JP2024508906A - 極めて強力なｍ－ｃｅｎｋ細胞及び方法 - Google Patents

Abstract

記憶様サイトカイン増強ＮＫ（Ｍ－ＣＥＮＫ）細胞は、優れた細胞傷害性を有し、且つ単一バッチの単核球から十分な分量を生成／拡大することができるため、従って注入に好適な細胞ベースの治療薬を形成することができる。有利には、このＭ－ＣＥＮＫ細胞は、生存能力及び細胞傷害性を損なうことなく凍結保存し、及び解凍することができる。
【選択図】図５

Description

本願は、本出願人らの同時係属中の２０２１年３月３日に出願された米国仮特許出願第６３／１５６，２６９号、及び２０２１年６月３０日に出願された同第６３／２１７，０９７号に対する優先権を主張するものであり、これらの各々は、参照により全体として本明細書に援用される。

本発明の分野は、特に細胞傷害性及び拡大特性が向上した記憶様サイトカイン増強ＮＫ細胞（Ｍ－ＣＥＮＫ）に関するとおりの、細胞ベースの治療薬及びその関連する方法である。

背景の説明には、本発明の理解に有用となり得る情報が含まれる。これは、本明細書に提供される情報のいずれかが先行技術である、若しくはここに特許請求される発明と関連性があること、又は具体的若しくは暗黙的に参照されるいずれかの刊行物が先行技術であることの承認ではない。

本明細書における全ての刊行物及び特許出願は、個別の刊行物又は特許出願各々が参照によって援用されることが具体的且つ個別的に示されたものとするのと同様に参照によって援用される。援用される文献中の用語の定義又は使用が本明細書に提供される当該用語の定義と矛盾する、又はそれに反する場合、本明細書に提供される当該用語の定義を適用し、文献中の当該用語の定義は適用しない。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、一群の自然免疫細胞を構成し、多くの場合に、グラニュライシン及びパーフォリンを標的に向かって放出することによって抗体依存性細胞毒性を呈する細胞傷害性リンパ球として特徴付けられる。ほとんどのＮＫ細胞が、様々な活性化型及び抑制型受容体の集合に加えて、特異的細胞表面マーカープロファイル（例えば、ＣＤ３^－、ＣＤ５６^＋、ＣＤ１６^＋、ＣＤ５７^＋、ＣＤ８^＋）を有する。最近では、ＮＫ細胞は、ある種の癌治療の重要な構成要素となっているが、全血中のＮＫ細胞の比率が比較的低いため、多量のＮＫ細胞（及び特に自己ＮＫ細胞）の生成が、重大な障害となっている。

治療的に意味のある量のＮＫ及びＮＫ様細胞を入手するため、様々な前駆細胞からＮＫ細胞を生成することができる。例えば、様々な幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５が、様々なインビトロ手法において、臍帯血由来のサイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞を誘導し、拡大することが報告されている（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３４９３－３５００（２０１０））。同様に、米国特許出願公開第２０１８／００４４６３６号明細書に報告されるとおり、ＣＤ３４^＋造血細胞をＩＬ－１２及び他の薬剤に曝露することができる。なおも他の手法では、国際公開第２０１１／０６８８９６号パンフレットに記載されるとおり、ヒト血管芽細胞が２つの異なるサイトカインカクテルに順次曝露され、国際公開第２０１２／１２８６２２号パンフレットに教示されるとおり、異なるサイトカインカクテルが後胚期造血幹細胞と共に使用された。これらの方法の少なくとも一部はＮＫ細胞のｎ倍の大きい拡大を提供するが、かかる拡大のための方法及び試薬は、時間及び財源の両方が要求される。なおも更には、公知の方法の多くはフィーダー細胞層上でのＮＫ細胞培養が必要であるが、これは技術的及び規制上の観点から多く問題となることに留意しなければならない。

より簡便な方法では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞をＴｐｏＲアゴニストに曝露してもよく、そのようにしてＡＭＬ細胞がＮＫ細胞を形成するよう誘導することができる。しかしながら、かかる手法は、治療用細胞を調製するための供給源としては実行可能性が低いものと思われる。代替的方法もまた、国際公開第２０１１／１０３８８２号パンフレットに開示されるとおり、様々なインターロイキン、幹細胞因子、及びＦＬＴ３リガンドの存在下で末梢血細胞を培養することに頼るものとなっている。更に別の方法では、米国特許出願公開第２０１３／０２９５６７１号明細書が、既存のＮＫ細胞をサイトカインに加えて抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ３抗体で刺激する方法を教示している。手順としてはより簡便であるものの、かかる方法は、なおも細胞の入念な操作が必要であり、及び特別な試薬が必要となるため、大幅なコスト増となる。

なおも更なる公知の方法では、米国特許第１０，１２５，３５１号明細書が、臍帯血又は末梢血を細胞の供給源として使用して、それを密度勾配分離に供することにより有核細胞を単離し、次にはそれを、インターフェロン、インターロイキン、ＣＤ３抗体及びヒトアルブミンを含有する培地で培養することについて記載している。最も有利には、かかる方法はバイオリアクターでの灌流培養に適しており、そのため作業上の諸問題が大幅に削減される。残念ながら、ＮＫ細胞の収率はなおも比較的低い。

具体的な作製方法にかかわらず、培養されたＮＫ細胞は、典型的には、癌免疫療法に特に望ましい記憶様の性質を呈しないことになる。記憶様ＮＫ細胞を作製しようとする少なくとも一部の試みでは、選択されたＮＫ細胞がＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８に曝露されており、そのようにして曝露されたＮＫ細胞は記憶様表現型を呈し、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、及びＣＤ６９の発現並びにＣＤ５７及びＫＩＲの欠損と相関した（Ｂｌｏｏｄ（２０１２）Ｖｏｌ．１２０，Ｎｏ．２４；４７５１－４７６０を参照）。同様に、国際公開第２０１８／０８９４７６号パンフレット及び米国特許第１０，３００，０８９号明細書に記載されるとおり、記憶様ＮＫ細胞は、様々な刺激性サイトカインを使用してＮＫ細胞を予め活性化し、続いてその予め活性化した細胞をＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、又はＦＣ２１フィーダー細胞と接触させることによっても調製された。記憶様ＮＫ細胞を生成する更に別の手法では、国際公開第２０１８／１６５２０８号パンフレットに記載されるとおり、単離したてのＮＫ細胞がＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体に曝露された。かかる方法では、典型的には少なくとも一部が記憶様の性質を有するＮＫ細胞が作製されたが、選択の標的細胞に対するかかる活性化ＮＫ細胞の細胞傷害性は、恐らくは特定の活性化型受容体の発現及び／又は特定の抑制型受容体の発現が欠損している又は低いことに起因して、なおも最適以下であった。

更に別の公知の手法では、実験室で患者血液を使用してサイトカイン誘導記憶様ＮＫ細胞（ＣＩＭＬ ＮＫ）を作製することができる。しかしながら、かかる方法は、作製することができるＣＩＭＬ ＮＫ細胞の数が比較的限られているため、典型的にはその利用が限られている。ひいては、全治療レジメンに充てるのに十分な用量を作製するためには、患者から複数の試料を複数回採取しなければならない。国際公開第２０２１／００６８７６号パンフレットに記載されるとおりのＣＩＭＬ ＮＫ細胞を生成するなおも別の手法では、臍帯血又は全血由来の単核球を抗ＣＤ１６抗体及びＮ－８０３で活性化させて、次にサイトカイン混合物を用いて拡大する。概念上は簡便であるものの、それにも関わらず、ＣＤ３＋細胞が存在すること、及び少なくとも一部の標的細胞に対する細胞傷害性が最適以下であることを含め、様々な難題が残る。

或いは、ＮＫ細胞をアフェレーシス産物からビーズを使用して単離することができ、次にはそのようにして単離した細胞が、ＣＩＭＬ表現型を生じるように直接誘導される。かかる手法によれば、ＮＫ細胞製剤中のＣＤ３＋細胞を低減することが可能になるものの、この手法ではまた、細胞の拡大能力も限られる。その上、かかる細胞を凍結し、後に解凍して治療上有効な細胞製剤に戻すことが可能かどうかは、不明である。最後に、かかる単離され、誘導されたＮＫ細胞は、潜在的な細胞傷害能が比較的低くなる傾向がある。

このように、当該技術分野においては標的化した抗ウイルス療法及びワクチンの様々なシステム及び方法が公知であるにしても、その全て又はほぼ全てが幾つかの欠点を抱えている。数ある難題の中でも特に、多くのＣＩＭＬ ＮＫ細胞調製物が限られた数の細胞しか調製できず、従って治療上有効とならないこともある。その上、特に複数の特徴的に異なるサイトカインで記憶表現型が誘導される場合、サイトカイン混合物の費用及び活性の一貫性のなさが妨げとなって、予測可能な活性を持つ治療製剤を再現性をもって作製できないこともある。従って、改良されたＮＫ細胞ベースの治療のための組成物及び方法、特に記憶様サイトカイン増強ＮＫ細胞ベースの組成物及び方法が引き続き必要とされている。

本発明の主題は、Ｍ－ＣＥＮＫ細胞並びにその生成及び拡大の様々な組成物及び方法、並びにそれについての様々な使用に関する。注目すべきことに、本明細書に提示されるとおりのＭ－ＣＥＮＫ細胞は優れた細胞傷害性を有するため、迅速な相当量の拡大が可能であったとともに、凍結保存後も治療活性を示した。最も有利には、本Ｍ－ＣＥＮＫ細胞は単核球由来のサイトカイン増強ＮＫ細胞から単純且つ有効な方法で望ましい分量で調製することができ、Ｍ－ＣＥＮＫ表現型の誘導が、単一のタンパク質複合体、好ましくはＩＬ－１２／ＩＬ－１５／ＩＬ－１８活性を有するＴｘＭで実現する。

本発明の主題の一態様において、本発明者らは、記憶様サイトカイン増強ナチュラルキラー（Ｍ－ＣＥＮＫ）細胞を生成する方法であって、複数の単核球を入手するステップ、及び複数の単核球をコルチコステロイド及び任意選択でサイトカインと接触させる別のステップを含む方法を企図する。なおも別のステップでは、複数の単核球がコルチコステロイド及び任意選択のサイトカインの存在下でインキュベートされてＮＫ細胞中の単核球が濃縮され、次に濃縮されたＮＫ細胞が、Ｍ－ＣＥＮＫ細胞を生成するようにＴｘＭ融合タンパク質で誘導され、ここでＴｘＭ融合タンパク質は、ＩＬ－１２活性を有するタンパク質部分、ＩＬ－１５活性を有するタンパク質部分、及びＩＬ－１８活性を有するタンパク質部分を含む。

一部の実施形態において、複数の単核球は、インキュベートするステップの前に凍結保存される。かかる実施形態において、凍結保存された単核球は好ましくは、コルチコステロイド及び任意選択のサイトカインを含有する培地で解凍され、洗浄される。更に、インキュベートするステップは、１４～２１日の間にわたって、及び／又はＮＫ細胞が全生細胞の少なくとも６５％に濃縮されるまで実施されることが企図される。加えて、濃縮されたＮＫ細胞は、１～２５μｇ／ｍＬの濃度のＴｘＭで、典型的には１２～１６時間の間にわたって誘導されることが企図される。

本発明の主題を限定するものではないが、概して、コルチコステロイドがヒドロコルチゾンであること、及び任意選択のサイトカインがＮ－８０３であることが好ましい。その上、インキュベートするステップに任意選択のサイトカインが含まれることもまた好ましい。企図される方法には、典型的には、Ｍ－ＣＥＮＫ細胞を回収し、回収したＭ－ＣＥＮＫ細胞を注入用に製剤化するステップが含まれることになる。望ましい場合には、回収したＭ－ＣＥＮＫ細胞は、注入前に凍結保存される。本発明の主題の更なる態様において、インキュベートするステップは自動バイオリアクターで実施される。

結果的に、本発明者らはまた、記憶様サイトカイン増強ナチュラルキラー（Ｍ－ＣＥＮＫ）細胞を作製する方法であって、複数の単核球由来のサイトカイン増強ＮＫ細胞（ＣＥＮＫ）を入手するステップ、及び濃縮されたＮＫ細胞を、Ｍ－ＣＥＮＫ細胞が生成されるようにＴｘＭ融合タンパク質で誘導する更なるステップを含む方法も企図し、ここでＴｘＭ融合タンパク質は、ＩＬ－１２活性を有するタンパク質部分、ＩＬ－１５活性を有するタンパク質部分、及びＩＬ－１８活性を有するタンパク質部分を含む。

別の見方をすれば、本発明者らはまた、本明細書に提示されるとおりの方法によって作製される記憶様サイトカイン増強ナチュラルキラー（Ｍ－ＣＥＮＫ）細胞も企図する。最も典型的には、細胞は、一部の実施形態では凍結保存培地であるか、又はそれを含む薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物中に含まれることになる。更に、概して、薬学的に許容可能な担体が注入用に製剤化され、及び／又は０．５～１．５×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度を有し得ることが企図される。

更に別の実施形態において、本発明者らは、癌を有する個体を治療する方法であって、本明細書に提示される細胞及び組成物を投与するステップを含む方法を企図する。従って、癌の治療における使用のための組成物もまた企図される。一実施形態において、本明細書に提示されるＭ－ｃｅＮＫ細胞は、癌幹細胞及び間葉細胞を死滅させるために使用することができ、及びそのために患者に投与され得る。

本発明の主題の様々な目的、特徴、態様及び利点が、同様の符号が同様の構成要素を表している添付の図面中の図に加えて、好ましい実施形態についての以下の詳細な説明から更に明らかになるであろう。

