KR102007872B1 - 줄기세포를 멜라토닌 처리 하여 증식 촉진 또는 생존율을 증가시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따라 멜라토닌을 처리한 줄기세포는 프리온 단백질(cellular prion protein; PrP^C)의 발현을 증가시켜 ROS에 의한 세포사멸을 억제하고, IDO 효소의 발현을 조절하여 줄기세포가 이식된 질환 부위의 대식세포(macrophage)의 면역 활성을 조절하여 질환 부위에 이식된 줄기세포의 주변 환경의 면역조절 기능 및 생존율을 증가시킨다. 또한, 본 발명은 멜라토닌을 포함하는 줄기세포의 증식 촉진 또는 생존율 증가용 조성물을 이용하여 허혈성 질환을 치료할 수 있다.

Description

줄기세포를 멜라토닌 처리 하여 증식 촉진 또는 생존율을 증가시키는 방법 {Method Of Promoting Proliferation Or Increasing Survival 0f Stem Cells By Melatonin Treatment}

본 발명은 줄기세포에 멜라토닌을 처리하여 줄기세포의 증식 촉진 또는 생존율을 증가시키는 것을 특징으로 하는 멜라토닌을 포함하는 줄기세포의 증식 촉진 또는 생존율 증가용 조성물 및 이를 포함하는 줄기세포 치료 보조제에 관한 것이다.

줄기세포 치료제 등을 포함하는 세포 치료제는 질병으로 손상된 질환 부위의 세포 및 조직의 기능을 회복 및 복원시키기 위하여 자가, 동종 또는 이종의 세포를 체외 배양 및 증식시킨 후 환자에게 그 세포를 이식하는 치료제를 의미하며, 특히 줄기세포를 기반으로 하는 줄기세포 치료가 대표적이며 많은 연구가 진행되고 있다. 또한, 줄기세포 치료제 연구에서 이식될 줄기세포의 선정 및 배양 방법 또는 여타의 다른 행위 등의 변화를 이용하여 이식되어질 줄기세포의 생물학적 특성을 강화시켜 치료효과를 증진시키는 다양한 연구가 진행 중이다.

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)는 뼈, 연골, 근육, 인대, 힘줄 및 지방 조직으로 분화될 수 있다. 중간엽 줄기세포는 심근 경색, 척수 손상, 폐 손상, 뇌졸중, 말초 허혈성 질환 및 연조직 상처와 같은 다양한 병리학적 상태의 조직 치료를 위한 유망한 세포 공급원이다. 이식된 MSCs는 두 가지 일반적인 치료 메카니즘, 즉 면역 조절 및 영양 효과(trophic effects)를 유도하는 것과 증식 및 분화에 대한 가능성을 증가시키는 것에 의해 모든 이상 증상을 치료하는 것으로 여겨진다. MSCs 면역 조절 효과는 분비된 사이토카인 및 세포-세포 상호 작용에 의해 매개되는 반면, 그들의 영양 능력은 항-세포사멸, 항-상처 및 혈관 신생 작용뿐만 아니라 손상된 조직에서의 촉진 작용에도 관련된다. MSCs는 높은 치료적 가능성을 갖지만, 염증, 산화 스트레스, 국소 빈혈 또는 영양 부족과 같은 손상된 조직의 병리학적 조건에서 생존율이 낮기 때문에 그 효과가 제한적이다. 따라서 다양한 허혈성 질환에서 MSCs 기반 치료를 성공적으로 수행하기 위해서는 병리학적 조건에서 세포사멸에 내성을 갖도록 만들어 줌으로써 이식된 MSCs의 생존을 촉진하는 것이 중요하다.

멜라토닌(melatonin, N-acetyl-5-methoxytryptamine)은 송과선으로부터 내생적으로 분비되는 인돌아민(indoleamine) 호르몬이며, 골수, 간장, 장, 태반, 난소 및 고환과 같은 다양한 조직에 의해 분비된다. 특히, 멜라토닌은 세포막과 뇌혈관을 비롯한 모든 생리학적 장벽을 쉽게 통과하여 혈류로 방출될 뿐만 아니라 송과체를 통해 제3 뇌실의 뇌척수액으로 들어가는 것으로 알려져 있다. 멜라토닌의 기능은 수면, 일주기 리듬, 면역방어 및 신경 내분비 작용을 비롯한 여러 가지 생리 기능을 조절한다는 것이 밝혀졌다. 이외에 항산화, 항암, 항염증 및 자가소화작용(autophagy) 조절 효과가 있다는 연구 결과가 있다. 특히 멜라토닌이 심근 경색 및 급성 폐 허혈 등의 질환에서 줄기세포 기반 치료의 효능을 향상시킨다는 연구가 발표되었다. 하지만 멜라토닌이 줄기세포의 생물학적 활성을 증진시키는 병리 생리학적 매커니즘은 여전히 불분명하다.

