CN114588312B - 功能化纤维大分子交联体键合3d打印弹性植入体及其制备方法与应用 - Google Patents

功能化纤维大分子交联体键合3d打印弹性植入体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体，由具有相互贯通的微米级大孔3D打印支架、以及附着在3D打印支架上并且分布于3D打印支架的微米级大孔中的胶原复合材料组成；3D打印支架由聚乙烯醇、多巴胺和微米级羟基磷灰石组成；胶原复合材料是具有儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联以及具有儿茶酚官能团的高分子材料与胶原通过迈克尔加成反应形成的具有微米级小孔的高分子网络；3D打印支架通过多重化学反应与胶原复合材料而化学键合在一起。本发明可增强植入体中无机相与有机相之间的结合强度和整合度，并赋予其分级式孔结构，提高其骨修复性能。本发明还提供了该植入体在骨修复领域中的应用。

Description

功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体及其制备方 法与应用
技术领域
本发明属于生物材料及其制备技术领域，涉及功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体及其制备方法与应用。
背景技术
现有的骨修复材料多种多样，临床上理想的骨修复材料应当具备生物相容性、骨传导性、骨诱导性、合适的孔结构以及一定的机械强度等特性，3D打印技术的进步使得精细有效地控制有机-无机杂化结构及其组成成为可能，特别是能够个性化调节纤维尺寸、孔隙率以及骨修复植入物的形状。但是，若仅依靠有机成分与无机成分之间的界面键合，会导致骨修复材料的物理性能和生物功能等方面出现一定的不足。
多层级孔隙结构中相互连接的大孔可为细胞向内生长提供通道，微纳米结构可为生物活性分子提供更多的吸附位点，并改善营养和代谢废物的运输。这种相互连接的三维层次结构通过细胞粘附、渗透、增殖和组织向内渗透生长来包围周围的细胞和组织，可诱导早期成骨性能，因此，多层级孔隙结构在生物医用材料及组织工程支架设计方面引起了国内外学者的广泛关注。
CN 109568674A公开了载药型仿生骨修复多孔支架的制备方法及其产品和应用，该方法将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)与纳米羟基磷灰石(nHA)预混合后熔融共混，得到3D打印“墨水”，利用熔融3D打印技术将该“墨水”打印成PLGA/nHA多孔支架，将该多孔支架在溶解了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的明胶溶液中充分浸泡之后取出冷冻干燥，制备得到了复合载药明胶涂层的PLGA/nHA多孔骨修复支架。虽然该方法利用熔融3D打印技术可制备得到孔径、孔隙率及形状可控的多孔支架，在负载BMP-2蛋白后可提高产品的促骨生长能力。但是，该方法制备的产品中载药明胶与PLGA/nHA多孔支架之间缺少化学键合，因而力学性能和溶胀性能较差，在植入体内之后容易发生大面积的溶胀，导致其无法精准修复组织器官，严重的甚至可能导致严重的炎症反应，存在二次手术的风险。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体及其制备方法，以增强植入体中的无机相羟基磷灰石与其上的有机相胶原复合材料之间的结合强度和整合度，并赋予植入体微米级的分级式孔结构，以在组织重建促进植入体向成骨方向转化，本发明的目的之二是提供上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体在骨修复领域的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体，该植入体由具有相互贯通的微米级大孔3D打印支架、以及附着在3D打印支架上并且分布于3D打印支架的微米级大孔中的胶原复合材料组成；
3D打印支架由聚乙烯醇、多巴胺和微米级羟基磷灰石组成；胶原复合材料是具有儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联以及具有儿茶酚官能团的高分子材料与胶原通过迈克尔加成反应形成的具有微米级小孔的高分子网络；
