KR20120041706A

KR20120041706A - 제대혈 또는 지방조직유래 성체줄기세포를 함유한 항암용 조성물

Info

Publication number: KR20120041706A
Application number: KR1020120008588A
Authority: KR
Inventors: 강경선
Original assignee: 주식회사 강스템홀딩스
Priority date: 2012-01-25
Filing date: 2012-01-25
Publication date: 2012-05-02

Abstract

본 발명은 제대혈 또는 지방조직 유래 성체줄기세포를 함유한 항암용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 제대혈 또는 지방조직 유래 성체줄기세포는 아폽토시스를 유도하여 암세포의 성장을 억제하고, 암세포가 폐 등 다른 장기로 전이하는 것을 억제하여, 효과적으로 유방암을 치료할 수 있다.

Description

제대혈 또는 지방조직유래 성체줄기세포를 함유한 항암용 조성물{Composition for Anticancer Containing Umbilical Cord Blood- or Adipose Tissue-derived Stem Cell}

본 발명은 제대혈 또는 지방조직 유래 성체줄기세포를 함유한 항암용 조성물에 관한 것이다.

MSC(mesenchymal stromal cell)는 다양한 조직원, 일차적으로 골수(BM)로부터 분리되는 다능성(pluripotent) 전구세포의 군(population)을 포함한다. 적절한 조건 하에서, MSC는 외배엽, 내배엽 및 중배엽 세포 계통으로 유도될 수 있다. MSC는 다양한 기능적 말단 계통으로 분화할 수 있는 능력 때문에 재생 의학에서 광범위하게 연구되었다. MSC는 시험관내 및 생체내 분화와 트랜스분화(transdifferentiation) 능력 뿐 아니라 퇴행성 부위에 접목되어(engraft) 치료 기능을 수행할 수 있다. MSC는 치료 단백질의 전달을 위한 세포 비히클로서 고려될 수 있다.

UCB(umbilical cord blood) MSC는 사람 UCB에 존재하는 줄기 세포이다. 몇몇 연구는 전구(progenitor) 상태와 면역제어(immunomodulation)를 포함하여, 이 세포의 선호되는 특성을 밝혀냈다. AD(adipose tissue) MSC는 유방 축소술을 한 여성의 유방 지방 조직으로부터 분리할 수 있다. AD MSC는 BM 유래 MSC와 유사한 특성을 나타내었다. UCB와 AD MSC는 경제적이고 용이하게 획득할 수 있는 재료이므로 임상에서 주목하고 있다.

암종(carcinomas)은 잘 조화된 결합조직형성(desmoplastic) 반응의 결과이다. 이 과정은 상처 치유와 매우 닮았고, 다양한 성장인자, 사이토카인 및 매트릭스 리모델링 단백질을 보충한다. 이러한 인자들은 종양 부위가 치유하지 않은 상처인 것으로 간주하고, MSC는 상처 부위와 유사하게, 종양 부위로부터 분비되는 내분비(endocrine) 및 측분비(paracrine) 시그날에 의해 보충될 수 있다. 다양한 기질 세포가 암종 형성 동안에 보충되었다. MSC는 일반적으로 기질 세포 중에 존재하므로 종양 환자로 MSC의 이식은 면밀하게 조사되어야 한다. 강력한 항종양 효과가 직접적인 세포 접촉에서 관찰되었고, 이로 인해 카포시 육종(Kaposi' sarcoma) 세포내 Akt 활성화가 억제되었다. 그러나, BM MSC는 암 세포의 운동성, 침입 및 전이를 촉진할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 명백한 임상적 변화가 없는 암형성 초기 단계 동안에 MSC 이식에 의한 효과가 규명되어야 한다.

본 발명자는 암 형성 초기단계에서 제대혈 또는 지방조직 유래 성체줄기세포를 주입한 결과, 암세포의 성장이 억제되고, 다른 장기로의 전이가 억제되어, 효과적으로 암을 치료할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 제대혈 유래 성체줄기세포를 함유한 항암용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 제대혈(Umbilical Cord Blood, UCB) 또는 지방조직(AD) 유래 성체줄기세포(MSC)가 암, 특히 유방암 치료에 유용함을 규명한 것에 기초 한다.

