CN106806939B - 骨修复材料及其制备方法和应用 - Google Patents

骨修复材料及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106806939B
CN106806939B CN201710195557.9A CN201710195557A CN106806939B CN 106806939 B CN106806939 B CN 106806939B CN 201710195557 A CN201710195557 A CN 201710195557A CN 106806939 B CN106806939 B CN 106806939B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bioactive glass
repair material
bone repair
hours
amino
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710195557.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106806939A (zh
Inventor
王晓燕
高凯
王干
柳珑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Weiyemo Biotechnology Co ltd
Original Assignee
National University of Defense Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National University of Defense Technology filed Critical National University of Defense Technology
Priority to CN201710195557.9A priority Critical patent/CN106806939B/zh
Publication of CN106806939A publication Critical patent/CN106806939A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106806939B publication Critical patent/CN106806939B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/12—Phosphorus-containing materials, e.g. apatite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/10—Ceramics or glasses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/10—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing inorganic materials
    • A61L2300/112—Phosphorus-containing compounds, e.g. phosphates, phosphonates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A61L2300/414—Growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/602—Type of release, e.g. controlled, sustained, slow
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供一种骨修复材料及其制备方法和应用，该材料的制备方法包括将结构导向剂、扩孔剂溶解后，加入钙源、硅源和磷源，调节pH值为9‑11，并在90‑110℃下放置56‑80小时后，在550‑600℃烘烧6‑10小时，得到生物活性玻璃，将生物活性玻璃与3‑氨基丙基三乙氧基硅烷混合14‑20小时，在80‑150℃烘烧20‑30小时，氯仿洗涤后烘干，得到氨基修饰的生物活性玻璃。该氨基修饰的生物活性玻璃与细胞因子在37℃二氧化碳培养箱孵育4‑6小时，以促进吸附，得到骨修复材料。该材料能够促进成骨细胞的增殖、成骨方向分化及矿化过程，具有很好的细胞相容性及促进骨生成作用，在骨缺损修复过程中作为修复材料具有广阔的应用前景。

