮＫ細胞を活性化する。最も好ましくは、容器は、細胞形状、染色、及び／又は増殖が、顕微鏡又は他の光学機器で観察され得るように光透過性である少なくとも１つの壁（又はその部分）を有する細胞培養フラスコである。したがって、細胞は、バイオリアクター中で連続的に又は定期的にモニターされ得、このように得られた測定値（例えば、細胞サイズ、細胞数、細胞分布など）を用いて、バイオリアクターに論理的に結合された制御ユニット中で、自動化された供給スケジュールを開始させるか又は調節することができることに留意されたい。最も典型的に、図２に示されるように、新鮮な培地に、Ｎ－８０３を供給することは、所定のスケジュールを用いて、典型的に、３日置きに行われ得、ここで、好ましくは、各供給は、連続的なシグナル伝達を維持するためにＮ－８０３を含む。図２に示される特定の体積が、ＮＫ細胞を、細胞増殖と整合する細胞密度まで増殖させるのに好適である一方、この体積は、特定の増殖パターンに対応するように調整されてもよいことが理解されるべきである。そのために、供給は連続的であり得ること、又は所定の体積は、容器中で観察される増殖動態に応じて変化され得ることも理解されるべきである。

ほとんどの場合、培養の最後におけるＮＫ細胞の収率は、典型的に、全生細胞の少なくとも８０％、又は少なくとも８２％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも８８％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９４％であり、残りは、ＮＫＴ細胞、ＤＮ Ｔ細胞、及びＴ細胞である。例えば、残りのＮＫＴ細胞は、典型的に、全生細胞の１０％以下、又は８％以下、又は７％以下、又は６％以下であろう一方、残りのＴ細胞は、典型的に、全生細胞の５％以下、又は４％以下、又は３％以下、又は２％以下であり、残りのＤＮ Ｔ細胞は、典型的に、全生細胞の３％以下、又は２％以下、又は１．５％以下、又は１％以下であろう。

したがって、異なる観点から見ると、本明細書において想定されるシステム及び方法は、ＮＫ細胞の著しく高い増殖が可能であることが理解されるべきであり、典型的な増殖は、単核細胞の混合物中に元々存在するＮＫ細胞の数に対して、少なくとも８０倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも１２０倍、又は少なくとも１３０倍、又は少なくとも１４０倍である。このような増殖は、活性化及び培養（ワンポットプロセス）の非常に簡単な方法を考慮すると特に注目に値する。実際に、単核細胞の混合物が、細胞培養容器に入れられてから、全プロセスが、同じ容器内で継続し得、図２に概略的に示されるように、培地のみの添加によって持続されることになる。したがって、複雑な処理及び高価な試薬が、完全に回避され、汚染のリスクが、著しく低下される。

本発明の主題に限定するものではないが、したがって、ＮＫ細胞は、連続的なモニタリング、ＣＯ_２及びＯ_２レベルの連続的な管理、並びに細胞密度（例えば、コンフルエンス）を検出するための連続的なモニタリングを可能にする培養環境において増殖及び／又は活性化されると考えられる。このような環境についての他の選択肢の中でも、特に好ましい環境は、例えば、国際公開第２０１５／１６５７００号パンフレットに記載されるような、自動化された細胞培養及び収集デバイスである。このような「ボックス中のＧＭＢ（ＧＭＢ－ｉｎ－ａ－ｂｏｘ）」システムは、供給スケジュールの制御、ガス制御を有益に可能にし、細胞密度、増殖（動態）及び細胞の健康のリアルタイム検出を可能にし、並びに著しく軽減される処理要件のため、汚染の可能性を大幅に低下させる。

さらに他の想定される態様において、特に、ＮＫ細胞が末梢血から産生される場合、本明細書に示されるシステム及び方法はまた、ＣＤ５６^ｄｉｍ及びＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ} ＮＫ細胞の産生を有利に可能にすることに留意されたい。さらなる培養条件に応じて、次に、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ} ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^ｄｉｍ細胞へと分化し得る。次に、このような異なるＮＫ細胞集団が、それらの異なる成熟及び細胞毒性プロフィールのため、異なる治療選択肢に関して用いられ得る。さらに、組成物、システム及び方法はまた、適切な刺激及び培養により、ＮＫＴ細胞を産生するのに好適であろうことが理解されるべきである。