ＣＤ５６＋ＣＤ３^－Ｍ－ＣＥＮＫ細胞濃縮を二変数ドットプロットに描く。アフェレーシス材料をＮ－８０３及びヒドロコルチゾンで活性化すると、ＣＤ５６＋ＣＤ３^－Ｍ－ＣＥＮＫ細胞の有意な濃縮が得られた。 異なる日数で解凍したときにも同等である同じアフェレーシス産物ロットからのＭ－ＣＥＮＫ濃縮動態を描く。 Ｍ－ＣＥＮＫ細胞の表現型タイピングの例示的結果を示す。 回収時のＭ－ＣＥＮＫ細胞についての細胞健常性マーカーの例示的結果を描く。 腫瘍細胞に対する強力な細胞傷害性を指し示す例示的結果を描く。Ｋ５６２及びＭＳ－１細胞を含む２つの標的細胞に対するＭ－ＣＥＮＫ細胞の細胞傷害性をカルセインＡＭベースの細胞傷害性アッセイを用いて試験した。異なるドナーからのＭ－ＣＥＮＫ細胞が、ＮＫ抵抗性細胞株ＭＳ－１に対し、２０：１のＥ：Ｔ比で６０～８０％の範囲の細胞傷害性を呈した。 同じロットのアフェレーシス材料から作製したが、但し異なる時点で解凍したＭ－ＣＥＮＫ細胞に関してＣＤ５６及びＩＦＮ－ガンマ発現が同等の結果であることを示す。 一組の標的腫瘍細胞株に対するＭ－ＣＥＮＫ細胞の例示的細胞傷害活性を描く。 一組の標的腫瘍細胞株に対するＭ－ＣＥＮＫ細胞の例示的活性を描く。 一組の標的腫瘍細胞株に対するＭ－ＣＥＮＫ細胞の例示的活性を描く。 Ｍ－ＣＥＮＫ細胞の例示的ＩＦＮ－γ発現を描く。 本発明の主題に係るＭ－ＣＥＮＫ細胞についての例示的細胞生存能結果を描く。 本発明の主題に係るＭ－ＣＥＮＫ細胞についての更なる例示的細胞健常性の結果を描く。 本発明の主題に係るＭＳ－１細胞に対するＭ－ＣＥＮＫ細胞についての例示的細胞傷害性結果を描く。 本発明の主題に係るＫ５６２細胞に対するＭ－ＣＥＮＫ細胞についての例示的細胞傷害性結果を描く。 例示的ＴｘＭを概略的に描く。 ＴｘＭの配列を描く。 ＴｘＭ誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞による有効なＩＦＮ－ガンマ産生を描くグラフである。 ＴｘＭ誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞によるＮＫ抵抗性ＭＳ－１細胞の強力な死滅を描くグラフである。 ＴｘＭ誘導と比べたサイトカインカクテル誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞によるＮＫ抵抗性ＭＳ－１細胞の細胞死滅を比較した結果を描く。 ＴｘＭ誘導と比べたサイトカインカクテル誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞によるＫ５６２細胞の細胞死滅を比較した結果を描く。 ＴｘＭ誘導と比べたサイトカインカクテル誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞におけるＩＦＮ－ガンマ産生の比較結果を描く。 ＴｘＭ誘導と比べたサイトカインカクテル誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞におけるＮＫ特異的マーカーの更なる比較結果を描く。 ＴｘＭ誘導と比べたサイトカインカクテル誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞における記憶細胞表現型の更なる比較結果を示す。 ＮＫ細胞による小細胞肺癌の溶解を例示する。 ＮＫ細胞による卵巣癌の溶解を例示する。 ＮＫ細胞による乳癌及びＮＳＣＬＣの溶解を例示する ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ ＮＫ細胞と比較した健常ドナーＮＫ細胞のＣＤ５６／ＣＤ１６プロファイルを例示する。 ｃｅＮＫ及びＭ－ｃｅＮＫ細胞が、活性化型受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及びＮＫＧ２Ｄをより高度に発現することを例示する。 ＮＫ活性化型受容体発現を例示する。 ＮＫ細胞内タンパク質発現を例示する。 ＮＫ抑制型受容体発現を例示する。 ＮＡＮＴ ００１バイオリアクターを使用したＭ－ＣＥＮＫ－ＤＳ製造工程の概要を例示する。 Ｍ－ＣＥＮＫ生産フロー工程の例を示す。 上記の工程によって作製されたＭ－ＣＥＮＫロットの効力を例示する。 Ｍ－ＣＥＮＫ表面表現型を例示する。 Ｍ－ＣＥＮＫが強力な癌細胞キラーであることを例示する。 ＬＮ２におけるアフェレーシス材料中間体の安定性を例示する。 凍結保存したＭ－ＣＥＮＫ細胞製剤の安定性を例示する。 Ｍ－ＣＥＮＫの健常ドナーからの作製と患者からの作製との比較を例示する。 臨床試験ＱＵＩＬＴ－３．０７６（局所進行又は転移性固形腫瘍を有する対象における自己Ｍ－ＣＥＮＫの研究）の第１相プロトコルを示す ＩＬ－１５、ＩＬ－１２及びＩＬ－１８を組み合わせた新規融合タンパク質スーパーカイン（１８／１２／ＴｘＭ）が全ての標的サイトカイン受容体を介してシグナル伝達を誘導することを例示する。（Ａ）１８／１２／ＴｘＭ分子の構造を示す図。（Ｂ～Ｄ）３～５例の健常ドナーからの単離したばかりのＮＫ細胞をＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ）、又はＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）（ＩＬ１２／１５／１８）又は１８／１２／ＴｘＭ（３８．８ｎＭ）で刺激し、様々な時間間隔が経った時点で、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}及びＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞でゲーティングして評価した。刺激後にリン酸化した（Ｂ）ＳＴＡＴ５、ＡＫＴ、及びＥＲＫ、（Ｃ）ＳＴＡＴ４、又は（Ｄ）ｐ６５の変化倍数を示す要約データ。示されるデータは平均値±ＳＥＭであり、対応のあるｔ検定を用いた比較である。Ｎ＝３～５例のヒトドナー。（Ｅ～Ｇ）個別のサイトカイン活性の評価をレポーター細胞株を使用して実施した。（Ｅ）様々な濃度の１８／１２／ＴｘＭ又はＮ－８０３と共にインキュベートしてから３日後にＩＬ－１５依存性３２β細胞株の増殖を評価した （Ｆ）．ＨＥＫ１２と共に様々な濃度のＩＬ－１２又は１８／１２／ＴｘＭとインキュベートした後に生物活性を測定した （Ｇ）．ＨＥＫ１８細胞と共に様々な濃度のＩＬ－１８又は１８／１２／ＴｘＭとインキュベートした後に生物活性を測定した ＩＬ－１５、ＩＬ－１２及びＩＬ－１８を組み合わせた新規融合タンパク質スーパーカイン（１８／１２／ＴｘＭ）が全ての標的サイトカイン受容体を介してシグナル伝達を誘導することを例示する。（Ａ）１８／１２／ＴｘＭ分子の構造を示す図。（Ｂ～Ｄ）３～５例の健常ドナーからの単離したばかりのＮＫ細胞をＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ）、又はＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）（ＩＬ１２／１５／１８）又は１８／１２／ＴｘＭ（３８．８ｎＭ）で刺激し、様々な時間間隔が経った時点で、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}及びＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞でゲーティングして評価した。刺激後にリン酸化した（Ｂ）ＳＴＡＴ５、ＡＫＴ、及びＥＲＫ、（Ｃ）ＳＴＡＴ４、又は（Ｄ）ｐ６５の変化倍数を示す要約データ。示されるデータは平均値±ＳＥＭであり、対応のあるｔ検定を用いた比較である。Ｎ＝３～５例のヒトドナー。（Ｅ～Ｇ）個別のサイトカイン活性の評価をレポーター細胞株を使用して実施した。（Ｅ）様々な濃度の１８／１２／ＴｘＭ又はＮ－８０３と共にインキュベートしてから３日後にＩＬ－１５依存性３２β細胞株の増殖を評価した （Ｆ）．ＨＥＫ１２と共に様々な濃度のＩＬ－１２又は１８／１２／ＴｘＭとインキュベートした後に生物活性を測定した （Ｇ）．ＨＥＫ１８細胞と共に様々な濃度のＩＬ－１８又は１８／１２／ＴｘＭとインキュベートした後に生物活性を測定した １８／１２／ＴｘＭスーパーカインで短期活性化したところ、ＮＫ細胞が活性化し、ＩＦＮ－γ及びＣＤ２５発現の誘導、並びに細胞傷害性の増加が得られたことを示す。（Ａ～Ｇ）単離したばかりのＮＫ細胞を漸増濃度の１８／１２／ＴｘＭ又はＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）で１６時間活性化させて、指示されるマーカーの発現を評価した。（Ａ）ＩＦＮ－γ及びＣＤ２５発現を示す代表的なフロープロット。（Ｂ）ＮＫ細胞を各種濃度の１８／１２／ＴｘＭと共にインキュベートして、ＣＤ２５を最大限誘導するのに最適な濃度を同定した。（Ｃ、Ｄ）３８．８ｎＭ １８／１２／ＴｘＭで１６時間刺激したＮＫ細胞の要約データ。（Ｃ）パーセントＣＤ２５陽性ＮＫ細胞率及び（Ｄ）ＣＤ２５ ＭＦＩとして示されるＣＤ２５発現。（Ｅ）ＮＫ細胞を各種濃度の１８／１２／ＴｘＭと共にインキュベートして、ＩＦＮ－ｖを最大限誘導するのに最適な濃度を同定した。（Ｆ、Ｇ）３８．８ｎＭ １８／１２／ＴｘＭで１６時間刺激したＮＫ細胞の要約データ。（Ｆ）パーセントＩＦＮ－γ陽性ＮＫ細胞率及び（Ｇ）ＩＦＮ－γ ｍｆｉとして示されるＩＦＮ－γ発現。データはＲＭ一元配置ＡＮＯＶＡを用いて比較した（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｎ＝６ドナー、２つの独立した実験）。 １８／１２／ＴｘＭスーパーカインで短期活性化したところ、ＮＫ細胞が活性化し、ＩＦＮ－γ及びＣＤ２５発現の誘導、並びに細胞傷害性の増加が得られたことを示す。（Ａ～Ｇ）単離したばかりのＮＫ細胞を漸増濃度の１８／１２／ＴｘＭ又はＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）で１６時間活性化させて、指示されるマーカーの発現を評価した。（Ａ）ＩＦＮ－γ及びＣＤ２５発現を示す代表的なフロープロット。（Ｂ）ＮＫ細胞を各種濃度の１８／１２／ＴｘＭと共にインキュベートして、ＣＤ２５を最大限誘導するのに最適な濃度を同定した。（Ｃ、Ｄ）３８．８ｎＭ １８／１２／ＴｘＭで１６時間刺激したＮＫ細胞の要約データ。（Ｃ）パーセントＣＤ２５陽性ＮＫ細胞率及び（Ｄ）ＣＤ２５ ＭＦＩとして示されるＣＤ２５発現。（Ｅ）ＮＫ細胞を各種濃度の１８／１２／ＴｘＭと共にインキュベートして、ＩＦＮ－ｖを最大限誘導するのに最適な濃度を同定した。（Ｆ、Ｇ）３８．８ｎＭ １８／１２／ＴｘＭで１６時間刺激したＮＫ細胞の要約データ。（Ｆ）パーセントＩＦＮ－γ陽性ＮＫ細胞率及び（Ｇ）ＩＦＮ－γ ｍｆｉとして示されるＩＦＮ－γ発現。データはＲＭ一元配置ＡＮＯＶＡを用いて比較した（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｎ＝６ドナー、２つの独立した実験）。 １８／１２／ＴｘＭスーパーカインで活性化すると、ＩＬ１２／１５／１８と同様に、ＮＫ細胞増殖が刺激されることを示す。細胞分裂を追跡するため、精製したＮＫ細胞をＣＦＳＥで標識し、ＬＤ ＩＬ１５（１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５）、ＩＬ１２／１５／１６（１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ１２＋５０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５＋５０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１８）又は３８．８ｎＭ １８／１２／ＴｘＭのいずれかで１６時間活性化した。インキュベーション後、細胞を３回洗浄して予備的活性化用のサイトカインを除去し、ＬＤ ＩＬ１５で培養した。７日後、ＣＦＳＥ希釈に関して細胞を分析した。（Ａ）１８／１２／ＴｘＭ及びＩＬ１２／１５／１８による細胞分裂（ＣＦＳＥ希釈）を実証するＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}及びＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞の両方の代表的な二変数プロット。（Ｂ）低用量ＩＬ－１５対照と比較して、１８／１２／ＴｘＭ又はＩＬ１２／１５／１８で活性化して７日後にＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}及びＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞の両方の増殖が増強されたことを示す要約結果。要約結果は、世代毎の細胞の割合の平均値±ＳＥＭとして示す（ｎ＝４ドナー、２つの独立した実験）。比較は条件間で一元配置反復測定ＡＮＯＶＡを用いて個別に行ったもの。精製したＮＫ細胞は９５％超がＣＤ５６^＋ＣＤ３^－であり、ＣＤ３^＋Ｔ細胞は０．５％未満であった。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊Ｐ＜０．００１。 １８／１２／ＴｘＭ及びＩＬ１２／１５／１８活性化後のＮＫ細胞における多次元表現型変化が同等であることを例示する。マスサイトメトリー分析により、ＮＫ細胞表現型の同様の変化が明らかになる。単離したばかりのヒトＮＫ細胞を１８／１２／ＴｘＭ又はＩＬ１２／１５／１８で１６時間活性化させて、ベースライン時又は活性化後１日目若しくは６日目の３６種のマーカーの発現をマスサイトメトリーを用いて評価した。（Ａ）ベースライン時、及びＩＬ１２／１５／１８又は１８／１２／ＴｘＭによる活性化後１日又は６日のＮＫ細胞集団を示す１例のドナーからの代表的なｖｉＳＮＥマップ。これらの集団のオーバーレイは、集団レベルでの変化が活性化条件間で同様であることを実証している。（Ｂ～Ｃ）活性化後（Ｂ）１日目又は（Ｃ）６日目の発現中央値のベースラインに対する平均対数変化倍数として報告するデータ。（ｎ＝２ドナー、１つの独立した実験）。Ｒ二乗値は単純線形回帰によって求めたもの。 １８／１２／ＴｘＭがインビトロで機能性の記憶様ＮＫ細胞を誘導することを例示する。（Ａ）機能アッセイシェーマ。簡潔に言えば、健常ドナーのＮＫ細胞を単離し、ＬＤ ＩＬ１５、１８／１２／ＴｘＭ、又はＩＬ１２／１５／１８で１６時間活性化させて、及び１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５で洗浄し、１週間インキュベートした。ＮＫ細胞をＫ５６２細胞（５：１のＥ：Ｔ比）又はＩＬ－１２及びＩＬ－１５で刺激することにより機能性評価を実施し、指示されるマーカーに関してフローサイトメトリーにより評価した（ｎ＝９ドナー、３つの独立した実験）。（Ｂ）Ｋ５６２及びＩＬ１２＋ＩＬ１５で刺激したＮＫ細胞におけるＩＦＮ－γ誘導を示す代表的なフロープロット。（Ｃ）Ｋ５６２又はＩＬ－１２／１５で刺激したパーセントＩＦＮ－γ陽性ＮＫ細胞率を平均値±ＳＥＭとして示す要約データ。分析は二元配置ＡＮＯＶＡを用いて実施したもの（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。Ｎ＝１５例のユニークなヒトドナー、６つの独立した実験。（Ｄ）Ｋ５６２細胞と様々なＥ：Ｔ比でインキュベートした後にクロム遊離法によって測定したパーセント特異的死滅率（ｎ＝４ドナー、２つの独立した実験）。分析は二元配置ＡＮＯＶＡを用いて実施したもの。 １８／１２／ＴｘＭがインビトロで機能性の記憶様ＮＫ細胞を誘導することを例示する。（Ａ）機能アッセイシェーマ。簡潔に言えば、健常ドナーのＮＫ細胞を単離し、ＬＤ ＩＬ１５、１８／１２／ＴｘＭ、又はＩＬ１２／１５／１８で１６時間活性化させて、及び１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５で洗浄し、１週間インキュベートした。ＮＫ細胞をＫ５６２細胞（５：１のＥ：Ｔ比）又はＩＬ－１２及びＩＬ－１５で刺激することにより機能性評価を実施し、指示されるマーカーに関してフローサイトメトリーにより評価した（ｎ＝９ドナー、３つの独立した実験）。（Ｂ）Ｋ５６２及びＩＬ１２＋ＩＬ１５で刺激したＮＫ細胞におけるＩＦＮ－γ誘導を示す代表的なフロープロット。（Ｃ）Ｋ５６２又はＩＬ－１２／１５で刺激したパーセントＩＦＮ－γ陽性ＮＫ細胞率を平均値±ＳＥＭとして示す要約データ。分析は二元配置ＡＮＯＶＡを用いて実施したもの（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。Ｎ＝１５例のユニークなヒトドナー、６つの独立した実験。（Ｄ）Ｋ５６２細胞と様々なＥ：Ｔ比でインキュベートした後にクロム遊離法によって測定したパーセント特異的死滅率（ｎ＝４ドナー、２つの独立した実験）。分析は二元配置ＡＮＯＶＡを用いて実施したもの。 １８／１２／ＴｘＭ活性化によりＭＬ ＮＫ細胞分子プログラムが誘導されることを例示する。低用量ＩＬ－１５、ＩＬ１２／１５／１８、又は１８／１２／ＴｘＭによる１６時間の活性化後（Ａ～Ｄ）１日目、及び（Ｅ～Ｆ）６日目。（Ａ）１日目に低用量及び１８／１２／ＴｘＭ（赤色）及びＩＬ１２／１５／１８（青色）活性化ＮＫ細胞間で共有された（紫色）及び特徴的に異なった、発現に統計的に有意な差のある遺伝子の数を実証するベン図（ｐ＜０．０５）。（Ｂ）ＩＬ１２／１５／１８又は１８／１２／ＴｘＭ活性化後に誘導された遺伝子のｌｏｇ_２（変化倍数）を比較する散布図。（Ｃ～Ｄ）活性化翌日に低用量ＩＬ１５と（Ｃ）１８／１２／ＴｘＭ又は（Ｄ）ＩＬ１２／１５／１８との間で発現に差のある遺伝子の数を示すボルケーノプロット。（Ｅ）ＩＬ１２／１５／１８又は１８／１２／ＴｘＭ活性化後に誘導された遺伝子のｌｏｇ_２（変化倍数）を示す散布図、ｌｏｇ_２変化倍数が１より大きいか、又は－１より小さい遺伝子を示すようにフィルタリングしている。（Ｆ）６日目に条件間で遺伝子誘導が同様であることを示す散布図。ＲＮＡシーケンシング解析はＰｈａｎｔａｓｕｓを使用して実施したもの。遺伝子発現差解析はＬＩＭＭＡパッケージを使用して実施したもの。各条件Ｎ＝３例の異なるドナー。示されるデータは、各３例のドナーを使用した２つの独立した実験からの代表的なものである。 １８／１２／ＴｘＭ活性化によりＭＬ ＮＫ細胞分子プログラムが誘導されることを例示する。低用量ＩＬ－１５、ＩＬ１２／１５／１８、又は１８／１２／ＴｘＭによる１６時間の活性化後（Ａ～Ｄ）１日目、及び（Ｅ～Ｆ）６日目。（Ａ）１日目に低用量及び１８／１２／ＴｘＭ（赤色）及びＩＬ１２／１５／１８（青色）活性化ＮＫ細胞間で共有された（紫色）及び特徴的に異なった、発現に統計的に有意な差のある遺伝子の数を実証するベン図（ｐ＜０．０５）。（Ｂ）ＩＬ１２／１５／１８又は１８／１２／ＴｘＭ活性化後に誘導された遺伝子のｌｏｇ_２（変化倍数）を比較する散布図。（Ｃ～Ｄ）活性化翌日に低用量ＩＬ１５と（Ｃ）１８／１２／ＴｘＭ又は（Ｄ）ＩＬ１２／１５／１８との間で発現に差のある遺伝子の数を示すボルケーノプロット。（Ｅ）ＩＬ１２／１５／１８又は１８／１２／ＴｘＭ活性化後に誘導された遺伝子のｌｏｇ_２（変化倍数）を示す散布図、ｌｏｇ_２変化倍数が１より大きいか、又は－１より小さい遺伝子を示すようにフィルタリングしている。（Ｆ）６日目に条件間で遺伝子誘導が同様であることを示す散布図。ＲＮＡシーケンシング解析はＰｈａｎｔａｓｕｓを使用して実施したもの。遺伝子発現差解析はＬＩＭＭＡパッケージを使用して実施したもの。各条件Ｎ＝３例の異なるドナー。示されるデータは、各３例のドナーを使用した２つの独立した実験からの代表的なものである。 １８／１２／ＴｘＭによってインビボで機能性の記憶様ＮＫ細胞が誘導され、抗腫瘍活性はＩＬ１２／１５／１８によって誘導されたＮＫ細胞と同等であることを例示する。（Ａ）（Ｂ）及び（Ｃ）についての実験計画。ＮＳＧマウスに１×１０^６個のＫ５６２－ルシフェラーゼ細胞を静脈内注射した。３日後、ＢＬＩを実施して白血病の生着を確認した。４日目、対照（ＮＫ細胞なし）又は低用量ＩＬ－１５、ＩＬ１２／１５／１８、若しくは１８／１２／ＴｘＭで活性化した５×１０^６個のＮＫ細胞のいずれかをマウスの後眼窩に投与した。マウスをｒｈＩＬ－２で１日おきに（ｅｖｅｒｙ ｏｔｈｅｒ ｄａｔａ）治療し、腫瘍量（ＢＬＩ）をモニタした。（Ｂ）腫瘍投与から指示される日数が経った後のＫ５６２－ｌｕｃを生着させたレシピエントマウスの代表的なＢＬＩ。（Ｃ）ＩＬ１２／１５／１８及び１８／１２／ＴｘＭによって活性化させたＮＫ細胞の投与を受けたマウスにおける腫瘍量の減少を示す経時的ＢＬＩ測定の要約。データは平均値±ＳＥＭとして提示したもの。要約データは、各群９～１０匹のマウスによる２つの独立した実験からのものである。差は二元配置分散分析（二元配置ＡＮＯＶＡ）を用いて決定した。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊Ｐ＜０．００１。 ７７．６ｎＭの１８／１２／ＴｘＭが、全ての標的受容体を介したシグナル伝達を誘導することを例示する。（Ａ～Ｃ）３～５例の健常ドナーからの単離したばかりのＮＫ細胞をＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）又は１８／１２／ＴｘＭ（７７．６ｎＭ）で刺激し、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ及びＣＤ５６ｄｉｍ ＮＫ細胞に関して様々な時間間隔で評価した。（Ａ）ＩＬ－１５シグナル伝達の下流のシグナル伝達メディエーター、ＳＴＡＴ５、ｐＡＫＴ、及びｐＥＲＫのリン酸化。（Ｂ）ＩＬ－１２シグナル伝達の下流のｐＳＴＡＴ４のリン酸化。（Ｃ）ＩＬ－１８シグナル伝達の下流のｐ６５のリン酸化。要約データは対応のあるｔ検定を用いて比較した。 活性化条件の間でＮＫ細胞生存能力に差がないことを例示する。単離したばかりのヒトＮＫ細胞をＬＤ ＩＬ－１５（１ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ１２／１５／１８、又は１８／１２／ＴｘＭのいずれかで１６時間活性化させて、ＬＤ ＩＬ－１５中で７日間培養した。フローサイトメトリーにより、Ｚｏｍｂｉｅ－グリーン陰性ＮＫ細胞の割合を測定することによって生存能力を評価した。Ｎ＝５例のヒトドナー、２つの独立した実験。統計的分析は一元配置ＡＮＯＶＡを用いて実施したもの（^＊Ｐ＜０．０５）。 ベースライン時、ＩＬ－１２／１５／１８又は１８／１２／ＴｘＭによる活性化後１日目、及び６日目におけるＮＫ細胞の表現型の差を例示する。（Ａ）図４３からの指示されるマーカーの発現中央値を実証する要約データ。 ベースライン時、ＩＬ－１２／１５／１８又は１８／１２／ＴｘＭによる活性化後１日目、及び６日目におけるＮＫ細胞の表現型の差を例示する。（Ａ）図４３からの指示されるマーカーの発現中央値を実証する要約データ。 ベースライン時、ＩＬ－１２／１５／１８又は１８／１２／ＴｘＭによる活性化後１日目、及び６日目におけるＮＫ細胞の表現型の差を例示する。（Ａ）図４３からの指示されるマーカーの発現中央値を実証する要約データ。 １８／１２／ＴｘＭによりインビトロで機能性の記憶様細胞が誘導されることを例示する。図５に記載されるとおり機能性評価を実施し、（Ａ～Ｃ）ＣＤ１０７ａ、及び（Ｄ～Ｆ）ＴＮＦの発現に関して評価した。（Ａ）Ｋ５６２及びＩＬ－１２＋ＩＬ－１５で刺激したＮＫ細胞におけるＣＤ１０７ａ誘導を示す代表的なフロープロット。（Ｂ～Ｃ）（Ｂ）Ｋ５６２又は（Ｃ）ＩＬ－１２＋ＩＬ－１５で刺激したパーセントＣＤ１０７ａ陽性ＮＫ細胞率を示す要約データ。（Ｄ）Ｋ５６２及びＩＬ－１２＋ＩＬ－１５で刺激したＮＫ細胞におけるＴＮＦ誘導を示す代表的なフロープロット。（Ｄ～Ｆ）（Ｅ）Ｋ５６２又は（Ｆ）ＩＬ－１２＋ＩＬ－１５で刺激したパーセントＴＮＦ陽性ＮＫ細胞率を示す要約データ。（ｎ＝１５例のドナー、７つの独立した実験）。分析は一元配置ＡＮＯＶＡを用いて実施したもの（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 １８／１２／ＴｘＭによりインビトロで機能性の記憶様細胞が誘導されることを例示する。図５に記載されるとおり機能性評価を実施し、（Ａ～Ｃ）ＣＤ１０７ａ、及び（Ｄ～Ｆ）ＴＮＦの発現に関して評価した。（Ａ）Ｋ５６２及びＩＬ－１２＋ＩＬ－１５で刺激したＮＫ細胞におけるＣＤ１０７ａ誘導を示す代表的なフロープロット。（Ｂ～Ｃ）（Ｂ）Ｋ５６２又は（Ｃ）ＩＬ－１２＋ＩＬ－１５で刺激したパーセントＣＤ１０７ａ陽性ＮＫ細胞率を示す要約データ。（Ｄ）Ｋ５６２及びＩＬ－１２＋ＩＬ－１５で刺激したＮＫ細胞におけるＴＮＦ誘導を示す代表的なフロープロット。（Ｄ～Ｆ）（Ｅ）Ｋ５６２又は（Ｆ）ＩＬ－１２＋ＩＬ－１５で刺激したパーセントＴＮＦ陽性ＮＫ細胞率を示す要約データ。（ｎ＝１５例のドナー、７つの独立した実験）。分析は一元配置ＡＮＯＶＡを用いて実施したもの（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 ＮＬ ｃａｌｌ表現型マスサイトメトリーパネルを例示する。このマスサイトメトリー表現型パネルの金属同位体（ｍｅｔａｌ ｉｓｏｔｙｐｅ）、マーカー名、抗体クローン、及び供給元を示す。供給元の後ろに付した星印（ａｓｔｅｒｉｘ）（^＊）は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ抗体標識キットを製造者の指示どおりに使用してカスタムでコンジュゲートした抗体であることを指示する。

