KR20210080566A

KR20210080566A - 단핵 세포 유래 nk 세포(mononuclear cell derived nk cells)

Info

Publication number: KR20210080566A
Application number: KR1020217018216A
Authority: KR
Inventors: 로힛 두갈; 란짓 신하; 웬쟈오 리; 제이슨 이삭슨; 칼 마르퀘즈; 패트릭 순-시옹
Original assignee: 난트퀘스트, 인크.
Priority date: 2019-07-08
Filing date: 2019-07-08
Publication date: 2021-06-30
Also published as: JP2022513614A; JP2023040184A; IL283998A; CA3120695A1; SG11202104339WA; AU2019456283B2; EP3853354A4; EP3853354A1; JP7213976B2; WO2021006875A1; CN113166726A; AU2019456283A1

Abstract

제대혈 또는 말초혈 NK 세포는 CD34+ 조혈모세포 또는 NK 세포를 분리할 필요 없이, 그리고 피더 층의 필요 없이 전혈 단핵 세포로부터 제조된다. 유리하게는, 본 명세서에 제시된 방법은 항CD16 작용제 항체, 항CD3 항체, 및 N-803을 사용하는 풍부화 공정을 사용한다. 또한, 고려된 공정은 완전 자동화 생성 공정(GMP in a box)에 적용하기에 적합하다.

Description

단핵 세포 유래 NK 세포(MONONUCLEAR CELL DERIVED NK CELLS)

본 개시내용은 전혈로부터의 제대혈(CB) 또는 말초혈(PB) NK 세포에 관한 것과 같은 면역 적격 세포를 생성하고 배양하기 위한 조성물, 방법 및 장치에 관한 것이다.

배경기술의 설명은 본 개시내용을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이는 본 명세서에서 제공되는 임의의 정보가 선행기술이거나 청구된 발명과 관련되거나, 또는 명시적으로 또는 암시적으로 참조된 임의의 간행물이 선행기술이라는 것을 인정하는 것이 아니다.

본 명세서의 모든 간행물 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조에 의해 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 참조로서 포함된다. 포함된 참조에서 용어의 정의 또는 사용이 본 명세서에 제공된 용어의 정의와 일치하지 않거나 반대되는 경우, 본 명세서에서 제공된 해당 용어의 정의가 적용되고, 참조에서의 해당 용어의 정의는 적용되지 않는다.

자연살해(NK) 세포는 선천적 면역 세포의 군을 구성하며, 이는 종종 그래뉼리신 및 퍼포린의 표적 지향적 방출을 통해 항체 의존성 세포 독성을 나타내는 세포독성 림프구로 특징지어진다. 대부분의 NK 세포는 다양한 활성화 및 억제 수용체의 모음 외에도, 특정 세포 표면 마커 프로파일(예를 들어 CD3^-, CD56⁺, CD16⁺, CD57⁺, CD8⁺)을 갖는다. 더 최근에는, NK 세포가 특정 암 치료의 중요한 구성요소가 되었지만, 전혈에서 NK 세포의 분율이 상대적으로 낮기 때문에, 상당한 양의 NK 세포(특히 자가 NK 세포)의 생성이 중요한 장애물이 되었다.

치료적으로 중요한 양의 NK 및 NK-유사 세포를 수득하기 위해, NK 세포는 다양한 전구체 세포로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 다양한 줄기 세포 인자(SCF), FLT3 리간드, 인터류킨(IL)-2, IL-7 및 IL-15는 제대혈 유래 시토카인 유도 살해(CIK) 세포를 유도하고 증식시키기 위한 다양한 시험관 내 접근법에서 보고되었다(Anticancer Research 30: 3493-3500 (2010)). 마찬가지로, CD34⁺ 조혈모세포는 US 2018/0044636에서 보고된 바와 같이 IL-12 및 기타 물질에 노출될 수 있다. 또 다른 접근법에서, 인간 혈관아세포는 WO2011/068896에 기재된 바와 같이 두 개의 상이한 시토카인 칵테일에 순차적으로 노출되었고, WO2012/128622에 교시된 바와 같이 배아 후(post-embryonic) 조혈세포와 함께 상이한 시토카인 칵테일이 사용되었다. 이들 방법들 중 적어도 일부는 NK 세포의 상당한 n배 증식을 제공하지만, 그러한 증식을 위한 방법 및 약제는 시간과 자원이 모두 필요하다. 또한, 많은 알려진 방법들은 피더(feeder) 층 상에서의 NK 세포 배양도 필요로 하며, 이는 기술 및 규제 관점에서 종종 문제가 된다는 점에 유의해야 한다.

더욱 단순화된 방법에서, 급성 골수성 백혈병(AML) 세포는 TpoR 작용제에 노출되어 AML 세포가 NK 세포를 형성하도록 유도할 수 있다. 그러나, 그러한 접근법은 치료용 세포 제조의 공급원으로서 실행가능하지 않을 것으로 보인다. 대안적 방법들은 또한 WO 2011/103882에 개시된 바와 같이 다양한 인터류킨, 줄기 세포 인자, 및 FLT3 리간드의 존재 하에서 말초혈 세포를 배양하는 것에 의존해 왔다. 또 다른 방법에서, US 2013/0295671은 시토카인과 함께 항-CD16 및 항-CD3 항체로 이미 존재하는 NK 세포를 자극하는 방법을 교시한다. 절차적으로 더 단순하지만, 이러한 방법은 여전히 세포의 정교한 조작을 필요로 하고, 필요한 특정 시약으로 인해 상당한 비용이 추가된다.

또한 추가로 알려진 방법에서, US 10,125,351은 밀도 구배 분리 처리되는 세포 공급원으로서 제대혈 또는 말초혈을 사용하여 유핵 세포(nucleated cell)를 분리한 다음, 인터페론, 인터류킨, CD3 항체 및 인간 알부민을 함유하는 배지를 사용하여 배양하는 것을 기재한다. 가장 유리하게는, 그러한 방법은 생물반응기에서 관류 배양을 처리할 수 있고, 그에 따라 작동상 어려움을 상당히 감소시킨다. 그러나 유감스럽게도, NK 세포 수율이 상대적으로 낮다.

