KR20150043482A

KR20150043482A - 심근경색의 수복 재생을 유도하는 다능성 간세포

Info

Publication number: KR20150043482A
Application number: KR1020157006629A
Authority: KR
Inventors: 마사노리 요시다; 신야 미나토쿠치; 마리 데자와
Original assignee: 가부시키가이샤 클리오; 도호쿠 다이가쿠; 고꾸리츠 다이가꾸호오징 기후다이가꾸
Priority date: 2012-08-17
Filing date: 2013-08-15
Publication date: 2015-04-22
Also published as: CA2882239C; PL2886123T3; US10639335B2; US20150196600A1; AU2013303492B2; WO2014027684A1; PT2886123T; DK2886123T3; SG10201800829XA; EP3659612A1; ES2767182T3; EP2886123A4; EP2886123A1; CA2882239A1; KR101730052B1; US20180050067A1; US9844570B2; CN104582711B; JP5968442B2; EP3659612B1

Abstract

재생의료에 있어서, 다능성 간세포(Muse 세포)를 이용한 새로운 의료 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는, 심근경색 특히, 중증 대형 심근경색, 그리고 그에 따른 심부전을 치료하기 위한 세포제제를 제공한다. 본 발명의 세포제제는, 상기 질환의 대상에 대하여, Muse 세포를 정맥 투여함으로써 장해 심근조직에 선택적으로 집적시켜서, 그 조직 내에서 Muse 세포가 심근으로 분화한다는 심근조직의 재생 메커니즘에 근거한다.

Description

심근경색의 수복 재생을 유도하는 다능성 간세포{PLURIPOTENT STEM CELL THAT INDUCES REPAIR AND REGENERATION AFTER MYOCARDIAL INFARCTION}

본 발명은 재생의료에서의 세포제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 심근경색에 의해 손상을 받은 심장조직의 수복(修復) 및 재생에 유효한 다능성 간세포를 함유하는 세포제제에 관한 것이다.

관동맥 폐색에 의해 초래되는 심근괴사에 기인한 심근경색은, 급성 심장사 및 만성 심장사를 일으키기 때문에, 임상의학에서 해결해야 할 중요한 과제가 되고 있다. 특히, 급성 심근경색의 경우, 사망율이 35~50%로 높고, 그 사망예의 60~70%가 발증후 1~2시간 이내에 사망하였다. 또한, 급성기를 무사히 지나가도, 첫회 발작에서의 심근괴사 발생부위가 큰 경우, 심근경색이 재발하거나 그에 따른 심부전에 빠질 위험성이 크다. 따라서, 심근경색의 치료에서는 발작이 일어났을 때 신속히 처치해야 하며, 괴사된 심근의 크기 즉, 경색의 사이즈를 가급적 줄이는 것이 중요하다.

예를 들어, 중증 대형 심근경색 등의 심근경색에서는, 좌실 리모델링이 진행되고, 심부전에 빠지기 때문에 생명 예후가 나쁜 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 심근경색에 대해서는 혈전용해 요법이나 혈행 재건술 등의 재개통 요법이 실시되고 있다. 하지만, 재개통에 의한 효과를 얻을 수 없거나, 반대로 재관류(Reperfusion) 장해 등에 의해 심근세포에 손상을 주는 경우도 많아서, 재개통 요법 단독으로는 반드시 만족할 만한 치료 효과를 얻을 수 없었다. 그 때문에, 재개통 요법의 보조 요법으로서 심근 보호 작용을 기대한 약제에 대한 검토가 이루어지고 있는데, 만족할 만한 약제가 아직 발견되지 않았다. 또한, 중증 대형 심근경색의 경우, 괴사한 심근조직을 재생시키고, 좌실 리모델링을 개선할 수 있으면, 예후가 개선된다. 하지만, 상기 질환에 대하여 현시점에서 유효한 내과적 치료법이 존재하지 않는다.

상기와 같이 심근경색의 치료에 있어서, 발작이 일어났을 때 신속한 처치가 필요하지만, 경색의 사이즈를 줄이기 위한 결정적인 치료 방법이 없기 때문에, 괴사된 심근조직의 재생에 대한 대처가 이루어지고 있다. 그 중에서도, 근래 조직 재생에 공헌할 수 있는 생체 유래의 세포가 주목을 받고 있다. 성체(成體)로부터 얻은 분화능을 가진 세포로서, 예를 들어, 뼈, 연골, 지방세포, 신경세포, 골격근 등으로의 분화능을 가지는 골수간엽계 세포의 분획물(cell fraction)(MSC)(비특허문헌 1 및 비특허문헌 2)이 알려져 있는데, 이것은 여러 가지 세포를 포함하는 세포군으로, 그 분화능의 실체가 알려지지 않았고, 치료 효과에 편차가 컸다. 또한, 성체 유래의 다능성 간세포로서 iPS 세포(특허문헌 1 등)가 보고되고 있는데, iPS 세포의 수립에는 간엽계 세포인 피부 선유아세포의 분획물에 특정한 유전자나 특정한 화합물을 체세포에 도입한다는 매우 복잡한 조작이 필요한데다가, iPS 세포가 높은 종양 형성 능력을 가지기 때문에, 임상응용에 대한 매우 높은 장애물을 가지고 있다.

본 발명자들 중 한 사람인 데자와 씨의 연구에 의해, 간엽계 세포의 분획물에 존재하고, 유도조작 없이 얻어지는 SSEA-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3)을 표면 항원으로 하여 발현하는 다능성 간세포(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells; Muse 세포)가 간엽계 세포의 분획물이 가지는 다능성을 담당하고 있어서, 조직 재생을 목적으로 한 질환 치료에 응용할 수 있는 가능성이 있는 것으로 알려져 왔다. 또한, Muse 세포는 간엽계 세포의 분획물을 여러 가지 스트레스로 자극함으로써 농축할 수 있는 것도 알려져 있다(특허문헌 2, 비특허문헌 3). 하지만, 중증 대형 심근경색 등의 심근경색 및 그에 따른 심부전의 예방 및/또는 치료에 Muse 세포를 사용하여 기대할 만한 치료 효과를 얻을 수 있다는 것을 명백히 한 예는 없다.

특허문헌 1: 일본특허공보 제4183742호 특허문헌 2: 국제공개공보 WO2011/007900호

비특허문헌 1: 데자와, M 외, J. Clin. Invest., 113권, p1701-1710 (2004) 비특허문헌 2: 데자와, M 외, Science, 309권, p314-317 (2005) 비특허문헌 3: 와카오, S 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108권, p9875-9880 (2011)

본 발명은 재생의료에 있어서, 다능성 간세포(Muse 세포)를 이용한 새로운 의료 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 Muse 세포를 포함하는 심근경색(특히 중증 대형 심근경색)의 치료, 그리고 그에 따른 심부전의 예방 및/또는 치료를 위한 세포제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 일본 백색종 토끼를 이용하여, 관동맥 허혈(虛血)(30분 동안)에 의해 유도된 심근경색에 대하여 정맥주사로 Muse 세포를 투여함으로써, Muse 세포가 장해 심근조직의 국소에 집적되고, 그 장해 심근조직 내에서 심근세포로 분화되어서 경색 사이즈의 축소 및 심기능 개선 또는 회복을 가져오는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하는데 이르렀다.

즉, 본 발명은 아래와 같다.

[1] 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는 심근경색을 치료하기 위한 세포제제.

[2] 외적 스트레스 자극에 의해 SSEA-3 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포의 분획물을 포함하는 [1]에 기재된 세포제제.

[3] 사람의 중증 대형 심근경색 후의 심부전을 예방 및/또는 치료하기 위한 상기 [1] 및 [2]에 기재된 세포제제.

[4] 상기 다능성 간세포가 CD105 양성인 상기 [1] 내지 [3]에 기재된 세포제제.

[5] 상기 다능성 간세포가 CD117 음성 및 CD146 음성인 상기 [1] 내지 [4]에 기재된 세포제제.

