TW201839129A - 產生腫瘤浸潤淋巴球的方法及其在免疫治療中的應用 - Google Patents

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Abstract

本發明提供經改善和/或經時程縮短之用於擴增TIL和製造治療性TIL族群之方法，包括用於在封閉系統中擴增TIL族群之新穎方法，其在較短時程中產生療效改善、性狀改善、和TIL之代謝健康增加，同時考量降低微生物污染與降低成本。此等TIL能用於治療性治療給藥方案。

Description

產生腫瘤浸潤淋巴球的方法及其在免疫治療中的應用 相關申請案的交互參照
本申請案主張下列之優先權：美國臨時專利申請案第62/478,506號，2017年3月29日申請；美國臨時專利申請案第62/539,410號，2017年7月31日申請；美國臨時專利申請案第62/548,306號，2017年8月21日申請；美國臨時專利申請案第62/554,538號，2017年9月5日申請；美國臨時專利申請案第62/559,374號，2017年9月15日申請；美國臨時專利申請案第62/567,121號，2017年10月2日申請；美國臨時專利申請案第62/577,655號，2017年10月26日申請；美國臨時專利申請案第62/582,874號，2017年11月7日申請；及美國臨時專利申請案第62/596,374號，2017年12月8日申請；彼等係在此以引用方式將他們全部併入。
本案是關於產生腫瘤浸潤淋巴細胞的方法及其在免疫療法中的應用。
使用過繼性轉移腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)治療巨瘤、頑抗性癌提供針對預後不良患者之治療的有力方法。Gattinoni,et al.,Nat.Rev.Immunol. 2006, 6,383-393。大量TIL係成功的免疫療法所需的，且強效和可靠程序係商業化所需。此因為細胞擴增之技術、物流、及法規問題已成為達成之挑戰。基於IL-2之TIL擴增接著“快速擴增程序(rapid expansion process)”(REP)因為其速度及效率，已成為TIL擴增之較佳方法。Dudley,et al.,Science 2002, 298,850-54；Dudley,et al.,J.Clin.Oncol. 2005, 23,2346-57；Dudley,et al.,J.Clin.Oncol. 2008,26,5233-39；Riddell,et al.,Science 1992, 257,238-41；Dudley,et al.,J.Immunother. 2003,26,332-42。REP可以導致在14天時間TIL擴增1000倍，惟需要大量過量(例如200倍)輻照過的同種異體周邊血液單核細胞(PBMC，也稱為單核細胞(MNC))(通常來自多個供體)作為餵養細胞，以及抗CD3抗體(OKT3)和高劑量的IL-2。Dudley,et al.,J.Immunother. 2003, 26,332-42。經過REP程序的TIL已經在黑色素瘤患者於宿主免疫抑制後產生了成功的過繼性細胞治療。當前輸注接受參數依賴於TIL組成(例如CD28、CD8或CD4陽性)的讀數以及REP產物的倍數擴增和存活性。
當前的TIL製造程序受到長度、成本、無菌性問題以及本文中所述之其他因素的限制，使得這些程序 商業化的可能性受到嚴重限制，並且由於這些和其他原因，目前還沒有商業程序可用。迫切需要提供TIL製造程序和基於這些程序的療法，這些程序適用於在多個臨床中心用於人患者的商業規模生產和監管批准。
本發明提供經改善和/或經時程縮短之用於擴增TIL和製造治療性TIL族群之方法。
本發明提供一種用於將腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)擴增(expanding)為TIL治療族群之方法，其包含：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自該患者所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第 二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生。
在一些實施態樣中，該方法其進一步包含使用冷凍保存程序冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含在步驟(f)中該經收獲之TIL族群。
在一些實施態樣中，該冷凍保存製程序使用1：1比例的經收穫之TIL族群對冷凍保存介質來進行。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。在一些實施態樣中，該等PBMC係經照射且係同種異體(allogeneic)。在一些實施態樣中，該等PBMC係在步驟(d)中於第9至14日中任一日加至該細胞培養。在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在一些實施態樣中，步驟(e)中之該收獲係使 用以膜為基礎之細胞處理系統來進行。
在一些實施態樣中，步驟(e)中之該收獲係使用LOVO細胞處理系統來進行。
在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約4個至約50個碎片，其中各碎片具有約27mm3之體積。
在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約30個至約60個碎片，具有約1300mm3至約1500mm3之總體積。
在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1350mm3之總體積。
在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1克至約1.5克之總質量。
在一些實施態樣中，該細胞培養基係經提供於選自由G-container及Xuri cellbag所組成之群組之容器中。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中之該細胞培養基進一步包含IL-15和/或IL-21。
在一些實施態樣中，該IL-2的濃度約10,000IU/mL至約5,000IU/mL。
在一些實施態樣中，該IL-15的濃度約500IU/mL至約100IU/mL。
在一些實施態樣中，該IL-21的濃度約20IU/mL至約0.5IU/mL。
在一些實施態樣中，在步驟(f)中之該輸注袋 係含有HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施態樣中，該冷凍保存介質包含二甲亞碸(DMSO)。在一些實施態樣中，該冷凍保存介質包含7%至10%的二甲亞碸(DMSO)。
在一些實施態樣中，在步驟(c)中之該第一時期和在步驟(e)中之該第二時期係各分別於10日、11日、或12日的時期內來進行。
在一些實施態樣中，在步驟(c)中之該第一時期和在步驟(e)中之該第二時期係各分別於11日的時期內來進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)係於約10日至約22日的時期內來進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)係於約20日至約22日的時期內來進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)係於約15日至約20日的時期內來進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)係於約10日至約20日的時期內來進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)係於約10日至約15日的時期內來進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)係進行22日或更少。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)係進行20日或更少。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)係進行15日或更少。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)係進行10日或更少。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)和冷凍保存係進行22日或更少。
在一些實施態樣中，在步驟(e)中所收獲之該治療性TIL族群包含足夠的TIL以供治療有效劑量之TIL。
在一些實施態樣中，足夠供治療有效劑量之TIL數量係約2.3×1010至約13.7×1010。
在一些實施態樣中，步驟(b)至(e)係在單一容器中來進行，其中，相較於在多於一個容器中進行步驟(b)至(e)，在單一容器中進行步驟(b)至(e)導致每經切除之腫瘤的TIL產量之增加。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係在步驟(d)中的該第二時期之期間加至該等TIL而未開放該系統。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中之該第三TIL族群當經投予個體時，提供療效的增加、干擾素-γ製造的增加、多株性(polyclonality)的增加、平均IP-10的增加、和/或平均MCP-1的增加。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中之該第三TIL族群當經投予個體時，提供至少五倍或更高的干擾素-γ製造。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中之該第三TIL族群係治療性TIL族群，其相對於該第二TIL族群，包含增加的效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞(central memory T cell)次族群，其中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，在該治療性TIL族群中之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現一或多種選自下列所組成之群組之特性：表現CD27+、表現CD28+、較長的端粒、CD57表現增加、及CD56表現下降。
在一些實施態樣中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，獲自該第三TIL族群之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現CD57表現增加和CD56表現下降。
在一些實施態樣中，微生物污染之風險相較於開放系統係減少的。
在一些實施態樣中，來自步驟(g)之該等TIL係經輸注至患者。
在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約4個碎片。
本發明亦提供一種用於治療具有癌之個體之方法，該方法包含投予經擴增之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，其包含：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自個體所切除之腫瘤之 第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生； (g)使用冷凍保存程序隨意地冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含來自步驟(f)之該經收獲之TIL族群；以及(h)將自步驟(g)中該輸注袋的治療有效劑量之該第三TIL族群投予該患者。
在一些實施態樣中，在步驟(e)中所收獲之該治療性TIL族群包含足夠的TIL以供在步驟(h)中投予治療有效劑量之該等TIL。
在一些實施態樣中，足夠供在步驟(h)中投予治療有效劑量之TIL數量係約2.3×1010至約13.7×1010。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞(APC)係PBMC。
在一些實施態樣中，該等PBMC係在步驟(d)中於第9至14日中任一日加至該細胞培養。
在一些實施態樣中，其中，在步驟(h)中投予治療有效劑量TIL細胞之前，業經投予非骨髓淨除式淋巴球大量降低方案(non-myeloablative lymphodepletion regimen)於該患者。
在一些實施態樣中，該非骨髓淨除式淋巴球大量降低方案包含將劑量60mg/m2/日的環磷醯胺(cyclophosphamide)投予二日接著將劑量25mg/m2/日的氟達拉濱(fludarabine)投予五日之步驟。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含在步驟(h)中從將該等TIL細胞投予該患者後之日起以高劑量IL- 2給藥方案治療該患者之步驟。
在一些實施態樣中，該高劑量IL-2給藥方案包含每八小時以15分鐘靜脈輸注速注(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000IU/kg，直到耐受。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中之該第三TIL族群係治療性TIL族群，其相對於該第二TIL族群，包含增加的效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞(central memory T cell)次族群，其中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，在該治療性TIL族群中之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現一或多種選自下列所組成之群組之特性：表現CD27+、表現CD28+、較長的端粒、CD57表現增加、及CD56表現下降。
在一些實施態樣中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，在該治療性TIL族群中之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現CD57表現增加和CD56表現下降。
在一些實施態樣中，該癌係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突狀瘤病毒所造成之癌、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌、及腎細胞癌(renal cell carcinoma)。
在一些實施態樣中，該癌係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、及NSCLC所組成之群組。
在一些實施態樣中，該癌係黑色素瘤。
在一些實施態樣中，該癌係HNSCC。
在一些實施態樣中，該癌係子宮頸癌。
在一些實施態樣中，該癌係NSCLC。
本發明亦提供用於將腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)擴增(expanding)為TIL治療族群之方法，其包含：(a)將來自患者所切除之腫瘤之經處理之腫瘤碎片加入封閉系統中，以獲得第一TIL族群；(b)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(a)至步驟(b)之過渡係在未開放該系統下而發生；(c)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生； (d)收獲獲自步驟(c)之該治療性TIL族群，其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(e)將自步驟(d)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(d)至(e)之轉移係在未開放該系統下而發生。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中所收獲之該治療性TIL族群包含足夠的TIL以供治療有效劑量之該等TIL。
在一些實施態樣中，足夠供治療有效劑量之TIL數量係約2.3×1010至約13.7×1010。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含使用冷凍保存程序冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含該經收獲之TIL族群。
在一些實施態樣中，該冷凍保存製程序使用1：1比例的經收穫之TIL族群對冷凍保存介質來進行。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施態樣中，該等PBMC係經照射且係同種異體(allogeneic)。
如請求項68之方法，其中該等PBMC係在步驟(c)中於第9至14日中任一日加至該細胞培養。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中之該收獲係使用LOVO細胞處理系統來進行。
在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約4個至約50個碎片，其中各碎片具有約27mm3之體積。
在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約30個至約60個碎片，具有約1300mm3至約1500mm3之總體積。
在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1350mm3之總體積。
在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1克至約1.5克之總質量。
在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約4個碎片。
在一些實施態樣中，該第二細胞培養基係經提供於選自由G-container及Xuri cellbag所組成之群組之容器中。
在一些實施態樣中，在步驟(e)中之該輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施態樣中，在步驟(b)中之該第一時期和在步驟(c)中之該第二時期係各分別於10日、11日、或12日的時期內來進行。
在一些實施態樣中，在步驟(b)中之該第一時期和在步驟(c)中之該第二時期係各分別於11日的時期內來進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)係於約10日至約22日的時期內來進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)係於約10日至約20日的時期內來進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)係於約10日至約15日的時期內來進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)係進行22日或更少。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)和冷凍保存係進行22日或更少。
在一些實施態樣中，步驟(b)至(e)係在單一容器中來進行，其中，相較於在多於一個容器中進行步驟(b)至(e)，在單一容器中進行步驟(b)至(e)導致每經切除之腫瘤的TIL產量之增加。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係在步驟(c)中的該第二時期之期間加至該等TIL而未開放該系統。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中之該第三TIL族群係治療性TIL族群，其相對於該第二TIL族群，包含增加的效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞(central memory T cell)次族群，其中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，在該治療性TIL族群中所獲得之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現一或多種選自下列所組成之群組之特性：表現CD27+、表現 CD28+、較長的端粒、CD57表現增加、及CD56表現下降。
在一些實施態樣中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，在該治療性TIL族群中之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現CD57表現增加和CD56表現下降。
在一些實施態樣中，微生物污染之風險相較於開放系統係減少的。
在一些實施態樣中，來自步驟(e)之該等TIL係經輸注至患者。
在一些實施態樣中，該密閉容器包含單一生物反應器。
在一些實施態樣中，該密閉容器包含G-REX-10。
在一些實施態樣中，該密閉容器包含G-REX-100。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中，該等抗原呈現細胞(APC)係以APC：TIL比例為25：1至100：1下加至該第二TIL族群之該細胞培養中。
在一些實施態樣中，該細胞培養具有2.5×109 APC對100×106 TIL之比率。
在一些實施態樣中，在步驟(c)中，該等抗原呈現細胞(APC)係以APC：TIL比例為25：1至100：1下加至該第二TIL族群之該細胞培養中。
在一些實施態樣中，該細胞培養具有2.5×109 APC對100×106 TIL之比率。
本發明亦提供一種經擴增之TIL族群，其係用於治療具有癌之個體，其中經擴增之TIL族群係第三TIL族群，其可藉由包含下列之方法獲得：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自個體所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在 未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生；以及(g)使用冷凍保存程序隨意地冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含來自步驟(f)之該經收獲之TIL族群。
在一些實施態樣中，該TIL族群係用於根據如上述及本文中之方法來治療具有癌之個體，其中該方法進一步包含一或多個如上述及本文中所記載之特徵。
序列表簡單說明
SEQ ID NO：1係莫羅單抗(muromonab)重鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：2係莫羅單抗(muromonab)輕鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：3係重組人IL-2蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：4係阿地白介素(aldesleukin)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：5係重組人IL-4蛋白之胺基酸序 列。
SEQ ID NO：6係重組人IL-7蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：7係重組人IL-15蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：8係重組人IL-21蛋白之胺基酸序列。
圖1：顯示程序2A實施態樣之圖，係用於TIL製造的22天程序。
圖2：顯示用於TIL製造的1C程序與2A程序實施態樣之間的比較。
圖3：顯示1C程序時間線。
圖4：顯示使用程序2A進行TIL製造的TIL治療的實施態樣的過程，包括用於較高細胞計數的投予和共同治療步驟。
圖5：顯示使用程序2A進行TIL製造的TIL治療的實施態樣的過程，包括用於較低細胞計數的投予和共同治療步驟。
圖6：顯示用於2A程序實施態樣之詳細示意圖。
圖7：藉由比較新鮮TIL與經解凍之TIL之間的干擾素-γ(IFN-γ)表現，顯示使用2A程序實施態樣所製備 的TIL的表徵。
圖8：藉由檢驗新鮮TIL與經解凍之TIL的CD3表現，顯示使用2A程序實施態樣所製備的TIL的表徵。
圖9：藉由檢驗新鮮TIL與經解凍之TIL的回復，顯示使用2A程序實施態樣所製備的TIL的特徵分析。
圖10：藉由檢驗新鮮TIL與經解凍之TIL的存活性，顯示使用2A程序實施態樣所製備的TIL的表徵。
圖11：描繪程序2A實施態樣之主要步驟，包括冷凍保存步驟。
圖12：描繪自1C程序及2A程序實施態樣所獲得之細胞計數。
圖13：描繪自1C程序及2A程序實施態樣所獲得之細胞存活性百分比。
圖14：描繪藉由流動式細胞測量術測量1C程序及2A程序實施態樣所獲得之TIL的CD45及CD3細胞(即T細胞)百分率。
圖15：描繪了1C程序及2A程序實施態樣所獲得的IFN-γ釋放，其藉由不同於用於生成圖80和98中數據者所測定。
圖16：描繪了1C程序及2A程序實施態樣所獲得的IFN-γ釋放，其藉由不同於用於生成圖80和98中數據者所測定。
圖17：描繪自1C程序及2A程序之實施態樣 所獲得之TCR a/b及NK細胞之百分率。
圖18：描繪藉由流動式細胞測量術測量1C程序及2A程序實施態樣所獲得之TIL的CD8+及CD4+細胞百分率，和各次群組之間的比率。
圖19：描繪藉由流動式細胞測量術測量1C程序及2A程序實施態樣所獲得之TIL的記憶型次群組百分率。
圖20：描繪藉由流動式細胞測量術測量1C程序及2A程序實施態樣所獲得之TIL的PD-1、LAG-3及TIM-3表現之百分率。
圖21：描繪藉由流動式細胞測量術測量1C程序及2A程序實施態樣所獲得之TIL的4-1BB、CD69及KLRG1表現之百分率。
圖22：描繪藉由流動式細胞測量術測量1C程序及2A程序實施態樣所獲得之TIL的TIGIT表現之百分率。
圖23：描繪藉由流動式細胞測量術測量1C程序及2A程序實施態樣所獲得之TIL的CD27及CD28表現之百分率。
圖24：描繪流式-FISH端粒長度分析結果。
圖25：描繪流式-FISH端粒長度分析結果(移除離群值數據點後)。
圖26：描繪包括以程序1C及程序2A之實施態樣所處理之定群之臨床試驗設計。
圖27：例示性程序2A圖表提供步驟A至F的概觀。
圖28：程序2A之處理流程圖。
圖29：程序2A數據收集計畫之處理流程圖。
圖30：新鮮對經解凍之TIL之存活性
圖31：於Re-REP培養物中擴增新鮮及經解凍之TIL
圖32：正常實驗室血液代謝物數值。
圖33：程序2A的REP前(pre-REP)TIL之代謝物分析。
圖34：定量程序2A的REP前TIL細胞培養中的IL-2。
圖35：於抗CD3、抗CD28及抗4-1BB刺激TIL下細胞毒性細胞介素IFN-γ之釋放。
圖36：於抗CD3、抗CD28及抗4-1BB刺激TIL後的顆粒酶B之釋放。
圖37：TCR αβ+TIL。大多數人CD3+T細胞表現由α和β鏈所形成的受體，其以MHC限制性方式辨識抗原。A)除了在M1061中，新鮮和經解凍的TIL產物具有80%或更多的表現TCR αβ+之TIL。新鮮和解凍的TIL兩者都具有相當的TCR αβ表現(p值-0.9582)。儘管觀察到Re-REP後表現TCR αβ+之TIL的減少，但是在Re-REP TIL內該減少不顯著(p=0.24)。B)分別與新鮮和解凍TIL相比，新鮮和解凍的表現TCR αβ的RE-REP TIL分別降低9.2%和 15.7%。
圖38：TCRαβ-CD56+。腫瘤浸潤自然殺手(NK)和NKT細胞也具有溶裂缺乏MHC表現的細胞以及CD1呈現的脂質抗原的能力，並提供免疫調節細胞介素。然而，強烈的NK細胞浸潤與晚期疾病相關並且會促進癌症發展。圖A顯示，在所有情況下，除M1063外，與新鮮TIL相比，經解凍之TIL中NK族群有中度、但不顯著的減少(p=0.27)。在re-REP TIL族群之間沒有觀察到顯著差異(p=0.88)。新鮮TIL、新鮮re-REP TIL和經解凍的re-REP TIL證實出CD56的相似表現，如圖B所示。經解凍的TIL產物具有比新鮮TIL(3.0±2.2)更少的(1.9±1.3)NK表現細胞，這可能是低溫冷凍程序的結果。
圖39：CD4+細胞。在個別條件下沒有觀察到CD4族群的實質性差異。圖A代表每種條件下的平均CD4族群。圖B中的表顯示了SD和SEM值。新鮮re-REP族群中的CD4族群略有減少，這主要是由於EP11001T中新鮮re-REP族群中CD4減少引起的。
圖40：CD8+細胞。總之，除EP11001T外，新鮮和經解凍的TIL均顯示出相當的CD8+族群(p=0.10，無顯著差異)。在大多數實驗中，新鮮的re-REP TIL產物中表現CD8+的TIL略有下降(例外是M1061T和M1065T)。經解凍的re-REP TIL中的CD8+族群減少了大約10-30%。來自新鮮和經解凍TIL的re-REP TIL的比較顯示出顯著差異(p=0.03，Student氏t檢定)。圖B顯示了在所有條件下表現 CD8+的TIL的平均值。新鮮及經解凍TIL兩者均顯示類似結果。然而，與新鮮的re-REP TIL相比，經解凍的re-REP TIL產物中的CD8+族群減少了10.8%。
圖41：CD4+CD154+細胞。CD154，亦稱為CD40L，係經活化之T細胞之標記。圖A：在不同條件下，未觀察到CD4+CD154+族群的實質差異，然而，在EP11001T新鮮re-REP CD4+TIL中觀察到減少34.1%。在M1061T和M1062T中未檢測到CD154表現，因為這些實驗是在經擴增之表型檢測項目就位之前進行的。圖B：經解凍之TIL條件的略為下降可歸因於未在M1061T和M1062T中測量的CD154。在CD4族群中所有條件顯示極為相當的CD154表現，表明經活化的CD4+T細胞。
圖42A至42B：CD8+CD154+細胞。亦分析了在CD8+TIL上表現的活化標記CD154。A)總體而言，在新鮮和經解凍的TIL產物中的CD8+族群中的CD154表現較低。這並不令人驚訝，因為CD154主要在經活化的CD4+T細胞中表現。在新鮮和經解凍的TIL產物中測量CD154表現的情況下，在經解凍的TIL產物中觀察到CD154表現沒有差異或增加。Student氏t檢定顯示這二種條件之間沒有顯著差異。所有實驗都顯示了與新鮮re-REP相比，經解凍的re-REP中CD154表現的增加(p=0.02)。與對應物相比，在經解凍的TIL和經解凍的re-REP TIL產物中均觀察到CD154表現的增加。與新鮮的re-REP TIL相比，經解凍的re-REP TIL顯示CD154表現增加29.1%。
圖43A-43B：CD4+CD69+細胞。CD69是刺激或活化後T細胞中的早期活化標記。A)在除EP11001T之外的所有TIL中，新鮮和經解凍的re-REP均表現出CD69表現的中度增加，這可能是由於重新REP長度(7天而不是11天)。在新鮮和經解凍的TIL之間沒有觀察到差異(p=0.89)。新鮮和經解凍的re-REP之間的差異也沒有觀察到(p=0.82)。B)在re-REP TIL產物中觀察到CD69表現的輕微增加。(註：對M1061T和M1062T經解凍的TIL產物均未進行CD69染色。M1061T新鮮TIL產物的CD69表現為33.9%)。
圖44A-44B：CD8+CD69+細胞。如對於CD4+族群所觀察到的，圖A顯示了CD8+re-REP TIL中CD69表現的增加。CD69表現在新鮮和經解凍的TIL(p=0.68)或新鮮和經解凍的re-REP TIL(p=0.76)之間沒有顯著差異。圖B支持觀察到re-REP TIL產物中CD69表現有中度增加。
圖45A-45B：CD4+CD137+細胞。CD137(4-11313)是TCR活化時所誘導的T細胞共刺激受體。它在CD4+和CD8+T細胞上係經活化的。A)CD137表現顯示刺激7天後re-REP TIL族群顯著增加。然而，新鮮和經解凍的TIL或新鮮和經解凍的re-REP TIL之間沒有觀察到差異(在兩種情況下，p<0.05，圖B支持該觀察)。此外，經解凍的TIL顯示CD137表現中度降低。re-REP TIL中CD137表現的增加可歸因於7天re-REP的第二輪刺激。
圖46A-46B：CD8+CD137+細胞。A)CD8+族群顯示re-REP產物總體增加。B)與新鮮TIL產物相比，新鮮re-REP產物的CD8+CD137+表現增加33.4%。與經解凍的TIL相比，經解凍的re-REP產物亦顯示CD8+族群中CD137表現增加33.15%。新鮮和經解凍的re-REP TIL之間沒有觀察到顯著差異。比較新鮮的TIL和經解凍的TIL產物可以看到類似的觀察結果。CD137表現的這種增加可能是由於re-REP的第二輪活化。(注意，僅有6個TIL用於分析，因為3個實驗未測量CD137表現。)
圖47A-47B：CD4+CM細胞。中樞型記憶(CM)族群由CD45RA-(陰性)和CCR7+(陽性)表現定義。A)觀察到re-REP條件下CM族群的增加。與新鮮TIL產物相比，M1063T和M1064T顯示從經解凍TIL獲得的CD4+族群中CM表現降低。新鮮和經解凍的TIL產物(p=0.1658)以及新鮮的re-REP和經解凍re-REP TIL(p=0.5535)均顯示CM族群的顯著差異。B)分別與新鮮和經解凍的TIL相比，在新鮮和經解凍的re-REP TIL中觀察到CM族群增加14.4%和15.4%。
圖48A-48B：CD8+CM細胞。A)在CD8+族群中，看到新鮮TIL產物中CM表現的顯著增加，這觀察未存在於TIL產物中。這種增加不影響顯著性(p=0.3086)，表明新鮮和經解凍的TIL之間沒有差異。在REP-TIL產物中也出現了類似的趨勢。圖48B)與經解凍的TIL相比，觀察到新鮮TIL中CM族群的總體增加。數據顯示新鮮TIL和re- REP TIL只有~2%的差異；新鮮的TIL顯示出非常高的標準偏差，這可歸因於M1064T；排除M1064T中的CM表現導致新鮮和經解凍的TIL產物之間非常相似的CM表現(未顯示)。
圖49A-49B：CD4+EM細胞。效應記憶型(effector memory)(EM)族群定義為缺乏CCR7和CD45RA表現。A)正如預期，來自新鮮和經解凍TIL的CD4+族群具有高量的效應記憶型表型。在M1056T re-REP TIL族群中發現效應記憶型表現的急劇下降。此外，5個其他實驗顯示新鮮和經解凍的re-REP TIL中效應記憶型表型的減少。B)新鮮和經解凍的TIL均顯示效應記憶型表型的相似表現。新鮮和新鮮Re-REP TIL的比較顯示後者減少了16%。當與經解凍的TIL相比，在經解凍的Re-REP TIL中觀察到類似的降低(9%)。
圖50A-50B：CD8+EM細胞。A)新鮮TIL中效應記憶型增加的類似模式也在CD8+族群中看到。在M1064T中注意到一個例外，其中新鮮TIL僅具有20%的效應記憶型輪廓；這是由於這些TIL中的73%具有如A和B所述的CM表型。所有顯示其來自re-REP產物的CD4+TIL中的效應記憶型族群減少的樣本遵循其CD8+TIL趨勢。B)與CD4+TIL族群不同，CD8+TIL在新鮮、經解凍和re-REP產物中顯示出類似的效應記憶型表型。(注意新鮮和經解凍的TIL中的高標準偏差，這是由於M1064T新鮮中的低效應記憶型族群和M1061T經解凍的TIL樣本中沒有表現。)
圖51A-51B：CD4+CD28+細胞CD28表現與隨年齡增長而年輕TIL降低相關。A)儘管在re-REP TIL中觀察到CM族群的增加，但CD28表現的減少被視為一種趨勢，表明單獨CM狀態不能判定TIL的命運。在-re-REP產物中觀察到CD28表現的減少，除了M1061T CD4+TIL之外。B)與新鮮和經解凍的TIL產物相比，分別觀察到新鮮和經解凍的TIL中降低了8.89%和5.71%。
圖52A-52B：CD8+CD28+細胞。A)CD8+TIL族群中CD28表現在新鮮和經解凍的TIL中高於re-REP產物。在大多數情況下，與經解凍的TIL和新鮮的re-REP TIL相比，經解凍的re-REP TIL顯示出急劇下降。然而，Student氏t檢定顯示新鮮和經解凍的TIL(p=0.3668)之間以及新鮮和經解凍的re-REP產物之間沒有顯著差異(p=0.7940)。B)如在CD4+TIL族群中所見，與其未經再刺激的對應物相比，在新鮮re-REP(21.5%)和經解凍的re-REP(18.2%)中CD8+CD28+族群減少。
圖53A-53B：CD4+PD-1+細胞。TIL中的PD-1表現與抗原反應性和耗竭(exhausted)T細胞相關。因此，在已經歷了11天的REP的TIL中觀察到耗竭表型並不令人驚訝。A)在經解凍的TIL產物中，這種耗竭表型係維持或增加(具體地，EP11001T和M1056T)。新鮮和經解凍的TIL產物之間沒有看到顯著差異(p=0.9809)。與經解凍的re-REP TIL相比，新鮮者顯示出類似的趨勢(p=0.0912)。B)新鮮的re-REP顯示CD4+TIL族群中PD-1表現中度下降。所 有其他條件保持相當的PD-1表現模式。與所有其他條件相比，在新鮮的re-REP產物中觀察到PD-1表現的減少或沒有變化。在經解凍的re-REP產物中，在M1062T、M1063T(CD4+)和EP11001T(CD8+)中觀察到PD-1表現的增加。所有其他經解凍的re-REP產物都顯示出與經解凍產物相當的結果。
圖54A-54B：CD8+PD-1+細胞。A)來自新鮮TIL產物的CD8+族群顯示與增加的PD-1表現相關的更耗竭表型。在EP11001T中觀察到一個例外，其中與新鮮TIL產物相比，CD8+經解凍TIL產物的PD-1表現有中度增加。與經解凍的TIL相比，新鮮TIL中PD-1表現存在少量但無顯著差異(p=0.3144)。B)與經解凍的TIL相比，新鮮TIL產物顯示略微增加、但是不顯著的PD-1表現(6.74%，或比經解凍的TIL高1.2倍)，表明經解凍的TIL產物基於表型模式是相當的。
圖55A-55B：CD4+LAG3+細胞。耗竭T細胞隨PD-1表現高量的抑制性受體LAG3。A)與新鮮TIL相比，CD4+經解凍的TIL顯示略高、但不顯著的LAG3表現量(p=0.52)。在M1063T中觀察到一個例外。在測量CD4+新鮮和新鮮re-REP TIL中的LAG3表現的實驗中，與新鮮TIL相比，在新鮮re-REP樣本中觀察到LAG3+表現的降低。B)總體而言，在新鮮re-REP TIL產物中LAG3表現有中度降低。請注意，為與圖B保持一致，排除了M1061T、M1062T和M1064T，因為未在新鮮產物中測量LAG3表 現。
圖56A-56B：CD8+LAG3+細胞。A)在實驗中，表現CD8+LAG3+的TIL顯示中度降低，除了在新鮮re-REP TIL中觀察到LAG3表現顯著降低的M1063T之外。總體而言，針對LAG3表現，與新鮮的re-REP TIL相比，經解凍的re-REP TIL顯示1.5倍的顯著增加(p=0.0154)。然而，在新鮮TIL和經解凍TIL產物之間沒有觀察到顯著差異(p=0.0884)。B)與經解凍的TIL產物相比，觀察到來自新鮮re-REP的CD8+TIL中LAG3表現約減少30%。新鮮和經解凍的TIL都與經解凍的TIL相當，呈現中度增加。(在該圖中，M1061T、M1062T和M1064T被省略，因為在新鮮或新鮮的re-REP TIL樣本中LAG3表現未測量。)
圖57A-57B：CD4+TIM-3+細胞。A)如先前在PD-1和LAG3的情況中所觀察到的，與在經解凍的re-REP TIL中相比，在新鮮reREP TIL中看到TIM-3表現降低。無論如何，新鮮和經解凍的reREP TIL之間沒有顯著差異(p=0.2007)。B)在新鮮、解凍和經解凍的reREP TIL產物中沒有觀察到TIM-3表現的重大變化。與經解凍的reREP產物相比，在新鮮的reREP TIL中觀察到TIM-3表現中度降低9.2%。
圖58A-58B：CD8+TIM-3+細胞。A)在CD8+TIL中也觀察到在CD4+族群中看到的TIM-3表現的類似趨勢。新鮮的re-REP TIL具有最低耗竭表型和低TIM-3表現，顯示與經解凍的re-REP TIL相比有顯著差異 (p=0.0147)。PD-1、LAG3和TIM-3的比較表明新鮮re-REP TIL具有較少的耗竭表型，具有增加的CM表型。B)與經解凍的re-REP TIL產物相比，新鮮re-REP TIL顯示TIM-3表現顯著降低22%。新鮮和經解凍的TIL都顯示類似的TIM-3表現模式。
圖59：TIL對P815靶向細胞株的細胞毒性潛力。
圖60A-60F：新鮮TIL、新鮮re-REP TIL和經解凍re-REP TIL的代謝呼吸輪廓。基礎(Basal)OCR(A)、明顯(Overt)SRC(B)、SRC2DG(C)、內隱(Covert)SRC(D)、基礎ECAR(E)、及糖解儲備(Glycolytic Reserve)(F)。
圖61A-61B：流氏-FISH(flow-FISH)技術用於測量REP後程序2A的經解凍的TIL產物中的端粒重複的平均長度。A)數據代表藉由qPCR測量的端粒長度來比較TIL與1301細胞，B)數據顯示藉由流氏-FISH檢定所測量的端粒長度(TIL與1301細胞相比)。用於圖表的數據以附錄部分10中的表格格式(表25)提供。總體而言，二種端粒長度檢定結果的模式存在粗略的相似性，但實驗將繼續以判定哪種方法更準確地反映TIL的實際端粒長度。該技術可應用於將來的臨床樣本以判定端粒長度與患者對TIL治療反應之間的關係。
圖62A-62B：選擇無血清培養基供應者(purveyor)(血清替代品)。將各碎片培養於G-Rex 24孔盤的 單孔中(一式四份)。在第11日，使用45個TIL伴隨106個餵養細胞開始REP以模擬2A程序。A)條形圖顯示針對每種條件在第11日(REP前)所記錄的平均存活細胞計數。B)條形圖顯示在第22日(REP後)所記錄的平均存活細胞計數。P值係用student氏't'檢定計算的。分別是* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。
圖63A-63B：選擇無血清培養基供應者(purveyor)(血小板溶裂液血清)。將各碎片培養於G-Rex 24孔盤的單孔中(一式三份)。在第11日，使用4e5個TIL伴隨10e6個餵養細胞開始REP以模擬2A程序。A)條形圖顯示針對每種條件在第11日(REP前)所記錄的平均存活細胞計數。B)條形圖顯示在第22日(REP後)所記錄的平均存活細胞計數。P值係用student氏't'檢定計算的。分別是* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。‘#’沒有足夠的腫瘤碎片。
圖64A-64B：比較CTS Optimizer和標準條件下使用微型2A程序(G-Rex 5M)的功效。將二個碎片/G-Rex 5M一式三份培養，使用26個TIL伴隨506個餵養細胞初始REP以模擬2A程序。上面提供的長條是在第11日(A)或第22日(B)獲得的平均存活細胞計數。
圖65A-65C：比較標準條件和CTS Optimizer，所外推(extrapolate)的TIL擴增前和擴增後的總結。A)REP前。B)REP後。C)外推至全尺度運作(full scale run)之TIL擴增總結(標準對CTS Optimizer+SR)。
圖66：對活細胞圈選(gate)CD8+。9個腫瘤中的7個顯示出CTS+SR條件下絕對CD8+族群的增加。
圖67：干擾素-γ相當性(comparability)。干擾素-γ ELISA(Quantikine)。使用R&D systems的Quantikine ELISA套組測量IFN-γ的產生。當與我們的標準條件相比，CTS+SR產生相當量的IFN-γ。
圖68：快速擴增規程例示性實施態樣的流程圖。在到達後，將腫瘤碎片化，置於具有IL-2的G-Rex燒瓶中以供TIL擴增(REP前擴增)11天。對於三重混合物研究，在REP前初始加入IL-2/IL-15/IL-21。對於快速擴增規程(REP)，將TIL與餵養細胞和OKT3(以供REP擴增)培養再11天。
圖69：使用流動式細胞測量術，將源自黑色素瘤(n=4)和肺(n=7)的TIL針對CD4+及CD8+細胞表型評估(REP前之後)。*P值代表CD8+細胞中的IL-2與IL-12/IL-15/IL-21之間的差異(使用student氏非成對t檢定)。
圖70：使用流動式細胞測量術，將源自黑色素瘤(n=4)和肺(n=7)的TIL針對CD4+及CD8+細胞中的CD27+及CD28+表型評估(REP前之後)。
圖71A-71B：將TIL針對CD8+及CD4+(數據未顯示)細胞中的效應/記憶型次群組(CD45RA和CCR7)(黑色素瘤(n=4)和肺(n=8))表型評估。評估黑色素瘤和肺的CXCR3表現。REP前之後所有表型表現係使用流動式細胞測量術來評估。TCM=中樞記憶型，TSCM=幹細胞記憶 型，TEMRA(效應T細胞)，TEM=效應記憶型。
圖72A-72C：藉由流動式細胞測量術，評估源自(A)黑色素瘤(n=4)和(B)肺(n=5)的TIL於PMA刺激4小時反應的CD107a+表現(在CD4+和CD8+細胞中)。(C)REP前TIL(n=5)用可溶性OKT3(30ng/ml)刺激24小時，藉由ELISA評估上清液的IFNγ。
圖73A-73B：使用用於流動式細胞測量術的Beckman Coulter套組，評估源自黑色素瘤(A)和肺(B)的TIL中的TCRvβ組庫(repertoire)(24個特異性)。
圖74：經冷凍保存TIL例示性製造程序(~22日)。
圖75A-75B：在第22日，將體積減少的細胞產物彙集(pool)並取樣以在洗滌和調製之前判定培養性能。如前所述，在NC-200自動化細胞計數器上分析樣本。總存活細胞密度由來自4個獨立樣本的二重複計數的總平均判定。第2代(Gen 2)程序產生與第1代(Gen 1；Gen 1平均=4.10×1010±2.92×1010，Gen 2平均=3.12×1010±2.19×1010)相似劑量的TIL產物。B)REP階段的倍數擴增係以計算最終存活細胞密度除以最初存活TIL播種密度的值。Gen 2 TIL產物相對於Gen 1具有較低的倍數擴增(Gen 1平均值=1.40×103±9.86×102，Gen 2平均值=5.11×102±2.95×102)。
圖76：藉由流動式細胞測量術檢定新鮮調製的藥物產物的一致性以放行。Gen 1和Gen 2程序產生高純 度的T細胞培養物，如CD45、CD3雙陽性表型(Gen1 #±SD,Gen 2 #±SD)所界定。使用Mann-Whitney 't'檢定計算P值。
圖77：將經調配藥物產物的經冷凍保存之衛星小瓶解凍，並如前所述藉由流動式細胞測量術來檢定擴增的表型。Gen 1和Gen 2產物表現相似CD8對CD4 T細胞亞型的比例。使用Mann-Whitney 't'檢定計算P值。
圖78：將經調配藥物產物的經冷凍保存之衛星小瓶解凍，並如前所述藉由流動式細胞測量術來檢定擴增的表型。Gen 1和Gen 2產物在T細胞次群組上表現相似量的共刺激分子CD27和CD28。使用Mann-Whitney 't'檢定計算P值。需要共刺激分子如CD27和CD28以提供T細胞受體結合(engagement)後效應細胞增殖所必需的二級和三級傳訊。
圖79：如先前所述，流氏-FISH(flow-FISH)技術用於測量端粒重複的平均長度。上述RTL值表明對照細胞系(1301白血病細胞系)每個染色體/基因體的端粒螢光之每個染色體/基因體的平均端粒螢光在Gen 1(程序1C實施態樣)中是# %±SD%，並且Gen 2是#%±SD%。數據表明Gen 2產物平均至少具有與Gen 1產物相當的端粒長度。端粒長度是離體細胞培養長度的替代量度。
圖80：相對於Gen 1藥物產物，Gen 2(程序2A實施態樣)藥物產物展現及已增加的製造IFN-γ能力。藥物產物再活化和分泌細胞介素的能力是在HLA背景下於 TCR與關聯性抗原(cognate antigen)結合時體內功能的替代量度。
圖81：T細胞受體多樣性：檢定來自Gen 1的10×106個TIL(程序1C實施態樣)和Gen 2(程序2A實施態樣)的藥物產物的RNA，以判定在各產物中存在的獨特CDR3序列的總數和頻率。A)各產物中存在的獨特CDR3序列的總數(Gen 1 n=#，平均±SD，Gen 2 n=#，平均±SD)。B)將獨特的CDR3序列相對於各產物中的頻率分度(index)，以產生代表產物中T細胞受體的相對多樣性的分數。來自二個程序的TIL產物由具有不同抗原特異性和結合性(avidity)的多株T細胞族群所構成。總T細胞組庫(repertoire)的廣度可以指示腫瘤細胞上可作用表位的數量。
圖82：顯示程序2A實施態樣之圖，係用於TIL製造的22天程序。
圖83：來自程序1C和程序2A的例示性實施態樣的步驟A至F的比較表。
圖84：程序1C實施態樣及程序2A實施態樣詳細比較。
圖85：TIL治療程序之實施態樣之詳細流程。
圖86A-86C：使用10色流動式細胞測量術檢定表型特徵分析TIL產物(A)T細胞和非T細胞次群組的百分比分別由CD45+CD3+和CD45-(非淋巴球)/CD45+CD3-(非 T細胞淋巴球)界定。總體而言，測試的TIL產物之>99%由T細胞(CD45+CD3+)組成。顯示的是TIL產物的平均值(n=10)。(B)二個T細胞次群組的百分比，包括CD45+CD3+ CD8+(藍色空心圓)和CD45+CD3+CD4+(粉紅色空心圓)。使用student氏非成對t檢定觀察到兩個次群組的百分比沒有統計差異(P=0.68)。(C)針對四種不同的次群組特徵分析非T細胞族群，包括：1)非淋巴球(CD45-)，2)NK細胞(CD45+CD3-CD16+/56+)，3)B細胞(CD45+ CD19+)和4)非NK/B細胞(CD45+CD3-CD16-CD56-CD19-)。
圖87A-87B：CD45+CD3+CD4+和CD45+CD3+CD8+細胞族群中T細胞次群組的表徵。使用CD45RA和CCR7界定未經(抗原)刺激(naïve)、中樞型記憶(TCM)、效應記憶型(TEF)和效應記憶RA+(EMRA)T細胞次群組。圖式顯示來自CD4+(A)和CD8+(B)細胞族群中的10個最終TIL產物的代表性T細胞次群組。效應記憶型T細胞次群組(藍色空心圓)是TIL最終產物的CD4+和CD8+次群組中的主要族群(>93%)。少於7%的TIL產物細胞是中樞型記憶次群組(粉紅色空心圓)。在TIL產物中幾乎檢測不到EMRA(灰色空心圓)和未經(抗原)刺激(naïve)(黑色空心圓)次群組(<0.02%)。p值表示使用student氏非成對t檢定的EM和CM之間的差異。
圖88A-88B：偵檢黑色素瘤腫瘤細胞中的MCSP及EpCAM表現。黑色素瘤腫瘤細胞系(WM35、526和888)、患者來源的黑色素瘤細胞系(1028、1032和1041) 和大腸直腸腺癌細胞系(HT29作為負對照組)藉由染色MCSP(黑色素瘤相關的硫酸軟骨素蛋白多醣)和EpCAM(上皮細胞黏附分子)標記來表徵。(A)平均90%的黑色素瘤腫瘤細胞表現MCSP。(B)與陽性對照HT29(EpCAM+腫瘤細胞系)相比，未在黑色素瘤腫瘤細胞系中偵測到EpCAM表現。
圖89A-89B：偵檢加料對照(spiked control)以判定腫瘤偵檢準確度。該檢定藉由將已知量的腫瘤細胞摻入(spiking)PBMC懸浮液(n=10)來進行。將MCSP+的526黑色素瘤腫瘤細胞以1：10、1：100和1：1,000的比例稀釋，然後與PBMC混合且用抗MCSP和抗CD45抗體和活/死染料染色，並藉由流動式細胞測量術分析。(A)分別以1：10、1：100和1：1,000的稀釋度檢測到大約3000、300和30個細胞。(B)在各條件下所獲得的細胞的平均(AV)和標準偏差(SD)用於界定參考上限和下限。
圖90A-90B：加料對照組中的上限和下限的重現性研究。三重覆進行三次獨立實驗以判定摻入(spiking)檢定的重現性。(A)MCSP+檢測的腫瘤細胞的數量始終在參考上限和下限範圍內。(B)線性回歸圖顯示MCSP+細胞和摻入(spiking)稀釋之間的相關性(R2=0.99)，黑色實線顯示最佳擬合。綠色和灰色虛線分別代表標準曲線和樣本(Exp # 1至3)中95%的預測極限。
圖91A-91B：偵檢TIL產物中的殘餘的黑色素瘤腫瘤。使用所開發的檢定來評估TIL產物殘餘的腫瘤 污染(n=15)。(A與B)可檢測的MCSP+事件的中位數和百分比分別為2和0.0002%。
圖92：T細胞活化後TIL產物的效力評估。TIL產物中的抗CD3/CD28/CD137再刺激後的IFNγ分泌藉由ELISA二重複來評估(n=5)。使用Wilcoxon符號秩檢定(P=0.02)，TIL產物的IFNγ分泌顯著大於未經刺激的對照，並且始終>1000pg/ml。IFNγ分泌>200pg/ml被認為是強效的。p值<0.05被認為具統計顯著性。
圖93：描述了經冷凍保存的TIL製造程序的實施態樣(22日)。
圖94：從Gen 1到Gen 2的程序改進表。
圖95A-95C：總存活細胞、生長速率及存活性。在第22日，將體積減少的細胞產物彙集(pool)並取樣以在洗滌和調製之前判定培養性能。(A)如前所述，在NC-200自動化細胞計數器上分析樣本。總存活細胞密度由來自4個獨立樣本的二重複計數的總平均判定。Gen 2程序產生與Gen 1相似劑量的TIL產物(Gen 1平均=4.10×1010±2.8×1010，Gen 2平均=4.12×1010±2.5×1010)。(B)對REP期計算生長速率，為gr=ln(N(t)/N(0))/t。(C)使用如前所述之Cellometer K2，從9個程序開發批次評估細胞存活性。在經調製之產物的單次凍融循環後未觀察到細胞存活性的顯著降低。解凍和取樣後存活性的平均降低為2.19%。
圖96A-96C：Gen 2產物是高純度的T細胞培 養物，其表現的共刺激分子量與Gen 1相當。(A)藉由流動式細胞測量術檢定新鮮調製的藥物產物的一致性以放行。Gen 1和Gen 2程序產生高純度的T細胞培養物，如CD45+、CD3+表型所界定。(B & C)將經調配藥物產物的經冷凍保存之衛星小瓶解凍，並如前所述藉由流動式細胞測量術來檢定擴增的表型。Gen 1和Gen 2產物在T細胞次群組上表現相似量的共刺激分子CD27和CD28。需要共刺激分子如CD27和CD28以提供T細胞受體結合(engagement)後效應細胞增殖所必需的二級和三級傳訊。使用Mann-Whitney 't'檢定計算P值。
圖97：Gen 2產物展現類似端粒長度。然而，一些TIL族群可能趨向於較長的相對端粒。
圖98：Gen 2藥物產物響應CD3、CD28和CD137結合而分泌IFNγ。
圖99A-99B：T細胞受體多樣性。(A)將獨特的CDR3序列相對於各產物中的頻率分度(index)，以產生代表產物中T細胞受體的整體多樣性的分數。(B)各輸注產物中存在的獨特CDR3序列的平均總數。
圖100：本發明的TIL製造程序的實施態樣。
圖101：在多個腫瘤組織學中IL-2/IL-15/IL-21在REP前的擴增增強。
圖102A-102B：IL-2/IL-15/IL-21增強了肺癌中CD8+細胞的百分比，但在黑色素瘤中沒有。使用流動式細胞測量術在REP前之後對來自(A)黑素瘤(n=4)和(B)肺 (n=7)的TIL進行表型評估CD4+和CD8+細胞。
圖103A-103B：在用IL-2/IL-15/IL-21處理的培養物中，CD8+細胞中CD27的表現略微增強。使用流動式細胞測量術，將源自(A)黑色素瘤(n=4)和(B)肺(n=7)的TIL針對CD4+及CD8+細胞中的CD27+及CD28+表型評估(REP前之後)。
圖104A-104B：添加IL-15/IL-21，T細胞次群組未改變。REP前之後藉由流動式細胞測量術，將TIL針對來自(A)黑色素瘤(n=4)和(B)肺(n=8)的CD8+及CD4+(數據未顯示)細胞中的效應/記憶型次群組(CD45RA和CCR7)表型評估。
圖105A-105C：以IL-2/IL-15/IL-21差異增強TIL功能性能力。藉由流動式細胞測量術，評估源自(A)黑色素瘤(n=4)和(B)肺(n=5)的TIL於PMA刺激4小時反應的CD107a+表現(在CD4+和CD8+細胞中)。(C)源自黑色素瘤及肺之REP前TIL用可溶性抗CD3抗體刺激24小時，藉由ELISA評估上清液的IFNγ。
圖106A-106B：使用用於流動式細胞測量術的Beckman Coulter套組，評估源自(A)黑色素瘤和(B)肺腫瘤的TIL中的TCRvβ組庫(repertoire)(24個特異性)。
圖107：Gen 2冷凍保存的LN-144製造程序流程圖。
圖108：多中心第2期臨床試驗之新穎經冷凍保存的TIL投予轉移性黑色素瘤患者之研究設計之流程 圖。
圖109：描繪定群1(ASCO 2017)與定群2的比較患者特徵的表。
圖110：表格描繪治療緊急不良事件(30%)。
圖111：該輸注產物及TIL療法之療效。
圖112：可評估的SD患者或更好的反應患者的臨床狀態。
圖113：直徑總和的百分比變化。
圖114：在TIL處理後觀察到HMGB1量的增加。
圖115：LN-144輸注後觀察到生物標記IL-10增加。
圖116：從第二次數據截斷(N=17名患者)的轉移性黑素瘤第2期臨床試驗的定群2的更新患者特徵。
圖117：第二次數據截斷(N=17名患者)的定群2(30%)治療緊急不良事件。
圖118：從第二次數據截斷(N=17名患者)的定群2中對可評估患者(穩定疾病或更好)的反應時間。在療效組中的10名患者中，一名患者(患者10)由於在第一次腫瘤評估之前的黑色素瘤相關死亡而無法評估，圖中未表示。
圖119：從第二次數據截斷(N=17名患者)的定群2的更新療效數據。所輸注的TIL之平均數係34×109。 先前療法的中位數為4.5。具有BRAF突變的患者及具有野生型BRAF的患者反應(a *係指具有BRAF突變的患者)。一名患者(患者10)由於在第一次腫瘤評估之前的黑色素瘤相關死亡而無法評估，但仍被認定在功效組中。縮寫：PR，部分反應；SD，穩定疾病；PD，進展疾病。
圖120：從第二次數據截斷(N=17名患者)來自定群2的可評估患者的更新療效數據。*表示無法評估患者，其未有第一評估。所有功效可評估的患者均已接受過先前的抗PD-1和抗CTLA-4檢查點抑制劑治療。
圖121：具有來自定群2(第二數據截斷)的PR的患者(003-015)的代表性電腦斷層攝影掃描。
圖122：輸注前藉由TIL產物的IFN-γ誘導與TIL輸注後第42日腫瘤尺寸臨床減少之相關性。
圖123：Gen 2 TIL產物實施態樣輸注前及後的IP-10(CXCL10)量(pg/mL,log10)。IP-10係細胞黏附及歸巢(homing)標記。
圖124：Gen 1 TIL產物實施態樣輸注前及後的IP-10(CXCL10)量(pg/mL,log10)。
圖125：Gen 2 TIL產物實施態樣輸注前及後的MCP-1量(pg/mL,log10)。MCP-1係細胞黏附及歸巢(homing)標記。
圖126：Gen 1 TIL產物實施態樣輸注前及後的MCP-1量(pg/mL,log10)。
圖127：子宮頸癌和頭頸部鱗狀細胞癌 (HNSCC)的第2期研究數據。SD=穩定疾病。PR=進展疾病。PR=部分反應。
I. 簡介
利用藉由快速擴增規程(REP)離體培養之過繼性細胞治療TIL已經在黑色素瘤患者於宿主免疫抑制後產生了成功的過繼性細胞治療。當前輸注接受參數依賴於TIL組成(例如CD28、CD8或CD4陽性)的讀數以及REP產物的數字倍數擴增和存活性。
目前的REP規程很少能夠了解將被輸注到患者體內的TIL的健康狀況。T細胞在其成熟過程中從未經(抗原)刺激(naïve)到效應T細胞經歷深刻的代謝轉變(參見Chang,et al.,Nat.Immunol. 2016, 17,364，在此明確地全部併入，特別是用於厭氧和有氧代謝的討論和標記)。例如，未經(抗原)刺激(naïve)T細胞依靠粒線體呼吸產生ATP，而成熟、健康的效應T細胞如TIL是高度醣解、依靠有氧醣解提供它們增殖、遷移、活化和抗腫瘤療效所需的生物能量學基質。
先前的論文報導，在轉移之前針對TIL限制醣解和促進粒線體代謝是理想的，因為重度依賴醣解的細胞將在過繼性轉移時遭受營養物剝奪，這導致大部分轉移的細胞死亡。因此，本領域教導促進粒線體代謝可促進體內壽命，並且事實上建議在誘導免疫反應之前使用醣解抑 制劑。參見Chang et al.(Chang,et al.,Nat.Immunol. 2016,17(364)。
在一些實施態樣中，本發明進一步涉及用於評估和量化代謝健康的這種增加的方法。因此，本發明提供了使用一或多種代謝的一般評估來檢定TIL族群的相對健康的方法，包括但不限於醣解、氧化磷酸化、備用呼吸能力(spare respiratory capacity(SRC))和糖解儲備的速率和量。
又，在一些實施態樣中，本發明進一步涉及用於評估和量化代謝健康的這種增加的方法。因此，本發明提供了使用一或多種代謝的一般評估來檢定TIL族群的相對健康的方法，包括但不限於醣解、氧化磷酸化、備用呼吸能力(spare respiratory capacity(SRC))和糖解儲備的速率和量。
此外，隨意之額外評估包括但不限於ATP產生、粒線體質量和葡萄糖攝取。
II. 定義
除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術和科學用語具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的相同含義。本文中所有提及之專利及出版物係以引用方式將彼等全部併入本案。
用語〝(活)體內〞係指發生在個體體內的事件。
用語〝(活)體外(試管內)〞係指發生在個體體外發生之事件。試管內檢定包含其中可使用活或死細胞的基於細胞之檢定，且亦可包含其中使用不完整細胞的無細胞檢定。
用語“離體”是指涉及對已從個體體內移走的細胞、組織和/或器官進行治療或進行程序的事件。適當地，細胞、組織和/或器官可以藉由手術或治療方法返回個體的身體。
用語〝快速擴增〞意指抗原特異性TIL的數量經一週期間增加至少約3倍(或4、5、6、7、8或9倍)，更佳為經一週期間增加至少約10倍(或20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或最佳為經一週期間增加至少約100倍。下文說明數個快速擴增規程。
在本文以〝腫瘤浸潤淋巴球〞或〝TIL〞意指最初以離開個體血流及遷移至腫瘤中的白血球獲得的細胞族群。TIL包括但不限於CD8+胞毒性T細胞(淋巴球)、Th1和Th17 CD4+T細胞、自然殺手細胞、樹狀細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初次及二次TIL二者。〝初次TIL(primary TIL)〞為如本文概述之自患者組織樣品所獲得者(有時稱為〝新鮮收穫〞)，及〝二次TIL(secondary TIL)〞為如本文所討論的已擴增或增生之任何TIL細胞群，包括但不限於主體TIL及經擴增之TIL(〝REP TIL〞或〝REP後TIL〞)。TIL細胞族群可包括基改TIL(genetically modified TIL)。
在本文以〝細胞族群(population of cells)〞(包括TIL)意指共享共同的性狀之許多細胞。一般而言，族群通常具有1 X 106至1×1010之數量範圍，不同的TIL族群包含不同的數量。例如，在IL-2的存在下最初生長的初次TIL得到約1×108個細胞的主體TIL族群。通常進行REP擴增以提供用於輸注之1.5×109至1.5×1010個細胞群。
本文“(經)冷凍保存(的)TIL(cryopreserved TIL)”是指初級、本體或經擴增的TIL(REP TIL)在約-150℃至-60℃的範圍內處理和儲存。用於冷凍保存的一般方法也在本文其他地方描述，包括在實施例中。為了清楚起見，〝經冷凍保存之TIL〞與可用作為初次TIL(包括rTIL)之來源的經冷凍之組織樣品有區別。
在本文中以〝經解凍之經冷凍保存之TIL〞意指先前經冷凍保存及接著經處理以返回室溫或更高溫(包括包括但不限於細胞培養溫度或其中TIL可投予患者的溫度)之TIL(諸如rTIL)族群。
一般而言，TIL可使用細胞表面標記物以生物化學方式定義，或藉由其浸潤腫瘤和使治療生效之能力從功能上定義。一般而言，TIL可藉由表現下列生物標記物之一或多者來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。此外，另外，TIL可藉由其被重新引入患者時浸潤實體瘤之能力從功能上定義。
用語“冷凍保存介質(cryopreservation media 或cryopreservation medium)”係指可用於冷凍保存細胞的任何介質(培養基)。此類培養基可包括含有7%至10%的DMSO的介質。例示性介質包括CryoStor CS10、Hyperthermasol、以及它們的組合。用語“CS10”是指從Stemcell Technologies或Biolife Solutions獲得的冷凍保存介基。該CS10介質可係指商標名“CryoStor® CS10”。CS10培養基是無血清、無動物成分的介質，其包含DMSO。
用語“中樞型記憶T細胞(central memory T cell)”係指一種T細胞次群組，其在人體中為CD45R0+且持續表現(constitutively express)CCR7(CCR7hi)和CD62L(CD62hi)。中樞型記憶T細胞之表面表型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。用於中樞型記憶T細胞之轉錄因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2和BMI1。中樞型記憶T細胞主要分泌IL-2和CD40L作為TCR觸發後之效應分子。中樞型記憶T細胞在血液中之CD4隔室(CD4 compartment)中占絕大多數，且在人體中按比例富集在淋巴結和扁桃腺中。
用語“效應記憶T細胞(effector memory T cell)”係指一種人或哺乳動物T細胞次群組(像中樞型記憶T細胞)，其為CD45R0+，但已損失持續表現CCR7(CCR7lo)且為異質性或為低CD62L表現(CD62Llo)。中樞型記憶T細胞之表面表型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。用於中樞型記憶T細胞之轉錄因子包括BLIMP1。在抗原刺激後，效應記憶T細胞迅速分泌大量發炎性細胞介 素，包括干擾素γ、IL-4和IL-5。效應記憶T細胞在血液中之CD8隔室中占絕大多數，且在人體中按比例富集在肺、肝和腸。CD8+效應記憶T細胞攜帶大量穿孔蛋白(perforin)。
用語“封閉系統(closed system)”係指對外部環境封閉的系統。適用於細胞培養方法的任何封閉系統均可與本發明的方法一起使用。封閉系統包括例如但不限於封閉(密封)的G-container。一旦腫瘤節段被添加到封閉系統中，該系統就不會向外部環境開放，直到TIL準備好投予患者。
如本文中所使用，用語“碎片化(fragmenting)”、“碎片”和“經片段化(fragmented)”描述破壞腫瘤的方法，包括機械碎片化方法，例如壓碎、切片、分開和絞碎腫瘤組織以及任何其他方法，以破壞腫瘤組織的物理結構。
用語〝周邊血液單核細胞〞及〝PBMC〞係指具有圓核之周邊血液細胞，包括淋巴球(諸如T細胞、B細胞和NK細胞)及單核球。較佳的是，周邊血液單核細胞為經照射之同種異體周邊血液單核細胞。PBMC為抗原呈現細胞類型。
用語〝抗CD3抗體〞係指直接針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體之抗體或其變異體，例如單株抗體，且包括人、人化、嵌合或鼠類抗體。抗CD3抗體包括OKT-3，亦稱為莫羅單抗(muromonab)。抗CD3抗 體亦包括UHCT1株，亦稱為T3及CD3ε。其他的抗CD3抗體包括例如奧特希珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizumab)和維西珠單抗(visilizumab)。
用語〝OKT-3〞(在本文亦稱為“OKT3”)係指直接針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體之單株抗體或生物相似藥或其變異體，包括人、人化、嵌合或鼠類抗體，且包括在市場上可取得的形式，諸如OKT-3(30ng/mL，，純MACS GMP CD3，Miltenyi Biotech,Inc.，San Diego,CA,USA)及莫羅單抗，或其變異體、保守性胺基酸取代、糖化形式或生物相似藥。莫羅單抗的重鏈和輕鏈之胺基酸序列於表1中給出(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。能夠生產OKT-3之融合瘤係寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)且配給ATCC寄存編號CRL 8001。能夠生產OKT-3之融合瘤亦寄存於歐洲認證細胞培養物收集中心(European Collection of Authenticated Cell Cultures)(ECACC)且配給目錄編號86022706。
用語〝IL-2〞(在本文亦稱為〝IL2〞)係指已知為介白素-2之T細胞生長因子，且包括IL-2的所有形式，包括其人和哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物相似藥及變異體。IL-2說明於例如Nelson之J.Immunol.2004,172,3983-88及Malek之Annu.Rev.Immunol.2008,26,453-79中，將該等揭示內容併入本文以供參考。適用於本發明的重組人IL-2之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO：3)。例如，用語IL-2包含IL-2之人重組形式，諸如阿地白介素(aldesleukin)(PROLEUKIN，在市場上取自多個供應商，2200萬IU/單次使用小瓶)，以及在市場上由CellGenix,Inc.，Portsmouth,NH,USA(CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，East Brunswick,NJ,USA(目錄編號CYT-209-b)所供應之重組IL-2形式及來自其他供應商的其他市售等效物。阿地白介素(去-丙二醯基-1，絲胺酸-125人IL-2)為IL-2之非糖基化人重組形式，具有約15kDa之分子量。適用於本發明的阿地 白介素之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO：4)。用語IL-2亦包含如本文所述之IL-2之聚乙二醇化形式，包括自Nektar Therapeutics，South San Francisco,CA,USA取得的聚乙二醇化IL2前藥NKTR-214。適用於本發明的NKTR-214及聚乙二醇化IL-2說明於美國專利申請公開案號US 2014/0328791 A1及國際專利申請公開案號WO 2012/065086 A1中，將該等揭示內容併入本文以供參考。適用於本發明的共軛IL-2之替代形式說明於美國專利案號4,766,106、5,206,344、5,089,261及4902,502中，將該等揭示內容併入本文以供參考。適用於本發明的IL-2之調配物說明於美國專利案號6,706,289中，將其揭示內容併入本文以供參考。
用語〝IL-4〞(在本文亦稱為〝IL4〞)係指已知為介白素4之細胞激素，其係由Th2 T細胞及由嗜酸性球、嗜鹼性球和肥大細胞產生。IL-4調節未經(抗原)刺激 (naïve)輔助T細胞(Th0細胞)分化成Th2 T細胞。Steinke and Borish,Respir.Res. 2001, 2,66-70。在經IL-4活化時，Th2 T細胞隨後在正反饋環中生產額外的IL-4。IL-4亦刺激B細胞增生及類別II MHC表現，且誘發類別自B細胞轉換成IgE及IgG1表現。適用於本發明的重組人IL-4係於市場上取自許多供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，East Brunswick,NJ,USA(目錄編號CYT-211)及ThermoFisher Scientific,Inc.，Waltham,MA,USA(人IL-15重組蛋白質，目錄編號Gibco CTP0043)。適用於本發明的重組人IL-4之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO：5)。
