CN115475283B - 基于水凝胶材料构建的组织工程骨及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于水凝胶材料构建的组织工程骨及其制备方法与应用。将成骨分化潜力的细胞包裹于具有成骨诱导活性的水凝胶材料，并通过一定的培养方式培养一段时间，即可获得成熟的组织工程骨。与现有技术相比，本发明提供的组织工程骨的构建方法是通过水凝胶材料来实现的，并且以水凝胶材料作为支架材料具备较好的成骨诱导活性，非常适用于骨组织工程。本发明通过体外生物反应器培养或体内皮下植入培养，有效解决了细胞在水凝胶内的营养交换障碍。本发明提供的组织工程骨具有成熟、稳定的组织学特性，能够达到正常骨组织水平，能够有效解决临床上自体骨供体不足的问题。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程与再生医学领域，尤其是涉及一种基于水凝胶材料构建的组织工程骨及其制备方法与应用。
背景技术
当前，对于严重创伤、肿瘤切除后导致的大段骨缺损一直都是临床医生亟需解决的难题。目前，临床上最常用的治疗方法是自体骨移植，因为自体骨的骨诱导、骨生成作用被认为是植骨融合的金标准。但是，对于大段骨缺损填充，自体骨的供体十分有限，异体骨又面临免疫排异反应的问题。因此，临床上通常采用生物材料来替代治疗，例如骨水泥、生物陶瓷、生物可降解复合材料等，但仍然面临着植入材料难以吸收降解等问题。随着组织工程技术的发展，经典的骨组织工程修复策略已经在实验中得到了广泛的验证，但是还未能广泛应用于临床治疗，究其原因在于再生的组织工程骨没有达到正常骨组织水平。目前，常用的骨组织工程支架材料包括PCL、明胶、脱钙骨基质等生物材料。作为新一代组织工程支架材料，水凝胶以其高度含水、合适的力学强度，被认为是最理想的组织再生材料，但是基于水凝胶材料构建的组织工程骨并未有报道，主要原因在于：1)用于骨组织再生的水凝胶材料不够理想，缺乏成骨诱导活性；2)适合水凝胶材料的组织培养技术尚不完善，面临着营养物质交换等问题。
发明内容
为了解决水凝胶材料构建组织工程骨的技术壁垒，本发明提供一种基于水凝胶材料构建的组织工程骨及其制备方法与应用。
本发明通过优化用于骨组织再生的水凝胶材料，并结合相应的组织培养技术，首次利用水凝胶材料成功构建了成熟的组织工程骨。
本发明提供的组织工程骨的构建方法有望为整形美容、骨缺损修复与再生领域带来全新的治疗方案。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的第一个目的是提供具有成骨诱导活性水凝胶材料的制备方法。
在本发明的一个实施方式中，所述成骨诱导活性水凝胶材料是将成骨活性成分包裹于水凝胶材料制备得到。
在本发明的一个实施方式中，所述成骨活性成分包括生物活性的无机材料或生物活性因子。
在本发明的一个实施方式中，所述生物活性的无机材料包括羟基磷灰石、磷酸钙、碳酸钙、生物玻璃、脱钙骨基质等。在本发明的一个实施方式中，所述生物活性因子包括BMP-2～BMP-9(骨形态发生蛋白)、VEGF、TGFβ等。
在本发明的一个实施方式中，所述成骨活性成分优选为羟基磷灰石、脱钙骨基质、BMP-2。
在本发明的一个实施方式中，所述水凝胶材料是由水溶性高分子通过物理交联或化学交联或光交联中的一种或多种交联方式，或单一交联方式的多种材料组合交联形成。
在本发明的一个实施方式中，所述水溶性高分子选自天然高分子材料或合成高分子材料。
在本发明的一个实施方式中，所述天然高分子材料包括天然多糖类物质及其修饰物或降解物，蛋白及其修饰物或降解物。
在本发明的一个实施方式中，所述天然多糖类物质包括透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐。
在本发明的一个实施方式中，所述蛋白包括各种亲水或水溶性动植物蛋白、胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白。