Description

骨修复材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体的涉及一种骨修复材料及其制备方法和应用。
背景技术
生物活性玻璃是孔径介于2-50nm的一类多孔材料，主要含有硅、钙和磷，它具有极高的比表面积、规则有序的孔道结构、狭窄的孔径分布、孔径大小连续可调等特点。这些特点使得它在大分子的吸附、分离中具有广泛的应用。该材料具有良好的生物活性，可使新骨生成与材料降解速度相匹配，溶出的离子可以激活成骨基因的表达，可促进成骨细胞形成、增殖、分化及细胞外基质矿化，发挥骨诱导作用。具有良好的生物相容性、生物可降解性，可促进无机盐的沉积、成骨细胞粘附，与骨组织结合紧密，发挥骨传导的作用。生物活性玻璃以其优异的骨诱导性和骨传导性，引起了生物医用材料界的高度关注。
然而，现有的生物活性玻璃由于其本身的性质，对生物大分子的吸附作用受限。即使该材料吸附了生物大分子，生物大分子也不能从材料中缓慢释放出来，产生瀑释现象，因而不能满足人们对骨修复速率与效果的需求。这一问题制约了生物活性玻璃在对骨形成过程促进方面的运用。现有的骨修复材料虽然具有一定的骨传导性，能够提供不同水平的结构支持，已在临床上应用于大块骨缺损的修复。但是生物活性玻璃的骨诱导性不足，导致细胞响应时间长、成骨方向分化能力差，呈现出骨再生和骨重建速度慢等问题。
表皮生长因子(EGF)是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。表皮生长因子在骨中能够促进生成大量的成骨细胞而抑制破骨细胞的生长。然而，EGF会在骨中很快被代谢过程消耗殆尽，无法完成骨修复。
发明内容
本发明的目的在于提供一种骨修复材料及其制备方法和应用，该发明解决了现有生物活性玻璃对生物大分子吸附释放能力较差，骨诱导性不足，导致细胞响应时间长、成骨方向分化能力差，呈现出骨再生和骨重建速度慢；表皮生长因子在骨修复过程中代谢速度过快而无法完成骨修复过程的技术问题。
本发明提供了一种骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将结构导向剂的酸性溶液与扩孔剂溶液混合后加入由硅源、钙源和磷源混合而成的原料混合物中，在40～50℃下搅拌均匀，即至形成具有玻璃网络结构的混合物后，调整所述混合物的pH值至碱性后在90～110℃下静置沉淀，洗涤所得沉淀物至其pH为7-7.4后，在550-600℃下烘烧所得沉淀物6-10小时得到生物活性玻璃；
(2)将所述生物活性玻璃与3-氨基丙基三乙氧基硅烷混合14-20小时后，在80-150℃下烘烧20-30小时，氯仿洗涤后烘干，得到氨基修饰的生物活性玻璃；
(3)向所述氨基修饰的生物活性玻璃中加入质量浓度为10-30ng/mL的表皮生长因子溶液后孵育4-6小时，除去上清，在37-50℃下烘烤12-20小时后，得到所述骨修复材料；
所述结构导向剂为PEO20-PPO70-PEO20；
所述硅源、所述钙源和所述磷源按物质的量比为2.2-3.7:0.8-1.4:1混合。
本发明提供的制备方法以PEO20-PPO70-PEO20为结构导向剂，能使所得骨修复材料的微观结构与真骨相似，从而有利于成骨细胞在其中生长。该材料的分解过程还能为成骨细胞的生长提供钙、磷元素，从而促进骨骼的生长。
所用硅源、钙源和磷源按此比例混合，能合理的为骨骼再生过程提供所需元素，并提供所需支撑，增强材料的生物相容性，易于表面钙沉积的形成，所用硅源、钙源和磷源可以为现有骨修复材料中常用的无机物。
在碱性条件下形成沉淀的过程中，无机物前驱体和结构导向剂能形成有机无机复合聚集体，并通过在该温度下的烘烧使所形成的有机无机复合聚集体所具有的结构有利于促进细胞在成骨方向分化，并除去结构导向剂使所得骨修复材料适于人体使用。
此处的孵育是指在37℃二氧化碳培养箱内进行孵育，从而使得氨基修饰的生物活性玻璃中所存在的孔洞结构能对表皮生长因子进行全面吸附。
由于在骨修复过程中涉及到的多种生物大分子特别是蛋白多肽分子都具有羟基，因此对生物活性玻璃进行氨基化修饰，有助于其与蛋白多肽分子通过氢键的相互作用从而对蛋白多肽分子进行吸附及缓慢释放。通过后续实验表明：本发明制备的骨修复材料不仅可对负载的表皮生长因子进行缓释，而且可作为表皮生长因子的载体，促进骨的生成过程。
进一步地，结构导向剂的酸性溶液的浓度为0.016～0.025g/mL，pH值为1-2。
进一步地，扩孔剂为1，3，5-均三甲苯。
进一步地，扩孔剂溶液的浓度为0.2-0.3mol/L。
进一步地，硅源为正硅酸乙酯；所述钙源为硝酸钙或氯化钙；所述磷源为磷酸三乙酯。
进一步地，表皮生长因子为质量浓度为10-30ng/mL的溶液；所述氨基修饰的生物活性玻璃与所述表皮生长因子的质量比为1*105～0.3*105。
本发明的另一方面提供了一种按上述方法制备得的骨修复材料。
进一步地，骨修复材料的平均孔径为4～40nm，比表面积为253.4m2/g～490.3m2/g，组成中具有氨基。所得骨修复材料中存在高度有序的六方结构的孔道结构，从而提高了其中表皮生长因子的吸附量。
