KR20150108843A - 고기능 임플란트 재료 - Google Patents

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KR20150108843A
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culture
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medium
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미노루 유에다
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가부시키가이샤 쿠오리맨
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Abstract

본 발명은 간편한 방법으로 재료의 표면 특성을 향상시키고 뼈와 금속 임플란트 재료를 일정 기간 중에 충분히 일체화 가능한 임플란트의 제조용 세포 산생물의 제조 방법, 상술한 방법으로 생성된 생산물, 상기 생산물을 이용한 기능 임플란트를 제공하고자 한다. 골수 간질 세포 또는 불멸화 유치 줄기 세포에서 이들 세포를 생산하고 Col-I, OCN, OPN, BSP, 피브로넥틴 및 VEGF와 이외의 다른 성장 인자를 포함하는 세포 산생물을 제조하고 얻어지는 세포 산생물과 석회화 용액을 이용하여 이들의 성장 인자를 표면에 고정화한 고기능 임플란트를 제공한다.

Description

고기능 임플란트 재료{HIGHLY FUNCTIONAL IMPLANT MATERIAL}
본 발명은 골수 간질 세포(BMCs) 또는 불멸화 유치 줄기 세포의 생산물을 이용한 기능 임플란트 재료에 관한 것으로, 보다 세부적으로는 상기 BMCs 골수 간질 세포 또는 불멸화 유치 줄기 세포의 생산물을 표면에 코팅한 고기능 임플란트 재료에 관한 것이다.
치과 치료 목적의 하나는 인공적인 재료를 이용하여 결핍된 치아의 기능 및 형상을 회복하는 데 있다. 이 때문에, 결핍된 치아 등을 보충하기 위해서 가장 일반적인 치료로서 임플란트가 사용된다.
본래, 결핍된 치아 등에 충분한 기능을 발휘시키기 위해서 임플란트를 안정화시킬 필요가 있으므로, 임플란트는 치조골과 일체화하는 것이 바람직하다. 이 때문에, 이러한 임플란트 재료로서, 바이오 유리나 인산 칼슘 세라믹(즉, 히드록시 아파타이트 및 β-인산 삼칼슘) 이 외의 생물 활성 재료 및 금속 재료가 사용되어 왔다.
뼈와의 일체화 차원에서 보면, 이런 생물 활성 재료는 생체 적합성이 높다는 점에서 뛰어나다. 한편, 이에는 큰 힘이 걸리기 때문에 강도나 내구성이라는 기계적 특성이라는 관점에서 보면 금속 재료가 훨씬 뛰어나다. 따라서, 이러한 금속 재료 중에서도 생체 적합성 및 비용 등의 면에서 티탄(이하,"Ti"라고 하는 경우가 있음)이 임플란트 재료로 범용되고 있다.
임플란트 재료의 표면 특성을 향상시키는 기술로서는, 인간 간엽계 줄기 세포 및 골아 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포, 또는 소 혈장 알부민, 프렉션(fraction) V 및 소혈청 피브로넥틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 표면에 이끌릴 수 있다. 양의 전하를 띤 금속 산화물을 표면에 가진 임플란트(이하,"종래 기술 1"이라 함)이 제안되고 있다.
또한, 금속 임플란트의 뼈에 대한 일체화는 뼈의 재생 능력에 의존하는 것으로 알려졌다. 이에, 이 뼈에 대한 일체화 능력을 향상시키기 위해서, 골 형성 시약이나 성장 인자의 임플란트 재료 표면에 적용이 수행되어 왔다. 지금까지의 보고(이하,"종래 기술 2"이라 한다.)에서는, 폴리펩티드와 세포를, 무코 다당류로 코팅한 임플란트 상에 고정하면 이식 후 골 유착 및 골 복원을 개선하는 것이 보고되고 있다.
특허공개 2012-509750 특허 공개 2004-531461
상술한 종래 기술은 금속 임플란트 재료 표면을 처리하지 않는 경우와 비교하면, 뼈에 대한 일체화가 진행되고 있다는 점에서는 훌륭한 것이다. 그러나 생체 적합성이 높은 생물 활성 재료를 사용한 경우에 비하면 뼈에 대한 일체화는 미흡하다는 문제점이 있었다.
또한, 금속 임플란트 재료 표면 처리는 우선 금속 임플란트 표면을 활성화하기 전 처리를 하고, 그 후에 뼈 형성 시약으로 처리하거나 성장 인자를 적용하는 순서로 진행되기 때문에 조작이 번잡스러웠다. 나아가, 금속 임플란트 재료 표면에 성장 인자를 적용할 경우에는 그 표면에 고정된 성장 인자 보유되는 기간이 문제가 된다. 금속 임플란트 재료의 표면에 유지되는 기간이 뼈와 금속 임플란트 재료가 일체화하는 데 필요한 시간과 비교해서 짧으면 충분한 일체화할 수 없기 때문이다.
이 때문에 간편한 방법으로 재료의 표면 특성을 향상시키고 뼈와 금속 임플란트 재료를 일정 기간 중에 충분히 일체화할 수 있도록 하기 위해서는 강한 사회적 요청이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 상황 하에 완성된 것이다.
즉, 본 발명의 제1의 양태는 5~15%의 혈청, 50~150 U/mL의 페니실린 및 50~150 μg/mL의 스트렙토마이신을 함유한 배양액에 5×103~5×104개/mL의 골수 간질 세포 또는 불멸화 유치 줄기 세포를 첨가하여 34~37.5℃, 5% CO2 존재 하에 예비 배양을 실시하는 예비 배양 공정과, 소정의 형상과 접착성을 가지는 상기 세포를 선별하는 세포 선별 공정; 상기 선별 공정에서 선별된 세포를 예비 배양과 같은 조건에서 배양하고 배양 개시 후 40~56시간 배양상청을 모으는 배양상청 수집 공정을 갖추는 세포 산생물 제조 방법이다.
여기에서, 상기 골수 간질 세포는 랫트의 대퇴골에서 얻어진 것이 좋고, 불멸화 유치 치수 간 세포는 돼지 치수 및 인간 유치로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 세포에서 유래하는 것이 바람직하다. 상기 세포는 37℃에서 배양하는 것이 좋다.
또한, 상기 세포 선별 공정에 있어서 소정의 형상은 스핀들 형상이고 방추형인 것이 바람직하다. 상기 배양상청은 배양 개시 후 44~52시간으로 모으는 것이 바람직하고, 배양 개시 후 48시간으로 모으는 것이 더 바람직하다.
여기에서 상기 배양액은 둘베코(Dulbecco) 배지, 이스코브 개변 둘베코(Iscove modification Dulbecco) 배지, 햄 F12 배지 및 rpmI 1640 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 배지인 것이 좋다. 또한, 상기 혈청은 소태아 혈청, 소혈청, 말 혈청, 인간 혈청 및 양 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 혈청인 것이 바람직하다. 나아가, 상기 배양액은 10%소태아 혈청과 100 U/mL의 페니실린과 100 μg/mL의 스트렙토마이신을 포함하는 것이 좋다.
또한, 상기 제조 방법은 원심 및 에탄올 침전 처리를 하고 침전물을 제조하는 침전물 조정 공정과 상기 침전물 제조 공정에서 얻어진 침전물을 동결 건조시키는 동결 건조 공정을 더 갖추는 것이 바람직하다.
본 발명의 제2의 양태는 상술한 제조 방법으로 제조된 세포 생성물이다. 상기 세포 산생물에는 적어도 I형 콜라겐(Col-I), 피브로넥틴, 데콜린 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 포함되는 것이 바람직하고, 이들과 더불어 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 7, 폴리스타틴 관련 단백질, 메탈로프로티나아제 억제제-I, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 억제제, 액틴 및 설프히드릴 옥시다아제 I, SPARC, 콜라겐 α2(IV) 사슬, β-2-매크로 글로불린, Rho GTPase 활성 단백질 18이 더 포함되는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명은 또한, 임플란트 재료의 표면을 유기 용매에 세척하고, 세척 임플란트 재료로 하는 세정 공정;상기 세척 임플란트 재료를 소정의 조성을 가진 제1석회화 용액 안에서 소정의 온도로 3~6시간 숙성하는 침지 임플란트 재료로 하는 숙성 공정; 상기 침지 임플란트 재료를 소정의 농도의 세포 산생물을 함유하는 제2석회화 용액에서 2~5일 간 큐베이트 처리하는 처리 공정을 갖추는 것을 특징으로 하는 고기능 임플란트 제조 방법이다.
여기에서, 상기 임플란트 재료는 티타늄, 지르코니아, 하이드록시 아파타이트 및 β-TCP로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 재료로 형성되어 있는 것이 좋다. 또한, 상기 유기 용매는 아세톤과 60~80% 에탄올인 것이 좋다. 또한 상기 제1석회화 용액은 100~150 mm NaCl, 2.5~3.5 mm CaCl2·H2O, 1.5~2.5 mm K2HPO4, 25~75 mm Tris-HCl(pH 7.2~7.6)인 것이 바람직하고, 136.8 mm NaCl, 3.10 mm CaCl2·H2O, 1.86 mm K2HPO4, 50 mm Tris-HCl(pH 7.4)임이 더 바람직하다.
또한, 상기 소정의 온도가 36~38℃이며 침지 시간이 4시간인 것이 바람직하다. 상기 소정의 세포 산생물은 상기의 세포 산생물의 5~20 mg/mL의 수용액인 것이 바람직하고, 약 10 mg/mL임이 더 바람직하다.
본 발명의 제3의 양태는 전술한 하나의 방법으로 제조된 고기능 임플란트로, 여기서 상기 임플란트 재료는 티타늄, 지르코니아, 하이드록시 아파타이트 및 β-TCP로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 재료에 형성되고 있는 것이 바람직하다.
상기 임플란트는 적어도 최소한 I형 콜라겐(Col-I), 피브로넥틴 및 데콜린을 표면에 보유하는 것이 바람직하고, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 7(IGF-binding protein 7)폴리스타틴 관련 단백질, 메탈로프로티나아제 억제제-I, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 억제제, 액틴 및 설프히드릴 옥시다아제 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 이상의 단백질을 더 표면에 갖는 것이 더 바람직하다.
본 발명의 제조 방법에 따르면 골수 간질 세포 또는 불멸화 유치 치수 간 세포에 의해서 생성되어, Col-I, 데콜린, 비멘틴, IGF-결합 단백질 7, 피브로넥틴, SPARC(secreted protein acidic and rich cycteine)등을 포함하는 세포 산생물을 제조할 수 있으며, 이러한 세포 산생물을 이용하여 간편하게, 고기능 임플란트를 제조할 수 있다. 또한, 단기간에 뼈와 일체화할 수 있는 고기능 임플란트 재료를 얻을 수 있다.
[도 1] 도 1은 주사형 전자 현미경(SEM)을 이용하여 촬영한 Ti 임플란트 표면의 전자 현미경 사진이다. 도 1에서, (A) 및 (D)는 PBS(인산 완충 생리 식염수)로 처리한 경우의 표면, (B) 및 (E)는 DMEM(둘 베코의 α-MEM)으로 처리한 경우의 표면, (C) 및 (F)는 CM(세포 배양의 배양상청)으로 처리한 경우의 표면을 나타낸다.
[도 2] 도 2는 상기와 같이 처리한 Ti 임플란트(이하,"Ti 플레이트"라고 하는 경우가 있다.) 표면에, 1.0×106개의 세포를 파종하고, 24시간 후에 접착하여 있는 세포 수를 나타낸 도이다(ANOVA 검정. 도 중, *은 p<0.05를 나타낸다).
[도 3] 도 3은 고정화된 DMEM 또는 CM을 가진 Ti 플레이트 표면상에 배양된 랫트 BMSCs의 겔 전기 영동상 (A)~(C) 및 이를 정량화한 그래프 (D)~(F)이다.
[도 4] 도 4는 in vivo에서의 Ti 임플란트 상에 QD 라벨된 생체 분자의 검출 화상이다. 도 중, PBS, DMEM 및 CM은 상기와 같다.
[도 5] 도 5는 상술한 치수 세포에서 선택된 불멸화 줄기 세포와 불멸화 줄기 세포가 아닌 세포의 개체 배화수와 배양 기간과의 관계를 그래프이다. 도 1중, SHED-T는 불멸화 줄기 세포를 나타내고, SHED-C는 불멸화 줄기 세포가 아닌 세포를 나타낸다.
[도 6] 도 6은 SHED-C및 SHED-T에서 STRO-1 발현의 결과를 나타내는 그래프이다(도 2 (A)~(D)). 도 중, PD20은 개체수 배화 횟수=20회, PD30은 개체수 배화 횟수=30회 및 PD40은 개체수 배화 횟수=40회를 나타낸다.
[도 7] 도 7은 도 8에 나타낸 각 개체 배가 시간 때, SHED-C와 SHED-T조직 염색상을 나타낸 도이다.
[도 8] 도 8는 개체 배가 시간(회수)과 신생 골량과의 관계를 나타내는 그래프이고, 도 중,**는 p<0.05,***는 p<0.01을 나타낸다. 신생 골량은 이하의 산출식으로 구하였다. 신생 골량=신생 뼈 면적/시야 면적×100
[도 9] 도 9는 랫트의 대퇴골 Ti 임플란트의 토크 제거의 값을 나타내는 그래프이다(N=3). PBS, DMEM 또는 CM으로 28일 간 관찰하였다(ANOVA검정. *은 p<0.05를, **는 p<0.01을 나타낸다).
[도 10] 도 10은 대퇴골 해면골 또는 피질골의 뼈-임플란트 접촉(Bone-to-implant contact, 이하, "BIC"이라고 생략한다.)의 변화를 나타내는 그래프이다(N=3). (A)는 해면골, (B)는 피질골을 나타낸다. 도 중, ANOVA 검정 결과, *는 p<0.05, **는 p<0.01을 나타낸다.
[도 11] 도 11은 본 발명의 세포 생성물로 처리한 경우가 아닌 경우와 임플란트의 안정성의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 그래프이다(N=3). 도 중, ANOVA 검정 결과, *는 p<0.05를 나타낸다.
[도 12] 도 12는 PBS에서 처리한 경우 및 본 발명의 세포 생성물 처리한 경우의 세포 수의 차이를 나타낸 그래프이다(N=3). 도 중, P는 대기압 아래에서 플라스마 처리를 한 경우, N은 플라즈마 처리를 하지 않은 경우이다. 또한, ANOVA 검정 결과, *는 p<0.05, **는 p<0.01을 나타낸다.
[도 13] 도 13은 도 12의 경우의 세포의 증식을, DAPI(4', 6-디아미노-2-페닐 인돌)와 팔로이딘으로 염색하여 형광 현미경으로 관찰한 결과이다(N=3). 도 중, 기준 자는 100 μM을 나타낸다.
[도 14] 도 14는 본 발명의 세포 산생물을 4℃, -15℃ 및 -80℃에서 1주일(1W), 2주(2W), 및 1개월(1M) 보존하여, 이들을 동일한 양으로 배지에 첨가한 경우의 세포의 증식률의 변화를 나타낸다(N=3).