3D打印支架与胶原复合材料之间通过具有儿茶酚官能团的高分子材料的酚羟基与3D打印支架的微米级羟基磷灰石中的钙离子螯合反应、具有儿茶酚官能团的高分子材料与3D打印支架表面的多巴胺的氧化自交联反应、以及胶原与3D打印支架表面的多巴胺的迈克尔加成反应而化学键合在一起。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的技术方案中，植入体中胶原复合材料含量为15wt.％～25wt.％。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的技术方案中，胶原复合材料是具有儿茶酚官能团的高分子材料与胶原按照(0.5～2):1的质量比反应形成的。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的技术方案中，3D打印支架中聚乙烯醇、微米级羟基磷灰石与多巴胺的质量比为(70～140):(10～20):(0.05～2)。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的技术方案中，微米级羟基磷灰石的1～200μm，优选为1～100μm。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的技术方案中，所述具有儿茶酚官能团的高分子材料包括多巴胺改性的透明质酸、多巴胺改性的丝素蛋白或多巴胺改性的明胶。进一步地，所述具有儿茶酚官能团的高分子材料，是将多巴胺接枝在生物相容性的高分子材料上形成的，所述的生物相容性高分子材料包括透明质酸、丝素蛋白、明胶等，多巴胺在生物相容性材料上的接枝率为5％～40％，优选为5％～20％。作为多巴胺接枝改性基础的生物相容性高分子材料的分子量通常可为100～2000kDa。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的技术方案中，所述胶原为I型胶原。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的技术方案中，具有儿茶酚官能团的高分子材料与胶原之间的迈克尔加成反应，主要是具有儿茶酚官能团的高分子材料与胶原上的氨基、巯基等基团之间发生的加成反应。类似的，胶原与3D打印支架表面的多巴胺的迈克尔加成反应，主要是胶原上的氨基、巯基等基团与3D打印支架表面的多巴胺之间发生的加成反应。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的技术方案中，所述微米级大孔的尺寸为200～1000μm，微米级小孔的尺寸为10～200μm。微米级大孔的尺寸大于微米级小孔的尺寸。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的技术方案中，所述3D打印支架是将3D打印浆料通过3D打印的方式制备成支架，去除支架中的水分之后得到的；所述3D打印浆料是多巴胺和微米级羟基磷灰石均匀分散在聚乙烯醇溶液中形成的。
本发明还提供了上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇溶于热水并冷却至室温，将多巴胺和微米级羟基磷灰石均匀分散在所得聚乙烯醇溶液中得到3D打印浆料；通过3D打印的方式制备成支架，去除支架中的水分，得到3D打印支架；
(2)将具有儿茶酚官能团的高分子材料溶解，将胶原溶解，将所得具有儿茶酚官能团的高分子材料的溶液与胶原溶液充分混合，然后调节pH值至中性形成溶胶；
(3)立即将步骤(1)制备的3D打印支架浸没于步骤(2)配制的溶胶中，使溶胶充满3D打印支架的孔隙，将孔隙内充满了溶胶的3D打印支架静置至溶胶转变为凝胶状态，冷冻干燥，即得3D打印工程化植入体。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的制备方法中，步骤(1)所述聚乙烯醇溶液的浓度为10wt.％～20wt.％。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的制备方法中，步骤(1)将多巴胺溶液和微米级羟基磷灰石均匀分散在聚乙烯醇溶液中得到3D打印浆料，所述多巴胺溶液的浓度为10～60mmol/L。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的制备方法的步骤(2)中，将具有儿茶酚官能团的高分子材料用水溶解形成浓度为5～50mg/mL的具有儿茶酚官能团的高分子材料的溶液，将胶原用醋酸溶液溶解形成浓度为5～50mg/mL的胶原溶液。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的制备方法的步骤(2)中，所述调节pH值至中性形成溶胶的指调节pH值至6.8～7.2形成溶胶。
