KR20210053058A

KR20210053058A - 면역 활성 개선용 조성물 및 이의 방법

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Publication number: KR20210053058A
Application number: KR1020190138866A
Authority: KR
Inventors: 예상규; 김병학; 이해리; 노금희; 정애진; 이송희; 김슬기; 권용진; 서은비
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2021-05-11
Also published as: WO2021085853A1; KR102300846B1; CN114667152A

Abstract

본 발명은, 면역세포의 배양 시 배양액에 첨가함으로써 면역세포를 활성화시킬 수 있는 물질 및 이를 이용한 면역세포의 활성화 방법에 관한 것이다.

Description

면역 활성 개선용 조성물 및 이의 방법{Composition for improving immune activity and a method therefor}

본 발명은 면역세포 활성화 물질 및 이를 이용한 면역세포의 활성화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 면역세포의 배양 시 상기 면역세포와 함께 배양함으로써 상기 면역세포의 면역 활성을 증진시킬 수 있는 조성물에 관한 것이다.

췌장암(pancreatic cancer)은 흔한 원발성 암 중 한 종으로, 전체 환자의 5% 미만만이 진단 후 평균 5년의 생존율을 보이는 악성종양이다. 다른 암종들과 비교 시 수 십년 동안 그 평균 생존율이 향상되지 않은 유일한 암 종으로 알려져 있다. 현재 췌장암에 대한 효과적인 치료 방법으로 알려져 있는 방법은 수술을 통한 제거이다. 췌장암의 암 종괴 조직이 주로 섬유조직으로 이루어져 있고 암세포는 일부에 불과하여 항암 치료 후 암에 대한 치료 반응을 평가하는 데 어려움이 있는데다가, 췌장암은 비교적 항암 치료가 잘 듣지 않는 암이라고 알려져 있기 때문에 항암 화학요법 보다는 가능한 외과적인 절제가 권장된다. 임상적으로 사용되고 있는 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine) (Eli Lilly and Company)이 있으나 치료 효과에 대한 지속적인 의문이 제기 되고 있는 실정이다. 하지만 이를 대체할 만한 물질 및 치료 방법이 전무한 상태다. 따라서 현재 췌장암을 효과적으로 치료할 수 있으면서 사용에 부작용이 적은 항암제 혹은 기존의 항암제의 효과를 증진시킬 수 있는 보조제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이러한 항암제의 보조제로서 세포치료제가 주목 받고 있다. 세포치료제의 유효성분 중 하나로 흔히 사용되는 세포인 자연살해세포는 여러 사이토카인에 의해 활성화(activation)되어 증폭하고 세포용해기능(cytolytic function)의 물질을 분비하게 되는데, 활성화된 자연살해세포는 인터페론-감마, 종양괴사인자(tumor-necrosis factor, TNF), 자가유래 과립세포-대식세포 집락자극인자(granulocyte/macrophage colony-stimulation factor; GM-CSF)를 케모카인(chemokine)과 함께 분비하여 염증반응을 일으킨다. 또한 단핵구(monocyte), 수지상 세포(dendritic cells), 과립구(granulocyte)의 분화와 성장을 유도함으로써 적응 면역에 영향을 미친다(Prospects for the use of NK cells in immunotherapy of human cancer, NATURE REVIEWS, 2007).

한편, 면역 조절 관여에는 인터페론 감마(IFN- γ)와 같은 단백질 외에 식물에서 유래한 다당류가 다양한 대식세포 기능, 즉 종양세포와 미생물에 대한 세포독성 활성, 탐식활성알파조양괴사 인자, 인터루킨 등 특정 사이토카인의 분비를 활성화하며 세포의 분화 및 증식을 촉진한다.

이에 따라 특정 물질을 활용하여 위와 같은 면역세포의 면역 활성 증진효과를 높일 수 있다. 면역세포의 면역 활성을 효율적으로 증진시키고, 궁극적으로 이러한 면역세포를 이용한 암 치료 효과를 달성할 수 있는 방법이 다양하게 시도되고 있다.