이하, 본 발명의 골수 간질 세포의 생산물의 제조 방법에 대해서 상세하게 설명한다.
본 발명의 제조방법은 (a) 5~15%의 혈청, 50~150 U/mL의 페니실린 및 50~150 μg/mL의 스트렙토마이신을 함유하는 배양액 내에, 5×103~5×104개/mL의 골수 간질 세포 또는 불멸화 유치 줄기 세포를 첨가하여, 34~37.5℃, 5% CO2 존재 하에 예비 배양을 실시하는 예비 배양 공정과; (b) 소정의 형상과 접착성을 가지상기 세포를 선별하는 세포 선별 공정과; (c) 상기 선별 공정에서 얻어진 세포를 예비 배양과 같은 조건에서 배양하고 배양 개시 40~56시간 후 배양상청을 모으는 배양상청 수집 공정;을 갖추고 있다.
여기에서, 상기 배양액은 둘베코(Dulbecco) 배지(이하, "DMEM"이라고 하는 경우가 있다.), 이스코브 개변 둘베코(Iscove modification Dulbecco) 배지 (이하,"IMDM"이라고 하는 경우가 있다.), 햄 F12제(이하, "Ham 12"이라고 하는 경우가 있다.) 및 rpm I1640 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 배지인 것이나, 입수 및 취급이 용이한 것이 바람직하다. 상기의 배지는 기본 배지라는 배지이며, GIBCO사, SIGMA사 등에서 구입할 수 있다. 이들의 배지 가운데는 2종 이상을 병용하여 혼합 배지로 하여 사용할 수도 있다. 혼합 배지의 한 예로, IMDM과 HamF12를 동일한 양으로 혼합한 배지(예를 들면, 상품명:IMDM/HamF12(GIBCO사)으로 시판된다)를 들 수 있다.
또한, 상기 혈청은 소태아 혈청, 소혈청, 말 혈청, 인간 혈청 및 양 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 혈청인 것으로 세포의 증식이 좋고 문제가 되는 단백질을 배양상청 안에 생산하지 않는 것이 바람직하다.
배지에 첨가 가능한 성분으로는 상기의 혈청의 외에 혈청 대체물(Knockout serum replacement(KSR) 등), 소혈청 알부민(BSA), 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 이외의 기타 항생제, 비타민 K, 엽산 이외의 기타 각종 비타민류, 칼슘, 마그네슘 이외의 기타 각종 미네랄, 아르기닌, 트립토판 이외의 기타 아미노산 등을 들 수 있다.
본 발명의 제조 방법에서는 10% 소태아 혈청과, 100 U/mL의 페니실린과, 100 μg/mL의 스트렙토마이신을 포함한 배양액을 사용하는 것이 충분한 양의 세포 증식 인자군을 포함하는 배양상청을 얻는 데 바람직하다.
또한, 본 발명은 (d) 원심 및 에탄올 침전 처리를 하고 침전물을 제조하는 침전물 조정 공정과; (e) 상기 침전물 제조 공정에서 얻어진 침전물을 동결 건조시키는 동결 건조 공정을 더 갖추는 방법으로 할 수 있다.
상기 골수 간질 세포는 랫트의 대퇴골, 돼지 치수 및 인간 유치로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 세포에서 유래하는 것이, 일정한 종류의 세포 성장 인자를 안정되고 생산할 수 있는 세포를 확실하게 입수할 수 있는 것으로부터부터 바람직하다.
여기에서, 세포 성장 인자란 특정 세포의 증식 분화 등에 관여하는 폴리 펩티드성 인자의 총칭이며, 면역계를 조절하는 림포카인과 사이토카인 등도 포함된다. 증식 인자, 세포 증식 인자로 불리기도 한다. 이하, 세포 성장 인자를 간단히 "성장 인자"라고 하는 것이 있다.
성장 인자는 생체 내의 여러 가지 세포학적 프로세스, 생리학적 프로세스 조절에 관여하는 것으로 알려졌고, 표적 세포 표면에 있는 수용체 단백질(이하, 간단히 "수용체" 또는 "리셉터"라는 것이 있다.)에 특이적으로 결합하는 시그널 전달을 한다.
대표적인 성장 인자로서는, 상피 성장 인자(Epidermal growth factor:EGF), 인슐린 유사 성장 인자(Insulin-like growth factor:IGF), 형질 전환 성장 인자(Transforming growth factor:TGF), 신경 성장 인자(Nerve growth factor:NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(Brain-derived neurotrophic factor:BDNF), 혈관 내피 세포 증식 인자(Vesicular endothelial growth factor:VEGF), 과립구 콜로니 자극 인자(Granulocyte-colony stimulating factor:G-CSF), 과립 대식 세포 자극 인자(Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor:GM-CSF), 혈소판 유래 성장 인자(Platelet-derived growth factor:PDGF), 에리스로포이에틴(Erythropoietin:EPO), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin:TPO), 염기성 섬유 모세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor:bFGF 또는 FGF2), 간 세포 성장 인자(Hepatocyte growth factor:HGF) 등을 들 수 있다.
TGF-β은 자연계에 존재하는 증식 인자의 1개이다. 다른 다수의 신호 경로와 마찬가지로 소자의 발생, 세포의 분화, 배아 발달에 매우 중요한 역할을 한다.
β형 변이 증식 인자 TGF-β은 신장, 골수, 혈소판 등 거의 모든 세포에서 생산되고, 5 종류의 서브 타입(β1 ~ β5)이 존재한다. TGF-β1~β3은 뼈 기질 중에 불활성형으로 축적되어 있고 뼈 흡수 때 파골 세포가 방출하는 산에 의해서 활성화된다. TGF-β은 골아 세포의 증식 및 콜라겐 등의 간엽 세포의 합성·증식을 촉진하나, 상피 세포의 증식이나 파골 세포에 대해서는 억제적으로 작용한다.
티로신 인산화 효소 활성을 가지는 상기 수용체는 성장 인자의 결합에 의한 단백질 중의 티로신 잔기가 인산화되어, 세포의 증식·분화가 야기된다. 또한, 개체 발생 때 성장 인자가 중배엽 유도 물질로 된 예도 있다.
상기의 성장 인자는 이들의 구조 및 진화의 측면에서 관련하는 몇가지 패밀리로 분류된다. 이들의 페밀리로는 TGF-β, 골 형성 단백질(bone morphogenic protein:BMP), 뉴로토로펜.(신경영양 인자), 섬유 아세포 증식 인자(FGF) 등을 들 수 있다. 상기 신경 영양 인자에는 NGF, BDNF, NT3 등이 포함된다. 성장 인자는 현재 의료에서도 활발히 이용되고 있다.
또한, TGF-β은 TGF-β 슈퍼 패밀리를 구성하는 1개의 멤버인데, 이 슈퍼 패밀리에는 생물의 골 형성에 중요한 역할을 하는 골 형성 단백질(bone morphogenic protein:BMP) 등이 포함된다.
본 발명의 배양상청에는 콜라겐 α-1(I) 사슬, 콜라겐 α-2(I) 사슬, 비멘틴, 콜라겐 α-1(IV) 사슬, IGF 결합 단백질 7(IGFBP7), 피브로넥틴, 데콜린, 플라스미노겐 활성화 인자 억제제 1, 액틴(세포질성 2), 설프히드릴 옥시다아제 1, SPARC, 메탈로프로티나아제 억제제-1, 콜라겐 α-2(IV) 사슬, SCP2, 72kDa IV형 콜라게나아제, β-2-매크로 글로불린, Rho GTPase 활성 단백질 18등의 각종 단백질이 포함된 것이 바람직하다.
여기에서, 콜라겐은 3개의 α 사슬로 구성되는 3중 나선 구조의 분자인, I형, II형, III형, IV형, V형 등 많은 형태가 있는 것으로 알려졌다. 각 형태의 분자는 같은 종류 또는 다른 종류의 폴리 펩티드 사슬로 이루어진다. 이 폴리 펩티드 사슬(α사슬)의 종류에는 30종류 이상이 있음이 알려졌으며 α 1(I), α 2(IV) 등으로 불린다.
콜라겐 단백질 패밀리는 다음과 같이 분류된다.
1)특이적인, 67nm 주기의 횡문 구조를 가지는 섬유를 형성하는 분자 군(I형, III형, V형(주로 디스크 이외의 조직)), II형, XI형(연골 조직)
2)이들의 섬유 표면에 결합하여 있는 분자군(XII형, XIV형(연골 이외의 조직)IX형(연골 조직)
3)그물코 모양의 회합체를 형성하고 있는 분자군(주로 기저막의 골격을 형성하는 IV형 콜라겐), 세포 외의 미세 섬유를 형성하는 VI형, 피부 등의 표피 기저 세포의 기저판을 뚫고 존재하는 고정 원섬유(Anchoring fibril)을 형성하는 VII형
4)헥사고날 격자를 형성하는 X형(연골이 뼈로 이행하는 시기에 잠정적으로 존재한다), 눈의 핵막의 데스메의 육각형 구조를 형성하는 혈관(혈관 이외의 다른 조직에도 존재한다), 또한, 세포막을 관통하는 도메인을 가진 XIII형, XV형, XVII형, XVIII형
비멘틴은 섬유 아세포, 백혈구 세포 등의 간엽계 세포에 특징적으로 발현하고 있는 중관경 필라멘트 단백질이다. 각종 단백질 인산화 효소에 의한 인산화에 따른 비멘틴 필라멘트 구축의 제어를 받는다. 발생 과정에서 일과성 발현되는 것으로 알려졌다.
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 7(insulin-like growth factor-binding protein 7:IGFBP7)은 IGF-1수용체에 결합하는 인슐린 유사 성장 인자에 의한 IGF-1수용체 활성화를 차단한다. 이 때문에 IGFBP7의 존재량은 종양 진행과 반대 관계를 나타내는 단백질이다.
피브로넥틴은 세포 외 매트릭스를 형성하는 당 단백질로 분자량 약 250kDa의 폴리펩티드가 이합체를 형성하고 있다. 주로 섬유 아세포, 줄기 세포, 신경 세포 등의 접착을 촉진한다. 세포막 표면의 특이적 수용체인 인테그린을 통해서 세포 부착 외의 세포 이동, 식균 작용의 촉진 등에 관여하고 더욱이 조직 손상의 경우에서도 일한다.
데콜린은 소형 데르마탄 황산염 프로테오글리칸, 골 프로테오글리칸 II, PG-40, PG-II, PG-2, DS-PGII, 38kDa(분자량 3.8만)의 코어 단백질에 1개의 콘드로이틴 황산의 혼성 사슬을 가진 프로테오글리칸, 콜라겐 섬유에 결합하여 존재한다. 연골 뼈, 힘줄, 피부, 공막, 대동맥 등의 동물의 결합 조직에 널리 분포한다.
플라스미노겐 활성화 인자 억제제(PAI)는 섬유소 용해에 중요한 역할을 하는 조직 플라스미노겐 활성제와 결합하고 이의 작용을 저지한다. 가장 중요한 것은 혈관 내피로 생산하는 PAI-1이며, 혈소판 중에도 존재한다. 이 외에 태반에서 생성되는 PAI-2와 활성화 단백질 C(APC)을 저지하는 PAI-3가 있다. PAI-1의 혈중 농도 증가는 혈전 경향의 원인이 되나, 일종의 급성기 단백질이여서, 오전보다 오후가 높고 혈중의 트리 아실 글리세롤과 비례의 상관이 있다.
액틴(세포질성 2)은 근육의 수축성 단백질이다. 세포 내에서 액틴은 주로 액틴 필라멘트로서 기능한다고 생각되고 있다. 근 세포에서는 액틴 필라멘트는 II형 미오신과 회합하여 액토미오신 속을 형성하고 근 수축력에 기여한다. 신경 세포를 포함하는 근 세포에서 액틴 필라멘트는 돌기 모양의 필로포디아(Filopodia, 사상 위족), 세포 주변적인 표면파형 구조인 라멜리포디아(Lamellipodia, 엽상 위족), 활성화된 II형 미오신과 회합하여 액토미오신 속으로부터 된 스트레스 섬유(Stress fiber) 등의 다양한 액틴 구조를 형성한다.
이들 액틴 구조의 재편성은 Rho 패밀리 저분자량 G단백질을 통한 세포 내 정보 전달에 의해 시공간 특이적으로 제어되고 있어, 세포 운동이나 세포 분열 등의 세포 형태의 동적 제어에서 중요한 기능을 담당한다. 동시에, 비정형 미오신의 결합을 통해서 액틴 필라멘트에 따른 소포 수송에 기여한다. 이런 동적인 역할 외에도 액틴 필라멘트는 세포막 바로 아래에 집적하고 세포 피질(cell cortex)의 보강 구조를 형성하는 외에, α-카테닌이나 빈쿨린을 통해서 세포 부착 인자인 카데린과 결합하여 세포 간 접합을 지지한다.
설프히드릴 옥시다아제 1은 R'C(R)SH를 기질로 하여, 티올 산화 효소이다.
SPARC는 뼈와 상아질에 존재하는 30kDa의 비아교질 단백질이며, 진피의 형성을 기능에 중심적인 역할을 한다. 섬유 아세포로부터 분비되고 콜라겐과 히알루론산의 합성을 높인다.
메탈로프로티나아제 억제제는(TIMP, Tissue Inhibitors of Metallo-Proteinases) 기질 금속 단백질 분해 효소(matrix metalloproteinase: mmP)의 활성을 조절하는 내재성 저해 물질이다. mmP는 Zinc 금속 단백질 분해 효소 패밀리로, 세포에서 분비되는 세포 외기질의 대사를 조절한다. 현재 다른 저해 형식을 가진 4종의 TIMP, TINP-1~4이 알려져 있으며 조직에 의해서, mmP의 유입에 따라서 다른 차원으로 발현한다. TIMP-1과 2는 모두 많은 mmP의 활성 부위에 결합하고 이들의 활성을 비가역적으로 저해한다. 또한, 이들 2개의 TIMP는 여러 세포에 직접적으로 작용하고 성장 촉진 활성을 나타낸다.
SCP2는 석유, 천연 가스, 알코올, 당밀, 농산물 등을 발효 원료로서 대량 생산되는 미생물 세포 또는 변종의 단백질 추출물을 말한다. "단세포 단백질"이라고도 좋고, 효모, 세균, 진균, 조류 등의 단백질에 풍부한 단세포 생물을 살균하고 건조한 물을 말하기도 한다.
72kDa IV형 콜라게나아제는 젤라틴 분해 효소도 좋고, 젤라틴 분해 효소 중 A 효소를 72kDa IV형 콜라게나아제(mmP-2)라고 부른다. 95kDa의 B효소는 mmP-9로 불린다. mmP-2는 촉매 도메인에 삽입된 II형 피브로넥틴 도메인의 3개의 반복을 가지고 있으며, mmP-9과 함께 mmPs의 젤라티나아제 그룹에 속한다. mmP-2는 콜라겐 I, IV, V, VII, X, XIV, 젤라틴(gelatin), 엘라스틴, 라미닌-1, 라미닌-5, 미엘린 염기성 단백질(myelin basic protein), mmP-1, mmP-9, mmP-13에 직접 혹은 간접적인 기질 특이성을 나타낸다.