본 발명자는 사람 UCB 또는 AD MSC가 종양의 성장을 억제하는지 여부를 조사하기 위해, 먼저, 마우스의 유방 지방 패드(pad)에 유방암 세포주(MDA-MB-231 세포)를 주입하여 종양의 성장을 유도하였다. 그 후, 사람 UCB 또는 AD MSC를 정맥으로 주입하고 일정 간격으로 종양의 부피를 측정하였다. 그 결과 사람 UCB 또는 AD MSC를 이식한 후 종양의 성장이 억제되는 것을 알 수 있었다(실시예 2-1 참조).

일반적으로 유방암 세포는 폐로 전이할 수 있다. 본 발명자는 UCB 및 AD MSC가 유방암 세포의 폐로의 전이를 억제할 수 있는지 여부를 조사하였다. 이를 위해, UCB 및 AD MSC를 주입하고 일정 기간이 경과한 후에 폐로의 전이 지수(metastasis index)를 검사하였다. 그 결과 UCB 및 AD MSC 처리군은 모두 대조군에 비해 50%까지 폐로의 전이 지수가 감소되었다. 조직학적 검사(H&E 염색) 결과에서도 UCB 및 AD MSC 처리군에서 대조군에 비해 전이된 종양 콜로니가 현저하게 적었다(실시예 2-2 참조).

본 발명의 한 양태에 의해 정맥으로 투여된 MSC가 일차 종양 부위 및 폐로 귀소(homing)하는지 여부를 추적하기 위해, 먼저 UCB 및 AD MSC를 모두 PKH261로 라벨링하였다. 그리고, 라벨링된 UCB 또는 AD MSC를 종양을 보유한 마우스에 정맥으로 투여하였다. 상기 투여된 UCB 및 AD MSC는 일차 종양 위치와 폐에 접목되어 존재함을 확인하였다(실시예 2-3 참조).

UCB 또는 AD MSC가 어떻게 종양의 성장을 억제하는지 메커니즘을 조사하기 위해 면역조직화학이 수행되었다. 상기 메커니즘에 아폽토시스가 관여하는지 여부를 조사하기 위해, 절단된 PARP에 대한 면역반응력(immunoreactivity)을 분석하였다. 분석 결과, UCB 및 AD MSC 처리군의 종양 절편에서는 절단된 PARP에 대하여 양성인 면역반응력을 나타내었지만, 전이된 폐 절편에서는 PARP에 대한 면역반응력이 희귀하였다. 사람 UCB 또는 AD MSC가 PARP 절단에 관여하는지 여부를 추가로 조사하기 위해, 단백질을 종양과 폐로부터 추출하여 웨스턴 블로팅을 진행하였다. 그 결과, UCB 및 AD MSC 처리군의 종양 세포에서 절단된 PARP와 카스파제-3이 증가함을 알 수 있었다. PARP와 카스파제-3의 절단 증가는 UCB 및 AD MSC 처리가 종양 조직에서 아폽토시스를 유도한다는 것을 의미한다(실시예 2-4 참조).

유방암의 초기 단계에서 UCB 및 AD MSC의 영향을 추가로 조사하였다. 이를 위해, 유방암 세포주를 사람 UCB 및 AD MSC와 혼합한 후 마우스 유방 지방 패드에 주입한 후 종양 부피를 측정하였다. 종양 형성과 진행은 사람 USC 및 AD MSC에 의해 억제되었다. 폐로의 전이 지수는 UCB MSC 처리군에서 AD MSC 처리군에 비해 적었으나, 두 가지 유형의 줄기세포 모두 폐 전이를 억제하였다(실시예 2-5 참조).

줄기세포가 암형성과 전이를 촉진할 수 있다는 것이 알려져 있어 줄기세포의 치료 효과는 임상 증상을 보이지 않는 초기 단계 암 모델에서 평가되어야 한다. 이를 위해 GFP로 라벨링된 사람 MDA-MB-231 세포를 마우스 유방 지방 패드에 주입하고, 같은 날, 사람 UCB 또는 AD MSC를 정맥으로 투여하였다. 종양 형성과 진행은 UCB MSC에 의해서는 억제되었으나, AD MSC에 의해서는 억제되지 않았다. 또한, UCB MSC 처리군에서 전이된 폐 콜로니의 개수는 AD MSC 처리군 및 대조군 보다 적었다.

결론적으로, 제대혈 또는 지방조직 유래 성체줄기세포는 아폽토시스를 유도하여 암세포의 성장을 억제하고, 암세포의 전이를 억제하여, 효과적으로 암, 특히 유방암을 치료할 수 있다.