本発明者らは、望ましい分量にまで拡大させることのできる、且つ機能的特性を損なうことなく凍結保存及び解凍することのできる、優れた細胞傷害性のＭ－ＣＥＮＫ細胞を生成できることを発見した。注目すべきことに、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を作製するプロトコルとは対照的に、本方法は、抗ＣＤ１６抗体を使用して単核球混合物中のＮＫ細胞を活性化させる必要がない。対照的に、本明細書に提示される方法は、好ましくはＮ－８０３（又はＩＬ－１５）及びヒトＡＢ血清と組み合わせて、ヒドロコルチゾンを使用する。その上、予想外にも、凍結保存したアフェレーシス材料から濃縮及び拡大を行えること、及びこのＭ－ＣＥＮＫ細胞はまた、細胞傷害性の損失なしに凍結保存及び解凍もできることが観察された。

従って、本発明者らは、Ｍ－ＣＥＮＫ（記憶様サイトカイン増強ＮＫ細胞）及びその生成方法、並びにかかる細胞を含む細胞ベースの治療薬、特に注入用の凍結保存したＭ－ＣＥＮＫ懸濁液を企図する。別の見方をすれば、成長培地にヒドロコルチゾン（及び典型的にはＮ－８０３又はＩＬ－１５様活性を持つ他のサイトカイン若しくはサイトカイン類似体）を含めて、そのようにしてアフェレーシス産物から高品質のＮＫ細胞を作製することにより、（解凍した）患者アフェレーシス材料からのＮＫ細胞の選択的濃縮及び拡大を実現できるということが理解されなければならない。そのようにして入手された細胞を次に活性化させて、記憶表現型を作製する。結果的に、ドナーからの採血を繰り返さなくても、凍結保存した材料から複数用量の高品質Ｍ－ＣＥＮＫ細胞を調製できるということが理解されなければならない。実際、本明細書に提示される工程で作製されるＭ－ＣＥＮＫ細胞は、既製品用の特注の培地に凍結保存することができ、凍結保存用に開発された凍結融解手順により、以下に更に詳細に示すとおり、細胞特性及び生存能力が確実に維持される。

例えば、企図される方法の一ステップでは、凍結保存したアフェレーシス材料中間体を以下のとおり作製する：患者からの白血球アフェレーシス産物（ＭＮＣ、アフェレーシス）を処理し、Ｍ－ＣＥＮＫ製剤の製造を可能にするためアフェレーシス材料中間体（ＡＭＩ）として凍結保存する。凍結製剤培地は、解凍後のアフェレーシス産物の高い生存能力が確保されるように製剤化する。最も好ましくは、凍結製剤培地は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、５％アルブミン（ヒト）ＵＳＰ、及びＤＭＳＯを含む。調製したばかりの培地を０．２μｍ、ＰＥＳフィルタユニットを使用してろ過滅菌する。凍結製剤培地をＭＮＣアフェレーシス産物と１：１比（体積基準）で混合し、そのようにしてＡＭＩを生成する。製剤化した産物を別個のクライオバッグに充填する。各アフェレーシス産物から１０～２０袋のバッグを作ることができる。続いて充填した細胞バッグをコントロールレートフリーザー（例えば、ＣｒｙｏＭｅｄフリーザー）を使用して－８５℃以下に凍結保存する。

次にサイトカイン増強ＮＫ細胞の濃縮及び拡大を以下のとおり行うことができる。凍結保存したアフェレーシス材料中間体（ＡＭＩ）を３７℃の水浴で解凍し、拡大に使用する。解凍した細胞を、例えば、Ｓｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏ装置又は卓上遠心機を使用して洗浄し、５０～１００ｎｇ／ｍＬ Ｎ－８０３及び０．２～２．０μＭヒドロコルチゾン及びヒトＡＢ血清を含有するＮＫ－ＭＡＣＳ培地からなる成長培地に再懸濁する。ある戦略を開発しており、そこでは成長培地を加えることにより、ＮＫ細胞の２０日間の濃縮及び拡大に成功した。例えば、図１は、例示的ＣＤ５６＋ＣＤ３^－細胞濃縮を二変数ドットプロットに描く。このプロットを見ると容易に分かるとおり、アフェレーシス材料をＮ－８０３及びヒドロコルチゾンで活性化したところ、ＣＤ５６＋ＣＤ３^－ＣＥＮＫ細胞の有意な濃縮が得られた。図２は、異なる日数で解凍したときにも、同じアフェレーシス産物ロットから実質的に同一のＣＥＮＫ濃縮動態を実現できることを示す（ここでは：１５日後を３８０日後と比べている）。

次にＭ－ＣＥＮＫ細胞の生成を以下のとおり実施した：拡大２０日目までに培養物が少なくとも１×１０^６細胞／ｍＬの密度で少なくとも８５％のＣＤ５６陽性細胞に達したところで、培養物に一定濃度のＮ－８０３（１００～３００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１２（１～１００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－１８（５～２５０ｎｇ／ｍＬ）を加える。細胞をサイトカインのカクテルで１４～１６時間刺激し、それによってＣＤ５６陽性細胞の記憶様表現型が誘導される。Ｍ－ＣＥＮＫ誘導段階の完了後、Ｓｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏ装置を使用して細胞を洗浄する。最も典型的には、洗浄及び再懸濁溶液として５％アルブミン（ヒト）溶液を使用する。凍結保存用に、５％アルブミン（ヒト）ＵＳＰ：ＣｒｙｏＳｔｏｒ １０（ＣＳ１０）（１：１）を含有する培地中にＭ－ＣＥＮＫ細胞を製剤化する。Ｍ－ＣＥＮＫが癌細胞標的を死滅させる能力は、そのＩＦＮ－γ産生の増加を通じて増強されている。加えて、これらの細胞は、表現型的にＣＤ５６＋、ＣＤ２５＋、ＤＮＡＭ－１＋、及びＮＫＰ３０＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、ＮＫＧ２Ａ＋、及びＣＤ３－である。

図３は、本発明の主題により作製されたＭ－ＣＥＮＫ細胞の表現型タイピングの例示的結果を提供し、ＮＫマーカーには、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ２５、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＮＫｐ３０、ＣＤ１６、及びＮＫＧ２Ｄが含まれた。更に、そのようにして作製された細胞はまた、図４のデータを見ると分かるとおり、高い生存率／生存能も有した。同様に、図６に描かれるとおり、凍結及び解凍はＩＦＮ－γ分泌に何ら有害な効果を及ぼさなかった。

細胞傷害性に関して、本発明者らは、このＭ－ＣＥＮＫ細胞が、好ましいエフェクター対標的比では、種々の標的細胞に対して、更にはＮＫ細胞による死滅に抵抗性を示すことが公知のＭＳ－１細胞に対してさえも（図５参照）、優れた細胞傷害活性を有したことを観察した。図７～９は、幅広い種類の癌細胞に対するＭ－ＣＥＮＫ細胞の細胞傷害性の更なる例を描く。従って、改良されたＮＫ細胞ベースの治療製剤（Ｍ－ＣＥＮＫ（商標）、注入用の懸濁液、凍結保存されている）は、長期にわたる低温保存後であっても容易に調製及び使用できることが理解されなければならない。

当然ながら、アフェレーシス材料の凍結には、数多くの代替的な方法又は製剤を使用することができ、又はアフェレーシス材料は凍結されないか、若しくは濃縮及び拡大ステップの前に新鮮な材料を予め凍結してあった材料と組み合わせてもよいことが理解されなければならない。同様に、ＮＫ細胞はまた、初めに全血、臍帯血、又はアフェレーシス材料から精製して、次に拡大に供してもよいことが企図される。そのようにして拡大した細胞は、次に記憶表現型にするため活性化させることができる。同様に、濃縮及び拡大ステップにはヒドロコルチゾンが概して好ましいが、数多くのヒドロコルチゾン類似体及び他のコルチコステロイド類（例えば、コルチゾール、コルチコステロン、コルチゾン、アルドステロン等）もまた本明細書における使用に好適と見なされることが理解されなければならない。

加えて、Ｍ－ＣＥＮＫ細胞は種々の凍結製剤培地を使用して凍結することができ、あらゆる公知の凍結製剤培地が本明細書における使用に適切と見なされることに留意しなければならない。また、凍結処理に関して、濃縮し、拡大したＮＫ細胞が凍結され、及び解凍時、記憶表現型生成のための活性化に供され得ることも注記される。

製造工程
例示的製造工程の概要：本製造工程は、自己白血球アフェレーシス産物（ＭＮＣ、アフェレーシス）を受領することから始まり、受注対応型の製剤の製造を可能にするため、これをアフェレーシス材料中間体（ＡＭＩ）として処理し、及び凍結保存する。解凍後、ＡＭＩをＳｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏを使用した培地交換用に処理することにより、初めにＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａで凍結製剤培地を除去し、１０％ヒトＡＢ血清、Ｎ－８０３及びヒドロコルチゾンを含有するＮＫ－ＧＭに溶出し、ＣＥＮＫへの拡大及び濃縮のためＮＡＮＴ ００１バイオリアクターに播種する。所望の数及び純度のＣＥＮＫ細胞が生成されたとき、Ｎ－８０３、ＩＬ－１２及びＩＬ－１８サイトカイン含有のサイトカインカクテルで細胞を処理することにより、サイトカイン誘導記憶様（ＣＩＭＬ）－ＮＫ細胞をＭ－ＣＥＮＫとして生成する。誘導後、細胞を回収し、高濃度化し、及びＳｅｐａｘ Ｃ Ｐｒｏを使用して５％アルブミン（ヒト）で洗浄し、５％アルブミン（ヒト）に溶出し、次に１００ｍＬ容量中の合計約０．２５～０．７５×１０^９Ｍ－ＣＥＮＫ細胞／バッグについて所望のＶＣＤ（０．２５～０．７５×１０^７細胞／ｍＬ）となるようにＣｒｙｏＳｔｏｒ １０（ＣＳ１０）と１：１比で混合し、凍結保存する。

末梢血単核球を入手するためのアフェレーシス：製造施設にて新鮮なアフェレーシス材料の受領後、自己Ｍ－ＣＥＮＫ細胞の製造が始まる。一連の保管書類の作成完了後、アフェレーシス輸送用パックから試料を無菌的に取り出し、細胞生存能力、全有核細胞（ＴＮＣ）計数値及び表現型特性の決定を可能にする。

アフェレーシス材料中間体（ＡＭＩ）の凍結保存：製造時のアフェレーシス材料の受領から患者特異的単核球（ＭＮＣ）、アフェレーシス材料中間体（ＡＭＩ）の解凍までの間に凍結保存及び処理ステップが関わった。ＡＭＩの凍結保存工程は、新鮮ＭＮＣ、アフェレーシス産物の全有核細胞（ＴＮＣ）カウント及びパーセント生存率を決定することから開始する。

凍結製剤培地は調製したてであり、０．２μｍ、ＰＥＳフィルタユニットを使用してろ過滅菌し、使用時まで氷上に保存する。凍結製剤培地は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ及び５％アルブミン（ヒト）ＵＳＰの混合物、及びＤＭＳＯを使用して調製する。アフェレーシス材料を三角フラスコに移し替え、所望の細胞密度に調整する。凍結製剤培地をＭＮＣ、アフェレーシス産物と１：１比で混合し、細胞を製剤化してアフェレーシス材料中間体（ＡＭＩ）を生成する。製剤化した産物を所望の細胞数（２～１０×１０^８細胞）が実現するように別個のクライオバッグに充填する。各アフェレーシス材料から幾つか（１０～２０個）のバッグが作られる。続いて充填した細胞バッグをコントロールレートフリーザー（ＣｒｙｏＭｅｄフリーザー）を使用して－８５℃以下に凍結保存し、次に長期保存用の気相液体窒素（－１２０℃以下）フリーザーに移し替える。

ＮＫ成長培地の組成：Ｍ－ＣＥＮＫの製造に使用される基本培地は、指定されたＮＫ成長培地（ＮＫ－ＧＭ）である。培地は各研究の開始時に調製し、次に０．２μｍ、ＰＥＳフィルタユニットを使用して滅菌ろ過し、使用時まで氷上に保存する。

この工程全体を通じて、工程の特定のステップで種々の培地サプリメントを無菌的に添加する。（１）ＮＡＮＴ ００１バイオリアクターへの接種時点では、解凍したアフェレーシス材料中間体（ＡＭＩ）は、５０～１００ｎｇ／ｍＬ Ｎ－８０３（０．８ｎＭ）及び０．２～２．０μＭヒドロコルチゾンを含有するＮＫ－ＧＭに懸濁する。（２）続く培地添加ステップの間、バイオリアクターに、５０～１００ｎｇ／ｍＬ Ｎ－８０３を含有するＮＫ－ＧＭを添加する。（３）記憶表現型の刺激は、サイトカインカクテル［Ｎ－８０３（１００～３００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１２（１～１００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－１８（５～２５０ｎｇ／ｍＬ）］を含有するＮＫ－ＧＭの添加によって実現する。毎回、培地添加ステップの前に、所望量のＮＫ－ＧＭを一定濃度のサイトカイン／サプリメント（Ｎ－８０３＋ヒドロコルチゾン又はＮ－８０３単独又はＮ－８０３＋ＩＬ－１２＋ＩＬ－１８）と混合し、次に０．２μｍ、ＰＥＳフィルタユニットを使用してろ過滅菌する。細胞の拡大／刺激のため、調製した培地をＮＡＮＴ ００１に無菌的に移し替える。

