CN114854045A - 一种聚氨基酸水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种聚氨基酸水凝胶及其制备方法和应用。所述方法：用溶剂将谷氨酸‑N‑羧基内酸酐或侧链修饰的谷氨酸‑N‑羧基内酸酐与含有巯基的N‑羧基内酸酐混匀，加入引发剂进行反应，得到聚氨基酸I；用溶剂将肌氨酸‑N‑羧基内酸酐溶解，然后加入多官能引发剂进行反应，得到聚合中间体，然后用溶剂将聚合中间体溶解后加入3‑马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯进行反应，得到聚氨基酸II；配制聚氨基酸I溶液和聚氨基酸II溶液，然后将其与短肽溶液混匀，经凝胶化，得到聚氨基酸水凝胶。本发明得到的聚氨基酸水凝胶具有优异的生物相容性和生物可降解性，能够很好地支持干细胞生长与软骨分化，并具有很好的免疫调节特性。

Description

一种聚氨基酸水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药材料技术领域，尤其涉及一种聚氨基酸水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
关节骨软骨损伤是极其常见的关节病损，成熟的关节软骨无血液供应，自身修复能力有限。如果不及时治疗骨软骨缺损，未来将增加6倍的患骨性关节炎的风险。并且骨关节疾病在医疗保健中的花费位居首位，因此对其进行早期治疗和干预极其重要。
治疗软骨缺损的方法有很多，目前临床上常用的方法是微骨折术修复，但人体关节软骨是透明软骨，通过微骨折法修复的软骨是纤维软骨，纤维软骨的机械强度没有透明软骨高，因此在反复运动的日常活动的挤压下更容易破碎。因此微骨折并不能修复真正受损的软骨本身，只是提供了性质类似的替代品。目前组织工程技术为软骨损伤提供了一种很有希望的治疗策略。合适的组织工程支架能起到局部支撑作用，并能使病损组织重建为合适的活体组织。水凝胶的结构和天然软骨的细胞外基质相似，因此是用于软骨修复和再生的一类非常重要的材料。
水凝胶是一种由亲水的聚合物链段通过交联形成的三维空间网状材料，其含水量通常在70％以上。由于其具有极高的含水量、较大的空隙率以及优异的生物相容性等优势，目前已被开发用于药物可控释放、细胞培养支架等领域。
共价交联的水凝胶相比于非共价交联的凝胶，通常具有更高的力学性能，降解速度适中，因而更符合软骨组织修复的需求。然而，传统共价交联水凝胶设计选用的聚合物通常化学可修饰性较差，且难以与生物体相容。
目前研究和临床应用中，基于聚乙二醇的水凝胶得到广泛应用。聚乙二醇水溶性较好，且具有优异的生物相容性。但聚乙二醇在食品、药品、化妆品等领域的广泛应用，使得大部分人的体内已产生聚乙二醇抗体，因而具有潜在的免疫原性。同时聚乙二醇在体内难以降解，存在一定的安全隐患。
聚氨基酸是一种具有广泛生物应用前景的聚合物材料。其侧链的具有化学多样性，可以方便地进行修饰或引入交联。同时，和天然多肽类似的主链结构使其能够形成和蛋白质类似的二级结构，例如α-螺旋、β-折叠等，从而能够提高材料的力学性能；该材料又具有的优异的生物相容性与生物可降解性。聚氨基酸水凝胶在药物递送、干细胞培养、人工组织等领域的应用已有较多先例。然而目前，聚氨基酸水凝胶在软骨修复中应用范围较窄，选用的单体种类较少。此外，为兼顾水溶性和低吸涨性能，目前往往采取和聚乙二醇链段嵌段等手段制备聚氨基酸前体，但同时也引入了聚乙二醇链段在免疫原性和降解性上的问题。
因此，需要设计一种新型的低免疫原性、高生物相容性、优异可降解性能的聚合物作为软骨修复的水凝胶基底。
发明内容
为了解决现有技术中存在的一个或者多个技术问题，本发明提供了一种聚氨基酸水凝胶及其制备方法和应用。
本发明在第一方面提供了一种聚氨基酸水凝胶的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)用第一溶剂将谷氨酸-N-羧基内酸酐或侧链修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐与含有巯基的N-羧基内酸酐混合均匀，然后加入引发剂进行聚合反应，得到聚氨基酸I；
(2)用第二溶剂将肌氨酸-N-羧基内酸酐溶解，然后加入多官能化引发剂进行聚合反应，得到聚合中间体，然后用第三溶剂将所述聚合中间体溶解后加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯进行聚合物端基修饰反应，得到聚氨基酸II；
(3)用磷酸盐缓冲液分别将聚氨基酸I和聚氨基酸II配制成聚氨基酸I溶液和聚氨基酸II溶液，然后将聚氨基酸I溶液、聚氨基酸II溶液和短肽溶液混合均匀，经凝胶化，得到聚氨基酸水凝胶。
优选地，所述谷氨酸-N-羧基内酸酐的侧链修饰基团选自乙二醇、二乙二醇、二乙二醇单甲醚、三乙二醇单甲醚、四乙二醇单甲醚、乙醇胺、3-羟基丙酸和乳酸中的一种或多种；所述含有巯基的N-羧基内酸酐选自半胱氨酸-N-羧基内酸酐、高半胱氨酸-N-羧基内酸酐、青霉胺-N-羧基内酸酐中的一种或多种；步骤(1)中的所述引发剂为具有一定亲核性的含氨基或巯基的试剂，优选的是，所述引发剂包括但不限于正己胺、苄胺、巯基乙醇、谷氨酸甲酯、二乙胺、异丙胺、环己胺中的一种或多种，更优选的是，所述引发剂为苄胺；和/或所述短肽溶液中含有的短肽为半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。
优选地，所述谷氨酸-N-羧基内酸酐的侧链修饰基团为三乙二醇单甲醚，三乙二醇单甲醚修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐的结构式如下式a所示：
Figure BDA0003622374980000031
所述含有巯基的N-羧基内酸酐为半胱氨酸-N-羧基内酸酐，所述半胱氨酸-N-羧基内酸酐的结构式如下式b所示：
Figure BDA0003622374980000032
所述聚氨基酸I为聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)，结构式如下式I所示：