用語〝IL-7〞(在本文亦稱為〝IL7〞)係指已知為介白素7之糖基化組織衍生之細胞激素，其可自基質和上皮細胞以及自樹狀細胞獲得。Fry and Mackall,Blood 2002, 99,3892-904。IL-7可刺激T細胞發展。IL-7結合IL-7受體(由IIL-7受體α和常見的γ鏈受體所組成之雜二聚物)，其一系列信號對T細胞在胸腺內發展及在周邊內生存具有重要性。適用於本發明的重組人IL-7係於市場上取自許多供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，East Brunswick,NJ,USA(目錄編號CYT-254)及ThermoFisher Scientific,Inc.，Waltham,MA,USA(人IL-7重組蛋白質，目錄編號Gibco PHC0071)。適用於本發明的重組人IL-7之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO：6)。
用語〝IL-15〞(在本文亦稱為〝IL15〞)係指已知為介白素15之T細胞生長因子，且包括IL-2的所有形 式，包括其人和哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物相似藥和變異體。IL-15說明於例如Fehniger and Caligiuri,Blood 2001, 97,14-32中，將其揭示內容併入本文以供參考。IL-15與IL-2共享β及γ傳訊受體次單元。重組人IL-15為含有114個胺基酸(及N終端甲硫胺酸)之單一非糖基化多肽鏈，具有12.8kDa之分子量。重組人IL-15係於市場上取自許多供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，East Brunswick,NJ,USA(目錄編號CYT-230-b)及ThermoFisher Scientific,Inc.，Waltham,MA,USA(人IL-15重組蛋白質，目錄編號34-8159-82)。適用於本發明的重組人IL-15之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO：7)。
用語〝IL-21〞(在本文亦稱為〝IL21〞)係指已知為介白素21之多效性細胞激素蛋白質，且包括IL-21的所有形式，包括其人和哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物相似藥和變異體。IL-21說明於例如Spolski and Leonard,Nat.Rev.Drug.Disc. 2014, 13,379-95中，將其揭示內容併入本文以供參考。IL-21主要由天然殺手T細胞及活化之人CD4+T細胞產生。重組人IL-21為含有132個胺基酸之單一非糖基化多肽鏈，具有15.4kDa之分子量。重組人IL-21係於市場上取自許多供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，East Brunswick,NJ,USA(目錄編號CYT-408-b)及ThermoFisher Scientific,Inc.，Waltham,MA,USA(人IL-21重組蛋白質，目錄編號 14-8219-80)。適用於本發明的重組人IL-21之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO：8)。
當指“抗腫瘤有效量”、“腫瘤抑制有效量”、或“治療量”時，本發明之組成物之投予正確量可由醫師考慮在年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及患者(個體)的狀況之個體差別而決定。通常可稱包含本文所述之腫瘤浸潤淋巴細胞(例如二次TIL或基改細胞毒性淋巴球)之醫藥組成物可以104至1011個細胞/公斤體重(例如105至106、10'5至1010、105至1011、106至1010、106至1011、107至1011、107至1010、108至1011、108至1010、109至1011、或109至1010個細胞/公斤體重)之劑量投予，包括在該等範圍內的所有整數值。腫瘤浸潤淋巴細胞(包括在一些情況中，基改細胞毒性淋巴球)組成物亦可以該等劑量多次投予。腫瘤浸潤淋巴細胞(包括在一些情況中，基改)可使用免疫療法中一般已知的輸液技術投予(參見例如Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319：1676,1988)。用於特別患者之最優劑量及治療方案可由熟習醫藥技術領域者藉由監測患者的疾病徵兆及據此調整治療而輕易地決定。
用語〝血液惡性疾病〞係指造血及淋巴組織(包括但不限於血液、骨髓、淋巴結和淋巴系統之組織)的哺乳動物癌症及腫瘤。血液惡性疾病亦稱為〝血液腫瘤〞。血液惡性疾病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞淋巴瘤(CLL)、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、急性骨髓球性白血病(AML)、慢性骨髓球性白血 病(CML)、急性單核細胞白血病(AMoL)、何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤。用語〝B細胞血液惡性疾病〞係指影響B細胞之血液惡性疾病。
用語〝實體腫瘤〞係指通常不含有囊腫或液體區域的異常組織塊。實體腫瘤可為良性或惡性。用語〝實體腫瘤癌〞係指惡性、贅生或癌性實體腫瘤。實體腫瘤癌包括但不限於肉瘤、上皮癌(carcinoma)和淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌和膀胱癌。實體腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織間隔，包括主質(癌細胞)及癌細胞分散於其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
用語“液體腫瘤”係指本質上為流體的異常細胞塊。液體腫瘤癌包括但不限於白血病、骨髓瘤和淋巴瘤，以及其他的血液惡性疾病。自血液腫瘤所獲得的TIL在本文亦可稱為骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。
如本文所使用的用語〝微環境〞可指整個實體或血液腫瘤微環境或在微環境內個別的細胞次群組。如本文所使用的腫瘤微環境係指〝細胞、可溶性因子、傳訊分子、細胞外基質及促進贅瘤轉變、支持腫瘤生長和侵入、保護腫瘤免於宿主免疫力、助長抗治療性和提供優勢轉移以茁壯的區位(niche)之機械式刺激〞的複雜混合，如Swartz,et al.,Cancer Res., 2012, 72,2473中所述。雖然腫瘤表現應由T細胞辨識之抗原，但是因為受到微環境的免疫抑制，以免疫系統清除腫瘤卻很罕見。
於一實施態樣中，本發明包括以TIL族群治療癌症之方法，其中患者在輸注根據本發明之TIL之前預先以非骨髓淨除式化療治療。於一實施態樣中，可TIL提供族群，其中患者在輸注根據本發明之TIL之前預先以非骨髓淨除式化療治療。於一實施態樣中，該非骨髓淨除式化療為60mg/kg/d之環磷醯胺(cyclophosphamide)2天(在輸注TIL前第27和26天)和25mg/m2/d之氟達拉濱(fludarabine)達5天(在輸注TIL前第27至23天)。於一實施態樣中，在非骨髓淨除式化療和輸注根據本發明之TIL(第0天)後，患者接受每8小時靜脈內輸注720,000IU/kg之IL-2直至產生生理性耐受性。
實驗結果指出淋巴細胞耗竭在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴細胞之前藉由消除免疫系統(〝細胞激素匯集(cytokine sink)〞)的調節性T細胞及競爭元素而在提高治療效能中扮演關鍵角色。因此，本發明的一些實施態樣係在引入本發明之rTIL之前對患者使用淋巴細胞耗竭步驟(有時亦稱為〝免疫抑制調理〞)。
如本文中所使用，用語〝共同投予(co-administration)〞、〝共同投予(co-administering)〞、〝與...組合投予(administered in combination with)〞、〝與...組合投予(administering in combination with)〞、〝同時〞及〝並行〞包含對個體投予二或更多種活性醫藥成分(在本發明較佳的實施態樣中，例如至少一種鉀通道促效劑併以複數種TIL)，使得兩種活性醫藥成分及/或彼 等之代謝物在相同的時間存在於個體中。共同投予包括以單獨的組成物同時投予、以單獨的組成物在不同的時間投予或以二或更多種活性醫藥成分存在於其中的組成物投予。以單獨的組成物同時投予及以兩種劑存在於其中的組成物投予較佳。
用語〝有效量〞或〝治療有效量〞係指如本文所述之化合物或化合物組合的量，該量足以實現意欲應用，包括但不限於疾病治療。治療有效量可取決於意欲應用(試管內或活體內)或所治療之個體及疾病之狀況(例如個體的體重、年齡和性別)、疾病狀況的嚴重性或投予方式而改變。該用語亦適用於標的細胞中誘發特別反應(例如減少血小板黏附及/或細胞遷移)的劑量。特定的劑量係取決於所選擇之特別化合物、遵循之給藥方案、化合物是否與其他的化合物組合投予、投予時間、欲投予之組織及其中載送化合物之物理遞輸系統而改變。
術語〝治療(treatment)〞、〝治療(treating)〞、〝治療(treat)〞及相似者係指獲得所欲藥理學及/或生理學效應。該效應在完全或部分預防疾病或其症狀方面可為預防性及/或在部分或完全治癒疾病及/或歸屬於疾病的副作用方面可為治療性。如本文所使用的術語〝治療〞涵蓋在哺乳動物中(特別為人類)的任何疾病治療，且包括：(a)預防疾病在可能易罹患疾病，但尚未診斷出已患有疾病的個體中發生；(b)抑制疾病，亦即遏阻其發展或進展；及(c)緩解疾病，亦即引起疾病消退及/或緩解一或多種疾 病症狀。〝治療〞亦意指包含遞輸劑以提供藥理效應，即使在沒有疾病或病況的存在下。例如，〝治療〞包含在沒有疾病狀況存在下遞輸可引發免疫反應或賦予免疫力之組成物，例如在疫苗的例子中。
當述及核酸或蛋白質的部分使用時，用語〝異源性〞表示核酸或蛋白質包含二或更多個未發現彼此在本質上呈相同關係之子序列。例如，核酸通常經重組產生，具有二或更多個自不相關的基因排列之序列以製成新的功能性核酸，例如來自一種來源的啟動子及來自另一種來源的編碼區，或來自不同來源的編碼區。同樣地，異源性蛋白質表示蛋白質包含二或更多個未發現彼此在本質上呈相同關係之子序列(例如融合蛋白質)。
在上下文中，用語二或多個核酸或多肽之〝序列同一性〞、〝同一性百分比〞及〝序列同一性百分比〞(或其同義詞，例如〝99%同一性〞)係指當與最大的相應性相比及比對(若必要時導入間隙)而不考慮任何保守性胺基酸取代作為序列同一性的一部分時，二或更多個相同或具有特定百分比相同的核苷酸或胺基酸殘基之序列或子序列。同一性百分比可使用序列比較軟體或演算法或經由目視檢查來測量。可用於獲得胺基酸或核苷酸序列比對的各種演算法及軟體為本技術中所知。適合於測定序列同一性百分比之程式包括例如取自U.S.Government’s National Center for Biotechnology Information BLAST網址的BLAST套裝程式。兩個序列之間的比較可使用BLASTN 或BLASTP演算法進行。BLASTN係用於比較核酸序列，而BLASTP係用於比較胺基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(Genentech，South San Francisco,California)或取自DNASTAR的MegAlign為可用於比對序列之另外公開可用的軟體程式。熟習本技術領域者可以特定的比對軟體測定最大比對之適當參數。在特定的實施態樣中，使用比對軟體的系統內定參數。
如本文所使用的用語〝變異體〞包含但不限於包含胺基酸序列藉由在參考抗體之胺基酸序列內或鄰近處的特定位置上以一或多個取代、缺失及/或加入的方式而不同於參考抗體之胺基酸序列的抗體或融合蛋白。當與參考抗體之胺基酸序列相比時，變異體可包含一或多個在其胺基酸序列中的保守性取代。保守性取代可涉及例如相似的荷電或未荷電胺基酸之取代。變異體保留特異性結合參考抗體之抗原的能力。用語變異體亦包括經PEG化之抗體或蛋白質。
在本文以〝腫瘤浸潤淋巴球〞或〝TIL〞意指最初以離開個體血流及遷移至腫瘤中的白血球獲得的細胞族群。TIL包括但不限於CD8+胞毒性T細胞(淋巴球)、Th1和Th17 CD4+T細胞、自然殺手細胞、樹狀細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初次及二次TIL二者。〝初次TIL〞為如本文概述之那些自患者組織樣品所獲得者(有時稱為〝新鮮收穫〞)，及〝二次TIL〞為如本文所討論的已擴增或增生之任何TIL細胞群，包括但不限於主體TIL及擴增之 TIL(〝REP TIL〞)和〝reREP TIL〞)。reREP TIL可以包括例如第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(例如，圖27的步驟D中描述的那些，包括被稱為reREP TIL的TIL)。
一般而言，TIL可使用細胞表面標記物以生物化學方式定義，或藉由其浸潤腫瘤和使治療生效之能力從功能上定義。一般而言，TIL可藉由表現下列生物標記物之一或多者來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。此外，另外，TIL可藉由其被重新引入患者時浸潤實體瘤之能力從功能上定義。TILS還可以藉由效價來表徵-例如，如果例如干擾素(IFN)釋放大於約50pg/mL、大於約100pg/mL、大於約150pg/mL、或大於約200pg/mL，則TILS可被認為是有效的。
用語〝醫藥上可接受之載體〞或〝醫藥上可接受之賦形劑〞意欲包括任何及所有的溶劑、分散介質、包膜、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑及惰性成分。用於活性醫藥成分的此等醫藥上可接受之載體或醫藥上可接受之賦形劑為本技術中所熟知。除非任何習知的醫藥上可接受之載體或醫藥上可接受之賦形劑與活性醫藥成分不相容，否則期待其在本發明之治療組成物中的用途。額外的活性醫藥成分(諸如其他的藥物)亦可併入所述之組成物、製程及方法中。
用語〝約(about及approximately)〞意指在統計學上有意義的值範圍。此範圍可在數量級的範圍內，較 佳為給出之值或範圍的50%之內，更佳為20%之內，又更佳為10%之內，且甚至更佳為5%之內。以用語〝約(about及approximately)〞包含的可容許變化係取決於研究的特定系統而定，且可由一般熟習本技術領域者輕易地察知。而且，如本文所使用的用語〝〝約(about及approximately)〞意指尺寸、大小、調配、參數、形狀及其他的量和特徵不是且不必是精確的，但可依要求為近似的及/較大的或較小的，以反映容差、轉換因子、捨入、測量誤差及相似者，及那些熟習本技數領域者已知的其他因子。尺寸、大小、調配、參數、形狀及其他的量和特徵通常為〝大約的(about及approximate)〞，不論是否以此明確地表示。應注意極其不同的大小、形狀及尺寸的實施態樣可使用所述之安排。
當在原始及修正形式的所附申請專利範圍中使用時，過渡性用語〝包含(comprising)〞、〝基本上由...所組成(consisting essentially of)〞及〝由...所組成(consisting of)〞定義關於凡是若任何未列舉之額外的申請範圍要素或步驟之申請專利範圍自申請專利範圍排除。用語〝包含(comprising)〞意欲為內含或開放式，且不排除任何額外未列舉之要素、方法、步驟或材料。用語〝由...所組成(consisting of)〞排除任何除了那些在申請專利範圍具體指出者以外的要素、步驟或材料及在稍後實施例中與具體指出之材料相關聯的尋常雜質。用語〝基本上由...所組成(consisting essentially of)〞限制申請專利範圍至具體 指出之要素、步驟或材料及那些不顯著地影響所主張之發明的基本及新穎特徵者。使本發明具體化的本文所述之所有組成物、方法及套組可在替代的實施態樣中更具體地以過渡性用語〝包含(comprising)〞、〝基本上由...所組成(consisting essentially of)〞及〝由...所組成(consisting of)〞中任一者界定。
III. TIL製造程序
在圖1中描繪了稱為含有這些特徵中的一些特徵的程序2A的例示性TIL程序，並且圖2中描述了本發明的實施態樣相對於程序1C的一些優點，如圖84所示。程序1C在圖3中示出用於比較。基於程序2A的TIL治療的二個替代時間線顯示在圖4中(較高的細胞計數)和圖5(較低的細胞計數)。程序2A實施態樣示於圖6和圖27中。圖83及84進一步提供例示性2A程序(相較於例示性1C程序)。
如本文所討論的，本發明可包括與經冷凍保存的TIL的再刺激相關的步驟，以在移植入患者之前增加其代謝活性並因此增加相對健康，以及測試所述代謝健康的方法。如在本文中一般概述的，TIL通常取自患者樣本並在移植入患者之前進行操作以擴增其數量。在一些實施態樣中，如下所述，TIL可以任選地進行遺傳操作。
在一些實施態樣中，TIL可經冷凍保存。一旦解凍，它們也可以再次刺激以在輸注到患者體內之前增加其新陳代謝。
在一些實施態樣中，第一擴增(包括稱為REP前的程序以及顯示在圖27中步驟A的程序)縮短為3至14天並且第二擴增(包括稱為REP的過程以及顯示在圖27中步驟B的程序)縮短為7至14天，如下面詳細討論的以及實施例和圖式中所述。在一些實施態樣中，第一擴增(例如在圖27中步驟B所述之擴增)縮短為11天並且第二擴增(例如在圖27中步驟D所述之擴增)縮短為11天，如實施例中所討論和圖4、5及27中所示。在一些實施態樣步驟D中，第一擴增及第二擴增之組合(例如在圖27中步驟B及所述之擴增)縮短為22天，如在下文詳細所討論及實施例中和圖中所討論。
以下“步驟”標記A、B、C等係參照圖27並參考本文中所述之某些實施態樣描述。下文和圖27中的步驟的排序是例示性的，且本申請和在本文中所揭示之方法涵蓋步驟的任何組合或順序，以及額外步驟、步驟的重複和/或步驟的省略。
A. 步驟A：獲得患者腫瘤樣本
通常，TIL最初從患者腫瘤樣本(“初級TIL”)獲得，然後擴增成更大的族群以供如本文所述的進一步操作，任選地冷凍保存、如在本文中所概述之再刺激並任選地評估表型和代謝參數作為TIL健康指示。
可以使用本領域已知的方法獲得患者腫瘤樣品，通常經由手術切除、針吸活體組織切片或用於獲得 腫瘤和TIL細胞的混合物的樣本的其他手段。通常，腫瘤樣品可以來自任何實體腫瘤，包括原發性腫瘤、侵襲性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本也可以是液體腫瘤，例如從血液惡性腫瘤獲得的腫瘤。實體瘤可以是任何癌症類型，包括但不限於乳癌、胰癌、前列腺癌、大腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌和皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌和黑色素瘤)。在一些實施態樣中，可用的TIL獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為據報導這些具有特別高量的TIL。
用語〝實體腫瘤〞係指通常不含有囊腫或液體區域的異常組織塊。實體腫瘤可為良性或惡性。用語〝實體腫瘤癌〞係指惡性、贅生或癌性實體腫瘤。實體腫瘤癌包括但不限於肉瘤、上皮癌(carcinoma)和淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌和膀胱癌。在一些實施態樣中，該癌選自子宮頸癌、頭頸癌(包括例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、及非小細胞肺癌。實體腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織間隔，包括主質(癌細胞)及癌細胞分散於其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
用語〝血液惡性疾病〞係指造血及淋巴組織(包括但不限於血液、骨髓、淋巴結和淋巴系統之組織)的哺乳動物癌症及腫瘤。血液惡性疾病亦稱為〝血液腫瘤〞。血液惡性疾病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病 (ALL)、慢性淋巴細胞淋巴瘤(CLL)、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、急性骨髓球性白血病(AML)、慢性骨髓球性白血病(CML)、急性單核細胞白血病(AMoL)、何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤。用語〝B細胞血液惡性疾病〞係指影響B細胞之血液惡性疾病。
一旦獲得，腫瘤樣品通常使用銳器解剖碎片成1至約8mm3的小片，其中約2-3mm3是特別有用的。使用酶促腫瘤消化從這些片段培養TIL。這種腫瘤消化可以通過在酶介質(例如，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640緩衝液，2mM谷氨酸，10mcg/mL慶大霉素，30單位/mL DNase和1.0mg/mL膠原酶)中孵育來產生，然後機械解離(例如，使用組織解離器)。藉由將腫瘤置於酶介質中並將腫瘤機械解離約1分鐘，然後在37℃，5%CO2中孵育30分鐘，然後在上述條件下重複循環機械解離和孵育，直到只有小的組織片存在，可產生腫瘤消化物。在該過程結束時，如果細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可以使用FICOLL支鏈親水性多醣進行密度梯度分離以除去這些細胞。可以使用本領域已知的替代方法，例如美國專利申請公開No.2012/0244133A1中描述的那些，其揭露以引用方式併入到本文中。任何前述方法可用於本文所述的任何實施態樣中用於擴增TIL的方法或治療癌症的方法。
通常，收穫的細胞懸浮液稱為“原代細胞族群”或“新鮮收穫的”細胞族群。
在一些實施態樣中，碎片化包括物理碎片化，包括例如解剖和消化。在一些實施態樣中，該碎片化係物理性碎片化。在一些實施態樣中，該碎片化係切割(dissection)。在一些實施態樣中，該碎片化係消化(digestion)。在一些實施態樣中，TIL可由獲自病患之酵素腫瘤消化物及腫瘤片段來開始培養。在一實施態樣中，TIL可由獲自病患之酵素腫瘤消化物及腫瘤片段來培養。
在一些實施態樣中，當腫瘤是實體瘤時，腫瘤在例如步驟A(如圖27中提供)中獲得腫瘤樣品後經歷物理破碎。在一些實施態樣中，該碎片化在冷凍保存前發生。在一些實施態樣中，該碎片化在冷凍保存後發生。在一些實施態樣中，在獲得腫瘤之後並且在沒有任何冷凍保存的情況下發生碎片化。在一些實施態樣中，腫瘤係經碎片化，並且將10、20、30、40或更多個碎片或片放置在每個容器中用於第一擴增。在一些實施態樣中，腫瘤係經碎片化，並且將30或40個碎片或片放置在每個容器中用於第一擴增。在一些實施態樣中，腫瘤係經碎片化，並且將40個碎片或片放置在每個容器中用於第一擴增。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約4個至約50個碎片，其中各碎片具有約27mm3之體積。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約30個至約60個碎片，具有約1300mm3至約1500mm3之總體積。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1350mm3之總體積。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1克至約1.5克 之總質量。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約4個碎片。
在一些實施態樣中，該TIL係自腫瘤碎片獲得。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係藉由銳器解剖獲得。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係約1mm3與10mm3之間。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係約1mm3與8mm3之間。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係約1mm3。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係約2mm3。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係約3mm3。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係約4mm3。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係約5mm3。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係約6mm3。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係約7mm3。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係約8mm3。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係約9mm3。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係約10mm3。
在一些實施態樣中，該TIL係自腫瘤消化物獲得。在一些實施態樣中，藉由在酶培養基介質中孵育產生腫瘤消化物，酶介質例如但不限於RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL建它黴素、30U/mL DNase和1.0mg/mL膠原酶，然後進行機械解離(GentleMACS,Miltenyi Biotec,Auburn,CA)。將腫瘤置於酶介質中後，可以將腫瘤機械解離約1分鐘。然後將溶液在37℃、5%CO2中溫育30分鐘，然後再次機械破碎約1分鐘。在37℃、5%CO2中再次孵育30分鐘後，可以第三次機械破壞腫瘤約1分鐘。 在一些實施態樣中，在第三次機械破碎後，如果存在大塊組織，則對樣本施加1或2次額外的機械解離，有或沒有在37℃、5%CO2中另外30分鐘的溫育。在一些實施態樣中，在最終培育結束時，如果細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可以使用Ficoll進行密度梯度分離以除去這些細胞。
在一些實施態樣中，在第一次擴增步驟之前收穫的細胞懸浮液稱為“原代細胞群”或“新鮮收穫的”細胞群。
在一些實施態樣中，細胞可以在樣品收穫後任選地冷凍並在進入步驟B中描述的擴增之前冷凍儲存，這將在下面進一步詳細描述，以及圖27中舉例說明。
B. 步驟B：第一擴增 1. 年輕TIL
在一些實施態樣中，本方法提供了獲得年輕TIL，其在投予個體/患者後能夠增加複製週期，因此可提供超過較老TIL的額外治療益處(即，在投予個體/患者前，進一步經歷更多輪複製的TIL)。年輕TIL的特徵已在文獻中描述，例如Donia,at al.,Scandinavian Journal of Immunology,75：157-167(2012)；Dudley et al.,Clin Cancer Res,16：6122-6131(2010)；Huang et al.,J Immunother,28(3)：258-267(2005)；Besser et al.,Clin Cancer Res,19(17)：OF1-OF9(2013)；Besser et al.,J Immunother 32：415-423(2009)；Robbins,et al.,J Immunol 2004；173：7125-7130；Shen et al.,J Immunother,30：123-129(2007)；Zhou,et al.,J Immunother,28：53-62(2005)；and Tran,et al.,J Immunother,31：742-751(2008)，所有這些都通過引用整體併入本文。
T和B淋巴細胞的多種抗原受體通過有限但大量基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變)，D(多樣性)，J(連接)和C(恆定的，確定免疫球蛋白和T細胞受體(TCR)的結合特異性和下游應用。本發明提供了產生TIL的方法，其顯示和增加T細胞庫的多樣性。在一些實施態樣中，通過在一些實施態樣中，與使用除了那些之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL相比，通過本方法獲得的TIL表現出T細胞庫集多樣性的增加。本文提供的方法包括例如除了圖27中體現的方法之外的方法。在一些實施態樣中，與新鮮相比，通過本方法獲得的TIL表現出T細胞譜系多樣性的增加。使用被稱為過程1C的方法製備的收穫的TIL和/或TIL，如圖83中所示。在一些實施態樣中，在第一次擴增中獲得的TIL表現出T細胞庫譜多樣性的增加。在一些實施態樣中，多樣性是免疫球蛋白多樣性和/或T細胞受體多樣性的增加。在一些實施態樣中，多樣性在免疫球蛋白中是在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施態樣中，多樣性在免疫球蛋白中是在免疫球蛋白中。在一些實施態樣中，多樣性在T細胞受體中。在一些實施態樣中，多樣性在選自α，β，γ和δ受體的T細胞受體之一中。 在一些實施態樣中。T細胞受體(TCR)α和/或β的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α的表現增加。在一些實施態樣中，存在增加e T細胞受體(TCR)β的表現。在一些實施態樣中，TCRab的表現(即TCRα/β)增加。
在解剖或消化腫瘤片段後，例如如圖27的步驟A中所述，在有利於TIL在腫瘤和其他細胞上生長的條件下，在含有IL-2的血清中培養所得細胞。在一些實施態樣中，將腫瘤消化物在含有滅活的人AB血清和6000IU/mL IL-2的培養基中的2mL孔中溫育。此原代細胞族群培養數日(通常3至14日)的時期，產生主體TIL族群，通常約1×108個主體TIL細胞。在一些實施態樣中，此原代細胞族群培養7至14日的時期，產生主體TIL族群，通常約1×108個主體TIL細胞。在一些實施態樣中，此原代細胞族群培養10至14日的時期，產生主體TIL族群，通常約1×108個主體TIL細胞。在一些實施態樣中，此原代細胞族群培養約11日的時期，產生主體TIL族群，通常約1×108個主體TIL細胞。
在一個優選的實施態樣中，TIL的擴增可以使用初始的體TIL擴增步驟(例如，如圖27的步驟B中描述的那些，其可以包括稱為pre-REP的過程)進行，如下所述和此後，進行第二次擴增(步驟D，包括稱為快速擴增方案(REP)步驟的過程)，如下文步驟D和本文所述，然後進行任選的冷凍保存，然後進行第二步驟D(包括所述的方法)作為再刺激REP步驟，如下文和本文所述。從該過程 獲得的TIL可任選地表徵如本文所述的表型特徵和代謝參數。
在TIL培養物在24孔板中啟動的實施態樣中，例如，使用Costar 24孔細胞培養簇，平底(Corning Incorporated，Corning，NY)，每個孔可以接種1×106個腫瘤消化細胞或一個腫瘤片段在含有IL-2(6000IU/mL；Chiron Corp.，Emeryville，CA)的2mL完全培養基(CM)中片段化。在一些實施態樣中，該腫瘤碎片係約1mm3與10mm3之間。
在一些實施態樣中，第一種擴增培養基被稱為“CM”，是培養基的縮寫。在一些實施態樣中，步驟B的CM由具有GlutaMAX的RPMI 1640組成，補充有10%人AB血清，25在含有40mL容量和10cm 2透氣矽底的透氣性燒瓶中開始培養的實施態樣(例如，G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing，New Brighton，MN)(圖1)，每個燒瓶裝載10-40×106個活腫瘤消化細胞或5-30個腫瘤片段在10-40mL含有IL-2的CM中.G-Rex10和24孔板在37℃，5% CO 2的潮濕培養箱中培養，培養5天後，取出一半培養基，換上新鮮的CM和IL-2，第5天後，每2-3天更換一半培養基。
在製備腫瘤片段後，在有利於TIL相對於腫瘤和其他細胞生長的條件下，在含有IL-2的血清中培養所得細胞(即片段)。在一些實施態樣中，將腫瘤消化物培養於在含有滅活的人AB血清(或在某些情況下，如本文所述，在aAPC細胞群存在下)的培養基中的2mL孔，具有 6000IU/mL的IL-2。該原代細胞群培養一段時間通常10至14天，產生大量TIL群，通常約1×108個大量TIL細胞。在一些實施態樣中，第一次擴增期間的生長培養基包含IL-2或其變體。在一些實施態樣中，IL在一些實施態樣中，對於1mg小瓶，IL-2儲備溶液具有20-30×106IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液具有重組人IL-2(rhIL-2)。對於1mg小瓶，比活性為20×106IU/mg。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液h對於1mg小瓶，比較活性為25×106IU/mg。在一些實施態樣中，對於1mg小瓶，IL-2儲備溶液具有30×106IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2種儲備溶液的終濃度為4-8×106IU/mg IL-2。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的終濃度為5-7×106IU/mg IL-2。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的終濃度為6×106IU/mg IL-2。在一些實施態樣中，如實施例4中所述製備IL-2儲備溶液。在一些實施態樣中，第一次擴增培養基包含約10,000IU/mL的IL-2，約9,000IU/mL的IL-2，約8,000IU/mL的IL-2，約7,000IU/mL的IL-2，約6000IU/mL的IL。在一些實施態樣中，第一種擴增培養基包含約9,000IU/mL的IL-2至約5,000IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一次擴增，IL-2為約1 000或約5,000IU/mL的IL-2。培養基包含約8,000IU/mL的IL-2至約6,000IU/mL的IL-2.I在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約7,000IU/mL的IL-2至約6,000IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約6,000IU/mL的IL-2。在一個實施態樣中，細胞培養 基還包含IL-2。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約3000IU/mL的IL-2。在一個實施態樣中，細胞培養基還包含IL-2。在一個實施態樣中，細胞培養基包含約1000IU/mL，約1500IU/mL，約2000IU/mL，約2500IU/mL，細胞培養基包含約3000IU/mL的IL-2。約3000IU/mL，約3500IU/mL，約4000IU/mL，約4500IU/mL，約5000IU/mL，約5500IU/mL，約6000IU/mL，約6500IU/mL，約7000IU/mL，約7500IU/mL，或約8000IU/mL的IL-2。在一個實施態樣中，細胞培養基包含1000至2000IU/mL，2000至3000IU/mL，3000至4000之間。IU/mL，介於4000和5000之間U/mL，5000至6000IU/mL，6000至7000IU/mL，7000至8000IU/mL，或約8000IU/mL的IL-2。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約500IU/mL的IL-15，約400IU/mL的IL-15，約300IU/mL的IL-15，約200IU/mL的IL-15，約180IU/mL的IL-15，約160IU/mL的IL-15，約140IU/mL的IL-15，約120IU/mL的IL-15，或約100IU/mL的IL。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約500IU/mL的IL-15至約100IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約400IU/mL的IL。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約300IU/mL的IL-15至約100IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一次擴增-15至約100IU/mL的IL-15。培養基包含約200IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約180IU/mL的IL-15。在一個實施態樣中，細胞培養基還包 含IL-15。在一個優選的實施態樣中。細胞培養基包含約180IU/mL的IL-15。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約20IU/mL的IL-21，約15IU/mL的IL-21，約12IU/mL的IL-21，約10IU/mL的IL-21，約5IU/mL的IL-21，約4IU/mL的IL-21，約3IU/mL的IL-21，約2IU/mL的IL-21，約1IU/mL的IL-在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約20IU/mL的IL-21至約0.5IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一次擴增，第一擴增培養基包含約20IU/mL的IL-21至約0.5IU/mL的IL-21。培養基包含約15IU/mL的IL-21至約0.5IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約12IU/mL的IL-21至約0.5IU/mL的IL。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約10IU/mL的IL-21至約0.5IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約5IU/mL的IL。在一些實施態樣中，第一種擴增培養基包含約2IU/mL的IL-1。在一些實施態樣中，-21至約1IU/mL的IL-1。細胞培養基包含約1IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約0.5IU/mL的IL-211。在一個實施態樣中，細胞培養基還包含IL-21。在優選的實施態樣中，細胞培養基包含約1IU/mL的IL-21。
在一些實施態樣中，第一種擴增培養基被稱為“CM”，是培養基的縮寫。在一些實施態樣中，它被稱為CM1(培養基1)。在一些實施態樣中，CM由RPMI組成。1640與GlutaMAX，補充有10%人AB血清，25mM Hepes和 10mg/mL慶大霉素。在實施態樣中，培養物在具有40mL容量和10cm 2透氣矽底的透氣燒瓶中開始(例如，G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing，New Brighton，MN)(圖1)，每個燒瓶在10-40mL含有IL-2的CM中裝載10-40×10 6個活腫瘤消化細胞或5-30個腫瘤片段。將G-Rex10和24孔板在37℃，5% CO 2的潮濕培養箱中培養，培養開始後5天，取出一半培養基，換上新鮮的CM和IL-2，第5天後，每半天更換一半培養基。在一些實施態樣中，CM是實施例中描述的CM1，參見實施例5.所以在實施態樣中，第一次擴增發生在初始細胞培養基或第一種細胞培養基中。在一些實施態樣中，初始細胞培養基或第一種細胞培養基包含IL-2。
在一些實施態樣中，如所討論的，第一次擴增(包括例如在圖27的步驟B中描述的那些過程，其可以包括那些有時被稱為前REP的過程)被縮短到3-14天。在一些實施態樣中，第一次擴增(包括例如圖27的步驟B中描述的那些過程，其可以包括那些有時被稱為前REP的過程)縮短為7至14天，如在實施例中所討論並在圖4和5中所示，以及包括例如圖27的步驟B中所述的擴增。在一些實施態樣中，步驟B的第一次擴增縮短至10-14天，如在一些實施態樣中，第一次擴增縮短至11天，如實施例中所討論和圖4和5中所示，並且包括例如如在實施例中所述的擴增，如在實施例中所述圖27的步驟B。
在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進 行1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行1天至14天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行2天至14天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以持續1天至14天。進行3天至14天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行4天至14天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行5天至14天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增。可以進行6天至14天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行7天至14天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行8天至14天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行9天到14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可以進行10天到14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可以進行11天至14天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行12天至14天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行13天至14天。在一些實施態樣中。第一次TIL擴增可以進行14天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行1天至11天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行2天至11天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行3天至11天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行4天至11天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行5天至11天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行6天至11天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行7天至11天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行8天至11天。在一些實施態 樣中.，第一次TIL擴增可以進行9天到11天在實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行10天至11天。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以進行11天。
在一些實施態樣中，IL-2，IL-7，IL-15和/或IL-21的組合在第一次擴增期間用作組合。在一些實施態樣中，IL-2，IL-7，IL-15和/或IL-21及其任何組合可以在第一次擴增期間包括在內，包括例如在根據圖27的步驟B過程期間以及本文所述的過程中。在一些實施態樣中，組合在第一次擴增期間使用IL-2，IL-15和IL-21作為組合。在一些實施態樣中，在步驟B期間可以包括IL-2，IL-15和IL-21以及它們的任何組合。根據圖27並如本文所述的方法。
在一些實施態樣中，如實施例和附圖中所討論的，第一次擴增(包括稱為前REP的過程；例如，根據圖27的步驟B)過程縮短至3至14天。在實施態樣中，步驟B的第一次擴增縮短至7至14天，如實施例中所討論和圖4和5所示。在一些實施態樣中，步驟B的第一次擴增縮短至10至14天，如實施例中所討論的。在一些實施態樣中，第一次擴增縮短至11天，如實施例中所討論並在圖4,5和27中顯示。
在一些實施態樣中，第一次擴增，例如，根據圖27的步驟B，在封閉系統生物反應器中進行。在一些實施態樣中，如本文所述，採用封閉系統進行TIL擴增。在一些實施態樣中。在一些實施態樣中，所用的單個生物 反應器是例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施態樣中，封閉系統生物反應器是單個生物反應器。
C. 步驟C：第一擴增到第二擴增過渡
在一些情況下，使用下文討論的方案，可以立即冷凍保存從第一次擴增獲得的大量TIL群體，包括例如從如圖27中所示的例如步驟B獲得的TIL群體。或者，從第一次擴增獲得的TIL群體，稱為第二次TIL群體，可以進行第二次擴增(可以包括有時稱為REP的擴增)，然後如下所述進行冷凍保存。類似地，在轉基因的情況下TIL將用於治療，第一個TIL群體(有時稱為大量TIL群體)或第二個TIL群體(在一些實施態樣中可以包括稱為REP TIL群體的群體)可以進行適當的遺傳修飾在擴增之前或第一次擴增之後和第二次擴增之前的處理。
在一些實施態樣中，從第一次擴增獲得的TIL(例如，如圖27中所示的步驟B)被儲存直至用於選擇的表型。在一些實施態樣中，從第一次擴增獲得的TIL(例如，來自不存儲如圖27中所示的步驟B並直接進行第二次擴增。在一些實施態樣中，從第一次擴增獲得的TIL在第一次擴增後和第二次擴增之前不被冷凍保存。在一些實施態樣中，轉變從第一次擴張到第二次擴張發生在大約3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天或14天之後在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在從發生破碎時起約3天至14天。 在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在約4天至14天後在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在從發生破碎時起約4天至10天。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在約7天。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在從發生破碎時起約14天。
在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天。在發生破碎時，天，12天，13天或14天。在一些實施態樣中，從破碎發生後1天至14天發生從第一次擴增到第二次擴增的轉變。在一些實施態樣中，第一次TIL擴增可以在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的過渡發生在碎裂發生後3天至14天。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的過渡發生4天。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在碎裂發生後5天至14天。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的過渡發生在6天。到14天在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的過渡發生在碎裂發生後7天至14天。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的過渡發生在8天到14天之間。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的過渡發生在碎裂發生後9天至14天。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的過渡發生在10天到14天之間。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的過渡發生在碎 裂發生的11天到14天之間。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的過渡發生在12天到14天之間。從碎裂發生的幾天開始。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的過渡發生在13天到14天之間在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在碎裂發生後14天。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在碎裂發生的1天到11天之間。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在碎裂發生的2天到11天之間。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在碎裂發生的3天到11天之間。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在從發生破碎時起4天到11天。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在碎裂發生的5天到11天之間。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在碎裂發生後6天至11天在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在碎裂發生後7天至11天。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在碎裂後8天至11天。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在碎裂發生後9天至11天。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在碎裂後10天至11天。在一些實施態樣中，從第一次擴增到第二次擴增的轉變發生在碎裂發生的11天。
在一些實施例中，在所述第一擴增之後和在所述第二擴增之前不存儲所述TID，TILS直接前進到第二 擴增中(例如，在一些實施例中，在從步驟b到步驟d的轉換期間沒有存儲(如圖27所示)。在一些實施例中，如下文所述，過渡發生在閉合系統中。在一些實施例中，來自第一擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞，第二群集群，直接進入第二擴增中，無過渡期。
在一些實施例中，從第一擴增到第二擴增的轉換，例如，根據圖27的步驟C，在封閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，使用封閉系統來進行直到擴增，如本文所述，在一些實施態樣中，單個生物反應器是雇主。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器為G-REX-10或G-REX-100。在一些實施方式中，封閉系統生物反應器是單個生物反應器。
D. 步驟D：第二擴增
在一些實施態樣中，TIL細胞群在收穫和初始批量處理後例如在步驟A和步驟B之後擴增，並且過渡稱為步驟C，如圖27中所示。這種進一步的擴增在本文中稱為第二擴增，其可包括本領域通常稱為快速擴增過程的擴增過程(REP；以及圖27的步驟D中所示的過程)。第二次擴增通常是使用包含許多組分的培養基完成，所述組分包括飼養細胞，細胞因子源和抗CD3抗體，在透氣性容器中。
在一些實施態樣中，可以使用已知的任何TIL燒瓶或容器進行TIL的第二擴增或第二TIL擴增(其可以 包括擴增，有時稱為REP；以及圖27的步驟D中所示的過程)。在一些實施例中，第二TIL擴增可以進行7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天或14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可以進行。TIL擴增可以進行約7天至約14天。在一些實施態樣中，第二次TIL擴增可以進行約8天至約14天。在一些實施態樣中，第二次TIL擴增可以進行約9天至約14天。在一些實施態樣中，第二次TIL擴增可以進行約10天至約14天。在一些實施態樣中，第二次TIL擴增可以進行約11天至約14天。在一些實施態樣中，第二次TIL擴增可以進行約12天至約14天。在一些實施態樣中，s第二次TIL擴增可以進行約13天至約14天。在一些實施態樣中，第二次TIL擴增可以進行約14天。
在一個實施態樣中，可以使用本公開的方法在透氣性容器中進行第二次擴增(包括例如稱為REP的擴增；以及圖27的步驟D中所示的過程)。例如，在白血球介素-2(IL-2)或白血球介素-15(IL-15)存在下，使用非特異性T細胞受體刺激可以快速擴增TIL。非特異性T細胞受體刺激可以包括例如，抗CD3抗體，例如約30ng/ml的OKT3，小鼠單株抗CD3抗體(可從Ortho-McNeil，Raritan，NJ或Miltenyi Biotech，Auburn，CA商購)或UHCT-1。(可從BioLegend，San Diego，CA，USA商購獲得)。通過在第二次擴增期間包括一種或多種抗原，包括其抗原部分，例如表位，可以擴增以利用體外進一步刺激TILs。可以任選地從載體如人白血球中表現癌症細胞抗原A2(HLA-A2)結 合肽，例如0.3μMMART-1：26-35(27L)或gp100：209-217(210M)，任選地存在T細胞生長因子，例如其他合適的抗原可包括例如NY-ESO-1，TRP-1，TRP-2，酪氨酸酶癌抗原，MAGE-A3，SSX-2和VEGFR2，還可以通過用表現HLA-A2的抗原呈遞細胞上的相同抗原的抗原再刺激來快速擴增。或者，可以用例如TIL進一步再刺激TIL。例如，經照射的自體淋巴細胞或經輻照的HLA-A2+同種異體淋巴細胞和IL-2。在一些實施態樣中，再刺激作為第二次擴增的一部分發生。在一些實施態樣中，第二次擴增在受照射的，存在下發生。自體淋巴細胞或經輻照的HLA-A2+同種異體淋巴細胞和IL-2。
在一個實施態樣中，細胞培養基還包含IL-2。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約3000IU/mL的IL-2。在一個實施態樣中，細胞培養基包含約1000IU/mL，約1500IU/mL，約2000IU/mL，約2500IU/mL，約3000IU/mL，約3500IU/mL，約4000IU/mL，約4500IU/mL，約5000IU/mL，約5500IU/mL，約6000IU/mL，約6500IU/mL，約7000IU/mL，約7500IU/mL，或約8000IU/mL的IL-2。在一個實施態樣中，細胞培養基包含1000至2000IU/mL，2000至3000IU/mL，3000至4000IU/mL，4000至5000IU/mL，5000至6000IU/mL，6000至7000IU/mL，7000至7000之間和8000IU/mL，或8000IU/mL的IL-2。
在一個實施態樣中，細胞培養基包含OKT3 抗體。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約30ng/mL的OKT3抗體。在一個實施態樣中，細胞培養基包含約0.1ng/mL，約0.5ng/mL，約1ng/mL，約2.5ng/mL，約5ng/mL，約7.5ng/mL，約10ng/mL，約15ng/mL，約20ng/mL，約25ng/mL，約30ng/mL，約35ng/mL，約40ng/mL，約50ng/mL，約60ng/mL，約70ng/mL，約80ng/mL，約90ng/mL，約100ng/mL，約200ng/mL，約500ng/mL，和約1μg/mL的OKT3抗體。在一個實施態樣中，細胞培養基包含0.1ng/mL至1ng/mL，之間，1ng/mL和5ng/mL，介於5ng/mL和10ng/mL之間，介於10ng/mL和20ng/mL之間，介於20ng/mL和30ng/mL之間，介於30ng/mL和40ng/mL之間ng/mL，介於40ng/mL和50ng/mL之間，介於50ng/mL和100ng/mL之間的OKT3抗體。
在一些實施態樣中，在第二次擴增期間使用IL-2，IL-7，IL-15和/或IL-21的組合作為組合。在一些實施態樣中，IL-2，IL-7，在第二次擴增期間可以包括IL-15和/或IL-21以及它們的任何組合，包括例如在根據圖27的步驟D過程期間以及本文所述的過程中。在一些實施態樣中，組合在第二次擴增期間使用IL-2，IL-15和IL-21作為組合。在一些實施態樣中，在步驟D期間可以包括IL-2，IL-15和IL-21以及它們的任何組合。根據圖27並如本文所述的方法。
在一些實施態樣中，第二次擴增可以在包含IL-2，OKT-3和抗原呈遞飼養細胞的補充細胞培養基中進 行。在一些實施態樣中，第二次擴增發生在補充的細胞培養基中。在一些實施態樣中，補充的細胞培養基包含IL-2，OKT-3和抗原呈遞飼養細胞。在一些實施態樣中，第二細胞培養基包含IL-2，OKT-3和抗原呈遞細胞(APC)。在一些實施態樣中，第二次擴增發生在包含IL-2，OKT-3和抗原呈遞飼養細胞(即抗原呈遞細胞)的細胞培養基中；並且也稱為抗原呈遞飼養細胞。
在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約500IU/mL的IL-15，約400IU/mL的IL-15，約300IU/mL的IL-15，約200IU/mL的IL。-15，約180IU/mL的IL-15，約160IU/mL的IL-15，約140IU/mL的IL-15，約120IU/mL的IL-15，或約100IU/mL的在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約500IU/mL的IL-15至約100IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約400IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約300IU/mL的IL-15至約1001U/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含IL-15至約100IU/mL的IL-15。擴增培養基包含約200IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約180IU/mL的IL-15。在一個實施態樣中，細胞培養基還包含IL-15。在一個實施態樣中，細胞培養基包含約180IU/mL的IL-15。
在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約20IU/mL的IL-21，約15IU/mL的IL-21，約12IU/mL的IL-21，約10IU/mL的IL。-21，約5IU/mL的IL-21，約4IU/mL 的IL-21，約3IU/mL的IL-21，約2IU/mL的IL-21，約1IU/mL的IL。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約20IU/mL的IL-21至約0.5IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約20IU/mL的IL-21至約0.5IU/mL的IL-21。擴增培養基包含約15IU/mL的IL-21至約0.5IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約12IU/mL的IL-21至約0.5IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約10IU/mL的IL-21至約0.5IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約5IU/mL的IL-21。IL-21至約1IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二種擴增培養基包含約2IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約1IU/mL的IL-211。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約0.5IU/mL的IL-211。在一個實施態樣中，細胞培養基還包含IL-21。在優選的實施態樣中，細胞培養基包含約1IU/mL的IL-21。
在一些實施態樣中，抗原呈遞飼養細胞(APC)是PBMC。在一個實施態樣中，在快速擴增和/或第二次擴增中TIL與PBMC和/或抗原呈遞細胞的比例為約1至25。約1至50，約1至100，約1至125，約1至150，約1至175，約1至200，約1至225，約1至250，約1至275，約1至300在一個實施態樣中，快速擴增和/或第二擴增中TIL與PBMC的比率在1以內，約1至325，約1至350，約1至375，約1至400，或約1至500。在一個實施態樣中，快速擴增和/或第二擴增中TIL與PBMC的比率為1至100和1至200。
在一個實施態樣中，REP和/或第二次擴增在燒瓶中進行，其中大量TIL與100或200倍過量的滅活飼養細胞，30mg/mL OKT3抗CD3抗體和3000IU混合。在150ml培養基中加入/mL IL-2。進行培養基更換(通常用新鮮培養基通過呼吸替換2/3培養基)，直到將細胞轉移到另一個生長室。替代生長室包括G-REX燒瓶和透氣容器。如下面更充分討論。
在一些實施態樣中，第二次擴增(其可包括稱為REP過程的過程)縮短至7-14天，如實施例和附圖中所討論的。在一些實施態樣中，第二次擴增縮短至11天。。
在一個實施態樣中，REP和/或第二次擴增可以使用如前所述的T-175燒瓶和透氣袋進行(Tran等，J.Immunother.2008,31,742-51；Dudley，等人，J.Immunother.2003,26,332-42)或透氣性培養器皿(G-Rex燒瓶)。在一些實施態樣中，第二次擴增(包括稱為快速擴增的擴增)在T-175燒瓶中進行。可以在每個T-175燒瓶中加入懸浮在150mL培養基中的約1×106個TIL。TIL可以在CM和AIM-V培養基的1：1混合物中培養，補充3000IU/mL IL。可以在37℃，5% CO 2中培養T-175燒瓶。半天，可以使用50/50培養基更換培養基，每毫升含有3000IU的IL在一些實施態樣中，在第7天，來自兩個T-175燒瓶的細胞可以在3L袋中組合，並且300mL AIM V與5%人AB血清和3000IU/mL IL-2一起加入到300毫升TIL懸浮液。每個細胞的數量每天或每兩天計數袋子並加入新鮮培養基以使細胞計數保持在 0.5和2.0×10 6個細胞/mL之間。
在一個實施態樣中，第二擴增(其可以包括稱為REP的擴增，以及圖27的步驟D中提到的擴增)可以在具有100cm透氣矽的500mL容量的透氣燒瓶中進行。底部(G-Rex 100，可從Wilson Wolf Manufacturing Corporation，New Brighton，MN，USA商購)，5×106或10×106 TIL可與PBMC一起培養在400mL 50/50培養基中，補充有5%人AB血清，3000IU/mL IL-2和30ng/ml抗CD3(OKT3).G-Rex 100燒瓶可在37℃，5% CO2中培養。第5天，250mL上清液可將其取出並置於離心瓶中，以1500rpm(491×g)離心10分鐘.TIL顆粒可用150mL含5%人AB血清，3000IU/mL IL-的新鮮培養基重懸。2，並添加回原來的G-Rex 100燒瓶。當TIL在G-Rex 100燒瓶中連續擴增時，在第7天，每個G-Rex 100中的TIL可以懸浮在300mL o中。每個燒瓶中存在的培養基和細胞懸浮液可分成3個100mL等分試樣，可用於接種3 G-Rex 100燒瓶。然後150mL含有5%人AB血清的AIM-V和每mL 3000IU可以將IL-2加入每個燒瓶中.G-Rex 100燒瓶可以在37℃，5% CO 2中培養，4天後，可以加入150mL含有3000IU/mL IL-2的AIM-V每個G-REX 100燒瓶。可在培養的第14天收穫細胞。
在一個實施態樣中，第二次擴增(包括稱為REP的擴增)在燒瓶中進行，其中大量TIL與100或200倍過量的滅活飼養細胞，30mg/mL OKT3抗CD3混合。在一些實施態樣中，進行培養基更換直至將細胞轉移至另一種生 長室。在一些實施態樣中，用新鮮培養基呼吸代替2/3的培養基。抗體和150Ib培養基中的3000IU/mL IL-2。在一些實施態樣中，替代生長室包括G-REX燒瓶和可透氣的容器，如下面更全面地討論的。
在一個實施態樣中，進行第二次擴增(包括稱為REP的擴增)，並且進一步包括選擇TIL以獲得優異的腫瘤反應性的步驟。可以使用本領域已知的任何選擇方法。例如，方法在美國專利申請公開號2016/0010058 A1中描述的，其公開內容通過引用併入本文，可用於選擇TIL以獲得優異的腫瘤反應性。
任選地，可以使用本領域已知的標準測定法在第二次擴增(包括稱為REP擴增的擴增)後進行細胞活力測定。例如，可以對以下樣品進行台盼藍排除測定。在一些實施態樣中，可以使用Cellometer K2自動細胞計數器(Nexcelom Bioscience，Lawrence，MA)計數TIL樣品並測定活力。在一些實施態樣中，確定存活力的大體積TIL，其選擇性地標記死細胞並允許活力評估。根據例如在實施例15中描述的Cellometer K2 Image Cytometer Automatic Cell Counter protocol。
在一些實施態樣中，TIL的第二次擴增(包括稱為REP的擴增)可以使用如前所述的T-175燒瓶和透氣袋進行(Tran KQ，Zhou J，Durflinger KH，et al.,2008，J Immunother.,31：742-751，和Dudley ME，Wunderlich JR，Shelton TE，等人，2003，J Immunother.,26：332- 342)或透氣性G-Rex燒瓶。在一些實施態樣中，使用燒瓶進行第二次擴增。在一些實施態樣中，使用透氣性G-Rex燒瓶進行第二次擴增。在一些實施態樣中，第二次擴增在T-175燒瓶中進行，並且約1×10 6。將TIL懸浮於約150mL培養基中，並將其加入每個T-175燒瓶中。將TIL與經照射的(50Gy)同種異體PBMC一起培養為“飼養”細胞，比例為1至100，並將細胞培養於CM和AIM-V培養基(50/50培養基)的1比1混合物，補充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3。將T-175培養瓶在37℃溫育在一些實施態樣中，使用具有3000IU/mL IL-2的50/50培養基在第5天更換一半培養基。在一些實施態樣中，在第7天，將來自2個T-175培養瓶的細胞組合在一起。將3L袋和300mL AIM-V與5%人AB血清和3000IU/mL IL-2加入到300mL TIL懸浮液中。每個袋中的細胞數可以每天或每兩天計數和新鮮培養基可加入以保持細胞計數在約0.5和約2.0×10 6個細胞/mL之間。
在一些實施態樣中，第二次擴增(包括稱為REP的擴增)在具有100cm 2透氣性矽底物(G-Rex 100，Wilson Wolf)的500mL容量燒瓶中進行(圖1)，約5×10 6。或10×106 TIL與照射的同種異體PBMC以1比100的比例在400mL 50/50培養基中培養，補充3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3.G-Rex 100將燒瓶在37℃，5% CO 2中溫育。在一些實施態樣中，在第5天，取出250mL上清液並置於離心瓶中並以1500rpm(491g)離心10分鐘。然後可以將TIL顆粒重懸浮。將150mL新鮮的50/50培養基與 3000IU/mL的IL-2一起加回到原始的G-Rex 100燒瓶中。在TIL在G-Rex 100燒瓶中連續擴增的實施態樣中，在第7天每個中的TIL。將G-Rex 100懸浮在每個燒瓶中存在的300mL培養基中，並將細胞懸浮液分成三個100mL等分試樣，用於接種3G-Rex 1然後向每個燒瓶中加入150mL含有5%人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V。將G-Rex 100燒瓶在37℃，5% CO 2和4℃下孵育。在每個G-Rex 100燒瓶中加入150mL含有3000IU/mL IL-2的AIM-V。在培養的第14天收穫細胞。
T和B淋巴細胞的多種抗原受體通過有限但大量基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變)，D(多樣性)，J(連接)和C(恆定的，確定免疫球蛋白和T細胞受體(TCR)的結合特異性和下游應用。本發明提供了產生TIL的方法，其顯示和增加T細胞庫的多樣性。在一些實施態樣中，通過本發明方法表現出T細胞庫譜多樣性的增加。在一些實施態樣中，在第二次擴增中獲得的TIL表現出T細胞庫譜多樣性的增加。在一些實施態樣中，多樣性的增加是免疫球蛋白多樣性的增加。在一些實施態樣中，多樣性在免疫球蛋白中是在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施態樣中，免疫球蛋白中的多樣性是免疫球蛋白中的多樣性。和/或T細胞受體多樣性。在一些實施態樣中，多樣性在T細胞受體中。在一些實施態樣中，多樣性在選自α，β，γ和δ受體的T細胞受體之一中。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α和/或β的表現增加。在一些實施態 樣中，T細胞受體(TCR)α的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)β的表現增加。在一些實施態樣中，TCRab的表現(即TCRα/β)增加。
在一些實施態樣中，第二擴增培養基(例如，有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2，OKT-3，以及抗原呈遞飼養細胞(APC)，如下面更詳細討論的那樣。
在一些實施態樣中，第二次擴增，例如，根據圖27的步驟D，在封閉系統生物反應器中進行。在一些實施態樣中，如本文所述，採用封閉系統進行TIL擴增。在一些實施態樣中。在一些實施態樣中，所用的單個生物反應器是例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施態樣中，封閉系統生物反應器是單個生物反應器。
1. 飼養細胞和抗原呈遞細胞
在一個實施態樣中，本文描述的第二擴增程序(例如包括擴增，例如圖27中的步驟D中描述的那些，以及稱為REP的那些)在REP TIL擴增期間需要過量的飼養細胞和/或在許多實施態樣中，飼養細胞是從健康獻血者的標準全血單位獲得的外周血單核細胞(PBMC)。使用標準方法如Ficoll-Paque梯度分離獲得PBMC。
通常，通過輻射或熱處理使同種異體PBMC失活，並用於REP程序，如實施例中所述，特別是實施例14，其提供用於評估照射同種異體的複制能力不足的示例 性方案。外周血單個核細胞。
在一些實施態樣中，如果第14天的活細胞總數小於REP第0天培養的初始活細胞數，則PBMC被認為是複制不能並且被接受用於本文所述的TIL擴增程序。和/或第二次擴增的第0天(即第二次擴增的開始日期)。例如請參閱實施例14。
在一些實施態樣中，如果在第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培養的活細胞的總數沒有，則PBMC被認為是複制不能並且被接受用於本文所述的TIL擴增程序。從在REP的第0天和/或第二次擴增的第0天(即第二次擴增的開始日)投入培養的初始活細胞數增加。在一些實施態樣中，PBMC在30的存在下培養。ng/ml OKT3抗體和3000IU/ml IL-2。例如請參閱實施例13。