在本发明的一个实施方式中，所述蛋白降解物包括明胶或多肽。
在本发明的一个实施方式中，所述合成高分子材料包括两臂或多臂聚乙二醇、聚乙烯亚胺、树枝体、合成多肽、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮。
在本发明的一个实施方式中，所述水凝胶材料优选为天然多糖类或蛋白类高分子，进一步优选为透明质酸、明胶。
其中，物理交联是通过高分子链间的缠结或非共价键交联(参考文献XiangyuLiang,Pingguo Duan,Jingming Gao,et al.ACS Biomater.Sci.Eng.2018,4,3506.)。化学交联是通过高分子链间的共价键交联(参考文献Luping Cao,Bin Cao,Chengjiao Lu,etal.J.Mater.Chem.B 2015,3,1268.)。光交联是通过发生光化学反应形成共价键交联(参考文献Huitang Xia,Dandan Zhao,Hailin Zhu,et al.ACS Appl.Mater.Interfaces 2018,10,31704.)。
在本发明的一个实施方式中，物理交联构建的水凝胶材料涉及的物理交联反应包括热缩合(温敏性)：聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)、嵌段共聚物(PEO-PPO-PEO、PLGA-PEG-PLGA、PEG-PLLA-PEG、PCL-PEG-PCL等)；自组装作用：亲疏水作用、氢键作用、主客体相互作用；离子交联：海藻酸与钙离子；静电相互作用：壳聚糖与磷酸类物质。
在本发明的一个实施方式中，物理交联水凝胶采用海藻酸与钙离子的交联，即海藻酸与钙离子通过络合作用交联制备水凝胶，即海藻酸水凝胶。所述海藻酸水凝胶可实现的实施方式：将海藻酸高分子溶于生物相容性介质，配成一定浓度的水凝胶前体溶液，加入一定量的钙离子溶液搅拌均匀后，即可获得物理交联的海藻酸水凝胶。
在本发明的一个实施方式中，化学交联构建的水凝胶材料涉及的化学交联反应包括巯基-迈克尔加成反应、酰胺缩合反应、席夫碱反应等。
在本发明的一个实施方式中，化学交联水凝胶采用席夫碱反应制备，即含醛基的高分子衍生物与含氨基的高分子衍生物通过席夫碱反应交联制备水凝胶。所述席夫碱水凝胶可实现的实施方式：将含醛基的高分子衍生物和含氨基的高分子衍生物分别溶于生物相容性介质，配成一定浓度的水凝胶前体溶液，混合均匀后，即可获得化学交联的席夫碱水凝胶。
所述含醛基的高分子衍生物的制备方法为邻二醇氧化法，即利用高碘酸钠氧化含邻二醇结构的高分子衍生物得到醛基官能团(参考文献Brendan P.Purcell,David Lobb,Jason A.Burdick,et al.Nat.Mater.2014,13,653.)。所述含醛基的高分子衍生物可实现的实施方式：将含有邻二醇结构的水溶性高分子衍生物于蒸馏水中溶解，加入一定量的高碘酸钠，室温下搅拌反应5-12h，加入乙二醇淬灭反应。然后将反应液倒入透析袋中透析2-3d，然后冷冻干燥，即可得到所述的含醛基的高分子衍生物。反应中，水溶性高分子中的邻二醇结构与高碘酸钠的摩尔比优选为1:0.1-2；高分子溶液的质量浓度优选为1.0％-10％w/v。
所述含醛基的高分子衍生物的制备方法中，含有邻二醇结构的水溶性高分子衍生物可以为多糖类(如葡聚糖、透明质酸、羧甲基纤维素、海藻酸、硫酸软骨素等)，优选为透明质酸、硫酸软骨素。
所述含胺基的高分子衍生物可以是天然含胺基多糖类亲水或水溶性高分子及其修饰物或降解物(如乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖、壳寡糖等)；也可以是生物或经微生物表达后提取的蛋白及其改性物或降解物(如胶原，血清蛋白及明胶等)。优选为明胶、羧甲基壳聚糖。
在本发明的一个实施方式中，光交联构建的水凝胶材料是通过光引发聚合交联反应制备，即光引发剂在光源照射下生成的自由基，引发含甲基丙烯酸酯基的高分子衍生物上双键官能团的聚合反应，从而制备光交联水凝胶。