정상적인 프리온 단백질(PrP^C)은 당지질을 통해 세포표면에 있거나 세포막 속에 박혀있는 모습으로 세포막에서 발견된다. 비정상적으로 형태가 변형된 프리온 단백질(PrP^SC)은 프리온 질환 및 신경 퇴행성 질환의 발병과 관련이 있으며, 최근 정상 프리온이 줄기세포의 증식 및 자가 재생산에 근본적인 역할을 하는 주요 인자이며 신경 퇴화에 대한 보호 기능을 한다는 연구 보고가 있다. 특히, 프리온 단백질이 줄기세포 및 전구세포의 분화, 신경 발생 및 혈관 신생에 관여한다는 연구 결과가 있다.

따라서 본 발명은 멜라토닌을 처리한 줄기세포의 병리생리학적 조건에서 프리온 단백질 발현의 상향 조절을 통해 이식된 줄기세포의 증식률 증가, 산화성 스트레스 저항성 향상, 면역조절의 기초가 되는 프리온 단백질의 중추적 기능 및 허혈성 질환 조직에서 혈관 재생 등의 치료 효능을 증진시키는 메커니즘을 밝히고 있다.

본 발명의 목적은 기존 줄기세포 치료의 문제점인 환자 본인이 갖고 있는 다양한 질병 인자 및 질환 부위의 척박한 환경으로 인해 이식된 줄기세포의 증식률 저하, 산화성 스트레스에 의한 생존율 감소 및 면역 반응의 문제점을 개선하기 위한 것이며, 멜라토닌을 포함하는 줄기세포의 증식률, 생존율 증가 및 면역조절 기능을 향상하는 메커니즘을 제공하고 효과적인 허혈성 질환 치료를 위한 줄기세포 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명은 멜라토닌을 포함하는 줄기세포의 증식 촉진 또는 생존율 증가용 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다.

바람직하게는, 상기 조성물은 멜라토닌을 10^-10 M이상 10^-4 M 이하의 농도로 포함한다.

바람직하게는, 상기 조성물은 처리된 멜라토닌에 의해 프리온 단백질의 발현이 증가되어 줄기세포 내의 세포사멸인자인 BAX, PARP1 및 Caspase-3의 활성을 억제하고 면역조절인자인 IDO 효소의 발현을 증가시킨다.

또한, 본 발명은 줄기세포에 멜라토닌을 처리하여 줄기세포의 증식 촉진 또는 생존율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다.

바람직하게는, 상기 멜라토닌은 10^-10 M이상 10^-4 M 이하의 농도로 처리된다.

바람직하게는, 상기 방법은 멜라토닌을 처리하여 프리온 단백질의 발현이 증가되어 줄기세포 내의 세포사멸인자인 BAX, PARP1 및 Caspase-3의 활성을 억제하고 면역조절인자인 IDO 효소의 발현을 증가시킨다.

또한, 본 발명은 멜라토닌을 포함하는 줄기세포의 증식 촉진 또는 생존율 증가용 조성물을 포함하는 줄기세포 치료 보조제에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 줄기세포 치료 보조제는 허혈성 질환 치료용이다.

본 발명의 멜라토닌을 포함하는 조성물을 줄기세포에 처리하면, 줄기세포의 증식을 촉진하고, 생존율을 향상시키며, 면역조절의 메커니즘을 통하여 줄기세포 내의 PrP^C의 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 이를 이용하여 줄기세포 치료의 단점인 표적 장기 내의 강력한 산화성 스트레스와 면역반응으로 인한 낮은 생착률의 문제를 효과적으로 개선하여 새로운 줄기세포 치료 보조제로서 사용할 수 있다.