따라서, 본 발명은 제대혈 또는 지방조직 유래 성체줄기세포를 함유한 항암용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 성체줄기세포는 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키는 가장 중요한 원인인 조직적합항원 HLA-DR(class II)이 발현되지 않는 세포이므로, 이식수술시 문제가 되는 거부반응 등의 면역반응을 유발하지 않거나 최소화할 수 있어, 자가 유래는 물론 타가 유래 또한 사용할 수 있다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물의 제대혈 또는 지방조직으로부터 분리될 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, 대한민국특허출원 10-2009-0023821호에 개시된 제대혈 유래 줄기세포일 수 있다.

상기 제대혈 유래 줄기세포는 하기 특성 중 적어도 한 특성을 가지고 있다:

(a) 전사조절인자인 c-myc, ZNF281에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타낸다.

(b) 세포외기질이 코팅된 바닥에 부착되어 부착 후 5 내지 30일 사이에 선 형태 또는 구 형태의 세포 집락을 이루면서 증식한다.

(c) 30 내지 45의 CPDL(cumulative population doubling level)을 보인다.

(d) CD14, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타낸다.

(e) 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세포로 분화 가능하다.

(f) TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, PFGF-bb로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인을 분비한다.

본 발명에서 사용된 용어 '제대혈'은 포유동물의 태반과 태아를 연결하는 제대정맥으로부터 채취된 혈액을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '지방조직'은 지방세포 및 미세혈관 세포를 비롯해 복수 세포형을 포함하는 조직을 말한다. 또한, 상기 지방조직은 지방을 저장하는 연결조직을 포함한다.

상기 제대혈은 출산시 공여자의 제대정맥으로부터 용이하게 채취할 수 있다. 보다 구체적으로, 정상질식분만의 경우에는 출산 후 자궁 내에 아직 태반이 남아있는 상태에서 밖으로 만출된 제대정맥으로부터 채취할 수 있다. 또는 제왕절개의 경우에는 아기 출산 후 태반 역시 자궁 밖으로 만출된 상태에서 제대정맥으로부터 채취한다.

상기 지방조직은 당업자에게 알려진 임의의 방법으로 수득할 수 있다. 예를 들면, 지방조직은 흡입 보조 지방흡입술, 초음파 보조 지방흡입술 및 절개 지방조직제거술 및 이들을 조합한 방법에 의해 수득될 수 있다.

상기에서 수득한 제대혈 또는 지방조직으로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 성체줄기세포를 분리할 수 있다. 상기 성체줄기세포의 분리는 종래 알려진 어떤 분리방법에 의해서도 분리될 수 있다.

예를 들면, 밀도차를 이용한 분리법(density gradient fractionation), 면역선택(immunoselection) 및 감별 부착 분리법(differential adhesion separation) 등이 있다.

제대혈로부터 줄기세포를 분리, 배양하는 방법은 대한민국 특허출원 10-2009-0023821호의 방법을 비롯하여 기존에 사용되어 온 방법은 모두 사용할 수 있다.

지방조직으로부터 줄기세포를 분리, 배양하는 방법은 공지된 방법을 모두 사용할 수 있다.

하나의 실시양태로서, 지방조직에 콜라게나제를 분해에 충분한 농도로 처리하고 적합한 조건(온도 및 시간)하에서 배양한 다음 원심분리 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 부유 지방세포를 분리하고 침전 간질 분획을 조직 배양함으로써 성체줄기세포를 분리한다.

상기에서 분리된 성체줄기세포의 배양은 당업계에 공지된 세포 배양용 배지에서 수행할 수 있으며, 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, DMEM 배지, McCoys 5A 배지, Eagls'basal 배지, CMRL 배지, Glasgow 최소 필수 배지, Ham's F-12 배지, Iscove's modified Dulbecco's 배지, Liebovitz' L-15 배지, RPMI 1640 배지 등이 있다. 또한, 본 발명에서 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 첨가할 수 있는데, 소 태아 혈청, 말 또는 사람 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 항생제 및 항진균제 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 대한민국 특허출원 10-2009-0023821호에 개시된 세포 배양 배지를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

분리 또는 배양된 줄기세포는 사용전까지 당업계에 공지된 방법에 의해 보관될 수 있다. 일반적으로 줄기세포는 동결보호(cyoprotection) 처리한 후 냉동 보관할 수 있다. 상기 동결보호 처리는 당업계에 공지된 DMSO, 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민, 덱스트란, 수크로스, 에틸렌 글리콜, i-에리스리톨, D-리비톨, D-만니톨 , D-솔비톨, i-이노시톨, D-락토스 또는 콜린 클로라이드와 같은 동결보호제를 이용하여 수행할 수 있다.