ＮＡＮＴ ００１プラットフォームを使用したＣＥＮＫ拡大：Ｍ－ＣＥＮＫの製造工程の概要を以下に例示する。ＮＡＮＴ ００１バイオリアクタープラットフォームシステム（ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ，Ｉｎｃ．）は、製造工程の回収、濃縮、拡大、及びＭ－ＣＥＮＫ誘導段階全てにわたって自動での手順及びリアルタイムモニタリングを行うよう指図する予めプログラムされたプロトコルを実行する自給式バイオリアクターである。プログラム可能な工程パラメータとしては、ｐＨモニタリング、細胞の画像化、温度、及び揺動パラメータが挙げられる。ＮＡＮＴ００１バイオリアクターは、サーモスタット槽、タッチスクリーンユーザインタフェース、バーコードリーダー、ｐＨ推定ユニット、一体型画像化システム、及びガス流量制御を含む。構成要素は、安全且つＧＭＰに準拠した細胞処理のための装填が容易な単回使用のクローズドシステム設計であり、最大４Ｌの廃棄物用バッグ、無菌接続切断部品、回収用ボトル、各々最大１００ｍＬの補助バッグ×２、無菌接続部品、細胞培養フラスコ、６３６ｃｍ２、最大３Ｌの培地バッグ、及び最大３Ｌの緩衝液バッグを備えている。本明細書での使用に好適な例示的システムについては、例えば、米国特許第１０，８０１，００５号明細書及び米国特許出願公開第２０１７／００３７３５７号明細書（参照によって本明細書に援用される）に記載されている。

Ｓｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏを使用したＭＮＣ、アフェレーシス－凍結保存材料の解凍、培地交換及びＮＡＮＴ ００１接種：初めに、ＣｕｌｔｕｒｅＷａｓｈソフトウェアプログラムを利用してＳｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏ装置を始動させる。単回使用使い捨てキットを据え付けた後、１Ｌの洗浄溶液（ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ）及び１００ｍＬの再懸濁溶液（５０～１００ｎｇ／ｍＬ Ｎ－８０３及び０．２～２．０μＭヒドロコルチゾンを含有するＮＫ－ＧＭ）をバッチ記録のとおりに装置に取り付ける。凍結保存したアフェレーシス材料中間体（ＡＭＩ）を低温保存から取出し、目視し得る損傷の痕がないかクライオバッグを調べ、直ちに３７℃の水浴に入れて急速解凍する。

解凍後、解凍されたクライオバッグ材料をＳｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏ装置に接続する前に、試料を無菌的に取り出して細胞生存能力及びＴＮＣカウントを決定する。続いてＭＮＣアフェレーシス－凍結保存材料をＳｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏ装置を使用して洗浄溶液（ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ）で２回洗浄し、５０～１００ｎｇ／ｍＬ Ｎ－８０３及び０．２～２．０μＭヒドロコルチゾンを含有するＮＫ－ＧＭが入った細胞回収バッグに３．５×１０^６細胞／ｍＬ以上で再懸濁する。次にＳｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏ装置から細胞回収バッグを取り出す。試料を採取して細胞生存能力及び細胞数を確認し、必要であれば細胞を所望の接種細胞密度（１．０～５．０×１０^６細胞／ｍＬ）に調整した後、ＮＫ細胞濃縮及び拡大段階を開始するため、同じ濃度のＮ－８０３（７４ｎｇ／ｍＬ）及びヒドロコルチゾン（１μＭ）を含有する１００ｍＬの予め温めたＮＫ－ＧＭが入ったＮＡＮＴ ００１バイオリアクターに５０ｍＬの接種材料を移し替える。ＮＡＮＴ ００１バイオリアクター内の初期細胞培養物容積は１５０ｍＬであり、細胞密度範囲は０．５～１．５×１０^６細胞／ｍＬである。同じ患者から２つ以上のＮＡＮＴ ００１バイオリアクター接種が計画されている場合、複数のＡＭＩバッグを解凍する。

ＮＡＮＴ ００１バイオリアクターを使用した細胞回収、濃縮及び拡大：ＮＡＮＴ ００１バイオリアクターユニットに１．２０～１．８０×１０^８個の解凍したＡＭＩ細胞を接種した後、培養を毎日、顕微鏡法を用いてモニタし、細胞回収、濃縮及び拡大工程の全段階を通じて特定の段階で試料採取する。工程間モニタリング（ＩＰＭ）を実施して、細胞生存能力、細胞数及び表現型結果（ＣＤ５６陽性細胞パーセントの割合）を決定する。この検査を用いることにより、続いてＮ－８０３を含有する（ヒドロコルチゾン不含の）新鮮な成長培地を添加する必要があるかが制御される。拡大２０日目、バイオリアクター内のＣＤ５６陽性細胞の割合が８５％以上に達し、総細胞数が１×１０^６細胞／ｍＬを超えたところで、培養物をＭ－ＣＥＮＫ製造工程のサイトカイン刺激段階に移行させる。サイトカイン刺激段階の前に、バイオバーデン検査用の試料を採取する。

工程間モニタリング（ＩＰＭ）：毎回培地及びＮ－８０３を添加する間、混濁の兆候又は目に見える汚染がないか、培養物を目視で調べる。指定された日にバッチ記録のとおりに生細胞密度、細胞生存能力及び細胞表現型分析を実施してＮＫ濃縮プロファイルを入手し、生産バイオリアクターが所望のＶＣＤ規格の範囲内にあることを確実にする。

サイトカインカクテル（ヒトＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＮ－８０３）によるＣＥＮＫの刺激：ＮＡＮＴ ００１バイオリアクター培養物が拡大２０日目までに１×１０^６細胞／ｍＬ以上の密度で８５％以上のＣＤ５６陽性細胞に達したところで、新鮮なＮＫ－ＧＭ中の培養物に最大で約６５０ｍＬの最終的な総培養容積として一定濃度のＮ－８０３（１００～３００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１２（１～１００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－１８（５～２５０ｎｇ／ｍＬ）を添加する。細胞をサイトカインのカクテルで１４～１６時間刺激すると、それによってＮＡＮＴ ００１バイオリアクター内に含まれる記憶様表現型のＣＤ５６陽性細胞（Ｍ－ＣＥＮＫ）が誘導される。次に、バイオリアクター内でのこのサイトカインカクテルによる刺激段階は、ＮＡＮＴ ００１自動搬出機能を用いた培養物のバルク細胞回収によって終了する。培養物の回収前にマイコプラズマ検査用の試料を採取する。

ＮＡＮＴ ００１バイオリアクター：細胞培養物の回収及びＳｅｐａｘ濃度、及び洗浄：Ｍ－ＣＥＮＫ誘導段階の完了後、ＮＡＮＴ ００１を手動で進めて自動化された自動搬出回収プロトコルを実施する。自動搬出回収は、ＮＡＮＴ ００１バイオリアクターと収集バッグとの間の直接の無菌溶着を利用したクローズドシステムを使用して行われる。Ｍ－ＣＥＮＫの搬出後、ＮＡＮＴ ００１バイオリアクターをＮＫ－ＧＭでフラッシュして、残留するあらゆる細胞を取り込む。

自動搬出回収段階の完了後、Ｍ－ＣＥＮＫ細胞が入った中間体回収バッグを秤量し、次に下流処理及び原薬製剤化のためＳｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏ装置に直接溶着する。ＧＥからのＳｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏは、単回使用の使い捨て技術を利用するものであり、ＢＣＨ中間バッグに直接無菌溶着することが可能である。Ｓｅｐａｘ Ｃ－Ｐｒｏは、単回使用の使い捨てキット並びに指定された洗浄及び再懸濁液プログラムを使用して、初めに細胞濃縮ステップを実施し、続いて５％アルブミン（ヒト）溶液を使用した２室容量緩衝液交換／洗浄ステップを実施する。最後に、細胞を濃縮し、取り付けた３００ｍＬ細胞収集バッグ内の５０ｍＬの近似容積の５％ヒトアルブミン溶液に０．１～２．５×１０^７細胞／ｍＬの予想細胞密度で溶出させる。次に装置からＭ－ＣＥＮＫが入った収集バッグ／ベッセルを取り出し、ＱＣ試料をアリコートに分けて、細胞生存能力、細胞密度及びエンドトキシンを決定する。播種用の接種材料として同じ患者のＭＮＣが複数のＮＡＮＴ ００１バイオリアクターに入っていた場合、Ｍ－ＣＥＮＫはプールすることができる。

Ｍ－ＣＥＮＫ薬物製剤の製剤化：同じ患者のＡＭＩを接種した複数のＮＡＮＴ ００１バイオリアクターから生成されたＭ－ＣＥＮＫ調製物は、この段階でプールし、容量補正を行って０．５～１．５×１０^７細胞／ｍＬのＶＣＤを実現する。続いて５％ヒトアルブミン中のＭ－ＣＥＮＫを氷上のフラスコ内で等容積（１：１）のＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０と混合して製剤化された薬物製剤を調製する。製剤化した細胞を氷上のＣｅｌｌＦｒｅｅｚｅ（登録商標）注入バッグ（ＣＦ－７５０）に移し替え、複数の薬物製剤バッグ及び小さいＱＣバッグを調製する。続いて充填済みの注入バッグをコントロールレートフリーザーを使用して－８５℃以下に凍結する。次に凍結した薬物製剤を長期保存用に気相のＬＮ２フリーザーに移し替える（－１２０℃以下）。解凍時にＱＣバッグでＱＣ及び無菌性検査を実施する。ＮＡＮＴ ００１バイオリアクターを使用したＭ－ＣＥＮＫ細胞の拡大及び回収の工程フローを以下に示す。

ＮＡＮＴ ００１バイオリアクターを使用したＭ－ＣＥＮＫ－ＤＳ製造工程の概要を図３１に示す。図３２は、Ｍ－ＣＥＮＫ生産フロー工程の例を示す。この工程によって生産されたＭ－ＣＥＮＫロットの効力を図３３に示す。

ＩＬ－１２／ＩＬ－１８／Ｎ－８０３誘導Ｍ－ＣＥＮＫ
生存率及び生細胞密度：Ｍ－ＣＥＮＫ細胞の構造的完全性を反映する一つの尺度は、パーセント生存率である。生存率は、工程及び最終製剤出荷時の測定における常法として用いられ、製剤品質の指標となる。以下の実験は、製剤特性及び品質を確かめる例示的検査について記載する。

ＣＤ５６発現：神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ１）、別名ＣＤ５６は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６が発現し、ＣＤ３がないことによって特徴付けられる。ＰＢ－ＮＫ由来のＭ－ＣＥＮＫ細胞はＣＤ５６発現を保持している。

ＩＦＮ－γ発現：ＮＫ細胞は、自然免疫系における細胞溶解性のサイトカイン産生エフェクター細胞である。ＮＫ細胞は、腫瘍活性に干渉するＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）の主要な供給源である。フローサイトメトリーベースの細胞内サイトカイン染色アッセイを用いてＩＦＮ－γ産生を分析した。図１０を見ると分かるとおり、Ｍ－ＣＥＮＫ細胞には、ＮＡＮＴ ００１工程によって生成された多量のＩＦＮ－γが検出され、発現は高度に均一であった（ＣＤ５６＋細胞の９９．６％がＩＦＮ－γ染色陽性であり、ＭＦＩは、非染色試料の１２２（青色）に対して１５７５９（赤色）を示した。

表現型分析：（Ａ）ＤＮＡＭ－１：接着分子として機能して活性化型受容体と相乗作用し、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を惹起する細胞表面糖タンパク質である。ＤＮＡＭ－１＋ｖｅ ＮＫ細胞は、ＩＬ－１２及びＩＬ－１８による刺激後、そのＤＮＡＭ－１－ｖｅ対応物と比べてＩＦＮγをより高度に産生する。ＤＮＡＭ－１は、以下に記載する表現型タイピングアッセイで観察されるとおり、Ｍ－ＣＥＮＫ細胞で上方制御される。（Ｂ）ＴＩＧＩＴ：ＮＫ細胞の細胞傷害活性に負の影響を及ぼし得るチェックポイント受容体である。Ｍ－ＣＥＮＫ生成では、ＴＩＧＩＴ発現の有意な変化は見られなかった。ＴＩＧＩＴ発現は、以下に記載する表現型タイピングアッセイで分析した。（Ｃ）ＣＤ２５：ナチュラルキラー細胞はＩＬ－２Ｒα鎖（ｐ５５）を発現し、これは高親和性ＩＬ－２Ｒの形成についてはＣＤ２５と同定される。Ｍ－ＣＥＮＫ細胞ではＣＤ２５が上方制御される。（Ｄ）ＣＤ１６：選択のＣＤ５６＋末梢血ＮＫ細胞に存在する。抗体で被覆された細胞の認識時に、これがＮＫ細胞に強力なシグナルを送り、それによって標的が直接的な殺傷及びサイトカイン産生を通じて排除される。

ＧＳＨ細胞の生存能：Ｍ－ＣＥＮＫ細胞の健常性状態を反映する一つの尺度は、細胞に利用可能な細胞内還元力又はパーセント生存能である。細胞内還元型チオール（グルタチオン；ＧＳＨ）の発現は、特異的色素（ＶｉｔａＢｒｉｇｈｔ－４８（商標）、ＶＢ４８）による細胞株の染色よって分析することができ、この色素は、チオールと反応して、アクリジンオレンジ（ＡＯ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）との組み合わせでそれぞれ有核細胞及び死細胞を染色する蛍光生成物を形成するものである。続いて、染色した試料をＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ３０００（商標）イメージングサイトメーターによって分析する。図１１の例示的結果を見ると分かるとおり、ＮＡＮＴ ００１バイオリアクターで拡大した異なる培養バッチからのＭ－ＣＥＮＫ細胞が、高い生存能を有する健常な細胞の特徴（ＧＳＨ＋ｖｅ、ＰＩ－ｖｅ）を示し、互いに同等であった。

アネキシンＶ細胞健常性：Ｍ－ＣＥＮＫ細胞の健常性を反映する別の尺度は、培養物中にアポトーシス細胞、プレアポトーシス細胞及び壊死細胞が存在することである。アネキシンＶアッセイでは、初期アポトーシスの指標である細胞膜外層へのホスファチジルセリンの移行を検出することが可能である。初期アポトーシス細胞の定量化は、細胞をアネキシンＶ－ＡＦ４８８コンジュゲートと、加えてＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２及びＰＩで染色してそれぞれ有核細胞及び死細胞を染色することにより実現できる。続いて、染色した試料をＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ３０００（商標）イメージングサイトメーターによって分析する。ＮＡＮＴ ００１バイオリアクターで拡大した異なる培養バッチからのＭ－ＣＥＮＫ細胞が、健常な細胞の特徴（アネキシン陰性ＰＩ陰性）を示し、互いに同等であった。例示的結果を図１２に示す。

ＭＳ－１細胞に対するＭ－ＣＥＮＫ細胞傷害性：Ｍ－ＣＥＮＫ細胞の活性の測定に用いられる重要な機能アッセイは、ＮＫ細胞の細胞傷害性全般に対して比較的抵抗性の高い細胞株であるＭＳ－１標的細胞株に対する細胞傷害性を評価することである。拡大版特性評価の例として、以下の図１３のグラフは、幅広いエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比にわたってグラフに描いたＭ－ＣＥＮＫ細胞（赤色）の細胞傷害性の結果を示す。対照ＣＥＮＫ細胞（青色）もまたＮＡＮＴ ００１バイオリアクターで拡大したが、Ｍ－ＣＥＮＫ生成は誘導されなかった。

Ｋ５６２細胞に対するＭ－ＣＥＮＫ細胞の細胞傷害性：Ｋ５６２細胞株に対するＭ－ＣＥＮＫ細胞の天然の細胞傷害性に関する検査は、Ｍ－ＣＥＮＫ細胞の拡大版特性評価の一部である。図１４のグラフは、ＮＡＮＴ ００１バイオリアクターで拡大したが、サイトカインカクテルで刺激しなかった対照ＣＥＮＫ細胞（青色）と比べたＫ５６２細胞に対するＭ－ＣＥＮＫ細胞（赤色）の天然の細胞傷害性を比較した結果を提示する。

ＴｘＭ誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞
以下の研究で使用するＴｘＭはＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ，Ｉｎｃ．から入手したもので、図１５Ａに示されるとおりのＮ－８０３、ＩＬ－１２及びＩＬ－１８を含む融合タンパク質であり、図１５Ｂは、ＴｘＭに使用される配列を描く。ＩＬ－１８をＮ－８０３のＩＬ－１５部分に融合し、及びＩＬ－１８のＩＬ－１２単鎖ヘテロ二量体をＮ－８０３のＩＬ－１５受容体α部分に融合したこのスーパーカインを、サイトカインＮ－８０３の代わりとして、ＮＫ記憶表現型を誘導するその能力の点で判定した。

単核球からのＣＥＮＫの作製について上記のとおり記載したが、しかしながら、本工程では、サイトカインカクテル（ヒトＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＮ－８０３）によるＣＥＮＫの誘導／刺激を、直前で説明したとおりのＴｘＭによる誘導／刺激に置き換えた。これに関連して、本明細書で使用したＴｘＭは、１：１：１の等モル比のＩＬ－１５類似体（Ｎ－８０３）とＩＬ－１８とＩＬ１２（単鎖）を有したことに留意しなければならない。注目すべきことに、ＴｘＭの構成要素のモル比はサイトカインカクテルのモル比と実質的に異なっている。

その上、ＴｘＭは、３つ全てのサイトカイン機能がごく近接して会合していたため、同時発生的な活性化をもたらすが、一方、サイトカインカクテル（ヒトＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＮ－８０３）によるＣＥＮＫの誘導／刺激は空間的及び時間的に別々の活性化イベントを許容するであろうことに留意しなければならない。意外にも、ＴｘＭは、サイトカインカクテルの使用と比較したとき、向上したとまでは言えないにしても、実質的に同一のＭ－ＣＥＮＫの形成を可能にした。加えて、ＴｘＭは単一のタンパク質複合体として提供され、ＣＥＮＫ細胞への添加は１回限りでよいため（３回の添加とは対照的に）、汚染のリスクが大幅に減少する。その上、ＴｘＭは単一のタンパク質複合体として提供されるため、個々のサイトカイン調製物の効力の一貫性のなさ（例えば、ロット間変動）を完全に回避することができる。

ＴｘＭ誘導細胞との比較のため、Ｎ－８０３濃縮後のＮＫ細胞（ＣＥＮＫ、サイトカイン増強ＮＫ細胞）を、一定濃度のＮ－８０３（１７５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するサイトカインカクテルと共に、又はＴｘＭ（９．８μｇ／ｍＬ）単独と共にインキュベートした。細胞を１４～１６時間刺激し、それによって以下に更に詳細に示すとおりの記憶様表現型のＣＤ５６陽性細胞（Ｍ－ＣＥＮＫ）が誘導された。

