CN101991875A - 介孔生物活性玻璃和壳聚糖复合多孔止血材料及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种介孔生物活性玻璃和壳聚糖复合多孔止血材料及制备方法，其特征在于所述的复合止血材料是由介孔生物活性玻璃与壳聚糖复合而成；所述的介孔生物活性玻璃占整个复合材料的质量百分比1～90％。所述的复合多孔止血材料为多孔微球、多孔海绵或多孔粉体。所述的80wt％介孔生物活性玻璃和20wt％壳聚糖复合多孔海绵状止血材料显示出最短的止血时间或最小的出血量，优于同条件下美国Starch Medical Inc公司生产的PerelotTM止血粉；所述的介孔生物活性玻璃为M58S。

Description

介孔生物活性玻璃和壳聚糖复合多孔止血材料及制备方法

技术领域

本发明涉及一种多孔止血材料及其制备方法，更确切地说涉及一种介孔生物活性玻璃和壳聚糖复合多孔止血材料及制备方法，属于止血材料领域。

背景技术

当人体失血超过800mL时就会危及生命，而一旦意外伤害导致动脉出血，可能在10分钟内出血超过800mL，因此在急救医学上对于动脉出血抢救有“白金10分钟”的说法。每年我国有上百万的人死于失血过多，这些人群主要集中在车祸、摔砸伤、地震灾害、洪水灾害、手术中或手术后以及其它突发事件等出血。在战场上，50％的阵亡士兵是由于出血过多所致。为了减少士兵在战场上的由于失血过多的死亡，美军在阿富汗战争以及伊拉克战争中给士兵配置了含沸石分子筛快速止血海绵(商品名为Quickclot)。

在临床上常用的止血材料有止血纱布、止血纤维、止血绷带，但他们在使用过程中存在：止血时间较长、易与伤口粘连而不易换药、对伤口的感染和化脓无能为力等。而且在手术中和手术后突发性大出血的止血问题也一直是临床难题。目前止血材料主要分为生物性和化学性两类，生物性的止血材料主要包括：纤维蛋白胶和胶原蛋白。化学性止血材料主要有：壳聚糖、多微孔类无机材料如沸石(zeolite)等、可溶性止血纱布、组织胶等，但各有缺点，如纤维蛋白胶和胶原蛋白主要是成本过高、止血速度慢而且存在疾病感染危险；多孔沸石主要存在使用过程中放热烧伤表面组织；可溶性止血纱布主要存在止血时间过长、对出血迅猛者止血性能差等。

介孔材料作为止血材料研究时间不长，最早开始于20世纪80年代，Francis X.Hursey无意发现沸石分子筛具有良好的止血作用并申请专利，2002年专门生产以沸石分子筛为主体的Z-Medica公司成立，生产的商品名为Quikclot，在实际应用中(特别是野战战场)，该新型止血材料的止血效果及提高存活率等方面多优于传统止血材料，因而目前已经获得美国FDA批准上市。该材料的止血机理是依赖分子筛材料超常的吸附能力，可在数秒钟内吸干伤口流出的血液中的水分，而不吸收红细胞、血小板和其它凝血因子，因而使凝血因子浓缩立即起到止血效果。到2005年复旦大学余承忠教授报道介孔生物活性玻璃具有很好的止血效果并申请国家发明专利，随后2006年华东理工大学刘昌胜教授报道介孔硅基干凝胶具有很好的止血性能并申请国家发明专利。虽然介孔材料作为快速止血材料的研究取得一定的成就，但介孔材料在止血使用过程中依然存在许多问题亟待改进，如介孔硅基干凝胶粉和沸石分子筛生物活性低，在使用过程中难以被人体吸收，而且最为关键的是介孔止血材料都是粉体止血材料，给使用中带来极为不便。

