CN107349470A

CN107349470A - 一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法及其在人工骨膜中的应用

Info

Publication number: CN107349470A
Application number: CN201710628349.3A
Authority: CN
Inventors: 陈亮; 顾勇; 辛天闻; 崔文国; 程若昱; 孙智勇
Original assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Current assignee: Hainan Dramick Investment Co.,Ltd.
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2017-07-28
Publication date: 2017-11-17
Anticipated expiration: 2037-07-28
Also published as: CN107349470B

Abstract

本发明提供了一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（（1）甲基丙烯酸改性明胶GelMA的制备；（2）可光交联纳米介孔生物活性玻璃GelMA‑MBGNs的制备；（3）可光交联纳米介孔生物活性玻璃和改性明胶共交联GelMA‑G‑MBGNs水凝胶的制备。本发明的无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，采用共交联双重网状结构不仅显著提升了材料的结构稳定性、降解稳定性，还通过控制无机相离子释放速度达到了维持局部pH相对稳定的目的，从而使材料拥有了更为出色的组织修复功能。

Description

一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法及其在人工骨膜中的应用

技术领域

本发明涉及医用材料领域，具体涉及一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法及其在人工骨膜中的应用。

背景技术

骨膜是覆盖在除关节部位以外骨表面的薄膜，是一层坚固的结缔组织包膜。天然的骨膜可分为内外两层：外层为纤维层，由胶原纤维紧密结合而成，含有成纤维细胞；内层为发生层，含有较粗的胶原纤维，并含有骨祖细胞，可以在特定条件下向成骨细胞分化。成纤维细胞和骨祖细胞都会分泌一定的细胞外基质，该细胞外基质主要是一种天然的矿化胶原成分，其中胶原呈规则排列的多级结构，并为钙磷盐的矿化提供模板，从而形成有序排列的矿化胶原复合体。骨膜可通过血管向骨组织提供营养物质，对骨组织的生长发育以及骨组织缺损的修复起到至关重要的作用。

甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)，它应用广泛，可用于骨、软骨和血管等。明胶（Gel）具有优良的理化性能，如亲水性强、侧链反应活性高等，且明胶来源广泛、价格低廉、生物相容性好、生物可降解等优点，被广泛用于组织工程支架材料。Gel最重要的氨基酸序列是精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD）序列，此序列可促进细胞粘附、增殖和分化。美国食品和药物管理局（FDA）认定明胶安全，且已将Gel用做等离子膨胀剂和稳定剂，包括疫苗等。不仅如此，GelMA不仅具有明胶的生物学活性，还具有光交联水凝胶的理化定制能力。水凝胶由于其具有海绵样多孔结构以及良好的亲水性，可以作为良好的拟细胞外基质材料使用，可以为细胞的增殖和分化提供良好的3D环境。

甲基丙烯酸改性明胶水凝胶（GelMA）是一种光引发交联水凝胶，众多的研究表明，GelMA可以作为组织工程支架以及药物和基因载体使用。然而和其他众多水凝胶材料类似，缺乏必要的无机成份。在应用于成骨修复领域时，加入含有钙、磷、硅等元素的无机成份可以显著提高材料的生物活性，从而提升修复速度和修复效果。纳米介孔生物活性玻璃（Mesoporous Bioactive glasses Nanoparticles，MBGNs）组成成分为SiO₂-CaO-P₂O₅。纳米介孔生物活性玻璃具有普通生物活性玻璃所无法比拟的更大的比表面积且更容易降解，同时具有均一的纳米级介孔结构和良好的生物相容性和热稳定性。因此，本技术中采用MBGNs作为无机相来进行材料的有机-无机复合，从而提升材料的生物活性。随着生物活性玻璃的降解，生物活性玻璃中含有的钙、硅、磷等无机离子随之溶出，可以起到促进新生血管生成或促进骨质生成的目的。但MBGNs其纳米的结构使其有团聚的倾向，传统的直接混合的无机成分加入方式只能从成份上对材料进行改进，对材料的机械性能和结构稳定性的提升并不明显。

发明内容

要解决的技术问题：本发明针对传统无机成分混合加入方式存在的不足提供一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，在加入无机成分的同时提高其机械性能和结构稳定性。

技术方案：一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

（1）甲基丙烯酸改性明胶GelMA的制备；

（2）可光交联纳米介孔生物活性玻璃GelMA-MBGNs的制备

将纳米介孔生物活性玻璃MBGNs加入到正己烷中，超声分散均匀后，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES进行改性，改性后得到APTES-MBGNs，将碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS加入GelMA溶液中搅拌溶解后加入APTES-MBGNs，反应得到GelMA-MBGNs；

