CN111701071B - 一种骨修复支架材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种骨修复支架材料及其制备方法和应用，该骨修复支架材料呈纤维状支架结构，所述骨修复支架材料由负载有OOB融合蛋白的掺镁介孔生物活性玻璃组成；所述OOB融合蛋白由OCN、OPN以及BGN连接而成；该制备方法包括制备掺镁介孔生物活性玻璃、获得OOB融合蛋白、负载以及静电纺丝。本发明提供的骨修复支架材料的骨修复性能优异，且可为骨修复过程提供长效的供给；本发明提供的制备方法可成功制备获得包含OCN、OPN以及BGN三种蛋白的骨修复支架材料，该骨修复支架材料可应用于临床骨缺损修复中。

Description

一种骨修复支架材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种骨修复支架材料及其制备方法和应用。
背景技术
介孔生物活性玻璃是孔径介于2～50nm的多孔材料，主要含有硅、钙以及磷元素，其具备规则的孔道结构、巨大的比表面积及孔容，能够提供细胞粘附和物质交换的场所，从而有利于细胞的增殖。其次，巨大的比表面积有利于基质结节矿化，从而在骨修复方面具有很大的潜力。研究发现，生物活性玻璃在成骨诱导活性上具有显著的促进作用，因此其在骨修复方面引起了极大的关注。
骨基质中促进成骨作用的主要是有机成分，具体为由成骨细胞分泌到骨基质中的基质蛋白，如：OCN、Collagen、BMP、OPN等蛋白。然而，现阶段的骨修复材料中加入的促进成骨作用的有机成分仅为某一个蛋白，显然不能满足患者对骨修复速度的要求。
发明内容
本发明提供一种骨修复支架材料及其制备方法和应用，用于克服现有技术中的骨修复材料仅包含一种蛋白使得骨修复速度不能满足患者需求等缺陷。
为实现上述目的，本发明提出一种骨修复支架材料，所述骨修复支架材料呈纤维状支架结构，所述骨修复支架材料由负载有OOB融合蛋白的掺镁介孔生物活性玻璃组成；所述OOB融合蛋白由OCN、OPN以及BGN连接而成。
为实现上述目的，本发明还提出骨修复支架材料的制备方法，所述制备方法包括：
S1：将扩孔剂加入结构导向剂的酸性溶液中，加入镁源、钙源、硅源和磷源，在40～50℃下搅拌至形成均匀的混合液，调整所述混合液的pH值至碱性，在90～110℃下静置得到沉淀，洗涤所述沉淀至pH为7～7.4，在100～150℃下烘烧所述沉淀6～10h后，在500～600℃下煅烧6～8h，得到掺镁介孔生物活性玻璃；
S2：去除OPN蛋白的信号肽，去除BGN蛋白的信号肽并保留所述BGN蛋白的核心蛋白序列，将处理后的OPN蛋白的基因序列和BGN蛋白的基因序列与OCN蛋白的基因序列连接在一起，获得OOB蛋白基因序列模板；根据所述OOB蛋白基因序列模板，利用基因工程得到包含OCN、OPN以及BGN的OOB融合蛋白基因序列；利用宿主大肠杆菌菌株对所述OOB融合蛋白基因序列进行表达，获取单克隆，对所述单克隆进行多次培养，离心收集菌液，分离、纯化、浓缩，获得OOB融合蛋白；
S3：将步骤S2获得的OOB融合蛋白负载到步骤S1获得的掺镁介孔生物活性玻璃中，搅拌1～2h，置于4℃冰箱静置吸附24～48h，离心取沉淀，得到纺丝原料；
S4：取4～6g聚(ε己内酯)加入到50mL六氟异丙醇溶液中，搅拌，得到纺丝溶液，将步骤S3获得的纺丝原料以5～15mg/mL的比例加入到所述纺丝溶液中，搅拌、超声获得混合液，对所述混合液进行静电纺丝，得到骨修复支架材料。
为实现上述目的，本发明还提出一种骨修复支架材料的应用，将如上述所述的骨修复支架材料或者上述所述的制备方法制备得到的骨修复支架材料应用在临床骨缺损修复中。
与现有技术相比，本发明的有益效果有：
1、本发明提供的骨修复支架材料呈纤维状支架结构，所述骨修复支架材料由负载有OOB(OCN-OPN-BGN)融合蛋白的掺镁介孔生物活性玻璃组成；所述OOB融合蛋白由OCN、OPN以及BGN连接而成。骨基质在结构上为纳米纤维状网格，为成骨细胞增殖、分化、骨基质矿化提供有利的结构，本发明的骨修复支架材料高度模拟了骨基质的结构，为骨缺损部位的细胞提供适合的微环境；介孔生物活性玻璃在掺杂镁元素后，使得其能够模拟细胞外基质的主要元素成分，有利于骨细胞的生长，此外镁元素的加入给规整的介孔生物活性玻璃结构引入缺损，有利于各种元素的释放以及介孔生物活性玻璃的降解，从而发挥骨诱导活性，并为骨组织增生提供必要空间；OOB融合蛋白模拟了骨基质中的主要有机成分，为成骨细胞的生长提供了主要的有机成分，OOB融合蛋白中的OCN以及OPN蛋白能够形成编织状的网络结构，从而促进钙离子的沉积、细胞外基质的矿化过程，BGN是蛋白聚糖，其核心蛋白可连接两条长长的糖链，该糖链可以招募基质中的Collagen、BMP等蛋白，Collagen、BMP等蛋白可以促进骨基质中的无机成分钙、磷等的沉积，同时其核心蛋白作为结晶核可促进无机成分沉积，从而促进骨基质的矿化及骨修复过程；此外，掺镁介孔生物活性玻璃的介孔结构可以缓释吸附于其中的OOB融合蛋白，为骨修复过程提供长效的供给。因此，本发明提供的骨修复支架材料的骨修复速度能够很好地满足患者需求。