上記を考慮して、以下により詳細に示されるように、１つの例示的な方法は、単一のＦｉｃｏｌｌ遠心分離工程によるＣＢＭＣ又はＰＢＭＣの単離、それに続く、１０％のヒトＡＢ血清を含むＮＫ ＭＡＣＳ培地中における、約０．４ｎＭのＮ－８０３及び約０．１ｍｃｇ／ｍｌの抗ＣＤ１６抗体（例えば、クローンＢ７３．１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている）、及び任意選択的に約０．５ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体との、細胞のインキュベーションを含んでいた。典型的に、１００万個の細胞／ｍｌで１５０ｍＬのＣＢＭＣを、上記の試薬とともに出発材料として使用した。培地を、０．４ｎＭの最終濃度のためのＮ－８０３の対応する濃度を有する既存の体積と比較して、１：２及び１：１０のレジメンで、週に２回のＮ－８０３による希釈に使用した。

材料：臍帯血及び末梢血からのＭＮＣ、抗ＣＤ１６抗体、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ；ＮＫ補充物を含むＮＫ ＭＡＣＳ培地、表現型検査のための染色抗体（ａＣＤ３、ａＣＤ１６、ａＣＤ５６、ａＮＫｐ３０、ａＮＫｐ４４、ａＮＫｐ４６、ａＮＫＧ２Ａ、ａＮＫＧ２Ｄ、ａＴＩＧＩＴ、ａＣＤ３４、ａＴＲＡＩＬ、ａＣＤ５７、ａＣＸＣＲ３、及びａＣＣＲ５）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ヒトＡＢ血清、Ａｃｃｅｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）；Ｎ－８０３、Ｂｏｘキット中のＧＭＰ、Ｎａｎｔｂｉｏ Ｉｎｃ Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ。

方法：ＭＮＣを、臍帯血又は末梢血から新たに単離した。それを、完全ＮＫＭＡＣＳ培地（ＮＫＭＡＣＳ＋補充物＋１０％のｈｕ－ＡＢ－血清）で２回洗浄した。ＭＮＣを、１×１０^６個の細胞／ｍＬの密度で、１５０ｍＬの培地中で懸濁させた。１５０ｍＬの細胞懸濁液に、ＣＤ１６抗体（１ｍｃｇ／ｍＬ）及びＮ－８０３（０．４ｎＭ）を補充した。さらなるＧＭＰキットを、ボックスにインストールし、プロトコルを、ＶｉｖａＢｉｏウェブポータルを通してアップロードした。完全なサイトカイン及び抗体を含む細胞懸濁液を、細胞バッグに移し、１５０ｍＬの細胞懸濁液を、Ｂｏｘ－キット中の細胞注入部を介して注入した。ＧＭＰ Ｂｏｘが、イメージングを開始し、細胞を、図２に示されるプロトコルに書かれた工程に従って増殖させた。図２に記載されるように、ボックス中の細胞に、１０×サイトカイン培地又は２×サイトカイン培地を交互に補充した。ＮＫ富化（ＣＤ３、ＣＤ５６、及びＣＤ１６発現についての表現型）及び細胞の健康（細胞数、生存率、及び細胞密度）を、定期的にモニターし、図３及び図４ａにあるようにグラフにプロットした。細胞を、富化後にボックスから収集し、図４にあるようなその完全な特性評価のためにＮＫ細胞ベースの受容体の発現について測定した。