Figure BDA0003622374980000041
所述聚氨基酸II为聚氨基酸PSar-Mal4，结构式如下式II所示：
Figure BDA0003622374980000042
优选地，在步骤(1)中：所述侧链修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐、所述含有巯基的N-羧基内酸酐与所述引发剂的摩尔比为(200～400)：(10～100)：1，优选为250:50:1；所述引发剂的浓度为0.3～0.6mol/L，优选为0.5mol/L；所述第一溶剂的用量为2～8mL，优选为3mL；所述聚合反应的温度为室温，所述聚合反应的时间为3～6h，优选为4h；和/或所述聚合反应将未经保护的含巯基的N-羧基内酸酐直接作为聚合单体参与反应，使得到的聚氨基酸I具有支化结构。
优选地，在步骤(2)中：所述多官能化引发剂为具有亲核性的多个氨基和/或巯基的化合物，优选的是，所述多官能化引发剂包括但不限于乙二胺、三氨乙基胺、季戊四胺、赖氨酸、赖氨酸甲酯中的一种或多种，更优选的是，所述多官能化引发剂为季戊四胺；所述肌氨酸-N-羧基内酸酐、所述多官能化引发剂与所述3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1：(0.004～0.006)：(0.05～0.15)，优选为1:0.005:0.1；所述聚合反应的温度为室温，所述聚合反应的时间为18～30h，优选为24h；和/或所述聚合物端基修饰反应的温度为室温，所述聚合物端基修饰反应的时间为18～30h，优选为24h。
优选地，在步骤(3)中：所述聚氨基酸I溶液的浓度为80～120mg/mL，优选为100mg/mL；和/或所述聚氨基酸II溶液的浓度为120～180mg/mL，优选为150mg/mL。
优选地，在步骤(3)中：所述短肽溶液采用磷酸盐缓冲液配制而成；和/或所述聚氨基酸I溶液和所述短肽溶液中含有的巯基基团总量与所述聚氨基酸II溶液中含有的马来酰亚胺基团的摩尔比为(0.9～1.1)：1，优选为1:1。
优选地，在步骤(3)中：制备得到的聚氨基酸水凝胶的质量分数为5％～20％，优选为10％。
本发明在第二方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的聚氨基酸水凝胶。
本发明在第三方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的聚氨基酸水凝胶在生物医药领域中的应用；优选的是在干细胞培养与组织工程中的应用，更优选的是在干细胞培养与组织工程中作为软骨修复材料的应用。
本发明与现有技术相比，至少具有如下有益效果：
(1)本发明针对传统碳骨架软骨修复水凝胶生物相容性差、难降解等问题，采用全聚氨基酸骨架和交联剂设计，得到聚氨基酸水凝胶具有优异的生物相容性和生物可降解性。
(2)本发明中的聚氨基酸水凝胶主链含有硫酯键，相比于酰胺键化学活性更高，使得聚氨基酸水凝胶具有更好的降解性能。
(3)本发明的一些优选实施方案中，选用了侧链修饰了三乙二醇单甲醚的聚谷氨酸衍生物作为聚氨基酸凝胶骨架，该聚氨基酸单体本身为电中性，同时又具有较好的水溶性，从而解决了传统聚氨基酸凝胶需要引入离子型氨基酸导致的高吸胀比的问题，也规避了引入长链聚乙二醇导致的潜在免疫原性和降解性隐患。
(4)本发明的一些优选实施方案中，将半胱氨酸-N-羧基内酸酐(CysNCA)作为共聚单体，制备了含有一定量巯基的聚氨基酸，这一方法通过一步合成的方式进行制备，合成方法简单便捷，相比于传统方法常用的保护-脱保护策略与后修饰策略，操作更简便，修饰效率更可控。
(5)本发明选用的CysNCA共聚策略，将含有活性巯基的NCA加入共聚体系中，使得到的聚氨基酸具有支化结构。
(6)本发明的一些优选实施方案中，使用的聚氨基酸骨架P(L-EG3Glu-co-L-Cys)在水溶液中呈现出α-螺旋二级结构，同时聚合过程中巯基的存在使其具有一定的支化特征，螺旋结构和支化的存在赋予水凝胶相比于传统聚氨基酸水凝胶更强且可调的力学性能，从而适用于软骨修复。
(7)本发明使用的交联剂为端基马来酰亚胺官能化的四臂聚肌氨酸，使用马来酰亚胺-巯基反应形成化学交联的水凝胶。这一反应使用原位交联策略，能够在两种前体混合后在室温下迅速凝胶化，便于和细胞以及其他功能物质混合，同时操作简便。
(8)本发明制备得到的聚氨基酸水凝胶具有优异的生物相容性，能够很好地支持干细胞生长与软骨分化，其降解过程符合软骨的修复进程，并具有免疫调节功能，促进巨噬细胞向M2表型分化，并在长期植入中体现出免疫调节性能。
(9)本发明得到的聚氨基酸水凝胶相比于传统的软骨修复水凝胶材料而言，具有更好的免疫调节特性，能够很好地诱导M2型巨噬细胞极化，最终实现促进组织修复的效果。
附图说明
图1是本发明实施例1中的聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)进行1H NMR测试所得的核磁谱图(400M，D2O)。
图2是本发明实施例1中的聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)的尺寸排阻色谱曲线图(DMF)。
图3是本发明实施例1中的聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)的圆二色光谱曲线图。
图4是本发明实施例1中的聚氨基酸PSar-Mal4进行1H NMR测试所得的核磁谱图(400M，D2O)。
图5是本发明实施例1得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的合成示意图。
图6是本发明实施例1得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的流变振荡频率扫描曲线。该曲线通过旋转流变仪振荡频率扫描测试得到；测试温度为25℃，在测试前首先在频率1Hz下对凝胶进行振荡振幅扫描，确定其线性粘弹区，随后于线性粘弹区内进行振荡频率扫描，扫描范围为0.01-100rad/s，其结果表明得到的聚氨基酸水凝胶为较为稳定的可自支撑凝胶。