본 발명의 일 목적은, 세포치료제의 유효성분인 면역세포의 면역 활성을 증진시킬 수 있는 세포치료제 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은, 암 치료 또는 예방용인 세포치료제의 치료 효과를 증진시키는 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 면역세포를 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 멜라토닌 또는 이의 조합과 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 면역세포를 분리하는 단계를 포함하는, 상기 면역세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제의 제조 방법에 관한 것이다:

[화학식 1]

[화학식 2]

.

본 발명에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 5-니트로-2-푸랄데하이드 p-하이드록시벤조일하이드라존(5-Nitro-2-furaldehyde p-hydroxybenzoylhydrazone)에 해당하며, '니푸록사지드(예, AMBATROL™, ANTINAL™, BACIFURANE™, DIAFURYL™)'로 나타낼 수도 있다.

본 발명에서 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 3-(2,4-디클로로-페녹시메틸)-5-트리클로로메틸-[1,2,4]옥사디아졸(3-(2,4-dichloro-phenoxymethyl)-5-trichloromethyl-[1,2,4]oxadiazole)에 해당한다.

상기 면역세포를 배양하는 단계에서 배양액은 멜라토닌을 포함할 수 있다. 본 발명에서 멜라토닌(melatonin)은, 수면 타이밍, 혈압 조절, 계절에 따른 생식 등 생리적 기능의 활동일주기(circadian rhythm)에 영향을 미치는 것으로 알려진, 포유동물, 식물, 박테리아, 곰팡이 등에서 발견되는 물질 중 하나이다. 멜라토닌은 '멜라토닌 단독, 또는 진세노사이드(ginsenoside) 및 β-글루칸(β-glucan) 중 선택된 하나 이상과의 조합(이하, MTAM1)'으로 사용될 수 있다. MTAM1은 림프구를 배양하는데 사용될 수 있고, 배양 후 얻어지는 면역세포 내 자연살해세포의 증식 비율을 보다 높이고, 상기 자연살해세포의 암 세포에 대한 살상능 또한 더욱 증진시켜 암을 보다 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. MTAM1이 존재하는 환경에서 림프구를 배양하는 경우, 상기 림프구는 CD3와 우선 배양된 것일 수 있다. 상기 MTAM1은 CD56, IL-18 또는 이의 조합을 더 포함할 수 있다. MTAM1과 추가적인 면역 활성화 인자인, CD3, CD56, IL-18 또는 이의 조합과의 배양은 필요에 따라, 동시에, 순차적으로 또는 교차적으로 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다. 일 구체예에서, 상기 세포치료제는 유효성분으로 면역세포를 포함할 수 있다.

본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 암의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 상기 “면역세포”는 체내에 존재하거나 체외로 분리할 수 있는 면역활성을 갖는 모든 세포를 의미할 수 있다. 면역세포는 예를 들어, 자연살해세포, T세포, B세포, 수지상세포, 대식세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 면역세포는 림프구일 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 면역세포는 자연살해세포(natural killer cells, NK cells)일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 화학식 1 또는 2의 화합물은 단리된 자연살해세포와 접촉하여 이의 면역 활성을 증진시킬 수 있다. 인체로부터 수득되는 면역세포는 다양한 면역세포 종류가 혼합물 형태이다. 따라서, 배양 과정에서 특정 면역세포로의 분화를 유도하거나, 이의 증식만 활성화하는 것이 일반적이다. 본 발명의 일 구체예는, 하기의 실시예에서도 입증된 바와 같이, 단리된 자연살해세포에 적용하여도 성공적으로 이의 면역 활성을 증진시킬 수 있다. 이러한 효과는, 유효 성분으로 순수한 자연살해세포를 포함하는 세포치료제의 최종 제품에 대해서도 기대하는 면역 활성을 얻을 수 있음을 시사한다.

본 발명에서, 상기 “배양”은 세포를 생존 가능한 상태로 유지 또는 보존하는 것으로서, 면역세포를 특정 환경에 노출 또는 접촉시키는 것을 포함하는 의미일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 조합은 면역세포와 혼합하여 배양함으로써 면역세포의 면역 활성을 증진시킬 수 있다. 상기 면역 활성은 예를 들어, 암세포 또는 감염세포에 대한 세포살상능(cytotoxicity)을 의미할 수 있다. 이는 궁극적으로, 면역세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제의 암 치료 또는 예방 효과를 더욱 증진시킬 수 있다. 본 발명에서, 상기 암은 예컨대 췌장암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 대장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 췌장암일 수 있다.

