CN115304775A - 一种改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质的制备方法，首先通过酰胺化反应合成多巴胺接枝改性透明质酸，然后通过多巴胺氧化聚合时的粘附性将透明质酸连接到胶原蛋白基质表面，从而获得基于改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质。该方法制备的修饰型胶原蛋白表面具有优异的润滑性能、抗蛋白吸附性能以及良好的生物相容性，并可便捷自主修饰在胶原蛋白表面，克服了未修饰胶原蛋白表面润滑性能不足、抗蛋白性能差的缺点，该制备方法简便，原料易于合成。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质的制备方法。
背景技术
关节炎是最常见的慢性疾病之一。其中，急慢性软骨组织损伤造成的关节炎是全世界公认的致残性疾病，约占关节炎疾病患者的30％左右，该疾病的治疗在国际上都是个公认的难题。传统的外科治疗方法主要有关节镜下冲洗、微骨折术、关节磨削术等，但存在不能彻底治愈、需要多次微创手术等问题。临床上，胶原蛋白(COL)基质常用于关节软骨的修复再生，重建的软骨接近正常透明软骨组织，疗效持久，并且适用于损伤面积较大的关节软骨缺损。但是单一的胶原蛋白基质力学性能不足，抗蛋白性能较差，严重影响其修复软骨的效果。由于胶原蛋白基质可为软骨细胞提供一个合适生存的三维空间，从而诱导其周围的自体软骨细胞向其内部迁移、增殖扩增，形成新的透明软骨组织。
透明质酸(HA)是由β-1,4糖苷键和β-1,3-糖苷键交替连接的D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰葡萄糖胺构成，既是软骨细胞外基质的重要糖胺聚糖，也是滑液的主要组成成分。研究发现HA具有优异的润滑性能以及良好的抗炎症因子性能，在治疗骨关节炎中发挥着不可或缺的作用。目前，临床上通过注射透明质酸提高软骨表面的润滑性能。但近年来研究发现，在天然软骨表面，透明质酸是镶嵌在软骨表面上的，相比游离的透明质酸，具有更好的润滑能力。同时单一的透明质酸虽然可以暂时缓解软骨损伤的进程，但并不能从根本上再生修复软骨组织。此外，大分子透明质酸和受损软骨组织表面的结合能力很差，几乎不能粘附在受损软骨组织上。
发明内容
为改善胶原蛋白表面抗蛋白非特异性性能差、润滑性能不足的缺点，达到更好治疗软骨损伤的目的，本发明的目的是提供一种改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质的制备方法。
为此，本发明采用以下技术方案：
一种改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质的制备方法，包括以下步骤：
1)制备多巴胺接枝透明质酸：
a)将透明质酸加入到pH为7.3-7.5的磷酸盐缓冲液中，常温下搅拌溶解；
b)按透明质酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为2：1，向步骤a)所获溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，反应20-30min；
c)按盐酸多巴胺与透明质酸重复单元摩尔比为(1-3)：1，向步骤b)反应后的体系中加入盐酸多巴胺，反应1-3h；
d)将步骤c)反应后的溶液在去离子水中透析以除去催化剂及未反应单体，冷冻干燥得到白色棉花状的多巴胺接枝透明质酸；
2)制备胶原蛋白基质：
将胶原蛋白溶解于pH为7.4的磷酸盐缓冲液，配制成50μg/mL的胶原蛋白溶液，随后将100μL所述胶原蛋白溶液滴加到基底表面，孵化1-3h，并用所述磷酸盐缓冲液冲洗，除去未吸附在基底的分子，得到修饰在基底表面的胶原蛋白基质；
3)利用改性透明质酸修饰胶原蛋白基质表面：
(1)将步骤1)得到的多巴胺接枝透明质酸溶解在pH为8-9的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为5-20mg/mL的溶液；
(2)将步骤2)得到的胶原蛋白修饰的基底表面浸入步骤(1)得到的溶液中，在25-50℃条件下反应4-12h，制得改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质。