图7是本发明实施例1得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的体外吸胀曲线。将本发明制备得到的聚氨基酸水凝胶(50μL)浸泡于磷酸盐缓冲液中，37℃下浸泡特定时间后记录凝胶吸胀后质量，吸胀后质量与吸胀前的初始质量之比为吸胀比。
图8是本发明实施例1得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的压缩测试曲线。
图9是本发明实施例1得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的扫描电镜图。
图10是本发明实施例1得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD在培养PB-MSCs细胞3天、7天、14天后的细胞死活染色结果图。
图11是本发明实施例1得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD在培养PB-MSCs细胞14天后的II型胶原表达情况图。
图12是本发明得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的软骨修复示意图。
图13是本发明实施例1得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD对兔骨软骨缺损修复6周和12周的大体观图。
图14是本发明实施例1得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD对兔骨软骨缺损修复6周和12周的MRI成像图。
图15是本发明实施例1得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD对兔骨软骨缺损修复6周和12周的micro-CT成像图。
图16是本发明实施例1得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD修复兔骨软骨缺损12周后的SEM图像。
图17是本发明实施例1得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD对兔骨软骨缺损修复6周和12周后的甲苯胺蓝染色结果图。
图18是本发明实施例1得到的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD周围浸润的巨噬细胞极化的免疫组化结果图。
图19是本发明实施例1中的PAA-RGD与PEG-RGD和GelMA水凝胶的国际软骨修复评分结果图。
图20是本发明实施例1中的PAA-RGD与PEG-RGD和GelMA水凝胶周围浸润巨噬细胞M2极化面积结果图。
图21是PEG-RGD水凝胶的结构和水凝胶示意图。
图22是GelMA水凝胶的结构示意图。
图中：关于兔骨软骨缺损修复实验的结果，Blank对应的均是兔骨软骨缺损后未植入实施例1中的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的空白组的实验结果，PAA-RGD对应的是均是兔骨软骨缺损后植入实施例1中的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的实验结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明在第一方面提供了一种聚氨基酸水凝胶的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)用第一溶剂将谷氨酸-N-羧基内酸酐或侧链修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐与含有巯基的N-羧基内酸酐混合均匀，然后加入引发剂进行聚合反应，得到聚氨基酸I，优选的是，所述聚氨基酸I为聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)；在本发明的具体实施例中，优选的是，在进行下述步骤(2)之前，还包括先对所述聚氨基酸I进行纯化处理的步骤；在本发明一些优选的实施例中，所述侧链修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐为三乙二醇单甲醚修饰的L-EG3GluNCA，所述含有巯基的N-羧基内酸酐为半胱氨酸-N-羧基内酸酐L-CysNCA，所述引发剂为苄胺引发剂BnNH2，本发明步骤(1)制备所述聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)的反应式例如如下所示：
Figure BDA0003622374980000091
(2)用第二溶剂将肌氨酸-N-羧基内酸酐SarNCA溶解，然后加入多官能化引发剂进行聚合反应，得到聚合中间体，然后用第三溶剂将所述聚合中间体溶解后加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯NHS-MAL进行聚合物端基修饰反应，得到聚氨基酸II，即聚氨基酸PSar-Mal4；在本发明的一些具体实施例中，在将聚合中间体进行聚合物端基修饰反应之前，还包括先对所述聚合中间体进行纯化处理的步骤；在进行下述步骤(3)之前，还包括先对所述聚氨基酸II进行纯化处理的步骤；
(3)用磷酸盐缓冲液PBS分别将聚氨基酸I和聚氨基酸II配制成聚氨基酸I溶液和聚氨基酸II溶液，然后将聚氨基酸I溶液、聚氨基酸II溶液和短肽溶液(例如CRGD溶液)混合均匀，经凝胶化(例如在室温静置10min内即发生凝胶化)，得到聚氨基酸水凝胶，例如PAA-RGD水凝胶。