β-2-매크로 글로불린은 조직 적합 항원(등급 I)을 구성하는 두 가닥 중 경 사슬이다. 조직 적합 항원의 특이성을 나타내는 항원성을 갖지 않는다.
Rho GTPase 활성 단백질은 분자량 2~3만 서브 유닛 구조를 가지지 않는 군의 G단백질로 슈퍼 패밀리를 구성하고 있다. 이 슈퍼 패밀리는 Ras, Rho, Rab, Arf, Ran의 5개의 그룹으로 분류된다. Rho GTPase활성 단백질은 이 중 Rho에 속하는 단백질이다. Rho단백질은 액틴 필라멘트의 재편성을 통해서 평활근의 수축과 세포질 분열 세포 운동, 세포 형태를 제어하고 있다.
골수 간질 세포는 골수 중에 존재하는 골수 천자에 의해서 용이하게 채취할 수 있고 조혈을 지탱하는 세포를 말한다. 여기에서 골수에는 혈액 세포와 혈액 세포를 지지하는 간질 세포라는 2가지로 대별되는 세포가 포함되어 있으나, 골수 간질 세포는 후자에 포함된다. 혈액 세포가 배양하면 부유 상태에서 증식하지만 골수 간질 세포는 벽에 부착하고 증식한다. 형상은 간엽계 세포와 같으나, 골수 중 망상 구조를 취한다. 통상의 섬유 아세포와 같이 배양이 가능하다. 원래 간엽계에서 유래한 간질 세포는 다양한 세포로 분화한다. 골수 간질 세포는 뼈 세포, 연골 세포, 지방 세포, 골격근 세포로 분화 유도된다.
치수 세포는 치아 신경에 포함되는 간 세포의 일종이다. 치수 세포는 이빨이라는 단단한 소재로 보호되고 있으며, 이빨은 자외선이나 방사선을 통하지 않아 유전자도 상처받기 어렵다고 알려졌다.
불멸화 유치 줄기 세포는, 치아로부터 얻은 치수 간 세포를 불멸화한 세포이며, 치수 간 세포는 치아 신경에 포함되는 간 세포의 1종이다. 이는 단단한 소재로 구성되며 치수를 물리적으로 보호하고 자외선이나 방사선을 거치지 않기 때문에 유전자도 상처받기 어렵다고 알려졌다.
불멸화 줄기 세포는 다음과 같이 제조한다. 우선 탈락 유치를, 예를 들면, 클로로헥시딘, 이소딘 용액 이외의 기타의 소독약으로 소독한다.다음으로, 동물의 대퇴골을 저면으로 하는 경우에는, 예를 들면, PBS 등을 채운 실린지에 이 동물의 대퇴골의 골공에 제대로 빠지는 굵기의 주사 바늘을 선택하여 골수 세포 밀어내듯이 꺼낸다. 또한, 돼지의 이빨 또는 인간 탈락 유치 경우에는 각각의 치관부를 분할하고 치과용 리머로 치수 조직을 회수한다.
채취한 골수 간엽 세포 또는 치수 조직을, 기본 배지, 예를 들면, 5~15% 소혈청(이하,"CS"라는 것이 있다.) 및 50~150 유닛/mL의 항생 물질을 함유하는 둘 베코 개변 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 이하,"DMEM"이라 한다.)에 현탁한다. 다음으로, 1~5 mg/mL의 콜라게나아제 및 1~5 mg/mL의 디스파아제를 이용하여 37℃에서 0.5~2시간 처리한다.
상기 기본 배지로는, 상술한 배지, 예를 들면 DMEM에 소 태자 혈청을 첨가하여 효소 처리 후 3~10분간의 원심 조작(3,000~7,000 회전/분)을 하여, 치수 세포를 회수한다. 필요에 따라서, 셀 스트레이너를 이용하여 세포의 선별을 수행한다. 선별된 세포를, 예를 들면, 3~6 mL의 상기 기본 배지에서 다시 현탁하고 직경 4~8cm의 부착성 세포 배양용 디쉬에 파종한다.
다음으로, 배양액, 예를 들면, 10% FCS를 함유하는 DMEM을 첨가한 후, 5% CO2 인큐베이터에서 37℃, 예를 들면, 2~3일마다 배지를 교환하면서 2주 정도 배양한다. 이 간격으로 2~4회 계대를 실시한다. 서브컨플루렌트(subconfluent)된 것을 확인한 후 상기 배양액을 제거하고 PBS등에서 세포를 1~수회 세척한다. 배양액의 제거 및 세포의 세척에 대신하여 콜로니를 형성한 접착성의 치수 간 세포를 회수할 수도 있다. 접착성의 치수 간 세포는 예를 들면, 0.025~0.1%의 트립신과 0.3~1 mm의 EDTA에서 몇 분 동안 37℃에서 처리하고 접시로부터 분리시키고 세포를 회수한다.
치수 간 세포의 경우에는 효소 처리 후 3~10분간의 원심 조작(3,000~7,000회전/분)을 하여, 치수 세포를 회수한다. 필요에 따라, 셀 스트레이너를 이용하여 세포 선별한다. 선별된 세포를, 예를 들면 3~6 mL의 상기 기본 배지에서 다시 현탁하고 직경 4~8cm의 부착성 세포 배양용 접시에 파종한다.
다음으로, 배양액 예를 들면, 10% FCS를 함유하는 DMEM을 첨가하여 상기와 같이 소망의 기간 배양하고 PBS등에서 세포를 1~수회 세척하고 접착성 세포를 얻는다.
랫트의 골수 세포를 사용할 경우에는 랫트의 대퇴골 수강에서 얻은 골액(약 30~100 μL/대퇴골)을 약 5~15%의 소태아 혈청(FBS), 페니실린, 스트렙토마이신(와코 순약 공업(주))을 포함하는 DMEM에 넣어 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 2~4대 예비 배양을 하고 소망의 특징을 가진 세포를 선택하는 것이 좋다.
예를 들면, 골액(약 50 μL/대퇴골)을 10% FBS 상술한 농도의 페니실린, 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에 넣어 5% CO2 인큐베이터 중에서 37℃에서 3대 예비 배양을 하고, 후술하는 선별 공정에서 스핀들 형상 및 접착성 등 특징을 가지는 세포를 선택한다.
이상과 같이, 선별된 접착성 세포(줄기 세포)을 얻는다. 그 다음으로, 예를 들면, 줄기 세포를 접착성 세포 배양용 접시에 파종하고 5% CO2,37℃의 조건에서 배양한다.
대퇴골에서 얻은 BMSCs를 사용한 경우에는 스핀들 형상 및 접착성 등 특징을 가지는 세포만을 선택하고 사용한다.
계대 배양은 예를 들면, 육안으로 관찰하고 서브컨플루렌트(subconfluent) 또는 컨플루렌트(confluent)에 이르렀을 때, 상술한 바와 같이 트립신과 EDTA을 이용하여 세포를 배양 용기에서 분리시키고 회수하여, 다시 배양액을 넣은 배양 용기에 파종한다.
여기에서, 서브컨플루렌트는 배양 용기 중의 세포 부착 면의 약 70%에 세포가 부착된 상태를 말한다. 예를 들면 계대 배양을 1~8회 수행하여 선별된 세포를 필요한 세포 수, 예를 들면 약 1×107개/mL까지 증식 시킨다. 이렇게 배양한 후에 세포를 회수하고 액체 질소 중에서 보존한다. 다양한 도너로부터 회수한 세포를 치수 줄기 세포 뱅크의 형태로 보존하는 것도 좋다.
불멸화 줄기 세포를 제조하는 경우에는 상기와 같이 얻은 줄기 세포를 초기 배양하여 초기화 배양 세포를 얻는다. 이 초기 배양 세포에 다음과 같이, hTERT, bmi-1, E6, E7을 도입한다. 상기의 유전자를 활용하기 위한 플라스미드를 제조하고 이를 셔틀 벡터, 예컨대 pSuttle2 에 넣어 상기의 유전자를 복제한다. 이 셔틀 벡터에서 대장균을 형질 전환하고-카나마이신류 본성 형질 전환체를 선택한다. 선택한-카나마이신류 본성 형질 전환체의 플라스미드 DNA을 정제하여, 제한 효소 부위를 해석해서 재조합을 동정한다.
다음에, 제한 효소, 예를 들면, PI-Sce I 및 I-Cue I를 사용하여 발현 카세트를 상기의 셔틀 벡터에서 꺼내어, 이를 아데노 바이러스 벡터, 예를 들면, Adeno-X viral DNA에 리게이션한다. 얻어진 리게이션 산물을 Swa I에서 절단하고 이를 이용하여 대장균을 트랜스 포메이션한다.
여기에서, hTERT는 텔로미어 수복 효소의 유전자이며, bmi-1은 폴리콤 복합체를 구성하는 단백질의 1개인 Bmi-1유전자이다. 여기서, Bmi-1은 조혈 줄기 세포의 유지에 필요하며 활성 증강으로 조혈 줄기 세포를 늘릴 수 있다는 작용을 가진다.
E6 및 E7은 HPV-16 또는 HPV-18의 DNA의 초기 유전자이다. 또한, Oct3/4는 Sox2과 협조하고 표적 유전자의 전사를 활성화하는 유전자이다. Klf4(Kruppel형 전사 인자 4)은 세포 분열과 발생에 관여하는 유전자를 조절하고, 소화 기계 암의 암 억제 인자로서 관여하고 있다.
Sox2는 SRY-related H mg box 유전자 패밀리에 속하며 기능의 미분화성(다능성) 유지에 관여하는 것이 알려진 유전자이다. c-Myc은 발암 유전자인, c-Myc에서 유도된 종양 내에서 세포의 생존과 죽음의 양쪽을 촉진하는 유전자이다. p16INK4a는 암세포의 cell cycle을 control하는데 중요한 역할을 하는 유전자이다.
얻어진 형질 전환체 중에서 앰피실린 체성 형질 전환체를 선택한다. 상기의 유전자가 내장된 재조합 아데노 바이러스 DNA을 정제하고 제한 효소 부위를 해석해서 재조합을 동정한다.
다음으로, Pac I에서 재조합 아데노 바이러스를 소화하며, 이를 HEK293세포에 트랜스팩트(transfect)한다. 변형 아데노 바이러스 증식시키고 이를 모아 바이러스의 힘 값을 측정한다. 상법에 따라서 바이러스를 정제하고 표적 세포인 SHED에 감염시킨다.
바이러스 감염 후의 세포군을 상법에 따라 FITC으로 염색하여, 플로 사이트 미터를 이용하여 STRO-1양성 세포를 검출한다. 여기서 STRO-1은 골수에서의 다분화능을 가진 간엽계 줄기 세포의 마커의 1개로 인식되고 있으며, 세포 불멸화의 지표가 된다.
이상의 절차에 의해서 골수 간질 세포, 치수 세포 및 치수 유래의 불멸화 유치 줄기 세포를 얻을 수 있다.
이상과 같이 해서 얻어진 골수 간질 세포, 치수 세포 및 불멸화 유치 치수 세포는 랫트, 돼지 또는 인간 유치에서 유래한 것을 사용하는 것이나, 이들 세포를 얻기 위한 소스를 입수하기 쉬운 것, 및 안정되고 상술한 성장 인자를 생성하는 세포를 얻을 수 있는 것으로부터 바람직하다. 그리고 (a)의 예비 배양 공정에서는 이들 세포를 37℃ 배양하는 것이 좋다.
또한, 상기 세포 선별 공정에서 스핀들 형상이면서 방추형 접착성을 가진 세포를 선별하는 것이 좋다. 나아가, 상기 배양상청을 배양 개시 후 44~52시간 상기 배양상청을 모으는 것이나, 스핀들 형상이고 방추형으로 접착성을 가진 세포의 함유량이 많은 것으로부터 좋다. 나아가, 배양 개시 후 48시간 후 배양상청을 모으는 것이 더 높은 접착성을 가진 세포를 얻는 것으로부터 더 바람직하다.
상기 배양상청은 최소한 상기 선별된 세포가 만든 I형 콜라겐(Col-I), 피브로넥틴, 데콜린, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 뼈 시알로단백질(BSP)을 포함하는 것이, 금속 임플란트 재료와 뼈와의 일체화가 촉진된다는 점에서 바람직하고, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 7, 폴리스타틴 관련 단백질, 메탈로프로티나아제 억제제-I, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 억제제, 액틴 및 설프히드릴 옥시다아제 I, 인슐린 유사 성장 인자(IGF)-1, 줄기 세포 증식 인자(HGF) 및 TGF-β으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 단백질을 더 포함 것이 금속 임플란트 재료와 뼈와의 일체화가 더욱 촉진되기 때문에 좋다.
다음으로, 침전물 제조 공정에서 이상과 같이 해서 얻은 배양상청을 원심하고, 에탄올 침전 처리를 하고 침전물을 제조한다. 예를 들면, 1,000~2,000 rpm에서 3~10분 동안, 2,500~3,500 rpm으로 1~5분간 0~10℃에서 원심하고 불필요한 세포를 제거한다. 다음으로, 원심 상청의 약 8~12배 자세인 에탄올을 가하고,-5~15℃에서 30~90분 인큐베이트, 2~6℃에서 10,000~20,000 rpm으로 10~20분간 원심하고 상청을 제외하고 침전물을 얻는다. 다음으로, 상기 침전물 제조 공정에서 얻어진 침전물을 동결 건조시킨다. 예를 들면,80~95%의 냉 에탄올에 다시 현탁하고, 2~6℃에서 10,000~20,000 rpm으로 10~20분간 원심하고 상청을 제외하여 침전물을-60~90℃에서 동결시켜 동결 건조한다.
이상의 방법으로 상기 세포의 생산물을 얻을 수 있다. 얻어진 상기 세포 산생물은 -20~-40℃로 저장하는 것이 활성 보유의 관점에서 바람직하다.
다음으로, 상기와 같이 해서 얻어진 동결 건조품을 사용하여 다음과 같이 고기능 임플란트를 제조한다. 구체적으로는 (f) 임플란트 재료의 표면을 유기 용매에 세척하는 세척 임플란트 재료하는 세척 공정과; (g) 상기 세척 임플란트 재료를 소정의 조성을 갖고 석회화 용액 안에 소정의 온도에서 3~6시간 숙성하고 침지 임플란트 재료로 하는 숙성 공정과; (h)상기 침지 임플란트 재료를 소정의 농도의 세포 산생물을 함유하는 용액에서 처리하는 처리 공정;을 갖춘 방법에 의해서 제조한다.
여기에서 상기 임플란트 재료로는 티타늄, 지르코니아, 하이드록시 아파타이트 및 β-TCP로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 재료로 형성되어 있는 것이 생체 조직의 적합성 및 가공성이 뛰어나고 입수의 용이성 측면에서 바람직하다. 이들 가운데도, 티타늄(Ti)을 사용하는 것이 줄기 세포 배양상청에 의한 가공이 용이하고 효율성도 높기 때문에 더 좋다.