（3）可光交联纳米介孔生物活性玻璃和改性明胶共交联GelMA-G-MBGNs水凝胶的制备

将步骤（2）制备的GelMA-MBGNs加至光引发剂2959溶液中超声分散后，加入GelMA溶液，水浴搅拌至完全溶解后置于紫外灯下反应，得到GelMA-G-MBGNs水凝胶。

进一步的，所述的一种应用于人工骨膜的无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，所述甲基丙烯酸改性明胶的制备方法为：称取Gel加入PBS溶液中，于50℃温浴下搅拌1 h至完全溶解，制备15%（w/v）Gel溶液；将MA以0.5 ml/min的速度逐步滴入15%（w/v）Gel溶液，至体积比为1：400，溶液搅拌1 h，得到GelMA溶液；将GelMA溶液置于透析袋中透析过滤后，冻干后于-80℃下冻存。

进一步的，所述的一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，所述GelMA溶液透析袋的截留分子量为12～14 kDa，过滤采用0.22um滤膜过滤。

进一步的，所述一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，所述步骤（2）中GelMA溶液的质量分数为5wt%，其中GelMA溶液中，m_水：m_EDC：m_NHS为200:2-4:1-2。进一步的，所述的一种应用于人工骨膜的无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，所述步骤（2）中的加入APTES-MBGNs与GelMA的质量比为1:1。

进一步的，所述的一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，所述步骤（3）中光引发剂2959的浓度为1wt%。

进一步的，所述的一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，所述步骤（3）中超声分散时间为10min，水浴温度为40℃。

进一步的，所述的一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，所述步骤（3）中紫外灯的光照强度为10mW/cm²，反应时间为5min。

上述的制备方法制备的无机纳米颗粒增强水凝胶在人工骨膜中应用。

有益效果：本发明的无机纳米颗粒增强水凝胶，对MBGNs进行表面氨基改性并进一步接枝GelMA，使MBGNs具有和GelMA进行共交联的性能。采用共交联双重网状结构的GelMA-G-MBGNs水凝胶人工骨膜不仅显著提升了材料的结构稳定性、降解稳定性，还通过控制无机相离子释放速度达到了维持局部pH相对稳定的目的，从而使材料拥有了更为出色的组织修复功能。

附图说明

图1为甲基丙烯酸改性明胶的制备过程图；

图2为制备GelMA-MBGNs的反应流程图；

图3为MBGNs改性前后的FTIR图，其中（a）为未改性的MBGNs，（b）为表面氨基改性的MBGNs，（c）为GelMA-MBGNs；

图4为MBGNs改性前后的SEM和TEM图，其中（a）为未改性的MBGNs的SEM图，（b）为GelMA-MBGNs的SEM图，（c）为未改性的MBGNs的TEM图，（d）为GelMA-MBGNs的TEM图；

图5为光交联水凝胶的合成过程图，其中（a）普通光交联GelMA水凝胶，（b）共混GelMA/MBGNs水凝胶，（c）GelMA-G-MBGNs水凝胶；

图6为三种水凝胶SEM图，其中（a）普通光交联GelMA水凝胶，（b）共混GelMA/MBGNs水凝胶，（c）GelMA-G-MBGNs水凝胶；

图7为三种水凝胶FTIR图，其中（a）普通光交联GelMA水凝胶，（b）共混GelMA/MBGNs水凝胶，（c）GelMA-G-MBGNs水凝胶；

图8为不同浓度GelMA/MBGNs水凝胶的力学测试、溶胀、失重测试图，其中（a）为GelMA水凝胶，（b）为1% GelMA/MBGNs水凝胶，（c）为3% GelMA/MBGNs水凝胶，（d）为5% GelMA/MBGNs水凝胶；

图9为不同浓度GelMA-G-MBGNs水凝胶的力学测试、溶胀、失重测试图，其中（a）为GelMA水凝胶，（b）为1% GelMA-G-MBGNs水凝胶，（c）为3% GelMA-G-MBGNs水凝胶，（d）为5% GelMA-G-MBGNs水凝胶；