本发明的另一面提供了一种按上述方法制备得的骨修复材料在制备骨缺损修复材料中的应用。
具体的，本发明提供的骨修改材料的制备方法包括以下步骤：
1)将4-6g结构导向剂溶解在水中，采用HCl调节溶液pH值为1-2，加入6-10g扩孔剂，搅拌3-6小时直至均匀，再加入6-10毫升的正硅酸乙酯，2.75-4.55g的硝酸钙或氯化钙作为钙源，2.5g磷酸三乙酯。在45℃搅拌20-24小时后，采用浓氨水调整pH至9-11，在90-110℃静置56-80小时得到沉淀，将所得沉淀采用去离子水洗涤数次至pH7-7.4，550-600℃进行烘烧6-10小时，得到生物活性玻璃材料；
(2)将所述生物活性玻璃与3-氨基丙基三乙氧基硅烷混合14-20小时，在80-150℃下烘烧20-30小时，氯仿洗涤后烘干，得到氨基修饰的生物活性玻璃；
(3)将所述氨基修饰的生物活性玻璃与表皮生长因子在37℃二氧化碳培养箱孵育4-6小时进行吸附后，除去上清，37-50℃烘烤12-20小时后，得到所述骨修复材料。
本发明的技术效果：
本发明提供的骨修复材料制备方法，所得骨修复材料能发挥对表皮生长因子的缓释作用，从而促进细胞在成骨方向分化，促进骨再生和骨重建的快速进行，达到长效快速的促进骨修复过程。
本发明提供的骨修复材料，具有高效吸附并能缓慢释放表皮生长因子的特性，从而使得该骨修复材料不仅具有生物活性玻璃的骨传导性，还具有表皮生长因子对骨分化诱导的骨诱导性。因此，该骨修复材料具有促进骨组织再生和诱导分化的双重功能，对细胞具有长效地促进其增殖、成骨方向分化和矿化的作用，能有效的提升骨缺损的修复效果和速度。在骨缺损修复、微整形上具有广泛的应用前景。
具体请参考根据本发明的骨修复材料及其制备方法和应用提出的各种实施例的如下描述，将使得本发明的上述和其他方面显而易见。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的生物活性玻璃的典型氮气吸附脱附曲线图；
图2为本发明实施例1制得的生物活性玻璃和氨基修饰的生物活性玻璃的广角度XRD衍射图；
图3为本发明实施例1制得的生物活性玻璃的小角度XRD衍射图；
图4为本发明实施例1制得的生物活性玻璃和氨基修饰的生物活性玻璃的红外光谱图；
图5为本发明实施例1制得的生物活性玻璃和氨基修饰的生物活性玻璃的XPS谱图；
图6为本发明实施例1制得的氨基修饰的生物活性玻璃的N1s分峰拟合图；
图7为本发明实施例1制得的骨修复材料对表皮生长因子的缓释结果示意图；
图8为本发明实施例1制得的生物活性玻璃和氨基修饰的生物活性玻璃在体外SBF溶液中对钙沉积速度影响图；
图9为本发明实施例1制得的生物活性玻璃和氨基修饰的生物活性玻璃在体外SBF溶液中对钙沉积10天后的形貌的扫描电镜图，其中a)为放大10，000倍时；b)为放大20，000倍时；
图10为本发明实施例1制得的生物活性玻璃、氨基修饰的生物活性玻璃及骨修复材料对成骨细胞(MC3T3-E1)粘附影响图；
图11为本发明实施例1制得的生物活性玻璃、氨基修饰的生物活性玻璃及骨修复材料对MC3T3-E1的增殖影响图；
图12为本发明实施例1制得的生物活性玻璃、氨基修饰的生物活性玻璃及骨修复材料对MC3T3-E1的分化影响图；
图13为本发明实施例1制得的生物活性玻璃、氨基修饰的生物活性玻璃及骨修复材料对MC3T3-E1的矿化影响图。
具体实施方式
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
实施例
以下实施例中所用物料和仪器均为市售。
实施例1
通过模板诱导和自组装相结合的方法合成生物活性玻璃(MBG)。将4.5g结构导向剂非离子型嵌段共聚物PEO20-PPO70-PEO20(P123)溶解在240毫升水中，采用HCl调节溶液pH值为1，加入6.5g扩孔剂1，3，5-均三甲苯(TMB)，搅拌3小时直至均匀，再加入7毫升正硅酸乙酯(TEOS)，3.65g Ca(NO3)2·4H2O钙源，2.5g磷酸三乙酯(TEP)，在40℃搅拌24小时后，采用浓氨水调整pH至10，110℃静置50小时得到沉淀。将所得沉淀采用去离子水洗涤数次至pH为7，550℃进行烘烧10小时，得到生物活性玻璃材料。将生物活性玻璃材料与3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，分子式为C9H23NO3Si，)，混匀20小时，在120℃烘烧30小时，氯仿洗涤后烘干，得到氨基修饰的生物活性玻璃材料(MBG-NH2)。将氨基修饰的生物活性玻璃材料与表皮生长因子(20ng/mL)在37℃二氧化碳培养箱孵育6小时进行吸附后，除去上清，37℃烘烤20小时，得到氨基修饰的生物活性玻璃协同表皮生长因子的材料(MBG-NH2/EGF)。
实施例1 中氨基修饰的生物活性玻璃的表征测量及结果