또한, 상기의 유기 용매로, 아세톤과 60~80%(v/v) 에탄올을 사용하는 것이 임플란트 재료 표면의 세정 효과가 높기 때문에 좋다. 또한, 에탄올 농도를 60~80%(v/v)으로 한 것은 60% 미만에선 세정력이 약하고, 80%를 넘어도 더 이상 세척 효과가 얻어지지 않기 때문이다. 바람직하게는 약 70%의 에탄올을 사용한다.
다음으로, 상기와 같이 세척한 임플란트 재료를 소정의 조성을 갖고 석회화 용액 안에 3~6시간 숙성한다. 상기 제1석회화 용액의 조성은 100~150 mm NaCl, 2.5~3.5 mm CaCl2·H2O, 1.5~2.5 mm K2HPO4, 25~75 mm Tris-HCl(pH 7.2~7.6)로 함이 석회화의 효율 면에서 좋고 136.8 mm NaCl, 3.10 mm CaCl2·H2O, 1.86 mm K2HPO4, 50 mm Tris-HCl(pH 7.4)로 하는 것이 석회화의 효율이 높기 때문에 좋다.
여기서, 침지 시간을 3~6시간으로 하는 것은 3시간 미만은 석회화가 충분하지 않다는 문제가 있고, 6시간을 넘어도 더 이상의 효과를 얻을 수 없기 때문이다. 침지 시간을 4시간으로 하는 것으로 충분한 석회화가 이루어지므로 바람직하다.
또한, 침지는 36~38℃에서 하는 것이, 후술하는 제2석회화 용액에 숙성하는 사전 준비로 하기 때문에 바람직하고 37℃에서 하는 것이 더 좋다.
상기와 같이 침지 처리를 한 임플란트 재료를 소정의 농도의 배양물을 함유하는 제2석회화 용액에서 소정의 시간 동안 인큐베이션 처리함으로써, Col-I, BSP, VEGF과 이외 기타 성장 인자를 부착시킨다. 상기 제2석회화 용액은 30~160 mm KNO3, 1~2 mm Ca(NO3)2·4H2O, 0.5~1.5 mm K2HPO4(pH 7.0~7.8) 조성으로 하는 것이 이들 단백질의 부착 효율이 높은 것부터 바람직하다.
구체적으로는, 상기와 같이 해서 얻어진 세포 배양물(세포 산생물)의 동결 건조품을 5~20 mg/mL로 함유하는 142.8 mm KNO3, 1.5 mm Ca(NO3)2·4H2O, 0.9 mm K2HPO4(pH 7.4)으로 실온에서 약 2~5일 간 인큐베이션 처리하는 것이 임플란트 표면에 충분 양의 상술한 성장 인자를 부착시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 인큐베이션 시간은 3일로 하는 것이 고기능 임플란트 제조 효율의 점에서 더 바람직하다.
여기에서, 수용액의 농도가 5 mg/mL 미만은 부착하는 성장 인자의 양이 불충분하여 치주골과 접착성이 약하다는 문제가 있고, 한편, 20 mg/mL을 넘어도 더 이상 높은 접착성을 얻을 수 없기 때문이다. 10 mg/mL의 농도 수용액으로 처리하는 것이 치조골과 충분히 접착을 확보할 수 있어 더 바람직하다.
이상에 의해, 그 표면에 적어도 Col-I, 골 시알로단백질(BSP) 및 VEGF를 보유한 고기능 임플란트를 얻을 수 있다. 상기 임플란트 표면에, IGF-1, HGF 및 TGF-β을 추가 보유하 고기능 임플란트의 경우에는, 임플란트와 뼈와의 일체화가 단시간에 도달하고, 안정화 효과가 한층 높다.
실시예
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
(실시예 1)
(1) 재료와 방법
(1-1) 동물
6주 나이의 암컷 SD 랫트(n=15, 몸무게 200-230g)를 일본 SLC(주)에 의해 구입하였다. 모든 실험은 나고야 대학 의학부의 실험 지침에 따랐다. 이들 동물은 12 시간의 명암 사이클 하에, 실온에서 사육하였다. 사료 및 물은 자유롭게 섭취시켰다.
(1-2) 세포 배양
랫트의 BMSCs를 랫트의 대퇴골 수강에서 얻었다. 골수액(50 μL/대퇴골)을 모아 10% 소태아 혈청(FBS, 와코 순약 공업(주), 페니실린, 스트렙토마이신(와코 순약 공업(주)을 포함하는 둘 베코 변법 MEM(DEMEM, 시그마-알드리치사 제) 중에서 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 3대 예비 배양하였다. 2일 마다 배지를 교환하였다. 스핀들 형상 및 접착성 등의 특징을 가지는 세포만을 사용하였다.
(1-3) CM 제조
배양한 BMSC를 70~80% 컨플루렌트될 때까지 증식시키고 따뜻한 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 3회 세척하여, 페니실린, 스트렙토마이신을 포함하는 무혈청 DMEM을 첨가하였다. 48시간 후 배양상청(이하,"CM"이라고 한다.)을 거둬 1,500 rpm에서 5분간 원심에 이어, 3,000 rpm에서 3분간 원심하여 다른 세포를 제거하였다. 5 mL의 CM을 45 mL의 100% 에탄올과 혼합하고, -20℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 이 혼합물을 4℃, 15,000 rpm에서 15분간 원심, 상청을 제거하였다. CM의 침전물을 냉 90% 에탄올(-20℃)에 다시 현탁하고, 4℃, 15,000 rpm에서 15분간 원심하였다. 최종 침전물을 -80℃에서 동결하여 동결 건조시키고, -30℃에서 사용까지 보존하였다. 세포와 접촉시키지 않은 무혈청 DMEM을 대조로 사용하였다.
(1-4) CM 고정 Ti 임플란트 스크루 제조
Ti 임플란트 스크류(길이 5 mm, 스레드 직경 2 mm 및 1 mm 피치)는 서도 메디컬(주)로부터 제공을 받았다. 이들의 Ti 임플란트는 지난 연구에서 얻어진 조건에서 제조되었다.
Ti 임플란트 표면은 PBS만, DMEM만, 또는 CM으로 처리하여 각각 PBS 처리군(음성 대조군), DMEM 처리군(양성 대조군)및 CM/DMEM 처리군(시험군)으로 하였다.
각 처리군은 다음과 같이 제조하였다.
우선, Ti 임플란트를 아세톤과 70% 에탄올로 세척하고 제1석회화 용액[1136.8 mm NaCl, 3.10 mm CaCl2·H2O, 1.86 mm K2HPO4 를 함유하는 50 mm Tris-HCl(pH 7.4)(와코 순약 공업(주) 제)에서, 37℃에서 4시간 숙성하였다.
이 숙성 처리와 병행하여 CM/DMEM(1 mg/mL), DMEM(3 mL), 또는 PBS(3 mL)을 각각 함유하는 3종류의 제2석회화 용액[142.8 mm KNO3, 1.5 mm Ca(NO3)2·4H2O, 0.9 mm K2HPO4(pH 7.4) 와코 순약 공업(주) 제)]을 제조하였다.
상기 3 종류의 석회화 용액 3 mL 중에 세척제의 각 Ti 임플란트 재료 5개를 숙성하고 37℃에서 3일간 인큐베이트하였다. 인큐베이션 직후, 각 Ti 임플란트 재료를 꺼냈다.
다음으로, 제2석회화 용액 중에, 인큐베이트 개시 직후 및 종료 후의 각 Ti 임플란트 재료 표면을 주사형 전자 현미경(일본전자(주) 제)으로 관찰한 마이크로 그래프를 도 1(A)~(F)에 나타낸다. 도 1(A)~(C)은 3,000배, (D)~(F)은 15,000배로 각각 촬영하였다.
(A) 및 (D)는 Ti 임플란트 표면을 기계 연마한 경우의 전형적인 토포그라피를 나타내었다. (C) 및 (E)는 설경의 미세 구조를 나타냈다.(F)에서는 Ti 임플란트 표면의 설경의 미세 구조 및 미세소구(마이크로 스피어)가 관찰되었다. 미세소구를 화살표로 나타내었다. 도 중에 나타낸 선분은 (A)~(C)가 10 μM, (D)~(F)가 2 μM이다.
(2) 세포 부착 분석
Ti 디스크(10×10 mm(주)오파 제)를, Ti 임플란트 상에의 고정과 동일한 방법으로, PBS, DMEM 또는 CM의 하나로 처리하였다. 랫트의 BMSCs(1.0×106개)을 상기와 같이 처리한 Ti 디스크에 파종하여(N=3), 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 함유 DMEM을 이용하여 37℃에서 5% CO2 존재 하에 24시간 배양하였다.
접착한 랫트의 BMSCs를 0.05% 트립신-EDTA(시그마--올드리치사제)와 10분 간 인큐베이트하여, Ti 디스크로부터 분리시켰다. 상기 Ti 디스크를 SEM에서 관찰하여 모든 랫트의 BMCs이 박리된 것을 확인하였다. 박리된 세포를 혈구 계산반(산리도 유리(유) 제)을 이용하여 계산하였다. 3 차례 실험을 반복하면서 유의 수준 5%(p<0.05)에서 Scheff 검정을 이용하여 일원 배치 분산 분석(ANOVA)으로 통계적 유의 차를 분석하였다. 결과를 도 2에 나타낸다.
PBS처리군 및 DMEM 처리군 간, 및 PBS 처리군 및 CM 처리군과의 간에는 각각 유의 차가 보였다(*:p<0.05, ANOVA 검정).
(3) 주사형 전자 현미경(SEM)으로 Ti 임플란트 표면의 변화 관찰
이상에 의해, PBS에서 표면을 처리한 Ti 임플란트는 도 1 (A) 및 (D)과 같은 기계 연마의 전형적인 토포그러피를 보였다. DMEM을 고정화한 Ti 임플란트는 설경의 미세 구조를 넓고, 불규칙하게 디스플레이하고 있다 (도 1 (B) 및 (E)). CM에서 코트한 Ti 임플란트 표면은 설경의 미세 구조적으로 마이크로 스피어를 디스플레이하고 있다(도 1 (C) 및 (F)의 화살표 참조). 이들 결과는 CM 또는 DMEM의 고정화 성분으로 임플란트 표면의 토포그라피가 변화하는 것을 시사하였다.
(4) LC/MS/MS에 의해 Ti 임플란트 표면 상의 단백질의 동정
상기에서 얻어진 CM/DMEM 처리군의 Ti 임플란트 재료의 표면으로부터 80% 아세토니트릴을 이용하여 단백질을 분리시켰다. 분리시킨 단백질은 동결 건조하고 분말화하였다. 분말화한 단백질 1 mg을 100 μL의 이동용 샘플 버퍼로 희석하고 희석한 버퍼 10 μL을 12% 아크릴 아미드 겔의 겔을 사용하여 겔 전기 영동으로 제공하였다. 이동 후, CBB(코마 디브릴리언트 블루 용액 또는 Silver Stain Kit(Therimo사 제)를 이용하여 각각 염색을 하였다. 염색 후 메스를 이용하여 젤을 꺼냈다.
상기로부터 얻어진 겔을 처음 100 μL의 30%(v/v) 아세토니트릴을 포함하는 25 mm NH4HCO3 에서 20분간 2회 세척하여 탈염색하고, 그 후 CVE-3100(도쿄 이화학 기계(주) 제)에서 건조시켰다. 단백질의 겔 소화(in-gel digestion)는 20 μg/mL의 시퀀스 그레이드 트립신(프로 메가사 제)를 포함하는 50 mm의 요오드 아세트아미드(와코 순약 공업(주) 제)/ 100 mm NH4HCO3(pH 7.8)을 100 μL 이용하여 37℃에서 1시간 후, 100 μL의 25 mm NH4HCO3 첨가하여 37℃에서 밤샘 인큐베이트하였다. 펩티드를 0.1%의 TFA를 함유하는 60% 아세토니트릴로, 실온에서 20분간 추출하고 펩티드 샘플을 CVE-3100에서 건조시켰다.
펩티드 매스 핑거프린팅(PMF)을 Paradigm MS4-LCQ Advantage(AMR사 제)를 이용하여 수행하였다. 얻어진 펩티드 매스 스펙트럼을 the Mascot search engine(www.matrixscience.com)을 사용하는 Swiss-Prot protein knowledgebase(포유류 단백질에 한정되어 있다)에의 쿼리(검색 요구)에 사용하는 펩티드 매스 리스트의 생성에 사용하였다.
검색 파라미터는 1 missed trypsin cleavage의 톨러런스, 질량 톨러런스 6100 ppm 및 메티오닌 잔기의 산화를 허용하도록 설정하였다. 쿼리가 함유된 4 이상의 펩티드와 매치하고 Mascot search engine에 의해서 생성된 통계적으로 의미가 있는 Mowse(분자량 서치;molecular weight search)점수와 일치하는 질량을 가질 때 동정된 단백질을 승인하였다.
다음으로, Ti 임플란트상에 고정화된 단백질과 배양상청(CM) 중에 이들을 LC/MS/MS에서 검출하였다. 약 2,000종의 단백질이 배양상청에서 검출됐으나, 이 수는 Ti 임플란트의 표면적과 거의 마찬가지였다. Ti 임플란트 표면에서 검출된 모든 단백질은 모두 CM 중에서 검출됐다. 세포 외기질은 단백질 신호 전달, 단백질 합성 및 처리 및 성장 인자 단백질을 포함하기 때문에 이하에 제시하는 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 이용하여 단백질 검출하였다.
(ALP유전자 증폭용)
포워드 프라이머 GCTGTGAAGGGCTTCTTGTC...순서 번호 1
리버스 프라이머 CGCCTATCAGCTAATGCACA...순서 번호 2
(OCN유전자 증폭용)
포워드 프라이머 TGAGGACCCTCTCTCTGCTC...순서 번호 3
리버스 프라이머 GAGCTCACACACCTCCCTGT...순서 번호 4
(OPN유전자 증폭용)
포워드 프라이머 AGGTCCTCATCTGTGGCATC...순서 번호 5
리버스 프라이머 AGACTGGCAGTGGTTTGCTT...순서 번호 6
(BSP유전자 증폭용)
포워드 프라이머 TTCTCGAGAAAAATTTCCA...순서 번호 7
리버스 프라이머 TCACTGGTGGTAGTAATAAT...순서 번호 8
(Col-I유전자 증폭용)
포워드 프라이머 CGATGCCATTTTCTCCCTTA...순서 번호 9
리버스 프라이머 CTCTGGTACCGCTGGAGAAG...순서 번호 10
(GAPDH유전자 증폭용)
포워드 프라이머 ATGACTCTACCCACGGCAAG...순서 번호 11
리버스 프라이머 TTCAGCTCTGGGATGACCTT...순서 번호 12
[표 1]
Figure pct00001
ALP:알칼리 포스파타제; OCN:오스테오 칼신;
OPN:오스테오 폰틴; BSP:뼈 시알로단백질; Col-I:I형 콜라겐
뼈 결합 단백질인 I형 콜라겐, 뼈 시알로단백질 2, 데콜린, 오스테오 폰틴, 오스테오 칼신, 피브로넥틴 및 혈관 상피 성장 인자 A(VEGF A)이 검출됐다. 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00002

(5) 인 비트로에서 랫트 BMSCs의 RNA분석
랫트 BMSCs를 PBS, DMEM 또는 CM으로 처리한 Ti 디스크에서 배양하였다. 고정화 및 배양 방법은 세포 부착 분석을 했던 것과 같은 방법이다. BMSCs를 하루, 7일, 14일간 배양하였다. 각 디스크 상에서 배양한 랫트 BMSCs에서 총 RNA을 TRIZOL 시약(인비토르젠 라이프 테크놀로지사 제)를 이용하여 제조원의 프로토콜에 따라 수행하였다. cDNA을 1 μg의 총 RNA에서 10x반응 버퍼, 5 mm dNTP혼합물, 1U/ μL의 RNase억제제, 0.25U/ μL의 역전사 효소(M- mLV역 전사 효소, 인비 토르 젠사)및 0.125 μM의 마구잡이 시발체(다카라 바이오(주)을 포함 20 μL의 반응 혈중에서 합성하였다.
sq-PCR을 위해서, PCR Thermal Cycler SP(다카라 바이오(주) 제)중에, 95℃에서 30초, 45~60℃에서 30초, 및 72℃에서 30초의 반응 조건으로 25~35 사이클 하였다.
