CN112957515B - 一种生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末及其制备方法及应用 - Google Patents

一种生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末及其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末及其制备方法及作为止血材料的应用，包括以下步骤：制备生物活性玻璃粉末；将生物活性玻璃粉末用APTES改性后得到氨基改性生物活性玻璃，加入到凝血酶水溶液中，孵育加载凝血酶分子,制得生物活性玻璃/凝血酶止血粉末。本发明包含介孔生物活性玻璃的合成制备，以及对生物活性表面进行氨基改性，以及凝血酶的加载。本发明中的生物活性玻璃合成方法简单，通过改性使得凝血酶与生物活性玻璃可以稳定结合，可以实现对内源性凝血的加速作用，并且蛋白质结构变化减少，可以保证蛋白质的活性，达到更好的止血效果。

Description

一种生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末及其制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末及其制备方法及作为止血材料的应用。
背景技术
不受控制的外伤性和手术性出血是战争、事故、灾难和犯罪中死亡的主要原因。出血过多会破坏血液动力学，需要输血，延长手术时间，并给医疗系统增加巨大负担。因为失血导致的死亡约占创伤死亡率的35％，其中40％的死亡发生在入院前。患者受到钝性创伤时，会有一个止血的“黄金时间”，但是在此期间可能仍会发生灾难性出血，而受到穿透性创伤的士兵只有“白金5分钟”，在这五分钟内必须采取有效的治疗措施。因此，控制出血和延长院前时间可能会导致病人生与死之间的差异，对伤口的即使处理对于提高病人的生存机会至关重要。
生物活性玻璃是第一种显示出与骨骼结合的合成材料，已成功用于骨骼再生。它们可以在体内以与骨骼形成速度相当的速率降解，并且通过其表面磷灰石结晶和离子释放的结合，它们刺激骨骼细胞增殖，从而导致新骨骼的形成。介孔生物活性玻璃具有高度有序的介孔通道结构和较高的比表面积。不仅如此，介孔生物活性玻璃还具有这些MBGs还提供了其他独特的特性，包括更大的孔隙体积和2到10纳米的孔隙大小，使它们适合于各种药物传输和肌肉骨骼应用。而近年来，研究发现介孔生物活性玻璃(MBGs)可以有效地诱导止血。止血是一个复杂的生理过程，可防止失血，并通过三种机制(包括血管收缩，血小板栓塞形成和凝血)的同步作用进行。
凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，通过激活血小板细胞膜上的蛋白酶激活受体来刺激血小板活化和聚集。凝血酶将循环中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白单体，后者聚合形成纤维蛋白，即血凝块的纤维基质。凝血酶还触发血小板表面促凝活性的表达，从而支持额外的凝血酶的产生。凝血酶还可以通过内皮依赖性血管舒张来调节血管直径。在没有内皮的情况下，作用于平滑肌细胞的凝血酶会引起血管收缩。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末及其制备方法及作为止血材料的应用。光热治疗和光动力治疗同时发生作用，并且取得更加有效的肿瘤杀伤效果，克服单一功能的治疗方式所带来的弊端。
本发明采用如下技术方案：
一种生物活性玻璃/凝血酶止血粉末，包括生物活性玻璃及凝血酶，所述的凝血酶通过酰胺反应加载于生物活性玻璃表面。