2、本发明提供的骨修复支架材料的制备方法，首先通过制备掺镁介孔生物活性玻璃，为成骨细胞的生长提供了主要的元素成分；然后通过对OPN蛋白以及BGN蛋白进行信号肽去除的预处理，以将OCN、OPN以及BGN三种蛋白融合在一起最终获得OOB融合蛋白。掺镁介孔生物活性玻璃对蛋白的吸附具有偏向性，如该掺镁介孔生物活性玻璃对OCN蛋白的吸附性最强，则其将优先吸附OCN蛋白，这将导致对其他蛋白的吸附效果差甚至不吸附，因此本发明通过对OPN蛋白以及BGN蛋白进行预处理以获得OOB融合蛋白，以使得掺镁介孔生物活性玻璃能均匀吸附到OCN、OPN以及BGN三种蛋白，从而有效提高制备获得的骨修复支架材料的骨修复性能；接着将OOB融合蛋白负载到掺镁介孔生物活性玻璃中，获得纺丝原料；最后通过静电纺丝生产出纳米级直径的聚合物细丝，静电纺丝制备的支架具有独特的微观结构和适当的力学性能，可以模拟天然骨基质的编织状的网格结构促进骨修复。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1a为对比例1制得的MBG(Ca/Mg 1:0)的扫描电镜图；
图1b为实施例1制得的Mg-MBG(Ca/Mg3:1)的扫描电镜图；
图2a为对比例1制得的MBG(Ca/Mg 1:0)的氮气吸附-脱附等温曲线图；
图2b为实施例1制得的Mg-MBG(Ca/Mg3:1)的氮气吸附-脱附等温曲线图；
图3为实施例1制得的OOB融合蛋白检测图；
图4a为MBG(Ca/Mg 1:0)支架的扫描电镜图；
图4b为Mg-MBG(Ca/Mg3:1)支架的扫描电镜图；
图4c为骨修复支架的扫描电镜图；
图5为Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架和MBG(Ca/Mg 1:0)支架的小角度X射线衍射图；
图6为Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架和MBG(Ca/Mg 1:0)支架的大角度X射线衍射图；
图7为Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及骨修复(Mg-MBG-OOB)支架的红外光谱图；
图8a为MBG(Ca/Mg 1:0)支架在体外SBF溶液中体外矿化的扫描电镜图；
图8b为Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架在体外SBF溶液中体外矿化的扫描电镜图；
图8c为骨修复支架在体外SBF溶液中体外矿化的扫描电镜图；
图9为Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及骨修复支架对MC3T3-E1的增殖影响图；
图10为Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及骨修复支架对MC3T3-E1的分化影响图；
图11a为MBG(Ca/Mg 1:0)支架对MC3T3-E1的矿化影响图；
图11b为Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架对MC3T3-E1的矿化影响图；
图11c为骨修复支架对MC3T3-E1的矿化影响图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
无特殊说明，所使用的药品/试剂均为市售。
本发明提出一种骨修复支架材料，所述骨修复支架材料呈纤维状支架结构，所述骨修复支架材料由负载有OOB融合蛋白的掺镁介孔生物活性玻璃组成；所述OOB融合蛋白由OCN、OPN以及BGN连接而成。
本发明提供的骨修复支架材料呈纤维状支架结构，所述骨修复支架材料由负载有OOB(OCN-OPN-BGN)融合蛋白的掺镁介孔生物活性玻璃组成；所述OOB融合蛋白由OCN、OPN以及BGN连接而成。骨基质在结构上为纳米纤维状网格，为成骨细胞增殖、分化、骨基质矿化提供有利的结构，本发明的骨修复支架材料高度模拟了骨基质的结构，为骨缺损部位的细胞提供适合的微环境；介孔生物活性玻璃在掺杂镁元素后，使得其能够模拟细胞外基质的主要元素成分，有利于骨细胞的生长，此外镁元素的加入给规整的介孔生物活性玻璃结构引入缺损，有利于各种元素的释放以及介孔生物活性玻璃的降解，从而发挥骨诱导活性，并为骨组织增生提供必要空间；OOB融合蛋白模拟了骨基质中的主要有机成分，为成骨细胞的生长提供了主要的有机成分，OOB融合蛋白中的OCN以及OPN蛋白能够形成编织状的网络结构，从而促进钙离子的沉积、细胞外基质的矿化过程，BGN是蛋白聚糖，其核心蛋白可连接两条长长的糖链，该糖链可以招募基质中的Collagen、BMP等蛋白，Collagen、BMP等蛋白可以促进骨基质中的无机成分钙、磷等的沉积，同时其核心蛋白作为结晶核可促进无机成分沉积，从而促进骨基质的矿化及骨修复过程；此外，掺镁介孔生物活性玻璃的介孔结构可以缓释吸附于其中的OOB融合蛋白，为骨修复过程提供长效的供给。因此，本发明提供的骨修复支架材料的骨修复速度能够很好地满足患者需求。