또한, 성체줄기세포를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 줄기세포 및 이를 이식받을 수혜자에 대해 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 약학적으로 허용되는 희석제의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 주사제의 형태로 제제화되는 것이 바람직하며, 투여경로로는 경피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하내, 비강내, 척수강내, 구강내, 경로를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 종양내 직접 투여용으로 제형화할 수도 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 도관법을 사용하여 적용될 수도 있는데, 말초 정맥 접근법에 있어서, 세포는 단일 덩어리 또는 여러 개의 더 작은 분취량으로 도관을 통해 주사될 수 있다. 도관을 이용한 세포의 투여는 예를 들면, 표준 말초 정맥내 도관, 중앙 정맥 도관, 또는 폐동맥 도관을 통한 정맥내 전달을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 투여경로, 치료 회수, 치료가 필요한 개체의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인을 고려하여 당업자가 상술한 특정 용도에 따른 적절한 유효량을 결정할 수 있다.

본 발명에 의하면, 제대혈 또는 지방조직 유래 성체줄기세포는 아폽토시스를 유도하여 암세포의 성장을 억제하고, 암세포의 폐 등 다른 장기로의 전이를 억제하여, 효과적으로 유방암을 치료할 수 있다.

도 1은 사람 UCB 및 AD MSC 이식이 종양 성장을 억제함을 나타낸 것으로서, (A)는 마우스 유방의 지방 패드에 주입된 GFP-MDA-MB-231세포가 녹색 형광을 띤 종양을 생성함을 나타낸 것이고, (B)는 당해 프로토콜을 나타낸 것이며, (C)는 UCB 및 AD MSC가 종양 성장을 억제함을 나타낸 것이다.
도 2는 사람 UCB 및 AD MSC 이식이 폐로의 전이를 억제함을 나타낸 것으로서, (A)는 마우스 유방의 지방 패드에 주입된 GFP-MDA-MB-231세포가 폐로 전이될 수 있다는 것을 나타낸 것이고, (B)는 UCB 및 AD MSC가 대조군에 비해 폐 전이를 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸 것이며, (C)는 UCB 또는 AD MSC 처리군 및 대조군에 대한 H&E 염색 결과를 나타낸 것으로 종양 콜로니는 적색 원으로 표시하였다.
도 3은 사람 UCB 및 AD MSC는 폐와 일차 종양 부위로 귀소함을 나타낸 것으로서, (A)는 UCB 및 AD MSC가 일차 종양 부위와 폐서 접목되었음을 나타낸 것이고, 여기서, 적색은 PKH26으로 라벨링된 UCB 및 AD MSC를 나타낸 것이며, (B)는 일차 종양과 폐로 전이된 콜로니에 존재하는 MSC의 개수를 정량하여 나타낸 것이다.
도 4는 사람 UCB 및 AD MSC가 PARP 및 카스파제-3의 절단을 유도함을 나타낸 것으로서, (A)는 절단된 PARP 면역반응력이 종양 절편에서는 보여지는 반면, 폐로 전이된 콜로니 절편에서는 드물다는 것을 나타낸 것이고, (B)는 종양 절편에서 면역양성인 세포의 개수를 정량하여 나타낸 것이며, (C)는 종양으로부터 추출한 단백질에 대한 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 사람 UCB 및 AD MSC가 초기 단계부터 종양 진행을 억제함을 나타낸 것으로서, (A)는 당해 프로토콜을 나타낸 것이고, (B)는 사람 USC 및 AD MSC에 의해 종양 형성과 진행이 억제됨을 나타낸 것이며, (C)는 폐 전이 지수를 정량하여 나타낸 것이다.
도 6은 사람 UCB 및 AD MSC의 정맥 이식은 마우스 유방암 모델에서 안전함을 나타낸 것으로서, (A)는 당해 프로토콜을 나타낸 것이고, (B)는 종양 형성과 진행이 사람 USC에 의해서는 억제되지만 AD MSC에 의해서는 억제되지 않음을 나타낸 것이며, (C)는 사람 UCB 처리군에서 폐 전이 콜로니 개수는 AD MSC 또는 대조군에 비해 더 적음을 나타낸 것이다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

＜실시예 1: 재료 및 방법＞

실시예 1-1: 세포주

사람 유방암 세포주 MDA-MB-231을 ATCC(Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. MDA-MB-231 세포를 10% 열로 불활성화시킨 FBS(fetal bovine serum; Gibco), 페니실린(100 U/ml; Gibco) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/ml; Gibco)을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; Gibco BRL, Grand Island, NY)에서 37℃, CO₂ 대기에서 유지하였다.