상기 배양물로부터 면역세포를 분리하는 단계는, 면역세포 외에 배양액 및 배양액에 잔존하는 성분들을 실질적으로 제거하는 것을 의미할 수 있다. 분리하는 방법은, 예를 들어, 막 여과, 투석, 침전법, 세포 부착 및 세척 등 다양한 방법을 사용할 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 면역세포가 개체에 적용되는 경우 발생할 수 있는 불필요한 생체 반응을 회피하기 위해 면역세포를 분리하는 단계를 채용할 수 있으나, 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 멜라토닌 또는 이의 조합은 단지 면역세포의 면역 활성을 증진시키기 위해 소량 사용되므로, 면역세포와 함께 잔존하더라도 개체에 미치는 효과는 매우 미미할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 세포치료제의 제조 방법은, 분리된 면역세포를 세포치료제로 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 제형화는 세포치료제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하기에 적절한 형태로 가공하는 모든 행위를 포함하는 것으로서, 예를 들어, 분리된 면역세포를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 것을 의미할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 세포치료제는 액제, 현탁제, 분산액, 유제, 겔제, 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 주사제가 될 수 있다. 상기 세포치료제가 주사제로 제형화되는 경우, 상기 제형화 단계에서 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 멜라토닌 또는 이의 조합을 포함하는, 세포치료제의 치료 효과 증진용 조성물을 제공한다.

상기 세포치료제의 치료 효과 증진용 조성물은, 세포치료제와 접촉함으로써, 상기 세포치료제의 유효성분인 면역세포의 면역 활성을 증진시키고, 결과적으로 세포치료제의 암 치료 또는 예방 효과를 증진시킬 수 있다.

상기 세포치료제의 치료 효과 증진용 조성물은, 면역세포와 접촉시키기 위해 면역세포를 배양하기 위한 배양액에 첨가물로서 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 세포치료제가 개체 내에서 신속하고 효율적인 면역 활성을 나타낼 수 있도록, 상기 세포치료제의 치료 효과 증진용 조성물은 세포치료제를 필요로 하는 개체에 사용하기 전에 우선적으로 상기 세포치료제와 혼합될 수 있다. 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물은 1 μM 내지 100 μM, 1 μM 내지 80 μM, 1 μM 내지 60 μM, 또는 1 μM 내지 40 μM으로 포함될 수 있다. 상기 세포치료제의 치료 효과 증진용 조성물은, 개체에 투여되기 전에 세포치료제와의 혼합물로부터 제거되어 개체 내에서 불필요한 생체 반응이 유발되는 것을 차단할 수 있다. 그러나, 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물은 면역세포의 면역 활성을 증진시킬 수 있을 정도로 소량 사용되므로, 혼합물 상태로 투여되거나 잔존하더라도 개체에 미치는 효과는 미미하다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 멜라토닌 또는 이의 조합을 포함하는 제1 유닛; 및 면역세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 포함하는 제2 유닛을 포함하는, 키트를 제공한다.

본 발명에서, 상기 “유닛”은 단지 키트의 구성을 구분하기 위한 수단이고, 고체, 분말, 용액, 현탁액, 겔 등의 형태로 존재할 수 있고, 서로 분리 가능한 적절한 용기에 포함된 것을 의미할 수 있다.

상기 제1 유닛 및 제2 유닛은 상기 키트 내에서 분리되어 있고, 개체에 사용하기 전에 서로 혼합되어, 제2 유닛의 면역세포의 면역 활성을 증진시킴으로써 세포치료제의 치료 효과를 증진시킬 수 있다.