本发明还提出一种骨修复支架材料的制备方法，所述制备方法包括：
S1：将扩孔剂加入结构导向剂的酸性溶液中，加入镁源、钙源、硅源和磷源，在40～50℃下搅拌至形成均匀的混合液，调整该混合液的pH值至碱性(在碱性条件下可以提高得到的介孔材料的孔道有序度，并保持一定的稳定性)，在90～110℃下(在此温度下，室温中卷曲的碳链会伸直并膨胀体积，造成胶束的直径增加，从而孔径尺寸增加)静置得到沉淀(进一步反应晶化，形成凝胶)，洗涤该沉淀至pH为7～7.4(洗涤的目的在于除去吸附或裹挟的杂质及溶剂，pH在此作为标志，若达到中性环境，则杂质或溶剂即清洗干净)，在100～150℃下烘烧该沉淀6～10h后(将其干燥，在该温度恒温一段时间，有利于结构导向剂分解成有机小分子，从而挥发掉，避免积碳现象，最后的介孔材料就是白色的，否则由于有机物碳化，最后的介孔材料为黑色)，在500～600℃下煅烧6～8h(去除有机结构导向剂成分)，得到掺镁介孔生物活性玻璃；
所用镁源、钙源、硅源和磷源可以为现有骨修复材料中常用的无机物。
S2：去除OPN蛋白的信号肽，去除BGN蛋白的信号肽并保留所述BGN蛋白的核心蛋白序列(OPN及BGN蛋白的信号肽在OPN和BGN蛋白从细胞膜中分泌的时候已经切掉，也就是说在细胞质基质中的OPN及BGN蛋白是不含有信号肽序列的，因此，为了更加真实的模拟细胞质基质中的蛋白，在构建融合蛋白序列的时候将其信号肽序列去除)，将处理后的OPN蛋白的基因序列和BGN蛋白的基因序列与OCN蛋白的基因序列连接在一起，获得OOB蛋白基因序列模板；根据所述OOB蛋白基因序列模板，利用基因工程得到包含OCN、OPN以及BGN的OOB融合蛋白基因序列；利用宿主大肠杆菌菌株对所述OOB融合蛋白基因序列进行表达，获取单克隆，对所述单克隆进行多次培养，离心收集菌液，分离、纯化、浓缩，获得OOB融合蛋白；
S3：将步骤S2获得的OOB融合蛋白负载到步骤S1获得的掺镁介孔生物活性玻璃中，搅拌1～2h，置于4℃冰箱静置吸附24～48h，离心取沉淀，得到纺丝原料；
充分搅拌以使OOB融合蛋白均匀分散在掺镁介孔生物活性玻璃上，便于掺镁介孔生物活性玻璃对OOB融合蛋白的均匀吸附。
4℃静置吸附24～48h，以使掺镁介孔生物活性玻璃尽可能多的吸附OOB融合蛋白，达到吸附饱和。S4：取4～6g聚(ε己内酯)(PCL)加入到50mL六氟异丙醇溶液中，搅拌，得到纺丝溶液，将步骤S3获得的纺丝原料以5～15mg/mL(如果原料太少，骨修复材料及缓释的OOB蛋白太少，达不到骨修复的目的，如果原料太多，则在纺丝液中就增大了纺丝液的浓度，容易把纺丝设备中的针头堵塞，导致无法纺丝)的比例加入到所述纺丝溶液中，搅拌、超声获得混合液，对所述混合液进行静电纺丝，得到骨修复支架材料。
聚(ε己内酯)与六氟异丙醇为常用的纺丝溶液制备剂，容易获得且纺丝效果佳。
静电纺丝是一种特殊的纤维制造工艺，聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝，可以生产出纳米级直径的聚合物细丝。静电纺丝制备的支架具有独特的微观结构和适当的力学性能，可高度模拟天然骨基质的编织状的网格结构，从而促进骨修复。因此，静电纺丝的仿骨基质的微观结构为骨缺损部位的细胞提供适合的微环境，采用静电纺丝的支架结构是实现高效骨修复的有效途径。
优选地，所述步骤S1具体包括：
将4～6g结构导向剂溶解在200～300mL水中，采用浓HCl调节溶液pH值为1～2(HCl的存在起催化作用，TEOS(正硅酸乙酯)在此强酸性的条件下可加速水解，生成更多的硅酸根离子；其次，HCl为反应体系提供了Cl-作为过渡离子，并促进硅酸根离子的聚合；再次，HCl的加入导致电解质浓度较高时，介孔孔道有序度提高。)，加入5～7g扩孔剂，搅拌均匀，加入硝酸镁、硝酸钙(选择为无机可溶的镁盐和钙盐)、6～10mL正硅酸乙酯(TEOS)(以TEOS为硅源可得到大孔径的囊泡或泡沫结构)以及2～3.5g磷酸三乙酯(TEP)(选择的磷源为有机磷酸酯)，在40～50℃下搅拌20～24h，采用浓氨水调整pH至9～11(添加铵盐和调节pH值可以提高在碱性合成条件下得到的介孔的孔道有序度，并保持相当的稳定性)，将溶液加入反应釜中后，在90～110℃下静置56～80h得到沉淀，将所述沉淀在8000～10000rpm的条件下离心15min，去上清，采用去离子水洗涤所述沉淀数次至pH7～7.4，在100～150℃的烘箱中进行烘烧6～10h后，将沉淀放入马弗炉中以1℃/min的升温速率(尽量除去有机成分，同时又要保证介孔材料的孔结构在热处理过程中不致坍塌而遭到破坏，因此采用缓慢升温的方式来去除样品中的有机成分)从室温升温至500～600℃并在500～600℃下煅烧6～8h，得到掺镁介孔生物活性玻璃(Mg-MBG)。
在40～50℃下搅拌20～24h，以获得形成均匀的混合液。