在本发明的一个实施方式中，光交联水凝胶可实现的实施方式：将含甲基丙烯酸酯基的高分子衍生物和光引发剂溶于生物相容性介质，配成一定浓度的水凝胶前体溶液，在254nm-450nm(优选为365nm或405nm)波长的光源照射下，即可获得光交联水凝胶。
所述含甲基丙烯酸酯基的高分子衍生物的制备方法：将含羟基或胺基的水溶性高分子溶于去离子水，冷却至0-4℃，加入甲基丙烯酸酐，再缓慢滴加5M NaOH，反应24h，然后将反应液倒入透析袋中，用去离子水透析2-3d，然后冷冻干燥，即可得到所述的含甲基丙烯酸酯基的高分子衍生物。
上述含羟基或胺基的多糖类(如：透明质酸、海藻酸、羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、葡聚糖、硫酸软骨素等)、含羟基或胺基的蛋白或多肽类(如：明胶等)，优选为透明质酸、明胶、海藻酸、羧甲基纤维素、硫酸软骨素，进一步优选为透明质酸、明胶。
上述光交联水凝胶可实现的实施方式中，用于构建光交联水凝胶材料的光引发剂可以选用I 2959(2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)或LAP(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂)。
本发明中，所述水凝胶材料除了通过单一交联方式构建，还可以由水溶性高分子通过物理交联或化学交联或光交联的一种或多种交联方式，或单一交联方式的多种材料组合交联形成。
在本发明的一个实施方式中，所述水凝胶材料可以是由单一交联方式形成的水凝胶材料，称为单网络水凝胶；或者是由两种或两种以上交联方式形成的水凝胶材料，称为互穿网络水凝胶，或双网络水凝胶；或者是由同一交联方式的多种材料复合交联而成，称为复合交联水凝胶。
在本发明的一个实施方式中，所述由多种交联方式构建的水凝胶可实现的实施方式：利用物理交联和光交联构建互穿网络水凝胶，将海藻酸、含甲基丙烯酸酯基的高分子和光引发剂溶于生物相容性介质，配成一定浓度的水凝胶前体溶液，在254nm-450nm(优选为365nm或405nm)波长的光源照射下实现光交联。然后将制备的水凝胶浸泡于含钙离子的溶液中交联海藻酸高分子，即可获得互穿网络水凝胶。所述含甲基丙烯酸酯基的高分子优选为甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)。
在本发明的一个实施方式中，所述由单一交联方式的多种材料组合交联构建的水凝胶可实现的实施方式：将多种含甲基丙烯酸酯基的高分子和光引发剂溶于生物相容性介质，配成一定浓度的水凝胶前体溶液，在254nm-450nm(优选为365nm或405nm)波长的光源照射下实现光交联，即可获得复合交联水凝胶。所述多种含甲基丙烯酸酯基的高分子优选为甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)和甲基丙烯酸酯化透明质酸(HAMA)的复合水凝胶材料。
在本发明的一个实施方式中，负载脱钙骨基质的水凝胶材料的制备方法：将脱钙骨基质粉末、甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)和甲基丙烯酸酯化透明质酸(HAMA)的高分子和光引发剂(LAP)溶于生物相容性介质，配成一定浓度的水凝胶前体溶液，在254nm-450nm(优选为365nm或405nm)波长的光源照射下实现光交联，即可获得负载脱钙骨基质的水凝胶材料。
在本发明的一个实施方式中，所述生物相容性介质选自蒸馏水、生理盐水、缓冲液或细胞培养基溶液。根据不同的应用，可选取不同的生物相容性介质。
在本发明的一个实施方式中，所述一定浓度的水凝胶前体溶液可以为0.1％w/v-60％w/v，优选为1％w/v-20％w/v。
在本发明的一个实施方式中，所述水凝胶材料优选为光交联水凝胶材料，进一步优选为复合光交联水凝胶材料。
在本发明的一个实施方式中，所述光交联水凝胶材料可选自以下结构式Ⅰ-1～式Ⅰ-7中的结构：