따라서, 상당한 양의 NK 세포를 생성하는 다양한 방법이 당업계에 알려져 있지만, 이들 모두 또는 거의 모두는 다양한 결점을 겪고 있다. 결론적으로, 상당한 양의 NK 세포, 특히 자가 NK 세포를 생성하는 개선된 시스템 및 방법을 제공할 필요가 있다. 또한, 개선된 시스템 및 방법은 또한 세포 배양의 자동화를 가능하게 할 것이며, 그러한 방법을 임상적으로 및 상업적으로 실행가능하게 만들기 위해 시약 요구사항을 상당히 감소시킬 것이다.

본 발명자들은 개념적으로 단순하고 효율적인 방식으로 NK 세포의 생성 및 증식을 가능하게 하는 조성물, 방법 및 장치를 발견하였다. 유리하게는, NK 세포는 CD34+ 조혈모세포(HSC) 또는 NK 세포를 분리하지 않고, 피더 층을 사용하지 않으며, 바람직하게는, N-803, 및 선택적으로 항-CD16 작용제 항체 및 항-CD3 항체를 사용하는 풍부화 공정에 의해, 제대혈 또는 전혈로부터 수득한 혈액 단핵 세포(MNC)로부터 생성될 수 있다.

본 발명의 주제의 일 양태에서, 본 발명자는, 생체액으로부터 단핵 세포의 혼합물을 분리하는 단계, 단핵 세포의 혼합물을 항-CD16 항체 및 N-803과 접촉시켜 NK 세포를 활성화하는 단계, 및 활성화된 NK 세포에 N-803을 함유하는 배지를 순차적으로 공급하는 또 다른 단계를 포함하는 NK 세포를 생성하는 방법을 고려한다.

대부분의 통상적인 예에서, 단핵 세포의 혼합물을 분리하는 단계는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 수행되고/되거나, 생체액은 전혈 또는 제대혈이다. 따라서, 단핵 세포의 혼합물은 일반적으로 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 및 이중 음성(DN) T 세포를 포함할 것이다. 단핵 세포의 혼합물이 NK 세포를 풍부화하기 위해 추가로 처리되지 않는 것이 명백히 배제되는 것은 아니지만, 일반적으로 바람직하다.

고려되는 항-CD16 항체와 관련하여, 일반적으로 항체는 인간 CD16에 특이성을 갖는 단일클론 항체인 것이 바람직하다. 가장 통상적으로는, 항-CD16 항체는 0.05~0.5 mcg/ml의 농도로 존재하고/하거나, N-803은 0.1~1.0 nM의 농도로 존재한다. 원하는 경우, 고려되는 방법은 또한 단핵 세포의 혼합물을 항-CD3 항체(예를 들어, 0.1~1.0 ng/ml 사이의 농도)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 혼합물을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 단핵 세포의 혼합물은 약 100~500×10⁶ 세포를 함유하고/하거나, 혼합물을 접촉시키는 단계는 약 100~300 ml의 부피에서 또는 약 1×10⁶ 세포/ml의 세포 밀도에서 수행된다. 필수적이지는 않지만 바람직하게는, N-803을 함유하는 배지는 인간 AB 혈청 및/또는 NK MACS™배지(독일, 베르기슈 글라트바흐, 51429, 프리드리히-에버트-스트라스 68 소재, Miileny Biotech에서 구매가능함) 및 하이드로코르티손(0.1~5 uM)을 포함한다. 또한, 순차적으로 공급하는 단계는 약 72시간마다 수행되고/되거나, 순차적으로 공급하는 단계는 약 0.5~5.0×10⁹ 세포의 총 세포 수에 도달할 때까지 수행되는 것으로 고려된다. 또한, 활성화된 NK 세포를 순차적으로 공급하는 단계는 단일 용기에서 수행될 수 있고, 단핵 세포의 혼합물을 접촉시키는 단계는 동일 용기 내에서 수행될 수 있다.

다른 구현예에서, 활성화된 NK 세포를 순차적으로 공급하는 단계는 NK 세포가 적어도 100배 증식까지 풍부화될 때까지 및/또는 NK 세포가 모든 생세포의 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%를 구성할 때까지 수행된다.

따라서, 다른 관점에서 볼 때, 본 발명자들은 또한 5% 이하의 NK 세포를 함유하는 단핵 세포의 혼합물을 제공하는 단계를 포함하는 단핵 세포의 혼합물로부터 NK 세포를 증식시키는 방법을 고려한다. 또 다른 단계에서, 이어서 단핵 세포의 혼합물을 항-CD16 항체 및 N-803과 접촉시켜 NK 세포를 활성화하고, 추가 단계에서 활성화된 NK 세포는 N-803을 함유하는 배지로 공급된다.

필수적이지는 않지만 바람직하게는, 단핵 세포의 혼합물은 전혈 또는 제대혈로부터 수득하거나, 단핵 세포의 혼합물은 NK 세포를 수용하는 개체에 대하여 MHC-매칭 자가 공급원으로부터 수득한다. 통상적인 예에서, 단핵 세포의 혼합물은 3% 이하의 NK 세포를 함유하고/하거나, T 세포, NKT 세포, 및 DN 세포를 추가로 포함할 수 있다. 배지, 항-CD16 항체, N-803, 및 항-CD3 항체와 관련하여, 위에 언급한 것과 동일한 고려사항이 적용된다.

추가로, 공급 단계는 약 72시간마다의 간격으로 순차적으로 공급하는 단계를 포함하고, 공급 단계는 약 0.5~5.0×10⁹ 세포의 총 세포 수에 도달할 때까지 수행되고/되거나, 활성화된 NK 세포를 공급하는 단계는 NK 세포가 적어도 100배 증식까지 풍부화될 때까지 수행되는 것으로 고려된다. 추가 구현예에서, 활성화된 NK 세포를 공급하는 단계는 자동화된 방식으로, 바람직하게는 단일 용기에서 수행되는 것으로 고려된다.

