JP7045670B2 - 多能性幹細胞による虚血再灌流肺障害の軽減及び治療 - Google Patents
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Description
[1]生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたSSEA-3陽性の多能性幹細胞を含む、虚血再灌流肺障害を軽減及び/又は治療するための細胞製剤。
[2]外部ストレス刺激によりSSEA-3陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を含む、上記[1]に記載の細胞製剤。
[3]前記多能性幹細胞が、CD105陽性である、上記[1]又は[2]に記載の細胞製剤。
[4]前記多能性幹細胞が、CD117陰性及びCD146陰性である、上記[1]~[3]のいずれかに記載の細胞製剤。
[5]前記多能性幹細胞が、CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性、及びCD271陰性である、上記[1]~[4]のいずれかに記載の細胞製剤。
[6]前記多能性幹細胞が、CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snai1陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性、及びDct陰性である、上記[1]~[5]のいずれかに記載の細胞製剤。
[7]前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記[1]~[6]のいずれかに記載の細胞製剤:
(i)テロメラーゼ活性が低いか又は無い;
(ii)三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ;
(iii)腫瘍性増殖を示さない;及び
(iv)セルフリニューアル能を持つ。
[8]虚血再灌流肺障害が、肺移植後、心臓手術時の人工心肺使用後、血管形成あるいは血流遮断を伴う肺癌等の胸部外科手術後、及び/又は肺血栓閉塞症の血栓溶解後あるいは血栓摘出後の血流再開時に生じる肺障害である、上記[1]~[7]のいずれかに記載の細胞製剤。
[9]前記多能性幹細胞が肺組織に生着する能力を有する、上記[1]~[8]のいずれかに記載の細胞製剤。
本発明は、SSEA-3陽性の多能性幹細胞(Muse細胞)を含む細胞製剤又は医薬組成物を用いて、虚血再灌流肺障害の軽減及び治療を目指す。「虚血再灌流肺障害」とは、肺移植後の移植肺機能不全の主な原因とされ、肺移植後3カ月以降に起こる慢性拒絶反応にも関与している、虚血再灌流後に肺において生じる虚血再灌流障害である。
(1)多能性幹細胞
本発明の細胞製剤及び医薬組成物に使用される多能性幹細胞は、典型的には、本発明者らの一人である出澤氏が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring)細胞」と命名した細胞である。Muse細胞は、骨髄液、脂肪組織(Ogura,F.,et al.,Stem Cells Dev.,Nov 20,2013(Epub)(published on Jan 17,2014))や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができ、各臓器の結合組織にも散在する。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、それぞれの細胞表面マーカーである「SSEA-3(Stage-specific embryonic antigen-3)」と「CD105」のダブル陽性として同定される。したがって、Muse細胞又はMuse細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカーを指標として生体組織から分離することができる。また、Muse細胞はストレス耐性であり、間葉系組織又は培養間葉系細胞から種々のストレス刺激により濃縮することができる。本発明の細胞製剤には、ストレス刺激によりMuse細胞が濃縮された細胞画分を用いることもできる。Muse細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第WO2011/007900号に開示されている。また、Wakaoら(2011、上述)によって報告されているように、骨髄、皮膚などから間葉系細胞を培養し、それをMuse細胞の母集団として用いる場合、SSEA-3陽性細胞の全てがCD105陽性細胞であることが分かっている。したがって、本発明における細胞製剤及び医薬組成物において、生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からMuse細胞を分離する場合は、単にSSEA-3を抗原マーカーとしてMuse細胞を精製し、使用することができる。なお、本明細書においては、虚血再灌流肺障害を軽減及び/又は治療するための細胞製剤及び医薬組成物において使用され得る、SSEA-3を抗原マーカーとして、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から分離された多能性幹細胞(Muse細胞)又はMuse細胞を含む細胞集団を単に「SSEA-3陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Muse細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織に含まれる細胞であって、「SSEA-3陽性細胞」以外の細胞を指す。