生物活性玻璃的孔结构参数通过Brnauer-Emmett-Teller法和Barret-Joyer-Halenda法来确定。图1为生物活性玻璃的氮气吸附脱附IV曲线图，由图1可见，在0.8-1.0范围的p/po区域，生物活性玻璃的吸附体积具有明显的变化，说明该生物活性玻璃的孔径在介孔范围，数据表明其平均孔径为6.4nm。图1中吸附和脱附曲线没有重合，说明生物活性玻璃具有介孔材料的性质，为后续所得骨修复材料具有对大分子物质的缓释能力提供基础。
生物活性玻璃及氨基修饰的生物活性玻璃的晶体组成通过X-射线衍射(BrukerD8，德国)进行测定，采用压片法制片，Cu/Ka靶，广角角度15°-90°，小角角度0.8°-4°进行测试。广角角度的X-射线衍射所得结果如图2所示，在2θ＝15-35°存在一个衍射峰，说明本发明提供方法制备得到的骨修复材料是以无定型状态存在。小角度X-射线衍射结果如图3所示，在2θ＝15-35°下存在(100,110及200)的衍射峰，显示其中的生物活性玻璃存在高度有序的六方结构孔道结构。
生物活性玻璃及氨基修饰的生物活性玻璃的表面基团通过傅里叶变换红外光谱(FTIR，Nicolet Avatar 360system)获得，测试采用KBr压片的方法，测试波长的范围为：400-4000cm-1。结果如图4所示，骨修复材料在1550cm-1存在一个C-NH2的氨基峰，但是MBG不存在该峰，说明其中的生物活性玻璃已经成功修饰了氨基，即为：氨基修饰的生物活性玻璃。
氨基修饰的生物活性玻璃的组成成分由X-射线光电子能谱分析(XPS，ThermoEscalab 250，美国)获得，采用由Al K辐射的1486.6eV的能量进行测试。结构如图5所示，生物活性玻璃及氨基修饰的生物活性玻璃中N1s，Si2p，Si2s，Ca2p，Ca2s及C1s的原子组成进行了分析，氨基修饰的生物活性玻璃在399.8和402.5eV处具有N1s的两个峰。由图6的分峰拟合图可知，结合能在399.8eV的为N-H键，结合能在402.5eV为N-C键。因此，从另外一方面说明骨修复材料中的生物活性玻璃已形成氨基修饰。
骨修复材料对表皮生长因子的缓释过程在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中进行测试。图7显示，在2天时，骨修复材料对表皮生长因子的释放量已达到总负载量的35％，而在9天时，其释放量仅达到总负载量的70％，骨修复材料对表皮生长因子具有良好的缓释功能。
生物活性玻璃和氨基修饰的生物活性玻璃在模拟人体体液的液体(SBF)(142.0mMNa+，5.0mM K+，1.5mM Mg2+，2.5mM Ca2+，103.0mM Cl-，27.0mM HCO3 -，1.0mM HPO4 2-，0.5mMSO4 2-)中测试对钙沉积速度的影响，钙沉积实验在37℃培养箱中进行，在相应的时间点通过显微镜观察钙沉积的速度。结果显示(图8)，在4小时和1天后，在生物活性玻璃和氨基修饰的生物活性玻璃表面均出现了颗粒沉积，而在10天后，在氨基修饰的生物活性玻璃表面的颗粒沉积比在生物活性玻璃表面的多，表明氨基修饰的生物活性玻璃可以促进类骨沉积的生成。在钙沉积10天后，采用去离子水洗涤钙沉积，然后在扫描电子显微镜(SEM；JSM-6700F，日本)下观察表面形貌。测试前先将钙沉积充分干燥并用导电胶粘结于样品铜台上，然后对样品表面进行喷金处理后进行观察。如图9显示，生物活性玻璃和氨基修饰的生物活性玻璃表面均被球形的类骨样沉积所覆盖，而在氨基修饰的生物活性玻璃上类骨样沉积明显多于生物活性玻璃。在不同的放大倍数下(图9中a和b)，可以更清晰的看出沉积形态的不同。氨基修饰的生物活性玻璃上的沉积形态与骨中的钙化沉积更相似。
生物活性玻璃、氨基修饰的生物活性玻璃、骨修复材料对MC3T3-E1细胞的粘附能力通过免疫荧光进行测定。细胞分别在三种材料中进行孵育6小时，采用甲醇:丙酮(1:1)室温固定30分钟后，通过10％马血清4℃封闭过夜，anti-Actin的抗体以1:100的比例进行稀释后对细胞4℃孵育过夜后，FITC标记的二抗以1:100的比例进行稀释对细胞室温孵育2小时，碘化丙啶(PI)染细胞核5分钟后在具有蓝光和绿光激发波的显微镜(Leica，德国)下观察细胞的粘附。结果如图10显示，骨修复材料对细胞的粘附性最好，氨基修饰的生物活性玻璃其次，生物活性玻璃最次，说明氨基修饰的生物活性玻璃对成骨细胞的附着及伸展具有正向调节作用，氨基修饰的生物活性玻璃协同表皮生长因子后促进了成骨细胞的粘附。
生物活性玻璃、氨基修饰的生物活性玻璃、骨修复材料对MC3T3-E1细胞的增殖能力通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)进行测定。在对应测试时间前4小时，将CCK-8以10％的比例加入到细胞培养液中。测试时，在酶标仪的450nm的波长下读取吸光度值。如图11所示，在第5天时，氨基修饰的生物活性玻璃、骨修复材料促进细胞活性的效果相同。不同天数的对细胞活性的研究表明，骨修复材料促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖。
