KR20160120726A - 암 치료용 의약 조성물 및 그 조성물을 유효 성분으로 하는 암 치료용 의약 제제 - Google Patents
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Abstract
고형 암에 대해서 효과가 높고, 화학 요법제와 같은 부작용이 없고, 내성화를 일으키기 어려운 새로운 항암 치료약을 제공하는 것을 목적으로 한다. 포유류의 치수로부터 얻은 유치 치수 줄기세포에 4종류의 유전자를 도입해서 불사화 줄기세포로 하는 줄기세포 제작 공정과, 상기 불사화 줄기세포를 무혈청 배양 중에서 소정의 기간 산소 농도가 0.5% 이상 20% 미만인 저산소 농도 조건 하에서 23~27℃에서 배양하고, 컨디션 배양을 조제하는 컨디션 배지 조제 공정을 구비하는 방법에 의해 조제되고, 산소 농도를 20%로 한 것 이외에는 같은 조건 하에서 배양한 경우에 조제되는 컨디션 배지에 비해 1.5배 이상의 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1) 및 혈관내피세포 증식 인자(VEGF)를 포함하는 암 치료용 의약 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 암 치료용 의약 조성물 및 그 조성물을 유효 성분으로 하는 암 치료용 의약 제제에 관한 것이다. 보다 상세하게는 포유류의 치수 줄기세포의 배양 상청을 사용한 암 치료용 의약 조성물 및 그 조성물을 유효 성분으로 하는 암 치료용 의약 제제에 관한 것이다.
체 내의 미소 환경에 있어서의 저산소 응답은 발생시의 기관 형성, 줄기세포 증식 등에 기능하는 것 및 저산소 응답의 기능은 암이나 허혈성 질환 등의 병에도 관여하고 있는 것이 알려져 있다.
또한, 저산소 환경은 다수의 유전자 발현을 조정하고, 세포의 증식, 분화, 아포토시스 등의 세포 응답 등을 제어한다.
한편, 암의 치료를 위해 여러 가지 항암제가 개발되어 왔다. 이러한 항암제로서는, 예를 들면 DNA 합성 조해제인 시타라빈, 플루오로우라실, 메르캅토푸린, 티오구아닌, 빈카알카로이드인 빈브라스틴이나 빈크리스틴, 프로카르바진, 알킬화제인 무스틴, 시클로포스파미드, 시스플라틴, 항생 물질인 악티노마이신 D, 독소루비신, 마이트마이신, 미스라마이신, 블레오마이신, 스테로이드 호르몬인 당질 코르티코이드, 에스트로겐, 항에스트로겐, 안드로겐 등을 들 수 있다.
시타라빈은 DNA 폴리메라아제를 저해하고, 플루오로우라실은 티미딜산 합성 효소를 저해하고, 피리미딘 합성을 억제한다. 메르캅토푸린이나 티오구아닌은 푸린 합성을 저해한다. 빈브라스틴이나 빈크리스틴은 M기에 특이적으로 작용하고, 튜불린과 결합해서 방추를 파괴하여 유사 분열을 정지시킨다. 프로카르바진은 2중쇄 DNA의 해중합을 발생시키고, 무스틴, 시클로포스파미드, 시스플라틴 등은 공유 교차 결합을 발생시켜 DNA 합성을 저해한다. 악티노마이신 D, 독소루비신, 마이트마이신, 미스라마이신 등은 인터칼레이터이며, 2중쇄 DNA의 염기쌍 사이에 들어가서 RNA의 생산을 차단한다. 또한, 블레오마이신은 2중쇄 DNA의 절단을 일으킨다. 당질 코르티코이드, 에스트로겐, 항에스트로겐, 안드로겐 등은 RNA 합성 후의 단백질 합성을 저해한다.
이들 외에도 많은 항암제가 개발되어서 치료에 사용되어 일정한 치료 효과를 들어 왔다.
Yue Wang, et al., PLOS ONE, January 2013, Vol.8, Issue 1, e54296
M. Celeste Simon and Brian Keith, Nature Reviews/ Molecular Cell Biology, April 2008, Vol.9, pp.285-296
WO 2011/118795호 공보에는 줄기세포를 배양함으로써 얻어진 줄기세포 배양 상청을 포함하는 표적 조직의 손상부를 수복하기 위한 손상부 치료용 조성물이 개시되어 있다(이하, 「종래 기술 1」이라고 한다).
종래 기술 1은 일반적인 산소 농도 조건 하에서 배양한 혈관내피 증식 인자(VEGF), 줄기세포 증식 인자(HGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 형질 전환 성장 인자-베타(beta)(TGF-β)로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 사이토카인을 포함하는 줄기세포의 배양 상청이 여러 가지 질병에 의해 손상을 받은 조직, 예를 들면 중추 신경 조직, 피부 조직, 치주 조직, 뼈 조직, 뇌 조직, 망막 조직의 치료에 사용할 수 있는 것을 발견하고, 주요한 사인 중 하나인 심질환이나 뇌혈관 질환에 의해 손상된 조직의 치료제를 개발했다는 점에서는 우수한 기술이다. 그러나, 주요한 사인 중 하나인 종양(암)에 대해서는 검토가 이루어져 있지 않다.
암의 치료에 관해서는 상기와 같은 항암제를 사용해서 화학 요법이 행해지는 경우가 많지만, 임상에서는 항암제가 효과가 없어지는(내성화되는) 경우가 종종 보인다. 내성화의 기서로서는, 예를 들면 간장에 있어서의 항암제의 불활화나 대사의 항진 등, 암환자의 생체 반응에 기인하는 경우나, 암세포 레벨의 생화학적 변화에 기인하는 경우가 있다. 이들 중 후자에서는 다제내성에 관여하는 항암제의 막 수송 기구의 변화, 표적 효소나 단백질의 증폭, 약제 활성화 기구, 효소의 활성의 저하, 예를 들면 DNA 수복 기구의 항진, 항암제의 불활화 기구의 항진 등이 일어나고 있는 것으로 여겨진다. 또한, 항암제는 강한 부작용을 갖는 사람이 많아 부작용에 의해 환자가 사망하는 케이스도 있다.
이 때문에, 부작용이 적은 암 치료법에 대한 요구는 높다. 이러한 부작용이 적은 치료법으로서 면역 요법이 주목을 받고 있지만, 종양 제어능이 낮아 확실히 종양을 박멸하는 것은 곤란하다. 이것은 면역 요법이 면역의 주체인 림파구나 NK세포를 이용하는 것에 기인하는 것이며, 또한 림파구나 NK세포가 본래는 감염증 대응 세포이기 때문에 고형암으로의 억제 효과가 작은 것에 의한 것이다.
따라서, 고형암에 대해서 효과가 높고, 화학 요법제와 같은 부작용이 없고, 내성화를 일으키기 어려운 새로운 항암 치료약의 개발에 대한 강한 사회적 요청이 있다.
본원발명의 발명자들은 이러한 상황 하에서 유치 줄기세포(SHED)의 생물학적 능력에 대한 연구를 진행하고, 그 과정에 있어서, SHED의 배양 상청(이하, 「SHED-CM」이라고 하는 경우가 있다)이 매크로파지(이하, 「M」으로 생략하는 경우가 있다)의 기능을 제어하는 것을 발견하여 본원발명을 완성했다.
즉, 본원발명의 일실시형태는 포유류의 치수로부터 얻은 유치 치수 줄기세포에 4종류의 유전자를 도입해서 불사화 줄기세포로 하는 줄기세포 제작 공정과; 상기 불사화 줄기세포를 무혈청 배양지 중에서 소정의 시간, 산소 농도가 0.5% 이상 20% 미만인 저산소 농도 조건 하에서 23~27℃에서 배양하고, 컨디션 배지를 조제하는 컨디션 배지 조제 공정을 구비하는 방법에 의해 조제되고, 산소 농도를 20%로 한 것 이외에는 같은 조건 하에서 배양했을 경우에 조제되는 컨디션 배지에 비해 1.5배 이상의 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1) 및 1.5배 이상의 혈관내피세포 증식 인자(VEGF)를 포함하는 암 치료용 의약 조성물이다.
여기에서, 상기 소정의 시간은 40~56시간인 것이 바람직하고, 상기 저산소 농도는 산소 농도 5% 이하인 것이 바람직하다. 또한, 상기 저산소 농도는 산소 농도 1% 이하인 것이 바람직하다. 상기 4종류의 유전자는 hTERT, bmi-1, E6, E7, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 p16INK4a로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 방법에 의해 조제된 암 치료용 의약 조성물은 산소 농도를 20%로 한 것 이외에는 같은 조건 하에서 배양했을 경우에 비해 5배 이상의 트랜스포밍 인자β(TGF-β1)를 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기 의약 조성물은 3배 이상의 스트로마세포 유래 인자(SDF-1)를 더 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본원발명의 다른 실시형태는 상기와 같이 해서 얻어진 컨디션 배지를 유효 성분으로서 함유하는 암 치료용 의약 제제이다. 상기 암은 고형 종양인 것이 바람직하다.
(발명의 효과)
본 발명에 의하면 소정의 배양 조건 하에 저산소 농도에서 배양함으로써 산소 농도를 20%로 해서 배양했을 경우보다 유의하게 높은 농도의 IGF-1 및 VEGF를 포함하는 의약 조성물을 얻을 수 있다.