(i)テロメラーゼ活性が低いか又は無い;
(ii)三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ;
(iii)腫瘍性増殖を示さない;及び
(iv)セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも1つの性質を有してもよい。本発明の一局面では、本発明の細胞製剤及び医薬組成物に使用されるMuse細胞は、上記性質を全て有する。ここで、上記(i)について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore社)を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はHela細胞に比べて1/5以下、好ましくは1/10以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。上記(ii)について、Muse細胞は、in vitro及びin vivoにおいて、三胚葉(内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系)に分化する能力を有し、例えば、in vitroで誘導培養することにより、肝細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、in vivoで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器(心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等)に遊走及び生着し、組織に応じた細胞に分化する能力を有する。上記(iii)について、Muse細胞は、浮遊培養では増殖速度約1.3日で増殖するが、浮遊培養では1細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り14日間程度で増殖が止まる、という性質を有するが、これらの胚様体様細胞塊を接着培養に持っていくと、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が広がっていく。さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。また、上記(iv)について、Muse細胞は、セルフリニューアル(自己複製)能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、1個のMuse細胞から浮遊培養で培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞から3胚葉性の細胞への分化が確認できると同時に、胚様体様細胞塊の細胞を再び1細胞で浮遊培養に持っていくことにより、次の世代の胚様体様細胞塊を形成させ、そこから再び3胚葉性の分化と浮遊培養での胚様体様細胞塊が確認できることをいう。セルフリニューアルは1回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。
(i)SSEA-3陽性;
(ii)CD105陽性;
(iii)テロメラーゼ活性が低いか又は無い;
(iv)三胚葉に分化する能力を持つ;
(v)腫瘍性増殖を示さない;及び
(vi)セルフリニューアル能を持つ。
本発明の細胞製剤及び医薬組成物は、限定されないが、上記(1)で得られたMuse細胞又はMuse細胞を含む細胞集団を生理食塩水や適切な緩衝液(例えば、リン酸緩衝生理食塩水)に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したMuse細胞数が少ない場合には、投与前に細胞を培養して、所定の細胞濃度が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように(国際公開第WO2011/007900号パンフレット)、Muse細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。また、回収したMuse細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地(例えば、10%仔牛血清を含むα-最少必須培地(α-MEM))において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第WO2011/007900号を参照して、Muse細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物(例えば、抗生物質、血清)等を選択し、所定濃度のMuse細胞を含む溶液を調製することができる。