其中，n≥2。
式Ⅰ-1为丙烯酸酯修饰的葡聚糖衍生物；式Ⅰ-2为丙烯酸酯修饰的羧甲基壳聚糖衍生物；式Ⅰ-3为丙烯酸酯修饰的透明质酸衍生物；式Ⅰ-4为丙烯酸酯修饰的羧甲基纤维素衍生物；式Ⅰ-5为丙烯酸酯修饰的海藻酸衍生物；式Ⅰ-6为丙烯酸酯修饰的硫酸软骨素衍生物；式Ⅰ-7为丙烯酸酯修饰的明胶衍生物。
本发明的第二个目的是，提供一种基于水凝胶材料构建组织工程骨的方法。
基于水凝胶材料构建组织工程骨的方法包括：将成骨分化潜力的细胞包裹于本发明第一个目的提供的具有成骨诱导活性水凝胶材料，并通过一定的培养方式培养一段时间，即可获得成熟的基于水凝胶材料构建的组织工程骨。
在本发明的一个实施方式中，所述成骨分化潜力的细胞选自成骨细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或胚胎干细胞等，优选为成骨细胞或间充质干细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述培养方式包括：体外诱导分化、培养；或体内皮下植入培养，或体外/体内联合培养方式。
在本发明的一个实施方式中，所述体外诱导分化、培养方式可以为静态培养或动态培养，静态培养方式即将包裹细胞的水凝胶放置于培养皿中培养，动态培养方式即将包裹细胞的水凝胶放置于生物反应器中搅拌或加压培养，以促进水凝胶中的营养物质交换。经过所述体外诱导分化、培养后得到基于水凝胶材料构建的组织工程骨。
在本发明的一个实施方式中，所述体内皮下植入培养是将经过所述体外诱导分化、培养后获得的组织工程骨植入动物体的皮下培养。所述动物体可以为裸鼠、SD大鼠、兔子、羊、狗、猪，优选为裸鼠、羊。
在本发明的一个实施方式中，所述体外/体内联合培养方式是首先在体外诱导培养成相对成熟的组织工程骨(相对成熟的组织工程骨是指：ALP，RUNX2，COL1基因达到正常骨组织基因水平的10％-30％)，然后植入皮下进一步培养为成熟的组织工程骨(成熟的组织工程骨是指：ALP，RUNX2，COL1基因达到正常骨组织基因水平的80％-100％)。
在本发明的一个实施方式中，所述培养时间为1周-24周，优选为4周-8周。
在本发明的一个实施方式中，所述成熟的组织工程骨包括以下生物学与组织学特征：1)DNA、胶原、钙盐含量基本达到正常组织水平(基本达到正常组织水平是指：DNA含量约50-100ng/mg，胶原含量约占总质量的25％-35％，钙盐含量约占总质量的65％-75％)；2)生物力学强度基本达到骨组织的正常水平(基本达到骨组织的正常水平是指：弹性模量大于5MPa)；3)组织学上具有清晰的骨小梁结构，以及Masson和LAP的成骨特异性表达。
本发明基于水凝胶材料构建组织工程骨的原理：水凝胶材料给细胞提供三维的培养环境，结合相应的培养方式(体外生物反应器培养或体内皮下植入培养)，能够有效改善水凝胶内的营养物质交换，为细胞构建合适的三维培养体系。同时，水凝胶内负载的成骨活性成分能够诱导细胞向成骨方向分化、增殖，经过一段时间培养，成骨分化潜力的细胞逐渐分化为成熟的成骨细胞，并且分泌出丰富的细胞外基质，最终形成成熟的骨组织。因此，运用本发明提供的构建方法基本可以通过水凝胶材料包裹成骨分化潜力的细胞培养出成熟的组织工程骨。
本发明的第三个目的是提供基于水凝胶材料构建组织工程骨的方法获得的基于水凝胶材料构建的组织工程骨。
本发明的第四个目的是提供基于水凝胶材料构建的组织工程骨的应用。
本发明提供了基于水凝胶材料构建的组织工程骨在整形美容、骨缺损修复与再生领域的应用。
具体而言，所述基于水凝胶材料构建的组织工程骨在制备整形美容材料、骨缺损修复与再生材料上的应用。
其中，骨缺损包括粉碎性骨折、骨不连、骨肿瘤、颅骨、下颌骨损伤。
与现有技术相比，本发明具有如下创新点：
