JP6033888B2 - 高機能インプラント材料 - Google Patents
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Description
本来、欠損した歯等に十分な機能を発揮させるためにインプラントを安定化させることが必要であるから、インプラントは歯槽骨と一体化することが望ましい。このため、こうしたインプラント材料として、バイオガラスやリン酸カルシウムセラミックス(すなわち、ヒドロキシアパタイト及びβ-リン酸三カルシウム)その他の生物活性材料及び金属材料が使用されてきた。
また、金属インプラント材料表面の処理は、まず、金属インプラント表面を活性化する前処理を行い、その後に骨形成試薬で処理する、又は成長因子を適用するという手順で行われるため、操作が煩雑であった。さらに、金属インプラント材表面に成長因子を適用する場合には、その表面に固定した成長因子の保持される期間が問題となる。金属インプラント材の表面に保持される期間が、骨と金属インプラント材料とが一体化するのに必要な時間と比べて短ければ、十分な一体化が望めないからである。
すなわち、本発明の第1の態様は、5〜15%の血清、50〜150U/mLのペニシリン及び50〜150μg/mLのストレプトマイシンを含有する培養液中に、5×103〜5×104個/mLの骨髄間質細胞又は不死化乳歯幹細胞を加えて、34〜37.5℃、5%CO2存在下に、予備培養を行う予備培養工程と;所定の形状と接着性とを有する前記細胞を選別する細胞選別工程と;前記選別工程で選別された細胞を予備培養と同じ条件で培養し、培養開始後40〜56時間の培養上清を集める培養上清収集工程と;を備える、細胞産生物の調製方法である。
また、前記細胞選別工程における所定の形状は、スピンドル形状かつ紡錘型であることが好ましい。前記培養上清は、培養開始後44〜52時間で集めることが好ましく、培養開始後48時間で集めることがさらに好ましい。
また、上記調製方法は、遠心及びエタノール沈殿処理を行って沈殿物を調製する沈殿物調整工程と、前記沈殿物調製工程で得られた沈殿物を凍結乾燥させる凍結乾燥工程とをさらに備えることが好ましい。
ここで、前記細胞産生物は、骨髄間質細胞又は不死化乳歯幹細胞から得られるものであることが好ましい。そして、前記骨髄間質細胞は、ラットの大腿骨、ブタ歯髄、及びヒト乳歯からなる群から選ばれるいずれかの細胞に由来するものであることが好ましい。前記細胞産生物には、少なくとも、I型コラーゲン(Col−I)、フィブロネクチン、デコリン及び血管内皮増殖因子(VEGF)が含まれることが好ましい。また、インスリン様成長因子結合タンパク質7、フォリスタチン関連タンパク質、メタロプロテイナーゼインヒビターI、組織プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、アクチン、及びスルフヒドリルオキシダーゼIがさらに含まれることが好ましく、SPARC、コラーゲンα2(IV)鎖、β−2−ミクログロブリン、Rho GTPase活性化タンパク質18がさらに含まれることがより好ましい。
さらに、前記所定の温度が36〜38℃であり、浸漬時間が4時間であることが好ましい。前記所定の細胞産生物は、上記の細胞産生物の5〜20mg/mlの水溶液であることが好ましく、約10mg/mLであることがさらに好ましい。
上記インプラントは、少なくとも、I型コラーゲン(Col−I)、フィブロネクチン、及びデコリンを表面に保有することが好ましく、インスリン様成長因子結合タンパク質7(IGF-binding protein 7)、フォリスタチン関連タンパク質、メタロプロテイナーゼインヒビターI、組織プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、アクチン、及びスルフヒドリルオキシダーゼIからなる群から選ばれる少なくとも1以上のタンパク質をさらに表面に有することがさらに好ましい。
さらにまた、短期間で骨との一体化ができる、高機能インプラント材を得ることができる。
本発明の調製方法は、(a)5〜15%の血清、50〜150U/mLのペニシリン及び50〜150μg/mLのストレプトマイシンを含有する培養液中に、5×103〜5×104個/mLの骨髄間質細胞又は不死化乳歯幹細胞を加えて、34〜37.5℃、5%CO2存在下に、予備培養を行う予備培養工程と;(b)所定の形状と接着性とを有する前記細胞を選別する細胞選別工程と;(c)前記選別工程で得られた細胞を予備培養と同じ条件で培養し、培養開始40〜56時間後の培養上清を集める培養上清収集工程と;を備えている。
培地に添加可能な成分としては、上記の血清のほか、血清代替物(Knockout serum replacement(KSR)など)、ウシ血清アルブミン(BSA)、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンその他の抗生物質、ビタミンK、葉酸その他の各種ビタミン類、カルシウム、マグネシウムその他の各種ミネラル、アルギニン、トリプトファンその他のアミノ酸等を挙げることができる。
また、本発明は、(d)遠心及びエタノール沈殿処理を行って沈殿物を調製する沈殿物調整工程と;(e)前記沈殿物調製工程で得られた沈殿物を凍結乾燥させる凍結乾燥工程と;をさらに備える方法とすることができる。
前記骨髄間質細胞は、ラットの大腿骨、ブタ下顎及び歯、及びヒト乳歯からなる群から選ばれるいずれかの細胞に由来するものであることが、一定の種類の細胞成長因子を安定して産生できる細胞を確実に入手できることから好ましい。
成長因子は、生体内における種々の細胞学的プロセス、生理学的プロセスの調節に関与していることが知られており、標的細胞表面にある受容体タンパク質(以下、単に「受容体」又は「レセプター」ということがある。)に特異的に結合し、シグナル伝達を行う。
β型変異増殖因子TGF-βは腎臓、骨髄、血小板などほぼすべての細胞で産生され、5種類のサブタイプ(β1〜β5)が存在する。TGF-β1〜β3は、骨基質中に不活性型として蓄積されており、骨吸収の際に破骨細胞が放出する酸によって活性化される。TGF-βは、骨芽細胞の増殖及びコラーゲン等の間葉細胞の合成・増殖を促進するが、上皮細胞の増殖や破骨細胞に対しては抑制的に作用する。
上記の成長因子は、それらの構造及び進化の面から関連するいくつかのファミリーに分類される。これらのファミリーとしては、TGF-β、骨形成タンパク質(bone morphogenic protein:BMP)、ニューロトロフィン(神経栄養因子)、線維芽細胞増殖因子(FGF)等を挙げることができる。上記神経栄養因子には、NGF、BDNF、NT3等が含まれる。成長因子は現在、医療でも盛んに用いられている。
コラーゲンタンパク質ファミリーは、以下のように分類される。
1)特異的な、67nmの周期構造横紋構造を有する線維を形成する分子群(I型、III型、V型(主として軟骨以外の組織))、II型、XI型(軟骨組織)
