KR20230019460A - 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지 및 이의 용도에 관한 것이며, 상기 배지는 세포 배양 성분, 사이토카인 및 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 성분을 포함하며, 여기서 상기 사이토카인은 IL-2를 포함하고, 상기 면역관문은 PD-1, LAG-3, TIGIT 및/또는 CTLA-4를 포함하며, 상기 세포 배양 성분은 혈청 배지 또는 무혈청 배지이다. 본 발명의 상기 종자세포 배지는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배양을 가속화하고, 및/또는 종양 침윤 림프구에 필요한 증폭 시간을 단축할 수 있다.
Description
본 발명은 생물의약 분야에 관한 것이며, 구체적으로 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지 및 이의 용도에 관한 것이다.
1998년 미국 국립 암 연구소(NCI) 외과 분과(Surgery Branch)는 처음으로 환자 치료에 사용된 종양 침윤 림프구(TIL-)의 사례를 보고했다. TIL-에 대한 광범위한 연구는 흑색종 환자의 종양 조직에서 항종양 활성을 갖는 세포를 단리하여 얻을 수 있음을 보여 준다. 최근 부피가 크고 완치가 어려운 종양, 특히 고형 종양에 대한 입양 세포 전이 요법(ACT)에서 TIL-이 매우 뚜렷한 치료 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.
종양 면역 요법에 사용되는 TIL-은 비교적 많은 양의 세포가 필요한데, 이는 TIL-세포 증폭의 기술 및 공정 제어에 비교적 큰 도전을 제기한다. 종래의 방법은 일반적으로 IL-2 기반 사전 증폭(pre-Rapid Expansion Procedure，pre-REP)을 사용하였으나, 이후 "신속 증폭 과정"(REP)을 사용하고 있다. 그 과정은 피더 세포(feeder cell) 및 항-CD3 항체(OKT3)와 고용량 IL-2로 사용될 조사된 복수 공여체로부터의 동종이계 PBMC(단핵세포, MCC라고도 한다)가 많이 필요하다. 복수 공여체 유래의 동종이계 조사된 PBMC세포는 잠재적인 오염 위험이 존재하며, 비교적 높은 농도의 IL-2는 후속 재주입에서 세포 고갈 위험이 존재할 수 있다.
따라서 종양 침윤 림프구의 종자세포를 신속하게 수득하는 데 도움이 되는 배지를 제공하는 것이 시급하다.
본 발명은 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명의 상기 종자세포 배지 및 이의 제조 방법은 하기 중 하나 이상의 유익한 효과를 갖는다.
1) IL-2의 사용량이 크게 감소된다.
2) 후속 재주입에서 IL-2의 사용량이 감소되거나 사용할 필요가 없다.
3) 후속 재주입에서 더 높은 농도의 IL-2로 인한 세포 고갈 위험이 감소된다.
4) 후속 신속 증폭 과정(REP)에서 외인성 동종이계 PBMC 또는 다른 세포를 피더 세포로 사용할 필요가 없으므로, 외인성 오염이 감소된다.
5) 후속 신속 증폭 과정(REP)을 촉진하여 1010-1011 세포 수율이 달성된다.
6) 종양 침윤 림프구의 종자세포 수득이 뚜렷하게 향상되고, 더 나아가 종양 침윤 세포를 증폭시키는 배양 효율이 향상된다, 배양 시간이 단축된다.
한 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지는 세포 배양 성분, 사이토카인 및 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 성분을 포함하며, 여기서 상기 사이토카인은 IL-2를 포함하고, 상기 면역관문은 PD-1, LAG-3, TIGIT 및/또는 CTLA-4를 포함하며, 상기 세포 배양 성분은 혈청 배지 또는 무혈청 배지이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-2의 농도는 약 3000IU/mL 이하이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-2의 농도는 약 2000IU/mL 내지 약 3000IU/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 사이토카인은 IL-7을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-7의 농도는 약 200 내지 약 1000U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 사이토카인은 IL-15를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-15의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 사이토카인은 종양괴사인자 TNF를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 사이토카인은 TNFα를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 TNFα의 농도는 약 10 내지 약 100pg/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 사이토카인은 집락자극인자를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 사이토카인은 GM-CSF, G-CSF 및/또는 M-CSF를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 GM-CSF의 농도는 약 200 내지 약 5000U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 G-CSF의 농도는 약 300U/mL 내지 약 1000U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 M-CSF의 농도는 약 300U/mL 내지 약 800U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 사이토카인은 인터페론을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 사이토카인은 IFN-γ, IFN-α 및/또는 IFN-β를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 IFN-γ의 농도는 약 10 내지 약 1000ng/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IFN-γ의 농도는 약 300 내지 약 1000U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IFN-α의 농도는 약 500U/mL 내지 약 1000U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IFN-β의 농도는 약 200U/mL 내지 약 500U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 사이토카인은 IL-4, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-18, IL-12, IL-21 및/또는 IL-10을 더 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-4의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-1α의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-1β의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-6의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-9의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-18의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-12의 농도는 약 200 내지 약 1000U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-21의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-10의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
특정 실시 양태에서, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 것이며, 상기 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
특정 실시 양태에서, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 3 내지 약 10μg/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
특정 실시 양태에서, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 25μg/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
특정 실시 양태에서, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 종자세포 배지는 공동 자극 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 더 포함하며, 여기서 상기 공동 자극 수용체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
특정 실시 양태에서, 상기 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
특정 실시 양태에서, 상기 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 10μg/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
특정 실시 양태에서, 상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 5 내지 약 10μg/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
특정 실시 양태에서, 상기 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 3 내지 약 10μg/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 혈청 배지는 혈청을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 혈청은 인간 AB 혈청을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 혈청의 농도는 약 1 내지 약 10%(v/v)이다.
특정 실시 양태에서, 상기 혈청 배지는 AIM-V 배지를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 무혈청 배지는 X-VIVO 배지를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 세포 배양 성분은 항생제를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 세포 배양 성분은 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS의 농도는 약 1 내지 약 200U/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 종자세포 배지는 M2형 대식 세포 억제제를 더 포함하며, 상기 M2형 대식 세포 억제제는 RRx001 및/또는 CNI-1493을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 M2형 대식 세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM이다.
특정 실시 양태에서, 상기 종자세포 배지는 조절 T 세포(Treg) 억제제를 더 포함하며, 상기 조절 T 세포 억제제는 CAL-101, 다사티닙(dasatinib), 이매티닙(imatinib) 및/또는 파노비노스탓(Panobinostat)을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 조절 T 세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM이다.
특정 실시 양태에서, 상기 종자세포 배지는 골수 유래 억제세포(MDSC) 억제제를 더 포함하며, 상기 골수 유래 억제세포 억제제는 AG490, 데시타빈(decitabine), 수니티닙 및/또는 BBI608을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 골수 유래 억제세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μg/mL이다.
특정 실시 양태에서, 상기 종자세포 배지는 T 세포 활성제를 더 포함하며, 상기 T 세포 활성제는 LYC-55716, GNE-1858 및/또는 메틸렌블루를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 T 세포 활성제의 농도는 약 1 내지 약 10μM이다.
특정 실시 양태에서, 상기 종자세포 배지는 T 세포 분화 억제제를 더 포함하며, 상기 T 세포 분화 억제제는 TWS119를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 T 세포 분화 억제제의 농도는 약 1 내지 약 10μM이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 종자세포 배지 배양으로 수득된 종양 침윤 림프구의 종자세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 종양 침윤 림프구의 종자세포 또는 이의 세포 집단 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 치료용 약제의 제조에 있어서 상기 종양 침윤 림프구의 종자세포 또는 이의 세포 집단 및 본 발명의 상기 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
특정 실시 양태에서, 상기 암은 흑색종, 신경교종, 위암, 폐암, 위장관 기질종양, 대장암, 간암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 자궁내막 기질육종, 골반강 저분화선암 및 담관암으로 구성된 군에서 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구의 증폭에 있어서 상기 종자세포 배지의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 종자세포 배지에서 단리된 종양 침윤 림프구를 배양하는 단계를 포함하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배양 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 종자세포 배지에서 단리된 종양 침윤 림프구를 배양하여, 상기 종양 침윤 림프구의 종자세포를 수득하는 단계를 포함하는 종양 침윤 림프구의 증폭 방법을 제공한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 종양 침윤 림프구는 필요로 하는 대상체의 복수, 외과적으로 절제된 원발부위 검체, 동시성 및 비동시성 외과적으로 절제된 전이부위 검체, 천자 검체 및 체액으로 구성된 군에서 선택된 검체에서 유래된다.
특정 실시 양태에서, 상기 체액은 혈액, 조직액, 림프액 및/또는 체강액을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 종양 침윤 림프구는 흑색종, 신경교종, 위암, 폐암, 위장관 기질종양, 대장암, 간암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 자궁내막 기질육종, 골반강 저분화선암 및 담관암으로 구성된 군에서 선택되는 종양에서 유래된다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 종양 침윤 림프구는 종양 조직이 절제된 조직괴에서 나오며, 상기 종양 조직이 절제된 조직괴의 직경은 약 1mm 내지 약 10mm이다.
특정 실시 양태에서, 상기 배양 시간은 약 3일 내지 20일이다.
특정 실시 양태에서, 상기 배양 온도는 약 30 내지 42℃이다.
당업자는 하기 상세한 설명을 통해 본 발명의 기타 측면 및 이점을 용이하게 통찰할 수 있다. 하기의 상세한 설명에는 본 발명의 예시적 실시 양태만 도시 및 설명된다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 본 발명의 내용은 본 발명과 관련된 발명의 정신 및 범위를 벗어나 당업자가 개시된 구체적 실시 양태를 변경할 수 없게 한다. 따라서, 본 발명의 도면 및 명세서의 설명은 예시적일 뿐 제한적인 것이 아니다.
본 발명과 관련된 구체적 특징은 청구 범위에 설명된 바와 같다. 하기의 상세한 예시적 실시 양태 및 도면을 통해 본 발명과 관련된 특징 및 이점을 보다 잘 이해할 수 있다. 도면에 대한 간략한 설명은 하기와 같다.
도 1A 내지 도 1B~도 9A 내지 도 9B는 본 발명의 상기 종자세포 배지를 사용해 고형 종양 조직으로부터 배양해 수득한 TIL 종자세포의 유세포 분석 결과,
도 10A 내지 도 10B~도 12A 내지 도 12B는 본 발명의 상기 종자세포 배지를 사용해 종양 환자의 체강액으로부터 배양해 수득한 TIL 종자세포의 유세포 분석 결과,
도 13A 내지 도 13B~도 15A 내지 15B는 종래 기술의 종자세포 배지를 사용해 종양 환자의 체강액으로부터 배양해 수득한 TIL 종자세포의 유세포 분석 결과,
도 16A 내지 도 16B, 도 17 내지 도 20은 본 발명의 종자세포 배지를 사용해 제조된 TIL 재주입 제품의 임상적 재주입 후, TIL 재주입 제품과 상이한 시점의 환자 말초혈액의 TCR 레퍼토리에 대한 고처리량 시퀀싱 분석 결과,
도 21은 본 발명의 상기 종자세포 배지로 제조된 TIL 재주입 제품을 사용하여 임상적 재주입 후 환자 말초혈액의 백혈구, 호중구 및 림프구 증식 상황의 결과를 나타낸다.
도 1A 내지 도 1B~도 9A 내지 도 9B는 본 발명의 상기 종자세포 배지를 사용해 고형 종양 조직으로부터 배양해 수득한 TIL 종자세포의 유세포 분석 결과,
도 10A 내지 도 10B~도 12A 내지 도 12B는 본 발명의 상기 종자세포 배지를 사용해 종양 환자의 체강액으로부터 배양해 수득한 TIL 종자세포의 유세포 분석 결과,
도 13A 내지 도 13B~도 15A 내지 15B는 종래 기술의 종자세포 배지를 사용해 종양 환자의 체강액으로부터 배양해 수득한 TIL 종자세포의 유세포 분석 결과,
도 16A 내지 도 16B, 도 17 내지 도 20은 본 발명의 종자세포 배지를 사용해 제조된 TIL 재주입 제품의 임상적 재주입 후, TIL 재주입 제품과 상이한 시점의 환자 말초혈액의 TCR 레퍼토리에 대한 고처리량 시퀀싱 분석 결과,
도 21은 본 발명의 상기 종자세포 배지로 제조된 TIL 재주입 제품을 사용하여 임상적 재주입 후 환자 말초혈액의 백혈구, 호중구 및 림프구 증식 상황의 결과를 나타낸다.