그리고, 이 의약 조성물을 투여함으로써 고형 종양 주위에 모이는 매크로파지의 파퓰레이션을 제어해서 암세포의 증식을 억제하거나, 암세포를 사멸시킬 수 있다.
도 1은 상술한 치수세포로부터 선택된 불사화 줄기세포와, 불사화 줄기세포가 아닌 세포의 개체 배가 횟수와 배양 기간의 관계를 나타내는 그래프이다. 도 1 중 SHED-T는 불사화 줄기세포를 나타내고, SHED-C는 불사화 줄기세포가 아닌 세포를 나타낸다.
도 2는 SHED-C 및 SHED-T에서의 STRO-1 발현의 결과를 나타내는 그래프이다(도 2(A)~도 2(D)). 도면 중 PD20은 개체수 배가 횟수=20회, PD30은 개체수 배가 횟수=30회 및 PD40은 개체수 배가 횟수=40회를 나타낸다.
도 3은 하기의 도 4에 나타내는 각 개체 배가 시간일 때의 SHED-C(D)~SHED-C(F)와 SHED-T(A)~SHED-T(C)의 조직 염색상을 나타내는 도면이다.
도 4는 개체 배가 시간(횟수)과 신생 골량의 관계를 나타내는 그래프이며, 도면 중 **은 p<0.05, ***은 p<0.01을 나타낸다. 신생 골량은 이하의 산출식에 의해 구했다. 신생 골량=신생 골면적/시야 면적×100
도 5는 SCCⅦ을 피하에 주사한 후의 종양의 크기가 배양 조건이 다른 SHED의 배양 상청을 투여했을 때에 어떻게 변화되는지 경시적으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중 *은 ANOVA 검정의 결과 p<0.05를, 또한 **은 p<0.001을 나타낸다.
도 6은 직경 10㎜를 초과하는 크기의 종양(A)이 완전히 퇴축된 증례(B)를 나타내는 도면이다.
도 7은 SCCⅦ를 피하 주사한 각 군의 마우스의 경시적인 생존율을 나타내는 도면이다.
도 8은 종양이 형성된 마우스에 IVIS(등록상표) XenoLight DiR(Summit Pharmaceuticals International Corporation)에서 표지한 매크로파지 1×107개를 꼬리 정맥으로부터 주입하여 in vivo 이미징한 상이다.
도 9는 SCCⅦ에 의해 고형 종양이 형성된 마우스의 복강 내 매크로파지의 파퓰레이션의 변화를 도시한 도면이다.
도 10은 마우스 편평상피암 주SCCⅦ를 피하 주사해서 형성된 고형 종양의 조직학적 검색 결과(헤마톡실린-에오신 염색상)이다.
도 2는 SHED-C 및 SHED-T에서의 STRO-1 발현의 결과를 나타내는 그래프이다(도 2(A)~도 2(D)). 도면 중 PD20은 개체수 배가 횟수=20회, PD30은 개체수 배가 횟수=30회 및 PD40은 개체수 배가 횟수=40회를 나타낸다.
도 3은 하기의 도 4에 나타내는 각 개체 배가 시간일 때의 SHED-C(D)~SHED-C(F)와 SHED-T(A)~SHED-T(C)의 조직 염색상을 나타내는 도면이다.
도 4는 개체 배가 시간(횟수)과 신생 골량의 관계를 나타내는 그래프이며, 도면 중 **은 p<0.05, ***은 p<0.01을 나타낸다. 신생 골량은 이하의 산출식에 의해 구했다. 신생 골량=신생 골면적/시야 면적×100
도 5는 SCCⅦ을 피하에 주사한 후의 종양의 크기가 배양 조건이 다른 SHED의 배양 상청을 투여했을 때에 어떻게 변화되는지 경시적으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중 *은 ANOVA 검정의 결과 p<0.05를, 또한 **은 p<0.001을 나타낸다.
도 6은 직경 10㎜를 초과하는 크기의 종양(A)이 완전히 퇴축된 증례(B)를 나타내는 도면이다.
도 7은 SCCⅦ를 피하 주사한 각 군의 마우스의 경시적인 생존율을 나타내는 도면이다.
도 8은 종양이 형성된 마우스에 IVIS(등록상표) XenoLight DiR(Summit Pharmaceuticals International Corporation)에서 표지한 매크로파지 1×107개를 꼬리 정맥으로부터 주입하여 in vivo 이미징한 상이다.
도 9는 SCCⅦ에 의해 고형 종양이 형성된 마우스의 복강 내 매크로파지의 파퓰레이션의 변화를 도시한 도면이다.
도 10은 마우스 편평상피암 주SCCⅦ를 피하 주사해서 형성된 고형 종양의 조직학적 검색 결과(헤마톡실린-에오신 염색상)이다.
이하에 본 발명을 더 상세하게 설명한다.
본원발명의 불사화 줄기세포를 얻는 데에는, 우선 포유류의 간엽계 세포, 초기 발생배 및 체세포로부터 줄기세포를 단리한다. 상기 포유류로서는 인간, 돼지, 말 및 원숭이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 인간세포와의 유전적 유사성이 높은 점 및 감염의 위험성이 낮은 점으로부터 바람직하다.
본 명세서 중 「간엽계 세포」란 골아세포, 지방세포, 근육세포, 연골세포 등 간엽계에 속하는 세포로의 분화능을 갖는다는 세포를 말한다. 구체적인 간엽계 세포로서는 상기 동물의 치수세포, 골수세포, 탯줄세포 및 지방세포 등을 들 수 있다. 또한, 「초기 발생배」란 ES세포를 수립하기 위해 필요한 수정란보다 발생이 진행된 배반포까지의 초기 단계의 배를 말한다. 「체세포」란 생물체를 구성하고 있는 세포 중 생식세포 이외의 세포를 총칭한 것을 말한다.
또한, 「치수세포」란 재생능을 갖는 치의 신경에 포함되는 줄기세포의 일종을 말한다. 치라는 경질의 재료로 보호되어 있기 때문에 자외선이나 방사선을 통하지 않고, 유전자도 상처받기 어렵다는 특성을 갖는다. 「골수세포」란 골수의 천자액 중에 얻어지는 세포의 총칭이며, 골수아구 등의 백혈구계의 세포, 적아구계의 세포, 골수 거핵구 및 형질세포 등이 포함된다.
본 명세서 중에서 탯줄세포란 태아와 태반을 연결하는 탯줄 중에 존재하는 세포이며, 탯줄 중에 포함되고, 조혈 줄기세포를 풍부하게 함유하는 탯줄혈도 포함한다.
또한, 상술한 줄기세포 중에 도입하는 유전자로서는 hTERT, bmi-1, E6, E7, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 p16INK4a 등을 들 수 있다. hTERT는 테로메아 수복 효소의 유전자이며, bmi-1은 폴리콤 복합체를 구성하는 단백질 중 1개인 Bmi-1의 유전자이다. 여기에서, Bmi-1은 조혈 줄기세포의 유지에 필요하며, 활성 증강에 의해 조혈 줄기세포를 증가시킬 수 있다는 작용을 갖는다.
E6 및 E7은 HPV-16 또는 HPV-18의 DNA의 초기 유전자이다. 또한, Oct3/4은 Sox2와 협조해서 표적 유전자의 전사를 활성화하는 유전자이다. Klf4(Kruppel형 전사 인자4)는 세포 분열과 배 발생에 관계되는 유전자를 조절하고, 소화기계의 암의 암 억제 인자로서 관계되어 있다.
Sox2는 SRY-related H㎎ box 유전자 패밀리에게 속해 있고, 기능의 미분화성(다능성) 유지에 관여하는 것이 알려지는 유전자이다. c-Myc는 발암 유전자이며, c-Myc로 유도된 종양 내에서 세포의 생존과 죽음의 양쪽을 촉진하는 유전자이다. p16INK4a는 암세포의 cell cycle을 control하는데에 중요한 역할을 하는 유전자이다.
이하에 인간의 탈락 유치로부터 치수세포를 사용한 불사화 줄기세포의 제작을 설명한다.
우선, 탈락 유치를, 예를 들면 클로로헥시딘, 이소딘 용액 그 밖의 소독약으로 소독한 후 치관부를 분할하고, 치과용 리머로 치수 조직을 회수한다.
채취한 치수 조직을 기본 배지, 예를 들면 5~15% 소 혈청(이하, 「CS」라고 하는 경우가 있다) 및 50~150 유닛/㎖의 항생 물질을 함유하는 둘베코 변법 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 이하 「DMEM」이라고 한다)에 현탁한다. 이어서, 1~5㎎/㎖의 콜라게나제 및 1~5㎎/㎖의 디스파제를 사용해서 37℃에서 0.5~2시간 처리한다.
상기 기본 배지로서는 DMEM 외에 이스코브 개변 둘베코 배지(IMDM)(GIBCO Corporation 등), HamF12 배지(HamF12)(Sigma-Aldrich Co., LLC., GIBCO Corporation 등), RPMI1640 배지 등을 사용할 수 있다. 2종 이상의 기본 배지를 병용하는 것으로 해도 좋다. 혼합 배지의 일례로서 IMDM과 HamF12를 등량 혼합한 배지(예를 들면, 상품명: IMDM/HamF12(GIBCO Corporation)로서 시판된다)를 들 수 있다.