3)網目状の会合体を形成している分子群(主として基底膜の骨格を形成するIV型コラーゲン)、細胞外の微細繊維を形成するVI型、皮膚等の表皮基底細胞からの基底板を突き抜けて存在するアンカリングフィブリルを形成するVII型
4)ヘキサゴナル格子を形成するX型(軟骨が骨へと移行する時期に暫定的に存在する)、目の核膜のデスメの六角構造を形成し、血管その他の組織にも存在する)、さらに細胞膜を貫通するドメインを有するXIII型、XV型、XVII型、XVIII型
インスリン様増殖因子結合タンパク質7(insulin-like growth factor-binding protein 7:IGFBP7)はIGF-1受容体に結合し、インスリン様増殖因子によるIGF-1受容体の活性化を遮断する。このため、IGFBP7の存在量は腫瘍進行と逆相関を示すタンパク質である。
SPARCは、骨と象牙質に存在する30kDaの非コラーゲン性タンパク質であり、真皮の形成を機能に中心的な役割を果たす。線維芽細胞から分泌され、コラーゲンとヒアルロン酸の合成を高める。
72kDa IV型コラゲナーゼはゼラチナーゼともいい、ゼラチナーゼのうち、A酵素を72kDa IV型コラゲナーゼ(MMP-2)と呼ぶ。95kDaのB酵素は、MMP-9と呼ばれる。MMP-2は、触媒ドメインに挿入されたII型ファイブロネクチンドメインの3つのリピートを有しており、MMP-9と共にMMPsのゼラチナーゼグループに属する。MMP-2はコラーゲンI, IV, V, VII, X, XIV, ゲラチン(gelatin), エラスチン、ラミニン-1、ラミニン-5、ミエリン塩基性タンパク質(myelin basic protein)、MMP-1, MMP-9, MMP-13に対して、直接あるいは間接的な基質特異性を示す。
Rho GTPase活性化タンパク質は、分子量2〜3万のサブユニット構造を有していない一群のGタンパク質で、スーパーファミリーを構成している。このスーパーファミリーは、Ras, Rho, Rab, Arf, Ranの5つのグループに分類される。Rho GTPase活性化タンパク質は、このうちのRhoに属するタンパク質である。Rhoタンパク質は、アクチンフィラメントの再編成を介して、平滑筋の収縮や細胞質分裂、細胞運動、細胞形態を制御している。
歯髄細胞とは、歯の神経に含まれる幹細胞の一種である。歯髄細胞は、歯という硬質の素材に保護されており、歯は紫外線や放射線を通さないために、遺伝子も傷つきにくいといわれている。
採取した骨髄間葉細胞又は歯髄組織を、基本培地、例えば、5〜15%ウシ血清(以下、「CS」ということがある。)及び50〜150ユニット/mLの抗生物質を含有するダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 以下、「DMEM」という。)に懸濁する。ついで、1〜5mg/mLのコラゲナーゼ及び1〜5mg/mLのディスパーゼを用いて、37℃で、0.5〜2時間処理する。
次いで、培養液、例えば、10%FCSを含有するDMEMを添加して、上記と同様に所望の期間培養し、PBS等で細胞を1〜数回洗浄して接着性細胞を得る。
例えば、骨液(約50μL/大腿骨)を、10%FBS、上述した濃度のペニシリン及びストレプトマイシンを含むDMEMに入れ、5%CO2インキュベータ中にて、37℃で、3代予備培養を行い、後述する選別工程において、スピンドル形状及び接着性等の特徴を有する細胞を選択する。
大腿骨から得たBMSCsを使用した場合には、スピンドル形状及び接着性等の特徴を有する細胞のみを選択して使用する。
ここで、サブコンフレントとは、培養容器中の細胞付着面の約70%に細胞が付着した状態をいう。例えば、継代培養を1〜8回行い、選別された細胞を、必要な細胞数、例えば約1×107個/mLまで増殖させる。以上のように培養した後に、細胞を回収して液体窒素中にて保存する。様々なドナーから回収した細胞を歯髄幹細胞バンクの形態で保存することにしてもよい。
ここで、hTERTはテロメア修復酵素の遺伝子であり、bmi-1はポリコーム複合体を構成するたんぱく質の1つであるBmi-1の遺伝子である。ここで、Bmi-1は造血幹細胞の維持に必要であり、活性増強により造血幹細胞を増やすことができるという作用を有する。
Sox2はSRY-related HMG box遺伝子ファミリーに属しており、機能の未分化性(多能性)維持に関与することが知られる遺伝子である。c-Mycは発癌遺伝子であり、c-Mycで誘導された腫瘍内で細胞の生存と死の両方を促進する遺伝子である。p16INK4aはがん細胞のcell cycleをcontrolするのに重要な役割を果たす遺伝子である。
ウイルス感染後の細胞群を、常法に従ってFITCで染色し、フローサイトメーターを用いて、STRO-1陽性細胞を検出する。ここで、STRO-1は、骨髄における多分化能を有する間葉系幹細胞のマーカーの1つとして考えられており、細胞の不死化の指標となる。
以上のようにして得られる骨髄間質細胞、歯髄細胞及び不死化乳歯歯髄細胞は、ラット、ブタ又はヒト乳歯由来のものを使用することが、これらの細胞を得るためのソースを入手しやすいこと、及び安定して上述した成長因子を産生する細胞を得られることから好ましい。そして、(a)の予備培養工程では、これらの細胞を、37℃培養することが好ましい。
次いで、上記のようにして得られた凍結乾燥品を使用して、以下のようにして高機能インプラントを製造する。具体的には、(f)インプラント材の表面を有機溶媒で洗浄し、洗浄インプラント材とする洗浄工程と;(g)前記洗浄インプラント材を、所定の組成を有する石灰化溶液中に所定の温度で3〜6時間浸漬し、浸漬インプラント材とする浸漬工程と;(h)前記浸漬インプラント材を所定の濃度の細胞産生物を含有する溶液で処理する処理工程と;を備える方法によって作成する。
ここで、浸漬時間を3〜6時間とするのは、3時間未満では石灰化が十分でないという問題があり、6時間を越えてもそれ以上の効果が得られないからである。浸漬時間を4時間とすることが、十分な石灰化が行われるために好ましい。
上記のように浸漬処理を行ったインプラント材を、所定の濃度の培養物を含有する第2石灰化溶液で所定の時間インキュベーション処理することにより、Col-I、BSP、VEGFその他の成長因子を付着させる。上記第2石灰化溶液は、130〜160 mMKNO3, 1〜2mM Ca(NO3)2・4H2O, 0.5〜1.5mM K2HPO4(pH 7.0〜7.8)の組成とすることが、これらのタンパク質の付着効率が高いことから好ましい。
ここで、水溶液の濃度が5mg/mL未満では付着する成長因子の量が不十分で歯槽骨との接着性が弱いという問題があり、一方、20mg/mLを越えてもそれ以上高い接着性が得られないからである。10mg/mLの濃度の水溶液で処理することが、歯槽骨との十分な接着が確保できることから、さらに好ましい。