优选的是，在进行步骤b)前，先将步骤a)获得的溶液的pH调节为5-6。
上述的步骤1)-3)中使用的磷酸盐缓冲液的制备方法为：将3.63g十二水合磷酸氢二钠、0.27g磷酸二氢钾、8g氯化钠和0.2g氯化钾溶于1L去离子水中，然后调节至需要的pH。
优选的是，步骤c)中，反应温度为20-30℃；，所述盐酸多巴胺和透明质酸的摩尔比为2：1。
步骤1)制得的多巴胺接枝透明质酸具有以下结构：
上述方法中所述的基底为关节、软骨组织或培养皿的表面。
本发明的方法制得的改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质可应用于软骨修复材料制备和骨关节炎治疗领域，能够改善受损软骨表面胶原蛋白的抗蛋白吸附性能和润滑性能。
本发明利用多巴胺氧化聚合时的粘附性，能够便捷地将透明质酸牢牢连接到胶原蛋白表面，从而获得基于改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质。通过该方法制备的胶原蛋白基质既保留了胶原蛋白在软骨细胞迁移、生长和在受损软骨组织粘附的能力，同时又赋予了其优异的抗非特异性吸附性能和促润滑性能。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1.本发明的方法制备的改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质，其表面具有很好的抗非特异性吸附性能，对于溶菌酶(带正电荷)、牛血清蛋白(带负电荷)的非特性吸附量分别低至14.69ng/cm2、8.9ng/cm2，远低于未修饰胶原蛋白基质的非特异性吸附量，大大降低了因蛋白、细菌吸附而引起的各种副作用或感染问题。
2.本发明的方法制备的改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质，其表面具有优异的润滑性能，在磷酸盐缓冲液(PBS，模拟生理环境)中的摩擦系数低至0.16左右，克服了未修饰胶原蛋白润滑性能差的缺点。
3.本发明的方法制备的改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质，其表面耐磨损性能高，在磷酸盐缓冲液(PBS，模拟生理环境)中的耐磨损压力可达9.7MPa(详见图3)，远超过未修饰胶原蛋白的耐磨损压力。
4.本发明采用的多巴胺接枝改性的透明质酸可自主结合在胶原蛋白基质表面，还可与受损软骨表面胶原蛋白直接结合，且修饰过程简便易操作。
5.本发明的制备方法简便，原料易于合成且生产成本低，有很好的可行性和实用性。
附图说明
图1是本发明中多巴胺接枝改性透明质酸(HADA)修饰的胶原蛋白基质的结构示意图；
图2a是胶原蛋白表面与改性透明质酸修饰的胶原蛋白表面对2mg/mL的牛血清蛋白(BSA)的非特异性吸附实时曲线变化图；
图2b是胶原蛋白表面与改性透明质酸修饰的胶原蛋白表面对2mg/mL的溶菌酶(LYS)的非特异性吸附实时曲线变化图；
图2c是胶原蛋白表面与改性透明质酸修饰的胶原蛋白表面对2mg/mL的溶菌酶(LYS)、牛血清蛋白(BSA)的最终吸附频率值变化；
图3是胶原蛋白与改性透明质酸修饰的胶原蛋白的摩擦力随压力变化性能图；
图4是胶原蛋白与改性透明质酸修饰的胶原蛋白的摩擦力随剪切速度变化性能图；
图5是胶原蛋白与改性透明质酸修饰的胶原蛋白的磨损压力性能图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案进行详细说明。
本发明中多巴胺接枝改性透明质酸(HADA)修饰的胶原蛋白基质的结构示意图如图1所示。
以下实施例中，磷酸盐缓冲液的制备方法为：将3.63g十二水合磷酸氢二钠、0.27g磷酸二氢钾、8g氯化钠和0.2g氯化钾溶于1L去离子水中，配制成pH为7.3-7.5的10mM磷酸盐缓冲液，然后根据需要调节至相应的pH。
本发明中使用的透明质酸为食品级。
本发明中使用的胶原蛋白为无毒、无热源、纯度>99.9％的胶原蛋白。以下实施例中使用的胶原蛋白购自关节动力安达(天津)生物科技有限公司。
以下实施例中，步骤1)制得的多巴胺接枝透明质酸具有以下结构：