ヒト対象に本発明の細胞製剤又は医薬組成物を投与する場合には、ヒトの腸骨から数mL程度の骨髄液を採取し、例えば、骨髄液からの接着細胞として骨髄間葉系幹細胞を培養して有効な治療量のMuse細胞を分離できる細胞量に達するまで増やした後、Muse細胞をSSEA-3の抗原マーカーを指標として分離し、自家又は他家のMuse細胞を細胞製剤として調製することができる。あるいは、例えば、Muse細胞をSSEA-3の抗原マーカーを指標として分離後、有効な治療量に達するまで細胞を培養して増やした後、自家又は他家のMuse細胞を細胞製剤として調製することができる。
本明細書においては、本発明の細胞製剤による虚血再灌流肺障害の軽減及び治療効果を検討するために虚血再灌流肺障害モデルラットを作製し、使用することができる。該モデルとして使用されるラットには、限定されないが、一般的に、スプラーグドーリー(SD)系ラット、Wistar/ST系ラットが挙げられる。虚血再灌流肺障害モデルラットを作製する方法は公知であり、例えば、Manning,E.ら(Hum.Gene Ther.,21,p.713-727(2010))の方法に従って虚血再灌流肺障害モデルラットを作製することができる。また、上記方法によって作製されたモデルラットが、虚血再灌流肺障害を有するかどうかを後述する肺機能の評価により確認することができる。
本発明の実施形態では、本発明の細胞製剤及び医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物における虚血再灌流肺障害及びそれに伴う各種症状を軽減及び/又は治療することができる。本発明によれば、上記で作製した虚血再灌流肺障害モデルラットを用いて、実験的にMuse細胞による症状の軽減等を検討し、該Muse細胞の効果を評価することができる。評価方法としては、ラットを用いた肺機能を評価する一般的な測定系を用いて行うことができる。
本発明によれば、肺の機能的評価は、当業者によって承認される一般的な手法を用いて行うことができ、例えば、P/F比、A-aDO2(肺胞気・動脈血酸素分圧較差)、肺コンプライアンスの測定により行うことができる。
(a)P/F比
P/F比は、肺の機能的評価において一般的に使用される酸素化の指数であり、該比は、PaO2(動脈血酸素分圧)/FiO2(吸入酸素分圧)で計算される。ヒト健常人であれば、正常値が400~500となる。この数値以下では、低酸素状態であるとみなされる。上記の酸素分圧は、限定されないが、血液ガス分析装置(例えば、GASTAT-navi(Techno Medica,Yokohama,Japan))によって測定することができる。後述する実施例3に示されるように、正常なラットではP/F比が500前後、虚血再灌流肺障害モデルラットでは100未満であり、Muse細胞の投与によりP/F比を正常に近づけることができる。
A-aDO2は、肺胞器酸素分圧(PAO2)と動脈血酸素分圧(PaO2)の差を意味し、A-aDO2を求めることにより肺胞でのガス交換が正常にできているかを判断することができる。PaO2は、動脈血を採取し、血液ガス分析装置を用いて測定することができるが、PAO2は、肺胞に含まれる酸素分圧のため、直接測定することができない。そのため、PAO2は、計算式(PAO2=(760-47)×0.21-PaCO2/0.8)によって理論値を求める。ヒト健常人であれば、正常値が5~15となる。この数値以上では、ガス交換が正常でないとみなされる。後述する実施例3に示されるように、正常なラットではA-aDO2が150mmHg前後、虚血再灌流肺障害モデルラットでは500mmHg以上であり、Muse細胞の投与によりA-aDO2を正常に近づけることができる。
肺の柔らかさを表す指数であり、肺コンプライアンスは、肺の縮まろうとする性質(弾性)の逆数で表される。横軸に肺を伸展させる圧力(ΔP)、縦軸に肺の容量変化(ΔV)をプロットすると、圧-量曲線得られ、この曲線の傾き(ΔV/ΔP)が静的肺コンプライアンスとなる。本研究ではより簡便に肺コンプライアンスを測定、算出するため1回換気量(ml)/換気圧(cmH2O)によって求められる動的肺コンプライアンスを用いた。また、本研究で用いたラットは成長過程にあり、肺も成長するため、個体間による大きさを補正するため、動的肺コンプライアンスを個体体重(kg)で除した数値(ml/cmH2O/Kg)で比較した。肺コンプライアンスが高ければ、肺は伸展しやすい状態と言え、一方、低ければ肺は硬い状態であると言える。後述する実施例4に示されるように、正常なラットでは肺コンプライアンスが1前後、虚血再灌流肺障害モデルラットでは0.6であり、Muse細胞の投与により肺コンプライアンスを正常に近づけることができる。ラットを用いた場合の測定方法とは異なるが、ヒトでは、200ml/cmH2Oが正常値である。
本発明によれば、組織学的評価は、当業者によって承認される一般的な手法を用いて行うことができ、例えば、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色、TUNEL染色により行うことができる。
