CN114904051B - 矿化活性蛋白纳米材料及其凝胶复合材料、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种矿化活性蛋白纳米材料及其凝胶复合材料、制备方法及应用，制备方法包括将活性蛋白分子加入至细胞培养基进行孵育，以获得孵育溶液；将水溶性钙盐加入至孵育溶液进行矿化，以获得矿化溶液；对矿化溶液依次进行分离、洗涤和冷冻干燥，以获得矿化活性蛋白纳米材料。其优点在于，本发明的制备工艺简单、操作简便、环境友好、条件温和，不需要昂贵的原材料，不需要复杂昂贵的设备或仪器，易于实现工业化生产。采用不同活性蛋白分子，通过本发明所述制备方法制备的矿化活性蛋白纳米颗粒作为活性生物医用材料在药物递送、生物成像、基因转染、组织工程和硬组织修复等领域将具有良好的应用前景。

Description

矿化活性蛋白纳米材料及其凝胶复合材料、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及材料合成技术领域，尤其涉及一种矿化活性蛋白纳米材料及其凝胶复合材料、制备方法及应用。
背景技术
磷酸钙是脊椎动物硬组织的主要无机组分，具有优异的生物相容性和生物降解性，是理想的生物材料选择，因此，磷酸钙类生物材料被广泛研究和应用于骨修复材料、齿科修复材料、生物涂层、基因转染、药物递送、生物成像和组织工程等领域。磷酸钙存在多种物相，比如：非晶磷酸钙、羟基磷灰石、碳酸氢钙、磷酸三钙、磷酸八钙等，不同物相磷酸钙生物材料具有不同的理化性质及钙磷比，决定了其不同的性能和不同的优势应用范围。
在材料学研究初期，材料制备的目的只是简单的合成人体可耐受且不引起免疫排斥反应的惰性材料，当时的生物学性能没有获得足够的重视，随着材料学和生物学的共同发展和交叉融汇，逐渐地，生物材料的概念发生变化，进一步对材料的生物活性和生物降解性提出了要求。研究指出，磷酸钙的不同物相中，非晶磷酸钙相比结晶磷酸钙相具有更好的生物活性和生物降解性，因此，其研究及应用更广泛，目前的研究主要聚焦于对其的筛选、修饰、改性和复合等方面。
为提高磷酸钙材料的生物活性，国内外学者提出了种类繁多的方法和策略。研究指出磷酸钙材料的结构和组分与生物体硬组织越相似，其生物活性越高。因为纳米尺寸磷酸钙生物材料最能模拟生物体硬组织中发现的磷酸钙，目前关于磷酸钙生物材料结构的研究集中在纳米尺寸磷酸钙的设计和制备上，高比表面积赋予了其更强的扩散驱动力、溶解性和吸附某些特定蛋白的能力。另外一个常用的提高磷酸钙生物活性的策略是将有机成分与无机磷酸钙复合制备有机-无机杂化材料，常用的有机成分包括生物活性小分子、蛋白、多糖、聚乳酸等。值得一提的是，有机-无机杂化材料的性质不仅仅是有机无机成分各自特性的总和，通过有机无机材料的尺寸域效应和界面性质可使复合材料发挥巨大的协同作用。有机-无机杂化材料的制备方法也多种多样，可以在共沉淀合成磷酸钙的过程中将有机成分同步负载到磷酸钙颗粒中，或者通过物理吸附的方式将有机组分装载至磷酸钙中，研究表明通过共沉淀同步装载有机成分的策略可以构建更稳定的有机-无机复合材料体系。
虽然目前改善磷酸钙类材料生物活性和生物性能的方法和策略很多，但是在温和条件下，以细胞培养基模拟生理环境并提供磷酸根离子，利用水溶性钙盐作为钙源，基于活性蛋白分子碱性磷酸酶调控仿生矿化并同步实现其负载，以制备具有优异生物活性的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒及其与GelMA水凝胶的复合材料未见报道。
目前，针对相关技术中存在的制备方法复杂、成本高昂、难以工业化生产等问题，尚未提出有效的解决方案。
发明内容
本申请的目的是针对现有技术中的不足，提供一种矿化活性蛋白纳米材料及其凝胶复合材料、制备方法及应用，以至少解决相关技术中的制备方法复杂、成本高昂、难以工业化生产的问题。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种矿化活性蛋白纳米材料的制备方法，包括：
将活性蛋白分子加入至细胞培养基进行孵育，以获得孵育溶液；
将水溶性钙盐加入至所述孵育溶液进行矿化，以获得矿化溶液；
对所述矿化溶液依次进行分离、洗涤和冷冻干燥，以获得矿化活性蛋白纳米材料，其中，所述矿化活性蛋白纳米材料的尺寸为50～200nm。