또한, 기본 배지에 첨가하는 것으로서는 소 태자 혈청(이하, 「FCS」라고 한다), 인간 혈청, 양 혈청 그 밖의 혈청, 혈청 대체물(Knockout serum replacement(KSR) 등), 소 혈청 알부민(이하, 「BSA」라고 하는 경우가 있다), 페니실린, 스트렙토마이신 그 밖의 항생 물질, 각종 비타민, 각종 미네랄을 들 수 있다.
상기 기본 배지는 후술하는 세포 선별용의 배양 및 선별 후의 세포의 배양에 사용할 수도 있다.
효소 처리 후 3~10분간의 원심 조작(3,000~7,000회전/분)을 행하고, 치수세포를 회수한다. 필요에 따라서 셀 스트레이너를 사용해서 세포의 선별을 행한다. 선별된 세포를, 예를 들면 3~6㎖의 상기 기본 배지에서 재현탁하고, 직경 4~8㎝의 부착성 세포 배양용 디쉬에 파종한다.
이어서, 배양액, 예를 들면 10% FCS를 함유하는 DMEM을 첨가한 후 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 2주간 정도 배양한다. 상기 배양액을 제거한 후 PBS 등으로 세포를 1~수회 세정한다. 배양액의 제거 및 세포의 세정 대신에 콜로니를 형성한 접착성의 치수 줄기세포를 회수할 수도 있다. 접착성의 치수 줄기세포는, 예를 들면 0.025~0.1%의 트립신과 0.3~1mM의 EDTA로 수분간 37℃에서 처리해서 디쉬로부터 박리시키고, 이어서 세포를 회수한다.
이어서, 상기와 같이 선별된 접착성 세포를 배양한다. 예를 들면, 상기와 같이 해서 얻은 치수 줄기세포를 부착성 세포 배양용 디쉬에 파종하고, 5% CO2, 37℃의 조건에서 인큐베이터에서 배양한다.
계대 배양은, 예를 들면 육안으로 관찰해서 서브 콘플루엔트 또는 콘플루엔트에 도달했을 때에 상술한 바와 같이 트립신과 EDTA를 사용해서 세포를 배양 용기로부터 박리시켜서 회수하고, 다시 배양액을 넣은 배양 용기에 파종한다.
여기에서, 서브 콘플루엔트란 배양 용기 중의 세포 부착면의 약 70%에 세포가 부착된 상태를 말한다. 예를 들면, 계대 배양을 1~8회 행하고, 선별된 세포를 필요한 세포수, 예를 들면 약 1×107개/㎖까지 증식시킨다. 이상과 같이 배양한 후에 세포를 회수해서 액체 질소 중에서 보존한다. 여러 가지 도너로부터 회수한 세포를 치수 줄기세포 뱅크의 형태로 보존하는 것으로 해도 좋다.
이어서, 상기 줄기세포를 초기 배양해서 얻어진 초기 배양 세포에 4종류의 유전자를 도입해서 유전자 도입 세포를 제작한다. 여기로 도입하는 유전자는 hTERT, bmi-1, E6, E7, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 p16INK4a로 이루어지는 군으로부터 선택되는 4종류인 것이 바람직하다. hTERT, bmi-1, E6, E7을 도입함으로써 보다 개체수 배가 횟수가 많은 불사화 줄기세포를 얻을 수 있다. 여기에서, hTERT는 인간 텔로메라제 역전사 효소의 유전자이며, bmi-1은 줄기세포의 자기 복제나 분화 제어에 관계되어 있는 폴리콤군 유전자이다. E6 및 E7은 인간 파필로마 바이러스가 자기 복제를 위해서 사용하는 초기 유전자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 중에 존재하는 유전자이다.
이러한 유전자의 도입은 이하와 같이 해서 행할 수 있다.
목적으로 하는 상기 유전자를 장착하기 위한 플라스미드를 조제하고, 이것을 셔틀 벡터, 예를 들면 pSuttle2에 장착하고, 상기 유전자를 클로닝한다. 이 셔틀 벡터에서 대장균을 형질 전환하고, 카나마이신 내성 형질 전환체를 선택한다. 선택한 카나마이신 내성 형질 전환체의 플라스미드 DNA를 정제하고, 제한 효소 부위를 해석해서 재조합체를 동정한다.
이어서, 제한 효소, 예를 들면 PI-Sce I 및 I-Cue I를 사용해서 발현 카세트를 상기 셔틀 벡터로부터 잘라내고, 이것을 아데노 바이러스 벡터, 예를 들면 Adeno-X Viral DNA에 라이게이션한다. 얻어진 라이게이션 산물을 Swa I로 절단하고, 이것을 사용해서 대장균을 트랜스포메이션한다.
얻어진 형질 전환체 중으로부터 암피실린 내성 형질 전환체를 선택한다. 상기 유전자가 장착된 재조합 아데노 바이러스 DNA를 정제하고, 제한 효소 부위를 해석해서 재조합체를 동정한다.
이어서, Pac I로 재조합 아데노 바이러스를 소화하고, 이것을 HEK293세포에 트랜스펙트한다. 재조합 아데노 바이러스를 증식시키고, 이것을 모아서 바이러스의 역가를 측정한다. 상법에 따라서 바이러스를 정제하고, 표적세포인 SHED에 감염시킨다.
바이러스 감염 후의 세포군을 상법에 따라서 FITC로 염색하고, 플로우 사이토미터를 사용해서 STRO-1 양성세포를 검출한다. 여기에서, STRO-1은 골수에 있어서의 다분화능을 갖는 간엽계 줄기세포의 마커 중 1개로서 여겨지고 있어 세포의 불사화의 지표가 된다.
이상의 순서에 의해 치수 유래의 불사화 줄기세포를 얻을 수 있다.
이어서, 얻어진 불사화 줄기세포를 상술한 기본 배지, 예를 들면 10% FBS를 첨가한 DMEM을 사용해서 5% CO2, 37℃의 조건 하에 24~48시간 배양하여 배양 상청을 얻는다. 배양 상청의 회수에는, 예를 들면 코마고메 피펫 등을 사용할 수 있다. 회수한 배양 상청은 그대로 본 발명의 의약 조성물의 유효 성분으로서 사용해도 좋고, 농축, 용매의 치환, 투석, 동결 건조, 희석 그 밖의 처리 후에 본 발명의 의약 조성물의 유효 성분으로서 사용해도 좋다.
또한, 후술하는 바와 같이 상기와 같이 해서 얻어진 불사화 줄기세포의 배양 상청은 여러 가지 성장 인자를 포함하고, 고도인 정제를 하지 않아도 여러 가지 작용을 나타낸다. 즉, 각종 질병의 치료에 사용할 수 있는 본 발명의 의약 조성물을 간이한 공정으로 제조할 수 있기 때문에 고도 정제에 수반하는 각종 성장 인자의 생리 활성의 저하를 회피할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용하는 「불사화 줄기세포의 배양 상청」은 불사화 줄기세포를 배양해서 얻어지는 여러 가지 생체 인자를 함유하는 배양 상청을 말하고, 불사화 줄기세포 그 밖의 세포를 포함하지 않는 용액을 말한다. 혈청을 포함하지 않는 배양 상청을 조제할 경우에는 초기 배양으로부터 계대까지의 모든 과정에 있어서 무혈청 배양지를 사용하거나 또는 세포를 회수하기 전의 수회의 계대시에 무혈청 배양지를 사용하면 좋다.
상기 방법에 의해 선발·배양한 치수 줄기세포는 생체로부터 채취한 조직이나 세포로서, 최초에 파종된 초대 배양세포와 마찬가지의 성질을 갖는다. 일반적으로 초대 배양세포는 그 소스가 된 장기와 유사한 성질을 갖고, 정상세포에 가깝다는 점에서 중요하다. 그러나, 주화세포에 비해 증식이 느리고, 또한 배양을 계속하는 동안에 탈분화를 일으키는 경우도 있어 그 성질을 유지한 채 유지하는 것이 어렵다.
그러나, 본 발명의 불사화 줄기세포는 세포 배가 횟수가 20회 또는 40회인 시점에서 세포의 미분화도의 마커가 되는 STRO-1의 발현율이 불사화 줄기세포가 아닌 치수 줄기세포보다 유의하게 높고, 약 1.5~3배라는 높은 비율을 나타내는 것이 바람직하다. STRO-1의 발현율의 높이는 초대 배양세포와 마찬가지의 성질을 나타내는 것의 지표가 되기 때문이다.
또한, 본 발명의 불사화 줄기세포는 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1), 혈관내피세포 증식 인자(VEGF), 트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β) 및 줄기세포 증식 인자인 HGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상의 성장 인자를 배양 상청 중에 분비한다. 여기에서, 「성장 인자」란 세포 분열을 촉진시키거나, 형태의 변화나 비대를 초래하거나 하는 폴리펩티드의 총칭이다. 성장 인자를 생산하는 세포의 종류에 따라 인자는 다르고, 상피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 신경계 신경 성장 인자, 종양 증식 인자(TGF) 등으로 대별된다.
또한, 각 세포의 세포막에 있는 수용체는 티로신키나제 활성을 갖고, 성장 인자가 결합하면 단백질의 티로신 잔기가 인산화되어 세포의 증식이나 분화를 야기한다. 성장 인자가 개체 발생에 있어서 중배엽 유도 물질이 되어 있는 예가 몇가지 알려져 있다. 또한, 면역계를 조절하는 림포카인 개체 발생에 있어서 중배엽 유도 물질이 되어 있는 예가 몇가지 알려져 있다. 이러한 성장 인자는 ELISA법, 마이크로 어레이법 등에 의해 정량할 수 있다.