랫트의 글리세르 알데히드-3-포스페이트, 탈수소 효소(GAPDH) 프라이머를 내부 표준으로 사용하였다. in vitro유전자 발현 분석에서 이식된 배양 세포 중의 GAPDH에 대한 mRNA의 발현 수준(%)을 Scion Image picture-imaging software(Scion사 제)를 사용하여 측정하였다. 합성된 cDNA을 표 1에 나타내는 특이적 프라이머를 이용한 다음 PCR 증폭용 주형으로 사용하였다. 모든 실험은 3차례 반복하며 데이터를 유의 차 수준 5%로 Scheffe검정을 이용해서 일원 배치 분산 분석(ANOVA)에 의해 해석하였다.
결과를 OCN, OPN 및 Col I의 유전자의 발현 패턴(도 3 (A)~(C) 참조) 및 그것을 정량화한 그래프(도 3 (D)~(F) 참조)로서 도 3에 나타냈다.
(6) Qdot(등록 상표)655 ITK carboxyl quantum dots(QDs)에 의한 CM의 표시
QDs(인비토르젠 모리큘러·프로브스사제)를 이용한 CM의 표시는 제조원의 지시서에 따라 수행하였다. 간단히 말하면 석회화 용액으로 처리한 Ti 검사 대상 물체를, 25 μL의 8 μM QDs, 1 mg/mL의 CM, 1 mL의 10 mm의 붕산 버퍼(pH 7.4) 및 5.7 μL의 10 mg/mL N-에틸-N'-디메틸아미노프로필-카르보디이미드(교차 시약;시그마-올드리치 사 제)의 혼합물에 첨가하고 실온에서 약 1시간 섞었다. 혈청 비첨가의 DMEM 또는 PBS의 QD표시를 대조로 사용하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.
도 중, A, B 및 C는 각각 시험 시작 전 Ti 임플란트의 화상을 나타낸다. A1는 시험 개시 하루 만에, A7은 7일 후, A14는 14일 후, A28은 28일 후의 화상을 나타낸다. B 및 C에 대해서도 마찬가지이다.
PBS에서 처리한 Ti 임플란트에서는 관찰 기간 내내, 그 주위에 경향이 검출되지 않았다. 이에 DMEM 또는 CM으로 처리한 Ti 임플란트에서는 그 주위에 경향이 검출되었다.
이상에서 DMEM 또는 CM으로 처리한 Ti 임플란트에서는 생체 분자의 국재화가 일어나는 것으로 나타났다.
(실시예 2) 불멸화 유치 줄기 세포 육성용 바이러스의 제조
(1) 플라스미드 추출용 시약
(1-1) 시약 등
카나마이신류(Kan), 앰피실린(Amp), LB 액체 배지 및 LB 한천 배지, 글리코겐, 아가로오스 멸균 수, 초산 암모늄 초산 나트륨, 도데실 황산나트륨 및 RNase A을 사용하였다. 50 mg/mL의 카나마이신류(Kan) 및 앰피실린(Amp)을 제조하고 스톡 용액으로 -20℃에서 저장하였다. 글리코겐은 20 mg/mL에 제조하였다. 10 mg/mL의 RNase A을 제조하고 20℃에서 보존하였다. 10M (포화)초산 암모늄(NH4OAc) 3M의 아세트산 나트륨(NaOAc; pH5.2)을 제조하였다.
(1-2) 제한 효소 등
대장균 콤피턴트 셀(Supercharge EZ10 Electrocompetent Cells, 제품 코드 636756), Swa I(제품 코드 1111A, Smi I가 동등품), Xho I(제품 코드 1094A), T4 DNA Ligase(제품 코드 2011A), NucleoBond Xtra Midi(제품 코드 740410.10/. 50/. 100), NucleoSpin Plasmid(제품 코드 740588 10/50/250)는 모두 다카라 바이오(주)에서 구입하였다. Pac I는 New England Biolabs사에서 구입하였다.
(1-3) 버퍼 등
1×TE Buffer(1 mm의 EDTA을 포함하는 10 mm Tris-HCl[pH8.0]), 100 mm Tris-HCl(pH8.0)에서 포화된 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1 이하,"PCI혼합액"라 한다.)를 제조하였다. 에탄올은 100% 및 70%로 사용하였다. 미니 스케일에서 조합하는데 사용하는 pAdeno-X 플라스미드 DNA정제용으로, 이하의 버퍼 1~4를 제조하였다.
버퍼 1:10 mm의 EDTA 및 50 mm의 포도당을 포함 25 mm의 Tris-HCl(pH8.0)(오토 클레이브 후 4℃에서 보존)
버퍼 2:1% SDS를 포함하는 0.2M NaOH(사용 직전에 사용 시 제조, 밀봉하고 실온 저장)
버퍼 3:5 M KOAc(오토 클레이브 후 4℃에서 보존)
버퍼 4:1 mm의 EDTA, 20 μg/mL의 RNase를 포함하는 10 mm의 Tris-HCl(pH8.0)(사용 직전에 RNase를 첨가하여-20℃에서 보존)
(2) 아데노 바이러스 정제 및 β-gal분석용 시약
인간 5형 아데노 바이러스로 형질 전환한 인간 HEK293 세포(ATCC#CRL1573)를 사용하였다. HEK293 세포는 완전 배지에서 배양하였다. 완전 배지의 조성은 100 unit/mL의 페니실린 G나트륨과 100 μg/mL의 스트렙토마이신, 4 mm의 L-글루타민 및 10% FBS를 첨가한 DMEM(기본 배지)로 하였다. 페니실린 G나트륨 용액은 10,000 units/mL, 황산 스트렙토마이신 용액은 10,000 μg/mL로 제조하고 스톡 용액으로 보존하였다.
배양에는 60 mm 플레이트, 100 mm 플레이트, 6-웰 플레이트, T75 및 T175 플라스크를 사용하였다.
트립신-EDTA(제품 코드 CC-5012)는 타카라 바이오(주)에서 구입하였다. 인산 완충 생리 식염수(PBS, Ca2 + 및 mg2 + 함유) 및 둘베코의 인산 완충 생리 식염수(DPBS, Ca2+ 및 mg2+ 함유)을 제조하였다. 또한, 0.33%의 뉴트럴 레드 염색액, 0.4% 트리판 블루 염색액을 사용하였다.
β-gal분석에는 X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside[25 mg/mL]) 디메틸포름아미드(DMF)용액은 -20℃으로 차광 보존하였다. Luminescentβ-gal Detection Kit II(제품 코드 631712)를 사용하였다.
(3) 예비 시험
(3-1) lacZ를 포함하는 변형 아데노 바이러스(pAdeno-X-lacZ)의 구축
10 mL의 상술한 완전 배지에 압축 해동 후, DMSO을 제거한 HEK293 세포를 다시 현탁하고 전량 100 mm의 배양 플레이트에 옮겼다. HEK293세포를 부착한 후에 배양액을 제거하고 세포를 멸균 PBS에서 1번 세탁하고 1 mL의 트립신-EDTA용액을 넣고 약 2분간 처리하였다.
다음으로, 10 mL의 완전 배지를 가하고 트립신의 반응을 멈추고 온화하게 현탁하였다. 바이어블 카운트를 하고, 배양액 10 mL를 넣은 100 mm판에 105개의 세포를 옮기고 균일하게 넓혔다.
pShuttle2-lacZ(Adeno-X Expression System 1에 포함된 양성 대조 벡터)과 키트에 포함된 Adeno-X Viral DNA(PI-Sce I및 I-Ceu I digested)을 사용하여, 키트에 첨부된 프로토콜에 따르고, lacZ를 포함한 변형 아데노 바이러스를 구축하였다. 표적 세포인 SHED에 감염시키고 β-갈락토시드 가수 분해 효소 발현을 분석하고 벡터가 구축되어 있음을 확인하였다.
(3-2) 재조합 pShuttle2 플라스미드의 구축
변형 pShuttle2 Vector(이하,"rpShuttle2 Vector"라 한다.) 구축 전에, 키트에 포함된 pShuttle2 Vector 및 pShuttle2-lacZ Vector로 DH5α 대장균을 형질 전환하였다. 50 μg/mL의-카나마이신류를 함유하는 LB 한천 플레이트(이하,"LB/Kan"이라 한다.) 상에서 형질 전환체를 선택하고 단일 콜로니에서 추출한 변종을 새로운 LB/Kan에 획선, 37℃에서 밤샘 인큐베이트하였다.
다음으로, hTERT, bmi-1, E6, E7을 pShuttle2에 이하의 순서로 복제하였다. 이들 유전자에 적합한 제한 효소를 pShuttle2 Vector로 절단하였다.
다음으로, 상기 키트에 첨부된 pShuttle2 Vector Information Packet(PT3416-5)을 참조하여 삽입하는 DNA에 부합하는 멀티 클론 사이트를 결정하였다. 제한 효소 처리된 상기 플라스미드를 알칼리성 인산 가수 분해 효소로 처리하고 정제하였다.
상법에 따라서 표적 DNA단편을 제조하여 정제하였다. 상기 제한 효소로 소화한 벡터와 상기 유전자 단편을 라이트러게이션, DH5α 세포(콤피턴트 세포)를, 라이트러게이션 산물로 형질 전환하였다. 상기 콤피턴트 세포 일부를 따서, 키트에 포함된 대조 벡터 pShuttle2-lacZ Vector에서 형질 전환하고 양성 대조로 하였다.
형질 전환한 대장균을 포함한 혼합물을 LB/Kan 한천 플레이트에 접종하고-카나마이신류 내성(Kanr)의 형질 전환체(콜로니)을 선택하였다. 5~10개의 Kan 내성 복제를 선택하고 소량의 액체 배지에 접종하여 증폭하였다. 이들 복제가 rpShuttle2 Vector를 갖고 있음을 확인한 후에 하룻밤 인큐베이트하였다. 그 후 시판의 실리카 흡착 컬럼을 이용하여 상법에 따라, 구축된 플라스미드 DNA을 정제하였다.
이 플라스미드 DNA를 제한 효소로 처리하고 1% 아가로오스 겔 전기 영동을 하여 목적의 변형 플라스미드를 동정하였다. 시퀀싱으로 삽입한 단편의 방향과 삽입 부위를 확인하고 파지티브 복제를 동정하였다.
변형 pShuttle2 플라스미드 DNA(이하,"rpShuttle2 플라스미드 DNA"라 한다.)를 표적 세포로 직접 트랜스펙트하고 웨스턴 블롯을 하여 목적 단백질의 발현을 예비적으로 체크하였다.
(3-3) rpShuttle2 플라스미드 DNA의 PI-Sce I/I-Ceu I이중 소화
상기와 같이 제조한 rpShuttle2 플라스미드 DNA에서 도입한 유전자의 발현 카세트를 PI-Sce I 및 I-Ceu I에서 꺼냈다. 키트에 첨부된 프로토콜에 기재된 in vitro 라이트러게이션 법에 따라, 분리한 발현 카세트를 Adeno-X Viral DNA에 혼합하였다. rpShuttle2 플라스미드 DNA의 PI-Sce I/I-Ceu I 이중 소화액을 30 μL제조하여, 하기 표 1에 기재한 시약을 1.5 mL의 멸균 후 마이크로 원심 튜브에 넣고 혼합하였다.
[표 3]
Figure pct00003

다음으로, 충분히 혼합한 후에 마이크로 원심 튜브에 넣고 가볍게 원심하여, 이후, 37℃에서 3시간 인큐베이트, 1kb 라더(DNA사이즈 마커)과 함께 상기 이중 소화 후의 반응 액체(5 μL)를 1% 아가로오스/EtBr 겔에서 영동하였다.
(3-4) 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 추출
원심 튜브에 상술한 이중 소화액의 나머지(25 μL)에 70 μL의 1×TE Buffer(pH8.0)과 100 μL의 PCI 혼합액을 첨가하여 볼텍스에서 충분히 교반하였다. 다음으로, 미량 원심기를 이용하여 4℃에서 14,000 rpm에서 5분간 원심, 물층을 청정한 1.5 mL의 마이크로 원심 튜브에 옮겼다. 여기에 400 μL의 95% 에탄올, 25 μL의 10M의 초산 암모늄, 및 1 μL의 글리코겐(20 mg/mL)을 첨가하여 볼텍스에서 충분히 교반하였다.
다음으로, 4℃에서 14,000 rpm에서 5분간 원심, 상청을 흡인 제거하고 팔레트를 얻었다. 이 팔레트에 300 μL의 70% 에탄올을 가해 실온에서 14,000 rpm으로 2분간 원심하였다. 상청을 주의 깊게 흡입하고 제거하여 팔레트를 실온에서 약 15분 동안 바람에 말렸다. 팔레트가 건조한 후, 이를 10 μL의 멸균한 1×TE Buffer(pH8.0)에 녹여 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.
(4) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA의 구축
(4-1) Adeno-X바이러스 게놈에 대한 발현 카세트의 서브 복사
하기 표 4에 나타내는 시약을, 순서대로 1.5 mL의 멸균제 마이크로 원심 튜브에 넣어 부드럽게 섞으면서 가벼운 원심을 돌린 후, 16℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다.
[표 4]
Figure pct00004

각 샘플에, 90 μL의 1×TE 버퍼(pH 8.0)와 100 μL의 PCI 혼합액을 넣고 볼텍스에서 온화하게 교반하였다. 4℃에서 14,000 rpm에서 5분간 원심, 물층을 청정한 1.5 mL의 마이크로 원심 튜브로 옮기고 여기에 400 μL의 95%에탄올, 25 μL의 10M 초산 암모늄, 및 1 μL의 글리코겐(20 mg/mL)를 넣어 볼텍스에서 온화하게 교반하였다.