在其中的一些实施例中，所述活性蛋白分子为碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、牛血清白蛋白、纤维蛋白原、明胶中的一种或几种的组合。
在其中的一些实施例中，所述细胞培养基为MEM培养基、高糖DMEM培养基、低糖DMEM培养基。
在其中的一些实施例中，所述活性蛋白分子与所述细胞培养基的质量/体积比为10：1～1：10。
在其中的一些实施例中，所述活性蛋白分子与所述细胞培养基的质量/体积比为2：1。
在其中的一些实施例中，所述孵育的温度为0～39℃、振荡条件为10～200r/min、时间为24h。
在其中的一些实施例中，所述孵育的温度为37℃、振荡条件为140～180r/min、时间为24h。
在其中的一些实施例中，所述孵育的温度为37℃、振荡条件为180r/min、时间为24h。
在其中的一些实施例中，所述水溶性钙盐为氯化钙和/或其水合物、硝酸钙和/或其水合物、乙酸钙和/或其水合物中的一种或几种的组合。
在其中的一些实施例中，所述水溶性钙盐与所述孵育溶液的体积比为1：100～1：1。
在其中的一些实施例中，所述水溶性钙盐与所述孵育溶液的体积比为1：50。
在其中的一些实施例中，所述水溶性钙盐的摩尔浓度为0.001～5mol/L。
在其中的一些实施例中，所述水溶性钙盐的摩尔浓度为1mol/L。
在其中的一些实施例中，所述矿化的温度为0～39℃、振荡条件为10～200r/min、时间为20min～24h。
在其中的一些实施例中，所述矿化的温度为37℃、振荡条件为140～180r/min、时间为20min。
在其中的一些实施例中，所述矿化的温度为37℃、振荡条件为180r/min、时间为20min。
在其中的一些实施例中，所述分离包括离心分离、过滤分离、静置沉淀分离中的任意一种或几种的组合。
在其中的一些实施例中，所述洗涤包括水洗和/或乙醇洗。
在其中的一些实施例中，所述洗涤的次数大于等于3次。
在其中的一些实施例中，所述矿化活性蛋白纳米材料的尺寸为50～150nm。
在其中的一些实施例中，所述矿化活性蛋白纳米材料的尺寸为50～100nm。
在其中的一些实施例中，包括：
将活性蛋白分子加入至细胞培养基进行孵育，以获得孵育溶液，其中，所述活性蛋白分子与所述细胞培养基的质量/体积比为2：1，所述孵育的温度为37℃、振荡条件为140～180r/min、时间为24h；
将水溶性钙盐加入至所述孵育溶液进行矿化，以获得矿化溶液，其中，所述水溶性钙盐与所述孵育溶液的体积比为1：50，所述矿化的温度为37℃、振荡条件为140～180r/min、时间为20min；
对所述矿化溶液依次进行分离、洗涤和冷冻干燥，以获得矿化活性蛋白纳米材料，其中，所述矿化活性蛋白纳米材料的尺寸为50～100nm。
第二方面，提供一种矿化活性蛋白纳米材料，由第一方面所述的制备方法制备得到。
第三方面，提供一种如第二方面所述的矿化活性蛋白纳米材料在制备促进骨修复材料的应用。
第四方面，提供一种矿化活性蛋白基水凝胶复合材料的制备方法，包括：
将第二方面所述的矿化活性蛋白纳米材料与GelMA水凝胶前驱体溶液混合，以获得混合液；
对所述混合液依次进行紫外光固化、冷冻干燥，以获得矿化活性蛋白基水凝胶复合材料。
在其中的一些实施例中，所述矿化活性蛋白纳米材料与所述GelMA水凝胶前驱体溶液的质量比为10％～50％。
在其中的一些实施例中，所述矿化活性蛋白纳米材料与所述GelMA水凝胶前驱体溶液的质量比为30％。
在其中的一些实施例中，紫外光固化的时间为5min～1h。
在其中的一些实施例中，紫外光固化的时间为5min～50min。
在其中的一些实施例中，紫外光固化的时间为5min～35min。
在其中的一些实施例中，紫外光固化的时间为5min～15min。
在其中的一些实施例中，冷冻干燥的时间为24h～120h。
在其中的一些实施例中，冷冻干燥的时间为24h～96h。
在其中的一些实施例中，冷冻干燥的时间为24h～72h。
在其中的一些实施例中，冷冻干燥的时间为24h～48h。
在其中的一些实施例中，包括：
将所述矿化活性蛋白纳米材料与GelMA水凝胶前驱体溶液混合，以获得混合液，其中，所述矿化活性蛋白纳米材料与所述GelMA水凝胶前驱体溶液的质量比为30％；