图10为三种水凝胶在SBF模拟体液中的离子释放和对溶液pH的影响示意图；

图11为三种水凝胶植入大鼠颅骨4周和8周的micro-CT扫描三维重建图；

图12为三种水凝胶植入大鼠颅骨缺损修复病理切片染色结果，其中（A）病理切片HE染色，（B）一型胶原免疫组织化学染色，（C）CD-31免疫组织化学染色。

具体实施方式

实施例1 GelMA-G-MBGNs水凝胶的制备

（1）GelMA的制备

称取7.5gGel加入50mlPBS溶液中，于50℃温浴下搅拌1 h 至完全溶解，制备15%（w/v）Gel溶液；将MA以0.5 ml/min的速度逐步滴入15%（w/v）Gel溶液，至体积比为1：400，溶液搅拌1 h，得到GelMA溶液；将GelMA溶液置于透析袋（截留分子量为12～14 kDa）中透析，再采用0.22um滤膜过滤后，冻干后于-80℃下冻存（图1）；

（2）GelMA-MBGNs的制备

将0.3gMBGNs加入到100mL正己烷中，超声分散均匀后，加入5mLAPTES，在60℃水浴，于转速400rpm搅拌8h进行改性，洗净干燥后得到APTES-MBGNs，再配置5%（w/v）GelMA溶液，将2gEDC和1gN-羟基琥珀酰亚胺NHS加入100gGelMA溶液中搅拌溶解后加入5g APTES-MBGNs，室温搅拌反应12h，过滤洗净得到GelMA-MBGNs（图2、图3和图4）；

（3）GelMA-G-MBGNs水凝胶的制备

将步骤（2）制备的GelMA-MBGNs按1%（w/v），3%（w/v）以及5%（w/v）加至1%（w/v）光引发剂2959溶液中超声分散10min后，加入15%（w/v）GelMA溶液，40℃水浴搅拌至完全溶解后置于10mW/cm²紫外灯下反应，反应时间为5min，得到不同质量分数的GelMA-G-MBGNs水凝胶。

对比例1 普通光交联GelMA水凝胶的制备

（1）GelMA的制备

称取7.5gGel加入50mlPBS溶液中，于50℃温浴下搅拌1 h 至完全溶解，制备15%（w/v）Gel溶液；将MA以0.5 ml/min的速度逐步滴入15%（w/v）Gel溶液，至体积比为1：400，溶液搅拌1 h，得到GelMA溶液；将GelMA溶液置于透析袋（截留分子量为12～14 kDa）中透析，再采用0.22um滤膜过滤后，在干燥环境下保存；

（2）普通光交联GelMA水凝胶的制备

将步骤（1）制备的15%（w/v）GelMA加至1%（w/v）光引发剂2959溶液中超声分散10min，40℃水浴搅拌至完全溶解后置于10mW/cm²紫外灯下反应，反应时间为5min，得到普通光交联GelMA水凝胶。

对比例2 共混GelMA/MBGNs水凝胶的制备

（1）GelMA的制备

（2）共混GelMA/MBGNs水凝胶的制备

将MBGNs按1%（w/v），3%（w/v）以及5%（w/v）加至1%（w/v）光引发剂2959溶液中超声分散10min后，加入15%（w/v）GelMA溶液，40℃水浴搅拌至完全溶解后置于10mW/cm²紫外灯下反应，反应时间为5min，得到共混GelMA/MBGNs水凝胶。

根据实施例1的步骤（2），结合图4可以发现，改性对MBGNs的分散性能以及内部介孔形貌变化影响不明显，如图3所示，APTES-MBGNs与MBGNs相似，而在1635cm-1处出现NH2振动吸收带，1540 cm-1为其面内弯曲振动峰，2960cm-1处出现明显的亚甲基C-H伸缩振动峰，1570cm-1处为C-C振动峰，表明改性的成功，而且G-MBGNs曲线中1635cm-1处NH2振动吸收带的增强侧面反映了GelMA在MBGNs表面接枝的成功。

根据实施例1和对比例1-2所述的三种水凝胶，如图5所示，三种水凝胶材料均可在光照后成型；如图6所示，三种水凝胶材料均呈现3D复合孔结构，孔隙分布均匀，孔与孔互相贯通，孔径150±20 μm，孔壁内均匀镶嵌MBGNs颗粒，随着MBGNs比例增加（1 wt%，3 wt%，5wt%），孔径无明显变化。图7表示三种水凝胶材料的FTIR，GelMA-G-MBGNs曲线中2350 cm-1处出现新吸收峰，证明C-N键的存在，表明双交联网络的形成。