본 발명의 실시 양태는 특정한 구체적 실시 예를 통해 하기에서 설명되며, 통상의 지식을 가진 자라면 본 명세서에 개시된 내용을 통해 본 발명의 기타 이점 및 효과를 쉽게 이해할 수 있다.
용어 정의
본 발명에서, 용어 "인터페론"은 통상적으로 바이러스 복제 및 세포 증식을 억제하고 면역 반응을 조절하는 고도의 종특이성을 갖는 단백질 패밀리를 말한다. 전형적으로 적합한 인터페론은 재조합 인터페론 α-2b, 재조합 인터페론 α-2a, 재조합 인터페론 α-2C, 인터페론 α-n1, 컨센서스 α 인터페론, 또는 인터페론 α-n3을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 "집락자극인자"는 통상적으로 조혈모세포 표면의 수용체 단백질에 결합함에 따라, 세포를 증식하여 특정 유형의 혈액세포로(일반적으로 백혈구, 적혈구 생성은 적혈구생성소 참조) 분화를 초래할 수 있는 세포내 신호 전달 경로를 활성화하는 분비형 당단백질을 말한다. 그들은 인위적으로 합성되고 외인성으로 투여될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항원 결합 단편"은 통상적으로 항체와 항원 사이의 특이적 결합을 담당하는 아미노산을 포함하는 항체 분자의 일부를 말한다. 항원에서 항체에 의해 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 부분은 전술한 바와 같이 "에피토프"라 지칭한다. 전술한 바와 같이, 항원 결합 도메인은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하지만, 반드시 둘 모두를 포함해야 하는 것은 아니다. Fd 단편은 예를 들어 두 개의 VH 영역을 갖고 일반적으로 온전한 항원 결합 도메인의 일부 항원 결합 기능을 보유한다. 항체의 항원 결합 단편의 예는 (1) Fab 단편, VL, VH, 불변 경쇄(CL) 및 CH1 도메인을 갖는 1가 단편, (2) F(ab’)2 단편, 힌지 영역의 이황화 가교로 연결된 두 개의 Fab 단편을 갖는 2가 단편, (3) 두 개의 VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편, (4) 항체 한 팔의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편, (5) VH 도메인을 갖는 dAb 단편(Ward 등, “Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted From Escherichia coli,”Nature 341:544-546(1989), 이의 전체 내용은 인용을 통해 본 명세서에 포함된다), (6) 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 및 (7) 예를 들어 scFV-라이브러리에서 유래되는 단일사슬 Fv(scFv)를 포함한다. 비록 Fv 단편의 두 도메인 VL 및 VH가 독립된 유전자에 의해 코딩되지만, 합성 링커를 통해 재조합 방법을 사용해 연결될 수 있으며, 합성 링커는 여기서 VL 및 VH 영역이 짝을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬(단일사슬 Fv(scFv)라 한다)로 제조되도록 한다(Huston 등, “Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988) 참조). 이들 항체 단편은 당업계에 공지된 일반적인 기술을 사용해 수득되고, 온전한 항체와 상동한 방식으로 상기 단편의 기능이 평가된다. 본 발명에서, 용어 "항원 결합 단편"은 항원, 특히 세포 표면 수용체 항원에 특이적으로 결합하는 리간드를 더 포함한다. 리간드는 통상적으로 기능적 반응을 유도하기 위해 높은 친화성 및 특이적 방식으로 수용체 단백질(예를 들어 상기 항원)에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 화합물이다. 예를 들어, 상기 리간드는 CD40의 리간드 CD40L, CD137의 리간드 CD137L, CD28의 리간드 CD80 및/또는 OX-40의 리간드 OX-40L을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "면역관문"은 통상적으로 CD4+ 및 CD8+T 세포의 세포 표면 분자 그룹을 말한다. 이들 분자는 항종양 면역 반응을 하향 조절 또는 억제하는 "브레이크"로 효과적으로 사용될 수 있다. 이들 억제성 분자는 DNA, RNA 또는 단백질 수준을 억제함으로써 억제될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "공동 자극 수용체"는 통상적으로 T 세포 표면에서 발현되어 면역 반응 활성화에 의존하는 수용체 부류와 같은 면역 세포를 말한다. 공동 자극 수용체는 항원 제시 세포가 존재하고 제1신호를 제공한 전제 하에, 이와 상응하는 활성화 항체, 리간드 또는 항원 결합 단편과 결합한 후 공동 자극 신호를 켜고, 더 나아가 면역 효과기 세포를 완전히 활성화한다. 공동 자극 수용체가 매개하는 신호 전달 경로의 활성화는 일반적으로 면역 반응의 효과적인 발생에 핵심적인 작용을 한다. 일반적인 공동 자극 수용체는 CD28, CD40, CD137 및 OX-40을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 "종양괴사인자 TNF"는 통상적으로 TNF 단백질을 말하며 TNF 리간드의 슈퍼패밀리가 아니다. 인간 TNFα의 Genbank 수탁번호는 NP_000585.2이다. 용어 “TNFα”는 TNFα의 전구체 형태, 프로 TNFα(pro-TNFα), 전장 TNFα, 및 세포 내 과정에 의해 생성되는 임의의 형태의 TNFα를 포괄한다. 그 용어는 스플라이스 변이체, 대립유전자 변이체, 동종형과 같은 TNFα의 자연 발생 및 비자연 발생의 변이체를 더 포괄한다. TNFα는 TNFR1(TNF 수용체 1, CD120a, p55/60) 및 TNFR2(TNF 수용체 2, CD120b, p75/80)의 두 가지 수용체에 결합할 수 있다. TNFα는 예를 들어 신경염증에서의 작용과 같은 염증성 사이토카인의 역할을 한다.
본 발명에서, 용어 "종양 침윤 림프구"는 통상적으로 종양 조직에서 단리된 침윤 림프구를 말한다. 면역조직화학 염색에 의하면, 종양 침윤 림프구는 CD3+ T 세포, CD20+, CD79α+B 세포, 형질 세포 및 CD56+NK 세포를 포함할 수 있고, 또 T 세포, 소수의 B 세포, NK 세포, 대식 세포 및 수지상 세포를 포함할 수 있는 것으로 나타났다. 상기 종양 침윤 림프구는 직접적인 세포 독성 T 림프구 및 사이토카인 분비를 통해 고효율, 특이성이 강한 항종양 사멸 효과를 생성할 수 있다. 본 발명에서, 상기 종양 침윤 림프구는 단핵 백혈구를 포함할 수 있으며, 상기 단핵 백혈구는 혈류를 떠나 종양으로 이동한다. 상기 종양 침윤 림프구는 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "종자세포"는 통상적으로 본 발명의 배지가 포함된 임의의 적합한 배지를 사용해 종양 조직으로부터 배양된 종양 침윤 림프구를 말한다. 이들 세포는 후속 추가 증폭 배양을 위한 개시제 세포 집단으로 사용될 수 있고, 대상체에 대한 개별적 재주입 요법을 위해 사용되는 세포 집단과 같은 최종 용도의 세포 집단으로도 사용될 수 있다. 상기 종자세포는 종양 조직으로부터 임의의 상이한 배양 시간을 거쳐 수득될 수 있고, 상기 종자세포의 배양 시간은 상기 종자세포의 후속 용도에 따라 결정될 수 있으며, 특정 배양 시간에 국한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 "IL-15”는 통상적으로 T 세포(특히 장상피세포층 림프구(IEL)) 및 자연 살해(NK) 세포의 효율적 성장, 생존 및 활성화 인자로 작용하는 염증성 사이토카인을 말하며, “IL-15 항원” 및 “인터루킨 15”로도 지칭된다. CD, 류마티스 관절염(RA) 및 건선을 포함하는 다양한 염증성 질환에서 IL-15의 발현 증가가 입증되었다(Malamut 등, 2010). IL-15는 CD 면역병리의 중심 조절인자 및 RCD에서 림프종 형성의 비중복 구동인자로 간주된다.
본 발명에서, 용어 “IL-2”는 통상적으로 정상 말초혈액 림프구로부터 생성되고 저농도로 체내에 존재하는 림포카인 파생 단백질을 말한다. 최초로 Morgan 등(1976)이 Science193：1007-1008에서 IL-2를 설명했으며, 처음에는 자극적인 T 림프구 증식을 유도할 수 있기 때문에 T 세포 성장인자로 지칭했다. 그 용어 역시 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등과 같은 IL-2의 발현 후 변형된 단백질을 포함한다.
본 발명에서, 용어 “IL-7”은 통상적으로 IL-7 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말한다. IL-7은 골수 및 흉선의 기질세포에서 분비되는 조혈 성장인자이다. 각질형성 세포, 수지상 세포, 간세포, 뉴런 및 상피 세포에 의해 생성될 수 있다. IL-7은 T 세포 및 B 세포에 대한 작용에 관련될 수 있다.
본 발명에서, 용어 “PD-1”은 통상적으로 CD28 패밀리에 속하는 면역 억제 수용체를 말한다. PD-1은 주로 이전에 활성화된 T 세포의 생체 내에서 발현되고, PD-1 및 PD-2의 두 리간드에 결합된다. 완전한 hPD-1 서열은 GenBank 수탁번호 U64863을 참조할 수 있다.
본 발명에서, 용어 “LYC-55716”은 통상적으로 RORγ 활성제를 말한다. 이의 CAS 번호는 2055536-64-4이다.
본 발명에서, 용어 “GNE-1858”은 통상적으로 HPK1 억제제를 말하며, 이의 CAS 번호는 T11438이다.
본 발명에서, 용어 “TWS119”는 통상적으로 GSK-3 억제제를 말하며, 이의 CAS 번호는 601514-19-6이다.
본 발명에서, 용어 “RRX-001”은 통상적으로 방사선 감작 활성을 갖는 후성유전 조절제를 말한다. 상기 RRX-001은 CD47 /SIRPα 축을 하향 조절하고 종양 미세환경의 TAM 및 기타 면역 억제 세포를 면역 자극 표현형으로 재분극할 수 있다. 이의 CAS 번호는 925206-65-1이다.
본 발명에서, 용어 “CNI-1493”은 통상적으로 염증성 사이토카인(TNF 포함)의 생성을 차단할 수 있는 화합물을 말하며, 이의 CAS 번호는 164301-51-3이다.
발명의 상세한 설명
한 측면에서, 본 발명은 세포 배양 성분, 사이토카인 및 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편 성분을 포함하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지를 제공하며, 여기서 상기 사이토카인은 IL-2를 포함하고, 상기 면역관문은 PD-1, LAG-3, TIGIT 및/또는 CTLA-4를 포함하며, 상기 세포 배양 성분은 혈청 배지 또는 무혈청 배지이다.
본 발명에서, 상기 사이토카인은 인간 유래 사이토카인일 수 있다.