따라서, 본 발명의 주제의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 또한 자동화된 생물반응기에서 NK 세포를 증식시키는 방법을 고려한다. 그러한 방법은 통상적으로 NK 세포를 활성화하기에 충분한 시간 동안 N-803 및 항-CD16 항체를 함유하는 활성화 배지에서 단핵 세포의 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 포함할 것이며, 여기서 단핵 세포의 혼합물은 혼합물을 인큐베이션하는 동안 세포 배양 용기에 함유된다. 또 다른 단계에서, 세포가 용기 내에 있는 동안 세포의 성장을 측정하고, 미리 정해진 일정 및/또는 세포의 성장을 측정하는 단계의 결과에 따라, 세포는 N-803을 함유하는 배지로 자동으로 공급된다. 또 다른 단계에서, 미리 정해진 일정 및/또는 세포의 성장을 측정하는 단계의 결과에 따라 세포 공급을 종료한다.

예를 들어, 적합한 용기는 약 200 ml 내지 약 2,500 ml의 부피를 가질 것이고/이거나 세포의 성장을 측정하는 단계는 (예를 들어, 광학 측정을 사용하여) 용기의 벽을 통해 수행된다. 가장 바람직하게는, 활성화 배지는 0.1~1.0 nM의 농도의 N-803 및 0.05~0.5 mcg/ml 농도의 항-CD16 항체를 함유한다. 다른 예에서, N-803을 함유하는 배지는 0.1~1.0 nM 농도의 N-803을 함유한다. 가장 통상적으로, NK 세포를 활성화하는 데 충분한 시간은 24시간 내지 96시간이며, 세포는 약 0.5~5.0×10⁹ 세포의 총 세포 수에 도달할 때까지 및/또는 NK 세포가 적어도 100배 증식까지 풍부화될 때까지 공급된다.

본 발명의 주제의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 또한 독특한 유형의 면역 적격 세포를 갖는 배지를 함유하는 세포 배양 용기(예를 들어, 약 200 ml 내지 약 2,500 ml의 부피를 가짐)를 고려한다. 가장 바람직하게는, 배지는 모든 생세포의 적어도 80% 양의 NK 세포, 모든 생세포의 10% 이하의 양의 NKT 세포, 모든 생세포의 5% 이하의 양의 T 세포, 및 모든 생세포의 3% 이하의 양의 DN T 세포를 함유한다. 바람직하게는, 용기의 적어도 하나의 벽은 광학적으로 투명한 부분을 갖고/갖거나, NK 세포는 모든 생세포의 적어도 약 90%의 양으로 존재한다.

다양한 목적, 특징, 양태 및 이점은, 유사한 번호가 유사한 구성요소를 나타내는, 첨부 도면과 함께, 바람직한 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

도 1은 제대혈로부터 출발하여 CBMC의 분리를 통해 이어서 NK 세포의 풍부화/증식을 위한 씨드(seed)를 구성하는 공정을 설명하는 예시적인 개략도를 나타낸다.
도 2는 자동화 환경('GMP in a box')에서 대표적인 공정의 예시적인 세부 사항과 다양한 성분의 첨가 일정을 나타낸다.
도 3은 NK 세포에 대한 도 2의 공정의 풍부화 동력학에 대한 예시적인 결과를 수 및 선택된 유세포 분석 특성에 의해 나타낸다.
도 4는 도 2의 공정의 다양한 세포 개체군의 동력학에 대한 예시적인 결과를, 마커 발현, 특히 대부분의 NK 활성화 수용체의 상당한 발현을 갖는 결과와 함께 나타낸다.

암 치료에서 면역 치료법의 사용이 지속적으로 증가함에 따라, 치료제로서 충분한 양의 NK 세포, 특히 자가 NK 세포를 생성하는 것이 중요해졌다. 불행히도, 현재의 많은 방법은 피더 층을 사용하거나 분리된 CD34+ 조혈모세포(HSC)의 분화를 필요로 하며, 이는 시간과 자원 집약적이다. 또한, 다양한 조작 단계가 필요하기 때문에, 이러한 방법은 통상적으로 인간 상호작용이 필요하고, 오염되기 쉽다.

NK 세포의 생성 방법을 개선하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 이제, 단핵 세포를 함유하는 생체액(예를 들어, 전혈, 제대혈)으로부터, 단핵 세포가 일단 수득되면 심지어는 완전히 자동화될 수 있는 단순하고 효과적인 방식으로 치료적으로 중요한 양(예를 들어, 적어도 0.5×10⁹ NK 세포)을 생성하는 다양한 시스템, 조성물 및 방법을 발견하였으며, 이는 도 1에 개략적으로 예시된 바와 같다. 바람직하게는, 생물반응기는 독립형 장치(self-contained unit)이며, 다양한 작동(예를 들어, 유체 이동을 위한 펌프 조작, 온도 및 가스 조절, 영상 처리 등)을 위한 프로그래밍 가능한 프로토콜을 실행하고, 규제 준비 보고서를 생성하기 위한 기판 상의 중앙 프로세서 및 메모리뿐만 아니라, 세포 배양을 모니터링하기 위한 현미경(또는 기타 광학 장치)을 가질 것이다.

예를 들어, 본 명세서에서 고려되는 하나의 공정에서, 말초 전혈 또는 제대혈이 단핵 세포를 수득하기 위해 처리되는 출발 물질로 사용된다. 가장 통상적으로는, 처리는 종래의 밀도 구배 원심분리를 사용하여(예를 들어, GE Lifesciences에서 구매가능한, Ficoll-Paque Plus™(친수성 가용성 다당류, 밀도 1.077 g/mL)를 사용하여) 수행할 수 있다. 일단 단핵 세포가 원심분리 관에서 분리되면, 세포를 세척하고 활성화 배지(예를 들어, 10% 인간 AB 혈청으로 보충된 NK MACS)에 재현탁시킨다. 활성화 배지는 약 0.4 nM 농도의 N-803, 및 약 1.0 mcg/ml 농도의 항-CD16 항체를 추가로 포함한다.