优选地，所述结构导向剂为三嵌段聚合物P123(PEO20-PPO70-PEO20)、F127(EO106-PO70-EO106)以及十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基磺酸钠、十六烷基三甲溴化铵-四甲基氢氧化胺中的一种；
不同的结构导向剂对孔径的大小具有调节作用，结构导向剂的浓度不同将影响结构导向剂的聚集态结构，最终导致产物介孔结构的不同，由嵌段共聚物为结构导向剂得到的有序介孔材料的孔径尺寸要比由低分子量结构导向剂体系大。
所述扩孔剂为1,3,5-均三甲苯(TMB)、聚乙二醇、三异丙基苯(TIPB)以及二甲苯中的一种。
选择合适的扩孔剂以使获得的掺镁介孔生物活性玻璃增大介孔孔径的尺寸，以吸附更多的OOB融合蛋白。扩孔剂的疏水性可以在结构导向剂胶束的憎水部分达到增溶效果，从而使胶束膨胀。通过使用扩孔剂就可以连续地增大有序介孔材料的孔径尺寸。合适的扩孔剂可以使结构导向剂形成更大的胶束来得到具有大孔径的有序介孔材料。
优选地，所述镁源中的镁与所述钙源中的钙的摩尔比为1：3。控制镁元素与钙元素的比例以使最终制备获得的骨修复支架材料的体外矿化能力最佳。
优选地，所述步骤S2具体包括：
S21：去除OPN蛋白的信号肽，去除BGN蛋白的信号肽并保留所述BGN蛋白的核心蛋白序列，将处理后的OPN蛋白的基因序列和BGN蛋白的基因序列与OCN蛋白的基因序列连接在一起，获得OOB蛋白基因序列模板，在所述OOB蛋白基因序列模板的最后添加终止子(添加终止子之后，就可以得到表达完整的OOB融合蛋白，如果没有终止子，转录时mRNA会按照连接质粒上的基因序列继续转录，那么根据mRNA翻译的蛋白则是在OOB融合蛋白后还有一段蛋白序列的蛋白)；
S22：根据所述OOB蛋白基因序列模板，对宿主大肠杆菌菌株进行密码子优化，以实现对OOB蛋白基因序列模板更好的表达；
S23：根据所述OOB蛋白基因序列模板，利用基因工程得到包含OCN、OPN以及BGN的OOB融合蛋白基因序列；
S24：将所述OOB融合蛋白基因序列克隆到表达质粒中，并将所述表达质粒转化入所述宿主大肠杆菌菌株中；
S25：将所述宿主大肠杆菌菌株平铺在具有氨苄青霉素抗性培养基的培养皿上，并在培养皿上挑取单克隆，对所述单克隆进行多次培养，离心收集菌液，分离、纯化、浓缩，获得OOB融合蛋白。
优选地，所述步骤S25具体包括：
S251：将所述宿主大肠杆菌菌株平铺在具有氨苄青霉素抗性培养基的培养皿上，并在培养皿上挑取单克隆；
S252：将所述单克隆在3mL的37℃含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中培养至OD600值为0.5-0.7，转至25mL的37℃含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中培养至OD600值为0.5-0.7，再转至2L的37℃含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中培养至OD600值为0.5-0.7，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，大肠杆菌中的基因表达采用的是乳糖操纵子作为启动子的模型，需要乳糖进行诱导，才可以启动表达，但乳糖可以被细胞很快利用掉，需要不断补充。IPTG在结构上与乳糖相似，也可以将基因表达启动，但大肠杆菌不能消耗掉IPTG，因此达到持续表达的目的。)并在37℃下培养7～9h；
分别用3mL、25mL和2L的37℃含有氨苄青霉素抗性的LB培养基培养单克隆，以使大肠杆菌在生长旺盛，菌体活力强盛的对数生长期，也就是在生命力最旺盛的阶段。
S253：将培养液在4000～6000rpm条件下离心20～40min，收集菌液，采用100～150mL的磷酸缓冲盐溶液进行重悬，超声破碎重悬菌液，将破碎菌液在12000rpm的条件下离心30min，取上清液；将所述上清液过镍柱，采用40～50mM咪唑15mL对镍柱进行洗脱，再采用200mM咪唑15mL对镍柱进行洗脱，收集流穿液，将所述流穿液透析24～48h，将透析液在超滤管中以4000rpm的条件离心30min，得到浓缩纯化后的OOB融合蛋白。
优选地，所述步骤S3具体包括：
将100～300μg步骤S2获得的OOB融合蛋白负载到20mg步骤S1获得的掺镁介孔生物活性玻璃中，搅拌1～2h，置于4℃冰箱静置吸附24～48h，在12000rpm条件下离心5min，取沉淀，得到纺丝原料。
优选地，所述步骤S4中，对所述混合液进行静电纺丝具体包括：
在18～22kV的高压直流电场下，利用数字注射泵控制所述混合液的流速为0.60～0.85mL/h、温度为25℃、相对湿度为44％，进行静电纺丝。选择合适的静电纺丝条件以获得以与天然骨基质结构更相似的仿骨基质，从而为骨缺损部位的细胞提供适合的微环境。
本发明还提出一种骨修复支架材料的应用，将如上述所述的骨修复支架材料或者上述所述的制备方法制备得到的骨修复支架材料应用在临床骨缺损修复中。
实施例1
本实施例提供一种骨修复支架材料的制备方法，包括：