壳聚糖是研究者开发的一种新型止血材料，由于其对人体生物相容性好，可生物降解、能促进组织再生等而逐渐用于临床。早在1983年Malette WG等就发现壳聚糖具有较好的止血功能，并申请专利。随后很多科技工作者对壳聚糖的止血性能展开了很多研究，如1991年Klokkevold PR等在兔舌上进行壳聚糖止血性能研究，在实验中给兔注射前列环素抑制体内血小板功能，进一步证实壳聚糖醋酸盐溶液的止血功效，同时也说明了止血作用不依赖于血小板；2000年Sugamori T等用壳聚糖的盐酸溶液做止血研究，分别与医用棉、胶原相比，发现壳聚糖能够刺激血小板大量释放PF-4因子，说明壳聚糖可以对肝素化血液促凝。随后Malette WG，Fukasawa M等展开了壳聚糖止血机理研究，发现其止血机制不是常规依赖于血小板和凝血因子，而是通过对红细胞作用，使其发生黏附，从而达到止血效果。但由于壳聚糖材料止血作用有限，对于广泛的出血创面止血效果不甚理想，常需复合其他止血药如凝血因子等。而凝血因子等生物止血剂的保存条件比较苛刻，储备不便，使得价格较高，这又为壳聚糖快速止血材料的应用代来阻碍。

美国专利US6060461描述了一种具有微孔结构颗粒材料用于快速止血，其止血性能效果明显高于非孔结构，本申请的发明人认为，有孔的材料止血性能明显优于非孔结构、表面粗糙结构或其他处理材料，而且孔隙率越高其止血性能越好。鉴于上述认知，如何利用介孔材料和壳聚糖制备出可生物降解，其一利用介孔生物玻璃的介孔结构及对创面的修复功能，其二壳聚糖本身具有较好的止血性能天然高分子材料，避其现有止血材料的不足，又能充分利用二者良好的止血性能。以上的设想构成了本发明的构思，也即引导出本发明的目的。

发明内容

本发明的目的是在于提出一种介孔生物活性玻璃和壳聚糖复合多孔止血材料及其制备方法。该复合多孔止血材料可以用于不同医用止血场合，包括缓慢性出血和快速大量出血等。该材料不仅止血效果好，止血速度快，而且可以调控细胞的行为和组织的形成，加速创面组织愈合修复，以弥补现有技术中单一介孔生物活性玻璃或单一壳聚糖止血材料使用过程中存在的不足。

一种介孔生物活性玻璃和壳聚糖复合多孔止血材料，其特征在于它是由介孔生物活性玻璃和壳聚糖复合而成，通过冷冻干燥方法，制备出具有纳米或微米级的多孔止血材料，所述的介孔生物活性玻璃与壳聚糖或壳聚糖的衍生物的质量百分比为1～90％，所述的介孔生物活性玻璃的主要组成为SiO₂，还可添加CaO、P₂O₅、MgO、Ag₂O、ZnO等，其中二氧化硅和其他氧化物的摩尔比为(50～99)∶(1～50)；表面可以通过氨基接枝改性提高，以与壳聚糖的相容性。

具体步骤如下：

(1)将表面活性剂溶于去离子水溶液中在25～45℃搅拌至澄清，用盐酸调节pH值小于2以下后，加入硅源及钙源、磷源、镁源、银源、锌源中的一种或几种，其中生成的二氧化硅和其他氧化物的摩尔比为(50～99)∶(1～50)，继续搅拌至完全溶解后在90～120℃温度下继续搅拌一定时间，得到溶胶凝胶；

(2)将所制得的溶胶-凝胶烘干，在550℃～700℃温度下烧结6小时，得到介孔生物活性玻璃材料，介孔生物活性玻璃的孔径在3～20nm之间，粒径为0.5～10μm；

(3)将制备好的介孔生物活性玻璃进行表面氨基接枝：将每克介孔生物活性玻璃分散在100ml无水甲苯以及1ml KH550，在80℃水浴回流装置中回流5h，然后用孔径0.22微米微孔滤膜的抽滤瓶抽滤、清洗，清洗过的生物活性玻璃放于100～130℃真空烘箱中干燥12h；表面接枝实验方法参照如下：Jin Sun，Yongsheng Li，Liang Li，et al.Functionalization andbioactivity in vitro of mesoporous bioactive glasses，Journal ofNon-Crystalline Solids 354(2008)3799-3805.