도 1은 멜라토닌의 MT₂-PrP^C axis를 통한 중간엽 줄기세포(MSCs)에 대한 효과를 도시한다. 구체적으로, (A)는 12시간 동안 멜라토닌(0, 0.1, 1, 10 또는 100 μmol/L)을 처리한 후 MSCs 증식을 측정한 것을 나타내고, (B)는 1 μmol/L의 멜라토닌을 특정 시간 처리한 후의 MSCs 증식을 나타낸다. (C)는 역전사 PCR(RT-PCR)에 의해 확인된 MSCs의 MT₁과 MT₂ 유전자 발현을 나타내고, (D)는 멜라토닌(1 μmol/L)을 MSCs에 처리한 후, MT₂ 유전자 발현을 정량적 RT-PCR로 분석한 것을 나타낸다. 또한, (E)와 (F)는 멜라토닌(1 μmol/L)을 MSCs에 처리한 후 MT₂와 PrP^C의 단백질 발현을 웨스턴 블랏에 의해 분석하고, β-액틴 발현에 대해 덴시토메트리(densitometry)에 의해 정량화한 것을 나타낸다. (G)는 미처리 MSCs, 멜라토닌으로 12시간 동안 처리한 MSCs, 멜라토닌과 MT₂ SiRNA(si-MT₂), 또는 멜라토닌과 스크램블된 siRNA의 조합(Scr-siRNA)에서 웨스턴 블랏으로 MT₂ 및 PrP^C의 발현 수준을 평가한 것을 나타낸다. (H)는 덴시토메트리에 의해 정량화되고 β-액틴 발현 수준에 대해 정규화된 MT₂ 및 PrP^C의 수준을 나타낸다. (I)는 10일 동안 단일 세포 배양에서 배양한 미처리 MSCs(대조군), 멜라토닌(1 μmol/L)으로 처리한 MSCs, 및 멜라토닌(1 μmol/L)과 PRNP siRNA (si-PRNP+멜라토닌)으로 처리한 MSCs의 김자(Giemsa) 염색을 나타내고, (J)는 배양 10일 후에 적어도 하나의 세포 분열된 웰당 세포의 수를 나타낸다.
도 2는 중간엽 줄기세포(MSCs)에서 멜라토닌의 항산화 효과가 PrP^C 발현의 상향 조절을 수반하는 것을 나타낸다. 구체적으로, (A)는 1 mmol/L H₂O₂로 3시간 처리한 후에 웨스턴 블랏에 의해 멜라토닌 포함 또는 미포함하여 배양된 MSCs에서 BCL2, BCL2 관련 X 단백질(BAX), C-PARP-1(cleaved PARP-1) 및 C-Caspase-3(cleaved caspase-3)의 발현 수준을 측정한 것을 나타낸다. (B)는 β-액틴 발현에 대해 덴시토메트리에 의해 BCL2, BAX, C-PARP-1 및 C-Caspase-3을 측정한 것을 나타낸다. (C)는 미처리 MSCs(대조군) 및 1 mmol/L H₂O₂로 처리된 MSCs(H₂O₂), 1 mmol/L H₂O₂와 멜라토닌(Melatonin+H₂O₂) 또는 1 mmol/L H₂O₂, 멜라토닌 및 PRNP siRNA(si-PRNP+melatonin+H₂O₂)에서 요오드화프로피디움(propidium iodide; PI) 및 아넥신 V로 인큐베이션한 후 유세포 분석에 의해 세포사멸의 수를 측정한 것을 나타낸다. (D)는 각 실험군을 주입한 후 디하이드로에티듐(DHE) 염색으로 허혈성-손상된 넓적다리(thigh) 부분에서 반응 산소 종(ROS) 수준을 평가한 것을 나타낸다. (E)는 허혈성-손상된 넓적다리 부분에서 ROS 수준을 DHE-양성 단위의 수로 정량화한 것을 나타낸다.