상기 키트는 제1 유닛 및 제2 유닛의 혼합물로부터 면역세포를 분리할 수 있는 구성을 더 포함할 수 있다. 상기 면역세포를 분리하는 구성은 실질적으로 상기 제1 유닛 및 제2 유닛의 혼합물로부터 화학식 1 또는 2, 멜라토닌 또는 이의 혼합물을 제거하기 위한 것일 수 있다. 그러나, 제1 유닛의 성분은 단지 면역세포의 면역 활성을 증진시킬 수 있을 정도로 소량이므로, 혼합물 상태로 투여되거나 잔존하더라도 개체에 미치는 효과는 미미하다.

상기, 세포치료제의 제조 방법에 대한 설명은, 세포치료제의 치료 효과 증진용 조성물 또는 키트에 대한 동일한 구성에 대한 설명과 같은 의미로 해석될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 조합을 이용한 세포치료제 제조 방법 및 이를 위한 조성물은 면역세포의 암세포 또는 감염세포에 대한 세포살상능을 현저히 증진시켜, 면역세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제의 암 치료 또는 예방 효능을 현저히 증진시킬 수 있다.

도 1은, 화합물 1 및 2의 NK 세포에 대한 독성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는, 화합물 1 및 2와 각각 배양한 NK 세포의 Panc-1 세포에 대한 세포독성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 3 내지 6은, 각각 실시예 2에서 시험군 1, 시험군 2 및 대조군에 대하여 배양조건 별로 세포표면항원을 검사한 그래프이고, 도 6은 각각으로부터 수확한 세포 내 NK 세포 및 NKT 세포의 비율 및 T 세포의 비율을 나타낸 것이다.
도 7은, 실시예 2에서 시험군 1, 시험군 2 및 대조군에 대한 세포성장곡선을 나타낸 것이다.
도 8은, 실시예 2에서 시험군 1, 시험군 2 및 대조군에 대한 세포독성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 2에서 본 발명에 따른 면역세포 활성화 물질에 대한 세포생존시험(Cell viability test) 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10 및 11은 실시예 2에서 본 발명에 따른 면역세포 활성화 물질에 대한 활성산소(Reactive Oxygen Species, ROS) 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 실시예 2에서 혈액으로부터 채취 및 분리한 림프구에 시험군 1의 처리 후 배양 및 수확한 면역세포의 세포표면항원을 검사한 그래프를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 화학식 1 및 2의 면역세포의 면역 활성 증진 능력 확인

1-1. 세포 배양

췌장암세포주인 Panc-1는 한국세포주은행(서울대학교)에서 구매하였다. 세포는 10% FBS와 1% 페니실린 스트렙토마이신이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Hyclone, Logan, UT; Panc-1세포) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 자연살해세포주인 NK-92세포는 ATCC (Manassas, VA) 에서 구매하였으며, 20% FBS와 1% 페니실린 스트렙토마이신, 10 ng/ml recombinant human IL-2가 함유된 Minimum Essential Medium Eagle alpha (MEM-α) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.

1-2. 화학식 1 및 2의 세포독성 확인

실험물질의 자연살해세포에 대한 독성을 평가하기 위해, 실시예 1-1의 NK-92세포에 대해 화학식 1 및 2 각각을 1 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 및 40 μM의 농도로 처리하여 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, D-Plus™ cell viability assay kit (CCK-3000, Donginbiotech Co., korea)를 잘 알려진 방식대로 0.1X 처리 후 450nm 흡광도 측정하였다.

그 결과, 시험된 모든 농도에서 생존률이 약 85%로 관찰되어, NK-92세포에 대한 직접적은 독성은 없는 것으로 확인되었다 (도 1).

1-3. 화학식 1 및 2의 면역세포의 면역 활성화 평가

실시예 1-1의 NK-92세포를 각각 40 μM 의 화학식 1 및 2와 4시간 동안 배양한 후, NK-92 세포를 분리하고, 이를 암세포인 Panc-1 세포와 각 비율에 맞게 (E:T=2.5, 5, 10, 20) 공동 배양하였다. 4시간 후, 암세포 생존률에 대해 LDH cytotoxicity detection kit (Takara, Japan)로 잘 알려진 방식대로 실험을 진행하여, 490nm 흡광도 측정하였다.