上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的制备方法的步骤(3)在形成凝胶的过程中，具有儿茶酚官能团的高分子材料发生了氧化自交联、具有儿茶酚官能团的高分子材料与胶原之间发生了迈克尔加成反应，同时，具有儿茶酚官能团的高分子材料的酚羟基与3D打印支架的微米级羟基磷灰石中的钙离子发生了螯合反应、具有儿茶酚官能团的高分子材料与3D打印支架表面的多巴胺发生了氧化自交联反应、胶原与3D打印支架表面的多巴胺支架发生了迈克尔加成反应，以上这些反应过程，不但形成了具有微米级小孔的高分子网络，而且将胶原与3D打印支架化学键合为一体。
本发明以具有儿茶酚官能团的高分子材料作为桥梁，将生物活性的胶原通过物理吸附和化学反应均匀锚定在3D打印支架上以及3D打印支架的孔隙结构之中，形成了具有微米级大孔-小孔的多级孔结构的多孔类骨质结构的植入体。具体通过具有儿茶酚官能团的高分子材料发生的氧化自交联、具有儿茶酚官能团的高分子材料与胶原之间发生的迈克尔加成反应、具有儿茶酚官能团的高分子材料的酚羟基与3D打印支架的微米级羟基磷灰石中的钙离子发生的螯合反应、具有儿茶酚官能团的高分子材料与3D打印支架表面的多巴胺发生的氧化自交联反应、胶原与3D打印支架表面的多巴胺支架发生的迈克尔加成反应，将胶原与3D打印支架化学键合在了一起。化学键合相对于单纯的物理结合，具有更好的结合强度，同时，化学键合增强的结合可促使胶原复合材料更好地贴合在3D打印支架上，起到压迫止血及与周围组织进行湿粘附的作用，可良好的固定在缺损部位，对大段骨缺损模型的修复更具优势。微米级大孔-小孔的多级孔结构不仅能为细胞粘附和细胞迁移提供了附着位点，而且有利于在植入体内之后各种营养物质及气体的交换，为植入部位提供利于细胞及组织生长的微环境。此外，利用3D打印技术可高精度、个性化定制出与骨骼损伤部位贴合度更好的3D打印支架。以上因素都有利于3D打印工程化植入体在组织重建中向成骨方向转化，实现更好的骨修复效果。
本发明通过体外细胞实验证实，本发明提供的功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体没有明显的细胞毒性并能促进细胞增殖，具有良好的生物相容性。同时，在体外共培养14天后，植入体未出现明显的收缩及溶胀现象，保持了稳定的结构，并且其中的细胞呈现高密度均匀分布。
本发明通过兔子临界颅骨缺损修复实验证实，本发明提供的功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体对颅骨缺损具有优异的修复效果，可促进兔子颅骨缺损再生，不仅能在缺损处形成大量的新生骨组织，且新生骨组织与3D打印工程化植入体的骨整合度良好。说明该植入体具有良好的宿主骨整合和骨传导能力。
基于以上实验结果，本发明还提供了上述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体在骨修复领域中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供了功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体，由具有相互贯通的微米级大孔3D打印支架、以及附着在3D打印支架上并且分布于3D打印支架的微米级大孔中的胶原复合材料组成；3D打印支架由聚乙烯醇、多巴胺和微米级羟基磷灰石组成；胶原复合材料是具有儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联以及具有儿茶酚官能团的高分子材料与胶原通过迈克尔加成反应形成的具有微米级小孔的高分子网络；3D打印支架与胶原复合材料之间通过具有儿茶酚官能团的高分子材料的酚羟基与3D打印支架的微米级羟基磷灰石中的钙离子螯合反应、具有儿茶酚官能团的高分子材料与3D打印支架表面的多巴胺的氧化自交联反应、以及胶原与3D打印支架表面的多巴胺的迈克尔加成反应而化学键合在一起。一方面，本发明通过在3D打印支架中引入多巴胺，以具有儿茶酚官能团的高分子材料作为桥梁，通过多重化学反应将生物活性的有机相胶原与无机相羟基磷灰石整合为一体，可以克服现有支架材料中有机相与无机相之间缺少化学键合而造成的整合度、力学性能和溶胀性能欠佳的问题。另一方面，本发明通过多重的化学反应在3D打印支架的微米级大孔中引入了微米级小孔，这种分级式孔结构不仅能为细胞粘附和迁移提供丰富的附着位点，而且有利于各种营养物质及气体的交换，可在植入部位提供利于细胞及组织生长的微环境，相对于仅具有单一孔结构的3D打印支架材料，本发明可提高植入体的生物活性。