렌티바이러스를 ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 제조하였다. 리포펙타민 2000(Invitrogen)이 SHC003(벡터 대조군)(Sigma, St Louis, MO, USA)을 293FT 세포(Invitrogen)로 형질감염시키는데 이용되었다. 세포 배양 배지는 형질감염 후 그 날 교환하고, 상층액을 형질감염 후 48 및 72시간에 회수하였다. 바이러스의 상층액을 0.4 ㎛(Invitrogen)에서 여과하였다. MDA-MB-231 세포를 10MOI(multiplicities of infection)의 Turbo-GFP-렌티바이러스로 형질변환하였다. 폴리브렌(Sigma)을 최종 농도 6 ㎍/ml가 되도록 세포 배양 배지에 첨가하였다. 세포 배양 배지는 형질변환 후 그 날에 새로운 배양 배지로 교환해주었다. 선별을 위해, 세포 배양 배지에 푸로마이신(Sigma)을 최종 농도 3 ㎍/ml로 첨가하여 3일 동안 두었다.

실시예 1-2: 사람 UCB MSC의 분리 및 배양

UCB 시료를 산모의 사전 동의를 받은 후 분만 직후 제대혈로부터 수득하였다. 이 프로토콜은 보라매 병원 IRB(Institutional Review Board) 및 서울대학교 IRB의 승인을 받았다. UCB MSC는 공지의 방법을 약간 수정하여 수득하였다. UCB 시료와 Hetasep 용액(StemCell Technologies, Vancouver, Canada)을 5:1의 비율로 혼합한 후 실온에서 30-100분간 정치배양하여 적혈구를 제거하였다. 상층액을 조심스럽게 회수한 후 2500 r.p.m.으로 20분간 Ficoll 밀도 구배 원심하여 단핵세포를 수득하였다. 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 1 또는 2회 세척하고, 37℃, 5% CO₂의 습한 대기에서 2 x 10⁵ - 2 x 10⁶ 세포/cm²의 밀도로 접종하였다. 성장 배지는 헤파린(heparin), 아스코르브산(ascorbic acid), rhEGF(recombinant human epidermal growth factor), 하이드로코르티손(hydrocortisone), VEGF(vascular endothelial growth factor), rhFGF-B(recombinant human fibroblast growth factor), R³-IGF-1(recombinant long R insulin-like growth factor-1), GA-100(gentamycin sulfate, amphotericin-B) 및 10% FBS(Gibco)를 함유하는 D-media (formula no. 78-5470EF; Gibco)로 구성하였다. 3 내지 4일 배양 후 비부착 세포를 제거하고 배지를 교환하였다. 그 후 배지는 일주일에 3회 교환하였다. 부착 세포는 접종 후 약 10-14일쯤 콜로니를 형성하였고 그 후 선 형태로 빠르게 성장하였다.

실시예 1-3: 사람 AD MSC의 분리 및 배양

AD MSC는, 미용상의 이유로 유방 축소술을 한 여성의 수술시 수득한 유방 지방 조직으로부터 분리하였다. 모든 과정은 서울대 IRB의 사전 승인을 받았다. AD MSC는 공지의 방법에 따라 분리하고 배양하였다. 세포를 1회 또는 2회 PBS로 세척하고, 37℃ 5% CO₂의 습한 대기에서 0.1 mg/ml에 2 x 10⁵- 2 x 10⁶ 세포/cm²의 밀도로 접종하였다. 지방 조직을 동량의 PBS(Gibco)로 세척한 후 다지고(mince) 콜라겐 타입 I(1 mg/ml; Gibco)으로 37℃에서 2시간 동안 소화시켰다. 소화된 조직을 PBS로 세척하고 5분 동안 1000 r.p.m으로 원심분리하여 펠렛을 회수하였다. 펠렛을 100 ㎛ 나일론 메쉬(BD Bioscience, San Jose, Ca, USA)로 여과하여 세포 데브리스를 제거하고 10% FBS(Gibco)로 보충된 DMEM에서 5% 습한 CO₂ 대기에서 37℃, 하룻밤동안 정치배양하였다. 24시간 후 부착되지 않은 세포와 잔류 비부착 적혈구를 PBS로 세척하여 제거하고 세포 배지를 K-NAC 배지로 교환하였다. K-NAC 배지는 NAC(N-acetyl-L-cysteine; 2mM; Sigma) 및 Asc 2P(L-ascorbic acid 2-phosphate; 2mM; sigma)를 포함하는 변형된 MCDB 153 배지(keratinocyte -SFM; Gibco-Invitrogen Corporation)이다. 배지 중 칼슘 농도는 0.09 mM이었다. 이 배지에 첨가된 성장 인자와 호르몬은 rEGF(recombinant epidermal growth factor; 5 ng/mL), BPE(bovine pituitary extract; 50 ㎍/mL), 인슐린(5 ㎍/mL) 및 하이드로코르티손 (74 ng/mL)이었다. 배지는 세포가 콘플루언트에 도달할 때까지 48시간 간격으로 교환하였다. 세포가 90% 이상의 콘플루언스에 도달하였을 때 트립신 처리하여 액체 질소에 저장하거나 계대 배양하였다.

