CN111973804B - 高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂及其制备方法 - Google Patents

高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂，由具有多重杂化交联网络结构的水凝胶以及分布在具有多重杂化交联网络结构的水凝胶中的干细胞组成；该骨修复粘合剂在冷冻干燥后具有具有互穿网络结构；具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联、具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料与具有氨基及羧基的高分子材料通过迈克加成反应，具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料上的酚羟基与从微米级球形羟基磷灰石中游离出的钙离子螯合形成了多重杂化交联网络结构，微米级球形羟基磷灰石均匀分布于多重杂化交联网络结构中。该骨修复粘合剂在提高组织粘附性的同时可促进干细胞的粘附和增殖，增强干细胞的血管生成和成骨作用。

Description

高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂及 其制备方法
技术领域
本发明属于骨修复材料领域，涉及一种高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂及其制备方法。
背景技术
目前，治疗极限骨缺损的可降解类骨修复材料主要有自体骨、异体骨和人工骨三大类。虽然自体骨和异体骨具有良好的成骨作用和生物相容性，但是一般来源有限、不易降解、具有潜在的传播疾病和免疫排斥的危险以及愈合时间较长等缺点。人工骨修复可降解材料因其结构和性能可人为的进行多样化的设计和调控，成为了临床上应用最为广泛的骨修复材料。
源自天然产物的水凝胶是富有吸引力的用于组织工程的三维生物材料。由在水性微环境中，聚合物链的交联网络形成的水凝胶与体内细胞外基质高度相似，有利于细胞生长以促进组织再生。然而，在无外成骨因子、生物活性分子或包囊细胞的条件下，水凝胶本身的成骨能力较为有限。其原因可能是水凝胶缺乏多孔结构，抑制了营养物质和细胞的运输。据报道，孔隙结构对于新组织的形成至关重要，因为它可以使细胞在3D环境中迁移、浸润和增殖，并且促进血管形成、分化和传质。因此，在水凝胶三维微环境中引导干细胞分化以促进骨再生仍然是一个挑战。
目前，已提出的用于增强水凝胶骨再生的策略主要是负载成骨相关生长因子(如BMP-2，Runx2等)，在负载生长因子后，虽然展现出潜在的治疗优势，但是，外源性生长因其潜在的不可控临床风险和严格的审批程序阻碍了其转化应用。因此，有必要开发出能够自我调节的无生长因子的生物功能性水凝胶，以营造成骨的利基环境并与周围组织相互作用，促进骨再生。植入体在缺损部位的粘附和保留是其发挥再生功能的关键，在体液或血液存在的体内湿环境中保持粘附性是一大挑战。已报道的用于骨组织工程的负载细胞水凝胶的主要缺点是它们对缺损部位的宿主组织缺乏粘附，这限制了它们的再生特性。虽然目前已有将水凝胶基粘合剂用于密封组织或涂层以改善其对周围组织的粘附力的报道，然而，细胞相容性较差和在潮湿环境中缺乏对周围组织的有效粘附限制了这些粘合剂的成功应用。
另外，通过掺入羟基磷灰石(HAp)颗粒可诱导成骨分化，形成骨传导性水凝胶。生物活性水凝胶/HAp复合材料在颅骨修复中已显示出良好的应用前景。但是，HAp在复合材料中团聚、分散不均匀，无机相与有机相的结合稳定性和相容性较为有限等问题，不利于细胞的粘附和增殖又限制了其应用。因此，如何改善HAp在有机相中的分散性、增加无机相与有机相之间的相容性，在赋予其强大的组织粘附性的同时促进干细胞的粘附和增殖，增强干细胞的血管生成和成骨作用，仍然是本领域亟须解决的难题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂及其制备方法，以改善羟基磷灰石在材料中的分散性，增加羟基磷灰石与有机相的整合度，在提高组织粘附性的同时促进干细胞的粘附和增殖，增强干细胞的血管生成和成骨作用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供的高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂，由具有多重杂化交联网络结构的水凝胶以及分布在具有多重杂化交联网络结构的水凝胶中的干细胞组成；该骨修复粘合剂在冷冻干燥后具有具有互穿网络结构，平均孔径为200～500μm、孔隙率为60％～90％；
具有多重杂化交联网络结构的水凝胶是具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液、具有氨基及羧基的高分子材料的溶液与微米级球形羟基磷灰石浆料反应形成的，具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联、具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料与具有氨基及羧基的高分子材料通过迈克加成反应，具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料上的酚羟基与从微米级球形羟基磷灰石中游离出的钙离子螯合形成了多重杂化交联网络结构，微米级球形羟基磷灰石均匀分布于多重杂化交联网络结构中。
上述可注射骨修复粘合剂的技术方案中，微米级球形羟基磷灰石的粒径为5～50μm。