본 발명에서, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 및/또는 완전 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-2의 농도는 3000IU/mL 이하일 수 있다(예를 들어, 약 2900IU/mL 이하, 약 2800IU/mL 이하, 약 2700IU/mL 이하, 약 2600IU/mL 이하, 약 2500IU/mL 이하, 약 2400IU/mL 이하, 약 2300IU/mL 이하, 약 2200IU/mL 이하, 약 2100IU/mL 이하, 약 2000IU/mL 이하, 약 1900IU/mL 이하, 약 1800IU/mL 이하, 약 1700IU/mL 이하, 약 1600IU/mL 이하, 약 1500IU/mL 이하, 약 1400IU/mL 이하, 약 1300IU/mL 이하, 약 1100IU/mL 이하, 약 1100IU/mL 이하, 약 1000IU/mL 이하, 약 900IU/mL 이하, 약 800IU/mL 이하, 약 700IU/mL 이하, 약 600IU/mL 이하, 약 500IU/mL 이하, 약 400IU/mL 이하, 약 300IU/mL 이하 또는 그 이하일 수 있다). 예를 들어, 상기 IL-2의 농도는 약 2000 IU/mL 이하일 수 있고, 약 2500 IU/mL 이하이거나 그 이하일 수 있고, 약 3000 IU/mL 이하일 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 IL-7을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-7의 농도는 약 5 내지 약 100ng/mL일 수 있다(예를 들어, 약 5 내지 약 95ng/mL, 약 5 내지 약 90ng/mL, 약 5 내지 약 85ng/mL, 약 5 내지 약 80ng/mL, 약 5 내지 약 75ng/mL, 약 5 내지 약 70ng/mL, 약 5 내지 약 65ng/mL, 약 5 내지 약 60ng/mL, 약 5 내지 약 55ng/mL, 약 5 내지 약 50ng/mL, 약 5 내지 약 45ng/mL, 약 5 내지 약 40ng/mL, 약 5 내지 약 35ng/mL, 약 5 내지 약 30ng/mL, 약 5 내지 약 25ng/mL, 약 5 내지 약 20ng/mL 또는 약 5 내지 약 10ng/mL일 수 있다). 예를 들어, 상기 IL-7의 농도는 약 200 내지 약 1000U/mL일 수 있다(예를 들어, 적어도 약 200U/mL, 적어도 약 500U/mL, 또는 적어도 약 1000U/mL일 수 있다). 본 발명에서, 상기 IL-7의 농도는 약 200-1000 IU/mL일 수 있다. 예를 들어 적어도 약 200 IU/mL, 적어도 약 500IU/mL 또는 적어도 약 1000 IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 IL-15를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-15의 농도는 약 5 내지 약 100ng/mL일 수 있다(예를 들어, 약 5 내지 약 95ng/mL, 약 5 내지 약 90ng/mL, 약 5 내지 약 85ng/mL, 약 5 내지 약 80ng/mL, 약 5 내지 약 75ng/mL, 약 5 내지 약 70ng/mL, 약 5 내지 약 65ng/mL, 약 5 내지 약 60ng/mL, 약 5 내지 약 55ng/mL, 약 5 내지 약 50ng/mL, 약 5 내지 약 45ng/mL, 약 5 내지 약 40ng/mL, 약 5 내지 약 35ng/mL, 약 5 내지 약 30ng/mL, 약 5 내지 약 25ng/mL, 약 5 내지 약 20ng/mL 또는 약 5 내지 약 10ng/mL일 수 있다). 예를 들어, 상기 IL-15의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL일 수 있다(예를 들어, 적어도 약 200U/mL, 적어도 약 250U/mL, 적어도 약 300U/mL, 또는 적어도 약 500U/mL일 수 있다). 본 발명에서, 상기 IL-15의 농도는 200-500 IU/mL일 수 있다. 예를 들어 적어도 약 200 IU/mL, 적어도 약 250IU/mL, 적어도 약 300 IU/mL 또는 적어도 약 500 IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 종양괴사인자 TNF를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 TNFα를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 TNFα의 농도는 약 10 내지 약 100pg/mL일 수 있다(예를 들어, 약 10 내지 약 95pg/mL, 약 10 내지 약 90pg/mL, 약 10 내지 약 80pg/mL, 약 10 내지 약 70pg/mL, 약 10 내지 약 60pg/mL, 약 10 내지 약 50pg/mL, 약 10 내지 약 40pg/mL, 약 15 내지 약 40pg/mL, 약 10 내지 약 25pg/mL, 약 15 내지 약 25pg/mL, 약 10 내지 약 30pg/mL, 약 10 내지 약 20pg/mL 또는 약 10 내지 약 15pg/mL일 수 있다). 본 발명에서, 상기 TNF-α의 농도는 약 10-100pg/mL일 수 있다. 예를 들어, 약 10-100pg/mL, 약 15-100pg/mL, 약 20-100pg/mL 또는 약 25-100pg/mL일 수 있다. 예를 들어 적어도 약 10pg/mL, 적어도 약 15pg/mL, 적어도 약 20pg/mL 또는 적어도 약 25pg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 집락자극인자를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 GM-CSF, G-CSF 및/또는 M-CSF를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 GM-CSF의 농도는 약 200 내지 약 5000U/mL일 수 있다(예를 들어, 약 200 내지 약 800U/mL, 약 200 내지 약 500U/mL, 약 300 내지 약 5000U/mL, 약 500 내지 약 5000U/mL, 약 1000 내지 약 5000U/mL, 약 1500 내지 약 5000U/mL, 약 2000 내지 약 5000U/mL, 약 2500 내지 약 5000U/mL, 약 3000 내지 약 5000U/mL, 약 3500 내지 약 5000U/mL, 약 4000 내지 약 5000U/mL 또는 약 45000 내지 약 5000U/mL일 수 있다). 예를 들어, 약 200 내지 약 1000U/mL일 수 있고, 약 200 내지 약 800U/mL일 수 있고, 약 200 내지 약 500U/mL일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 200 U/mL일 수 있고, 적어도 약 500 U/mL 또는 적어도 약 800U/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 G-CSF의 농도는 약 300U/mL 내지 약 1000U/mL일 수 있다. 예를 들어, 상기 G-CSF의 농도는 약 500-1000U/mL일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 500 U/mL 또는 적어도 약 1000U/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 M-CSF의 농도는 약 300U/mL 내지 약 800U/mL일 수 있다. 예를 들어, 상기 M-CSF의 농도는 약 300U/mL 내지 약 500U/mL일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 300 U/mL일 수 있고, 적어도 약 500 U/mL 또는 적어도 약 800U/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 인터페론을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 IFN-γ, IFN-α 및/또는 IFN-β를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 IFN-γ의 농도는 약 10 내지 약 1000ng/mL일 수 있다(예를 들어, 약 15 내지 약 1000ng/mL, 약 20 내지 약 1000ng/mL, 약 30 내지 약 1000ng/mL, 약 40 내지 약 1000ng/mL, 약 50 내지 약 1000ng/mL, 약 60 내지 약 1000ng/mL, 약 70 내지 약 1000ng/mL, 약 80 내지 약 1000ng/mL, 약 90 내지 약 1000ng/mL, 약 100 내지 약 1000ng/mL, 약 200 내지 약 1000ng/mL, 약 300 내지 약 1000ng/mL, 약 400 내지 약 1000ng/mL, 약 500 내지 약 1000ng/mL, 약 600 내지 약 1000ng/mL, 약 700 내지 약 1000ng/mL, 약 800 내지 약 1000ng/mL 또는 약 900 내지 약 1000ng/mL일 수 있다). 예를 들어, 상기 IFN-γ의 농도는 약 10 내지 약 1000ng/mL일 수 있다. 예를 들어, 상기 IFN-γ의 농도는 약 300 내지 약 1000ng/mL, 약 300 내지 약 800ng/mL, 또는 약 300 내지 약 500ng/mL일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 300 ng/mL, 적어도 약 500 ng/mL, 적어도 약 800 ng/mL 또는 적어도 약 1000 ng/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IFN-α의 농도는 약 500U/mL 내지 약 1000U/mL일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 500 ng/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IFN-β의 농도는 약 200U/mL 내지 약 500U/mL일 수 있다. 예를 들어, 상기 IFN-β의 농도는 약 250 내지 약 500ng/mL일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 200 ng/mL, 적어도 약 250 ng/mL 또는 적어도 약 500 ng/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 IL-4, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-18, IL-12, IL-21 및/또는 IL-10을 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-4의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL일 수 있다. 예를 들어 적어도 약 200 IU/mL 또는 적어도 약 500 IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-1α의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL일 수 있다. 예를 들어 적어도 약 200 IU/mL 또는 적어도 약 500 IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-1β의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL일 수 있다. 예를 들어 적어도 약 200 IU/mL 또는 적어도 약 500 IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-6의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL일 수 있다. 예를 들어 적어도 약 200 IU/mL 또는 적어도 약 500 IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-9의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL일 수 있다. 예를 들어 적어도 약 200 IU/mL 또는 적어도 약 500 IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-18의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL일 수 있다. 예를 들어 적어도 약 200 IU/mL 또는 적어도 약 500 IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-12의 농도는 약 200 내지 약 1000U/mL일 수 있다. 예를 들어, 상기 IL-12의 농도는 약 200 내지 약 1000U/mL, 약 200 내지 약 500U/mL 또는 약 300 내지 약 1000U/mL일 수 있다. 예를 들어 적어도 약 200 IU/mL, 적어도 약 250 IU/mL, 적어도 약 300 IU/mL 또는 적어도 약 500 IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-21의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL일 수 있다. 예를 들어, 상기 IL-21의 농도는 약 250 내지 약 1000U/mL일 수 있다. 예를 들어 적어도 약 200 IU/mL, 적어도 약 250 IU/mL 또는 적어도 약 500 IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-10의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL일 수 있다. 예를 들어 적어도 약 200 IU/mL, 적어도 약 250 IU/mL, 적어도 약 300 IU/mL또는 적어도 약 500 IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL일 수 있다(예를 들어, 약 3 내지 약 100μg/mL일 수 있고, 약 5 내지 약 100μg/mL일 수 있고, 약 10 내지 약 100μg/mL일 수 있으며, 약 15 내지 약 100μg/mL, 약 16 내지 약 100μg/mL, 약 17 내지 약 100μg/mL, 약 18 내지 약 100μg/mL, 약 19 내지 약 100μg/mL, 약 20 내지 약 100μg/mL, 약 25 내지 약 100μg/mL, 약 30 내지 약 100μg/mL, 약 36 내지 약 100μg/mL, 약 40 내지 약 100μg/mL, 약 45 내지 약 100μg/mL, 약 50 내지 약 100μg/mL, 약 55 내지 약 100μg/mL, 약 60 내지 약 100μg/mL, 약 65 내지 약 100μg/mL, 약 70 내지 약 100μg/mL, 약 80 내지 약 100μg/mL 또는 약 90 내지 약 100μg/mL일 수 있디). 본 발명에서, 상기 PD-1 mAb의 농도는 약 3 내지 100μg/mL일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 3μg/mL, 적어도 약 5μg/mL, 적어도 약 10μg/mL, 적어도 약 15μg/mL, 적어도 약 20μg/mL, 적어도 약 25μg/mL, 적어도 약 36μg/mL, 적어도 약 50μg/mL 또는 적어도 약 100μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있으며, 상기 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 3 내지 약 10μg/mL이다. 예를 들어, 약 5 내지 약 10μg/mL일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 3μg/mL, 적어도 약 5μg/mL 또는 적어도 약 10μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있으며, 상기 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 25μg/mL이다. 본 발명에서, 상기 TIGIT mAb의 농도는 약 2.5-20μg/ mL일 수 있다. 예를 들어, 약 5-20μg/mL일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 2.5μg/mL, 적어도 약 5μg/mL 또는 적어도 약 20μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있으며, 상기 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL이다. 본 발명에서, 상기 CTLA-4 mAb의 농도는 약 3-50μg/mL, 약 5-50μg/mL 또는 약 10-50μg/mL일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 3μg/mL, 적어도 약 5μg/mL, 적어도 약 10μg/mL 또는 적어도 약 50μg/mL일 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자세포 배지는 공동 자극 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 공동 자극 수용체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 공동 자극 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL일 수 있다(예를 들어, 약 2 내지 약 100μg/mL, 약 3 내지 약 100μg/mL, 약 3 내지 약 20μg/mL, 약 4 내지 약 100μg/mL, 약 5 내지 약 100μg/mL, 약 6 내지 약 100μg/mL, 약 7 내지 약 100μg/mL, 약 8 내지 약 100μg/mL, 약 9 내지 약 100μg/mL, 약 10 내지 약 100μg/mL, 약 12 내지 약 100μg/mL, 약 20 내지 약 100μg/mL, 약 10 내지 약 90μg/mL, 약 10 내지 약 80μg/mL, 약 10 내지 약 70μg/mL, 약 10 내지 약 50μg/mL, 약 10 내지 약 20μg/mL 또는 약 3 내지 약 12μg/mL일 수 있다). 본 발명에서, 상기 CD137 mAb의 농도는 약 3-20μg/mL일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 3μg/mL, 적어도 약 5μg/mL, 적어도 약 10μg/mL, 적어도 약 12μg/mL 또는 적어도 약 20μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 공동 자극 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 3 내지 약 10μg/mL일 수 있다. 본 발명에서, 상기 OX-40 mAb의 농도는 약 5-10μg/mL일 수 있다, 예를 들어, 적어도 약 3μg/mL, 적어도 약 5μg/mL 또는 적어도 약 10μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 공동 자극 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어. 상기 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 10μg/mL일 수 있다. (예를 들어, 약 2 내지 약 10μg/mL, 약 3 내지 약 10μg/mL, 약 3 내지 약 5μg/mL, 약 4 내지 약 10μg/mL, 약 5 내지 약 10μg/mL, 약 6 내지 약 10μg/mL, 약 7 내지 약 10μg/mL 또는 약 8 내지 약 10μg/mL일 수 있다). 본 발명에서, 상기 CD28 mAb의 농도는 약 3-10μg/mL일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 3μg/mL, 적어도 약 5μg/mL 또는 적어도 약 10μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 공동 자극 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 5 내지 약 10μg/mL일 수 있다. 본 발명에서, 상기 CD40 mAb의 농도는 약 6-10μg/mL 또는 약 5-8μg/mL일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 5μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 혈청 배지는 혈청을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 혈청은 인간 AB 혈청을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 혈청의 농도는 약 1 내지 약 10%（v/v）일 수 있다(예를 들어, 약 1.5 내지 약 10%, 약 2 내지 약 10%, 약 3 내지 약 10%, 약 4 내지 약 10%, 약 5 내지 약 10%, 약 1 내지 약 9%, 약 1 내지 약 8%, 약 1 내지 약 7% 또는 약 1 내지 약 6%일 수 있다).