실시예 1-4: 폐와 종양에서 MSC 귀소(homing)의 결정

MSC는 제조업자에 의해 제공된 프로토콜에 따라 형광 염료 PKH26(Sigma)로 라벨링하였다. 종양 세포 주입 후 36일째에 마우스를 살상할 때 폐와 종양을 회수하였다. 시료는 얼음으로 차갑게 한 PBS로 세척한 후 즉시 OCT 화합물(Tissue Tek, Miles, Naperville, IL, USA)에 포매하였다. 10-마이크로미터 절편은 형광 현미경을 이용하여 적색 신호에 대해 스크리닝하였다. 모든 과정은 조직 회수 24시간 내에 마무리하였다.

실시예 1-5: 동물 실험

모든 마우스 실험은 서울대학교의 실험동물 관리 및 이용 위원회에 의해 승인된 프로토콜(SNU-080304-2)에 따라 수행되었다. 암컷 NOD/SCID 마우스는 한국생명공학연구원(Korea)으로부터 구입하였다. 동물을 병원균이 없는 환경에 수용하고, 멸균된 식이와 물을 공급하였다. 세포를 PBS로 1 또는 2회 세척하고 37℃, 5% CO₂의 습한 대기에서 0.1 mg/ml에 2 x 10⁵-2x 10⁶ 세포/cm²의 밀도로 접종하였다. 지정된 개수의 세포를 100㎕ 용적의 멸균된 PBS에 넣어 유방의 지방 패드(pad) 또는 꼬리 정맥으로 주입하였다. 6주령의 NOD/SCID 마우스가 이용되었다. 10마리의 마우스가 각 그룹에서 이용되었다. 종양은 정밀 칼리퍼를 이용하여 1주당 2회 측정하였다. 종양 부피는 다음 같이 계산되었다: 부피 = (길이 x 너비²)/2. 마우스를 종양 세포 이식 후 36일째에 살상하였다.

실시예 1-6: 폐 전이의 정량

마우스를 CO₂ 질식법을 이용하여 살상하고 전체 폐를 적출하였다. 폐를 얼음으로 차갑게 한 PBS로 세척한 후 얼음으로 차갑게 한 HBSS(Hank's buffered salt solution; Gibco)에 넣었다. 엽(lobe)을 명시야 현미경 하에서 절개하고, 부검 후 24시간에 전형적으로 출현하는 조직의 자가형광을 방지하기 위해, 절개 20시간 내에 형광 현미경으로 조사하였다. 폐 전이는 형광 현미경 하에서 관찰되는 GFP-양성 콜로니의 개수로 평가되었다. 각 마우스별 폐 전이지수는 폐에서 관찰된 GFP-양성 콜로니의 개수를 일차 종양의 질량(g)으로 나눔으로써 계산되었다.

실시예 1-7: 조직학적 분석

조직학적 분석을 위해, 파라핀 절편을 자일렌에서 탈파라핀화하고 구배진 일련의 알코올을 통해 재수화한 후 H&E (hematoxlin and eosin)로 염색하였다.