上述可注射骨修复粘合剂的技术方案中，所述具有氨基及羧基的高分子材料是I型胶原，所述具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料是结构式如式(Ⅰ)所示的多巴胺改性的透明质酸，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为1％～50％，优选地，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为5％～10％；
Figure BDA0002687686120000021
具有多重杂化交联网络结构的水凝胶是在pH＝6.5～7.5的条件下，多巴胺改性的透明质酸溶液、I型胶原溶液与以及微米级球形羟基磷灰石浆料反应形成的，多巴胺改性的透明质酸氧化自交联、多巴胺改性的透明质酸与I型胶原通过迈克加成反应，多巴胺改性的透明质酸上的酚羟基与从微米级球形羟基磷灰石中游离出的钙离子螯合形成了多重杂化交联网络结构，微米级球形羟基磷灰石均匀分布于多重杂化交联网络结构中。
上述可注射骨修复粘合剂的技术方案中，该骨修复粘合剂在冷冻干燥后具有具有互穿网络结构，平均孔径优选为300～400μm、孔隙率优选为68％～88％。
上述可注射骨修复粘合剂的技术方案中，该可注射骨修复粘合剂的含水量为20％～80％，含水量优选为40％～75％；在冷冻干燥状态下，微米级球形羟基磷灰石的含量为15wt.％～80wt.％，微米级球形羟基磷灰石的含量优选为15wt.％～50wt.％，余量为多重杂化交联网络结构及负载的干细胞。进一步地，在具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联、具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料与具有氨基及羧基的高分子材料通过迈克加成反应，具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料上的酚羟基与从微米级球形羟基磷灰石中游离出的钙离子螯合形成了多重杂化交联网络结构中，具有氨基及羧基的高分子材料的含量为50wt.％～80wt.％，优选地，该多重杂化交联网络结构中，具有氨基及羧基的高分子材料的含量为50wt.％～70wt.％。
上述可注射骨修复粘合剂的技术方案中，分布在具有多重杂化交联网络结构的水凝胶中的干细胞的种类和量可根据实际应用需求进行调整。所述干细胞为骨髓间充质干细胞或脂肪干细胞。
上述可注射骨修复粘合剂的技术方案中，该骨修复粘合剂对组织具有粘附性，能在体内湿环境中实现粘附和保留，该骨修复粘合剂对颅骨的组织粘附力至少为16KPa。
上述可注射骨修复粘合剂的技术方案中，I型胶原是以动物皮、肌腱、尾腱为原料制备的I型胶原。
上述可注射骨修复粘合剂的技术方案中，结构式如式(Ⅰ)所示多巴胺改性的透明质酸是以透明质酸钠为基础通过多巴胺改性得到的，作为改性基础的透明质酸钠的分子量为30w～400w，优选为200w～400w，进一步优选为250w～350w。
上述可注射骨修复粘合剂的技术方案中，具有多重杂化交联网络结构的水凝胶最好是在pH＝7.1～7.4的条件下，多巴胺改性的透明质酸溶液、I型胶原溶液与氧化自交联以及微米级球形羟基磷灰石浆料反应形成。
本发明提供的可注射骨修复粘合剂在补充有10％血清和1％双抗的α-MEM培养基中培养3、7和14天后的溶胀率稳定在102±6％，具有良好的结构稳定性。
本发明提供的可注射骨修复粘合剂在植入裸鼠皮下30天后，压缩模量由植入前的21KPa增加到植入后的106KPa，同时形成了紧密交联堆积缠绕的纳米纤维结构，纤维中镶嵌着大量的类骨磷灰石颗粒，这种镶嵌类骨磷灰石且交错缠绕的纤维结构赋予了材料优异的力学性能。本发明提供的可注射骨修复粘合剂在植入裸鼠皮下30天后，实现了在体内诱导干细胞向成骨成血管分化。
本发明提供的可注射骨修复粘合剂采用微米级球形羟基磷灰石浆料为原料，相比于微米级棒状羟基磷灰石，微米级球形羟基磷灰石浆料中的羟基磷灰石具有更大的比表面积及更好的液相分散性，可改善羟基磷灰石在多孔膜中的分散均匀性，同时，相比于采用微米级棒状羟基磷灰石的情况，微米级球形羟基磷灰石浆料提升了多重杂化交联网络的交联度，这有利于提升多孔膜的湿热稳定性，改善有机相与无机相的整合度。以上两方面的改进，有利于增加细胞粘附位点，并实现更均匀的细胞粘附，促进细胞在该可注射骨修复粘合剂中更均匀地铺展生长。
本发明还提供了高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
将具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料溶解，在冰浴条件下加入微米级球形羟基磷灰石浆料并充分超声分散，然后滴加具有氨基及羧基的高分子材料的溶液，充分超声分散，调节所得混合液的pH值至6.5～7.5，然后加入pH值为6.5～7.5的干细胞混悬液，搅拌混匀，再立即转移至模具中在37℃静置至各组分充分交联和络合并转变为凝胶状态，即得可注射骨修复粘合剂；
所述微米级球形羟基磷灰石浆料的固含量为5wt.％～45wt.％，该固含量优选为20wt.％～45wt.％。
上述可注射骨修复粘合剂的制备方法的技术方案中，所述具有氨基及羧基的高分子材料是I型胶原，所述具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料是结构式如式(Ⅰ)所示的多巴胺改性的透明质酸，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为1％～50％，优选地，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为5％～10％；
Figure BDA0002687686120000051