2.本发明提供的功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体具有类似骨小梁的结构，具有适合细胞长入的多重孔隙结构，3D打印支架与胶原之间通过化学键结合，解决了现有技术这这类支架材料存在的有机高分子与无机羟基磷灰石支架结合不够紧密的问题，可以通过3D打印技术个性化定制出与骨骼损伤部位吻合的植入体，也可以在制备好之后自由剪裁，用于方式灵活、多样化，在骨组织修复领域有着广阔的应用前景。
3.本发明通过体外细胞实验证实该植入体没有明显的细胞毒性并能促进细胞增殖，具有良好的生物相容性。同时，该植入体在体外培养过程中结构稳定，未出现明显的收缩及溶胀现象。本发明还通过兔子临界颅骨缺损修复实验证实，该植入体可促进兔子颅骨缺损再生，不仅能在缺损处形成大量的新生骨组织，且新生骨组织与3D打印工程化植入体的骨整合度良好。说明本发明提供的功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体在骨组织缺损修复领域应用时可产生良好的修复效果。
附图说明
图1是透明质酸钠及实施例2制备的多巴胺改性的透明质酸的核磁氢谱。
图2是实施例1制备的3D打印支架(DPH)和实施例3制备的3D打印弹性植入体(DPHH)的光学照片和SEM照片。
图3是实施例1制备的3D打印支架(DPH)和实施例3制备的3D打印弹性植入体(DPHH)的热重及差示扫描量热测试结果。
图4是HAD/COL冻干水凝胶和实施例3制备的3D打印弹性植入体(DPHH)的红外光谱测。
图5是实施例3制备的3D打印弹性植入体(DPHH)的不同时间点的溶胀测试结果。
图6是3D打印弹性植入体与细胞体外共培养不同时间后的细胞的增殖情况。
图7是3D打印弹性植入体与细胞体外共培养不同时间后的FDA/PI染色结果。
图8是3D打印弹性植入体与细胞体外共培养不同时间后的鬼笔环肽/DAPI染色结果。
图9是3D打印弹性植入体在植入兔子颅骨缺损模型15周后的颅骨缺损修复情况，其中，第一行和第二行是冠状截面图和三维重建结果，第三行是X-ray图像，第四行是大体观。
图10是3D打印弹性植入体在植入兔子颅骨缺损模型15周后的颅骨缺损修复情况的定量分析结果，其中的(A)(B)(C)(D)图分别是骨小梁数目、骨体积密度、骨小梁厚度以及骨小梁间隙数据。
图11是3D打印弹性植入体在植入兔子颅骨缺损模型15周后的颅骨缺损修复情况的组织学评价结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体及其制备方法与应用。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例中，制备3D打印支架，步骤如下：
将聚合度为1700，醇解度为99％的聚乙烯醇(PVA)颗粒加入超纯水中，加热搅拌至PVA完全溶解，冷却至室温，得到浓度为16wt.％的PVA溶液。
向PVA溶液中加入浓度为52.7mmol/L的多巴胺溶液，充分混合，然后加入粒径为25～80μm的羟基磷灰石颗粒，在室温下用混合脱泡仪混匀并脱泡，得到3D打印浆料。
该3D打印浆料中，PVA、羟基磷灰石以及多巴胺的质量比为116:16:1。该3D打印浆料是以水为溶剂配制而成的，其中不含有毒有害溶剂，生物安全性好，具有适用于直接挤出式打印的流变学性质，适合用于人工器官构建、诱导组织再生等方面的生物打印。
将3D打印浆料转移到3D打印机的打印料管中，通过Bio-architect@Pro直接挤出式打印机进行打印成0/90/0正交结构的支架。打印参数如下：打印丝间距为1.0mm，层高设置为0.32mm，打印模型为10*10*3mm的立方体，通过bioprinter软件进行切片，打印过程无需固化，挤出即可成型。通过调整打印丝间距和丝的直径，可以调整3D打印支架的孔径，即微米级大孔的孔径。