[6] 상기 다능성 간세포가 CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성 및 CD271 음성인 상기 [1] 내지 [5]에 기재된 세포제제.

[7] 상기 다능성 간세포가 CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성 및 Dct 음성인 상기 [1] 내지 [6]에 기재된 세포제제.

[8] 상기 다능성 간세포가 아래의 성질을 모두 가지는 다능성 간세포인 상기 [1] 내지 [7]에 기재된 세포제제:

(i) 텔로머라아제 활성(telomerase activity)이 낮거나 없음;

(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;

(iii) 종양성 증식을 나타내지 않음; 그리고

(iv) 자기재생(self-renewal) 능력을 가짐.

[9] 상기 다능성 간세포가 심근경색 부위에 집적하는 능력을 가지는 상기 [1] 내지 [8]에 기재된 세포제제.

[10] 상기 다능성 간세포가 혈관 내피세포로 분화하는 능력을 가지는 상기 [1] 내지 [9]에 기재된 세포제제.

[11] 상기 다능성 간세포가 심근세포로 분화하는 능력을 가지는 상기 [1] 내지 [9]에 기재된 세포제제.

[12] 허혈후 1개월 이내에 대상이 되는 정맥 또는 관동맥에 상기 다능성 간세포를 치료상 유효량으로서 1×10³세포/개체~ 1×10⁶세포/개체로 1~10회 투여하는 상기 [1] 내지 [11]에 기재된 세포제제.

[13] 비투여 대조와 비교하여 심근경색 사이즈를 축소시키는 상기 [1] 내지 [12]에 기재된 세포제제.

[14] 좌실에서의 경시적인 혈압 변화, 좌실확장 말기직경(LVDd), 구출율(EF), 좌실내경 단축율(FS) 및 좌실수축 말기직경(LVDs)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 심기능 지표를 정상값으로 회복시키는 상기 [1] 내지 [13]에 기재된 세포제제.

본 발명은 심근경색 특히, 중증 대형 심근경색을 앓고 있는 대상에 대하여 Muse 세포를 정맥 등에 투여함으로써, 장해 심근조직에 선택적으로 집적시켜서 그 조직 내에서 Muse 세포가 심근으로 분화한다는 심근조직의 재생 메커니즘에 의해 심근경색 사이즈를 극적으로 축소시킬 수 있다.

도 1은 토끼 심근경색 모델의 경색부위를 포함하는 심장조직의 절편을 나타낸다. 트리페닐테트라졸륨·클로라이드(TTC) 염색법으로 경색부위를 결정하였다. 파선으로 둘러싼 비염색영역이 경색부위이다. 우측 패널은 허혈 30분 후에 재관류하고, 재관류 24시간 후에 Muse 세포를 정맥 투여한, 재관류 14일 후의 조직 절편이다. 좌측 패널은 Muse 세포 대신 생리식염수를 정맥 투여한 조직 절편이다. Muse 세포의 이식에 의해 경색부위가 유의하게 감소되었다.
도 2는 TTC 염색법으로 경색부위를 결정하고, 경색 사이즈를 허혈 영역에 대한 경색영역의 비율(%)로 하여 산출하였다. 좌측은 생리식염수 대조(n=3)에서의 경색 사이즈의 평균값을 나타내고, 우측은 Muse 세포이식군(n=4)에서의 경색 사이즈의 평균값을 나타낸다. Muse 세포의 이식에 의해 경색 사이즈가 유의하게 축소되었다.
도 3은 마손 트리크롬(MT; Masson Trichrome) 염색법에 의해 경색 사이즈의 축소 효과를 조직화학적으로 검토한 결과를 나타낸다. 이 MT 염색법에서는, 생(生)세포로 이루어지는 조직은 빨갛게 염색되고, 한편 교원선유화된 경색영역의 조직은 염색되지 않기 때문에 창백하게 관찰된다. 생리식염수를 투여한 대조군(n=3)과 비교하여 Muse 세포이식군(n=4)에서는 경색영역이 작고, 경색 사이즈가 현저히 감소되었다. 또한, 골수간엽계 세포의 분획물(MSC)을 이식한 조직에서는 경색 사이즈의 감소는 관찰되었지만, Muse 세포이식군과 비교하여 경색 사이즈의 축소 효과는 작았다.
도 4는 심장조직에서 Muse 세포가 심근세포로 분화하는 것을 나타낸다. 경색부위와 비경색부위는 좌측 패널에서의 파선을 경계선으로 하여 구별된다. 로다민·팔로이딘(rhodamine phalloidin) 염색에 의해 심근세포는 적색으로 염색되었다(중앙 패널). 또한, 녹색 형광 단백질(GFP)의 유전자가 렌티 바이러스(lentivirus)를 이용하여 이식 전에 미리 도입된 Muse 세포는, 경색부위에만 존재하는 것을 알 수 있다(우측 패널). 이 2개의 화상을 겹친 화상을 좌측 패널에 나타낸다. 이에 의해, 경색부위에서 적색 및 녹색이 겹쳐지는 세포가 다수 존재하고, 이는 이식된 Muse 세포가 심근세포로 분화하였다는 것을 시사한다.
도 5는 경색부위에 집적한 Muse 세포의 분화 상태를 검토한 결과를 나타낸다. 유약형 심근세포에서 발현하는 것으로 알려져 있는 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(ANP)의 발현 유무를 형광 염색에 의해 검토하였다. 녹색이 GFP 염색(Muse 세포), 적색이 ANP 염색, 그리고 청색이 DAPI 염색(세포핵을 염색함)을 나타낸다. 좌측 패널에서 이 3가지 형광이 복수개의 동일 세포에서 관찰되었기 때문에, 이식된 Muse 세포 중에는 심근세포로 분화하고 있는 세포가 포함되어 있는 것이 시사되었다.
도 6은 Muse 세포 이식후의 심기능에 대하여, 경시적인 혈압 변화(±dp/dt; p: 혈압, t: 시간)를 지표로 하여 검토한 결과를 나타낸다. 상단의 패널은 심장수축기능(+dp/dt)의 측정결과를 나타내고, 하단의 패널은 심장확장기능(-dp/dt)의 측정결과를 나타낸다. 이 결과들은 Muse 세포가 이식된 토끼군이 대조군과 비교하여 심기능이 유의하게 개선된 것을 시사한다.
도 7은 좌실의 흉골 옆 좌실 장축단면의 2D 심장 초음파 화상을 나타낸다. 좌측 패널은 생리식염수를 투여한 토끼(대조)의 좌실의 화상을 나타내고, 우측 패널은 Muse 세포가 이식된 토끼의 좌실의 화상을 나타낸다. 심기능의 지표가 되는 LVDd(좌실확장 말기직경), EF(구출율) 및 FS(좌실내경 단축율)를 이 화상들에 근거하여 측정하였다. Muse 세포 이식군에서는 모든 수치가 정상으로 회복된 것을 나타낸다.
도 8은 마손 트리크롬(MT) 염색법에 의해 경색부위를 결정하고, 경색 사이즈를 좌실에 대한 경색영역의 비율(%)로서 산출하였다. 가로축은 왼쪽부터 각각 생리식염수의 대조(n=10), MSC 세포(골수간엽계 세포의 분획물) 이식군(n=10), Muse 세포 이식군(n=10) 및 비Muse 세포(Muse 세포를 포함하지 않는 MSC세포) 이식군(n=4)에서의 각 경색 사이즈(하얀 동그라미) 및 그것들의 평균값(검은 동그라미)을 나타낸다. 도 2와 마찬가지로, Muse 세포의 이식에 의해 경색 사이즈가 유의하게 축소되었다.
도 9는 도 3과 마찬가지로 마손 트리크롬(MT) 염색법에 의해 경색 사이즈의 축소 효과를 조직화학적으로 검토한 결과를 나타낸다. 도 9는 도 8에 나타낸 결과에 대응하여, 각 이식군의 시료로부터 임의로 1개를 선택한 사진을 나타낸다.
도 10은 경색부위에 집적한 Muse 세포의 분화 상태를 검토한 결과를 나타낸다. 심근의 표지자(marker)로 알려져 있는 트로포닌I의 발현 유무를 도 4와 마찬가지로 하여 형광염색에 의해 검토하였다. 녹색이 GFP 염색(Muse 세포), 적색이 트로포닌I 염색, 그리고 청색이 DAPI 염색(세포핵을 염색함)을 나타낸다. 우측 패널에서 이 3가지 형광이 복수개의 동일 세포에서 관찰되었기 때문에, 이식된 Muse 세포 중에는 심근세포로 분화하고 있는 세포가 포함되어 있는 것이 시사되었다.
도 11은 도 6과 마찬가지로 Muse 세포 이식후의 심기능에 대하여, 경시적인 혈압변화(±dp/dt; p: 혈압, t: 시간)를 지표로 하여 검토한 결과를 나타낸다. +dp/dt는 수축능을 나타내고, -dp/dt는 확장능을 나타낸다. 이 결과들은 Muse 세포가 이식된 토끼군은 대조군, MSC 이식군 및 비MSC 세포이식군과 비교하여 심기능이 유의하게 개선된 것을 시사한다.
도 12는 2D 심장 초음파에 의해 심기능의 지표인 LVDd(좌실확장 말기직경), LVDs(좌실수축 말기직경), EF(구출율) 및 FS(좌실내경 단축율)를 계측하였다. Muse 세포 이식군에서는 모든 수치가 정상으로 회복된 것을 나타낸다.
도 13은 경색부위에 집적한 Muse 세포의 분화 상태를 검토한 결과를 나타낸다. 혈관 내피세포의 표지자로 알려져 있는 CD31의 발현 유무를 검토하였다. Muse 세포를 이식한 조직에서는 다른 이식군과 비교하여 경색부위에서 CD31 양성의 미소혈관밀도가 높았기 때문에, 이식된 Muse 세포가 경색부위에서 혈관 내피세포로 분화될 가능성이 시사된다. 도면의 세로축은 고배율시야(HPF)에서의 미소혈관수를 나타낸다.