本明細書において使用される際、医薬組成物又は薬物を「投与する」という用語は、医薬組成物又は薬物の直接及び間接的な投与の両方を指し、ここで、医薬組成物又は薬物の直接投与は、典型的に、医療従事者（例えば、医師、看護師など）によって行われ、間接的な投与は、（例えば、注射、注入、経口送達、局所送達などによる）直接投与のために、医薬組成物又は薬物を医療従事者に提供するか又は利用可能にする工程を含む。最も好ましくは、細胞又はエキソソームは、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ又はｓｕｂｄｅｒｍａｌ）注射によって投与される。しかしながら、他の想定される態様において、投与はまた、静脈注射であり得る。その代わりに、又はそれに加えて、抗原提示細胞は、患者の細胞から単離又は成長され、インビトロで感染され、次に、患者に輸注され得る。したがって、想定されるシステム及び方法が、高度に個人化された癌治療のための完全な創薬システム（例えば、創薬、治療プロトコル、検証など）であると考えられ得ることが理解されるべきである。

本明細書における値の範囲の記載は、その範囲内に含まれる各個別の値を個々に表す簡単な方法として用いられるものであるに過ぎない。本明細書に特に示されない限り、各個別の値は、それが本明細書に個々に記載されているかのように本明細書に援用される。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に特に示されない限り又は文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行われ得る。本明細書における特定の実施形態に関して示されるあらゆる例、又は例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、本開示の全容をより明らかにするためのものであるに過ぎず、特に権利請求されない限り本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる文言も、権利請求される発明の実施に不可欠な権利請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。

既述されるものに加えて多くのさらなる変更が、本明細書に開示される概念の全容から逸脱せずに可能であることは、当業者に明らかであるはずである。したがって、開示される主題は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されるものではない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の両方を解釈する際、全ての用語は、文脈と一致する最も広い様式で解釈されるべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、要素、構成要素、又は工程を非限定的に指すものと解釈されるべきであり、これは、言及される要素、構成要素、又は工程が、明示的に言及されていない他の要素、構成要素、又は工程とともに、存在するか、又は用いられるか、又はそれと組み合わされてもよいことを示す。本明細書請求項が、Ａ、Ｂ、Ｃ・・・及びＮからなる群から選択される何かの少なくとも１つを指す場合、その文は、ＡプラスＮ、又はＢプラスＮなどではなく、群からの１つのみの要素を必要とするものと解釈されるべきである。

Claims (37)