上述可注射骨修复粘合剂的制备方法的技术方案中，微米级球形羟基磷灰石浆料的加入量应使微米级球形羟基磷灰石的质量占具有氨基及羧基的高分子材料、具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料以及微米级球形羟基磷灰石总质量的15％～80％，优选为15％～50％。进一步地，具有氨基及羧基的高分子材料的溶液的加入量应使具有氨基及羧基的高分子材料的质量占具有氨基及羧基的高分子材料和具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的总质量的50％～80％，优选为50％～70％。
上述可注射骨修复粘合剂的制备方法的技术方案中，将具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料用水溶解形成浓度为5～50mg/mL、优选浓度为5～40mg/mL的具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液，将具有氨基及羧基的高分子材料用醋酸溶液溶解形成浓度为3～50mg/mL、优选浓度为3～35mg/mL的具有氨基及羧基的高分子材料的溶液。
上述可注射骨修复粘合剂的制备方法的技术方案中，优选采用浓度为0.01～1mol/L的醋酸溶液溶解具有氨基及羧基的高分子材料。
上述可注射骨修复粘合剂的制备方法的技术方案中，所述干细胞混悬液中的干细胞密度可根据实际应用需求进行确定，通常为10～1000万个/mL，优选为100～500万个/mL。
上述可注射骨修复粘合剂的制备方法的技术方案中，在冰浴条件下加入微米级球形羟基磷灰石浆料并充分超声分散，然后滴加具有氨基及羧基的高分子材料的溶液，充分超声分散，优选调节所得混合液的pH值至6.5～7.5，然后加入pH值为6.5～7.5的干细胞混悬液，搅拌混匀，再立即转移至模具中在37℃静置至各组分充分交联和络合并转变为凝胶状态，即得可注射骨修复粘合剂。
上述可注射骨修复粘合剂的制备方法的技术方案中，一种可行的多巴胺改性的透明质酸的制备方法如下：
将透明质酸钠溶解在事先脱气完全的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，随后将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在水中，将N-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液滴加至透明质酸钠溶液中，搅拌反应4～6h，向所得混合液中加入盐酸多巴胺(DA)水溶液，搅拌反应24～48h、优选24～36h，在两次搅拌反应过程中，控制pH值在5.5～6.5范围内，优选在5.8～6.5范围内，该步骤的所有操作均在氮气保护下进行。将所得反应液通过透析纯化3天，冷冻干燥，得到多巴胺改性的透明质酸粉末。
作为可选方案，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、盐酸多巴胺与透明质酸钠上的羧基的摩尔比为(6～8):(4～6):(3～5):1，优选为(6.5～7.5):(4.5～5.5):(3.5～4.5):1，盐酸多巴胺水溶液的浓度为3～6mmol/L，优选为3～5mmol/L，透明质酸钠水溶液的浓度为15～35mg/mL，优选为15～25mg/mL。作为改性基础的透明质酸钠的分子量为30w～400w，优选为200w～400w，进一步优选为250w～350w。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供了高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂，由具有多重杂化交联网络结构的水凝胶以及分布在具有多重杂化交联网络结构的水凝胶中的细胞组成；该骨修复粘合剂在冷冻干燥后具有具有互穿网络结构，平均孔径为200～500μm、孔隙率为60％～90％。具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联、具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料与具有氨基及羧基的高分子材料通过迈克加成反应，具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料上的酚羟基与从微米级球形羟基磷灰石中游离出的钙离子螯合形成了多重杂化交联网络结构，微米级球形羟基磷灰石在其中均匀分布，实现了有机-无机相的高度整合。该可注射骨修复粘合剂可作为细胞递送载体，将细胞输送到缺损部位并在缺损部位粘附保留，在无外源生长因子条件下，诱导干细胞向成骨及成血管分化，降低了外源性生长因子潜在的不可控临床风险，在大面积骨缺损再生修复领域具有提供广阔的应用前景。
2.本发明提供的高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂具有粘附性，实验表明，该骨修复粘合剂对颅骨的组织粘附力达到了16KPa，能在体内湿环境中实现粘附和保留。利用其组织粘附特性可实现在缺损组织的高效保留，自动匹配不规则的缺损，有利于大面积骨缺损的原位重建。
3.本发明提供的高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂，由天然聚合物、微米级球形羟基磷灰石、细胞和水构成，具有良好的生物相容性，体内降解产物可吸收，同时，该可注射骨修复粘合剂多孔膜在在补充有10％血清和1％双抗的α-MEM培养基中培养3、7和14天后的溶胀率稳定在102±6％，具有良好的结构稳定性。这些都有利于其在植入体内后稳定地发挥修复作用。
4.本发明提供的可注射骨修复粘合剂具有高度仿生骨基质成分与结构，体外细胞三维培养结果表明该可注射骨修复粘合剂能为骨髓间充质干细胞的增殖、粘附及成骨分化提供良好的微环境，可作为体内递送细胞的优良载体将细胞运送到目标位置并在缺损处粘附保留，稳定的发挥其功能。在无生长因子的情况下，将该可注射骨修复粘合剂植入裸鼠皮下30天后，展现出优异的组织相容性、结构稳定性及可控的降解速率，新生类骨组织显著提升了其力学强度，植入裸鼠皮下30天后，其压缩模量是增加至植入前的5倍，而SEM观察发现该粘合剂中生成了与骨基质高度相似的纤维结构和类骨磷灰石分布，同时Micro-CT三维重建及组织切片分析进一步验证该粘合剂具有出色的异位血管生成和成骨能力。