生物活性玻璃、氨基修饰的生物活性玻璃、骨修复材料对MC3T3-E1细胞的分化能力通过检测碱性磷酸酶(ALP)的活性进行测定。细胞分为两组，一组采用对硝基酚磷酸(pNPP)工作溶液(8mM pNPP，0.1％Triton X-100，2mM MgCl2，0.1M Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 10.3))，在37℃孵育30分钟后，通过酶标仪测定405nm的吸光度，另外一组采用基于二喹啉甲酸(BCA)法测定细胞内蛋白浓度作为内参，在37℃孵育30分钟后，通过酶标仪测定550nm的吸光度。采用公式计算细胞的碱性磷酸酶活性，碱性磷酸酶活性＝A405/A550。结果显示(图12)，MC3T3-E1细胞培养在骨修复材料上，其碱性磷酸酶的活性最高，氨基修饰的生物活性玻璃其次，生物活性玻璃最低。因此，骨修复材料对成骨细胞MC3T3-E1的分化作用最强，氨基修饰的生物活性玻璃次之，生物活性玻璃最低。
生物活性玻璃、氨基修饰的生物活性玻璃、骨修复材料对MC3T3-E1细胞的分化能力通过检测矿化结节的数量进行测定。将MC3T3-E1细胞培养在不同的材料上，3天后换为矿化培养基(含10mMβ-甘油磷酸钠，50μg/mL维生素C，10％FBS的αMEM培养液)，在细胞培养的第14天对矿化结节进行检测。通过75％的乙醇将细胞室温固定10分钟，然后采用茜素红工作液(pH4.2，40mM)37℃染色10分钟，去离子水冲洗，干燥后在显微镜下拍照。结果显示(图13)，MC3T3-E1细胞培养在骨修复材料上，其矿化结节量最多，氨基修饰的生物活性玻璃次之，生物活性玻璃最少。因此，骨修复材料对成骨细胞MC3T3-E1的矿化作用最强，氨基修饰的生物活性玻璃次之，生物活性玻璃最低。
实施例2
通过模板诱导和自组装相结合的方法合成生物活性玻璃(MBG)。将6g结构导向剂非离子型嵌段共聚物PEO20-PPO70-PEO20(P123)溶解在240毫升水中，采用HCl调节溶液pH值为1，加入10g扩孔剂1，3，5-均三甲苯(TMB)，在40℃下搅拌6小时直至均匀，再加入10毫升正硅酸乙酯(TEOS)，4.55g Ca(NO3)2·4H2O，2.5g磷酸三乙酯(TEP)，在45℃搅拌24小时后，采用浓氨水调整pH至11，90℃静置56小时得到沉淀。将所得沉淀采用去离子水洗涤数次至pH为7.4，550℃进行烘烧10小时，得到生物活性玻璃材料。将生物活性玻璃材料与3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，分子式为C9H23NO3Si，)，混匀14小时，在150℃烘烧20小时，氯仿洗涤后烘干，得到氨基修饰的生物活性玻璃材料(MBG-NH2)。将氨基修饰的生物活性玻璃材料与表皮生长因子(30ng/mL)在37℃二氧化碳培养箱孵育4小时进行吸附后，除去上清，37℃烘烤12小时，得到氨基修饰的生物活性玻璃协同表皮生长因子的材料(MBG-NH2/EGF)。
实施例3
通过模板诱导和自组装相结合的方法合成生物活性玻璃(MBG)。将4g结构导向剂非离子型嵌段共聚物PEO20-PPO70-PEO20(P123)溶解在240毫升水中，采用HCl调节溶液pH值为2，加入6g扩孔剂1，3，5-均三甲苯(TMB)，搅拌3小时直至均匀，再加入6毫升正硅酸乙酯(TEOS)，2.75g氯化钙，2.5g磷酸三乙酯(TEP)，在50℃搅拌20小时后，采用浓氨水调整pH至9，110℃静置80小时得到沉淀。将所得沉淀采用去离子水洗涤数次至pH为7，600℃进行烘烧6小时，得到生物活性玻璃材料。将生物活性玻璃材料与3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，分子式为C9H23NO3Si，)，混匀20小时，在80℃烘烧30小时，氯仿洗涤后烘干，得到氨基修饰的生物活性玻璃材料(MBG-NH2)。将氨基修饰的生物活性玻璃材料与表皮生长因子(10ng/mL)在37℃二氧化碳培养箱孵育6小时进行吸附后，除去上清，37℃烘烤20小时，得到氨基修饰的生物活性玻璃协同表皮生长因子的材料(MBG-NH2/EGF)。
本领域技术人员将清楚本发明的范围不限制于以上讨论的示例，有可能对其进行若干改变和修改，而不脱离所附权利要求书限定的本发明的范围。尽管己经在附图和说明书中详细图示和描述了本发明，但这样的说明和描述仅是说明或示意性的，而非限制性的。本发明并不限于所公开的实施例。
通过对附图，说明书和权利要求书的研究，在实施本发明时本领域技术人员可以理解和实现所公开的实施例的变形。在权利要求书中，术语“包括”不排除其他步骤或元素，而不定冠词“一个”或“一种”不排除多个。在彼此不同的从属权利要求中引用的某些措施的事实不意味着这些措施的组合不能被有利地使用。权利要求书中的任何参考标记不构成对本发明的范围的限制。