为便于制备和进行性能测试，以下实施例中均以云母或耗散型石英晶体微天平系统使用的带金膜的芯片为基底，该基底仅起支撑作用，对制得的胶原蛋白基质的功能不产生影响。可以理解，在实际应用中，可以以关节、软骨组织或培养皿的表面等作为基底。
实施例1
一种改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质的制备方法，包括以下步骤：
1)利用酰胺化反应制备多巴胺接枝透明质酸(HADA)，包括：
a)用3.63g十二水合磷酸氢二钠、0.27g磷酸二氢钾、8g氯化钠和0.2g氯化钾溶于1L去离子水中，配制成pH＝7.4的10mM磷酸盐缓冲液。取1.2g透明质酸(HA)溶于120mL上述磷酸盐缓冲液中，用1.0M盐酸将溶液的pH调至5；
b)向步骤a)的溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，搅拌20min，其中所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和透明质酸重复单元的摩尔比为2：1；
c)向步骤b)的溶液中加入多巴胺，用1M盐酸将溶液的pH值维持在5，且在20℃下搅拌反应1小时，其中所述多巴胺和透明质酸重复单元的摩尔比为1：1；
d)将步骤c)反应后的溶液置于透析袋(MWCO：8000-14000)中，在pH＝5.0的去离子水中透析2天，再在去离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干，得到白色棉花状的多巴胺接枝透明质酸(HADA)，于-20℃下储存备用。
2)制备胶原蛋白基质：
将胶原蛋白(COL)溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)中，配制成50μg/mL的COL溶液，随后将100μL所述COL溶液滴加到基底(芯片或云母)表面，孵化1h，并用PBS(pH＝7.4)冲洗，以除去未吸附在基底的分子，得到修饰在基底表面的胶原蛋白基质。
3)改性透明质酸在胶原蛋白基质表面的修饰：
(1)将10mg步骤1)得到的多巴胺接枝透明质酸(HADA)溶于2mL pH＝8.5的磷酸盐缓冲溶液中，最终浓度为5mg/mL；
(2)将步骤2)得到的胶原蛋白修饰的基底表面浸泡在步骤(1)得到的溶液中，在水浴摇床中于25℃下反应4h。反应后的胶原蛋白表面用去离子水次清洗三次，即获得基于多巴胺接枝透明质酸修饰的胶原蛋白基质。
本发明制备的多巴胺接枝改性透明质酸(HADA)修饰的胶原蛋白基质的结构示意图如图1所示。
抗非特异性吸附量测定：
对本实施例制得的改性透明质酸修饰的胶原蛋白表面的抗非特异性吸附性能进行测试，具体方法如下：
将该实施例得到的具有多巴胺改性透明质酸修饰胶原蛋白基质的耗散型石英晶体微天平芯片(COL-HA-DA)贴合到耗散型石英晶体微天平系统的流通池内。以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为50μL/min。待基线平稳后，通入2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)或溶菌酶(LYS)，经流动相推动蛋白溶液到达芯片表面，由耗散型石英晶体微天平系统测定实时变化曲线，读取频率变化值，并计算非特异性吸附量，结果见表1。
由表1的结果可知，实施例1制得的基于改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质表面(COL-HADA-4h)对牛血清蛋白和溶菌酶的非特异性吸附量分别为37.87ng/cm2和8.87ng/cm2，远低于对照组胶原蛋白的吸附量。
摩擦系数测定与润滑性能评价：
采用表面力仪对本实例制得的多巴胺接枝透明质酸改性胶原蛋白基质表面的摩擦系数进行测定，评价其润滑性能，具体方法如下：
将该实施例得到的具有多巴胺改性透明质酸修饰胶原蛋白基质的云母片固定于表面力仪测试系统内测量其摩擦系数，重复测量3次，结果汇总见图3。
由图3可知，该实施例1制得的多巴胺接枝透明质酸改性胶原蛋白基质表面(COL-HADA，4h)的摩擦系数为0.16，远低于单一胶原蛋白基质的摩擦系数(0.65)，因此具有良好的润滑性能。