(1)本发明提供的组织工程骨的构建方法是通过水凝胶材料来实现的，并且以水凝胶材料作为支架材料，具备较好的成骨诱导活性，非常适用于骨组织工程。具体构建方法是将成骨分化潜力的细胞包裹于具有成骨诱导活性的水凝胶材料。水凝胶材料给细胞提供三维培养环境，同时，成骨活性成分能够诱导细胞向成骨方向分化、增殖，经过一段时间培养，成骨分化潜力的细胞逐渐分化为成熟的成骨细胞，并且分泌出丰富的细胞外基质，最终形成成熟的骨组织。
(2)通过体外生物反应器培养或体内皮下植入培养，有效解决了细胞在水凝胶内的营养交换障碍问题。作为二维支架材料的细胞接种方式，细胞能够直接与培养液接触，而作为三维支架材料的水凝胶通常需要培养液渗透、浸润才能与细胞接触。因此，相较于传统的静态培养方式，体外生物反应器培养是一种动态培养方式，能够通过加压或搅拌等途径促进培养液的渗透、浸润作用，从而加快培养液中的营养物质交换，有利于促进水凝胶内细胞的增殖、分化。体内植入培养方式，相较于体内培养而言，营养物质来源于皮下渗液，并且十分充足，更利于渗透进入水凝胶内部，促进细胞增殖、分化。
(3)本发明提供的组织工程骨具有成熟、稳定的组织学特性，能够达到正常骨组织水平，能够有效解决临床上自体骨供体不足的问题。
附图说明
图1为负载脱钙骨基质光交联水凝胶的成胶流变图。
图2为负载脱钙骨基质光交联水凝胶的成骨诱导染色图。
图3为组织工程骨培养8周的大体观图。
图4为组织工程骨培养8周的micro-CT图。
图5为组织工程骨培养8周(实验组)的组织学图。
图6为组织工程骨培养8周(对照组)的组织学图。
图7为组织工程骨的q-PCR数据图。
具体实施方式
以下用实施例对本发明作更详细的描述。下面结合附图以及实施例对本发明作进一步描述，但这些实施例仅仅是对本发明最佳实施方式的描述，并不对本发明的范围有任何限制。本领域技术人员在不背离本发明精神和保护范围的情况下作出的其它任何变化和修改，仍包括在本发明保护范围之内。
实施例一：负载羟基磷灰石的氧化透明质酸/壳聚糖席夫碱水凝胶(HA/HAO/CS)的制备
氧化透明质酸的合成：将透明质酸(2g，340kDa)溶于100mL蒸馏水中至完全溶解，将高碘酸钠(NaIO4，1g)溶于5mL蒸馏水中，然后缓慢滴加上述溶液，于室温下搅拌反应12h。反应结束后，滴加1mL乙二醇继续搅拌30min，然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到HAO(1.82g)。根据盐酸羟胺滴定法，可以计算出醛基的含量大约为35％。
其中，n≥2.
负载羟基磷灰石的氧化透明质酸/壳聚糖席夫碱水凝胶(HA/HAO/CS)的制备：分别称取0.1g HAO和0.1g CS高分子溶于1mL PBS溶液(pH＝7.4)中，配成10％HAO和10％CS水凝胶前体溶液，以1:1的体积比混合，并加入0.05g HA搅拌均匀，灌注于预制的模具中，待反应5min后，即可制备5％HA/5％HAO/5％CS水凝胶。
实施例二：负载BMP-2的海藻酸/明胶复合交联水凝胶(BMP-2/Alg/GelMA)的制备
甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)的合成：将明胶(1g)溶于10mL PBS(pH＝7.4)中，加热至50℃搅拌至完全溶解，加入0.5mL甲基丙烯酸酐，反应2-3h，反应后用40mL PBS稀释反应液，然后倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到甲基丙烯酸酯化明胶(0.9g)。根据核磁氢谱图，可计算出双键的含量大约为75％。
负载BMP-2的海藻酸/明胶复合交联水凝胶(BMP-2/Alg/GelMA)的制备：称取0.1μgBMP-2，0.02g Alg，0.05g GelMA和2mg LAP溶于1mL PBS溶液(pH＝7.4)中，在37℃下配成BMP-2/2％Alg/5％GelMA/0.2％LAP的水凝胶前体溶液，灌注于预制的模具中，在365nm波长的光源照射下实现光交联。将成型的水凝胶从模具中取出，浸泡于0.1M CaCl2中，待物理交联2h后，即可获得复合交联的水凝胶材料。
实施例三：负载脱钙骨基质的明胶/透明质酸光交联水凝胶(DBM/GelMA/HAMA)的制备