在一些實施態樣中，如果在第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培養的活細胞的總數沒有，則PBMC被認為是複制不能並且被接受用於本文所述的TIL擴增程序。從在REP的第0天和/或第二次擴增的第0天(即第二次擴增的開始日)投入培養的初始活細胞數增加。在一些實施態樣中，PBMC在5的存在下培養。-60ng/ml OKT3抗體和1000-6000IU/ml IL-2。在一些實施態樣中，PBMC在10-50ng/ml OKT3抗體和2000-5000IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在20-40ng/ml OKT3抗體和2000-4000IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在25-35ng/ml OKT3抗體存在下培養。和2500-3500IU/ml IL- 2。
在一些實施態樣中，抗原呈遞飼養細胞是PBMC。在一些實施態樣中，抗原呈遞飼養細胞是人工抗原呈遞飼養細胞。在一個實施態樣中，TIL與抗原呈遞飼養細胞的比例在第二次擴增為約1至25，約1至50，約1至100，約1至125，約1至150，約1至175，約1至200，約1至225，約1至250，約1在一個實施態樣中，TIL與抗原呈遞飼養細胞的比例為275，約1至300，約1至325，約1至350，約1至375，約1至400，或約1至500。第二次擴增在1至50和1至300之間。在一個實施態樣中，第二次擴增中TIL與抗原呈遞飼養細胞的比例在1至100和1至200之間。
在一個實施態樣中，本文所述的第二擴增程序需要約2.5×10 9個飼養細胞與約100×10 6 TIL的比率。在另一個實施態樣中，本文所述的第二個擴增程序需要約2.5×10 9個飼養細胞與約50×10 6個TIL的比例。在另一個實施態樣中，本文所述的第二種擴增方法需要約2.5×10 9個飼養細胞至約25×10 6個TIL。
在一個實施態樣中，本文所述的第二擴增程序在第二次擴增期間需要過量的飼養細胞。在許多實施態樣中，飼養細胞是從健康獻血者的標準全血單位獲得的外周血單核細胞(PBMC)。使用標準方法例如Ficoll-Paque梯度分離獲得PBMC。在一個實施態樣中，使用人工抗原呈遞(aAPC)細胞代替PBMC。
通常，同種異體PBMC通過輻射或熱處理滅 活，並用於本文所述的TIL擴增程序，包括圖4,5和27中所述的示例性程序。
在一個實施態樣中，人工抗原呈遞細胞在第二次擴增中用作PBMC的替代物或與PBMC組合。
2. 細胞介素
如本領域已知的，本文所述的擴增方法通常使用具有高劑量細胞因子，特別是IL-2的培養基。
或者，使用細胞因子的組合用於TILS的快速擴增和/或第二次擴增，還可以使用IL-2，IL-15和IL-21中的兩種或更多種的組合，如國際公開號中一般概述的。WO2015/189356和W國際公開號WO2015/189357，其全部內容通過引用明確併入本文。因此，可能的組合包括IL-2和IL-15，IL-2和IL-21，IL-15和IL。-21和IL-2，IL-15和IL-21，後者在許多實施態樣中特別有用。細胞因子組合的使用特別有利於淋巴細胞的產生，特別是如其中所述的T細胞。
3. 抗CD3抗體
在一些實施態樣中，本文所述的擴增方法中使用的培養基(包括稱為REP的那些，參見例如圖27)還包括抗CD3抗體。抗CD3抗體與IL-2組合。在TIL群體中誘導T細胞活化和細胞分裂。這種效應可見於全長抗體以及Fab和F(ab')2片段，前者通常是優選的；參見，例如，Tsoukas 等，J.Immunol.1985,135,1719，其全部內容在此引入作為參考。
如本領域技術人員所理解的，有許多可用於本發明的合適的抗人CD3抗體，包括來自各種哺乳動物的抗人CD3多株和單株抗體，包括但不限於在特定實施態樣中，使用OKT3抗CD3.抗體(可從Ortho-McNeil，Raritan，NJ或Miltenyi Biotech，Auburn，CA商購獲得)，鼠，人，靈長類動物，大鼠和犬抗體。
E. 步驟E：收獲TIL
在第二個擴增步驟之後，可以收穫細胞。在一些實施態樣中，在一個，兩個，三個，四個或更多個擴增步驟後收穫TIL，例如如圖27中提供的。在一些實施態樣中，在收穫後收穫TIL。兩個擴增步驟，例如圖27中提供的。
可以以任何適當和無菌的方式收穫TIL，包括例如通過離心。用於TIL收穫的方法是本領域熟知的，並且任何這樣的已知方法都可以與本發明方法一起使用。在一些實施態樣中，使用自動化系統收穫TILS。
細胞收集器和/或細胞處理系統可從多種來源商購獲得，包括例如Fresenius Kabi，Tomtec Life Science，Perkin Elmer和Inotech Biosystems International，Inc。任何基於細胞的收穫器均可與在一些實施態樣中，細胞收集器和/或細胞處理系統是基於膜的 細胞收集器。在一些實施態樣中，細胞收穫係經由細胞處理系統，諸如LOVO系統(Fresenius Kabi所產製)術語“LOVO細胞處理系統”還指由任何供應商製造的任何儀器或裝置，其可以在無菌和/或封閉系統環境中泵送包含細胞的溶液通過膜或過濾器，例如旋轉膜或旋轉過濾器，允許連續流動和細胞處理以去除上清液或細胞培養基而不造粒。在一些實施態樣中，細胞收集器和/或細胞處理系統可以進行細胞分離，在封閉的無菌系統中進行洗滌，流體交換，濃縮和/或其他細胞處理步驟。
在一些實施態樣中，收穫物，例如，根據圖27的步驟E，是從封閉系統生物反應器進行的。在一些實施態樣中，如本文所述，採用封閉系統進行TIL擴增。在一些實施態樣中，在一些實施態樣中，所用的單個生物反應器是例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施態樣中，封閉系統生物反應器是單個生物反應器。
F. 步驟F：最終調製/轉移至輸注袋
在如圖27中的示例性順序和如上文和本文詳述的步驟中提供的步驟A至E完成後，將細胞轉移至容器以用於對患者給藥。在一些實施態樣中，一旦治療足夠使用上述擴增方法獲得TIL的數量，將它們轉移到用於給患者施用的容器中。
在一個實施態樣中，使用本公開的APC擴增的TIL作為醫藥組成物施用於患者。在一個實施態樣中， 醫藥組成物是TIL在無菌緩衝液中的懸浮液。使用本公開的PBMC擴增的TIL可以通過本領域已知的任何合適的途徑施用。在一些實施態樣中，T細胞作為單次動脈內或靜脈內輸注施用，其優選持續約30至60分鐘。其他合適的給藥途徑包括腹膜內，鞘內和淋巴管內。
1. 藥物組成物、劑量和給藥方案
在一個實施態樣中，使用本公開內容的方法擴增的TIL作為醫藥組成物施用於患者。在一個實施態樣中，醫藥組成物是TIL在無菌緩衝液中的懸浮液。使用本公開的PBMC擴增的TIL可以通過本領域已知的任何合適的途徑施用。在一些實施態樣中，T細胞作為單次動脈內或靜脈內輸注施用，其優選持續約30至60分鐘。其他合適的給藥途徑包括腹膜內，鞘內和淋巴管內給藥。
可以施用任何合適劑量的TIL。在一些實施態樣中，施用約2.3×1010至約13.7×1010 TIL，平均約7.8×10 10 TIL，特別是如果癌是黑色素瘤。在一個實施態樣中，施用約1.2×1010至約4.3×1010的TIL。在一些實施態樣中，施用約3×1010至約12×1010個TIL。在一些實施態樣中，施用約4×1010至約10×1010個TIL。在一些實施態樣中，施用約5×1010至約8×1010TIL。在一些實施態樣中，施用約6×1010至約8×1010個TIL。在一些實施態樣中，施用約7×1010至約8×1010TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量為約2.3×1010至約13.7×1010。在一些實施態樣中，治療有 效劑量為約7.8×10 10 TIL，特別是癌症是黑色素瘤。在一些實施態樣中，治療有效劑量為約1.2×1010至約4.3×1010的TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量為約3×1010至約12×1010TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量為約4×1010至約10×1010TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量為約5×1010至約8×1010TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量為約6×1010至約8×1010TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量為約7×1010至約8×1010TIL。
在一些實施態樣中，本發明的醫藥組成物中提供的TIL的數量為約1×106,2×106,3×106,4×106,5×106,6×106,7×106,8×106,9×106,1×107,2×107,3×107,4×107,5×107,6×107,7×107,8×107,9×107,1×108,2×108,3×108,4×108,5×108,6×108,7×108,8×108,9×108,1×109,2×109,3×109,4×109,5×109,6×109,7×109,8×109,9×109,1×1010,2×1010,3×1010,4×1010,5×1010,6×1010,7×1010,8×1010,9×1010,1×1011,2×1011,3×1011,4×1011,5×1011,6×1011,7×1011,8×1011,9×1011,1×1012,2×1012,3×1012,4×1012,5×1012,6×1012,7×1012,8×1012,9×1012,1×1013,2×1013,3×1013,4×1013,5×1013,6×1013,7×1013,8×1013和9×1013。在一個實施方案中，本發明的藥物組合物中提供的TIL的數量在以下範圍內：1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012、及5×1012至1×1013。
在一些實施態樣中，本發明的醫藥組成物中提供的TIL的濃度是小於醫藥組成物的，例如，100%，90%，80%，70%，60%，50%，40%，30%，20%，19%，18%，17%，16%，15%，14%，13%，12%，11%，10%，9%，8%，7%，6%，5%，4%，3%，2%，1%，0.5%，0.4%，0.3%，0.2%，0.1%，0.09%，0.08%，0.07%，0.06%，0.05%，0.04%，0.03%，0.02%，0.01%，0.009%，0.008%，0.007%，0.006%，0.005%，0.004%，0.003%，0.002%，0.001%，0.0009%，0.0008%，0.0007%，0.0006%，0.0005%，0.0004%，0.0003%0.0002%或0.0001%w/w，w/v或v/v。
在一些實施態樣中，本發明的醫藥組成物中提供的TIL的濃度大於90%，80%，70%，60%，50%，40%，30%，20%，19.75%，19.50%，19.25%19%，18.75%，18.50%，18.25%18%，17.75%，17.50%，17.25%17%，16.75%，16.50%，16.25%16%，15.75%，15.50%，15.25%15%，14.75%，14.50%，14.25%14%，13.75%，13.50%，13.25%13%，12.75%，12.50%，12.25%12%，11.75%，11.50%，11.25%11%，10.75%，10.50%，10.25%10%，9.75%，9.50%，9.25%9%，8.75%，8.50%，8.25%8%，7.75%，7.50%，7.25%7%，6.75%，6.50%，6.25%6%，5.75%，5.50%，5.25%5%，4.75%，4.50%，4.25%，4%，3.75%，3.50%，3.25%，3%，2.75%，2.50%，2.25%，2%，1.75%，1.50%， 125%，1%，0.5%，0.4%，0.3%，0.2%，0.1%，0.09%，0.08%，0.07%，0.06%，0.05%，0.04%，0.03%，0.02%，0.01%，0.009%，0.008%，0.007%，0.006%，0.005%，0.004%，0.003%，0.002%，0.001%，0.0009%，0.0008%，0.0007%，0.0006%，0.0005%，0.0004%，0.0003%，醫藥組成物的0.0002%或0.0001%w/w，w/v或v/v。
在一些實施態樣中，本發明的醫藥組成物中提供的TIL的濃度為約0.0001%至約50%，約0.001%至約40%，約0.01%至約30%，約0.02%至約29%，約0.03%至約28%，約0.04%至約27%，約0.05%至約26%，約0.06%至約25%，約0.07%至約24%，約0.08%至約23%，約0.09%至約22%，約0.1%至約21%，約0.2%至約20%，約0.3%至約19%，約0.4%至約18%，約0.5%至約17%，約0.6%至約16%，約0.7%至約15%，約0.8%至約14%，約0.9%至約12%或約1%至約10%w/w，w/v或v/v醫藥組成物。
在一些實施態樣中，本發明的醫藥組成物中提供的TIL的濃度為約0.001%至約10%，約0.01%至約5%，約0.02%至約4.5%，約0.03%至約4%，約0.04%至約3.5%，約0.05%至約3%，約0.06%至約2.5%，約0.07%至約2%，約0.08%至約1.5%，約0.09%醫藥組成物的含量為約1%，約0.1%至約0.9%w/w，w/v或v/v。
在一些實施態樣中，本發明的醫藥組成物中提供的TIL的量等於或小於10g，9.5g，9.0g，8.5g， 8.0g，7.5g，7.0g，6.5g，6.0g，5.5g，5.0g，4.5g，4.0g，3.5g，3.0g，2.5g，2.0g，1.5g，1.0g，0.95g，0.9g，0.85g，0.8g，0.75g，0.7g，0.65g，0.6g，0.55g，0.5g，0.45g，0.4g，0.35g，0.3g，0.25g，0.2g，0.15g，0.1g，0.09g，0.08g，0.07g，0.06g，0.05g，0.04g，0.03g，0.02g，0.01g，0.009g，0.008g，0.007g，0.006g，0.005g，0.004g，0.003g，0.002g，0.001g，0.0009g，0.0008g，0.0007g，0.0006g，0.0005g，0.0004g，0.0003g，0.0002g，或0.0001g。
在一些實施態樣中，本發明的醫藥組成物中提供的TIL的量大於0.0001g，0.0002g，0.0003g，0.0004g，0.0005g，0.0006g，0.0007g，0.0008g，0.0009g，0.001g，0.0015g，0.002g，0.0025g，0.003g，0.0035g，0.004g，0.0045g，0.005g，0.0055g，0.006g，0.0065g，0.007g，0.0075g，0.008g，0.0085g，0.009g，0.0095g，0.01g，0.015g，0.02g，0.025g，0.03g，0.035g，0.04g，0.045g，0.05g，0.055g，0.06g，0.065g，0.07g，0.075g，0.08g，0.085g，0.09g，0.095g，0.1g，0.15g，0.2g，0.25g，0.3g，0.35g，0.4g，0.45g，0.5g，0.55g，0.6g，0.65g，0.7g，0.75g，0.8g，0.85g，0.9g，0.95g，1g，1.5g，2g，2.5,3g，3.5,4g，4.5g，5g，5.5g，6g，6.5g，7g，7.5gg，8g，8.5g，9g，9.5g或10g。
本發明的醫藥組成物中提供的TIL在寬劑量範圍內是有效的。確切的劑量取決於給藥途徑，給藥化合 物的形式，待治療對象的性別和年齡，待治療對象的體重，以及主治醫師的偏好和經驗。如果合適，也可以使用臨床確定的TIL劑量。使用本文方法施用的醫藥組成物的量，例如TIL的劑量，將取決於所治療的人或哺乳動物，病症或病症的嚴重程度，施用率，活性藥物成分的處置。以及處方醫師的自由裁量權。
在一些實施態樣中，TIL可以單劑量施用。這種給藥可以通過注射，例如靜脈內注射。在一些實施態樣中，TIL可以多劑量施用。給藥可以是每年一次，兩次，三次，四次，五次，六次或六次以上。給藥可以是每月一次，每兩週一次，每週一次，或每隔一天一次。只要有必要，TIL的管理可以繼續。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量為約1×106,2×106,3×106,4×106,5×106,6×106,7×106,8×106,9×106，1×107,2×107,3×107,4×107,5×107,6×107,7×107,8×107,9×107,1×108,2×108,3×108,4×108,5×108,6×108,7×108,8×108,9×108,1×109,2×109,3×109,4×109,5×109,6×109,7×109,8×109,9×109,1×1010,2×1010,3×1010,4×1010,5×1010,6×1010,7×1010,8×1010,9×1010,1×1011,2×1011,3×1011,4×1011,5×1011,6×1011,7×1011,8×1011,9×1011,1×1012,2×1012,3×1012,4×1012,5×1012,6×1012,7×1012,8×1012,9×1012,1×1013,2×1013,3×1013,4×1013,5×1013,6×1013,7×1013,8×1013和9×1013。在一些實施態樣中，TIL的有效劑量在1×10 6至5×106,5×106至1×107,1×107至5×107,5×107至1×108,1×108至1×10 4的範圍內。5×108, 5×108至1×109,1×109至5×109,5×109至1×1010,1×1010至5×1010,5×1010至1×1011,5×1011至1×1012,1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量為約0.01mg/kg至約4.3mg/kg，約0.15mg/kg至約3.6mg/kg，約0.3mg/kg至約3.2mg。/kg，約0.35mg/kg至約2.85mg/kg，約0.15mg/kg至約2.85mg/kg，約0.3mg至約2.15mg/kg，約0.45mg/kg至約1.7mg/kg，約0.15mg/kg至約1.3mg/kg，約0.3mg/kg至約1.15mg/kg，約0.45mg/kg至約1mg/kg，約0.55mg/kg至約0.85mg/kg，約0.65mg/kg至約0.8mg/kg，約0.7mg/kg至約0.75mg/kg，約0.7mg/kg至約2.15mg/kg，約0.85mg/kg至約2mg/kg，約1mg/kg至約1.85mg/kg，約1.15mg/kg至約1.7mg/kg，約1.3mg/kgmg至約1.6mg/kg，約1.35mg/kg至約1.5mg/kg，約2.15mg/kg至約約3.6mg/kg，約2.3mg/kg至約3.4mg/kg，約2.4mg/kg至約3.3mg/kg，約2.6mg/kg至約3.15mg/kg，約2.7mg/kg至約3mg/kg。mg/kg，約2.8mg/kg至約3mg/kg，或約2.85mg/kg至約2.95mg/kg。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量為約1mg至約500mg，約10mg至約300mg，約20mg至約250mg，約25mg至約200mg，約1mg至約50mg，約5mg至約45mg，約10mg至約40mg，約15mg至約35mg，約20mg至約30mg，約23mg至約28mg，約50mg約150mg，約60mg至約140mg，約70mg至約130mg，約80mg至約120mg，約 90mg至約110mg，或約95mg至約105mg，約98mg至約約102mg，約150mg至約250mg，約160mg至約240mg，約170mg至約230mg，約180mg至約220mg，約190mg至約210mg，約195mg至約205mg mg，或約198至約207mg。
有效量的TIL可以通過任何可接受的具有類似用途的藥劑的給藥方式以單劑量或多劑量給藥，包括鼻內和透皮途徑，通過動脈內注射，靜脈內，腹膜內，腸胃外，肌內，皮下，局部，移植或吸入。
G. 任選的細胞存活性分析
任選地，可以使用本領域已知的標準測定法在步驟B第一次擴增後進行細胞活力測定。例如，可以對大量TIL的樣品進行錐藍質排除測試，其選擇性地標記死細胞並允許活力評估。用於測試活力的其他測定可包括但不限於Alamar藍測定；和MTT測定。
1. 細胞計數、存活性、流動式細胞測量術
在一些實施態樣中，測量細胞計數和/或活力。標記物(例如但不限於CD3，CD4，CD8和CD56)以及本文公開或描述的任何其他標誌物的表現可以通過流式細胞術用抗體測量，例如但不限於可從BD Bio-商購的那些。科學(BD Biosciences，San Jose，CA)使用FACSCantoTM流式細胞儀(BD Biosciences)。可以使用一次性c-芯片血細胞計數器(VWR，Batavia，IL)手動計數細 胞，並且可以使用本領域已知的任何方法評估活力，包括但不限於台盼藍染色。
在一些情況下，可以使用下面討論的方案立即冷凍保存大量TIL群體。或者，可以對大量TIL群體進行REP，然後如下所述進行冷凍保存。類似地，在將遺傳修飾的TIL用於治療的情況下，可以對大量或REP TIL群體進行遺傳修飾以進行合適的處理。
2. 細胞培養
在一個實施態樣中，用於擴增TIL的方法可包括使用約5,000mL至約25,000mL的細胞培養基，約5,000mL至約10,000mL的細胞培養基，或約5,800mL至約8,700mL的細胞培養基。在一個實施態樣中，擴增TIL的數量使用不超過一種類型的細胞培養基。可以使用任何合適的細胞培養基，例如AIM-V細胞培養基(L-谷氨醯胺，50μM硫酸鏈黴素和10μM硫酸慶大霉素)細胞培養基(Invitrogen，Carlsbad CA)。在這方面，本發明的方法有利地減少了擴增TIL數量所需的培養基量和培養基類型的數量。在一個實施態樣中，擴增TIL的數量可以包括不僅每三或四天將新鮮細胞培養基添加到細胞(也稱為餵養細胞)。擴大透氣容器中的細胞數量簡化了通過降低擴增細胞所需的進料頻率來擴大細胞數量所需的程序。
在一個實施態樣中，第一和/或第二透氣性容器中的細胞培養基未經過濾。使用未過濾的細胞培養基 可以簡化擴增細胞數量所需的程序。在一個實施態樣中，第一和/或第二透氣性容器中的細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME)。
在一個實施態樣中，所述方法的持續時間包括從哺乳動物獲得腫瘤組織樣品；在含有細胞培養基的第一透氣性容器中培養腫瘤組織樣品；從腫瘤組織樣品中獲得TIL；使用aAPC在其中含有細胞培養基的第二透氣性容器中擴增TIL的數量持續約14至約42天，例如約28天。
在一個實施態樣中，TIL在透氣容器中擴增。使用本領域已知的方法，組合物和裝置，包括在美國專利申請公開No.2005/0106717A1中描述的那些，使用PBMC來擴增TIL的氣體可滲透容器，其公開內容通過引用併入本文。在一個實施態樣中，TIL在透氣袋中擴增。在一個實施態樣中，使用細胞擴增系統擴增TIL，所述細胞擴增系統擴增透氣袋中的TIL，例如Xuri細胞擴增系統W25(GE Healthcare)。在一個實施態樣中，使用細胞擴增系統擴增TIL，所述細胞擴增系統擴增透氣袋中的TIL，例如WAVE生物反應器系統，也稱為Xuri細胞擴增系統W5(GE Healthcare)。在一個實施態樣中，細胞擴增系統包括透氣性細胞袋，其體積選自約100mL，約200mL，約300mL，約400mL，約500mL，約600mL，約700mL，約800mL，約900mL，約1L，約2L，約3L，約4L，約5L，約6L，約7L，約8L，約9L和約10L。在一個實施態樣中，TIL可以在G-Rex燒瓶中擴增(可從Wilson Wolf Manufacturing商購獲得)。這些實施態樣允許細胞群從約5×10 5個細胞/cm 2擴增至10×10 6個細胞/cm 2/10×10 6個細胞/cm 2。在一個實施態樣中，在不向細胞添加新鮮細胞培養基的情況下進行該擴增(也稱為餵養細胞)。在一個實施態樣中，只要介質在G-Rex燒瓶中位於約10cm的高度，就不進料。在一個實施態樣中，這是在沒有餵食但是添加一種或多種細胞因子的情況下。在一個實施態樣中，細胞因子可以作為推注添加而無需將細胞因子與培養基混合。此類容器，裝置和方法在本領域中是已知的並且已經用於擴增TIL，並且包括在美國專利申請公開No.US2014/0377739A1，國際公佈No.WO2014/210036A1，美國專利申請公開中描述的那些。US2013/0115617A1，國際公佈No.WO2013/188427A1，美國專利申請公開No.US2011/0136228A1，美國專利No.US8,809,050B2，國際公開No.WO2011/072088A2，美國專利申請公開號US 2016/0208216 A1，美國專利申請公開號US2012/0244133A1，國際公開號WO2012/129201A1，美國專利申請公開號US2013/0102075A1，美國專利號US8,956,860。B2，國際公開號WO2013/173835A1，美國專利申請公開號US2015/0175966A1，其公開內容通過引用併入本文。Jin等人，J.Immunotherapy，2012,35：283-292中也描述了這些方法。TIL的可選基因工程。
在一些實施態樣中，TIL任選地經遺傳工程改造以包括額外的功能，包括但不限於高親和力T細胞受 體(TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原(例如MAGE)的TCR。-1，HER2或NY-ESO-1，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或譜系限制性細胞表面分子(例如CD19)結合的嵌合抗原受體(CAR)。
H. TIL的隨意之冷凍保存
如上所述，並且如圖27中提供的步驟A至E中舉例說明的，冷凍保存可以在整個TIL擴增過程中的許多點發生。在一些實施態樣中，可以冷凍保存第二次擴增後擴增的TIL群(例如，根據圖27的步驟D提供)。通常可以通過將TIL群體置於冷凍溶液中來完成冷凍保存，例如85%補體滅活的AB血清和15%二甲基亞碸(DMSO)。將溶液中的細胞置於低溫小瓶中並在-80℃下儲存24小時，任選轉移至氣態氮冷凍箱進行冷凍保存。參見Sadeghi等，Acta Oncologica 2013,52,978-986。在一些實施態樣中，TIL在5%DMSO中冷凍保存。在一些實施態樣中，TIL在細胞培養基加5%DMSO中冷凍保存。在一些實施態樣中，根據實施例8和9中提供的方法冷凍保存TIL。
適當時，將細胞從冰箱中取出並在37℃水浴中解凍，直至解凍約4/5的溶液。通常將細胞重懸於完全培養基中並任選洗滌一次或多次。在一些實施態樣中，可以計數解凍的TIL並評估本領域已知的生存力。
I. 經擴增之TIL的表型特徵分析
在一些實施態樣中，分析TIL在擴增後表現多種表型標誌物，包括本文和實施例中描述的那些。在一個實施態樣中，檢查一種或多種表型標誌物的表現。在一些實施態樣中，在步驟B中的第一次擴增後分析TIL的表型特徵。在一些實施態樣中，在步驟C的轉變期間分析TIL的表型特徵。在一些實施態樣中，TIL的表型特徵是根據步驟C和冷凍保存後的過渡期間進行分析。在一些實施態樣中，根據步驟D在第二次擴增後分析TIL的表型特徵。在一些實施態樣中，根據步驟D在兩次或更多次擴增後分析TIL的表型特徵。在一些實施態樣中，標記物是選自TCRab(即TCRα/β)，CD57，CD28，CD4，CD27，CD56，CD8a，CD45RA，CD8a，CCR7，CD4，CD3，CD38和HLA-DR。在一些實施態樣中，標誌物選自TCRab(即TCRα/β)，CD57，CD28，CD4，CD27，CD56和CD8a。在一個實施態樣中，標誌物選自CD45RA，CD8a，CCR7，CD4，CD3，CD38和HLA-DR。在一些實施態樣中，檢查一種，兩種，三種，四種，五種，六種，七種，八種，九種，十種，十一種，十二種，十三種或十四種標記物的表現。在一些實施態樣中，檢查來自每組的一種或多種標誌物的表現。在一些實施態樣中，與解凍的TIL相比，新鮮TIL中維持HLA-DR，CD38和CD69表現中的一種或多種(即，未顯示統計學上顯著的差異)。在一些實施態樣中，TIL的活化狀態在解凍的TIL中維持。
在一個實施態樣中，測量一種或多種調節標 誌物的表現。在一些實施態樣中，調節標誌物選自CD137，CD8a，Lag3，CD4，CD3，PD-1，TIM-3，CD69，CD8a，TIGIT，CD4，CD3，KLRG1和CD154。在一些實施態樣中，調節標誌物選自CD137，CD8a，Lag3，CD4，CD3，PD-1和TIM-3。在一些實施態樣中，調節標誌物選自CD69，CD8a，TIGIT，CD4，CD3，KLRG1和CD154。在一些實施態樣中，與新鮮TIL相比，在解凍的TIL中調節分子表現降低。在一些實施態樣中，與新鮮TIL相比，在解凍的TIL中調節分子LAG-3和TIM-3的表現降低。在一些實施態樣中，CD4，CD8，NK，TCRαβ表現沒有顯著差異。在一些實施態樣中，與解凍的TIL相比，新鮮TIL中CD4，CD8，NK，TCRαβ表現和/或記憶標誌物沒有顯著差異。在一些實施態樣中，通過本文提供的方法產生的TIL之間的CD4，CD8，NK，TCRαβ表現沒有顯著差異，如例如圖27中所例示的，和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL。例如，除了圖27中所示的方法之外的方法。
在一些實施態樣中，沒有選擇第一TIL群體，第二TIL群體，第三TIL群體，收穫的TIL群體和/或基於CD4，CD8和/或NK的治療性TIL群體，TCRαβ表現在一些實施態樣中，不進行基於CD4，CD8和/或NK，TCRαβ的第一TIL群體的選擇，在任何步驟中進行，包括上述步驟或如圖27中所提供的那些步驟。在一些實施態樣中，不進行基於CD4，CD8和/或NK的第二TIL群體的選擇， TCRαβ表現。在一些實施態樣中，不進行基於CD4，CD8和/或NK的第三TIL群體的選擇，TCRαβ表現。在一些實施態樣中，不進行基於CD4，CD8和/或NK的TIL的收穫群體的選擇，TCRαβ表現。在一些實施態樣中，不進行基於CD4，CD8和/或NK的TIL治療群體的選擇，TCRαβ表現。
在一實施態樣中，在步驟(a)至(f)用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)為治療性TIL族群之方法的任何步驟中，未進行基於CD4、CD8、和/或NK、TCRαβ表現的第一TIL族群、第二TIL族群、第三TIL族群、或收獲TIL族群的選擇，包括：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自該患者所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第 二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其包含效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞的次族群增加(相對於該第二TIL族群)，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生。
在一實施態樣中，在步驟(a)至(h)用於治療癌個體之方法的任何步驟中，未進行基於CD4、CD8、和/或NK、TCRαβ表現的第一TIL族群、第二TIL族群、第三TIL族群、或收獲TIL族群的選擇，該方法包含投予擴增之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，包括：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自個體所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族 群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其包含效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞的次族群增加(相對於該第二TIL族群)，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生；(g)使用冷凍保存程序隨意地冷凍保存該輸注袋之步 驟，該輸注袋包含來自步驟(f)之該經收獲之TIL族群；以及(h)將自步驟(g)中該輸注袋的治療有效劑量之該第三TIL族群投予該患者。
在一些實施態樣中，記憶標誌物選自CCR7和CD62L
在一些實施態樣中，與解凍的TIL相比，新鮮TIL的存活率為至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或至少98%。在一些實施態樣中，新鮮和解凍的TIL的存活率大於70%，大於75%，大於80%，大於85%，大於90%，大於95%或大於98%。在一些實施態樣中，新鮮和解凍產物的存活率大於80%，大於81%，大於82%，大於83%，大於84%，大於85%，大於86%，更大比87%，大於88%，大於89%或大於90%。在一些實施態樣中，新鮮和解凍產物的存活率均大於86%。
在一個實施態樣中，還可以使用細胞因子釋放測定來評估再刺激的TIL的細胞因子釋放。在一些實施態樣中，可以響應於用OKT3刺激或與自體腫瘤消化共培養來評估TIL的干擾素-7(IFN-7)分泌。例如，在採用OKT3刺激的實施態樣中，TIL被廣泛洗滌，並且在96孔平底板中用1×10 5個細胞在0.2mL CM中製備複製孔，所述96孔平底板預塗有0.1或1.0μg/mL用磷酸鹽稀釋的OKT3-緩衝鹽水。孵育過夜後，收穫上清液，通過ELISA(Pierce/Endogen，Woburn，MA)測量上清液中的IFN-7。 對於共培養測定，將1x10 5個TIL細胞置於具有自體腫瘤細胞的96孔板中。(1：1的比例)。孵育24小時後，收穫上清液並可以定量IFN-7釋放，例如通過ELISA。
細胞表面生物標誌物的流式細胞術分析：將TIL樣品等分用於細胞表面標誌物的流式細胞術分析，參見實施例7,8和9。
在一些實施態樣中，正在評估TIL的各種調節標誌物。在一些實施態樣中，調節標誌物選自TCRα/β，CD56，CD27，CD28，CD57，CD45RA，CD45RO，CD25，CD127，CD95，IL-2R，CCR7，CD62L，KLRG1和CD122。在一些實施態樣中，調節標誌物是TCRα/β。在一些實施態樣中，調節標誌物是CD56。在一些實施態樣中，調節標誌物是CD27。在一些實施態樣中，調節標記是CD28。在一些實施態樣中，調節標記是CD57。在一些實施態樣中，調節標誌物是CD45RA。在一些實施態樣中，調節標記是CD45RO。在一些實施態樣中，調節標誌物是CD25。在一些實施態樣中，調節標誌物是CD127。在一些實施態樣中，調節標誌物是CD95。在一些實施態樣中，調節標誌物是IL-2R。在一些實施態樣中，調節標誌物是CCR7。在一些實施態樣中，調節標誌物是CD62L。在一些實施態樣中，調節標誌物是KLRG1。在一些實施態樣中，調節標記是CD122。
在一個實施態樣中，分析擴增的TIL的多種表型標誌物的表現，包括本文和實施例中描述的那些。在 一個實施態樣中，檢查一種或多種表型標誌物的表現。在一些實施態樣中，標誌物選自TCRab(即TCRα/β)，CD57，CD28，CD4，CD27，CD56，CD8a，CD45RA，CD8a，CCR7，CD4，CD3，CD38和HLA-DR。。在一些實施態樣中，標誌物選自TCRab(即TCRα/β)，CD57，CD28，CD4，CD27，CD56和CD8a。在一個實施態樣中，標誌物選自CD45RA，CD8a，CCR7，CD4，CD3，CD38和HLA-DR。在一些實施態樣中，檢查一種，兩種，三種，四種，五種，六種，七種，八種，九種，十種，十一種，十二種，十三種或十四種標記物的表現。在一些實施態樣中，檢查來自每組的一種或多種標誌物的表現。在一些實施態樣中，與解凍的TIL相比，新鮮TIL中維持HLA-DR，CD38和CD69表現中的一種或多種(即，未顯示統計學上顯著的差異)。在一些實施態樣中，TIL的活化狀態在解凍的TIL中維持。
在一個實施態樣中，測量一種或多種調節標誌物的表現。在一些實施態樣中，調節標誌物選自CD137，CD8a，Lag3，CD4，CD3，PD1，TIM-3，CD69，CD8a，TIGIT，CD4，CD3，KLRG1和CD154。在一些實施態樣中，調節標誌物選自CD137，CD8a，Lag3，CD4，CD3，PD1和TIM-3。在一些實施態樣中，調節標誌物選自CD69，CD8a，TIGIT，CD4，CD3，KLRG1和CD154。在一些實施態樣中，與新鮮TIL相比，在解凍的TIL中調節分子表現降低。在一些實施態樣中，與新鮮TIL 相比，在解凍的TIL中調節分子LAG-3和TIM-3的表現降低。在一些實施態樣中，CD4，CD8，NK，TCRαβ表現沒有顯著差異。在一些實施態樣中，與解凍的TIL相比，新鮮TIL中CD4，CD8，NK，TCRαβ表現和/或記憶標誌物沒有顯著差異。
在一些實施態樣中，記憶標誌物選自CCR7和CD62L。
在一些實施態樣中，與解凍的TIL相比，新鮮TIL的存活率為至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或至少98%。在一些實施態樣中，新鮮和解凍的TIL的存活率大於70%，大於75%，大於80%，大於85%，大於90%，大於95%或大於98%。在一些實施態樣中，新鮮和解凍產物的存活率大於80%，大於81%，大於82%，大於83%，大於84%，大於85%，大於86%，更大比87%，大於88%，大於89%或大於90%。在一些實施態樣中，新鮮和解凍產物的存活率均大於86%。
在一個實施態樣中，還可以使用細胞因子釋放測定來評估再刺激的TIL的細胞因子釋放。在一些實施態樣中，可以響應於用OKT3刺激或與自體腫瘤消化共培養來評估TIL的干擾素-7(IFN-7)分泌。例如，在採用OKT3刺激的實施態樣中，TIL被廣泛洗滌，並且在96孔平底板中用1×10 5個細胞在0.2mL CM中製備複製孔，所述96孔平底板預塗有0.1或1.0μg/mL用磷酸鹽稀釋的OKT3-緩衝鹽水。孵育過夜後，收穫上清液，通過ELISA (Pierce/Endogen，Woburn，MA)測量上清液中的IFN-7。對於共培養測定，將1x10 5個TIL細胞置於具有自體腫瘤細胞的96孔板中。(1：1的比例)。孵育24小時後，收穫上清液並可以定量IFN-7釋放，例如通過ELISA。
在一些實施態樣中，在冷凍保存後檢查表型表徵。
J. 經擴增之TIL的代謝健康
與新鮮收穫的TIL和/或解凍後的TIL相比，再刺激的TIL的特徵在於基礎醣解的顯著增強。在一個實施態樣中，在任何步驟(包括上文討論的那些步驟或步驟)期間，不進行第一TIL群體，第二TIL群體，第三TIL群體，收穫的TIL群體和/或基於CD8表現的治療性TIL群體的選擇。例如，如圖27中所提供的。在一些實施態樣中，不進行基於CD8表現的第一TIL群體的選擇。在一些實施態樣中，不進行基於CD8表現的第二TIL群體的選擇。在一些實施態樣中，不進行基於CD8表現的第三TIL群體的選擇。在一些實施態樣中，不進行基於CD8表現的TIL的收穫群體的選擇。在一些實施態樣中，不進行基於CD8表現的TIL治療群體的選擇。
在一實施態樣中，在步驟(a)至(f)用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)為治療性TIL族群之方法的任何步驟中，未進行基於CD8表現的第一TIL族群、第二TIL族群、第三TIL族群、或收獲TIL族群的選擇，包括： (a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自該患者所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其包含效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞的次族群增加(相對於該第二TIL族群)，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發 生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生。
在一實施態樣中，在步驟(a)至(h)用於治療具有癌之個體之方法的任何步驟中，未進行基於CD8表現的第一TIL族群、第二TIL族群、第三TIL族群、或收獲TIL族群的選擇，該方法包含投予經擴增之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，包括：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自個體所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增 係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其包含效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞的次族群增加(相對於該第二TIL族群)，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生；(g)使用冷凍保存程序隨意地冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含來自步驟(f)之該經收獲之TIL族群；以及(h)將自步驟(g)中該輸注袋的治療有效劑量之該第三TIL族群投予該患者。
通過本文所述方法製備的TIL的特徵在於，與例如使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL相比，基礎醣解顯著增強，包括例如除了那些之外的方法。在一個實施態樣中，在任何步驟中，不包括選擇第一TIL群體，第二TIL群體，第三TIL群體，收穫的TIL群體和/或基於CD8表現的治療性TIL群 體，包括在一些實施態樣中，不進行基於CD8表現的第一TIL群體的選擇。在一些實施態樣中，不進行基於CD8表現的第一TIL群體的選擇。在一些實施態樣中，不進行基於CD8表現的第二TIL群體的選擇。在一些實施態樣中，不進行基於CD8表現的第三TIL群體的選擇。在一些實施態樣中，不進行基於CD8表現的TIL的收穫群體的選擇。在一些實施態樣中，不進行基於CD8表現的TIL治療群體的選擇。在一個實施態樣中，在步驟(a)至(h)的任何步驟中，不進行第一TIL群體，第二TIL群體，第三TIL群體或基於CD8表現的收穫TIL群體的選擇。
可以評估用本公開的不同方法擴增的TIL的備用呼吸能力(SRC)和醣解儲備。Seahorse XF細胞Mito壓力測試通過使用針對粒線體中電子傳遞鏈組分的呼吸調節劑直接測量細胞的耗氧率(OCR)來測量粒線體功能。連續注射測試化合物(寡黴素，FCCP，以及魚藤酮和抗黴素A的混合物，如下所述)以分別測量ATP產生，最大呼吸和非粒線體呼吸。然後使用這些參數和基礎呼吸計算質子洩漏和備用呼吸能力。每個調製器靶向電子傳遞鏈的特定組分。Oligomycin抑制ATP合酶(複合物V)，注射寡黴素後OCR的減少與細胞ATP產生相關的粒線體呼吸相關。羰基氰-4(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)是一種解偶聯劑，它會破壞質子梯度並破壞粒線體膜電位。結果，通過電子傳輸鏈的電子流不受抑制，並且複合物IV最大程度地消耗氧。然後，FCCP刺激的OCR可用於計算備用呼吸容量，定義為 最大呼吸和基礎呼吸之間的差異。備用呼吸能力(SRC)是細胞響應增加的能量需求的能力的量度。第三次注射是複合物I抑制劑魚藤酮和復合物III抑制劑抗黴素A的混合物。這種組合可以關閉粒線體呼吸，並能夠計算由粒線體外的過程驅動的非粒線體呼吸。在一些實施態樣中，比較是，例如，使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL，包括例如除圖27中體現的方法之外的方法。
在一些實施態樣中，代謝測定是基礎呼吸。通常，第二次擴張TIL的基礎呼吸率至少為50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸率的85%，至少90%，至少95%，至少97%，至少98%或至少99%，包括在一些實施態樣中，基礎呼吸率是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約50%至約99%。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是使用除提供的那些之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約60%至約99%。這裡包括例如除了圖27中所體現的方法之外的方法。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約70%至約99%，包括例如除圖27中體現的方法之外的方法。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是使用除本文提供的方法之外的其他方法 製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約80%至約99%，包括例如除圖1中體現的方法之外的方法。27.在一些實施態樣中，基礎呼吸率為使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約90%至約99%，包括例如除了在本文中體現的方法之外的方法。圖27.在一些實施態樣中，基礎呼吸率是使用除了其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約95%至約99%。本文提供的那些包括例如除了圖27中體現的那些之外的方法。在一些實施例中，第二擴增TIL或第二附加擴增TIL(例如，圖27的步驟D中描述的那些，包括被稱為TIL的那些)reREP TILs)的基礎呼吸率與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸率無統計學顯著差異，包括例如圖27中所示的方法以外的方法。在一些實施態樣中，比較例如是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL，包括例如除圖27中體現的方法之外的方法。
在一些實施態樣中，代謝測定是備用呼吸能力。通常，第二擴增TIL或第二附加擴增TIL(例如，圖27的步驟D中描述的那些，包括被稱為reREP TIL的TIL)具有至少為50%的備用呼吸容量.，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%，使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的至少 98%或至少99%，包括例如除了圖27中體現的那些之外的方法。在一些實施態樣中，備用呼吸能力是新鮮收穫的TIL的基礎呼吸率的約50%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸能力是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約50%至約99%，包括例如除圖27中體現的方法之外的方法。在一些實施態樣中，備用呼吸能力是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約60%至約99%，包括例如除圖1中體現的方法之外的方法。27.在一些實施態樣中，備用呼吸能力是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約70%至約99%，包括例如除了在本文中體現的方法之外的方法。圖27.在一些實施態樣中，備用呼吸能力為新鮮收穫的TIL的基礎呼吸速率的約80%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸能力是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約90%至約99%，包括例如除圖27中體現的方法之外的方法。在一些實施態樣中，備用呼吸能力是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約95%至約99%，包括例如除圖1中體現的方法之外的方法。在一些實施例中，第二擴增TIL或第二附加擴增TIL(例如，圖27的步驟D中描述的那些，包括被稱為reREP TIL的TIL)具有在統計上不顯著不同的備用呼吸容量。比使用除本文提供的方法之外 的其他方法製備的新收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率，包括例如除了那些之外的方法。如圖27所示。
通常，第二擴增TIL或第二附加擴增TIL(例如，圖27的步驟D中描述的那些，包括被稱為reREP TIL的TIL)具有至少至少至少的備用呼吸容量。50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，，至少75%，至少80%，，至少85%，，至少90%，，至少95%，至少使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸率的97%，至少98%或至少99%，包括例如除圖27中體現的方法之外的方法。在一些實施態樣中，測量的代謝測定是醣解儲備。在一些實施態樣中，代謝測定是備用呼吸能力。為了測量細胞(呼吸)代謝，用粒線體呼吸和醣解抑制劑處理細胞，以確定TIL的代謝特徵，包括以下測量：基線氧化磷酸化(通過OCR測量)，備用呼吸能力，基線醣解活性(如由ECAR測量)和醣解儲備。使用Seahorse組合粒線體/醣解應激測試分析(包括可從Agilent商購的試劑盒)進行代謝譜，其允許確定細胞在阻斷粒線體ATP產生時進行醣解的能力。在一些實施態樣中，細胞缺乏葡萄糖，然後注射葡萄糖，然後注射應激劑。在一些實施態樣中，應激劑選自由寡黴素，FCCP，魚藤酮，抗黴素A和/或2-脫氧葡萄糖(2-DG)組成的組，以及它們的組合。在一些實施態樣中，以10mM加入寡黴素。在一些實施態樣中，FCCP以10mM加入。在一些實施態樣中，魚藤酮以2.5mM加入。在一些實施態樣中，抗黴素A以2.5mM 加入。在一些實施態樣中，以500mM加入2-脫氧葡萄糖(2-DG)。在一些實施態樣中，測量醣解能力，醣解儲備和/或非醣解酸化。一般來說，TILs的醣解儲備至少為50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的至少90%，至少95%，至少97%，至少98%或至少99%，包括例如，在一些實施態樣中，醣解儲備是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約50%至約99%，包括例如，在一些實施態樣中，醣解儲備是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約60%至約99%，包括例如，除了圖27中所體現的方法之外的方法。在一些實施態樣中，糖使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約70%至約99%，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，醣解儲備是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約80%至約99%，包括例如除圖27中體現的方法之外的方法。在一些實施態樣中，醣解儲備是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約90%至約99%，包括例如除圖27中體現的方法之外的方法。在一些實施態樣中，醣解儲備量是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/ 或TIL的基礎呼吸速率的約95%至約99%，包括例如m除了圖27中所示的那些方法之外的方法。
在一些實施態樣中，代謝測定是基礎醣解。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(例如，圖27的步驟D中描述的那些，包括稱為reREP TIL的TIL)基礎醣解增加至少兩倍，在與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備之新鮮收穫的TIL和/或TIL相比，至少三倍，至少四倍，至少五倍，至少六倍，至少七倍，至少八倍，至少九倍或至少十倍，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，第二種擴增TIL或第二種額外的擴增TIL(例如，描述的那些)在圖27的步驟D中，包括稱為reREP TIL的TIL，與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新收穫的TIL和/或TIL相比，基礎醣解增加約2倍至約10倍。例如，除了那些以外的方法在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(例如，圖27的步驟D中描述的那些，包括稱為reREP TIL的TIL)具有約2的基礎醣解增加。與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL相比，折疊至約8倍，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(例如，圖27的步驟D中描述的那些，包括稱為reREP TIL的TIL)與新鮮收穫的TIL和/或TIL相比，基礎醣解增加約3倍至約7倍。使用除本文提供的方法之外的其他方法製備，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施例 中，第二擴增TIL或第二附加擴增TIL(例如，tho)在圖27的步驟D中描述的，包括被稱為reREP TIL的TIL，與使用除提供的那些之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL相比，基礎醣解的增加為約2倍至約4倍。在一些實施例中，第二擴增TIL或第二附加擴增TIL(例如，圖27的步驟D中描述的那些，包括被稱為reREP TIL的TIL)，在一些實施例中，包括例如圖27中所體現的方法。與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL相比，基礎醣解的基礎醣解增加約2倍至約3倍，包括例如除圖27中所示的方法之外的方法。
通常，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(例如，圖27的步驟D中描述的那些，包括稱為reREP TIL的TIL)具有至少50%的醣解儲備，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%，使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的至少98%或至少99%，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，醣解儲備量是新鮮收穫的TIL的基礎呼吸率的約50%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約60%至約99%，包括例如除圖27中體現的方法之外的方法。在一些實施態樣中，醣解儲備是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約70%至約 99%，包括例如除圖27中體現的方法之外的方法。在一些實施態樣中，醣解儲備是使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約80%至約99%，包括例如除圖27中體現的方法之外的方法。在一些實施態樣中，醣解儲備是新鮮收穫的TIL和/或TIL的基礎呼吸速率的約90%至約99%，其使用除了提供的那些之外的其他方法製備。在一些實施態樣中，醣解儲備為新鮮收穫的TIL的基礎呼吸速率的約95%至約99%。
粒酶B產生：粒酶B是TIL殺死靶細胞的能力的另一種量度。如上所述使用針對CD3，CD28和CD137/4-1BB的抗體再刺激的培養基上清液也使用人粒酶B DuoSet ELISA試劑盒(R & D Systems，Minneapolis，MN)根據製造商的評估其顆粒酶B的水平。說明。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二另外的擴增TIL(例如，圖27的步驟D中描述的那些，包括稱為reREP TIL的TIL)具有增加的顆粒酶B產生。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(例如，圖27的步驟D中描述的那些，包括稱為reREP TIL的TIL)具有增加的細胞毒活性。
在一些實施態樣中，端粒長度可用作細胞活力和/或細胞功能的量度。在一些實施態樣中，與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL相比，本發明產生的TIL中的端粒令人驚訝地具有相同的長度，包括例如圖27中所示的方法以外的方法。端粒長度測量：多種方法已被用於測量基因組DNA和細胞學製劑中端粒的長度。 端粒限製片段(TRF)分析是測量端粒長度的金標準(de Lange等，1990)。然而，TRF的主要限制是需要大量的DNA(1.5μg)。用於測量端粒長度的兩種廣泛使用的技術，即熒光原位雜交(FISH；Agilent Technologies，Santa Clara，CA)和定量PCR可用於本發明。在一些實施態樣中，步驟A中初始收穫的TIL與來自例如圖27中提供的步驟D的擴增的TIL之間的端粒長度沒有變化。
在一些實施態樣中，通過IFN-γ(IFN-γ)分泌測量TIL健康。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些實施態樣中，使用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ的產生是細胞毒性潛力的另一種衡量標準。IFN-γ的產生可以通過測定用CD3，CD28和CD137/4-1BB抗體刺激的TIL培養基中細胞因子IFN-γ的水平來測量。來自這些刺激的TIL的培養基中的IFN-γ水平可以通過測量IFN-γ釋放來確定。在一些實施態樣中，與圖27中提供的例如步驟A中的最初收穫的TIL相比，如圖27中TIL所提供的例如步驟D中IFN-γ產生的增加表明步驟D的細胞毒性潛力增加。TIL的。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌增加一倍，兩倍，三倍，四倍或五倍或更多。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌增加兩倍。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施態樣中，使用Quantikine ELISA試劑盒測量IFN-γ。在一些實施態樣中，在體外TIL中測量 IFN-γ。在一些實施態樣中，在體外TIL中測量IFN-γ，包括通過本發明的方法產生的TIL，包括例如圖27的方法，以及新收穫的TIL或通過其他方法產生的那些TIL，例如提供的那些。例如，在圖83中(例如過程1C TIL)。
在一些實施態樣中，根據生物發光重定向裂解測定法(效力測定法)，使用TIL與生物發光細胞系P815(株G6)的共培養測定法評估TIL裂解靶細胞的細胞毒性潛力。TIL測定以高度敏感的劑量依賴性方式測量TIL細胞毒性。
在一些實施態樣中，本方法使用如上所述的方法提供用於評估TIL生存力的測定法。在一些實施態樣中，如上所述擴增TIL，包括例如如圖27中提供的。在一些實施態樣中，在評估生存力之前將TIL冷凍保存。在一些實施態樣中，活力評估包括在進行第一次擴增，第二次擴增和另外的第二次擴增之前解凍TIL。在一些實施態樣中，本方法提供用於評估細胞增殖，細胞毒性，細胞死亡和/或與TIL群體的生存力相關的其他術語的測定法。活力可以通過上述任何TIL代謝測定法以及本領域已知的任何已知用於評估細胞活力的方法來測量。在一些實施態樣中，本發明方法提供用於評估細胞增殖，細胞毒性，細胞死亡和/或與使用本文所述方法擴增的TIL活力相關的其他術語的測定，包括圖27中舉例說明的那些。
本發明還提供了用於確定TIL生存力的測定方法。在一些實施態樣中，與使用除本文提供的方法之外 的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL相比，TIL具有相同的存活力，包括例如除圖27中體現的方法之外的方法。在一些實施態樣中，TIL具有增加的存活力，如與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL相比，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。本公開內容提供了通過將腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)擴增為TIL來測定TIL活力的方法。更多的TILs包括：(i)獲得先前已擴大的第一批TIL；(ii)通過在包含IL-2的細胞培養基中培養第一群TIL進行第一次擴增，以產生第二組TIL；和(iii)通過用另外的IL-2，OKT-3和抗原呈遞細胞(APC)補充第二TIL群體的細胞培養基進行第二次擴增，以產生第三群TIL，其中第三群體TIL的數量至少比第二組TIL高100倍，並且其中第二次擴增進行至少14天以獲得第三TIL群，其中第三群TIL包含增加的亞群相對於第二TIL群體，效應T細胞和/或中樞記憶T細胞，並且其中進一步測定第三群體的存活力。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含：(iv)通過用另外的IL-2，另外的OKT-3和另外的APC補充第三群TIL的細胞培養基進行額外的第二次擴增，其中額外的第二次擴增進行至少14天以獲得TIL的比例大於步驟(iii)中獲得的TIL，其中相對於第三TIL群體，較大的TIL群體包含增加的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞亞群，並且其中第三群體進一步測定可行性。
在一些實施態樣中，在步驟(i)之前，將細胞冷凍保存。
在一些實施態樣中，在進行步驟(i)之前解凍細胞。
在一些實施態樣中，步驟(iv)重複一至四次，以獲得足夠的TIL用於分析。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在約40天至約50天的時間內進行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在約42天至約48天的時間內進行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在約42天至約45天的時間內進行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在約44天內進行。
在一些實施態樣中，來自步驟(iii)或(iv)的細胞以與新鮮收穫的細胞相似的水平表現CD4，CD8和TCRαβ。
在一些實施態樣中，抗原呈遞細胞是外周血單核細胞(PBMC)。
在一些實施態樣中，在步驟(iii)的第9天至第17天中的任何一天將PBMC添加至細胞培養物中。
在一些實施態樣中，步驟(iv)中較大TIL群體中的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞表現出選自CD27表現，CD28表現，較長端粒的一種或多種特徵。相對於第 三細胞群中的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞，CD57表現增加，CD56表現降低。
在一些實施態樣中，效應T細胞和/或中樞記憶T細胞表現出增加的CD57表現和降低的CD56表現。
在一些實施態樣中，APC是人工APC(aAPC)。
在一些實施態樣中，該方法還包括用包含編碼高親和力T細胞受體的核酸的表現載體轉導第一TIL群的步驟。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i)之前。
在一些實施態樣中，該方法還包括用表現載體轉導第一TIL群的步驟，所述表現載體包含編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受體包含與至少一個內結構域融合的單鏈可變片段抗體。T細胞信號分子。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i)之前。
在一些實施態樣中，測定TIL的存活力。
在一些實施態樣中，在冷凍保存後測定TIL的存活力。
在一些實施態樣中，在冷凍保存後和步驟(iv)後測定TIL的存活力。
T和B淋巴細胞的多種抗原受體通過有限但大量基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可 變)，D(多樣性)，J(連接)和C(恆定)，決定免疫球蛋白和T細胞受體(TCR)的結合特異性和下游應用。本發明提供了產生TIL的方法，該TIL表現出並增加T細胞庫的多樣性(有時稱為多株性)。在一些實施態樣中，與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的新鮮收穫的TIL和/或TIL相比，T細胞庫集多樣性的增加相比，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，TILs通過本方法獲得的T細胞譜系多樣性增加。在一些實施態樣中，在第一次擴增中獲得的TIL表現出T細胞庫集多樣性的增加。在一些實施態樣中，多樣性的增加是免疫球蛋白多樣性和/或T細胞受體多樣性的增加。在一些實施態樣中，免疫球蛋白的多樣性在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施態樣中，免疫球蛋白輕鏈中的多樣性存在於免疫球蛋白中。在一些實施態樣中，多樣性在T細胞受體中。在一些實施態樣中，多樣性在選自α，β，γ和δ受體的T細胞受體之一中。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α和/或β的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)β的表現增加。在一些實施態樣中，TCRab的表現(即TCRα/β)增加。
根據本公開內容，一種用於測定TIL的存活力和/或進一步用於施用於受試者的方法。在一些實施態樣中，用於測定腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法包括：(i)獲得第一批TIL；(ii)通過在包含IL-2的細胞培養基中培養第一群TIL進 行第一次擴增，以產生第二組TIL；和(iii)通過用另外的IL-2，OKT-3和抗原呈遞細胞(APC)補充第二TIL群體的細胞培養基進行第二次擴增，以產生第三群TIL，其中第三群體TILs的數量至少比第二代TIL群體高50倍；(iv)收穫，清洗和冷凍保存第三批TIL；(v)將冷凍保存的TIL儲存在低溫下；(vi)解凍第三個TIL群體，以提供解凍的第三個TIL群體；和(vii)通過用IL-2，OKT-3和APC補充第三群體的細胞培養基進行額外的擴增期(有時稱為a)，對部分解凍的第三TIL群體進行額外的第二次擴增。reREP期間至少3天，其中進行第三次擴增以獲得第四種TIL群體，其中將第四種TIL群體中的TIL數量與第三種TIL群體中的TIL數量進行比較以獲得比；(viii)基於步驟(vii)中的比率確定TIL的解凍群體是否適合給予患者；(ix)當第四組TIL中TILs數量與第三組TILs中TILs數量之比確定為大於5時，向患者施用治療有效劑量的解凍第三TIL群體。：步驟(viii)中的1。
在一些實施態樣中，進行額外的擴增期(有時稱為reREP期)，直到第四組TIL中TIL數與第三組TIL中TIL數之比大於50：1。
在一些實施態樣中，足以治療有效劑量的 TIL的數量為約2.3×10 10至約13.7×10 10。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(vii)在約40天至約50天的時間內進行。在一些實施態樣中，步驟(i)至(vii)在約42天至約48天的時間內進行。在一些實施態樣中，步驟(i)至(vii)在約42天至約45天的時間內進行。在一些實施態樣中，步驟(i)至(vii)在約44天內進行。
在一些實施態樣中，來自步驟(iii)或(vii)的細胞以與新鮮收穫的細胞相似的水平表現CD4，CD8和TCRαβ。在一些實施態樣中，細胞是TIL。
在一些實施態樣中，抗原呈遞細胞是外周血單核細胞(PBMC)。在一些實施態樣中，在步驟(iii)的第9天至第17天中的任何一天將PBMC添加至細胞培養物中。
在一些實施態樣中，步驟(iii)或(vii)中較大TIL群體中的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞表現出選自CD27表現，表現的一種或多種特徵。相對於第三細胞群中的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞，CD28，更長的端粒，增加的CD57表現和降低的CD56表現。
在一些實施態樣中，效應T細胞和/或中樞記憶T細胞表現出增加的CD57表現和降低的CD56表現。
在一些實施態樣中，APC是人工APC(aAPC)。
在一些實施態樣中，用包含編碼高親和力T細胞受體的核酸的表現載體轉導第一TIL群的步驟。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i) 之前。
在一些實施態樣中，用表現載體轉導第一TIL群體的步驟，所述表現載體包含編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受體包含與T細胞的至少一個內結構域融合的單鏈可變片段抗體。信號分子。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i)之前。
在一些實施態樣中，在步驟(vii)後測定TIL的存活力。
本公開還提供了用於測定TIL的其他方法。在一些實施態樣中，本公開內容提供了用於測定TIL的方法，其包括：(i)獲得第一批冷凍保存的TIL的一部分；(ii)解凍第一批冷凍保存的TIL的部分；(iii)通過在包含IL-2，OKT-3和抗原呈遞細胞(APC)的細胞培養基中培養第一群TIL的部分進行第一次擴增，進行額外的擴增期(有時稱為reREP)期間至少3天，以產生第二TIL群體，其中將來自第一TIL群體的部分與第二TIL群體進行比較以獲得TIL數量的比率，其中TILs的數量的比率第二個TIL群體中的TILs與第一個TIL群體中TIL的數量大於5：1；(iv)基於步驟(iii)中的比例確定第一TIL群是否適合用於對患者的治療性給藥；(v)確定第一TIL群體適合用於治療性給藥，當第二組 TILs中TILs數量與第一組TILs中TILs數量之比確定為大於5：1時在步驟(iv)中。
在一些實施態樣中，第二TIL群體中TIL數量與第一TIL群體部分中TIL數量的比率大於50：1。
在一些實施態樣中，該方法還包括根據本文提供的任何實施態樣中描述的方法，從步驟(i)進行整個第一冷凍保存的TIL群的擴增。
在一些實施態樣中，該方法還包括將來自步驟(i)的整個第一群冷凍保存的TIL給予患者。
K. 用於TIL製造之封閉系統
本發明提供了在TIL培養過程中封閉系統的用途。這種封閉系統允許防止和/或減少微生物污染，允許使用更少的燒瓶，並且允許降低成本。在一些實施例中，封閉系統使用兩個容器。
這種封閉系統在本領域中是公知的，並且可以在例如以下找到http：//www.fda.gov/cber/guidelines.htm and https：//www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidahces/Blood/ucm076779.htm..