본 발명은 SSEA-3 양성의 다능성 간세포(Muse 세포)를 포함하는 심근경색을 치료하기 위한 세포제제에 관한 것이다. 본 발명을 아래에 상세히 설명한다.

1. 적용 질환

본 발명은 SSEA-3 양성의 다능성 간세포(Muse 세포)를 포함하는 세포제제를 이용하여, 심근경색 특히, 중증 대형 심근경색 및 그에 따른 심부전을 치료하는 것을 목적으로 한다. 여기서, '심근경색'이란, 관동맥의 폐색에 의해 야기되는 심근괴사를 말한다. 또한, '심부전'이란, 충분한 양의 혈류를 밀어내는 심기능의 부전에 따른 증후군을 말하고, 심박출량의 저하와 그에 따른 정맥압의 증대, 또한 그 결과로서 발생하는 여러 가지 임상증상이 포함된다. 심근경색은 급성 심장사 및 만성 심장사를 일으키는 원인이 된다. 특히, 급성 심근경색의 경우, 사망율이 35~50%로 높고, 그 사망예의 60~70%가 발증후 1~2시간 이내에 사망하였다. 또한, 급성기를 무사히 지나가도, 초기 발작에서의 심근괴사 발생부위가 큰 경우, 심근경색이 재발할 위험성이 높다. 따라서, 심근경색의 치료에서는, 발작이 일어났을 때 신속하게 처치해야 하며, 괴사한 심근의 크기 즉, 경색 사이즈를 가급적 줄이는 것이 중요하다. 또한, 심근경색의 중증도 판정에는 여러 가지 분류가 있다. 그와 같은 분류로는, 예를 들어, 시간적 경과에 따른 분류, 형태학적 분류(심근층내 범위, 부위, 괴사 크기 등), 심근의 괴사형태, 경색후의 심실재구축, 혈행동태적 분류(치료, 예후 등과 관련됨), 임상적 중증도에 따른 분류 등을 들 수 있다. 여기서, 중증도가 높고, 보다 광범위하게 심근괴사에 빠진 심근경색을 특히 '중증 대형 심근경색'이라고 한다. 예를 들어, 좌관동맥과 가까운 부위의 완전 폐색을 들 수 있다. 또한, 중증 대형 심근경색에서는 심근의 좌실 리모델링이 진행되어 심부전에 빠지기 때문에, 생명 예후가 나쁜 것으로 알려져 있다. 여기서, 심근경색후의 '좌실 리모델링'이란, 심근경색후에 발생하는 경색부위의 비박화(rarefaction)에 따른 심기능 저하의 대가로서 일어나는 비경색부위의 심근세포의 비대, 간질(세포외 매트릭스)의 증가, 심내강(cardiac lumen) 확대 등의 일련의 변화를 가리킨다. 심근경색후의 장기 예후는 좌실 기능부전의 정도와 관련되기 때문에, 좌실 리모델링을 억제하는 것은 좌실의 기능을 유지 및 보존하기 위하여 불가결하다.

일반적으로, 발증 6시간 이내의 심근경색의 경우, 폐색한 관동맥의 재관류 요법을 적극적으로 실시함으로써 심근의 괴사범위를 축소하는 것이 가능하다. 이 치료법으로 한정되지 않고, 발증으로부터 24시간 이내의 병증의 예에서는 재관류 요법의 실시 의의를 높게 본다. 급성기의 경우, 카테터(catheter)를 이용한 관동맥 질환의 치료가 이루어지는 경우가 많다. 이에 대하여, 본 발명의 세포제제는 재관류하기까지 걸린 시간이 매우 길었던 경우, 또는 재관류 및 카테터 요법으로 잘 되지 않았을 경우를 치료대상으로 할 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면, 좌실 리모델링에 기인한 심부전에 빠지는 것을 예방하는 것을 포함하여, 심근조직 재생에 근거한 심근경색의 치료를 목적으로 한 Muse 세포를 포함하는 세포제제가 제공된다.

2. 세포제제

(1) 다능성 간세포(Muse 세포)

본 발명의 세포제제에 사용되는 다능성 간세포는, 본 발명자 중 한 사람인 데자와 씨가 사람 생체 내에서 그 존재를 발견하고, 'Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring) 세포'라고 명명한 세포이다. Muse 세포는 골수액이나 진피 결합조직 등의 피부조직에서 얻을 수 있으며, 각 장기의 결합조직에도 산재해 있다. 또한, 이 세포는 다능성 간세포와 간엽계 간세포 모두의 성질을 가지는 세포이며, 예를 들어, 각각의 세포 표면 표지자인 'SSEA-3(Stage-specific embryonic antigen-3'과 'CD105'의 더블 양성으로서 동정(同定)된다. 따라서, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 예를 들어, 이들의 항원 표지자를 지표로 하여 생체조직으로부터 분리할 수 있다. 또한, Muse 세포는 스트레스 내성을 가지며, 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 여러 가지 스트레스 자극에 의해 농축할 수 있다. 본 발명의 세포제제에는 스트레스 자극에 의해 Muse 세포가 농축된 세포의 분획물을 사용할 수도 있다. Muse 세포의 분리법, 동정법, 농축법 및 특징 등에 관한 자세한 내용은 국제공개공보 WO2011/007900호에 개시되어 있다. 또한, 와카오 씨 등(2011, 상술)에 의해 보고된 바와 같이, 골수, 피부 등의 간엽계 세포를 배양하여 얻은 것을 Muse 세포의 모집단으로 사용하는 경우, SSEA-3 양성 세포 모두가 CD105 양성 세포인 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서의 세포제제에서는, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 Muse 세포를 분리하는 경우, 단지 SSEA-3을 항원 표지자로 하여 Muse 세포를 정제하여 사용할 수 있다. 한편, 본 명세서에서는 심근경색을 치료하기 위한 세포제제에서 사용될 수 있는, SSEA-3을 항원 표지자로 하여 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 조직으로부터 분리된 다능성 간세포(Muse 세포) 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단을 단순히 'SSEA-3 양성 세포'라고 기재하는 경우가 있다.