상기 IGF-1은 인슐린과 배열이 고도로 유사한 폴리펩티드이며, 세포 배양에서 인슐린과 마찬가지로 유사 분열 유발 등의 반응을 야기한다. 신경 세포의 성장에도 영향을 미치는 것이 알려져 있다. 또한, 상기 VEGF는 배의 형성기에 혈관이 없는 곳에 새로운 혈관을 형성하는 맥관 형성 및 기존의 혈관으로부터 분지 신장해서 혈관을 형성하는 혈관 신생에 관여하는 한 군의 당단백질이다. 상기 TGF-β는 또한 많은 세포에 대한 강력한 증식 억제 인자가 되고, 세포의 분화·유주·접착에도 밀접하게 관여하고, 개체 발생이나 조직 재구축, 창상 치유, 염증·면역, 암의 침윤·전이 등의 폭넓은 영역에 중요한 역할을 하고 있다. 또한, HGF는 줄기세포뿐만 아니라 여러 가지 세포에 대해서 세포 증식 촉진, 세포 운동 촉진, 항아포토시스(세포사), 형태 형성 유도, 혈관 신생 그 밖의 조직·장기의 재생과 보호를 하는 다재한 생리 활성을 갖고 있다.
이상과 같은 단백질은 상술한 각종 줄기세포를, 예를 들면 15% FCS를 첨가한 DMEM 중에서 37℃에서 소정의 기간, 배양함으로써 상기 성장 인자를 포함하는 배양 상청 중에 얻을 수 있다. 또한, 상기 줄기세포의 배양 상청에는 IGF-1, VEGF, TGF-β 및 HGF 이외에도 약 70종류의 단백질이 포함된다.
얻어진 배양 상청 중 15㎖를 Amicon Ultra Centrifugal Filter Units-10K(Merck Millipore Corporation제)에 넣고, 4,000×g에서 약 60분간 원심하고, 약 200㎕까지 농축한다. 이어서, 이 튜브에 배양 상청과 동량의 멸균 PBS를 투입하고, 다시 4,000×g에서 약 60분간 원심하고, 용매를 PBS로 치환한다. 얻어진 200㎕의 용액을 마이크로 테스트 튜브로 회수하고, 농축 줄기세포 배양 상청으로 한다.
상기 Amicon을 사용하는 방법 대신에 에탄올 침전법에 의해 농축할 수도 있다. 예를 들면, 5㎖의 배양 상청에 대해서 45㎖의 100% 에탄올을 첨가해서 혼화하고, -20℃에서 60분간 방치한다. 그 후에 15,000×g에서 15분간 4℃에서 원심해서 상청액을 제거한다.
이어서, 예를 들면 10㎖의 90% 에탄올을 첨가해서 잘 교반하고, 다시 15,000×g에서 5분간 4℃에서 원심한다. 상청액을 제거하여 얻어진 펠릿을, 예를 들면 500㎕의 멸균수에 용해할 수 있다. 용해 후 전량을 마이크로 테스트 튜브에 회수하여 농축 줄기세포 배양 상청으로 한다.
이상과 같이 해서 얻어진 배양 상청은 그대로 사용해도 좋고, 인산 완충 생리 식염수 등의 생리학적으로 허용되는 용매를 사용해서 적당히 희석해서 사용해도 좋다. 또한, 상법에 따라서 동결 건조하여 용시 조정의 의약 조성물로 할 수도 있다.
이 의약 제제에 포함되는 배양 상청 중의 성장 인자의 양은 그 전체 건조 중량에 대해서 약 50~500중량%인 것이 바람직하다.
이 의약 조성물의 제형으로서는 분말, 액제, 겔제, 스프레이제 및 경피 흡수 시스템 등을 들 수 있다. 예를 들면, 충전제, 부형제, pH 조정제 등의 첨가물을 첨가해서 멸균되어 있는 유리 앰플, 세럼 튜브 그 밖의 소형의 용기에 넣고, 의약 제제로 할 수 있다. 사용시에 생리 식염수나, 멸균되어 있는 주사용 증류수로 용해하고, 경비 투여해도 좋고, 또한 거즈에 침윤시켜서 환부에 부착해도 좋다. 치조골 그 밖의 뼈의 재형성에 사용할 경우에는 스캐폴딩으로서 콜라겐이나 β-TCP 등을 사용하고, 이들을 상기 용해액에 침지시켜서 매입해도 좋다.
이상과 같이 해서 얻어진 배양 상청을 정맥 내 투여를 비롯한 여러 가지 방법으로 투여함으로써 체내 매크로파지의 서브 파퓰레이션을 제어할 수 있고, 그것에 의해 종양을 치료할 수 있다.
실시예
이하에 실시예를 사용해서 본원발명을 더 상세하게 설명하지만, 본원발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) 불사화 세포의 조제
(1) 바이러스 도입용 벡터의 제작
(1-1) 플라스미드 추출용 시약 등
카나마이신(Kan), 암피실린(Amp), LB 액체 배양지 및 LB 한천 배지, 글리코겐, 아가로스, 멸균수, 아세트산 암모늄, 아세트산 나트륨, 도데실황산 나트륨 및 RNase A를 사용했다. 50㎎/㎖의 카나마이신 및 암피실린을 조제하고, 스톡 용액으로서 -20℃에서 보존했다. 글리코겐은 20㎎/㎖로 조제했다. 10㎎/㎖의 RNase A를 조제하여 -20℃에서 보존했다. 10M(포화)아세트산 암모늄(NH4OAc), 3M의 아세트산 나트륨(NaOAc; pH 5.2)을 조제했다.
(1-2) 제한 효소 등
대장균 컴피턴트 셀(Supercharge EZ10 Electrocompetent Cells, 제품 코드636756), Swa I(제품 코드 1111A, Smi I가 동등품), Xho I(제품 코드 1094A), T4 DNA Ligase(제품 코드 2011A), NucleoBond Xtra Midi(제품 코드 740410.10/.50/.100), NucleoSpin Plasmid(제품 코드 74058810/50/250)는 모두 TAKARA BIO INC.로부터 구입했다. Pac I는 New England Biolabs로부터 구입했다.
(1-3) 버퍼 등
1×TE Buffer(1mM의 EDTA를 포함하는 10mM Tris-HCl [pH 8.0]), 100mM Tris-HCl(pH 8.0)로 포화한 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1, 이하, 「PCI 혼합액」이라고 한다)을 조제했다. 에탄올은 100% 및 70%로 사용했다. 미니 스케일에서의 재조합에서 사용하는 pAdeno-X 플라스미드 DNA의 정제용에 이하의 버퍼 1~4를 조제했다.
버퍼 1: 10mM EDTA 및 50mM 글루코오스를 포함하는 25mM Tris-HCl(pH 8.0)(오토클레이브 후, 4℃에서 보존)
버퍼 2: 1% SDS를 포함하는 0.2M NaOH(사용 직전에 용시 조제, 밀봉하여 실온 보존)
버퍼 3: 5M KOAc(오토클레이브 후 4℃에서 보존)
버퍼 4: 1mM EDTA, 20㎍/㎖ RNase를 포함하는 10mM Tris-HCl(pH 8.0)(사용 직전에 RNase를 첨가하고, -20℃에서 보존)
(2) 아데노 바이러스 정제 및 β-gal 어세이용 시약
인간 5형 아데노 바이러스로 형질 전환한 인간 HEK293세포(ATCC #CRL1573)를 사용했다. HEK293세포는 완전 배지에서 배양했다. 완전 배지의 조성은 100 unit/㎖의 페니실린G나트륨과 100㎍/㎖의 스트렙토마이신, 4mM의 L-글루타민 및 10% FBS를 첨가한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 기본 배지)으로 했다. 페니실린G나트륨 용액은 10,000units/㎖, 황산 스트렙토마이신 용액은 10,000㎍/㎖로 조제하고, 스톡 용액으로서 보존했다.
배양에는 60㎜ 플레이트, 100㎜ 플레이트, 6-웰 플레이트, T75 및 T175 플라스크를 사용했다.
트립신-EDTA(제품 코드 CC-5012)는 TAKARA BIO INC.로부터 구입했다. 인산 완충 생리 식염수(PBS, Ca2 +와 Mg2 + 불함) 및 Dulbecco's 인산 완충 생리 식염수(DPBS, Ca2 +와 ㎎2 + 함유)를 조제했다. 또한, 0.33%의 뉴트럴 레드 염색액, 0.4% 트리판 블루 염색액을 사용했다.
β-gal 어세이에는 X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside[25㎎/㎖])디메틸포름아미드(DMF) 용액은 -20℃에서 차광 보존했다. Luminescent β-gal Detection Kit Ⅱ(제품 코드 631712)를 사용했다.
(3) 예비 시험
(3-1) lac Z를 포함하는 재조합 아데노 바이러스(pAdeno-X-lac Z)의 구축
10㎖의 상술한 완전 배지에 해동 후 DMSO를 제거한 HEK293세포를 재현탁하고, 전량을 100㎜의 배양 플레이트에 옮겼다. HEK293세포가 부착된 후에 배양액을 제거하고, 세포를 멸균 PBS로 한 번 세정하여 1㎖의 트립신-EDTA 용액을 첨가해서 약 2분간 처리했다.