如FDA網站上所提供的，具有無菌方法的封閉系統是已知的並且被很好地描述。請見https：//www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779 .htm、as referenced above and provided in pertinent part below.Introduction
無菌連接裝置(STCD)在兩片相容管之間產生無菌焊接。該程序允許各種容器和管直徑的無菌連接。本指南介紹了使用這些設備的建議做法和程序。本指南未涉及無菌連接設備製造商必須向FDA提交以獲得市場准入或許可的數據或信息。同樣重要的是要注意，根據聯邦食品，藥品和化妝品法案，使用經批准或清除的無菌連接裝置用於未經標籤授權的用途可能會導致該裝置被認為是摻假和貼錯標籤的。
1. FDA建議
建議常規使用經FDA批准的STCD的血液製品製造商應在每种血液製品的標準操作程序(SOP)手冊中納入有關此類用途的信息。這些條目應包括記錄保存，產物跟踪，管焊接品質控制，軟件批次和一次性用品(包括要添加的元素的來源)。品質控制程序應包括每個焊縫完整性的測試。
2. STCD的應用
用戶應該意識到，使用該設備可以創建新產品或者顯著地修改尚未證明安全性和功效的受管制產品的配置。對於那些需要獲得許可的“新產品”，除了提交SOP之外，還必須向FDA提交申請或申請補充。通常，涉及蜂 窩組件的池化或混合表示產品的變化，需要提交和批准許可證申請或應用程序補充。此類申請和申請補充材料應包含製造程序的數據和說明，以證明“新產品”在整個擬議的約會期間對其預期用途是安全有效的。
提供以下評論作為FDA批准或批准的STCD的更常見用途的指導：
L. 血液採集裝置中添加新的或更小的針頭
在開始手術(全血採集，血小板去除術或源血漿採集)之前使用STCD添加針不被認為打開功能封閉的系統。如果在手術過程中添加針頭，則只能使用經批准用於焊接充滿液體的管道的STCD。如果焊接完整性測試令人滿意，則不考慮使用STCD來打開功能封閉的系統。
在開放系統中製備的血小板，Pheresis應標記24小時過期，並且在功能封閉系統中製備的血小板，Pheresis產物應標記為5天過期(參見修訂的血小板收集指南，Pheresis，10月)1988年7月7日)。
添加的管和針的來源和規格應該在血液中心的SOP和記錄中解決。使用STCD添加針頭並不代表製造商需要預先批准的製造業的重大變化。
M. 使用STCD製備組分
當STCD用於附著額外的組分製備袋時，應適當地保持記錄，以識別轉移包的來源和血液單位數和 ABO/Rh的適當驗證。必須對所有血液和血液成分進行適當標記(21 CFR 606.121)。
實例：
˙在全血採集三包裝中添加第四個袋子，用於從新鮮冷凍血漿中生產冷沉澱的AHF。
˙將添加劑溶液與紅血球單元連接。
˙添加了經FDA批准用於製造組件的在線過濾器。
˙在血小板置換帶上增加第三個儲存容器。
˙對於上述用途，應制定程序並保持記錄，但被許可人無需獲得FDA批准即可製定程序。
1. 使用STCD匯集血液製品
適當使用STCD來匯集由全血收集製備的血小板可以避免來自常用的尖峰和端口條目的潛在污染。在輸血前立即進行匯集是這種適當使用的一個例子。合併血小板應在合併後不超過4小時施用(參見21 CFR 606.122(1)(2))。
然而，與施用隨機供體單位相比，合併和隨後的儲存可能增加風險；如果一個受污染的單元與其他單元匯集並在施用前儲存，則由於在另外的體積中復制，可以增加施用的總細菌接種物。因此，建議使用STCD來儲存和儲存血小板超過4小時應該由數據支持，該數據令人滿意地解決了這種匯集是否與增加的風險相關聯。
這种血小板聚集構成了新產物的製造。
涉及血小板的匯集或混合被認為是新產物的製造，如果儲存期超過四小時，則需要提交和批准許可申請或申請補充。
2. 使用STCD準備等分試樣用於兒科和分開的單位
使用STCD製備的全血，紅血細胞和新鮮冷凍血漿的兒科單位和分開的單位將不被視為需要生物製劑許可申請(BLA)補充的新產物，條件是滿足以下條件： 製造商應具有經批准的生物製劑許可證或許可證補充，用於原始(即未分割)產物，包括批准使用的每種抗凝血劑。
在分發之前，應提交標籤以供審查和批准。應在FDA表格2567，標籤和通函傳送的評論部分進行表示法。
應使用經批准用於儲存所製備組件的最終產物容器。
在許可證下製造的血小板必須含有至少5.5×10(10)10個血小板(21 CFR 640.24(c))。在許可證下製造的血小板，Pheresis應含有至少3.0×10(10)11個血小板(參見1988年10月7日的血小板採集修訂指南，Pheresis)。
關於使用STCD從全血收集物以及通過自動血液成分術程序製備的血漿和血小板製備分開的產物的程序應包括以下描述：˙如何使用FDA批准的STCD修改單採血液成分術或收集容器； ˙分裂血漿或全血產物的最小體積；˙分離血小板分離產物的體積和血小板濃度；˙產物的存儲時間。產物應在認可的容器中，並應與此類容器標籤上的儲存時間一致；˙用於標記和跟踪血液中心記錄中分開的產物的方法。
注意：在程序中應清楚地說明標記等分試樣的程序。如果需要，記錄保存應足以允許跟踪和召回所有組分。
3. 在自動血漿置換過程中使用STCD連接額外的鹽水或抗凝血管
應該開發程序並且記錄保持與儀器製造商的使用說明一致，但是被許可人不需要獲得FDA批准以便制定程序。
4. 使用STCD接附流程溶液
當使用STCD將處理溶液的容器附接到洗滌或冷凍的紅血球產物時，所得產物的約會期為24小時，除非以CBER的許可申請或應用補充的形式提供數據以支持較長的約會期(21 CFR 610.53(c))。豁免或修改必須得到CBER主任的書面批准(21 CFR 610.53(d))。
5. 使用STCD添加經FDA批准的白血球減少濾器
一些白血球減少過濾器沒有整體連接到全血收集系統。使用STCD進行預存儲過濾的程序應與過濾器製造商的使用說明一致。
發布前的白血球減少構成了主要的製造變化。因此，對於使用STCD製備的新的白血球減少產物，製造商必須向FDA提交生物製劑許可申請(21 CFR 601.2)或事先批准申請補充(21 CFR 601.12)。
使用STCD從血液製品容器中取出樣品用於測試(例如，使用STCD從血小板或血小板的容器中獲得血小板樣品，Pheresis用於交叉匹配)。
如果取樣後產物的體積和/或細胞計數與原始標籤或信息循環中所述的不同，則應修改產物上的標籤以反映新的體積和/或細胞計數。例如，可能不會去除樣品，其將血小板單位的血小板計數減少至小於5.5 x(10)10血小板(21 CFR 640.24(c))。
6. FDA指南的其他信息
FDA指南提供了一般指導以及關於提交申請的規範的具體信息和示例以及FDA對STCD的使用的應用補充。如果出現關於STCD正確使用的進一步問題，應關注血液研究和審查辦公室，生物製品評估和研究中心。
在一些實施態樣中，封閉系統使用一個容器，從獲得腫瘤片段直到TIL準備好給予患者或冷凍保存。在一些實施態樣中，當使用兩個容器時，第一容器是 封閉的G-容器，並且將TIL群體離心並轉移到輸液袋而不打開第一封閉的G-容器。在一些實施態樣中，當使用兩個容器時，輸液袋是含有HypoThermosol的輸液袋。封閉系統或封閉的TIL細胞培養系統的特徵在於，一旦添加了腫瘤樣品和/或腫瘤片段，該系統與外部緊密密封以形成不受細菌，真菌和/或侵入的封閉環境。或任何其他微生物污染。
在一些實施態樣中，微生物污染的減少為約5%至約100%。在一些實施態樣中，微生物污染的減少為約5%至約95%。在一些實施態樣中，微生物污染的減少為約5%至約90%。在一些實施態樣中，微生物污染的減少為約10%至約90%。在一些實施態樣中，微生物污染的減少為約15%至約85%。在一些實施態樣中，微生物污染的減少為約5%，約10%，約15%，約20%，約25%，約30%，約35%，約40%，約45%，約50%，約55%，約60%，約65%，約70%，約75%，約80%，約85%，約90%，約95%，約97%，約98%，約99%或約100%。
封閉系統允許在不存在和/或微生物污染顯著減少的情況下進行TIL生長。
此外，TIL細胞培養環境的pH，二氧化碳分壓和氧分壓各自隨培養細胞而變化。因此，即使適合細胞培養的培養基循環，仍然需要不斷地保持封閉環境作為TIL增殖的最佳環境。為此，希望通過傳感器監測封閉環境的培養液中的pH，二氧化碳分壓和氧分壓的物理因素， 其信號用於控制安裝在其中的氣體交換器。根據培養液的變化，實時調節培養環境的入口和封閉環境的氣體分壓，以優化細胞培養環境。在一些實施態樣中，本發明提供一種閉孔培養系統，其在封閉環境的入口處結合有氣體交換器，該氣體交換器配備有監測裝置，該監測裝置測量封閉環境的pH，二氧化碳分壓和氧分壓，並優化基於來自監測裝置的信號自動調節氣體濃度的細胞培養環境。
在一些實施態樣中，連續或間歇地控制封閉環境內的壓力。也就是說，例如通過壓力維持裝置可以改變封閉環境中的壓力，從而確保該空間適合於正壓狀態下的TIL的生長，或促進處於負壓狀態的流體的滲出和從而促進細胞增殖。此外，通過間歇地施加負壓，可以通過封閉環境的體積的臨時收縮來均勻且有效地替換封閉環境中的循環液體。
在一些實施態樣中，可以替代或添加用於TIL增殖的最佳培養組分，並且可以添加諸如IL-2和/或OKT3的因子以及組合。
C. 細胞培養
在一個實施態樣中，用於擴增TIL的方法，包括上文討論的以及圖27中舉例說明的那些，可以包括使用約5,000mL至約25,000mL的細胞培養基，約5,000mL至約10,000mL的細胞培養基，或約5,800mL至約8,700mL的細胞培養基。在一些實施態樣中，培養基是無血清培養 基，如例如實施例21中所述。在一些實施態樣中，第一次擴增中的培養基不含血清。在一些實施態樣中，第二次擴增中的培養基不含血清。。在一些實施態樣中，第一次擴增和第二次擴增中的培養基均不含血清。在一個實施態樣中，擴增TIL的數量使用不超過一種類型的細胞培養基。可以使用任何合適的細胞培養基，例如AIM-V細胞培養基(L-谷氨醯胺，50μM硫酸鏈黴素和10μM硫酸慶大霉素)細胞培養基(Invitrogen，Carlsbad CA)。在這方面，本發明的方法有利地減少了擴增TIL數量所需的培養基量和培養基類型的數量。在一個實施態樣中，擴增TIL的數量可以包括不比每第三或第四天更頻繁地餵養細胞。擴大透氣容器中的細胞數量簡化了通過降低擴增細胞所需的進料頻率來擴大細胞數量所需的程序。
在一個實施態樣中，第一和/或第二透氣性容器中的細胞培養基未經過濾。使用未過濾的細胞培養基可以簡化擴增細胞數量所需的程序。在一個實施態樣中，第一和/或第二透氣性容器中的細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME)。
在一個實施態樣中，所述方法的持續時間包括從哺乳動物獲得腫瘤組織樣品；在含有細胞培養基的第一透氣性容器中培養腫瘤組織樣品；從腫瘤組織樣品中獲得TIL；在含有細胞培養基的第二透氣性容器中擴增TIL的數量持續約7至14天，例如約11天。在一些實施態樣中，REP前約7至14天，例如約11天。在一些實施態樣中，REP 為約7至14天，例如約11天。
在一個實施態樣中，TIL在透氣容器中擴增。使用本領域已知的方法，組合物和裝置，包括在美國專利申請公開No.2005/0106717A1中描述的那些，使用PBMC來擴增TIL的氣體可滲透容器，其公開內容通過引用併入本文。在一個實施態樣中，TIL在透氣袋中擴增。在一個實施態樣中，使用細胞擴增系統擴增TIL，所述細胞擴增系統擴增透氣袋中的TIL，例如Xuri細胞擴增系統W25(GE Healthcare)。在一個實施態樣中，使用細胞擴增系統擴增TIL，所述細胞擴增系統擴增透氣袋中的TIL，例如WAVE生物反應器系統，也稱為Xuri細胞擴增系統W5(GE Healthcare)。在一個實施態樣中，細胞擴增系統包括透氣性細胞袋，其體積選自約100mL，約200mL，約300mL，約400mL，約500mL，約600mL，約700mL，約800mL，約900mL，約1L，約2L，約3L，約4L，約5L，約6L，約7L，約8L，約9L和約10L。
在一個實施態樣中，TIL可以在G-Rex燒瓶中擴增(可從Wilson Wolf Manufacturing商購獲得)。這些實施態樣允許細胞群從約5×10 5個細胞/cm 2擴增至10×10 6個細胞/cm 2/10×10 6個細胞/cm 2。在一個實施例中，這是沒有進給的。在一個實施態樣中，只要介質在G-Rex燒瓶中位於約10cm的高度，就不進料。在一個實施態樣中，這是在沒有餵食但是添加一種或多種細胞因子的情況下。在一個實施態樣中，細胞因子可以作為推注添加而無需將 細胞因子與培養基混合。此類容器，裝置和方法在本領域中是已知的並且已經用於擴增TIL，並且包括在美國專利申請公開No.US2014/0377739A1，國際公佈No.WO2014/210036A1，美國專利申請公開中描述的那些。US2013/0115617A1，國際公佈No.WO2013/188427A1，美國專利申請公開No.US2011/0136228A1，美國專利No.US8,809,050B2，國際公開No.WO2011/072088A2，美國專利申請公開號US 2016/0208216 A1，美國專利申請公開號US2012/0244133A1，國際公開號WO2012/129201A1，美國專利申請公開號US2013/0102075A1，美國專利號US8,956,860。B2，國際公開號WO2013/173835A1，美國專利申請公開號US2015/0175966A1，其公開內容通過引用併入本文。Jin等人，J.Immunotherapy，2012,35：283-292中也描述了這些方法。
A. TIL的可選基因工程
在一些實施態樣中，TIL任選地經基因工程改造以包括額外的功能，包括但不限於高親和力T細胞受體(TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原的TCR，例如MAGE。-1，HER2或NY-ESO-1，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或譜系限制性細胞表面分子(例如CD19)結合的嵌合抗原受體(CAR)。
B. 任選的TIL冷凍保存s
可以任選地冷凍保存大量TIL群體或擴增的TIL群體。在一些實施態樣中，在治療性TIL群體上發生冷凍保存。在一些實施態樣中，在第二次擴增後收穫的TIL上發生冷凍保存。在一些實施態樣中，在圖27的示例性步驟F中在TIL上發生冷凍保存。在一些實施態樣中，TIL在輸注袋中冷凍保存。在一些實施態樣中，TIL在置於輸液袋中之前被冷凍保存。在一些實施態樣中，TIL被冷凍保存並且不放置在輸液袋中。在一些實施態樣中，使用冷凍保存培養基進行冷凍保存。在一些實施態樣中，冷凍保存介質含有二甲基亞碸(DMSO)。這通常通過將TIL群體置於冷凍溶液中來實現，例如，85%補充滅活的AB血清和15%二甲基亞碸(DMSO)。將溶液中的細胞置於低溫小瓶中並在-80℃下儲存24小時，任選轉移至氣態氮冷凍箱進行冷凍保存。參見Sadeghi等人，Acta Oncologica 2013,52,978-986。
適當時，將細胞從冰箱中取出並在37℃水浴中解凍，直至解凍約4/5的溶液。通常將細胞重懸於完全培養基中並任選洗滌一次或多次。在一些實施態樣中，可以計數解凍的TIL並評估本領域已知的生存力。
在優選的實施態樣中，使用CS10冷凍保存培養基(CryoStor 10，BioLife Solutions)冷凍保存TIL群。在優選的實施態樣中，使用含有二甲基亞碸(DMSO)的冷凍保存介質冷凍保存TIL群。在一個優選的實施態樣中，使 用1：1(體積：體積)比例的CS10和細胞培養基冷凍保存TIL群。在一個優選的實施態樣中，使用約1：1(體積：體積)比例的CS10和細胞培養基冷凍保存TIL群，還包含另外的IL-2。
如上文在步驟A至E中所討論的，冷凍保存可以在整個TIL擴增過程中的許多點發生。在一些實施態樣中，可以冷凍保存根據步驟B的第一次擴增後的大量TIL群體或根據步驟D的一次或多次第二次擴增後的擴增的TIL群體。通常可以通過將TIL群體置於冷凍溶液中來完成冷凍保存，例如85%補體滅活的AB血清和15%二甲基亞碸(DMSO)。將溶液中的細胞置於低溫小瓶中並在-80℃下儲存24小時，任選轉移至氣態氮冷凍箱進行冷凍保存。參見Sadeghi等，Acta Oncologica 2013,52,978-986。
適當時，將細胞從冰箱中取出並在37℃水浴中解凍，直至解凍約4/5的溶液。通常將細胞重懸於完全培養基中並任選洗滌一次或多次。在一些實施態樣中，可以計數解凍的TIL並評估本領域已知的生存力。
在一些情況下，可以使用下面討論的方案立即冷凍保存步驟B TIL群體。或者，可以對大量TIL群體進行步驟C和步驟D，然後在步驟D之後冷凍保存。類似地，在將遺傳修飾的TIL用於治療的情況下，步驟B或步驟D TIL群體可以進行遺傳修改適當的治療方法。
C. 可選的細胞存活性分析
任選地，可以使用本領域已知的標準測定法在第一次擴增(有時稱為初始體積擴增)後進行細胞活力測定。例如，可以對大量TIL的樣品進行台盼藍排除測定，其選擇性地標記死細胞並允許活力評估。用於測試活力的其他測定可包括但不限於Alamar藍測定；和MTT測定。
1. 細胞計數、存活性、流動式細胞測量術
在一些實施態樣中，測量細胞計數和/或活力。標記物(例如但不限於CD3，CD4，CD8和CD56)以及本文公開或描述的任何其他標誌物的表現可以通過流式細胞術用抗體測量，例如但不限於可從BD Bio-商購的那些。科學(BD Biosciences，San Jose，CA)使用FACSCantoTM流式細胞儀(BD Biosciences)。可以使用一次性c-芯片血細胞計數器(VWR，Batavia，IL)手動計數細胞，並且可以使用本領域已知的任何方法評估活力，包括但不限於台盼藍染色。
在一些情況下，可以使用下面討論的方案立即冷凍保存大量TIL群體。或者，可以對大量TIL群體進行REP，然後如下所述進行冷凍保存。類似地，在將遺傳修飾的TIL用於治療的情況下，可以對大量或REP TIL群體進行遺傳修飾以進行合適的處理。
2. 細胞培養
在一個實施態樣中，用於擴增TIL的方法可 包括使用約5,000mL至約25,000mL的細胞培養基，約5,000mL至約10,000mL的細胞培養基，或約5,800mL至約8,700mL的細胞培養基。在一個實施態樣中，擴增TIL的數量使用不超過一種類型的細胞培養基。可以使用任何合適的細胞培養基，例如AIM-V細胞培養基(L-谷氨醯胺，50μM硫酸鏈黴素和10μM硫酸慶大霉素)細胞培養基(Invitrogen，Carlsbad CA)。在這方面，本發明的方法有利地減少了擴增TIL數量所需的培養基量和培養基類型的數量。在一個實施態樣中，擴增TIL的數量可以包括不比每第三或第四天更頻繁地餵養細胞。擴大透氣容器中的細胞數量簡化了通過降低擴增細胞所需的進料頻率來擴大細胞數量所需的程序。
在一個實施態樣中，第一和/或第二透氣性容器中的細胞培養基未經過濾。使用未過濾的細胞培養基可以簡化擴增細胞數量所需的程序。在一個實施態樣中，第一和/或第二透氣性容器中的細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME)。
在一個實施態樣中，所述方法的持續時間包括從哺乳動物獲得腫瘤組織樣品；在含有細胞培養基的第一透氣性容器中培養腫瘤組織樣品；從腫瘤組織樣品中獲得TIL；使用aAPC在其中含有細胞培養基的第二透氣性容器中擴增TIL的數量持續約14至約42天，例如約28天。
在一個實施態樣中，TIL在透氣容器中擴增。使用本領域已知的方法，組合物和裝置，包括在美國 專利申請公開No.2005/0106717A1中描述的那些，使用PBMC來擴增TIL的氣體可滲透容器，其公開內容通過引用併入本文。在一個實施態樣中，TIL在透氣袋中擴增。在一個實施態樣中，使用細胞擴增系統擴增TIL，所述細胞擴增系統擴增透氣袋中的TIL，例如Xuri細胞擴增系統W25(GE Healthcare)。在一個實施態樣中，使用細胞擴增系統擴增TIL，所述細胞擴增系統擴增透氣袋中的TIL，例如WAVE生物反應器系統，也稱為Xuri細胞擴增系統W5(GE Healthcare)。在一個實施態樣中，細胞擴增系統包括透氣性細胞袋，其體積選自約100mL，約200mL，約300mL，約400mL，約500mL，約600mL，約700mL，約800mL，約900mL，約1L，約2L，約3L，約4L，約5L，約6L，約7L，約8L，約9L和約10L。
在一個實施態樣中，TIL可以在G-Rex燒瓶中擴增(可從Wilson Wolf Manufacturing商購獲得)。這些實施態樣允許細胞群從約5×10 5個細胞/cm 2擴增至10×10 6個細胞/cm 2/10×10 6個細胞/cm 2。在一個實施例中，這是沒有進給的。在一個實施態樣中，只要介質在G-Rex燒瓶中位於約10cm的高度，就不進料。在一個實施態樣中，這是在沒有餵食但是添加一種或多種細胞因子的情況下。在一個實施態樣中，細胞因子可以作為推注添加而無需將細胞因子與培養基混合。此類容器，裝置和方法在本領域中是已知的並且已經用於擴增TIL，並且包括在美國專利申請公開No.US2014/0377739A1，國際公佈 No.WO2014/210036A1，美國專利申請公開中描述的那些。US2013/0115617A1，國際公佈No.WO2013/188427A1，美國專利申請公開No.US2011/0136228A1，美國專利No.US8,809,050B2，國際公開No.WO2011/072088A2，美國專利申請公開號US 2016/0208216 A1，美國專利申請公開號US2012/0244133A1，國際公開號WO2012/129201A1，美國專利申請公開號US2013/0102075A1，美國專利號US8,956,860。B2，國際公開號WO2013/173835A1，美國專利申請公開號US2015/0175966A1，其公開內容通過引用併入本文。Jin等人，J.Immunotherapy，2012,35：283-292中也描述了這些方法。TIL的可選基因工程
在一些實施態樣中，TIL任選地經基因工程改造以包括額外的功能，包括但不限於高親和力T細胞受體(TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原(例如MAGE)的TCR。-1，HER2或NY-ESO-1，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或譜系限制性細胞表面分子(例如CD19)結合的嵌合抗原受體(CAR)。
II. 治療患者的方法
治療方法以TIL的初始TIL收集和培養開始。這些方法已經在本領域中描述，例如，Jin等，J.Immunotherapy，2012,35(3)：283-292，其通過引用整體併入本文。在以下部分中描述了治療方法的實施態樣，包 括實施例。
根據本文所述方法製備的擴增TIL，包括例如如上文步驟A至F或根據上述步驟A至F所述(也如圖27中所示)，在治療中特別有用。患有癌症的患者(例如，如Goff等人，J.Clinical Oncology，2016,34(20)：2389-239中所述，以及補充內容；通過引用整體併入本文。在一些實施態樣中，TIL如前所述從切除的轉移性黑色素瘤沉積物生長(參見Dudley等，J Immunother.,2003,26：332-342；其全部內容通過引用併入本文)。可以在下文中解剖新鮮腫瘤。可以收集代表性樣品用於正式病理學分析。可以使用2mm 3至3mm 3的單個片段。在一些實施態樣中，每個患者獲得5,10,15,20,25或30個樣品。在一些實施態樣中。每位患者獲得20,25或30個樣本在一些實施態樣中，獲得每位患者20,22,24,26或28個樣品。在一些實施態樣中，獲得每位患者24個樣品。可以將樣品置於24孔板的各個孔中，維持在具有高劑量IL-2(6,000IU/mL)的生長培養基中，並監測腫瘤的破壞和/或TIL的增殖。如本文所述，可以將處理後剩餘活細胞的任何腫瘤酶促消化成單細胞懸浮液並冷凍保存。
在一些實施態樣中，可以對成功生長的TIL進行取樣以進行表型分析(CD3，CD4，CD8和CD56)，並在可獲得時針對自體腫瘤進行測試。如果過夜共培養產生干擾素-γ(IFN-γ)水平200pg/mL和兩倍背景，則TIL可被認為是反應性的。(Goff等人，J Immunother.,2010,33： 840-847；其全部內容通過引用併入本文)。在一些實施態樣中，可以選擇具有自體反應性或足夠生長模式的證據的培養物用於第二次擴增(例如，根據圖27的步驟D提供的第二次擴增)，包括有時被稱為快速的第二次擴增。擴張(REP)。在一些實施態樣中，選擇具有高自體反應性(例如，在第二次擴增期間的高增殖)的擴增的TIL用於另外的第二次擴增。在一些實施態樣中，根據圖27的步驟D，選擇具有高自體反應性(例如，如圖27的步驟D中提供的第二次擴增期間的高增殖)的TIL用於另外的第二次擴增。
在一些實施態樣中，患者不直接移至ACT(過繼細胞轉移)，例如，在一些實施態樣中，在腫瘤收穫和/或第一次擴增後，細胞不立即使用。在此類實施態樣中，TIL可在給予患者前2天冷凍保存並解凍。在此類實施態樣中，TIL可在給予患者前1天冷凍保存並解凍。在一些實施態樣中，TIL可以在給予患者之前立即冷凍保存並解凍。
可以通過流式細胞術(例如，FlowJo)分析輸注袋TIL的冷凍保存樣品的細胞表型，用於表面標誌物CD3，CD4，CD8，CCR7和CD45RA(BD BioSciences)，以及通過任何描述的方法。於此。通過使用標準酶聯免疫吸附測定技術測量血清細胞因子。血清IFN-g的升高定義為100pg/mL且大於4 3基線水平。
在一些實施態樣中，通過本文提供的方法產生的TIL，例如圖27中舉例說明的那些，提供了TIL臨床功 效的驚人改善。在一些實施態樣中，通過本文提供的方法產生的TIL，例如圖27中例示的那些，與通過除本文描述的方法之外的方法產生的TIL相比表現出增加的臨床功效，包括例如除了圖27中舉例說明的方法之外的方法。在一些實施態樣中，除本文描述的那些之外的方法包括稱為過程1C和/或第1代(第1代)的方法。在一些實施態樣中，通過DCR，ORR和/或其他臨床反應測量增加的功效。在一些實施態樣中，通過本文提供的方法產生的TILS，例如圖27中舉例說明的那些，與通過除本文所述方法之外的方法產生的TIL相比，表現出與響應和安全性相似的時間，包括例如除這些之外的方法。在圖27中舉例說明，例如Gen 1過程。
在一些實施態樣中，IFN-γ(IFN-γ)指示治療功效和/或增加的臨床功效。在一些實施態樣中，用TIL治療的受試者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些實施態樣中，使用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ的產生是細胞毒性潛力的另一種衡量標準。IFN-γ的產生可以通過測定用本發明方法製備的TIL處理的受試者離體的血液，血清或TIL中的細胞因子IFN-γ的水平來測量，包括如例如圖1所述的那些。在一些實施態樣中，IFN-γ的增加指示用本發明方法產生的TIL治療的患者的治療功效。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用TIL製備的TIL治療的患者相比，IFN-γ增加一倍，兩倍，三倍，四倍或五倍或更多倍。除了本文提供的那些之外的其他方法，包括例如 圖27中體現的那些方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者相比和/或與用TIL製備的患者相比，IFN-γ分泌增加一倍。使用除本文提供的方法之外的其他方法，包括例如圖27中體現的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與用TIL治療的患者相比，IFN-γ分泌增加兩倍。使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的方法，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與治療的患者相比，IFN-γ分泌增加三倍。使用除本文提供的方法之外的其他方法製備TIL，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與患者相比，IFN-γ分泌增加四倍。使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者相比，IFN-γ分泌增加五倍和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，使用Quantikine ELISA試劑盒測量IFN-γ。在一些實施態樣中，在通過本發明的方法製備的TIL處理的受試者體外TIL中測量IFN-γ，包括例如圖27中所述的那些。在一些實施態樣中，在血液中測量IFN-γ。用本發明方法製備的TIL治療的受試者，包括如圖27中所述的那些。在一些實施態樣中，在用通過本發明的方法製備的TIL處理的受試者的TIL血清中測量IFN-γ，包括例如圖27中所述的那些。
在一些實施態樣中，較高的平均IP-10指示治療功效和/或增加的臨床功效。在一些實施態樣中，用TIL治療的受試者的血液中較高的平均IP-10指示活性TIL。IP-10的產生可以通過測定用本發明方法製備的TIL處理的受試者的血液中的IP-10水平來測量，包括如圖27中所述的那些。在一些實施態樣中，更高的平均值IP-10表示用本發明方法產生的TIL治療的患者的治療功效。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與患者相比，更高的平均IP-10與一倍，兩倍，三倍，四倍或五倍或更多的增加相關。使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或未治療的患者相比，更高的平均IP-10相關性增加一倍。與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，較高的平均IP-10與2倍相比增加2倍。未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，更高的平均IP-10與增加三倍相關，與未治療的患者相比和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，包括例如圖27中所示的方法以外的方法的三倍。在一些實施態樣中，更高的平均IP-與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，圖10相 比增加了四倍，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中更高的平均IP-10與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比增加5倍，包括例如除圖中所示的方法之外的方法。在一些實施態樣中，在用通過本發明的方法製備的TIL治療的受試者的血液中測量IP-10，包括例如圖27中所述的那些。在一些實施態樣中，在用通過本發明的方法製備的TIL處理的受試者的TIL血清中測量IP-10，包括例如圖27中所述的那些。
在一些實施態樣中，較高的平均MCP-1指示治療功效和/或增加的臨床功效。在一些實施態樣中，用TIL治療的受試者的血液中較高的平均MCP-1指示活性TIL。MCP-1的產生可以通過測定用本發明方法製備的TIL處理的受試者的血液中的MCP-1水平來測量，包括如圖27中所述的那些。在一些實施態樣中，更高的平均值MCP-1指示用本發明方法產生的TIL治療的患者的治療功效。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與患者相比，較高的平均MCP-1與1倍，2倍，3倍，4倍或5倍或更多的增加相關。使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者相比，更高的平均MCP-1相關性增加一倍和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，較高的平均 MCP-1與2倍相比增加2倍。未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，更高的平均MCP-1與增加的相關與未治療的患者相比和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，包括例如圖27中所示的方法以外的方法的三倍。在一些實施態樣中，更高的平均MCP-與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，圖1的相關性增加了四倍，包括例如除了圖27中體現的那些之外的方法。在一些實施態樣中更高的平均MCP-1與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比增加5倍，包括例如除圖中所示的方法之外的方法。在一些實施態樣中，在用通過本發明的方法製備的TIL治療的受試者的血液中測量MCP-1，包括例如圖27中所述的那些。在實施態樣中，MCP-1在用本發明方法製備的TIL處理的受試者的TIL血清中測量，包括例如圖27中所述的那些。
在一些實施態樣中，通過本發明的方法製備的TIL，包括如圖27中所述的那些，與通過其他方法產生的TIL相比，具有增加的多株性，包括圖27中未例示的那些，例如例如，稱為過程1C方法的方法。在一些實施態樣中，顯著改善的多株性和/或增加的多株性指示治療功效和/或增加的臨床功效。在一些實施態樣中，多株性是指T 細胞庫的多樣性。在一些實施態樣中，多株性的增加可指示關於通過本發明的方法產生的TIL的施用的治療功效。在一些實施態樣中，與使用本文提供的方法製備的TIL相比，多株性增加一倍，兩倍，十倍，100倍，500倍或1000倍，包括例如除這些之外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，多株性增加一倍，包括例如除了在本文中體現的方法之外的方法。圖27.在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，多株性增加兩倍，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，多株性增加十倍。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，多株性增加100倍，包括例如，在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，多株性增加500倍，包括例如其它方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，多株性增加1000倍，包括例如除了那些之外的方法。體現在圖27中。
功效測量可以包括疾病控制率(DCR)測量值以及總響應率(ORR)，如本領域已知的以及本文提供的實 施例中描述的，包括實施例28。
1. 治療癌症和其他疾病的方法
本文所述的組合物和方法可用於治療疾病的方法中。在一個實施態樣中，它們用於治療過度增殖性疾病。它們還可以用於治療本文和以下段落中描述的其他病症。
在一些實施態樣中，過度增殖性疾病是癌症。在一些實施態樣中，過度增殖性疾病是實體瘤癌症。在一些實施態樣中，實體瘤癌症選自黑色素瘤，卵巢癌，子宮頸癌，非小細胞肺癌(NSCLC)，肺癌，膀胱癌，乳腺癌，由人乳頭瘤病毒引起的癌症，頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))，腎癌和腎細胞癌。在一些實施態樣中，過度增殖性疾病是血液惡性腫瘤。在一些實施態樣中，實體瘤癌症選自慢性淋巴細胞白血病，急性淋巴細胞白血病，瀰漫性大B細胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤和套細胞淋巴瘤。
在一個實施態樣中，本發明包括用TIL群體治療癌症的方法，其中根據本公開內容在輸注TIL之前用非清髓性化學療法預處理患者。在一個實施態樣中，非清髓性化療是環磷醯胺60mg/kg/d，持續2天(TIL輸注前第27和26天)和氟達拉濱25mg/m 2/d持續5天(TIL輸注前第27至23天))。在一個實施態樣中，在根據本公開內容的非清髓性化學療法和TIL輸注(在第0天)之後，患者每8小時靜脈 內輸注IL-2，以720,000IU/kg達到生理學耐受性。
本文所述的化合物和化合物組合在治療，預防和/或控制所示疾病或病症中的功效可使用本領域已知的各種模型進行測試，所述模型為治療人類疾病提供指導。例如，在Mullany等人，Endocrinology 2012,153,1585-92；和Fong等人，J.Ovarian Res。用於確定胰腺癌治療功效的模型描述於Herreros-Villanueva等，World J.Gastroenterol。2012,18,1286-1294。用於確定乳腺癌治療功效的模型描述於例如Fantozzi，Breast Cancer Res。用於確定黑色素瘤治療功效的模型描述於例如Damsky等人，Pigment Cell & Melanoma Res.,2006,28,212。2010,23,853-859。用於確定肺癌治療功效的模型描述於例如Meuwissen等，Genes & Development，2005,19,643-664中。用於確定肺癌治療功效的模型描述於例如Kim，Clin。進出口。Otorhinolaryngol。2009,2,55-60；和Sano，Head Neck Oncol。2009年，1,32。
在一些實施態樣中，IFN-γ(IFN-γ)指示過度增殖性疾病治療的治療功效。在一些實施態樣中，用TIL治療的受試者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些實施態樣中，使用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ的產生是細胞毒性潛力的另一種衡量標準。IFN-γ的產生可以通過測定用本發明方法製備的TIL處理的受試者的血液中細胞因子IFN-γ的水平來測量，包括如圖27中所述的那些。在一些實施態樣中，與使用稱為方法1C的方法製備的TIL處理的 受試者相比，通過本方法獲得的TIL在用本方法的TIL處理的受試者的血液中提供增加的IFN-γ，如圖83所示。在一些實施態樣中，IFN-γ的增加表明用本發明方法產生的TIL治療的患者的治療功效。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用TIL製備的TIL治療的患者相比，IFN-γ增加一倍，兩倍，三倍，四倍或五倍或更多倍。除了本文提供的那些之外的其他方法，包括例如圖27中體現的那些方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者相比和/或與用TIL製備的患者相比，IFN-γ分泌增加一倍。使用除本文提供的方法之外的其他方法，包括例如圖27中體現的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與用TIL治療的患者相比，IFN-γ分泌增加兩倍。使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的方法，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與治療的患者相比，IFN-γ分泌增加三倍。使用除本文提供的方法之外的其他方法製備TIL，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與患者相比，IFN-γ分泌增加四倍。使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者相比，IFN-γ分泌增加五倍和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，使用Quantikine ELISA試劑盒測量IFN-γ。在一些實施態樣中， 使用Quantikine ELISA試劑盒測量IFN-γ。在一些實施態樣中，從用本發明方法產生的TIL處理的患者離體TIL測量IFN-γ。在一些實施態樣中，在用通過本發明的方法產生的TIL治療的患者的血液中測量IFN-γ。在一些實施態樣中，在用通過本發明的方法產生的TIL治療的患者的血清中測量IFN-γ。
在一些實施態樣中，較高的平均IP-10指示治療功效和/或增加的過度增殖性疾病治療的臨床功效。在一些實施態樣中，用TIL治療的受試者的血液中較高的平均IP-10指示活性TIL。在一些實施態樣中，與使用稱為方法1C的方法製備的TIL處理的受試者相比，通過本方法獲得的TIL在用本發明方法的TIL處理的受試者的血液中提供更高的平均IP-10，如圖中所示。83.可以通過測定用本發明方法製備的TIL處理的受試者血液中IP-10的水平來測量IP-10的產生，包括如圖27中所述的那些。在一些實施態樣中，更高的平均IP-10表示用本發明方法產生的TIL治療的患者的治療功效。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與患者相比，更高的平均IP-10與一倍，兩倍，三倍，四倍或五倍或更多的增加相關。使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或未治療的患者相比，更高的平均IP-10相關性增加一倍。與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，包括例如圖27中體現的方法以外的方 法。在一些實施態樣中，較高的平均IP-10與2倍相比增加2倍。未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，更高的平均IP-10與增加o相關。與未治療的患者相比和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，包括例如圖27中所示的方法以外的方法的三倍。在一些實施態樣中，更高的平均IP-與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，圖10相比增加了四倍，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中更高的平均IP-10與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比增加5倍，包括例如除圖27中所示的方法之外的方法。
在一些實施態樣中，較高的平均MCP-1指示治療功效和/或增加的過度增殖性疾病治療的臨床功效。在一些實施態樣中，用TIL治療的受試者的血液中較高的平均MCP-1指示活性TIL。在一些實施態樣中，通過本發明方法獲得的TIL在用本發明方法的TIL處理的受試者的血液中提供更高的平均MCP-1，與使用稱為方法1C的方法製備的TIL處理的受試者相比較，如圖中所示。83.可以通過測定用本發明方法製備的TIL處理的受試者的血液中MCP-1的水平來測量MCP-1的產生，包括如圖27中所述的那些。在一些實施態樣中，較高的平均MCP-1指示用本發明 方法產生的TIL治療的患者的治療功效。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與患者相比，較高的平均MCP-1與1倍，2倍，3倍，4倍或5倍或更多的增加相關。使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者相比，更高的平均MCP-1相關性增加一倍和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，較高的平均MCP-1與2倍相比增加2倍。未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，更高的平均MCP-1與增加的相關與未治療的患者相比和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，包括例如圖27中所示的方法以外的方法的三倍。在一些實施態樣中，更高的平均MCP-與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，圖1的相關性增加了四倍，包括例如除了圖27中體現的那些之外的方法。在一些實施態樣中更高的平均MCP-1與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比增加5倍，包括例如除圖27中所示的方法之外的方法。
在一些實施態樣中，通過本發明的方法製備的TIL，包括如圖27中所述的那些，與通過其他方法產生 的TIL相比，表現出增加的多株性，包括圖27中未例示的那些，例如，稱為過程1C方法的方法。在一些實施態樣中，顯著改善的多株性和/或增加的多株性指示治療功效和/或增加的癌症治療的臨床功效。在一些實施態樣中，多株性是指T細胞庫的多樣性。在一些實施態樣中，多株性的增加可指示關於通過本發明的方法產生的TIL的施用的治療功效。在一些實施態樣中，與使用本文提供的方法製備的TIL相比，多株性增加一倍，兩倍，十倍，100倍，500倍或1000倍，包括例如除這些之外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，多株性增加一倍，包括例如除了在本文中體現的方法之外的方法。圖27.在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，多株性增加兩倍，包括例如圖27中體現的方法以外的方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，多株性增加十倍。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，多株性增加100倍，包括例如，在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外的其他方法製備的TIL治療的患者相比，多株性增加500倍，包括例如其它方法。在一些實施態樣中，與未治療的患者和/或與使用除本文提供的方法之外 的其他方法製備的TIL治療的患者相比，多株性增加1000倍，包括例如除了那些之外的方法。體現在圖27中。
2. 共同投予之方法
在一些實施態樣中，如本文所述產生的TIL，包括例如衍生自圖27的步驟A至F中描述的方法的TIL，可以與一種或多種免疫檢查點調節劑組合施用，例如所述的抗體。下面。例如，靶向PD-1並且可以與本發明的TIL共同施用的抗體包括，例如但不限於nivolumab(BMS-936558，Bristol-Myers Squibb；Opdivo®)，pembrolizumab(lambrolizumab)，MK03475或MK-3475，Merck；Keytruda®)，人源化抗PD-1抗體JS001(ShangHai JunShi)，單株抗PD-1抗體TSR-042(Tesaro，Inc。)，Pidilizumab(抗PD-1)mAb CT-011，Medivation)，抗PD-1單株抗體BGB-A317(BeiGene)，和/或抗PD-1抗體SHR-1210(ShangHai HengRui)，人單株抗體REGN2810(Regeneron)，人類單株抗體MDX-1106(Bristol-Myers Squibb)和/或人源化抗PD-1 IgG4抗體PDR001(Novartis)。在一些實施態樣中，PD-1抗體來自株：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell cat # BP0146。適用於與根據本文所述的步驟A至F產生的TIL的共同施用方法的其它合適的抗體是美國專利號8,008,449中公開的抗PD-1抗體，其通過引用併入本文。在一些實施態樣中，抗體或其抗原結合部分特異性結合PD-L1並抑制其與PD-1的相互作 用，從而增加免疫活性。本領域已知的任何與PD-L1結合併破壞PD-1和PD-L1之間相互作用並刺激抗腫瘤免疫應答的抗體適用於與根據步驟產生的TIL的共同給藥方法。如本文所述的A至F.例如，靶向PD-L1並且處於臨床試驗中的抗體包括BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)和MPDL3280A(Genentech)。靶向PD-L1的其他合適的抗體公開在美國專利號7,943,743中，其通過引用併入本文。本領域普通技術人員將理解，任何與PD-1或PD-L1結合，破壞PD-1/PD-L1相互作用並刺激抗腫瘤免疫應答的抗體都適用於共同使用。根據本文所述的步驟A至F產生的TIL的給藥方法。在一些實施態樣中，當患者俱有難以施用抗PD-1抗體的癌症類型時，施用根據步驟A至F產生的TIL組合的受試者與抗PD-1抗體共同施用。單獨。在一些實施態樣中，當患者患有難治性黑色素瘤時，向患者施用與抗PD-1組合的TIL。在一些實施態樣中，當患者患有非小細胞肺癌(NSCLC)時，向患者施用與抗PD-1組合的TIL。
3. 患者可選的淋巴細胞清除預處理
在一個實施態樣中，本發明包括用TIL群體治療癌症的方法，其中根據本公開內容在輸注TIL之前用非清髓性化學療法預處理患者。在一個實施態樣中，本發明包括用於治療已經用非清髓性化學療法預處理的患者的癌症的TIL群。在一個實施態樣中，TIL群用於通過輸注給藥。在一個實施態樣中，非清髓性化療是環磷醯胺 60mg/kg/d，持續2天(TIL輸注前第27和26天)和氟達拉濱25mg/m 2/d持續5天(TIL輸注前第27至23天))。在一個實施態樣中，在根據本公開內容的非清髓性化學療法和TIL輸注(在第0天)之後，患者以每8小時720,000IU/kg靜脈內輸注IL-2(阿地白介素，以市售PROLEUKIN)靜脈內輸注。對生理上的耐受在某些實施態樣中，TIL群體用於與IL-2組合治療癌症，其中IL-2在TIL群體後施用。
實驗結果表明，過繼轉移腫瘤特異性T淋巴細胞之前的淋巴細胞清除在通過消除調節性T細胞和免疫系統的競爭元件(“細胞因子沉降”)來增強治療功效中起關鍵作用。因此，本發明的一些實施態樣在引入本發明的TIL之前對患者使用淋巴耗竭步驟(有時也稱為“免疫抑制調節”)。
通常，使用氟達拉濱或環磷醯胺(活性形式稱為mafosfamide)及其組合來實現淋巴細胞消除。這些方法描述於Gassner、et al.、Cancer Immunol.Immunother.2011、60、75-85、Muranski、et al.、Nat.Clin.Pract.Oncol.、2006、3、668-681、Dudley、et al.、J.Clin.Oncol.2008、26、5233-5239、and Dudley、et al.、J.Clin.Oncol.2005、23、2346-2357所有這些都通過引用整體併入本文。
在一些實施態樣中，氟達拉濱以0.5μg/mL-10μg/mL氟達拉濱的濃度施用。在一些實施態樣中，氟達拉濱以1μg/mL氟達拉濱的濃度施用。在一些實施態樣 中，氟達拉濱治療施用1天，2天，3天，4天，5天，6天或7天或更長時間。在一些實施態樣中，氟達拉濱以10mg/kg/天，15mg/kg/天，20mg/kg/天25mg/kg/天，30mg/kg/天，35mg/劑的劑量施用。kg/天，40mg/kg/天，或45mg/kg/天。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療以35mg/kg/天施用2-7天。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療以35mg/kg/天施用4-5天。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療以25mg/kg/天施用4-5天。
在一些實施態樣中，通過施用環磷醯胺，以0.5μg/mL-10μg/mL的濃度獲得馬氟醯胺(環磷醯胺的活性形式)。在一些實施態樣中，通過施用環磷醯胺以1μg/mL的濃度獲得馬來醯胺(活性形式的環磷醯胺)。在一些實施態樣中，給予環磷醯胺治療1天，2天，3天，4天，5天，6天或7天或更長時間。在一些實施態樣中，環磷醯胺以100mg/m 2/天，150mg/m 2/天，175mg/m 2/天200mg/m 2/天，225mg/m 2/天，250mg/劑的劑量施用。m2/天，275毫克/平方米/天，或300毫克/平方米/天。在一些實施態樣中，靜脈內施用環磷醯胺(即，靜脈內)。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療以35mg/kg/天施用2-7天。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療以250mg/m 2/天靜脈內施用4-5天。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療以250mg/m 2/天靜脈內施用4天。
在一些實施態樣中，通過將氟達拉濱和環磷醯胺一起施用於患者來進行淋巴細胞清除。在一些實施態 樣中，氟達拉濱以25mg/m 2/天靜脈內施用。環磷醯胺和環磷醯胺以250mg/m 2/天靜脈內給藥。超過4天。
在一個實施態樣中，通過以60mg/m 2/天的劑量施用環磷醯胺兩天進行淋巴細胞消除，然後以25mg/m 2/天的劑量施用氟達拉濱，持續五天。
4. IL-2給藥方案
在一個實施態樣中，IL-2方案包括高劑量IL-2方案，其中高劑量IL-2方案包括阿地白介素或其生物仿製藥或其變體，在施用後第二天開始靜脈內施用。治療性TIL群體的治療有效部分，其中阿地白介素或其生物仿製藥或變體以0.037mg/kg或0.044mg/kg IU/kg(患者體重)的劑量施用，每次15分鐘推注靜脈輸注8小時，直到容忍，最多14劑。在休息9天後，該時間表可以重複另外14個劑量，總共最多28個劑量。
在一個實施態樣中，IL-2方案包括漸弱的IL-2方案。降低IL-2方案已在O'Day等人，J.Clin。ONCOL。1999,17,2752-61和Eton等，Cancer 2000,88,1703-9，其公開內容在此引入作為參考。在一個實施態樣中，漸弱IL-2方案包括在6小時內靜脈內施用18×106IU/m 2，然後在12小時內靜脈內施用18×10 6IU/m 2，隨後在24小時內靜脈內施用18×10 6IU/m 2。然後在72小時內靜脈內施用4.5×106IU/m 2。該處理週期可以每28天重複一次，最多四個週期。在一個實施態樣中，漸弱IL-2方案在第1天包含 18,000,000IU/m 2，在第2天包含9,000,000IU/m 2，並且在第3天和第4天包含4,500,000IU/m 2。
在一個實施態樣中，IL-2方案包括以0.10mg/天至50mg/天的劑量每1,2,4,6,7,14或21天施用聚乙二醇化IL-2。
5. 過繼性細胞轉移
過繼細胞轉移(ACT)是一種非常有效的免疫療法形式，涉及將具有抗腫瘤活性的免疫細胞轉移到癌症患者體內。ACT是一種治療方法，涉及體外鑑定具有抗腫瘤活性的淋巴細胞，將這些細胞體外擴增至大量並將其輸注到攜帶癌症的宿主中。用於過繼轉移的淋巴細胞可以源自切除腫瘤的基質(腫瘤浸潤淋巴細胞或TIL)。ACT的TIL可如本文所述製備。在一些實施態樣中，例如，根據圖27中描述的方法製備TIL。如果它們經基因工程改造以表現抗腫瘤T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體，它們也可以衍生自或來自血液。CARs)，富含混合淋巴細胞腫瘤細胞培養物(MLTC)，或使用自體抗原呈遞細胞和腫瘤衍生肽株。其中淋巴細胞來源於要輸注的攜帶癌的宿主的ACT稱為自體ACT。美國公開號2011/0052530涉及用於進行過繼性細胞療法以促進癌症消退的方法，主要用於治療患有轉移性黑色素瘤的患者，其通過引用整體併入這些方法。在一些實施態樣中，TIL可以如本文所述施用。在一些實施態樣中，TIL可以單劑量施用。這種給藥可以通過注射，例如 靜脈內注射。在一些實施態樣中，TIL和/或細胞毒性淋巴細胞可以多劑量施用。給藥可以是每年一次，兩次，三次，四次，五次，六次或六次以上。給藥可以是每月一次，每兩週一次，每週一次，或每隔一天一次。只要需要，TIL和/或細胞毒性淋巴細胞的施用可以繼續。
6. 例示性治療實施態樣
在一些實施態樣中，本公開內容提供了用腫瘤浸潤淋巴細胞群(TIL)治療癌症的方法，其包括以下步驟：(a)從患者切除的腫瘤中獲得第一TIL群；(b)在第一細胞培養基中初始擴增第一TIL群體以獲得第二TIL群體，其中第二TIL群體的數量比第一TIL群體的數量至少高5倍，並且其中第一細胞培養基包含IL-2；(c)使用在第二細胞培養基髓系人工抗原呈遞細胞(骨髓AAPCS)的群體獲得的TIL，其中的TIL的第三群是至少50的第三群執行的TIL的第二群的迅速擴增在快速擴張開始7天後，數量比第二批TIL數量更多；其中第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)將第三組TIL的治療有效部分給予患有癌症的患者。在一些實施態樣中，本公開內容用於治療癌症的腫瘤浸潤淋巴細胞群(TIL)，其中TIL群可通過包括以下步驟的方法獲得：(b)進行所獲得的第一TIL群的初始擴增來自在第一細胞培養基中從患者切除的腫瘤以獲得第二TIL群，其中第二TIL群的數量比第一TIL群多至少5倍，並且其中第一細胞培養基包含IL-2；(c)使用在第二細胞培養基髓系人工抗 原呈遞細胞(骨髓AAPCS)的群體獲得的TIL，其中的TIL的第三群是至少50的第三群執行的TIL的第二群的迅速擴增在快速擴張開始7天後，數量比第二批TIL數量更多；其中第二細胞培養基包含IL-2和OKT-3；(d)將第三組TIL的治療有效部分給予患有癌症的患者。在一些實施態樣中，該方法包括從患者切除的腫瘤中獲得第一TIL群的第一步驟(a)。在一些實施態樣中，IL-2以約3000IU/mL的初始濃度存在，OKT-3抗體以約30ng/mL的初始濃度存在於第二細胞培養基中。在一些實施態樣中，第一次擴增在不超過14天的時間內進行。在一些實施態樣中，使用透氣性容器進行第一次擴增。在一些實施態樣中，使用透氣性容器進行第二次擴增。在一些實施態樣中，第二TIL群體與快速擴增中的aAPC群體的比率在1至80和1至400之間。在一些實施態樣中，第二TIL群體與aAPC群體的比率在1至80和1至400之間。快速擴增約為1至300.在一些實施態樣中，用於治療的癌症選自黑色素瘤，卵巢癌，子宮頸癌，非小細胞肺癌(NSCLC)，肺癌，膀胱癌，乳腺癌.，由人乳頭瘤病毒，頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))，腎癌和腎細胞癌引起的癌症。在一些實施態樣中，用於治療的癌症選自黑色素瘤，卵巢癌和子宮頸癌。在一些實施態樣中，用於治療的癌症是黑色素瘤。在一些實施態樣中，用於治療的癌症是卵巢癌。在一些實施態樣中，用於治療的癌症是子宮頸癌。在一些實施態樣中，治療癌症的方法還包括在將第三組TIL施用於患者之前用非清髓性淋巴細胞清除 方案治療患者的步驟。在一些實施態樣中，該非骨髓淨除式淋巴球大量降低方案包含將劑量60mg/m2/日的環磷醯胺(cyclophosphamide)投予二日接著將劑量25mg/m2/日的氟達拉濱(fludarabine)投予五日之步驟。在一些實施態樣中，高劑量IL-2方案包含600,000或720,000IU/kg阿地白介素或其生物仿製藥或變體，每8小時以15分鐘推注靜脈內輸注給藥直至耐受。
V. 例示性實施態樣
在一些實施態樣中，本發明提供一種用於治療具有癌之個體之方法，該方法包含投予經擴增之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，其包含：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自個體所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約11日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生； (d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約11日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生；(g)使用冷凍保存程序冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含來自步驟(f)之該經收獲之TIL族群；以及(h)將自步驟(g)中該輸注袋的治療有效劑量之該第三TIL族群投予該患者。
在一些實施態樣中，冷凍保存方法包括在包含DMSO的培養基中冷凍保存。在一些實施態樣中，冷凍保存培養基包含7%至10%DMSO。在一些實施態樣中，CS10中的冷凍保存培養基。
在一些實施態樣中，在步驟(e)中所收獲之該 治療性TIL族群包含足夠的TIL以供在步驟(h)中投予治療有效劑量之該等TIL。
在一些實施態樣中，足夠供在步驟(h)中投予治療有效劑量之TIL數量係約2.3×1010至約13.7×1010。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞(APC)係PBMC。
在一些實施態樣中，該等PBMC係在步驟(d)中於第9至11日中任一日加至該細胞培養。
在一些實施態樣中，其中，在步驟(h)中投予治療有效劑量TIL細胞之前，業經投予非骨髓淨除式淋巴球大量降低方案(non-myeloablative lymphodepletion regimen)於該患者。
在一些實施態樣中，該非骨髓淨除式淋巴球大量降低方案包含將劑量60mg/m2/日的環磷醯胺(cyclophosphamide)投予二日接著將劑量25mg/m2/日的氟達拉濱(fludarabine)投予五日之步驟。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含在步驟(h)中從將該等TIL細胞投予該患者後之日起以高劑量IL-2給藥方案治療該患者之步驟。
在一些實施態樣中，該高劑量IL-2給藥方案包含每八小時以15分鐘靜脈輸注速注(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000IU/kg，直到耐受。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中之該第三TIL族群當經投予個體時，提供療效的增加、干擾素- γ(IFN-γ)製造的增加、多株性(polyclonality)的增加、平均IP-10的增加、和/或平均MCP-1的增加。在一些實施態樣中，在用TIL治療的受試者的血液中測量IFN-γ的增加，平均IP-10的增加和/或平均MCP-1的增加。
在一些實施態樣中，該癌係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突狀瘤病毒所造成之癌、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌、及腎細胞癌(renal cell carcinoma)。在一些實施態樣中，該癌係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、及NSCLC所組成之群組。在一些實施態樣中，該癌係黑色素瘤。在一些實施態樣中，該癌係HNSCC。在一些實施態樣中，該癌係子宮頸癌。在一些實施態樣中，該癌係NSCLC。
在一實施態樣中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)擴增(expanding)之方法。
本發明提供擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法，包括：(a)從患者獲得腫瘤樣品，其中所述腫瘤樣品包含第一TIL群；(b)將所述腫瘤樣品加工成多個腫瘤碎片；(c)將所述腫瘤碎片加入密閉容器中；(d)在第一細胞培養基中進行所述第一TIL群體的初始擴增以獲得第二TIL群體，其中所述第一細胞培養基包含IL-2，其中所述初始擴增在所述密閉容器中進行，提供於至少100cm 2的透氣表面積，其中所述初始擴增在約7-14天的第一時間段內進行以獲得第二TIL群，其中所述第二TIL群的數量比至少50倍 大。所述第一種TIL群體，其中從步驟(c)到步驟(d)的轉變在不打開系統的情況下發生；(e)在第二細胞培養基中擴增所述第二TIL群，其中所述第二細胞培養基包含IL-2，OKT-3和外周血單核細胞(PBMC，也稱為單核細胞(MNC))，其中所述擴增在約7-14天的第二階段內進行以獲得第三TIL群體，其中所述第三TIL群體相對於第二TIL群體表現出增加的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞亞群.，其中所述擴增在提供至少500cm 2的透氣表面區域的密閉容器中進行，並且其中從步驟(d)到步驟(e)的轉變在不打開系統的情況下進行；(f)收穫從步驟(e)獲得的所述第三TIL群，其中從步驟(e)到步驟(f)的轉變在不打開系統的情況下發生；(g)將所述收穫的TIL群從步驟(f)轉移到輸液袋，其中從步驟(f)到(g)的所述轉移在不打開系統的情況下發生。在一些實施態樣中，該方法是體外或前體內方法。
在一些實施態樣中，該方法還包括在步驟(f)中經由細胞處理系統收穫，例如由Fresenius Kabi製造的LOVO系統。術語“LOVO細胞處理系統”還指由以下製造的任何儀器或裝置：任何能夠在無菌和/或封閉系統環境中通過膜或過濾器(例如旋轉膜或旋轉過濾器)泵送包含細胞的溶液的供應商，允許連續流動和細胞處理以去除上清液或細胞培養基而無需造粒。在一些情況下，細胞處理系統可以在封閉的無菌系統中進行細胞分離，洗滌，流體交換，濃縮和/或其他細胞處理步驟。
在一些實施態樣中，密閉容器選自G-容器和 Xuri細胞袋。
在一些實施態樣中，步驟(g)中的輸液袋是含有HypoThermosol的輸液袋。
在一些實施態樣中，步驟(d)中的第一時間段和步驟(e)中的所述第二時間段各自在10天，11天或12天的時間段內單獨進行。
在一些實施態樣中，步驟(d)中的第一時段和步驟(e)中的所述第二時段各自在11天的時間段內單獨進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)-(g)在約25天至約30天的時間內進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(g)在約20天至約25天的時間內進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)-(g)在約20天至約22天的時間內進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(g)在22天或更短時間內進行。
在一些實施態樣中，步驟(c)至(f)在單個容器中進行，其中在單個容器中進行步驟(c)至(f)導致每個切除的腫瘤的TIL產量與執行相比增加步驟(c)至(f)在一個以上的容器中。
在一些實施態樣中，在步驟(e)的第二階段期間將PBMC添加至TIL，而不打開系統。
在一些實施態樣中，從所述第三TIL群體獲 得的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞表現出選自下組的一種或多種特徵：表現CD27 +，表現CD28 +，更長的端粒，增加的CD57表現，和相對於從所述第二細胞群獲得的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞，CD56表現降低。
在一些實施態樣中，相對於從所述第二細胞群獲得的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞，從所述第三TIL群獲得的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞表現出增加的CD57表現和降低的CD56表現。
在一些實施態樣中，微生物污染之風險相較於開放系統係減少的。
在一些實施態樣中，來自步驟(g)之該等TIL係經輸注至患者。
本發明還提供了治療患有腫瘤浸潤淋巴細胞群(TIL)的患者的癌症的方法，包括以下步驟：(a)從患者獲得腫瘤樣品，其中所述腫瘤樣品包含第一群體TILs；(b)將所述腫瘤樣品加工成多個腫瘤碎片；(c)將所述腫瘤碎片加入密閉容器中；(d)在第一細胞培養基中進行所述第一TIL群體的初始擴增以獲得第二TIL群體，其中所述第一細胞培養基包含IL-2，其中所述初始擴增在所述密閉容器中進行，提供於至少100cm 2的透氣表面積，其中所述初始擴增在約7-14天的第一時間段內進行以獲得第二TIL群，其中所述第二TIL群的數量比至少50倍大。所述第一種TIL群體，其中從步驟(c)到步驟(d)的轉變在不打開系統的情況下發生；(e)在第二細胞培養基中擴增所述第二TIL群， 其中所述第二細胞培養基包含IL-2，OKT-3和外周血單核細胞(PBMC)，其中所述擴增在第二週期內進行。獲得第三TIL群體約7-14天，其中所述第三TIL群體相對於第二TIL群體表現出增加的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞亞群，其中所述擴增在閉合中進行容器提供至少500cm 2的透氣表面區域，並且其中從步驟(d)到步驟(e)的過渡發生而不打開系統；(f)收穫從步驟(e)獲得的所述第三TIL群，其中從步驟(e)到步驟(f)的轉變在不打開系統的情況下發生；(g)將所述收穫的TIL群從步驟(f)轉移到輸液袋，其中從步驟(f)到(g)的所述轉移在不打開系統的情況下進行；(h)在步驟(g)中將所述輸注袋中的治療有效量的TIL細胞給予所述患者。
在一些實施態樣中，本發明還包括用於治療癌症，其中的TIL群是由包含以下步驟的方法獲得的用於腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL的)群體：(b)中處理的腫瘤樣品從患者，其中所述腫瘤樣品包含第一TIL群體成多個腫瘤片段；(c)將所述腫瘤碎片加入密閉容器中；(d)在第一細胞培養基中進行所述第一TIL群體的初始擴增以獲得第二TIL群體，其中所述第一細胞培養基包含IL-2，其中所述初始擴增在所述密閉容器中進行，提供於至少100cm 2的透氣表面積，其中所述初始擴增在約7-14天的第一時間段內進行以獲得第二TIL群，其中所述第二TIL群的數量比至少50倍大。所述第一種TIL群體，其中從步驟(c)到步驟(d)的轉變在不打開系統的情況下發生；(e)在第二細胞培養基中擴增 所述第二TIL群，其中所述第二細胞培養基包含IL-2，OKT-3和外周血單核細胞(PBMC)，其中所述擴增在第二週期內進行。獲得第三TIL群體約7-14天，其中所述第三TIL群體相對於第二TIL群體表現出增加的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞亞群，其中所述擴增在閉合中進行容器提供至少500cm 2的透氣表面區域，並且其中從步驟(d)到步驟(e)的過渡發生而不打開系統；(f)收穫從步驟(e)獲得的所述第三TIL群，其中從步驟(e)到步驟(f)的轉變在不打開系統的情況下發生；(g)將所述收穫的TIL群體從步驟(f)轉移到輸液袋，其中從步驟(f)到(g)的所述轉移在不打開系統的情況下發生。在一些實施態樣中，該方法包括第一步驟(a)獲得來自患者的腫瘤樣品，其中所述腫瘤樣品包含第一TIL群。在一些實施態樣中，TIL群用於在步驟(g)中以所述輸注袋以治療有效量給藥。
在一些實施態樣中，在步驟(h)中施用治療有效量的TIL細胞之前，已對所述患者施用非清髓性淋巴細胞清除方案。在一些實施態樣中，TIL群體用於施用於誰接受了非清髓性淋巴清除方案的患者。
在一些實施態樣中，非清髓性淋巴細胞清除方案包括以60mg/m 2/天的劑量施用環磷醯胺兩天的步驟，然後以25mg/m 2/天的劑量施用氟達拉濱五次。天。
在一些實施態樣中，該方法還包括在步驟(h)中向所述患者施用所述TIL細胞後第二天開始用高劑量IL-2方案治療所述患者的步驟。在一些實施態樣中，TIL 群體用於在高劑量IL-2方案之前施用。在一些實施態樣中，TIL群體用於在高劑量IL-2方案開始前一天施用。
在一些實施態樣中，該高劑量IL-2給藥方案包含每八小時以15分鐘靜脈輸注速注(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000IU/kg，直到耐受。
在一些實施態樣中，從所述第三TIL群體獲得的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞表現出選自下組的一種或多種特徵：表現CD27 +，表現CD28 +，更長的端粒，增加的CD57表現，和相對於從所述第二細胞群獲得的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞，CD56表現降低。