1. ＮＫ細胞を富化する方法であって、
   全血又は臍帯血から、単核細胞の混合物を単離する工程と、前記単核細胞の混合物を、容器中で抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３抗体、及びＮ－８０３と接触させて、ＮＫ細胞を活性化する工程と；
   活性化されたＮＫ細胞が全生細胞の少なくとも９０％を占めるまで又は前記活性化されたＮＫ細胞が、少なくとも８０倍の増殖に富化されるまで、前記活性化されたＮＫ細胞に、同一の容器中で、Ｎ－８０３を含む培地を連続して供給する工程と
   を含む方法。
2. 前記単核細胞の混合物を単離する工程が、密度勾配遠心分離を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記単核細胞の混合物が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＤＮ Ｔ細胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記単核細胞の混合物が、ＮＫ細胞を富化するためにさらに処理されない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記抗ＣＤ１６抗体が、ヒトＣＤ１６に対する特異性を有するモノクローナル抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記単核細胞の混合物が、約１００～５００×１０^６個の細胞を含有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記混合物を接触させる工程が、約１００～３００ｍｌの体積で又は約１×１０^６個の細胞／ｍｌの細胞密度で行われる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記抗ＣＤ１６抗体が、０．０５～０．５ｍｃｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記Ｎ－８０３が、０．１～１．０ｎＭの濃度で存在する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記抗ＣＤ３抗体が、０．１～１．０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
11. Ｎ－８０３を含む前記培地が、ヒトＡＢ血清を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. Ｎ－８０３を含む前記培地が、ＮＫ ＭＡＣＳ培地を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記連続して供給する工程が、約７２時間置きに行われる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記連続して供給する工程が、約０．５～５．０×１０^９個の細胞の総細胞数に達するまで行われる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記活性化されたＮＫ細胞に連続して供給する工程が、ＮＫ細胞が少なくとも１００倍の増殖に富化されるまで行われる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 単核細胞の混合物からＮＫ細胞を増殖する方法であって、
    ５％以下のＮＫ細胞を含有する前記単核細胞の混合物を提供する工程と；
    容器中で、前記単核細胞の混合物を、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３抗体、及びＮ－８０３と接触させて、ＮＫ細胞を活性化する工程と；
    前記活性化されたＮＫ細胞が全生細胞の少なくとも９０％を占めるまで又は前記活性化されたＮＫ細胞が少なくとも８０倍の増殖に富化されるまで、前記活性化されたＮＫ細胞に、当該容器中で、Ｎ－８０３を含む培地を供給する工程と
    を含む方法。
17. 前記単核細胞の混合物が、前記ＮＫ細胞を与えられる個体に対して、ＭＨＣ適合した同種異系起源から得られる、請求項１６に記載の方法。
18. 前記単核細胞の混合物が、３％以下のＮＫ細胞を含有する、請求項１６又は１７に記載の方法。
19. 前記単核細胞の混合物が、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＤＮ細胞をさらに含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記抗ＣＤ１６抗体が、ヒトＣＤ１６に対する特異性を有するモノクローナル抗体である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記抗ＣＤ１６抗体が、０．０５～０．５ｍｃｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記Ｎ－８０３が、０．１～１．０ｎＭの濃度で存在する、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記抗ＣＤ３抗体が、０．１～１．０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. Ｎ－８０３を含む前記培地が、ヒトＡＢ血清を含む、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記供給する工程が、約７２時間置きの間隔で連続して供給することを含む、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記供給する工程が、約０．５～５．０×１０^９個の細胞の総細胞数に達するまで行われる、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記活性化されたＮＫ細胞に供給する工程が、ＮＫ細胞が少なくとも１００倍の増殖に富化されるまで行われる、請求項１６～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記活性化されたＮＫ細胞に供給する工程が、自動化された方法で行われる、請求項１６～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 自動化されたバイオリアクター中でＮＫ細胞を増殖する方法であって、
    ＮＫ細胞を活性化するのに十分な時間にわたって、Ｎ－８０３及び、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１６抗体を含む活性化培地中で、単核細胞の混合物をインキュベートする工程であって；
    前記単核細胞の混合物が、前記混合物をインキュベートしながら細胞培養容器に含まれる、工程と；
    前記細胞が前記容器に入っている状態で、前記細胞の増殖を測定する工程と；
    活性化されたＮＫ細胞が全生細胞の少なくとも９０％を占めるまで又は前記活性化されたＮＫ細胞が、少なくとも８０倍の増殖に富化されるまで、同一の容器中で、Ｎ－８０３を含む培地を用いて、前記細胞に自動的に供給する工程であって、前記供給が、所定のスケジュール及び／又は前記細胞の増殖を測定する前記工程からの結果によって制御される、工程と；
    前記細胞への供給を停止する工程であって、前記停止が、所定のスケジュール及び／又は前記細胞の増殖を測定する前記工程からの結果によって制御される、工程と
    を含む方法。
30. 前記容器が、約２００ｍｌ～約２，５００ｍｌの体積を有する、請求項２９に記載の方法。
31. 前記細胞の増殖を測定する工程が、前記容器の壁を通して行われる、請求項２９又は３０に記載の方法。
32. 前記細胞の増殖を測定する工程が、光学的測定を使用する、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記活性化培地が、０．１～１．０ｎＭの濃度のＮ－８０３及び０．０５～０．５ｍｃｇ／ｍｌの濃度の前記抗ＣＤ１６抗体を含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
34. ＮＫ細胞を活性化するのに十分な前記時間が、２４時間～９６時間である、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. Ｎ－８０３を含む前記培地が、０．１～１．０ｎＭの濃度のＮ－８０３を含む、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記細胞が、約０．５～５．０×１０^９個の細胞の総細胞数に達するまで供給される、請求項２９～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記細胞が、ＮＫ細胞が少なくとも１００倍の増殖に富化されるまで供給される、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の方法。

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