5.本发明提供的可注射骨修复粘合剂，在制备时采用了具有高分散相的微米级球形HAp浆料，有效缓解了HAp在材料中团聚，改善了其分散性，同时，相对于采用微米级棒状HAp的情况，该可注射骨修复粘合剂的热变性湿热温度得到了一定的提升，说明采用微米级球形HAp制备多孔膜，因微米级球形HAp具有更好的流动性和液相分散性，有利于钙离子的溶出，促进了Ca2+参与的络合反应，进而使得杂化交联的程度增加，增加了HAp与有机相的整合度。HAp在多孔膜中更均匀的分散以及与有机相更有效地整合，同时微米级球形HAp的高比表面积可提供更多的细胞粘附位点，使得细胞可在该多孔膜中更好、更均匀地铺展生长。
附图说明
图1是本发明所述可注射骨修复粘合剂的制备过程示意图(以多巴胺改性的透明质酸及I型胶原为例)。
图2是冷冻干燥后的微米级球形HAp浆料的SEM照片(A图)、EDS分析(B图)、激光粒径散射测试(C图)以及XRD测试(D图)结果。
图3是冷冻干燥后的微米级棒状HAp分散液的SEM照片，其中，右图是左图的局部放大图。
图4是对比例1制备的具有多重杂化交联网络结构的水凝胶在冷冻干燥后的SEM照片，下图是上图的局部放大图。
图5是对比例2制备的HAD/CoI/棒状HAp水凝胶在冷冻干燥后的SEM照片。
图6是对比例1、2制备的水凝胶在冷冻干燥后的Micro-CT图。
图7是对比例1、2制备的水凝胶在冷冻干燥后的DSC曲线。
图8是HA、Col I、HAD和冷冻干燥后的HCLM的红外谱图。
图9是HA、Col I、HA-Col I以及冷冻干燥后的HCLH的TG曲线。
图10是HA、HAD、Col I、HA-Col I、HA-Col I-HAp以及冷冻干燥后的HCLH的DSC曲线。
图11是实施例3制备的HCLH-MSCs在不同放大倍数下的SEM照片。
图12是实施例3制备的HCLH-MSCs在共培养3、7和14天后的照片((A)～(C)图)及溶胀率((D)图)。
图13是实施例3制备的HCLH-MSCs对钛合金、玻璃、聚乙烯、新鲜猪皮和颅骨的粘附力测试结果。
图14是HCLH-MSCs及HAD/CoI/棒状HAp-MSCs体外共培养3、7、14天后的CCK-8细胞增殖测试结果。
图15是HCLH-MSCs及HAD/CoI/棒状HAp-MSCs体外共培养14天的FDA细胞活死染色结果对比图。
图16是HCLH-MSCs体外共培养14天后的细胞骨架染色的激光共聚焦测试、茜素红染色、BMP-2免疫组化染色以及SEM测试结果。
图17是HCLH-MSCs植入裸鼠皮下后的照片((A)图)，植入后样品大体观((B)图)，植入前后的HCLH-MSCs的照片((C)图)。
图18是HCLH-MSCs植入裸鼠皮下前后的尺寸变化率及压缩模量测试结果。
图19是HCLH-MSCs植入裸鼠皮下前后的Micro-CT三维重建图。
图20是HCLH-MSCs植入裸鼠皮下30天后在不同放大倍数下的SEM照片。
图21是HCLH-MSCs植入裸鼠皮下30天后的EDS分析结果。
图22是HCLH-MSCs植入裸鼠皮下30天后的茜素红染色和VEGF免疫组化染色结果。
图23是HCLH-MSCs植入裸鼠皮下30天后的Runx2免疫荧光染色激光共聚焦图像。
图24是HCLH-MSCs植入裸鼠皮下30天后的CD31免疫荧光染色激光共聚焦图像。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂及其制备方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明的保护范围。
下述各实施例中，微米级球形羟基磷灰石(HAp)浆料由四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心生产，通过超声破碎处理，微米级球形HAp在浆料中具有良好的分散性。
实施例1
本实施例中，制备多巴胺改性透明质酸(HAD)，步骤如下：
(1)向浓度为21mg/mL的透明质酸钠(Mw＝2000kDa)水溶液中滴加浓度为84mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，然后滴加浓度为200mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)溶液，搅拌反应4h，滴加浓度为3mmol/L的盐酸多巴胺水溶液，搅拌反应24h，两次搅拌反应过程中均控制pH值在6.0，该步骤的操作均在氮气保护下进行，EDCI、NHS、盐酸多巴胺与透明质酸钠上的羧基的摩尔比为7:5:4:1；
(2)将步骤(1)所得反应液用透析膜(MW＝3.5-8kDa)在pH值为4的超纯水中透析72h，真空冷冻干燥，即得多巴胺接枝率为10％的HAD粉体，将样品保存在干燥器中。
通过调整EDCI、NHS、盐酸多巴胺与透明质酸钠上的羧基的摩尔比，透明质酸钠的分子量，可以改变HAD中多巴胺的接枝率，在本发明限定的比例关系范围内，可以调整HAD中多巴胺的接枝率在5％～10％范围内。
对比例1
以下通过对比例1～2，在不负载细胞的情况下，比较采用微米级球形HAp与采用微米级棒状HAp制备具有多重杂化交联网络结构的水凝胶，微米级球形HAp与微米级棒状HAp在微米级球形HAp与采用微米级棒状HAp水凝胶中的分散性，以及二者在交联度和湿热稳定性等方面的差异。
制备具有多重杂化交联网络结构的水凝胶，步骤如下：
将实施例1制备的多巴胺的接枝率为10％的HAD溶解在水去离子中，涡旋振荡至透明澄清，得到浓度为25mg/mL的HAD溶液，将I型胶原(Col I)溶解在0.5mol/L的酸溶液中得到浓度为25mg/mL的Col I溶液。