实施例2
1)多巴胺接枝透明质酸(HADA)的制备：
a)取1.2g透明质酸(HA)溶于120mL、pH＝7.5的磷酸盐缓冲液中，用1.0M盐酸将溶液的pH调至5.5；
b)向步骤a)的溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐搅拌25min，其中所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和透明质酸重复单元的摩尔比为2：1；
c)向步骤b)的溶液中加入多巴胺，用1M盐酸将溶液的pH值维持在5.5，且在25℃下搅拌反应2小时，其中所述多巴胺和透明质酸重复单元摩尔比为2：1；
d)将步骤c)反应后的溶液置于透析袋(MWCO：8000-14000)中，且在pH＝5.0的去离子水中透析2天，再在去离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干，白色棉花状的的多巴胺接枝透明质酸(HADA)，于-20℃下储存备用。
2)胶原蛋白基质的制备：
将COL溶解在PBS(pH＝7.5)中配制成50μg/mL的COL溶液，随后将100μL所述COL溶液滴加到基底(芯片或云母)表面，孵化2h，并用PBS(pH＝7.5)冲洗以除去未吸附在基底的分子，得到修饰在基底表面的胶原蛋白基质。
3)改性透明质酸在胶原蛋白基质表面的修饰：
(1)将20mg步骤1)得到的多巴胺接枝透明质酸(HADA)溶于2mL pH＝8.5的磷酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为10mg/mL。
(2)将步骤2)得到的胶原蛋白修饰的基底表面浸泡在步骤(1)得到的溶液中，在水浴摇床中于37℃且100rpm的摇速下反应8h。修饰后的胶原蛋白表面用去离子水次清洗三次，即获得基于多巴胺接枝透明质酸修饰的胶原蛋白基质。
抗非特异性吸附量测定：
测试方法同实施例1，测试结果见表1和图2a-图2c。
由表1和图2a-图2c的结果可知，实施例2制得的基于改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质表面(COL-HADA-8h)对牛血清蛋白和溶菌酶的非特异性吸附量分别为15.22ng/cm2和5.31ng/cm2。
摩擦系数测定与润滑性能评价：
采用表面力仪对本实例制得的多巴胺接枝改性透明质酸修饰的胶原蛋白表面的磨损速度进行测定，评价其润滑性能，结果汇总见图4。
由图4可见，实施例2中制得的基于改性透明质酸修饰的胶原蛋白表面(COL-HADA，8h)的磨损速度为14μm/s，远高于单一胶原蛋白基质的磨损速度(4μm/s)，说明其耐磨性高，具有优异的润滑性能。
实施例3
1)多巴胺接枝透明质酸(HADA)的制备：
a)取1.2g透明质酸(HA)溶于120mL、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，用1.0M盐酸将溶液的pH调至6；
b)向步骤a)的溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，搅拌30min，其中，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和透明质酸重复单元摩尔比为2：1；
c)向步骤b)的溶液中加入多巴胺，用1M盐酸将溶液的pH值维持在6且在30℃下搅拌反应3小时，其中所述多巴胺和透明质酸重复单元摩尔比为3：1；
d)将步骤c)反应后的溶液置于透析袋(MWCO：8000-14000)中，且在pH＝5.0的去离子水中透析2天，再在去离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到白色棉花状的产物HADA，于-20℃下储存备用。
2)胶原蛋白基质的制备：
将COL溶解在PBS(pH＝7.4)中配制成50μg/mL的溶液，随后将100μL COL溶液滴加到基底(芯片或云母)表面，孵化3h，并用PBS(pH＝7.4)冲洗以除去未吸附在基底的分子，得到修饰在基底表面的胶原蛋白基质。
3)多巴胺接枝改性透明质酸修饰胶原蛋白表面的制备：