간단히 말하면, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은, 세포 표면 표지자인 SSEA-3에 대한 항체를 단독으로 이용하여, 또는 SSEA-3 및 CD105에 대한 각각의 항체를 이용하여, 생체조직(예를 들어, 간엽계 조직)으로부터 분리할 수 있다. 여기서, '생체'란, 포유동물의 생체를 말한다. 본 발명에서의 생체에는 수정란이나 포배기보다 발생단계가 앞인 배자는 포함되지 않지만, 태아나 포배(胞胚)를 포함하는 포배기 이후의 발생단계인 배자는 포함된다. 포유동물으로는, 한정되지는 않지만, 사람, 원숭이 등의 영장류, 생쥐, 쥐, 토끼, 기니피그 등의 설치류, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 당나귀, 염소, 흰족제비 등을 들 수 있다. 본 발명의 세포제제에 사용되는 Muse 세포는, 생체조직 유래라는 점에서 배아줄기세포(ES 세포)나 배아 생식줄기세포(EG 세포)와 명확하게 구별된다. 또한, '간엽계 조직'이란, 뼈, 연골, 지방, 혈액, 골수, 골격근, 진피, 인대, 힘줄, 심장 등의 조직 및 그것들의 결합조직을 말한다. 예를 들어, Muse 세포는 골수나 피부로부터 얻을 수 있다. 또한, 본 발명은 심근 재생을 목적으로 하는 세포제제를 제공하는 것을 목적으로 하며, 예를 들어, 생체의 간엽계 세포를 채취하고, 이 조직으로부터 Muse 세포를 분리하여 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 분리수단을 이용하여 배양간엽계 세포로부터 Muse 세포를 분리하여도 좋다. 한편, 본 발명의 세포제제에서는, 사용되는 Muse 세포가 세포이식을 받은 수혜자에 대하여 자가(自家)이어도 되고, 또는 타가(他家)이어도 된다.

상기와 같이 Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은, 예를 들어, SSEA-3 양성 및 CD 105 양성을 지표로 하여 생체조직으로부터 분리할 수 있는데, 사람 성인 피부에는 여러 가지 타입의 간세포 및 전구세포가 포함되어 있는 것이 알려져 있다. 하지만, Muse 세포는 이 세포들과 같지 않다. 이와 같은 간세포 및 전구세포에는 피부유래 전구세포(SKP), 신경능(neural crest) 간세포(NCSC), 멜라노 블라스트(MB; Melanoblast), 혈관 주위세포(PC), 내피 전구세포(EP), 지방유래간세포(ADSC)를 들 수 있다. 이 세포들에 고유 표지자의 '비발현'을 지표로 하여 Muse 세포를 분리할 수 있다. 보다 구체적으로는, Muse 세포는 CD34(EP 및 ADSC의 표지자), CD117(c-kit)(MB의 표지자), CD146(PC 및 ADSC의 표지자), CD271(NGFR)(NCSC의 표지자), NG2(PC의 표지자), vWF 인자(폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자)(EP의 표지자), Sox10(NCSC의 표지자), Snai1(SKP의 표지자), Slug(SKP의 표지자), Tyrp1(MB의 표지자) 및 Dct(MB의 표지자)로 이루어지는 군에서 선택되는 11개의 표지자 중 적어도 1개, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 및 11개의 표지자의 비발현을 지표로 분리할 수 있다. 예를 들어, 한정되지는 않지만, CD117 및 CD146의 비발현을 지표로 분리할 수 있으며, 또한 CD117, CD146, NG2, CD34, vWF 및 CD271의 비발현을 지표로 분리할 수 있고, 더욱이 상기 11개의 표지자의 비발현을 지표로 분리할 수 있다.

또한, 본 발명의 세포제제에 사용되는 상기 특징을 가지는 Muse 세포는 이하:

(i) 텔로머라아제 활성이 낮거나 없음;

(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;

(iii) 종양성 증식을 나타내지 않음; 그리고

(iv) 자기재생(self-renewal) 능력을 가짐.

으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 성질을 가져도 된다. 본 발명의 한 형태에서는, 본 발명의 세포제제에 사용되는 Muse 세포가 상기 성질을 모두 가진다. 여기서, 상기 (i)에 관하여, '텔로머라아제 활성이 낮거나 없음'이란, 예를 들어, TRAPEZE XL 텔로머라아제 검출 키트(Millipore사 제조)를 이용하여 텔로머라아제 활성을 검토하였을 경우, 낮거나 또는 검출되지 않았다는 것을 말한다. 텔로머라아제 활성이 '낮다'는 것은, 예를 들어, 사람 선유아세포와 같은 정도의 텔로머라아제 활성을 가지고 있거나, 또는 Hela 세포와 비교하여 1/5 이하, 바람직하게는 1/10 이하의 텔로머라아제 활성을 가지고 있는 것을 말한다. 상기 (ii)에 관하여, Muse 세포는 생체 밖(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 삼배엽(내배엽계, 중배엽계 및 외배엽계)으로 분화하는 능력을 가지고, 예를 들어, 생체 밖에서 유도 배양함으로써 피부, 간, 신경, 근육, 뼈, 지방 등으로 분화할 수 있다. 또한, 생체 내에서 정소에 이식하였을 경우에도 삼배엽으로 분화하는 능력을 나타내는 경우가 있다. 더욱이, 정맥주사에 의해 생체에 이식함으로써 손상을 받은 장기(심장, 피부, 척수, 간, 근육 등)로 이동 및 생착하여, 분화하는 능력을 말한다. 상기 (iii)에 관하여, Muse 세포는 부유배양으로 증식속도 약 1.3일에 증식하는데, 10일 정도에 증식이 멈추는 성질을 가지고, 또한 정소에 이식하였을 경우, 적어도 반년 동안은 암(癌)화되지 않는다는 성질을 가진다. 또한, 상기 (iv)에 관하여, Muse 세포는 자기재생(자기복제) 능력을 가진다. 여기서, '자기재생'이란, Muse 세포를 부유배양함으로써 얻어지는 배양체 유사세포 덩어리에 포함되는 세포를 배양하여, 다시 배양체 유사세포 덩어리를 형성시키는 것을 말한다. 자기재생은 1회 또는 여러번의 사이클을 반복하게 하면 좋다.

또한, 본 발명의 세포제제에 사용되는 Muse 세포를 포함하는 세포의 분획물은, 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포에 외적 스트레스 자극을 주어, 그 외적 스트레스에 내성인 세포 이외의 세포를 사멸시키고, 살아남은 세포를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 아래의 성질 모두를 가지는, SSEA-3 양성 및 CD105 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포의 분획물이어도 된다.

(i) SSEA-3 양성;

(ii) CD105 양성;

(iii) 텔로머라아제 활성이 낮거나 없음;

(iv) 삼배엽으로 분화하는 능력을 가짐;

(v) 종양성 증식을 나타내지 않음; 그리고

(vi) 자기재생 능력을 가짐.

상기 외적 스트레스는 프로테아제 처리, 저산소 농도에서의 배양, 저인산 조건하에서의 배양, 저혈청 농도에서의 배양, 저영양 조건에서의 배양, 열쇼크 노출하에서의 배양, 저온에서의 배양, 동결 처리, 유해물질 존재하에서의 배양, 활성산소 존재하에서의 배양, 기계적 자극하에서의 배양, 진동 처리하에서의 배양, 압력 처리하에서의 배양 또는 물리적 충격 중 어느 하나 또는 복수개의 조합이어도 된다.

상기 프로테아제에 의한 처리시간은 세포에 외적 스트레스를 주기 위하여 총 0.5~36시간 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 프로테아제 농도는 배양용기에 접착한 세포를 벗길 때, 세포 덩어리를 단일 세포로 해체할 때, 또는 조직으로부터 단일 세포를 회수할 때 사용되는 농도이면 된다.