在打印结束后，迅速将打印的支架浸没无水乙醇中进行脱水，每个支架均在无水乙醇中脱水3次，每次脱水15min，脱水后自然风干，得到一系列3D打印支架，将3D打印支架记作DPH。
实施例2
本实施例中，制备多巴胺改性的透明质酸(HAD)，步骤如下：
(1)向浓度为11.5mg/mL的透明质酸钠(Mw＝300kDa)水溶液中滴加浓度为46mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，然后滴加浓度为150mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)溶液，搅拌反应1h，然后加入盐酸多巴胺粉末搅拌反应12h，两次搅拌反应过程中均控制pH值在5.0，该步骤的操作均在氮气保护的无氧条件下进行，透明质酸钠、EDCI、NHS与盐酸多巴胺的质量比为400:766:230:230；
(2)将步骤(1)所得反应液用透析膜(Mw＝3.5～8kDa)在pH值为3.5的超纯水中透析3天，冷冻干燥，即得多孔海绵状的HAD，其结构式如式(I)所示，将其保存于-20℃的环境中备用。
Figure BDA0003515736970000071
对本实施例采用的透明质酸钠和制备的HAD进行1HNMR表征，结果如图1所示，HAD的核磁氢谱中在6.8ppm附近出现了多巴胺的特征氢谱，说明HAD制备成功，通过积分结果测得HAD中多巴胺的接枝率约为6％。
实施例3
本实施例中，制备功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体，步骤如下：
(1)取实施例2制备的HAD溶于超纯水中，得到浓度为25mg/mL的HAD溶液。将Ⅰ型胶原溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，得到浓度为25mg/mL的I型胶原溶液。在冰浴上将HAD溶液和I型胶原溶液在搅拌条件下按照1:1的体积比充分混合，然后在搅拌条件下向所得混合液中加入NaOH溶液调节pH值至7.2形成溶胶。
(2)立即取实施例1制备的3D打印支架迅速浸没于步骤(1)制备的溶胶中，使溶胶充满3D打印支架的孔隙，该过程中注意观察溶胶中是否出现气泡，若出现气泡，需要用注射器将其中的气泡去除。之后将孔隙内充满了溶胶的3D打印支架静置至溶胶转变为凝胶状态，然后冷冻干燥，即得功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体，记作DPHH。
实施例1制备的3D打印支架(DPH)以及本实施例制备的3D打印弹性植入体(DPHH)的光学照片和SEM照片如图2所示，图2的(A)(B)(C)(D)四组图分别代表DPH和DPHH的光学照片、俯视SEM照片、侧视SEM照片和SEM照片的局部放大图。由图2可知，在DPH中具有边长约为800μm的正方形大孔，在向DPH中引入HAD与I型胶原的复合材料之后，在DPH的3D打印支架上以及3D打印支架的大孔中，形成了丰富的小孔，小孔的尺寸基本在200μm以内，这些小孔是由步骤(2)形成的水凝胶在冷冻干燥后形成的。说明本实施例通过向3D打印支架中引入凝胶并冷冻干燥，可形成微米级大孔与小孔的多层级孔结构的3D打印弹性植入体，该多层级孔结构与天然骨组织有着相似的空间结构。
对实施例1制备的3D打印支架(DPH)以及本实施例制备的3D打印弹性植入体(DPHH)进行热重及差示扫描量热(DSC)表征，结果如图3所示。图3的(B)图所示的热重测试结果证明I型胶原纤维与HAD反应形成的胶原复合材料在整个3D打印工程化植入体中的重量含量约为20％，图3的(A)图所示的DSC结果显示，相较于3D打印支架，3D打印弹性植入体的分解温度提高了约23℃，证明在3D打印弹性植入体中形成了新的化学键。
对本实施例制备的3D打印弹性植入体(DPHH)进行红外光谱测试，同时制备HAD/COL冻干水凝胶并进行红外光谱测试，结果如图4所示。
HAD/COL冻干水凝胶的制备方法为：取实施例2制备的HAD溶于超纯水中，得到浓度为25mg/mL的HAD溶液。将Ⅰ型胶原溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，得到浓度为25mg/mL的I型胶原溶液。在冰浴上将HAD溶液和I型胶原溶液在搅拌条件充分混合，然后在搅拌条件下向所得混合液中加入NaOH溶液调节pH值至7.2，然后静置至其转变为凝胶状态，冷冻干燥，即得。