在一些實施態樣中，從所述第三TIL群體獲得的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞相對於從所述第二群體獲得的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞表現出增加的CD57表現和降低的CD56表現。
本發明還提供了擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法，包括以下步驟：(a)將加工的腫瘤片段加入封閉系統中；(b)在第一細胞培養基中首次擴增所述第一TIL群體以獲得第二TIL群體，其中所述第一細胞培養基包含IL-2，其中所述第一次擴增在密閉容器中進行。第一透氣表面區域，其中所述第一次擴增在約3-14天的第一時間段內進行以獲得第二TIL群體，其中所述第二TIL群體的數量比所述第一群體至少高50倍。TIL群，其中從步驟(a)到步驟(b)的轉變在不打開系統的情況下發生；(c)在第二細胞培養基中擴增所述第二TIL群，其中所述第二細胞培養基 包含IL-2，OKT-3和抗原呈遞細胞，其中所述擴增在約7-的第二週期內進行。獲得第三TIL群體14天，其中所述第三TIL群體相對於第二TIL群體表現出效應T細胞和/或中樞記憶T細胞亞群的增加，其中所述擴增在密閉容器中進行，提供了第二透氣表面區域，其中在不打開系統的情況下發生從步驟(b)到步驟(c)的過渡；(d)收穫從步驟(c)獲得的所述第三TIL群，其中從步驟(c)到步驟(d)的轉變在不打開系統的情況下發生；(e)將所述收穫的TIL群從步驟(d)轉移到輸液袋，其中從步驟(d)到(e)的所述轉移在不打開系統的情況下進行。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含使用冷凍保存程序冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含該經收獲之TIL族群。在一些實施態樣中，該冷凍保存製程序使用1：1比例的經收穫之TIL族群對CS10介質來進行。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中之該收獲係使用LOVO細胞處理系統來進行。
在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約50個碎片，其中各碎片具有約27mm3之體積。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約30個至約60個碎片，具有約1300mm3至約1500mm3之總體積。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1350mm3之總體 積。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1克至約1.5克之總質量。
在一些實施態樣中，該第二細胞培養基係經提供於選自由G-container及Xuri cellbag所組成之群組之容器中。
在一些實施態樣中，在步驟(e)中之該輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施態樣中，在步驟(b)中之該第一時期和在步驟(c)中之該第二時期係各分別於10日、11日、或12日的時期內來進行。在一些實施態樣中，在步驟(b)中之該第一時期和在步驟(c)中之該第二時期係各分別於11日的時期內來進行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)在約25天至約30天的時間內進行。在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)在約30天的時間內進行。在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)在約20天至約22天的時間內進行。在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)在以下進行。在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)和冷凍保存在22天或更短時間內進行。
在一些實施態樣中，步驟(b)至(e)在單個封閉系統中進行，其中在單個容器中進行步驟(b)至(e)導致每個切除的腫瘤的TIL產量增加。在多個容器中執行步驟(b)到(e)。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係在步驟(c)中的該第二時期之期間加至該等TIL而未開放該系 統。
在一些實施態樣中，從所述第三TIL群體獲得的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞表現出選自下組的一種或多種特徵：表現CD27 +，表現CD28 +，更長的端粒，增加的CD57表現，和相對於從所述第二細胞群獲得的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞，CD56表現降低。
在一些實施態樣中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，獲自該第三TIL族群之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現CD57表現增加和CD56表現下降。
在一些實施態樣中，微生物污染之風險相較於開放系統係減少的。
在一些實施態樣中，來自步驟(e)之該等TIL係經輸注至患者。
在一些實施態樣中，該密閉容器包含單一生物反應器。在一些實施態樣中，該密閉容器包含G-REX-10。在一些實施態樣中，該密閉容器包含G-REX-100。在一些實施態樣中，該密閉容器包含G-Rex 500。在一些實施態樣中，該密閉容器包含Xuri或Wave生物反應器透氣袋。
在一些實施態樣中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)擴增(expanding)為TIL治療族群之方法，其包含：(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中，其中該腫瘤碎 片包含第一TIL族群；(c)由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其包含效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞的次族群增加(相對於該第二TIL族群)，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系 統下而發生。
在一些實施態樣中，該方法亦包含作為第一步驟之：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自該患者所切除之腫瘤之第一TIL族群。
在一實施態樣中，該方法係體外或離體方法。
在一些實施態樣中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)擴增(expanding)為TIL治療族群之方法，其包含：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自該患者所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額 外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其包含效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞的次族群增加(相對於該第二TIL族群)，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生。
在一實施態樣中，該方法係體外或離體方法。
在一些實施態樣中，該方法其進一步包含使用冷凍保存程序冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含在步驟(f)中該經收獲之TIL族群。
在一些實施態樣中，該冷凍保存製程序使用1：1比例的經收穫之TIL族群對冷凍保存介質來進行。在一些實施態樣中，該冷凍保存介質包含二甲亞碸。在一些實施態樣中，該冷凍保存介質係選自由Cryostor CS10、 HypoThermasol、或彼等之組合所組成之群組。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施態樣中，該等PBMC係經照射且係同種異體(allogeneic)。
在一些實施態樣中，該等PBMC係在步驟(d)中於第9至14日中任一日加至該細胞培養。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在一些實施態樣中，步驟(e)中之該收獲係使用LOVO細胞處理系統來進行。
在一些實施態樣中，該等腫瘤碎片係多個碎片且包含約4個至約50個碎片，其中各碎片具有約27mm3之體積。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約30個至約60個碎片，具有約1300mm3至約1500mm3之總體積。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1350mm3之總體積。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1克至約1.5克之總質量。
在一些實施態樣中，該細胞培養基係經提供於選自由G-container及Xuri cellbag所組成之群組之容器中。
在一些實施態樣中，在步驟(f)中之該輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施態樣中，在步驟(c)中之該第一時 期和在步(e)中之該第二時期系各分別於10日，11日，或12日的時期內來進行。在一些實施態樣中，在步驟(c)中之該第一時期和在步(e)中之該第二時期系各分別於11日的時期內來進行。在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)係於約25日至約30日的時期內來進行。在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)係於約20日至約25日的時期內來進行。在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)係於約20日至約22日的時期內來進行。在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)系進行22日或更少。在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)和冷凍保存系進行22日或更少。
在一些實施態樣中，在步驟(e)中所收獲之該治療性TIL族群包含足夠的TIL以供治療有效劑量之TIL。在一些實施態樣中，足夠供治療有效劑量之TIL數量係約2.3×1010至約13.7×1010。
在一些實施態樣中，步驟(b)至(e)係在單一容器中來進行，其中，相較於在多於一個容器中進行步驟(b)至(e)，在單一容器中進行步驟(b)至(e)導致每經切除之腫瘤的TIL產量之增加。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係在步驟(d)中的該第二時期之期間加至該等TIL而未開放該系統。
在一些實施態樣中，治療TIL群體中的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞表現出選自下組的一種或多種特徵：表現CD27 +，表現CD28 +，更長的端粒，增加的 CD57表現和相對減少的CD56表現。從第二細胞群獲得的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞。
在一些實施態樣中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，獲自該第三TIL族群之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現CD57表現增加和CD56表現下降。
在一些實施態樣中，微生物污染之風險相較於開放系統係減少的。
在一些實施態樣中，來自步驟(f)之該等TIL係經輸注至患者。
在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約4個碎片。在一些實施態樣中，將4個片段置於G-REX-100中。在一些實施態樣中，4個片段的直徑為約0.5cm。在一些實施態樣中，將4個片段置於G-REX-100中。在一些實施態樣中，4個片段為約0.1，實施態樣中，4個片段的直徑為約0.1cm，0.2cm，0.3cm，0.4cm，0.5cm，0.6cm，0.7cm，0.8cm，0.9cm或1cm。將cm，0.2cm，0.3cm，0.4cm，0.5cm，0.6cm，0.7cm，0.8cm，0.9cm或1cm直徑放入G-REX-100中。在一些實施態樣中，4個片段是將約0.1cm，0.2cm，0.3cm，0.4cm，0.5cm，0.6cm，0.7cm，0.8cm，0.9cm或1cm的直徑放入容積與G-REX-100相當的容器中。在一些實施態樣中，4個片段的直徑為約0.5cm並置於G-REX-100中。在一些實施態樣中，4個片段的直徑為約0.5cm，並置於具有與G-REX-100相等體積的容器 中。
以下提供步驟(a)，(b)，(c)，(d)，(e)和(f)的進一步細節，包括例如但不限於標題“STEP”下描述的實施態樣。A：獲取患者腫瘤樣本“，”步驟B：首次擴增“，”步驟C：首次擴增至第二次擴增過渡“，”步驟D：第二次擴增“，”步驟E：收穫TILS“和”步驟F：最終制定/轉移到輸液袋“。
在一些實施態樣中，本公開提供了用於治療患有癌症的受試者的方法，該方法包括施用擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，其包含：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自個體所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第 二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其包含效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞的次族群增加(相對於該第二TIL族群)，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生；(g)使用冷凍保存程序隨意地冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含來自步驟(f)之該經收獲之TIL族群；以及(h)將自步驟(g)中該輸注袋的治療有效劑量之該第三TIL族群投予該患者。
在一些實施態樣中，本發明提供用於治療癌症的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的治療性群體，其中所述群體可從包括以下步驟的方法獲得：(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中，其中該腫瘤碎片包含第一TIL族群； (c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其包含效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞的次族群增加(相對於該第二TIL族群)，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生；以及 (g)使用冷凍保存程序隨意地冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含來自步驟(f)之該經收獲之TIL族群。
在一些實施態樣中，群體可通過還包括作為第一步驟的方法獲得：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自該患者所切除之腫瘤之第一TIL族群。
在一實施態樣中，該方法係體外或離體方法。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)中的任一個包含本文公開的一種或多種特徵，例如，在標題“步驟A：獲取患者腫瘤樣本”，“步驟B：首次擴增”，“步驟C：第一次擴增到第二次擴增過渡”，“步驟D：第二次擴增”，“步驟E：”下標明的一個或多個特徵收穫TILs和“步驟F：最終配方/轉移到輸液袋”。
在一些實施態樣中，步驟(g)包含本文公開的一種或多種特徵，例如，在標題“步驟H：TIL的任選冷凍保存”標題下公開的一個或多個特徵。在一些實施態樣中，步驟(h)包括本文公開的一個或多個特徵，例如，在“步驟F：1醫藥組成物，劑量和給藥方案”標題下公開的一種或多種特徵。
在一些實施態樣中，在步驟(e)中所收獲之該治療性TIL族群包含足夠的TIL以供在步驟(h)中投予治療 有效劑量之該等TIL。
在一些實施態樣中，足夠供在步驟(h)中投予治療有效劑量之TIL數量係約2.3×1010至約13.7×1010。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞(APC)係PBMC。
在一些實施態樣中，該等PBMC係在步驟(d)中於第9至14日中任一日加至該細胞培養。
在一些實施態樣中，其中，在步驟(h)中投予治療有效劑量TIL細胞之前，業經投予非骨髓淨除式淋巴球大量降低方案(non-myeloablative lymphodepletion regimen)於該患者。
在一些實施態樣中，提供了用於治療癌症並與非清髓性淋巴細胞清除方案組合的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的治療性群體。在一些實施態樣中，非清髓性淋巴細胞清除方案在之前施用。施用腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的治療群體。
在一些實施態樣中，該非骨髓淨除式淋巴球大量降低方案包含將劑量60mg/m2/日的環磷醯胺(cyclophosphamide)投予二日接著將劑量25mg/m2/日的氟達拉濱(fludarabine)投予五日之步驟。
在一些實施態樣中，在步驟(h)中將TIL細胞施用於患者後第二天開始用高劑量IL-2方案治療患者的步驟。
在一些實施態樣中，提供了用於治療癌症並 與高劑量IL-2方案組合的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的治療群體。在一些實施態樣中，高劑量IL-2方案開始。在給予治療TIL細胞群的第二天。
在一些實施態樣中，該高劑量IL-2給藥方案包含每八小時以15分鐘靜脈輸注速注(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000IU/kg，直到耐受。
在一些實施態樣中，TIL治療群體中的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞表現出選自表現CD27 +，表現CD28 +，更長端粒，增加CD57表現和減少的一種或多種特徵。相對於效應T細胞的CD56表現，和/或從第二細胞群獲得的中樞記憶T細胞。
在一些實施態樣中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，在該治療性TIL族群中之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現CD57表現增加和CD56表現下降。
本公開還提供了用於將腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)擴增到治療TIL群中的方法，包括：(a)將來自患者所切除之腫瘤之經處理之腫瘤碎片加入封閉系統中，以獲得第一TIL族群；(b)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL 族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(a)至步驟(b)之過渡係在未開放該系統下而發生；(c)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其包含效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞的次族群增加(相對於該第二TIL族群)，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)收獲獲自步驟(c)之該治療性TIL族群，其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(e)將自步驟(d)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(d)至(e)之轉移係在未開放該系統下而發生。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中所收獲之該治療性TIL族群包含足夠的TIL以供治療有效劑量之該等TIL。
在一些實施態樣中，足夠供治療有效劑量之TIL數量係約2.3×1010至約13.7×1010。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含使用冷凍保存程序冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含該經收獲之TIL族群。
在一些實施態樣中，使用1：1比例的收穫的TIL群體與CS10培養基進行冷凍保存過程。
在一些實施態樣中，本公開提供了用於治療患有癌症的受試者的方法，該方法包括施用擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，其包含：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自個體所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該 第三TIL族群係治療性TIL族群，其包含效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞的次族群增加(相對於該第二TIL族群)，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生；(g)使用冷凍保存程序隨意地冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含來自步驟(f)之該經收獲之TIL族群；以及(h)將自步驟(g)中該輸注袋的治療有效劑量之該第三TIL族群投予該患者。
其中，在步驟(a)至(h)的任何步驟中不進行TIL群體的選擇。在一個實施態樣中，在進行第二次擴增之前不進行基於表型選擇第二TIL群體(pre-REP群體)。步驟(d)。在一個實施態樣中，在步驟(a)至(h)的任何步驟中，不進行第一TIL群體，第二TIL群體，第三TIL群體或基於CD8表現的收穫TIL群體的選擇。
在一些實施態樣中，本發明提供用於治療具 有癌之個體之方法，該方法包含投予經擴增之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，其包含：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自個體所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其包含效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞的次族群增加(相對於該第二TIL族群)，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生； (e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生；(g)使用冷凍保存方法冷凍保存包含來自步驟(f)的收穫的TIL群的輸注袋，其中冷凍保存過程包括將冷凍保存介質與收穫的TIL群混合；(h)將自步驟(g)中該輸注袋的治療有效劑量之該第三TIL族群投予該患者。
其中在步驟(a)至(h)的任何步驟中不進行TIL群的選擇。在一個實施態樣中，在進行步驟(d)的第二次擴增之前，不進行基於表型的第二TIL群體(例如，REP前群體)的選擇。在一個實施態樣中，在步驟(a)至(h)的任何步驟中，不進行第一TIL群體，第二TIL群體，第三TIL群體或基於CD8表現的收穫TIL群體的選擇。在一些實施態樣中，非清髓性淋巴細胞清除方案在施用收穫的TIL群體之前施用。在一些實施態樣中，非清髓性淋巴細胞清除方案包括以60mg/m 2/天的劑量施用環磷醯胺兩天，然後以25mg/m 2/天的劑量施用氟達拉濱五天的步驟。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。在一些實施態樣中，該等PBMC係經照射且係同種異體(allogeneic)。在一些實施態樣中， 在步驟(c)的第9天至第14天中的任何一天將PBMC添加至細胞培養物中。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中之該收獲係使用LOVO細胞處理系統來進行。
在一些實施態樣中，該方法包括在步驟(d)中通過LOVO細胞處理系統收穫，例如由Fresenius Kabi製造的LOVO系統。術語“LOVO細胞處理系統”還指可以在無菌和/或封閉系統環境中泵送包含細胞的溶液通過膜或過濾器(例如旋轉膜或旋轉過濾器)的任何儀器或裝置，允許連續流動和細胞處理以除去上清液或細胞培養基而不造粒。在一些情況下，細胞處理系統可以在封閉的無菌系統中進行細胞分離，洗滌，流體交換，濃縮和/或其他細胞處理步驟。
在一些實施態樣中，該等腫瘤碎片係多個碎片且包含約4個至約50個碎片，其中各碎片具有約27mm3之體積。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約30個至約60個碎片，具有約1300mm3至約1500mm3之總體積。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1350mm3之總體積。在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1克至約1.5克之總質量。
在一些實施態樣中，該等多個碎片包含約4個碎片。在一些實施態樣中，將4個片段置於G-REX-100 中。在一些實施態樣中，4個片段的直徑為約0.1cm，0.2cm，0.3cm，0.4cm，0.5cm，0.6cm，0.7cm，0.8cm，0.9cm或1cm。在一些實施態樣中，4個片段的直徑為約0.1cm，0.2cm，0.3cm，0.4cm，0.5cm，0.6cm，0.7cm，0.8cm，0.9cm或1cm，並置於G-REX-中。100。在一些實施態樣中，將4個片段直徑為約0.1cm，0.2cm，0.3cm，0.4cm，0.5cm，0.6cm，0.7cm，0.8cm，0.9cm或1cm放入具有等量體積的容器中。到G-REX-100。在一些實施態樣中，4個片段的直徑為約0.5cm並置於G-REX-100中。在一些實施態樣中，4個片段的直徑為約0.5cm，並置於與G-REX-100等量的容器中。
在一些實施態樣中，該細胞培養基係經提供於選自由G-container及Xuri cellbag所組成之群組之容器中。
在一些實施態樣中，在步驟(e)中之該輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施態樣中，在步驟(b)中之該第一時期和在步驟(c)中之該第二時期係各分別於10日、11日、或12日的時期內來進行。在一些實施態樣中，在步驟(b)中之該第一時期和在步驟(c)中之該第二時期係各分別於11日的時期內來進行。在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)在約25天至約30天的時間內進行。在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)在約20天至約25天的時間內進行。在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)在約20天至約22天的時間內進行。在 一些實施態樣中，步驟(a)至(e)係進行22日或更少。在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)和冷凍保存係進行22日或更少。
在一些實施態樣中，步驟(b)至(e)係在單一容器中來進行，其中，相較於在多於一個容器中進行步驟(b)至(e)，在單一容器中進行步驟(b)至(e)導致每經切除之腫瘤的TIL產量之增加。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係在步驟(c)中的該第二時期之期間加至該等TIL而未開放該系統。
在一些實施態樣中，在治療性TIL群體中獲得的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞表現出一種或多種選自表現CD27 +，表現CD28 +，更長端粒，增加CD57表現的特徵，和相對於從第二細胞群獲得的效應T細胞和/或中樞記憶T細胞，CD56表現降低。
在一些實施態樣中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，在該治療性TIL族群中之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現CD57表現增加和CD56表現下降。
在一些實施態樣中，微生物污染之風險相較於開放系統係減少的。
在一些實施態樣中，來自步驟(e)之該等TIL係經輸注至患者。
在一些實施態樣中，該密閉容器包含單一生 物反應器。在一些實施態樣中，該密閉容器包含G-REX-10。在一些實施態樣中，密閉容器包含G-REX-100。
實施例
現在參考以下實施例描述在本文中包括的實施態樣。提供這些實施例僅用於說明的目的，並且在本文中包括的本揭露不應被解釋為限於這些實施例，而是應該被解釋為包括由於本文提供的教示而變得明顯的任何和所有變化。
實施例1：封閉系統檢定
如本文所討論的，開發了用於在封閉系統中從患者腫瘤產生TIL的規程和檢定。
該實施例描述了一種新的簡化方法，用於從G-REX裝置中患者切除的腫瘤組織產生臨床相關數量的TIL並最終細胞產物的冷凍保存。該程序的其他態樣在實施例2至8中描述。
定義/縮寫
BSC-生物安全櫃
℃-攝氏度數
CO2-二氧化碳
CD3-分化簇3
CM1-完全培養基1
CM2-完全培養基2
TIWB-腫瘤分離洗滌緩衝液
CM4-完全培養基4
CRF-控速冷凍機
EtOH-乙醇
GMP-優良製造規範
IL-2、rIL-2-介白素-2、重組人介白素-2
IU-國際單位
L-升
LN2-液態氮
mL-毫升
μl-微升
mM-毫莫耳濃度
μm-微米
NA-不適用
PBMC-周邊血液單核細胞
PPE-個人保護配備
REP前(預REP)-源自腫瘤碎片之初始TIL培養
REP-快速擴增規程
TIL-腫瘤浸潤淋巴細胞
TIWB-TIL分離洗滌緩衝液
SOP-標準操作程序
程序
1. 預先準備：第0天(提前36小時執行)
1.1通過用50μg/mL慶大霉素補充500mL Hanks平衡鹽溶液製備TIL分離洗滌緩衝液(TIWB)。對於10mg/mL慶大霉素原液，將2.5mL轉移至HBSS。對於50mg/mL原液，將0.5mL轉移至HBSS。
1.2. 根據LAB-005製備含有GlutaMaxTM的CM1培養基“用於製備用於CM2說明的PreREP和REP的培養基”。在4℃下儲存至24小時。在使用前允許在37℃下加熱至少1小時。
1.3. 從-20℃冰箱中取出IL-2等分試樣並將等分試樣置於2-8℃冰箱中。
2.腫瘤組織的再獲取
2.1. 保存所有接受腫瘤組織的文書工作，並獲得運輸容器和腫瘤組織的照片。
2.2. 如果提供了TempTale打印並保存了相關文檔；保存了PDF。
2.3. 從托運人處取出腫瘤標本和二級容器(拉鍊袋)並儲存在4℃直至準備處理。
2.4在HypoThermasol中運輸未使用的腫瘤或在CryoStor CS10中運輸冷凍片段(均可從BioLife Solutions，Inc。商購)。
3.TIL的腫瘤處理
3.1. 根據需要將以下材料無菌轉移至BSC，並根據下表3進行標記。
3.2. 用字母A-J標記腫瘤碎片盤的圓圈。
3.3.用字母A-J標記有利組織盤的孔的下側。
3.4.將5mL慶大霉素轉移至HBSS瓶中。標記為TIWB。
3.5.旋轉混合。
3.6.將50mL TIWB移液至以下各項：
1.洗1碟
2.洗2碟
3.洗3碟
4.洗4碟
3.7.將2mL TIWB移液到有利組織培養皿的A-J孔中。
3.8.用相應的腫瘤碎片盤(6孔板蓋)覆蓋有利的組織盤(6孔板底部)。
3.9.使用長鑷子，從樣本瓶中取出腫瘤並轉移到Wash 1培養皿中。
3.10.將腫瘤在環境溫度下在Wash 1培養皿中孵育3分鐘。
3.11.在孵育期間，重新標記樣品瓶“Bioburden”並在2-8℃下儲存，直至進入品質控制進行測試。
3.12.Dardarded長鑷子和使用短鑷子進行進一步操作。
3.13.使用鑷子將腫瘤轉移到Wash 2培養皿中。
3.14.在室溫下在Wash 2培養皿中孵育腫瘤3分鐘。
3.15.使用鑷子將腫瘤轉移到Wash 3培養皿中。
3.16.在Wash 3培養皿中在環境中孵育腫瘤3分鐘。
3.17.從有利的組織盤(6孔板底)取出腫瘤碎片盤(6孔板蓋)並將腫瘤碎片盤倒置在BSC表面上。
3.18.使用移液管，在腫瘤碎片培養皿的每個圓圈中添加大約4個均勻間隔的單個TIWB滴。
3.19.在解剖盤下面放一把尺子。
3.20.使用鑷子將腫瘤轉移至解剖盤。
3.21.在解剖盤下使用標尺，測量並記錄腫瘤的長度。
3.22.對於大於1厘米的腫瘤，製作了額外的有利組織盤。
3.23.在解剖培養皿中對腫瘤碎片進行初步解剖，製成10個中間片，並註意保存每個中間片的腫瘤結構。
3.24.將未被主動解剖的任何中間腫瘤塊轉移到Wash 4 培養皿中，以確保組織在整個解剖過程中保持水合。
3.25.一次使用一個中間腫瘤片，在解剖盤中將腫瘤小心地切成最多3x3x3mm的碎片，使用盤下面的尺子作為參考。當手術刀變鈍時，用新的手術刀替換。
3.26.繼續從中間腫瘤塊解剖碎片，直到評估中間片中的所有組織。
3.27.選擇有利的片段並使用轉移移液管將最多4個有利片段轉移到腫瘤碎片培養皿中的一個圓中的TIWB滴中。
3.28.使用轉移移液管將任何剩餘的有利碎片從腫瘤塊轉移到有利組織培養皿中的相應孔中。
3.29.使用移液管盡可能多地將不利的組織和廢物轉移到不利的組織盤中以清除解剖盤。黃色脂肪組織或壞死組織顯示不利的組織。
3.30.通過對剩餘的中間腫瘤塊重複步驟7.3.25-7.3.30繼續處理，一次處理一個中間片，直到所有腫瘤都已處理完畢。
3.31.如果在腫瘤碎片盤的相應圓圈中可獲得的腫瘤碎片少於4個，則可以使用來自有利組織培養皿的非相應孔的碎片來實現40個碎片目標。當小於40時將10-40個片段置於單個G-Rex 100M燒瓶中。
4. 播種G-Rex 100M燒瓶
4.1. 根據需要將以下材料無菌轉移至BSC，並根據下表4進行標記。
4.2. 用1mL IL-2儲備溶液(6×106IU/mL)補充每升CM1。
4.3. 如下表5所示，在每個G-REX 100M生物反應器中放置1000mL預熱的CM1，其含有6,000IU/mL的IL-2。
4.4. 使用轉移移液管，將適當數量的腫瘤片段轉移至每個G-Rex 100M燒瓶，按表5分配片段。
4.5. 當轉移到G-Rex 100M燒瓶中的一個或多個腫瘤碎片漂浮時，如果可從有利組織培養皿獲得一個另外的腫瘤片段並將其轉移到G-Rex 100M燒瓶中。
4.6. 記錄添加到每個燒瓶中的碎片總數。
4.7. 丟棄了不利的紙巾。
4.8. 將每個G-REX 100M生物反應器置於37℃，5%CO 2培養箱中。
4.9. 當有超過40個碎片時：
4.9.1. 當獲得>41個片段時，在第二個G-REX 100M生物反應器中放置1000mL預熱的完全CM1。
5. 高級準備：第11天(提前24小時準備)
5.1. 用GlutaMax製備6L CM2。用於“製備用於PreReP和REP的培養基”的CM2說明書的參考實驗室程序“。在使用前1小時在37℃下進行。
5.2. 解凍IL-2等分試樣：從冰箱中取出IL-2等分試樣並置於4℃。
6.Harvest TIL(第11天)
6.1. 小心地從培養箱中取出G-REX-100M燒瓶並置於BSC2中。小心不要打擾燒瓶底部的細胞。
6.2. 使用GatherRex或蠕動泵吸出約900mL來自燒瓶的細胞培養上清液。
6.3. 通過輕輕旋轉燒瓶重懸TIL。觀察到所有細胞已從膜中釋放出來。
6.4. 使用蠕動泵或GatherRex將殘留的細胞懸浮液轉移至適當大小的血液轉移包(300-1000mL)。小心不要將碎片轉移到血液轉移包中。
6.5. 使用4“等離子轉移裝置將轉移包裝釘好(確保夾具已關閉)。
6.6. 按摩包裝以確保細胞懸液充分混合併使用3mL注射器，取出1mL TIL懸浮液進行細胞計數。用新的無菌魯爾蓋蓋住管道並重新蓋上母魯爾連接器。
6.7. 將轉移包放入塑料拉鍊袋中並更換到培養箱中直到準備使用。
7. 培養基準備
7.1. 允許的介質在37℃下加熱>1小時。
7.2. 添加3mL 6x10 6IU/mL原液rhIL-2至6L CM2，使最終濃度為3,000IU/mL rhIL-2.Label為“完全CM2”。
7.3. 將帶有母魯爾接頭的4“等離子傳輸裝置無菌焊接到1L轉移包裝。
7.4. 將500mL完全CM2轉移至1L轉移包裝。離去的流體轉移裝置或注射器，並將無菌魯爾接頭連接至母魯爾端口。
7.5. 用樣品現場耦合器釘上包裝。
7.6. 使用帶有針頭的1.0mL注射器吸取150μL的1mg/mL抗CD3(株OKT3)並通過樣品位點耦合器轉移至500mL“完全CM2”。回到注射器上以確保所有試劑均從保存在37℃直至使用。
8. Flask準備
8.1. 使用燒瓶上的刻度將4.5L“完全CM2”轉移至G-REX-500M燒瓶以供參考。
8.2. 將燒瓶置於37℃培養箱中直至準備好。
9. Thaw輻射饋線
9.1. 使用來自兩個或更多供體的5.0×109同種異體輻射飼養器。
9.2. 從LN2冷凍機中取出餵料器並放入生物危害運輸袋中。
9.3. 使用生物危害運輸袋中的飼料袋，在37℃培養箱或珠浴中解凍餵食器。保持靜態和浸沒的袋子。當幾乎完全解凍但仍然冷卻時，從浴缸中移除餵食器。
9.4. 用70%EtOH噴塗或擦拭進料袋並置於BSC2中。將每個進料袋直接加入到開放的G-Rex 500M中以確保足夠數量的經輻照的細胞(5×10 9個細胞，+/- 20%)。
9.5. 關閉帶有公魯爾鎖的fenwal Y型連接器上的兩個夾具。
9.6. 用Y連接器的一條腿釘住每個送料袋。
9.7. 用500mL“完全CM2”+ OKT3取出1L轉移包並轉移至BSC。
9.8. 無菌地將60mL注射器連接到3通旋塞，並將轉移包無菌地連接到旋塞的陽端。
9.9. 無菌地將Y連接器連接到3通旋塞。
9.10. 將進料袋的全部內容物注入注射器，記錄體積，並將5.0×109同種異體輻射的餵養細胞分配到轉移包裝中。
9.11. 從設備上拆下和分離轉移包裝，並用新的無菌 魯爾塞塞住母魯爾鎖。
9.12. 使用針頭和3mL注射器從樣品位點耦合器中取出1mL進行細胞計數。
9.13. 當達到+/- 10%的目標細胞數(5.0×109)且生存率>70%時，繼續進行。
9.14當達到目標細胞數(5.0×109)不到90%時，生存率>70%解凍另一個袋並重複7.9.4-7.9.12。當達到大於110%的靶細胞數時，計算所需細胞劑量所需的適當體積並繼續進行。
10. 在G-REX 500M燒瓶中共培養TIL和飼養細胞
10.1. 從培養箱中取出含有製備培養基的G-REX 500M燒瓶並置於BSC2中。
10.2. 將附加的餵養細胞轉移到G-REX-500M，並允許袋中的內容物排入500M。
10.3. 從培養箱中移除TIL懸浮液並置於BSC中。
10.4. 計算加入的TIL懸浮液體積，使活細胞達到200×106。
(TVC/mL)/200×106=mL
10.5. 當TIL在5-200×106總活細胞之間時，將所有TIL(總體積)加入到G-REX-500M中。當TIL計數大於200×106總活細胞時，加入計算所需體積為200×將10 TIL分配至個體G-REX-500M。將剩餘的TIL旋轉並在CS10中至少兩個冷凍瓶中冷凍至最高108/mL，用TIL鑑定標記並冷凍日期。
10.6. 將G-REX-500M在37℃，5%CO 2培養箱中放置5天。
11. 高級準備：第16-18天
11.1. 對於在37℃下至少1小時或直至準備使用的那些以大於50×106 TIL開始的培養物，以1×10L袋AIM V為小於50×106 TIL的培養物加溫2。
12. 執行TIL細胞計數：第16-18天
12.1. 從培養箱中取出G-REX-500M燒瓶，置於BSC2中。小心不要打擾燒瓶底部的細胞培養物。
12.2. 從G-REX-500M燒瓶中無菌移除4L細胞培養基並置於無菌容器中。
12.3. 旋轉G-REX-500M，直到所有TIL都從膜上重新懸浮。
12.4. 使用GatherRex或蠕動泵將細胞懸浮液轉移到2L轉移包裝中。將500M燒瓶取出後再使用。用樣品位耦合器密封端口以避免TIL丟失。
12.5. 用樣品位點耦合器加入轉移包，並使用3mL注射器和針頭取出2×1mL獨立樣品進行細胞計數。
12.6. 根據下式計算傳代培養所需的燒瓶總數。重新分級。
活細胞總數/1.0 x109=燒瓶#
13. Parepare CM4
13.1. 每需要兩個500M的燒瓶，準備一個10L的AIM-V袋。必要時加入額外的培養基。
13.2. 每需要10升AIM-V，加入100毫升GlutaMAX製成CM4。
13.3. 補充有rhIL-2的CM4培養基，終濃度為3,000IU/mL rhIL-2。
14. 分裂細胞培養物
14.1. 在燒瓶上使用刻度，重力將每個G-REX-500M填充到5L。
14.2. 甚至在計算出的G-REX-500M數量中分配TIL量。
14.3. 在37℃，5%CO 2培養箱中放置燒瓶直至REP第22天收穫。
15. 高級準備：第22-24天
15.1. 通過向兩個1L PlasmaLyte A 7.4.Pool袋中的每一個中加入40mL 25%HSA，將2L 1%HSA洗滌緩衝液製備成LOVO輔助袋。
15.2. 補充200mL CS10，IL-2 @ 600IU/mL。
15.3. 在4℃下預先冷卻4個750mL鋁製冷凍罐。
16. Harvest TIL：第22-24天
16.1. 從37℃培養箱中取出G-REX-500M燒瓶並置於BSC2中。小心不要打擾燒瓶底部的細胞培養物。
16.2. 從每個燒瓶中分離並棄去4.5L細胞培養物上清液。
16.3. 旋轉G-REX-500M燒瓶以完全重懸TIL。
16.4. 使用前稱取3-5L生物加工袋。
16.5. 使用GatherRex或蠕動泵，將TIL收集到生物加工袋中。
16.6. 混合袋並使用3mL注射器從注射器樣品端口取2×2mL樣品進行細胞計數。
16.7. 稱重袋子，發現初始和最終重量之間的差異。使用下面的計算來確定細胞懸浮液的體積。
細胞懸浮液淨重(mL)/1.03=體積(mL)
17. 過濾TIL並準備LOVO Source bag
17.1. 將含有細胞培養物的袋子放入BSC2中。
17.2. 將170μm血液過濾器放入BSC2並關閉所有夾子。
17.3. 將過濾器的源腿焊接到細胞懸浮液上。
17.4. 稱量一個新的適當大小的生物過程袋(這被稱為LOVO源袋)。
17.5. 將過濾器的末端焊接到LOVO源袋上。
17.6. 通過將細胞懸掛在靜脈輸液架上來增加細胞懸液，以建立細胞的重力流轉移。
注意：(不允許源袋懸掛在過濾裝置上。)
17.7. 打開所有必要的夾子，讓TIL通過過濾器從細胞懸浮袋中排出，進入LOVO源袋。
17.8. 一旦將所有細胞轉移到LOVO源袋中，關閉所有夾子並密封LOVO源袋管以移除過濾器。
17.9. 稱量LOVO源袋併計算體積。
17.10. LOVO源袋準備好用於LOVO。
17.11. 通過密封袋子附近的管子，從一次性套件中移除LOVO最終產物袋。
18. 在補充有600IU/mL rhIL-2的冷CS10中配製TIL 1：1
18.1. 計算所需的冷凍袋數量。
(volume of cell product x 2)/100=number of required bags(round down)
18.2. 計算分配到每個袋子的體積。.
(volume of cell product x 2)/number of required bags=volume to add to each bag
18.3. 將表6中的下列材料無菌轉移至BSC。
19. TIL配方
19.1. 關閉Cell Connect CC1上的所有夾具。
19.2. 將細胞連接裝置無菌連接LOVO最終產物， CS10袋魯爾鎖和適當數量的冷凍袋。用100mL注射器替換60mL注射器。
19.3. 所需的CS10體積量等於LOVO最終產物袋的體積。
19.4. Opened旋塞途徑和鬆開LOVO最終產物袋和注射器之間的線拉CS10入注射器，重新夾緊CS10 path.Unclamped途徑對細胞袋推CS10入LOVO最終產物bag.Used注射器來測量添加到LOVO最終產物袋中的體積。根據需要使用新注射器重複，直到轉移所需量的CS10。
19.5. 通過倒置混合LOVO最終產物袋。
19.6. 更換100mL注射器
19.7. Opened夾在750毫升冷凍袋上，一次一個
19.8. 僅打開與配方產物直接相關的夾具和使用中的冷凍袋。
19.9. 使用100mL注射器測量導致冷凍袋的配製產物的體積。
19.10. 將100mL配製產物轉移到每個冷凍袋中。
19.11. 添加到每個袋子後，拉回注射器以去除冷凍袋中的所有氣泡並重新夾緊相關的線。
19.12. 在最後一個袋子上拉回10mL保留物用於QC測試。
19.13. 密封每個冷凍袋，留下盡可能少的管子。
19.44. 取出含有保留樣品的注射器，轉移到50mL錐 形管中；將1.5ml轉移到單獨的冷凍管中並冷凍到控制速率的冷凍器中。
19.15. 將密封袋轉移至4℃，同時製備標籤。
19.1. 用產物描述，名稱和日期，體積，細胞計數和活力標記每個冷凍標籤。
19.17.將每個冷凍袋放入預先冷卻的鋁冷凍罐中。
20.使用控制速率冷凍機(CRF)冷凍保存TIL
20.1. 控制速率冷凍機的標準程序。
20.2. 使用CRF後，將冷凍袋存放在液氮(LN2)中。
21. 確定預期結果並衡量驗收標準。
實施例2：對8名患者腫瘤的過程運行
使用8個患者腫瘤進行實施例1的過程以產生8批TIL。從培養物，活力，細胞計數，CD3 +(指示%T細胞含量)和IFN-γ(IFN-g或IFN)恢復良好。獲得-γ)釋放，如下表7和圖7至圖10所示。
實施例3：修改TIL過程的可擴增性
此處呈現的研究在過程開發(PD)實驗室中進行，隨後，在製造工廠的GMP潔淨室套件中進行利用工程運行的過程認證(PQ)研究。三個PQ/工程運行是根據資格認證規程在GMP設施潔淨室完成，並根據此處提出的PD研究進行批次記錄。前瞻性地設定了工程運行的接受標準.PQ研究進一步總結如下，並為工程獲得測試結果批次在以下部分中提供。
從快速前擴增方案(pre-REP)培養物產生的細胞數量經常超過100×106個活細胞。此外，包括Pre-REP和REP培養步驟之間的凍融循環減少了活細胞。通過消除過程中的冷凍保存步驟，REP可以通過增加TIL的數量可靠 且定期地啟動。這種變化允許REP的持續時間減少一定比例的細胞倍增時間至大約11天。此外，從活化到收穫的培養時間縮短導致產物分化程度較低，並且可能更好地在體內持續存在(Tran 2008)。
PD研究用最多200×10 6個細胞和固定數量的飼養細胞驗證了REP培養物的啟動。然後在9至14天內評估收穫REP培養物的最佳時間。培養物在飼養細胞接種。TIL比率範圍從100：1到25：1。通過測量總細胞計數，活力，免疫表型，培養基消耗，代謝物分析，白血球介素-2(IL-2)分析和所述功能分析來確定收穫時間的優化。下面。
基於下表8中列出的標誌物評估REP培養結束時細胞的免疫表型分析。評估細胞的表型活化和分化狀態。在任何細胞中均未觀察到表型的統計學差異。實驗條件。
縮寫：PE/Cy7=藻紅蛋白(Phycoerythrin)；Cy-7 Tandem Conjugate；PerCP-Cy5.5=Peridinin-chlorophyll-protein Complex：CY5.5 Conjugate；PE=Phycoerythrin；FITC=Fluorescein Isothiocyanate Conjugate；APC-H7=Allophycocyanin：H7 Tandem Conjugate；APC=Allophycocyanin；PB=Pacific BlueTM
對於所有測試條件，培養基消耗和代謝物產生保持在可容忍的限度內；IL-2水平和IL-2水平保持大於150IU/mL培養上清液(數據未顯示)。
通過T細胞殺傷腫瘤細胞被理解為響應於腫瘤細胞表面上呈遞的肽而在效應T細胞上活化T細胞受體介導。體外擴增的T細胞必須保留如果它們在輸注時在體內持續存在並且介導腫瘤消退，則響應於TCR活化而被活化和增殖的能力。
為了評估培養細胞的活化潛力，在負載有OKT3的經輻照的同種異體PBMC中重新活化在不同時間點收穫的TIL .7天後收穫培養物並測定折疊擴增。本研究的結果總結在表9中。
該研究證明，在該測定中TIL活化的可能性隨著培養的每一天到第11天(收穫第9-11天)而增加。在修改過程的第11天收穫的細胞與對照TIL維持相似。培養14 天，類似於當前的過程。
這些研究證明了修飾的TIL過程的可擴增性並且建立了TIL與飼養細胞的接種比例的可接受範圍。此外，發現生長特徵在培養的第14天持續，而培養條件在日仍然是最佳的。11.測試的條件顯示對TIL表型沒有可測量的影響。在REP培養第11天收穫的細胞表現出最佳的響應再活化的能力，同時細胞培養條件保持在耐受範圍內。這些變化被採用並且在文化分裂時全面驗證。發生在第5天，第11天收穫。
在程序開發設施中實施工程運行，以便在GMP製造自體TIL產物之前獲得製造和測試TIL產物的經驗，用於向患者施用。用於工程運行的製造程序是相同的。用於製造GMP TIL產物的規模。從各種類型的腫瘤(包括黑色素瘤，乳腺癌，頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)，子宮頸癌和肺癌的轉移)中生長TIL的經驗已經確定對於這些癌症，來自轉移性腫瘤樣本的TIL的解剖和生長是相似的(Sethuraman 2016，JITC P42)。因為腫瘤組織的腫瘤碎片的初始分離和淋巴細胞的生長似乎相似，所以這些工程運行足以使該過程合格。用於從HNSCC，宮頸和黑色素瘤腫瘤中產生TIL。
表10顯示了用於工程運行的腫瘤樣品的來源和特徵。
如下所述完成了在程序開發設施中TIL的三次工程運行的釋放測試(表11)。在第16天和第22天測試產物。還測定了三次工程運行的IFN-γ分泌(表12)詳述其他地方。
* 第16天和第22天的最終無菌結果直到最終產物發貨後才可用。第22天的革蘭氏染色結果用於無菌運輸釋放。
總之，來自工程試驗的數據證明可以製造TIL藥物產物用於向患者自體給藥的目的。
實施例4：淋巴球大量降低
細胞計數可在第7天和淋巴細胞清除之前進行。最終細胞產物包括至多約150×109個活細胞，其配製在Plasma-Lyte A TM(體積/體積)中的最小50% HypoThermosol TM中，並且含有300IU/mL IL2的高達0.5%的HSA(與人類輸注相容)。最終產物可以兩個容量之一用於輸注：
1)當收穫的總TIL為250mL時(在300mL容量的輸液袋中)75×109
OR
2)收穫的總TIL為500mL(在600mL容量的輸液袋中)<150×109
由於在REP步驟期間患者與患者之間T細胞擴增速率的變化，不能預測每個患者可為最終TIL輸注產物產生的細胞總數。在3至14天REP的第3,4,5,6,7天的細胞下限基於使用環磷醯胺加氟達拉濱化療來決定淋巴細胞消 化所需的最小細胞數量來設定養生之道。一旦我們開始基於這個最小的細胞數進行淋巴細胞清除，我們將致力於在第3天至第14天的任何一天，以及在許多情況下第7天，在REP中使用我們產生的TIL的可用數量來治療患者。輸注範圍(150×109活細胞)基於安全輸注的已知公佈的上限，其中已達到臨床反應。Radvanyi等，Clin Cancer Res 2012,18,6758-6770。
實施例5：程序2A-第0天
該實施例描述了實施例1至4中描述的2A過程的詳細第0天方案。
製備
1. 確認的腫瘤洗滌培養基，CM1和IL-2在有效期內。
2. 將CM1(細胞培養基1)置於培養箱中。
方法
1. 清潔生物安全櫃(BSC)。
2. 設置過程中的監控板，並在程序中留在生物安全櫃中1-2小時。
3. 將TIL培養基CM1放入生物安全櫃中。
4. 製備含有6000IU/mL IL-2的TIL培養基CM1：
4.1. 1L CM1
4.2. 1ml IL-2(6,000,000IU/mL)
4.3. 將25ml的CM1+IL2置於50ml錐形中，當加入G-REX時用於片段。
4.4. 置於37℃培養箱中預熱
5. 用70%酒精擦拭G-REX 100MCS包裝並放入生物安全櫃中。除濾芯外，關閉所有夾具。
6. 執行相思泵校準。
7. 將G-REX 100MCS燒瓶的紅線連接到金合歡泵套管的出口管線上。
8. 連接泵送到泵靴的入口管線並放入帶有介質的瓶子中。釋放夾子以泵送靴子。
9. 在每個G-REX 100MCS生物反應器中泵送剩餘的975ml預熱的CM1，其含有6,000IU/ml的IL-2。
10. 加熱密封紅線，斷開泵啟動。
11. 在G-REX上放置標籤。
12. 將G-REX 100MCS置於培養箱中直至需要.
切組織
1.記錄腫瘤處理的開始時間。
2.將腫瘤洗滌培養基轉移至BSC。
3.在生物安全櫃中放置5個100毫米培養皿，3個用於洗滌，1個用於保持，1個用於不利組織。相應標記的菜餚。黃色脂肪組織或壞死組織表明不利組織。
4.將三個6孔板放入生物安全櫃中。
5.將3-5mL腫瘤洗滌培養基移液到一個六孔板的每個 孔中以獲得過量的腫瘤塊。
6.移取50mL腫瘤洗滌培養基以洗滌培養皿1-3並保持培養皿。
7.將兩個150毫米的解剖盤放入生物安全櫃中。
8.將3個無菌的50mL錐形管置於BSC中。
9.標記一個作為鑷子腫瘤清洗介質，第二個標記為手術刀腫瘤清洗介質，第三個標記用於用於蓋滴的腫瘤清洗介質。
10.向每個錐形物中加入5-20mL腫瘤洗滌介質。在腫瘤清洗和解剖過程中，根據需要將鉗子和手術刀浸入腫瘤清洗介質中。
11.將scapel和鑷子放入適當的管中。
12.使用長鑷子從標本瓶中取出腫瘤並轉移到Wash 1培養皿中。
13.將腫瘤在Wash 1培養皿中在環境中孵育3分鐘。
14.在孵育期間，重新標記樣品瓶“Bioburden”並在2-8℃下儲存直至最終收穫或需要進一步的無菌測試。
15.使用鑷子將腫瘤轉移到Wash 2培養皿中。
16.將腫瘤在Wash 2培養皿中在環境中孵育3分鐘。
17.在孵育期間，使用轉移移液管，將大約4個均勻間隔的單獨的腫瘤洗滌培養基滴加到指定為腫瘤碎片培養皿的6孔板蓋的每個圓圈中。
18.使用鑷子將腫瘤轉移到Wash 3培養皿中。
19.將腫瘤在Wash 3培養皿中在環境溫度下孵育3分 鐘。
20.使用150mm盤蓋進行解剖。在下面放置了一把尺子。
21.使用鑷子將腫瘤轉移到解剖盤中，測量並記錄腫瘤的長度。
22.拍攝腫瘤照片。
23.將解剖盤中的腫瘤塊初始解剖成中間片，注意保存每個中間片的腫瘤結構。
24.將未被主動解剖成片段的任何中間腫瘤塊轉移到組織保持盤中，以確保組織在整個解剖過程中保持水合。
25.一次處理一個中間腫瘤片，在解剖盤中將腫瘤小心地切成約3×3×3mm的碎片，使用盤下面的規則作為參考
26.繼續從中間腫瘤塊解剖碎片，直到評估中間片中的所有組織。
27.選擇的有利片段並使用轉移移液管將多達4個有利片段轉移到洗滌培養基中，在腫瘤碎片培養皿中以一個圓圈滴下。使用移液管手術刀或鑷子，盡可能多地將不利的組織和廢物轉移到不利的組織盤中以清除解剖盤。將所有剩餘的組織放入六孔板的一個孔中。(黃色脂肪組織或壞死組織表明不利組織。)
28.通過對剩餘的中間腫瘤塊重複步驟23-26繼續處理，一次處理一個中間片直至整個腫瘤已被處理。(根據需要獲得新鮮的手術刀或鑷子，由加工技師決定。)
29.將碎片板移向發動機罩後部。
30.使用轉移移液管，scapel或鑷子將多達50個最佳腫瘤碎片轉移到50mL錐形管中，標記含有CM1的腫瘤碎片。
31.用移液管從50mL錐形管中取出浮子。記錄的碎片和浮子數量。
32.從罩子中取出所有不必要的物品，如果它們含有額外的碎片，則保留有利的組織板。用酒精擦拭濕巾。
33.從培養箱中取出G-REX 100MCS，用70%酒精擦拭並放入生物安全櫃中。
34.用腫瘤碎片旋轉錐形，將內容物倒入50ml錐形瓶中，注入G-Rex 100MCS燒瓶中
35.如果轉移到G-Rex 100M燒瓶中的一個或多個腫瘤碎片漂浮，當從有利組織培養皿獲得時獲得一個另外的腫瘤片段並將其轉移至G-Rex 100M燒瓶。
36.記錄的培養箱#(s)和添加到每個燒瓶中的片段總數。
37.將G-REX 100M生物反應器置於37℃，5%CO2培養箱中
38.將任何未使用的腫瘤置於100mL HypoThermosol中並送至實驗室。
39.記錄腫瘤處理的停止時間。
40.丟棄任何未使用的含有IL-2的TIL完全培養基和任何未使用的IL-2等分試樣。
41.清潔生物安全櫃。
42.將Bioburden樣品置於適當的儲存條件下。
43.記錄的數據。
44.將圖片保存為文件樣本ID #腫瘤處理日期到準備好的患者文件。
45.訂購併確保向微生物實驗室提供定居板。
實施例6：程序2A-第11日
該實施例描述了實施例1至4中描述的2A過程的詳細第11天方案。
在先製備。
1.處理前一天：
1.1.可在加工發生前一天製備CM2。在4℃下放置。
2.處理日。
2.1.準備好餵食器細胞束。
2.1.1.關閉CC2和4S-4M60連接器組上的所有夾具。
2.1.2.將4個4S-4M60線束無縫焊接到CC2上的尖釘線上，去除尖釘。
2.1.3.留出飼養細胞匯集。
2.2.每個CTF-FORM-318製備5mL冷凍保存培養基並置於4℃直至需要。
潔淨室環境監測-預處理
1.記錄潔淨室信息。
2.用大飽和酒精擦拭物或酒精噴霧清潔生物安全櫃 (BSC)。
3.在開始處理之前，驗證粒子計數10分鐘。
4.設置過程中的監控板，並在程序中留在生物安全櫃中1-2小時。
準備G-Rex 500MCS燒瓶：
1.使用10mL注射器通過未使用的無菌母魯爾連接器將每升CM2(細胞培養基2)的0.5mL IL-2(原液為6×106IU/mL)無菌轉移到生物過程袋中。
2.使用注射器中的過量空氣清除管線，從袋中取出一些培養基並排回到後面。這確保所有IL-2與培養基混合。混合均勻。
3.打開外部包裝並將G-Rex 500MCS放置在BSC中。除了大型過濾器管路外，設備上的所有夾子都已關閉。
4.將紅色收穫線從G-Rex 500MCS無菌焊接到泵管出口管線。
5.連接的生物加工袋母魯爾接頭連接到泵套的公魯爾接頭。
6.將生物過程袋懸掛在靜脈注射桿上，打開夾子並將4.5升CM2培養基泵入G-Rex 500MCS。清除管線，夾緊和熱封。
7.保留從泵到介質的管線。在準備飼養細胞時使用。
8.將G-Rex 500MCS置於培養箱中。
製備經輻照的飼養細胞
1.從IL TP密封並去除尖刺。夾住兩條線。
2.記錄1L轉移包(TP)的干重。
3.將1L轉移包無菌焊接到金合歡泵靴上，距離袋子約12英寸。
4.泵管的另一端仍然連接到10L實驗室。
5.將500mL重量的CM2泵入TP中。
6.閉合夾緊並密封接近焊接接頭。
7.放入培養箱中。
8.驗證並註銷了送紙器袋。
9.使用記錄的飼料批次。
10.用酒精擦拭袋子。
11.放在拉鍊鎖袋中。
12.在37℃(+/- 1℃)水浴中解凍飼養細胞。記錄水浴溫度。
13.取出並用紗布擦乾。
14.通過飼養細胞通過準備室。
15.轉移到潔淨室的BSC。
16.使用先前準備的餵養細胞線束，將帶有介質的1L TP焊接到3通旋塞的樣品端口側的未使用的管線之一，盡可能靠近密封接頭，盡可能少地移除管道。
17.將饋線線束放入BSC。
18.將3個進料袋中的每一個與餵養細胞線束中的長 釘一起釘入進料袋的單個端口。
19.旋轉旋塞閥，使1L TP處於“OFF”位置。
20.一次使用一個袋子，將線上的夾子打開到進料袋，排出注射器中的空氣並將進料袋的內容物吸入注射器。來自注射器的驅散空氣有助於恢復細胞。閉合夾到送料袋。
21.記錄每個袋中解凍的飼養細胞的回收量。
22.旋轉旋塞閥，使進料袋處於“OFF”位置
23.打開TP上的夾子，將注射器中的內容物分配到TP中。
24.確保線路已被清除並重新夾緊TP。您可能不得不從TP中吸取一些空氣進入注射器用於清理生產線。
25.將細胞充分混合。
26.閉合夾到送料袋。
27.旋轉旋塞閥使注射器端口處於“OFF”位置。將60mL注射器從旋塞閥上斷開。
28.換上每個餵食袋的新注射器。
29.在最後一個袋子後留下注射器。
30.混合的最終飼料配方。
31.旋轉旋塞，使飼養細胞懸浮液處於“關閉”位置。
32.混合細胞細胞並使用5mL注射器和不必要的端口，用一些細胞溶液沖洗端口以確保准確取樣並取出1ml細胞，放入標記用於計數的管中。
33.用第二個注射器重複。這兩個獨立的樣品各自進 行一次細胞計數。
34.轉動旋塞，使餵料器懸浮液處於“打開”位置，並使用連接的60ml注射器將排出的空氣帶入TP以清除管線。
35.用新的無菌帽取下注射器和帶蓋的魯爾端口。
36.加熱密封TP靠近焊接接頭，拆下線束。
37.用細胞懸浮液記錄轉移包的質量併計算細胞懸浮液的體積。
38.放在孵化器中。
39.對飼養細胞樣本進行單個細胞計數並記錄數據並將計數原始數據附加到批記錄中。
40.記錄了Cellometer計數程序。
41.驗證了正確的稀釋度已輸入Cellometer。
42.計算飼養轉移包中的總活細胞密度。
43.如果細胞計數<5×10 9，則解凍更多細胞，計數並添加到飼養細胞中。
44.重新稱重餵料袋併計算體積。
45.計算要去除的細胞體積。
向G-REX添加飼養細胞
1.將4“轉移裝置無菌焊接到餵養細胞TP上。
2.在BSC中，將適當大小的注射器連接到焊接到餵養細胞轉移包的母魯爾接頭上。
3.充分混合細胞並除去步驟40或41中計算的體積以獲得5.0×10 9個細胞。丟棄不需要的細胞。
4.使用1mL注射器和18G針頭吸取0.150mL OKT3，取出針頭並通過母魯爾接頭轉移至餵養細胞TP。
5.沖洗管和注射器，帶有飼養細胞和混合袋。用注射器中的空氣清除管線。
6.從培養箱中取出G-Rex 500MCS，用酒精擦拭物擦拭並放在SCD旁邊。
7.將進料袋無菌焊接到G-Rex 500MCS上的紅線上。鬆開管線，讓進料池通過重力流入燒瓶。
8.確保線路已完全清除，然後將線路熱封至原始焊縫附近並取下送料袋。
9.將G-Rex 500MCS送回培養箱並記錄時間。
準備TIL：記錄TIL收穫的時間開始
1.小心地從培養箱中取出G-Rex 100MCS並關閉除大過濾器外的所有夾具。
2.將1L轉移包焊接到G-REX 100MCS的紅線上。
3.封閉在300ml TP上。熱封距離袋子約12英寸，去除釘子。記錄乾重/質量。
4.將300mL轉移包無菌焊接到靠近熱封的100MCS上的細胞收集管線上。緊緊抓住這條線。
5.釋放所有通向1L TP的夾具。
6.使用GatheRex將~900mL培養上清液轉移至1L轉移包中。當空氣進入生產線時，Gatherex停了下來。夾緊線和熱封。
7.旋轉燒瓶，直到所有細胞都從膜上脫離。檢查膜以確保所有細胞都脫落。
8.傾斜燒瓶遠離收集管並允許腫瘤碎片沿邊緣沉降。
9.將燒瓶慢慢傾向收集管，使碎片保留在燒瓶的另一側。
10.使用GatheRex將殘留的細胞懸浮液轉移到300mL轉移的包裝中，避免腫瘤碎片。
11.重新檢查所有細胞是否已從膜上移除。
12.如有必要，通過釋放GatheRex上的夾子進行反洗，並允許一些介質通過重力流入G-Rex 100MCS燒瓶。
13.劇烈敲擊燒瓶以釋放細胞並泵入300ml TP。
14.收集完成後，關閉紅線和熱封。
15.加熱密封收集管線，留下與記錄乾重時大致相同長度的管道。
16.記錄含有細胞懸浮液的300ml TP的質量(包括乾質量)併計算細胞懸浮液的體積。
17.在BSC加標300mL TP，用4“等離子體轉移裝置。混合細胞很好。無菌連接5mL注射器吸取1mL，置於低溫小瓶中。用第二個注射器重複。這些用於細胞計數，活力。
18.用新的無菌魯爾蓋重新夾緊並更換魯爾蓋。
19.置於培養箱中，記錄在培養箱中的時間點。
20.對每個樣品執行單個細胞計數並記錄數據並將計數原始數據附加到批記錄中。
21.記錄了Cellometer計數程序。
22.驗證了正確的稀釋度輸入了Cellometer。
23.如果必要，將總活TIL密度調整為2×108活細胞。
24.計算要移除的音量或不必要的音符調整。
25.在BSC中，無菌地將適當大小的注射器連接到300mL TP上。
26.如果需要，刪除在“計算要移除的體積”表中計算的計算的細胞體積。
27.夾緊並熱封300ml TP。
28.將過量的細胞轉移到適當大小的錐形管中，並置於培養箱中，蓋上蓋子以便稍後冷凍保存。
29.從培養箱中取出G-Rex 500MCS並放在SCD旁邊。
30.將300ml TP無菌焊接到Acacia泵的入口管線上。
31.將G-Rex 500MCS的紅線無菌焊接到Acacia泵的出口管線上。
32.將細胞泵入燒瓶中。
33.確保線已完全清除，然後將紅線熱封到原始焊縫附近。
34.檢查除大型過濾器管路外，G-Rex 500MCS上的所有夾具均已關閉。
35.將G-Rex 500MCS送回培養箱並記錄G-Rex培養箱中的時間。
36.訂購併確保向微生物實驗室提供定居板。
過量之冷凍保存
計算加入細胞的冷凍培養基的量：
37.在完全制動和完全加速的情況下，在20℃下將TIL以400 x g旋轉5分鐘。
38.無菌吸出的上清液。
39.輕輕敲打管底部，將細胞重新懸浮在剩餘的液體中。
40.輕輕敲打管子的同時緩慢加入準備好的冷凍介質。
41.將其等分到適當大小的冷凍管中並記錄置於-80℃的時間單元。
實施例7：程序2A-第16日
該實施例描述了實施例1至4中描述的2A過程的詳細第16天方案。
潔淨室環境監測-預處理。
1.生物安全櫃用大飽和酒精擦拭物或酒精噴霧清潔。
2.在開始處理之前，驗證粒子計數10分鐘。
3.設置過程中監控板，並在程序中留在生物安全櫃中1-2小時。
收穫和計數TIL。
1.在37℃培養箱中至少30分鐘或在準備使用之前，將一個10L袋的CM4加熱至低於50x106 TIL的培養物。
2.在BSC無菌地將Baxter延伸裝置連接到10L Labtainer袋。
3.將G-Rex 500MCS燒瓶從培養箱中取出並放在靠近GatheRex的檯面上。檢查除了大過濾器線以外的所有夾子都是關閉的。將夾子移到靠近“T”連接處的快速連接線上。
4.通過Baxter延伸線上的可焊接管將10L Labtainer無菌焊接到G-Rex 500MCS上的紅色收穫線。
5.將2L轉移包密封在“Y”下方2“處，去除長釘並記錄乾重。將2L TP焊接到G-Rex 500MCS上的透明收集線上。
6.將G-Rex 500MCS設置在水平表面上。
7.鬆開通向10L Labtainer的所有夾子，並使用GatheRex將~4L培養上清液轉移到10L Labtainer中。
8.根據適當的GatheRex收穫說明收穫。
9.扣住紅線並記錄TIL收穫時間。
10.當空氣進入生產線時，GatheRex停了下來。扣住了紅線。
11.除去上清液後，旋轉燒瓶直至所有細胞都從膜上脫離。將燒瓶傾斜以確保軟管位於燒瓶邊緣。
12.釋放通向2L TP的所有夾具並使用GatheRex將殘留的細胞懸浮液轉移到2L TP中，保持傾斜的邊緣直至收集 所有細胞。
13.檢查粘附細胞的膜。
14.如有必要，通過釋放紅線上的夾子進行反洗，並允許一些介質通過重力流入燒瓶。
15.關閉紅線和三重熱封。
16.劇烈敲擊燒瓶以釋放細胞。
17.將細胞添加到2L TP。
18.加熱密封2升轉移包，留下與記錄乾重時大致相同長度的管。
19.保留了G-Rex 500MCS，它在拆分中重複使用。
20.記錄具有細胞懸浮液的轉移包的質量併計算細胞懸浮液的體積。
21.確定細胞懸浮液體積，包括乾重。
22.將4“轉移裝置無菌焊接到細胞懸浮袋中。
23.在BSC中輕輕混合細胞，用20cc注射器吸取11ml並等分，如表14所示：
1.熱封。關閉保持夾具的魯爾接頭
2.標記並將細胞懸浮液置於培養箱中並記錄放置在培養箱中的時間。
3.計算新量。
4.基於細胞懸浮液的體積和2L轉移包中的記錄體積，去除QC(11mL)的體積。
5.接種和訂購無菌試驗。
6.將支原體樣品保存在待定架子中的4℃下進行支原體檢測。
7.留出直到TIL播種。
細胞計數：
進行單細胞計數和記錄數據並將計數原始數據附加到批記錄中。記錄稀釋。記錄細胞計數器計數程序。驗證正確的稀釋度進入細胞計數器。
方法繼續：
1. 計算傳代培養所需的燒瓶總數
**重新使用原始容器和其他容器的圓形部分。
IL-2加入CM
1.在BSC中放置10L袋Aim V和Glutamax。
2.用4英寸等離子轉移裝置加入介質袋。
3.將18G針頭連接到10mL注射器上，並將5mL IL-2吸入注射器(最終濃度為3000IU/ml)。
4.取下針頭並將注射器無菌地連接到血漿轉移裝置上，並將IL-2分配到袋子中。
5.用空氣沖洗管線，抽出一些介質並分配到袋子裡。這保險所有的IL-2都在介質中。
6.重複剩餘的Aim V袋。
準備G-REX500MCS燒瓶
1.確定添加到燒瓶中的CM4量。記錄每個燒瓶中加入的細胞體積和CM4 5000mL-A的體積。
2.關閉除大型過濾器線以外的所有夾具。
3.將Acacia泵的入口管線無菌焊接到裝有CM4的介質袋上的4“等離子轉移裝置上。
4.通過紅色收集管線將泵的出口管線無菌焊接到G-Rex 500MCS。
5.使用燒瓶上的管線作為指導，將確定量的CM4泵入G-Rex 500MCS。
6.加熱密封G-Rex 500MCS紅線。
7.對每個燒瓶重複步驟4-6。可以使用重力填充或多個泵同時填充多個燒瓶。可將“Y”型連接器焊接到泵的出口管線上，並將兩個臂焊接到兩個同時填充的G-Rex 500MCS燒瓶上。
8.將燒瓶置於37℃，5%CO 2中。
用TIL播種至燒瓶
1.關閉G-Rex 500MCS上的所有夾具，除了大型過濾器線
2.無菌焊接細胞產物袋到Acacia泵的入口管線。
3.將泵的另一端無菌焊接到G-Rex 500MCS的紅線上。
4.將泵啟動泵放入泵中。
5.將細胞產物袋置於分析天平上並記錄時間TIL加入G-REX燒瓶中。
6.調整餘額。
7.假設1g=1mL，未夾緊的線和泵將所需的細胞體積按重量計入G-Rex 500MCS。
8.將細胞袋倒置並抽空以清除管線。加熱密封紅線G-Rex 500MCS。在培養箱中放置燒瓶。
9.通過紅色收集管線將泵的出口管線無菌焊接到下一 個G-Rex 500MCS
10.混合細胞很好。
11.對所有燒瓶重複細胞轉移。
12.將燒瓶置於37℃，5%CO 2中並記錄時間TIL加入G_REX燒瓶中。
13.對微生物實驗室的定居板進行有序測試。
14.記錄的入藏號碼。
15.有氧和無氧無菌的有序測試。
16.確保將板和瓶送到微生物實驗室。
流氏或過量細胞的冷凍保存：
1.計算所需的冷凍介質量：
a. 靶細胞濃度為1×108/ml；記錄去除的總細胞數。靶細胞濃度為1×10 8個細胞/mL。計算要添加的冷凍介質的總體積。
2.製備冷凍保存介質並置於40℃直至需要。
3.在20℃下將TIL以400 x g旋轉5分鐘，完全制動並完全加速。
4.無菌吸出的上清液。
5.輕輕敲打管底部，將細胞重新懸浮在剩餘的液體中。
6.輕輕敲打管子的同時緩慢加入準備好的冷凍介質。
7.等分到適當大小的標記冷凍管中。
8.將小瓶放入Frosty先生或同等產物中，置於-80℃冰箱中。
9.在72小時內轉移到永久性儲存地點，記錄並記錄日期和時間放置在-80℃冰箱中。
實施例8：程序2A-第22日
該實施例描述了實施例1至4中描述的2A方法的詳細第22天方案。
文件否定過程中無菌結果
在開始收穫之前，從微生物學實驗室獲得第16天初步無菌結果。如果結果是陽性，則聯繫實驗室主任或指定人員以獲得進一步的指示。
潔淨室環境監測-預處理
1.在開始處理之前，驗證粒子計數10分鐘。
2.生物安全櫃用大飽和酒精擦拭物或酒精噴霧清潔。
3.設置過程中監控板，並在程序中留在生物安全櫃中1-2小時。
預先製備
1.在BSC中無菌地將Baxter延伸裝置連接到10L實驗室袋或同等物.Label LOVO濾液袋。
2.在BSC中放置三個1L袋PlasmaLyte A.