回収後、両処理実験からのＭ－ＣＥＮＫ細胞を様々なアッセイで記憶細胞特性に関して判定した。サイトカインプライミングは、概してＮＫ細胞の増殖及び機能に必要である。しかしながら、サイトカインはまた、ＮＫ細胞の用量依存性の死滅にもつながり得る。従って、Ｎ－８０３で拡大したＮＫ細胞の生存率をＴｘＭ刺激の前後に判定した。以下の表を見ると分かるとおり、ＴｘＭ誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞は高い生存率を示し、それはＣＥＮＫ細胞と同等であった（９０％超）。

Ｍ－ＣＥＮＫ細胞は、主要なＩＦＮ－ガンマ産生細胞である。ＴｘＭ誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞にＩＦＮ－ガンマ産生能力が発生したかどうかを判定するため、フローサイトメトリーベースの染色方法を用いた。図１６を見ると分かるとおり、Ｍ－ＣＥＮＫ細胞には、ＣＥＮＫ細胞と比較したとき、大幅に多い数のＩＦＮ－ガンマ発現細胞が観察された。ここで、このグラフは、ＴｘＭ誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞が炎症誘発性サイトカインとしてのＩＦＮ－ガンマの有効な産生者であることを実証する例示的結果を描いている。

細胞傷害性に関して、ＴｘＭ誘導Ｍ－ＣＥＮＫＳ細胞が様々な細胞株に対して有意な細胞傷害性を有することを確立するため、様々な実験を実施した。

ある一組の実験では、ＴｘＭ誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞の細胞傷害性をＭＳ－１細胞に対して試験した。ＭＳ－１は、ＮＫ細胞の細胞傷害性全般に抵抗性を持つ皮膚癌細胞である。ＭＳ－１細胞株に対するＭ－ＣＥＮＫ細胞の細胞傷害性を細胞傷害性アッセイで幅広いエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比にわたって測定した。注目すべきことに、Ｍ－ＣＥＮＫはＭＳ－１細胞の有意な溶解を誘導したが、ＣＥＮＫ細胞は誘導しなかったことから、生成された製剤が抵抗性腫瘍細胞に対する強力な細胞傷害活性を獲得したことが示唆される。詳細には、図１７は、ＴｘＭ誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞が、グラフから容易に見て取れるとおり、ＮＫ抵抗性ＭＳ－１細胞の強力なキラーであることを実証している。

次に、両方の処理によるＭ－ＣＥＮＫ細胞を細胞傷害性アッセイで比較した。ここでは、いずれの処理から作製した細胞も、ＭＳ－１に対して強力な同等の細胞傷害性を誘導したことから、ＴｘＭがサイトカインカクテルの代わりとして働き得ることが示唆される。図１８は、ＮＫ抵抗性ＭＳ－１細胞を死滅させるためのＴｘＭ誘導と比べたサイトカインカクテル誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞の例示的比較結果を描く。

ＴｘＭ誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞がＮＫ細胞の天然の細胞傷害活性を保持しているかどうかを判定するため、カルセインベースの細胞傷害性アッセイでＭ－ＣＥＮＫ細胞をＫ５６２標的細胞と混合した。エフェクター細胞と標的細胞とを様々な比で一緒に混合した。いずれの処理から作製したＭ－ＣＥＮＫも、Ｋ５６２に対して強力な同等の細胞傷害性を誘導したことから、ＴｘＭを使用した活性化工程においてＮＫ細胞の天然の細胞傷害性が保持されたことが示唆される。図１９は、ＴｘＭ誘導と比べたサイトカインカクテル誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞がＫ５６２細胞を死滅させる能力の典型的な比較結果を示す。

更なる実験では、両方の処理（ＴｘＭ誘導及びサイトカインカクテル誘導）からのＭ－ＣＥＮＫ細胞について、ＩＦＮ－ガンマを産生するその潜在的能力を比較した。著しいことに、いずれの処理から生成されたＭ－ＣＥＮＫも、フローサイトメトリーベースのアッセイで観察されるとおり、強力なＩＦＮ－ガンマを誘導した。詳細には、図２０は、ＴｘＭ誘導及びサイトカインカクテル誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞におけるＩＦＮ－ガンマ産生の例示的比較結果を描く。

ＮＫ細胞の活性化型受容体がＮＫ細胞の抗腫瘍応答の惹起において鍵となる役割を果たすことは周知である。従って本発明者らは、ＴｘＭ処理が１つ以上のＮＫ特異的受容体の発現に影響を与え得るかどうかを調べた。注目すべきことに、いずれの処理から生成された細胞においても、図２１の例示的結果に示されるとおり、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ａ、及びＮＫＧ２Ｃの発現は同等であることが確認された。ここで、グラフは、ＴｘＭ誘導及びサイトカインカクテル（ＩＬ－１２＋ＩＬ－１８＋Ｎ－８０３）誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞上のＮＫ特異的マーカーの典型的な比較結果を示している。

ＴｘＭ処理したＣＥＮＫ細胞が実際にＭ－ＣＥＮＫ表現型に分化するであろうことを確立するため、本発明者らは、処理した細胞を記憶型に関連する特異的マーカーの存在に関してアッセイした。より具体的には、ＣＥＮＫからＭ－ＣＥＮＫへの分化には、概して、ＤＮＡＭ－１（ＤＮＡＸアクセサリー分子－１）、ＣＤ２５、及びＣＤ１６を含めた特異的受容体発現の変化が付随する。そのため、これらの受容体の発現状態の変化をフローサイトメトリーベースのアッセイを用いて検出した。ここでもやはり、いずれの処理からのＭ－ＣＥＮＫ細胞も、これらの受容体の同等の発現を示した。図２２は、ＴｘＭ誘導及びサイトカインカクテル誘導Ｍ－ＣＥＮＫ細胞の記憶細胞表現型の例示的比較結果を示す。

上記を踏まえると、これらの実験結果は、明確に、及び予想外にも、ＣＥＮＫ細胞におけるＮＫ記憶表現型（Ｍ－ＣＥＮＫ）の誘導について、ＴｘＭ融合タンパク質がＩＬ－１２／ＩＬ－１８／Ｎ－８０３カクテルの代わりとして働き得ることを実証している。これらのサイトカインはまた、多くの場合に細胞傷害性を増加させるが、高濃度ではアポトーシスを引き起こすであろう他のＮＫ細胞活性化サイトカイン（例えば、ＩＬ－２１）の代わりとしても働き得る。

Ｍ－ｃｅＮＫ細胞は細胞傷害効果の増強をもたらす
本発明者らまた、Ｎ－８０３（又は本明細書に提示されるとおりのＩＬ１５受容体足場を有するＴｘＭ）を含有するサイトカインカクテルで様々なＮＫ細胞を処理した場合に、かかる細胞が種々の癌細胞に対して、及びＥＭＴ（内皮間葉転換）を起こした癌細胞に対してまでも、優れた細胞傷害性を有したことも発見した。注目すべきことに、このように処理した細胞は、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}、ＣＤ１６^ｌｏｗの表現型を呈し、未処理細胞と比べてＮＫｐ４４高発現、及びＴＩＧＩＴ低発現を示した。図２３～図３０は、かかる向上した細胞傷害性についての例示的結果を提供する。その上、上記の知見を踏まえると、同じような方法でＴ細胞多様性を実現し得ることもまた企図される。

ＮＫ細胞溶解アッセイには、ｃｅＮＫ、Ｍ－ｃｅＮＫ、健常ドナーＮＫ細胞（２ドナー）、及びＮ－８０３で予め処理した健常ドナーＮＫ細胞（２ドナー）などのＮＫ細胞エフェクターが含まれた。腫瘍細胞には、ＳＣＬＣ－Ｈ６９及びＨ８４１、卵巣癌－ＯＶＣＡＲ３及びＳＫ－ＯＶ－３、乳癌－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＳＣＬＣ－Ｈ４４１が含まれた。ＮＫ細胞と腫瘍細胞とを６時間の間にわたって共培養し、Ｃｅｌｉｇｏシステムで細胞数を収集した。２０：１、１０：１、及び５：１のＥ：Ｔ比を評価した。結果は、それぞれ図２３～図２５に示す。図２３は、ＮＫ細胞による小細胞肺癌の溶解を例示する。これらの結果は、ｃｅＮＫ及びＭ－ｃｅＮＫ細胞が上皮及び間葉表現型のＳＣＬＣ腫瘍を溶解させるのに極めて有効であることを示している。図２４は、ＮＫ細胞による卵巣癌の溶解を例示する。これらの結果は、ｃｅＮＫ及びＭ－ｃｅＮＫ細胞が卵巣癌細胞株において上皮標的に対してはＮ８０３で予め処理したＮＫ細胞と同様の溶解をもたらすが、間葉標的細胞のより高い溶解活性をもたらすことを示している。図２５は、ＮＫ細胞による乳癌及びＮＳＣＬＣの溶解を例示する。ｃｅＮＫ及びＭ－ｃｅＮＫ細胞は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＴＮＢＣ腫瘍細胞の溶解に有効であり、Ｈ４４１ ＮＳＣＬＣ細胞の最も有効なＮＫ溶解をもたらす。これらの結果は、本明細書に開示されるＭ－ｃｅＮＫ細胞を癌幹細胞及び間葉系幹細胞の治療として使用し得ることを示している。

フローサイトメトリーで評価されるＮＫ受容体の概要については、Ｃｈａｎ．Ｃ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎ．，２０１６（これは参照により全体として本明細書に援用される）を参照し得る。ＮＫ細胞のＣＤ５６／ＣＤ１６プロファイル－健常ドナーＮＫ細胞のＣＤ５６／ＣＤ１６プロファイルはＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ ＮＫ細胞と大きく異なり、図２６に示されるとおり、後者は高度にＣＤ５６＋である。ｃｅＮＫ及びＭ－ｃｅＮＫ細胞は、図２７～図２８に示されるとおり、活性化型受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及びＮＫＧ２Ｄをより高度に発現する。図２９は、ＮＫ細胞内タンパク質発現を例示する。ｃｅＮＫ及びＭ－ｃｅＮＫ細胞は、Ｎ－８０３で活性化させたＮＫと同程度のパーフォリン及びグランザイムを発現する。Ｍ－ｃｅＮＫではＩＦＮ－γが著しく高い。図３０は、ＮＫ抑制型受容体発現を例示する。ｃｅＮＫ及びＭ－ｃｅＮＫ細胞は、抑制型受容体ＴＩＭ３、ＫＬＲＧ１、及びＴＩＧＩＴの発現レベルが著しく低い。

図３４は、Ｍ－ＣＥＮＫ表面表現型を例示する。そこに示されるとおり、ＣＤ５６、ＣＤ２５、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＤＮＡＭ－１、及びＴＩＧＩＴに関して陽性発現が見られた。Ｍ－ＣＥＮＫが各種の癌細胞に及ぼす効果を図３５に示し、これは、Ｍ－ＣＥＮＫが強力な癌細胞キラーであることを例示している。

ＬＮ２下でのアフェレーシス材料中間体安定性及び凍結保存したＭ－ＣＥＮＫ細胞製剤の安定性を、それぞれ図３６～図３７に示す。Ｍ－ＣＥＮＫの健常ドナーからの生産と患者からの生産とを比較すると（図３８）、健常ドナー及び患者の両方からＭ－ＣＥＮＫを入手し得ることが示される。図３９は、臨床試験ＱＵＩＬＴ－３．０７６（局所進行又は転移性固形腫瘍を有する対象における自己Ｍ－ＣＥＮＫの研究）の第１相プロトコルを示す。

融合タンパク質足場１８／１２／ＴｘＭはＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８受容体を活性化してヒト記憶様ナチュラルキラー細胞を誘導する
一実施形態において、Ｆｅｈｎｉｇｅｒ及び共同研究者らが、ＩＬ－１８及びＩＬ－１２に融合したＩＬ－１５スーパーアゴニスト骨格（Ｎ－８０３）を含有する新規の三重サイトカイン融合分子１８／１２／ＴｘＭの創製について記載している。この三量体分子は、特異的でユニークなＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８活性を保持していたとともに、インビトロ及びインビボで強力なヒト記憶様ナチュラルキラー細胞を生成した。Ｃｕｂｉｔｔ ＣＣ，ｅｔ ａｌ，「Ａ ｎｏｖｅｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ １８／１２／ＴｘＭ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ＩＬ－１２，ＩＬ－１５，ａｎｄ ＩＬ－１８ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ－ｌｉｋｅ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ（２０２２）（これは全体として参照により援用される）を参照されたい。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、様々な悪性腫瘍に対する細胞免疫療法として浮上しつつある細胞傷害性の自然リンパ球系細胞である。ＮＫ細胞は、特に、その生存、増殖、及び細胞傷害機能に関してインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）に依存する。ＮＫ細胞は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８による短時間の活性化後に、エフェクター機能が増強された記憶様細胞に分化する。Ｎ－８０３は、ＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したＩＬ－１５ＲαのｓｕｓｈｉドメインにＩＬ－１５突然変異体（ＩＬ－１５Ｎ７２Ｄ）が結合したものを含む、その結果、ＩＬ－１５の生理的トランスプレゼンテーションを生じるＩＬ－１５スーパーアゴニストである。ここで、本発明者らは、ＩＬ－１５Ｎ７２Ｄドメインを介してＩＬ－１８に融合した、且つＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインによってヘテロマー単鎖ＩＬ－１２ ｐ７０に連結したＮ－８０３足場を使用する新規三重サイトカイン融合分子、１８／１２／ＴｘＭのエンジニアリングについて記載する。この分子は、個別のサイトカイン受容体を通じたその結合及びシグナル伝達による三重特異性サイトカイン活性を呈する。個別のサイトカインによる活性化と比較すると、１８／１２／ＴｘＭは、転写レベル及びタンパク質レベルの両方での同様のＮＫ細胞短期活性化及び記憶様分化、並びに同一のインビトロ及びインビボ抗腫瘍活性を誘導する。従って、Ｎ－８０３は、養子細胞療法用のＮＫ細胞を活性化させるように複数の受容体特異性を備えたサイトカイン免疫療法の創製のための機能性足場として修飾することができる。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、循環血液リンパ球の約５～２０％を占める細胞傷害性自然リンパ球系細胞であり、ウイルス感染細胞及び悪性形質転換細胞の排除に重要である。ＮＫ細胞機能は、細胞表面に発現する生殖細胞系列にコードされる活性化型受容体、共刺激受容体、及び抑制型受容体の平衡による厳密な調節を受ける。ＮＫ細胞は、これらの受容体を通じて、ＮＫ細胞上の抑制型受容体に結合する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩなどの自己識別分子の喪失によるか（「自己喪失」の検出）、又は抑制シグナルに打ち勝つことのできるＮＫ細胞上の活性化型受容体が認識するリガンドを上方制御することにより、細胞を認識し、自然発生的に死滅させることが可能である。ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６の表面発現及びＣＤ３が存在しないことによって同定され、相対的ＣＤ５６発現に基づいて特徴的に異なるＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}及びＣＤ５６^ｄｉｍサブセットに分類することができ、ここでＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞は、典型的にはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を発現し、一方、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞は低発現であるか、又は発現がない。

ＮＫ細胞は幾つものサイトカイン受容体を構成的に発現し、特に、発生、恒常性、及び機能に関してＩＬ－１５に依存する。ＩＬ－１５シグナル伝達は、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞の生存、増殖、及びプライミング（高用量で）を促進すること、及びＣＤ５６^ｄｉｍサブセットの細胞傷害性を増強することが示されている。ＩＬ－１５受容体型の受容体サブユニットは３つある：ＩＬ－１５Ｒα（ＣＤ２５）、ＩＬ－１５Ｒβ（ＣＤ１２２）、及びＩＬ－１５Ｒ（ＣＤ１３２）。ＩＬ－１５受容体のシグナル伝達成分はプライベートでなく、そのβサブユニットはＩＬ－２と共有され、そのγサブユニット（共通のγ鎖）はＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、及びＩＬ－２１と共有されている。生理学的には、ＩＬ－１５はその効果をトランスプレゼンテーションを通じて媒介し、これは、ＩＬ－１５Ｒβγ_ｃを担持するＮＫ細胞にＩＬ－１５を提示するアクセサリー細胞（樹状細胞及び単球／マクロファージなど）の表面上に高親和性ＩＬ－１５Ｒαを発現させるものである。ＩＬ－１５によって媒介される効果に加えて、サイトカインＩＬ－１２及びＩＬ－１８もまた、ＮＫ細胞の生存及び機能にとって重要である。ＩＬ－１２がＮＫ細胞に及ぼす一次効果はＳＴＡＴ４媒介性シグナル伝達を介して起こり、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）産生が含まれる。ＩＬ－１８は、ＭＡＰＫ及びＮＦ－ｋＢ活性化につながるシグナルを伝達するものであり、ＩＬ－１２及びＩＬ－１５と相乗的に機能する一方で、ＮＫ細胞をＩＦＮ－γ産生に向けてプライミングもすると記載されている。実際、パラダイムシフト研究では、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８による活性化の組み合わせにより、サイトカイン、腫瘍による、又は活性化型受容体を介した再刺激後に、増殖の増強、高親和性ＩＬ－２受容体αβγ（ＩＬ－２Ｒαβγ）の発現及びＩＦＮ－γ産生の増加によって定義される記憶様ＮＫ細胞が誘導されることが実証されている。これらのサイトカイン誘導記憶様（ＭＬ）ＮＫ細胞は、有望なＮＫ細胞療法に相当し、再発性／難治性ＡＭＬ患者のファースト・イン・ヒューマン臨床試験で期待の持てる結果を見せている。

Ｎ－８０３は、ＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したＩＬ－１５ＲαのＮ末端構造（ｓｕｓｈｉ）ドメインにＩＬ－１５突然変異体（ＩＬ－１５Ｎ７２Ｄ）が結合したものを含むＩＬ－１５スーパーアゴニストである。この結果、ＩＬ－１５と比較して、アクセサリー細胞非依存性のＩＬ－１５トランスプレゼンテーション、長期にわたるインビボ薬物動態、インビボでの生物学的活性の増加、及びエフェクター機能の増加が生じる。ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の刺激の組み合わせによって誘導される強力な機能的効果を所与として、本発明者らは、単一分子の構築物が３つ全てのサイトカイン経路を通じてシグナルを送ることができれば、研究適用及び臨床適用の両方のための記憶様ＮＫ細胞の生成に有益となるであろうと仮定した。そのため、本発明者らは、Ｎ－８０３を足場として用いて、ＩＬ－１８をＩＬ－１５Ｎ７２Ｄドメインに連結し、及びヘテロマー単鎖ＩＬ－１２ ｐ７０を、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに既に連結されているＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインに連結して、融合タンパク質１８／１２／ＴｘＭを構築した。この非共有結合的に会合したヘテロ二量体、ホモ二量体、三重サイトカイン融合タンパク質は、インビトロ及びインビボで、特異的且つユニークなＩＬ－１８、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１５活性を保持していた。