本发明提供的一种生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末，凝血酶蛋白分子通过酰胺反应加载于生物活性玻璃表面，生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末中，凝血酶的加载量为10.45wt％，复合止血粉末的尺寸为2μm。在生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末中，生物活性玻璃可以通过离子交换反应释放Ca2+能够加速凝血级联反应，并且可以吸收水分使凝血因子浓缩，从而加速凝血。此外介孔生物活性玻璃富含硅烷醇的表面与富含磷脂酰胆碱的RBC膜结合并且提供更多晶格以捕获细胞和血浆成分的玻璃的大表面积和孔体积，使得形成的血栓相对于一般血栓(由血小板塞和交联纤维蛋白组成)多了一层红细胞，有利于稳定血栓的形成。凝血酶分子凝血酶能够直接作用于血浆中的纤维蛋白原，促进纤维蛋白原转化为纤维蛋白，加速伤口表面血液凝固，从而起到止血的作用。因此，生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末可以在不同方面加速凝血作用，进而实现更强的止血效果。
氨基的改性主要是为了提高凝血酶分子的活性，因为氨基改性可以最大限度地减少凝血酶吸附在玻璃表面后的结构变化，从而保证凝血酶的生物活性。同时，官能团可以在表面以均匀的单层形式组装，这使得生物分子可以以同样均匀的方式附着，实现蛋白质在生物活性玻璃上均匀附着的目的。
本发明的生物活性玻璃在2μm左右，具有介孔结构，其较大的比表面积能够捕获和储存大量的水，并为离子交换反应提供合适的场所。
一种生物活性玻璃/凝血酶止血粉末的制备方法，包括以下步骤：
1)制备生物活性玻璃粉末；
2)将生物活性玻璃粉末用APTES改性后得到氨基改性生物活性玻璃，加入到凝血酶水溶液中，孵育加载凝血酶分子,制得生物活性玻璃/凝血酶止血粉末。
步骤1)中，制备生物活性玻璃粉末，具体包括：
称取EO-PO型聚醚溶于乙醇中，混合均匀后得到澄清透明溶，再加入硅酸四乙酯，四水硝酸钙和磷酸三乙酯，随后加入盐酸，在15℃～35℃下搅拌48小时～96小时，随后在15℃～35℃下陈化12小时～36小时，将所得凝胶在50℃～70℃(优选为60℃)烘箱中烘干，将烘干后的产物移入坩埚，在,500℃～700℃下煅烧4h～6h后研磨得到生物活性玻璃粉末。
步骤1)中，所述的EO-PO型聚醚、乙醇、硅酸四乙酯、四水硝酸钙、磷酸三乙酯和盐酸的用量之比为3～5g：40～60g：4～6g：2.5～4g：0.5～0.95g：0.5～3mL，所述的盐酸的浓度为0.5mol/L。最优选的，所述的EO-PO型聚醚、无水乙醇、硅酸四乙酯、四水硝酸钙、磷酸三乙酯和盐酸的用量之比为4g：50g：5g：3.3053g：0.72864g：1mL，所述的盐酸的浓度为0.5mol/L。
在生物活性玻璃的合成过程中加入的Si/Ca的量可以是60：35、70：25或者80：15，此处优选60：35，室温下进行溶胶凝胶反应。
反应完毕后在室温下陈化，之后在60℃下进行干燥，干燥后所得产物在600℃下煅烧5h。
步骤2)中，将生物活性玻璃粉末用APTES改性后得到氨基改性生物活性玻璃，具体包括：
取生物活性玻璃粉末浸泡在乙醇中，加入APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，在40℃～60℃下搅拌反应12h～36h后，经离心、洗涤、烘干后得到氨基改性生物活性玻璃。
步骤2)中，所述的生物活性玻璃粉末、乙醇、APTES的用量之比为80～120mg：40～60mL：1～4mL。
步骤2)中，所述的生物活性玻璃粉末、乙醇、APTES的用量之比为100mg：50mL：2mL。
所述的搅拌反应的条件为：45℃～55℃下搅拌反应18h～30h，最优选为50℃下搅拌反应24h。
最优选的，取生物活性玻璃粉末浸泡在50mL的无水乙醇中，加入2mL的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，在50℃下搅拌24h后，10000rpm的离心速度下离心，而后用无水乙醇离心洗涤三次，烘干后得到氨基改性生物活性玻璃。
所述的APTES的分子量为20000～30000，最优选为25000。
步骤2)中，所述的凝血酶水溶液中凝血酶的浓度为0.15～0.4mg/mL。最优选的，凝血酶水溶液中凝血酶的浓度为0.25mg/mL，所述的凝血酶水溶液采用PBS溶液(PH＝7.4)作为溶剂。
所述的孵育的条件为：在33～40℃温水孵育18h～30h，即33～40℃搅拌18h～30h。最优选的，所述的孵育的条件为：在37℃温水孵育24h，即37℃搅拌24h。
APTES表面修饰是通过将100mg生物活性玻璃泡在50mL乙醇溶液中，加入一定体积的APTES，在50℃搅拌一定时间，APTES的量可以在1mL到4mL不等，搅拌时间4-6h不等，此处选用2mL以及24h，搅拌速度为400rpm。