3.準備好的泳池並標記為1%HSA的PlasmaLyte A袋：
3.1.關閉4S-4M60連接器組上的所有夾具，並加上每 個PlasmaLyte袋。
3.2.將4S-4M60的一個公端焊接到Acacia泵套的入口管線上。
3.3.將泵套的出口管線焊接到3升收集袋上。將3L袋上的所有夾子關閉，除了泵送管線。
3.4.將3升Plasmalyte泵入3升袋中。如有必要，通過倒轉泵從3L袋中取出空氣。
3.5.關閉除母魯爾線以外的所有夾具。
3.6.使用兩個100mL注射器和16-18G針頭，裝入120mL 25%HSA.Red加蓋注射器。
3.7.將一個注射器連接到3升袋上的母魯爾接頭，並將HSA轉移到3L PlasmaLyte袋中。混合均勻。
3.8.用第二個注射器重複。
3.9.好混。
3.10.關閉所有夾具。
3.11.使用10mL注射器，從3升袋上的無針口取出含有1%HSA的5mL PlasmaLyte。
3.12.蓋上注射器並保持在BSC中用於IL-2稀釋。
3.13.關閉所有夾具。
3.14.加熱密封件從泵套上移除母魯爾線。
3.15.標記的LOVO洗滌緩衝液和日期。在環境溫度下24小時內暴露。
IL-2製備
1.將5mL注射器中的分配的Plasmalyte/1%HSA分配到標記的50ml無菌錐形管中。
2.向含有PlasmaLyte的試管中加入0.05mL IL-2原液。
3.標記的IL-2 6X104
4.加蓋標籤並儲存在2-8℃。記錄量。
製備細胞
1.關閉10L Labtainerbag上的所有夾子。在Attach Baxter擴增部分通過luer連接設置到10L袋。
2.從37℃中取出G-REX 500M燒瓶
3.將G-Rex 500MCS的紅色介質去除管線無菌焊接到10L生物處理袋上的延伸裝置。
4.將透明細胞去除管線從G-Rex 500MCS無菌焊接到3L收集袋並標記為“混合細胞懸浮液”。
5.未夾緊的紅線和10L袋。
6.使用GatheRex泵，減少第一個燒瓶的體積。
注意：如果檢測到氣泡，則泵可能會過早停止。如果完全減容未完全重新活化GatheRex泵。
7.關閉上清液袋和紅線上的夾子。
8.旋轉G-REX 500M燒瓶直至TIL完全重懸，同時避免飛濺或起泡。確保所有細胞都從膜上脫落。
9.在透明線和3L細胞袋上打開夾子。
10.傾斜G-Rex燒瓶，使細胞懸浮液合併在收集吸管所在的燒瓶側面。
11.開始GatherRex收集細胞懸液。注意：如果細胞收集吸管不在壁和底膜的連接處，則在以45°角平舖時敲擊燒瓶通常足以正確定位吸管。
12.確保從燒瓶中取出所有細胞。
13.如果細胞保留在燒瓶中，將100mL上清液加回到燒瓶中，旋轉，並收集到細胞懸浮液袋中。
14.封閉夾在細胞收集袋的線上。在GatheRex上發布了夾子。
15.加熱密封清晰的G-Rex 500MCS系列。
16. G-Rex 500MCS的加熱密封紅線。
17.對於其他燒瓶重複步驟3-16。
18.每隔一個燒瓶後，必要時需要更換10L上清液袋。
19.可以使用多個GatherRex。
20.已處理的G-Rex 500MCS的記錄數量。
21.加熱密封細胞收集袋。記錄收集的G-REX數量。
22.用一個標記在一個新的3升收集袋上用一個女性魯爾連接器標記~2英寸。
23.加熱密封並移除標記下方的母魯爾接頭。
24.標記為LOVO Source Bag
25.記錄乾重。
26.關閉170μm血液過濾器的所有夾子。
27.將過濾器的末端無菌焊接到標記正下方的LOVO源袋。
28.將過濾器的源管線無菌焊接到含有細胞懸浮液的 袋子上。
29.通過將細胞懸掛在靜脈輸液架上來升高細胞懸液，以啟動細胞的重力流轉移。(注意：不允許源袋懸掛在過濾裝置上。)
30.打開所有必要的夾子，讓TIL通過過濾器從細胞懸浮袋中排出，進入LOVO源袋。
31.將所有細胞轉移到LOVO源袋後，關閉所有夾子，在標記正上方加熱密封並分離以除去過濾器。
32.混合袋充分並使用兩個3mL注射器從注射器樣品端口取2個獨立的2mL樣品用於細胞計數和活力。
33.稱重袋子並確定初始和最終重量之間的差異。
34.記錄數據並放入培養箱中，包括乾質量。
細胞計數
對每個樣品進行單個細胞計數並記錄數據並將原始數據附加到批次記錄中。記錄細胞計數計數程序。驗證正確的稀釋度進入細胞計數器。確定有核細胞總數。確定的TNC數量移除以保留=1.5×1011個細胞用於LOVO處理。將移出的細胞放入適當大小的容器中以便處理。
LOVO收穫
在先前製備中設置的具有Baxter延伸的10L Labtainer是稍後焊接到LOVO套件的替換濾液袋。在屏幕顯示上並且跟隨屏幕顯示轉動LOVO。
檢查稱重秤和壓力傳感器
訪問儀器操作配置文件：
1.觸摸信息按鈕。
2.觸摸儀器設置選項卡。
3.觸摸儀器操作配置文件按鈕。
4.顯示儀器操作配置文件。
檢查重秤
1.確保任何稱重秤上沒有任何物品懸掛，並檢查每個秤的讀數。
2.如果任何刻度讀數超出0 +/- 2g範圍，則按照製造商的稱量標定手冊中的描述進行稱重秤校準。
3.如果所有秤均在公差範圍內且沒有重量懸掛，則在每個秤(# 1-4)上懸掛1公斤重物並檢查讀數。
4.當懸掛1千克重物時，如果任何刻度尺在1000 +/- 10g範圍之外讀取，則按照製造商的LOVO操作員手冊中的描述進行稱重刻度校準。
檢查壓力傳感器
1.檢查儀器操作配置文件屏幕上的壓力傳感器讀數。
2. N/A：如果壓力傳感器讀數超出0 +/- 10mmHg，則按照製造商的LOVO操作手冊中的說明在維修模式下存儲新的大氣壓設置。
a. 觸摸儀器操作配置文件屏幕上的檢查按鈕。
b. 觸摸“儀器設置”選項卡上的複選按鈕。
3.如果已執行稱重秤校准或已存儲新的大氣壓力設置，請重複相關章節。
為了開始該過程，從規程選擇屏幕上的下拉菜單中選擇“TIL G-Rex Harvest”規程，然後按開始。
1.顯示程序設置屏幕。
2.觸摸解決方案信息按鈕。
3.解決方案1顯示屏幕。查看解決方案1所需的清洗緩衝液類型。(應讀取PlasmaLyte。)
4.觸摸下一步按鈕進入解決方案2屏幕。查看解決方案2所需的清洗緩衝液類型。(應顯示“無”，表示規程已配置為僅使用一種類型的清洗緩衝液，勃)
5.觸摸解決方案2信息屏幕上的複選按鈕以返回到程序設置屏幕。
6.觸摸過程信息按鈕。
7.顯示過程信息屏幕。
8.觸摸用戶ID輸入字段。將顯示一個鍵盤。輸入執行者和驗證者的姓名首字母。觸摸按鈕接受輸入。
9.觸摸Source ID輸入字段。將顯示一個鍵盤。輸入產物批號#。觸摸按鈕接受輸入。
10.觸摸過程ID輸入字段。將顯示一個鍵盤。輸入“TIL Harvest”。觸摸按鈕接受輸入。
11.如果有額外的記錄要記錄，請觸摸程序記錄輸入字段。顯示一個鍵盤。輸入任何記錄。觸摸按鈕接受輸 入。
注意：“程序註釋”輸入字段是可選的，可以留空。
12.觸摸過程信息屏幕上的檢查按鈕返回過程設置屏幕。
13.驗證過程信息按鈕中顯示“檢查”。如果未顯示“檢查”，請再次觸摸“過程信息”按鈕，並確保“用戶ID”，“源ID”和“過程ID”字段都具有條目。
14.觸摸參數配置按鈕。
15.顯示一般程序信息屏幕。
16.觸摸Source Volume(mL)輸入字段。顯示數字小鍵盤。輸入表1中計算的細胞懸浮液體積(mL)
17.觸摸按鈕接受輸入。
18.觸摸Source PCV(%)輸入字段。顯示TIL(可行+死亡)屏幕。
19.觸摸細胞濃度輸入字段。顯示數字小鍵盤。以“x 106/mL”為單位輸入源產物中表14中的總細胞濃度/mL。條目範圍從00.0到99.9。觸摸按鈕接受輸入並返回“常規過程信息”屏幕。注意：在接受細胞濃度後，通用程序信息屏幕上的源PCV(%)輸入字段顯示由LOVO計算的PCV%，基於操作員輸入的細胞濃度條目。
20.在“常規步驟”屏幕上，觸摸“下一步”按鈕以前進到第4頁的第4頁，即最終產物體積(滯留量)屏幕。注意：屏幕2和3沒有任何輸入字段供操作員填寫。
21.顯示最終產物量(滯留量)屏幕。
22.使用表15中的總有核細胞(TNC)值，確定下表中的最終產物目標體積(表16)。在LOVO程序設置期間輸入與該單元格範圍相關的最終產物體積(mL)。
23.要從表16中指定指定的體積，請觸摸最終產物體積(mL)輸入字段。顯示數字小鍵盤。以mL為單位輸入所需的最終產物體積。觸摸按鈕接受輸入。
24.觸摸最終產物體積(滯留量)屏幕以返回到程序設置屏幕。注意：屏幕5-8沒有任何輸入字段供操作員填寫。
25.驗證參數配置按鈕中是否顯示“檢查”。如果未顯示“檢查”，請再次觸摸“過程信息”按鈕，並確保第1頁上的源捲和源PCV具有條目。還確保選中Target Minimum Final Product Volume複選框或最終產物體積(mL)字段在第4頁上有條目。
26.觸摸屏幕右上角的Estimate Button。
27.顯示“估計摘要”屏幕。確認Source和PlasmaLyte Wash Buffer的足夠和準確的值。
28.加載一次性套件：通過選擇幫助按鈕“(？)”按照屏幕說明加載套件。
29.記下濾液和溶液1顯示的體積(讀取PlasmaLyte)
30.記下濾液和溶液1顯示的體積(讀取PlasmaLyte)。
31.有關裝載一次性套件的說明，請觸摸幫助按鈕或按照操作員手冊中的說明進行詳細說明。
32.裝入標準LOVO一次性套件後，觸摸下一步按鈕。將顯示“容器信息和位置”屏幕。從# 3級去除濾液袋。
33.對於此規程，Filtrate容器為New and Off Scale
34.如果Filtrate容器已顯示為New and Off-Scale，則不會進行任何更改。
35.如果Filtrate容器類型顯示為Original，請觸摸Original按鈕切換到New。
36.如果Filtrate位置顯示為On-Scale，則觸摸On-Scale按鈕切換到Off-Scale。
37.如果要生成的濾液量2500mL，則濾料容器位置顯示為按比例放置為了運行之間的一致性，濾料容器位置已更改為不成比例且容器類型為“新”。
38.觸摸On-Scale按鈕切換到Off-Scale。附帶的轉移裝 置使用無菌焊接技術，用10升袋替換LOVO一次性套件濾液容器。打開焊縫。
39.將濾液容器放在檯面上。沒有將濾液袋掛在# 3秤上。在該過程中，# 3稱重秤是空的。
40.打開通向濾液容器的管道上的任何塑料夾。注意：如果在焊接過程中將管道從F夾具中取出，則更換為夾具。
41.觸摸Filtrate Container Capacity輸入字段。顯示數字小鍵盤。輸入總新的濾液容量(10,000mL)。觸摸“檢查”按鈕接受輸入。
42.採用無菌焊接技術，用10升袋替換LOVO一次性套件濾液容器。打開焊縫。注意：如果在焊接過程中從F夾具中取出管道，則更換為夾具。
43.將新的Filtrate容器放在檯面上。沒有將濾液袋掛在# 3秤上。在該過程中，# 3稱重秤是空的
44.打開通向濾液容器的管道上的任何塑料夾子。
45.對於Retentate容器，屏幕顯示Original和On-Scale。
46.沒有對Retentate容器進行任何更改。
47.如果對Filtrate容器進行了所有更改並輸入了相應的信息，請觸摸Next按鈕。
48.一次性套件乾檢查疊加顯示。檢查套件是否已正確裝入，然後按“是”按鈕。
49.所有LOVO機械夾自動關閉，並顯示檢查一次性套 件安裝屏幕。LOVO經過一系列加壓步驟來檢查套件。
50.成功通過一次性套件檢查後，將顯示“連接解決方案”屏幕。
51. 3L是洗滌量。在屏幕上輸入此值。
52.使用無菌焊接技術將3升的PlasmaLyte袋連接到通過夾具1的管道上。打開焊縫。
把靜脈輸液袋掛在靜脈輸液架上，
54.打開通往PlasmaLyte袋的管道上的任何塑料夾子。
55.驗證Solution Volume條目是3000mL。這是先前輸入的。
56.觸摸下一步按鈕。顯示一次性套件Prime疊加。驗證PlasmaLyte已連接，並且通向PlasmaLyte的管道上的任何焊接和塑料夾都打開，然後觸摸Yes按鈕。注意：由於在LOVO過程中僅使用了一種類型的清洗緩衝液(PlasmaLyte)，因此沒有溶液附著在通過夾具2的管道上。在此過程中，該管道上的羅伯茨夾具保持關閉狀態。
57.啟動一次性套件，顯示啟動一次性套件屏幕。目視觀察到PlasmaLyte通過連接到PlasmaL Lyte袋的管道移動。如果沒有流體移動，按下屏幕上的暫停按鈕，確定夾具或焊接是否仍然關閉。問題解決後，按屏幕上的“繼續”按鈕恢復一次性套件Prime。
58.當一次性套件素數成功完成時，顯示連接源屏幕。
59.對於此規程，Source容器為New and Off-Scale
60.如果Source容器已顯示為New和Off-Scale，則不進行任何更改。
61.如果Source位置顯示為On-Scale，則觸摸On-Scale按鈕切換到Off-Scale。
62.觸摸源容量(mL)輸入字段。顯示數字小鍵盤。輸入包含Source產物的容器的容量。觸摸檢查按鈕接受輸入。注意：源容量條目用於確保源包能夠保存在Source Prime階段添加到包中的其他解決方案。
63.使用無菌焊接技術將源容器連接到穿過夾具S的管道。打開焊縫。根據需要從夾具上取下管子。
64.確保將源管更換為S夾。
65.觸摸下一步按鈕。顯示Source Prime疊加層。驗證Source已連接到一次性套件，並且通向Source的管道上的任何焊接和塑料夾都打開，然後觸摸Yes按鈕。
66.源素數開始並顯示啟動源屏幕。目視觀察到PlasmaLyte正在通過連接到Source袋的管道移動。如果沒有流體移動，按下屏幕上的暫停按鈕，確定夾具或焊接是否仍然關閉。問題解決後，按屏幕上的“繼續”按鈕恢復Source Prime。
67. Source Prime成功完成後，顯示Start Procedure Screen。
68.按下“開始”按鈕。出現“預洗循環1”暫停屏幕，其中包含“塗抹IP，混合源”的說明。
69.預塗IP袋。
70.在按下“開始”按鈕之前，從稱重秤# 2中取出IP袋(也可以從IP頂部端口管道導管上取下管道)並手動將其翻轉，以便在一次性套件初始步驟中添加洗滌緩衝液以塗覆所有內部袋子的表面。
71.將IP袋重新懸掛在# 2的稱重秤上(左側袋子上的標籤)。如果已移除，則更換管道導向器中的頂部端口管。
72.混合源袋。
73.在按下“開始”按鈕之前，從稱重秤# 1中取出源袋並將其倒置幾次，以形成均勻的細胞懸浮液。
74.在電子秤# 1或IV桿上重新放入源袋。確保包沒有擺動。
75.按下“開始”按鈕。
76. LOVO開始處理源袋中的液體並顯示洗滌循環1屏幕。
在LOVO過程期間，系統自動暫停以允許操作員與不同的袋子交互。在不同的暫停期間顯示不同的屏幕。遵循每個屏幕的相應指令。
源沖洗暫停
排出源袋後，LOVO將洗滌緩衝液添加到源袋中以沖洗袋。在將已配置體積的洗滌緩衝液添加到源袋後，LOVO自動暫停並顯示源沖洗暫停屏幕。
當顯示源沖洗暫停屏幕時，操作員：
1.從稱重秤# 1中取出源袋。
1.多次倒入Source袋，讓洗滌緩衝液接觸整個袋子內 部。
2.將源袋重新懸掛在# 1的稱重秤上。確保源袋在稱重秤# 1上沒有擺動。
3.按下“恢復”按鈕。
LOVO處理來自源袋的沖洗流體，然後繼續進行自動化程序。
混合IP袋暫停
為了製備另一次通過旋轉器的細胞，用洗滌緩衝液稀釋IP袋。在將洗滌緩衝液加入IP袋後，LOVO自動暫停並顯示“混合IP袋”暫停篩選。
當顯示“混合IP包”暫停屏幕時，操作員：
1.從稱重秤# 2上取下IP袋。也可以從IP頂部管道導管上取下管子。
2.將IP袋倒置數次以徹底混合細胞懸浮液。
3.將IP袋重新懸掛在# 2的稱重秤上。如果已拆下，還要更換管道導向器中的IP頂部端口管。確保IP袋沒有在秤# 2上擺動。
4.按下“恢復”按鈕.LOVO開始處理IP袋中的液體。
按摩IP角暫停
在LOVO程序的最後洗滌循環期間，將細胞從IP袋泵送通過旋轉器，並且到達保留物(最終產物)袋。當IP袋是空的時，添加10mL洗滌緩衝液。IP袋的底部端口 用於沖洗袋子。加入沖洗液後，LOVO自動暫停並顯示“按摩IP角落”暫停屏幕。
當顯示“按摩IP角落”暫停屏幕時，操作員：
1.沒有從稱重秤# 2上取下IP袋。
2.將IP袋仍然懸掛在# 2的稱重秤上，按摩袋的角部以使任何殘留的細胞懸浮。
3.確保IP袋沒有在# 2秤上擺動。
4.按下“繼續”按鈕。
5. LOVO開始從IP袋中抽出沖洗液。
在LOVO程序結束時，顯示刪除產物屏幕。當顯示此屏幕時，可以操作LOVO套件上的所有袋子。
注意：在刪除產物屏幕顯示之前，請勿觸摸任何袋。
將止血劑放置在非常靠近滯留物袋上的端口的管上，以防止細胞懸浮液沉降到管中並在止血劑下方三重熱密封。
通過破壞中間密封去除滯留物袋並轉移到BSC。
遵循移除產品屏幕上的說明
觸摸下一步按鈕。所有LOVO機械夾打開，顯示移除套件屏幕。
遵循“移除套件”屏幕上的說明。完成後繼續。
觸摸下一步按鈕。關閉所有LOVO機械夾並顯示結果摘要屏幕。從表17中的結果摘要屏幕記錄數據。 關閉所有泵和過濾的支持。
觸摸下一步按鈕。顯示規程選擇屏幕。
LOVO關閉程序
1.確保所有夾具均已關閉，過濾器支撐處於直立位置。
2.觸摸LOVO正面的STOP按鈕。
3.顯示STOP按鈕決策覆蓋。
4.顯示Shutdown Confirmation Overlay。
5.觸摸是按鈕。顯示關閉屏幕。
6.幾秒鐘後，顯示電源關閉屏幕。顯示此屏幕時，使用儀器左後方的開關關閉LOVO。
在表格中記錄最終配製的產品體積。
計算最終產品表中所需的IL-2的量
確定冷凍袋的數量和保留體積
在目標體積上標記並保留低於冷凍保存袋數量和產品保留樣品體積的表格。
靶向體積/袋計算：(最終配製體積-由於未獲得100%回收的體積調整=10mL)/#袋。
製備具有1：1(體積：體積)CS10(CryoStor 10，BioLife溶液)和IL-2的細胞。
1.組裝連接設備
1.1.將CS750冷凍袋無菌焊接到CC2 Cell Connect設備上，替換每個袋子的遠端公魯爾端部之一。
1.2.將夾具保持在關閉位置。
1.3.標記袋1-4。
2.用IL-2和連接的裝置製備細胞。
2.1.在BSC尖峰中，細胞產品袋帶有4英寸等離子轉移裝置，帶有母魯爾連接器。確保夾具在轉印裝置上關閉。
2.2.使用合適大小的注射器繪製從最終產品表中確定的IL-2工作稀釋液的體積。
2.3.分配到LOVO產品。
2.4.無菌焊接LOVO產品袋到CC2單釘線去除釘。
2.5.將細胞和裝置放入運輸袋中，置於2-8℃下15分鐘。
3.增加CS10
3.1.在BSC附加的3路旋塞到冷的CS10袋上的男性魯爾。
3.2.將適當大小的注射器連接到旋塞閥的母魯爾接頭上。
3.3.鬆開袋子並繪製“最終配方產品量”表中確定的CS10量。
3.4.取下注射器，紅色加蓋。
3.5.如果需要多個注射器，則重複進行。
3.6.從2-8℃冰箱中取出細胞/CC2裝置並置於BSC中。
3.7.附加第一個含有CS10的注射器到中間的旋塞閥。轉向止動器使CS750行包線處於“OFF”位置。
3.8.緩慢地並且在溫和混合下，將CS10(1：1，體積：體積)加入細胞中。
3.9.重複使用CS10的其他注射器。
將配製的細胞產物添加到冷凍袋中
1.用適當大小的注射器替換注射器，以便放入每個冷凍袋中的細胞體積。
2.混合細胞產品。
3.打開通向細胞產品袋的夾子並繪製適當的體積
4.轉動旋塞，使細胞產品袋處於“關閉”位置，並將注射器的內容物分配到冷凍袋# 1中。用注射器中的空氣清除管線。
記錄最終產品體積
1.使用不必要的端口和適當大小的注射器，繪製先前確定的保留量。
2.將其保留在標有“保留”的50mL錐形管中
3.使用連接在線束上的注射器將袋中的所有空氣從細胞袋中取出，將大約1英寸的袋子放入管中。夾緊並熱封。放置在2-8℃。
轉動旋塞，冷凍袋處於“關閉”狀態
5.在細胞產品袋中混合細胞，並使用旋塞和新注射器上的新注射器重複步驟3-8以保留剩餘的CS750袋以獲得細胞保留。
6.一旦產品進入CRF，應留出保留處理。
控制冷凍機(CRF)程序(參見實施例9)
1.打開CRF(CryoMed Controlled Rate Freezer，型號7454)和相關的筆記本電腦。
2.使用帳戶和密碼登錄計算機
3.打開位於桌面上的Controlled Rate Freezer圖標。
4.單擊主屏幕上的“運行”按鈕。
5.單擊打開配置文件，單擊打開。
6.輸入運行文件名，然後輸入以下格式的日期：runMMDDYYYY。
7.輸入數據標籤作為沒有破折號的日期作為MMDDYYY。
8.通往CRF的大門。
9.單擊開始運行。
10.在下拉菜單中選擇COM 6。
11.單擊確定。等了大約30秒。
12.彈出“配置文件下載”時，單擊“確定”。點擊保存。(有關控制速率凍結剖面詳細信息，請參見示例9)。
13.等待按綠色按鈕，直到樣品進入CRF。將冷凍機保持在4℃直至準備添加它們。
14.向CRF添加樣本。
15.等到CRF回到4℃。達到溫度後，單擊綠色的繼續按鈕。這啟動了程序，以進入計劃的下一步。
16.對以下冷凍袋進行目視檢查(注意：未檢查過量或底部填充)：容器完整性，端口完整性，密封完整性，細胞團塊的存在以及顆粒的存在。
17.在每個袋子上放置批准的吊牌標籤。
18.經過驗證的最終產品標籤包括：批號，產品名稱，製造商日期，產品體積，其他添加劑，儲存溫度和失效。
19.將每個冷凍袋(帶掛架)放入一個袋子裡。
20.熱封。
21.放在冷的盒子裡。
22.每袋重複一次。
23.將標記的冷凍袋置於預處理的盒中並轉移至CRF。
24.將盒式磁帶均勻地分佈在CRF的機架中。
25.將帶狀熱電偶應用於中心盒，或將假袋放在中心位置。
26.關閉CRF的大門。
27.一旦腔室溫度達到4℃ +/- 1.5℃，按PC Interface軟件上的Run。
28.記錄產品轉移到CRF的時間和室溫。
品質控制樣品的處理
1.根據需要將以下材料無菌轉移到BSC，並根據下表進行標記：
2.使用新的移液器移液器如下：品質控制和保留表
3.送至QC：1-Cell Count管，1-內毒素管，1-支原體管，1-Gram染色管，1管再刺激管，1-流量管至QC，立即測試。剩餘的複制管放置在控制速率冰箱。
4.聯繫品質控制主管，通知所需的測試。
5.有關測試和存儲說明，請參見表18。
細胞計數
對每個樣品進行單個細胞計數並記錄數據並將計數原始數據附加到批記錄中。記錄Cellometer計數程序。驗證正確的稀釋度輸入Cellometer。
製劑後保留細胞的低溫保存：
1. 在CRF中放置小瓶。
2. 凍結完成後移動到存儲位置並記錄CFR中記錄的日期和時間。記錄移至LN2日期和時間。
微生物學測試
1.對微生物實驗室的定居板進行有序測試。
2.記錄的入藏號碼。
3.有氧和無氧無菌的有序測試。
4.確保將板和瓶送到微生物實驗室。
細胞產物袋的冷凍保存後
1.完成運行後停止冷凍。可以通過單擊“停止”按鈕或按下冷凍鍵盤上的“返回”鍵來停止運行。
2.從錄音帶中取出冷凍袋
3.將盒子轉移到氣相LN2。
4.記錄存儲位置。
5.再次打開文本輸入窗口時輸入任何其他註釋。無論Run stop方法如何，都會出現此窗口。
6.打印配置文件報告並附加到標記有運行批號的批記錄中。
7.終止暖模式並使用退出按鈕關閉運行屏幕。
實施例9：冷凍保存方法
該實施例描述了使用CryoMed Controlled Rate Freezer，型號7454(Thermo Scientific)，用上文實施例8中所述的縮短的封閉方法製備的TIL的冷凍保存方法。
除了實施例9中所述的設備之外，所使用的設備如下：鋁盒式保持架(與CS750冷凍袋兼容)，用於750mL袋的低溫保存盒，低壓(22psi)液氮罐，冰箱，熱電 偶傳感器(袋式帶狀)和CryoStore CS750冷凍袋(OriGen Scientific)。
冷凍過程提供從成核到-20℃和1℃/分鐘冷卻速率到-80℃終點溫度的0.5℃速率。程序參數如下：步驟1-等待4℃；步驟2：1.0℃/min(樣品溫度)至-4℃；步驟3：20.0℃/min(室溫)至-45℃；步驟4：10.0℃/min(室溫)至-10.0℃；步驟5：0.5℃/min(室溫)至-20℃；步驟6：1.0℃/min(樣品溫度)至-80℃。
結合實施例1至8的方法描述該實施例的方法，如圖11所示。
實施例10：程序2A TIL之特徵分析。
該實施例描述了用上述縮寫的封閉方法製備的TIL的表徵。總之，縮寫的封閉方法(方法2A，在實施例1至9中描述)具有優於表19中給出的現有TIL製造方法的優點。對於Pre-REP，可以包括：每瓶增加腫瘤碎片，縮短培養時間，減少步驟數，和/或適應封閉系統。前REP到REP轉換的優點可包括：縮短前REP-to-REP過程，減少步驟數，消除表型選擇，和/或適用於封閉系統.REP的優點包括：減少步驟數，縮短REP持續時間，在燒瓶之間關閉系統轉移TIL，和/或封閉系統培養基交換。收穫的優勢包括：減少步驟數，自動洗滌細胞，封閉系統，減少洗滌過程中產品的損失。最終配方和/或產品的優勢可能包括ude運輸靈活性。
使用衍生自表20中描述的9種腫瘤的TIL進行總共9次實驗。這裡顯示的所有數據是從來自方法1C和方法2A的實施態樣的解凍的冷凍TIL產物測量的。
本文描述的方法2A的程序用於產生TIL以用於該實施例中的表徵。簡而言之，對於REP，在第11天，一個G-REX-500M燒瓶含有5L補充有3000IU/ml rhil-2,30ng/mL抗CD3(株OKT3)和5×109輻射同種異體飼養PBMC的CM2。製備細胞。計數體積減少後從REP-REX-100M前燒瓶中收穫的TIL，並以5×106和200×106個細胞之間的密度接種到G-REX-500M燒瓶中。然後將燒瓶置於潮 濕的37℃，5%CO 2組織培養箱中5天。在第16天，減少G-REX-500M燒瓶的體積，計數TIL並測定其活力。此時，將TIL擴增成多個G-REX-500M燒瓶(最多六個燒瓶)，每個燒瓶密度為1×109TILs/燒瓶。然後將所有燒瓶置於潮濕的37℃，5%CO2組織培養箱中再培養6天。在收穫當天第22天，將每個燒瓶體積減少90%，將細胞合併在一起並通過170μm血液過濾器過濾，然後收集到3L Origin EV3000袋或等同物中以準備使用自動洗滌。LOVO。使用LOVO自動細胞處理系統洗滌TIL，該系統用補充有1%HSA的PlasmaLyte-A組成的洗滌緩衝液替換99.99%的細胞培養基。LOVO採用旋轉過濾膜技術，可回收超過92%的TIL，同時幾乎消除了殘留的組織培養成分，包括血清，生長因子和細胞因子，以及其他碎片和顆粒。在洗滌完成後，進行細胞計數以確定TIL的擴增及其在收穫時的生存力。將CS10以1：1體積：體積比添加到經洗滌的TIL中以實現方法2A最終製劑。將最終配製的產物等分到低溫保存袋中，密封，並置於預冷的鋁盒中。然後根據本文所述的方法，包括實施例9，使用CryoMed Controlled Rate Freezer(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)冷凍含有TIL的冷凍保存袋。
在圖12和13中比較了九次運行的細胞計數和百分比存活率。
使用合適的市售試劑，使用流式細胞術(Canto II流式細胞儀，Becton，Dickinson，and Co., Franklin Lakes，NJ，USA)分析以下結果中顯示的細胞表面標誌物。目標標記的結果顯示在圖14至圖23中。
已經使用多種方法來測量基因組DNA和細胞學製劑中端粒的長度。端粒限製片段(TRF)分析是測量端粒長度的金標準(de Lange等，1990)。然而，TRF的主要限制是需要大量的DNA(1.5μg)。這裡，應用了兩種廣泛使用的端粒長度測量技術，即熒光原位雜交(FISH)和定量PCR。
使用Dako試劑盒(K532711-8 RUO Code K5327 Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometry，PNA FISH Kit/FITC.Flow，20次試驗)進行Flow-FISH，並遵循製造商的說明書測量平均長度。端粒重複。簡言之，將細胞表面用CD3APC在4℃染色20分鐘，然後用GAM Alexa 546染色20分鐘。然後將抗原-抗體複合物與2mM BS3(Fisher Scientific)化學交聯劑交聯。在具有長端粒的標準T細胞群中，PNA-端粒探針結合，Jurkat 1301T白血病細胞系(1301細胞)用作每個測定中的內部參考標準。在抗體孵育後計數單個TIL並與細胞比例為1：1的1301細胞(ATCC)混合。將5×105個TIL與5×105個1301細胞混合。原位雜交在雜交溶液(70%甲醯胺，1%BSA，20mM Tris pH 7.0)中進行，並且在存在和不存在FITC-綴合的端粒PNA探針(Panagene)，FITC-00-CCC-TAA-的情況下進行。CCC-TAA-CCC-TAA，與末端濃度為60nM的端粒重複序列互補。加入端粒PNA探針後，將細胞在81℃下在振盪水浴中 溫育10分鐘。然後將細胞在室溫下避光過夜。第二天早上，用預熱至40℃的PBS洗滌2次，除去過量的端粒探針。洗滌後，加入DAPI(Invitrogen，Carlsbad，CA)，終濃度為75ng/mL。用DAPI進行的DNA染色用於對G0/G1群體中的細胞進行門控。使用我們的流式細胞儀(BD Canto II，Mountain View，CA)進行樣品分析。測試樣品的端粒熒光錶示為1301細胞的熒光(fl)的百分比，按照下式計算：相對端粒長度=[(平均FITC fl測試細胞w/探針-平均FITC fl測試細胞無探針))×DNA指數1301細胞×100]/[(平均FITC fl 1301細胞w/探針-平均FITC fl 1301細胞無探針)×DNA指數測試細胞。
實時qPCR也用於測量相對端粒長度(Nucleic Acids Res.2002 May 15；30(10)：e47.,20，Leukemia，2013,27,897-906)。簡而言之，使用BioRad PCR熱循環儀(Hercules，CA)以96孔格式測定端粒重複拷貝數與單基因拷貝數(T/S)比。將10ng基因組DNA用於端粒或血紅蛋白(hgb)PCR反應，所用引子如下：Tel-1b引子(CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT)，Tel-2b引子(GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT)，hgb1引子(GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC)和hgb2引子(CACCAACTTCATCCACGTTCACC)。通過端粒和血紅蛋白反應分析所有樣品，並在同一平板上一式三份進行分析。除了測試樣品之外，使用從1301細胞系分離的基因組 DNA，每個96孔板含有0.08ng至250ng的五點標準曲線。通過從中值端粒Ct值中減去中值血紅蛋白閾值循環(Ct)值來計算每個樣品的T/S比(-dCt)。通過從每個未知樣品的T/S比中減去10.0ng標準曲線點的T/S比來確定相對T/S比(-ddCt)。
流式-FISH結果顯示在圖24和25中，並且在方法1C和方法2A之間未觀察到顯著差異，表明方法2A產生的TIL的驚人性質不能從單獨的TIL的年齡預測。。
總之，方法2A產生了具有“年輕”表型的有效TIL產物，其由高水平的共刺激分子，低水平的耗竭標誌物和在再活化時分泌細胞因子的能力增加所定義。縮短的22天擴增平台允許為急需治療的患者快速生成臨床規模劑量的TIL。冷凍保存的藥物產品引入了關鍵的物流效率，允許快速製造和分配靈活性。這種擴增方法克服了TIL治療更廣泛應用的傳統障礙。
實施例11：IL-2，IL-15和IL-21細胞因子混合物的用途
該實施例描述了與實施例1至10的TIL方法組合使用IL-2，IL-15和IL-21細胞因子，其作為另外的T細胞生長因子。
使用實施例1至10的方法，在實驗的一個臂中在IL-2存在下從結腸直腸，黑色素瘤，宮頸，三陰性乳腺，肺和腎腫瘤生長TIL，代替IL-2.,IL-2，IL-15和IL-21的組合在培養開始時的另一組中。在REP前完成時，評估 培養物的擴增，表型，功能(CD107a+和IFN-γ)在本文其他地方和Gruijl等人中描述了IL-15和IL-21，IL-21促進具有高細胞毒性潛力和調節性T細胞的低側枝擴增的CD27+CD28+腫瘤浸潤淋巴細胞的擴增，Santegoets，SJ，J Transl Med.,2013,11：37(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/)。
結果顯示，相對於僅IL-2，在多種組織學中觀察到在IL-2，IL-15和IL-21處理的條件下CD4 +和CD8 +細胞中增強的TIL擴增(>20%)。在相對於僅IL-2培養物的IL-2，IL-15和IL-21處理的培養物中獲得的TIL中，具有傾斜的TCRVβ譜的偏向CD8 +群體存在偏向.IFN-γ和與僅用IL-2處理的TIL相比，CD107a在IL-2，IL-15和IL-21處理的TIL中升高。
實施例12：黑色素瘤的第2期、多中心、三種定群研究
此第2期、多中心、三種定群研究係經設計以評估根據程序1C之TIL治療(如本文所述)在轉移性黑色素瘤患者之安全性及療效。第一組和第二組將分別招募多達30名患者，並且組群三是在多達十名患者中進行第二次TIL輸注的再治療組。前兩組同時評估兩種不同的製造過程：過程1C和過程2A的實施例(分別在實施例1至10中描述。組1中的患者接受新鮮的，非冷凍保存的TIL和組群兩名患者接受通過實施例1至10中描述的方法製備的產品，產生冷凍保存的產品。研究設計顯示於圖1中。.26。該研 究是一項2期，多中心，3項定群研究，旨在評估自體TIL治療轉移性黑色素瘤患者亞群的安全性和有效性。關鍵入選標準包括：可測量的轉移性黑色素瘤和1個TIL生成可切除的病變；至少一個系統治療的先前行；年齡18；ECOG表現狀態為0-1。治療組包括非冷凍保存的TIL產品(使用方法1C)，冷凍保存的TIL產物(使用方法2A的實施態樣製備)，並且用TIL產物再治療用於沒有反應或在初始反應後進展的患者。主要終點是安全性，次要終點是功效，定義為客觀反應率(ORR)，完全緩解率(CRR)，無進展生存期(PFS)，反應持續時間(DOR)和總生存期(OS).
實施例13：對個體γ射線照射的外周單核細胞的個體進行鑑定
該實施例描述了用於鑑定個體批次的γ-照射的外周單核細胞(PBMC，也稱為MNC)的新的簡化方法，其用作本文所述的示例性方法中的同種異體飼養細胞。
每個經輻照的MNC進料批次由個體供體製備。在純化的抗CD3(株OKT3)抗體和白血球介素-2(IL-2)存在下，每個批次或供體單獨篩選其在REP中擴增TIL的能力。此外，在不添加TIL的情況下測試每批飼養細胞。以驗證接收的γ輻射劑量足以使它們複製不能。.
定義/縮寫
BSC-生物安全櫃
CD3-分化簇3；表面標記蛋白質T-淋巴球
CF-離心
CM2-TIL完全培養基#
CMO-委託生產機構(Contract Manufacturing Organization)
CO2-二氧化碳
EtOH-乙醇
GMP-優良製造規範
IL-2-介白素2
IU-國際單位
LN2-液態氮
mini-REP-小型快速擴增規程
ml-毫升
MNC-單核細胞
NA-不適用
OKT3-MACS GMP CD3純(OKT3株)抗體
PPE-個人保護配備
Pre-REP-快速擴增規程之前
QS-適量；填至此量
REP-快速擴增規程
TIL-腫瘤浸潤淋巴細胞
T25-25cm2組織培養瓶
μg-微克
μL-微升
程序
背景
7.1.1 TIL的REP需要γ照射，生長停滯的MNC飼養細胞。飼養細胞MNCs上的膜受體與抗CD3(株OKT3)抗體結合併與REP瓶中的TIL交聯，刺激TIL擴增從各個供體的全血白血球分離法製備飼養批次。將白血球分離產物在Ficoll-Hypaque上離心，洗滌，照射，並在GMP條件下冷凍保存。
7.1.2重要的是，接受TIL治療的患者不能注射活飼養細胞，因為這會導致移植物抗宿主病(GVHD)。因此，通過用γ射線照射給予細胞來抑制細胞生長。在再培養時導致雙鏈DNA斷裂和MNC細胞的細胞活力喪失。
評估標準和實驗設置
在兩個標准上評估飼養批次：1)它們在共培養中擴增TIL的能力>100倍和2)它們的複制不能。
7.2.2飼餵器批次採用mini-REP格式進行測試，使用在直立T25組織培養瓶中生長的兩條初級REP-TIL前體系。
7.2.3飼養批次針對兩種不同的TIL系進行測試，因為每種TIL系在響應REP中的活化而增殖的能力方面是獨特的。
7.2.4作為對照，歷史上顯示符合7.2.1標準的許多輻照MNC飼養細胞與試驗批次一起運行。
7.2.5為了確保在單個實驗中測試的所有批次都能獲得相同的測試，可以使用相同的REP-TIL前系列的足夠庫存來測試所有條件和所有進料批次。
7.2.6對於每批測試的飼養細胞，共有六個T25燒瓶：
7.2.6.1 Pre-REP TIL第1行(2個燒瓶)
7.2.6.2 Pre-REP TIL第2行(2個燒瓶)
7.2.6.3饋線控制(2個燒瓶)
注意：包含TIL線# 1和# 2的燒瓶評估了進料批次擴增TIL的能力。餵養細胞控制燒瓶評估了進料批次的複制能力不足。
實驗方案
7.3.1第-2/3天，解凍TIL線
7.3.1.1準備好的CM2培養基。
7.3.1.2在37℃水浴中加熱CM2。
7.3.1.3製備40ml補充有3000IU/ml IL-2的CM2。保持溫暖直至使用。
7.3.1.4將20ml預先加熱的不含IL-2的CM2放入兩個50ml錐形管的每一個中，標記有所用TIL線的名稱。
7.3.1.5從LN2儲存中取出兩條指定的REP-TIL之前的管線，並將小瓶轉移到組織培養室。
7.3.1.6記錄的TIL線路識別。
7.3.1.7將解凍的小瓶放入密封的拉鍊儲存袋中，置於37℃水浴中，直至留下少量冰。
7.3.1.8用70%乙醇噴灑或擦拭解凍的小瓶並將小瓶轉移至BSC。
7.3.1.9使用無菌轉移移液管，立即將小瓶中的內容物 轉移到製備好的標記的50ml錐形管中的20ml CM2中。
7.3.1.10 QS至40ml使用不含IL-2的CM2洗滌細胞。
7.3.1.11在400 x CF下離心5分鐘。
7.3.1.12吸出上清液，重懸於5ml溫熱的CM2中，補充3000IU/ml IL-2。
7.3.1.13一式兩份取出小等分試樣(20μl)，使用自動細胞計數器進行細胞計數。記錄計數。
7.3.1.14計數時，將帶有TIL細胞的50ml錐形管放入加濕的37℃，5%CO2培養箱中，蓋上蓋子以便進行氣體交換。
7.3.1.15確定細胞濃度並在補充有3000IU/ml的IL-2的CM2中將TIL稀釋至1×10 6個細胞/ml。
7.3.1.16在加濕的37℃培養箱中，在2孔/孔的24孔組織培養板中，根據需要培養至mini-REP的第0天。
7.3.1.17在單獨的24孔組織培養板中培養不同的TIL細胞系，以避免混淆和潛在的交叉污染。
7.3.2第0天，啟動Mini-REP
7.3.2.1準備足夠的CM2培養基，用於待測試的飼養批次數。(例如，為了一次測試4個飼養批次，製備800ml CM2培養基)。
7.3.2.2將7.3.2.1中製備的CM2的一部分等分，並用3000IU/ml IL-2補充其用於培養細胞。(例如，為了一次測試4個飼養批次，準備500ml具有3000IU/ml IL-2的CM2培養基)。
7.3.2.3如下所述，沒有IL-2的CM2的剩餘部分將用於洗滌細胞。
7.3.2.4分別使用每條TIL管線以防止交叉污染，用培養箱中的TIL培養物去除24孔板並轉移到BSC。
7.3.2.5使用無菌移液管或100-1000μl移液器和吸頭，從TIL的每個孔中取出約1ml培養基，置於24孔組織培養板未使用的孔中。用於洗滌孔。
7.3.2.6使用新鮮的無菌移液管或100-1000μl移液器和吸頭，在孔中混合剩余培養基和TIL重懸細胞，然後將細胞懸浮液轉移到標有TIL名稱的50ml錐形管中並記錄體積。
7.3.2.7用保留的培養基洗滌孔並將該體積轉移到相同的50ml錐形管中。
7.3.2.8以400×CF旋轉細胞以收集細胞沉澱。
7.3.2.9吸出培養基上清液，將細胞沉澱重新懸浮於含有3000IU/ml IL-2的2-5ml CM2培養基中，根據收穫的孔數和顆粒大小確定使用的體積-體積應為足以確保濃度>1.3×10 6個細胞/ml。
7.3.2.10用血清移液管徹底混合細胞懸液並記錄體積。
7.3.2.11使用自動細胞計數器去除200μl細胞計數。
7.3.2.12計數時，將帶有TIL細胞的50ml錐形管放入加濕的5%CO2,37℃培養箱中，蓋上蓋子以便進行氣體交換。
7.3.2.13記錄計數。
7.3.2.14從培養箱中取出含有TIL細胞的50ml錐形管，將細胞以1.3×10 6細胞/ml的濃度重新懸浮於溫熱的CM2中，補充3000IU/ml IL-2。將50ml錐形管返回培養箱中。鬆開的帽子。
7.3.2.15如果需要，保留原始的24孔板以重新培養任何殘留的TIL。
7.3.2.16對第二條TIL線重複步驟7.3.2.4-7.3.2.15。
7.3.2.17在將TIL接種到T25燒瓶中進行實驗之前，按照步驟7.3.2.35，將TIL 1：10稀釋至終濃度1.3×10 5個細胞/ml。
製備MACS GMP CD3純(OKT3)工作溶液
7.3.2.18從4℃冰箱中取出OKT3(1mg/ml)的儲備液，置於BSC中。
7.3.2.19在mini-REP的培養基中使用30ng/ml OKT3的終濃度。
7.3.2.20實驗的每個T25燒瓶中需要600ng的OKT3，20ml。對於每個20ml，這相當於60μl的10μg/ml溶液，或者對於每個飼養批次測試的所有6個燒瓶，相當於360μl。
7.3.2.21對於每個測試的飼養批次，製備400μl1：100稀釋的1mg/ml OKT3，工作濃度為10μg/ml(例如，一次測試4個飼養批次，進行1600μl1：100稀釋1mg/ml OKT3：16μl1mg/ml OKT3+1.584ml CM2培養基，含3000IU/ml IL-2。)
準備T25燒瓶
7.3.2.22標記每個燒瓶，其中包含測試的TIL品系名稱，燒瓶複製品編號，飼料批號，日期和分析人員的姓名縮寫。
7.3.2.23在製備飼養細胞之前，用CM2培養基填充燒瓶。
7.3.2.24將燒瓶置於37℃濕潤的5%CO2培養箱中，以保持培養基溫暖，同時等待添加其餘組分。
7.3.2.25製備飼養細胞後，將各組分加入每個燒瓶中的CM2中。
製備MACS GMP CD3純(OKT3)工作溶液。
製備餵養細胞
7.3.2.26對於該方案，每批測試至少需要78×106個飼養細胞。通過SDBB冷凍的每個1ml小瓶在冷凍時具有100×10 6個活細胞。假設從LN2儲存解凍後恢復50%，建 議每批解凍至少兩個1ml小瓶飼養細胞，每個REP估計有100×106個活細胞。或者，如果在1.8ml小瓶中提供，則只有一個小瓶提供足夠的飼養細胞。
7.3.2.27在解凍飼養細胞之前，對每個待測試的飼養批次預加熱約50ml不含IL-2的CM2。
7.3.2.28從LN2儲存器中取出指定的飼料批次小瓶，放入拉鍊儲存袋中，置於冰上。將轉移的小瓶轉移到組織培養室。
7.3.2.29將密封的小瓶放入封閉的拉鍊儲存袋中，浸入37℃水浴中。
7.3.2.30從拉鍊袋中取出小瓶，用70%EtOH噴霧或擦拭，並將轉移的小瓶移至BSC。
7.3.2.31使用移液管立即將飼料瓶中的內容物轉移到50ml錐形管中的30ml溫熱CM2中。用少量CM2洗滌小瓶以除去小瓶中的任何殘留細胞。
7.3.2.32在400 x CF下離心5分鐘。
7.3.2.33吸出上清液，重懸於4ml溫熱的CM2加3000IU/ml IL-2中。
7.3.2.34使用自動細胞計數器去除200μl進行細胞計數。記錄計數。
7.3.2.34在溫CM2加3000IU/ml IL-2中以1.3×10 7個細胞/ml重懸的細胞。
7.3.2.34稀釋的TIL細胞從1.3×10 6個細胞/ml到1.3×10 5個細胞/ml。獨立處理每條TIL生產線以防止交叉污染。
設置共培養
7.3.2.36稀釋的TIL細胞從1.3×10 6個細胞/ml到1.3×10 5個細胞/ml。獨立處理每條TIL生產線以防止交叉污染。
7.3.2.36.1將4.5ml CM2培養基加入15ml錐形管中。
7.3.2.36.2從培養箱中取出TIL細胞，用10ml血清移液管重懸。
7.3.2.36.3從1.3×10 6個細胞/ml TIL懸浮液中取出0.5ml細胞，加入15ml錐形管中的4.5ml培養基中。將TIL儲存瓶返回培養箱。
7.3.2.36.4混合均勻。
7.3.2.36.5對第二條TIL線重複步驟7.3.2.36.1-7.3.2.36.4。
7.3.2.36.6如果同時測試多個進料批次，則在電鍍TIL之前將TIL稀釋至每個進料批次的較低濃度。
7.3.2.37帶有預熱介質的轉移燒瓶，用於從培養箱到BSC的單個飼養批次。
7.3.2.38混合飼養細胞用1ml移液管吸頭上下移液幾次，然後將1ml(1.3 x 107個細胞)轉移到每個燒瓶中。
7.3.2.39向每個燒瓶中加入60μlOKT3工作原液(10μg/ml)。
7.3.2.40將兩個對照燒瓶返回培養箱。
7.3.2.41將1ml(1.3×105)每個TIL批次轉移至相應標記的T25燒瓶中。
7.3.2.42將燒瓶返回培養箱並直立孵育。直到第5天才打擾。
7.3.2.43對所有測試的進料批次重複7.3.2.36-7.3.2.42。
第5天，培養基改變
7.3.3.1用3000IU/ml IL-2製備CM2。每個燒瓶需要10ml
7.3.3.2為防止交叉污染，一次處理一個餵料器的燒瓶。從培養箱中取出燒瓶並轉移到BSC，注意不要打擾燒瓶底部的細胞層。
7.3.3.3對包括對照燒瓶在內的所有燒瓶重複進行。
7.3.3.4用10ml移液管將10ml溫熱的CM2和3000IU/ml IL-2轉移到每個燒瓶中。
7.3.3.5將燒瓶返回培養箱並直立孵育至第7天。對於所有測試的飼養批次，重複7.3.3.1-7.3.3.6。
第7日，收獲
7.3.4.1為防止交叉污染，一次處理一個餵料器的燒瓶。
7.3.4.2從培養箱中取出燒瓶並轉移到BSC，注意不要打擾燒瓶底部的細胞層。
7.3.4.3在不擾亂生長在燒瓶底部的細胞的情況下，從每個試驗瓶中取出10ml培養基，從每個對照燒瓶中取出 15ml培養基。
7.3.4.4使用10ml血清移液管，將細胞重懸於剩余培養基中並充分混合以破碎任何細胞團塊。
7.3.4.5記錄每個燒瓶的體積。
7.3.4.6通過移液徹底混合細胞懸液後，取出200μl進行細胞計數。
7.3.4.7使用適當的標準操作程序與自動細胞計數器設備一起計算TIL。
7.3.4.8第7天記錄的計數。
7.3.4.9對所有測試的進料批次重複7.3.4.1-7.3.4.8。
7.3.4.10評估餵養細胞對照燒瓶的複制能力不足，並根據表21(下文)中列出的標準評價含有TIL的燒瓶從第0天開始的倍數擴增。
第7天，將餵養細胞控制燒瓶繼續至第14天
7.3.5.1在完成第7天的飼養對照燒瓶計數後，向每個對照燒瓶中加入15ml含有3000IU/ml IL-2的新鮮CM2培養基。
7.3.5.2將對照燒瓶放回培養箱中，直立培養至第14天。
第14天，餵養細胞對照燒瓶的擴增不增殖
7.3.6.1為防止交叉污染，一次處理一個餵料器的燒瓶。
7.3.6.2從培養箱中取出燒瓶並轉移到BSC，注意不要打擾燒瓶底部的細胞層。
7.3.6.3在不擾亂生長在燒瓶底部的細胞的情況下，從每個對照燒瓶中取出約17ml培養基。
7.3.6.4使用5ml血清移液管，將細胞重懸於剩余培養基中並充分混合以破碎任何細胞團塊。
7.3.6.5記錄每個燒瓶的體積。
7.3.6.6用移液器徹底混勻細胞懸液後，取出200μl進行細胞計數。
7.3.6.7使用適當的標準操作程序與自動細胞計數器設備一起計算TIL。
7.3.6.8記錄的計數。
7.3.6.9對所有測試的進料批次重複7.3.4.1-7.3.4.8。
結果和接受標準 結果
10.1.1γ輻射劑量足以使飼養細胞複製不能勝任。預期所有批次都符合評估標準，並且還證明與第0天相比，REP培養第7天剩餘的飼養細胞總存活數減少。
10.1.2預計所有飼養批次均符合REP培養第7天TIL生長100倍擴增的評估標準。
10.1.3飼餵對照燒瓶的第14天計數預計將繼續第7天所見的非增殖趨勢。
接受標準
10.2.1對於每批飼養細胞測試的每個重複TIL品系，滿足以下接受標準
10.2.2接受是二倍，如下所示(見下表)。
10.2.2.1評估當在30ng/ml OKT3抗體和3000IU/ml IL-2存在下培養時，輻射劑量是否足以使MNC飼養細胞複製不能勝任。
10.2.2.1.1通過REP的第7天和第14天的自動細胞計數確定的總活細胞計數(TVC)評估複製功能不全。
10.2.2.1.2驗收標準是“無生長”，意味著在第7天和第14天，從REP的第0天投入培養的初始活細胞數開始，總活細胞數沒有增加。
10.2.2.2評估飼養細胞支持TIL擴增的能力。
10.2.2.2.1根據REP第0天至REP第7天培養開始時活細胞的倍數擴增測量TIL生長。
10.2.2.2.1在第7天，通過自動細胞計數評估，TIL培養物達到最小100倍的擴增(即，大於在REP第0天投入培養的總活TIL細胞數的100倍)。
10.2.2.3如果一批不符合上述兩個標準，則根據下面第10.3節中列出的應急計劃對該批次進行重新測試。
10.2.2.4對失敗的批次進行重新測試後，不包括原始評估和應急測試中不符合兩個驗收標準的任何MNC進料批次。
10.2.2.5任何符合驗收標準但被認為在相對於其他先前與相同的REP-TIL前線同時測試的其他先前進料批次擴增TIL的能力方面表現不佳的MNC進料批次被排除在外。
不符合驗收標準的MNC進料器批次的應變測試
10.3.1如果MNC進料批次不符合上述10.2節中列出的任何一個驗收標準，將採取以下步驟重新測試該批次，以排除簡單的實驗者錯誤。
10.3.2如果該批次有兩個或兩個以上剩餘的衛星測試小瓶，那麼該批次將被重新測試。如果該批次有一個或沒有剩餘的衛星測試小瓶，那麼該批次根據章節中列出的驗收標準失敗10.2以上。
10.3.3兩名經過培訓的人員，包括評估該批次的原始人員，同時對該批次進行了測試。
10.3.4重複第7.2-7.3節，重新評估有關批次。
10.3.5每個人測試有關批次以及對照批次(如上文第7.2.4節所定義)。
10.3.6為了獲得資格，有關批次和控制批次必須達到10.2節對於進行應急測試的人員的驗收標準。
10.3.7在滿足這些標准後，該批次隨後被釋放用於CMO，如上文第10.2節所述。
實施例14：對個體γ射線照射的外周血單核細胞進行定性
該實施例描述了用於鑑定個體批次的γ-照射的外周血單核細胞(PBMC)的新的簡化方法，其用作本文所述的示例性方法中的同種異體飼養細胞。該實施例提供了用於評估經照射的PBMC細胞批次的方案，其用於臨床批次的TIL的生產。每個經照射的PBMC批次均由個體供體製備。在超過100個鑑定方案的過程中，已經顯示，在所有情況下，來自SDBB(聖地亞哥血庫)的經照射的PBMC批次在REP的第7天擴增TIL>100倍。該修改的鑑定方案旨在應用於來自SDBB的經輻照的供體PBMC批次，然後進一步測試以驗證接收的γ輻射劑量足以使它們複製不能勝任。一旦證明他們在14天的過程中保持複製能力不足，供體PBMC批次被認為是“合格的”用於生產臨床批次的TIL。
重要用語及定義
μg-微克
μl-微升
AIM-V-商業上可獲得之細胞培養基
BSC-生物安全櫃
CD-分化簇
CM2-TIL完全培養基#2
CM2IL2-CM2補充3000IU/ml IL-2
CMO-委託生產機構
CO2-二氧化碳
EtOH-乙醇
GMP-優良製造規範
Gy-Gray
IL-介白素
IU-國際單位
LN2-液態氮
MI-毫升
NA-不適用
OKT3-抗CD3單株抗體名稱
P20-2-20μl微量分注器
P200-20-200μl微量分注器
PBMC-周邊血液單核細胞
P1000-100-1000μl微量分注器
PPE-個人保護配備
REP-快速擴增規程
SDBB-San Diego Blood Bank
TIL-腫瘤浸潤淋巴細胞
T25-25cm2組織培養瓶
x g-“times gravity”-相對離心力量度
標本，包括輻照的供體PBMC(SDBB) 程序 背景
7.1.1目前TIL的標準REP需要γ輻射，生長停滯的PBMC.PBMC上的膜受體與抗CD3(株OKT3)抗體結合併與培養物中的TIL交聯，刺激TIL擴增.PBMC批次從個體供體的全血白血球分離術製備。將白血球分離產物在Ficoll-Hypaque上離心，洗滌，照射，並在GMP條件下冷凍保存。
重要的是，接受TIL治療的患者不能注射活的PBMC，因為這可能導致移植物抗宿主病(GVHD)。因此，通過給予γ射線照射細胞，導致PBMCs生長停滯，導致雙鏈再培養時，DNA破裂並且PBMC的細胞活力喪失。
評價標準
7.2.1輻照PBMC批次的評價標準是其複制能力不足。
實驗裝置
7.3.1飼餵批次以mini-REP形式進行測試，就好像它們與TIL共培養一樣，使用直立的T25組織培養瓶。
7.3.1.1對照批次：歷史上顯示符合7.2.1標準的一批經輻照的PBMC與實驗批次一起作為對照。
7.3.2對於每批測試的輻照供體PBMC，運行重複的燒瓶。
實驗方案
本方案中的所有組織培養工作均在BSC中使用無菌技術完成。
第0天
7.4.1為每批待測試的供體PBMC製備約90ml的CM2培養基。將CM2保持在37℃水浴中溫熱。
7.4.2解凍6×106IU/ml IL-2的等分試樣。
7.4.3將CM2培養基返回BSC，用70%EtOH擦拭，然後放入罩中。對於每批測試的PBMC，將約60ml的CM2移至單獨的無菌瓶中。將解凍的6×106IU/ml儲備溶液中的IL-2加入該培養基中，終濃度為3000IU/ml。將該瓶標記為“CM2/IL2”(或類似物)以將其與未補充的CM2區分開。
7.4.4為每批待測試的PBMC標記兩個T25燒瓶。最小標籤包括：
7.4.4.1批號
7.4.4.2燒瓶號(1或2)
7.4.4.3文化啟動日期(第0天)
準備OKT3
7.4.5從4℃冰箱中取出抗CD3(OKT3)的儲備溶液並置於BSC中。
7.4.6在mini-REP的培養基中使用終濃度為30ng/ml的OKT3。
7.4.7從1mg/ml儲備溶液中製備10μg/ml抗CD3(OKT3)工作溶液。放入冰箱直到需要。
7.4.7.1對於每個測試的PBMC批次，準備150μl1：100稀釋的抗CD3(OKT3)原液
例如，為了一次測試4個PBMC批次，通過向594μl補充有3000IU/ml IL-2的CM2中加入6μl的1mg/ml儲備溶液製備600μl10μg/ml抗CD3(OKT3)。
準備燒瓶
7.4.8每瓶加入19ml CM2/IL-2至標記的T25燒瓶中，並將燒瓶置於37℃，濕潤的5%CO 2培養箱中，同時製備細胞。
準備輻照PBMC
7.4.9單獨處理每個供體PBMC批次，以避免批次可能的交叉污染。
7.4.10從LN2存儲中檢索要測試的PBMC批次的小瓶。將它們置於-80℃或在解凍前保持在乾冰上。
7.4.11將30ml CM2(不含IL-2補充劑)放入50ml錐形管中，每批待解凍。用不同批號的PBMC標記每個管以進行解凍。將管蓋緊，並在使用前置於37℃水浴中。根據需要，將50ml錐形管返回BSC，用70%EtOH擦拭，然後放入罩中。
7.4.12從冷藏庫中取出樣品瓶PBMC，置於37℃水浴 中的浮管架中解凍。允許解凍，直到小瓶中殘留少量冰。
7.4.13用70%EtOH噴灑或擦拭解凍的小瓶並轉移至BSC。
7.4.14使用無菌轉移移液管，立即將小瓶中的內容物轉移到50ml錐形管中的30ml CM2中。從管中取出約1ml培養基沖洗小瓶；恢復沖洗至50ml錐形管。蓋緊並輕輕旋轉以洗滌細胞。
7.4.15在室溫下以400×g離心5分鐘。
7.4.16吸出上清液，用1000μl移液管尖端將細胞沉澱重懸於1ml溫熱的CM2/IL-2中。或者，在添加培養基之前，通過沿著空管架拖動加蓋的管重新懸浮細胞沉澱。重懸細胞沉澱後，使用CM2/IL-2培養基使體積達到4ml。錄音量。
7.4.17使用自動細胞計數器取出一小份等分試樣(例如100μl)進行細胞計數。
7.4.17.1根據特定的自動細胞計數器SOP，一式兩份進行計數。在進行細胞計數之前，很可能需要對PBMC進行稀釋。推薦的起始稀釋度為1：10，但這取決於所用細胞計數器的類型。
7.4.17.2記錄計數。
7.4.18使用CM2/IL-2培養基，按照步驟7.4.15.2中的工作表將PBMC的濃度調整為1.3×10 7個細胞/ml。通過溫和的旋轉或使用血清移液管上下輕輕吸氣混合均勻。