그 결과, 화학식 1 및 2와 배양된 NK-92 세포가 Panc-1 세포에 대해 대조군과 비교하여 현저히 우수한 살상능을 갖는 것으로 확인되었다 (도 2).

실시예 2: 멜라토닌의 면역세포의 면역 활성 증진 능력 확인

2-1. 림프구의 수득 및 배양

환자의 혈액에서 림프구를 분리하고, 배양액에 현탁한 다음, 이를 CD3가 고상화되어 있는 T-25 플라스크(Flask)에 넣었다. 그런 다음, D56 5㎛ 및 자가유래 혈장 10%를 T-25 Flask에 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 1~2일간 배양하였다. T-75 Flask에 옮긴 후, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 3~4일간 배양하였다. 이 때, 시험예 1 및 2 각각에는, T-75 Flask에서 CD56 5㎕, IL-18 및 면역세포 활성화 물질로 멜라토닌, 진세노사이드 및 β-글루칸의 혼합물(이하, MTAM1)을 11.5㎕ 또는 40㎕ 처리하였다. 그리고 비교를 위하여 대조군에서는 T-75 Flask에서 CD56 5㎕, IL-18를 처리한 후, CO₂ 인큐베이터에서 3~4일간 배양하였다. 그 후, T-175 Flask에 옮기고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 48시간 배양하였다.

그 후, 시험군 1 및 2에는 T-175 Flask에서 MTAM1을 각각 10㎕ 또는 20㎕ 처리하고, 자가유래 혈장 5%를 첨가하였다. 그리고 비교를 위한 대조군에는 자가유래 혈장 5%를 첨가한 후, CO₂ 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다.

그 후, 시험군 1 및 2에 대하여, T-175 Flask에 배양 중인 세포현탁액에 IL-18과 MTAM1을 처리하고 세포의 활성화된 상태를 관찰한 후, T-150 Flask를 1000ml 용량의 가스투과성 배양백이 들어있는 배양액에 옮긴 후 7~9일간 더 배양하여 세포를 다량 증식시켰다. 대조군에 대하여는, T-150 Flask를 1000ml 용량의 가스투과성 배양백이 들어있는 배양액에 옮긴 후 7~9일간 더 배양하여 세포를 다량으로 증식시켰다.

2-2. 면역세포의 수득

시험군 1 및 2, 대조군 각각에 대하여, 1000ml 용량의 CO₂ 가스투과성 배양백이 들어있는 세포와 배양액을 500ml 원심 분리 튜브에 나누어 옮기고, 17분(min)간 원심 분리하여 세포를 수확하였다. 상층액을 세포가 떨어지지 않도록 조심히 버린 후 멸균생리식염수 250ml로 세포를 세척하였다. 다시 원심 분리기 안에 밸런스를 맞추어 원심 분리관을 넣고 15분간 원심 분리하여 세포를 수확하였다. 상층액을 세포가 떨어지지 않도록 조심히 버린 후 100ml 주사용 멸균 생리식염수 백(bag)에서 주사기(syringe)를 사용하여 30ml 채취하였다. 30ml 주사용 멸균 생리식염수로 세포를 현탁하였다. 현탁한 세포를 셀스트레이너(cell strainer)에 부어 걸렀다. 거른 세포 현탁액을 주사용 멸균 생리식염수 백에 넣어 현탁시켰다.

2-3. 면역세포의 면역 활성 평가

실시예 2-2로부터 수득된 시험군 1 및 2, 그리고 대조군의 세포표면항원을 분석하여 림프구의 종류를 정량적으로 측정하기 위한 순도시험을 행하였고, 그 결과를 각각 도 3 내지 6에 나타내었다. 여기서, 도 3 내지 5는 각각 시험군 1, 시험군 2 및 대조군에 대하여 배양조건 별로 세포표면항원 검사한 그래프이고, 도 6은 각각에 대하여 NK 세포 및 NKT 세포의 비율, T 세포 비율을 나타내었다.

그 결과, 시험군 1 및 2는 대조군에 비하여 NK 세포 및 NKT 세포의 비율이 월등히 증가함을 알 수 있었다 (도 6).