4℃에서 5분 동안 14,000 rpm에서 원심, 상청을 흡인에 의해 제거하고 팔레트를 얻었다. 이하의 에탄올 침전 조작은 상기(3-4)와 같이 하였다.
팔레트가 건조한 후 이를 15 μL의 멸균 탈염수로 용해하였다.
(4-2) 재조합 Adeno-X플라스미드 DNA의 Swa I소화
하기 표 5에 나타내는 소화액을 제조하고 원심 튜브에 넣은 각 샘플에 첨가하여, 2시간 25℃에서 인큐베이트하였다.
[표 5]
Figure pct00005

각 샘플에, 80 μL의 1×TE Buffer(pH8.0)과 100 μL의 PCI 혼합액을 함께 볼텍스에서 온화하게 교반하였다. 마이크로 원심 튜브, 4℃에서 5분 동안 14,000 rpm에서 원심하였다. 이하의 에탄올 침전의 조작은 상기(3-4)와 동일하게 실시하고 팔레트의 용해액은 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.
(4-3) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA에 의한 대장균의 형질 전환의 확인
전기적으로 콤피턴트한 대장균을 Supercharge EZ10 Electrocompetent Cell(제품 코드 636756)을 사용하여 상기 (4-2)에서 얻은 Swa I 소화 산물로 형질 전환하였다.
형질 전환 혼합물을 LB 배지에 앰피실린(마지막 농도 100 μg/mL)을 참가하여 한천 플레이트(이하,"LB/Amp한천 플레이트"이라 한다.)에 접종하고 37℃에서 하룻밤 인큐베이트하여, 앰피실린 내성(Ampr) 형질 전환체를 선택하였다. 약 106개의 콜로니을 얻었다. 얻어진 콜로니를 제품에 부속의 Adeno-X System PCR Screening Primer Set으로 표시하였다.
5 mL의 신선한 LB/Amp 액체 배지에 단일 콜로니의 세포를 접종하고, 하룻밤 배양하였다. 다음날, 후술하는 미니 스케일법에 따라, Adeno-X플라스미드 DNA을 정제하였다.
(4-4) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA의 미니 스케일 제조
대수 증식에 있는 배양액 5 mL을 14,000 rpm에서 30초간 원심, 상청을 제거하였다. 팔레트를 다시 10,000 rpm으로 1분간 원심하고 마이크로 피펫을 이용하여 상청을 제거하였다.
여기에 150 μL의 상기 버퍼 1을 첨가하여 온화하게 피펫팅하여, 다시 현탁하였다. 이 세포 현탁액에 150 μL의 버퍼 2를 첨가하여 온화하게 전도 혼화하여, 얼음 상에 5분간 방치하였다. 냉각된 세포 현탁액에 150 μL의 버퍼 3을 더하고, 다시 전도 혼화하여, 얼음 상에 5분간 방치하였다.
이 세포 현탁액을 4℃에서 14,000 rpm에서 5분간 원심하고, 투명한 상청을 청정한 1.5 mL의 원심 튜브로 옮겼다. 이 후 상청에, 450 μL의 PCI 혼합액을 첨가하고, 전도 혼화하여 교반하였다. 그 후, 4℃에서 14,000 rpm에서 5분간 원심, 수층을 청정한 1.5 mL의 마이크로 원심 튜브에 옮겼다.
이하의 에탄올 침전의 조작은 상기(4-1)와 같이 조작하고, 팔레트의 용해액은 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다. 목적의 rDNA는 후술하는 제한 효소에 의해 해석 및 PCR에 의해 동정하였다.
(5) 얻어진 rAdeno-X 플라스미드 DNA의 제한 효소 부위 해석
PI-Sce I 및 I-Ceu I을 이용하여 해석을 실시하였다. 하기 표 6에 나타내는 시약을, 1.5 mL의 멸균 후 마이크로 원심 튜브에 넣고 30 μL의 PI-Sce I/I-Ceu I 이중 소화 반응액을 첨가하여 충분히 교반면서 가볍게 회전시켜서 내용물을 모았다.
[표 6]
Figure pct00006
37℃에서 3시간 인큐베이트, 제한 효소 처리를 하였다. 이 처리 후의 반응 액을 1% 아가로오스/EtBr겔로 영동, 배양액을 얻었다.
(6)재조합 아데노 바이러스의 생성
(6-1) HEK293 세포 트랜스펙트용 rAdeno-X 플라스미드 DNA의 제조
하기 표 7에 나타낸 시약 등을 1.5 mL의 멸균 후 원심 튜브에 넣고 혼합하고 미량 원심기로 가볍게 원심하였다. 그 후 37℃에서 2시간 인큐베이트, rAdeno-X 플라스미드 DNA의 Pac I 제한 효소 처리를 하였다.
[표 7]
Figure pct00007
60 μL의 1×TE Buffer(pH8.0)과 100 μL의 PCI 혼합액을 첨가하여 볼텍스에서 온화하게 교반, 미량 원심기로 4℃에서 5분 동안 14,000 rpm에서 원심하였다. 물층을 청정한 1.5 mL짜리 멸균 후 원심 튜브에 주의 깊게 옮겼다.
이하의 에탄올 침전의 조작은 상기(3-4)와 같이 조작하고 팔레트의 용해액은 사용 때까지 -20℃에 보관하였다.
(6-2) Pac I소화 Adeno-X 플라스미드 DNA의 HEK293 세포 트랜스펙션
상기 플라스미드 DNA의 트랜스펙션의 24시간 전에 60 mm의 배양 플레이트 근처의 세포 수가 1~2×106(약 100 cells/ mm2)이 되도록, HEK293 세포를 접종하고 37℃, 5%CO2존재 하에서 인큐베이트하였다.
각 배양 판에, Pac I 소화한 10 μL의 Adeno-X 플라스미드 DNA을 트랜스 펙트하고 표준적인 트랜스펙션법(CalPhos Ma mmalian Transfection Kit, 제품 코드 631312)에 따라서, HEK293 세포에 Adeno-X DNA을 도입하였다. 트랜스펙션 다음날부터 CPE(세포 변성 효과)가 일어나고 있는지를 확인하였다.
1주 만에 배양 플레이트의 바닥과 측면에 부착되어 있는 세포를 온화하게 교반하여 유리시켰다. 얻어진 세포 현탁액을 15 mL짜리 멸균된 원뿔 원심 튜브에 옮기고 실온에서 5분 동안 1,500×g에서 원심하였다.
얻어진 침전을 500 μL의 멸균 PBS에 서스펜션하였다. 드라이 아이스/에탄올에서 동결시키고 37℃의 항온기에서 융해시키는 동결 융해 조작을 3차례 반복하고, 세포를 충분히 용해시킨 라이세이트를 얻었다. 다음으로, 가볍게 원심 중 부유물을 제외하고 상청을 멸균한 다른 튜브로 옮기고 즉시 사용하였다. 즉시 사용하지 않고는 -20℃에서 보존하였다.
60 mm 플레이트의 배양 세포에 250 μL의 상기 라이세이트를 첨가하여 배양을 계속하였다. 또한, Adeno-X Rapid Titer Kit(제품 코드 631028)에 포함된 항 Hexon항체를 이용하여 이 키트의 취급 설명서(PT3651-1)에 따라 아데노 바이러스의 힘 값을 측정하였다.
(6-3) 고력가 바이러스 제조를 위한 바이러스의 증폭
이 힘의 값 측정을 시작하는 약 24시간 전에 HEK293 세포를 T75 플라스크에 접종하고 37℃, 5% CO2 존재 하에서 하룻밤 배양하고 50~70% 컨플루렌트가 되어 있는 것을 확인하였다.
다음날, 바이러스를 포함하는 새로운 배지와 교환하고, MOI=10에서 감염시켰다. 37℃, 5% CO2 존재 하에서 90분간 배양한 후에 플라스크에서 꺼내어, 10 mL의 배지를 첨가하였다.
37℃, 5% CO2 존재 하에서 3~4일 동안 배양하고 CPE을 확인하였다. 50%의 세포가 상처난 곳에서 상기와 마찬가지로 유리 세포 현탁으로 15 mL짜리 멸균된 원뿔 원심 튜브에 옮겼다. 상기와 같은 동결융해 조작을 하여 세포를 융해시켰다. Adeno-X Rapid Titer Kit(제품 코드 631028)을 사용하고 107PF U/mL의 힘 값을 얻었다.
웨스턴 블랏을 갖고 포장된 아데노 바이러스 게놈이 목적 유전자에 특이적인 전사 단위의 복사를 기능하는 형태로 가지고 있는지 확인하였다.
(7) 표적 세포에 대한 아데노 바이러스 감염
(7-1) 표적 세포의 감염
감염 24시간 전에 6-웰 플레이트에 1×106개의 SHED를 접종하였다. 접종 다음 날 배지를 제거하고 바이러스를 포함하는 1.0 mL의 배지를 각 플레이트의 중심에 첨가하였다. 이 용액을 SHED가 형성된 단층 전체에 균일하게 벌렸다.
37℃, 5% CO2 존재 하에서 4시간 배양하고 바이러스를 SHED에 감염시켰다. 다음으로, 신선한 배지를 첨가하였으며 37℃, 5% CO2 존재 하에서 배양하였다. 감염 24시간 후~48시간 후까지 도입 유전자 발현을 시간 경과적으로 해석하였다.
(7-2) 감염 세포 β-갈락토시다아제 발현의 해석
Adeno-X-lacZ를 감염시킨 접착성 세포에서의 β-갈락토시다아제의 발현은 Luminescentβ-galDetection Kit II(제품 코드 631712, 쿠론 테크 사)를 사용하고 분석하였다.
(실시예 3) 불멸화 유치 줄기 세포 제조
(1) 탈락 유치 치수 세포 제조
10세의 일반 남자로부터 얻어진 탈락 유치를 사용하였다. 이 탈락 유치를 이소딘 용액으로 소독한 후, 치과용 다이아몬드 포인트를 이용하여 치관을 수평 방향으로 절단하고 치과용 리머를 이용하여 치수 조직을 회수하였다. 얻은 치수 조직을 3 mg/mL의 I형 콜라게나아제 및 4 mg/mL의 디스파아제의 용액 중 37℃에서 1시간 소화하였다. 다음으로, 이 용액을 70 mm의 세포 스트레이너(Falcon사제)를 이용하여 여과하였다.
여별한 세포를 4 mL의 상기 배지에 다시 현탁하고, 직경 6cm의 부착성 세포 배양용 접시에 파종하였다. 10% FCS를 함유하는 DMEM을 이 접시에 첨가하여 5% CO2 , 37℃으로 조절한 인큐베이터에서 2주 정도 배양하였다. 증식을 형성한 접착성 세포(치수 간 세포)를 0.05%트립신, EDTA에서 5분 동안 37℃으로 처리하여 접시에서 분리된 세포를 회수하였다.
다음에, 상기와 같이 선발한 접착성 세포를 접착성 세포 배양용 접시(콜라겐 코트 디쉬)에 파종하고, 5% CO2, 37℃으로 조절한 인큐베이터에서 일차 배양하여 초대 배양 세포로 하였다. 육안 관찰로 서브컨플루렌트(배양 용기 표면의 약 70%를 세포가 차지하는 상태) 또는 컨플루렌트 된 때 0.05% 트립신, EDTA로 5분 동안 37℃에서 처리하고 세포를 배양 용기에서 분리하여 회수하였다.
이렇게 얻어진 세포를 다시 상기의 배지를 넣은 접시에 파종하고 계대 배양을 몇 번 하여 약 1×107개/mL까지 증식시켰다. 얻어진 세포를 액체 질소 중에서 보존하였다.
그 후 일차 배양 세포를 상기의 배지를 이용하여 약 1×104세포/cm2 농도로 계대 배양하였다. 1~3회 계대된 세포를 실험에 사용하였다. 인간 B mmSCs(Bone Marrow Mesenchymal stem cells, 골수 간 잎계 줄기 세포)은 런던 더사에서 구입하고 메이커의 취급 설명서에 따르고 배양하였다.
이상과 같이 인간 탈락 유치 치수 간 세포(SHED)를 얻었다. 얻은 SHED를 FACSTARPLUS(베크톤, 디킨슨 사 제)을 이용하여 각 표본에 대해서, 약 1x106개의 STRO-1 양성 세포를 다음과 같이 분류하였다.
브로모디옥시 우리딘 BrdU 염색 키트의 제조 업체(Invitrogen사 제)의 취급 설명서에 따라, BrdU을 12시간 넣고, SHED의 증식 속도를 평가하였다(각군에 대해서 n=3). 실험은 5번 되풀이하였다. 1원 배치 분산 분석 후에 Tukey-Kramer검정을 행하는 통계적 유의 차를 평가하였다.
STRO-1을 면역 형광으로 검출하기 위해서, SHED를 3% 파라포름알데하이드로 고정하여, 바로 PBS에서 2회 린스하고, 100 mm의 글리신에서 20분간 처리하였다. 다음으로 이들 세포를 0.2%의 Triton-X(Sigma-Aldrich사)에서 30분간 투과 처리하고 그 후, 5%의 당나귀 혈청 및 0.5%의 소혈청 알부민 혼합물에서 20분 인큐베이트하였다.
다음으로, 세포를 일차 항체의 마우스 항 인간 STRO-1 항체(1:100, R&D사제)와 함께 1시간 인큐베이트하며 이차 항체의 염소 항 마우스 면역 글로불린 M-FITC 항체(1:500, Southern Biotech사 제)과 함께 30분 인큐베이트하여 벡터 다 실드 DAPI(Vector Laboratories Inc)를 이용하여 마운트하였다.
그 후 15% FBS를 첨가한 α-MEM을 6웰 플레이트에 넣고, 정렬한 세포를 클론 복제용으로 파종하였다. 증식된 세포 중에서 약 300 콜로니를 시험용으로 활용하였다.
(2) 유전자 도입
상술한 바와 같이, bmi-1, E6, E7 및 hTERT의 4개의 유전자를 아데노 바이러스 벡터에 넣어 이들 유전자 산물을 발현하는 바이러스 벡터를 제조하였다. 대조로 이들 유전자를 넣지 않은 대조 벡터를 제조하였다.
SHED를 100 mmφ의 콜라겐 코트 디쉬에 1×106개를 파종하고, 10% FBS를 첨가한 DMEM을 가해 서브컨플루렌트 배양하였다. 이 배지를 흡인 제거하고 상기 배지로 희석한 바이러스 용액 500 μL을 가하고(MOI=10), 37℃에서 5%CO2 인큐베이터로 1시간 배양하고 상기 바이러스 벡터를 감염시켰다. 감염 48시간 후, 감염 세포를 퓨로 마이신(1pg/mL)을 첨가한 상기의 배지에서 10일 동안 배양하고 선택하여 500~600개의 내성 클론을 풀하였다. 3~4일마다 약 0.5x105개의 SHED를 100 mmφ의 배양 샬레에 파종하고 계대하였다. 유전자가 도입된 SHED를 SHED-T, 유전자가 도입되지 않는 SHED를 SHED-C라고 하였다.