예를 들어, 상기 혈청 배지는 AIM-V 배지를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 무혈청 배지는 X-VIVO 배지 또는 CTSTMOpTmizerTM 배지를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 세포 배양 성분은 항생제를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 세포 배양 성분은 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS의 농도는 약 1 내지 약 200 U/mL일 수 있다(예를 들어, 약 1 내지 약 5 U/mL, 약 1 내지 약 10 U/mL, 약 1 내지 약 20 U/mL, 약 1 내지 약 30 U/mL, 약 1 내지 약 40 U/mL, 약 1 내지 약 50 U/mL, 약 1 내지 약 60 U/mL, 약 1 내지 약 70 U/mL, 약 1 내지 약 80 U/mL, 약 1 내지 약 90 U/mL, 약 1 내지 약 100 U/mL, 약 1 내지 약 120 U/mL, 약 1 내지 약 140 U/mL, 약 1 내지 약 160 U/mL, 약 1 내지 약 180 U/mL 또는 약 1 내지 약 200 U/mL일 수 있다). 예를 들어, 상기 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS의 농도는 약 100 U/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 종자세포 배지는 M2형 대식 세포 억제제를 더 포함할 수 있으며, 상기 M2형 대식 세포 억제제는 RRx001 및/또는 CNI-1493을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 M2형 대식 세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM일 수 있다(예를 들어, 약 0.5 내지 약 100μM, 약 1 내지 약 100μM, 약 2 내지 약 100μM, 약 2.5 내지 약 100μM, 약 3 내지 약 100μM, 약 2 내지 약 3μM, 약 5 내지 약 100μM, 약 10 내지 약 100μM, 약 20 내지 약 100μM, 약 0.1 내지 약 90μM, 약 0.5 내지 약 90μM, 약 1 내지 약 90μM, 약 5 내지 약 90μM, 약 0.1 내지 약 80μM일 수 있다).
예를 들어, 상기 종자세포 배지는 조절 T 세포(Treg) 억제제를 더 포함할 수 있으며, 상기 조절 T 세포 억제제는 CAL-101, 다사티닙(dasatinib), 이매티닙(imatinib) 및/또는 파노비노스탓(Panobinostat)을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 조절 T 세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM일 수 있다(예를 들어, 약 0.5 내지 약 100μM, 약 1 내지 약 100μM, 약 5 내지 약 100μM, 약 10 내지 약 100μM, 약 20 내지 약 100μM, 약 0.1 내지 약 90μM, 약 0.5 내지 약 90μM, 약 1 내지 약 90μM, 약 5 내지 약 90μM, 약 0.1 내지 약 80μM일 수 있다). 예를 들어, 상기 조절 T 세포 억제제의 농도는 약 1 내지 약 5Μm, 약 1 내지 약 3μM일 수 있고, 약 1.5 내지 약 5μM일 수 있고, 약 2 내지 약 5μM일 수 있고, 약 2.5 내지 약 5μM일 수 있고 또는 약 3 내지 약 5μM일 수 있다.
예를 들어, 상기 종자세포 배지는 골수 유래 억제 세포 억제제를 더 포함할 수 있으며, 상기 골수 유래 억제세포 억제제는 AG490, 데시타빈(decitabine), 수니티닙 및/또는 BBI608을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 골수 유래 억제세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μg/mL일 수 있다(예를 들어, 약 0.5 내지 약 100μg/mL, 약 1 내지 약 100μg/mL, 약 2 내지 약 100μg/mL, 약 5 내지 약 100μg/mL, 약 6 내지 약 100μg/mL, 약 7 내지 약 100μg/mL, 약 8 내지 약 100μg/mL, 약 9 내지 약 100μg/mL, 약 10 내지 약 100μg/mL, 약 20 내지 약 100μg/mL, 약 10 내지 약 90μg/mL, 약 10 내지 약 80μg/mL, 약 10 내지 약 70μg/mL 또는 약 10 내지 약 50μg/mL일 수 있다). 예를 들어, 상기 골수 유래 억제세포 억제제의 농도는 약 1 내지 약 3μg/mL일 수 있고, 또는 약 1.5 내지 약 3μg/mL일 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자세포 배지는 상기 조절 T 세포(Treg) 억제제, 상기 골수 유래 억제세포 억제제 및 상기 M2형 대식 세포 억제제 중 적어도 1개, 적어도 2개 및 적어도 3개를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자세포 배지는 T 세포 활성제를 더 포함할 수 있으며, 상기 T 세포 활성제는 LYC-55716, GNE-1858 및/또는 메틸렌블루를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 T 세포 활성제의 농도는 약 1 내지 약 10μM일 수 있다. 예를 들어, 약 1 내지 약 9μM, 약 1 내지 약 8μM, 약 1 내지 약 7μM, 약 1 내지 약 6μM, 약 2 내지 약 10μM, 약 3 내지 약 10μM, 약 4 내지 약 10μM 또는 약 5 내지 약 10μM일 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자세포 배지는 T 세포 분화 억제제를 더 포함할 수 있으며, 상기 T 세포 분화 억제제는 TWS119를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 T 세포 분화 억제제의 농도는 약 1 내지 약 10μM일 수 있다. 예를 들어, 약 1 내지 약 9μM, 약 1 내지 약 8μM, 약 1 내지 약 7μM, 약 1 내지 약 6μM, 약 2 내지 약 10μM, 약 3 내지 약 10μM, 약 4 내지 약 10μM 또는 약 5 내지 약 10μM일 수 있다.
본 발명에서, 상기 RRX-001의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 3μM일 수 있다.
본 발명에서, 상기 Sunitinib의 농도는 약 1.5 내지 약 3μM일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 1.5μM 또는 적어도 약 3μM일 수 있다.
본 발명에서, 상기 CNI-1493의 농도는 약 2 내지 약 3μM일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 2μM, 적어도 약 2.5μM 또는 적어도 약 3μM일 수 있다.
본 발명에서, 상기 Imatinib의 농도는 약 2 내지 약 5μM일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 2μM 또는 적어도 약 5μM일 수 있다.
본 발명에서, 상기 CAL -101의 농도는 약 1.5 내지 약 5μM일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 1.5μM 또는 적어도 약 5μM일 수 있다.
본 발명에서, 상기 Dasatinib의 농도는 약 2 내지 약 3μM일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 2μM, 적어도 약 2.5μM 또는 적어도 약 3μM일 수 있다.
본 발명에서, 상기 LYC -55716의 농도는 약 1 내지 약 10μM일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 1μM 또는 적어도 약 10μM일 수 있다.
본 발명에서, 상기 GNE-1858의 농도는 약 4 내지 약 5nM일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 4nM, 적어도 약 4.5nM 또는 적어도 약 5nM일 수 있다.
본 발명에서, 상기 메틸렌블루의 농도는 약 1 내지 약 2μM일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 1μM, 적어도 약 1.5μM 또는 적어도 약 2μM일 수 있다.
본 발명에서, 상기 TWS119의 농도는 약 1 내지 약 10μM일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 1μM, 적어도 약 5μM 또는 적어도 약 10μM일 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자세포 배지는 IL-2, IL-7, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 3000 U/mL IL-2, 적어도 약 1000 U/mL IL-7, 적어도 약 100μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10 pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-9, IL-15, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 2000 U/mL IL-2, 적어도 약 500 U/mL IL-9, 적어도 약 500 U/mL IL-15, 적어도 약 50μg/mL CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 50μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3% 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-7, G-CSF, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 2000 U/mL IL-2, 적어도 약 500 U/mL IL-7, 적어도 약 1000 U/mLG-CSF, 적어도 약 36μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 20 pg/mL TNFα, 적어도 약 3% 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-12, IL-21, GM-CSF, LAG3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 3000 U/mL IL-2, 적어도 약 200 U/mL IL-12, 적어도 약 500 U/mL IL-21, 적어도 약 800 U/mL GM-CSF, 적어도 약 10μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10μg/mL CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-21, IFN-γ, TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 500 U/mL IL-1β, 적어도 약 2500 U/mL IL-2, 적어도 약 200 U/mL IL-6, 적어도 약 200 U/mL IL-21, 적어도 약 1000 U/mL IFN-γ, 적어도 약 20μg/mL TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 50μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 25 pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-1α, IL-2, IL-9, IL-18, IFN-α, IFN-β, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 500 U/mL IL-1α, 적어도 약 2000 U/mL IL-2, 적어도 약 500 U/mL IL-9, 적어도 약 200 U/mL IL-18, 적어도 약 500 U/mL IFN-α, 적어도 약 500 U/mL IFN-β, 적어도 약 5μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 25μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 25 pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-4, IL-10, IL-21, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 3000 U/mL IL-2, 적어도 약 200 U/mL IL-4, 적어도 약 200 U/mL IL-10, 적어도 약 250 U/mL IL-21, 적어도 약 10μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 20μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10 pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 1 00U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-6, IL-12, IL-21, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 3000 U/mL IL-2, 적어도 약 500 U/mL IL-6, 적어도 약 500 U/mL IL-12, 적어도 약 200 U/mL IL-21, 적어도 약 20μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10 pg/mL TNFα, 적어도 약 3% 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-1β, IL-2, IL-7, IL-21, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 200 U/mL IL-1β, 적어도 약 3000 U/mL IL-2, 적어도 약 200 U/mL IL-7, 적어도 약 200 U/mL IL-21, 적어도 약 500 U/mL G-CSF, 적어도 약 500 U/mL GM-CSF, 적어도 약 1000 U/mL IFN-γ, 적어도 약 5μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 15 pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, M-CSF, IFN-β, IFN-γ, TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 2500 U/mL IL-2, 적어도 약 500 U/mL IL-4, 적어도 약 500 U/mL IL-12, 적어도 약 500 U/mL GM-CSF, 적어도 약 300 U/mL M-CSF, 적어도 약 200 U/mL IFN-β, 적어도 약 800 U/mL IFN-γ, 적어도 약 5μg/mL TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10μg/mL CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-7, IL-15, IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 3000 U/mL IL-2, 적어도 약 200 U/mL IL-7, 적어도 약 200 U/mL IL-15, 적어도 약 800 U/mL GM-CSF, 적어도 약 10μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 20μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 20pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-4, IL-10, IL-10, G-CSF, M-CSF, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 2500 U/mL IL-2, 적어도 약 500 U/mL IL-4, 적어도 약 500 U/mL IL-10, 적어도 약 250 U/mL IL-10, 적어도 약 500 U/mL G-CSF, 적어도 약 300 U/mLM-CSF, 적어도 약 5μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10μg/mL OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-7, IL-21, IFN-α, IFN-γ, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 3000 U/mL IL-2, 적어도 약 200 U/mL IL-7, 적어도 약 500 U/mL IL-21, 적어도 약 500 U/mL IFN-α, 적어도 약 800 U/mL IFN-γ, 적어도 약 5μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10 pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-7, IL-15, IFN-β, IFN-γ, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 3000 U/mL IL-2, 적어도 약 500 U/mL IL-7, 적어도 약 500 