将5g结构导向剂PEO20-PPO70-PEO20(P123)完全溶解在300mL水中，采用浓HCl调节溶液pH值为1，加入7g扩孔剂1,3,5-均三甲苯(TMB)，搅拌4h直至均匀，再加入硝酸镁、硝酸钙、10mL正硅酸乙酯(TEOS)、2.6g磷酸三乙酯(TEP)，其中硝酸镁与硝酸钙中镁与钙的摩尔比为(1：3)，在40℃下搅拌24h后，采用浓氨水调整pH至10，将溶液加入反应釜中后，在90℃下静置80h得到沉淀。将所得沉淀在10000rpm的条件下离心，去上清，采用去离子水洗涤沉淀数次至pH7，再在100℃烘箱中进行烘烧10h，之后将沉淀放入马弗炉中500℃煅烧8h，得到掺镁介孔生物活性玻璃(Mg-MBG)。
去除OPN蛋白的信号肽，去除BGN蛋白的信号肽并保留所述BGN蛋白的核心蛋白序列，将处理后的OPN蛋白的基因序列和BGN蛋白的基因序列与OCN蛋白的基因序列连接在一起，获得OOB蛋白基因序列模板，在所述OOB蛋白基因序列模板的最后添加终止子；根据所述OOB蛋白基因序列模板，对宿主大肠杆菌BL21菌株进行密码子优化；根据所述OOB蛋白基因序列模板，利用基因工程得到包含OCN、OPN以及BGN的OOB融合蛋白基因序列；将所述OOB融合蛋白基因序列克隆到表达质粒pUC57中，并将所述表达质粒pUC57转化入所述BL21菌株中；将所述BL21菌株平铺在培养基上，并在培养皿上挑取单克隆，将所述单克隆在3mL的37℃含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中培养至OD600值为0.6，转至25mL的37℃含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中培养至OD600值为0.6，再转至2L的37℃含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中培养至OD600值为0.6，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)并在37℃下培养8h；将培养液在5000rpm条件下离心30min，收集菌液，采用100mL的磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行重悬，超声破碎重悬菌液(超声总共进行10min，其中每工作5s后需暂停10s(如果连续超声，则温度会一直升高，高温会将蛋白变性)，将破碎菌液在12000rpm的条件下离心30min，取上清液；将所述上清液过镍柱(Ni-NTA柱)，采用50mM咪唑15mL对镍柱进行洗脱，再采用200mM咪唑15mL对镍柱进行洗脱，收集流穿液，将所述流穿液透析48h，将透析液在超滤管中以4000rpm的条件离心30min，得到浓缩纯化后的OOB融合蛋白。
将200μg OOB融合蛋白负载到20mg掺镁介孔生物活性玻璃(Mg-MBG)中，搅拌1.5h，置于4℃冰箱静置吸附36h，在12000rpm条件下离心5min，取沉淀，得到纺丝原料(Mg-MBG-OOB)。
取5g聚(ε己内酯)加入到50mL六氟异丙醇溶液中，搅拌，得到纺丝溶液，将纺丝原料(Mg-MBG-OOB)以8mg/mL的速率加入到所述纺丝溶液中，搅拌、超声获得混合液，在20kV的高压直流电场下，利用数字注射泵控制所述混合液的流速为0.75mL/h、温度为25℃、相对湿度为44％，进行静电纺丝，获得骨修复支架材料。
对比例1
本对比例提供一种骨修复支架材料的制备方法，与实施例1相比，本对比例中硝酸镁与硝酸钙中镁与钙的摩尔比为(0：1)，其他过程同实施例1。
实施例1与对比例1制备的骨修复支架材料的表征测量及结果如下：
1、Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)与MBG(Ca/Mg 1:0)扫描电镜表征；
将实施例1制得的Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)以及对比例1制得的MBG(Ca/Mg 1:0)喷金30s，开启系统后，将待测样品放入样品室后关闭样品室抽真空进行观察。结果如图1所示，MBG(Ca/Mg 1:0)和Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)均具有均匀、规则的微纳米结构，相比之下，MBG(Ca/Mg 1:0)比Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)具有更加规则的微观结构。
2、Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)与MBG(Ca/Mg 1:0)氮气吸附-脱附等温曲线表征；
Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)与MBG(Ca/Mg 1:0)的介孔结构通过氮气吸附-脱附等温曲线来确定。由图2可知，在p/po中的0.8～1.0区域范围内，MBG(Ca/Mg 1:0)的吸附体积具有明显变化，说明MBG(Ca/Mg 1:0)的孔径大小在介孔范围内，通过测量其孔径为13.64nm，在p/po中的0.5-1.0区域范围内，Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)的吸附体积具有明显变化，说明MBG(Ca/Mg3:1)的孔径大小在介孔范围内，通过测量其孔径为9.54nm。因此，MBG(Ca/Mg 1:0)和Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)具有介孔材料的性质，为之后负载及缓释蛋白分子奠定了基础。
3、OOB融合蛋白检测；
从OOB融合蛋白的表达、分离、纯化、浓缩以及最终通过SDS-PAGE、蛋白电泳以及考马斯亮蓝染色，确认分离、纯化的蛋白为高纯度的蛋白质，通过western blotting的方法检测OOB融合蛋白后面的标签蛋白His，确认分离、纯化的蛋白质为OOB融合蛋白，结果如图3所示。
4、Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架(Mg-MBG-OOB支架即骨修复支架材料)的扫描电镜表征；
将Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)、MBG(Ca/Mg 1:0)以及Mg-MBG-OOB经过静电纺丝得到纤维状支架结构，即得到Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架。通过扫描电子显微镜观察发现，Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架均具有均匀的纤维网络结构，纤维的直径分布在250nm左右，整体的空间连通，适合细胞的粘附与迁移(如图4所示)。
通过元素分布图(Mapping)对Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架的元素含量和分布进行表征，表征发现三种材料中的Mg-MBG或者MBG都均匀分布在纤维之中，且各个元素的分布状况基本一致，表明Mg-MBG或者MBG在静电纺丝过程中稳定存在。
5、Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架和MBG(Ca/Mg 1:0)支架的X射线衍射表征；
Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架和MBG(Ca/Mg 1:0)支架的晶体组成通过X-射线衍射进行测定，采用压片法制片，小角角度0.8°-4°，广角角度15°-80°进行测试。从小角度XRD衍射分析图中可知(图5)，由于Mg元素的加入，介孔材料固有的衍射峰消失(100，110，200)，从大角度的XRD衍射分析图中可知(图6)，由于Mg元素的掺入改变了介孔材料固有的衍射峰。
6、Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架的红外光谱表征；
Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架的表面基团通过傅里叶变换红外光谱获得。从红外光谱测试图7可知，Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架在相同的波长具有相似的峰，表明Mg元素的掺入并没有显著性的改变MBG的红外吸收峰，OOB融合蛋白以吸附的形式负载在材料中，并没有与材料发生化学反应。
7、Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架在体外SBF溶液中体外矿化的扫描电镜表征；
Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架在模拟人体体液的液体(SBF)(142.0mM Na+，5.0mM K+，1.5mM Mg2+，2.5mM Ca2+，103.0mM Cl-，27.0mMHCO3 -，1.0mM HPO4 2-，0.5mM SO4 2-)中测试体外矿化的程度，该实验的反应温度为37℃。矿化10天后，采用扫描电子显微镜进行观察，结果如图8所示，Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架比MBG(Ca/Mg 1:0)支架在体外矿化的多，Mg-MBG-OOB支架比Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架在体外矿化的多，且与Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架矿化沉积的形态和钙沉积的形态相似。因此，Mg-MBG-OOB支架(即骨修复支架材料)能在体外进行良好的矿化过程。