本发明优选为使用NCA开环聚合的方式合成含L-EG3Glu单元的聚氨基酸，得到的聚合物不带电荷，同时又具有较好的水溶性，适合作为凝胶骨架；本发明优选为使用半胱氨酸NCA单体共聚的方式合成含半胱氨酸单元的聚氨基酸，避免了繁琐的保护和脱保护步骤，引入巯基交联点，用于软骨修复凝胶制备；同时半胱氨酸NCA单体赋予了材料一定的支化特征，使其具有较好的力学性能；本发明合成得到具有特定二级结构的聚氨基酸；相比于无规线团等二级结构的聚氨基酸，得到的具有α-螺旋的聚氨基酸形成的凝胶材料具有更高的力学性能；本发明使用马来酰亚胺修饰的聚肌氨酸作为交联剂，交联剂也完全可降解；巯基-马来酰亚胺反应快速高效，易于操作；本发明得到的聚氨基酸水凝胶共价连接短肽CRGD，具有极好的细胞黏附性；当然，本发明还可以使用聚脯氨酸等不同二级结构的聚氨基酸骨架，调节凝胶的力学性能以适应不同细胞分化的需求；并且本发明可以引入更多带有巯基官能团的功能小分子，共价连接至凝胶中，以赋予凝胶更多的功能。
根据一些优选的实施方式，所述谷氨酸-N-羧基内酸酐的侧链修饰基团选自乙二醇、二乙二醇、二乙二醇单甲醚、三乙二醇单甲醚、四乙二醇单甲醚、乙醇胺、3-羟基丙酸和乳酸中的一种或多种；所述含有巯基的N-羧基内酸酐选自半胱氨酸-N-羧基内酸酐、高半胱氨酸-N-羧基内酸酐、青霉胺-N-羧基内酸酐中的一种或多种；本发明对这些侧链修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐与含有巯基的N-羧基内酸酐的来源没有特别的限制，例如可以为市面上直接购买得到的产品或者通过现有的方法合成的产品均可；步骤(1)中的所述引发剂为具有一定亲核性的含氨基或巯基的试剂，优选的是，所述引发剂包括但不限于正己胺、苄胺、巯基乙醇、谷氨酸甲酯、二乙胺、异丙胺、环己胺中的一种或多种，更优选的是，所述引发剂为苄胺；所述第一溶剂、所述第二溶剂和/或所述第三溶剂选自N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-乙基吡咯烷酮、二甲基亚砜中的至少一种，优选的是，所述第一溶剂、所述第二溶剂和所述第三溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；和/或所述短肽溶液中含有的短肽为半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。
根据一些优选的实施方式，所述谷氨酸-N-羧基内酸酐的侧链修饰基团为三乙二醇单甲醚，所述三乙二醇单甲醚修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐的结构式如下式a所示：
Figure BDA0003622374980000101
所述含有巯基的N-羧基内酸酐为半胱氨酸-N-羧基内酸酐，所述半胱氨酸-N-羧基内酸酐的结构式如下式b所示：
Figure BDA0003622374980000111
所述聚氨基酸I为聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)，结构式如下式I所示：
Figure BDA0003622374980000112
式I中，m，n，o，p为聚氨基酸I中，将一定量三乙二醇单甲醚修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐与半胱氨酸-N-羧基内酸酐共聚后，得到共聚物的重复单元数目，其中，o和p为聚合物含支化链的重复单元和支化链段重复单元数目；本发明可以根据投料比的不同，获得不同m，n，o，p取值；其中，优选的是，根据投料方式的不同，得到聚氨基酸I中m：n：o可选比例为(200～400)：(4～40)：(10～60)，更优选的是，m：n：o＝120:7.5:16.3。
根据一些优选的实施方式，所述聚氨基酸II为聚氨基酸PSar-Mal4，结构式如下式II所示：
Figure BDA0003622374980000113
式II中，x为聚氨基酸II中每条臂上重复单元数目，本发明对x的取值没有特别的限制，优选的是，可选范围30～70，更优选的是，x＝60。
根据一些优选的实施方式，在步骤(1)中：所述侧链修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐、所述含有巯基的N-羧基内酸酐与所述引发剂的摩尔比为(200～400)：(10～100)：1，优选为250:50:1；本发明发现，所述侧链修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐、所述含有巯基的N-羧基内酸酐与所述引发剂的摩尔比为(200～400)：(10～100)：1，该摩尔比的选择使得在上述条件下得到的聚氨基酸I中含有巯基的半胱氨酸比例适中，符合交联的需求；同时形成一定的支化结构，有利于改善凝胶的降解性能。
根据一些优选的实施方式，在步骤(1)中，所述引发剂的浓度为0.3～0.6mol/L，优选为0.5mol/L；所述第一溶剂的用量为2～8mL(例如2、3、4、5、6、7或8mL)，优选为3mL；所述聚合反应的温度为室温(例如室温15～35℃)，所述聚合反应的时间为3～6h(例如3、4、5或6h)，优选为4h；和/或所述聚合反应将未经保护的含巯基的N-羧基内酸酐直接作为聚合单体参与反应，使得到的聚氨基酸I具有支化结构。
根据一些优选的实施方式，在步骤(2)中：所述多官能化引发剂为具有亲核性的多个氨基和/或巯基的化合物，优选的是，所述多官能化引发剂包括但不限于乙二胺、三氨乙基胺、季戊四胺、赖氨酸、赖氨酸甲酯中的一种或多种，更优选的是，所述多官能化引发剂为季戊四胺；所述肌氨酸-N-羧基内酸酐、所述多官能化引发剂与所述3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1：(0.004～0.006)：(0.05～0.15)(例如1:0.004:0.05、1:0.004:0.08、1:0.004:0.1、1:0.004:0.12、1:0.004:0.15、1:0.005:0.05、1:0.005:0.08、1:0.005:0.1、1:0.005:0.12、1:0.005:0.15、1:0.006:0.05、1:0.006:0.08、1:0.006:0.1、1:0.006:0.12或1:0.006:0.15)，优选为1:0.005:0.1；本发明发现，所述肌氨酸-N-羧基内酸酐、所述多官能化引发剂与所述3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1：(0.004～0.006)：(0.05～0.15)，该摩尔比下肌氨酸-N-羧基内酸酐能完全转化为聚氨基酸，其分子量与聚氨基酸I相匹配；同时，该摩尔比下，聚氨基酸II的端基能够完全转化为马来酰亚胺，能够和巯基反应迅速成胶；所述聚合反应的温度为室温(例如室温15～35℃)，所述聚合反应的时间为18～30h(例如18、20、24、28或30h)，优选为24h；和/或所述聚合物端基修饰反应的温度为室温(例如室温15～35℃)，所述聚合物端基修饰反应的时间为18～30h(例如18、20、24、28或30h)，优选为24h。