실시예 1-8: 면역조직화학

면역조직화학 분석이 포르말린으로 고정되고 파라핀으로 포매된 조직에 대해 수행되었다. 5-마이크로미터 두께의 절편을 탈파라핀화하고, 재수화한 후 항원 재생을 진행하였다. 절편을 3% 과산화수소(AppliChem, Darmstadt, Germany)에서 30분간 정치배양하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 억제시켰다. 조직 절편을 PBS로 세척한 후 PBS에 녹인 5% BSA(bovine serum albumin; Sigma)와 실온에서 1시간 동안 정치배양하여 비특이적인 결합 자리를 차단하였다. PARP(poly(ADP-ribose) polymerase-1; Cell Signaling, Beverly, MA, USA)에 대한 일차 항체를 조직 절편으로 4℃에서 1시간 동안 적용하였다. 다음 날, 조직 절편을 세척하고 이차 HRP-접합된 Ab와 실온에서 1시간 동안 정치배양하였다. 조직 절편을 조심스럽게 세척한 후 Mayer's hematoxylin(Dako, Carpinteria, CA, USA)로 대조염색하고 자일렌으로 세척하였다. 커버 슬립은 Permount(Fisher Scientific)를 이용하여 표본 제작되었고, 슬라이드는 광 현미경(Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA)을 이용하여 관찰되었다.

실시예 1-9: 웨스턴 블랏 분석

종양 시료로부터 추출된, 균질화된 용해물의 단백질 농도를 측정한 후 10㎍의 단백질을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gen electrophoresis)를 이용하여 분리하고 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인 상으로 트랜스블로팅하였다. 블랏은 0.05% Tween-20을 함유한 가루화된 무지방밀크 용액(PBS에 녹여 5%)으로 차단한 후 5% 차단 용액으로 1:1000 희석한 폴리클로날 래비트 항-사람 절단된 PARP(Cell Signaling) 및 래비트 항-사람 절단된 카스파제-3(Cell Signaling)로 4℃에서 하룻밤동안 프로브하였다. 1:5000으로 희석한 항-래비트 IgG를 이차 항체로서 이용하였다. 절단된 PARP 밴드를 ECL 키트(enhanced chemiluminescence; Amersham Bioscience/GE Healthcare, Little Chalfont, UK)로 검출하였다.

＜실시예 2: 결과＞

2-1. 사람 UCB 및 AD MSC의 이식은 종양 성장을 억제함

AD MSC의 MSC로서의 특성은 이미 입증되었다. UCB MSC는 MSC 표면 항원을 발현하였다. MDA-MB-231 사람 유방암 세포는 Turbo-GFP에 의해 형질변환되었다. GFP의 고발현이 푸로마이신에 의한 선별 후 3일째에 관찰되었다(데이터 미도시). 이어서, 2 x 10⁶의 GFP로 라벨링된 MDA-MB-231 세포를 좌측 가슴안 유방 지방 패드로 주입하였다. 종양은 이식 후 7일째에 관찰되었다. 도 1B는 GFP로 라벨링된 MDA-MB-231 세포에 의해 생성되는 종양의 녹색 형광을 나타낸 것이다. 종양 부피는 종양 세포 주입 후 22일째에 약 200mm³로 증가하였다. 22일째에, 1 x 10⁶ 사람 UCB 또는 AD MSC를 PKH26으로 라벨링한 후 정맥으로 주입하였다. 이 과정은 도 1A에 나타내었다. 사람 UCB 또는 AD MSC의 이식 후 종양의 성장이 억제되었다. 36일째에 MSC로 처리된 종양은 대조군에 비해 현저하게 작아졌다(도 1C).

2-2. 사람 UCB 및 AD MSC 이식은 폐 전이를 억제함

유방암세포는 폐로 전이할 수 있다. 줄기세포 이식 후 14일째에 폐로의 전이 개수를 비교하였다. UCB 및 AD MSC 모두 대조군에 비해 50%까지 폐로의 전이 개수를 감소시켰다(도 2B). H&E 염색이 파라핀 절편에 대해 수행되었다. 그룹 간 형태학적 차이는 도 2C에 나타내었다.

2-3. 사람 UCB 및 AD MSC는 폐와 일차 종양 부위로 귀소함

이식된 MSC의 일차 종양 부위 및 폐로의 귀소 능력을 추적하기 위해, UCB 및 AD MSC 모두 PKH261로 라벨링하였다. 라벨링된 UCB 또는 AD MSC를 종양을 보유한 마우스에 정맥으로 투여하였다. 줄기 세포 이식 후 14일째에 동물을 살상하고 조직을 회수하였다. 10-마이크로미터 절편 슬라이드를 준비하여 줄기 세포의 귀소를 검출하였다(각 그룹은 n = 5이고, 각 마우스별로 10개의 절편이 준비됨). 도 3에 나타낸 바와 같이, UCB 및 AD MSC는 일차 종양 위치와 폐에 접목되어 존재하였다. MSC의 개수를 정량화하여 도 3B에 나타내었다.