由图4可知，对于3D打印弹性植入体，在1730cm-1左右出现了明显的羰基的伸缩振动峰，这说明在3D打印弹性植入体中，3D打印支架与HAD之间发生了交联反应。
对比例1
本对比例中，制备负载胶原纤维的支架，步骤如下：
(1)将Ⅰ型胶原溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，得到浓度为25mg/mL的I型胶原溶液，然后在搅拌条件下向I型胶原溶液中加入NaOH溶液调节pH值至7.2。
(2)立即取实施例1制备的3D打印支架迅速浸没于I型胶原溶液中，使I型胶原溶液充满3D打印支架的孔隙，该过程中注意观察I型胶原溶液中是否出现气泡，若出现气泡，需要用注射器将其中的气泡去除。之后将孔隙内充满了I型胶原溶液的3D打印支架静置至溶液转变为凝胶状态，然后冷冻干燥，即得负载胶原纤维的支架。
实施例4
本实施例中，通过体外细胞实验测试实施例3制备的3D打印弹性植入体的生物活性。
将实施例3制备的3D打印弹性植入体浸没于孔板内的培养基中，将BMSC细胞悬液逐滴滴加在3D打印弹性植入体上，滴加完成后，将孔板置于培养箱中在37℃、5％的CO2的条件下培养，培养期间每隔2天更换一次培养基。
所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入质量浓度为1％青霉素和链霉素混合液、质量浓度为0.2％的抗坏血酸以及质量浓度为10％的胎牛血清得到，本实施例中青霉素和链霉素混合液由HyClone公司提供。
从开始培养时开始，每隔一段时间对3D打印弹性植入体的尺寸进行测量，以考察其在细胞培养过程中的尺寸变化情况，图5示意的是在培养基中浸没不同时间后，3D打印弹性植入体的高度变化情况。由图5可知，本发明提供的3D打印弹性植入体在培养基中浸没3天后，其尺寸基本未发生变化，基本未发生溶胀情况，说明3D打印弹性植入体具有优异的稳定性。这主要是由于3D打印支架的支撑以及3D打印支架上的胶原复合材料与3D打印支架之间的化学键合的共同作用的结果。这有利于提升3D打印弹性植入体的力学性能和改善其溶胀性能，可避免因植入体在体内过度溶胀而造成的无法精准修复组织器官以及导致炎症反应的问题。
在培养3天、7天和14天后取出3D打印弹性植入体，使用CCK-8测试其中细胞的增殖情况，增殖情况如图6所示。
在培养3天、7天和14天后取出取出3D打印弹性植入体，用PBS缓冲液清洗2遍，然后浸没于含有FDA和PI的PBS缓冲液中染色1min，通过激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察其中细胞的生长状态和分布情况，FDA/PI染色结果如图7所示，其中的(A)(B)(C)图分别代表培养3天、7天和14天的FDA/PI染色结果。
在培养3天、7天和14天后取出3D打印弹性植入体，用PBS缓冲液清洗2遍，然后浸没于含有鬼笔环肽溶液中染色4h，再通过含有DAPI的染液染色30s，通过CLSM观察其中的细胞的生长状态和分布情况，鬼笔环肽/DAPI染色结果如图8所示，其中的(A)(B)(C)图分别代表培养3天、7天和14天的鬼笔环肽/DAPI染色结果。
由图6～8可知，随着培养时间的增加，细胞在3D打印弹性植入体中的增殖情况明显，并且BMSC细胞在3D打印弹性植入体上伸展充分，有着较明显的伪足，呈现典型的长梭形形态。说明本发明提供的3D打印弹性植入体有利于BMSC细胞的粘附与生长，能够促进BMSC细胞在其中的增殖，具有良好的细胞相容性。
实施例5
本实施例中，对兔进行颅骨临界尺寸缺损修复实验。
选取新西兰大白兔，在兔子的颅骨中线左右各0.5cm处，构建直径约10mm的颅骨缺损模型。设置实验组、对照组和空白组。实验组在兔颅骨缺损处植入实施例3制备的3D打印弹性植入体，对照组在兔颅骨缺损处植入对比例1制备的负载胶原纤维的支架，空白组在兔颅骨缺损处不植入任何材料。在植入15周后取材进行拍照、X-ray扫描和Micro-CT扫描，结果如图9所示。