(実施例1)
(1)材料と方法
(1−1)動物
6週齢の雌のSDラット(n = 15、体重200−230g)を、日本SLC(株)より購入した。全ての実験は、名古屋大学医学部の実験ガイドラインに従って行った。これらの動物は、12時間の明暗サイクル下に、室温にて飼育した。飼料及び水は自由に摂取させた。
ラットのBMSCsを、ラットの大腿骨の髄腔から得た。骨髄液(50μL/大腿骨)を集めて、10%ウシ胎児血清(FBS、和光純薬工業(株))、ペニシリン及びストレプトマイシン(和光純薬工業(株))を含むダルベッコ変法MEM(DEMEM、シグマ−アルドリッチ社製)中にて、5%CO2インキュベータ中にて、37℃で3代予備培養した。2日ごとに培地を交換した。スピンドル形状及び接着性等の特徴を有する細胞のみを使用した。
培養したBMSCを70〜80%コンフレントになるまで増殖させ、暖めたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む無血清DMEMを加えた。48時間後の培養上清(以下、「CM」ということがある。)を集めて1,500 rpmで5分間遠心し、その後、3,000rpmで3分間遠心して他の細胞を除去した。5mLのCMを45mLの100%エタノールと混合し、−20℃にて1時間インキュベートした。この混合物を、4℃、15,000rpmにて15分間遠心し、上清を除いた。CMの沈殿物を冷90%エタノール(−20℃)に再度懸濁し、4℃、15,000rpmにて15分間遠心した。最終沈殿物を−80℃にて凍結させて凍結乾燥させ、−30℃で使用まで保存した。細胞と接触させていない無血清DMEMを対照として使用した。
Ti インプラントスクリュー(全長5mm、スレッド径2mm、及び1mm ピッチ)は、西島メディカル(株))より提供を受けた。これらのTiインプラントは、先の研究で得られた条件で製造された。
Tiインプラントの表面は、PBSのみ、DMEMのみ又はCMで処理し、それぞれ、PBS処理群(陰性対照群)、DMEM処理群(陽性対照群)及びCM/DMEM処理群(試験群)とした。
各処理群は、以下のようにして調製した。
まず、Tiインプラントをアセトンと70%エタノールで洗浄し、第1石灰化溶液[136.8mM NaCl, 3.10mM CaCl2・H2O, 1.86mM K2HPO4を含有する50mM Tris-HCl(pH 7.4)(和光純薬工業(株)製))中で、37℃にて、4時間浸漬した。
上記3種類の石灰化溶液3mL中に、洗浄済の各Tiインプラント材5本を浸漬し、37℃にて3日間、インキュベートした。インキュベーション終了後、各Tiインプラント材を取り出した。
(A)及び(D)は、Tiインプラントの表面を機械研磨したときの典型的なトポグラフィーを示した。(C)及び(E)は雪景色様の微細構造を示した。(F)では、Tiインプラント表面の雪景色様の微細構造及び微小球(ミクロスフェア)が観察された。微小球を矢印で示した。図中に示した線分は、(A)〜(C)が10μm、(D)〜(F)が2μmである。
Tiディスク(10×10mm;(株)オーファ製)を、Tiインプラント上への固定と同様の手法によって、PBS、DMEM、又はCMのいずれかで処理した。ラットのBMSCs(1.0×106個)を上記のように処理したTiディスク上に播種し(N=3)、10%FBS及び1%ペニシリン‐ストレプトマイシン含有DMEMを用いて、37℃にて、5%CO2存在下に24時間培養した。
PBS処理群及びDMEM処理群の間、及びPBS処理群及びCM処理群との間には、それぞれ有意差が見られた(*:p<0.05, ANOVA検定)。
以上より、PBSで表面を処理したTiインプラントは、図1(A)及び(D)に示すような機械研磨の典型的なトポグラフィーを示した。DMEMを固定化したTiインプラントは、雪景色様の微細構造を広く、不規則にディスプレイしていた(図1(B)及び(E))。CMでコートしたTiインプラントの表面は、雪景色様の微細構造上にミクロスフェアをディスプレイしていた(図1(C)及び(F)の矢印参照)。これらの結果は、CM又はDMEMの固定化成分により、インプラント表面のトポグラフィーが変化することを示唆した。
上記で得たCM/DMEM処理群のTiインプラント材の表面から、80%アセトニトリルを用いてタンパク質を剥離させた。剥離させたタンパク質は、凍結乾燥を行って粉末化した。粉末化したタンパク質1mgを100μLの泳動用サンプルバッファーで希釈し、希釈したバッファー10μLを、12%アクリルアミドゲルのゲルを使用したゲル電気泳動に供した。泳動後、CBB(コマジーブリリアントブルー)溶液、又はSilver Stain Kit(Therimo社製)を用いてそれぞれ染色を行なった。染色後、メスを用いてゲルを切り出した。
検索パラメータは、1 missed trypsin cleavageのトレランス、質量トレランス6100 ppm及びメチオニン残基の酸化を許容するように設定した。クエリーが、含有される4以上のペプチドとマッチし、Mascot search engineによって生成された統計的に有意なMowse(分子量サーチ;molecular weight search)スコアと一致する質量を有するときに、同定されたタンパク質を承認した。
フォワードプライマー GCTGTGAAGGGCTTCTTGTC・・・配列番号1
リバースプライマー CGCCTATCAGCTAATGCACA・・・配列番号2
フォワードプライマー TGAGGACCCTCTCTCTGCTC・・・配列番号3
リバースプライマー GAGCTCACACACCTCCCTGT・・・配列番号4
フォワードプライマー AGGTCCTCATCTGTGGCATC・・・配列番号5
リバースプライマー AGACTGGCAGTGGTTTGCTT・・・配列番号6
フォワードプライマー TTCTCGAGAAAAATTTCCA・・・配列番号7
リバースプライマー TCACTGGTGGTAGTAATAAT・・・配列番号8
フォワードプライマー CGATGCCATTTTCTCCCTTA・・・配列番号9
リバースプライマー CTCTGGTACCGCTGGAGAAG・・・配列番号10
フォワードプライマー ATGACTCTACCCACGGCAAG・・・配列番号11
リバースプライマー TTCAGCTCTGGGATGACCTT・・・配列番号12
ラットBMSCsを、PBS、DMEM又はCMで処理したTiディスク上で培養した。固定化及び培養方法は、細胞接着分析を行ったのと同じ方法である。BMSCsを、1日、7日、14日間培養した。各ディスク上で培養したラットBMSCsからの総RNAを、TRIZOL試薬(インビトロジェン ライフテクノロジー社製)を用いて、製造元のプロトコルにしたがって行った。cDNAを、1μgの総RNAから、10x反応バッファー、5mM dNTP混合物、1U/μLのRNaseインヒビター、0.25U/μLの逆転者酵素(M-MLV逆転写酵素、インビトロジェン社)、及び0.125μMのランダムプライマー(タカラバイオ(株))を含む20μLの反応液中で合成した。