8、Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架对MC3T3-E1的增殖影响测试；
Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架对成骨细胞(MC3T3-E1细胞)的增殖能力通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)进行测定。在测试前4h按照培养液体积的10％加入CCK-8。在细胞生长1、3、5及7天时在酶标仪的450nm的波长下读取吸光度值对其增殖进行测定。结果如图9所示，Mg-MBG-OOB支架(即骨修复支架材料)能够促进MC3T3-E1细胞的增殖。
9、Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架对MC3T3-E1的分化影响测试；
Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架对MC3T3-E1细胞的分化能力通过检测碱性磷酸酶(ALP)的活性进行测定。在检测时，细胞分为两组分别进行检测，一组采用对硝基酚磷酸(pNPP)工作溶液(8mM pNPP，0.1％Triton X-100，2mMMgCl2，0.1M Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 10.3))，按照每孔100μL工作液加入细胞内，在37℃孵育30min后，通过酶标仪测定405nm的吸光度，另外一组采用基于二喹啉甲酸(BCA)法测定细胞内蛋白浓度作为内参，每孔加入200μL工作液并在37℃孵育30min后，通过酶标仪测定550nm的吸光度。根据公式计算碱性磷酸酶活性＝A405/A550。结果如图10所示，MC3T3-E1细胞培养在骨修复支架材料(即Mg-MBG-OOB支架)中的碱性磷酸酶活性最高，Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架中次之，MBG(Ca/Mg 1:0)支架中最低。因此，骨修复支架材料对成骨细胞的分化能力最强，Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架次之，MBG(Ca/Mg 1:0)支架最低。
10、Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架对MC3T3-E1的矿化影响测试；
Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架、MBG(Ca/Mg 1:0)支架以及Mg-MBG-OOB支架对MC3T3-E1细胞的矿化能力通过茜素红染矿化结节进行测定。成骨MC3T3-E1细胞在支架材料中培养3天后换为矿化培养基(含10mMβ-甘油磷酸钠，50μg/mL维生素C，10％FBS的αMEM培养液)进行培养。在细胞培养的第21天进行矿化结节的测定，具体为通过75％的乙醇将细胞在室温固定10min后，茜素红工作液(pH4.2，40mM)37℃染矿化结节10min，再采用去离子水将多余的工作液洗净，干燥后拍照。结节数量越多，说明矿化效果越好。结果如图11所示，骨修复支架材料对MC3T3-E1成骨细胞的矿化能力最大，Mg-MBG(Ca/Mg 3:1)支架次之，MBG(Ca/Mg 1:0)支架最小。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S1：将扩孔剂加入结构导向剂的酸性溶液中，加入镁源、钙源、硅源和磷源，在40～50℃下搅拌至形成均匀的混合液，调整所述混合液的pH值至碱性，在90～110℃下静置得到沉淀，洗涤所述沉淀至pH为7～7.4，在100～150℃下烘烧所述沉淀6～10h后，在500～600℃下煅烧6～8h，得到掺镁介孔生物活性玻璃；
S2：去除OPN蛋白的信号肽，去除BGN蛋白的信号肽并保留所述BGN蛋白的核心蛋白序列，将处理后的OPN蛋白的基因序列和BGN蛋白的基因序列与OCN蛋白的基因序列连接在一起，获得OOB蛋白基因序列模板；根据所述OOB蛋白基因序列模板，利用基因工程得到包含OCN、OPN以及BGN的OOB融合蛋白的基因序列；利用宿主大肠杆菌菌株对所述OOB融合蛋白基因序列进行表达，获取单克隆，对所述单克隆进行多次培养，表达，离心收集菌液，纯化，获得OOB融合蛋白；
S3：将步骤S2获得的OOB融合蛋白负载到步骤S1获得的掺镁介孔生物活性玻璃中，搅拌1～2h，置于4℃冰箱静置吸附24～48h，离心取沉淀，得到纺丝原料；
S4：取4～6g聚(ε己内酯)加入到50mL六氟异丙醇溶液中，搅拌，得到纺丝溶液，将步骤S3获得的纺丝原料以5～15mg/mL的比例加入到所述纺丝溶液中，搅拌、超声获得混合液，对所述混合液进行静电纺丝，得到骨修复支架材料。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：