Claims (8)

1.一种骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将结构导向剂的酸性溶液与扩孔剂溶液混合后加入由硅源、钙源和磷源混合而成的原料混合物中，在40～50℃下搅拌至形成具有玻璃网络结构的混合物后，调整所述混合物的pH值至碱性后在90～110℃下静置沉淀，洗涤所得沉淀物至其pH为7-7.4后，在550-600℃下烘烧所得沉淀物6-10小时得到生物活性玻璃；
(2)将所述生物活性玻璃与3-氨基丙基三乙氧基硅烷混合14-20小时后，在80-150℃下烘烧20-30小时，氯仿洗涤后烘干，得到氨基修饰的生物活性玻璃；
(3)向所述氨基修饰的生物活性玻璃中加入质量浓度为10-30ng/mL的表皮生长因子溶液后孵育4-6小时，除去上清，在37-50℃下烘烤12-20小时后，得到所述骨修复材料；
所述结构导向剂为PEO20-PPO70-PEO20；
所述硅源、所述钙源和所述磷源按物质的量比为2.2-3.7:0.8-1.4:1混合；
所述表皮生长因子为质量浓度为10-30ng/mL的溶液；所述氨基修饰的生物活性玻璃与所述表皮生长因子的质量比为1*105～0.3*105；
所述制备方法制备得到的骨修复材料可作用于骨细胞MC3T3-E1。
2.根据权利要求1所述的骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述结构导向剂的酸性溶液的浓度为0.016～0.025g/mL，pH值为1-2。
3.根据权利要求1所述的骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述扩孔剂为1，3，5-均三甲苯。
4.根据权利要求1所述的骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述扩孔剂溶液的浓度为0.2-0.3mol/L。
5.根据权利要求1所述的骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述硅源为正硅酸乙酯；所述钙源为硝酸钙或氯化钙；所述磷源为磷酸三乙酯。
6.一种骨修复材料，其特征在于，按如权利要求1～5任一项所述的方法制备得到。
7.根据权利要求6所述的骨修复材料，其特征在于，所述骨修复材料的平均孔径为4～40nm，比表面积为253.4m2/g～490.3m2/g。
8.一种如权利要求1～5中任一项所述的方法制备得到的骨修复材料在制备骨缺损修复材料中的应用。
CN201710195557.9A 2017-03-29 2017-03-29 骨修复材料及其制备方法和应用 Active CN106806939B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710195557.9A CN106806939B (zh) 2017-03-29 2017-03-29 骨修复材料及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710195557.9A CN106806939B (zh) 2017-03-29 2017-03-29 骨修复材料及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106806939A CN106806939A (zh) 2017-06-09
CN106806939B true CN106806939B (zh) 2020-03-31