ラットのグリセルアルデヒド-3-ホスフェート・デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プライマーを、内部標準として使用した。in vitro遺伝子発現分析において、移植された培養細胞中のGAPDHに対するmRNAの発現レベル(%)を、Scion Image picture-imaging software (Scion社製)を使用して測定した。合成されたcDNAを、表1に示す特異的プライマーを用いた次のPCR増幅用の鋳型として使用した。すべての実験は3回繰り返し、データを有意差レベル5%で、Scheffe検定を用いて、一元配置分散分析(ANOVA)により解析した。
結果をOCN,OPN及びCol Iの遺伝子の発現パターン(図3(A)〜(C)参照)及びそれを定量化したグラフ(図3(D)〜(F)参照)として図3に示した。
QDs (インビトロジェン・モレキュラー・プローブス社製)を用いたCMのラベリングは、製造元の指示書に従って行った。簡単に言えば、石灰化溶液で処理したTi検体 を、25μLの8μM QDs、1mg/mLのCM、1mLの10mMのホウ酸バッファー(pH 7.4)、及び5.7μLの10mg/mL N-エチル-N’-ジメチルアミノプロピル-カルボジイミド(架橋試薬;シグマ‐アルドリッチ社製)の混合物に添加し、室温でそっと1時間攪拌した。血清不添加のDMEM又はPBSのQDラベリングを、対照として使用した。結果を図4に示す。
PBSで処理したTiインプラントでは、観察期間中を通して、その周囲に蛍光は検出されなかった。これに対し、DMEM又はCMで処理したTiインプラントでは、その周囲に傾向が検出された。
以上から、DMEM又はCMで処理したTiインプラントでは生体分子の局在化が起きていることが判明した。
(1)プラスミド抽出用試薬
(1−1)試薬等
カナマイシン(Kan)、アンピシリン(Amp)、LB液体培地及びLB寒天培地、グリコーゲン、アガロース、滅菌水、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム及びRNase Aを使用した。50mg/mLのカナマイシン(Kan)及びアンピシリン(Amp)を調製し、ストック溶液として−20℃で保存した。グリコーゲンは20mg/mLに調製した。10mg/mLのRNase Aを調製し−20℃で保存した。10M(飽和)酢酸アンモニウム(NH4OAc)、3Mの酢酸ナトリウム(NaOAc;pH5.2)を調製した。
大腸菌コンピテントセル(Supercharge EZ10 Electrocompetent Cells、製品コード 636756)、Swa I(製品コード 1111A、Smi Iが同等品)、Xho I(製品コード 1094A)、T4 DNA Ligase(製品コード 2011A)、NucleoBond Xtra Midi(製品コード 740410.10/.50/.100)、NucleoSpin Plasmid(製品コード 740588 10/50/250)は、いずれもタカラバイオ(株)より購入した。Pac IはNew England Biolabs社より購入した。
1×TE Buffer(1mMのEDTAを含む10mM Tris-HCl[pH8.0])、100mM Tris-HCl(pH8.0)で飽和したフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、以下、「PCI混液」という。)を調製した。エタノールは、100%及び70%で使用した。ミニスケールでの組換えで使用するpAdeno-X プラスミドDNAの精製用に、以下のバッファー1〜4を調製した。
バッファー2:1%SDSを含む0.2M NaOH(使用直前に用時調製、密封し、室温保存)
バッファー3:5M KOAc(オートクレーブ後、4℃で保存)
バッファー4:1mMのEDTA、20μg/mLのRNaseを含む10mMのTris-HCl(pH8.0)(使用直前にRNaseを添加し、−20℃で保存)
ヒト5型アデノウイルスで形質転換したヒトHEK293細胞(ATCC #CRL1573)を使用した。HEK293細胞は完全培地で培養した。完全培地の組成は、100 unit/mLのペニシリンGナトリウムと100μg/mLのストレプトマイシン、4mMのL-グルタミン及び10%FBSを添加したDMEM(基本培地)とした。ペニシリンGナトリウム溶液は10,000 units/mL、硫酸ストレプトマイシン溶液は10,000μg/mLで調製し、ストック溶液として保存した。
培養には、60mmプレート、100mmプレート、6−ウェルプレート、T75及びT175フラスコを使用した。
β-galアッセイには、X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside [25mg/mL])ジメチルホルムアミド(DMF)溶液は−20℃で遮光保存した。Luminescent β-gal Detection Kit II(製品コード 631712)を使用した。
(3−1)lacZ を含む組換えアデノウイルス(pAdeno-X-lacZ)の構築
10mLの上述した完全培地に、解凍後、DMSOを除去したHEK293細胞を再懸濁し、全量を100mmの培養プレートに移した。HEK293細胞が付着した後に培養液を除去し、細胞を滅菌PBSで1度洗浄し、1mLのトリプシン-EDTA溶液を加えて約2分間処理した。
pShuttle2-lacZ(Adeno-X Expression System 1に含まれている陽性対照ベクター)とキットに含まれているAdeno-X Viral DNA(PI-Sce I及びI-Ceu I digested)とを使用し、キットに添付されているプロトコルに従って、lacZを含む組換えアデノウイルスを構築した。標的細胞であるSHEDに感染させ、β-ガラクトシダーゼの発現をアッセイし、ベクターが構築されていることを確認した。
組換えpShuttle2 Vector(以下、「rpShuttle2 Vector」という。)の構築前に、キットに含まれているpShuttle2 Vector及びpShuttle2-lacZ VectorでDH5α大腸菌を形質転換した。50μg/mLのカナマイシンを含有するLB寒天プレート(以下、「LB/Kan」という。)上で形質転換体を選択し、単一コロニーからとった菌体を新しいLB/Kanに画線し、37℃で一晩インキュベートした。
次いで、hTERT、bmi-1、E6、E7を、pShuttle2へ以下の手順でクローニングした。これらの遺伝子に適した制限酵素でpShuttle2 Vectorを切断した。