(a)ヘマトキシリン・エオジン染色
組織染色法では、ヘマトキシリン・エオジン染色はよく使用され、当業者に周知である。本発明によれば、肺の組織学的評価として、肺組織を抽出し、該染色後、4つの病理学的項目(肺胞腔内の浮腫、肺胞腔内の出血、肺胞・肺胞隔壁のうっ血、炎症性細胞の浸潤)の程度により0~4+の5段階に急性肺障害の程度をグレーディングし、各動物実験群間で比較することにより、評価を行うことができる。より具体的には、評価では2名がブラインドマナーとなり、上記の病理学的項目のそれぞれについて、5段階評価、すなわち、スコア0:病変部0%、1:病変部1~25%、2:病変部26~50%、3:病変部51~75%、及び4:病変部76~100%を用いてスコアリングする。後述する実施例5に示されるように、Muse細胞を投与した処置群では、PBSのみを投与した対照群と比較して、いずれの病理学的項目における平均スコアが減少し得る。
本発明によれば、TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)法を用いて、障害肺におけるアポトーシスを評価することができる。これは、アポトーシスの過程で生じる、組織スライス中の断片化DNAをビオチン標識ヌクレオチドで標識後、HRP標識ストレプトアビジンを反応させて染色する方法である。検出試薬としては、FITC、DAB、Blue Labelのいずれであってもよい。染色後、顕微鏡下で、TUNEL陽性細胞数を数えることにより、各実験群で比較することができる。例えば、実施例6に示されるように、顕微鏡下、10視野でTUNEL陽性細胞数を比較すると、PBS投与の対照と比較して、Muse細胞による処置群では、アポトーシスに起因したTUNEL陽性細胞の数を顕著に減少させることができる。
(1)間葉系幹細胞の調製
ロンザジャパン株式会社より購入したヒト間葉系幹細胞(MSC)使用した。既報に従い、低グルコース、L-グルタミン含有のDMEM(Life Technologies,Carlsbad,U.S.A.)に10%ウシ胎児血清(FBS)(Sigma-Aidrich,St.Louis,U.S.A.)とカナマイシンを添加した培地を用いて、10cmディッシュで37℃、5%CO2の条件で培養した。細胞が90%コンフルエントの細胞密度に達したところで、0.25%トリプシン-EDTA(Life Technologies,Carlsbad,U.S.A.)で細胞を剥離し、1:2で継代した。同様に培養、継代を繰り返し、7~8継代目の細胞を実験に用いた。
ヒトMSCを培養、継代し、7~8継代目の細胞を用いた。まず、FluoroBrite DMEM(Life Technologies,Carlsbad,U.S.A.)44mlに5%ウシ血清アルブミン(Sigma-Aidrich,St.Louis,U.S.A.)を5ml、100mM EDTAを1ml加え、バッファーを作成した。ラットIgM 抗Stage-Specific Embryonic Antigen-3(SSEA-3)抗体(1:1000,BioLegend,San Diego,U.S.A.)を一次抗体とし、MSCと作成したバッファー中で氷上で1時間反応させた。その後、400gで5分間遠心し、上清を除去し900μlのバッファーを加え、愛護的にピペッティングし洗浄した。この洗浄の操作を3回繰り返し、FITCコンジュゲート化抗ラットIgM抗体(1:100,Jackson Immunoresearch,Baltimore,U.S.A.)を二次抗体として氷上で1時間反応させた。二次抗体と反応させた後、先述した洗浄を3回行った。次いで、抗FITCマイクロビーズ(1:10,Miltenyibiotec,Germany)を氷上で15分間反応させ、2回洗浄した後、MACS(magnetic-activated cell sorting)を用いてSSEA-3陽性細胞をMuse細胞として分離した。細胞を分離した後、BD FACS Aria(BD Biosciences,Franklin Lakes,U.S.A.)を用いて、MACSで分離した細胞の一部を解析し、分離した細胞集団中に含まれるSSEA-3陽性細胞数の割合を確認した。FACSによる解析においてSSEA-3陽性率が70%以上のものを実験に使用した。以下に述べる実験において用いられる「Muse細胞」は、SSEA-3陽性細胞を70%以上含むMACSによって分離された細胞である。
本研究では、虚血再灌流肺障害モデルラットにPBSを投与するPBS群、ヒトMSCを投与するMSC群、Muse細胞を投与するMuse群、手術操作を行わない正常群の計4群を設けた。虚血再灌流肺障害後の肺機能の評価は、各群n=8で評価した。PBS群はPBS 200μl、MSC群はMSC 1.5×105細胞/200μl PBS、Muse群はMuse細胞 1.5×105細胞/200μl PBSをそれぞれ再灌流直後に左肺動脈を30G針で穿刺し、1分間かけて投与する。