在冰浴条件下将固含量为35wt.％的微米级球形HAp浆料加入HAD溶液中，并用细胞破碎仪探头超声分散15min，然后滴加Col I溶液，用细胞破碎仪探头充分超声分散，微米级球形HAp浆料、HAD溶液及Col I溶液的加入量应使微米级球形HAp、HAD及Col I的质量比为2:5:5；然后在超声条件下用1mol/L的NaOH溶液将所得混合溶液的pH值调节至7.5，再立即转移至硅胶模具(直径8mm，高度2mm)中静置24h使各组分充分交联和络合，得到具有多重杂化交联网络结构的水凝胶，冷冻干燥。
对比例2
本对比例中，以微米级棒状HAp制备HAD/CoI/棒状HAp水凝胶，步骤如下：
将实施例1制备的多巴胺的接枝率为10％的HAD溶解在水去离子中，涡旋振荡至透明澄清，得到浓度为25mg/mL的HAD溶液，将I型胶原(Col I)溶解在0.5mol/L的酸溶液中得到浓度为25mg/mL的Col I溶液，将微米级棒状HAp加入去离子水中，在涡旋振荡器上充分振荡使棒状HAp充分分散在水中，得到固含量为35wt.％的微米级棒状HAp分散液。
在冰浴条件下将固含量为35wt.％的微米级棒状HAp分散液加入HAD溶液中，并用细胞破碎仪探头超声分散15min，然后滴加Col I溶液，用细胞破碎仪探头充分超声分散，然后在超声条件下用1mol/L的NaOH溶液将所得混合溶液的pH值调节至7.5，再立即转移至硅胶模具(直径8mm，高度2mm)中静置24h使各组分充分交联和络合，得到HAD/CoI/棒状HAp水凝胶，冷冻干燥。
1.微米级球形HAp浆料与微米级棒状HAp分散液中HAp的分散性比较
分别量取1mL微米级球形HAp浆料和1mL微米级棒状HAp分散液，冷冻干燥，粘贴在导电胶上进行真空喷金处理及SEM拍照，同时对微米级球形HAp浆料进行激光粒径散射测试、EDS分析以及XRD测试。
图2是冷冻干燥后的微米级球形HAp浆料的SEM照片(A图)、EDS分析(B图)、激光粒径散射测试(C图)以及XRD测试(D图)结果，图3是冷冻干燥后的微米级棒状HAp分散液的SEM照片。由SEM照片可知，微米级棒状HAp出现了明显的团聚现象，而微米级球形HAp则具有更好的分散性和更大的比表面积。激光粒径散射测试表明微米级球形HAp的粒径分布范围为10～50μm，XRD和EDS测试结果表明微米级球形HAp的钙磷比为1.67，完全吻合羟基磷灰石PDF卡片。
2.微米级球形HAp与微米级棒状HAp在水凝胶中的分散性
对比例1、2制备的水凝胶在冷冻干燥后的SEM照片分别如图4～5所示，对比例1、2制备的水凝胶在冷冻干燥后的Micro-CT图分别如图6的(A)(B)两图所示，结合图4～6可知，棒状HAp在水凝胶中出现了较为明显的团聚，而微米级球形HAp在水凝胶中的分散性则相对更好，在对比例2制备的HAD/CoI/棒状HAp水凝胶中，棒状HAp在材料的某些部位出现了较为明显的团聚，而在材料的某些部位又几乎没有棒状HAp的分布，在对比例1制备的多重杂化交联网络结构的水凝胶中，微米级球形HAp的分布明显更均匀。说明本发明采用微米级球形HAp浆料制备水凝胶可有效避免HAp在材料中团聚，改善其分散性。
3.DSC分析
对比例1、2制备的水凝胶在冷冻干燥后的DSC曲线如图7所示，相比于对比例2采用棒状HAp制备的水凝胶，对比例1采用球形HAp制备的水凝胶在冷冻干燥状态下的热变性温度提高了8℃，说明相比于微米级棒状HAp分散液，采用微米级球形HAp浆料制备水凝胶，提升了水凝胶中的交联网络的交联度，交联度的增加使得水凝胶的热变性温度升高，这是因为微米级球形HAp具有更好的流动性和液相分散性，有利于钙离子的溶出，促进了Ca2+参与的络合反应，进而使得杂化交联的程度增加。杂化交联度的增加，可提升材料的湿热稳定性，湿热稳定性增加，表明材料结构稳定性得到提升，有利于改善材料降解性能，延长材料在缺损部位发挥修复功效的时间。同时，酚羟基与HAp表面游离钙离子的鳌合，提升了杂化交联的程度，这种相互作用能赋予材料良好的有机-无机相相容性，增强了有机-无机相之间的结合。
实施例2
本实施例中，首先按照对比例1的操作制备未负载细胞的骨修复粘合剂(HCLH，即对比例1中制备的具有多重杂化交联网络结构的水凝胶)，然后通过红外和热分析证实其中多重杂化交联网络结构的形成。
采用红外光谱仪(Nicolet 6700，Germany)在500cm-1～2000cm-1波长范围内，对Col I、透明质酸钠(HA)、HAD和HCLM的化学结构进行表征。如图8所示，1627cm-1(酰胺I谱带)处峰归属于Col I的特征酰胺峰，在1550cm-1(酰胺II带)和1235cm-1(酰胺III带)的峰表明多巴胺的氨基与HA的羧基之间发生酰胺化反应，形成HAD。1747cm-1处的峰出现减弱，这是由于一方面是由于HAD侧链的酚羟基被氧化成醌或半醌结构，随后发生歧化反应并自交联造成的，另一方面，是由于酚羟基与Col I的氨基发生迈克加成反应，并与钙离子鳌合，形成多重交联网络结构造成的。
对HA、Col I、透明质酸钠-I型胶原的物理混合物(HA-Col I，HA与Col I的质量比为1:1)、冷冻干燥后的HCLH进行热重分析(温度范围：25～800℃，升温速率：10℃/min，氮气保护)，以对HCLH的热分解性能进行表征，结果如图9所示。从图9可知，HAD与Col I分子之间产生了化学交联，而不仅是简单的物理作用，因为TG曲线中并未产生额外的失重阶段。
对HA、HAD、Col I、透明质酸钠-I型胶原的物理混合物(HA-Col I，HA与Col I的质量比为1:1)、透明质酸钠-I型胶原-微米级球形HAp的物理混合物(HA-Col I-HAp，三者的质量比同对比例1)以及冷冻干燥后的HCLH进行差热(DSC)分析，结果如图10所示，DSC曲线中的吸热峰温度代表胶原分子内氢键被破坏，导致三股螺旋结构解散为无规卷曲结构的温度，即热变性温度。相比于HA-Col I及HA-Col I-HAp，HCLH的变性温度大幅提升，从纯Col I膜的84.6℃提高到113.5℃。DSC测试结果表明HAD与Col I之间发生了迈克加成反应。DSC测试结果进一步表明，相比于物理共混，杂化交联使HCLH湿热稳定性得到明显提高，有助于改善材料的降解速率。