次いで、上記のキットに添付されているpShuttle2 Vector Information Packet(PT3416-5)を参照し、挿入するDNAに合致するマルチクローニングサイトを決定した。制限酵素処理済みの上記プラスミドをアルカリホスファターゼで処理して精製した。
形質転換した大腸菌を含む混合液を、LB/Kan寒天プレートに接種し、カナマイシン耐性(Kanr)の形質転換体(コロニー)を選択した。5〜10個のKan耐性クローンを選択し、少量の液体培地に接種して増幅した。これらのクローンがrpShuttle2 Vectorを有していることを確認した後に、一晩インキュベートした。その後、市販のシリカ吸着カラムを用いて、常法に従い、構築されたプラスミドDNAを精製した。
組換えpShuttle2プラスミドDNA(以下、「rpShuttle2プラスミドDNA」という。)をターゲット細胞に直接にトランスフェクトし、ウエスタンブロットを行って目的タンパク質の発現を予備的にチェックした。
上記のようにして作製したrpShuttle2プラスミドDNAから、導入した遺伝子の発現カセットをPI-Sce I及びI-Ceu Iで切り出した。キットに添付されたプロトコルに記載されたin vitroライゲーション法に従って、切り出した発現カセットをAdeno-X Viral DNAに組み込んだ。rpShuttle2プラスミドDNAのPI-Sce I/I-Ceu I二重消化液を30μL調製し、下記の表1に記載した試薬を1.5mLの滅菌済みマイクロ遠心チューブに入れて混合した。
遠心チューブに、上述した二重消化液の残り(25μL)に、70μLの1×TE Buffer(pH8.0)と100μLのPCI混液とを添加し、ボルテックスで十分に撹拌した。次いで、微量遠心機を用いて、4℃にて14,000rpmで5分間遠心し、水層を清浄な1.5mLのマイクロ遠心チューブに移した。ここに、400μLの95%エタノール、25μLの10Mの酢酸アンモニウム、及び1μLのグリコーゲン(20mg/mL)を添加し、ボルテックスで十分に撹拌した。
(4−1)Adeno-X ウイルスゲノムへの発現カセットのサブクローニング
下記の表4に示す試薬を、順番通りに1.5mLの滅菌済マイクロ遠心チューブに入れ、穏やかに混和し、軽く遠心した後に、16℃にて一晩インキュベートした。
4℃にて5分間、14,000rpmで遠心し、上清を吸引により除去してペレットを得た。以下のエタノール沈殿操作は、上記(3−4)と同様に行った。
ペレットが乾燥した後に、これを15μLの滅菌脱イオン水に溶解した。
(4−2)組換えAdeno-X プラスミドDNAのSwa I消化
下記表5に示す消化液を調製し、遠心チューブに入れた各サンプルに加えて、2時間、25℃にて、インキュベートした。
電気的にコンピテントにした大腸菌を、Supercharge EZ10 Electrocompetent Cell(製品コード 636756)を使用して、上記(4−2)で得たSwa I消化産物で形質転換した。
形質転換混合液を、LB培地にアンピシリン(終濃度100μg/mL)を加えた寒天プレート(以下、「LB/Amp寒天プレート」という。)に接種し、37℃で一晩インキュベートして、アンピシリン耐性(Ampr)形質転換体を選択した。約106個のコロニーを得た。得られたコロニーを、製品に付属のAdeno-X System PCR Screening Primer Setでチェックした。
対数増殖にある培養液5mLを、14,000rpmで30秒間遠心し、上清を除去した。ペレットを再度10,000rpmで1分間遠心し、マイクロピペットを用いて、上清を除去した。
ここに、150μLの上記バッファー1を加えて穏やかにピペッティングし、再懸濁した。この細胞懸濁液に、150μLのバッファー2を添加し、穏やかに転倒混和し、氷上に5分間放置した。冷却した細胞懸濁液に、150μLのバッファー3を加えて、再度転倒混和し、氷上に5分間放置した。
この細胞懸濁液を、4℃にて14,000rpmで5分間遠心し、透明な上清を清浄な1.5mLの遠心チューブに移した。この上清に、450μLのPCI混液を添加し、転倒混和して撹拌した。その後、4℃にて14,000rpmで5分間遠心し、水層を清浄な1.5mLのマイクロ遠心チューブに移した。
(5)得られたrAdeno-X プラスミドDNAの制限酵素部位解析
PI-Sce I及びI-Ceu Iを用いて解析を行った。下記の表6に示す試薬を、1.5mLの滅菌済みマイクロ遠心チューブに入れ、30μLのPI-Sce I/I-Ceu I二重消化反応液を加えて、十分に撹拌し、軽く回転させて内容物を集めた。
(6)組換えアデノウイルスの産生
(6−1)HEK293細胞トランスフェクト用rAdeno-X プラスミドDNAの調製
下記表7に示す試薬等を、1.5mLの滅菌済み遠心チューブに入れて混合し、微量遠心機で軽く遠心した。その後、37℃にて2時間、インキュベートし、rAdeno-X プラスミドDNAのPac I制限酵素処理を行った。
以下のエタノール沈殿の操作は、上記(3−4)と同様に操作を行い、ペレットの溶解液は、使用まで−20℃にて保存した。
(6−2)Pac I消化Adeno-X プラスミドDNAのHEK293細胞へのトランスフェクション
上記プラスミドDNAのトランスフェクションの24時間前に、60mmの培養プレートあたりの細胞数が1〜2×106(およそ100 cells/mm2)になるよう、HEK293細胞を接種し、37℃、5%CO2存在下でインキュベートした。
1週間後に、培養プレートの底面や側面に付着している細胞を穏やかに撹拌して遊離させた。得られた細胞懸濁液を15mLの滅菌済みの円錐遠心チューブに移し、室温にて5分間、1,500×gで遠心した。
60mmプレートの培養細胞に250μLの上記ライセートを加えて、培養を続けた。なお、Adeno-X Rapid Titer Kit(製品コード 631028)に含まれる抗Hexon 抗体を用いて、このキットの取扱説明書(PT3651-1)に従い、アデノウイルスの力価を測定した。
この力価測定を始める約24時間前に、HEK293細胞をT75フラスコに接種し、37℃、5%CO2存在下で一夜培養し、50〜70%コンフルエントになっていることを確認した。
翌日、ウイルスを含む新しい培地と交換し、MOI=10で感染させた。37℃、5%CO2存在下で90分間培養した後にフラスコを取り出し、10mLの培地を加えた。
ウェスタンブロッティングを行い、パッケージングされたアデノウイルスゲノムが、目的遺伝子に特異的な転写単位のコピーを、機能する形で持っているかを確認した。
(7−1)標的細胞への感染
感染の24時間前に6−ウェルプレートに1×106個のSHEDを接種した。接種の翌日に培地を取り除き、ウイルスを含む1.0mLの培地を各プレートの中心に添加した。この溶液をSHEDが形成した単層全体に均一に広げた。