U/mL IL-15, 적어도 약 250 U/mL IFN-β, 적어도 약 1000 U/mL IFN-γ, 적어도 약 5μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 15μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, IFN-γ, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 3000 U/mL IL-2, 적어도 약 200 U/mL IL-7, 적어도 약 200 U/mL IL-15, 적어도 약 500 U/mL GM-CSF, 적어도 약 1000 U/mL IFN-γ, 적어도 약 3μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10 pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-7, IL-12, G-CSF, GM-CSF, IFN-α, IFN-γ, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 3000 U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-7, 적어도 약 300U/mL IL-12, 적어도 약 300U/mL G-CSF, 적어도 약 200U/mL GM-CSF, 적어도 약 500 U/mL IFN-α, 적어도 약 500 U/mL IFN-γ, 적어도 약 3μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 2.5μg/mL TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10 pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-7, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, RRx-001, CAL-101, 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 3000 U/mL IL-2, 적어도 약 1000 U/mL IL-7, 적어도 약 50μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μM RRx-001, 적어도 약 1.5μM CAL-101, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-10, IL-18, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, Sunitinib, Imatinib, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 2500 U/mL IL-2, 적어도 약 200 U/mL IL-10, 적어도 약 200 U/mLIL-18, 적어도 약 10μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μM Sunitinib, 적어도 약 5μM Imatinib, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-1β, IL-6, GM-CSF, M-CSF, CNI-1493, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 3000 U/mL IL-2, 적어도 약 200 U/mL IL-1β, 적어도 약 500 U/mL IL-6, 적어도 약 500 U/mL GM-CSF, 적어도 약 500 U/mL M-CSF, 적어도 약 5μM CNI-1493, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-9, IL-10, IL-21, GM-CSF, OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, Sunitinib, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 2000 U/mL IL-2, 적어도 약 200 U/mL IL-9, 적어도 약 200 U/mL IL-10, 적어도 약 500 U/mL IL-21, 적어도 약 500 U/mL GM-CSF, 적어도 약 5μg/mL OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 36μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 1.5μM Sunitinib, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-6, IL-12, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, Imatinib, 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 2500 U/mL IL-2, 적어도 약 500 U/mL IL-6, 적어도 약 1000 U/mL IL-12, 적어도 약 10μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 15 pg/mL TNFα, 적어도 약 5μM Imatinib, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-7, IL-15, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, Dasatinib, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 3000 U/mL IL-2 ,적어도 약 200 U/mL IL-7, 적어도 약 300 U/mL IL-15, 적어도 약 12μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μM Dasatinib, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-6, IL-12, G-CSF, M-CSF, IFN-β, IFN-γ, CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, Dasatinib, LYC-55716, GNE-1858, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 3000 U/mL IL-2, 적어도 약 500 U/mL IL-6, 적어도 약 500 U/mL IL-12, 적어도 약 1000 U/mL G-CSF, 적어도 약 500 U/mL M-CSF, 적어도 약 500 U/mL IFN-β, 적어도 약 800 U/mL IFN-γ, 적어도 약 3μg/mL CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 2.5μM Dasatinib, 적어도 약 10μM LYC-55716, 적어도 약 4.5nM GNE-1858, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-1α, IL-9, GM-CSF, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CNI-1493, 메틸렌블루, TWS119, 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 적어도 약 2500 U/mL IL-2, 적어도 약 500 U/mL IL-1α, 적어도 약 500 U/mL IL-9, 적어도 약 800 U/mL GM-CSF, 적어도 약 3μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 2.5μg/mL TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 2.5μM CNI-1493, 적어도 약 1μM 메틸렌블루, 적어도 약 5μM TWS119, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종자 배지는 IL-2, IL-1α, IL-12, IL-21, G-CSF, M-CSF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CNI-1493, Dasatinib, GNE-1858, 메틸렌블루, 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 종자 배지는 약 3000 U/mL IL-2, 약 200 U/mL IL-1α, 약 500 U/mL IL-12, 약 500 U/mL IL-21, 약 300 U/mL G-CSF, 약 800 U/mL M-CSF, 약 500U/mL IFN-α, 약 300 U/mL IFN-β, 약 300 U/mL IFN-γ, 약 3μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 약 5μg/mL CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 약 5μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 약 3μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 약 3μM CNI-1493, 약 2μM Dasatinib, 약 5nM GNE-1858, 약 1.5μM 메틸렌블루, 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 종자세포 배지 배양으로 수득된 종양 침윤 림프구의 종자세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 종양 침윤 림프구의 종자세포 또는 이의 세포 집단 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 치료용 약제의 제조에 있어서 상기 종양 침윤 림프구의 종자세포 또는 이의 세포 집단 및 본 발명의 상기 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 상기 종자 배지는 상이한 유형의 암으로부터 유래된 종양 침윤 림프구의 증식에 적용될 수 있다. 본 발명의 상기 종자 배지는 암 유형에 대해 광범위성 및 보편성을 갖는다. 특정 경우에서, 상기 종자 배지는 상이한 유형의 암으로부터 유래된 종양 침윤 림프구의 배양에 적용될 수 있고, 상이한 유형의 암으로부터 유래된 종양 침윤 림프구의 종자세포 또는 이의 세포 집단을 수득하는 데 적용될 수도 있다. 특정 경우에서, 본 발명의 상기 종자 배지 및/또는 본 발명의 상기 약학적 조성물은 암 치료용 약제의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 암은 자궁경부암(예를 들어, 재발성 자궁경부암을 포함할 수 있다), 난소암, 골반강 저분화선암, 대장암(예를 들어, 간 전이와 같이 전이가 발생한 대장암을 포함할 수 있다), 위암, 흑색종, 유방암 및/또는 자궁내막 기질육종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 암은 흑색종, 신경교종, 위암, 폐암, 위장관 기질종양, 대장암, 간암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 자궁내막 기질육종, 골반강 저분화선암 및 담관암으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 증폭에 있어서 상기 종자세포 배지의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 종자세포 배지에서 단리된 종양 침윤 림프구를 배양하는 단계를 포함하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배양 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 종자세포 배지에서 단리된 종양 침윤 림프구를 배양하여, 상기 종양 침윤 림프구의 종자세포를 수득하는 단계를 포함하는 종양 침윤 림프구의 증폭 방법을 제공한다.
예를 들어, 상기 단리된 종양 침윤 림프구는 필요로 하는 대상체의 복수, 외과적으로 절제된 원발부위 검체, 동시성 및 비동시성 외과적으로 절제된 전이부위 검체, 천자 검체 및 체액으로 구성된 군에서 선택된 검체에서 유래될 수 있다.
예를 들어, 상기 체액은 혈액, 조직액, 림프액 및/또는 체강액을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 체액은 복수(예를 들어 위암 환자의 복수, 또는 유방암 환자의 복수일 수 있다) 및/또는 흉수(예를 들어 자궁내막 기질육종 환자의 흉수일수 있다)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 종양 침윤 림프구는 흑색종, 신경교종, 위암, 폐암, 위장관 기질종양, 대장암, 간암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 자궁내막 기질육종, 골반강 저분화선암 및 담관암으로 구성된 군에서 선택되는 종양에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 상기 단리된 종양 침윤 림프구는 자궁경부암(예를 들어, 재발된 자궁경부암을 포함할 수 있다), 난소암, 골반강 저분화선암, 대장암(예를 들어, 간 전이와 같이 전이가 발생한 대장암을 포함할 수 있다), 위암, 흑색종, 유방암 및/또는 자궁내막 기질육종으로 구성된 군에서 선택되는 종양 조직에서 유래될 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 종양 침윤 림프구는 종양 조직이 절제된 조직괴에서 나올 수 있고, 상기 종양 조직이 절제된 조직괴의 직경은 약 1mm 내지 약 10mm이며, 예를 들어, 약 2mm 내지 약 10mm, 약 3mm 내지 약 10mm, 약 4mm 내지 약 10mm, 약 5mm 내지 약 10mm, 약 6mm 내지 약 10mm, 약 7mm 내지 약 10mm 또는 약 8mm 내지 약 10mm일 수 있다.
예를 들어, 상기 배양 시간은 약 3 내지 약 20일일 수 있다. 예를 들어, 상기 배양 시간은 약 3 내지 약 15일일 수 있으며, 예를 들어, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일 또는 약 20일일 수 있다.
예를 들어, 상기 배양 온도는 약 30 내지 약 42℃일 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 30℃, 적어도 약 31℃, 적어도 약 32℃, 적어도 약 33℃, 적어도 약 34℃, 적어도 약 35℃, 적어도 약 36℃, 적어도 약 37℃, 적어도 약 38℃, 적어도 약 39℃, 적어도 약 40℃, 적어도 약 41℃ 또는 적어도 약 42℃일 수 있다.
예를 들어, 상기 배양 CO2 농도는 약 1% 내지 약 10%이며, 예를 들어, 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9% 또는 적어도 약 10%일 수 있다.
발명에서, 본 발명의 상기 종자 배지 사용은 종양 침윤 림프구의 종자세포 세포 활성을 뚜렷하게 증가시킬 수 있다(예를 들어, 종양 침윤 림프구의 종자세포의 수를 적어도 약 108 자릿수까지 증가시킬 수 있는 것처럼 종양 침윤 림프구의 종자세포 총 세포 수를 뚜렷하게 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 종양 침윤 림프구의 종자세포의 세포 생존율을 적어도 약 85%에 달할 수 있게 하는 것처럼 종양 침윤 림프구의 종자세포 세포 생존율을 뚜렷하게 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 종양 침윤 림프구의 종자세포에서 사이토카인(예를 들어 IFN-γ의 수량) 분비를 뚜렷하게 증가시킬 수 있다. 본 발명에서, 본 발명의 상기 종자 배지의 사용은 종양 침윤 림프구의 종자세포에서 CD3+ 세포의 비율을 뚜렷하게 증가시킬 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 상기 종자 배지 사용은 종양 침윤 림프구의 종자세포를 공여자 대상체(예를 들어 종양 환자)에게 재주입하면 부분적 재주입 제품 TIL의 TCR 클론 빈도가 공여자 대상체 말초혈액에서 뚜렷하게 크게 증가될 수 있으며, 공여자 대상체 말초혈액의 TCR 레퍼토리와 TIL 재주입 제품의 TCR 레퍼토리의 유사도도 뚜렷하게 높아지고, 장시간 변하지 않고 유지될 수 있다. 또한, 공여자 대상체는 본 발명의 상기 종자 배지에 의해 배양된 TIL 세포의 자가 재주입 후, 체내 림프구가 더 활발하게 증식할 수 있다.
어떤 이론에도 제한되지 않는 하기의 실시 예는 본 발명의 융합 단백질, 제조 방법 및 용도 등의 설명을 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시 예
실시 예 1. TIL 종자세포 배지
하기의 성분(카탈로그 번호)을 사용해 TIL 종자세포 배지를 제조한다.
표 1 내지 표 3에 따라 상이한 TIL 종자세포 배지를 제조한다. 기본 배지는 비율에 따라 혈청 및 이중 항체를 첨가한 후 4℃에서 1개월 이내 보관할 수 있다. 사용 전 배지를 먼저 4℃에서 꺼내 37℃ 항온 수조에 넣고 예열한 후, 사용 전 다른 성분(각 인터루킨, 집락자극인자, 인터페론, TNF-α, 각 항체 및 기타 분자)을 작용 농도까지 첨가한 후 TIL 세포 배양에 사용한다. 또한, 비교를 위해, CN110099998A 명세서 실시 예 5에 개시된 배합 및 방법에 따라 6000IU/mL의 IL-2, Glutamax 및 항생제가 함유된 CM1 배지(이하 CM1이라 한다)를 제조해 종양 유래 검체의 TIL 세포(본 명세서의 종자세포에 해당된다) Pre-REP 배양에 사용한다.