(4)依提供的复合多孔材料不同形态制备步骤分别为：

①复合多孔止血材料为多孔微球的制备是采用水/油乳化体系，首先将氨基接枝改性后介孔生物活性玻璃和壳聚糖醋酸水溶液复合，搅拌均匀；形成乳液，然后将上述乳液在油溶性有机溶剂中反相乳化，得到油/水/油体积，搅拌；

在石蜡、十氢萘或甲苯的油溶性有机溶剂中加入油溶性乳化剂Span80或Span85，其中油溶性乳化剂质量百分比为10～30％；

按油溶性有机溶剂的量为乳液的量的2～8倍，将乳液相缓慢的滴加到油相中，搅拌、用甲醛、乙二醛、戊二醛、香草醛、三聚磷酸钠和京尼平中的任意一种作为交联剂进行交联，得到复合微球，过滤洗涤，然后冷冻干燥得到多孔复合微球；交联剂的量占加入乳液的体积百分比的3-8％；

②复合多孔止血材料为多孔海绵的制备方法为：将氨基接枝改性介孔生物活性玻璃和壳聚糖的醋酸溶液混合均匀，用甲醛、乙二醛、戊二醛、香草醛、三聚磷酸钠或京尼平中的一种作为交联剂进行交联，然后冷冻干燥，其中壳聚糖醋酸水溶液的体积浓度为2～8％，交联剂的浓度为0.5～3％，交联剂的用量为整个混合溶液体积的＞0-4％；

③复合多孔止血材料为多孔粉体颗粒的制备方法为：将制备好的多孔海绵不经过交联，直接经过干燥，然后粉碎成30-50μm大小的粉体。

上述方法中的介孔生物活性玻璃材料的制备方法，其特征在于其结构为有序结构，其比表面积为300-1200m²/g，孔容在0.5～1.8cm³/g之间，其孔径为3～20nm；

上述方法中的介孔生物活性玻璃和壳聚糖复合材料的制备方法，其特征在于介孔生物活性玻璃占整个复合材料的质量百分比1～90％；

上述方法中的介孔生物活性玻璃和壳聚糖复合材料的制备方法，其特征在于所述的介孔生物活性玻璃与壳聚糖复合多孔材料，其微米级孔径在1～50μm，纳米级孔径在3～500nm，孔隙率占整个材料的30～80％；

本发明所述的生物活性玻璃和壳聚糖复合多孔止血材料，不仅止血速度快，而且可以调控细胞的行为和组织的形成，加速创面组织愈合修复，而且制备方法简单，成本低廉，是一种具有开发前景的快速止血材料(详见实施例)。

附图说明

图1是介孔生物活性玻璃的TEM图；

图2是介孔/壳聚糖复合多孔止血材料的SEM图；

图3是介孔/壳聚糖复合多孔止血微球的SEM图。

具体实施方式

实施例1.介孔生物活性玻璃的制备

(1)将P123(聚环氧乙烯环氧丙烯嵌段聚合物)表面活性剂溶于去离子水溶液中在25～45℃搅拌至澄清，用盐酸调节pH＜2后，加入正硅酸乙酯及磷酸三乙酯、四水合硝酸钙、硝酸镁、硝酸银、硝酸锌中的一种或几种，继续搅拌至完全溶解后在90～120℃温度下继续搅拌4天，得到溶胶凝胶；

(2)将所制得的溶胶-凝胶烘干，在550℃～700℃温度下烧结，得到介孔生物活性玻璃材料；

(3)将制备好的介孔生物活性玻璃进行表面氨基接枝，然后清洗，清洗过的生物活性玻璃放于真空烘箱中干燥；

(4)依提供的复合多孔止血材料的不同形态，分为以下3种制备方法

(a)多孔微球的制备

将脱乙酰度为80～95％，粘度为50～800的壳聚糖加入2％的醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，加入改性后的介孔生物活性玻璃，搅拌均匀制成乳液相；取液体石蜡，加入Span 80，搅拌制成油相；将制备好乳液相逐滴加入到制备好的油相中，不停的搅拌，加温到50～80℃，搅拌，加入交联剂交联，继续搅拌，乘热过滤，用蒸馏水反复洗涤，用乙醇洗涤油相和乳化剂，冷冻干燥后得到介孔生物活性玻璃/壳聚糖多孔微球。