根据一些优选的实施方式，在步骤(3)中：所述聚氨基酸I溶液的浓度为80～120mg/mL(例如80、85、90、95、100、105、110、115或120mg/mL)，优选为100mg/mL；和/或所述聚氨基酸II溶液的浓度为120～180mg/mL(例如120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180mg/mL)，优选为150mg/mL；本发明发现，该浓度范围混合下，两种聚氨基酸前体均能较好溶解，得到的聚氨基酸水凝胶的凝胶化速率较快。
根据一些优选的实施方式，在步骤(3)中：所述短肽溶液采用磷酸盐缓冲液配制而成，优选的是，所述短肽溶液的浓度为20mg/mL；和/或所述聚氨基酸I溶液和所述短肽溶液中含有的巯基基团总量与所述聚氨基酸II溶液中含有的马来酰亚胺基团的摩尔比为(0.9～1.1)：1，优选为1:1。
根据一些更优选的实施方式，在步骤(1)中，所述侧链修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐、所述含有巯基的N-羧基内酸酐与所述引发剂的摩尔比为(200～400)：(10～100)：1；在步骤(2)中，所述肌氨酸-N-羧基内酸酐、所述多官能化引发剂与所述3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1：(0.004～0.006)：(0.05～0.15)；在步骤(3)中，所述聚氨基酸I溶液的浓度为80～120mg/mL，所述聚氨基酸II溶液的浓度为120～180mg/mL；本发明经过大量的创造性试验才得到了本发明制备所述聚氨基酸水凝胶的最佳试验条件，如此能保证得到性能最佳的本发明所述聚氨基水凝胶。
根据一些优选的实施方式，在步骤(3)中：所述凝胶化为在室温下进行凝胶化8～15min(例如8、9、10、12或15min)，优选为10min；
所述凝胶化为在室温下进行凝胶化10min得到，优选的是，得到的聚氨基酸水凝胶的质量分数可为5～20％，优选为10％；在本发明中，所述聚氨基酸水凝胶的质量分数即指的是所述聚氨基酸水凝胶中含有的聚氨基酸的质量百分含量。
根据一些具体的实施方式，所述聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的制备，包括如下步骤：
①合成聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)
室温下，将L-EG3GluNCA(9.3mmol)与L-CysNCA(1.8mmol)溶解于DMF(3.0mL)中，加入苄胺引发剂(75μL×0.5M)，室温搅拌反应4h。使用FT-IR检测聚合是否完全。聚合完毕后，用乙醚沉淀，离心4000rpm，10min。弃去上层清液。使用透析对聚合物进行进一步纯化，最终得到白色粉末状固体(产率80％)，即为聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)。
②合成聚氨基酸PSar-Mal4
在20mL的样品瓶中加入SarNCA(8.70mmol)，使用LC-MS级DMF溶解(9mL)，加入新配置的季戊四胺引发剂(570μL×0.075M)加入磁子进行反应。反应24小时之后，使用FT-IR检测聚合是否完全。聚合完毕后，从手套箱中取出，用乙醚沉淀，离心4000rpm，10min。弃去上层清液，将所得到的聚合中间体置于真空烘箱中烘干。
为了得到末端修饰马来酰亚胺的聚合物，将得到的聚合中间体溶解于DMF中，加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-MAL)(0.91mmol)，室温反应过夜。用乙醚沉淀，离心4000rpm，10min。弃去上层清液，吹干后将所得的聚合物加水复溶，透析除去小分子杂质，冻干，得到白色固体(产率81％)，即为聚氨基酸PSar-Mal4。
③合成聚氨基酸水凝胶PAA-RGD
使用PBS将聚合物P(EG3Glu-co-Cys)配制为100mg/mL、聚合物PSar-Mal4配制为150mg/mL的储液，使用PBS将短肽半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(CRGD)配制成CRGD溶液，根据短肽和聚合物P(EG3Glu-co-Cys)中的巯基总量与PSar-Mal4中的马来酰亚胺的摩尔比为＝1：1，吸取混匀特定体积的储液和CRGD溶液，室温静置10min内即发生凝胶化，制备得到预设的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD。
本发明对采用的各原料的来源没有特别的限制，例如可以为市面上直接购买的产品或者是通过现有的方法合成的均可。
本发明在第二方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的聚氨基酸水凝胶。
本发明在第三方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的聚氨基酸水凝胶在生物医药领域中的应用；优选的是在干细胞培养与组织工程中的应用，更优选的是在干细胞培养与组织工程中作为软骨修复材料的应用。