도 3은 PrP^C 발현의 상향 조절에 의해 매개된 중간엽 줄기세포(MSCs)에서의 멜라토닌의 면역 조절 효과를 나타낸다. 구체적으로, (A)는 시간에 따라 MSCs를 1 mmol/L의 멜라토닌으로 처리한 후 IDO-1과 IDO-2의 발현을 웨스턴 블랏으로 평가한 것을 나타낸다. (B)는 덴시토메트리에 의해 정량화되고 β-액틴 발현 수준에 대해 정규화된 IDO-1과 IDO-2의 수준을 나타낸다. (C)는 6시간 동안 멜라토닌으로 MSCs를 전처리한 후, IDO 효소 활성 분석에 의해 IDO 활성을 평가한 것을 나타낸다. (D)는 6시간 동안 미처리된 MSCs 및 멜라토닌, 멜라토닌과 PRNP siRNA의 조합(si-PRNP) 또는 멜라토닌과 스크램블된 siRNA의 조합(Scr-siRNA)으로 처리된 MSCs에서 웨스턴 블랏에 의해 IDO-1과 IDO-2의 발현 수준을 평가한 것이다. (E)는 덴시토메트리에 의해 정량화되고 β-액틴 발현 수준에 대해 정규화된 IDO-1과 IDO-2의 수준을 나타낸다. (F)와 (G)는 24시간 동안 각 실험군에서 발현 수준을 ELISA로 평가한 것이다. MΦ는 멜라토닌을 처리하지 않고 배양된 대식세포(macrophage)를 나타내고, sMΦ는 멜라토닌을 처리하지 않고 지질다당류로 자극시킨 대식세포를 나타내고, sMΦ에 "+"로 기재된 것은 sMΦ에 해당 성분을 처리하거나 공배양한 것을 의미한다.
도 4는 하지 허혈 모델(쥣과)의 기능성 회복을 평가한 것을 나타낸다. 구체적으로, (A)는 각각 PBS, 중간엽 줄기세포(MSC), 멜라토닌 처리된 MSCs(MSC+melatonin), 멜라토닌과 PRNP siRNA를 처리한 MSCs(si-PRNP+MSC+melatonin) 또는 멜라토닌과 스크램블된 siRNA를 처리한 MSCs(Scr-siRNA+MSC+melatonin)를 투여한 마우스의 허혈성 사지에서 레이저 도플러 관류 화상 진찰(laser Doppler perfusion imaging; LDPI)로 혈액 관류(blood perfusion)를 관찰한 것을 나타낸다. (B)는 혈액 관류 비를 LDPI 분석으로 정량화한 것을 나타낸다. (C)는 수술 후 28일 내의 허혈성 사지에서 다양한 실험 결과(발 괴사, 발가락 손실, 사지 구제)를 나타내는 대표 사진이다. (D)는 수술 후 28일 내의 다양한 결과의 분포를 나타낸다.
도 5는 허혈성 손상을 입은 조직에서 중간엽 줄기세포(MSC)-매개 혈관 신생에 멜라토닌이 미치는 영향을 나타낸다. 구체적으로, (A)는 모세혈관 형성을 CD31 면역형광 염색(녹색)으로 나타낸 것이다. (B)는 모세혈관 밀도의 표준 정량화를 고전력 필드 당 31-양성 세포의 수로서 나타낸 것이다. (C)는 소동맥 형성을 α-평활근 액틴(SMA) 면역형광 염색(붉은색)으로 나타낸 것이다. (D)는 소동맥 밀도의 표준 정량화를 고전력 필드 당 α-SMA-양성 세포의 수로 나타낸 것이다.
도 6은 허혈성으로 손상된 조직에서 이식된 중간엽 줄기세포에 대한 멜라토닌의 항-세포사멸 및 면역조절 효과를 나타낸다. 구체적으로, (A)는 TUNEL 분석으로 사멸 세포를 측정한 것을 나타내고, (B)는 사멸 세포의 수를 고전력 필드 당 TUNEL-양성 세포의 수를 세어 정량화한 것을 나타낸다. (C)는 이식된 MSCs의 세포사멸을 HNA(녹색)과 caspase-3(cleaved caspase-3, 붉은색)으로 면역형광 염색하여 평가한 것을 나타낸다. (D)는 세포사멸을 수행한 이식된 MSCs의 수를 고전력 필드 당 HNA 및 cleaved caspase-3에 대해 더블 양성인 세포의 수를 세어서 정량화한 것을 나타낸다. (E)는 대식세포의 침투를 특정 면역형광 염색(녹색)으로 측정한 것이다. (F)는 침투된 대식세포의 수를 고전력 당 대식세포의 수를 세어 정량화한 것을 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명은 멜라토닌을 포함하는 줄기세포의 증식률 증가 및 면역조절 증가용의 조성물을 포함한다.