가장 통상적으로, 단핵 세포는 약 200 ml의 총 부피 중 1~2×10⁶ 세포/ml의 밀도를 갖고, 세포 및 배지는 단일 용기에 있다. 약 3~4일 후, 세포에 N-803을 함유하는 신선한 배지를 공급하고, 도 2에 예시적으로 나타나 있는 바와 같이, 회수, 급속 증식, 및 배양 정점(culmination)을 통해 약 3일마다 추가 공급 사이클을 수행한다. 원하는 양, 통상적으로 약 0.5~5.0×10⁹ 총 세포에 도달할 때, 및/또는 원하는 증식(예를 들어, 적어도 100배 증식)에 도달할 때 세포를 수확한다. 특히, 명백한 단순성에도 불구하고, 이렇게 수득된 세포 배양물은 약 3주 후에 약 85% 초과의 NK 세포, 약 8% 미만의 NKT 세포, 및 약 2.5% 미만의 T 세포, 및 약 1.2% 미만의 이중 음성(DN) T 세포를 함유한다. 또한, 전체 배양 공정은 독립형 생물반응기 내의 단일 용기에서 수행될 수 있으며, 이는 오염 위험을 상당히 감소시키며, 배양 단계 동안 시약 및 세포 취급을 제거한다는 점을 인식해야 한다. 도 3은, 23일차에 약 480 ml의 최종 부피로부터 수확된 총 1.17×10⁹ 세포를 갖는, 약 136배의 NK 세포의 증식을 수득한 NK 생성에 대한 예시적인 결과를 나타낸다. 도 4는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, DN 세포를 추적하는 시간 경과에 따른 세포 조성을 설명하는 추가 실험 데이터를 나타낸다(CD16 결과와 함께; 왼쪽 패널). 도 2 및 도 3의 공정에서 수확된 세포에 대한 최종 표현형에 대한 결과는 도 4의 오른쪽 패널에 나타나 있다. 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 검출된 마커는 NK 세포를 나타내었다.

적합한 생체액과 관련하여, 일반적으로 액은 본 명세서에 제시된 방법에서 분리된 NK 세포를 수용할 개체에 대해 자가유래성일 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 특히 바람직한 생체액은 신선한 전혈, (냉동 또는 신선한) 제대혈 및 백혈구 성분채집술 절차에서 분리된 세포를 포함한다. 그러나, 생체액은 (통상적으로 여러 세포 유형들 중에서 특히) NK 세포를 함유하는 어떠한 액이어도 된다는 것을 인식해야 한다. 예를 들어, 적합한 대안적 생체액에는 동종 공여자로부터의 전혈이 포함되며, 이는 상용성 MHC 유형에 대해 매칭되거나 매칭되지 않을 수 있다. 따라서, 만료일이 다가오는 혈액은행의 샘플뿐만 아니라, NK 세포 수용자 이외의 개인에 의해 신선하게 공여된 전혈 또는 저장된 제대혈이 사용에 적합하다고 간주된다.

마찬가지로, 단핵 세포를 분리하거나 풍부화하는 방법은 상당히 다양할 수 있으며, 당업자는 가장 적합한 분리 및 풍부화의 방법을 쉽게 알 수 있을 것이라는 점에 주목한다. 예를 들어, 생체액이 전혈 또는 제대혈인 경우, 액은 임의의 적합한 배지(예를 들어, Ficoll-Hypaque)를 사용하여 구배 밀도 원심분리를 통해 처리되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 단핵 세포는 백혈구 성분채집술에 의해 환자로부터 직접 수득할 수 있거나, 항체를 사용하여 생체액의 적혈구 세포를 제거할 수 있다. 또한 추가 방법에서, 단핵 세포는, 비드가 코팅되거나 다르게는 단핵 세포에 결합하는 항체에 연결되는 자석 비드 분리를 사용하여 분리될 수 있다.

마찬가지로, 활성화 및 공급을 위한 배지의 특정 성질은 NK MACS 배지에 제한될 필요가 없고, NK 세포의 성장을 지원하는 것으로 알려진 모든 배지가 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로 여겨진다는 것을 인식해야 한다. 그러나, 가장 바람직하게는 정의된 배지가 사용되며, 이는 인간 AB 혈청으로 보충될 수 있다.

단핵 세포의 혼합물 내 NK 세포의 활성화는 바람직하게는 항-CD16 항체 및 N-803, 및 선택적으로 항-CD3 항체의 조합으로 수행된다. 당업계에 알려진/구매가능한 항-CD16 항체에 대한 다양한 공급원이 있으며, 특히 바람직한 항-CD16 항체는 작용제(활성화) 활성을 갖고, 인간 CD16에 특이적이다. 그러나, 항-CD16 항체 이외의 활성화제 또한 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로도 간주되며, 항-CD16 항체 단편 및 항-CD16 항체 단편과의 융합 단백질을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 고려되는 활성화제에는 또한, 특히 CD314 또는 NKG2D, 천연 세포독성 수용체 CD335(NKp46), CD336(NKp44) 및 CD337(NKp30), CD226(DNAM-1), CD244(2B4), CD158 또는 짧은 세포질 꼬리를 운반하는 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR) 부류의 구성원(KIR2DS 및 KIR3DS) 및 CD94/NKG2C가 포함된다.