下文将通过举例的方式对本发明进行进一步的说明，但是本发明的保护范围不限于这些实施例。
实施例1
①合成聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)
室温下，将L-EG3GluNCA(9.3mmol)与L-CysNCA(1.8mmol)溶解于DMF(3.0mL)中，加入苄胺引发剂(75μL×0.5M)，室温25℃搅拌反应4h。使用FT-IR检测聚合是否完全。聚合完毕后，用乙醚沉淀，离心4000rpm，10min。弃去上层清液。使用透析对聚合物进行进一步纯化，最终得到白色粉末状固体(产率80％)，即为聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)。得到的聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)具有支化结构，具体表征为：聚合物中的巯基含量通过Ellman’s试剂表征，所得结果中，每条链段含有7.5个巯基；聚合物中的总氨基/巯基含量由TNBS试剂表征，所得结果中，每条链段含有17.5个氨基(末端单元数)；根据上述分析化学结果、聚合物核磁共振氢谱和元素分析结果，得到聚合物中每条链段的硫酯数目为16.5个；支化聚合物中，支化度＝(支化单元+末端单元)/重复单元总数，即所得聚合物聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)中支化度为(16.5+17.5)/147＝0.23。
②合成聚氨基酸PSar-Mal4
在20mL的样品瓶中加入SarNCA(8.70mmol)，使用LC-MS级DMF溶解(9mL)，加入新配置的季戊四胺引发剂(570μL×0.075M)加入磁子进行反应。室温25℃反应24小时之后，使用FT-IR检测聚合是否完全。聚合完毕后，从手套箱中取出，用乙醚沉淀，离心4000rpm，10min。弃去上层清液，将所得到的聚合中间体置于真空烘箱中烘干。
为了得到末端修饰马来酰亚胺的聚合物，将得到的聚合中间体溶解于DMF(9mL)中，加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-MAL)(0.91mmol)，室温25℃反应过夜。用乙醚沉淀，离心4000rpm，10min。弃去上层清液，吹干后将所得的聚合物加水复溶，透析除去小分子杂质，冻干，得到白色固体(产率81％)，即为聚氨基酸PSar-Mal4。
③合成聚氨基酸水凝胶PAA-RGD
使用PBS将聚合物P(EG3Glu-co-Cys)配制为100mg/mL、聚合物PSar-Mal4配制为150mg/mL的储液，使用PBS将短肽半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(CRGD)配制成CRGD溶液，CRGD溶液的浓度为20mg/mL，根据短肽和聚合物P(EG3Glu-co-Cys)中的巯基总量与PSar-Mal4中的马来酰亚胺的摩尔比为＝1：1，吸取混匀特定体积的储液和CRGD溶液，室温25℃静置10min即发生凝胶化，制备得到预设的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD。
本实施例对制得的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD进行了性能测试：聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的流变振荡频率扫描曲线，如图6所示；聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的体外吸胀曲线如图7所示；聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的压缩测试曲线如图8所示；聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的扫描电镜图如图9所示。
本实施例制得的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD在培养PB-MSCs细胞3天、7天、14天后的细胞死活染色结果图如图10所示，其中，PB-MSCs的培养方法参考中国专利ZL201110187286.5；聚氨基酸水凝胶PAA-RGD在培养PB-MSCs细胞14天后的II型胶原表达情况如图11所示；从图11可以得知，II型胶原在软骨细胞中高表达，而在未分化的间充质干细胞中不表达，培养14天后，通过DAPI进行细胞核的染色，而COLII则进行细胞表面二型胶原含量的表达，图11中高的COLII荧光强度显示PAA-RGD水凝胶具有优异的促进PB-MSCs成软骨分化的作用。
本实施例制得的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD的软骨修复示意图如图12所示：在新西兰大白兔膝关节股骨滑车沟进行骨软骨缺损造模，通过直径5mm的角膜环钻进行直径5mm、深度3mm的骨软骨缺损造模，并将提前制备好的同样直径深度的含有PB-MSCs的PAA-RGD水凝胶填充到缺损中；聚氨基酸水凝胶PAA-RGD对兔骨软骨缺损修复6周和12周的大体观图如图13所示；聚氨基酸水凝胶PAA-RGD对兔骨软骨缺损修复6周和12周的MRI成像图如图14所示：与单纯缺损组相比，PAA-RGD水凝胶修复后的软骨下骨水肿情况显著降低，并且软骨的连续性更好，表明其具有良好的软骨修复能力；聚氨基酸水凝胶PAA-RGD对兔骨软骨缺损修复6周和12周的micro-CT成像图如图15所示：与单纯缺损组相比，PAA-RGD水凝胶具有明显促进软骨下骨修复的能力；聚氨基酸水凝胶PAA-RGD修复兔软骨缺损12周后的SEM图像如图16所示，在图16中，Normal表示的是兔软骨缺损前的正常状态的SEM图像，Blank表示兔单纯骨软骨缺损造模后(不加任何水凝胶填充修复)的新生填充组织12周后的SEM图像，结果表明，PAA-RGD水凝胶修复后的新生软骨表面的光滑程度更接近于正常软骨，而空白组的新生填充组织则十分粗糙。