对所述混合液依次进行紫外光固化5min、冷冻干燥24h，以获得矿化活性蛋白基水凝胶复合材料。
第五方面，提供一种矿化活性蛋白基水凝胶复合材料，由第四方面所述的制备方法制备得到。
第六方面，提供一种如第五方面所述的矿化活性蛋白基水凝胶复合材料在制备促进骨修复材料的应用。
相比于现有相关技术，本申请实施例提供的一种矿化活性蛋白纳米材料及其凝胶复合材料、制备方法及应用，本发明的制备工艺简单、操作简便、环境友好、条件温和，不需要昂贵的原材料，不需要复杂昂贵的设备或仪器，易于实现工业化生产。采用不同活性蛋白分子，通过本发明所述制备方法制备的矿化活性蛋白纳米颗粒作为活性生物医用材料在药物递送、生物成像、基因转染、组织工程和硬组织修复等领域将具有良好的应用前景。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为实施例3中引入水溶性钙盐前后反应体系的丁达尔效应光学照片；
图2为实施例3中样品矿化碱性磷酸酶纳米颗粒(Mineralized alkalinephosphatase nanoparticles,MALPNs)的扫描电子显微镜(Scanning electronmicroscopy,SEM)图片；
图3为实施例3中样品MALPNs的透射电子显微镜(Transmission electronmicroscopy,TEM)图片及选区电子衍射结果图片；
图4为实施例3中样品MALPNs的元素面扫(Elemental mapping)图片；
图5为实施例3中样品MALPNs、对照样(CaP)及纯碱性磷酸酶(ALP)的傅里叶变换红外光谱(FTIR)，对照样(CaP)采用同样的制备策略，但没有活性蛋白分子调控，该实施例中即没有碱性磷酸酶的调控，后续图示中的对照样(CaP)与该实施例一致；
图6a为实施例3中样品MALPNs、对照样CaP及磷酸盐缓冲液(PBS)的碱性磷酸酶酯酶定性染色结果图；
图6b为实施例3中样品MALPNs中碱性磷酸酶的定量检测结果；
图7为实施例3中样品MALPNs中碱性磷酸酶释放行为研究结果；
图8为实施例3中样品MALPNs中碱性磷酸酶的生物活性检测结果；
图9为实施例4中样品的透射电子显微镜(TEM)照片及选区电子衍射结果图片；
图10为实施例5中样品的透射电子显微镜(TEM)照片；
图11为实施例6中样品的透射电子显微镜(TEM)照片；
图12为实施例7中样品的透射电子显微镜(TEM)照片；
图13为实施例8中样品的透射电子显微镜(TEM)照片；
图14为实施例9中样品的透射电子显微镜(TEM)照片；
图15为实施例10中样品的透射电子显微镜(TEM)照片；
图16为实施例11中样品的透射电子显微镜(TEM)照片；
图17为实施例12中样品的透射电子显微镜(TEM)照片；
图18为实施例13中样品的透射电子显微镜(TEM)照片；
图19为实施例14中样品的扫描电子显微镜(SEM)照片；
图20为实施例15中样品的扫描电子显微镜(SEM)照片；
图21为实施例16中样品的扫描电子显微镜(SEM)照片；
图22为使用不同浓度的实施例3中的样品MALPNs与骨髓间充质干细胞共培养的细胞增殖曲线；
图23为实施例3中样品MALPNs提高骨髓间充质干细胞成骨分化中碱性磷酸酶活性的分析结果，其中，Blank指未与任何材料共培养的骨髓间充质干细胞；
图24为实施例3中样品MALPNs促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的钙结节形成分析结果，其中，Blank指未与任何材料共培养的骨髓间充质干细胞；
图25为实施例3中的样品MALPNs促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中相关基因表达量变化的分析结果，所选成骨分化相关基因为OPN(Osteopontin,骨桥蛋白)、OCN(Osteocalcin,骨钙蛋白)、Runx2(Runt-relatedtranscriptionfactor2，Runt相关转录因子-2)、Col I(Type I collagen,I型胶原)；