항-CD16 항체의 농도는 통상적으로 NK 세포의 활성화에 대해 당업계에 이미 알려진 농도를 따를 것이다. 따라서, 항-CD16 항체의 적합한 농도는 약 0.01~5.0 mcg/ml, 더 통상적으로는 약 0.01~0.3 mcg/ml, 또는 약 0.05~0.5 mcg/ml, 또는 약 0.1~1.0 mcg/ml, 또는 약 1.0~5.0 mcg/ml일 것이다. 항-CD16 항체에 대한 노출 기간과 관련하여, 단핵 세포의 혼합물은 가장 통상적으로는 단핵 세포가 분리되고 최초(및/두 번째, 및/또는 세 번째)로 활성화 배지와 접촉할 때, 항-CD16 항체의 1회, 2회 또는 3회의 용량에만 노출되는 것으로 일반적으로 고려된다. 당업자는 NK 세포 활성화를 달성하기 위한 적절한 일정 및 투여량을 쉽게 인식할 수 있을 것이다. 가장 통상적으로는, 항-CD16 항체에 대한 단핵 세포의 노출은 N-803에 의한 단핵 세포의 노출과 동시에 일어난다. 그러나, 덜 바람직한 구현예에서, 항-CD16 항체에 대한 단핵 세포의 노출은 N-803에 의한 단핵 세포의 노출에 대해 순차적이다(항-CD16 항체에 대한 단핵 세포의 노출이 먼저인 것이 바람직한 순서임).

원하는 경우, 활성화는 또한 통상적으로 세포를 항-CD16 항체와 접촉시키는 동시에, 세포를 항-CD3 항체와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 위에 언급한 바와 같이, 항-CD3 항체의 농도는 통상적으로 NK 세포의 활성화를 위해 당업계에 이미 알려진 농도를 따를 것이다. 따라서, 항-CD3 항체에 적합한 농도는 약 0.01~10.0 ng/ml, 더 통상적으로는 약 0.01~0.1 ng/ml, 또는 약 0.1~0.5 ng/ml, 또는 약 0.3~1.0 ng/ml, 또는 약 1.0~5.0 ng/ml일 것이다. 마찬가지로, 항-CD3 항체에 대한 노출 지속기간과 관련하여, 단핵 세포의 혼합물은 가장 통상적으로는 단핵 세포가 분리되고 활성화 배지와 최초(및/두 번째, 및/또는 세 번째)로 접촉할 때, 항-CD3 항체의 1회, 2회 또는 3회의 용량에만 노출되는 것으로 일반적으로 고려된다. 당업자는 NK 세포 활성화를 달성하기 위한 적절한 일정 및 투여량을 쉽게 인식할 수 있을 것이다.

N-803과 관련하여, N-803(인간서열을 갖는 IL-15N72D:IL-15RαSu/IgG1 Fc 복합체; US 2019/0023766 참조, ImmunityBio에서 구매가능함)은 활성화 및 공급 배지의 제제로서 바람직하다고 생각된다. 그러나, IL-15 활성을 갖는 다양한 대안적인 제제도 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로 간주된다. 이러한 맥락에서, 임의의 이론 또는 가설에 얽매이지 않으면서, 본 발명자들은 N-803이 연속적인 신호전달에 의해 NK 세포의 성장 및 증식을 가능하게 한다고 생각한다. 대조적으로, 분리된 시토카인으로서 IL-15는 매우 짧은 수명을 가지며, 신호전달 활성은 통상적으로 매우 짧다. 이렇게, 분리된 시토카인인 IL-15가 성장 배지에 첨가되는 경우, 신호전달이 맥동하거나 간헐적이 될 것이다. 대조적으로, N-803이 제공되는 경우, IL-15의 안정성은 극적으로 확장되고 신호전달은 연속적인 것으로 간주된다. 또한, N-803은 생리학적 맥락(즉, IL-15 R-알파 사슬), 및 과작용제(super agonist)로서 작용하는 N72D 형태를 제공한다는 것도 인식해야 한다. 따라서, 임의의 안정화된 IL-15 화합물도 본 발명에서 사용하기에 명확히 적합한 것으로 간주된다. 또한 추가의 고려되는 양태에서, (재조합, 재조합 발현된, 또는 분리된) IL-15 및/또는 N-803은 TxM 유형 융합 단백질 복합체에 의해 적어도 부분적으로 대체되거나 보충될 수 있으며, 특히 바람직한 융합 단백질 복합체는 본 명세서에 참조로 포함된 WO 2018/165208에 기재되어 있다. 예를 들어, 고려되는 TxM 유형 융합 단백질 복합체는 IL-7, IL-18, 및 IL-21로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 시토카인을 포함할 것이다. 따라서, 적합한 선택들 중 특히 고려되는 TxM 융합 복합체는 IL-18/IL-7 TxM 및/또는 IL-18/IL-21 TxM을 포함한다.

예를 들어, IL-15 신호전달에 영향을 미치는 모든 화합물 및 복합체는 이러한 화합물 및 복합체가 분리/재조합 및 정제된 IL-15 단독보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는 한 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로 간주된다. 또한, 안정화된 IL-15 화합물이 IL-15 및/또는 IL-15 Rα에 대한 인간 서열의 적어도 일부를 포함하는 것이 일반적으로 바람직하다. 예를 들어, 적합한 화합물은 P22339(IL-15/스시 도메인 복합체를 IgG1 Fc와 연결하여 반감기를 증가시키는 이황화 결합을 갖는, IL-15 및 IL-15Rα 사슬의 스시(Sushi) 도메인의 복합체; 문헌[Nature, Scientific Reports (2018) 8:7675] 참조) 및 IL-15/IL-15Rα-Fc 이종이량체인 XmAb24306(예를 들어, WO 2018/071919 참조)을 포함한다.