按上述实施例二制备甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)。
甲基丙烯酸酯化透明质酸(HAMA)的合成：将透明质酸(1g，340kDa)溶于100mL去离子水，冷却至0-4℃，加入5mL甲基丙烯酸酐，再缓慢滴加5mL 5M NaOH，反应24h，然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到甲基丙烯酸酯化透明质酸(0.9g)。根据核磁氢谱图，可计算出双键的含量大约为60％。
负载脱钙骨基质的明胶/透明质酸光交联水凝胶(DBM/GelMA/HAMA)的制备：称取0.05g DBM，0.05g GelMA，0.02g HAMA和2mg LAP溶于1mL PBS溶液(pH＝7.4)中，在37℃下配成5％DBM/5％GelMA/2％HAMA/0.2％LAP的水凝胶前体溶液，灌注于预制的模具中，在365nm波长的光源照射下实现光交联，即可获得DBM/GelMA/HAMA水凝胶材料。
实施例四：水凝胶材料的流变分析
按照本发明方法，于37℃下操作，制得不同材料组成的水凝胶前体溶液，包括水溶性高分子通过物理交联或化学交联或光交联的一种或多种交联方式，或单一交联方式的多种材料组合交联形成，如表1所示。流变分析采用HAAKE MARS流变仪，在37℃的测试平台上进行流变测试。本实施例研究了不同材料组成的水凝胶成胶时间和凝胶强度的情况。图1为以实施例三的DBM/GelMA/HAMA配制的水凝胶，在光照180s的成胶曲线。从图1中看出，光照5s后，储存模量(G’)逐渐超过损耗模量(G”)，实现了水凝胶前体溶液由溶液态向凝胶态的转变，且完全成胶时的模量可达到1200Pa左右。其它不同材料组成的水凝胶体系的凝胶点和凝胶强度也有所不同，具体数据如表1所示。
表1
注：上述高分子缩写对应的名称：HA(羟基磷灰石)，CP(磷酸钙)，DBM(脱钙骨基质)，Alg(海藻酸)，CS(壳聚糖)，HAO(氧化透明质酸)，GelMA(甲基丙烯酸酯化明胶)，HAMA(甲基丙烯酸酯化透明质酸)、CSMA(甲基丙烯酸酯化硫酸软骨素)。
实施例五：负载脱钙骨基质的明胶/透明质酸光交联水凝胶的成骨诱导评价
按照上述实施例三制备负载脱钙骨基质的明胶/透明质酸光交联水凝胶，实验通过水凝胶前体溶液与间充质干细胞(BMSCs)的共培养验证脱钙骨基质的成骨诱导活性。将一定浓度的水凝胶前体溶液(0.5％w/v)与BMSCs共培养14天，通过碱性磷酸酶、一型胶原染色检测，以及q-PCR定量对成骨特异性表达进行分析。实验结果表明，负载脱钙骨基质的明胶/透明质酸光交联水凝胶具有成骨诱导活性(图2)，能够更好的实现骨再生。
实施例六：组织工程骨的构建
从兔子股骨取一小块骨组织，常规分离培养扩增成骨细胞，传代培养至第二代或第三代，收集并调节细胞悬液终浓度为10×106/mL，包裹于上述实施例一制备的负载羟基磷灰石的氧化透明质酸/壳聚糖席夫碱水凝胶(5％HA/5％HAO/5％CS)作为实验组，单纯的氧化透明质酸/壳聚糖席夫碱水凝胶(5％HAO/5％CS)作为对照组。常规体外成骨定向诱导培养4-8周，同时结合静水压生物反应器改善成骨培养过程中的营养交换。体外培养8周后，取材，进行大体观、组织学、q-PCR定量等骨再生指标体外检测。实验结果表明，虽然对照组也能形成较为成熟的骨组织，但是组织学上没有出现骨小梁结构，Masson和固绿的成骨特异性染色也没有实验组明显；q-PCR定量上实验组要明显优于对照组。因此，羟基磷灰石能够有效促进骨组织成熟，有利于组织工程骨的构建。
实施例七：组织工程骨的构建