实施例2 普通光交联GelMA水凝胶、共混GelMA/MBGNs水凝胶、GelMA-G-MBGNs水凝胶力学性能、溶胀和失重的比较

根据制备时MBGNs质量分数的异同，进行压缩模量的比较。所有水凝胶样品都制做成为直径5mm，高度2mm的圆片状，测试前在室温缓冲溶液中浸泡12小时充分溶胀后备用。将溶胀后的圆片状水凝胶置于力学测试机上以0.4mm每分钟的速度进行压缩得到压力-形变曲线，再将压力-形变曲线变换为应力-应变曲线，计算应力-应变曲线的线性段斜率即可得到材料的压缩模量。结合图8和9可以发现，GelMA水凝胶的压缩模量为21.5kPa±2.8kPa。当MBGNs比例相同时，GelMA-G-MBGNs的压缩模量分别为24.9kPa±3.1kPa，38.4kPa±1.5kPa，27.7kPa±2.9kPa，均大于GelMA/MBGNs的23.3kPa±2.4kPa，31.4kPa±3.0kPa，26.6kPa±2.2kPa，但是仅当MBGNs为3 wt%时，两组差异才有统计学意义（p<0.05），由图可见随着MBGNs比例的提高，水凝胶在相同压缩程度下承载的压力逐渐提升，压缩模量也逐渐提升，但是当MBGNs比例超过3%时，又出现力学性能的下降。

根据制备时MBGNs质量分数比例异同，进行溶胀比较。将不同的水凝胶材料制成直径5mm，高度2mm的圆片状后冷冻干燥并称取重量W₀，水凝胶材料在PBS中浸泡12小时并在不同时间点记录其重量W₁，经过计算溶胀率=（W₁-W₀）/W₀*100%，实验结果如图8、9所示，GelMA/MBGNs组中1wt%MBGNs组和GelMA组溶胀百分比相差不大，3wt%MBGNs组和GelMA组溶胀百分比相差约为50%，而5wt%MBGNs组和GelMA组溶胀百分比相差可达100%，同一时间GelMA-G-MBGNs组中1%MBGNs组和GelMA组溶胀百分比相差为70%，3wt%MBGNs组和GelMA组溶胀百分比相差约为120%，而5wt%MBGNs组和GelMA组溶胀百分比相差可达200%相差明显大于GelMA/MBGNs组。这一结果说明共混组的溶胀性明显高于共交联组，这也可从侧面反映出在加入同样质量分数MBGNs时，化学共交联组GelMA水凝胶的结构稳定性要高于混合组。

根据制备时MBGNs质量分数比例异同，进行失重比较。同样结合图8和9，将不同的水凝胶材料制成直径5mm，高度2mm的圆片状后冷冻干燥并称取重量W₀，在PBS中浸泡28d后，经过冷冻干燥后称重得到重量W₁，经过计算失重率=（W₀-W₁）/W₀*100%。随着时间延长，MBGNs比例相同的GelMA/MBGNs的失重率呈下降趋势；而随着MBGNs比例增加，失重率下降幅度增大。因此，在GelMA/MBGNs组失重率在不同时刻均表现为MBGNs质量分数为5%时失重速率最大，1%居中，而3%最低，但最终稳定失重速率均大于纯GelMA组。而随着时间延长，MBGNs比例相同的GelMA-G-MBGNs的失重率也呈下降趋势，但是下降速率均较GelMA/MBGNs组缓和，最终稳定失重速率均小于GelMA组；在第28天时，相同组分比例的GelMA/MBGNs组的失重率均大于GelMA-G-MBGNs组，GelMA/MBGNs组含有1%，3%，5%MBGNs重量下降分别为76.4%±1.4%，74.5%±1.3%，67.5%±2.5%，GelMA-G-MBGNs组含有1wt%，3wt%，5wt%MBGNs重量下降分别为88%±1%，85%±1.6%，80.5%±1.5%，差异有统计学意义。这一结果说明随着MBGNs含量的提升，材料的失重率都逐渐上升，说明在相同MBGNs含量的条件下，GelMA-G-MBGNs组的结构稳定性均高于GelMA/MBGNs组，这可以从侧面反映出双交联结构可以提升水凝胶材料的稳定性。

以上实验从直接力学角度，降解稳定性和溶胀性三方面对材料进行了对比，对比结果表明相对于纯GelMA和GelMA/MBGNs，GelMA-G-MBGNs组拥有更良好的结构稳定性，从而反映了共交联手段带来的双重网状结构与共混的单纯网状结构相比稳定性更高，此外有望通过调节MBGNs的含量可以达到控制降解速度的目的。