2-4. 사람 UCB 및 AD는 PARP 절단을 유도함

종양 성장 억제의 메커니즘을 조사하기 위해 면역조직화학이 수행되었다. 아폽토시스 시그널링이 이 과정에 관여할 것이라고 가정하였다. PARP는 세포 생존의 유지에 중요한 단백질로서 간주되고 있다; 카스파제 단백질의 주요 절단 타겟이다. 폐와 종양을 줄기 세포 주입 후 14일째에 마우스로부터 추출하였다. 5-마이크로미터 파라핀 절편을 준비하였다(각 그룹은 n = 5이고, 각 마우스별로 10개의 절편이 준비됨). 도 4A에 나타낸 바와 같이, 종양 절편은 절단된 PARP에 대하여 양성인 면역반응력을 나타내었다. 그러나, PARP 면역반응력은 폐 전이 절편에서 희귀하였다.

사람 UCB 또는 AD MSC가 PARP 절단에 관여하는지 여부를 추가로 조사하기 위해, 단백질을 종양과 폐로부터 추출하여 웨스턴 블로팅을 진행하였다. PARP와 카스파제-3의 절단 증가는 UCB 및 AD MSC 처리가 종양 조직에서 아폽토시스를 유도한다는 것을 의미하였다(도 4C). 그러나, 폐에 접목된 사람 MSC의 개수가 제한되어 있어, 폐 시료에서 PARP와 카스파제-3의 절단은 검출할 수 없었다.

2-5. 사람 UCB 및 AD MSC는 초기 단계부터 종양의 진행을 억제함

유방암의 초기 단계에서 UCB 및 AD MSC의 영향을 추가로 조사하였다. 이 프로토콜은 도 5A에 나타내었다. 1 x 10⁶ GFP로 라벨링된 사람 MDA-MB-231 세포를 사람 UCB 및 AD MSC와 혼합한 후 마우스 유방 지방 패드에 주입하였다. 종양 형성과 진행은 사람 USC 및 AD MSC에 의해 억제되었다(도 5B). 42일째에 UCB 및 AD MSC가 이식된 그룹 모두에서 종양의 부피는 대조군에 비해 작았다. UCB MSC 처리군에서 종양의 부피는 AD MSC 처리군에 비해 현저하게 작았다. 폐 전이 지수는 도 5C에 나타내었다. UCB MSC 처리군에서 전이된 폐의 콜로니 개수는 AD MSC 처리군에 비해 적었다. 그러나, 두 가지 유형의 줄기 세포 모두 폐 전이를 억제하였다(도 5C).

2-6. 사람 UCB 및 AD MSC의 정맥 이식은 마우스 유방암 모델에서 안전함

어떤 질환의 환자에게 줄기세포를 제공하기 전에 잠재적인 위험이 주의 깊게 평가되어야 한다. 정맥 투여는 세포치료에서 광범위하게 이용되었다. 줄기세포가 암형성과 전이를 촉진할 수 있다는 것이 알려져 있으므로 줄기세포의 정맥투여가 임상 증상을 보이지 않는 초기 단계 암 모델에서 평가되어야 한다. 본 발명에서는 1 x 10⁶ GFP로 라벨링된 사람 MDA-MB-231 세포를 마우스 유방 지방 패드에 주입하였다. 같은 날, 사람 UCB 및 AD MSC를 정맥으로 투여하였다. 종양 형성과 진행은 UCB MSC에 의해서는 억제되었으나, AD MSC에 의해서는 억제되지 않았다(도 6B). 42일째에 UCB MSC로 이식된 그룹에서 종양의 부피는 AD MSC 및 대조군보다 더 작았다. AD MSC 처리군과 대조군 간에는 유의적인 차이가 없었다. 폐 전이 지수는 도 6C에 나타내었다. UCB MSC 처리군에서 전이된 폐 콜로니의 개수는 AD MSC 처리군 및 대조군 보다 적었다. 따라서, AD MSC 투여 후 종양 형성과 전이에 어떤 영향도 주지 않는 것으로 나타났다(도 6C).

Claims

분리된 지방조직 유래 성체줄기세포를 함유하는 항암용 조성물.