再灌流3日、5日にラットをイソフルランによる全身麻酔下に気管切開し、14G血管カテーテルを気管に挿入した。3-0絹糸で結紮し、カテーテルと気管を固定し、カテーテルと人工呼吸器を接続した。胸骨正中切開で開胸した。左右の横隔膜を切開し、ガーゼを用いて腹部臓器の胸腔内への脱出を防いだ。右肺門を顕微鏡下に剥離した後、右肺動脈を結紮した。その後、吸入酸素濃度100%、一回換気量1ml/体重100g、呼吸数80/分、呼気終末陽圧2cmH2Oで5分間換気させた後、上行大動脈から採血を行った。血液ガス分析を行い、動脈血酸素分圧/吸入酸素濃度比(P/F比)、また以下の式より算出されるA-aDO2(A-aDO2=713-動脈血二酸化炭素分圧/0.8-動脈血酸素分圧)を各群間で比較した。血液ガス分析はGASTAT-navi(Techno Medica,Yokohama,Japan)を用いて測定した。各群n=8で評価した。
血液ガス分析後、右肺門をモスキートペアン鉗子で遮断し、換気数を80回/分に設定し、分時換気量を40mlから段階的に200mlまで上げ、各換気量における換気圧を計測した。一回換気量を個体重量で除して調整し、換気量/換気圧(ml/kg/cm H2O)を求め、肺コンプライアンスとして各群間で比較した。各群n=8で評価した。
左肺コンプライアンスを測定後、心肺ブロックを摘出し、気管から4%パラホルムアルデヒドを10cmH2Oの圧で注入し、左肺を4%パラホルムアルデヒド中に24時間固定した。固定後、肺組織を分割し、半分をパラフィンに包埋し、もう半分をO.C.T.コンパウンドに包埋し、それぞれパラフィン切片、凍結切片を作製した。パラフィン切片は3μm、凍結切片は8μmで薄切切片をそれぞれ作製した。
パラフィン切片を用いてヘマトキシリン・エオジン染色を行い、Okada Yらの報告(Transplantation 1997;64:801-806)に基づいて、4つの病理学的項目(肺胞腔内の浮腫、肺胞腔内の出血、肺胞・肺胞隔壁のうっ血、炎症性細胞の浸潤)の程度により0~4+の5段階に急性肺障害の程度をグレーディングし、各群間で比較した。3日目、5日目でそれぞれ各群n=8で評価した。
障害肺におけるアポトーシスを評価するため、TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)法を行った。TUNEL法にはDeadEnd(商標)Fluorometric TUNEL System(Promega,Wisconsin,U.S.A.)を用い、添付のプロトコールに従って染色を行った。200倍で10視野観察し、TUNEL陽性細胞数を数え、10視野の合計のTUNEL陽性細胞数を各群間で比較した。Day3、Day5でそれぞれ各群n=4で評価した。
凍結切片を用いて、一次抗体としてウサギ抗ヒトgolgi抗体(1:50,Abcam,Cambridge,UK)を4℃で一晩反応させた。二次抗体としてCy3コンジュゲート化ロバ抗ウサギIgG抗体(1:500、Jackson Immunoresearch,Baltimore,U.S.A.)を2時間、室温で反応させ、免疫組織化学を行い、MSC群、Muse群における抗ヒトgolgi抗体陽性細胞数を数えた。2群とも1個体あたり3切片ずつ作成し、切片の面積を測定し、切片毎に全陽性細胞数を数え、単位面積あたりの抗ヒトgolgi抗体陽性細胞数を2群間で比較した。Day3、Day5でそれぞれ各群n=4で評価した。
障害肺における発現タンパク質を比較するため、障害肺からタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングを行った。PBS群、MSC群、Muse群の左肺組織を再灌流後3日目に摘出し、バイオマッシャーによりホモジェナイズし、プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche,Mannheim,Germany)を添加したLysis Buffer(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,1%Triton X-100)により15分間氷上で反応させた。抽出したタンパク量はBradford法で定量した。続いて、Lysis Bufferと等量のx2 Sample Buffer(30%グリセロール,4%ドデシル硫酸ナトリウム,125mM Tris-HCl(pH6.8),100mMジチオスレイトール,10mM EDTA,10%β-メルカプトエタノール,0.1%ブロモフェノールブルー)を添加し、100℃で10分間インキュベートする。それぞれのサンプルは50μgずつ10%、15%SuperSep Ace(Wako,Osaka,Japan)で電気泳動し、Immobilon-P転写メンブレン(Merck Millipore,Billerica,U.S.A.)に転写する。5%スキムミルク(Nakarai Tesque,Kyoto,Japan)で、4℃、1時間でブロッキングした後、一次抗体として5%スキムミルクで希釈したウサギ抗IL-10抗体(1:2500,Abcam,Cambridge,UK)、ウサギ抗IL-1β抗体(1:5000,Merck Millipore Billerica,U.S.A)、マウス抗IL-6抗体(1:2000,Abcam,Cambridge,UK)、ヤギ抗KGF抗体(1:2000,R&D systems,Minneapolis,U.S.A.)