상기 프로테아제는 세린 프로테아제, 아스파라긴산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 금속 프로테아제, 글루타민산 프로테아제 또는 N 말단 트레오닌 프로테아제인 것이 바람직하다. 더욱이, 상기 프로테아제가 트립신, 교원질 분해효소(collagenase) 또는 디스파제(dispase)인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 세포제제에 사용되는 상기 특징을 가지는 Muse 세포는, 후술하는 바와 같이, 정맥 투여한 후에 장해 심근조직(심근경색 부위)에 집적하여, 그 조직 내에서 심근세포로 분화함으로써 경색 사이즈를 줄이고, 더욱이 심기능을 개선 또는 정상으로 회복시킬 수 있다(실시예 2 ~ 실시예 4).

(2) 세포제제의 조제 및 사용

본 발명의 세포제제는, 한정되지는 않지만, 상기 (1)에서 얻어진 Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단을 생리식염수나 적절한 완충액(예를 들어, 인산완충 생리식염수)으로 현탁시킴으로써 얻어진다. 이 경우, 자가 또는 타가의 조직으로부터 분리된 Muse 세포수가 적은 경우에는, 세포 이식전에 세포를 배양하여, 소정의 세포농도가 얻어질 때까지 증식시켜도 된다. 한편, 이미 보고된 바와 같이(국제공개공보 WO2011/007900), Muse 세포는 종양화되지 않기 때문에, 생체조직으로부터 회수한 세포가 미분화한 채로 포함되어 있어도 암화할 가능성이 낮아서 안전하다. 또한, 회수한 Muse 세포의 배양은, 특별히 한정되지는 않지만, 통상의 증식배지(예를 들어, 10% 송아지 혈청을 포함하는 α-최소필수배지(α-MEM))에서 실시할 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 국제공개공보 WO2011/007900를 참조하여, Muse 세포의 배양 및 증식에 있어서 적절히 배지, 첨가물(예를 들어, 항생물질, 혈청) 등을 선택하여, 소정 농도의 Muse 세포를 포함하는 용액을 조제할 수 있다. 사람의 심근경색 대상에 본 발명의 세포제제를 투여하는 경우, 사람의 엉덩이뼈에서 수 ml 정도의 골수액을 채취하고, 예를 들어, Muse 세포를 SSEA-3의 항원 표지자를 지표로 하여 분리한 후, 유효한 치료량에 도달할 때까지 세포를 적절한 시간(예를 들어, 2~3주 동안) 배양하여 늘린 후, 자가의 Muse 세포를 세포제제로서 조제할 수 있다.

또한, Muse 세포를 세포제제로 사용하는데 있어서, 이 세포를 보호하기 위하여 디메틸술폭시드(DMSO)나 혈청 알부민 등을, 세균의 혼입 및 증식을 막기 위하여 항생물질 등을 세포제제에 함유시켜도 된다. 더욱이, 제제상 허용되는 다른 성분(예를 들어, 담체, 부형제, 붕괴제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리식염수 등)이나 간엽계 간세포에 포함되는 Muse 세포 이외의 세포 또는 성분을 세포제제에 함유시켜도 된다. 당업자는 이 인자 및 약제들을 적절한 농도로 세포제제에 첨가할 수 있다. 이와 같이 Muse 세포는 각종 첨가물을 포함하는 의약조성물로서 사용하는 것도 가능하다.

상기에서 조제되는 세포제제 안에 함유되는 Muse 세포의 개수는, 심근경색의 치료에 있어서 원하는 효과(예를 들어, 경색 사이즈의 감소, 심기능의 개선)를 얻을 수 있도록, 대상의 성별, 연령, 체중, 환부의 상태, 사용하는 세포의 상태 등을 고려하여 적절히 조정할 수 있다. 후술하는 실시예 1 내지 실시예 4에서는, 토끼 심근경색 모델을 만들어서 Muse 세포 이식에 의한 각종 효과를 검토하였는데, 약 2~3kg의 일본 백색종 토끼에 대해서는 SSEA3 양성 세포를 5×10⁵세포/마리 투여함으로써 매우 뛰어난 효과를 얻을 수 있었다. 이 결과로부터 포유동물 1개체당 1.7~2.5×10⁵ 세포/kg을 체중 환산한 세포량을 투여함으로써 뛰어난 효과가 얻어지는 것이 기대된다. 한편, 혈관으로의 세포 투여에 의해 발생하는 폐색을 막기 위하여, 1회 투여분의 양으로서 예를 들어, SSEA-3 양성 세포를 1×10⁶ 세포/개체 이하로 세포제제에 함유시켜도 된다. 여기서, 개체는 토끼, 사람을 포함하는데, 이것으로 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명의 세포제제는 원하는 치료효과가 얻어질 때까지 여러 번(예를 들어, 2~10회), 적절히 간격(예를 들어, 1일에 2회, 1일에 1회, 1주일에 2회, 1주일에 1회, 2주일에 1회)을 두고 투여하여도 된다. 따라서, 대상의 상태에 따라 다르지만, 치료상 유효량으로는 예를 들어, 1개체당 1×10³ 세포~ 1×10⁶ 세포로 1~10회의 투여량이 바람직하다. 한 개체에 대한 투여총량은, 한정되지는 않지만, 1×10³ 세포~ 1×10⁷ 세포, 1×10⁴ 세포~ 5×10⁶ 세포, 2×10⁴ 세포~ 2×10⁶ 세포, 5×10⁴ 세포~ 1×10⁶ 세포 등을 들 수 있다.

본 발명의 세포제제에 사용되는 Muse 세포는 상기와 같이 심근경색 부위에 집적하는 성질을 가진다. 따라서, 세포제제의 투여에 있어서, 세포제제의 투여부위, 투여되는 혈관의 종류(정맥 및 동맥)는 한정되지 않는다. 투여에 적합한 정맥으로는 이정맥, 경정맥을 들 수 있는데, 이것으로 한정되지 않는다. 사람의 경우, 팔꿈치 정맥이 바람직하다. 또한, 투여에 적합한 동맥으로는, 한정되지는 않지만, 관동맥이 바람직하다. 하지만, 세포 수송 효율, 대상의 시술후의 조기회복 등을 고려하면, 경피적으로 심장 카테터를 삽입하여, 경색부위의 관동맥에 세포제제를 직접투여하는 것이 바람직하다. 심장 카테터의 천자 부위는, 한정되지는 않지만, 손목(요골 동맥), 팔꿈치(상완 동맥) 및 서혜부(대퇴 동맥)를 들 수 있다.

본 발명의 세포제제는 중증 대형 심근경색 등의 심근경색을 치료 대상으로 하는데, 투여 시기는 허혈후 수시간에서 수주 동안의 범위가 상정된다. 따라서, 본 발명의 세포제제의 투여시기는, 한정되지는 않지만, 허혈후 늦어도 1개월 이내가 바람직하다. 보다 바람직하게는 14일 이내, 더욱 바람직하게는 7일 이내, 보다 더욱 바람직하게는 72시간 이내, 한층 바람직하게는 48시간 이내, 더한층 바람직하게는 24시간 이내, 보다 더한층 바람직하게는 12시간 이내, 가장 바람직하게는 6시간 이내이다. 본 발명에 따르면, 재관류하기까지 걸린 시간이 매우 길었던 경우, 또는 재관류 및 카테터 요법으로 잘 되지 않았던 경우를 치료대상으로 할 수 있기 때문에, 심근경색의 치료에 매우 유용하다. 또한, 사용되는 Muse 세포는 타가 유래인 경우에도 면역응답을 야기하지 않는 것이 본 발명자들의 실험에서 확인되었기 때문에, 투여 횟수는 특별히 한정되지 않고, 심근경색의 치료에서 원하는 효과가 얻어질 때까지 적절히 투여되어도 된다.