본 발명은 멜라토닌을 전 처리하는 방법을 통해 줄기세포의 증식률 및 면역조절 효과를 측정하였다.

본 발명에서 사용된 용어 "줄기세포"는 자기복제 능력 및 다른 두 개 또는 그 이상의 종류로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포, 전분화능 줄기세포 및 다분화능 줄기세포로 분류할 수 있다. 줄기세포는 개체 자신 혹은 동종 이계의 골수, 지방 및 근육 조직 등에서 유래된 간엽 줄기세포 및 혈액, 제대혈, 배아 등에서 추출되어 체외에서 배양된 줄기세포일 수 있으며, 본 발명의 실시예에는 일 예로서 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 사용하였다.

본 발명에서 사용된 용어 "면역조절"은 줄기세포가 이식된 질환 부위의 면역 반응 및 염증 반응을 감소시키는 주변 환경 조성 또는 그 환경을 형성하기 위한 특정 인자의 발현이 증가되는 줄기세포 기능을 의미한다.

본 발명은 멜라토닌을 포함하는 줄기세포의 정상 프리온 단백질의 발현 조절을 통해 줄기세포의 증식률 증가, 생존율 증가 및 면역조절 기능 강화에 대한 메커니즘을 포함하고 있다.

본 발명에 있어서, 멜라토닌은 줄기세포의 증식률 증가, 생존율 증가 및 면역조절 기능 강화를 위하여 바람직하게는 10^-10 M 이상 10^-4 M 이하의 농도로 포함될 수 있으며, 줄기세포에 처리하고 12시간 이상 36시간 이하로 공배양할 수 있다.

본 발명에 의하면 멜라토닌을 처리하여 줄기세포와 함께 배양함으로써 줄기세포 내의 PrP^C의 발현을 증가시킬 수 있으며, 발현된 PrP^C에 의해 항-세포사멸 인자인 BCL2, 세포사멸 인자인 BAX, cleaved-PARP1, cleaved-Caspase3의 발현이 조절되어 산화성 스트레스에 의한 세포사멸을 억제하고 생존율을 증가될 수 있다. 특히 줄기세포 내의 증가된 PrP^C에 의해 대식세포의 면역 활성 조절 인자인 IDO-1의 발현을 증가시켜 줄기세포의 주변 환경의 염증 반응을 감소시키는 면역조절 기능 강화될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 멜라토닌을 포함하는 줄기세포의 증식 촉진 또는 생존율 증가용 조성물을 유효성분으로 함유하는 줄기세포 치료 보조제를 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "줄기세포 치료 보조제"는 당업계에서 일반적으로 사용되는 줄기세포 치료제의 효과를 증진시키기 위하여 보조적으로 사용될 수 있는 제재를 말하며, 본 발명에 의한 보조제를 사용함으로써 줄기세포 치료제의 줄기세포의 증식 촉진, 생존율 향상 및 면역조절 기능 촉진하여 치료제의 효과를 증진시킬 수 있다. 또한, 용어 "세포 치료제"는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아 있는 자가, 동종, 이종 세포를 체외에서 증식 배양 및 선별 등의 여타 방법을 이용하여 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 행위를 통하려 진단 및 치료 또는 예방을 목적으로 사용하는 의약품을 말하며, "줄기세포 치료제"는 상기 세포 치료제의 재료로서 배아줄기세포 또는 성체줄기세포를 이용한 세포 치료제를 의미한다.

상기 줄기세포 치료 보조제는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 인체에 투여될 수 있다. 그 예로 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 같은 비경구 투여할 수 있으나 이제 제한되지는 않는다. 상기 줄기세포 치료 보조제는 또한 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 줄기세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있으며, 이런 담체로 생리학적 식염수를 예로 들 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 예로서, 줄기세포 치료 보조제는 허혈질환 치료를 위한 줄기세포 치료에 사용되는 줄기세포 치료 보조제 일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험 재료 및 방법

본 발명의 실시예에서 사용된 줄기세포는 지방유래 중간엽 줄기세포( American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA))이다. 사용된 중간엽 줄기세포는 세포 표면 마커 CD73 및 CD105를 발현하였으나, CD31은 발현하지 않았으며, 특정 분화배지에서 배양시 지방 형성 및 골 형성 분화가 수행될 수 있다.

멜라토닌을 에탄올에 용해시키고 0.45 ㎛ 기공 필터를 통해 여과-멸균시키고, 사용시까지 4℃에서 5mmol/L 저장 용액으로 저장하였다. 실험에 따라, 중간엽 줄기세포를 37℃에서 12시간 동안 다양한 농도(0, 0.1, 1, 10 또는 100 μmol/L)의 멜라토닌으로 처리하거나, 또는 다양한 시간(0, 6, 12 또는 24시간) 동안 1μmol/L의 멜라토닌으로 처리하였다.