(b)介孔生物活性玻璃/壳聚糖复合多孔海绵的制备

将脱乙酰度为80～95％，粘度为50～800的壳聚糖加入到2％的醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，加入改性后的介孔生物活性玻璃，搅拌均匀，加入交联剂进行交联，继续搅拌，然后放入模具中冷冻干燥制得多孔复合止血海绵。

(c)介孔生物活性玻璃/壳聚糖复合多孔粉体的制备

将上述(b)制备好的多孔海绵经过干燥后，粉碎成大小为30-50μm的粉体。

实施例2.止血实施例

a.肝切口的止血实验

取健康成年SD大鼠20只，体重为180±10g，由上海长征医院实验动物中心提供，随机分成4组，每组5只，A1组为纯介孔生物活性玻璃粉，B1组为介孔生物活性玻璃/壳聚糖复合多孔微球，C1组为介孔生物活性玻璃/壳聚糖复合多孔海绵，D1组为止血粉。麻醉成功后，将SD大鼠固定于解剖台上，并用碘尔康溶液消毒，在肋弓下沿着腹中线切一纵行切口，长度约2cm，深度先至皮肤全层，然后提起腹肌沿着腹中线剪开腹肌，注意避开腹内重要脏器，轻轻挤压腹部，肝中叶从切口处被挤出，注意避免损伤肝中叶，用无菌纱布吸干肝脏周围腹腔液，用天平称过重量的无菌纱布垫于肝中叶下，快速切除肝中叶，切线约是肝中叶下缘以上2cm。同时立刻上止血材料，并计时，直至出血停止，记下出血时间，称出吸血的无菌纱布重量，与之前称出的重量相减得出出血量。实验方法详见参考文献：Matsuoka T，Hildreth J，Wisner DH.Liver injury as a model of uncontrolled hemorrhagic shock：resuscitation with different hypertonic regimens.J Trauma，1995，39(4)：674-680.(肝中叶切除出血模型)

表1不同止血材料的出血时间及出血量

b.股动脉的止血实验

取健康成年SD大鼠20只，体重为180±10g，由上海长征医院实验动物中心提供，随机分成4组，每组5只，A1组为纯介孔生物活性玻璃粉，B1组为介孔生物活性玻璃/壳聚糖复合多孔微球，C1组为介孔生物活性玻璃/壳聚糖复合多孔海绵，D1组为止血粉。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg，麻醉后仰面固定于手术台上。剥离颈总动脉约2cm，夹住近心端，用线扎住另一端，沿动脉横向剪一切口，从切口处插入导管并固定。打开近心端止血夹，导管与生理仪相连。静脉注射肝素300U/kg。腹股沟部去毛，用碘酒和酒精棉球消毒，剥离股动脉，用止血夹夹住近心端，将动脉横向剪开占直径1/3的切口。立即擦去喷出的血液，立即纱布压住。然后缓慢松开纱布并立即出血部位施以止血材料，再以纱布用适当压力压住，并开始计时。一定时间(1min)后拿开棉球，观察止血效果，必要时可增加使用止血材料，以后每半分钟观察一次，直至完全止血，记录止血时间。观察一段时间(10min)后拿去止血材料，观察是否会继续出血。记录出血时间及出血量。实验方法详见参考文献：Larson MJ，Bowersox JC，Lim RC，et al.Efficacy of a fibrin hemostatic bandagein controlling hemorrhage from experimental arterial injuries.Arch Surg，1995，130(4)：420-422.

表2不同止血材料的出血时间及出血量

本实施例结果充分说明80wt％介孔生物活性玻璃和20wt％壳聚糖复合多孔止血材料显示出最短的止血时间或最小的出血量，优于同条件下美国StarchMedical Inc公司生产的Perelot TM止血粉；所述的介孔生物活性玻璃为M58S。

Claims (10)

1.一种介孔生物活性玻璃和壳聚糖复合多孔止血材料，其特征在于所述的复合止血材料是由介孔生物活性玻璃与壳聚糖复合而成；所述的介孔生物活性玻璃占整个复合材料的质量百分比1～90％。