이어서, 10㎖의 완전 배지를 첨가해서 트립신의 반응을 멈추고, 부드럽게 현탁했다. 바이어블 카운트를 행해서 배양액 10㎖를 넣은 100㎜의 플레이트에 105개의 세포를 옮겨 균일하게 넓혔다.
pShuttle2-lac Z(Adeno-X Expression System 1에 포함되어 있는 양성 대조 벡터)와 키트에 포함되어 있는 Adeno-X Viral DNA(PI-Sce I 및 I-Ceu I digested)를 사용하고, 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라서 lac Z를 포함하는 재조합 아데노 바이러스를 구축했다. 표적세포인 SHED에 감염시키고, β-갈락토시다아제의 발현을 어세이하여 벡터가 구축되어 있는 것을 확인했다.
(3-2) 재조합 pShuttle2 플라스미드의 구축
재조합 pShuttle2 Vector(이하, 「rpShuttle2 Vector」라고 한다)의 구축 전에 키트에 포함되어 있는 pShuttle2 Vector 및 pShuttle2-lac Z Vector로 DH5α 대장균을 형질 전환했다. 50㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트(이하, 「LB/Kan」이라고 한다) 상에서 형질 전환체를 선택하고, 단일 콜로니로부터 취한 균체를 새로운 LB/Kan에 획선하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이팅했다.
이어서, hTERT, bmi-1, E6, E7을 pShuttle2에 이하의 순서로 클로닝했다. 이들 유전자에 적합한 제한 효소로 pShuttle2 Vector를 절단했다.
이어서, 상기 키트에 첨부되어 있는 pShuttle2 Vector Information Packet(PT3416-5)을 참조하여 삽입하는 DNA에 합치하는 멀티 클로닝 사이트를 결정했다. 제한 효소 처리가 완료된 상기 플라스미드를 알칼리포스파타아제로 처리해서 정제했다.
상법에 따라서 표적 DNA 단편을 조제하여 정제했다. 상기 제한 효소로 소화한 벡터와 상기 유전자 단편을 라이게이션하고, DH5α세포(컨피턴트세포)를 라이게이션 산물로 형질 전환했다. 상기 컨피턴트세포의 일부를 취하고, 키트에 포함되어 있는 대조 벡터 pShuttle2-lac Z Vector로 형질 전환해서 양성 대조로 했다.
형질 전환한 대장균을 포함하는 혼합액을 LB/Kan 한천 플레이트에 접종하고, 카나마이신 내성(Kanr)의 형질 전환체(콜로니)를 선택했다. 5~10개의 Kan 내성 클론을 선택하고, 소량의 액체 배양지에 접종해서 증폭했다. 이들 클론이 rpShuttle2 Vector를 갖고 있는 것을 확인한 후에 하룻밤 인큐베이팅했다. 그 후 시판의 실리카 흡착 칼럼을 사용해서 상법에 따라서 구축된 플라스미드 DNA를 정제했다.
이 플라스미드 DNA를 제한 효소로 처리해서 1% 아가로스겔 전기 영동을 행하고, 목적으로 하는 재조합 플라스미드를 동정했다. 시퀀싱에 의해 삽입한 단편의 방향과 삽입 부위를 확인하고, 포지티브 클론을 동정했다.
재조합 pShuttle2 플라스미드 DNA(이하, 「rpShuttle2 플라스미드 DNA」라고 한다)를 타깃 세포에 직접적으로 트랜스펙트하고, 웨스턴 블로팅을 행해서 목적 단백질의 발현을 예비적으로 체크했다.
(3-3) rpShuttle2 플라스미드 DNA의 PI-Sce I/I-Ceu I 2중 소화
상기와 같이 해서 제작한 rpShuttle2 플라스미드 DNA로부터 도입한 유전자의 발현 카세트를 PI-Sce I 및 I-Ceu I로 잘라냈다. 키트에 첨부된 프로토콜에 기재된 in vitro 라이게이션법에 따라서 잘라낸 발현 카세트를 Adeno-X Viral DNA에 장착했다. rpShuttle2 플라스미드 DNA의 PI-Sce I/I-Ceu I 2중 소화액을 30㎕ 조제하고, 하기 표 1에 기재한 시약을 1.5㎖의 멸균된 마이크로 원심 튜브에 넣어서 혼합했다.
이어서, 충분히 혼화한 후에 마이크로 원심 튜브에 넣어서 가볍게 원심하고, 그 후 37℃에서 3시간 인큐베이팅했다.
1kb 러더(DNA 사이즈 마커)와 함께 상기 2중 소화 후의 반응액(5㎕)을 1% 아가로스/EtBr겔로 영동했다.
(3-4) 페놀:클로로포름:이소아밀알코올 추출
원심 튜브에 상술한 2중 소화액의 나머지(25㎕)에 70㎕의 1×TE Buffer(pH 8.0)와 100㎕의 PCI 혼합액을 첨가하고, 볼텍스로 충분히 교반했다. 이어서, 미량 원심기를 사용해서 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 수층을 청정한 1.5㎖의 마이크로 원심 튜브로 옮겼다. 여기에 400㎕의 95% 에탄올, 25㎕의 10M아세트산 암모늄 및 1㎕의 글리코겐(20㎎/㎖)을 첨가하고, 볼텍스로 충분히 교반했다.
이어서, 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 상청을 흡인해서 제거하여 펠릿을 얻었다. 이 펠릿에 300㎕의 70% 에탄올을 첨가하여 실온에서 14,000rpm으로 2분간 원심했다. 상청을 주의 깊게 흡인해서 제거하고, 펠릿을 실온에서 약 15분간 풍건했다.
펠릿이 건조된 후에 이것을 10㎕의 멸균한 1×TE Buffer(pH 8.0)에 용해하고, 사용할 때까지 -20℃에서 보존했다.
(4) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA의 구축
(4-1) Adeno-X 바이러스 게놈으로의 발현 카세트의 서브 클로닝
하기 표 2에 나타내는 시약을 순서대로 1.5㎖의 멸균된 마이크로 원심 튜브에 넣어 부드럽게 혼화하고, 가볍게 원심한 후에 16℃에서 하룻밤 인큐베이팅했다.
각 샘플에 90㎕의 1×TE Buffer(pH 8.0)와 100㎕의 PCI 혼합액을 첨가해서 볼텍스로 부드럽게 교반했다. 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 수층을 청정한 1.5㎖의 마이크로 원심 튜브에 옮기고, 여기에 400㎕의 95% 에탄올, 25㎕의 10M 아세트산 암모늄 및 1㎕의 글리코겐(20㎎/㎖)을 첨가해서 볼텍스로 부드럽게 교반했다.
4℃에서 5분간 14,000rpm으로 원심하고, 상청을 흡인에 의해 제거해서 펠릿을 얻었다. 이하의 에탄올 침전 조작은 상기 (3-4)와 마찬가지로 행했다.
펠릿이 건조된 후에 이것을 15㎕의 멸균 탈이온수에 용해했다.
(4-2) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA의 Swa I소화
하기 표 3에 나타내는 소화액을 조제하고, 원심 튜브에 넣은 각 샘플에 첨가해서 2시간 25℃에서 인큐베이팅했다.
각 샘플에 80㎕의 1×TE Buffer(pH 8.0)와 100㎕의 PCI 혼합액을 첨가하여 볼텍스에서 부드럽게 교반했다. 마이크로 원심 튜브, 4℃에서 5분간 14,000rpm으로 원심했다. 이하의 에탄올 침전의 조작은 상기 (3-4)와 마찬가지로 행하고, 펠릿의 용해액은 사용까지 -20℃에서 보존했다.
(4-3) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA에 의한 대장균의 형질 전환의 확인
전기적으로 컨피턴트로 한 대장균을 Supercharge EZ10Electrocompetent Cell(제품 코드 636756)을 사용해서 상기 (4-2)에서 얻은 Swa I 소화산물로 형질 전환했다.
형질 전환 혼합액을 LB 배지에 암피실린(종농도 100㎍/㎖)을 첨가한 한천 플레이트(이하, 「LB/Amp 한천 플레이트」라고 한다)에 접종하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이팅해서 암피실린 내성(Ampr) 형질 전환체를 선택했다. 약 106개의 콜로니를 얻었다. 얻어진 콜로니를 제품에 부속된 Adeno-X System PCR Screening Primer Set으로 체크했다. 5㎖의 신선한 LB/Amp 액체 배양지에 단일의 콜로니로부터 균체를 접종하고 하룻밤 배양했다. 다음날 후술하는 미니 스케일법에 따라서 Adeno-X 플라스미드 DNA를 정제했다.
(4-4) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA의 미니 스케일 조제
대수 증식에 있는 배양액 5㎖를 14,000rpm으로 30초간 원심하여 상청을 제거했다. 펠릿을 다시 10,000rpm으로 1분간 원심하고, 마이크로 피펫을 사용해서 상청을 제거했다.
여기에 150㎕의 상기 버퍼 1을 첨가해서 부드럽게 피페팅하여 재현탁했다. 이 세포 현탁액에 150㎕의 버퍼 2를 첨가하여 부드럽게 전도 혼화하고, 빙상에 5분간 방치했다. 냉각한 세포 현탁액에 150㎕의 버퍼 3을 첨가해서 다시 전도 혼화하여 빙상에 5분간 방치했다.