추가로 특히 고려되는 구현예에서, 단핵 세포의 혼합물을 생체액으로부터 분리한 후, 항-CD16(및 선택적으로 항-CD3) 항체 및 N-803을 함유하는 배지와 함께 세포 배양 용기에 넣어 NK 세포를 활성화한다. 가장 바람직하게는, 용기는 세포 형태, 염색 및/또는 성장이 현미경 또는 기타 광학 기기로 관찰될 수 있도록 빛에 투명한 적어도 하나의 벽(또는 그 일부)을 갖는 세포 배양 플라스크이다. 따라서, 세포는 생물반응기에서 지속적으로 또는 주기적으로 모니터링될 수 있으며, 이렇게 수득된 측정값(예를 들어, 세포 크기, 세포 수, 세포 분포 등)은 생물반응기에 논리적으로 연결된 제어 장치에서 자동화된 공급 일정을 촉발하거나 변형시키는 데 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 가장 통상적으로는, 도 2에 나타낸 바와 같이, N-803을 갖는 신선한 배지를 공급하는 것은 미리 정의된 일정을 사용하여, 통상적으로 3일마다 수행할 수 있으며, 여기서 바람직하게는 각각의 공급은 연속적인 신호전달을 유지하기 위해 N-803을 포함할 것이다. 도 2에 나타나 있는 특정 부피는 NK 세포를 세포 성장과 일치하는 세포 밀도로 증식시키는 데 적합하지만, 특정한 성장 패턴을 수용하도록 부피를 조절할 수 있음을 인식해야 한다. 이를 위해, 공급이 연속적으로 이루어질 수 있거나, 용기에서 관찰되는 성장 동력학에 반응하여 미리 정해진 부피가 변경될 수 있음도 인식해야 한다.

대부분의 경우, 배양 종료시 NK 세포의 수율은 통상적으로, 모든 생세포의 적어도 80%, 또는 적어도 82%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 88%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 94%이며, 나머지는 NKT 세포, DN T 세포, 및 T 세포일 것이다. 예를 들어, 나머지 NKT 세포는 통상적으로, 모든 생세포의 10% 이하, 또는 8% 이하, 또는 7% 이하, 또는 6% 이하일 것인 한편, 나머지 T 세포는 통상적으로 모든 생세포의 5% 이하, 또는 4% 이하, 또는 3% 이하, 또는 2% 이하일 것이며, 나머지 DN T 세포는 통상적으로 모든 생세포의 3% 이하, 또는 2% 이하, 또는 1.5 % 이하, 또는 1% 이하일 것이다.

따라서, 다른 관점에서 볼 때, 본 발명에서 고려되는 시스템 및 방법은 NK 세포의 현저하게 높은 증식을 가능하게 하며, 통상적인 증식은 단핵 세포의 혼합물 중에 원래 존재하는 NK 세포의 수에 대하여 적어도 80배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 120배, 또는 적어도 130배, 또는 적어도 140배라는 것을 인식해야 한다. 이러한 증식은, 활성화 및 배양(1-용기 공정)의 매우 단순한 방식 면에서 특히 주목할 만하다. 실제로, 단핵 세포의 혼합물을 세포 배양 용기에 넣으면, 전체 공정은 동일한 용기 내에서 계속될 수 있고, 도 2에 개략적으로 나타낸 바와 같이 단지 배지를 첨가함으로써 지속될 것이다. 따라서, 복잡한 취급과 값비싼 시약을 완전히 피하고, 오염 위험은 상당히 줄어든다.

따라서, 본 발명의 주제를 제한하지 않으면서, NK 세포는 연속 모니터링, CO₂ 및 O₂ 수준의 연속 관리, 및 세포 밀도를 검출하기 위한 연속 모니터링(예를 들어, 융합(confluence))을 가능하게 하는 배양 환경에서 증식 및/또는 활성화되는 것으로 생각된다. 이러한 환경을 위한 선택사항들 중, 특히 바람직한 환경은 예를 들어 WO 2015/165700에 기재된 바와 같은 자동화 세포 배양 및 수확 장치이다. 이러한 'GMB-in-a-box' 시스템은 유리하게는 공급 일정에 대한 제어, 가스 제어를 허용하고, 세포 밀도, 성장(동력학) 및 세포 건강의 실시간 감지를 허용할 뿐만 아니라, 취급 요건이 상당히 줄어들기 때문에 오염의 가능성이 크게 감소한다.

또한 추가의 고려되는 양태에서, 본 명세서에서 제시된 시스템 및 방법은 특히 NK 세포가 말초혈로부터 생성되는 경우 CD56^dim 및 CD56^bright NK 세포의 생성을 또한 유리하게 허용한다는 점에 유의해야 한다. 추가 배양 조건에 따라, CD56^bright NK 세포는 이어서 CD56^dim 세포로 분화될 수 있다. 이어서 이러한 별개의 NK 세포 개체군은 별개의 성숙 및 세포독성 프로파일로 인해 별개의 치료 선택사항으로 사용될 수 있다. 추가로, 조성물, 시스템 및 방법은 또한 적절한 자극 및 배양시 NKT 세포를 생성하는 데 적합할 것임을 인식해야 한다.

실시예

상기 관점에서 그리고 아래에 더 상세히 제공되는 바와 같이, 하나의 예시적인 방법은 단일 Ficoll 원심분리 단계에 의해 CBMC 또는 PBMC를 분리한 후, 세포를 약 0.4 nM N-803 및 약 0.1 mcg/ml의 항-CD16 항체(예를 들어, 클론 B73.1, BD Biosciences에서 구매가능함) 및 선택적으로 10% 인간 AB 혈청을 갖는 NK MACS 배지에서 약 0.5 ng/ml의 항-CD3 항체와 함께 인큐베이션하는 것을 수반하였다. 통상적으로, 100만 세포/ml의 CBMC 150 mL를 상기 시약과 함께 출발 물질로 사용하였다. 배지는 0.4 nM의 최종 농도에 대해 N-803의 상응하는 농도를 갖는 기존 부피와 비교하여 1:2 및 1:10의 투약 계획으로 주 2회, N-803으로 희석하는 데 사용되었다.

재료: 제대혈 및 말초혈로부터의 MNC, 항-CD16 항체, BD bioscience(미국 캘리포니아 샌디에고 소재); NK 보충제를 갖는 NK MACS 배지, 표현형분석을 위한 염색 항체(aCD3, aCD16, aCD56, aNKp30, aNKp44, aNKp46, aNKG2A, aNKG2D, aTIGIT, aCD34, aTRAIL, aCD57, aCXCR3, 및 aCCR5), Miltenyi Biotec(미국 캘리포니아 샌디에고 소재); 인간 AB 혈청, Access Biologicals(미국 캘리포니아 샌디에고 소재); N-803, GMP in a Box 키트, Nantbio Inc.(미국 캘리포니아 컬버 시티 소재).