Ｎ－８０３構造は安定しているため、ＩＬ－１５ベースのシグナルは維持しつつ、「骨格」を追加成分で装飾するという生化学的戦略が与えられる。ここで、本発明者らは、この新規１８／１２／ＴｘＭ融合タンパク質が記憶様ＮＫ細胞を生成する能力について、個別の組換えヒトＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の組み合わせと比較して調べた。これには、各サイトカイン受容体シグナル伝達の個別の活性、短期エフェクター機能、及び記憶様ＮＫ細胞の生成能力のインビトロ試験が含まれた。

融合体１８／１２／ＴｘＭスーパーカインは、全ての標的サイトカイン受容体を介したシグナル伝達を誘導する
本発明者らは初めに、組換えサイトカインを個別に使用することに代えるため、ヒトＩＬ－１８、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１５からなる融合タンパク質を構築しようとした。この目的で、Ｎ－８０３（ＩＬ－１５スーパーアゴニスト、旧称ＡＬＴ－８０３）をＩＬ－１５Ｎ７２Ｄドメインを介してＩＬ－１８に連結し、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインにつながっているＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインによってヘテロマー単鎖ＩＬ－１２ ｐ７０に連結した（図４０Ａ）。この三重サイトカイン融合タンパク質（以下、１８／１２／ＴｘＭと称する）が、全ての標的サイトカイン受容体を介したシグナル伝達を誘導する能力を評価した。単離及び精製したばかりのＮＫ細胞を１８／１２／ＴｘＭ（３８．８ｎＭ）又は組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ）との最適な組み合わせ（ＩＬ１２／１５／１８）で刺激し、それが主要なシグナル伝達中間体のリン酸化を誘導する能力に関して様々な時点で評価した。１８／１２ＴｘＭは、ＳＴＡＴ５、ＡＫＴ、及びＥＲＫのリン酸化を通じてＩＬ－１５シグナル伝達を誘導し、効率はＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}及びＣＤ５６^ｄｉｍの両方のＮＫ細胞サブセットでＩＬ１２／１５／１８刺激と同様であった（図４０Ｂ）。濃度が高くなると、１８／１２／ＴｘＭ（７７．６ｎＭ）はＣＤ５６^ｄｉｍ細胞にやや高いリン酸化（ｐ）ＥＲＫを誘導し、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞にやや低いｐＡＫＴを誘導した（図４７Ａ）。ＩＬ－１２シグナル伝達によるＳＴＡＴ４のリン酸化は、低いＴｘＭ用量（３８．８ｎＭ）でＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞において中程度ではあるが統計的に有意な差を示し（ｐ＝０．００５）、高いＴｘＭ濃度（７７．６ｎＭ）では、又はＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞においては、差は観察されなかった（図４０Ｃ、図４７Ｂ）。ＩＬ－１８シグナル伝達を介したｐ６５のリン酸化も同様に１８／１２／ＴｘＭ及びＩＬ－１２／１５／１８によって誘導された（図４０Ｄ、図４７Ｃ）。次に、１８／１２／ＴｘＭが個別のサイトカインバイオアッセイを活性化する能力を評価した。ＩＬ－１５活性を解明するため、マウス造血細胞株、ＩＬ－２／１５依存性３２Ｄ－ＩＬ２／１５Ｒβ（３２Ｄβ）細胞の増殖を評価した。漸増濃度の１８／１２／ＴｘＭ又はＮ－８０３を３２Ｄβ細胞に加え、３７℃で３日間インキュベートし、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生死判別試薬を使用して増殖を測定した。１８／１２／ＴｘＭが細胞増殖を促進する能力は、Ｎ－８０３と比較すると低下したが（ＥＣ_５０がＮ－８０３について０．０３ｎＭであるのに対し１．７ｎＭ）、これはＩＬ－１８をＩＬ－１５Ｎ７２Ｄドメインに連結したことに起因する可能性がある（図４０Ｅ）。１８／１２／ＴｘＭのＩＬ－１２活性を決定するため、ＳＴＡＴ４誘導可能分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を発現するＩＬ－１２レポーターＨＥＫ－ｂｌｕｅ（ＨＥＫ１２）細胞の活性化を評価した。漸増濃度の１８／１２／ＴｘＭ又は組換えＩＬ－１２をＨＥＫ１２細胞に３７℃で２０～２２時間加えた。ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用してＳＥＡＰの活性を測定し、吸光度とタンパク質濃度との間の関係に基づきＩＬ－１２生物活性の５０％有効濃度（ＥＣ_５０）を決定し、及び組換えＩＬ－１２の生物活性を陽性対照として使用した。１８／１２／ＴｘＭのＥＣ_５０は、ｒｈＩＬ－１２について９９．１ｐＭ及び８６．１ｐＭであったが、これは、組換えＩＬ－１２と同様の生物活性であることを実証している（図４０Ｆ）。最後に、ＩＬ－１８について、ＮＦ－κＢ／ＡＰ－１誘導可能ＳＥＡＰ遺伝子を発現するＩＬ－１８レポーターＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（ＨＥＫ１８）細胞を漸増濃度の１８／１２／ＴｘＭと共に播いた。３７℃で２０～２２時間インキュベートした後、上記に記載されるとおりＳＥＡＰの活性を測定した。１８／１２／ＴｘＭのＥＣ_５０は７．１ｐＭであって、組換えＩＬ－１８（０．５４ｐＭのＥＣ_５０）と比較して約１３分の１に低下したが、これは、ＩＬ－１８をＩＬ１５Ｎ７２Ｄに連結したことに起因した可能性がある（図４０Ｇ）。まとめると、これらのデータは、適切な濃度の１８／１２／ＴｘＭがＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８受容体を介してシグナルを刺激することを裏付けている。

１８／１２／ＴｘＭスーパーカインによる短期活性化によってＮＫ細胞活性化が起こる
ヒトＮＫ細胞をＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８で短期活性化すると、ＩＬ－２受容体α（ＩＬ－２Ｒα、ＣＤ２５）の発現の増加及びＩＦＮ－γ産生の増強につながる。１８／１２／ＴｘＭ活性化に最適な濃度を判定するため、精製したヒトＮＫ細胞を漸増濃度の１８／１２／ＴｘＭ又はＩＬ１２／１５／１８で１６時間活性化させた。活性化表現型の誘導は、フローサイトメトリーにより決定されるとおりの、対照の静止ＮＫ細胞と比較したときの細胞表面ＣＤ２５発現及び細胞内ＩＦＮ－γの増加として評価した（図４１Ａ）。ＣＤ２５を最大限誘導するのに最適な濃度に達したのは３８．８ｎＭ １８／１２／ＴｘＭであり、このときＥＣ５０は２．０９５ｎＭであった（図４１Ｂ）。３８．８ｎＭの１８／１２／ＴｘＭ又はＩＬ１２／１５／１８による精製ヒトＮＫ細胞の短期活性化は、対照ＮＫ細胞と比べて同様のＣＤ２５誘導を実証した（図４１Ｃ、図４１Ｄ）。同様に、３８．８ｎＭでＩＦＮ－γの誘導はほぼ最大に達し、このときＥＣ_５０は２．６４ｎＭであった（図４１Ｅ）。短期活性化は、１８／１２／ＴｘＭによる細胞内ＩＦＮ－γの誘導がＩＬ１２／１５／１８と比較して同様であることを実証したが、但し、両方とも、低用量ＩＬ－１５（１ｎｇ／ｍＬ）対照より有意に高かった（図４１Ｆ、図４１Ｇ）。まとめると、これらのデータは、１８／１２／ＴｘＭ融合タンパク質が、ｒｈＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の組み合わせと比較してほぼ同一のＩＬ－１２、１５、及び１８受容体を介した短期活性化を生じさせ、その結果、ＩＦＮ－γ及びＣＤ２５発現が生じることを示している。

１８／１２／ＴｘＭスーパーカインで活性化するとＮＫ細胞増殖が刺激される
先行研究では、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８で活性化すると、ＮＫ細胞のロバストな増殖及び拡大を含む記憶様表現型につながることが実証されている。１８／１２／ＴｘＭが増殖を誘導する能力について取り組むため、精製したヒトＮＫ細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、１８／１２／ＴｘＭ（３８．８ｎＭ）、ＩＬ１２／１５／１８、又は低用量ＩＬ－１５（ＬＤ ＩＬ１５）で１６時間活性化させた。活性化後、ＮＫ細胞（ＣＤ５６^ｄｉｍ及びＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}の両方のサブセットを含む）を洗浄し、ＬＤ ＩＬ１５中に６日間静置した。先行のデータと一致して、ＩＬ－１２／１５／１８又は１８／１２／ＴｘＭで活性化すると、低用量ＩＬ－１５で活性化したものと比較して、ロバストな増殖が誘導された（図４２Ａ、図４２Ｂ）。興味深いことに、この一組の実験では１８／１２／ＴｘＭによる活性化の結果、ＩＬ１２／１５／１８と比較して増殖の増強が生じ、３世代を超えて拡大するＮＫ細胞の比率が増加した（図４２Ｂ）。この１８／１２／ＴｘＭによる細胞周期の増加は、活性化条件間での生存率の違いが原因ではなかった（図４８）。この増殖の増強は、ＩＬ－１５Ｒα及びＩｇＧ１－Ｆｃ成分からのシグナル伝達の増強に起因してＩＬ－１５単独よりも増殖を誘導する程度が大きいＮ－８０３足場が原因であるか、又は別の可能性として、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８受容体を介したシグナルの同時発生に関係していることもあり得る。

多次元表現型の変化は、ＩＬ１２／１５／１８誘導及び１８／１２／ＴｘＭ誘導記憶様ＮＫ細胞の間で同様である
記憶様ＮＫ細胞は、ＩＬ１２／１５／１８による活性化直後及び分化６日後の両方で多数の細胞表面及び細胞内マーカーの劇的な変化を起こす。ＮＫ細胞の系統、成熟、及び機能的能力に関するマーカーを含むカスタムのマスサイトメトリーパネルを以前開発しており（図５１）、ＭＬ ＮＫ細胞多次元表現型を同定した。多次元表現型を比較するため、活性化前（ベースライン）、ＩＬ－１２／１５／１８又は１８／１２／ＴｘＭと共に１６時間インキュベートした後（Ｄ１）、活性化から６日間のＭＬ分化の時間を与えた後（Ｄ６）のヒトＮＫ細胞のプロファイルをマスサイトメトリーを用いて決定した。マーカーの発現中央値を使用したｔＳＮＥ分析により、ベースライン、活性化後１日目、及び６日目のＮＫ細胞集団が特徴的に異なることが明らかになった。注目すべきことに、ＩＬ１２／１５／１８又は１８／１２／ＴｘＭのいずれで活性化したときも、同じ特定のクラスタリングＮＫ細胞サブセットが同定された（図４３Ａ）。更に、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ１３７の増加並びにＣＤ５６及びＣＤ１６の低下など、急性ＮＫ細胞活性化の十分に定義付けられたマーカーについて一晩活性化した後の発現中央値の変化を比較すると、ＩＬ１２／１５／１８活性化及び１８／１２／ＴｘＭ活性化ＮＫ細胞の間で同一であった（図４３Ｂ、図４９）。分化型記憶様ＮＫ細胞の先行研究によれば、ＩＬ１２／１５／１８活性化及び１８／１２／ＴｘＭ活性化ＮＫ細胞は両方とも、６日目にＮＫＧ２Ａ、ＣＤ６９、Ｋｉ６７、ＣＤ２５、ＣＤ１３７、グランザイムＢ、パーフォリン、並びに活性化型受容体ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ９４の同様の上方制御を実証した。これらはまた、既報告のとおり、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ５７、ＮＫｐ３０、及びＮＫｐ８０の同様の下方制御も実証した（図４３Ｃ）。本発明者らは、マスサイトメトリーを用いて、三量体スーパーカイン１８／１２／ＴｘＭが記憶様ＮＫ細胞表現型を誘導可能であり、それは個別の組換えサイトカインを組み合わせた誘導と同一であったと決定することができた。これらのデータは、１８／１２／ＴｘＭ活性化がＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８活性化と同様のＮＫ細胞の短期及び長期変化を生じさせることを指示している。

１８／１２／ＴｘＭはインビトロで機能性の記憶様ＮＫ細胞を誘導する
先行研究では、エキソビボで精製ＮＫ細胞を飽和量のＩＬ１２／１５／１８で一晩刺激した後にＭＬ ＮＫ細胞を誘導できることが示されている。こうした細胞は、１）増殖の増強、２）ＩＬ－２Ｒαの発現、３）ＩＦＮ－γ産生の増加、並びに４）パーフォリン及びグランザイムによって媒介される細胞傷害性の増大などのＭＬ特性を呈する。１８／１２／ＴｘＭによるＭＬ ＮＫ細胞の生成を実証するため、初代ヒトＮＫ細胞を１８／１２／ＴｘＭ（３８．８ｎＭ）、ＩＬ１２／１５／１８又はＬＤ ＩＬ１５で１６時間活性化させて、洗浄し、及び低用量ＩＬ－１５で６日間支持して記憶様分化を可能にしておいた（図４４Ａ）。サイトカイン（ＩＬ－１２［１０ｎｇ／ｍｌ］及びＩＬ－１５［５０ｎｇ／ｍＬ］）又は白血病標的（Ｋ５６２細胞、５：１のエフェクター：標的比）で６時間再刺激した後に、ＭＬ ＮＫ細胞の生成に関する機能読取り値としてＩＦＮ－γの産生を評価した（図４４Ｂ）。１８／１２／ＴｘＭによる活性化では、Ｋ５６２刺激後に誘導されたＩＦＮ－γ発現の程度はＩＬ－１２／１５／１８よりもやや大きかった（図４４Ｃ）。ＩＬ－１２＋ＩＬ－１５刺激後のＩＦＮ－γの発現は、１８／１２／ＴｘＭと比較すると、ＩＬ１２／１５／１８活性化ＮＫ細胞でやや高かったが、両条件で、ＬＤ対照と比べるとロバストに誘導された（図４４Ｃ）。Ｋ５６２刺激後のＣＤ１０７ａ（脱顆粒の代用マーカー）の誘導は、ＬＤ、ＩＬ１２／１５／１８、及び１８／１２／ＴｘＭの間で同様であったが、これは、脱顆粒が記憶様分化による影響を受けないという以前の報告と一致している（図５０Ａ～図５０Ｃ）。興味深いことに、１８／１２／ＴｘＭで活性化すると、刺激がなくてもＴＮＦの発現が高くなったことから、１８／１２／ＴｘＭがこのサイトカインのより高いベースライン発現を誘導するものであることが示唆される（図５０Ｄ～図５０Ｆ）。サイトカイン分泌に加えて、１８／１２／ＴｘＭが腫瘍死滅を促進する能力をＫ５６２標的細胞を使用した標準的な４時間細胞傷害性アッセイで評価した。ＩＬ１２／１５／１８活性化及び１８／１２／ＴｘＭ活性化ＮＫ細胞の間で標的細胞の特異的死滅は同一であり、判定した全てのＥ：Ｔ比でＬＤ ＮＫ細胞よりも高かった（図４４Ｄ）。これらのデータは、１８／１２／ＴｘＭ分子が、ＩＦＮ－γ及び細胞傷害性の増強を含めた記憶様機能の誘導能をＩＬ１２／１５／１８と同程度に有することを指示している。

１８／１２／ＴｘＭ活性化はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８と同様の分子プログラムを誘導する
１８／１２／ＴｘＭ及びＩＬ１２／１５／１８によって誘導される表現型及び機能の類似性を補足するため、本発明者らはバルクＲＮＡシーケンシングを実施した。３例の異なるドナーからの精製したＮＫ細胞を単離し、１８／１２／ＴｘＭ、ＩＬ１２／１５／１８、又はＩＬ－１５のいずれかで活性化する前（ベースライン）、一晩活性化した後（Ｄ１）、及び活性化後ＩＬ－１５で支持して６日（Ｄ６）でＲＮＡを単離した。転写物カウントの分析により、ＬＤ ＩＬ－１５と対比したとき、ＩＬ１２／１５／１８活性化及び１８／１２／ＴｘＭ活性化ＮＫ細胞の間で活性化後Ｄ１の遺伝子発現プロファイルが同様であることが明らかになった。ＩＬ１２／１５／１８又は１８／１２／ＴｘＭ刺激後Ｄ１で発現に有意な差（ｐ＜０．０５）があった遺伝子を分析すると、圧倒的多数（５，８１２個の遺伝子）の変化はいずれの処理後にも共有されており、８０８個のユニークな遺伝子がＴｘＭ条件で発現し、及び３３２個のユニークな遺伝子がＩＬ１２／１５／１８処理後に発現したことが実証された（図４５Ａ）。実際、１８／１２／ＴｘＭ又はＩＬ１２／１５／１８で活性化したＮＫ細胞に発現した遺伝子を直接比較すると、活性化翌日のそれらの発現プロファイルはほぼ同一であった（ｒ^２＝０．９６７９）（図４５Ｂ）。Ｄ１の表現型観察と一致して、１８／１２／ＴｘＭ及びＩＬ１２／１５／１８による短時間の活性化は両方とも、ＩＬ２Ｒα（ＣＤ２５）、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、ＬＴＡ、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）、ＮＩＦＫ、ＣＣＬ３及びＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）の発現の劇的な増加につながった（図４５Ｃ、図４５Ｄ）。活性化後に分化をＬＤ ＩＬ－１５によって支持して６日目、ＬＤ ＩＬ－１５及び１８／１２／ＴｘＭ又はＩＬ１２／１５／１８活性化ＮＫ細胞の間で遺伝子の発現に統計的に有意な差はなかった。圧倒的多数の遺伝子発現変化は最小限であったが（ｌｏｇＦＣ＜０．５又は＞－０．５）、６日目に１８／１２／ＴｘＭ及びＩＬ１２／１５／１８活性化ＮＫ細胞に誘導された遺伝子のうちＬＤと比較して傾向に差のあったもの（ｌｏｇＦＣ＞１又は＜－１）を直接比較すると、これらの２つの処理群間で変化は同様であることが明らかになった（図４５Ｅ）。活性化翌日の分子活性化プロファイルは劇的であるにもかかわらず、６日目までに、ＬＤ ＩＬ－１５及びＩＬ１２／１５／１８活性化ＮＫ細胞の間で発現に差のある統計的に有意な遺伝子はなかった。これは本発明者らの研究室で行われた先行研究と一致しており、記憶様分化を起こしたＮＫ細胞が６日目に不均一であること、及びＩＬ－１５によって誘導される転写プロファイルが圧倒的になるためユニークな転写プロファイルが隠れてしまう可能性があることに起因するものと思われる。発現に差のある一部の遺伝子については、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、及びグランザイムＫの発現の増加を含め、６日目にＬＤ ＩＬ－１５及び１８／１２／ＴｘＭ又はＩＬ１２／１５／１８処理ＮＫ細胞の間で傾向に差があった。１８／１２／ＴｘＭ又はＩＬ１２／１５／１８によって誘導された遺伝子発現の変化の直接比較では、統計的に有意な差は見られなかったことから、それらが６日目までに同様の転写プロファイルを誘導するものであることが示唆される（図４５Ｆ）。従って、濃縮したＮＫ細胞に対してバルクＲＮＡシーケンシング手法を用いると、１８／１２／ＴｘＭ及びＩＬ１２／１５／１８は２４時間後にほぼ同一の転写変化を誘導し、両方とも対照ＮＫ細胞とは異なっていた。しかしながら、この分析手法は、いずれの初期活性化で誘導された６日目ＭＬ ＮＫ細胞間の有意な差も同定しない。機能の増強を伴うＭＬ ＮＫ細胞のサブセットに基づき、本発明者らは、６日目の細胞のうち僅かな割合のみが、ユニークな転写シグネチャを持つ機能性のＭＬ ＮＫ細胞に相当するものと予想する。このセッティングでは、サブセットベースのトランスクリプトーム変化を同定するには、シングルセルＲＮＡｓｅｑ手法が必要となり得る。