从兔子皮下脂肪分离脂肪干细胞，常规分离培养扩增，传代培养至第二代或第三代，收集并调节细胞悬液终浓度为10×106/mL，包裹于上述实施例二制备的负载BMP-2的海藻酸/明胶复合交联水凝胶(BMP-2/2％Alg/5％GelMA)作为实验组，单纯海藻酸/明胶复合交联水凝胶(2％Alg/5％GelMA)作为对照组。实验直接植入裸鼠皮下进行体内培养，8周后，取材，进行大体观、组织学、q-PCR定量等骨再生指标体外检测。实验结果表明，虽然对照组也能形成较为成熟的骨组织，但是组织学上没有出现骨小梁结构，Masson和固绿的成骨特异性染色也没有实验组明显；q-PCR定量上实验组要明显优于对照组。因此，BMP-2能够有效促进骨组织成熟，有利于组织工程骨的构建。
实施例八：组织工程骨的构建
从兔子髂骨处抽取骨髓，常规分离培养扩增BMSCs，传代培养至第二代或第三代，收集并调节细胞悬液终浓度为10×106/mL，包裹于上述实施例三制备的负载脱钙骨基质的明胶/透明质酸光交联水凝胶(5％DBM/5％GelMA/2％HAMA)作为实验组，单纯明胶/透明质酸光交联水凝胶(5％GelMA/2％HAMA)作为对照组。常规体外成骨定向诱导培养2-4周，同时结合静水压生物反应器改善成骨培养过程中的营养交换。成骨培养完后，部分样本用于大体外观、组织学、q-PCR定量等骨再生指标体外检测。另一方面，将体外构建的骨组织植入裸鼠皮下，分别于4周及8周后取材，检测与评估体内骨再生的上述各项指标。实验结果表明，大体观上观察到乳白色的成骨样组织(图3)。Micro-CT上实验组在4周显示出大面积的骨体积，在8周基本完全形成骨组织；而对照组在4周的骨体积并未填满，中间出现明显的空洞，说明脱钙骨基质具有很好的成骨活性，能够加快骨组织的成熟(图4)。组织学上实验组具有清晰的骨小梁结构，以及Masson和固绿的成骨特异性染色(图5)；而对照组在组织学上虽然也有成骨特异性染色，但并未出现骨小梁结构，说明对照组的骨组织成熟度不及实验组(图6)。qPCR定量检测(ALP，RUNX2，COL1)分析表明再生的骨组织在基因层面上基本达到成熟的骨组织水平(图7)。
实施例九：组织工程骨应用于颅骨缺损修复
采用新西兰雄性大白兔，每只兔子均在颅骨处制造直径为10mm的骨缺损。实验前按体重随机分组(每组4只)：1.组织工程骨修复组；2.不做处理的空白组。手术过程中，首先按实施例五构建成熟的组织工程骨，然后将其填充至缺损部位。在手术3月后，通过静脉注射空气的方法处死实验中的兔子，并取样对实验修复效果进行评价。实验结果表明，使用组织工程骨处理的缺损部位取得了完全的骨修复，而对照组中骨缺损部位没有得到任何修复。因此，该类组织工程骨对骨缺损有很好的骨修复效果。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种基于水凝胶材料构建组织工程骨的方法，其特征在于，将成骨分化潜力的细胞包裹于负载脱钙骨基质的明胶/透明质酸光交联水凝胶，并培养一段时间，即获得成熟的基于水凝胶材料构建的组织工程骨；
所述培养是指体外结合静水压生物反应器成骨定向诱导培养2-4周，然后植入裸鼠皮下进行体内培养4周或8周；
所述负载脱钙骨基质的明胶/透明质酸光交联水凝胶是指5%DBM/5%GelMA/2% HAMA的水凝胶；
所述成熟的组织工程骨包括以下生物学与组织学特征：1）DNA含量50-100 ng/mg，胶原含量占总质量的25%-35%，钙盐含量占总质量的65%-75%；2）弹性模量大于5 MPa；3）组织学上具有清晰的骨小梁结构，以及Masson和LAP的成骨特异性表达。
2.基于权利要求1所述方法获得的基于水凝胶材料构建的组织工程骨。
3.权利要求2所述基于水凝胶材料构建的组织工程骨的应用，其特征在于，所述基于水凝胶材料构建的组织工程骨在制备整形美容材料、骨缺损修复与再生材料上的应用。
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| Publication number | Publication date |
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| CN115475283A (zh) | 2022-12-16 |
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