이 세포 현탁액을 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하여 투명한 상청을 청정한 1.5㎖의 원심 튜브에 옮겼다. 이 상청에 450㎕의 PCI 혼합액을 첨가하고, 전도 혼화해서 교반했다. 그 후 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 수층을 청정한 1.5㎖의 마이크로 원심 튜브에 옮겼다.
이하의 에탄올 침전의 조작은 상기 (3-4)와 마찬가지로 조작을 행하고, 펠릿의 용해액은 사용까지 -20℃에서 보존했다. 목적의 rDNA는 후술하는 제한 효소에 의한 해석 및 PCR에 의해 분류했다.
(5) 얻어진 rAdeno-X 플라스미드 DNA의 제한 효소 부위 해석
PI-Sce I 및 I-Ceu I를 사용해서 해석을 행했다. 하기 표 4에 나타내는 시약을 1.5㎖의 멸균된 마이크로 원심 튜브에 넣고, 30㎕의 PI-Sce I/I-Ceu I 2중 소화 반응액을 첨가해서 충분히 교반하고, 가볍게 회전시켜서 내용물을 모았다.
37℃에서 3시간 인큐베이팅하여 제한 효소 처리를 행했다. 이 처리 후의 반응액을 1% 아가로스/EtBr겔로 영동하여 배양액을 얻었다.
(6) 재조합 아데노 바이러스의 생산
(6-1) HEK293세포 트랜스펙트용 rAdeno-X 플라스미드 DNA의 조제
하기 표 5에 나타내는 시약 등을 1.5㎖의 멸균된 원심 튜브에 넣어서 혼합하고, 미량 원심기로 가볍게 원심했다. 그 후 37℃에서 2시간 인큐베이팅하고, rAdeno-X 플라스미드 DNA의 Pac I 제한 효소 처리를 행했다.
60㎕의 1×TE Buffer(pH 8.0)와, 100㎕의 PCI 혼합액을 첨가하고, 볼텍스로 부드럽게 교반하여 미량 원심기로 4℃에서 5분간 14,000rpm으로 원심했다. 수층을 청정한 1.5㎖의 멸균된 원심 튜브에 주의 깊게 옮겼다.
이하의 에탄올 침전의 조작은 상기 (3-4)와 마찬가지로 조작을 행하고, 펠릿의 용해액은 사용까지 -20℃에서 보존했다.
(6-2) Pac I 소화 Adeno-X 플라스미드 DNA의 HEK293세포로의 트랜스펙션
상기 플라스미드 DNA의 트랜스펙션의 24시간 전에 60㎜의 배양 플레이트당 세포수가 1~2×106(대략 100cells/㎟)이 되도록 HEK293세포를 접종하고, 37℃, 5% CO2 존재 하에서 인큐베이팅했다.
각 배양 플레이트에 Pac I 소화한 10㎕의 Adeno-X 플라스미드 DNA를 트랜스펙트하고, 표준적인 트랜스펙션법(CalPhos Mammalian Transfection Kit 제품 코드 631312)에 따라서 HEK293세포에 Adeno-X DNA를 도입했다. 트랜스펙션의 다음날로부터 CPE(세포 변성 효과)가 일어나 있는지의 여부를 확인했다.
1주간 후에 배양 플레이트의 바닥면이나 측면에 부착되어 있는 세포를 부드럽게 교반해서 유리시켰다. 얻어진 세포 현탁액을 15㎖의 멸균된 원뿔 원심 튜브에 옮기고, 실온에서 5분간 1,500×g으로 원심했다.
얻어진 침전을 500㎕의 멸균 PBS에 현탁했다. 드라이 아이스/에탄올 중에서 동결시키고, 37℃의 항온조에서 융해시킨다는 동결 융해 조작을 3회 반복해서 세포를 충분히 융해시킨 라이세이트를 얻었다. 이어서, 가볍게 원심해서 부유물을 제거하고, 상청을 멸균한 별도의 튜브에 옮겨서 즉시 사용했다. 즉시 사용하지 않는 분은 -20℃에서 보존했다.
60㎜ 플레이트의 배양세포에 250㎕의 상기 라이세이트를 첨가해서 배양을 계속했다. 또한, Adeno-X Rapid Titer Kit(제품 코드 631028)에 포함되는 항Hexon 항체를 사용해서 이 키트의 취급 설명서(PT3651-1)에 따라 아데노 바이러스의 역가를 측정했다.
(6-3) 고역가 바이러스 조제를 위한 바이러스의 증폭
이 역가 측정을 시작하기 약 24시간 전에 HEK293세포를 T75 플라스크에 접종하고, 37℃, 5% CO2 존재 하에서 하룻밤 배양하고, 50~70% 융합이 되어 있는 것을 확인했다. 다음날 바이러스를 포함하는 새로운 배지와 교환하고, MOI=10으로 감염시켰다. 37℃, 5% CO2 존재 하에서 90분간 배양한 후에 플라스크를 인출하여 10㎖의 배지를 첨가했다.
37℃, 5% CO2 존재 하에서 3~4일간 배양하고, CPE를 확인했다. 50%의 세포가 박리된 결과, 상기와 마찬가지로 해서 유리세포 현탁액으로 하고, 15㎖의 멸균된 원뿔 원심 튜브에 옮겼다. 상기와 마찬가지의 동결 융해 조작을 행하여 세포를 융해시켰다. Adeno-X Rapid Titer Kit(제품 코드 631028)를 사용하여 107PFU/㎖의 역가를 얻었다.
웨스턴 블로팅을 행하고, 패키징된 아데노 바이러스 게놈이 목적 유전자에 특이적인 전사 단위의 복사를 기능하는 형태로 갖고 있는지를 확인했다.
(7) 표적세포로의 아데노 바이러스 감염
(7-1) 표적세포로의 감염
감염의 24시간 전에 6-웰 플레이트에 1×106개의 SHED를 접종했다. 접종 다음날에 배지를 제거하고, 바이러스를 포함하는 1.0㎖의 배지를 각 플레이트의 중심에 첨가했다. 이 용액을 SHED가 형성한 단층 전체에 균일하게 펼쳤다.
37℃, 5% CO2 존재 하에서 4시간 배양하고, 바이러스를 SHED에 감염시켰다. 이어서, 신선한 배지를 첨가하고, 또한 37℃, 5% CO2 존재 하에서 배양했다. 감염 24시간 후~48시간 후에 걸쳐서 도입 유전자의 발현을 경시적으로 해석했다.
(7-2) 감염세포의 β-갈락토시다아제 발현의 해석
Adeno-X-lac Z를 감염시킨 접착성 세포에 있어서의 β-갈락토시다아제의 발현은 Luminescent β-galDetection Kit Ⅱ(제품 코드 631712, Clontech Laboratories, Inc.)를 사용해서 어세이했다.
(실시예 2) SHED의 제작
(1) 유치 줄기세포의 분리
10세의 건강한 남아로부터 얻어진 탈락 유치를 사용했다. 이 탈락 유치를 이소딘 용액으로 소독한 후, 치과용 다이아몬드 포인트를 사용해서 치관을 수평 방향으로 절단하고, 치과용 리머를 사용해서 치수 조직을 회수했다. 얻어진 치수 조직을 3㎎/㎖의 I형 콜라게나제 및 4㎎/㎖의 디스파제의 용액 중에서 37℃에서 1시간 소화했다. 이어서, 이 용액을 70㎜의 세포 스트레너(Falcon Corporation제)를 사용해서 여과했다.
여과 분별한 세포를 4㎖의 상기 배지에 재현탁하고, 직경 6㎝의 부착성 세포 배양용 디쉬에 파종했다. 10% FCS를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 이 디쉬에 첨가하고, 5% CO2, 37℃로 조정한 인큐베이터(탁상형 퍼스널 유스 세포 배양 장치 9000EX 시리즈, WAKENBTECH CO, LTD.) 중에서 2주간 정도 배양했다. 콜로니를 형성한 접착성 세포(치수 줄기세포)를 0.05% 트립신/EDTA로 5분간 37℃에서 처리하고, 디쉬로부터 박리한 세포를 회수했다.
이어서, 상기와 같이 해서 선발한 접착성 세포를 부착성 세포 배양용 디쉬(콜라겐 코트 디쉬)에 파종하고, 5% CO2, 37℃로 조정한 인큐베이터에서 1차 배양하여 초대 배양세포로 했다. 육안 관찰에 의해 서브 콘플루엔트(배양 용기의 표면의 약 70%를 세포가 차지하는 상태) 또는 콘플루엔트가 되었을 때에 0.05% 트립신/EDTA에서 5분간 37℃에서 처리해서 세포를 배양 용기로부터 박리해서 회수했다.
이렇게 해서 얻어진 세포를 다시 상기 배지를 넣은 디쉬에 파종하고, 계대 배양을 수회 행해서 약 1×107개/㎖까지 증식시켰다. 얻어진 세포를 액체 질소 중에서 보존했다.
그 후 1차 배양 세포를 상기 배지를 사용해서 약 1×104세포/㎠ 농도로 계대 배양했다. 1~3회 계대한 세포를 실험에 사용했다. 인간 BMMSC(골수 간엽계 줄기세포, Bone Marrow Mesenchymal stem cells)는 Lonza Inc.로부터 구입하고, 메이커의 취급 설명서에 따라서 배양했다.
이상과 같이 해서 인간 탈락 유치 치수 줄기세포(SHED)를 얻었다. 얻어진 SHED를 FACSTARPLUS(Becton, Dickinson and Company.제)를 사용해서 각 시료에 대해서 약 1×106개의 STRO-1 양성 세포를 이하와 같이 해서 소트했다.