실시예 1. 멜라토닌과 PrP ^C 가 줄기세포의 증식에 미치는 영향

멜라토닌을 처리하지 않는 줄기세포와 멜라토닌을 10^-7 M 내지 10^-4 M(0.1 μmol/L 내지 100 μmol/L) 농도로 줄기세포에 처리한 후에 12시간 배양했을 때 10^-6 M에서 가장 높은 증식률을 보였다(도 1의 (A)). 또한, 도 1의 (B)에서 도시하는 바와 같이 멜라토닌은 6시간, 12시간 또는 24시간 중에 12시간에서 가장 높은 증식률을 보였다.

멜라토닌이 어떠한 경로로 줄기세포에 영향을 미치는지 알아보기 위해, 줄기세포의 멜라토닌 수용체의 mRNA 발현 여부를 실시하였다. 실시예에 사용된 지방유래 중간엽 줄기세포가 멜라토닌 수용체 MT₁과 MT₂ 중에 MT₂의 mRNA의 발현을 증가시켰음을 PCR 실험법을 통해 관찰하였다(도 1의 (C), (D)), 멜라토닌 10^-6 M을 처리한 후 24 시간 동안 시간 종속적으로 MT₂와 PrP^C의 단백질 발현이 증가되는 것을 웨스턴 블랏법을 통해 측정하였다(도 1의 (E), (F)).

또한, 멜라토닌과 PrP^C의 상관관계를 알아보기 위해 실시예에 사용된 지방유래 중간엽 줄기세포에 MT₂를 siRNA를 이용하여 선택적으로 발현을 억제했을 때 MT₂의 단백질 발현과 PrP^C의 발현이 모두 감소하였음을 웨스턴 블랏법을 통해 측정하였다(도 1의 (G), (H)).

멜라토닌이 자극된 PrP^C 생산을 통해 MSC 증식을 증가시키는지 확인하기 위해 단일 세포 증식 분석(single cell expansion assay)으로 증식 능력을 분석하였다(도 1의 (I)). 도 1의 (I)와 (J)에서 도시하는 바와 같이 단일 세포로부터의 세포 증식률을 나타내는 실험을 통해, PRNP siRNA(si-PRNP+멜라토닌)를 이용한 PrP^C의 단백질의 발현을 감소시킨 줄기세포는 멜라토닌 10^-6 M을 10일간 처리했을 때 siRNA를 처리하지 않은 줄기세포에 비해 증식률이 낮았다.

실시예 2. 멜라토닌과 PrP ^C 의 산화성 스트레스에 의한 세포사멸로부터 줄기세포 보호

실시예에 사용된 중간엽 줄기세포에 PRNP siRNA를 처리한 실험군은 멜라토닌(10^-6 M)을 전처리를 하여도 과산화수소(H₂O₂ 10^-3 M)를 처리하였을 때 siRNA를 처리하지 않은 실험군에 비해 산화성 스트레스에 의해 유도된 세포사멸 인자인 BAX, PARP-1, Caspase-3의 활성을 억제하지 못했으며 항 세포사멸 인자인 BCL2의 발현 또한 회복하지 못하였음을 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다(도 2의 (A), (B)). 또한 PI/Anexin Ⅴ 염색을 통한 유세포 분석을 했을 때 PRNP siRNA 처리한 줄기세포는 멜라토닌에 의한 세포사멸을 억제하지 못하였다 (도 2의 (C)).

실시예 3. 멜라토닌과 PrP ^C 에 의한 줄기세포의 항산화 효과

실시예에 사용된 중간엽 줄기세포에 디하이드로에티듐(dihydroethidium; DHE) 염색을 통해 줄기세포 내에 발생한 반응 산소 종(ROS)의 변화를 측정했을 때, 도 2의 (D)와 (E)에 도시된 것과 같이 PRNP siRNA를 처리한 실험군은 멜라토닌을 전처리를 하여도 과산화수소에 의해 발생한 세포 내 ROS를 감소시키지 못하였다.