본 발명의 실시예에서는 본 발명의 세포제제를 투여함으로써 심근경색 대상에서 경색 사이즈를 감소시킬 수 있었다. 여기서, 본 명세서에서 사용할 때, '경색 사이즈'란, 허혈 영역에 대한 경색영역의 비율(%)로서 정의된다. 여기서, 허혈 영역은 에반스 블루(Evans Blue) 염색법을 사용하여 결정되며, 이 색소에 의해 비허혈영역이 염색된다. 한편, 경색영역은 트리페닐테트라졸륨·클로라이드(TTC) 염색법을 이용하여 결정되었다. 또한, 본 발명의 세포제제에 의한 경색 사이즈의 축소 효과를 검토하는 경우, 대조의 경색 사이즈에 대한 축소율(즉, (대조의 경색 사이즈- 세포이식후의 경색 사이즈)/대조의 경색 사이즈×100)을 이용하는 것이 유용하다. 본 발명에 따르면, 세포제제의 비투여군(대조)에 대하여, 경색 사이즈가 100% 축소하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 10~90% 축소, 보다 더욱 바람직하게는 20~70% 축소, 더한층 바람직하게는 30~50% 축소이다. 한편, 후술하는 실시예 2에 나타내는 바와 같이, 토끼 심근경색 모델을 이용하였을 경우, 대조군에서는 경색 사이즈가 평균 30.4%이었던데 대하여, Muse 세포이식군에서는 경색 사이즈가 평균 18.2%였다. 이 수치들로부터 Muse 세포 이식에 의해 경색 사이즈를 (30.4-18.2)/30.4×100= 약 40% 축소할 수 있는 것을 알 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 본 발명의 세포제제가 심근경색후의 심기능을 개선 또는 정상(또는 정상치)으로 회복시킬 수 있었다. 본 명세서에서 사용할 때, 심기능의 '개선'이란, 심근경색에 따른 각종 증상의 완화 및 진행의 억제를 의미하고, 바람직하게는 일상생활에 지장을 주지 않을 정도까지 증상을 완화시키는 것을 의미한다. 또한, 심기능을 '정상으로 회복한다'란, 심근경색에 기인한 모든 증상이 심근경색전의 상태로 되돌아가는 것을 의미한다. 한편, 본 발명의 일형태에서는 본 발명의 세포제제를 심근경색후의 (만성)심부전의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다.

여기서, 심근기능을 평가하는 지표로는, 한정되지는 않지만, 일반적인 것으로서, 좌실의 경시적인 혈압변화(±dp/dt; p:혈압, t:시간), 좌실확장 말기직경(Left Ventricular end-Diastolic dimension; LVDd), 구출율(Ejection Fraction; EF), 좌실내경 단축율(Fractional Shortening; FS) 및 좌실수축 말기직경(Left Ventricular end-Sytolic dimension; LVDs)을 들 수 있다. 본 발명의 세포제제에 따른 심기능의 개선 또는 회복은, 상기 5가지 지표 중 적어도 하나를 이용하여 판단할 수 있다. 예를 들어, 실시예 4에 기재된 바와 같이, 좌실의 경시적인 혈압변화(±dp/dt)에 관해서는, +dp/dt는 심장수축기능을 나타내고, -dp/dt는 좌실의 심장확장기능을 나타내는데, 2가지 측정값으로부터 세포이식군에서는 대조군과 비교하여 심기능이 유의하게 개선되고 있는 것을 알 수 있다(도 6 및 도 11). 더욱이, 2D 심장초음파 검사 결과로부터, LVDd에 대해서는 대조군에서는 LVDd의 증대가 보였지만, Muse 세포이식군에서는 LVDd의 증대가 관찰되지 않고 정상 범위내에 있었다(도 7 및 도 12). 이어서, 심장수축기능의 지표 중 하나인 구출율(EF)은 사람에서는 55% 이상을 정상이라고 하는데, 토끼 심근경색 모델의 Muse 세포이식군에서 60.9%(도 7) 및 평균 59.3%(n=10)(도 12)였기 때문에 정상으로 회복된 것을 시사한다. 또한, EF와 마찬가지로, 심장수축기능의 지표 중 하나인 좌실내경 단축율(FS)도 Muse 세포가 이식된 토끼에서는 30.4%(도 7) 및 평균 30.0%(n=10)(도 12)였다. 이 FS는 사람에서의 정상값이 30~50%라고 되어 있기 때문에, 이 토끼 심근경색 모델에서도 정상으로 회복된 것을 시사한다.

아래의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이 실시예들에 의해 전혀 한정되지 않는다.

실시예

실시예 1: 토끼 심근경색 모델의 제작

본 실시예에서의 토끼를 이용한 실험 프로토콜은, 일본 기후 대학의 동물실험에 관한 윤리위원회에서 승인받은 것으로, 미국 국립위생연구소(NIH)에서 간행된 '실험동물의 관리와 사용에 관한 지침'(1996년 개정판)에 따라 실시되었다. 구체적으로는 아래와 같다. 먼저, 일본 백색종 토끼(약 2~3kg/마리)를 30mg/kg 펜토바르비탈 나트륨을 이용하여 마취시켰다. 토끼의 동맥 가스 분석을 연속적으로 실시하여, 동맥 가스를 생리학적 범위로 유지시키도록 환기조건을 적절히 조정하였다. 좌경동맥 및 경정맥에 캐뉼러를 삽입하고, 동맥압을 감시하였다. 3번째 늑간격에서 좌개흉한 후, 심장을 노출시키고, 좌실의 외측 앞면의 중앙을 하행하는 대관동맥 가지 아래에서 4-0 견사로 매듭을 지었다. 봉합실의 양끝에 가는 비닐튜브를 통과시켜서, 그 봉합실을 당김으로써 관동맥 가지를 폐색하였다. 이어서, 모스키토 지혈 겸자를 이용하여 이 튜브를 클램프함으로써 고정하였다. 심근허혈은 국소적 청색증(cyanosis) 및 심전도의 변화에 의해 확인하였다. 폐색(허혈) 시간은 적절히 조정된다. 봉합실을 개방한 후, 위험 영역 전체에서의 심근의 적색 변화에 의해 확인하였다(야스다 외, Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol., 296:H1558-1565, 2009wo를 참조).

실시예 2: Muse 세포이식에 의한 심근경색 사이즈의 축소 효과

(1) Muse 세포의 조제

토끼(약 2~3kg/마리)로부터 골수세포를 회수하고, SSEA-3 양성 세포(Muse 세포)를 FACS를 이용하여 분리하였다. 보다 구체적으로는, 사람 Muse 세포의 분리 및 동정에 관한 국제공개공보 WO2011/007900에 기재된 방법에 준하여 실시하였다. 한편, 이식에 사용되는 Muse 세포는, 심근경색을 발증시킨 토끼 개체의 골수세포에서 유래하는 것으로, 골수에서 접착성을 가지는 간엽계 세포를 배양하고, 증식을 거쳐서 렌티 바이러스-GFP를 세포에 도입하였다. GFP로 표식된 Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단을 GFP와 SSEA-3의 2중 양성 세포로서 FACS로 분리하였다. 그 후, 소정의 농도로 조정하고, 정맥 주사로 심근경색을 가진 동일 개체의 토끼로 되돌려 놓았다. 한편, 상기와 같이 골수세포 등의 간엽계 세포를 배양하여 얻은 것을 Muse 세포의 모집단으로서 사용하는 경우, 와카오 외(2011, 상술)에 의해 보고된 바와 같이 SSEA-3 양성 세포는 모두 CD105 양성 세포인 것이 알려져 있다.

(2) Muse 세포 이식에 의한 경색 사이즈의 축소 효과

토끼에서 결찰에 의한 경색(허혈) 시간을 30분 동안(사람으로는 허혈 3시간에 대응함)으로 하고, 그 후 봉합실을 개방하여 재관류를 개시하였다. 재관류 24시간 후, 상기 (1)에서 얻은 후에 생리식염수로 농도 조정한 SSEA-3 양성 세포(5×10⁵ 세포)를 토끼의 이정맥에 투여하였다. 또한, 비교 대조로서 골수간엽계 세포의 분획물(MSC)(5×10⁵ 세포) 및 생리식염수를 각각 다른 토끼에 투여하고 재관류시켰다. 재관류 14일후에 Muse 세포에 의한 경색 사이즈의 축소 효과를 비교 검토하였다.