、ウサギ抗PGE2抗体(1:1000,Bioss,Boston,U.S.A.)、ウサギ抗SDF(Stem cell drived factor)-1抗体、ウサギ抗上皮性ナトリウムチャネル(ENaC)抗体(1:500,Thermo Fisher Scientific,Waltham,U.S.A.)、ウサギ抗Akt抗体(1:2000,Cell Signaling Technology,Danvers,U.S.A.)、ウサギ抗Bcl-2抗体(1:500 Abcam,Cambridge,UK)、マウス抗β-アクチン抗体(1:10000,Abcam,Cambridge,UK)を用いて、4℃で一晩反応させる。二次抗体にはペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗マウスIgG抗体(1:10000)またはペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗ウサギIgG抗体(1:15000)、ペルオキシダーゼコンジュゲート化ロバ抗ヤギIgG抗体(1:5000)を使用し、室温で1時間反応させた。発色にはPiece Western Blotting Substrate Plus(Thermo Fisher Scientific,Waltham,U.S.A.)を用いて、5分間発色させ、LAS-4000 IRマルチカラー(Fuji Film,Tokyo,Japan)で撮像し、β-アクチンに対する各タンパク質の発現レベル比を算出し、各群間で比較した。
凍結切片を用いて、Tris-EDTA(pH9.0)、80℃、20分間でマイクロウェーブにて抗原賦活化を行った後、増殖期の細胞マーカーとしてマウス抗PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)抗体(1:500,Abcam,Cambridge,UK)、2型肺胞上皮細胞のマーカーとしてウサギ抗Pro Surfactant protein C抗体(1:1000,Merck Millipore,Billerica,U.S.A.)、1型肺胞上皮細胞のマーカーとしてウサギ抗Aquaporin 5抗体(1:250,Abcam,Cambridge,UK)を一次抗体として使用し、4℃で一晩反応させた。二次抗体はそれぞれFITCコンジュゲート化ロバ抗マウスIgG抗体(1:500、Jackson Immunoresearch,Baltimore,U.S.A.)、Cy3コンジュゲート化ロバ抗ウサギIgG抗体(1:500、Jackson Immunoresearch,Baltimore,U.S.A.)を用いて2時間、室温で反応させた。200倍視野で観察し、PCNAとPro Surfactant protein C、PCNAとAquaporin 5のそれぞれ共陽性細胞を10視野で数えた。それぞれを増殖期にある2型肺胞上皮細胞数、1型肺胞上皮細胞数としてPBS群、MSC群、Muse群で比較した。再灌流後3日目、5日目でそれぞれ各群n=4で評価した。
Claims (6)
- 外部ストレス刺激によりSSEA-3陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を有効成分として含む、虚血再灌流肺障害を軽減及び/又は治療するための細胞製剤であって、
ここで、前記多能性幹細胞は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたSSEA-3陽性の多能性幹細胞であり、以下:
(i)CD105陽性;
(ii)テロメラーゼ活性が低いか又は無い;
(iii)三胚葉のいずれかの胚葉の細胞に分化する能力を持つ;
(iv)腫瘍性増殖を示さない;及び
(v)セルフリニューアル能を持つ
の全ての性質を有する、上記細胞製剤。 - 前記多能性幹細胞が、CD117陰性及びCD146陰性である、請求項1に記載の細胞製剤。
- 前記多能性幹細胞が、CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性、及びCD271陰性である、請求項1又は2に記載の細胞製剤。
- 前記多能性幹細胞が、CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snai1陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性、及びDct陰性である、請求項1~3のいずれか1項に記載の細胞製剤。
- 虚血再灌流肺障害が、肺移植後、心臓手術時の人工心肺使用後、血管形成あるいは血流遮断を伴う肺癌等の胸部外科手術後、及び/又は肺血栓閉塞症の血栓溶解後あるいは血栓摘出後の血流再開時に生じる肺障害である、請求項1~4のいずれか1項に記載の細胞製剤。
- 前記多能性幹細胞が肺組織に生着する能力を有する、請求項1~5のいずれか1項に記載の細胞製剤。
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