실시예 4. 멜라토닌과 PrP ^C 가 줄기세포의 면역조절에 미치는 영향

IDO(인돌아민-피롤-2,3-디옥시제나아제)는 염증성 사이토카인의 생산과 면역 세포들의 활성을 조절함으로써 면역 조절에 중요한 역할을 한다. 멜라토닌이 줄기세포의 면역조절 기능에 미치는 영향을 확인하기 위해 실시예에 사용한 중간엽 줄기세포에 멜라토닌을 10^-6 M을 6시간, 12시간, 24시간 동안 처리했을 때 6시간째에 대식세포의 면역조절 인자인 IDO-1과 IDO-2의 단백질 발현이 가장 높았음을 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다(도 3의 (A), (B)). 또한 멜라토닌을 처리했을 때 줄기세포의 IDO의 활성이 증가하였음을 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다(도 3의 (C)). 실시예에 사용된 중간엽 줄기세포에 PRNP siRNA를 처리한 실험군은 멜라토닌을 처리하여도 IDO-1과 IDO-2의 발현을 증가시키지 못하는 것을 웨스턴 블랏법을 통해 측정하여 관찰하였다(도 3의 (D), (E)). 인간 단핵구 세포주 THP-1 세포에 포볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate; PMA)를 10^-7 ng/mL의 농도로 48시간 동안 처리하여 대식세포로 분화시킨 다음 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS) 처리하여 면역반응을 활성화시킨 대식세포와 멜라토닌 전처리 줄기세포와 공배양 했을 때 대식세포의 인터루킨(Interlukin; IL)-10의 발현이 증가하고 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor; TNF)-α의 발현이 감소되어 대식세포의 염증반응이 억제되었으며, PRNP siRNA를 처리한 줄기세포는 멜라토닌을 처리하여도 공배양된 대식세포의 염증 반응을 크게 감소시키지 못하였다(도 3의 (F), (G)). 특히, 멜라토닌 처리된 MSC와 LPS-자극된 대식 세포의 공배양의 항-염증 효과는 멜라토닌 처리된 대식세포보다 유의적으로 높았고, 이것은 항-염증 효과가 멜라토닌의 직접 효과가 아니라, 멜라토닌 처리된 MSC 주변분비 작용(paracrine effect)에 의해 매개된다는 것을 나타낸다. 이러한 항-염증 효과는 또한 PRNP siRNA의 처리함으로써 억제되었다. 이 결과는 IDO-PrP^C 경로를 상향 조절함으로써 멜라토닌이 MSC에서 항-염증 변화를 촉진한다는 것을 시사한다.

실시예 5. 하지 허혈 동물모델에서의 치료효과 검증

5-1. 줄기세포 이식 및 멜라토닌 투약을 통한 허혈 부위 혈류량 변화 측정

실시예에 사용된 중간엽 줄기세포를 하지 허혈 동물모델의 근육내 이식한 후 멜라토닌을 28일간 매일 20 mg/kg 농도로 복강 내 투여한 이후 레이저 도플러(laser doppler)를 이용하여 수술 이후 당일차, 3일차, 7일차, 14일차, 21일차, 28일차에 혈류량을 측정하였다. 도 4의 (A)와 (B)에 도시된 바와 같이, 줄기세포를 이식하지 않은 실험군은 혈류량을 회복하지 못한 반면, 줄기세포 이식후 멜라토닌을 투여 받은 실험군은 혈류량을 회복하였다. 그러나, PRNP siRNA를 처리한 줄기세포를 이식받은 실험군운 혈류량을 전혀 회복하지 못하였다.

5-2. 줄기세포 이식 및 멜라토닌 투약을 통한 하지 치료효과 측정

도 4의 (C)와 (D)에 도시된 바와 같이 실시예에 사용된 중간엽 줄기세포를 하지 허혈 동물모델에 근육내 이식후 멜라토닌을 28일간 매일 20 mg/kg 농도로 복강 내 투여한 이후 수술 28일차에 실험군의 하지 수복 정도는 줄기세포를 이식받지 않고 PBS를 투여받은 실험군은 하지 전체가 괴사하였고, 줄기세포 이식 후 PBS를 투여받은 실험군은 발가락 부위가 괴사하였고, 줄기세포 이식과 멜라토닌을 투여받은 실험군은 하지 부위의 괴사가 없어 치료 효과가 있는 것으로 나타났다. 그러나, PRNP siRNA를 처리한 줄기세포를 이식받은 실험군은 하지 전체가 괴사하여 전혀 치료 효과를 얻지 못하였다.