브로모데옥시우리딘 BrdU 염색 키트의 메이커(Invitrogen Corporation제)의 취급 설명서에 따라 BrdU를 12시간 도입시키고, SHED의 증식 속도를 평가했다(각 군에 대해서 n=3). 실험은 5회 반복했다. 1원 배치 분산 분석 후에 Tukey-Kramer 검정을 행하여 통계적 유의차를 평가했다.
STRO-1을 면역 형광으로 검출하기 위해서 SHED를 3% 파라포름알데히드로 고정하고, 그 후 PBS로 2회 린싱하고, 100mM의 글리신으로 20분간 처리했다. 이어서, 이들 세포를 0.2%의 Triton-X(Sigma-Aldrich Co. LLC.)로 30분간 투과 처리하고, 그 후 5%의 당나귀 혈청 및 0.5%의 소 혈청 알부민의 혼합물 중에서 20분간 인큐베이팅했다.
이어서, 세포를 1차 항체의 마우스항인간 STRO-1 항체(1:100, R&D Systems, Inc.제)와 함께 1시간 인큐베이팅하고, 2차 항체의 염소항마우스 면역 글로블린 M-FITC항체(1:500, Southern Biotech associates Inc.제)와 함께 30분간 인큐베이팅하고, 벡터 실드 DAPI(Vector Laboratories Inc)를 사용해서 마운트했다.
그 후 15% FBS를 첨가한 α-MEM을 6-웰 플레이트에 넣고, 소트한 세포를 클론 제작용에 파종했다. 증식한 세포 중으로부터 약 300콜로니를 시험용으로 풀링했다.
(2) 유전자의 도입
상술한 바와 같이 bmi-1, E6, E7 및 hTERT의 4개의 유전자를 아데노 바이러스 벡터에 장착하고, 이들 유전자 산물을 발현하는 바이러스 벡터를 제작했다. 대조로서 이들 유전자를 장착하고 있지 않은 대조 벡터를 제작했다.
SHED를 100㎜φ의 콜라겐 코트 디쉬에 1×106개를 파종하고, 10% FBS를 첨가한 DMEM을 첨가해서 서브 콘프렌트까지 배양했다. 이 배지를 흡인 제거해서 상기 배지에서 희석한 바이러스 용액 500㎕을 첨가하여(MOI=10) 37℃에서 5% CO2 인큐베이터 중에서 1시간 배양하고, 상기 바이러스 벡터를 감염시켰다. 감염 48시간 후 감염 세포를 퓨로마이신(1pg/㎖)을 첨가한 상기 배지 중에서 10일간 배양해서 선택하고, 500~600개의 내성 클론을 풀링했다. 3~4일 마다 약 0.5×105개의 SHED를 100㎜φ의 배양 샬레에 파종하여 계대했다. 유전자가 도입된 SHED를 SHED-T, 유전자가 도입되어 있지 않은 SHED를 SHED-C로 했다.
(실시예 3) SHED의 특성의 검토
(1) SHED-C 및 SHED-T의 성장 속도의 측정
SHED-T(유전자 도입을 한 SHED)의 개체수의 배가 상태를 도 1에 나타냈다. 도면 중 세로축은 개체수 배가 횟수(세포 분열 횟수, 회), 가로축은 시간(배양일수)이다. 또한, 배양 중의 SHED가 1개월간 분열되지 않은 상태를 세포의 노화의 판단 기준으로 했다.
SHED-C는 30회 정도에서 증식이 정지하고, 노화 또는 증식 정지 단계에 들어갔다. 이것에 대하여 SHED-T는 250PD를 초과하고, 800일 경과 후에도 증식했다.
(2) 플로우 사이토메트리 분석
단일 세포를 포함하는 현탁액을 얻기 위해서 접착성의 단층 세포를 트립신/EDTA로 소화했다. 2×105개의 세포에 항STRO-1 모노클로날 항체(1:100)를 첨가해서 방치하고, FACSCalibur 플로우 사이토미터(Becton, Dickinson and Company)를 사용해서 분석했다. 대응하는 아이소 타입이 동일한 대조 항체와 비교하여 99% 이상의 비율로 형광 레벨이 높은 경우에 발현이 양성이 되었다. SHED-T 및 SHED-C 모두 초기 및 후기의 계대세포를 고정하고, FITC 결합 STRO-1 항체로 염색했다. 그 후 플로우 사이토메트리로 분석했다. 시험은 각각 2회 행했다. SHED-C에서는 STRO-1 양성세포의 비율이 PD20에서 27%이며, PD30에서는 15%까지 감소했다(도 2(A) 및 도 2(B)). SHED-T에서는 STRO-1 양성세포의 비율이 각각 PD20에서 46%, PD40에서 41%이었다(도 2(C) 및 도 2(D)).
(3) 분화능의 검토
PD0, PD10 및 PD20에 있어서의 SHED-C 및 SHED-T의 분화능을 신생 골량의 형성능 및 조직 염색으로 조사했다. 우선, 2.0×106개의 SHED-C 또는 SHED-T를 40㎎의 히드록시아파타이트/3칼슘인산(HA/TCP) 세라믹 분말(Olympus Corporation)에 혼합하고, 10주령의 면역 무방비 상태 마우스(NIH-bgnu-xid, 암컷, Harlan Sprague Dawley Inc.)의 배측 표면의 피하에 이식했다.
이식 8주간 후에 이식물을 회수하고, 4% 포르말린으로 고정해서 탈회한 후 파라핀 포매하기 위해서 10% EDTA를 포함하는 PBS 용액으로 버퍼링했다. 일부는 플라스틱 포매하기 위해서 70% 에탄올 용액 중에 보존했다.
파라핀 절편을 탈파라핀화하고, 이것을 수화한 후 헤마톡실린 및 에오신(이하, 「H&E」라고 한다)으로 염색했다. 도 3(A)~도 3(C)는 SHED-T(불사화 줄기세포)의 PD0~PD20을 나타내고, 동 도 3(D)~도 3(F)는 SHED-C(정상세포)의 PD0~PD20을 나타낸다. 생체 내에서의 새로운 뼈의 형성을 정량하기 위해서 특정 영역을 선택하고, SHED-T 이식 후에 형성된 이식물 또는 SHED-C 이식 후에 형성된 이식물 각각에 대해서 신생 골 면적과 시야 면적을 산출하여 이들 수치로부터 신생 골량을 구했다.
신생 골량=신생 골 면적/시야 면적×100
도 4에 각 개체수 배가 횟수(배가 시간)에 있어서의 SHED-T와 SHED-C의 신생 골량의 변화를 나타냈다. 도면 중 **은 p<0.05, ***은 p<0.01을 나타낸다. 또한, 신생 골량은 이하의 산출식으로 구했다.
도 4에 나타내어지는 바와 같이 SHED-C에서는 개체수 배가 횟수가 증가하는 것에 대해서 신생 골량이 감소하고, PD20에서는 PD0의 약 1/5까지 저하되었다. 이것에 대하여 SHED-T에서는 PD20까지 신생 골량은 거의 변동이 없고, PD20에서는 SHED-T는 SHED-C의 5배 이상의 뼈를 형성한 것이 나타내어졌다.
(4) 암화 활성의 평가
SHED-C 및 SHED-T세포를 면역 무방비 상태 마우스의 피하 조직에 1×106개 이식했다. 이식 후 30일 이상 관찰을 행했지만, 이 기간 중 상기 세포를 이식한 어느 마우스에 있어서도 종양은 형성되지 않았다. 또한, SHED-T세포에서는 40~200PD의 배양세포의 모든 클론의 형태에 변화는 없었다.
이상으로부터 SHED-T에는 암화 활성은 없는 것이 나타내어졌다.
(5) 평가
SEHD-T는 260PD를 초과해도 분화 능력을 유지한 채 증식하는 능력을 갖고 있는 것이 나타내어졌지만, SHED-C는 분화 능력을 갖지만 30PD 이하에서 노화했다.
이상으로부터 SHED-T는 불사화 줄기세포가 되고 있고, 활성이 높은 SHED 배양 상청의 대량 생산에 적합한 것이 나타내어졌다.
(실시예 4) 컨디션 배지의 조제
실시예 1에서 조제한 불사화 SHED를 산소 농도를 20%, 10%, 5%, 1%로 한 하기 조건에서 48시간, 무혈청 배양지에서 배양하고, 그 상청을 회수했다.
하기 표 6에 나타내는 사이토카인의 생산량을 ELISA KIT(R&D Systems, Inc.제, Human IGF-1 Quantikine Elisa kit(카탈로그 번호: DG100), Human TGF-β Quantikine Elisa kit(카탈로그 번호: DB100B), Human VEGF Quantikine Elisa kit(카탈로그 번호: DVE00))를 사용해서 측정했다.
표 6에 나타내는 바와 같이 저산소 농도에서 배양한 편이 IGF-1, VEGF, TGF-β1, SDF-1의 생산량은 유의하게 높게 되어 있고, 저산소 농도 하에서의 배양이 적어도 상기 4종류의 사이토카인의 생산량을 유의하게 증가시키는 것이 나타내어졌다.