보다 구체적으로는, 재관류 14일후의 토끼를 헤파린(heparin)(500U/kg) 처리하고, 과잉량의 펜토바르비탈(pentobarbital)을 정맥 주사함으로써 안락사시켰다. 심장을 적출하고, 심근조직에서의 경색영역에 대하여 트리페닐테트라졸륨·클로라이드(TTC) 염색법으로 결정하였다. 비염색 영역이 경색부위가 된다. 한편, 허혈영역에 대해서는 에반스 블루 색소(4%; Sigma Chemical, 미주리주 세인트루이스)를 대동맥에 80mmHg 주사하여 허혈영역을 결정하였다. 이 색소에 의해, 허혈에 빠지지 않은 조직이 청색으로 염색되고, 허혈영역은 이 색소가 모세혈관에 의해 운반되지 않기 때문에 백색이 된다.

방실고리(atrioventricular ring)가 얻어지도록 좌실을 절단하여 총 7개의 조직 절편을 얻었다. 각 조직을 계량한 후 1% TTC 용액 중, 37℃에서 인큐베이트한 후, 경색영역을 시각화하여 촬상하였다(Fishbein 외, Am.Heart J., 101, 593~600, 1981을 참조). 결과를 도 1에 나타낸다. 도면에서 좌측 패널은 대조로서 생리식염수를 투여한 방실고리를 나타내고, 우측 패널은 Muse 세포 이식을 한 방실고리를 나타낸다. 이 조직 절편들에서 백색 파선으로 둘러싸인 영역(심근의 일부와 유두근)은 TTC에 의해 염색되지 않은 경색부위를 나타낸다. Muse 세포 이식이 이루어진 조직 절편에서는, 대조와 마찬가지로 경색부위는 관찰되었지만, 대조와 비교하여 그 영역이 매우 좁은 것을 알 수 있다.

더욱이, 경색 사이즈는 허혈영역에 대한 경색영역의 비율(%)로서 산출되었다(도 2). 대조군(n=3)에서는 경색 사이즈가 30.4%인데, Muse 세포 이식(n=4) 후의 경색 사이즈는 18.2%로, Muse 세포에 의해 경색 사이즈가 현저히 축소된 것을 알 수 있다. 이러한 효과를 축소율로 계산하면, Muse 세포가 경색 사이즈를 약 40% 축소시킬 수 있었다. 더욱이, 피검체수를 늘려서 같은 시험을 하였다(도 8). 경색 사이즈의 평균값은 생리식염수에 의한 대조(n=10)에서는 27.0%이고, MSC 세포(골수간엽계 세포의 분획물) 이식군(n=10)에서는 21.0%이며, Muse 세포 이식군(n=10)에서는 13.9%이고, 그리고 비Muse 세포(Muse 세포를 포함하지 않는 MSC 세포) 이식군(n=14)에서는 22.8%였다. 이 결과로부터도 경색 사이즈의 축소에 있어서 Muse 세포의 효과가 큰 것을 알 수 있다.

또한, 마손 트리크롬 염색에 의해 경색 사이즈의 축소 효과를 조직화학적으로 검토하였다. 상기 적출한 심장을 10% 포르말린액 안에 고정시키고, 파라핀 포매(embedding)한 후, 방실고리가 얻어지도록 각 표본으로부터 횡단면 방향으로 절편을 제작하였다. 그 후, 보통의 방법에 따라 마손 트리크롬(MT) 염색을 하여 심근경색영역을 시각화하였다(도 3 및 도 9). 이 MT 염색에서는 생세포로 이루어지는 조직은 빨갛게 염색되고, 한편 교원선유화된 조직은 창백하게 색이 빠진 것처럼 관찰되었다. 생리식염수를 투여한 대조군에서는 MT에 염색되지 않은 교원선유화된 조직(경색부위)이 펼쳐져 있다. 한편, Muse 세포를 이식한 토끼군의 좌실 조직은 대조와 비교하여 창백한 부분이 작고, 경색 사이즈가 감소한 것을 알 수 있다. 또한, 특징적으로 유두근에 대해서도 경색에서 회복된 것이 관찰되었다. 한편, 비교대조로서 MSC 세포를 이식한 토끼의 좌실 조직은 생리식염수를 투여한 대조와 비교하면 경색 사이즈의 감소는 관찰되었지만, Muse 세포 이식군과 비교하여 경색 사이즈의 축소 효과는 작았다. 또한, Muse 세포 이식에서 관찰된 유두근의 회복은 MSC 세포를 이식한 조직에서는 보이지 않았다.

실시예 3: 심장조직에서의 Muse 세포의 분화

실시예 2에서 관찰된 Muse 세포에 의한 경색 사이즈의 감소가 Muse 세포에 의한 심근세포로의 분화에 의한 것인지 여부를 검토하였다. 먼저, 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하도록 유전자 도입된 Muse 세포(5×10⁵개)를 토끼 심근경색 모델의 이정맥에 주사하였다. 실시예 2와 마찬가지로 하여 조직 절편을 제작하고, 각종 조직염색용 형광 색소를 이용하여 조직을 관찰하였다(도 4). 도 4의 좌측 패널에 보이는 바와 같이, 백색 파선은 경색부와 비경색부의 경계를 나타내고, 그보다 오른쪽 상부는 경색부위, 왼쪽 하부는 비경색부위를 나타낸다. 중앙 패널은 보통의 방법에 따라 로다민 팔로이딘(rhodamine phalloidin) 염색으로 죽지 않은 심근세포를 적색으로 염색한 것이다. 이 색소에 의해 경색부위와 비경색부위를 명확하게 구별할 수 있다. 또한, 우측 패널은 GFP 염색 화상을 나타내고, GFP 유전자가 도입된 Muse 세포(녹색)가 경색부위로 선택적으로 집적한 모습을 나타낸다. 이 2개의 화상을 겹친 화상을 좌측 패널에 나타낸다. 이에 의해, 경색부위에서 적색 및 녹색이 겹치는 세포가 다수 존재하고, 이것는 이식된 Muse 세포가 심근세포로 분화한 것을 시사한다.

더욱이, 경색부위에 집적한 GFP 양성의 Muse 세포의 분화상태를 조사하기 위하여, 보통의 방법에 따라 이 세포들을 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(ANP)의 발현 유무에 대하여 검토하였다. 이 ANP는 유약형 심근세포가 발현하는 것이 알려져 있다. 도 5에서 녹색(Muse 세포)이 GFP 염색, 적색이 ANP 염색, 그리고 청색이 DAPI 염색(세포핵을 염색함)을 나타낸다. 도 5의 좌측 패널로부터도 알 수 있듯이, 이 3개의 형광이 복수개의 동일 세포에서 관찰된 것으로부터, 이식된 Muse 세포 안에는 심근세포로 분화하고 있는 세포가 포함되어 있는 것이 시사되었다.

이어서, 경색부위에 집적한 GFP 양성의 Muse 세포에 있어서, 심근 표지자로 알려져 있는 트로포닌I의 발현 유무를 검토하였다. 트로포닌I 염색에서는 토끼의 트로포닌I와 교차반응하는 쥐 항 인간 트로포닌I 항체(Chemical International, Inc)를 1차 항원으로 사용하였다. 도 10에서 녹색(Muse 세포)이 GFP 염색, 적색이 트로포닌I 염색, 그리고 청색이 DAPI 염색(세포핵을 염색함)을 나타낸다. 도 10의 우측 패널로부터도 알 수 있듯이, 이 3가지 형광이 복수개의 동일 세포에서 관찰된 것으로부터, 이식된 Muse 세포 안에는 상기 결과(도 5)와 마찬가지로 심근세포로 분화하고 있는 세포가 포함되어 있는 것이 시사되었다.