| 배지 번호 농도/성분 |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| IL-1α (U/mL) | - | - | - | - | - | 500 | - | - | - |
| IL-1β (U/mL) | - | - | - | - | 500 | - | - | - | 200 |
| IL-2 (U/mL) | 3000 | 2000 | 2000 | 3000 | 2500 | 2000 | 3000 | 2000 | 3000 |
| IL-4 (U/mL) | - | - | - | - | - | - | 200 | - | - |
| IL-6 (U/mL) | - | - | - | - | 200 | - | - | 500 | - |
| IL-7 (U/mL) | 1000 | - | 500 | - | - | - | - | - | 200 |
| IL-9 (U/mL) | - | 500 | - | - | - | 500 | - | - | - |
| IL-10 (U/mL) | - | - | - | - | - | - | 200 | - | - |
| IL-12 (U/mL) | - | - | - | 200 | - | - | - | 500 | - |
| IL-15 (U/mL) | - | 500 | - | - | - | - | - | - | - |
| IL-18 (U/mL) | - | - | - | - | - | 200 | - | - | - |
| IL-21 (U/mL) | - | - | - | 500 | 200 | - | 250 | 200 | - |
| G-CSF (U/mL) | - | - | 1000 | - | - | - | - | - | 500 |
| GM-CSF (U/mL) | - | - | - | 800 | - | - | - | - | 500 |
| M-CSF (U/mL) | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| IFN-α (U/mL) | - | - | - | - | - | 500 | - | - | - |
| IFN-β (U/mL) | - | - | - | - | - | 500 | - | - | - |
| IFN-γ (U/mL) | - | - | - | - | 1000 | - | - | - | 1000 |
| CD137 mAb(μg/mL) | - | - | - | - | - | - | 10 | 20 | - |
| CD28 mAb (μg/mL) |
- | - | - | - | - | - | - | 10 | - |
| CD40 mAb (μg/mL) |
- | - | - | - | - | - | - | - | - |
| OX-40 mAb(μg/mL) | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| LAG-3 mAb(μg/mL) | - | - | - | 10 | - | 5 | 3 | - | 5 |
| TIGIT mAb(μg/mL) | - | - | - | - | 20 | - | - | - | - |
| CTLA-4 mAb(μg/mL) | - | 50 | - | 10 | - | - | - | - | - |
| PD-1 mAb (μg/mL) |
100 | 50 | 36 | - | 50 | 25 | 20 | 10 | 3 |
| TNF-α (pg/mL) | 10 | - | 20 | - | 25 | - | 10 | - | 15 |
| RRx-001(μM) | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Sunitinib(μM) | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| CNI-1493(μM) | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Imatinib(μM) | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| CAL-101(μM) | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Dasatinib(μM) | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| LYC-55716 (μM) |
- | - | - | - | - | - | - | - | - |
| GNE-1858(nM) | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 메틸렌블루（μM） | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| TWS119 (μM) |
- | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AB인간 AB 혈청 (v/v%) | 5% | 3% | 3% | 5% | 5% | 5% | 5% | 3% | 5% |
| 100≠PS 이중 항체（10000U/mL） | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 |
| AIM-V | - | 최종 부피까지 보충 | 최종 부피까지 보충 | - | - | - | - | - | - |
| X-VIVO 15 | 최종 부피까지 보충 | - | - | - | 최종 부피까지 보충 | 최종부피까지 보충 | 최종 부피까지 보충 | - | - |
| CTSTMOpTmzerTM | - | - | - | 최종 부피까지 보충 | - | - | - | 최종 부피까지 보충 | 최종 부피까지 보충 |
| 배지 번호 농도/성분 |
10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 |
| IL-1α (U/mL) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| IL-1β (U/mL) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| IL-2 (U/mL) | 2500 | 3000 | 2500 | 3000 | 3000 | 3000 | 3000 | 3000 |
| IL-4 (U/mL) | 500 | - | 500 | - | - | - | - | - |
| IL-6 (U/mL) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| IL-7 (U/mL) | - | 200 | - | 200 | 500 | 200 | 200 | 1000 |
| IL-9 (U/mL) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| IL-10 (U/mL) | - | - | 500 | - | - | - | - | - |
| IL-12 (U/mL) | 500 | - | - | - | - | - | 300 | - |
| IL-15 (U/mL) | - | 200 | 250 | - | 500 | 200 | - | - |
| IL-18 (U/mL) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| IL-21 (U/mL) | - | - | - | 500 | - | - | - | - |
| G-CSF (U/mL) | - | - | 500 | - | - | - | 300 | - |
| GM-CSF (U/mL) | 500 | 800 | - | - | - | 500 | 200 | - |
| M-CSF (U/mL) | 300 | - | 300 | - | - | - | - | - |
| IFN-α (U/mL) | - | - | - | 500 | - | - | 500 | - |
| IFN-β (U/mL) | 200 | - | - | - | 250 | - | - | - |
| IFN-γ (U/mL) | 800 | - | - | 800 | 1000 | 1000 | 500 | - |
| CD137 mAb(μg/mL) | - | 10 | - | 5 | 5 | 3 | - | - |
| CD28 mAb(μg/mL) | - | - | 5 | 3 | - | 3 | 3 | - |
| CD40 mAb(μg/mL) | - | - | - | - | 5 | - | 5 | - |
| OX-40 mAb(μg/mL) | - | - | 10 | 5 | 5 | - | - | - |
| LAG-3 mAb(μg/mL) | - | - | - | 3 | - | - | - | - |
| TIGIT mAb(μg/mL) | 5 | - | - | - | 5 | - | 2.5 | - |
| CTLA-4 mAb(μg/mL) | 10 | - | - | 5 | - | - | - | - |
| PD-1 mAb(μg/mL) | - | 20 | 10 | - | 15 | 3 | 3 | 50 |
| TNF-α (pg/mL) | - | 20 | - | 10 | - | 10 | - | - |
| RRx-001(μM) | - | - | - | - | - | - | - | 3 |
| Sunitinib(μM) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| CNI-1493(μM) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Imatinib(μM) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| CAL-101(μM) | - | - | - | - | - | - | - | 1.5 |
| Dasatinib(μM) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| LYC-55716 (μM) |
- | - | - | - | - | - | - | - |
| GNE-1858(nM) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 메틸렌블루（μM） | - | - | - | - | - | - | - | - |
| TWS119 (μM) |
- | - | - | - | - | - | - | - |
| 인간 AB 혈청 (v/v%) | 5.00% | 5.00% | 5.00% | 5.00% | 5.00% | 5.00% | 5.00% | 5.00% |
| 100≠PS 이중 항체（10000U/mL） | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 |
| AIM-V | - | - | 최종 부피까지 보충 | - | - | - | - | - |
| X-VIVO 15 | 최종 부피까지 보충 | 최종 부피까지 보충 | - | 최종 부피까지 보충 | 최종 부피까지 보충 | - | 최종 부피까지 보충 | - |
| CTSTMOpTmzerTM | - | - | - | - | - | 최종 부피까지 보충 | - | 최종 부피까지 보충 |
| 배지 번호 농도 성분 |
18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 |
| IL-1α (U/mL) | - | - | - | - | - | - | 500 | 200 |
| IL-1β (U/mL) | - | 200 | - | - | - | - | - | - |
| IL-2 (U/mL) | 2500 | 3000 | 2000 | 2500 | 3000 | 3000 | 2500 | 3000 |
| IL-4 (U/mL) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| IL-6 (U/mL) | - | 500 | - | 200 | - | 500 | - | - |
| IL-7 (U/mL) | - | - | - | - | 200 | - | - | - |
| IL-9 (U/mL) | - | - | 200 | - | - | - | 500 | - |
| IL-10 (U/mL) | 200 | - | 200 | - | - | - | - | - |
| IL-12 (U/mL) | - | - | - | 1000 | - | 500 | - | 500 |
| IL-15 (U/mL) | - | - | - | - | 300 | - | - | - |
| IL-18 (U/mL) | 200 | - | - | - | - | - | - | - |
| IL-21 (U/mL) | - | - | 500 | - | - | - | - | 500 |
| G-CSF (U/mL) | - | - | - | - | - | 1000 | - | 300 |
| GM-CSF (U/mL) | - | 500 | 500 | - | - | - | 800 | - |
| M-CSF (U/mL) | - | 500 | - | - | - | 500 | - | 800 |
| IFN-α (U/mL) | - | - | - | - | - | - | - | 500 |
| IFN-β (U/mL) | - | - | - | - | - | 500 | - | 500 |
| IFN-γ (U/mL) | - | - | - | - | - | 800 | - | 300 |
| CD137 mAb(μg/mL) | - | - | - | - | 12 | - | 3 | - |
| CD28 mAb(μg/mL) | - | - | - | 10 | 5 | - | 3 | 3 |
| CD40 mAb(μg/mL) | - | - | - | - | - | - | - | 5 |
| OX-40 mAb(μg/mL) | - | - | 5 | 3 | - | - | - | - |
| LAG-3 mAb(μg/mL) | 10 | - | - | 10 | 5 | - | 5 | 5 |
| TIGIT mAb(μg/mL) | - | - | - | - | - | - | 2.5 | - |
| CTLA-4 mAb (μg/mL) | - | - | - | 5 | - | 3 | - | - |
| PD-1 mAb(μg/mL) | 5 | 5 | 36 | - | 3 | 5 | - | 3 |
| TNF-α (pg/mL) | - | - | - | 15 | - | - | - | - |
| RRx-001(μM) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Sunitinib(μM) | 3 | - | 1.5 | - | - | - | - | - |
| CNI-1493(μM) | - | 5 | - | - | - | - | 2.5 | 3 |
| Imatinib(μM) | 5 | - | - | 5 | - | - | - | - |
| CAL-101(μM) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Dasatinib(μM) | - | - | - | - | 3 | 2.5 | - | 2 |
| LYC-55716 (μM) |
- | - | - | - | - | 10 | - | - |
| GNE-1858(nM) | - | - | - | - | - | 4.5 | - | 5 |
| 메틸렌블루(μM) | - | - | - | - | - | - | 1 | 1.5 |
| TWS119(μM) | - | - | - | - | - | - | 5 | - |
| 인간 AB 혈청 (v/v%) | 5.00% | 5.00% | 5.00% | 5.00% | 5.00% | 5.00% | 5.00% | 5.00% |
| 100≠PS 이중 항체（10000U/mL） | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 | 1/100 |
| AIM-V | - | - | - | - | - | - | 최종 부피까지 보충 | 최종 부피까지 보충 |
| X-VIVO 15 | 최종 부피까지 보충 | 최종 부피까지 보충 | 최종 부피까지 보충 | - | 최종 부피까지 보충 | 최종 부피까지 보충 | - | - |
| CTSTM OpTmizerTM |
- | - | - | 최종 부피까지 보충 | - | - | - | - |
실시 예 2. 고형 종양 검체(외과적으로 절제된 조직) 처리 및 TIL 종자세포 배양
1) 최종 농도 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 50μg/mL 젠타마이신을 함유하는 생리식염수를 제조한다.
2) 클래스2 생물 안전 캐비닛의 멸균 환경에서 수득한 갓 단리된 종양 조직 검체를 단계 1)에서 제조된 30mL의 생리식염수가 첨가된 10cm 패트리 접시에 놓고 세척한 후, 다시 단계 1)에서 제조된 30mL의 생리식염수가 첨가된 10cm 패트리 접시로 옮겨 세척하며, 총 3회 반복 세척한다.
3) 멸균 메스로 지방 조직과 괴사 조직을 제거하고 종양 조직을 직경 3×3×3 mm3의 작은 조각으로 절단한 후, 각 G-REX10 배양 탱크(Wilsonwolf에서 구매)에 무작위로 선택된 종양 조직괴 12개를 넣고, 각 G-REX10 배양 탱크는 실시 예 1에 의해 제조된 TIL 종자 배지에 해당된다. 남은 종양 조직괴는 CryoStor10(BioLifeSolutions에서 구매) 동결보존액으로 초저온 냉동고를 통해 액체 질소로 동결보존한다.
4) 실시 예 1에 의해 제조된 각 TIL 종자세포 배지를 각각 상이한 G-REX10 배양 탱크에 각각 40mL씩 첨가하고 종양 조직괴를 37℃ 5%CO2에서 배양한다. 12일째에 TIL 종자세포를 수득한 후 총 세포 수와 생존율을 계수하고, 유세포 분석기로 세포의 표현형을 검출하며, HTRF IFN-γ 키트(Cisbio Human IFN gamma kit 카탈로그 번호：62HIFNGPET)로 지침에 설명된 방법에 따라 IFN-γ 분비 수준을 검출한다.
실시 예 3. 종양 환자 체강액(복수, 흉수) 처리 및 TIL 종자세포 배양
종양 환자 유래의 체강액(복수 T012, T013 및 흉수 T014) 300g을 8분 동안 원심분리해서 상층액을 버린 후, 세포 펠릿은 D-PBS로 3회 세척하고 매번 300g을 8분 동안 원심분리하며, 마지막으로 세포를 TIL 종자 배지로 재현탁한 후 37℃ 5%CO2에서 배양한다. 12일째 TIL 종자세포를 수득한 후 총 세포 수 및 생존율을 계수하고, 유세포 분석기로 세포의 표현형을 검출하며, HTRF IFN-γ 키트(Cisbio Human IFN gamma kit 카탈로그 번호：62HIFNGPET)로 지침에 설명된 방법에 따라 IFN-γ 분비 수준을 검출한다.
하기 각 그룹의 복수 또는 흉수 TIL 종자세포는 모두 6mL 체강액에서 유래된다.
실시 예 3에 의해 처리된 각 종양 조직(체강액) 정보는 표 4와 같다.
| 검체 번호 | 종양 유형 |
| T001 | 자궁경부암 |
| T002 | 난소암 |
| T003 | 골반강 저분화선암 |
| T004 | 자궁경부암(재발) |
| T005 | 대장암 간 전이 |
| T006 | 위암 |
| T007 | 위암 |
| T008 | 위암 |
| T009 | 대장암(천자) |
| T010 | 자궁경부암(천자) |
| T011 | 흑색종(천자) |
| T012 | 위암(복수) |
| T013 | 유방암(복수) |
| T014 | 자궁내막 기질육종(흉수) |
| T015 | 자궁경부암(재발) |
| T016 | 자궁경부암 |
실시 예 2 및 실시 예 4에서 처리된 각 종양 조직 및 체강액을 표 5에 따라 준비된 각 배지에서 배양하며, “+”는 해당 번호의 배지를 사용하였음을 나타내고, “-”는 해당 배지를 사용하지 않았음을 나타낸다. 종양 조직 T003, T005 및 T007은 대조 그룹으로 CM1 배지를 설정한다.