2.按权利要求1所述的复合多孔止血材料，其特征在于：

①所述的介孔生物活性玻璃组成为SiO₂和CaO、P₂O₅、MgO、Ag₂O或ZnO中的一种或几种，其中SiO₂和其他氧化物的摩尔比为(50-99)∶(1-50)；

②所述的壳聚糖的脱乙酰度为80-95％，粘度为50-800。

3.按权利要求1所述的复合多孔止血材料，其特征在于所述的复合多孔止血材料为多孔微球、多孔海绵或多孔粉体。

4.按权利要求1或2所述的复合多孔止血材料，其特征在于所述的介孔生物活性玻璃表面通过氨基接枝改性。

5.按权利要求1或2所述的复合多孔止血材料，其特征在于所述的介孔生物活性玻璃的粒径为0.5-10μm，所述的介孔生物活性玻璃孔径在3-20nm之间。

6.制备如权利要求1-4中任一项所述的复合多孔止血材料的方法，其特征在于制备步骤为：

(1)将表面活性剂溶于去离子水溶液中在25～45℃搅拌至澄清，用盐酸调节pH值小于2后，加入硅源及钙源、磷源、镁源、银源和锌源中任意一种或几种，其中生成的二氧化硅和其他氧化物的摩尔比为(50～99)∶(1～50)，继续搅拌至完全溶解后在90～120℃温度下继续搅拌一定时间，得到溶胶-凝胶；

(2)将所制得的溶胶-凝胶烘干后在550℃～700℃温度下烧结6小时，得到介孔生物活性玻璃材料；

(3)将制备好的介孔生物活性玻璃进行表面氨基接枝改性：将每克介孔生物活性玻璃分散在100ml无水甲苯以及1ml KH550，在80℃水浴回流装置中回流5h，然后用孔径0.22微米微孔滤膜的抽滤瓶抽滤、清洗，清洗过的生物活性玻璃放于100～130℃真空烘箱中干燥12h；

(4)按制备的复合多孔止血材料的不同形态，分为以下三种：

(a)复合多孔止血材料为多孔微球的制备方法是采用水/油乳化体系，首先将加有氨基接枝改性介孔生物活性玻璃的壳聚糖的醋酸水溶液搅拌均匀，形成乳液，然后将上述乳液在油溶性有机溶剂中反相乳化，得到油/水/油体系，搅拌、用甲醛、乙二醛、戊二醛、香草醛、三聚磷酸钠或京尼平中的一种作为交联剂进行交联，得到复合微球，过滤洗涤，然后冷冻干燥得到多孔复合微球；交联剂的加入量占加入乳液的3-8vol％；

(b)复合多孔止血材料为多孔海绵的制备方法是将步骤3的氨基接枝改性介孔生物活性玻璃和壳聚糖的醋酸溶液混合均匀，用甲醛、乙二醛、戊二醛、香草醛、三聚磷酸钠或京尼平中的一种作为交联剂进行交联，然后冷冻干燥，其中壳聚糖醋酸水溶液的体积浓度为2～8％，交联剂的浓度为0.5～3％，交联剂的用量为整个混合溶液体积的＞0-4％；

(c)复合多孔止血材料为对空粉体颗粒的制备方法是将上述步骤(b)制备的多孔海绵不经过交联直接干燥，然后粉碎成30-50μm的粉体。

7.按权利要求6所述的复合多孔止血材料的制备方法，其特征在于步骤4(a)中所述的油溶性的有机溶剂为石蜡、十氢萘或甲苯，油溶性有机溶剂的量为乳液的量的2～8倍，其中油溶性乳化剂重量百分比为10～30％，油溶性乳化剂为Span80，Span85。

8.按权利要求6所述的复合多孔止血材料的制备方法，其特征在于所述的复合多孔材料的孔隙率占整个材料的30～80％。

9.按权利要求1、2或3所述的复合止血材料的应用，其特征在于应用于肝切口的止血或股动脉止血。

10.按权利要求9所述的应用，其特征在于80wt％介孔生物活性玻璃和20wt％壳聚糖复合多孔海绵状止血材料显示出最短的止血时间或最小的出血量，优于同条件下美国Starch Medical Inc公司生产的Perelot TM止血粉；所述的介孔生物活性玻璃为M58S。

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