植入15周后缺损处再生骨组织的大体观如图8的最后一行图片所示，植入15周后缺损处再生骨组织的冠状截面图和Micro-CT三维重建图像如图9的第一行和第二行图片所示。由图可知，实验组颅骨缺损修复效果良好，而对照组及空白组则仅有少量骨质生成且新生骨的长入长度不理想。在实验组中，新骨自缺损处向缺损中心生长，与33D打印弹性植入体的骨整合效果优良，并且3D打印弹性植入体中小孔的多孔结构逐渐分解，但大孔结构仍有所保留。根据图9的第三行所示的X-ray实验结果可知，实验组中，3D打印弹性植入体在植入15周后与宿主骨组织具有更好的整合度。通过Micro-CT分析对骨形成的静态参数进行量化，结果如图10所示。图10中的天然组是指未构建颅骨缺损模型的新西兰大白兔。由图10可知，实验组的骨体积密度(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)更高，而骨小梁间隙(Tb.sp)更低。
对实验组、对照组和空白组的兔子缺损处的再生骨组织取出，依次进行脱钙、石蜡包埋和切片，随后进行H&E和Masson’s trichrome组织化学染色，结果如图11所示。由图11可知，在植入15周后，实验组中的新生骨组织完全覆盖了缺损区域，新生骨组织呈现出由边缘想中心，由硬脑膜侧向远端愈合的趋势。局部放大可以看到新生骨组织具有接近自然骨的结构特征且大量的新生血管分布在缺损处。
以上实验结果表明，本发明提供的3D打印弹性植入体具有更好的宿主骨整合和骨传导能力。
实施例6
本实施例中，制备功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体，步骤如下：
(1)将聚合度为1700，醇解度为99％的PVA颗粒加入超纯水中，加热搅拌至PVA完全溶解，冷却至室温，得到浓度为20wt.％的PVA溶液。
向PVA溶液中加入浓度为20mmol/L的多巴胺溶液，充分混合，然后加入粒径为150～200μm的羟基磷灰石颗粒，在室温下用混合脱泡仪混匀并脱泡，得到3D打印浆料。该3D打印浆料中，PVA、羟基磷灰石以及多巴胺的质量比为140:20:2。
将3D打印浆料转移到3D打印机的打印料管中，通过Bio-architect@Pro直接挤出式打印机进行打印成0/90/0正交结构的支架。打印参数如下：打印丝间距为0.8mm，层高设置为0.32mm，打印模型为10*10*3mm的立方体，打印过程无需固化，挤出即可成型。在打印结束后，迅速将打印的支架浸没无水乙醇中进行脱水，每个支架均在无水乙醇中脱水3次，每次脱水15min，脱水后自然风干，得到3D打印支架。
(2)参照实施例2的操作，以Mw＝2000kDa的透明质酸钠为基础制备多巴胺的接枝率约为20％的HAD。将HAD溶于超纯水中，得到浓度为5mg/mL的HAD溶液。将Ⅰ型胶原溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，得到浓度为50mg/mL的I型胶原溶液。在冰浴上将HAD溶液和I型胶原溶液在搅拌条件下充分混合，然后在搅拌条件下调节所得混合液的pH值至6.8形成溶胶。该溶胶中，HAD与I型胶原的质量比为0.5:1。
(3)立即取3D打印支架迅速浸没于溶胶中，使溶胶充满3D打印支架的孔隙，该过程中注意观察溶胶中是否出现气泡，若出现气泡，需要用注射器将其中的气泡去除。之后将孔隙内充满了溶胶的3D打印支架静置至溶胶转变为凝胶状态，然后冷冻干燥，即得功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体。
实施例7
本实施例中，制备功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体，步骤如下：
(1)将聚合度为1700，醇解度为99％的PVA颗粒加入超纯水中，加热搅拌至PVA完全溶解，冷却至室温，得到浓度为10wt.％的PVA溶液。
向PVA溶液中加入浓度为40mmol/L的多巴胺溶液，充分混合，然后加入粒径为50～100μm的羟基磷灰石颗粒，在室温下用混合脱泡仪混匀并脱泡，得到3D打印浆料。该3D打印浆料中，PVA、羟基磷灰石以及多巴胺的质量比为70:10:0.05。
将3D打印浆料转移到3D打印机的打印料管中，通过Bio-architect@Pro直接挤出式打印机进行打印成0/90/0正交结构的支架。打印参数如下：打印丝间距为0.77mm，层高设置为0.3mm，打印模型为10*10*3mm的立方体，打印过程无需固化，挤出即可成型。在打印结束后，迅速将打印的支架浸没无水乙醇中进行脱水，每个支架均在无水乙醇中脱水3次，每次脱水15min，脱水后自然风干，得到3D打印支架。