本实施例制得的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD对兔软骨缺损修复6周和12周后的甲苯胺蓝染色结果图如17所示：甲苯胺蓝可以将软骨染为蓝紫色，而骨组织、纤维组织等不能显色，因此，图中深染部分提示软骨部分，图17中N是指正常软骨，R是指修复软骨，箭头所指示正常软骨和修复软骨交界处，由图17可得，PAA-RGD水凝胶的新生软骨与正常软骨类似，而空白对照组则未能修复产生软骨组织，骨软骨缺损处被结缔组织或纤维组织填充；这表明PAA-RGD具有非常好的软骨修复能力。
本实施例制得的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD周围浸润的巨噬细胞极化14天的免疫组化结果如图18所示：巨噬细胞对机体的免疫调节作用至关重要，巨噬细胞通过经典激活途径激活为M1型即经典活化的巨噬细胞(CD86+)，其具有促炎作用，促进机体早期炎症反应的激活，不利于组织修复；而巨噬细胞也可以激活为M2型即替代性活化的巨噬细胞(CD206+)，发挥抗炎的作用，有利于组织的修复，本发明对浸润在PAA-RGD周围的巨噬细胞进行了免疫组化分析，发现其周围的细胞主要是M2型巨噬细胞(箭头所指为代表性CD206阳性的细胞)，而基本上没有M1型巨噬细胞，本发明的研究结果表明，PAA-RGD水凝胶具有促进巨噬细胞向M2极化的作用。
实施例2
①合成聚谷氨酸-聚半胱氨酸共聚物P(Glu-co-Cys)
室温下，将谷氨酸-N-羧基内酸酐(L-GluNCA)(5mmol)与L-CysNCA(1mmol)溶解于DMF(10.0mL)中，加入苄胺引发剂(100μL×0.5M)，10℃搅拌反应18h。使用FT-IR检测聚合是否完全。聚合完毕后，用乙醚沉淀，离心4000rpm，10min。弃去上层清液。使用透析对聚合物进行进一步纯化，最终得到白色粉末状固体(产率50％)，即为聚氨基酸P(Glu-co-Cys)。得到的聚氨基酸P(Glu-co-Cys)具有pH相关的溶解行为，于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中溶解良好，于弱酸性环境中不溶。利用这一性质可设计具有响应性孔隙/力学性能可调的智能凝胶；合成聚谷氨酸-聚半胱氨酸共聚物P(Glu-co-Cys)的反应式如下所示。
Figure BDA0003622374980000181
②与实施例1中的步骤②相同。
③与实施例1中的步骤③基本相同，不同之处在于；本实施例采用聚谷氨酸-聚半胱氨酸共聚物P(Glu-co-Cys)替换实施例1中的P(EG3Glu-co-Cys)进行步骤③。
实施例3
①合成侧链修饰为二乙二醇单甲醚的谷氨酸与半胱氨酸共聚物P(EG2Glu-co-Cys)
室温下，将侧链修饰为二乙二醇单甲醚的谷氨酸-N羧基内酸酐(L-EG2GluNCA)(9.3mmol)与L-CysNCA(1.8mmol)溶解于DMF(3.0mL)中，加入苄胺引发剂(75μL×0.5M)，室温25℃搅拌反应4h。使用FT-IR检测聚合是否完全。聚合完毕后，用乙醚沉淀，离心4000rpm，10min。弃去上层清液。使用透析对聚合物进行进一步纯化，最终得到白色粉末状固体(产率76％)，即为聚氨基酸P(EG2Glu-co-Cys)。得到的聚氨基酸P(EG2Glu-co-Cys)同样具有支化结构，且能够和PSar-Mal4反应制备水凝胶。同时，由于L-EG2Glu侧链具有接近人体温的临界共溶温度(LCST)，可利用其LCST性能调节水凝胶的通透性；合成侧链修饰为二乙二醇单甲醚的谷氨酸与半胱氨酸共聚物P(EG2Glu-co-Cys)的反应式如下所示。
Figure BDA0003622374980000191
②与实施例1中的步骤②相同。
③与实施例1中的步骤③基本相同，不同之处在于；本实施例采用P(EG2Glu-co-Cys)替换实施例1中的P(EG3Glu-co-Cys)进行步骤③。
实施例4
①合成侧链修饰为三乙二醇单甲醚的谷氨酸与聚青霉胺的共聚物P(EG3Glu-co-Pen)
室温下，将L-EG3GluNCA(9.3mmol)与青霉胺-N-羧基内酸酐(L-PenNCA)(1.8mmol)溶解于DMF(3.0mL)中，加入苄胺引发剂(75μL×0.5M)，室温25℃搅拌反应4h。使用FT-IR检测聚合是否完全。聚合完毕后，用乙醚沉淀，离心4000rpm，10min。弃去上层清液。使用透析对聚合物进行进一步纯化，最终得到白色粉末状固体(产率67％)，即为聚氨基酸P(EG3Glu-co-Pen)。由于L-PenNCA侧链空间位阻较大，得到的聚氨基酸P(EG3Glu-co-Pen)不具有支化结构，可经由SEC表征，但其巯基仍然具有反应活性，能够和PSar-Mal4反应制备水凝胶。同时，青霉胺具有一定的生物学功能，该凝胶能够在体内实现青霉胺的缓释；合成侧链修饰为三乙二醇单甲醚的谷氨酸与聚青霉胺的共聚物P(EG3Glu-co-Pen)的反应式如下所示。
Figure BDA0003622374980000201
②与实施例1中的步骤②相同。
③与实施例1中的步骤③基本相同，不同之处在于；本实施例采用P(EG3Glu-co-Pen)替换实施例1中的P(EG3Glu-co-Cys)进行步骤③。
本发明将实施例1制得的聚氨基酸水凝胶PAA-RGD与PEG-RGD、GelMA水凝胶进行了性能比较，结果如表1和表2所示。
表1：聚氨基酸水凝胶的性能比较。
Figure BDA0003622374980000202
PAA-RGD、PEG-RGD和GelMA三种水凝胶的国际软骨修复评分结果图，如图19所示；表1中符号“-”表示不存在该性能指标。由表1的结果可以得知，对应GelMA和PEG-RGD水凝胶6周的国际软骨修复评分比空白对照组的评分还低，这是因为GelMA和PEG-RGD组在体内6周时未能降解，阻碍了新生软骨的长入，而空白对照组在6周时被纤维组织或瘢痕组织填充，因此国际软骨修复评分较高。
表2水凝胶周围浸润巨噬细胞M2极化面积结果。
M2极化面积％ PAA-RGD PEG-RGD GelMA