37℃、5%CO2存在下で4時間培養し、ウイルスをSHEDに感染させた。次いで、新鮮な培地を添加し、さらに、37℃、5%CO2存在下で培養した。感染24時間後〜48時間後にかけて導入遺伝子の発現を経時的に解析した。
(7−2)感染細胞のβ--ガラクトシダーゼ発現の解析
Adeno-X-lacZを感染させた接着性細胞におけるβ--ガラクトシダーゼの発現は、Luminescent β-galDetection Kit II(製品コード 631712、クロンテック社)を使用してアッセイした。
(1)脱落乳歯歯髄細胞の調製
10歳の健常男児から得られた脱落乳歯を使用した。この脱落乳歯をイソジン溶液で消毒した後、歯科用ダイヤモンドポイントを用いて、歯冠を水平方向に切断し、歯科用リーマーを用いて歯髄組織を回収した。得られた歯髄組織を、3mg/mLのI型コラゲナーゼ及び4mg/mLのディスパーゼの溶液中で37℃にて1時間消化した。ついで、この溶液を70mmの細胞ストレーナ(Falcon社製)を用いて濾過した。
その後、一次培養細胞を上記の培地を用いて約1×104細胞/cm2濃度で継代培養した。1〜3回継代した細胞を実験に用いた。ヒトBMMSCs(Bone Marrow Mesenchymal stem cells、骨髄間葉系幹細胞)はロンザ社から購入し、メーカーの取扱説明書に従って培養した。
ブロモデオキシウリジンBrdU染色キットのメーカー(Invitrogen社製)の取扱説明書に従いBrdUを12時間取り込ませ、SHEDの増殖速度を評価した(各群についてn=3)。実験は5回繰り返した。1元配置分散分析後に、Tukey-Kramer検定を行い、統計的有意差を評価した。
次に、細胞を一次抗体のマウス抗ヒトSTRO-1抗体(1:100、R&D社製)と一緒に1時間インキュベートし、二次抗体のヤギ抗マウス免疫グロブリンM-FITC抗体(1:500、Southern Biotech社製)と一緒に30分間インキュベートし、ベクタシールドDAPI(Vector Laboratories Inc)を用いてマウントした。
その後、15%FBSを添加したα-MEMを6ウェルプレートに入れ、ソートした細胞をクローン作製用に播種した。増殖した細胞の中から約300コロニーを試験用にプールした。
上述したように、bmi-1, E6, E7及びhTERTの4つの遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込み、これらの遺伝子産物を発現するウイルスベクターを作製した。対照として、これらの遺伝子を組み込んでいない対照ベクターを作製した。
SHED-T(遺伝子導入をしたSHED)の個体数の倍加状態を、図5に示した。図中、縦軸は個体数倍化回数(細胞分裂回数)、横軸は時間(培養日数)である。また、培養中のSHEDが1ヶ月間分裂しない状態を、細胞の老化の判断基準とした。
SHED-Cは30回程で増殖が停止し、老化又は増殖停止段階に入った。これに対し、SHED-Tは250PDを超え、800日経過後も増殖した。
単一細胞の懸濁液を得るため、接着性の単層細胞をトリプシン/EDTAで消化した。2x105個の細胞に抗STRO-1モノクローナル抗体(1:100)を加えて放置し、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson社)を使用して分析した。対応するアイソタイプが同一の対照抗体と比較し、99%以上の割合で蛍光レベルが高い場合に発現が陽性とした。SHED-T及びSHED-Cともに、初期及び後期の継代細胞を固定し、FITC結合STRO-1抗体で染色した。その後、フローサイトメトリーで分析した。試験はそれぞれ二回行なった。SHED-CではSTRO-1陽性細胞の割合がPD20で27%であり、PD30では15%まで減少した(図6(A)及び(B))。SHED-TではSTRO-1陽性細胞の割合が、それぞれPD20で46%、PD40で41%であった(図6(C)及び(D))。
PD0、PD10及びPD20におけるSHED-C及びSHED-Tの分化能を、新生骨量の形成能及び組織染色で調べた。
まず、2.0 x 106個のSHED-C又はSHED-Tを、40mgのヒドロキシアパタイト/三カルシウムリン酸(HA/TCP)セラミック粉末(オリンパス工業(株)製)に混合し、10週齢の免疫無防備状態マウス(NIH-bgnu-xid, 雌、Harlan Sprague Dawley社製)の背側表面の皮下に移植した。
移植8週間後に移植物を回収し、4%ホルマリンで固定して脱灰した後、パラフィン包埋するため10%EDTAを含むPBS溶液でバッファリングした。一部は、プラスチック包埋するために70%エタノール溶液中に保存した。
新生骨量=新生骨面積/視野面積×100
図8に示されるように、SHED-Cでは個体数倍加回数が増えるについて新生骨量が減少し、PD20ではPD0の約1/5まで低下した。これに対し、SHED-Tでは、PD20まで新生骨量はほとんど変動がなく、PD20では、SHED-TはSHED-Cの5倍以上の骨を形成したことが示された。
SHED-C及びSHED-T細胞を、免疫無防備状態マウスの皮下組織に、1×106個移植した。移植後、30日以上観察を行ったが、この期間中、上記の細胞を移植したいずれのマウスにおいても、腫瘍は形成されなかった。また、SHED-T細胞では、40〜200PDの培養細胞のすべてのクローンの形態に変化はなかった。
以上より、SHED-Tには、癌化活性はないことが示された。
SEHD-Tは、260PDを超えても分化能力を保ったまま増殖する能力を有していることが示されたが、SHED-Cは、分化能力を有するものの30PD以下で老化した。
以上から、SHED-Tは不死化細胞となっており、活性の高いSHED培養上清の大量生産に適することが示された。
(5)CM固定Tiインプラントスクリューの調製
CM固定Tiインプラントスクリューの調製、細胞接着分析、走査型電子顕微鏡(SEM)によるTiインプラント表面の変化の観察、LC/MS/MSによるTiインプラント表面上のタンパクの同定及びインビトロにおけるSHEDのRNA分析は、上述した実施例1と同様に行った。
(1)インプラント及び外科的手順
Tiインプラント(チタンフィクスチャー)を、既に記載したように(文献番号40)、大腿骨中に挿入した。ラットを、ジエチルエーテル蒸気(3mL/チャンバー)の吸入と、ペントバルビタール(20 mg/kg)の腹腔内投与の組み合わせとにより麻酔した。10mmの切開口を遠位大腿骨を超えて形成し、この骨をむき出しにした。
固定化したQD-修飾CMを有するTiインプラントをトラックし、イメージングシステム(IVIS spectrum, Xenogen社製)を用いて可視化した。ラットを、移植後1日目、7日目、14日目、及び28日目にそれぞれ屠殺し、埋め込んだTiインプラントを有する大腿骨を取り出した。取り出したラットの大腿骨中のTiインプラントと会合した(associated with)QD-ラベルを、イメージングによって検出した。