实施例3
本实施例中，制备高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂(HCLH-MSCs)，步骤如下：
将实施例1制备的多巴胺的接枝率为10％的HAD溶解在水去离子中，涡旋振荡至透明澄清，得到浓度为25mg/mL的HAD溶液，将I型胶原(Col I)溶解在0.5mol/L的酸溶液中得到浓度为25mg/mL的Col I溶液。
在冰浴条件下将固含量为35wt.％的微米级球形HAp浆料加入HAD溶液中，并用细胞破碎仪探头超声分散15min，然后滴加Col I溶液，用细胞破碎仪探头充分超声分散，微米级球形HAp浆料、HAD溶液及Col I溶液的加入量应使微米级球形HAp、HAD及Col I的质量比为2:5:5，用1mol/L的NaOH溶液将所得混合溶液的pH值调节至7.5，然后按照每1mLHAD溶液中加入100μLMSCs悬浮液的比例加入事先准备好的浓度为5×106细胞/mL的兔子骨髓间充质干细胞(MSCs)悬浮液(调节pH至7.4)，搅拌混合均匀，再立即转移至硅胶模具(直径8mm，高度3mm)中，在37℃静置15min使各组分充分交联和络合并转变为水凝胶状态，得到HCLH-MSCs。
将所得HCLH-MSCs从模具中取出，浸入补充有10％血清和1％双抗的α-MEM培养基中，置于培养箱中在37℃孵育4h，更换新的培养基，随后在37℃共培养3、7和14天，培养期间，每隔1天更换新的培养基。
将本实施例制备的HCLH-MSCs置于2.5％戊二醛中固定24h，随后进行梯度乙醇脱水，临界点干燥。将干燥后得到的样品粘附在导电胶上，并进行表面喷金处理拍SEM。结果如图11所示，图11中的(A)～(E)图分别为不同放大倍数下的SEM照片。HCLH-MSCs呈现相互贯穿的多孔结构，该结构有利于营养物质的输送和细胞迁移，具有与松质骨相似的孔结构分布、孔隙率及微孔尺寸，呈现仿生骨基质结构。根据图11统计发现，冷冻干燥后的HCLH-MSCs的孔隙率为78±10％，平均孔径为340±36μm。同时，在HCLH-MSCs中可见大量细胞粘附铺展在水凝胶中且细胞带有明显的伪足，表明HCLH-MSCs具有良好的细胞亲和性，能促进细胞粘附生长。
对比例3
本对比例中，采用微米级棒状HAp制备负载干细胞的HAD/CoI/棒状HAp水凝胶(HAD/CoI/棒状HAp-MSCs)，步骤如下：
将实施例1制备的多巴胺的接枝率为10％的HAD溶解在水去离子中，涡旋振荡至透明澄清，得到浓度为25mg/mL的HAD溶液，将I型胶原(Col I)溶解在0.5mol/L的酸溶液中得到浓度为25mg/mL的Col I溶液；将微米级棒状HAp加入去离子水中，在涡旋振荡器上充分振荡使棒状HAp充分分散在水中，得到固含量为35wt.％的微米级棒状HAp分散液。
在冰浴条件下将固含量为35wt.％的微米级棒状HAp分散液加入HAD溶液中，并用细胞破碎仪探头超声分散15min，然后滴加Col I溶液，用细胞破碎仪探头充分超声分散，微米级棒状HAp分散液、HAD溶液及Col I溶液的加入量应使微米级棒状HAp、HAD及Col I的质量比为2:5:5，用1mol/L的NaOH溶液将所得混合溶液的pH值调节至7.5，然后按照每1mLHAD溶液中加入100μL MSCs悬浮液的比例加入事先准备好的浓度为5×106细胞/mL的MSCs悬浮液(调节pH至7.4)，搅拌混合均匀，再立即转移至硅胶模具(直径8mm，高度3mm)中，在37℃静置15min使各组分充分交联和络合并转变为水凝胶状态，得到HAD/CoI/棒状HAp-MSCs。
实施例4
本实施例中，测试实施例3制备的HCLH-MSCs的溶胀性能。
测量实施例3制备的HCLH-MSCs的直径，记作Rd，测量将HCLH-MSCs共培养3、7和14天后的尺寸，记作Rs。每个样品均设置三组平行试验。按照下式计算溶胀率，HCLH-MSCs水凝胶在共培养3、7和14天后的照片及溶胀率如图12所示：
溶胀率＝(Rs-Rd)/Rd×100％
图12的(A)～(C)图依次为HCLH-MSCs在共培养3、7和14天后的照片，由图可知，在共培养3、7和14天后，HCLH-MSCs的体积未出现明显的变化，进一步由图12的(D)图可知，HCLH-MSCs在共培养3、7和14天后溶胀率为102±6％，共培养3天、7天和14天，HCLH-MSCs的溶胀率变化不明显，说明HCLH-MSCs在湿环境中表现出了出色的结构稳定性，这对于体内湿环境中植入材料发挥其功能至关重要。
实施例5
本实施例中，测试实施例3制备的HCLH-MSCs对不同基底表面的粘附力，测试的基底包括钛合金、玻璃、聚乙烯、新鲜猪皮和颅骨，以它们作为亲水、疏水、生物组织的代表性表面。
将面积为30×25mm的HCLH-MSCs粘附于两块待测基底之间，然后通过岛津万能力学试验机(AG-X100N)以2mm/min的加载速率将样品拉伸至破坏。结果如图13所示，由图13可知，HCLH-MSCs对钛合金、玻璃、聚乙烯具有很强的粘附力，对组织也具有较强的粘附力，对颅骨的组织粘附力为16KPa。
实施例6
将实施例3制备的HCLH-MSCs从模具中取出，浸入补充有10％血清和1％双抗的α-MEM培养基中，置于培养箱中在37℃孵育4h，更换新的培养基，随后在37℃共培养3、7和14天，共培养期间，每隔1天更换新的培养基，所述培养基为补充有10％血清和1％双抗的α-MEM培养基。共培养3、7和14天后，取出进行相关测试。同时，用对比例3制备的HAD/CoI/棒状HAp-MSCs进行相同的操作作为对比实验进行比较。