設置文化燒瓶
7.4.19從組織培養箱中將兩個標記的T25燒瓶返回BSC。
7.4.20將10μg/ml小瓶抗CD3/OKT3返回BSC。
7.4.21向每個燒瓶中加入1ml 1.3×107PBMC細胞懸浮液。
7.4.22向每個燒瓶中加入60μl10μg/ml抗CD3/OKT3。
7.4.23將帶蓋的燒瓶返回組織培養箱培養14天，不受干擾。
7.4.24將抗CD3/OKT3樣品瓶放回冰箱中，直至下一批需要。
7.4.25對每批待評估的PBMC重複步驟7.4.9-7.4.24。
第14天，測量PBMC的不增殖
7.4.26獨立處理每批產品，小心地將重複的T25燒瓶返回BSC。
7.4.27對於每個燒瓶，使用新鮮的10ml血清移液管，從每個燒瓶中取出約17ml，然後小心地拉起剩餘的培養基以測量燒瓶中剩餘的體積。錄音量。
7.4.28使用相同的血清移液管上下移液混合樣品。
7.4.29從每個燒瓶中取出200μl樣品進行計數。
7.4.30使用自動細胞計數器計數細胞。
7.4.31對每批被評估的PBMC重複步驟7.4.26-7.4.31。
結果和接受標準 結果
10.1.1預計γ輻射劑量足以使飼養細胞複製不能勝任。預期所有批次均滿足評估標準，證明與第0天相比，REP培養第14天剩餘的飼養細胞總存活數減少。
驗收標準
10.2.1每個受輻射的供體PBMC批次均符合以下驗收標準：
10.2.2“無生長”-意指第14天的活細胞總數小於REP第0天培養的初始活細胞數。
10.2.3如果一批不符合上述標準，則根據10.4節中列出的應急測試程序對該批次進行重新測試。
10.2.4重新測試失敗的批次後，排除了原始評估和應急測試中未達到驗收標準的任何MNC進料批次。
不符合驗收標準的PBMC批次的應急測試。
10.4.1如果照射的供體PBMC批次不符合上述驗收標準，則採取以下步驟重新測試該批次，以排除簡單的實驗者錯誤作為其失敗的原因。
10.4.2如果該批次剩下兩個或兩個以上的衛星小瓶，那麼該批次將被重新測試。如果該批次有一個或沒有剩餘的衛星小瓶，則該批次根據上文第10.2節的驗收標準失敗。
10.4.3只要有可能，兩名經過培訓的人員(最好包括評估該批次的原始人員)獨立地對兩個獨立的小瓶進行測試。這是應急測試的首選方法。除了單獨的PBMC小瓶外，兩個人員都可以使用相同的試劑。
10.4.3.1。如果沒有兩名人員，則有一人為失敗的批次測試兩個PBMC小瓶，獨立地使用每個小瓶。
10.4.4重複第7.4節“實驗方案”以重新評估有關批次。
10.4.5除了有關批次外，每個人進行應急測試時，對照批次進行了測試。
10.4.5.1如果兩名人員進行應急測試，則兩名人員均獨立測試控制批次。
10.4.5.2如果只有一個人可以進行應急測試，則控制批次不必一式兩份。
10.4.5.3為了合格，通過應急測試的PBMC批次中，控制批次和有關批次的兩個重複都達到了10.2節的驗收標準。
10.4.5.4符合此標准後，該批次隨後將按照第10.2節的規定發布用於CMO。
實施例15：CELLOMETER IC2圖像細胞計數器自動細胞計數器
該實施例描述了Cellometer K2 Image Cytometer自動細胞計數器的操作程序。
1. 定義
μl 微升
AOPI 吖啶橙碘化丙啶
BSC生物安全櫃
DPBS Dulbecco的磷酸鹽緩衝鹽水
mL毫升
MNC單核血細胞
NA不適用
PBMC外周血單核細胞
PPE個人防護裝備
快速擴增培養方案之前的REP前初始TIL培養
REP快速擴增規程
TIL腫瘤浸潤淋巴細胞
7. 程序
7.1細胞懸液製備
7.1.1台盼藍(Trypan Blue)製備
最終台盼藍濃度為0.1%。製造商建議製備0.2%的儲備溶液。
7.1.1.1在Cellometer K2上使用台盼藍時，用PBS稀釋原液(0.4%)至0.2%。
7.1.1.2將台盼藍用0.2-0.4微米過濾器過濾，然後小批量等分到標記的加蓋管中。
7.1.1.3將細胞懸浮液以1：1與0.2%台盼藍混合。
7.1.2 AOPI準備
7.1.2.1在Cellometer K2上使用AOPI時，獲得AOPI溶 液。
7.1.2.2用AOPI溶液以1：1染色細胞樣品。
注意：計算高濃度培養物時，在用台盼藍或AOPI進行最終1：1稀釋之前，將細胞樣品稀釋在細胞培養基中。
使用製造商建議的計數範圍來確定要使用的最佳稀釋度。
7.2 Cellometer K2設置
7.2.1打開Cellometer K2設備。
7.2.2選擇相關計算機顯示器上的Cellometer Image Cytometer圖標。
7.2.3在軟件的主屏幕上，選擇下拉框中列出的其中一個分析。
7.2.3.1選擇合適的分析時，自我填充的細胞類型和圖像模式。
7.2.3.2在“樣品”部分下，單擊“設置用戶/樣品ID”以打開另一個屏幕，輸入樣品的操作員信息。
7.2.3.2.1輸入“用戶ID”。這將包含用戶的三個字母縮寫。
7.2.3.2.2輸入“樣品ID”。樣品ID來自進樣標本信息。
7.2.3.3設置稀釋參數。
7.2.3.3.1如果除1：1混合物外沒有進行其他稀釋，則稀釋倍數為2。
7.2.3.3.2如果在最終的1：1混合物之前進行稀釋，則稀釋倍數是先前稀釋的2倍。
7.2.3.3.3根據屏幕稀釋部分使用的混合物更新稀釋因子。點擊鉛筆圖標以顯示對話框屏幕。
7.2.3.3.4驗證F1 Image和F2 Image部分是否相同。
7.2.3.3.5設置完成後單擊“保存”按鈕。
7.3細胞計數
7.3.1從Cellometer計數室載玻片(SD100)的兩側取下塑料襯墊，並將其放在乾淨的無絨抹布上。
7.3.2在製備細胞懸浮液後，取出一小份樣品並將其轉移到多孔細胞培養板或管的孔中。
7.3.3如果稀釋樣品，使用細胞培養基進行稀釋。
7.3.4將20μl細胞懸浮液加入多孔細胞培養板或管的孔中。
7.3.5將201 111的0.2%台盼藍或AOPI溶液添加到20111的細胞懸浮液中並徹底混合樣品。
7.3.6測量20μl的1：1溶液並將其轉移到計數室的一側。
注意：避免觸摸幻燈片的清晰區域。
7.3.7如有必要，在載玻片的另一側重複樣品.7.3.8。將腔室插入Cellometer正面的槽中。
7.3.8對於AOPI細胞計數，單擊主屏幕上的“預覽F1”以預覽綠色熒光圖像(活細胞)圖像。對於台盼藍計數，單擊“預覽明場”。
7.3.9使用聚焦輪，使圖像成為最佳聚焦。細胞具有明亮的中心和清晰的邊緣。
7.3.10單擊“計數”開始計數過程。
7.3.11結果顯示在計算機屏幕上的計數結果彈出框中，顯示計數過程的結果。
實施例16：IL-2儲備溶液(CELLGENIX)的製備
該實施例描述了將純化的，凍乾的重組人白血球介素-2溶解於適用於其他組織培養方案的儲備樣品中的方法，所述方案包括本申請和實施例中描述的所有那些，包括涉及使用rhIL-2的那些。
3. 定義/縮寫
μL：微升
BSC：生物安全櫃
BSL2：生物安全等級2
D-PBS：Dulbecco的磷酸鹽緩衝鹽水
G：壓力表
GMP：優良製造規範
HAc：乙酸
HSA：人血清白蛋白
毫升：毫升
NA：不適用
PPE：個人防護裝備
rhIL-2；IL-2：重組人介白素-2
COA：分析證書
6. 程序
6.1準備0.2%乙酸溶液(HAc)。
6.1.1將29mL無菌水轉移至50mL錐形管中。
6.1.2向50mL錐形管中加入1mL 1N乙酸。
6.1.3通過倒置管混合2-3次。
6.1.4使用Steriflip過濾器過濾滅菌HAc溶液。
6.1.5加蓋，標註日期並標記溶液“無菌0.2%乙酸溶液”。
6.1.6溶液在2個月後過期。在室溫下儲存。
6.2在PBS中製備1%HSA。
6.2.1在150mL無菌過濾裝置中，向96mL PBS中加入4mL 25%HSA原液。
6.2.2過濾後的解決方案。
6.2.3加蓋，標註日期並標記溶液“PBS中的1%HSA”。
6.2.4溶液在2個月後過期。儲存4℃。
6.3對於每瓶製備的rhIL-2，填寫表格。
6.4製備的rhIL-2儲備液(6 x 106IU/mL終濃度)
6.4.1每批rh1L-2都不同，並且要求在製造商的分析證書(COA)中找到信息，例如：
6.4.1.1每瓶rhIL-2的質量(mg)
6.4.1.2 rhIL-2的比活度(IU/mg)
6.4.1.3推薦的0.2%HAc重建量(mL)
6.4.2使用下面的等式計算rhIL-2批次所需的1%HSA的體積：
6.4.2 如，根據CellGenix的rhIL-2批次10200121 COA，1mg小瓶的比活性為25x10 6lU/mg。它建議在2mL 0.2%HAc中重構rhIL-2。
6.1.2用酒精擦拭IL-2小瓶的擦拭橡膠塞。
6.1.3使用連接在3mL注射器上的16G針頭，將建議體積的0.2%HAc注入樣品瓶中。在取出針頭時，注意不要移動塞子。
6.1.4倒置的小瓶3次並旋轉直至所有粉末溶解。
6.1.5小心取下塞子，並用酒精擦拭物放在一邊。
6.1.6向樣品瓶中添加1%HSA的計算體積。
6.1.7用橡皮塞蓋住小瓶。
6.2 rhIL-2溶液的儲存
6.2.1短期儲存(<72小時)，儲存的小瓶在4℃。
6.2.2長期儲存(>72小時)，將等分的小瓶分裝到較小的體積中，並儲存在-20℃的冷凍瓶中直至準備使用。進行冷凍/解凍循環。在製備日期後6個月過期。
6.2.3 Rh-IL-2標籤包括供應商和目錄號，批號，有效期，操作員姓名，濃度和等分試樣的體積。
實施例17：製備用於預REP和REP過程的培養基
本實施例描述了製備組織培養基的方法，所述組織培養基用於涉及來自各種腫瘤類型的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)培養的方案，所述腫瘤包括但不限於轉移性黑色素瘤，頭頸部鱗狀細胞癌。(HNSCC)，卵巢癌，三陰性乳腺癌和肺腺癌。該介質可用於製備本申請和實施例中描述的任何TIL。
3. 定義
μg 微克
μm 微米
μM 微莫耳濃度
AIM-V® 無血清組織培養基(Thermo Fisher Scientific)
BSC生物安全櫃
CM1完全培養基#1
CM2完全培養基#2
CM3完全培養基#3
CM4完全培養基#4
IU或U 國際單位
ml 毫升
mM 毫莫耳濃度
NA 不適用
PPE 個人保護配備
Pre-REP 預快速擴增程序
REP 快速擴增程序
rhIL-2、IL-2 重組人介白素-2
RPMI1640 Roswell Park Memorial Institute medium、formulation 1640
SOP 標準操作程序
TIL 腫瘤浸潤淋巴細胞
7. 程序
7.1所有程序均在BSC(II類，A2類)中使用無菌技術完成。
7.1.1使用前噴塗70%乙醇的噴塗表面。
7.1.2在將所有物品和試劑放入組織培養罩之前，用70%乙醇噴灑所有物品和試劑。
7.2等分200mM L-谷氨醯胺
7.2.1提供的L-谷氨醯胺的體積大於製備血清所需的體積(例如，100ml或500ml體積)。
7.2.2在37℃水浴中解凍瓶裝L-谷氨醯胺。
7.2.3解凍後混合L-谷氨醯胺，在解凍後沉澱。確保所有沉澱物在等分之前已返回溶液。
7.2.4將5-10ml等份的L-谷氨醯胺置於無菌的15ml錐形管中。
7.2.5帶有濃度，供應商，批號，日期等分和有效期的標記管。
7.2.6然後將管儲存在-20℃並根據需要拉出以進行培養基製備。
7.3 CM1的製備
7.3.1從冷藏庫中取出以下試劑並在37℃水浴中加熱：
7.3.1.1 RPMI1640
7.3.1.2人AB血清
7.3.1.3 200mM L-谷氨醯胺
7.3.2將BME從4℃儲存中取出並置於組織培養罩中。
7.3.3將慶大霉素儲備液從室溫儲存放入組織培養罩中。
7.3.4根據下表23製備的CM1培養基，將每種成分加入適合於待過濾體積的0.2um過濾單元的頂部。
7.3.5標記CM1培養基瓶的名稱，製備者的首字母，過濾/製備的日期，兩週的有效期，並儲存在4℃直至組織培養所需。可以根據需要將培養基等分到較小體積的瓶中。
7.3.6將任何剩餘的RPMI1640，人AB血清或L-谷氨醯 胺儲存在4℃直至下一次培養基製備。
7.3.7將BME原料瓶放回4℃儲存。
7.3.8將一瓶慶大霉素放回適當的RT儲存位置。
7.3.9由於培養基的緩衝能力有限，CM1在製備後不超過兩週被丟棄，或者因為酚紅pH值指示劑顯示出pH的極端變化(亮紅色至粉紅色)。
7.3.10在使用當天，在37℃水浴中預熱所需量的CM1，並加入6000IU/ml IL-2。
7.3.11額外補充-根據需要
7.3.11.1 CM1補充了GlutaMAX®
7.3.11.1.1 CM1可以通過用2mM GlutaMAXTM替代2mM谷氨醯胺(最終濃度，參見表2)來製備。如果這樣做，則按照上述步驟7.3.5標記培養基瓶，加入“2mM GlutaMAX”以防止混淆CM1的標準配方。
7.3.11.2 CM1補充了額外的抗生素/抗真菌藥
7.3.11.2.1一些CM1製劑需要額外的抗生素或抗真菌劑以防止由某些腫瘤類型生長的前REP TIL的污染。
7.3.11.2.2將抗生素/抗真菌劑添加至下表24中所示的最終濃度。
7.3.11.2.3如果這樣做，按上述步驟7.3.1標記培養基瓶，加入額外抗生素/抗真菌劑的名稱，以防止與CM1的標準配方混淆。
7.4 CM2的製備
7.4.1從冰箱中取出準備好的CM1，或按照上述第7.3節準備新的CM1。
7.4.2從冰箱中取出AIM-V®。
7.4.3將製備的CM1與等體積的AIM-V®混合在無菌培養基瓶中，製備所需的CM2量。
7.4.4使用當天將3000IU/ml IL-2加入CM2培養基中。
7.4.5在使用當天製備足夠量的CM2和3000IU/ml IL-2。
7.4.6標記CM2培養基瓶的名稱，製備者的首字母，過濾/製備的日期，兩週的有效期，並儲存在4℃直至組織培養所需。根據需要將培養基等分到較小體積的瓶中。
7.4.7將沒有IL-2的任何CM2送回冰箱，在冰箱中可以存放長達兩週，或者直到酚紅pH值指示器顯示pH值發生極端變化(鮮紅色到粉紅色)。
7.5 CM3的製備
7.5.1在需要使用的當天準備好CM3。
7.5.2 CM3與AIM-V®培養基相同，在使用當天補充 3000IU/ml IL-2。
7.5.3通過將IL-2儲備溶液直接添加到AIM-V的瓶子或袋子中，製備足以滿足實驗需要的量的CM3。輕輕搖晃混合均勻。加入AIM-V後，立即用“3000IU/ml IL-2”標記瓶子。如果有過量的CM3，將其儲存在4℃的瓶子中，標有介質名稱，製備者的首字母，介質的製備日期和失效日期(製備後7天)。
7.5.4在4℃下儲存7天后，補充IL-2的廢棄培養基。
7.6 CM4的製備
7.6.1 CM4與CM3相同，額外補充2mM GlutaMAXTM(終濃度)。
7.6.1.1對於每1L CM3，加入10ml的200mM GlutaMAXTM。
7.6.2通過將IL-2儲備溶液和GlutaMAXTM儲備溶液直接添加到AIM-V的瓶子或袋子中，製備足以滿足實驗需要的CM4量。輕輕搖晃混合均勻。
7.6.3加入AIM-V後立即用“3000IL/nil IL-2和GlutaMAX”標記瓶子。
7.6.4如果有過量的CM4，將其儲存在4℃的瓶子中，標有介質名稱“GlutaMAX”，製備者的首字母，介質的製備日期及其有效期(製備後7天)。
7.6.5在4℃下儲存7天后，補充IL-2的廢棄培養基。
實施例18：REP後TIL的表面抗原染色 1. 目的
該實施例描述了通過流式細胞術對REP後TIL進行細胞表面染色的方法。該方法可以應用於本申請和實施例中描述的任何TIL。
關鍵術語和定義
α：Alpha
β：Beta
μl：微升
APC：異藻藍蛋白
Ax647：Alex Fluor 647
BD：Becton Dickinson Company
BSA：牛血清白蛋白
BSC：生物安全櫃
BV421：Brilliant Violet 421
CD：分化簇
CST：細胞計數器架設及追蹤
Cy：花青素
DPBS：Dulbecco氏磷酸鹽緩衝生理鹽水
FACS：螢光活化細胞分選器
FBS：胎牛血清
FITC：螢光異硫氰酸鹽
FMO：Fluorescence Minus One
G：克
H7：Cy7類似物
Ml：毫升
PE：藻紅素
PerCP-Cy5.5：甲藻黃素葉綠素蛋白
PPE：個人保護配備
REP：快速擴增規程
SIT：注射試樣管
TCR：T細胞受體
w/v：重量對體積
流動式細胞測量術抗體及染色
7. 程序
7.1試劑準備
7.1.1 FACS洗滌緩衝液
7.1.1.1向DPBS中加入2%(w/v)熱滅活的FBS(將10ml FBS加入到490mL的1X dPBS中)。
7.1.1.2添加0.1%(w/v)NaN3(76.9ul至500mL瓶)。
7.1.1.3溶液儲存在40℃。30天后丟棄。
7.1.2 Aqua染料
7.1.2.1向小瓶活性染料中加入50μlDMSO。
7.1.2.2混合均勻，目測確認所有染料均已溶解。
7.1.2.3將未用於該程序的染料等分並在20℃冷凍直至下次使用。不再冷凍/解凍第二次。
7.1.3抗體雞尾酒製備。
7.1.3.1雞尾酒申聚丙烯管如Eppendorf管製成
7.1.3.2雞尾酒儲存長達6個月。
7.2流式細胞儀檢測要求
7.2.1流式細胞儀校準
7.2.1.1按照製造商的說明，使用CST珠在測定當天校準流式細胞儀。
7.2.1.2操作員確保流式細胞儀已通過校準，其中性能和基線檢查有效。
7.2.2補償/FMO控制
7.2.2.1使用BD補償珠和ArCTM胺反應補償珠試劑盒製備單色補償樣品。
7.2.2.2 FMO對照，含有細胞的樣品用抗體混合物染色，減去下列單一抗體偶聯物，CD27，CD28和CD57。
7.2.3 MFI標準化
7.2.3.1每天用珠粒控制和目標電壓值測定細胞分析儀電壓。
7.3樣品染色
7.3.1標記的FACS管，樣品ID-DF1，樣品ID-DF2，樣品ID-T1，樣品ID-T2。
7.3.2標記的一組FMO對照，含CD27-APC-H7，CD28-PE，CD57-PerCPCy5.5，CD45RA-PECy7，CCR7-PE，CD38-APC，CD137-PE7，Lag3-PE，PD1 APC，Tim3-BV421，CD69-PE7，TIGIT-PE，KLRG1-Ax647和CD154-BV421。
7.3.3每管加入0.5至200萬個細胞。
7.3.4 QS至每管3mL的1xPBS。
7.3.5以400 x g，高加速度和製動旋轉管子5分鐘。
7.3.6當樣品離心時，製備死細胞標記的Aqua染料。
7.3.7從冰箱中取出Aqua等分試樣並在PBS中稀釋1/200。保持黑暗。將2uL染料加入198uL DPBS中。
7.3.8滗析或吸出步驟7.3.5中的上清液。
7.3.9從上面向樣品和FMO對照添加25uL Aqua溶液。
7.3.10在室溫(室溫)下避光孵育15分鐘。
7.3.11注意：如果細胞最初儲存在無蛋白質培養基中，則應在室溫下加入阻斷步驟，如5uL TruStain 10分鐘。
7.3.12在適當的試管中加入50uL抗體雞尾酒。
7.3.13搖管架混合。
7.3.14在室溫下在黑暗中孵育15分鐘。
7.3.15記錄開始和結束時間。加入3mL FACS洗滌緩衝 液。
7.3.16旋轉管400 x g，高加速度和製動，持續5分鐘。
7.3.17離心機旋轉完成後，傾倒或吸出上清液。
7.3.18通過沿空架滑動管重新懸浮的細胞。
7.3.19向每個管中加入100uL的1%對甲醛。
7.3.20在黑暗中儲存於40℃直至準備在流式細胞儀上收集。
注意：樣品可以存放長達72小時。
7.4 L/D Aqua補償控制。
7.4.1標記的FACS管作為L/D Aqua補償控制。
7.4.2在管中加入一滴弧形珠。
7.4.3將3μlL/D Aqua直接加入珠子中。
7.4.4將試管在室溫下在黑暗中孵育10至30分鐘。
7.4.5在工作表上記錄開始和結束孵育時間
7.4.6孵育後，向每個試管中加入3ml FACS Wash。
7.4.7旋轉管以400 x g，高加速度和製動，持續5分鐘。
7.4.8傾倒或吸出上清液。
7.4.9用500μl1%PFA溶液重懸管。加入1滴負珠。置於40℃黑暗中直至收集。
7.5補償對照染色。
7.5.1標記後的FACS管，如REP-TIL後表型工作表所示。
7.5.2添加抗體，如REP-TIL後表型工作表所示。
7.5.3孵育後，向每個管中加入3mL FACS緩衝液。
7.5.4旋轉管500g，高加速度和製動，持續2分鐘。
7.5.5傾倒或吸出上清液。
7.5.6用500μl含1%PFA的PBS重懸於試管中，在黑暗中於2-80℃保存。
7.6數據採集
7.6.1打開FACSDiva軟件並登錄。
7.6.2在細胞計數器不匹配對話框中，單擊“使用CST設置”。
7.6.3單擊“實驗”選項卡並選擇“擴增表型”模板，創建一個新實驗。
7.6.4雙擊目標值實驗並調整電壓以達到由流核心操作員確定的目標值。
7.6.5複製儀器設置並將其粘貼到新實驗上。
7.6.6為每個人創建一個標本並對其進行適當命名。
7.6.7根據管子上的標籤創建樣品名稱。
7.6.8在將管子放入SIT之前，用手指輕輕渦旋或輕彈。
7.6.9在採集板中獲取RECORD下的數據。
7.6.10以每秒少於7,500個事件的速度運行樣品。
7.6.11收集50,000到100,000個不包括碎片的現場活動。
實施例19：程序2A驗證程序開發
完成該實施例中的實驗以分析用於從患者來源的黑色素瘤和單一乳腺癌腫瘤製造TIL的過程2A，包括在REP前程序中來自腫瘤的TIL的生長，然後是修改的REP。特別強調了冷凍TIL產品的建立以及冷凍TIL產品與當前新鮮TIL產品程序(過程1C)的性能比較。該報告將證明在評估新鮮和解凍的臨界品質屬性(細胞數量，活力百分比，%CD3+T細胞和珠子刺激的γ干擾素(IFN-γ)產生)以及重新評估時觀察到類似的概況。刺激擴增表型程序(reREP)是否相同的TIL產品是新鮮的還是冷凍的。提供用於支持該結論的數據包括增殖，活力，表型，IFN-γ釋放，效力，端粒長度和代謝活性。結果表徵過程2A，縮短的REP/REP前過程，然後冷凍保存TIL，以及將2A過程與較長的1C過程進行比較，如本文所述。
腫瘤供體描述，加工日期和加工位置可以在下面的表1中找到(*表示REP使用冷凍的REP-TIL之前的品系開始)：
3. 背景資訊
3.1 LN-144是一種用於治療轉移性黑色素瘤患者的免疫治療產品。該產品由手術切除腫瘤後從個體患者獲得的自體腫瘤浸潤性T淋巴細胞(TIL)組成，並通過細胞培養的細胞腫瘤碎片(pre-REP)離體擴增，然後在存在下快速擴增TIL。高劑量IL-2，抗CD3和共刺激APC。在非清髓性淋巴清除預處理後，患者接受單次輸注他/她的TIL並隨後每8小時靜脈輸注阿地白介素(IL-2)，最多6次劑量。研究涉及TIL擴張的替代方法。腫瘤微環境(TNE)內的損傷相關分子模式分子(DAMP)的設置也證明了對治療有用的T細胞的有效擴增(Donia 2014；Sommerville，2012)。
已經用於TIL的商業生產的方法1C涉及生產時間表，其可能需要約45-55天來生產可輸注的TIL產品，其在24小時內被遞送至免疫耗盡的患者。接受患者的免疫耗竭必須 與當前TIL產品的收穫精確地定時。收穫或遞送新鮮產品的延遲會對等待輸注的免疫耗竭患者產生負面影響。由於REP和REP前程序的長度減少，過程2A通過減少製造前置時間和材料而改進了過程1C。此外，Process 2A提高了產品出貨時間的靈活性。在REP之前，REP和收穫過程中的過程1C和過程2A之間的差異(見表2)包括：
3.1.1在REP前程序中使用的具有增加的腫瘤碎片容量的較大燒瓶。
3.1.2使用封閉系統或適合未來適應封閉系統的步驟。
3.1.3 REP前和REP程序中的天數減少。
3.1.4直接至REP方法，其在選擇REP-TIL的特定群體以進行REP之前消除了對REP前種群表型的需要。
3.1.5與預先設定數量的經輻照的同種異體PBMC APC聯合培養的抗CD3(株OKT3)的共培養物，計算TIL的充分擴增。
3.1.6用於收穫的自動細胞清洗系統。
3.1.7基於CS10的最終配方，在裝運前進行低溫保存。
4. 縮寫
5. 實驗設計 5.1 程序2A
5.1.1預REP：收到後，將腫瘤轉移到生物安全櫃(II類，A2型)。使用無菌技術，將腫瘤從運輸容器中取出並在含有50μg/mL慶大霉素的HBSS中洗滌。技術人員將腫瘤粉碎成40×3×3×3mm的片段，將其轉移到含有補充有6000IU/mL rhIL-2的預熱的CM1培養基的G-REX-100M燒瓶中。將燒瓶置於37℃，5%CO 2濕潤的組織培養箱中11天。如果腫瘤產生超過40個片段，則可以設置多於一個G-REX-100M。然後收穫細胞並為REP製備。
5.1.2 REP：在第11天，一個含有5L CM2的G-REX-500M燒瓶，補充有3000IU/mL rhIL-2,30ng/mL抗CD3(株OKT3)和5×109輻射的同種異體飼養PBMC細胞。準備。計數體積減少後從REP-REX-100M前燒瓶中收集的TIL，並以5×10 6至200×10 6個細胞的密度接種到G-REX-500M燒 瓶中。然後將燒瓶置於潮濕的37℃，5%CO 2組織培養箱中5天。在第16天，減少G-REX-500M燒瓶的體積，計數TIL並測定其活力。此時，TIL擴增成多個G-REX-500M燒瓶(最多六個燒瓶)，每個燒瓶密度為1×109TIL/燒瓶。然後將所有燒瓶置於潮濕的37℃，5%CO 2組織培養箱中再培養6天。在收穫當天的第22天，每個燒瓶體積減少90%，將細胞合併在一起並通過170μm血液過濾器過濾，然後收集到3L Origin EV3000袋或等同物中以準備使用LOVO自動洗滌。
5.1.3收穫和最終配方：使用LOVO自動細胞處理系統洗滌TIL，其用含有1%HSA的PlasmaLyte-A的洗滌緩衝液代替99.99%的細胞培養基。LOVO採用旋轉過濾膜技術，可回收超過92%的TIL，同時幾乎消除了殘留的組織培養成分，包括血清，生長因子和細胞因子，以及其他碎片和顆粒。在洗滌完成後，進行細胞計數以確定TIL的擴增及其在收穫時的生存力。將CS10以1：1體積：體積比添加到經洗滌的TIL中以實現方法2A最終製劑。將最終配製的產品等分到低溫保存袋中，密封，並置於預冷的鋁盒中。然後根據SOP LAB-018 Rev 000 Operation of Controlled Rate Freezer，使用CryoMed Controlled Rate Freezer(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)冷凍含有TIL的低溫保存袋。
5.2 TIL樣品：收集TIL的四個條件用於表徵比較。
5.2.1新鮮收穫的TIL(直接來自PlasmaLyte-A，含 1%HSA洗滌緩衝液)解凍TIL(直接來自解凍的最終產品袋)
5.2.2新鮮擴增表型reREP TIL(新鮮收穫的TIL用IL-2，PBMC飼養細胞和抗CD3株OKT3培養7-14天)
5.2.3解凍擴增表型TIL(解凍TIL用IL-2，PBMC飼養細胞和抗CD3株OKT3培養7-14天)
5.3測試概述(見圖2)
5.3.1 REP前測試包括在整個REP前評估IL-2的數量和分析細胞培養代謝物，如葡萄糖，乳酸，L-谷氨醯胺和氨。
5.3.1.1 IL-2定量：定期從REP前培養物中除去培養基，並通過ELISA測試IL-2定量。參考R & D Systems Human IL-2 Quantikine ELISA Kit製造商的說明。
5.3.1.2細胞培養代謝物分析：定期從REP前培養物中除去培養基，並測試以下代謝物：葡萄糖，乳酸，L-谷氨醯胺和氨。有關說明，請參考Roche Cedex Bioanalyzer用戶手冊。
5.3.2 REP測試包括擴增測定，例如細胞計數，活力百分比，細胞表面分子的流式細胞術分析，效力(IFN-γ產生)，生物發光重定向裂解測定，顆粒酶B產生，細胞代謝和端粒長度測量。
5.3.2.1細胞計數和活力：根據SOP LAB-003 Rev 000 Cellometer K2 Image Cytometer Automatic Cell Counter，使用Cellometer K2自動細胞計數器(Nexcelom Bioscience，Lawrence，MA)計數TIL樣品並測定活力。
5.3.2.2細胞表面生物標誌物的流式細胞術分析：使用WRK LAB-041 Rev 000 Post REP TIL表面抗原染色中概述的程序，將TIL樣品等分用於細胞表面標誌物的流式細胞術分析
5.3.2.3效力測定(IFN-γ產生)：通過測定用CD3，CD28和CD137/4-1BB抗體刺激的TIL培養基中細胞因子IFN-γ的水平來測量細胞毒性潛力的另一種量度。使用WRK LAB-016 Rev 000刺激TIL測定IFN-γ釋放來測定來自這些刺激的TIL的培養基中的IFN-γ水平
5.3.2.4生物發光重定向裂解測定：根據WRK LAB-040生物發光中概述的SOP，使用TIL與生物發光細胞系P815(株G6)的共培養測定來評估TIL裂解靶細胞的細胞毒性潛力。TIL的重定向裂解分析(效力分析)
5.3.2.5顆粒酶B的產生：顆粒酶B是TIL殺死靶細胞能力的另一種衡量標準。按照製造商的說明，使用Human Granzyme B DuoSet ELISA試劑盒(R & D Systems，Minneapolis，MN)評估5.2.5.3中所述再刺激的培養基上清液的顆粒酶B水平。
5.3.2.6細胞(呼吸)代謝：用線粒體呼吸和糖酵解抑制劑處理細胞以確定TIL的代謝特徵，包括以下測量：基線氧化磷酸化(通過OCR測量)，備用呼吸能力，基線糖酵解活性(通過ECAR測量)和糖酵解儲備。使用WRK LAB-029 Seahorse Combination Mitochondrial/Glycolysis Stress Test Assay中概述的程序進行代謝譜。
5.3.2.7端粒長度測量：已使用多種方法測量基因組DNA和細胞學製劑中端粒的長度。端粒限製片段(TRF)分析是測量端粒長度的金標準(de Lange等，1990)。然而，TRF的主要限制是需要大量的DNA(1.5μg)。兩種廣泛使用的測量端粒長度的技術，即熒光原位雜交(FISH；Agilent Technologies，Santa Clara，CA)和定量PCR。
5.3.3為以下測試採集了額外的樣本，並可根據需要在將來進行分析：
5.3.3.1深入細胞因子分析
5.3.3.2 TCR測序
6. 所達到之結果
使用源自2.3節中描述的腫瘤的TIL進行總共9次實驗，實驗設計和5.1節中的收穫條件。使用方法2A收穫的TIL進行5.3.2節中概述的測試，目的是了解它們的擴增能力，活力，表型，細胞毒性潛力和代謝特徵。對新鮮收穫的TIL產物和解凍的冷凍TIL產物採取所有措施(方法2A)。
6.1細胞計數和活力
6.1.1細胞計數在REP前，REP的第5天或第6天(擴增日)和REP結束時進行，在LOVO洗滌之前和LOVO洗滌之後。然後將細胞計數用於確定REP期間TIL的擴增和LOVO洗滌後TIL的恢復。解凍後，再次計數細胞以確定解凍後的恢復(基於TIL被冷凍的濃度)和解凍後的生存力，然後進行其他分析測定。表3總結了九個Process 2A運行的所有 這些結果。
6.1.2過程2A SOP將REP的起始編號定義為5 200 x 106TIL的範圍。用於啟動Process 2A REPs的9個TIL樣品的範圍是4.1 x 106(M1065T)-1.8 x 108(M1064T)，平均起始TIL數為6.58 x 107.有趣的是，REP鍍有最低數量的TIL在REP收穫時擴大到最大程度(所有9個REP的擴增範圍：130-1900倍；平均擴張，840倍)。在這9個Process 2A REPs結束時收穫的平均TIL數為4.49×1010(範圍7.8×10 9-6.7×10 10)。
6.1.3對於過程1C的比較統計，請參閱LN144/LN-145的研究新藥(IND)申請的化學，製造和控制(CMC)部分。
6.1.4過程1C利用人工處理和離心來清洗TIL產品。這是耗時的，但更重要的是可導致在收穫和最終配方之間損失高達25%的產品。自動細胞清洗LOVO系統提供了一種使細胞損失最小化的方法，並且還引入了封閉的系統清洗，其降低了在清洗步驟期間產品污染的風險。在方案的 LOVO洗滌步驟後回收產物，並顯示進入洗滌步驟的TIL產物的平均回收率為93.8±10.4%。該統計數據包括M1062T的TIL產品，其LOVO回收率為68%，在此期間操作員錯誤操作LOVO導致需要離心樣品，然後重新啟動LOVO程序(參見第7節，偏差和差異))。這代表了對REP收穫日的程序1C洗滌步驟的非常有利的改進。
6.1.5解凍後TIL的回收也是冷凍TIL產品的主要問題。通過測量在解凍後從袋中回收的細胞數量與在冷凍保存之前放入每個冷凍袋中的細胞數量相比較來確定產物的回收率。解凍後的恢復範圍為78-103%，平均恢復率為88.2±8.6%。
6.1.6儘管在解凍之前或之後樣品的存活率存在顯著差異，但平均而言，解凍時存活率僅有2%的損失。進入冷凍保存的TIL的存活率為84.3±4.7%，解凍後相同的TIL具有82.1±4.4%的存活率(p=0.0742，配對Student's t-檢驗，非參數)。新鮮臨床TIL Process 1C產品的釋放標準要求至少70%的活力。無論解凍後的活力損失如何，過程2A的所有9次運行在低溫產物解凍後滿足該釋放標準。表4和圖3顯示了進入冷凍保存的TIL(Fresh+CS10)的活力和解凍後TIL的存活率。
6.2 TIL的re-REP擴增。除了檢查新鮮產品在REP中擴增的能力之外，還評估了新鮮和經解凍的TIL產物在用新鮮照射的同種異體PBMC飼養細胞APC和新鮮抗CD3再刺激時擴增的能力。7天后，分析這些再刺激的TIL產物從初始培養條件擴增的能力。圖4和表5顯示了培養7天后re-REP TIL細胞的平均擴增。使用配對Student's t檢驗分析數據表明，無論是用新TIL還是解凍TIL產品開始REP，TIL在re-REP中擴增的能力都沒有顯著差異(p=0.81)。
6.3細胞培養代謝物。Lion 2A的主要前提之一是減少技術時間和流程轉移將節省成本並限制可變性。可能的不良後果是不良代謝物的增加和營養源的減少。如圖5所示，在評估REP前11天的結果時，電解質(鈉和鉀)，營養素(谷氨醯胺和葡萄糖)和代謝物(乳酸和氨)的正常血液值提供了一個值得考慮的範圍。。如圖6所示，依次評估三個TIL(M1061T，M1062T和M1064T)。在這種情況下，鉀和鈉維持在正常水平，葡萄糖>1.0g/L，谷氨醯胺>0.3mmol/L，遠高於正常血液值。正如預期的那樣，乳酸鹽上升到高達0.8g/L，大約是血液中正常水平的5倍，氨水高達3mmol/L，正如快速擴增細胞所預期的那樣，並且 也大大高於血液中常見的水平。
6.4 IL-2定量。
6.4.1除了補充葡萄糖，谷氨醯胺和充足的氧合作用外，REP前TIL增殖的主要驅動因素是提供高水平的rhIL-2。在加入含有血清的培養基後，測量的IL-2水平為2-3.5×10 3IU/ml，在培養的11天內僅降至約1.0×10 3IU/ml。這遠遠高於維持T細胞增殖所需的30-100IU/ml。使用不同來源的IL-2(Prometheus，Akron，Cellgenix)評估IL-2濃度目前正在Lion Biotechnologies的單獨實驗(QP-17-010：來自Cellgenix，Akron和Prometheus的IL-2的鑑定)中進行測試，坦帕。
6.5 IFN-γ的產生
6.5.1如5.3.5.3部分所述用磁性抗CD3，CD28和4-1BB Dynabeads刺激TIL 24小時後，收集培養物的上清液並用ELISA試劑盒分析IFN-γ。所有再刺激的TIL比未刺激的TIL產生更多的IFN-γ，表明TIL的刺激導致它們的活化。圖8顯示了測試的四種不同TIL組合物(新鮮，解凍，新鮮re-REP和解凍re-REP TIL)在再刺激時將IFN-γ釋放到周圍培養基中的能力。
表6和7顯示了9個過程2A運行中IFN-γ分泌的平均值。再刺激時，在新鮮TIL產物和解凍的冷凍保存的TIL之間，向周圍培養基中分泌的IFN-γ沒有差異。表6顯示新鮮的產物平均產生4143±2285pg IFN-γ/106 TIL，而解凍產物產生3910±1487pg IFN-γ/106 TIL(使用配對Student t檢驗 p=0.55)。如果標準化為總TIL產物(表7))，平均而言，刺激的新鮮TIL產生86±61克IFN-γ，而解凍刺激的TIL產生68±40克IFN-γ(p=0.13)。這些發現表明新鮮和解凍的TIL產品均產生IFN-γ和在用抗CD3/抗CD28/抗-4-1BB刺激時，新鮮或解凍的匹配TIL產生IFN-γ的能力沒有差異。
6.6 顆粒酶B製造
1.1.1 如5.2.5.3中所述，用磁性抗CD3、CD28和4-1BB Dynabeads刺激TIL 24小時，24小時後收集培養物的上清液，並藉由ELISA分析顆粒酶B量。所有再刺激的TIL比未經刺激的對應物產生更多顆粒酶B，顯示TIL的刺激導致其活化。圖9顯示了在用細胞介素混合物再刺激時，新鮮TIL、新鮮re-REP TIL和經解凍的re-REP TIL將顆粒酶B釋放到周圍培養基中的能力。
所有產物的顆粒酶B產量範圍為9190pg/106個存活細胞至262000pg/106個存活細胞(表8)。表6顯示新 鮮產物平均產生60644+42959，而新鮮和經解凍的re-REP分別產生93600+67558和103878+84515。新鮮re-REP與經解凍之re-REP之間的比較，顯示從任一條件所獲得的TIL的能力沒有差異(p=0.7)。由於在經解凍之產物中缺乏顆粒酶B測量，使用新鮮TIL產物未進行統計學分析。
1.2 流式細胞儀分析細胞表面生物標記
TIL的表型分析：四種抗體組已在LION標準化，以廣泛地表徵T細胞的功能特徵。這些組用於評估新鮮TIL，解凍TIL，新鮮re-REP TIL和解凍re-REP TIL的免疫表型分析。本節中用於圖形表示的所有數據也以附錄部分10中的表格格式(表14-24)提供。
6.8生物發光重定向裂解分析
6.8.1為了確定Process 2A TIL殺死其靶腫瘤細胞的潛在能力，我們開發了一種效能測定，涉及TIL與生物發光替代靶細胞系P815的共培養，如5.3.2.4節中所述。在抗CD3刺激存在下，不同TIL組合物與P815共培養4小時，測量表現為LU50的TIL細胞的細胞毒性潛力，裂解單位可定義為殺死50所必需的TIL數。然後將該測量值表示為LU50/106 TIL。下面的圖32顯示了來自新鮮產物的TIL的 細胞毒性潛力，以及來自兩個re-REP TIL條件，新鮮的re-REP和解凍的細胞毒性潛力。REP。
6.8.2新鮮re-REP與解凍re-REP的比較顯示TIL殺死靶細胞的能力沒有顯著差異(p=0.3126)。該數據支持以下結論：兩者之間沒有差異。就TIL產品的細胞毒性潛力而言，新鮮和解凍的產品沒有進行比較。因為細胞毒性潛力在TIL解凍後沒有立即測量，所以沒有進行比較。表9顯示殺死50%P815所需的TIL裂解單位靶細胞系。
6.9 TIL的細胞代謝特徵
6.9.1為了評估REP後TIL的代謝健康狀況，我們按照5.3.2.6節中概述的方案使用了Agilent Technologies(Santa Clara，CA)的Seahorse代謝分析儀器(XFp和XFe96)。簡而言之，通過用靶向氧化磷酸化或糖酵解的某些方面的抑制劑處理細胞，以允許測定其SRC和糖酵解儲備的方式對細胞施加應激。此外，可以確定氧化磷酸化(基礎OCR)和糖酵解(基礎ECAR)的基礎水平。最後，因為氧化磷酸化和 糖酵解的抑制劑在同一測試中結合在一起，所以可以辨別出潛在的SRC隱藏儲備，這只有當細胞用競爭性糖酵解抑制劑2-脫氧葡萄糖(2-DG)處理時才會顯現，(標記為SRC2DG)，導致SRC增加，否則將保持隱藏。這種額外的呼吸能力被標記為“隱蔽”SRC。表9顯示了新鮮收穫的TIL，新鮮的re-REP TIL和來自對細胞進行的代謝應激測試的解凍的re-REP TIL的代謝特徵。
6.9.2圖55A-F以圖形形式顯示表38中的數據。新鮮收穫的REP產品顯示出與新鮮的re-REP和解凍的re-REP產品的一些統計學差異。這並不奇怪，因為re-REP產品已在REP後立即或在解凍後用新鮮的經照射的PBMC APC和新鮮的抗CD3抗體再刺激。然而，在所有情況下，當在re-REP程序中再次刺激兩者時，新鮮和解凍產品之間沒有顯著差異(參見表9的p值)。這表明冷凍保存過程不會對TIL產品產生不利影響。最值得注意的是，對於氧化磷酸化，re-REP產品具有比其匹配的新鮮收穫REP產品更高的SRC。對於糖酵解，re-REP TIL在統計學上顯著高於糖酵解的基礎水平，並且相反在統計學上比新鮮的REP產物具有更低的糖酵解儲備水平。值得注意的是，這可能表明re-REP TIL比新鮮收穫的TIL活性更高，因為據報導活化的健康TIL具有高水平的糖酵解活性(Buck等，JEM 212：1345-1360)；2015)。
6.9.3使用re-REP程序直接比較新鮮產品和冷凍產品使我們能夠確定在相同刺激條件下新鮮和冷凍TIL產品都會導致統計學上不明顯的代謝特徵。新鮮的re-REP和解凍的re-REP TIL都具有相似的基礎呼吸水平(圖60A，分別為36.7±10.6和44.8±12.9pmol/min；p=0.11)以及類似的(明顯的)SRC(圖60B，41.6±27.2和62.7±30.8；p=0.12)。用2-DG(葡萄糖的競爭性抑制劑)處理這些re-REP細胞，導致糖酵解的抑制，我們看到新鮮和解凍的REP-TIL都表現出額外的“隱藏”備用呼吸能力(SRC2DG)；新鮮收穫的TIL樣品中大部分低或不存在的隱蔽SRC(圖60C)；在新鮮收穫的TIL中只有一個樣品具有高水平的SRC2DG(圖60C)，而相反，在測試的七個樣品中只有一個顯示在重新REP時缺乏Covert SRC。新鮮re-REP的隱蔽SRC(圖60D)平均為20.7±20.1，而解凍re-REP的隱蔽SRC(圖60D)為27.8±16.1；p=0.52)。
6.9.4擴增表型(re-REP)TIL最顯著的代謝讀數是擴增表型(re-REP)樣品的基礎糖酵解的持續高水平。基礎糖酵解(圖60E)在re-REP樣品中始終較高，在新鮮的re-REP中平均為118.7±44.2mpH/min，在解凍的re-REP中平均為132.0±43.2mpH/min。這些樣本彼此之間沒有統計學差異(p=0.38)。然而，如上所述，新鮮收穫的樣品不具有如此高的基礎水平的糖酵解。與新鮮的re-REP TIL相比，這種差異很大，但並不顯著(p=0.10)；然而，與解凍的重新REP樣本相比，差異顯著(p<0.01)。這些重新REP細胞顯 然嚴重依賴於糖酵解的能量需求，因為它們在海馬代謝試驗中受到應力時幾乎沒有糖酵解儲備(圖60F)：新鮮的re-REP TIL平均為12.9±14.9mpH/min；解凍re-REP TIL，3.35±23.8mpH/min)。這些re-REPs彼此沒有差異(p=0.47)，但兩者在統計學上不同於新鮮收穫的TIL樣品中發現的糖酵解儲備，平均值為40.8±17.6mpH/min(與新鮮的相比，p=0.003和0.01)REP和解凍re-REP TIL，分別)。應進行進一步的研究，以確定這些新鮮收穫和再REP TIL樣品之間糖酵解差異的原因。
6.10端粒長度測量
6.10.1用Flow Fish和qPCR測量REP後TIL的端粒長度。
6.10.1.1 使用Dako/Agilent Pathology Solutions(Telomere PNA Kit/FITC for flow Cytometry)試劑盒進行Flow-FISH，按照製造商的說明書測量端粒重複序列的平均長度。在每個測定中使用1301 T細胞白血病細胞系(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))作為內部參考標準。計數個體TIL並以1：1的細胞比例與1301細胞混合。將2×106TIL與2×106×1301細胞混合。原位雜交在雜交溶液(70%甲醯胺，1%BSA，20mM Tris，pH7.0)中進行，並且在存在和不存在FITC-綴合的端粒PNA探針(FITC-00-CCCTAA-CCC-TAA-)的情況下進行。CCC-TAA)與端粒重複序列互補，終濃度為60nM。加入端粒PNA探針後，將細胞在82℃下在加熱塊中溫育10分鐘。然後將細胞在室溫下 避光過夜。第二天早上，通過在40℃的加熱塊上用洗滌溶液洗滌2次，每次10分鐘，除去過量的端粒探針。洗滌後，加入DAPI(Invitrogen，Carlsbad，CA)，終濃度為75ng/ml。用DAPI進行的DNA染色用於對G0/G1群體中的細胞進行門控。使用Yeti流式細胞儀(Propel-Labs，Fort Collins，CO)進行樣品分析。測試樣品的端粒熒光錶示為1301細胞的熒光(fl)的百分比，按照下式計算：相對端粒長度=[(平均FITC fl測試細胞w/探針-平均FITC fl測試細胞無探針))130個細胞的X DNA指數X 100]/[(平均FITC fl 1301細胞w/探針-平均FITC fl 1301細胞無探針)測試細胞的X DNA指數。
6.10.1.2 qPCR：實時qPCR用於測量相對端粒長度。簡言之，使用Bio-Rad PCR熱循環儀(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)以96孔格式測定端粒重複拷貝數與單基因拷貝數(T/S)比。10納克基因組DNA用於端粒(Tel)或血紅蛋白(hgb)PCR反應，所用引子如下：Tel-1b引子(CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT)，Tel-2b引子(GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT)，hgb1引子(GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC)和hgb2引子(CACCAACTTCATCCACGTTCACC)。通過端粒和血紅蛋白反應分析所有樣品，並在同一平板上一式三份進行分析。除了測試樣品之外，使用從1301細胞分離的基因組DNA，每個96孔板含有0.08ng至250ng的五點標準曲線。 通過從中值端粒Ct值中減去中值血紅蛋白閾值循環(Ct)值來計算每個樣品的T/S比(-dCt)。通過從每個未知樣品的T/S比中減去10ng標準曲線點的T/S比來確定相對T/S比(-ddCt)。
6.10.1.3端粒長度結果和討論：端粒是線性染色體末端的帽(重複核苷酸序列)，其在促進完整染色體複製中起關鍵作用端粒測量是研究退行性疾病等條件的新興工具，癌症和衰老。來自NIH的先前研究(J Immunol。2005，Nov 15；175(10)：7046-52；Clin Cancer Res。2011，Jul 1；17(13)：4550-4557)已顯示TIL的較長端粒長度相關聯有臨床反應。相反，Radvanyi的研究小組發現，應答者和非應答者之間TIL的端粒長度沒有顯著差異(Clin Cancer Res；18(24)；6758-70)。到目前為止，沒有證據證明端粒長度與體外T細胞培養的長度有關。與通過方法1C方法(25-36天培養)培養的TIL相比，通過方法2A(22天培養)培養的REP後TIL可能具有更長的端粒長度。
2. 不一致及偏差
7.1過程偏差
7.1.1 M1061T：在第6天將REP細胞分成4個G-Rex500M燒瓶。
7.1.2 M1062T：在第6天將REP細胞分成4個G-Rex500M燒瓶。由於LOVO過濾系統上的操作員錯誤，在程序期間發生緊急停止，需要從一次性試劑盒手動收集TIL。在第二次LOVO運行期間成功過濾了TIL。
7.1.3 M1063T：無偏差M1064T：無偏差
7.1.4 M1065T：Pre-REP細胞在第11天低於細胞計數的規格(<5×10 6個細胞)，但繼續進入REP。在REP第6天，計數細胞並放回G-Rex500M中。用4.5L新鮮培養基餵養。由於細胞計數不足(在REP第6天<1×109個細胞)，TIL在這天沒有擴增。
7.1.5 EP11001T：無偏差
7.1.6 M1056T：將Pre-REP細胞在LION中在G-Rex 100燒瓶中培養長達21天。在REP第11天過濾出腫瘤片段，並且在收穫當天將TIL冷凍100% CS10以每1.5ml小瓶30×10 6個細胞。冷凍TIL在Moffitt PD中在補充有6000IU/mL rhIL-2的CM1中解凍並休息3天，然後開始REP的第0天。在REP第6天，TIL擴大進入4個燒瓶，在REP第11天開始收穫。
7.1.7 M1058T：將Pre-REP細胞在LION中在G-Rex 100燒瓶中培養長達21天。在REP第11天過濾出腫瘤碎片，並且在收穫當天將TIL冷凍100% CS10以每1.5ml小瓶30×10 6個細胞。冷凍TIL在Moffitt PD中在補充有6000IU/mL rhIL-2的CM1中解凍並休息3天，然後開始REP的第0天。在REP第6天，細胞被分開進入4個燒瓶，在REP第11天開始收穫。
7.1.8 M1023T：將Pre-REP細胞在LION中在G-Rex10燒瓶中培養長達21天。在REP第11天過濾出腫瘤片段，並且在收穫當天將TIL在100%CS10中冷凍。每1.5ml小瓶 30×10 6個細胞。冷凍TIL在Moffitt PD中在補充有6000IU/mL rhIL-2的CM1中解凍並在REP開始第0天之前休息3天。在REP第6天，將細胞擴增到4個燒瓶在REP第11天開始收穫。
7.2測試偏差
7.2.1未進行深入的細胞因子分析和TCR測序
3. 結論及建議
8.1開發更強大的流程。對Lion的挑戰是將具有較長處理時間的早期Lion Process 1C轉換為可能更具商業化的Lion Process 2A，其利用改進，從而縮短處理時間並且冷卻保存TIL產品的最終配方。為此，進行了九次程序開發試驗以確認新舊程序證明了相當的細胞產量和相當的TIL效力和表型。特別值得注意的是整個過程的複雜性顯著降低，導致REP和REP前的總長度減少了50%，但仍然導致TIL產量相當(7.8 x 109-67 x 109個細胞)目前在我們的合同製造商處實施的歷史性Lion Process 1C。最近更新了2017年6月的ASCO演示文稿(平均值：41.04 x 109個細胞，範圍為1.2-96 x 109個細胞)。此外，Lion已成功開發出一種冷凍保存的TIL產品，該產品的解凍後恢復率為78-103%，TIL的活力>70%，符合目前的Process 1C釋放標準(見表2)。
8.2擴增表型分析的作用(Re-REP)。響應促有絲分裂刺激而增殖的能力(如本報告中提供的實驗性重新REP)是TIL的關鍵品質屬性。此處提供的實驗表明，與7/9匹配的 新鮮TIL產品相比，8/9解凍的TIL產品在一周內能夠擴增>100倍，支持解凍的TIL產品與新鮮TIL產品的可比性(表2)。TIL的另外兩個關鍵品質屬性是它們在細胞因子(CD3/CD28/4-1BB)刺激後釋放IFN-γ和/或粒酶B的能力。新鮮和解凍產品的細胞因子刺激導致7/9新鮮產品和所有解凍產品中IFN-γ釋放超過2ng/106細胞/24小時(圖35)(參見本報告第6.2節)。在所有9個過程運行中觀察到粒酶B釋放(圖36)。CD4和CD8水平(圖39和圖40)表明新鮮和解凍的TIL產品之間具有顯著的內部一致性。此外，分析TIL殺死替代腫瘤靶細胞系的能力(P815，圖59)顯示新鮮和解凍的TIL具有相似的細胞毒性潛力。
8.3 TIL的代謝應激試驗揭示了強大的生物能學。對在re-REP中刺激的新鮮和解凍的TIL產物的代謝特徵的分析表明，新鮮和解凍的TIL對代謝應激測試的反應相似，並且在一組代謝特徵中沒有顯示出實質性差異(表39)。因此，基於本報告中提供的身份，效力，細胞數和活力的四個品質屬性，可以認為冷凍保存的Process 2A TIL產品與新鮮的Process 1C產品相當。比較匹配的新鮮和解凍細胞的測定在本報告中概述的每個測定中是非常可比的。
8.4驗收標準：TIL產品的內在異質性與每位患者的個性化治療反映：(1)其獨特的主要組織相容性複合物限制分子(人類生物學中最多態的基因產物)；(2)腫瘤微環境中出現的個體腫瘤的獨特進化軌跡，具有基因組不穩定性和獨特的個體驅動和乘客突變；(3)等位基因變異，N區多樣 性和VDJ重排所賦予的異質性，定義了用於識別新表位共享腫瘤-睾丸抗原和病毒編碼產物的T細胞受體的β/β和β/β區段。。因此，評估由於過程變化而發生的額外變化是一項艱鉅的任務，並且需要評估盡可能多的參數以確保自己盡可能地保持本質上異質材料的“可比性”。這是通過忠實地檢查幾個可行性和可比性的驗收標準來完成的，詳見下表40。
根據表11中列出的可行性標準，將評估TIL是否符合要求。每個實驗和每個TIL線均滿足所有單獨標準(n=9)。使用學生t檢驗進行統計分析。非參數學生T檢驗用於 計算%生存力的p值，因為生存力測量不是高斯分佈。參見下表41。
基於表40中列出的驗收標準，評估新鮮和冷凍的re-REP TIL是否滿足要求。(由於重新REP的持續時間為7天而未報告的活力，並且殘留的輻照PBMC無法與TIL區分開。)括號中的數字表示未達到的標準。基於使用CD3+表現測量的純度標準，6/9新鮮Re-REP TIL產品符合嚴格>90%標準(M1061，M1065和EP11001沒有)，8/9解凍產品甚至在Re-REP之後通過驗收標準。EP11001T新鮮re-REP中CD3+TIL的數量較少可能歸因於T細胞受體的極端下調。對於M1023T解凍重新TIL，未測定CD3+TIL作為純 度的量度。對於該TIL組合物，使用TCRap染色估計純度，並用星號(*)表示。Student-t檢驗用於統計分析。見下表42。
書目
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4. 其他表格
實施例20：新穎的經冷凍保存之腫瘤浸潤淋巴細胞(LN- 144)投予轉移性黑色素瘤患者
在多中心第2期臨床試驗中，新穎的經冷凍保存之腫瘤浸潤淋巴細胞(LN-144)投予轉移性黑色素瘤患者證實療效及耐受性
簡介：
已經在數百名患有轉移性黑色素瘤的患者中研究了過繼細胞療法(ACT)與非冷凍保存的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的安全性和功效。這項多中心臨床試驗由集中製造的TIL(LN-144)作為非冷凍保存和冷凍保存的輸注產品啟動。我們用於非冷凍保存的LN-144的新型製造程序用於第1組，在組群2中使用縮短的3週，冷凍保存的LN-144。組群2製造提供了明顯更短的程序，加上冷凍保存的TIL產品這允許患者安排和劑量的靈活性。較短的製造過程減少了患者接收其TIL產品的等待時間，並且冷凍保存為物流和向臨床站點的遞送增加了便利性。
方法：
C-144-01是評估接受LN-144的轉移性黑色素瘤患者的前瞻性多中心研究。在使用Cy/Flu預處理方案進行非清髓性淋巴細胞清除後，患者接受單次輸注LN-144，然後給予IL-2(600,000IU/kg)至多6個劑量。評估患者作為主要終點的客觀反應長達24個月。
結果：
我們表徵了冷凍保存的LN-144，其在與用於組群1的TIL輸注治療方案相同的前後TIL輸注治療方案後給予第二組患者，組群2(N=10)。
組群2患者進行大量預處理，其中所有患者均具有抗CTLA-4和抗PD-1治療，並且腫瘤負荷較大(對於組群2,1，平均SOD：15.3,10.9cm)。對於組群2,1分別，先前全身治療的中位數為4,3。對安全性數據的初步分析表明冷凍保存的LN-144具有可比較的耐受性。接受非冷凍保存的LN-144的群組1患者的安全性特徵對於該晚期患者群體仍然是可接受的。在兩個定群中觀察到的最常見的TEAE是噁心，貧血，發熱性中性粒細胞減少，中性粒細胞計數減少，血小板計數減少。療效數據的早期評估表明在第2組中治療的患者中觀察到的TIL治療的抗腫瘤活性，包括PR。
結論：
這代表了多中心環境中的第一個臨床試驗，其中集中製造的TIL評估了具有明顯更短的過程(約3週)的冷凍保存的自體產物的新方法。初步結果表明，冷凍保存的LN-144對於轉移性黑色素瘤患者是一種安全且可耐受的治療選擇，這些患者多次接受多種治療失敗，包括檢查點抑制劑。冷凍保存的LN-144為患者和護理人員提供了更大的靈活性，並允許對具有如此高度未滿足的醫療需求的患 者進行更直接的治療。NCT02360579.