Family

ID=59116275

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710195557.9A Active CN106806939B (zh) 2017-03-29 2017-03-29 骨修复材料及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106806939B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107349470B (zh) * 2017-07-28 2020-11-06 苏州大学附属第一医院 一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法及其在人工骨膜中的应用
CN107720796B (zh) * 2017-10-20 2019-04-05 西北工业大学 一种骨修复用C-Ca-P-Si四组元生物复合材料的制备方法
CN112869897B (zh) * 2021-01-14 2022-01-25 南京医科大学附属口腔医院 一种氧化锆种植体表面处理方法
CN112957515B (zh) * 2021-02-04 2022-03-11 绍兴百立盛新材料科技有限公司 一种生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末及其制备方法及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101721751A (zh) * 2008-10-10 2010-06-09 张阳德 负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架及其制法和用途
CN102557398A (zh) * 2011-12-31 2012-07-11 武汉大学 一种含硼纳米介孔大孔生物活性玻璃、其制备方法及应用
CN102755650A (zh) * 2012-07-27 2012-10-31 华东理工大学 一种介孔钙硅凝胶及其制备方法和应用
CN103990177A (zh) * 2014-04-29 2014-08-20 东华大学 一种骨形态发生蛋白活性多肽修饰的介孔硅载药体系的制备方法
CN104027814A (zh) * 2014-05-29 2014-09-10 福州大学 一种通过氨基修饰后双重载药的介孔二氧化硅

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8303967B2 (en) * 2006-06-29 2012-11-06 Orthovita, Inc. Bioactive bone graft substitute