더욱이, 경색부위에 집적한 Muse 세포의 분화상태를 조사하기 위하여, 혈관 내피세포 표지자로 알려져 있는 CD31의 발현 유무를 검토하였다. 구체적으로는 토끼의 혈관 내피세포와 교차반응하는 쥐 항 사람 CD31 단일클론 항체(monoclonal antibody)(Dako에서 입수)를 1차 항체로 사용하여, 조직화학적으로 CD31을 발현한 세포를 염색하였다. 도 13의 사진에서도 분명하듯이, Muse 세포를 이식한 조직에서는 다른 이식군과 비교하여 경색부위에서 CD31 양성의 미소혈관 밀도가 높았다. 이것으로부터 이식된 Muse 세포는 경색부위에서 혈관 내피세포로 분화할 가능성이 시사되었다.

실시예 4: Muse 세포 이식에 따른 심기능 개선 평가

Muse 세포 이식 후의 심기능을 경시적인 혈압변화(±dp/dt; p는 혈압, t는 시간을 나타냄)를 지표로 하여 검토하고, 또한 2D 심장 초음파 검사에 의해 좌실단면의 화상으로부터 판단하였다. 이 실험들에서는 재관류 24시간 후에 생리식염수를 투여한 토끼(대조군)(n=3), 및 Muse 세포를 투여한 토끼군(n=4)을 사용하였다. 먼저, 경시적인 혈압변화의 측정은, 재관류 14일 후의 각 토끼를 10mg/kg 펜토바르비탈로 경마취(light anesthesia)시키고, 토끼의 경동맥으로부터 마이크로 마노미터가 장착된 카테터(SPR 407; Millar Instruments)를 좌실에 삽입하여 실시하였다. 이 카테터에 의해 얻어지는 좌실의 심장수축기능을 나타내는 +dp/dt, 그리고 좌실의 심장확장기능을 나타내는 -dp/dt를 기록하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다. 심장수축기능(+dp/dt)(도 6의 상부), 심장확장기능(-dp/dt)(도 6의 하부) 모두, Muse 세포가 이식된 토끼군은, 대조군과 비교하여 심기능이 유의하게 개선되었다.

더욱이 피검체수를 늘려서 상기와 마찬가지로 심기능을 경시적인 혈압변화를 지표로 하여 검토한 결과를 도 11에 나타낸다. 심장수축기능(+dp/dt)(도 11의 상부), 심장확장기능(-dt/dt)(도 11의 하부) 모두, Muse 세포(n=10)를 이식한 토끼군은 대조군(n=10), MSC 세포 이식군(n=10), 및 비Muse 세포 이식군(n=9)과 비교하여 심기능이 유의하게 개선되었다.

이어서 상기 토끼(대조군 및 Muse 세포 이식군)의 심기능을 더욱 확인하기 위하여 2D 심장초음파 검사를 하였다. 이 2D 심장초음파 검사에서는 동물용 초음파 진단장치(SSD2000; Aloka)를 이용하여 토끼의 심장을 촬상하였다. 측정으로 얻어진 좌실의 흉골 옆 좌실 장축단면의 화상을 도 7에 나타낸다. 좌측 패널은 대조 토끼의 좌실이고, 우측 패널은 Muse 세포가 이식된 토끼의 좌실이다. 대조에서는 좌실확장 말기직경(Left Ventricular end-Diastolic dimension; LVDd)이 22.2mm였다. 이에 대하여 Muse 세포를 이식한 토끼에서는 19.5mm로 작았기 때문에, Muse 세포에 의해 경색 사이즈가 축소된 것을 알 수 있다. 더욱이, 심장수축기능의 지표 중 하나인 구출율(Ejection Fraction; EF)을 측정하면, 대조에서는 34.1%이고, Muse 세포를 이식한 토끼에서는 60.9%였다. 이 구출율은 좌실 1회 배출량의 좌실확장 말단 용적에 대한 비율로 나타내어진다. 통상 사람에서는 구출율 55% 이상을 정상이라고 한다. 따라서, 상기 측정결과는 대조와 비교하여 토끼에서 Muse 세포 이식에 의해 심기능이 정상으로 회복된 것을 시사한다. 또한, EF와 마찬가지로, 심장 수축 기능의 하나의 지표가 되는 좌실내경 단축율(Fractional Shortening; FS)을 측정하면, 대조에서는 15.1%이고, Muse 세포를 이식한 토끼에서는 30.4%였다. 이 좌실내경 단축율은, 촬상하여 얻어진 M 모드 초음파 화상을 이용하여 좌실확장 말기직경과 좌실수축 말기직경을 계측하고, 이 차이들을 좌실확장 말기직경으로 나누어, 100분율로 나타낸 것이다. 통상 사람에서 정상값은 30~50%가 된다. 따라서, 상기 측정결과는 대조와 비교하여 토끼에서 Muse 세포 이식에 의해 심기능이 정상으로 회복된 것을 시사한다.

다시 Muse 세포 이식후의 토끼의 심기능이 정상으로 회복된 것을 확인하기 위하여, 대조 토끼, MSC 세포를 이식한 토끼 및 비Muse 세포를 이식한 토끼에 대하여 LVDd, EF 및 FS(상술), 그리고 좌실수축 말기직경(Left Ventricular end-Sytolic dimension; LVDs)을 측정하였다. 상기 결과와 마찬가지로, LVDd, EF 및 FS 모두, Muse 세포 이식에 의해 토끼의 심기능이 정상으로 회복되었다. 또한, LVDs에서도 대조 토끼에서는 평균 18.3mm였던데 대하여, Muse 세포를 이식한 토끼에서는 평균 13.8mm로 작았기 때문에, Muse 세포 이식에 의해 심기능이 정상으로 회복된 것을 시사한다.

본 발명의 세포제제는 심근경색 모델에 경정맥적으로 투여함으로써 경색부위에서 심근을 재생시킬 수 있고, 경색 사이즈를 축소시켜서 심기능을 개선할 수 있으며, 심근경색 특히, 사람의 중증 대형 심근경색 및 그에 따른 심부전의 치료에 응용할 수 있다.

본 명세서에서 인용하는 모든 간행물 및 특허문헌은 참조에 의해 전체적으로 본 명세서 안에서 원용된다. 한편, 본 명세서에서는 예시를 목적으로 본 발명의 특정 실시예를 설명하였는데, 본 발명의 정신 및 범위에서 이탈하지 않으면서 여러 가지로 개선과 변경이 이루어지는 것은 당업자가 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

Claims

생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는 심근경색을 치료하기 위한 세포제제.
제 1 항에 있어서,
외부 스트레스 자극에 의해 SSEA-3 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포의 분획물을 포함하는 세포제제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
사람의 중증 대형 심근경색 후의 심부전을 예방 및/또는 치료하기 위한 세포제제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD105 양성인 세포제제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD117 음성 및 CD146 음성인 세포제제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성 및 CD271 음성인 세포제제.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성 및 Dct 음성인 세포제제.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 아래의 성질을 모두 가지는 다능성 간세포인 세포제제:
(i) 텔로머라아제 활성(telomerase activity)이 낮거나 없음;
(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(iii) 종양성 증식을 나타내지 않음; 그리고
(iv) 자기재생(self-renewal) 능력을 가짐.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 심근경색 부위에 집적하는 능력을 가지는 세포제제.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 심근세포로 분화하는 능력을 가지는 세포제제.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 혈관 내피세포로 분화하는 능력을 가지는 세포제제.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
허혈후 1개월 이내에 대상이 되는 정맥 또는 관동맥에 상기 다능성 간세포를 치료상 유효량으로서 1×10³세포/개체~ 1×10⁶세포/개체로 1~10회 투여하는 세포제제.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
비투여 대조와 비교하여 심근경색 사이즈를 축소시키는 세포제제.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
좌실에서의 경시적인 혈압 변화, 좌실확장 말기직경(LVDd), 구출율(EF), 좌실내경 단축율(FS) 및 좌실수축 말기직경(LVDs)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 심기능 지표를 정상값으로 회복시키는 세포제제.