将4～6g结构导向剂溶解在200～300mL水中，采用浓HCl调节溶液pH值为1～2，加入5～7g扩孔剂，搅拌均匀，加入硝酸镁、硝酸钙、6～10mL正硅酸乙酯以及2～3.5g磷酸三乙酯，在40～50℃下搅拌20～24h，采用浓氨水调整pH至9～11，将溶液加入反应釜中后，在90～110℃下静置56～80h得到沉淀，将所述沉淀在8000～10000rpm的条件下离心15min，去上清，采用去离子水洗涤所述沉淀数次至pH7～7.4，在100～150℃的烘箱中进行烘烧6～10h后，将沉淀放入马弗炉中以1℃/min的升温速率从室温升温至500～600℃并在500～600℃下煅烧6～8h，得到掺镁介孔生物活性玻璃。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述结构导向剂为三嵌段聚合物P123(PEO20-PPO70-PEO20)、F127(EO106-PO70-EO106)以及十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基磺酸钠、十六烷基三甲溴化铵-四甲基氢氧化胺中的一种；
所述扩孔剂为1,3,5-均三甲苯、聚乙二醇、三异丙基苯以及二甲苯中的一种。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述镁源中的镁与所述钙源中的钙的摩尔比为1：3。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：
S21：去除OPN蛋白的信号肽，去除BGN蛋白的信号肽并保留所述BGN蛋白的核心蛋白序列，将处理后的OPN蛋白的基因序列和BGN蛋白的基因序列与OCN蛋白的基因序列连接在一起，获得OOB蛋白基因序列模板，在所述OOB蛋白基因序列模板的最后添加终止子；
S22：根据所述OOB蛋白基因序列模板，对宿主大肠杆菌菌株进行密码子优化；
S23：根据所述OOB蛋白基因序列模板，利用基因工程得到包含OCN、OPN以及BGN的OOB融合蛋白基因序列；
S24：将所述OOB融合蛋白基因序列克隆到表达质粒中，并将所述表达质粒转化入所述宿主大肠杆菌菌株中；
S25：将所述宿主大肠杆菌菌株平铺在具有氨苄青霉素抗性培养基的培养皿上，并在培养皿上挑取单克隆，对所述单克隆进行多次培养，离心收集菌液，分离、纯化、浓缩，获得OOB融合蛋白。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S25具体包括：
S251：将所述宿主大肠杆菌菌株平铺在具有氨苄青霉素抗性培养基的培养皿上，并在培养皿上挑取单克隆；
S252：将所述单克隆在3mL的37℃含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中培养至OD600值为0.5-0.7，转至25mL的37℃含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中培养至OD600值为0.5-0.7，再转至2L的37℃含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中培养至OD600值为0.5-0.7，加入异丙基硫代半乳糖苷并在37℃下培养7～9h；
S253：将培养液在4000～6000rpm条件下离心20～40min，收集菌液，采用100～150mL的磷酸缓冲盐溶液进行重悬，超声破碎重悬菌液，将破碎菌液在12000rpm的条件下离心30min，取上清液；将所述上清液过镍柱，采用40～50mM咪唑15mL对镍柱进行洗脱，再采用200mM咪唑15mL对镍柱进行洗脱，收集流穿液，将所述流穿液透析24～48h，将透析液在超滤管中以4000rpm的条件离心30min，得到浓缩纯化后的OOB融合蛋白。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：
将100～300μg步骤S2获得的OOB融合蛋白负载到20mg步骤S1获得的掺镁介孔生物活性玻璃中，搅拌1～2h，置于4℃冰箱静置吸附24～48h，在12000rpm条件下离心5min，取沉淀，得到纺丝原料。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，对所述混合液进行静电纺丝具体包括：
在18～22kV的高压直流电场下，利用数字注射泵控制所述混合液的流速为0.60～0.85mL/h、温度为25℃、相对湿度为44％，进行静电纺丝。
9.一种骨修复支架材料，其特征在于，由权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到；所述骨修复支架材料呈纤维状支架结构，所述骨修复支架材料由聚(ε己内酯)和负载有OOB融合蛋白的掺镁介孔生物活性玻璃组成；所述OOB融合蛋白由OCN、OPN以及BGN连接而成，所述OPN和BGN不含信号肽序列。
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