各ラット及び取り出した大腿骨を、以下の条件でイメージングした:
視野: 13×13cm
暴露時間: 1秒
f-ストップ: 1
バインディング: 8
励起フィルター: 605nm
放射フィルター: 655nm又は検体の高さ: 0.01cm
暴露時間: 2秒
f-ストップ: 1
バインディング: 8,
励起フィルター: 605nm,
放射フィルター: 655nm,
大腿骨インプラントの除去トルク(Ncm)を、インプラント設置後1日、7日、14日及び28日の時点で、実験群ごとに深麻酔下に測定した(各時点においてN=5)。除去トルクを、トルクゲージATG 3 CN(登録商標、測定レンジ:0.1‐3 Ncm;Tohnichi, Tokyo, Japan)及びBTG 15 CN-S(登録商標、測定レンジ:2−15 Ncm;(株)東日製作所製)を用いて測定した。データを有意差レベル5%で、Scheffe検定を用いて、一元配置分析により解析した。
結果を図9に示す。陰性対照群(PBS処理群)と陽性対照群(DMEM処理群)との間では、1日後、及び7日後で有意差が見られたが、14日後には有意差は見られなかった。試験群(CM処理群)では、全ての測定時点で対照群よりも高い値を示し、14日後まで有意差が見られた(*はp<0.05を示す。)。
除去トルク測定後、ラット(各群ともN=5)を深麻酔下に屠殺し、大腿骨インプラントを取り出した。得られた試料を、Technovit 7100(応研商事(株))中に埋め込んだ。各ブロックをインプラントの長軸方向に沿って移動させ、50μm厚の切片を作成し、トルイジンブルーを用いて、通常の方法で染色した。
切片の顕微鏡画像をモニター上に表示してコンピュータ入力し、イメージ分析用ソフトウェア(VMS-50 VideoPro、イノテック(株)製)を用いて分析した。骨接触率は、下記の式によって求めた:
骨接触率(%)=直接移植‐骨接触/ペリインプラント長。
データを有意差レベル5%で、Scheffe検定を用いて、一元配置分析で解析した。結果を図10に示す。
試験群でBICの値が高いことから、骨との一体化が促進されていることが示された。
(1)材料と方法
インプラントは、アストラ社製のチタンインプラント(長さ13mm、直径3.75mm、又は長さ11mm、直径3.75mm)を使用した。
(2)成長因子含有培養上清の調製
実施例1で得た幹細胞の培養上清を用いて成長因子含有溶液を調製し、以下のように処理を行った。
(1)患者等
41歳〜68歳の男性8名の上顎無歯顎に、実施例5で作製したインプラントを移植した。これらの患者には、糖尿病、高血圧その他の骨代謝に影響を与える基礎疾患はなかった。また、飲酒量が多いということもなく、喫煙習慣もなかった。
ある患者では、上顎臼歯部で、上顎洞底との距離が15mm以上残存している部位を埋入部位とした。成長因子で処理したインプラント(処理群)8本を患者の一方側の上顎臼歯部に埋入し、成長因子で処理していないインプラント(無処理群)8本を、同一患者の反対側上顎臼歯部に埋入した。
上記16本のインプラントを埋入した直後(埋入時)、6カ月後、及び12ヶ月後の時点で、オステルモニター(Ostell Mentor, Ostell AB, Grothenburug, Sweden)を用いて、ISQ(Implant Stability Quotient)の変動によって評価した。
ISQ値は、インプラント周囲の骨の高さや質、骨とインプラントの結合力によって変化し、1から100の間の数値で表示される。一般的に、成功したインプラントはISQが65±5の場合に多いといわれている。計測結果を図11に、また、評価を下記表8に示した。図11に示すように、設置時のISQは、対照群及びSHED-CM処理群ともにこの範囲内であった。ISQ値は、いずれの群においても経時的に上昇したが、6月経過時点でSHED-CM処理群が有意に高くなっていた(p<0.05)。この傾向は、12月経過でも同様であった。
(1)材料と方法
実施例1で得た幹細胞の培養上清中のタンパク質を使用し、LC/MS/MS(MS4 HPLC System (Michrom BioResources社製)とLCQ Advantage mass spectrometry system (Thermo Scientific社製)で同定した。
測定条件は、下記の通りとした。
カラム:Magic C18AQ(Michrom BioResources社製、0.1mm(i.d.)x50cm)
溶離液:溶液A(2% アセトニトリル−98% 水(0.1% 蟻酸含有))、溶液B(90% アセトニトリル−10% 水(0.1%蟻酸含有)をグラジエントさせた(0分, 95% A:5% B→45分, 0% A:100% B)。
流速:1μL/分
MS1:LCQ Advantage mass spectrometry system (Thermo Scientific社製)
MS2:LCQ Advantage mass spectrometry system (Thermo Scientific社製)
培養上清は、100%エタノール、90%エタノールを用いてエタノール沈殿をさせた後に凍結乾燥し、タンパク量が2μg/mLになるように調製した。タンパク量は、ブラッドフォード法にて測定した。
分析結果を表9に示す。
(1)材料
実施例1で得た幹細胞の培養上清を試料とし、陰性対照としてPBSを使用した。
(2)細胞の接着性に対する影響
直径15mm純チタン板に、イヌ骨髄間質細胞(年齢18-25ヶ月、体重15-25kgのビーグル犬の腸骨より骨髄液を10mL採取し、10%FBS及び50〜150U/mLのペニシリン、50〜150μg/mLのストレプトマイシンを含むDMEM培地を用いて、5%CO2インキュベータ中にて、37℃で3代予備培養したもの)を1.5〜3x105個/ウェルで播種(n=3)し、培養上清の有無による細胞の接着性の影響、及びプラズマ処理の影響を調べた。
N-PBS群とP-CM群では、24時間後の接着細胞数に有意差が見られた(p<0.01)。また、P-PBS群とP-CM群との間にも、有意差が見られた(p<0.05)。
また、24時間後における細胞の付着状態を、DAPIとファロイジンとを用いて蛍光染色し、250倍で、蛍光顕微鏡(励起波長:358nm(DAPI), 560nm(ファロイジン)、測定波長:465nm(DAPI), 575nm(ファロイジン)、A1+(Nikon社製)で観察した。
結果を図13に示す。図13に示すように、細胞の増殖状況は、N-CM群及びP-CM群で、明らかに多くなっていた。
上記の培養上清を、1mLずつプラスチック製のネジ口チューブ(容量2mL、コーニング社製)に分注し、それぞれ、4℃、-15℃、及び-80℃で1週間、2週間及び1ヶ月保存した。
この影響を、ブロモウリジンアッセイで確認した。アッセイキットとして、BrdUラベリング&ディテクションキットII(ロシュ アプライドサイエンス社製)を使用し、添付された使用説明書に従ってアッセイを行った。