(3)SHED-C 및 SHED-T의 성장 속도 측정
SHED-T(유전자 도입한 SHED)의 개체 수의 배가 상태를 도 5에 나타냈다. 도에서, 세로축 은 개체 수 배화 횟수(세포 분열 횟수), 가로 축은 시간(배양 일수)이다. 또한, 배양 중의 SHED가 1개월 간 분열하지 않은 상태를 세포 노화의 판단 기준으로 삼았다.
SHED-C는 30회 정도로 증식이 정지하고, 노화 또는 증식 정지 단계에 들어갔다. 이에 SHED-T는 250PD를 넘어 800일 경과 후도 증식하였다.
(3-1) 유동 세포계수(flow cytometry) 분석
단일 세포 현탁액을 얻기 위하여 접착성의 단층 세포를 트립신/EDTA에서 소화하였다. 2x105개의 세포에 항 STRO-1 모노 클로널 항체(1:100)를 넣어 방치하고, FACSCalibur 플로사이트 미터(Becton Dickinson사)를 사용하여 분석하였다. 대응하는 동종(isotype)이 동일한 대조 항체를 비교하여, 99%이상의 비율로 형광 수준이 높은 경우에 발현을 양성으로 하였다. SHED-T 및 SHED-C 함께 초기 및 후기의 계대 세포를 고정하여, FITC 결합 STRO-1항체로 염색하였다. 그 후, 플로우 사이토메트리에서 분석하였다. 시험은 각각 두번 하였다. SHED-C에서는 STRO-1 양성 세포의 비율이 PD20에서 27%이며, PD30에서는 15%까지 감소하였다(도 6 (A) 및 (B)). SHED-T에서는 STRO-1 양성 세포의 비율이 각각 PD20에서 46%, PD40에서 41%였다(도 6 (C) 및 (D)).
(3-2) 분화능의 검토
PD0, PD10 및 PD20의 SHED-C및 SHED-T의 분화 능력을 신생 골량의 형성 능력 및 조직 염색으로 조사하였다.
우선, 2.0 x 106개의 SHED-C 또는 SHED-T를 40 mg의 수산화 인회석/삼칼슘 인산(HA/TCP) 세라믹 분말(올림푸스 공업(주) 제)에 혼합하고 10주령의 면역 무방비 상태 마우스(NIH-bgnu-xid, 암컷, Harlan Sprague Dawley사 제)의 배측 표면의 피하에 이식하였다.
이식 8주 후에 이식물을 회수하고 4% 포르말린으로 고정하고 탈회한 후, 파라핀 처리하기 위해 10% EDTA을 포함하는 PBS용액에서 완충 작용하였다. 일부는 플라스틱 처리하기 위해서 70% 에탄올 용액 안에 저장하였다.
파라핀 절편을 탈 파라핀화하여, 이를 수화한 후, 헤마톡실린 및 에오신(이하,"H&E"라 한다.)으로 염색하였다. 도 7 (A)~(C)는 SHED-T(불멸화 줄기 세포)의 PD0~PD20을 나타내며, (D)~(F)은 SHED-C(정상 세포)의 PD0~PD-20을 나타낸다. 생체 내에서의 새로운 뼈의 형성을 정량하기 때문에 특정 영역을 선택, SHED-T 이식 후에 형성된 이식물 또는 SHED-C이식 후에 형성된 이식물 각각에 대해서 신생 뼈 면적과 시야 면적을 산출하고 이들 수치에서 신생 골량을 구하였다.
신생 골량=신생 뼈 면적/시야 면적×100
도 8에 각 개체 수 배가 횟수(배가 시간)의 SHED-T와 SHED-C와 신생 골량의 변화를 나타냈다. 도 중, **는 p<0.05,***는 p<0.01을 나타낸다. 또한, 신생 골량은 이하의 산출식으로 구하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, SHED-C에서는 개체 수 배가 횟수가 늘어나면서 신생 골량이 감소하고, PD20에서는 PD0의 약 1/5까지 떨어졌다. 이에, SHED-T에서는 PD20까지 신생 골량은 거의 변동이 없었고, PD20에서는 SHED-T는 SHED-C의 5배 이상의 뼈를 형성한 것으로 나타났다.
(3-3)암 활성의 평가
SHED-C 및 SHED-T세포를 면역 무방비 상태 마우스의 피하 조직에 1×106개 이식하였다. 이식 후 30일 이상 관찰했으나 이 기간 중 상기의 세포를 이식한 어느 랫트에게 있어서도 종양은 형성되지 않았다. 또한, SHED-T 세포에서는 40~200PD의 배양 세포의 모든 클론의 형태에 변화가 없었다.
이상에 의해, SHED-T에는 암 활성이 없는 것으로 나타났다.
(4) 평가
SEHD-T는 260PD를 넘어도 분화 능력을 유지한 채로 증식하는 능력을 가지고 있는 것으로 나타났으나, SHED-C는 분화 능력을 가진 것의 30PD 이하로 노화하였다.
이상으로부터 SHED-T는 불멸화 세포가 되고 있어 활성이 높은 SHED 배양상청의 대량 생산에 적합함을 보였다.
(5) CM 고정 Ti 임플란트 스크루 제조
CM 고정 Ti 임플란트 스크루 제조, 세포 부착 분석, 주사 전자 현미경(SEM)에 의한 Ti 임플란트 표면의 변화 관찰, LC/MS/MS에 의한 Ti 임플란트 표면적인 단백질의 분류 및 인비트로의 SHED의 RNA분석은 상술한 실시예 1과 마찬가지로 하였다.
(실시예 4)
(1) 임플란트 및 외과적 절차
Ti 임플란트(티탄 픽스쳐)를 이미 기재한 것과 같이(문헌번호 40), 대퇴골 중에 삽입하였다. 랫트를 디에틸 에테르 증기(3 mL/챔버)의 흡입과 펜토바르비탈(20 mg/kg)의 복강 내 투여의 편성에 의해 마취하였다. 10 mm의 절개구를 원위 대퇴골을 넘어 형성하여, 이 뼈를 드러냈다.
유니코티칼 임플란트 플로어(unicortical implant floor)을, 치과용 라운드 바(dental round bar, 직경 1.5 mm)를 이용하여 1500 rpm이하의 회전 속도에서 대퇴골 원위부터 7 mm에서 형성하였다. CM, DMEM 또는 PBS에서 처리한 임플란트를 피질 뼈 중에 삽입하고 심어 넣었다. 그 후, 연 조직을 이들의 정상 위치로 되돌려 3-0 바이쿠릴(등록 상표)SH-1(에치콤사 제)로 봉합하였다.
(2) In vivo 이미징 분석
고정화된 QD-수식 CM을 가진 Ti 임플란트를 트럭하여, 이미징 시스템(IVIS spectrum, Xenogen사제)을 이용하여 가시화하였다. 랫트를 이식 후 첫날, 7일째, 14일째 및 28일째에 각각 도살하여, 박은 Ti 임플란트를 가진 대퇴골을 꺼냈다. 꺼낸 랫트의 대퇴골 중의 Ti 임플란트와 회합한(associated with) QD-라벨을, 이미징에 의해서 검출하였다.
각 랫트 및 추출한 대퇴골을 이하의 조건으로 이미징하었다:
검체의 높이:1.50cm
시야:13×13cm
폭로 시간:1초
f-스톱:1
바인딩:8
여기 필터:605nm
복사 필터:655nm 또는 검체의 높이:0.01cm
시야:6.5×6.5cm,
폭로 시간:2초
f-스톱:1
바인딩:8,
여기 필터:605nm,
복사 필터:655nm,
(3) 제거 토크(Ncm)측정
대퇴골 임플란트 제거 토크(Ncm)를, 임플란트 설치 하루, 7일, 14일 및 28일 시점에서 실험군 마다 깊은 마취 하에 측정하였다(각 시점에서 N=5). 제거 토크를 토크 게이지 ATG 3 CN(등록 상표, 측정 범위:0.1-3 Ncm; Tohnichi, Tokyo, Japan) 및 BTG 15 CN-S(등록 상표, 측정 범위:2-15 Ncm(주) 동일 제작소 제품)을 이용하여 측정한 데이터를 유의 차 수준 5%로 Scheffe 검정을 이용해서 일원 배치 분석에 의해 해석하였다.
결과를 도 9에 나타낸다. 음성 대조군(PBS 처리군)과 양성 대조군(DMEM 처리군) 사이에서는 하루 후 및 7일 후에 유의 차를 보였으나, 14일 후에는 유의 차는 보지 못하였다. 시험군(CM 처리군)에서는 모든 측정 시점에서 대조군보다 높은 값을 나타내고 14일 후까지 유의 차가 보였다(*는 p<0.05를 나타낸다.).
(4) 조직학적 처리 및 뼈 이식 접촉(bone-implant contact(BIC))율(%)의 측정
제거 토크 측정 후, 랫트(각군 모두 N=5)를 깊은 마취 하에 도살하고 대퇴골 임플란트를 꺼냈다. 얻은 시료를, Technovit 7100(응연 상사 (주))중에 포함시켰다. 각 블록을 임플란트의 장축 방향에 따라서 이동시키고 50 μM 두께의 절편을 제조하고 톨루이딘 블루를 이용하여 통상적인 방법으로 염색하였다.
절편의 현미경 사진을 모니터 상에 표시하고 컴퓨터 입력하여 이미지 분석용 소프트웨어(VMS-50 VideoPro, 이노 테크(주)제)를 이용하고 분석하였다. 골 접촉률은 다음의 식에 의해서 구하였다:
골 접촉률(%)=직접 이식-뼈 접촉/페리 임플란트장.
데이터를 유의 차 수준 5%로 Scheffe 검정을 이용해서 일원 배치 분석으로 해석하였다. 결과를 도 10에 나타낸다.
결과의 도 10(A)은 해면골의 경우를 또 도 10(B)는 피질 뼈의 경우를 나타낸다. 뼈 이식 접촉률은 해면골에서는 이식 7일 후 및 14일 후에 음성 대조군과 다른 2군과 유의 차가 보였다. 한편, 피질 뼈에서는 이식 하루 후부터 시험군과 음성 대조군과 유의 차가 보였다(ANOVA 검정, *:p<0.05, **:p<0.01).
시험군에서 BIC의 값이 높은 것으로부터 뼈와의 일체화가 촉진되고 있는 것이 나타났다.
(실시예 5) 인간용 고기능 임플란트의 제조
(1) 재료와 방법
임플란트는 아스트라사 제의 티타늄 임플란트(길이 13 mm, 직경 3.75 mm, 또는 길이 11 mm, 직경 3.75 mm)를 사용하였다.
(2)성장 인자 함유 배양상청의 제조
실시예 1에서 얻은 줄기 세포 배양상청을 이용하여 성장 인자 함유 용액을 제조하고 다음과 같이 처리하였다.
상기 배양상청을 배양 플라스크에 넣고 티타늄 임플란트 재료를 여기에다 첨가하고 뚜껑을 잠구고 충분히 교반하였다. 소니케이터에서 1분간 소니케이션하였다. 다음으로 5분간 정치하여, 다시 같은 조건으로 1분간 소니케이션하였다. 5분간 정치 후에, 순수로 2회 세척하였다. 이상과 같이 하여, 상기 배양상청 내에 포함되는 성장 인자로 코팅한 티타늄 임플란트를 얻었다. 배양상청을 대신하여 DMEM만을 사용하여 같은 처리를 하여 무 처리의 티타늄 임플란트 재료를 제조하였다.
(실시예 6)고기능 임플란트의 이식 사례
(1) 환자 등
41세~68세 남성 8명의 상악 구치부에 실시예 5로 제조한 임플란트를 이식하였다. 이들 환자는 당뇨병, 고혈압 그 다른 골 대사에 영향을 주는 기초 질환은 없었다. 또한, 음주 양이 많다는 것도 없이 흡연 습관도 없었다.
환자에서는 상악 구치부에서 상악동저와의 거리가 15 mm 이상 잔존하고 있는 부분을 매입 부위로 하였다. 성장 인자로 처리한 임플란트(처리군) 8개를 환자의 일방 측의 상악 구치부에 매입하고, 성장 인자로 처리하지 않은 임플란트(자기 처리군) 8개를 동일 환자의 반대 측 상악 구치부에 매입하였다.
(2) 평가 방법
상기 16개의 임플란트를 매입한 직후(매입 시) 6개월 후 및 12개월 후의 시점에서, 오스텔 모니터(Ostell Mentor, Ostell AB, Grothenburug, Sweden)을 이용하여 ISQ(Implant Stability Quotient)의 변동에 의해서 평가하였다.
ISQ 값은 임플란트 주위의 뼈의 높이나 질, 뼈와 임플란트의 결합력에 의해서 변화하여, 1부터 100 사이의 수치로 표시된다. 일반적으로 성공한 임플란트는 ISQ가 65±5의 경우가 많다고 알려졌다. 계측 결과를 도 11에, 또한 평가를 하기 표 8에 나타냈다. 도 11에 나타나는 바와 같이, 설치 시의 ISQ는 대조군 및 SHED-CM처리군 함께 이 범위 이내였다. ISQ 값은 어느 군에서도 시간 경과적으로 상승했으나, 6월 경과, 현재 SHED-CM 처리군이 유의적으로 높아지고 있었다(p<0.05). 이런 추세는 12월 경과에서도 마찬가지이다.
[표 8]
Figure pct00008

상기 표 8과 같이, 불멸화 유치 줄기 세포 유래 성장 인자를 표면에 코팅한 티탄 임플란트에서는 픽스처의 길이에 관계없이 뼈와의 일체화가 촉진됨을 보였다.
(실시예 7) 배양상청 안 및 고기능 임플란트 표면에 부착된 단백질의 분석
(1) 재료와 방법
실시예 1에서 얻은 줄기 세포 배양상청 내의 단백질을 사용하여 LC/MS/MS(MS4 HPLC System(Michrom BioResources사제)과 LCQ Advantage mass spectrometry system(Thermo Scientific사제)에서 동정하였다.
측정 조건은 다음과 같이 하였다.
LC:MS4 HPLC System(Michrom BioResources사 제)
컬럼:Magic C18AQ(Michrom BioResources사 제, 0.1 mm(i.d.)x50cm)
용리액:용액 A(2% 아세토니트릴-98% 물(0.1%의 개미산 함유) 용액 B(90%아세토니트릴-10% 물(0.1%의 개미산 함유)을 그라디언트시켰다(0분, 95% A: 5% B→ 45분, 0% A:100% B).
속도:1 μL/분
MS1:LCQ Advantage mass spectrometry system(Thermo Scientific사 제)
MS2:LCQ Advantage mass spectrometry system(Thermo Scientific사 제)
임플란트 상에 부착한 단백질은 10% EDTA, 4M 구아니딘, 80% 아세토니트릴 순으로 액체 크로마토그래피에 의해 단계를 선정하고 각 버퍼의 유량은 2 mL/분이 되도록 하여 채취하고, 단백질량이 2 μg/mL이 되도록 제조하였다. 단백질량은 뷰렛 법으로 측정하였다.
배양상청은 100% 에탄올, 90% 에탄올을 이용하여 에탄올 침전을 시킨 후에 동결 건조하고, 단백질량이 2 μg/mL가 되도록 제조하였다. 단백질량은 포드 법으로 측정하였다.