１８／１２／ＴｘＭはインビボで記憶様ＮＫ細胞抗腫瘍活性を誘導する
インビトロで１８／１２／ＴｘＭによって誘導される分子及び表現型の変化がまた、インビボ機能の増強に置き換わることを確認するため、本発明者らは、白血病を生着させたＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ＩＬ２Ｒｇ^－／－（ＮＳＧ）マウスで抗腫瘍活性を比較した。簡潔に言えば、ＮＳＧマウスにルシフェラーゼを発現するＫ５６２腫瘍細胞（０．５×１０^６細胞／マウス）を生着させて、４日後に、１８／１２／ＴｘＭ、ＩＬ－２／１５／１８、又はＬＤ ＩＬ－１５で予め活性化させておいたＮＫ細胞（３～５×１０^６細胞／マウス）を注射した（図４６Ａ）。３日目、１１日目、及び１７日目に、全身生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いて腫瘍成長を評価した（図４６Ｂ）。ＩＬ１２／１５／１８又は１８／１２／ＴｘＭのいずれかで誘導したＭＬ ＮＫ細胞は、１７日目に腫瘍制御の増強を実証した（図４６Ｃ）。これらのデータは、ＮＫ細胞を１８／１２／ＴｘＭで活性化させると、インビボで腫瘍標的の制御の増強を発揮するＩＬ１２／１５／１８によって誘導されるものと同様のＭＬ ＮＫ細胞表現型を誘導できることを実証している。

Ｎ－８０３を足場として使用して、ＩＬ－１８をＩＬ－１５Ｎ７２Ｄドメインに連結し、及びヘテロマー単鎖ＩＬ－１２ ｐ７０を、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに既に連結されているＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインに連結して、新規融合タンパク質１８／１２／ＴｘＭを構築した。この非共有結合的に会合したヘテロ二量体ホモ二量体三重サイトカイン融合タンパク質は、活性化、増殖、及びコグネイト受容体を通じたシグナル伝達によって測定したとき、インビトロで特異的且つユニークなＩＬ－１８、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１５活性を保持していた。更に、１８／１２／ＴｘＭは、適切な濃度で使用したとき初代ＮＫ細胞に対してエキソビボで一晩刺激した後及び６日間のインビトロでの記憶様ＮＫ細胞への分化後に、並びにインビボでＮＳＧマウスにおいて、個別のサイトカインの組み合わせと等価な機能を呈した。１８／１２／ＴｘＭがこの記憶様表現型を誘導する能力は、マスサイトメトリー表現型タイピング及びバルクＲＮＡシーケンシングを含めた高次元方法を用いてタンパク質レベル及び転写レベルで確認された。これらの表現型の変化は、インビトロでは等価な細胞傷害性エフェクター機能に置き換わり、インビボでは同様の腫瘍制御に置き換わった。従って、１８／１２／ＴｘＭは、記憶様ＮＫ細胞を生成する際のＩＬ－１２、ＩＬ－１５及びＩＬ－１８の代替となる。

興味深いことに、１８／１２／ＴｘＭで活性化すると、個別のサイトカインを組み合わせるよりも精製ＮＫ細胞の増殖レベルが高くなった。この知見は、同じ又は異なる細胞上のＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８受容体が逐次的に活性化するのでなく、むしろ同じ細胞上にあるこれらの受容体が同時に会合する結果としての特徴的に異なる生物学的帰結があり得ることを示唆している。別の可能性は、足場上へのサイトカインの空間的連結により、三量体分子からの結合の結果としてのサイトカイン受容体及びシグナル伝達分子の膜クラスター形成が増強されるというものである。また、１８／１２／ＴｘＭのＦｃ部分が、ＦｃγＲＩＩＩ受容体（ＣＤ１６）との会合後の下流シグナル伝達イベントを介してＮＫ細胞を活性化させるものであるという可能性もあり得る。しかしながら、ＣＤ５６^ｄｉｍ（ＣＤ１６＋）及びＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}（ＣＤ１６－）ＮＫ細胞の両方で増殖の増加が起こったという観察を所与とすれば、Ｆｃ－ＦｃＲ相互作用によってＣＤ１６＋ＮＫ細胞による近くのＮＫ細胞に対する１８／１２／ＴｘＭの容易なトランスプレゼンテーションが可能になるという可能性もまたあり得る。このような寄与の可能性について明らかにするには、１８／１２／ＴｘＭのＦｃＲヌル変異体を使用した更なる調査が必要になるであろう。

６日目のＬＤ ＩＬ１５活性化及びＩＬ１２／１５／１８活性化ＮＫ細胞の間では、遺伝子発現の差は最小であることが観察された。これは、完全な記憶様分化を起こすことが可能なＮＫ細胞はごく一部であるという以前の観察と一致しており、そのため、バルクＲＮＡシーケンシング方法で及びインビトロでの広範なＩＬ－１５支持培養後にその遺伝子シグネチャを同定することは困難である。記憶様に分化したＮＫ細胞のユニークな転写変化を特徴付けるためには、シングルセルＲＮＡシーケンシングなど、より深さのあるシーケンシング方法を用いた更なる研究が不可欠であろう。また、記憶様分化が主に後成的な変化によって編成される可能性もあり、これはＡＴＡＣ－ｓｅｑなどの方法で明らかにすることができる。

ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞（及びＣＤ８＋ Ｔ細胞）活性化を刺激する能力があるため、臨床免疫療法の組み合わせに理想的な候補として使用されている。しかしながら、ＩＬ－１５による生理的活性化には、標的細胞を活性化させる前にＩＬ－１５Ｒα鎖に結合する必要があり、これが遊離ＩＬ－１５の研究及び臨床的役割を制限している。Ｎ－８０３は、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（生物学的活性を増強するＮ７２Ｄ突然変異）に結合した２つのＩＬ－１５ＲαサブユニットにヒトＩｇＧ１ Ｆｃが融合しているものからなり、遊離ＩＬ－１５と比較してより高い生物学的活性及びより長い血清半減期をもたらす。先行研究では、ＮＫ細胞をＩＬ１２／１５／１８で予め活性化するとＭＬ ＮＫ細胞分化が起こることが実証されており、これは養子同種異系ＮＫ細胞療法を増強するのに有望な手法に相当する。しかしながら、これらの個別のサイトカインを研究及び臨床目的で単独又は組み合わせで使用すると、生産上の課題及びロットのばらつきに見舞われ得る。加えて、このスーパーカインは、活性化したＮＫ細胞が腫瘍細胞を死滅させるように仕向けるため、種々のＮＫ細胞活性化型サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－２１）又は腫瘍ターゲティング分子（例えば、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＣＤ３４）を取り換えるのに有望なプラットフォームを提示する。実際、Ｎ－８０３は、ＣＤ２０ターゲティング抗体成分と融合した機能性足場として使用されており、個別の成分単独よりも優れた抗腫瘍活性を実証している。他の研究では、Ｎ－８０３を腫瘍ターゲティング抗体又はチェックポイント阻害抗体のいずれかと組み合わせて使用したときに抗腫瘍活性の増強が実証されており、これは更なる融合タンパク質の開発に向けた有望な道筋に相当する。

本開示においては、３つの特徴的に異なるサイトカインをヒトＩｇＧ１Ｆｃ結合を介して融合すると、インビトロ及びインビボで、個別のサイトカインを組み合わせたのと等価な活性が誘導されたことが実証される。これらの研究では、注入前にインビトロで１８／１２／ＴｘＭを使用してＮＫ細胞を予め活性化したが、Ｆｃ骨格が更なる生体内半減期を付与し、これは他のコンテクストでのそのインビボ使用の裏付けとなる可能性がある。加えて、３つの特徴的に異なるサイトカイン標的に連結したＮ－８０３タンパク質足場の使用は、ＮＫ細胞を養子細胞療法用に拡大し、及び刺激する新規方法に相当する。

材料及び方法
組換えタンパク質：ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭタンパク質、ロット番号３０５－８６（１）及びＮ－８０３タンパク質、ロット番号０１０６２０１６は、Ａｌｔｏｒ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｍｉｒａｍａｒ、ＦＬで製造され、精製された。これらの研究では、エンドトキシン不含の組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－１２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＩＬ－１８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）及びＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用した。

フローサイトメトリー抗体：以下のＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ抗体を使用した：ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１、ＣＤ４５（クローンＡ９６４１６）、ＣＤ５６（クローンＮ９０１）、ＮＫＧ２Ａ（クローンＺ１９９．１）、ＮＫｐ４６（クローンＢＡＢ２８１）。以下のＢＤ抗体を使用した：ＣＤ１６（クローン３Ｇ８）、ＩＦＮ－γ（クローンＢ２７）、ＣＤ１０７ａ（クローンＨ４Ａ３）、ＣＤ５７（ＮＫ－１） ＣＤ６９（ＦＮ５０）、ＣＤ１３７（クローン４－１ＢＢ）、パーフォリン（クローンｄＧ９）、Ｋｉ６７（クローンＢ５６）、ＥＲＫ１／２（ｐＴ２０２、ｐＹ２０４）、ＡＫＴ（ｐＳ４７３）、ＳＴＡＴ４（３８／ｐ－Ｓｔａｔ４）、ＳＴＡＴ５（４７／Ｓｔａｔ５、ｐＹ６９４）、ｐ３８（ｐＴ２９０／ｐＹ１８２）、ｐ６５（ｐＳ５２９）。以下のＢｉｏｌｅｇｅｎｄ抗体を使用した：ＮＫＧ２Ｄ（クローン１Ｄ１１）、ＮＫｐ３０（クローンＰ３０－１５）。ＮＫｐ４４（クローンＰ４４－８）、ＩｇＧ１対照（クローンＭＧ１－４５）。以下のｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ抗体を使用した：グランザイムＢ（ＧＢ１２）、ＴＮＦ（クローンＭａｂ１１）。

細胞株：Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－２４３）は、２００８年にＡＴＣＣから入手し、生存したまま凍結保存し、これらの研究に使用するため解凍し、及び記載されるとおりの連続培養の時点で２ヵ月を超えないように維持した。本発明者らの研究に先立ち、Ｋ５６２細胞について、２０１４年及び２０１５年に、ＮＫ細胞感受性標的としての細胞成長形態（リンパ芽球）、成長特性、及び機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ）を確認することにより真正を証明した。細胞は、Ｌ－グルタミン、ＨＥＰＥＳ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／グルタミン１０％ＦＢＳ含有を補足したＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）で培養した。

Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのＨＥＫ－ＢｌｕｅＩＬ－１８細胞（インターロイキン－１８センサー細胞）及びＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞（インターロイキン－１２センサー細胞）は、ＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）；１×ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）；１００ｕｇ／ｍｌノルモシン（ｎｏｒｍａｃｉｎ）、及び１×ＨＥＫ－Ｂｌｕｅセレクション（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からなる完全ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ培地（Ｉ１０培地）で培養した。３２Ｄ－ＩＬ２／１５Ｒβ（３２Ｄβ）細胞はＡｌｔｏｒ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（Ｍｉｒａｍａｒ、ＦＬ）で構築され、ＩＭＤＭ－１０培地＋２５ｎｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ－２を含有する完全３２Ｄβ培地で培養し、３７℃及び５％ＣＯ_２で１．５×１０^４～２×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度に維持した。

ＮＫ細胞の精製及び細胞培養：ヒト血小板アフェレーシスドナーＰＢＭＣをフィコール遠心法により入手した。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、≧９５％ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－）を使用してＮＫ細胞を精製し、選択の実験に使用した。細胞を３～５×１０^６細胞／ｍＬで播き、３８．８ｎＭ １８／１２／ＴｘＭ（９．５ｕｇ／ｍＬ）、ｒｈＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ｒｈＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ｒｈＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ）又は対照条件（ｒｈＩＬ－１５、１ｎｇ／ｍＬ）で予め１６時間活性化させた。細胞を３回洗浄してサイトカインを除去し、ｒｈＩＬ－１５（１ｎｇ／ｍＬ）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＨＡＢ１０完全培地で、２～３日毎に培地の５０％を新鮮なｒｈＩＬ－１５と交換しながら６日間培養して生存を支持した。

ＩＬ－１８及びＩＬ１２活性の評価：ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１８及びＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞を完全ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ培地に３７℃及び５％ＣＯ_２で維持した。製造者の細胞取扱い上の推奨に従い、２代継代した後、この成長培地にＨＥＫ－Ｂｌｕｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎを加えた。成長培地は週２回新しくし、７０～８０％コンフルエンシーに達したとき細胞を継代した。ＩＬ－１８又はＩＬ１２の活性を測定するため、それぞれのセンサー細胞をＰＢＳ中に解離し、完全ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイ培地に２８０，０００細胞／ｍｌで再懸濁した。サイトカイン対照及びｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭの２０マイクロリットルの片対数段階希釈液（以下に記載する濃度範囲）を平底９６ウェルプレートに加え、続いて最終的な細胞数が２００ｕＬ中に約５０，０００細胞となるように１８０ｕＬの細胞を加えた。このプレートを３７℃及び５％ＣＯ_２で約２０時間インキュベートした。ＩＬ－１８又はＩＬ－１２の活性を評価するため、結果として得られた分泌型アルカリホスファターゼをＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ検出試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して定量化した。ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ試薬は製造者の指示に従い調製した。ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅを室温に温めた後、９６ウェル平底プレート内の２０ｕＬの培養上清に１８０ｕＬを加え、３７℃及び５％ＣＯ_２で１８時間インキュベートした。次に吸光度を６５０ｎｍで測定して、分泌型アルカリホスファターゼによるＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅの還元に基づき細胞活性化を決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７で非線形回帰可変傾き曲線当てはめを用いて作成した用量反応曲線から、１８／１２／ＴｘＭのＩＬ－１８又はＩＬ－１２生物活性のＥＣ_５０を決定した。

濃度範囲：ＩＬ－１８活性の検出のため、ＩＬ－１８について１０ｎｇ／ｍｌ（５５６ｐＭ）～０．０５ｐｇ／ｍｌ（０．００２８ｐＭ）及び１８／１２／ＴｘＭについて３３５０ｎｇ／ｍｌ（１３６７３ｐＭ）～０．０１６７ｎｇ／ｍｌ（０．０６８３ｐＭ）の範囲の片対数段階希釈を実施した。これは、ＩＬ－１８サイトカインについて５６ｐＭ～０．０００２８ｐＭ及び１８／１２／ＴｘＭについて１３６７ｐＭ～０．００６８３ｐＭの最終的なｐＭ濃度に対応する。ＩＬ－１２活性の検出のため、ＩＬ－１２について１０００ｎｇ／ｍｌ（１７４８３ｐＭ）～５ｐｇ／ｍｌ（０．０８７５ｐＭ）及び１８／１２／ＴｘＭについて８５．７ｕｇ／ｍｌ（３４９，７９６ｐＭ）～０．４２８ｎｇ／ｍｌ（１．７４８ｐＭ）の範囲の片対数段階希釈を実施した。これは、ＩＬ－１２サイトカインについて１７４８．３～０．００８７５ｐＭ及び１８／１２／ＴｘＭ分子について３４，９７９．６～０．１７４８ｐＭの最終的なｐＭ濃度に対応する。

ＩＬ－１５活性の評価：ＩＬ－１５活性を測定するため、アッセイプレートを以下のとおり調製した：９６ウェル平底プレートの各ウェルに１００ｕＬのＩＭＤＭ－１０培地を加えた。次に１００ｕＬの４倍濃度のＮ－８０３（２２５ｎｇ／ｍｌ；約２４００ｐＭ）又はＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（１８，０００ｎｇ／ｍｌ；約７３４６８ｐＭ）を１列目に加えた。各ウェルに１００ｕＬを残しながら薬物を１０列目まで２倍段階希釈した。細胞をＩＭＤＭ－１０培地で３回洗浄し、ＩＭＤＭ－１０培地に密度１×１０^５細胞／ｍｌで再懸濁し、及びアッセイプレートの１～１１列目に総アッセイ容積が２００ｕＬとなるように１００ｕＬの細胞を加えた。１２列目に１００ｕＬのＩＭＤＭ－１０を加えた。アッセイプレートを３７℃及び５％ＣＯ_２に約７２時間置いた。ＩＬ－１５の活性を評価するため、約７２時間後に２０ｕＬの１０×ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生死判別試薬をアッセイプレートに直接加えたとともに、プレートを３７℃及び５％ＣＯ_２に更に約４時間置く。正規化のため５７０ｎｍ及び６００ｎＭで吸光度を測定した。１１列目（薬物のない細胞）を陰性対照として使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７で非線形回帰可変傾き曲線当てはめを用いて作成した用量反応曲線から、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭのＩＬ－１５生物活性のＥＣ_５０を決定した。