배양 결과는 표 6 내지 표 17 및 도 1 내지 도 15와 같다. 여기서, 표 6 내지 표 17은 각각 표 5의 T001, T002, T003, T004, T005, T006, T007, T008, T015, T012, T013 및 T014 TIL 종자세포 배양 결과이다. 도 1 내지 도 12는 각각 본 발명의 종자세포 배지를 사용해 TIL 종자세포가 배양된 T001, T002, T003, T004, T005, T006, T007, T008, T015, T012, T013 및 T014의 대표적 유세포 분석 결과이며, 도 13, 14 및 15는 각각 CMI 배지로 배양된 T002, T003 및 T007의 유세포 분석 결과이다.
T016은 15번 배지를 사용해 배양되어 총 세포 수는 1.13×108이고, 세포 생존율은 95.01%이며, 상청액에서 분비되는 IFN-γ 농도는 8446.32 pg/mL이고, CD3+ 세포 비율은 92.64%이다.
표 6 내지 표 14 및 T016의 결과에 의하면, 본 발명의 각 그룹 종자세포 배지를 사용해 배양된 고형 종양 조직은 12일째 수득 시 모두 적어도 108 정도의 총 세포 수에 달할 수 있으며, T003, T005 및 T006과 같은 일부 종양 검체는 총 세포 수가 6×108에 근접하고 7×108을 초과하는 세포를 수득할 수 있다. CM1를 사용해 병행 배양된 T003, T005 및 T007의 3개 검체에서 수득된 총 세포 수도 1×108 또는 2×108 이상이지만, 이의 각각 상응하는 다른 그룹의 배지에서 배양된 세포에 비해 총 세포 수는 모두 상대적으로 적다. 본 발명의 각 그룹 종자 배지로 배양해 수득된 TIL 종자세포의 생존율은 모두 85% 이상이고 대부분 90%를 초과하여 상대적으로 높다. CM1를 사용해 병행 배양된 T003, T005 및 T007의 3개 검체에서 수득된 종자세포의 생존율은 이의 각각 상응하는 다른 그룹의 배지에서 배양된 세포의 생존율에 비해 모두 뚜렷하게 더 낮으며, 여기서 T005 및 T007 두 검체의 CM1 종자세포 생존율은 모두 80% 미만이다. 또한, 본 발명의 각 그룹 종자 배지로 배양해 수득된 TIL 종자세포의 IFN-γ 분비량은 모두 상대적으로 높은 수준이다. CM1를 사용해 병행 배양된 T003, T005 및 T007의 3개 검체에서 수득된 TIL 종자세포의 IFN-γ 분비량은 이의 각각 상응하는 다른 그룹에 비해서도 모두 뚜렷하게 더 낮다.
도 1내지 도 9에 의하면, 본 발명의 각 그룹 종자 배지를 사용해 고형 종양 조직으로부터 배양해 수득된 TIL 종자세포의 유세포 분석 표현형은 정상이며, 대부분 검체의 CD3+ 세포 비율이 90% 이상이고, T002 및 T006과 같은 일부 검체의 CD3+ 세포 비율은 99% 정도인 것으로 나타났다. 표 6 내지 표 14의 CD3+ 세포 비율 데이터도 상동한 결과를 나타낸다. 대부분 검체의 CD4+ 및 CD8+ 비율은 1:1에 근접하고, T006 및 T012와 같은 일부 검체의 CD8+ 세포가 대부분의 비율을 차지한다. 여기서, 도 1A 내지 도 9A는 각각 CD3+ 세포의 비율을 나타내고, 도 1B 내지 도 9B는 각각 CD4+ 세포의 비율을 나타낸다. 여기서, 도 1 내지 도 9는 각각 순차적으로 1번 배지를 사용한 T001, 3번 배지를 사용한 T002, 2번 배지를 사용한 T003, 10번 배지를 사용한 T004, 7번 배지를 사용한 T005, 8번 배지를 사용한 T006, 16번 배지를 사용한 T007, 11번 배지를 사용한 T008, 15번 배지를 사용한 T015가 배양된 후 세포 표현형의 유세포 분석도이다.
표 15 내지 표 17의 결과에 의하면, 본 발명의 각 그룹 종자세포 배지를 사용하면 종양 환자의 흉수 및 복수와 같은 체강액으로부터 TIL 종자세포를 성공적으로 배양해 수득할 수 있음을 알 수 있다. 일부 검체는 10mL 이하의 낮은 체강액으로부터도 2×108 이상의 TIL 종자세포를 수득할 수 있다. 또한 각 그룹의 종자 배지에서 체강액으로부터 배양해 수득된 TIL 종자세포의 생존율은 모두 85% 이상, 대부분 90% 이상으로 상대적으로 높으며, 동시에 모든 그룹별 TIL 종자세포의 IFN-γ 분비량도 모두 상대적으로 높은 수준이다.
도 10 내지 도 12에 의하면, 본 발명의 각 그룹 종자 배지를 사용해 종양 환자의 체강액으로부터 배양해 수득된 TIL 종자세포의 유세포 분석 표현형은 정상이며, CD3+ 세포 비율이 모두 80% 이상이고, T012 및 T014 종자세포의 CD3+ 세포 비율은 90%를 초과한다. 표 15 내지 표 17의 CD3+ 세포 비율 데이터도 상동한 결과를 나타낸다. 여기서, 도 10 내지 도 12는 순차적으로 25번 배지를 사용한 T012, 9번 배지를 사용한 T013, 12번 배지를 사용한 T014가 배양된 후 세포 표현형의 유세포 분석도이다.
순차적으로 도 13 내지 도 15에 의하면, CM1 배지를 사용해 T003, T005 및 T007의 3개 고형 종양 조직 검체를 배양해 수득된 TIL 종자세포의 유세포 분석 표현형은 정상이고, CD3+ 세포 비율이 모두 상대적으로 높음을 나타내며, 여기서 T003 및 T007의 CD3+ 세포 비율은 99% 정도이고, 둘의 CD4+ 세포 비율은 이의 각각 상응하는 다른 그룹 배지에서 배양 후 수득된 TIL 종자세포에 비해 뚜렷하게 더 높다.
실시 예 4. 고형 종양 검체(천자 조직) 처리 및 TIL 종자세포 배양
1) 최종 농도 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 50μg/mL 젠타마이신을 함유하는 생리식염수를 제조한다.
2) 클래스2 생물 안전 캐비닛의 멸균 환경에서 가는 바늘(직경 1mm)로 천자하여 수득된 종양 천자 조직 검체를 단계 1)에서 제조된 30mL의생리식염수가 첨가된 10cm 패트리 접시에 놓고 세척한 후, 다시 단계 1)에서 제조된 30mL의 생리식염수가 첨가된 10cm 패트리 접시로 옮겨 세척하며, 총 3회 반복 세척한다.
3) 멸균 메스로 종양 천자 조직을 직경 1×1×3 mm3의 작은 조각으로 절단한 후, 각 G-REX24 배양 플레이트(Wilsonwolf에서 구매)의 웰에 무작위로 선택된 종양 조직괴 3개를 넣는다. 각 G-REX24 배양 플레이트 하나의 웰은 본 발명 실시 예 1에 의해 특별 배합된 TIL 종자 배지에 해당되고, CM1 배지는 대조 그룹으로 사용하여 각 웰에 배지 40mL를 첨가한다.
4) 상기 종양 천자 조직을 37℃ 5%CO2에서 배양하며, 12일째에 TIL 종자세포를 수득한 후 총 세포 수와 생존율을 계수하고, 유세포 분석기로 세포의 표현형을 검출하며, HTRF IFN-γ 키트(Cisbio Human IFN gamma kit 카탈로그 번호：62HIFNGPET)로 지침에 설명된 방법에 따라 IFN-γ 분비 수준을 검출한다.
종양 천자 조직 검체의 그룹별 및 배양 결과에 대한 구체적 정보는 표 18 내지 표 20을 참조한다.
표 18 내지 표 20의 결과에 의하면, 3개 종양 천자 조직 검체 T009, T010 및 T011을 각각 실시 예 1에 개시된 2번, 15번 및 12번 TIL 종자세포 배지로 12일 동안 배양하면 모두 0.3×108 정도의 TIL 종자세포를 수득할 수 있음을 알 수 있다. CM1 배지를 사용해 상기 조직을 병렬 배양하면, 악성 흑색종 천자 조직 검체 T011에서만 대체로 비슷한 수량의 TIL 세포를 수득할 수 있으며, 다른 2개의 천자 조직 검체는 12일 후 현미경으로 관찰한 바 모두 뚜렷한 TIL 세포가 발견되지 않는다. 12번 배지로 배양해 수득된 T011 종양 천자 조직 유래 TIL 종자세포는 CM1 TIL에 비해 생존율 및 IFN-γ 분비량이 모두 더 높고, CD3+ 세포 비율은 둘이 대체적으로 비슷하다.
또한, 2번, 15번 및 12번 TIL 종자세포 배지로 배양된 상기 3개 종양 천자 조직 유래 TIL 세포의 세포 생존율도 모두 86%를 초과하고 최대 95% 이상에 달하며, IFN-γ 분비량 및 CD3+ 세포 비율도 모두 상대적으로 높은 수준이다.
실시 예 5. TIL 임상적 재주입 및 생체 내 TCR 표현형 변화
본 발명의 배양 방법으로 수득된 TIL의 임상적 안전성 및 유효성을 검증하기 위해, 고형 종양에 대한 TIL 재주입 요법 임상시험을 수행한다. 본 임상시험은 상하이시 제10 인민병원 윤리위원회의 승인을 획득하였으며, 구체적 내용은 http://www.chictr.org.cn/, 등록번호 : ChiCTR2100044705를 참조한다. 또는 www.clinicaltrials.gov, 등록번호 : NCT04766320을 참조한다.
연구 방안
1) 저강도 고갈 전처리 : TIL 재주입 6일 전부터 재주입 4일 전까지 3일 연속 환자에게 6mg/kg/일 용량의 시클로포스파미드를 투여하고, 재주입 3일 전부터 재주입 1일 전까지 연속 3일 환자에게 5mg/m2/일의 플루다라빈을 투여한다.
2) 플루다라빈을 투여한 다음날, 환자에게 1010-1011 자가 TIL 세포를 정맥 재주입한다.
3) 재주입 후 환자의 상태를 관찰하고 기록하며, 상이한 시점에 말초혈액을 채취해 PBMC의 조성 및 변화를 측정하고, 재주입 1-3개월 후에 영상으로 효과를 평가한다.
재주입 TIL 세포의 제조
1) 전술한 실시 예 2에 개시된 방법에 따라 환자의 외과적으로 절제된 종약 조직에서 유래된 TIL 종자세포를 제조한다.
2) 증폭 배지의 제조 : 중국 출원 CN110099998A의 실시 예 5에 개시된 배합과 방법에 따라, 사용 당일 AIM-V 배지에 IL-2를 보충하고, 최종 농도를 3000IU/mL에서 1000IU/Ml로 감소시킨다. CN110099998A의 실시 예 6에 개시된 농도에 따라, 1000IU/mL IL-2의 AIM-V 배지에 CD3 항체(OKT3)를 최종 농도 30ng/mL까지 보충하여 TIL 세포 증폭 배양을 위한 증폭 배지로 사용한다.
3) 재주입 제품(Infusion Product, IP)의 제조 : 전술한 외과적으로 절제된 종양 조직의 배양에 의해 수득된 종자세포 1×108을 취하고, G-REX100 배양 탱크에서 단계 2)에서 제조된 1000mL 증폭 배지를 사용해 37℃ 5%CO2 조건에서 12-14일 동안 증폭 배양해 세포를 수득한 후, 원심분리하고 D-PBS로 세척하며, 생리식염수에서 재현탁한다. 품질 관리 검사(CD3+ 비율, CD4+ 및 CD8+ 비율, IFN-γ 분비 수준, 멸균, 내독소, 삼투압 등)를 거쳐 각 지표가 《중화인민공화국 약전》 요구사항 또는 국내외에 출시된 면역세포 요법 제품에 상응하는 일반 표준을 충족하면 통과시켜 재주입 제품을 획득한다.
상기 TIL 재주입 제품의 제조에 관련되는 전과정은 모두 GMP 수준의 생산 작업장에서 관련 법규에 따라 수행된다.