분석 결과를 표 9에 나타낸다.
[표 9]
Figure pct00009

표 9에 나타낸 것처럼 실시예 1에서 얻은 줄기 세포 배양상청 내에는 세포 구조의 형성에 관련하는 단백질이 함유되어 있다고 밝혀졌다. 또한, 상기와 같이 해서 얻은 간엽계 줄기 세포를 배양한 후 접착 세포 비율의 많음으로부터 콜라겐 α-1(I) 사슬, 콜라겐 α-2(I) 사슬, 피브로넥틴 및 데콜린이 임플란트와 치수골과의 접착에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 여겨졌다.
(실시예 8) 배양상청의 세포 부착성에 대한 영향 및 동결 보존의 영향
(1) 재료
실시예 1에서 얻은 줄기 세포 배양상청을 시료로 음성 대조로 PBS를 사용하였다.
(2) 세포 부착성에 대한 영향
경 15 mm 순티타늄 판에 개 골수 간질 세포(연령 18-25개월, 체중 15-25kg의 비글 강아지의 엉덩뼈로부터 골수액을 10 mL 추출하고, 10% FBS 및 50~150 U/mL의 페니실린, 50~150 μg/mL의 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 5%CO2 인큐베이터에서 37℃에서 3대 예비 배양한 것)을 1.5~3x105개/웰에 파종하여(n=3), 배양상청의 유무에 의한 세포 부착성의 영향 및 플라스마 처리의 영향을 조사하였다.
배양은 10% FBS 및 페니실린(50~150 U/mL), 스트렙토마이신(50~150 μg/mL)을 포함하는 DMEM을 사용하고 37℃에서 배양하였다. 배양 전에 직경 15 mm의 순티타늄 판에 대하여 30초간 대기압 플라스마(MPS-01K01C, 쿠리타 제작소사 제)를 플라스마염 선단으로부터 10 mm의 거리에서 조사하여, 티타늄 판을 배양상청 또는 PBS에서 24시간, 37℃ 조건 하에서 숙성하였다. 배양 개시 후 1시간 및 24시간의 시점에서 접착 세포 수를 트립신-EDTA로 접착 세포를 분리시키고, 혈구 계반 상에서 부유 세포를 카운트하는 것으로 계수하여 구하였다. 결과를 도 12에 나타낸다. 도 12에서, N-PBS는 플라스마 처리 없이 PBS에서 배양, P-PBS는 플라스마 처리하는 PBS에서 배양, N-CM은 플라즈마 처리 없이 배양상청에서 배양, P-CM은 플라즈마 처리하여 배양상청에서 배양을 의미한다.
N-PBS에서는 24시간 후에도 접착 세포 수의 큰 증가는 볼 수 없었으나, P-PBS에서는 크게 증가하였다. 또한, N-CM 및 P-CM의 양군에서는 24시간 후 접착 세포 수가 증가하였다.
N-PBS군과 P-CM군에서는 24시간 후 접착 세포 수에 유의 차가 보였다(p<0.01). 또한, P-PBS군과 P-CM군 사이에도 유의 차가 보였다(p<0.05).
나아가, 24시간 후의 세포 부착 상태를 DAPI와 팔로이딘를 이용하여 형광 염색하고 250배로 형광 현미경(들뜬 파장:358 nm(DAPI), 560 nm(팔로이딘), 측정 파장:46 5nm(DAPI), 575 nm(팔로이딘), A1+(Nikon사 제))으로 관찰하였다.
결과를 도 13에 나타낸다. 도 13과 같이 세포의 증식 상황은 N-CM 군 및 P-CM 군에서 분명히 많이 되고 있었다.
(3) 동결 보존한 경우의 세포 증식에 대한 영향
상기 배양상청을 1 mL씩 플라스틱제의 나사입 튜브(용량 2 mL, 코닝사 제)에 주입하여, 각각 4℃, -15℃ 및 -80℃에서 1주일, 2주 및 1개월 보존하였다.
이의 영향을, 브로모우리딘 검정에서 확인하였다. 검정 키트로서, BrdU 라벨링& 디텍션 키트 II(로슈 어플라이드 사이언스사 제)를 사용하며 첨부된 사용 설명서대로 분석하였다.
실시예 1과 동일하게 얻은 간엽계 줄기 세포를 1x106개/웰에서 96 웰 플레이트에 파종하였다. 상기와 같이 저장한 배양상청을 100 μL/웰에 첨가하여 5%CO2인큐베이터에서 37℃으로 24시간 배양하고 이 줄기 세포의 증식을 관찰하고 증식률을 요구하였다. 결과를 도 14에 나타낸다.
-80℃에서 저장한 경우에서 1개월 저장한 경우의 활성은 1주일 보존한 경우와 비교해서 저하 경향에 있었으나, 유의 차는 보지 못하였다. 한편, -80℃에서 2주일 보존한 경우와 -15℃에서 1개월 저장한 경우 사이에는 유의 차가 보였다(p<0.05). 또한, -80℃에서 2주일 보존한 경우와 4℃에서 1개월 저장한 경우 사이에는 유의 차가 보였고(p<0.05). -80℃에서 1주일 보존한 경우와 4℃에서 2주일 보존한 경우 사이에도 유의 차가 보였다(p<0.05).
이상에서 배양상청의 보존 기간은 -80℃에서 동결 보존한 경우에는 1개월, -15℃의 경우에는 1개월, 4℃의 경우에는 2주일이라고 생각된다.
이상에 의해, 배양상청에서 임플란트를 처리함으로써, 상기의 재생 인자를 생성되는 줄기 세포의 증식이 촉진되고, 임플란트와 이를 매입한 뼈와 접착이 강고하게 되는 것이 나타났다.
본 발명은 치과 및 의과 분야에서 유용하다.
서열 번호 1: ALP용 포워드 프라이머
서열 번호 2: ALP용 리버스 프라이머
서열 번호 3: OCN용 포워드 프라이머
서열 번호 4: OCN용 리버스 프라이머
서열 번호 5: OPN용 포워드 프라이머
서열 번호 6: OPN용 리버스 프라이머
서열 번호 7: BSP용 포워드 프라이머
서열 번호 8: BSP용 리버스 프라이머
서열 번호 9: Collagen 1용 포워드 프라이머
서열 번호 10: Collagen 1용 리버스 프라이머
서열 번호 11: GAPDH용 포워드 프라이머
서열 번호 12: GAPDH용 리버스 프라이머
서열 번호 13: 콜라겐 α-1(I)사슬 프리 카 산다
서열 번호 14: 콜라겐 α-1(II)사슬 프리 카 산다
서열 번호 15: 콜라겐 α-1(XXVII)사슬 프리 카 산다
서열 번호 16: 콜라겐 α-2(I)사슬 프리 카 산다
서열 번호 17: 피브로넥틴
서열 번호 18: 피브로넥틴
서열 번호 19: 데콜린
서열 번호 20: 데콜린
서열 번호 21: 오스테오 칼신
서열 번호 22: 오스테오 폰틴
서열 번호 23: 뼈 시알로단백질 2
서열 번호 24: 혈관 상피 성장 인자 A
<110> Quarrymen Corporation Quarrymen Corporation <120> Highly-functional implant <130> P13YY008PCT <150> JP2012-282001 <151> 2012-12-26 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gctgtgaagg gcttcttgtc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cgcctatcag ctaatgcaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tgaggaccct ctctctgctc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gagctcacac acctccctgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 aggtcctcat ctgtggcatc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agactggcag tggtttgctt 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ttctcgagaa aaatttcca 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapines <400> 8 tcactggtgg tagtaataat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cgatgccatt ttctccctta 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ctctggtacc gctggagaag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 atgactctac ccacggcaag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ttcagctctg ggatgacctt 20 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn Leu Asp Ala 1 5 10 15 Ile Lys <210> 14 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Gly Glu Pro Gly Thr Pro Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 1 5 10 15 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Gly Asn Phe Ala Ala Gln 20 25 30 Met Ala Gly Gly Phe Asp Glu Lys 35 40 <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asp Gly Tyr Pro Gly Pro Leu Gly Leu Asp Gly Lys Pro Gly Leu Pro 1 5 10 15 Gly Pro Lys <210> 16 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly Arg Pro Gly Glu Pro Gly Leu Met Gly 1 5 10 15 Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly Asn Val Gly Pro Ala Gly Lys 20 25 30 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Asp Leu Gln Phe Val Glu Val Thr Asp Val Lys 1 5 10 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Val Asp Val Leu Pro Val Asn Leu Pro Gly Glu His Gly Gln Arg 1 5 10 15 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ile Ser Pro Glu Ala Phe Lys Pro Leu Val Lys 1 5 10 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Thr Ser Tyr Thr Ala Val Ser Leu Tyr Ser Asn Pro Val Arg 1 5 10 <210> 21 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Leu Leu Pro Leu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Ala Val Ala Ala Leu 1 5 10 15 Cys Tyr Glu Ser His Glu Ser Met Glu Ser Tyr Glu Val Ser Pro Phe 20 25 30 Thr Thr Arg Arg Asn Ala Asn Thr Phe Ile Ser Pro Gln Gln Arg 35 40 45 <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Lys Ser Gln Glu Ser Asp Glu Ala Ile Lys Val Ile Pro Val Ala 1 5 10 15 Gln Arg <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ile Lys Ala Glu Asp Ser Glu Glu Asn Gly Val Phe Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Arg <210> 24 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala Leu Glu Cys Val Pro Thr Ser 1 5 10 15 Glu Ser Asn Val Thr Met Gln Ile Met Arg 20 25

Claims (25)

  1. 5~15%의 혈청, 50~150 U/mL의 페니실린 및 50~150 μg/mL의 스트렙토마이신을 함유하는 배양액에, 5×103~5×104개/mL의 골수 간질 세포 또는 불멸화 유치 줄기 세포를 첨가하여 34~37.5℃, 5% CO2 존재 하에 예비 배양을 실시하는 예비 배양 공정;
    소정의 형상과 접착성을 가지는 상기 세포를 선별하는 세포 선별 공정; 및
    상기 선별 공정에서 선별된 세포를 예비 배양과 같은 조건에서 배양하고 배양 개시 후 40~56시간 배양상청을 모으는 배양상청 수집 공정;을 갖추는 세포 산생물의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 골수 간질 세포는 랫트의 대퇴골, 돼지 치수 및 인간 유치로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 세포에서 유래하는 것임을 특징으로 하는 세포 산생물의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 세포를 37℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 세포 산생물의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 소정의 형상은 스핀들 형상이고 방추형인 것을 특징으로 하는 세포 산생물의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배양 개시 후 44~52시간의 배양상청을 모으는 것을 특징으로 하는 세포 산생물의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 배양 개시 후 48시간의 상기 배양상청를 모으는 것을 특징으로 하는 세포 산생물의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배양액은 둘베코(Dulbecco) 배지, 이스코브 개변 둘베코(Iscove modification Dulbecco) 배지, 햄 F12 배지 및 rpmI 1640 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 배지인 것을 특징으로 하는 세포 산생물의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 혈청은 소태아 혈청, 소혈청, 말 혈청, 인간 혈청 및 양 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 혈청인 것을 특징으로 하는 세포 산생물의 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 배양액은 10% 소태아 혈청, 100 U/mL의 페니실린 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 산생물의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    원심 및 에탄올 침전 처리를 하고 침전물을 제조하는 침전물 제조 공정; 및
    상기 침전물 제조 공정에서 얻어진 침전물을 동결 건조시키는 동결 건조 공정;을 더 갖추는 세포 산생물의 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 세포 산생물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 배양상청에는 적어도 I형 콜라겐(Col-I) 피브로넥틴, 데콜린 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 포함되는 것을 특징으로 하는 세포 산생물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 배양상청에는 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 7, 폴리스타틴 관련 단백질, 메탈로프로티나아제 억제제 I, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 억제제, 액틴 및 설프히드릴 옥시다아제 I가 더 포함되는 것을 특징으로 하는 세포 산생물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 배양상청에는 SPARC, 콜라겐 α2 (IV) 사슬, β-2-매크로 글로불린, Rho GTPase 활성 단백질 18이 더 포함되는 것을 특징으로 하는 세포 산생물.
  15. 임플란트 재료의 표면을 유기 용매로 세척하고, 세척 임플란트 재료로 하는 세정 공정;
    상기 세척 임플란트 재료를 소정의 조성을 가진 제1석회화 용액 안에서 소정의 온도로 3~6시간 숙성하여 침지 임플란트 재료로 하는 숙성 공정; 및
    상기 침지 임플란트 재료를 소정의 농도의 제12항 내지 제14항 중 어느 하나의 세포 산생물을 함유하는 제2석회화 용액에서 2~5일 간 큐베이트 처리하는 처리 공정;을 갖추는 것을 특징으로 하는 고기능 임플란트의 제조 방법.
  16. 제16항에 있어서,
    상기 임플란트 재료는 티타늄, 지르코니아, 하이드록시 아파타이트 및 β -TCP로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 재료로 형성되는 것을 특징으로 하는 고기능 임플란트의 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 유기 용매는 아세톤과 60~80% 에탄올인 것을 특징으로 하는 고기능 임플란트의 제조 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 제1석회화 용액은 100~150 mm NaCl, 2.5~3.5 mm CaCl2·H2O, 1.5~2.5 mm K2HPO4, 25~75 mm Tris-HCl(pH 7.2~7.6)이며, 제2석회화 용액은 130~160 mm KNO3, 1~2 mm Ca(NO3)2·4H2O, 0.5~1.5 mm K2HPO4(pH 7.0~7.8)인 것을 특징으로 하는 고기능 임플란트의 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 제1석회화 용액은 136.8 mm NaCl, 3.10 mm CaCl2·H2O, 1.86 mm K2HPO4, 50 mm Tris-HCl(pH 7.4)이며 제2석회화 용액은 142.8 mm KNO3, 1.5 mm Ca(NO3)2·4H2O, 0.9 mm K2HPO4(pH 7.4)임을 특징으로 하는 고기능 임플란트의 제조 방법.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 소정의 온도가 36~38℃이고, 침지 시간이 4시간인 것을 특징으로 하는 고기능 임플란트의 제조 방법.
  21. 제15항에 있어서,
    상기 소정의 농도의 세포 산생물은 5~20 mg/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 고기능 임플란트의 제조 방법.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 고기능 임플란트.
  23. 제22항에서,
    적어도 I형 콜라겐(Col-I), 피브로넥틴 및 데콜린을 표면에 보유하는 것을 특징으로 하는 고기능 임플란트.
  24. 제23항에 있어서,
    인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 7, 폴리스타틴(follistatin) 관련 단백질, 메탈로프로티나아제 억제제 I, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 억제제, 액틴 및 설프히드릴 옥시다아제 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 이상의 단백질을 더 표면에 있는 것을 특징으로 하는 고기능 임플란트.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 고기능 임플란트는 티타늄, 지르코니아, 하이드록시 아파타이트 및 β-TCP로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 재료로 형성되는 것을 특징으로 하는, 청구항 22에 기재의 고기능 임플란트.
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