(2)参照实施例2的操作，以Mw＝100kDa的透明质酸钠为基础制备多巴胺的接枝率约为10％的HAD。将HAD溶于超纯水中，得到浓度为50mg/mL的HAD溶液。将Ⅰ型胶原溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，得到浓度为5mg/mL的I型胶原溶液。在冰浴上将HAD溶液和I型胶原溶液在搅拌条件下充分混合，然后在搅拌条件下调节所得混合液的pH值至7.0形成溶胶。该溶胶中，HAD与I型胶原的质量比为2:1。
(3)立即取3D打印支架迅速浸没于溶胶中，使溶胶充满3D打印支架的孔隙，该过程中注意观察溶胶中是否出现气泡，若出现气泡，需要用注射器将其中的气泡去除。之后将孔隙内充满了溶胶的3D打印支架静置至溶胶转变为凝胶状态，然后冷冻干燥，即得功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体。

Claims (7)

1.一种功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体，其特征在于，该植入体由具有相互贯通的微米级大孔3D打印支架、以及附着在3D打印支架上并且分布于3D打印支架的微米级大孔中的胶原复合材料组成；该植入体中胶原复合材料含量为15 wt.%~25 wt.%；
3D打印支架由聚乙烯醇、多巴胺和微米级羟基磷灰石组成，3D打印支架中聚乙烯醇、微米级羟基磷灰石与多巴胺的质量比为（70~140）:（10~20）:（0.05~2）；胶原复合材料是具有儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联以及具有儿茶酚官能团的高分子材料与胶原通过迈克尔加成反应形成的具有微米级小孔的高分子网络，胶原复合材料是具有儿茶酚官能团的高分子材料与胶原按照（0.5~2）:1的质量比反应形成的；
3D打印支架与胶原复合材料之间通过具有儿茶酚官能团的高分子材料的酚羟基与3D打印支架的微米级羟基磷灰石中的钙离子螯合反应、具有儿茶酚官能团的高分子材料与3D打印支架表面的多巴胺的氧化自交联反应、以及胶原与3D打印支架表面的多巴胺的迈克尔加成反应而化学键合在一起。
2.根据权利要求1所述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体，其特征在于，微米级羟基磷灰石的1~200 μm。
3.根据权利要求1或2所述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体，其特征在于，所述具有儿茶酚官能团的高分子材料包括多巴胺改性的透明质酸、多巴胺改性的丝素蛋白或多巴胺改性的明胶。
4.根据权利要求1或2所述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体，其特征在于，所述微米级大孔的尺寸为200~1000 μm，微米级小孔的尺寸为10~200 μm。
5.权利要求1所述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将聚乙烯醇溶于热水并冷却至室温，将多巴胺和微米级羟基磷灰石均匀分散在所得聚乙烯醇溶液中得到3D打印浆料；通过3D打印的方式制备成支架，去除支架中的水分，得到3D打印支架；
（2）将具有儿茶酚官能团的高分子材料溶解，将胶原溶解，将所得具有儿茶酚官能团的高分子材料的溶液与胶原溶液充分混合，然后调节pH值至中性形成溶胶；
（3）立即将步骤（1）制备的3D打印支架浸没于步骤（2）配制的溶胶中，使溶胶充满3D打印支架的孔隙，将孔隙内充满了溶胶的3D打印支架静置至溶胶转变为凝胶状态，冷冻干燥，即得3D打印工程化植入体。
6.根据权利要求5所述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述聚乙烯醇溶液的浓度为10wt.%~20 wt.%；步骤（2）中，将具有儿茶酚官能团的高分子材料用水溶解形成浓度为5~50 mg/mL的具有儿茶酚官能团的高分子材料的溶液，将胶原用醋酸溶液溶解形成浓度为5~50 mg/mL的胶原溶液。
7.权利要求1至4中任一权利要求所述功能化纤维大分子交联体键合3D打印弹性植入体在制备骨修复材料中的应用。
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