凝血酶的加载能够使其在钙离子的催化下将可溶的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，具体先对生物活性玻璃克利进行APTS修饰，然后在0.25mg/mL凝血酶水溶液中37℃搅拌24h，离心洗涤之后就可以得到生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末。这种制备工艺简单，具有可重复性。
凝血酶的加载浓度为0.25mg/mL。将加载完毕的产物通过离心分离之后洗涤就可以得到生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末。
生物活性玻璃/凝血酶止血粉末作为止血材料的应用，可用于止血治疗。通过在具有介孔结构的生物活性玻璃颗粒进行表面改性并在表面加载凝血酶蛋白分子实现二者协同止血治疗。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明涉及基于氨基改性生物活性玻璃-凝血酶止血粉末的制备方法和应用，包含介孔生物活性玻璃的合成制备，以及对生物活性表面进行氨基改性，以及凝血酶的加载。本发明中的生物活性玻璃合成方法简单，通过改性使得凝血酶与生物活性玻璃可以稳定结合，可以实现对内源性凝血的加速作用，并且蛋白质结构变化减少，可以保证蛋白质的活性，达到更好的止血效果。
本发明的复合止血粉末中，介孔生物活性玻璃能够有效的实现快速止血，首先是因为其具有高度有序的介孔通道和比表面积，可以通过与孔内的Ca2+发生静电反应，从而有效的捕获和储存大量的水。进而导致血浆中凝血因子和其他蛋白质以及细胞成分的超浓缩，从而会加速凝血级联反应和随后的纤维蛋白凝块形成。其次，当生物活性玻璃与体液接触时，会和体液发生表面反应，其中包括玻璃网络修饰剂与溶液中的H+(或H3O+)离子之间的快速离子交换反应，这一反应导致硅基水解，随后在玻璃表面形成硅烷醇(Si-OH)基团，并最终产生带有官能团的负电荷表面。APTES的改性目的是为了改变颗粒表面的基团分布，在生物活性玻璃表面嫁接氨基，再将凝血酶通过脱水缩合附着到生物活性玻璃表面。从而实现生物活性玻璃和凝血酶凝血特性的结合，提高凝血速率，达到快速止血的目的。
在本发明中，通过在具有介孔结构的生物活性玻璃颗粒进行表面改性并在表面加载凝血酶蛋白分子实现二者协同止血治疗。迄今为止，本领域尚未开发一种改性生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末进行止血治疗。而本发明填补了这一空白。本发明的制备方法具有工艺简单，止血效果良好等优点，并且有良好的生物相容性。
附图说明
图1为生物活性玻璃颗粒的扫描电镜图片
图2为APTES改性前后生物活性玻璃以及APTES的红外光谱图(a)FTIR图谱，(b)Zeta电位。
图3为凝血酶和生物活性玻璃/凝血酶复合粉末的FTIR去卷积后二次求导图(a)凝血酶，(b)生物活性玻璃/凝血酶复合粉末。
图4为生物活性玻璃，氨基改性生物活性玻璃以及生物活性玻璃/凝血酶复合粉末的APTT时间
具体实施方式
以下结合附图和下述实施方式仅有必须说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
本发明提供的一种生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末，凝血酶蛋白分子通过酰胺反应加载于生物活性玻璃表面，生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末中，凝血酶的加载量为10.45wt％，复合止血粉末的尺寸为2μm。在生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末中，生物活性玻璃可以通过离子交换反应释放Ca2+能够加速凝血级联反应，并且可以吸收水分使凝血因子浓缩，从而加速凝血。此外介孔生物活性玻璃富含硅烷醇的表面与富含磷脂酰胆碱的RBC膜结合并且提供更多晶格以捕获细胞和血浆成分的玻璃的大表面积和孔体积，使得形成的血栓相对于一般血栓(由血小板塞和交联纤维蛋白组成)多了一层红细胞，有利于稳定血栓的形成。凝血酶分子凝血酶能够直接作用于血浆中的纤维蛋白原，促进纤维蛋白原转化为纤维蛋白，加速伤口表面血液凝固，从而起到止血的作用。因此，生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末可以在不同方面加速凝血作用，进而实现更强的止血效果。