또한, 세포수 및 생존률에서 시험군 1 및 2에서는 대조군에 비하여 세포수 및 생존율이 향상됨을 알 수 있었다 (도 7 및 표 1).

대조군		시험군 1		시험군 2
세포수	생존율	세포수	생존율	세포수	생존율
2.26X10⁹	83%	2.96X10⁹	97%	3.86X10⁹	95%

마지막으로 세포독성(Cytotoxicity) 시험 결과, 시험군 1 및 2의 세포상해활성능력(%)이 대조군의 세포상해활성능력에 비하여 월등히 향상됨을 알 수 있었다 (도 8 및 표 2).

	대조군	시험군 1	시험군 2
검체명	IMBIO_NK+T cell_01	IMBIO_NK+T cell_04	IMBIO_NK+T cell_04
세포상해활성능(%)	31	68	59

이와 같은 결과는 MTAM1의 첨가에 따른 것으로, 여기서 MTAM1은 식물로부터 유래된 멜라토닌, 진세노사이드 및 β-글루칸 중 적어도 하나를 포함하고, 바람직하게는 멜라토닌, 진세노사이드 및 β-글루칸을 모두 포함하여 제조된다.

NK 세포는 성장과 확산을 제한함으로써 종양의 여러 유형을 제어하는 타고난 면역 시스템의 조절 림프구로서, 다른 자극 없이 직접 세포의 세포 독성을 발휘하고, IFN-γ와 가은 면역촉진성의 사이토카인을 분비하여 국조 종양 성장(local tumor growth)과 전이(metastasis)를 모두 제어할 수 있다.

특히 IL-2에 의해 활성화된 NK 세포는 CTL과 유사하며, 퍼포린(perforin)과 그란자임 B(granzyme B)에 의해 연속적으로 타겟(target) 세포를 살해 후 자신은 살아 남으며, 이때 IL-2는 고갈된 NK 세포의 세포독성과 과립을 축적시켜 주는 능력을 지니고 있다. 또한 NK 세포는 항체 의존적인 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 가진다. NK 세포에서 발현되는 Fc 리셉터 중 FcγRIII(CD16)는 병원균(pathogen)에 감염된 세포의 표면에 결합되어 있는 IgG와 같은 항체의 Fc 부위를 인식하게 된다. Fc 리셉터의 활성은 NK 세포의 활성을 유도하여 세포용해성 사이토카인(cytolytic cytokine)을 분비하도록 유도하며, 이러한 NK 세포의 ADCC 작용은 CTL과는 다른 NK 세포만 가지고 있는 특징이다.

멜라토닌은 림프구의 글루타티온의 생산을 늘려 림프구의 기능을 높이는 효과가 있다. 단핵구 표면에 있는 멜라토닌 수용체를 통해 IFN-γ와 인터루킨-1, 2, 6, 12(Interleukin-1, 2, 6, 12) 등의 사이토카인의 분비를 촉진시켜, NK 세포의 활성을 유도한다. 본 발명에 따른 MTAM1은 NK 세포의 바이러스 감염 세포 및 암 세포에 대한 살상능을 높여주고, 배양 중의 활성산소를 저해하여 세포 생존율을 증가시킨다.

또한, 진세노이드(Ginsenoside)는 C-SRC 키나제(C-Src Kinase)를 활성화시키며, 세포 내 칼슘이온 농도를 2배~3배 증가시킨다. 세포 내 신호전달 체계의 초기단계인 C-Src 키나제 관련 경로의 활성화 및 세포 내 칼슘이온의 증가는 특정 유전자의 발현을 증가시키고 세포 증식을 촉진시킨다. 특히 진세노사이드-Rp1은 수지상 세포에 특이적으로 일정한 농도에서 면역 사이토카인의 생성반응을 유도하며 저농도에서 NK 세포의 활성도를 증가시킨다.