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101721751A (zh) * 2008-10-10 2010-06-09 张阳德 负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架及其制法和用途
CN102557398A (zh) * 2011-12-31 2012-07-11 武汉大学 一种含硼纳米介孔大孔生物活性玻璃、其制备方法及应用
CN102755650A (zh) * 2012-07-27 2012-10-31 华东理工大学 一种介孔钙硅凝胶及其制备方法和应用
CN103990177A (zh) * 2014-04-29 2014-08-20 东华大学 一种骨形态发生蛋白活性多肽修饰的介孔硅载药体系的制备方法
CN104027814A (zh) * 2014-05-29 2014-09-10 福州大学 一种通过氨基修饰后双重载药的介孔二氧化硅

Also Published As

Publication number Publication date
CN106806939A (zh) 2017-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106806939B (zh) 骨修复材料及其制备方法和应用
Zima Hydroxyapatite-chitosan based bioactive hybrid biomaterials with improved mechanical strength
Bai et al. Sequential macrophage transition facilitates endogenous bone regeneration induced by Zn-doped porous microcrystalline bioactive glass
CN103495210B (zh) 壳聚糖-羟基磷灰石原位负载淫羊藿苷复合微球
Li et al. Sr-doped nanowire modification of Ca–Si-based coatings for improved osteogenic activities and reduced inflammatory reactions
KR101461159B1 (ko) 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물
Wang et al. Function and mechanism of mesoporous bioactive glass adsorbed epidermal growth factor for accelerating bone tissue regeneration
CN107693843B (zh) 生物医用活性钛及其合金植入材料的表面改性方法
Tang et al. Gentamicin-loaded carbonated hydroxyapatite coatings with hierarchically porous structures: drug delivery properties, bactericidal properties and biocompatibility
CN101889912A (zh) 生物陶瓷涂层钛丝烧结多孔钛人工骨的制备方法
Sadeghian et al. Dentin extracellular matrix loaded bioactive glass/GelMA support rapid bone mineralization for potential pulp regeneration
Jyoti et al. In vitro bioactivity and biocompatibility of calcium phosphate cements using Hydroxy-propyl-methyl-Cellulose (HPMC)
Deng et al. 3D printed strontium–zinc-phosphate bioceramic scaffolds with multiple biological functions for bone tissue regeneration
Pan et al. Iron-doped brushite bone cement scaffold with enhanced osteoconductivity and antimicrobial properties for jaw regeneration
Shu et al. Novel vaterite-containing tricalcium silicate bone cement by surface functionalization using 3-aminopropyltriethoxysilane: setting behavior, in vitro bioactivity and cytocompatibility
Sutthavas et al. The shape-effect of calcium phosphate nanoparticle based films on their osteogenic properties
CN114129771B (zh) 仿海绵骨针微结构的柔性生物陶瓷支架及其制备方法和应用
Zhang et al. Enhancing the biological activity of vaterite-containing β-dicalcium silicate cement by silane coupling agent for biomaterials
Chen et al. Biocompatible octacalcium phosphate/sodium alginate/silk fibroin composite scaffolds for bone regeneration
El Kady et al. Fabrication, characterization and bioactivity evaluation of calcium pyrophosphate/polymeric biocomposites
Feito et al. Effects of immobilized VEGF on endothelial progenitor cells cultured on silicon substituted and nanocrystalline hydroxyapatites
Liu et al. Physicochemical and biological properties of composite bone cement based on octacalcium phosphate and tricalcium silicate
KR20180077956A (ko) 생체적합성세라믹스 코팅층, 그 코팅층을 포함하는 티타늄재구조체 및 그 구조체 제조방법
Dou et al. Preparation of mesoporous hydroxyapatite films used as biomaterials via sol–gel technology
Yao et al. An Injectable Hydrogel System with Mild Photothermal Effects Combined with Ion Release for Osteosarcoma‐Related Bone Defect Repair

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220621

Address after: 310018 Room 309, building 3, No. 265, Chengrui street, Xiasha street, Qiantang new area, Hangzhou, Zhejiang

Patentee after: Hangzhou Weiyemo Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 410073 Hunan province Changsha Kaifu District, Deya Road No. 109

Patentee before: NATIONAL University OF DEFENSE TECHNOLOGY