图26为实施例14中样品(MALPNs/GelMA-1)及对照样(CaP/GelMA,GelMA)在体内修复SD大鼠颅骨缺损实验中颅骨样本的Micro-CT扫描图片结果，其中不植入任何材料的组别命名为Blank组。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行描述和说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。基于本申请提供的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本申请应用于其他类似情景。此外，还可以理解的是，虽然这种开发过程中所作出的努力可能是复杂并且冗长的，然而对于与本申请公开的内容相关的本领域的普通技术人员而言，在本申请揭露的技术内容的基础上进行的一些设计，制造或者生产等变更只是常规的技术手段，不应当理解为本申请公开的内容不充分。
在本申请中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域普通技术人员显式地和隐式地理解的是，本申请所描述的实施例在不冲突的情况下，可以与其它实施例相结合。
除非另作定义，本申请所涉及的技术术语或者科学术语应当为本申请所属技术领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本申请所涉及的“一”、“一个”、“一种”、“该”等类似词语并不表示数量限制，可表示单数或复数。本申请所涉及的术语“包括”、“包含”、“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含；例如包含了一系列步骤或模块(单元)的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可以还包括没有列出的步骤或单元，或可以还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。本申请所涉及的“连接”、“相连”、“耦接”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电气的连接，不管是直接的还是间接的。本申请所涉及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，“A和/或B”可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。本申请所涉及的术语“第一”、“第二”、“第三”等仅仅是区别类似的对象，不代表针对对象的特定排序。
下面进一步举例实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。例如，下述实施例以高糖DMEM培养基模拟生理环境并提供磷酸根离子，但如上述，也可用其他细胞培养基比如MEM和低糖DMEM等；下述实施例以CaCl2作为钙源提供钙离子，但如上述，也可用采用其他合适的水溶性钙盐；下述实施例以碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、牛血清白蛋白、纤维蛋白原、明胶作为活性蛋白分子成分，但也可采用其他活性蛋白分子。下述示例具体的反应温度、时间、投料量等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
本实施例为本发明的示意性实施例，涉及矿化活性蛋白纳米材料、制备方法及应用。
一种矿化活性蛋白纳米材料的制备方法，包括：
步骤S102、将活性蛋白分子加入至细胞培养基进行孵育，以获得孵育溶液；
步骤S104、将水溶性钙盐加入至孵育溶液进行矿化，以获得矿化溶液；
步骤S106、对矿化溶液依次进行分离、洗涤和冷冻干燥，以获得矿化活性蛋白纳米材料，其中，矿化活性蛋白纳米材料的尺寸为50～200nm。
在步骤S102中：
活性蛋白分子为碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、牛血清白蛋白、纤维蛋白原、明胶中的一种或几种的组合；