実施例1と同様にして得た間葉系幹細胞を、1x106個/ウェルで96ウェルプレートに播種した。上記のように保存した培養上清を100μL/ウェルで添加し、5%CO2インキュベータ中にて、37℃で24時間培養し、この幹細胞の増殖を観察し、増殖率を求めた。結果を図14に示す。
以上から、培養上清の保存期間は、−80℃で凍結保存した場合には1ヶ月、−15℃の場合には1ヶ月、4℃の場合には2週間と考えられる。
配列番号2:ALP用リバースプライマー
配列番号3:OCN用フォーワードプライマー
配列番号4:OCN用リバースプライマー
配列番号5:OPN用フォーワードプライマー
配列番号6:OPN用リバースプライマー
配列番号7:BSP用フォーワードプライマー
配列番号8:BSP用リバースプライマー
配列番号9:Collagen 1用フォーワードプライマー
配列番号10:Collagen 1用リバースプライマー
配列番号11:GAPDH用フォーワードプライマー
配列番号12:GAPDH用リバースプライマー
配列番号13:コラーゲンα-1 (I) 鎖プリカーサー
配列番号14:コラーゲンα-1 (II) 鎖プリカーサー
配列番号15:コラーゲンα-1 (XXVII) 鎖プリカーサー
配列番号16:コラーゲンα-2 (I) 鎖プリカーサー
配列番号17:フィブロネクチン
配列番号18:フィブロネクチン
配列番号19:デコリン
配列番号20:デコリン
配列番号21:オステオカルシン
配列番号22:オステオポンチン
配列番号23:骨シアロタンパク質 2
配列番号24:血管上皮成長因子 A
Claims (11)
- チタン、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、及びβ‐TCPからなる群から選ばれるいずれかの材料で形成されたインプラント材の表面をアセトンと60〜80%エタノールとを含む有機溶媒で洗浄し、洗浄インプラント材とする洗浄工程と;
前記洗浄インプラント材を、所定の組成を有する第1石灰化溶液中に所定の温度で3〜6時間浸漬し、浸漬インプラント材とする浸漬工程と;
前記浸漬インプラント材を、骨髄間質細胞又は不死化乳歯幹細胞から得られた所定の濃度の細胞産生物を含有する第2石灰化溶液で2〜5日間インキュベート処理する処理工程と;を備え、
前記第1石灰化溶液の組成は、100〜150 mM NaCl, 2.5〜3.5 mM CaCl 2 ・H 2 O, 1.5〜2.5 mM K 2 HPO 4 , 25〜75 mM Tris-HCl(pH 7.2〜7.6)であり、
前記第2石灰化溶液の組成は、130〜160 mM KNO 3 , 1〜2 mM Ca(NO 3 ) 2 ・4H 2 O, 0.5〜1.5 mM K 2 HPO 4 (pH 7.0〜7.8)であり、前記細胞産生物として、少なくとも、I型コラーゲン(Col-I)、フィブロネクチン、デコリン及び血管内皮増殖因子(VEGF)を含む
ことを特徴とする、高機能インプラントの作成方法。 - 前記骨髄間質細胞は、ラットの大腿骨、ブタ歯髄、及びヒト乳歯からなる群から選ばれるいずれかの細胞に由来するものであることを特徴とする、請求項1に記載の高機能インプラントの作成方法。
- 前記細胞産生物には、インスリン様成長因子結合タンパク質7、フォリスタチン関連タンパク質、メタロプロテイナーゼインヒビターI、組織プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、アクチン、及びスルフヒドリルオキシダーゼIがさらに含まれることを特徴とする、請求項1又は2に記載の高機能インプラントの作成方法。
- 前記細胞産生物には、SPARC、コラーゲンα2(IV)鎖、β-2-ミクログロブリン、Rho GTPase活性化タンパク質18がさらに含まれることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の高機能インプラントの作成方法。
- 前記第1石灰化溶液の組成は、100〜150 mM NaCl, 2.5〜3.5 mM CaCl2・H2O, 1.5〜2.5 mM K2HPO4, 25〜75 mM Tris-HCl(pH 7.2〜7.6)であり;第2石灰化溶液の組成は、130〜160 mM KNO3, 1〜2 mM Ca(NO3)2・4H2O, 0.5〜1.5 mM K2HPO4(pH 7.0〜7.8)であり、前記細胞産生物として、少なくとも、I型コラーゲン(Col-I)、フィブロネクチン、デコリン及び血管内皮増殖因子(VEGF)を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の高機能インプラントの作成方法。
- 前記第1石灰化溶液の組成は、136.8 mM NaCl, 3.10 mM CaCl2・H2O, 1.86 mM K2HPO4, 50 mM Tris-HCl(pH 7.4)であり;第2石灰化溶液の組成は、142.8 mM KNO3, 1.5 mM Ca(NO3)2・4H2O, 0.9 mM K2HPO4(pH 7.4)であり、前記細胞産生物として、少なくとも、I型コラーゲン(Col-I)、フィブロネクチン、デコリン及び血管内皮増殖因子(VEGF)を含むことを特徴とする、請求項5に記載の高機能インプラントの作成方法。
- 前記所定の温度が36〜38℃であり、浸漬時間が4時間であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の高機能インプラントの作成方法。
- 前記所定の濃度の細胞産生物は、5〜20mg/mLの濃度であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の高機能インプラントの作成方法。
- チタン、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、及びβ‐TCPからなる群から選ばれるいずれかの材料で形成されたインプラント材を用いて、請求項1〜8のいずれかに記載の方法で作成した、高機能インプラント。
- 少なくとも、I型コラーゲン(Col-I)、フィブロネクチン、及びデコリンを表面に保有することを特徴とする、請求項9に記載の高機能インプラント。
- インスリン様成長因子結合タンパク質7、フォリスタチン関連タンパク質、メタロプロテイナーゼインヒビターI、組織プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、アクチン、及びスルフヒドリルオキシダーゼIからなる群から選ばれる少なくとも1以上のタンパク質をさらに表面に有することを特徴とする、請求項9又は10に記載の高機能インプラント。
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