氨基的改性主要是为了提高凝血酶分子的活性，因为氨基改性可以最大限度地减少凝血酶吸附在玻璃表面后的结构变化，从而保证凝血酶的生物活性。同时，官能团可以在表面以均匀的单层形式组装，这使得生物分子可以以同样均匀的方式附着，实现蛋白质在生物活性玻璃上均匀附着的目的。
本发明的生物活性玻璃在2μm左右，具有介孔结构，其较大的比表面积能够捕获和储存大量的水，并为离子交换反应提供合适的场所。
凝血酶的加载能够使其在钙离子的催化下将可溶的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，具体先对生物活性玻璃克利进行APTS修饰，然后在0.25mg/mL凝血酶水溶液中37℃搅拌24h，离心洗涤之后就可以得到生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末。这种制备工艺简单，具有可重复性。
在生物活性玻璃的合成过程中加入的Si/Ca的量可以是60：35、70：25或者80：15，此处优选60：35，室温下进行溶胶凝胶反应。
反应完毕后在室温下陈化，之后在60℃下进行干燥，干燥后所得产物在600℃下煅烧5h。
APTES表面修饰是通过将100mg生物活性玻璃泡在50mL乙醇溶液中，加入一定体积的APTES，在50℃搅拌一定时间，APTES的量可以在1mL到4mL不等，搅拌时间4-6h不等，此处选用2mL以及24h，搅拌速度为400rpm。
凝血酶的加载浓度为0.25mg/mL。将加载完毕的产物通过离心分离之后洗涤就可以得到生物活性玻璃/凝血酶复合止血粉末。
下面通过实施例以详细说明本发明。应理解为以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述十里具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
称取F127(4g,EO-PO型聚醚，即聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯)溶于50g无水乙醇中，室温25℃搅拌10分钟后得到澄清透明溶液。随后称量5g硅酸四乙酯(TEOS)，3.3053四水硝酸钙和0.72864g磷酸三乙酯加入到所得到的溶液中，随后加入1mL 0.5M的盐酸。在室温25℃下搅拌3d(72小时)，随后在室温25℃下陈化1d(24小时)。将所得凝胶在60℃烘箱中烘干，将烘干后的产物移入坩埚，在600℃下煅烧5h后研磨得到生物活性玻璃粉末。升温速率为5℃/mi5，降温为随炉冷却。
图1分别是生物活性玻璃颗粒的SEM图，可以看出，MoO2纳米颗粒的尺寸比较均匀，大约在2μm左右，并且可以看到疏松的孔洞结构。
图2所示为生物活性玻璃的红外光谱图，从中可以看出其表面含有羟基，这为生物活性玻璃氨基改性奠定了基础。
实施例2
通过对合成的生物活性玻璃进行表面修饰，进而提高凝血酶分子在颗粒上的加载后的活性，取实施例1制备的100mg生物活性玻璃粉末浸泡在50mL的无水乙醇中，加入2mL的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，在50℃下搅拌24h后，10000rpm的离心速度下离心，而后用无水乙醇离心洗涤三次，烘干后得到氨基改性生物活性玻璃。图2是氨基改性后生物活性玻璃的红外光谱，可以看到，通过APTES的改性，在1597处出现了氨基的吸收峰。说明氨基成功加载到了生物活性玻璃上。
氨基改性生物活性玻璃加入到凝血酶水溶液(250μg/mL)中，在37℃温水孵育24h，即37℃搅拌24h，得到生物活性玻璃/凝血酶止血粉末。
取氨基改性后生物活性玻璃以及凝血酶加载后(250μg/mL的凝血酶嫁接)的样品，加入KBr粉末于研钵中进行研磨，然后压成一定大小的片状固体。使用Perki5Elmer 580B(Te5sor 27,Bruker)的红外光谱仪测出不同样品的FTIR谱线(图2)，证明了APTES改性的完成。图2(b)是加载过程的Zeta电位值，也进一步证明了加载成功。