대상체 T015(자궁경부암 재발) 재주입 : 실시 예 2에 의해 수득된 T015 TIL 종자세포를 취해 상기 방법에 따라 증폭 배양한 후, 최종적으로 4×1010 재주입 제품 세포를 수득하여 200mL 생리식염수에서 재현탁하고, 저강도 고갈 전처리된 환자에게 정맥으로 자가 재주입하며, 재주입한 후 약제 IL-2는 투여하지 않는다. 각각 재주입 전, 재주입 후 19일째(D19）, 30일째(D30) 및 47일째(D47) 환자의 말초혈액을 채취한 후 PBMC 조성 및 변화를 측정하고, 동시에 상기 상이한 시점에 PBMC를 분리하여 재주입 제품(IP)와 함께 TCR 레퍼토리(TCR repertoire)에 대한 고처리량 시퀀싱 분석을 수행한다.
결과는 도 16 내지 도 20에 도시된 바와 같다. 도 16에 의하면, 재주입 제품에서 CD3+ 세포의 비율이 90%를 초과하고, CD3+ 세포에서 CD8+ 세포와 CD4+ 세포의 비율이 2:1 이상이다. 도 17에 의하면, 환자의 말초혈액에서 재주입 제품 TIL의 TCR 클론(즉, IP 클론)이 차지하는 빈도는 재주입 후 상승하기 시작하여 D30에서 최대치에 도달하고, D47은 D30보다 감소한다. 도 18에 의하면, 환자의 말초혈액에서 IP 클론 종류의 빈도는 재주입 후 상승하기 시작하여 D30에서 최대치에 도달하고, D47의 빈도는 D30보다 분명한 감소가 보이지 않는다. 도 19에 의하면, 재주입 제품에서 상위 빈도 10개의 TCR 클론(각각 IP-1-IP-10으로 명명된다) 빈도는 재주입 후 대부분이 모두 뚜렷하게 상승하여 대부분 D30에서 최대치에 도달하며. 제2위 및 제9위의 TCR 클론은 빈도가 D30 이후에도 계속 상승한다. 도 20은 재주입 전, D19, D30 및 D47의 말초혈액 T 세포의 TCR 레퍼토리와 IP의 TCR 레퍼토리의 유사도 지수 MOI(Morisita Index) 값을 나타낸다. 재주입 후 시간이 지나면서 말초혈액 T 세포의 TCR 레퍼토리와 재주입 제품의 TCR 레퍼토리의 유사도 지수는 점차 상승하여 D30에 최대치에 도달하고, D47에서도 유의미한 감소는 보이지 않는다.
상기 결과에 의하면, 본 발명의 TIL 종자 배지로 배양해 수득된 TIL 종자세포는 증폭 배양을 거쳐 1010-1011 자릿수 세포에 도달할 수 있고, 저강도 고갈 전처리된 종양 환자에게 자가 재주입된 후 IL-2 약제를 투여하지 않는 조건 하에서 생체 내에서 장시간 뚜렷하게 증식할 수 있다.
실시 예 6. TIL 임상적 재주입 및 생체 내 세포 증식
연구 방안
1) 저강도 고갈 전처리 : TIL 재주입 3일 전부터 재주입 1일 전까지 3일 연속 환자에게 6mg/kg/일 용량의 시클로포스파미드를 투여하고, 플루다라빈은 투여하지 않는다.
2) 시클로포스파미드를 투여한 다음날, 환자에게 1010-1011 자가 TIL 세포를 정맥 재주입한다.
3) 재주입 후 환자의 상태를 관찰하고 기록하며, 상이한 시점에 말초혈액을 채취해 PBMC의 조성 및 변화를 측정하고, 재주입 1-3개월 후에 영상으로 효과를 평가한다.
재주입 TIL 세포의 제조는 실시 예 5와 상동하다.
대상체 T016(자궁경부암 재발) 재주입 : 실시 예 2에 의해 수득된 T016 TIL 종자세포를 취해 실시 예 5의 방법에 따라 증폭 배앙한 후, 최종적으로 5.2×1010 재주입 제품 세포를 수득하여 250mL 생리식염수에서 재현탁하고, 저강도 고갈 전처리된 환자에게 정맥으로 자가 재주입하며, 재주입한 후 약제 IL-2는 투여하지 않는다. 각각 재주입 4일 전, 재주입 3일 전(시클로포스파미드 투여), 재주입 2일 전(시클로포스파미드 투여), 재주입 1일 전(시클로포스파미드 투여), 재주입 후 1일째, 6일째, 8일째, 13일째 및 17일째에 대상체의 말초혈액을 채취해 백혈구, 호중구 및 림프구를 계수한다.
결과는 도 21에 도시된 바와 같다. 도 21에 의하면, 시클로포스파미드 전처리 후 10일 정도에(재주입 후 6일째 내지 8일째) 대상체 말초혈액의 백혈구 및 호중구 수가 모두 최저 수준으로 감소하여 논문 보고와 일치한다(M E Gershwin, E J Goetzl, A D Steinberg Cyclophosphamide: use in practice Ann Intern Med. 1974 Apr;80(4):531-40). 말초혈액의 림프구 수준은 시클로포스파미드 전처리 후부터 재주입 후 1일째까지 최저 수준으로 감소하지만, 재주입 후 1일째부터 지속적으로 상승하기 시작한다. 비록 시클로포스파미드의 약효가 여전히 계속 작용 중인 상태에서 호중구 및 백혈구의 전체 수준이 최저 수준일 때에도 림프구의 수는 여전히 뚜렷하게 증가하고, 재주입 후 13일째 림프구는 기본적으로 시클로포스파미드 전처리 이전의 수준으로 회복된다. 상기 결과에 의하면, 본 발명의 TIL 종자 배지로 배양해 수득된 TIL 종자세포는 증폭 배양을 거쳐 1010-1011 자릿수 세포에 도달할 수 있고, 환자에게 자가 재주입한 후 체내 림프구가 활발하게 지속적으로 증식할 수 있다.
본 명세서에 본 발명의 실시 양태가 상세히 설명되었지만, 본 발명은 상기 실시 양태의 구체적인 내용에 한정되지 않고, 본 발명의 기술적 사상 범위 내에서 본 발명의 기술방안에 대해 여러 가지 간단하게 변형할 수 있으나, 이러한 간단한 변형은 모두 본 발명의 보호 범위에 포함되어야 한다. 또한, 상기 구체적 실시 양태에서 설명된 각각의 구체적 기술적 특징은 모순되지 않는 한 임의의 적절한 방식을 통해 조합될 수 있고, 불필요한 중복을 피하기 위해, 본 발명은 각종 가능한 조합 방식에 대해 별도로 설명하지 않는다. 또한, 본 발명의 상이한 실시 양태 사이도 본 발명의 사상에 위배되지 않는 한 임의로 조합될 수 있으며, 이 역시 본 발명에 개시된 내용으로 간주되어야 한다.
Claims (78)
- 세포 배양 성분, 사이토카인 및 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 성분을 포함하며,
상기 사이토카인은 IL-2를 포함하고,
상기 면역관문은 PD-1, LAG-3, TIGIT 및/또는 CTLA-4를 포함하며, 상기 세포 배양 성분은 혈청 배지 또는 무혈청 배지인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제 1항에 있어서,
상기 IL-2의 농도는 약 3000IU/mL 이하인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-2의 농도는 약 2000IU/mL 내지 약 3000IU/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사이토카인은 IL-7을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제4항에 있어서,
상기 IL-7의 농도는 약 200 내지 약 1000U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사이토카인은 IL-15를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제6항에 있어서,
상기 IL-15의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사이토카인은 종양괴사인자 TNF를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사이토카인은 TNFα를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제9항에 있어서,
상기 TNFα의 농도는 약 10 내지 약 100pg/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사이토카인은 집락자극인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사이토카인은 GM-CSF, G-CSF 및/또는 M-CSF를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제12항에 있어서,
상기 GM-CSF의 농도는 약 200 내지 약 5000U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제12항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 G-CSF의 농도는 약 300 내지 약 1000U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 M-CSF의 농도는 약 300 내지 약 800U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사이토카인은 인터페론을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사이토카인은 IFN-γ, IFN-α 및/또는 IFN-β를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제17항에 있어서,
상기 IFN-γ의 농도는 약 10 내지 약 1000ng/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제17항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IFN-α의 농도는 약 500 내지 약 1000U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IFN-β의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사이토카인은 IL-4, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-18, IL-12, IL-21 및/또는 IL-10을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제21항에 있어서,
상기 IL-4의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제21항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-1α의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-1β의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-6의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-9의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-18의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-12의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-21의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-10의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 33항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 3 내지 약 10μg/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 25μg/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
공동 자극 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 더 포함하며, 여기서 상기 공동 자극 수용체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제39항에 있어서,
상기 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제39항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 10μg/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 5 내지 약 10μg/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 3 내지 약 10μg/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 혈청 배지는 혈청을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제48항에 있어서,
상기 혈청은 인간 AB 혈청을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제48항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 혈청의 농도는 약 1 내지 약 10%(v/v)인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 혈청 배지는 AIM-V 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 무혈청 배지는 X-VIVO 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 배양 성분은 항생제를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 배양 성분은 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제54항에 있어서,
상기 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS의 농도는 약 1 내지 약 200U/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
M2형 대식 세포 억제제를 더 포함하며, 상기 M2형 대식 세포 억제제는 RRx001 및/또는 CNI-1493을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제56항에 있어서,
상기 M2형 대식 세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
조절 T 세포(Treg) 억제제를 더 포함하며, 상기 조절 T 세포 억제제는 CAL-101, 다사티닙(dasatinib), 이매티닙(imatinib) 및/또는 파노비노스탓(Panobinostat)을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제58항에 있어서,
상기 조절 T 세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
골수 유래 억제세포 억제제를 더 포함하며, 상기 골수 유래 억제세포 억제제는 AG490, 데시타빈(decitabine), 수니티닙 및/또는 BBI608을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제60항에 있어서,
상기 골수 유래 억제세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μg/mL인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
T 세포 활성제를 더 포함하며, 상기 T 세포 활성제는 LYC-55716, GNE-1858 및/또는 메틸렌블루를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제62항에 있어서,
상기 T 세포 활성제의 농도는 약 1 내지 약 10μM인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
T 세포 분화 억제제를 더 포함하며, 상기 T 세포 분화 억제제는 TWS119를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제64항에 있어서,
상기 T 세포 분화 억제제의 농도는 약 1 내지 약 10μM인 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포 배지. - 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 상기 종자세포 배지 배양으로 수득된 종양 침윤 림프구의 종자세포 또는 이의 세포 집단.
- 제66항의 상기 종양 침윤 림프구의 종자세포 또는 이의 세포 집단 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
- 암 치료용 약제의 제조에 있어서 제66항의 상기 종양 침윤 림프구의 종자세포 또는 이의 세포 집단 및 제67항의 상기 약학적 조성물의 용도.
- 제68항에 있어서,
상기 암은 흑색종, 신경교종, 위암, 폐암, 위장관 기질종양, 대장암, 간암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 자궁내막 기질육종, 골반강 저분화선암 및 담관암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도. - 종양 침윤 림프구의 증폭에 있어서 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 종자세포 배지의 용도.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 상기 종자세포 배지에서 단리된 종양 침윤 림프구를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 침윤 림프구의 종자세포를 배양하는 방법.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 상기 종자세포 배지에서 단리된 종양 침윤 림프구를 배양해, 상기 종양 침윤 림프구의 종자세포를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 종용 침윤 림프구를 증폭하는 방법.
- 제71항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단리된 종양 침윤 림프구는 필요로 하는 대상체의 복수, 외과적으로 절제된 원발부위 검체, 동시성 및 비동시성 외과적으로 절제된 전이부위 검체, 천자 검체 및 체액으로 구성된 군에서 선택된 검체에서 유래되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제73항에 있어서,
상기 체액은 혈액, 조직액, 림프액 및/또는 체강액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단리된 종양 침윤 림프구는 흑색종, 신경교종, 위암, 폐암, 위장관 기질종양, 대장암, 간암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 자궁내막 기질육종, 골반강 저분화선암 및 담관암으로 구성된 군에서 선택되는 종양에서 유래되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단리된 종양 침윤 림프구는 종양 조직이 절제된 조직괴에서 나오며, 상기 종양 조직이 절제된 조직괴의 직경은 약 1mm 내지 약 10mm인 것을 특징으로 하는 방법. - 제71항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양 시간은 약 3 내지 20일인 것을 특징으로 하는 방법. - 제71항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양 온도는 약 30 내지 42℃인 것을 특징으로 하는 방법.
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