14天 13.27 2.39 3.8
PAA-RGD、PEG-RGD和GelMA三种水凝胶周围浸润巨噬细胞M2极化14天的M2极化面积结果图，如图20所示。
表1和表2中，PEG-RGD为科研和商用的常用水凝胶，PEG-RGD水凝胶的结构示意图，如图21所示；GelMA为科研和商用的常用水凝胶，GelMA水凝胶的结构示意图，如图22所示。表1和表2中，PEG-RGD和GelMA水凝胶的结果的获得与PAA-RGD水凝胶采用的方法相同。
本发明未详细说明部分为本领域技术人员公知技术。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种聚氨基酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)用第一溶剂将谷氨酸-N-羧基内酸酐或侧链修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐与含有巯基的N-羧基内酸酐混合均匀，然后加入引发剂进行聚合反应，得到聚氨基酸I；
(2)用第二溶剂将肌氨酸-N-羧基内酸酐溶解，然后加入多官能化引发剂进行聚合反应，得到聚合中间体，然后用第三溶剂将所述聚合中间体溶解后加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯进行聚合物端基修饰反应，得到聚氨基酸II；
(3)用磷酸盐缓冲液分别将聚氨基酸I和聚氨基酸II配制成聚氨基酸I溶液和聚氨基酸II溶液，然后将聚氨基酸I溶液、聚氨基酸II溶液和短肽溶液混合均匀，经凝胶化，得到聚氨基酸水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述谷氨酸-N-羧基内酸酐的侧链修饰基团选自乙二醇、二乙二醇、二乙二醇单甲醚、三乙二醇单甲醚、四乙二醇单甲醚、乙醇胺、3-羟基丙酸和乳酸中的一种或多种；
所述含有巯基的N-羧基内酸酐选自半胱氨酸-N-羧基内酸酐、高半胱氨酸-N-羧基内酸酐、青霉胺-N-羧基内酸酐中的一种或多种；
步骤(1)中的所述引发剂为具有一定亲核性的含氨基或巯基的试剂，优选的是，所述引发剂包括但不限于正己胺、苄胺、巯基乙醇、谷氨酸甲酯、二乙胺、异丙胺、环己胺中的一种或多种，更优选的是，所述引发剂为苄胺；和/或
所述短肽溶液中含有的短肽为半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
所述谷氨酸-N-羧基内酸酐的侧链修饰基团为三乙二醇单甲醚，三乙二醇单甲醚修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐的结构式如下式a所示：
Figure FDA0003622374970000021
所述含有巯基的N-羧基内酸酐为半胱氨酸-N-羧基内酸酐，所述半胱氨酸-N-羧基内酸酐的结构式如下式b所示：
Figure FDA0003622374970000022
所述聚氨基酸I为聚氨基酸P(EG3Glu-co-Cys)，结构式如下式I所示：
Figure FDA0003622374970000023
所述聚氨基酸II为聚氨基酸PSar-Mal4，结构式如下式II所示：
Figure FDA0003622374970000031
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中：
所述侧链修饰的谷氨酸-N-羧基内酸酐、所述含有巯基的N-羧基内酸酐与所述引发剂的摩尔比为(200～400)：(10～100)：1，优选为250:50:1；
所述引发剂的浓度为0.3～0.6mol/L，优选为0.5mol/L；
所述第一溶剂的用量为2～8mL，优选为3mL；
所述聚合反应的温度为室温，所述聚合反应的时间为3～6h，优选为4h；和/或
所述聚合反应将未经保护的含巯基的N-羧基内酸酐直接作为聚合单体参与反应，使得到的聚氨基酸I具有支化结构。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中：
所述多官能化引发剂为具有亲核性的多个氨基和/或巯基的化合物，优选的是，所述多官能化引发剂包括但不限于乙二胺、三氨乙基胺、季戊四胺、赖氨酸、赖氨酸甲酯中的一种或多种，更优选的是，所述多官能化引发剂为季戊四胺；
所述肌氨酸-N-羧基内酸酐、所述多官能化引发剂与所述3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1：(0.004～0.006)：(0.05～0.15)，优选为1:0.005:0.1；
所述聚合反应的温度为室温，所述聚合反应的时间为18～30h，优选为24h；和/或
所述聚合物端基修饰反应的温度为室温，所述聚合物端基修饰反应的时间为18～30h，优选为24h。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中：
所述聚氨基酸I溶液的浓度为80～120mg/mL，优选为100mg/mL；和/或
所述聚氨基酸II溶液的浓度为120～180mg/mL，优选为150mg/mL。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中：
所述短肽溶液采用磷酸盐缓冲液配制而成；和/或
所述聚氨基酸I溶液和所述短肽溶液中含有的巯基基团总量与所述聚氨基酸II溶液中含有的马来酰亚胺基团的摩尔比为(0.9～1.1)：1，优选为1:1。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中：
制备得到的聚氨基酸水凝胶的质量分数为5％～20％，优选为10％。
9.由权利要求1至8中任一项所述的制备方法制得的聚氨基酸水凝胶。
10.由权利要求1至8中任一项所述的制备方法制得的聚氨基酸水凝胶在生物医药领域中的应用；优选的是在干细胞培养与组织工程中的应用，更优选的是在干细胞培养与组织工程中作为软骨修复材料的应用。
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