한편, 베타-글루칸은 TNF-α와 IFN-γ의 발현을 증가시키며, 호중구에서 항아포토시스(Anti-apoptosis) 효과를 나타낸다. 특히 라미나리아 디지타타(Laminaria digitata)에서 분리한 글루칸인 피카린(Phycarine)은 식세포 활성을 증가시키고, IL-1, IL-6, TNF-α의 생성 및 분비를 증가시킬 뿐만 아니라 피카린은 보체 제3 수용체(CR3)를 통한 NK 세포에 의한 암 세포 사멸작용을 증가시킨다.

도 9은 MTAM1에 대한 세포생사판별시험(Cell viability test) 결과를 나타낸 그래프로서, 본 발명에 따른 MTAM1이 세포 내의 독성이 없음을 보여주며, 나아가 증식에도 효과가 있음을 보여준다.

또한, 도 10 및 도 11은 활성산소(Reactive Oxygen Species; ROS) 측정 결과를 나타낸 그래프로서, 도 10을 통해서 NK 세포에 인위적으로 ROS를 증가시켜 MTAM1 처리 후 ROS가 감소됨을 확인하였고, 도 11을 통해서 MTAM1이 들어있는 배지에서 NK 세포를 14일간 배양 후에 ROS를 측정한 결과 멜라토닌이 활성산소를 막아줌을 확인하였다. 여기서 H₂0₂는 활성산소를 증가시키는 자극제를 나타내고, NAC는 ROS 스캐빈저(Scavenger)를 나타낸다.

세포표면항원 분석에서는, 멜라토닌, 진세노사이드 및 β-글루칸으로 이루어진 면역세포 활성화 물질을 처리한 뒤 배양 및 수확된 세포는 CD3-CD56+CD16+의 표현형을 갖는 NK 세포가 74.2%, NKT 세포가 7.9%, T 세포가 12.7%의 비율로 구성된 것을 확인할 수 있었다 (도 12). 이는 도 6의 무처리한 대조군에서의 결과와 비교해 보더라도, 상기 면역세포 활성화 물질의 처리로 인해 수확된 세포 내 NK 세포 및 NKT 세포의 비율이 현저히 증가한 것을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

면역세포를 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 멜라토닌 또는 이의 조합과 배양하는 단계; 및
상기 배양물로부터 면역세포를 분리하는 단계를 포함하는, 상기 면역세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제의 제조 방법:
[화학식 1]

[화학식 2]

.
제1항에 있어서, 상기 면역세포는 림프구인 것인, 세포치료제의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 면역세포는 자연살해세포(natural killer cells)인 것인, 세포치료제의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물은 단리된 자연살해세포와 배양하여 이의 면역 활성을 증진시키는 것인, 세포치료제의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 면역세포의 면역 활성을 증진시키기 위한, 세포치료제의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포치료제는 암 치료 또는 예방용인 것인, 세포치료제의 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 면역 활성은 암세포 또는 감염세포에 대한 세포살상능(cytotoxicity)인 것인, 세포치료제의 제조 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 대장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는, 세포치료제의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 분리된 면역세포를 세포치료제로 제형화하는 단계를 더 포함하는, 세포치료제의 제조 방법.
하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 멜라토닌 또는 이의 조합을 포함하는, 세포치료제의 치료 효과 증진용 조성물로서,
상기 세포치료제는 면역세포를 유효성분으로 포함하고, 암 치료 또는 예방용이고,
상기 세포치료제와 접촉함으로써, 상기 면역세포의 면역 활성을 증진시키는 것인, 세포치료제의 치료 효과 증진용 조성물:
[화학식 1]

[화학식 2]

.
제10항에 있어서, 상기 세포치료제를 필요로 하는 개체에 사용하기 전에, 우선적으로 상기 세포치료제와 혼합되는 것인, 세포치료제의 치료 효과 증진용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물은 1 μM 내지 100 μM으로 포함된 것인, 세포치료제의 치료 효과 증진용 조성물.
하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 멜라토닌 또는 이의 조합을 포함하는 제1 유닛; 및 면역세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 포함하는 제2 유닛을 포함하는, 키트.
제13항에 있어서, 상기 제1 유닛 및 제2 유닛은 분리되어 있고, 혼합되어 상기 제2 유닛의 면역세포의 면역 활성을 증진시키는 것인, 키트.