リン酸化アッセイ：単離したばかりのヒトＮＫ細胞をサイトカイン不含のＨＡＢ１０培地で３７℃で３０分間インキュベートした。ウェルに個別のサイトカイン（ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、又はＩＬ－１８）を指示される濃度で様々な時間間隔にわたって（ＳＴＡＴ４については２時間刺激、Ａｋｔ及びＥＲＫについては１時間刺激、及びＮＦ－κＢ－Ｐ６５、ＳＴＡＴ５、及びＰ３８検出については１５分間刺激）加えた。インキュベーション後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、室温で１０分間インキュベートした。次に細胞をペレット化し、冷１００％メタノールに再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣｓ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭＥＤＴＡ）で３回洗浄した。洗浄後、細胞を表面抗体マスターミックス（ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ４５）並びに適切なホスホフロー抗体に懸濁し、４℃で一晩染色した。翌朝、細胞を２回洗浄し、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーターで試料を取得し、ＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．３．２（ＴｒｅｅＳｔａｒ）ソフトウェアを使用して分析した。

機能アッセイによるサイトカイン産生の評価：記憶様ＮＫ細胞分化を起こさせるための６日間の静置期間後に、対照及び記憶様ＮＫ細胞を回収した。次に標準的な機能アッセイで細胞を再刺激した。簡潔に言えば、細胞をＫ５６２白血病標的と共に、特に注記しない限り５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、ＣＤ１０７ａの存在下６時間インキュベートした。１時間刺激した後、ブレフェルジンＡ及びモネンシン（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ／ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ、ＢＤ）を加え、５時間後にＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ２５に関して細胞を染色した。細胞を固定し（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ、ＢＤ）、透過処理し（Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ、ＢＤ）し、その後細胞内ＩＦＮ－γ及びＴＮＦを染色した。Ｇａｌｌｉｏｓ ３フローサイトメーターで細胞を取得し、ＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．３．２（ＴｒｅｅＳｔａｒ）ソフトウェアを使用して分析した。

特異的死滅の評価：活性化後６日目又は７日目、対照又はＭＬ－ＮＫ細胞を１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５に再懸濁し、標準的な４時間５１クロム遊離アッセイにおいてＫ５６２標的により様々なＥ：Ｔ比でチャレンジした。５１Ｃｒ遊離は、Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉ－ｌｕｘシンチレーションカウンターで検出した。パーセント特異的溶解率を以下により計算した：［（ｃｐｍ_ｅｘｐ－ｃｐｍ_{ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ}）／ｃｐｍ_ｍａｘ－ｃｐｍ_{ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ}）］×１００。

フローサイトメトリー分析：先述のとおり細胞染色を実施し、Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）でデータを取得し、Ｋａｌｕｚａ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．２（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）又はＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．３．２（ＴｒｅｅＳｔａｒ）ソフトウェアを使用して分析した。統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０ソフトウェアを使用して行った。

ＲＮＡシーケンシング：１００万個の精製ＮＫ細胞を、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｃｒｏＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用したＲＮＡ単離時まで、Ｔｒｉｚｏｌ中に－８０℃で凍結した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００シーケンサーを使用して次世代ＲＮＡシーケンシングを実施した。ＲＮＡＳｅｑリードをＳＴＡＲバージョン２．０．４ｂのＥｎｓｅｍｂｌリリース７６トップレベルアセンブリにアラインメントした。Ｓｕｂｒｅａｄ：ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔバージョン１．４．５により、ユニークにアラインメントされた多義性のないリードの数から遺伝子カウントを導き出した。シーケンシングデータの分析は、ブラウザベースの遺伝子発現解析ソフトウェアであるＰｈａｎｔａｓｕｓを使用して実施した。ＬＩＭＭＡパッケージを使用して発現差異解析を実施することにより条件間の差について分析し、結果は、偽陽性率補正後のｐ値が０．０５以下である遺伝子のみをフィルタリングした。

マスサイトメトリー：マスサイトメトリーデータは全て、ＣｙＴＯＦ２マスサイトメーター（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で収集し、Ｃｙｔｏｂａｎｋを使用して分析した。マスサイトメトリーデータは既述の方法を用いて分析し、試料染色及びデータ収集は既述のとおり実施した。

ＮＳＧ異種移植モデル及びＢＬＩ画像化：０日目、Ｋ５６２ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞（１×１０６）を８～１２週齢の雄及び雌ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ＩＬ２Ｒγ^－／－（ＮＳＧ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に尾静脈から静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。全てのマウスについて、腫瘍注射の２日前に２．５ｃＧｙを照射した。３日目、ＢＬＩを実施して白血病細胞の生着を確認した。４日目、５×１０^６個の対照（１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５中のＮＫ細胞）又はＩＬ－１２／１５／１８（１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１２、５０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５、５０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１８）、若しくは１８／１２／ＴｘＭ（３８ｎＭ）で活性化したＮＫ細胞をマウスに後眼窩から投与した（２つの独立した実験からの各群合計９～１０匹のマウス）。マウスをｒｈＩＬ－２（各マウス５０，０００ＩＵ）で１日おきに（ｅｖｅｒｙ ｏｔｈｅｒ ｄａｔａ）治療し、腫瘍量（ＢＬＩ）を毎週モニタした。

インビボＢＬＩ画像化をＩＶＩＳ ５０（１～６０秒露光、ｂｉｎ８、ＦＯＶ１２ｃｍ、オープンフィルタ）（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）で実施した。このために、マウスにＤ－ルシフェリン（ＰＢＳ中１５０ｍｇ／ｋｇ、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を腹腔内注射し、イソフルラン（ｉｓｏｆｌｏｕｒａｎｅ）（Ｏ_２中２％気化）で麻酔下に置いて画像化した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ２．６ソフトウェアプログラムを使用してマウス全体にわたる目的の固定領域から総光子束（光子／秒）を測定した。

一部の実施形態において、本発明の特定の実施形態を記載し、及び特許請求するために使用される成分の分量、濃度などの特性、反応条件などを表す数は、一部の例では、用語「約」によって修飾されているものと理解されるべきである。それに応じて、一部の実施形態では、明細書の記載及び添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、詳細な実施形態によって達成しようとする所望の特性に応じてばらつきがあり得る近似値である。本明細書における値の範囲の記載は、単にその範囲に含まれる各別々の値に個別に言及する簡略な方法として役立てることを意図しているに過ぎない。本明細書に特に指示されない限り、各個別の値は、それが本明細書に個別に記載されたものとして本明細書に援用される。

本明細書で使用されるとき、医薬組成物又は薬物を「投与すること」という用語は、医薬組成物又は薬物の直接投与及び間接的な投与の両方を指し、ここで医薬組成物又は薬物の直接投与は、典型的には医療専門家（例えば、医師、看護師等）によって実施され、及びここで間接的な投与には、医薬組成物又は薬物を医療専門家が直接投与（例えば、注射、注入、経口送達、局所送達等による）できるように提供する又は利用可能にするステップが含まれる。更に、病態、疾患の発症に対する感受性、又は意図した治療に対する反応を「予後判定すること」又は「予測すること」という用語は、対象の病態の進行速度、好転、及び／又は持続期間を含め、その病態、感受性及び／又は反応を予測する行為又はその予測（但し、その治療又は診断ではない）を包含することが意味されることに留意しなければならない。

本明細書に記載される方法は全て、本明細書に特に指示されない限り、又は文脈上特に明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順番で実施することができる。本明細書の特定の実施形態に関連して提供されるありとあらゆる例、又は例示的文言（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図しているに過ぎず、本来特許請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる文言も、本発明の実施に不可欠な何らかの特許請求されない要素を指示していると解釈されてはならない。

本明細書の記載において、及び以下の特許請求の範囲全体を通じて使用されるとき、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」の意味には、文脈上特に明確に指示されない限り、複数形の指示対象が含まれる。また、本明細書の記載において使用されるとき、「～内に（ｉｎ）」の意味には、文脈上特に明確に指示されない限り、「～内に（ｉｎ）」及び「～上に（ｏｎ）」が含まれる。また、本明細書で使用されるとき、及び文脈上特に指示されない限り、用語「～にカップリングされた」には、直接的なカップリング（ここでは互いにカップリングされる２つの要素が互いに接触している）及び間接的なカップリング（ここでは２つの要素の間に少なくとも１つの追加の要素が位置している）の両方が含まれることが意図される。従って、用語「～にカップリングされた」及び「～とカップリングされた」は、同義語として使用される。

当業者には、既に記載したものに加えて、本明細書における発明概念から逸脱することなく更に多くの変形例が可能であることは明らかなはずである。従って、本発明の主題は添付の特許請求の範囲にある場合を除いては、限定されるべきでない。その上、本明細書及び特許請求の範囲の両方を解釈するにおいて、用語は全て、文脈と整合的な、可能な限りで最も広義となる方法で解釈されなければならない。詳細には、用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「～を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非排他的な方法で要素、構成成分、又はステップに言及していると解釈されなければならず、これはつまり、言及されている要素、構成成分、又はステップが、明示的に言及されていない他の要素、構成成分、又はステップと共に存在してもよく、又は利用されてもよく、又は組み合わされてもよいことを指し示している。本明細書又は特許請求の範囲がＡ、Ｂ、Ｃ．．．．及びＮからなる群から選択される何かのうちの少なくとも１つに言及する場合、その文は、その群からの１つの要素のみを必要としていて、Ａ＋Ｎ、又はＢ＋Ｎ等ではないと解釈されなければならない。

当業者には、既に記載したものに加えて、本明細書における発明概念から逸脱することなく更に多くの変形例が可能であることは明らかなはずである。従って、本発明の主題は添付の特許請求の範囲にある場合を除いては、限定されるべきでない。その上、本明細書及び特許請求の範囲の両方を解釈するにおいて、用語は全て、文脈と整合的な、可能な限りで最も広義となる方法で解釈されなければならない。詳細には、用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「～を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非排他的な方法で要素、構成成分、又はステップに言及していると解釈されなければならず、これはつまり、言及されている要素、構成成分、又はステップが、明示的に言及されていない他の要素、構成成分、又はステップと共に存在してもよく、又は利用されてもよく、又は組み合わされてもよいことを指し示している。本明細書又は特許請求の範囲がＡ、Ｂ、Ｃ．．．．及びＮからなる群から選択される何かのうちの少なくとも１つに言及する場合、その文は、その群からの１つの要素のみを必要としていて、Ａ＋Ｎ、又はＢ＋Ｎ等ではないと解釈されなければならない。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［１］記憶様サイトカイン増強ナチュラルキラー（Ｍ－ＣＥＮＫ）細胞を生成する方法であって、
複数の単核球を入手すること、及び前記複数の単核球をコルチコステロイド及び任意選択でサイトカイン又はサイトカイン類似体と接触させること；
前記複数の単核球を前記コルチコステロイド及び前記任意選択のサイトカイン又はサイトカイン類似体の存在下でインキュベートすることであって、それによりＮＫ細胞中の前記単核球を濃縮すること；及び
前記濃縮されたＮＫ細胞をＴｘＭ融合タンパク質で誘導して前記Ｍ－ＣＥＮＫ細胞を生成すること
を含み、
前記ＴｘＭ融合タンパク質が、ＩＬ－１２活性を有するタンパク質部分、ＩＬ－１５活性を有するタンパク質部分、及びＩＬ－１８活性を有するタンパク質部分を含む、方法。
［２］前記複数の単核球が、前記インキュベートするステップの前に凍結保存される、［１］に記載の方法。
［３］前記凍結保存された単核球が、前記コルチコステロイド及び前記任意選択のサイトカインを含有する培地中で解凍され、洗浄され、及び再懸濁される、［２］に記載の方法。
［４］前記インキュベートするステップが１４～２１日の間にわたって実施される、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記インキュベートするステップが、前記ＮＫ細胞が全生細胞の少なくとも６５％に濃縮されるまで実施される、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記濃縮されたＮＫ細胞が１～２５μｇ／ｍＬのＴｘＭ濃度で誘導される、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記濃縮されたＮＫ細胞が、１２～１６時間の間にわたって誘導される、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記コルチコステロイドがヒドロコルチゾンであり、及び前記任意選択のサイトカインがＮ－８０３である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記インキュベートするステップに前記任意選択のサイトカインが含まれる、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記Ｍ－ＣＥＮＫ細胞を回収し、前記回収したＭ－ＣＥＮＫ細胞を注入用に製剤化するステップを更に含む、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記回収したＭ－ＣＥＮＫ細胞が注入前に凍結保存される、［１０］に記載の方法。
［１２］記憶様サイトカイン増強ナチュラルキラー（Ｍ－ＣＥＮＫ）細胞を作製する方法であって、
複数の単核球由来のサイトカイン増強ＮＫ細胞（ＣＥＮＫ）を入手すること；及び
前記濃縮されたＮＫ細胞を、前記Ｍ－ＣＥＮＫ細胞が生成されるようにＴｘＭ融合タンパク質で誘導すること
を含み、
前記ＴｘＭ融合タンパク質が、ＩＬ－１２活性を有するタンパク質部分、ＩＬ－１５活性を有するタンパク質部分、及びＩＬ－１８活性を有するタンパク質部分を含む、方法。
［１３］［１］～［１２］のいずれかに記載の方法によって作製される記憶様サイトカイン増強ナチュラルキラー（Ｍ－ＣＥＮＫ）細胞。
［１４］［１２］に記載のＭ－ＣＥＮＫ細胞と組み合わせて薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
［１５］前記薬学的に許容可能な担体が凍結保存培地を含む、［１４］に記載の組成物。
［１６］前記薬学的に許容可能な担体が注入用に製剤化される、［１４］又は［１５］に記載の組成物。
［１７］０．５～１．５×１０ ^７ 細胞／ｍＬの細胞密度を有する［１４］～［１６］のいずれかに記載の組成物。
［１８］凍結保存組成物である、［１４］～［１７］のいずれかに記載の組成物。
［１９］癌を有する個体を治療する方法であって、［１４］～［１７］のいずれかに記載の組成物を輸注によって投与するステップを含む方法。
［２０］［１４］～［１７］のいずれかに記載の組成物が、癌幹細胞及び間葉細胞を死滅させることによって前記個体の癌を治療する、［１９］に記載の方法。
［２１］癌の治療における使用のための［１４］～［１７］のいずれかに記載の組成物。
［２２］［１４］～［１７］のいずれかに記載の組成物が、癌幹細胞及び間葉細胞を死滅させることによって個体の癌を治療する、［２１］に記載の方法。

Claims (22)

1. 記憶様サイトカイン増強ナチュラルキラー（Ｍ－ＣＥＮＫ）細胞を生成する方法であって、
   複数の単核球を入手すること、及び前記複数の単核球をコルチコステロイド及び任意選択でサイトカイン又はサイトカイン類似体と接触させること；
   前記複数の単核球を前記コルチコステロイド及び前記任意選択のサイトカイン又はサイトカイン類似体の存在下でインキュベートすることであって、それによりＮＫ細胞中の前記単核球を濃縮すること；及び
   前記濃縮されたＮＫ細胞をＴｘＭ融合タンパク質で誘導して前記Ｍ－ＣＥＮＫ細胞を生成すること
   を含み、
   前記ＴｘＭ融合タンパク質が、ＩＬ－１２活性を有するタンパク質部分、ＩＬ－１５活性を有するタンパク質部分、及びＩＬ－１８活性を有するタンパク質部分を含む、方法。
2. 前記複数の単核球が、前記インキュベートするステップの前に凍結保存される、請求項１に記載の方法。
3. 前記凍結保存された単核球が、前記コルチコステロイド及び前記任意選択のサイトカインを含有する培地中で解凍され、洗浄され、及び再懸濁される、請求項２に記載の方法。
4. 前記インキュベートするステップが１４～２１日の間にわたって実施される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記インキュベートするステップが、前記ＮＫ細胞が全生細胞の少なくとも６５％に濃縮されるまで実施される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記濃縮されたＮＫ細胞が１～２５μｇ／ｍＬのＴｘＭ濃度で誘導される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記濃縮されたＮＫ細胞が、１２～１６時間の間にわたって誘導される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記コルチコステロイドがヒドロコルチゾンであり、及び前記任意選択のサイトカインがＮ－８０３である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記インキュベートするステップに前記任意選択のサイトカインが含まれる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記Ｍ－ＣＥＮＫ細胞を回収し、前記回収したＭ－ＣＥＮＫ細胞を注入用に製剤化するステップを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記回収したＭ－ＣＥＮＫ細胞が注入前に凍結保存される、請求項１０に記載の方法。
12. 記憶様サイトカイン増強ナチュラルキラー（Ｍ－ＣＥＮＫ）細胞を作製する方法であって、
    複数の単核球由来のサイトカイン増強ＮＫ細胞（ＣＥＮＫ）を入手すること；及び
    前記濃縮されたＮＫ細胞を、前記Ｍ－ＣＥＮＫ細胞が生成されるようにＴｘＭ融合タンパク質で誘導すること
    を含み、
    前記ＴｘＭ融合タンパク質が、ＩＬ－１２活性を有するタンパク質部分、ＩＬ－１５活性を有するタンパク質部分、及びＩＬ－１８活性を有するタンパク質部分を含む、方法。
13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法によって作製される記憶様サイトカイン増強ナチュラルキラー（Ｍ－ＣＥＮＫ）細胞。
14. 請求項１２に記載のＭ－ＣＥＮＫ細胞と組み合わせて薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
15. 前記薬学的に許容可能な担体が凍結保存培地を含む、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記薬学的に許容可能な担体が注入用に製剤化される、請求項１４又は１５に記載の組成物。
17. ０．５～１．５×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度を有する請求項１４～１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. 凍結保存組成物である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の組成物。
19. 癌を有する個体を治療する方法であって、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の組成物を輸注によって投与するステップを含む方法。
20. 請求項１４～１７のいずれか一項に記載の組成物が、癌幹細胞及び間葉細胞を死滅させることによって前記個体の癌を治療する、請求項１９に記載の方法。
21. 癌の治療における使用のための請求項１４～１７のいずれか一項に記載の組成物。
22. 請求項１４～１７のいずれか一項に記載の組成物が、癌幹細胞及び間葉細胞を死滅させることによって個体の癌を治療する、請求項２１に記載の方法。

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