(실시예 5) 담암 동물을 사용한 치료 효과의 검토
마우스 편평 상피 암주 SCCⅦ(Kindai University Faculty of Medicine, NISHIMURA씨로부터 제공을 받음)를 10% FBS(GIBCO Corporation제)를 포함하는 DMEM 중에서 37℃에서 1주간 배양하고, 0.5% 트립신을 포함하는 PBS 버퍼를 사용해서 세포를 분해했다. 트리판 블루로 염색해서 생세포수를 계수하고, 1×106개/㎖의 현탁액을 1㎖의 PBS 버퍼를 사용해서 조제했다.
50마리의 마우스(C3H/He, 7주령, Chubu Kagaku Shizai Co., Ltd.로부터 구입)의 배부 피하에 상기와 같이 해서 조제한 세포 현탁액 0.5㎖을 18G의 주사 바늘(TERUMO CORPORATION제)을 사용해서 주입했다(5×105개/마우스). 1군 10마리로 했다.
대조군(버퍼만), 그룹Ⅰ~그룹Ⅳ(이하, 「GⅠ~GⅣ」라고 하는 경우가 있다)의 배양 상청을 각 군의 마우스에 1㎖씩 꼬리 정맥으로부터 투여했다.
암세포를 주입한 후에 각 군의 마우스를 각각 상기와 같은 시조건 사육했다.
각 군의 마우스를 케이지에 넣고, 12시간 명암 조건 하 25±0.5℃, 습도 50%의 조건에서 사육했다. 물과 사료는 자유롭게 섭취시켰다. 종양의 직경을 매일 캘리퍼로 측정했다.
마우스에 주입한 SCCⅦ가 형성한 종양의 직경이 6㎜를 초과한 시점에서 산소 농도를 변경해서 배양한 GⅠ~GⅥ의 배양 상청을 마우스의 꼬리 정맥으로부터 1㎖씩 1회 주입했다. 각 군의 종양 지름의 증가를 도 5에 나타낸다.
GⅠ에서는 투여 개시 3일째에서 종양의 직경이 10㎜를 초과하고, 14일째에서 20㎜를 초과했다. 투여 개시 21일째에는 25㎜를 초과했다. GⅡ 및 GⅢ는 GⅠ보다는 종양 직경의 증가 속도가 유의하게 느리고(*은 p<0.05), 투여 개시 7일째에서 10㎜를 초과하고, 19일째에서 20㎜를 초과했다.
이것에 대하여 GⅣ에서는 종양 직경의 증가가 유의하게 늦어(**은 p<0.01) 투여 개시 21일째에서도 평균은 10㎜를 초과하지 않았다. 단, 14일째 이후에는 종양이 퇴축되는 케이스도 보였기 때문에 표준 편차가 커졌다. 도 6에 종양의 직경이 최대가 되었을 때의 상태(A) 및 완치된 상태(B)의 마우스의 사진을 나타낸다.
도 7에 각 군의 마우스의 생존율의 추이를 나타낸다. 종양 직경의 증가 속도의 차는 마우스의 생존율에 반영되어 있고, GⅠ에서는 41일째에서 모든 마우스가 사망했다. 또한, GⅡ 및 GⅢ에서는 50일에서 모든 마우스가 사망했다. 이것에 대하여 GⅣ에서는 60일을 초과해도 약 80%의 마우스가 생존하고 있고, 모든 마우스가 사망한 것은 78일째이었다. 생존 기간은 GⅠ의 약 2배가 되어 있었다.
(실시예 6) 종양 및 그 주변 조직의 변화에 대한 검토
암 조직에 대한 매크로파지의 거동을 in vivo 이미징으로 측정했다. 5㎖ 의 티오글리콜레이트 용액(2%의 Brewer's 티오글리콜레이트 배지(Difco Laboratories, Inc.))를 마우스의 복강 내에 주입하고, 4일 후에 PBS을 사용해서 복강 세정을 행하고, 107개의 매크로파지를 얻었다. 얻어진 매크로파지 중 3×106개를 3.5㎍/㎖의 색소(MolecularTracer DiR(Summit Pharmaceuticals International Corporation)) 및 0.5%의 에탄올과 혼합해서 라벨링했다.
실시예 2에서 조제한 배양 상청을 1㎖/마우스에서 꼬리 정맥으로부터 각 군의 마우스에 주입했다. 이 배양 상청 중의 사이토카인의 양을 상술한 Human IGF-1 Quantikine Elisa kit, Human TGF-β Quantikine Elisa kit, Human VEGF Quantikine Elisa kit를 사용해서 측정했다. 라벨링한 매크로파지의 거동은 Xenogen IVIS 200 series system(Xenogen, Alameda, CA)을 사용해서 관찰했다. 이미징은 추장되어 있는 IVIS 필터 세트(여기 710㎚/형광 760㎚)를 사용하여 여기 파장 748㎚, 형광 파장 780㎚에서 행했다.
GⅣ에서는 라벨링한 매크로파지는 1시간 이내에 이동을 비롯하여 24시간 후에는 종양 전체를 둘러싸도록 집적했다(도 8). 도면 중 종양 하 형성된 우측 후지의 발목 부분에 매크로파지의 침윤상이 보였다. 이것에 대하여 GⅠ~GⅢ에서는 이와 같은 매크로파지의 종양 주변으로의 집적은 보이지 않았다.
(실시예 7) 조직학적 검토
CH3/He 마우스에 5×105개의 SCCⅦ을 주입하고, 1주간 후 15주간 후에 주변 조직을 포함해서 종양을 절제하여 조직학적으로 검색했다. 15주에서 치료군(GⅣ)에 있어서, 종양 괴사를 확인한 예가 있었다(도 6).
또한, 매크로파지 마커는 CD11b 항체(BioLegend, Inc.), 또한 M2 매크로파지 마커는 CD206 항체(Abcam plc.), M1 매크로파지 마커는 ED1(CD68) 항체(Merck Millipore Corporation)를 각각 사용해서 염색하고, 매크로파지의 서브 파퓰레이션인 M1 및 M2의 비를 검토했다. 결과를 도 9에 나타낸다.
도 9에 나타내는 바와 같이 종양 발생 초기(세포 주입 후 1주째)에서는 M2의 비율이 많았던(M1 우위) 것에 대하여 후기(세포 주입 15주)에서는 M1과 M2의 비율이 역전(M1 우위)되어 있었다. 웨스턴 블로팅법에 의해 종양 조직을 조사한 결과 M2에는 TGF-β 수퍼 패밀리가 많이 발현되어 있는 것에 대하여 M1에는 TGF-β 인히비터(Trabedersen, LAP 12009) 등이 발현되어 있는 것을 알 수 있었다.
도 10에 대조군과 치료군에 있어서의 마우스의 종양 조직의 에오신-헤마톡실린 염색에 의한 염색상을 나타낸다. 확대율이 낮은 대조군(A)과 치료군(B)의 염색 상을 대비하면 치료군의 염색상에서 종양 조직에 약간의 사멸하고 있는 부분이 있는 것을 알 수 있다. 확대율을 높이면 그 차이점이 명확하게 관찰되었다(도 10(C) 및 도 10(D)).
이상으로부터 상기 치수 줄기세포는 저산소 조건에 응답해서 종양 증식에 관여하는 특정 사이토카인을 증가, 활성화시키는 것이 나타내어졌다. 그리고, 그 결과, 매크로파지의 유주능을 높여 종양 조직으로 고도로 집적시키는 것이 나타내어졌다.
또한, 종양에 집적한 매크로파지는 그 본래의 탐식능으로 종양 조직을 파괴함과 동시에 TGF-β를 통한 종양의 증식 제어를 행한 것으로 여겨졌다.
본 발명은 의약의 분야에 있어서 유용하다.
Claims (9)
- 포유류의 치수로부터 얻은 유치 치수 줄기세포에 4종류의 유전자를 도입해서 불사화 줄기세포로 하는 줄기세포 제작 공정과,
상기 불사화 줄기세포를 무혈청 배양지 중에서 소정의 시간, 산소 농도가 0.5% 이상 20% 미만인 저산소 농도 하에서 23~27℃에서 배양하고, 컨디션 배지를 조제하는 컨디션 배지 조제 공정을 구비하는 방법에 의해 조제되고,
산소 농도를 20%로 한 것 이외에는 같은 조건 하에서 배양했을 경우에 조제되는 컨디션 배지에 비해 1.5배 이상의 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1) 및 1.5배 이상의 혈관내피세포 증식 인자(VEGF)를 포함하는 암 치료용 의약 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 소정의 시간이 40~56시간인 암 치료용 의약 조성물. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 저산소 농도는 산소 농도 5% 이하인 암 치료용 의약 조성물. - 제 3 항에 있어서,
상기 저산소 농도는 산소 농도 1% 이하인 암 치료용 의약 조성물. - 제 4 항에 있어서,
상기 4종류의 유전자가 hTERT, bmi-1, E6, E7, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 p16INK4a로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 암 치료용 의약 조성물. - 제 1 항에 있어서,
산소 농도를 20%로 한 것 이외에는 같은 조건 하에서 배양했을 경우에 비해 5배 이상의 트랜스포밍 인자β(TGF-β1)를 더 포함하는 암 치료용 의약 조성물. - 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
3배 이상의 스트로마세포 유래 인자(SDF-1)를 더 포함하는 암 치료용 의약 조성물. - 제 1 항, 제 5 항 또는 제 6 항에 기재된 암 치료용 의약 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 암 치료용 의약 제제.
- 제 8 항에 있어서,
상기 암은 고형 종양인 암 치료용 의약 제제.
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