(1)将40mg步骤1)得到的HADA溶于2mL pH＝8.5的磷酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为20mg/mL。
(2)将步骤2)得到的胶原蛋白修饰的基底表面浸泡在步骤(1)得到的溶液中，在水浴摇床中于50℃且100rpm的摇速下反应12h。反应后的胶原蛋白基质用去离子水次清洗三次，即获得基于多巴胺接枝透明质酸修饰的胶原蛋白基质。
抗非特异性吸附量测定：
测试方法同实施例1。测试结果见表1。
表1不同凝胶基质表面的非特异性吸附量以及摩擦系数
由表1的结果可知，实施例3制得的基于透明质酸改性的胶原蛋白基质表面(COL-HADA-12h)对牛血清蛋白和溶菌酶的非特异性吸附量分别为33.80ng/cm2和7.87ng/cm2(见表1)，远低于对照组胶原蛋白表面吸附量。
摩擦系数测定与润滑性能评价：
采用表面力仪对本实例制得的多巴胺接枝改性透明质酸修饰胶原蛋白表面的磨损压力进行测定，评价其润滑性能，结果汇总见图5。
由图5可见，实施例3中制得的基于透明质酸改性的胶原蛋白基质表面(COL-HADA-12h)的磨损压力为9.7MPa，远高于单一胶原蛋白基质的磨损压力(0.79MPa)，说明其耐磨性高，具有优异的润滑性能。
Claims (7)
1.一种改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质的制备方法，包括以下步骤：
1)制备多巴胺接枝透明质酸：
a)将透明质酸加入到pH为7.3-7.5的磷酸盐缓冲液中，常温下搅拌溶解；
b)按透明质酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为2：1，向步骤a)所获溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，反应20-30min；
c)按盐酸多巴胺与透明质酸重复单元摩尔比为(1-3)：1，向步骤b)反应后的体系中加入盐酸多巴胺，反应1-3h；
d)将步骤c)反应后的溶液在去离子水中透析以除去催化剂及未反应单体，冷冻干燥得到白色棉花状的多巴胺接枝透明质酸；
2)制备胶原蛋白基质：
将胶原蛋白溶解于pH为7.3-7.5的磷酸盐缓冲液，配制成50μg/mL的胶原蛋白溶液，随后将100μL所述胶原蛋白溶液滴加到基底表面，孵化1-3h，并用所述磷酸盐缓冲液冲洗，除去未吸附在基底的分子，得到修饰在基底表面的胶原蛋白基质；
3)利用改性透明质酸修饰胶原蛋白基质表面：
(1)将步骤1)得到的多巴胺接枝透明质酸溶解在pH为8-9的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为5-20mg/mL的溶液；
(2)将步骤2)得到的胶原蛋白修饰的基底表面浸入步骤(1)得到的溶液中，在25-50℃条件下反应4-12h，制得改性透明质酸修饰的胶原蛋白基质。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在进行步骤b)前，先将步骤a)获得的溶液的pH调节为5-6。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)-3)中使用的磷酸盐缓冲液的制备方法为：将3.63g十二水合磷酸氢二钠、0.27g磷酸二氢钾、8g氯化钠和0.2g氯化钾溶于1L去离子水中，然后调节至需要的pH。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤c)中，反应温度为20-30℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤c)中，所述盐酸多巴胺和透明质酸的摩尔比为2：1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1)制得的多巴胺接枝透明质酸具有以下结构：
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述的基底为关节、软骨组织或培养皿的表面。
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