实施例3 共混GelMA/MBGNs水凝胶和GelMA-G-MBGNs水凝胶离子释放的实验

将实施例1中所述圆盘状材料浸泡在SBF模拟体液中分别经过12小时，1天，2天，3天，5天，7天后取出溶液使用ICP-AES（电感耦合等离子体原子发射光谱仪）测定其中的钙、磷、硅浓度，并使用pH计测试pH值。如图10所示，GelMA/MBGNs、GelMA-G-MBGNs，以及MBGNs均具有相似的Si释放特点， 24 h内浓度迅速达到最大值达到40ppm，在随后的时间里，浓度变化不大始终在40ppm左右波动，而MBGNs组可达50ppm，而GelMA-G-MBGNs组Si浓度始终在40ppm以下并且保持平稳。P浓度在开始的24h内急剧减少，MBGNs组GelMA/MBGNs组，GelMA-G-MBGNs组在24小时分别减少至10ppm，13ppm，18ppm，随后较少速度趋于稳定并且速度一致，到7天时，MBGNs组接近 0ppm，GelMA/MBGNs组和GelMA-G-MBGNs组分别为4ppm和10ppm。三种材料具有类似的Ca释放特点，浸泡12 h后，Ca浓度稍增加，之后开始下降，3 d后又上升，MBGNs组下降幅度较大较明显，最终稳定在70ppm而GelMA/MBGNs组和GelMA-G-MBGNs组最终稳定与90ppm左右。各组溶液的pH值变化曲线比较相似，开始的12 h，pH值迅速增大，MBGNs组可达7.7，GelMA/MBGNs组和GelMA-G-MBGNs组分别为7.6和7.5；12 h之后，先有短暂的降低，随后又有所增大，但GelMA-G-MBGNs组较GelMA/MBGNs 组和MBGNs组pH变化幅度更为缓和，始终在pH=7.55附近。由离子释放结果可以看出，当MBGNs比例降低时，随着Si的溶出，局部体液环境会发生碱性化，通过化学结合方法使水凝胶材料的化学结构更为稳定可以有效控制Si⁴⁺的释放速度，从而降低局部环境pH值变化的幅度，保持局部内环境的相对稳定，这对促进局部细胞增殖分化是至关重要的，而现有的有机-无机复合体系大多无法达到控制局部微环境稳定的目的。

综上所述，GelMA-G-MBGNs水凝胶共交联的双重网状结构其结构稳定和降解稳定性更好，还可以通过控制无机相离子释放速度达到了维持局部pH相对稳定的目的，从而使材料拥有了更为出色的组织修复功能。

实施例4 GelMA水凝胶，共混GelMA/MBGNs水凝胶和GelMA-G-MBGNs水凝胶人工骨膜在大鼠颅骨缺损修复中应用的实验

将48只雄性SD大鼠被随机分为对照组，GelMA组，GelMA/MBGNs组和GelMA-G-MBGNs组，评价了植入水凝胶盘后颅骨缺损的成骨能力。将水凝胶植入SD大鼠的颅骨中的缺损中（直径5mm），其用直径为5mm的圆锯制备。分别在4周和8周对大鼠进行micro-CT扫描并且随后处死大鼠取出颅骨标本进行切片，切片后进行HE染色，一型胶原免疫组化和CD-31免疫组化染色，结果如图11和图12所示，所有实验组的修复效果均好于空白对照组，实验组中骨缺损修复效果和促血管生成效果均为GelMA-G-MBGNs组好于GelMA/MBGNs组，GelMA/MBGNs组好于纯GelMA组。

Claims

1.一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）甲基丙烯酸改性明胶GelMA的制备；

（2）可光交联纳米介孔生物活性玻璃GelMA-MBGNs的制备

2.根据权利要求1所述的一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸改性明胶的制备方法为：称取Gel加入PBS溶液中，于50℃温浴下搅拌1 h 至完全溶解，制备15%（w/v）Gel溶液；将MA以0.5 ml/min的速度逐步滴入15%（w/v）Gel溶液，至体积比为1：400，溶液搅拌1 h，得到GelMA溶液；将GelMA溶液置于透析袋中透析过滤后，冻干后于-80℃下冻存。

3.根据权利要求2所述的一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，其特征在于：所述GelMA溶液透析袋的截留分子量为12～14 kDa，过滤采用0.22um滤膜过滤。

4.根据权利要求1所述一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中GelMA溶液的质量分数为5wt%，其中GelMA溶液中，m_水：m_EDC：m_NHS为200:2-4:1-2。

5.根据权利要求1所述的一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的加入APTES-MBGNs与GelMA的质量比为1:1。

6.根据权利要求1所述的一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中光引发剂2959的浓度为1wt%。

7.根据权利要求1所述的一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中超声分散时间为10min，水浴温度为40℃。

8.根据权利要求1所述的一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中紫外灯的光照强度为10mW/cm²，反应时间为5min。

9.根据权利要求1-7所述的制备方法制备的无机纳米颗粒增强水凝胶在人工骨膜中应用。