방법: MNC를 제대혈 또는 말초혈로부터 신선하게 분리하였다. 이를 완전 NKMACS 배지(NKMACS+ 보충제+ 10% hu-AB-혈청)로 2회 세척하였다. MNC를 밀도가 1x10^6 세포/mL인 150 mL의 배지에 현탁시켰다. 150 ml의 세포 현탁액은 aCD16 항체(1 mcg/mL) 및 N-803(0.4 nM)으로 보충되었다. 추가 GMP 키트를 박스에 설치하였으며 이는 VivaBio 웹 포털을 통해 업로드된 프로토콜이다. 완전 시토카인 및 항체를 갖는 세포 현탁액을 세포 백으로 옮기고, 150 mL의 세포 현탁액을 박스 키트의 세포 주입 포트를 통해 주입하였다. GMP Box는 이미징을 시작하였으며 세포는 도 2에 언급한 바와 같은 프로토콜에 작성된 단계에 따라 증식되었다. 박스의 세포는 10X 시토카인 배지 또는 2X 시토카인 배지를 사용하여 도 2에 기재된 바와 같은 교대 방식으로 보충되었다. NK 풍부화(CD3, CD56, 및 CD16 발현에 대한 표현형) 및 세포 건강(세포 수, 생존력, 및 세포 밀도)을 도 3 및 도 4a에서와 같이 정기적으로 모니터링하고, 그래프로 플롯팅하였다. 박스로부터 풍부화 후 세포를 수확하고, 도 4에서와 같이 완전한 특성화를 위해 NK 세포 기반 수용체의 발현에 대해 측정했다.

본 명세서에 사용된 바와 같은, 약학 조성물 또는 약물을 "투여하는"이라는 용어는 약학 조성물 또는 약물의 직접 및 간접 투여 모두를 지칭하며, 여기서 약학 조성물 또는 약물의 직접 투여는 통상적으로 의료 전문가(예를 들어, 의사, 간호사 등)에 의해 통상적으로 수행되고, 간접 투여는 (예를 들어, 주사, 주입, 경구 전달, 국소 전달 등을 통한) 직접 투여를 위해 의료 전문가에게 약학 조성물 또는 약물을 제공하거나 이용가능하게 만드는 단계를 포함한다. 가장 바람직하게는, 세포 또는 엑소좀은 피하 또는 진피아래(subdermal) 주사를 통해 투여된다. 그러나, 다른 고려되는 양태에서, 투여는 정맥내 주사일 수도 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항원 제시 세포는 환자의 세포로부터 분리되거나 성장되고, 시험관 내에서 감염된 다음 환자에게 주입될 수 있다. 따라서, 고려되는 시스템 및 방법은 고도로 개인화된 암 치료를 위한 완전한 약물 발견 시스템(예를 들어, 약물 발견, 치료 프로토콜, 검증 등)으로 고려될 수 있음을 인식해야 한다.

본 명세서에서 값의 범위를 언급하는 것은 단지 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법의 역할을 하는 것을 목적으로 한다. 본 명세서에서 달리 명시하지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 본 명세서에서 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 설명된 모든 방법은, 본 명세서에서 달리 지시되거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서의 특정 구현예와 관련하여 임의의 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 개시내용의 전체 범위를 더 잘 설명하기 위한 것이며, 달리 청구된 본 발명의 범위에 제한을 두지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 청구된 본 발명의 실행에 필수적인 청구되지 않은 임의의 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 명세서에 개시된 개념의 전체 범위로부터 벗어나지 않고, 이미 설명된 것들 외에 더 많은 변형이 가능하다는 것은 당업자에게 명백해야 한다. 따라서, 개시된 주제는 첨부된 청구범위의 범위를 제외하고는 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 청구범위 모두를 해석하는 데 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가능한 가장 광범위한 방식으로 해석되어야 한다. 구체적으로, 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은, 참조된 요소, 구성요소 또는 단계가 명시적으로 참조되지 않은 다른 요소, 구성요소 또는 단계와 함께 존재하거나 활용되거나 조합될 수 있음을 나타내는 비배타적인 방식으로 요소, 구성요소 또는 단계를 지칭하는 것으로서 해석되어야 한다. 명세서 청구범위가 A, B, C......및 N으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 어떤 것을 지칭하는 경우, 이는 A+N, 또는 B+N 등이 아니라, 그 군으로부터 하나의 요소만을 요구하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