5-3. 이식된 줄기세포의 혈관 형성 측정

실시예에 사용된 중간엽 줄기세포를 하지 허혈 동물모델에 근육내 이식후 멜라토닌을 28일간 매일 20 mg/kg 농도로 복강 내 투여한 이후 수술 28일차에 허혈 부위 조직을 생검하였다. 생검한 조직을 면역형광염색법을 이용하여 모세혈관 표지자인 CD31를 확인한 결과, 도 5의 (A)와 (B)에 도시된 바와 같이, 줄기세포 이식후 멜라토닌을 투여받은 실험군이 가장 높은 모세혈관 밀도를 보였으며, PRNP siRNA를 처리한 줄기세포를 이식받은 실험군의 모세혈관 밀도는 증가하지 못하였다. 또한 정맥 표지자인 SMA(alpha smooth muscle actin)의 면역형광염색을 통해 정맥의 밀도를 확인한 결과는 도 5의 (C)와 (D)에 도시된 바와 같이, 줄기세포 이식후 멜라토닌을 투여받은 실험군이 가장 높은 정맥 형성 밀도를 보였으며, PRNP siRNA를 처리한 줄기세포를 이식받은 실험군의 정맥 형성은 증가하지 못하였다. 이와 같은 결과는 허혈에 의해 손상된 뒷다리(hind-limb) 조직에서 혈관 수선이 PrP^C 수준의 상향 조절에 의해 멜라토닌으로 자극받은 MSCs에 의해 개선된다는 것을 시사한다.

5-4. 이식된 줄기세포의 생존율 측정

실시예에 사용된 중간엽 줄기세포를 하지 허혈 동물모델에 근육내 주사하고 멜라토닌을 3일간 매일 20 mg/kg 농도로 복강 내 투여한 이후 수술 3일차에 하지 허혈 부위를 생검하였다. 줄기세포 이식 이후 하지 허혈 부위의 세포사멸 활성화의 변화를 확인하기 위해 생검한 조직을 TUNEL 분석을 통해 염색하였다. 줄기세포를 이식한 후 멜라토닌을 투여받은 실험군은 가장 높은 세포사멸 억제 효과가 있었으며, PRNP siRNA를 처리한 줄기세포를 이식받은 실험군은 세포사멸 증가를 막지 못하였다(도 6의 (A) 및 (B)). 또한, 이식된 줄기세포의 생존율을 확인하기 위해(멜라토닌이 이식된 MSCs의 생존에 영향을 미치는지 확인하기 위해), 3일차에 생검한 조직에 인간 유래 세포의 핵을 표지하는 HNA(human nuclear antigen) 항체와 세포사멸 인자인 Caspase-3를 면역형광 염색하여 확인한 결과. 일반 줄기세포 이식과 멜라토닌을 투여받은 실험군의 줄기세포 생존율이 가장 높았다(도 6의 (C) 및 (D)).

5-5. 멜라토닌 투약 이후 하지 허혈 부위의 면역조절 측정

실시예에 사용된 중간엽 줄기세포를 하지 허혈 동물 모델에 근육내 주사하고 이후 멜라토닌을 3일간 매일 20 mg/kg 농도로 복강 내 투여한 이후 수술 3일차에 하지 허혈 부위를 생검하였다. 줄기세포를 이식한 후 하지 허혈 부위의 면역활성화를 확인하기 위해 대식세포를 표지하는 항체를 이용하여 면역형광 염색법을 실시하였다. 그 결과, 일반 줄기세포 이식과 멜라토닌을 투약 받은 실험군이 하지 허혈 주변에 대식세포의 분포가 가장 낮게 나타나, 면역 억제 조절이 가장 높게 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다(도 6의 (E) 및 (F)). 이러한 결과는 중간엽 줄기세포에서 멜라토닌에 의해 매개된 PrP^C의 발현이 허혈성 손상 부위에서의 세포 증식 및 대식세포 모집의 조절에 관여함을 시사한다. 이 메카니즘은 멜라토닌에 의해 촉진된 허혈성 조직에서 이식된 MSCs의 생존을 증가시키는데 중요할 것이다.

Claims (10)

1. 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 인간을 제외한 포유동물의 근육 조직 내에 이식한 후 멜라토닌 처리 하여 상기 줄기세포의 프리온 단백질 발현 조절을 통해 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포의 증식 촉진 또는 생존율을 증가시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 멜라토닌을 10^-10M이상 10^-4M 이하의 농도로 처리하는 것인, 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 방법은 줄기세포 내의 세포사멸인자인 BAX, PARP1 및 Caspase-3의 활성을 억제하고, 면역조절인자인 IDO 효소의 발현을 증가시키는 것인, 방법.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제

Images