以下实施例对实施例2中250μg/mL的凝血酶的生物活性玻璃/凝血酶颗粒进行性能表征。
实施例3
取猪血浆0.1mL至EP管，将APTT白陶土溶液平衡至室温25℃，颠倒混匀，取0.1mL与血浆混匀。置于37℃水浴5mi5，期间轻轻混匀数次。一共四组，一组三管。
将生物活性玻璃，氨基改性生物活性玻璃以及生物活性玻璃/凝血酶复合粉末加入不同混合液中，并设置一组空白组。
加入经温育至37摄氏度的CaCl2(25mM)0.1mL，立即计时，置于水中不断震荡，约30s时取出，观察出现纤维蛋白丝的时间，重复2次取平均值。
将所得红外光谱去卷积以及二次求导后经行曲线拟合后(图3)可见凝血酶谱线峰变化不明显，可见在加载凝血酶后，凝血酶二次结构变化不明显。从图4可以看到，相比于空白组，加入生物活性玻璃后，APTT时间缩短了百分之二十，从104s变为83s。并且若在加入氯化钙之前加入生物活性玻璃，样品也会出现凝固现象，说明生物活性玻璃可以通过离子交换释放钙离子。氨基改性生物活性玻璃的APTT时间较之未改性延长了到了91s，这是由于氨基减弱了生物活性玻璃的表面负电荷引起的。生物活性玻璃/凝血酶符合止血粉末的止血时间为65s，明显优于改性前后的生物活性玻璃。说明凝血酶的载入有效的提升了生物活性玻璃的止血性能。

Claims (9)

1.一种生物活性玻璃/凝血酶止血粉末的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）制备生物活性玻璃粉末；
2）将生物活性玻璃粉末用APTES改性后得到氨基改性生物活性玻璃，加入到凝血酶水溶液中，孵育加载凝血酶分子,制得生物活性玻璃/凝血酶止血粉末；
所述的生物活性玻璃/凝血酶止血粉末，包括生物活性玻璃及凝血酶，所述的凝血酶通过酰胺反应加载于生物活性玻璃表面。
2.根据权利要求1所述的生物活性玻璃/凝血酶止血粉末的制备方法，其特征在于，步骤1）中，制备生物活性玻璃粉末，具体包括：
称取EO-PO型聚醚溶于乙醇中，混合均匀后得到澄清透明溶液，再加入硅酸四乙酯，四水硝酸钙和磷酸三乙酯，随后加入盐酸，在15℃~35℃下搅拌48小时~96小时，随后在15℃~35℃下陈化12小时~36小时，将所得凝胶在50℃~70℃烘箱中烘干，将烘干后的产物移入坩埚，在500℃~700℃下煅烧4h~6h后研磨得到生物活性玻璃粉末。
3.根据权利要求2所述的生物活性玻璃/凝血酶止血粉末的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述的EO-PO型聚醚、乙醇、硅酸四乙酯、四水硝酸钙、磷酸三乙酯和盐酸的用量之比为3~5g：40~60g：4~6g：2.5~4g：0.5~0.95g：0.5~3mL。
4.根据权利要求1所述的生物活性玻璃/凝血酶止血粉末的制备方法，其特征在于，步骤2）中，将生物活性玻璃粉末用APTES改性后得到氨基改性生物活性玻璃，具体包括：
取生物活性玻璃粉末浸泡在乙醇中，加入APTES，在40℃~60℃下搅拌反应12h~36 h后，经离心、洗涤、烘干后得到氨基改性生物活性玻璃。
5.根据权利要求4所述的生物活性玻璃/凝血酶止血粉末的制备方法，其特征在于，所述的生物活性玻璃粉末、乙醇、APTES的用量之比为80~120mg ：40~60mL：1~4mL。
6.根据权利要求4所述的生物活性玻璃/凝血酶止血粉末的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述的搅拌反应的条件为：45℃~55℃下搅拌反应18h~30h。
7.根据权利要求1所述的生物活性玻璃/凝血酶止血粉末的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述的凝血酶水溶液中凝血酶的浓度为0.15~0.4mg/mL。
8.根据权利要求1所述的生物活性玻璃/凝血酶止血粉末的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述的孵育的条件为：在33~40℃温水孵育18h~30h。
9.根据权利要求1所述的制备方法制备的生物活性玻璃/凝血酶止血粉末在制备止血材料中的应用。
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