NK 세포를 풍부화하는 방법으로서,
생체액으로부터 단핵 세포의 혼합물을 분리하는 단계와 단핵 세포의 혼합물을 항-CD16 항체 및 N-803과 접촉시켜 NK 세포를 활성화하는 단계; 및
활성화된 NK 세포가 모든 생세포의 적어도 80%를 구성할 때까지 또는 활성화된 NK 세포가 적어도 80배 증식까지 풍부화될 때까지 활성화된 NK 세포를 N-803을 함유하는 배지로 순차적으로 공급하는 단계
를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 단핵 세포의 혼합물을 분리하는 단계는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 수행되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 생체액은 전혈 또는 제대혈인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단핵 세포의 혼합물은 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 및 DN T 세포를 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단핵 세포의 혼합물은 NK 세포를 풍부화하기 위해 추가로 처리되지 않는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항-CD16 항체는 인간 CD16에 대한 특이성을 갖는 단일클론 항체인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단핵 세포의 혼합물은 100~500Х10⁶ 세포를 함유하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 혼합물을 접촉시키는 단계는 100~300 ml의 부피에서 또는 1Х10⁶ 세포/ml의 세포 밀도에서 수행되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항-CD16 항체는 0.05~0.5 mcg/ml의 농도로 존재하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, N-803은 0.1~1.0 nM의 농도로 존재하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 혼합물을 접촉시키는 단계는 단핵 세포의 혼합물을 항-CD3 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제11항에 있어서, 항-CD3 항체는 0.1~1.0 ng/ml의 농도로 존재하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, N-803을 함유하는 배지는 인간 AB 혈청을 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, N-803을 함유하는 배지는 NK MACS 배지를 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 순차적으로 공급하는 단계는 72시간마다 수행되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 순차적으로 공급하는 단계는 0.5~5.0Х10⁹ 세포의 총 세포 수에 도달할 때까지 수행되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 활성화된 NK 세포를 순차적으로 공급하는 단계는 단일 용기에서 수행되는, 방법.
제17항에 있어서, 단핵 세포의 혼합물을 접촉시키는 단계는 단일 용기에서 수행되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 활성화된 NK 세포를 순차적으로 공급하는 단계는 NK 세포가 적어도 100배 증식까지 풍부화될 때까지 수행되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 활성화된 NK 세포를 순차적으로 공급하는 단계는 NK 세포가 모든 생세포의 적어도 90%를 구성할 때까지 수행되는, 방법.
단핵 세포의 혼합물로부터 NK 세포를 증식시키는 방법으로서,
5% 이하의 NK 세포를 함유하는 단핵 세포의 혼합물을 제공하는 단계;
단핵 세포의 혼합물을 항-CD16 항체 및 N-803과 접촉시켜 NK 세포를 활성화하는 단계; 및
활성화된 NK 세포가 모든 생세포의 적어도 80%를 구성할 때까지 또는 활성화된 NK 세포가 적어도 80배 증식까지 풍부화될 때까지 활성화된 NK 세포를 N-803을 함유하는 배지로 공급하는 단계;
를 포함하는, 방법.
제21항에 있어서, 단핵 세포의 혼합물은 전혈 또는 제대혈로부터 수득되는, 방법.
제21항에 있어서, 단핵 세포의 혼합물은 NK 세포를 수용하는 개체에 대하여 MHC-매칭 동종 공급원(allogenic source)으로부터 수득되는, 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단핵 세포의 혼합물은 3% 이하의 NK 세포를 함유하는, 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단핵 세포의 혼합물은 T 세포, NKT 세포, 및 DN 세포를 추가로 포함하는, 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD16 항체는 인간 CD16에 대한 특이성을 갖는 단일클론 항체인, 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD16 항체는 0.05~0.5 mcg/ml의 농도로 존재하는, 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, N-803은 0.1~1.0 nM의 농도로 존재하는, 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물을 접촉시키는 단계는 단핵 세포의 혼합물을 항-CD3 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제29항에 있어서, 항-CD3 항체는 0.1~1.0 ng/ml의 농도로 존재하는, 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, N-803을 함유하는 배지는 인간 AB 혈청을 포함하는, 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 공급하는 단계는 72시간마다의 간격으로 순차적으로 공급하는 단계를 포함하는, 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 공급하는 단계는 0.5~5.0Х10⁹ 세포의 총 세포 수에 도달할 때까지 수행되는, 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 NK 세포를 공급하는 단계는 NK 세포가 적어도 100배 증식까지 풍부화될 때까지 수행되는, 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 NK 세포를 공급하는 단계는 자동화 방식으로 수행되는, 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 NK 세포를 공급하는 단계는 단일 용기에서 수행되는, 방법.
자동화 생물반응기(bioreactor)에서 NK 세포를 증식시키는 방법으로서,
NK 세포를 활성화하기 위한 시간 동안 N-803 및 항-CD16 항체를 함유하는 활성화 배지에서 단핵 세포의 혼합물을 인큐베이션하는 단계로서,
단핵 세포의 혼합물은 혼합물을 인큐베이션하는 동안 세포 배양 용기에 함유되는, 단계;
세포가 용기 내에 있는 동안 세포의 성장을 측정하는 단계;
활성화된 NK 세포가 모든 생세포의 적어도 80%를 구성할 때까지 또는 활성화된 NK 세포가 적어도 80배 증식까지 풍부화될 때까지 N-803을 함유하는 배지를 사용하여 세포를 자동으로 공급하는 단계로서, 공급은 미리 정해진 일정 또는 세포의 성장을 측정하는 단계의 결과 중 적어도 하나에 의해 제어되는, 단계;
세포 공급을 종료하는 단계로서, 종료는 미리 정해진 일정 또는 세포의 성장을 측정하는 단계의 결과 중 적어도 하나에 의해 제어되는, 단계
를 포함하는, 방법.
제37항에 있어서, 용기는 200 ml 내지 2,500 ml의 부피를 갖는, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 세포의 성장을 측정하는 단계는 용기의 벽을 통해 수행되는, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 세포의 성장을 측정하는 단계는 광학 측정을 사용하는, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 활성화 배지는 0.1~1.0 nM 농도의 N-803 및 0.05~0.5 mcg/ml 농도의 항-CD16 항체를 함유하는, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, NK 세포를 활성화하기 위한 시간은 24시간 내지 96시간인, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, N-803을 함유하는 배지는 N-803을 0.1~1.0 nM의 농도로 함유하는, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 세포는 0.5~5.0Х10⁹ 세포의 총 세포 수에 도달할 때까지 공급되는, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 세포는 NK 세포가 적어도 100배 증식까지 풍부화될 때까지 공급되는, 방법.
별개의 유형의 면역 적격 세포를 함유하는 세포 배양 용기로서,
모든 생세포의 적어도 80% 양의 NK 세포;
모든 생세포의 10% 이하의 양의 NKT 세포;
모든 생세포의 5% 이하의 양의 T 세포; 및
모든 생세포의 3% 이하의 양의 DN T 세포
가 배치되는 배지를 포함하는, 세포 배양 용기.
제46항에 있어서, 용기의 부피는 200 ml 내지 2,500 ml인, 세포 배양 용기.
제46항 또는 제47항에 있어서, 용기의 적어도 하나의 벽은 광학적으로 투명한 부분을 갖는, 세포 배양 용기.
제46항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포는 모든 생세포의 적어도 90%의 양으로 존재하는, 세포 배양 용기.