實施例21：評估無血清培養基用於2A程序
該實施例提供的數據顯示評估無血清培養基作為目前在2A過程中使用的標準CM1，CM2和CM4培養基的替代品的功效。該研究測試了可用的無血清培養基(SFM)和無血清替代品作為三個階段的替代品的功效；
階段-1：使用標準對比CTSOptimizer或具有或不具有血清替代物或血小板裂解物的Prime T CDM或Xvivo-20無血清培養基比較TIL擴增(n=3)的功效。
階段-2：使用G-Rex 5M(n=3)在小規模2A過程中測試候選無血清培養基條件。
背景資訊：
儘管已經證明在REP前和後REP培養中使用的當前培養基組合是有效的，但是可以用AIM-V發生REP失敗。如果確定了一種有效的無血清替代品，那麼通過將使用的培養基類型從3減少到1，可以使該過程更直接，更容易在CMO中進行。此外，SFM通過減少不定期疾病的機會消除人血清的使用。該實施例提供了顯示支持在2A過程中使用無血清培養基的數據。
縮寫
μl 微升
實驗設計
如在LAB-008中提到的，開始REP前和REP。這3階段實驗的概述如下圖所示：
如上圖所示，該項目被暗示為分兩步測試無血清培養基和補充劑。
步驟1.選擇無血清培養基輸送器。設置preREP和postREP以模擬G-Rex 24孔板中的2A過程。通過每種條件一式三份地培養G-Rex 24孔板的每個片段/孔來啟動PreREP。REP在第11天開始，通過培養4×10e5 TIL/孔的G-Rex 24孔，在第16天分開，在第22天收穫.CTS OpTimizer，X-Vivo 20和Prime T-CDM用作潛在的血清-用於PreREP和REP的免費媒體替代品。將CTS免疫SR血清替代品(Life Technologies)或血小板裂解物血清(SDBB)以3%加入SFM中。計劃用preREP和postREP中的至少3個腫瘤測試每個條件以模擬2A過程。
步驟2.在每個方案的小規模2A過程(TP-17-007)上進一步測試鑑定的候選物。簡而言之，通過每種條件一式三份培養2個片段/G-Rex 5M燒瓶來啟動preREP。REP在第11天開始使用2×10e6/G-Rex 5M燒瓶，在第16天分開，在第22天收獲。
注意：處理並設置一些腫瘤以在一個實驗中 測量多個參數
觀察
當將無血清培養基與2A過程中使用的標准進行比較時，觀察到等效或統計學上更好的細胞生長結果
當與在2A過程中使用的標準培養基中生長的TIL相比時，觀察到在無血清培養基中生長的TIL的相似表型，IFN-γ產生和代謝物分析。
結果
測試無血清培養基在REP TIL擴增前後的功效。
CTSOptimizer+SR(血清替代)顯示增強的preREP TIL擴增和可比較的REP TIL擴增。CTS OpTimizer，X-Vivo 20和Prime T-CDM加入或不加3%CTS免疫CTS SR，根據標準條件進行測試。在M1079和L4026中，CTS OpTimizer+CSR條件顯示preREP TIL擴增顯著增強(p<0.05)與標準條件(CM1，CM2，CM4)相比(圖62A)。相反，沒有CSR的CTSOptimizer沒有幫助preREP TIL擴增(附錄-1,2,3).CTSOptimizer+CSR顯示可比較的TIL擴增在3個測試的兩個腫瘤中的PostREP(圖2B)。在X-Vivo 20和Prime T-CDM條件下，REP前後發生了大量變異，而四聯體之間的CTSOptimizer相對一致。此外，與標準品相比，SFM添加的血小板裂解物沒有增強preREP和post後TIL擴增(圖62A)。這一發現表明血清替代肯定需要提供與 我們的標準相當的增長，CTSOptimizer+CSR可能是候選者。
測試G-Rex 5M小規模中的候選條件(參見圖64)。
Post REP TIL的表型分析。見圖66及下表56。
干擾素-γ相當性
干擾素-γ ELISA(Quantikine)。使用R&D systems的Quantikine ELISA套組測量IFN-γ的產生。當與我們的標準條件相比，CTS+SR產生相當量的IFN-γ。參 見圖3。
實施例22：T細胞生長因子混合物IL-2/IL-15/IL-21增強擴增和效應功能 腫瘤切除T細胞的研究
具有自體腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的過繼性T細胞療法已經證實在患有轉移性黑色素瘤和子宮頸癌的患者中具有臨床功效。在一些研究中，更好的臨床結果與輸注的細胞總數和/或CD8+T細胞的百分比正相關。目前大多數生產方案僅利用IL-2促進TIL生長。已經報導了使用含IL-15和IL-21的方案增強的淋巴細胞擴增。該研究描述了將IL-15和IL-21添加到臨床上最近實施的第二代IL-2-TIL方案中的積極效果。
材料和方法
產生TIL的過程包括預快速擴增方案(pre-REP)，其中1-3mm 3大小的腫瘤片段置於含有IL-2的培養基中。在REP前，TIL從腫瘤碎片中移出並響應IL-2刺激而擴增。
為了進一步刺激TIL生長，將TIL擴增至稱為快速擴增方案(REP)的二次培養期，其包括經照射的PBMC飼養細胞，IL-2和抗CD3。在本研究中，開發了縮短的REP前和REP擴增方案以擴增TIL，同時保持最終TIL產物的表型和功能屬性。
該縮短的TIL產生方案用於評估IL-2單獨相對於IL2/IL-15/IL-21的組合的影響。比較這兩種培養方案用於從結腸直腸癌，黑色素瘤，子宮頸癌，三陰性乳腺癌，肺癌和腎癌中生長的TIL的產生。在REP前完成時，評估培養的TIL的擴增，表型，功能(CD107a+和IFNγ)和TCRVβ譜系。
使用標準IL-2(600IU/ml)方案，或使用IL-15(180IU/ml)和IL-21(IU/ml)以及IL-2，開始pre-REP培養。在REP前完成評估細胞的擴增。如果整體生長增加至少20%，則將培養物分類為比IL-2增加擴增。本文提供了黑色素瘤和肺表型和功能研究。見下表57。
這些數據表明，與單獨的IL-2相比，當TIL與IL-2/IL15/IL-21一起培養時，除了肺中的表型和功能差異外，TIL產物產量增加。
三重混合物對TIL擴增的作用是指示特異性的並且使大多數低產量腫瘤受益。
通過NSCLC TIL產物中的處理增加CD8+/CD4+T細胞比率。
如通過黑色素瘤和非小細胞肺癌中的CD107a的表現水平所評估的，通過向IL-2添加IL-15和IL-21，T細胞活性似乎增強。
這裡提供的數據顯示使用更短，更穩健的過程的TIL擴增，例如本申請和其他實施例中描述的2A過程，可以適用於包括IL-2/IL-15/IL-21。細胞因子混合物，從而提供進一步促進TIL擴增的手段，特別是在特定適應症中。
正在進行的實驗進一步評估IL-2/IL-15/IL-21對TIL功能的影響。
另外的實驗將評估REP(第一次擴增)期間三聯混合物的效果。
這些觀察結果與TIL培養方案的優化和標準化特別相關，TIL培養方案是大規模製造TIL所必需的，具有主流抗癌療法所需的廣泛適用性和可用性。
實施例23：以經縮減之方法所產生之經冷凍保存之TIL 背景
該實施例提供了與用於LN-144的冷凍保存的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)產品相關的數據，其用適於高通量商業製造的縮略方法產生，顯示出過繼細胞轉移(ACT)的有利品質屬性。
用於產生臨床TIL產物的現有方法涉及開放的操作者乾預，然後延長孵育期以產生治療產品。第1代過程大約需要6週，產生新鮮產品。為了使所有可能受益於其潛力的患者接受TIL治療，開發了一種縮短的22天培養方法，第2代，適用於使用能夠運送到遠端臨床部位的冷凍保存藥物產品的集中製造。第2代代表靈活，穩健，封閉和半自動化的電池生產程序，其適合於商業規模的高產量製造。通過該方法產生的藥物產品具有與第1代方法產生的藥物產品相當的品質屬性。
研究目標：
測定由第1代(過程1C實施態樣)和第2代(過程2A實施態樣)過程產生的藥物產品以確定以下品質屬性的可比性：
劑量及擴增倍數
T細胞純度和T細胞亞群的比例。
共刺激分子在T細胞亞群上的表型表現。
端粒重複的平均相對長度。
能夠分泌細胞因子以響應TCR再活化。.
T細胞受體多樣性。
TIL治療過程概述：
提取：從抑制性腫瘤微環境中移除患者的TIL(通過手術切除病變)
擴增：TIL在IL-2培養物中呈指數增長，產生109-1011TIL，然後輸入患者體內
製備：患者接受NMA-LD(非清髓性淋巴細胞清除，環磷醯胺：60mg/kg，IV×2劑量和氟達拉濱：25mg/m 2 x5劑量)以消除潛在的抑制性腫瘤微環境並最大化植入和效力。TIL治療
輸注：患者輸注其擴張的TIL(LN-144)和短時間的高劑量IL-2(600,000IU/kg，最多6劑)以促進活化，增殖和抗腫瘤，及TIL的細胞溶解活性
分析方法及儀器規畫：
劑量及存活性：對最終配製的產品進行取樣並使用NC-200自動細胞計數器測定總有核細胞，總活細胞和通過吖啶橙/DAPI複染劑測定的活力。
流氏細胞儀：對配製的藥物產品進行取樣並 通過FACS測定其特性。將T細胞百分比確定為活細胞的CD45，CD3雙陽性群體。解凍每個過程的冷凍衛星或前哨小瓶並測定擴增的表型標記，包括CD3，CD4，CD8，CD27和CD28。
端粒重複的平均相對長度：Flow-FISH技術用於測量端粒重複的平均長度。如DAKO®端粒PNA試劑盒/FITC for flow Cytometry方案中所述完成該測定。簡而言之，將2x10 6個TIL細胞與2×10 6 1301個白血病細胞組合。將DNA在82℃變性10分鐘，並將PNA-FITC探針在室溫下在黑暗中雜交過夜。碘化丙啶用於鑑定G0/1期的細胞。
免疫測定：在與mAb包被的珠子(Life Technologies，抗CD3，抗CD28和抗CD137)共培養後，測量藥物產品在再活化時分泌細胞因子的能力。24小時後，收穫培養物上清液，冷凍，解凍，並根據製造商的說明書使用QuantikineIFNγELISA試劑盒(R & D systems)通過ELISA測定。
T細胞受體多樣性：分離來自最終配製產物的RNA，並用VDJ特異性引子進行多重PCR。在TIL產物中表現的CDR3序列被半定量擴增以確定獨特TIL株的頻率和普遍性。在Illumina MiSeq台式測序儀上進行測序。對值進行索引以產生代表產物中T細胞受體的相對多樣性的分數。
結果和結論：
結果在圖75至81中提供。
第2代過程產生具有與第1代相當的品質屬性的TIL產品。
第2代產生相似量的高純度TIL產物，其組成相似比例的T細胞亞群，其表現相對於基因1的相當水平的共刺激分子。
第2代TIL顯示TCR受體的多樣性增加，其在接合時引發細胞因子的強烈分泌。
冷凍保存的藥物產品引入了關鍵的邏輯效率，允許分配的靈活性。
與現有方法不同，第2代縮寫為22天的擴增平台提供了可擴增且在邏輯上可行的TIL製造平台，其允許為急需治療的患者快速生成臨床規模劑量。
第2代TIL製造方案解決了迄今阻礙TIL療法的更廣泛應用的許多障礙。
實施例24：評估同種異體的餵養細胞：til比例範圍100：1至25：1
該研究測試以25：1和50：1的比例相對於對照的100：1(目前在程序1C中使用)之同種異體的餵養細胞對TIL的TIL增殖。
National Cancer Institute的Surgery Branch發表研究顯示，在開始REP(1)時，在G-Rex 100燒瓶中，以 5×106個同種異體的飼養細胞/cm2的TIL的最佳活化的閾值。這已通過數學模型驗證，並且在相同的模型下，預測對於單位面積的細胞：細胞接觸優化的餵養細胞，同種異體餵養細胞相對於TIL的比例可以降低到25：1而對TIL活化和擴增有最低影響。
本研究建立了REP開始時每單位面積飼養細胞的最佳密度，並驗證了REP啟動時同種異體飼養比的有效範圍，以減少和標準化每個臨床批次使用的飼養細胞數量。該研究還驗證了與固定數量的飼養細胞共培養的小於200×106TIL的REP的開始。
A. T細胞體積(10μm直徑)：V=(4/3)πr3=523.6μm3
B. G-Rex 100(M)管柱，有40μm(4個細胞)高度：V=(4/3)πr3=4×1012μm3
C. 填管柱B所需之細胞數：4×1012μm3/523.6μm3=7.6x108μm3 * 0.64=4.86×108
D. 可在4D空間中隨意活化之細胞數目：4.86×108/24=20.25×106
E. 餵養細胞及TIL經外推至G-Rex 500：TIL：100×106及餵養細胞：2.5×109
等式1.在具有100cm 2基部的圓柱體中提供二十面體幾何形狀以活化TIL所需的單核細胞數量的近似。計算推導出~5×108的實驗結果，T細胞的閾值活化與NCI實驗數據密切相關。(1)(C)乘數(0.64)是由Jaeger和 Nagel計算的等效球體的隨機堆積密度1992年(2)。(D)除數24是可以接觸4維空間中的類似物體的等效球體的數量“牛頓數”。(3)
參考文獻
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實施例25：針對TIL產物之重要品質屬性研究 背景
具有自體腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的過繼性T細胞療法已經證實在患有轉移性黑色素瘤和其他腫瘤的患者中具有臨床功效1-3。
來自臨床研究的大多數報告包括對輸注的TIL產品的探索性分析，目的是鑑定可能與產品功效和/或安全性相關的品質屬性，例如不育性，特性，純度和效 力.4,5
這裡，我們呈現來自TIL產品的三個關鍵產品參數的評估，其可以有助於用於TIL的商業製造的未來品質控制平台。
TIL治療過程概述
1.從患者切除腫瘤並轉運至GMP製造設施。
2.到達時，腫瘤被片段化並置於具有IL-2的燒瓶中，用於預快速擴增方案(REP)。
3.在輻照的PBMC，抗CD3抗體(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)的存在下，以REP方案進一步繁殖pre-REP TIL。
評估4.TIL產品的關鍵品質屬性，包括：(1)同一性(2)純度，和(3)效力。
5.在輸注擴增的TIL(LN-144)之前，患者接受由環磷醯胺和氟達拉濱組成的非清髓性淋巴細胞清除方案。在輸注TIL後，患者接受短期(最多6劑)的高劑量IL-2(600,000IU/kg)以支持轉移的TIL的生長和植入。
研究目標
目標：完全表徵TIL產品的特性，純度和效力，從而(a)指導關鍵品質屬性的定義和(b)支持建立在TIL產品的商業生產中實施的正式發布標準。
策略：開發以下分析方法以支持TIL產物表 徵。特別地，進行以下方法：通過流式細胞術進行表型分析以進行同一性和純度評估，使用殘留腫瘤細胞檢測分析來測量純度，以及干擾素-γ釋放試驗用於評估效力。
材料與方法 一致性和純度
表型特徵：TIL產物用抗CD45，抗CD3，抗CD8，抗CD4，抗CD45RA，抗CCR7，抗CD62L，抗CD19，抗CD16和抗CD56抗體染色。並通過流式細胞術分析T和非T細胞亞群的定量。
純度
殘留腫瘤檢測測定：用抗MCSP(黑色素瘤相關的硫酸軟骨素蛋白聚醣)和抗CD45抗體以及活/死可固定的Aqua染料染色TIL產物，然後通過流式細胞術分析以檢測黑色素瘤細胞。加標對照用於評估腫瘤檢測的準確性並建立數據分析的門控標準。
效力
IFNγ釋放測定：用抗CD3/CD28/CD137包被的珠子再刺激TIL產物18至24小時，之後收穫上清液以使用ELISA測定評估IFNγ分泌。
結果
一致性：大多數(>99%)黑色素瘤TIL產物由CD45+CD3+細胞組成。
圖86A-86C提供了使用10色流式細胞術測定的TIL產物的表型特徵。(A)T細胞和非T細胞亞群的百分比由CD45+CD3+和CD45-(非淋巴細胞)定義。/CD45+CD3-(非T細胞淋巴細胞)。總體而言，測試的TIL產物之>99%由T細胞(CD45+CD3+)組成。顯示的是TIL產物的平均值(n=10)。(B)二個T細胞次群組的百分比，包括CD45+CD3+CD8+(藍色空心圓)和CD45+CD3+CD4+(粉紅色空心圓)。使用學生的非配對T檢驗，觀察到兩個子集的百分比沒有統計學差異(P=0.68)。(C)針對四種不同的次群組特徵分析非T細胞族群，包括：1)非淋巴球(CD45-)，2)NK細胞(CD45+CD3-CD16+/56+)，3)B細胞(CD45+CD19+)和4)非NK/B細胞(CD45+CD3-CD16-CD56-CD19-)。
同一性：大多數黑色素瘤TIL產物表現出與T細胞細胞毒性功能相關的效應或記憶T細胞表型。
圖87A和87B顯示CD45+CD3+CD4+和CD45+CD3+CD8+細胞群中T細胞亞群的表徵.Naïve，中樞記憶(TCM)，效應記憶(TEF)和效應記憶RA+(EMRA)使用CD45RA和CCR7定義T細胞亞群。圖87A和87B顯示來自CD4+(A)和CD8+(B)細胞群中的10種最終TIL產物的代表性T細胞亞群。效應記憶T細胞亞群(藍色)開環)是TIL最終產品的CD4+和CD8+亞群中的主要群體(>93%)。超過 7%的TIL產物細胞是中心記憶子集(粉紅色空心圓).EMRA(灰色空心圓)和幼稚在TIL產品中幾乎檢測不到(黑色空心圓)子集(<0.02%)。p值表示使用學生的非配對T檢驗的EM和CM之間的差異。
純度：MCSP代表用於純度測定的合適的黑色素瘤腫瘤標誌物。
圖88A和88B顯示黑色素瘤腫瘤細胞中MCSP和EpCAM表現的檢測。根據本文所述的方法產生黑色素瘤腫瘤細胞系(WM35,526和888)，患者衍生的黑色素瘤細胞系(1028,1032，和通過對MCSP(黑色素瘤相關的硫酸軟骨素蛋白多醣)和EpCAM(上皮細胞粘附分子)標記物進行染色來表徵結腸直腸腺癌細胞系(HT29作為陰性對照)。(A)平均90%的黑色素瘤腫瘤細胞表現MCSP。(B)與陽性對照HT29(EpCAM+腫瘤細胞系)相比，未在黑色素瘤腫瘤細胞系中偵測到EpCAM表現。
純度：開發基於流式細胞術的測定法，用於檢測TIL產物中的殘留腫瘤細胞。
圖89A和89B示出了用於確定腫瘤檢測準確度的加標對照的檢測。該檢定藉由將已知量的腫瘤細胞摻入(spiking)PBMC懸浮液(n=10)來進行。將MCSP+的526黑色素瘤腫瘤細胞以1：10、1：100和1：1,000的比例稀釋，然後與PBMC混合且用抗MCSP和抗CD45抗體和活/死染料染色，並藉由流動式細胞測量術分析。(A)分別以1：10、1：100和1：1,000的稀釋度檢測到大約3000、300和30個細 胞。(B)在各條件下所獲得的細胞的平均(AV)和標準偏差(SD)用於界定參考上限和下限。
純度：使用加標對照對殘留腫瘤檢測測定進行鑑定
圖90A和90B顯示了加標對照中上限和下限的可重複性研究。三重覆進行三次獨立實驗以判定摻入(spiking)檢定的重現性。(A)MCSP+檢測的腫瘤細胞的數量始終在參考上限和下限範圍內。(B)線性回歸圖顯示MCSP+細胞和摻入(spiking)稀釋之間的相關性(R2=0.99)，黑色實線顯示最佳擬合。綠色和灰色虛線分別代表標準曲線和样品(Exp # 1至3)中95%的預測極限。
純度：黑色素瘤腫瘤細胞污染物低於最終TIL產物中的測定檢測限。
圖91A和91B顯示TIL產物中殘餘黑色素瘤腫瘤的檢測。使用所開發的檢定來評估TIL產物殘餘的腫瘤污染(n=15)。可檢測的MCSP+事件的中位數和百分比分別為2和0.0002%。
效力：TIL的IFNγ分泌(始終>1000pg/ml)證明了TIL產物的效應功能。
圖92顯示T細胞活化後TIL產物的效力評估。TIL產物中的抗CD3/CD28/CD137再刺激後的IFNγ分泌藉由ELISA二重複來評估(n=5)。使用Wilcoxon符號秩檢定(P=0.02)，TIL產物的IFNγ分泌顯著大於未經刺激的對照，並且始終>1000pg/ml。IFNγ分泌>200pg/ml被認為是有效 的。p值<0.05被認為具有統計學意義。
結論
評估了TIL產物的特性，純度和效力的關鍵產物參數。根據本文所述方法製備的TIL產品由大於99%的CD45+CD3+T細胞組成。大多數CD4+和CD8+TIL亞群表現出與T細胞細胞毒性功能相關的效應記憶表型。基於流式細胞術的檢測方法成功開發並鑑定了最終TIL產品中的污染黑色素瘤腫瘤細胞。應用該測定，顯示最終TIL產物中的污染黑色素瘤腫瘤細胞低於測定檢測的極限。在抗CD3/CD28/CD137再刺激後最終TIL產物的IFNγ分泌可用作商業製造的TIL的效力測定。這些數據為品質控制平台奠定了基礎，該平台將支持TIL產品商業化生產的關鍵品質屬性的進一步發展。
實施例26：以適用於高通量商業製造的經縮短方法所產生之經冷凍保存之TIL產物展現過繼性細胞轉移的較佳品質屬性 背景
產生用於過繼細胞轉移(ACT)的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的經典方法涉及多個離體培育步驟以產生新鮮(非經冷凍保存)輸注產物。
第一代(Gen 1)程序在約6週產生新鮮TIL劑量。開發了將離體培養期間縮短至22日的第二代(Gen 2)TIL製造程序(圖93)。
Gen 2程序適用於集中製造，並產生經冷凍保存的TIL輸注產物，為臨床中心的排程、物流和遞送帶來便利。藉由Gen 2程序產生的LN-144經冷凍保存的TIL輸注產物具有與藉由Gen 1方法產生的TIL的非經冷凍保存的TIL輸注產物相當的品質屬性。Gen 2 TIL製造方法代表了彈性、穩健、封閉式和半自動化的細胞生產程序，適用於商業規模的高產量TIL製造。
研究目標
評估Gen 1和Gen 2製造程序所產生的TIL輸注產物，以判定下列品質屬性的相當性：(1)細胞計數(劑量)、存活性、REP期生長速率，(2)T細胞純度和T細胞次群組共刺激分子的表型表現，(3)端粒重複的平均相對長度，(4)反應CD3、CD28、CD137結合之分泌IFNγ的能力，和(5)最終輸注產物中存在的T細胞受體的多樣性(圖94)。
分析方法&儀器規畫
細胞計數及存活性：對最終配製的輸注產物進行取樣，並使用NC-200自動細胞計數器測定總有核細胞，總活細胞和通過吖啶橙/DAPI複染劑測定的活力。使用吖啶橙/碘化丙啶雙熒光染色在Nexcellom Cellometer K2 Cell Viability Counter上測定程序開發批次。
表型標記：對配製的輸注產物取樣並通過免疫熒光染色測定其特性。將T細胞百分比確定為活細胞的CD45+，CD3+(雙陽性)群體。解凍每個過程的冷凍衛星或前哨小瓶並測定擴增的表型標記，包括CD3，CD4，CD8，CD27和CD28。在BD FACS Canto II上獲得新鮮的輸注產物，並且在Bio-Rad ZE5細胞分析儀上獲得解凍的輸注產物上的擴增的表型標記。
端粒重複的平均相對長度：流氏-FISH(flow-FISH)技術用於測量端粒重複的平均長度。如針對流動式細胞測量術規程之DAKO® Telomere PNA Kit/FITC中所述來完成該檢定。簡而言之，將2.0×106個TIL細胞與2.0×106個人細胞系(1301)白血病T細胞組合。將DNA在82℃變性10分鐘，並將PNA-FITC探針在室溫下在黑暗中雜交過夜。碘化丙錠用於鑑定G0/1期的細胞。
免疫功能：在與抗體包被的珠子(Life Technologies，抗CD3，抗CD28和抗CD137)共培養後，測量輸注產物在再活化時分泌IFNγ的能力。24小時後，收穫培養物上清液，冷凍，解凍，並使用QuantikineIFNγELISA試劑盒(R & D systems)根據製造商的說明通過ELISA測定。
T細胞受體多樣性：T細胞受體多樣性：分離來自輸注產物的RNA，並用VDJ特異性引子進行多重PCR。在TIL產物中表現的CDR3序列進行半定量擴增和深度測序以確定獨特TIL株的頻率和普遍性。在Illumina MiSeq台式測序儀上進行測序。對值進行索引以產生代表產物中T細胞受體的相對多樣性的分數。
結果
在第22日，將體積減少的細胞產物彙集(pool)並取樣以在洗滌和調製之前判定培養性能。圖95A-95C顯示總存活細胞、生長速率及存活性。(A)如前所述，在NC-200自動化細胞計數器上分析樣本。總存活細胞密度由來自4個獨立樣本的二重複計數的總平均判定。Gen 2程序產生與Gen 1相似劑量的TIL產物(Gen 1平均=4.10×1010±2.8×1010，Gen 2平均=4.12×1010±2.5×1010)。(B)對REP期計算生長速率，為。(C)使用如前所述之Cellometer K2，從9個程序開發批次評估細胞存活性。在經調製之產物的單次凍融循環後未觀察到細胞存活性的顯著降低。解凍和取樣後存活性的平均降低為2.19%。
圖96A-96C顯示Gen 2產物是高純度的T細胞培養物，其表現的共刺激分子量與Gen 1相當。(圖96A)藉由流動式細胞測量術檢定新鮮調製的藥物產物的一致性以放行。Gen 1和Gen 2程序產生高純度的T細胞培養物，如CD45+、CD3+表型所界定。(圖96B及96C)將經調配藥物產物的經冷凍保存之衛星小瓶解凍，並如前所述藉由流動式細胞測量術來檢定擴增的表型。Gen 1和Gen 2產物在T細胞次群組上表現相似量的共刺激分子CD27和CD28。會 需要共刺激分子如CD27和CD28以提供T細胞受體結合(engagement)後效應細胞增殖所必需的二級和三級傳訊。使用Mann-Whitney 't'檢定計算P值。
圖97顯示Gen 2產物趨向於較長的相對端粒長度。如先前所述，流氏-FISH(flow-FISH)技術用於測量端粒重複的平均長度。RTL值表明對照細胞系(1301白血病細胞系)每個染色體/基因體的端粒螢光之每個染色體/基因體的平均端粒螢光在Gen 1中是7.5%±2.1%，並且Gen 2是8.4%±1.8%。數據表明Gen 2產物平均具有與Gen 1產物相當的端粒長度。端粒長度是離體細胞培養長度的替代量度。
圖98顯示Gen 2藥物產物響應CD3、CD28和CD137結合而分泌IFNγ。將冷凍保存的藥物產物解凍並如前所述與經塗覆抗體的珠狀物一起溫育。數據以在24小時由5×105個存活性細胞產生的IFNγ的量表示。相對於Gen 1藥物產物，Gen 2藥物產物展現增加的製造IFN-γ能力。藥物產物再活化和分泌細胞介素的能力是在HLA背景下於TCR與關聯性抗原(cognate antigen)結合時體內功能的替代量度。
圖99A及99B顯示Gen 2藥物產物具有增加的獨特T細胞受體多樣性。T細胞受體多樣性評估如下。檢定來自Gen 1及Gen 2輸注產物的10x106個TIL的RNA，以判定在各產物中存在的獨特CDR3序列的總數和頻率。(圖99A)將獨特的CDR3序列相對於各產物中的頻率分度 (index)，以產生代表產物中T細胞受體的整體多樣性的分數。(圖99B)各輸注產物中存在的獨特CDR3序列的平均總數。來自二個程序的TIL產物由具有不同抗原特異性和結合性(avidity)的多株T細胞族群所構成。總T細胞組庫(repertoire)的廣度可以指示腫瘤細胞上呈現的可作用表位的數量。
結論
該Gen 2製造程序製造TIL輸注產物(LN-144)有與Gen 1相當品質屬性。Gen 2製造類似高度純TIL劑量。相對於Gen 1，T細胞亞群具有相似的比例，並且表現相當量下的共刺激分子。Gen 2 TIL趨向於較長的相對端粒長度，與離體培養期減少相稱。Gen 2 TIL展現TCR受體的多樣性增加，當結合時，引發IFN-γ的強烈分泌，IFN-γ是溶裂細胞效應子功能的量度。因此，Gen 2(縮短為22天、封閉擴增程序、使用冷凍保存之輸注產物)呈現可規模化擴增且在物流上可行的TIL製造平台，其允許快速生成臨床尺度劑量以供癌患者立即需要的新治療選擇。
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實施例27：T細胞生長因子COCKTAIL IL-2/IL-15/IL-21增強腫瘤浸潤性T細胞的擴增和效應功能在此處描述的新過程中 背景
使用自體TIL的過繼性T細胞療法已經證實在 患有轉移性黑色素瘤和子宮頸癌的患者中具有臨床功效。在一些研究中，更好的臨床結果與輸注的細胞總數和/或CD8+T細胞的百分比正相關。目前大多數生產方案僅利用IL-2促進TIL生長。已經報導了使用含IL-15和IL-21的方案增強的淋巴細胞擴增。該研究描述了將IL-15和IL-21添加到程序2A和第2代TIL製造程序的實施態樣中的積極效果和協同作用。
使用本文描述的新方法產生TIL
從患者切除腫瘤並將其運送到GMP製造設施或實驗室用於研究目的。在到達後，將腫瘤碎片化，置於具有IL-2的燒瓶中以供預快速擴增規程(pre-Rapid Expansion Protocol)(REP前)11天。對於三重混合物研究，在REP前初始加入IL-2、IL-15及IL-21(IL-2/IL-15/IL-21)。對於快速擴增規程(REP)，將TIL與餵養細胞和抗CD3抗體培養再11天(圖100)。
材料及方法
產生TIL的過程包括快速前擴增方案(pre-REP)，其中1-3mm 3大小的腫瘤片段置於含有IL-2的培養基中。在REP前，TIL從腫瘤碎片中移出並響應IL-2刺激而擴張。
為了進一步刺激TIL生長，將TIL擴增至稱為快速擴增方案(REP)的二次培養期，其包括經照射的PBMC 飼養細胞，IL-2和抗CD3抗體。開發了縮短的REP前和REP擴增方案以擴增TIL，同時保持最終TIL產物的表型和功能屬性。這種縮短的TIL生成方案用於評估單獨的IL-2與添加到REP前步驟的IL2/IL-15/IL-21的組合的影響。比較了這兩種培養方案，用於產生從結腸直腸癌，黑色素瘤，子宮頸癌，三陰性乳腺癌，肺癌和腎癌中生長的TIL。在REP前完成時，評估培養的TIL的擴增，表型，功能(CD107a+和IFNγ)和TCRVβ組庫。
該研究顯示在多個腫瘤組織學中IL-2/IL-15/IL-21在REP前的擴增增強。使用標準IL-2(6000IU/mL)方案，或使用IL-15(180IU/mL)和IL-21(1IU/mL)以及IL-2開始Pre-REP培養(圖101))。在REP之前完成評估細胞的擴增。如果總體生長增加至少20%，則將培養物分類為具有比IL-2增加的擴增。在以下段落中進一步討論了黑色素瘤和肺表型和功能研究(圖101中的粗體文)。
IL-2/IL-15/IL-21增強了肺癌中CD8+細胞的百分比，但在黑色素瘤中沒有。在圖102A及102B中，使用流動式細胞測量術在REP前之後對來自(A)黑色素瘤(n=4)和(B)肺(n=7)的TIL進行表型評估CD4+和CD8+細胞。p值表示使用Student氏非成對t檢定的IL-2和IL-12/IL-15/IL-21條件之間的差異。
在用IL-2/IL-15/IL-21處理的培養物中，CD8+細胞中CD27的表現略微增強。在圖103A及103B中，使用流動式細胞測量術，將源自(A)黑色素瘤(n=4)和 (B)肺(n=7)的TIL針對CD4+及CD8+細胞中的CD27+及CD28+表型評估(REP前之後)。CD27(一種與過繼性T細胞治療結果相關的較年輕表型相關的細胞標記物)的表現在源自IL-2/IL-15/IL-21培養的CD8+TIL與單獨的IL-2中略有增強。
添加IL-15/IL-21，T細胞次群組未改變。在圖104A及104B中，REP前之後藉由流動式細胞測量術，將TIL針對來自(A)黑色素瘤(n=4)和(B)肺(n=8)的CD8+及CD4+(數據未顯示)細胞中的效應/記憶型次群組(CD45RA和CCR7)表型評估。TEM=效應記憶型(CD45RA-、CCR7-)，TCM=中樞記憶型(CD45RA-、CCR7+)，TSCM=乾細胞記憶型(CD45RA+、CCR7+)，TEMRA(效應T細胞)(CD45RA+CCR7-)。
以IL-2/IL-15/IL-21差異增強TIL功能性能力。在圖105A及105B中，藉由流動式細胞測量術，評估源自(A)黑色素瘤(n=4)和(B)肺(n=5)的TIL於PMA刺激4小時反應的CD107a+表現(在CD4+和CD8+細胞中)。(C)源自黑色素瘤及肺之REP前TIL用可溶性抗CD3抗體刺激24小時，藉由ELISA評估上清液的IFNγ。
The relative frequency of the TCRvβ repertoire was altered in response to IL-2/IL-15/IL-21 in lung、but not in melanoma.在圖106A及106B中，使用用於流動式細胞測量術的Beckman Coulter套組，評估源自(A)黑色素瘤和(B)肺腫瘤的TIL中的TCRvβ組庫(repertoire)(24 個特異性)。
總結
該工作證明了IL-2/IL-15/IL-21混合物與第2代過程中單獨的IL-2(>20%)相比增強TIL數量的能力，此外還影響表型和功能性。特點。
三重混合物對TIL擴增的影響是組織學依賴性的。在肺腫瘤中加入IL-2/IL-15/IL-21可增加CD8+/CD4+T細胞比率。IL-15和IL-21的添加增強了源自肺腫瘤的TIL中CD107a表現和IFNγ產生。IL-2/IL-15/IL-21的加入改變了肺中的TCRvβ庫。第2代TIL擴增過程用於包括IL-2/IL-15/IL-21細胞因子混合物，從而提供進一步促進特定腫瘤組織學(例如肺和結腸直腸腫瘤)中TIL擴增的手段。這些觀察結果尤其與TIL培養方案的優化和標準化相關，TIL培養方案是大型製造TIL所必需的，具有主流抗癌療法所需的廣泛適用性和可用性。
實施例28：在多中心第2期臨床試驗中，新穎的經冷凍保存之腫瘤浸潤淋巴細胞(LN-144)投予轉移性黑色素瘤患者證實療效及耐受性 背景
已經在數百名患有轉移性黑色素瘤的患者中研究了過繼細胞療法(ACT)利用腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的安全性和功效，並且已經證明了有意義且持久的客觀反應 率(ORR).1在正在進行的階段2試驗，C-144-01利用TIL的集中GMP製造，非冷凍保存的第1代(第1代)和冷凍保存的第2代(第2代)TIL製造過程進行了評估。
第1代在製造期間約為5-6週(在C-144-01研究的第1組中施用)，而第2代在製造期間為22天(過程2A，在C-的第2組中施用)。144-01研究)。來自第1組LN-144製造產品的定群1患者的初步數據在治療PD-1轉移性黑色素瘤患者中是令人鼓舞的，因為TIL治療產生了反應.2第2代的益處包括：(A)減少患者和醫生等待將TIL注入患者的時間；(B)冷凍保存允許調度，分配和交付的靈活性；(C)降低製造成本。本文提供了來自群組2的初步數據。圖107顯示Gen 2實施態樣冷凍保存的LN-144製造程序(流程2A)。
研究設計：C-144-01第2期臨床試驗，轉移性黑色素瘤
第2期、多中心、3定群研究以評估自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(LN144)用於治療轉移性黑色素瘤患者的功效和安全性。
關鍵入選標準：(1)可測量的轉移性黑色素瘤和1個可切除TIL的病變；(2)至少一種全身治療的進展；(3)年齡18歲；(4)ECOG PS 0-1。
治療組：(1)非冷凍保存的LN-144產物；(2)冷凍保存的LN-144產品；(3)對於沒有反應或初始反應後進展的患者用LN-144再治療。圖108顯示了研究設計。
終點：(1)原發性：功效定義為ORR和(2)次 要：安全性和功效。
方法
組群2安全組：13名患者為了產生TIL而接受切除並接受研究治療的任何組分。
組群2功效組：9名接受NMA-LD預處理，LN-144輸注和至少一劑IL-2的患者，並且具有至少一種功效評估.4名患者沒有進行功效評估。數據削減的時間。
已經顯示了通過數據切割日期讀取的所有可用數據的生物標記數據。
結果
圖109提供描繪定群1(ASCO 2017)與定群2的比較患者特徵的表。定群2具有：4個中位數的先前療法；所有患者均已接受過抗-PD-1和抗-CTLA-4；並且具有更高的腫瘤負荷，其反映為靶病變的直徑總和(SOD)和基線時更高的平均LDH。圖110提供表格顯示治療緊急不良事件(30%)。
對於組群2(冷凍保存的LN-144)，輸注產品和TIL治療特徵是(1)輸注的TIL細胞的平均數量：37×109，和(2)IL-2劑量給藥的中位數是4.5。圖111顯示輸注產物及TIL療法針對患者#1至#8之療效。
圖112顯示可評估的穩定疾病(SD)患者或更好的反應患者的臨床狀態。患者6的部分反應(PR)未經證 實，因為患者尚未達到第二次療效評估。一名患者(患者9)在第一次評估之前去世(仍被認定在功效組中)。
在療效組中的9名患者中，一名患者(患者9)由於在第一次腫瘤評估之前的黑色素瘤相關死亡而無法評估(NE)，圖112中未表示。在用Gen 2治療的患者中觀察到反應。疾病控制率(DCR)為78%。響應時間與組群1類似。一名患有進展性疾病(PD)作為最佳反應的患者(患者3)未包括在泳道圖中。
圖113顯示直徑總和的百分比變化。由於在第42天之前的黑色素瘤相關死亡，患者9沒有LN-144後疾病評估。第-14天：從篩選到基線的直徑總和的百分比變化(第14天)。第-14天至第126天：SOD與基線的變化%。第-14天=基線。第0天=LN-144輸注。
在TIL治療，觀察到HMGB1的增加(圖114)。使用HMGB1ELISA試劑盒(Tecan US，Inc)測量血漿HMGB1水平。所示數據表示在第1組和第2組患者中輸注前(第-7天)和第(第4天和第14天)的HMGB1水平的倍數變化。(p值是使用基於對數轉換數據的雙尾配對t檢驗計算的)。樣品大小(粗體和斜體)和平均(斜體)值顯示在每個時間點的括號中.HMGB1由活化的免疫細胞分泌並由受損的腫瘤細胞釋放。因此，用LN-144處理後觀察到的增加的HMGB1水平提示免疫介導的抗腫瘤活性機制。
使用Luminex測定法測量血漿IP-10水平。圖115中顯示的數據表示組群1中的前一天(第-7天)和後一天 (第4天和第14天)LN-144輸注的IP-10水平的倍數變化。組群2患者(p值使用基於對數轉換數據的雙尾配對t檢驗計算)。樣本大小(粗體和斜體)和平均(斜體)值顯示在每個時間點的括號中。後LN正在監測IP-10中的-144輸注增加，以了解與TIL持續性的可能相關性。
來自群組2(n=17個患者)的更新數據在圖116至圖121中報告。與群組1和第1代過程的實施例相比，其顯示DCR為64%並且總響應率(ORR)為29%(N=14)，組群2和Gen 2方法的實施態樣顯示DCR為80%且ORR為40%(N=10)。
結論
來自現有數據的初步結果證明了Gen 1和Gen 2 LN-144 TIL產品之間相當的安全性。用Gen 2方法(如本文所述的方法2A)製備的TIL的給藥導致出現的驚人的臨床反應增加。疾病轉移性黑色素瘤患者，均在抗-PD-1和抗-CTLA-4治療前進展。組群2的DCR為78%。
初步生物標誌物數據支持為TIL療法提出的細胞溶解作用機制。
本文所述的第2代製造過程的實施態樣需要22天。該過程顯著縮短患者必須等待接受其TIL的持續時間，提供給予患者的時間的靈活性，並且導致減少製造成本，同時提供優於現有方法的其他優點，允許商業化和向健康監管機構註冊。使用第2代製造程序的實施態樣的轉 移性黑色素瘤中的初步臨床數據也表明TIL的臨床功效的驚人改善，通過DCR，ORR和其他臨床反應測量，與使用Gen 1程序製造的TIL相比，具有與響應和安全性相似的時間.Gen 2 TIL產品的出乎意料地提高的效率也被證明超過五倍IFN-γ產生增加(圖98)，這與一般的功效改善相關(圖122)，顯著改進的多面性(圖99A和圖99B)，以及更高的平均IP-10和MCP-1產量(圖123至圖126)。令人驚訝的是，儘管Gen 2的流程要短得多，但TIL產品的許多其他關鍵特性都是類似的使用更傳統的製造程序觀察到的那些，包括相對端粒長度(圖97)和CD27和CD28表現(圖96B和圖96C)。
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實施例29：HNSCC及子宮頸癌第2期研究
HNSCC(頭頸部鱗狀細胞癌；C-145-03)第2期研究收案。13名患者同意該研究，從10名患者中收穫TIL，最終7名患者輸注，多於1名患者進行中(in progress)。
子宮頸癌第2期研究(C-145-04)收案。8名患者同意該研究，從4名患者中收穫TIL，最終2名患者輸注，多於2名患者進行中(in process)。
圖127中提供了正在進行的研究的初始數據。在長達84日以TIL療法來治療的HCNSCC和子宮頸癌患者中均觀察到穩定疾病(SD)和/或進展反應。
以上提出的實施例係提供以給予本技術領域中具有通常知識者如何製造和使用本發明之組合物、系統和方法的實施態樣的完整揭露和描述，並且不意欲在限制發明人認為是他們的發明所涵蓋的範圍。對於本技術領域中具有通常知識者明顯的上述實施本發明模式的修改係意欲屬於後列申請專利範圍的範圍內。本說明書中提及的所有專利和出版物表示本發明所屬技術領域中具有通常知識者的技術水準。
所有標題和章節名稱僅用於清楚和參考目的，不應以任何方式視為限制。例如，本技術領域中具有通常知識者將理解根據本文中所述之的本發明的精神和範圍，適當組合來自不同標題和章節的各種態樣的可用性。
在本文中引用的所有參考文獻彼等以引用方式全部併入本文中，並且出於所有目的，其程度如同每個 單獨的出版物或專利或專利申請為了所有目的明確地和單獨地指出以藉由引用方式全部併入。
在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，可以對本申請進行許多修改和變化，這對熟習本技術領域者來說是清楚易見的。本文中所述之特定實施態樣和實施例僅作為例示提供，並且本申請僅受所附申請專利範圍以及申請專利範圍所賦予的等效物的全部範圍的限制。
序列：
SEQ ID NO：1係莫羅單抗(muromonab)重鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：2係莫羅單抗(muromonab)輕鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：3係重組人IL-2蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：4係阿地白介素(aldesleukin)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：5係重組人IL-4蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：6係重組人IL-7蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：7係重組人IL-15蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：8係重組人IL-21蛋白之胺基酸序列。
莫羅單抗(muromonab)的胺基酸序列
介白素的胺基酸序列
<110> 艾歐凡斯生物治療公司(IOVANCE BIOTHERAPEUTICS,INC.)
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<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 莫羅單抗(Muromonab)重鏈
<400> 1
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 莫羅單抗輕鏈
<400> 2
<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 重組人IL-2(rhIL-2)
<400> 3
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 阿地介白素(Aldesleukin)
<400> 4
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組人IL-4(rhIL-4)
<400> 5
<210> 6
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組人IL-7(rhIL-7)
<400> 6
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組人IL-15(rhIL-15)
<400> 7
<210> 8
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組人IL-21(rhIL-21)
<400> 8

Claims (100)

  1. 一種用於將腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)擴增(expanding)為TIL治療族群之方法，其包含：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自該患者所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生； (e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生。
  2. 如請求項1之方法，其進一步包含使用冷凍保存程序冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含在步驟(f)中該經收獲之TIL族群。
  3. 如請求項1之方法，其中使用1：1比例的經收穫之TIL族群對冷凍保存介質(cryopreservation media)來進行該冷凍保存程序。
  4. 如請求項1之方法，其中該等抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
  5. 如請求項4之方法，其中該等PBMC係經照射且係同種異體(allogeneic)。
  6. 如請求項4之方法，其中該等PBMC係在步驟(d)中於第9至14日中任一日加至該細胞培養。
  7. 如請求項1之方法，其中該等抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
  8. 如請求項1之方法，其中使用以膜為基礎之細胞處理系統來進行在步驟(e)中之該收獲。
  9. 如請求項1之方法，其中使用LOVO細胞處理系統來進行在步驟(e)中之該收獲。
  10. 如請求項1之方法，其中該等多個碎片包含約4個至約50個碎片，其中各碎片具有約27mm 3之體積。
  11. 如請求項1之方法，其中該等多個碎片包含約30個至約60個碎片，具有約1300mm 3至約1500mm 3之總體積。
  12. 如請求項9之方法，其中該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1350mm 3之總體積。
  13. 如請求項1之方法，其中該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1克至約1.5克之總質量。
  14. 如請求項1之方法，其中該細胞培養基係經提供於選自由G-container及Xuri cellbag所組成之群組之容器中。
  15. 如請求項1之方法，其中在步驟(d)中之該細胞培養基進一步包含IL-15和/或IL-21。
  16. 如前述請求項中任一項之方法，其中該IL-2的濃度約10,000IU/mL至約5,000IU/mL。
  17. 如請求項15之方法，其中該IL-15的濃度約500IU/mL至約100IU/mL。
  18. 如請求項1之方法，其中該IL-21的濃度約20IU/mL至約0.5IU/mL。
  19. 如請求項1之方法，其中在步驟(f)中之該輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。
  20. 如請求項3之方法，其中該冷凍保存介質包含二甲亞碸(DMSO)。
  21. 如請求項17之方法，其中該冷凍保存介質包含7%至10%的DMSO。
  22. 如請求項1之方法，其中在步驟(c)中之該第一時期和在步驟(e)中之該第二時期係各分別於10日、11日、或12日的時期內來進行。
  23. 如請求項1之方法，其中在步驟(c)中之該第一時期和在步驟(e)中之該第二時期係各分別於11日的時期內來進行。
  24. 如請求項1之方法，其中步驟(a)至(f)係於約10日至約22日的時期內來進行。
  25. 如請求項1之方法，其中步驟(a)至(f)係於約20日至約22日的時期內來進行。
  26. 如請求項1之方法，其中步驟(a)至(f)係於約15日至約20日的時期內來進行。
  27. 如請求項1之方法，其中步驟(a)至(f)係於約10日至約20日的時期內來進行。
  28. 如請求項1之方法，其中步驟(a)至(f)係於約10日至約15日的時期內來進行。
  29. 如請求項1之方法，其中步驟(a)至(f)係進行22日或更少。
  30. 如請求項1之方法，其中步驟(a)至(f)係進行20日或更 少。
  31. 如請求項1之方法，其中步驟(a)至(f)係進行15日或更少。
  32. 如請求項1之方法，其中步驟(a)至(f)係進行10日或更少。
  33. 如請求項2之方法，其中步驟(a)至(f)和冷凍保存係進行22日或更少。
  34. 如請求項1至33中任一項之方法，其中在步驟(e)中所收獲之該治療性TIL族群包含足夠的TIL以供治療有效劑量之TIL。
  35. 如請求項34之方法，其中足夠供治療有效劑量之TIL數量係約2.3×10 10至約13.7×10 10。
  36. 如請求項1至35中任一項之方法，其中步驟(b)至(e)係在單一容器中來進行，其中，相較於在多於一個容器中進行步驟(b)至(e)，在單一容器中進行步驟(b)至(e)導致每經切除之腫瘤的TIL產量之增加。
  37. 如請求項1至36中任一項之方法，其中該等抗原呈現 細胞係在步驟(d)中的該第二時期之期間加至該等TIL而未開放該系統。
  38. 如請求項1至37中任一項之方法，其中在步驟(d)中之該第三TIL族群當經投予個體時，提供療效的增加、干擾素-γ製造的增加、多株性(polyclonality)的增加、平均IP-10的增加、和/或平均MCP-1的增加。
  39. 如請求項1至38中任一項之方法，其中在步驟(d)中之該第三TIL族群當經投予個體時，提供至少五倍或更高的干擾素-γ製造。
  40. 如請求項1至39中任一項之方法，其中在步驟(d)中之該第三TIL族群係治療性TIL族群，其相對於該第二TIL族群，包含的效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞(central memory T cell)次族群增加，其中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，在該治療性TIL族群中之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現一或多種選自下列所組成之群組之特性：表現CD27+、表現CD28+、較長的端粒、CD57表現增加、及CD56表現下降。
  41. 如請求項1至40中任一項之方法，其中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，獲 自該第三TIL族群之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現CD57表現增加和CD56表現下降。
  42. 如請求項1至41中任一項之方法，其中微生物污染之風險相較於開放系統係減少的。
  43. 如請求項1至42中任一項之方法，其中來自步驟(g)之該等TIL係經輸注至患者。
  44. 如請求項1至43中任一項之方法，其中該等多個碎片包含約4個碎片。
  45. 一種用於治療具有癌之個體之方法，該方法包含投予經擴增之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，其包含：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)而獲得自個體所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步 驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；(e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生；(g)使用冷凍保存程序隨意地冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含來自步驟(f)之該經收獲之TIL族群；以及(h)將自步驟(g)中該輸注袋的治療有效劑量之該第三TIL族群投予該患者。
  46. 如請求項45之方法，其中在步驟(e)中所收獲之該治療性TIL族群包含足夠的TIL以供在步驟(h)中投予治療有效 劑量之該等TIL。
  47. 如請求項46之方法，其中足夠供在步驟(h)中投予治療有效劑量之TIL數量係約2.3×10 10至約13.7×10 10。
  48. 如請求項47之方法，其中該等抗原呈現細胞(APC)係PBMC。
  49. 如請求項48之方法，其中該等PBMC係在步驟(d)中於第9至14日中任一日加至該細胞培養。
  50. 如請求項45至49中任一項之方法，其中，在步驟(h)中投予治療有效劑量TIL細胞之前，業經投予非骨髓淨除式淋巴球大量降低方案(non-myeloablative lymphodepletion regimen)於該患者。
  51. 如請求項50之方法，其中該非骨髓淨除式淋巴球大量降低方案包含將劑量60mg/m 2/日的環磷醯胺(cyclophosphamide)投予二日接著將劑量25mg/m 2/日的氟達拉濱(fludarabine)投予五日之步驟。
  52. 如請求項45至51中任一項之方法，其進一步包含在步驟(h)中從將該等TIL細胞投予該患者後之日起以高劑量IL-2給藥方案治療該患者之步驟。
  53. 如請求項52之方法，其中該高劑量IL-2給藥方案包含每八小時以15分鐘靜脈輸注速注(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000IU/kg，直到耐受。
  54. 如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(d)中之該第三TIL族群係治療性TIL族群，其相對於該第二TIL族群，包含增加的效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞(central memory T cell)次族群，其中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，在該治療性TIL族群中之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現一或多種選自下列所組成之群組之特性：表現CD27+、表現CD28+、較長的端粒、CD57表現增加、及CD56表現下降。
  55. 如前述請求項中任一項之方法，其中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，在該治療性TIL族群中之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現CD57表現增加和CD56表現下降。
  56. 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突狀瘤病毒所造成之癌、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、 腎癌、及腎細胞癌(renal cell carcinoma)。
  57. 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、及NSCLC所組成之群組。
  58. 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌係黑色素瘤。
  59. 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌係HNSCC。
  60. 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌係子宮頸癌。
  61. 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌係NSCLC。
  62. 一種用於將腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)擴增(expanding)為TIL治療族群之方法，其包含：(a)將來自患者所切除之腫瘤之經處理之腫瘤碎片加入封閉系統中，以獲得第一TIL族群；(b)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數 量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(a)至步驟(b)之過渡係在未開放該系統下而發生；(c)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)收獲獲自步驟(c)之該治療性TIL族群，其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(e)將自步驟(d)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(d)至(e)之轉移係在未開放該系統下而發生。
  63. 如請求項62之方法，其中在步驟(d)中所收獲之該治療性TIL族群包含足夠的TIL以供治療有效劑量之該等TIL。
  64. 如請求項63之方法，其中足夠供治療有效劑量之TIL數量係約2.3×10 10至約13.7×10 10。
  65. 如請求項64之方法，其進一步包含使用冷凍保存程序冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含該經收獲之TIL族群。
  66. 如請求項65之方法，其中使用1：1比例的經收穫之TIL族群對冷凍保存介質來進行該冷凍保存程序。
  67. 如請求項62之方法，其中該等抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
  68. 如請求項67之方法，其中該等PBMC係經照射且係同種異體(allogeneic)。
  69. 如請求項68之方法，其中該等PBMC係在步驟(c)中於第9至14日中任一日加至該細胞培養。
  70. 如請求項62之方法，其中該等抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
  71. 如請求項62之方法，其中使用LOVO細胞處理系統來進行在步驟(d)中之該收獲。
  72. 如請求項62之方法，其中該等多個碎片包含約4個至 約50個碎片，其中各碎片具有約27mm 3之體積。
  73. 如請求項62之方法，其中該等多個碎片包含約30個至約60個碎片，具有約1300mm 3至約1500mm 3之總體積。
  74. 如請求項63之方法，其中該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1350mm 3之總體積。
  75. 如請求項62之方法，其中該等多個碎片包含約50個碎片，具有約1克至約1.5克之總質量。
  76. 如請求項62之方法，其中該等多個碎片包含約4個碎片。
  77. 如請求項62之方法，其中該第二細胞培養基係經提供於選自由G-container及Xuri cellbag所組成之群組之容器中。
  78. 如請求項62之方法，其中在步驟(e)中之該輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。
  79. 如請求項62之方法，其中在步驟(b)中之該第一時期和在步驟(c)中之該第二時期係各分別於10日、11日、或12日的時期內來進行。
  80. 如請求項62之方法，其中在步驟(b)中之該第一時期和在步驟(c)中之該第二時期係各分別於11日的時期內來進行。
  81. 如請求項62之方法，其中步驟(a)至(e)係於約10日至約22日的時期內來進行。
  82. 如請求項62之方法，其中步驟(a)至(e)係於約10日至約20日的時期內來進行。
  83. 如請求項62之方法，其中步驟(a)至(e)係於約10日至約15日的時期內來進行。
  84. 如請求項62之方法，其中步驟(a)至(e)係進行22日或更少。
  85. 如請求項65之方法，其中步驟(a)至(e)和冷凍保存係進行22日或更少。
  86. 如請求項62至85中任一項之方法，其中步驟(b)至(e)係在單一容器中來進行，其中，相較於在多於一個容器中進行步驟(b)至(e)，在單一容器中進行步驟(b)至(e)導致每經切除之腫瘤的TIL產量之增加。
  87. 如請求項62至86中任一項之方法，其中該等抗原呈現細胞係在步驟(c)中的該第二時期之期間加至該等TIL而未開放未系統。
  88. 如請求項62至87中任一項之方法，其中在步驟(d)中之該第三TIL族群係治療性TIL族群，其相對於該第二TIL族群，包含增加的效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞(central memory T cell)次族群，其中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，在該治療性TIL族群中所獲得之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現一或多種選自下列所組成之群組之特性：表現CD27+、表現CD28+、較長的端粒、CD57表現增加、及CD56表現下降。
  89. 如請求項62至88中任一項之方法，其中，相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞，在該治療性TIL族群中之該效應T細胞和/或中樞型記憶T細胞展現CD57表現增加和CD56表現下降。
  90. 如請求項62至89中任一項之方法，其中微生物污染之風險相較於開放系統係減少的。
  91. 如請求項62至90中任一項之方法，其中來自步驟(e)之 該等TIL係經輸注至患者。
  92. 如前述請求項中任一項之方法，其中該密閉容器包含單一生物反應器。
  93. 如請求項92之方法，其中該密閉容器包含G-REX-10。
  94. 如請求項92之方法，其中該密閉容器包含G-REX-100。
  95. 如請求項1至61中任一項之方法，其中，在步驟(d)中，該等抗原呈現細胞(APC)係以APC：TIL比例為25：1至100：1下加至該第二TIL族群之該細胞培養中。
  96. 如請求項95之方法，其中該細胞培養具有2.5×109的APC對100×10 6的TIL之比例。
  97. 如請求項62至94中任一項之方法，其中，在步驟(c)中，該等抗原呈現細胞(APC)係以APC：TIL比例為25：1至100：1下加至該第二TIL族群之該細胞培養中。
  98. 如請求項97之方法，其中該細胞培養具有2.5×10 9的APC對100×10 6的TIL之比例。
  99. 一種經擴增之TIL族群，其係用於治療具有癌之個體，其中經擴增之TIL族群係第三TIL族群，其可藉由包含下列之方法獲得：(a)藉由將獲自患者之腫瘤樣本處理成多個腫瘤碎片(tumor fragment)，而獲得自個體所切除之腫瘤之第一TIL族群；(b)將該等腫瘤碎片加入封閉系統中；(c)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來進行第一擴增，以製造第二TIL族群，其中該第一擴增係在提供第一氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，其中該第一擴增係進行約3至14日以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群數量係至少大於該第一TIL族群的50倍，且其中從步驟(b)至步驟(c)之過渡係在未開放該系統下而發生；(d)藉由將該第二TIL族群的該細胞培養基補充以額外的IL-2、OKT-3和抗原呈現細胞(APC)來進行第二擴增，以製造第三TIL族群，其中該第二擴增係進行約7至14日以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增係在提供第二氣體可通透性表面區的密閉容器中來進行，且其中從步驟(c)至步驟(d)之過渡係在未開放該系統下而發生； (e)收獲獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中從步驟(d)至步驟(e)之過渡係在未開放該系統下而發生；以及(f)將自步驟(e)中該經收穫之TIL族群轉移至輸注袋，其中從步驟(e)至(f)之轉移係在未開放該系統下而發生；以及(g)使用冷凍保存程序隨意地冷凍保存該輸注袋之步驟，該輸注袋包含來自步驟(f)之該經收獲之TIL族群。
  100. 如請求項99之經擴增之TIL族群，其係用於治療具有癌之個體，其中該方法進一步包含一或多個如請求項1至99中任一項所記載之特徵。
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