图14是HCLH-MSCs及HAD/CoI/棒状HAp-MSCs体外共培养3、7、14天后的CCK-8细胞增殖测试结果，其中(A)(B)两图分别代表HCLH-MSCs及HAD/CoI/棒状HAp-MSCs的CCK-8细胞增殖测试结果。图14表明HCLH-MSCs及HAD/CoI/棒状HAp-MSCs不具细胞毒性并促进了细胞增殖，且HCLH-MSCs能更好地促进细胞增殖。
将HCLH-MSCs及HAD/CoI/棒状HAp-MSCs体外共培养14天后取出进行细胞活死染色，图15是HCLH-MSCs及HAD/CoI/棒状HAp-MSCs体外共培养14天的FDA细胞活死染色结果对比图，其中(A)(B)两图分别代表HCLH-MSCs及HAD/CoI/棒状HAp-MSCs的FDA细胞活死染色结果。细胞活死染色结果表明HCLH-MSCs及HAD/CoI/棒状HAp-MSCs在体外共培养14天时，细胞具有良好的活性，呈团状生长，没有观察到死细胞的存在，表现出良好的生物相容性。相对于HAD/CoI/棒状HAp-MSCs，细胞在HCLH-MSCs中的生长更密集和更均匀，说明HCLH-MSCs因的微米级球形HAp具有更大的比表面积，同时微米级球形HAp在HCLH-MSCs中分布更均匀，有利于增加细胞粘附位点，促进细胞的粘附生长。
将HCLH-MSCs体外共培养14天后取出进行细胞骨架染色的激光共聚焦测试、茜素红染色、BMP-2免疫组化染色以及SEM测试，结果如图16所示。图16的(A)～(D)图是HCLH-MSCs体外共培养14天后的细胞骨架染色的激光共聚焦图像、SEM照片、茜素红染色、BMP-2免疫组化染色结果。细胞骨架染色及SEM图像表明在共培养14天后HCLH-MSCs上的细胞呈现出成片大面积铺展形态，表现出明显的黏附材料生长的形貌特征和分化趋势。茜素红及BMP-2免疫组化染色结果表明HCLH-MSCs中的细胞在共培养14天时向成骨分化，形成钙结节细胞外基质。
本实施例的实验结果证实，HCLH-MSCs能促进负载的干细胞增殖、粘附并向成骨分化。相对于负载干细胞的HAD/CoI/棒状HAp水凝胶，HCLH-MSCs更有利于负载细胞的增殖和更均匀地粘附生长。
实施例7
将实施例3制备的HCLH-MSCs从模具中取出，浸入补充有10％血清和1％双抗的α-MEM培养基中，置于培养箱中在37℃孵育4h，更换新的培养基，随后在37℃共培养7天，共培养期间，每隔1天更换新的培养基，所述培养基为补充有10％血清和1％双抗的α-MEM培养基。共培养7天后，取出，植入裸鼠皮下，植入后30天取出材料，并对取出材料的尺寸进行测量，通过动态力学测试仪对材料的力学性能进行表征，对HCLH-MSCs植入裸鼠皮下样品植入前后进行Micro-CT分析并三维重建图像，结果如图17～19所示。
图17是HCLH-MSCs植入裸鼠皮下后的照片((A)图)，植入后样品大体观((B)图)，植入前后的HCLH-MSCs的照片((C)图)，由大体观观察可见植入样品周周有大量血管存在，样品中形成白色块状固体，发生了明显的矿化现象。图18是HCLH-MSCs植入裸鼠皮下前后尺寸变化率及压缩模量测试结果，HCLH-MSCs在裸鼠皮下植入30天后尺寸结构相对稳定，没有出现明显的溶胀现象，样品植入后压缩模量大幅提升，从植入前的21KPa增加到植入后的106KPa，表明新生类骨组织显著提升了样品的力学强度。图19是HCLH-MSCs植入裸鼠皮下前后的Micro-CT三维重建图，其中(A)(B)两图分别是植入前后的Micro-CT三维重建图，由Micro-CT三维重建及定量分析确认得知，HCLH-MSCs在植入裸鼠皮下30天后，HCLH-MSCs内部出现大量新生类骨组织，新生类骨组织体积为32mm3。
实施例8
将实施例7植入裸鼠皮下30天的样品取出，按以下方法制样后用扫描电镜观察其微观结构。
将样品先浸于2.5％戊二醛室温固定2h。PBS清洗3次，每次5min以洗去固定液。分别用20％，40％，60％，80％，100％，100％，100％梯度乙醇脱水，每次20min。脱水完毕后进行临界点干燥和表面喷金处理，进行SEM测试。用电子能谱(EDS)对样品的成分做半定量分析。结果如图20～21所示。
由图20可知，样品中形成了紧密交联堆积缠绕的纳米纤维结构，纤维中镶嵌着大量的矿物质颗粒，颗粒尺寸在200nm左右，呈现出与天然骨组织高度相似的结构特征。材料的组分和结构对材料性能有重要影响。微观尺度上，这种镶嵌无机矿物质且交错缠绕的纤维结构赋予样品出色的力学性能，使材料具有良好的溶胀、降解和力学结构稳定性。EDS分析结果表明样品中存在大量的Ca和P元素，钙磷原子百分比为Ca/P＝1.90，接近天然骨组织的钙磷比1.67，同时可以看出HCLH-MSCs中无机矿物质沉积均匀且无机矿物质的主要成分为类骨磷灰石。
实施例9
将实施例7植入裸鼠皮下30天的样品取出，进行石蜡包埋，切片。随后分别进行茜素红染色和VEGF免疫组化染色，在光学显微镜下观察。同时实施例7植入裸鼠皮下30天的样品取出进行Runx2免疫荧光染色激光共聚焦测试。茜素红染色结果如图22的(A)(B)两图所示，样品中出现大量阳性表达，说明在样品中存在大量的钙结节，与Micro-CT分析结果一致。VEGF免疫组化染色结果如图22的(C)(D)两图所示，HCLH-MSCs中棕色区域表示在植入物中的VEGF阳性表达，蓝色的是细胞核。观察得知样品中存在大量的VEGF阳性表达，表明HCLH-MSCs促进干细胞成血管分化。成骨细胞分泌细胞外基质累积在矿化的骨中，并沉积磷酸钙矿物质。成骨与血管生成密切相关，新生血管有利于营养物质、氧气及新陈代谢产物的运输，促进骨生成。图23是HCLH-MSCs植入裸鼠皮下30天后的Runx2免疫荧光染色激光共聚焦图像。由图23可见HCLH-MSCs中存在大量的Runx2阳性表达，Runx2发挥许多作用，例如指导骨骼形成所必需的转录程序，刺激MSCs分化为成骨细胞，抑制其分化为软骨细胞和脂肪细胞，以及上调骨基质基因(OCN，Col I等)的表达。说明HCLH-MSCs中的MSCs分化成了成骨细胞。
实施例10
将实施例7植入裸鼠皮下30天的样品取出，进行石蜡包埋，切片。随后进行CD31免疫荧光染色，在激光共聚焦显微镜下观察。通过CD31免疫荧光染色进一步验证HCLH-MSCs在体内血管生成能力。如图24所示，通过CD31染色可以看到HCLH-MSCs中存在大量的新生血管，证实了HCLH-MSCs可支持干细胞生长并诱导血管生成，促进新骨形成。

Claims (6)

1.高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂，其特征在于，该骨修复粘合剂由具有多重杂化交联网络结构的水凝胶以及分布在具有多重杂化交联网络结构的水凝胶中的干细胞组成；该骨修复粘合剂在冷冻干燥后具有互穿网络结构，平均孔径为200～500μm、孔隙率为60％～90％；该骨修复粘合剂对颅骨的组织粘附力至少为16KPa；
具有多重杂化交联网络结构的水凝胶是具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液、具有氨基及羧基的高分子材料的溶液与微米级球形羟基磷灰石浆料反应形成的，具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联、具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料与具有氨基及羧基的高分子材料通过迈克加成反应，具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料上的酚羟基与从微米级球形羟基磷灰石中游离出的钙离子螯合形成了多重杂化交联网络结构，微米级球形羟基磷灰石均匀分布于多重杂化交联网络结构中；所述微米级球形羟基磷灰石的粒径为5～50μm；
所述具有氨基及羧基的高分子材料是I型胶原，所述具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料是结构式如式(Ⅰ)所示的多巴胺改性的透明质酸，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为1％～50％，
Figure FDA0003291716780000011
具有多重杂化交联网络结构的水凝胶是在pH＝6.5～7.5的条件下，多巴胺改性的透明质酸溶液、I型胶原溶液与微米级球形羟基磷灰石浆料反应形成的，多巴胺改性的透明质酸氧化自交联、多巴胺改性的透明质酸与I型胶原通过迈克加成反应，多巴胺改性的透明质酸上的酚羟基与从微米级球形羟基磷灰石中游离出的钙离子螯合形成了多重杂化交联网络结构，微米级球形羟基磷灰石均匀分布于多重杂化交联网络结构中；
该骨修复粘合剂的制备方法包括以下步骤：
将具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料溶解，在冰浴条件下加入微米级球形羟基磷灰石浆料并充分超声分散，然后滴加具有氨基及羧基的高分子材料的溶液，充分超声分散，调节所得混合液的pH值至6.5～7.5，然后加入pH值为6.5～7.5的干细胞混悬液，搅拌混匀，再立即转移至模具中在37℃静置至各组分充分交联和络合并转变为凝胶状态，即得可注射骨修复粘合剂；所述微米级球形羟基磷灰石浆料的固含量为5wt.％～45wt.％。
2.根据权利要求1所述高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂，其特征在于，该可注射骨修复粘合剂的含水量为20％～80％；在冷冻干燥状态下，微米级球形羟基磷灰石的含量为15wt.％～80wt.％。
3.根据权利要求2所述高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂，其特征在于，在具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联、具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料与具有氨基及羧基的高分子材料通过迈克加成反应，具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料上的酚羟基与从微米级球形羟基磷灰石中游离出的钙离子螯合形成了多重杂化交联网络结构中，具有氨基及羧基的高分子材料的含量为50wt.％～80wt.％。
4.根据权利要求1所述高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂，其特征在于，微米级球形羟基磷灰石浆料的加入量应使微米级球形羟基磷灰石的质量占具有氨基及羧基的高分子材料、具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料以及微米级球形羟基磷灰石总质量的15％～80％。
5.根据权利要求4所述高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂，其特征在于，具有氨基及羧基的高分子材料的溶液的加入量应使具有氨基及羧基的高分子材料的质量占具有氨基及羧基的高分子材料和具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的总质量的50％～80％。
6.根据权利要求1所述高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂，其特征在于，将具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料用水溶解形成浓度为5～50mg/mL的具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液，将具有氨基及羧基的高分子材料用醋酸溶液溶解形成浓度为3～50mg/mL的具有氨基及羧基的高分子材料的溶液。
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