细胞培养基为MEM(minimum essential medium)培养基、高糖DMEM(Dulbecco’smodified eagle medium)培养基、低糖DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培养基；
活性蛋白分子与细胞培养基的质量/体积比为10：1～1：10；
孵育的温度为0～39℃、振荡条件为10～200r/min、时间为24h。
优选地，活性蛋白分子与细胞培养基的质量/体积比为2：1。
优选地，孵育的温度为37℃。
优选地，孵育的振荡条件为140～180r/min。
更优选地，孵育的振荡条件为180r/min。
在步骤S102中，将活性蛋白分子加入至细胞培养基之后，先进行混合，再进行孵育。
其中，混合包括涡旋振荡。
在步骤S102中，使用恒温振荡摇床进行孵育。
在步骤S104中：
水溶性钙盐为氯化钙和/或其水合物、硝酸钙和/或其水合物、乙酸钙和/或其水合物中的一种或几种的组合；
水溶性钙盐与孵育溶液的体积比为1：100～1：1；
水溶性钙盐的摩尔浓度为0.001～5mol/L；
矿化的温度为0～39℃、振荡条件为10～200r/min、时间为20min～24h。
优选地，水溶性钙盐与孵育溶液的体积比为1：50。
优选地，水溶性钙盐的摩尔浓度为1mol/L。
优选地，矿化的温度为37℃。
优选地，矿化的振荡条件为140～180r/min。
更优选地，矿化的振荡条件为180r/min。
优选地，矿化的时间为20min。
在步骤S104中，使用恒温振荡摇床进行矿化。
在步骤S106中：
分离包括离心分离、过滤分离、静置沉淀分离中的任意一种或几种的组合
洗涤包括水洗和/或乙醇洗；
洗涤的次数大于等于3次。
优选地，水洗包括去离子水洗。
优选地，矿化活性蛋白纳米材料的尺寸为50～150nm。
更优选地，矿化活性蛋白纳米材料的尺寸为50～100nm。
在其中的一些实施例中，矿化活性蛋白纳米材料为矿化活性蛋白纳米颗粒。
对于上述矿化活性蛋白纳米材料，其可以应用于制备促进骨修复材料。
具体地，矿化活性蛋白纳米材料，可以作为单一成分进行使用，也可以与其他成分相互配合使用。
本发明以细胞培养基模拟生理环境同时提供磷酸根离子，利用活性蛋白分子调控生物矿化，同步实现活性蛋白分子负载，制得的产物为直径约50～100nm的矿化活性蛋白纳米颗粒，其中的磷酸钙组分为非晶磷酸钙物相。
本发明具有如下优点：
(1)所得矿化活性蛋白纳米颗粒尺寸均匀，呈纳米结构颗粒，分散性较好，由有机成分活性蛋白分子和无机成分磷酸钙共同组成；
(2)活性蛋白分子提高了磷酸钙的生物活性和生物降解性，磷酸钙构建了活性蛋白分子的缓释体系和生物活性保护体系；
(3)制得的矿化活性蛋白纳米颗粒具有较优异的生物相容性和生物活性，可应用于药物递送、生物成像、基因转染、组织工程和硬组织修复等生物医学领域。
本发明的制备工艺简单、操作简便、环境友好、条件温和，不需要昂贵的原材料，不需要复杂昂贵的设备或仪器，易于实现工业化生产。采用不同活性蛋白分子，通过本发明所述制备方法制备的矿化活性蛋白纳米颗粒作为活性生物医用材料在药物递送、生物成像、基因转染、组织工程和硬组织修复等领域将具有良好的应用前景。
实施例2
本实施例为本发明的示意性实施例，涉及矿化活性蛋白基水凝胶复合材料、制备方法及应用。
一种矿化活性蛋白基水凝胶复合材料的制备方法，包括：
步骤S202、将实施例1的矿化活性蛋白纳米材料与GelMA水凝胶前驱体溶液混合，以获得混合液；
步骤S204、对混合液依次进行紫外光固化、冷冻干燥，以获得矿化活性蛋白基水凝胶复合材料。
在步骤S202中：
矿化活性蛋白纳米材料与GelMA水凝胶前驱体溶液的质量比为10％～50％。
优选地，矿化活性蛋白纳米材料与GelMA水凝胶前驱体溶液的质量比为30％。
在步骤S202中，混合包括涡旋振荡。
在步骤S204中：
紫外光固化的时间为5min～1h；
冷冻干燥的时间为24h～120h。
优选地，紫外光固化的时间为5min～50min。
更优选地，紫外光固化的时间为5min～35min。
更优选地，紫外光固化的时间为5min～15min。
最优选地，紫外光固化时间为5min。
优选地，冷冻干燥的时间为24h～96h。
更优选地，冷冻干燥的时间为24h～72h。
更优选地，冷冻干燥的时间为24h～48h。
最优选地，冷冻干燥的时间为24h。
对于上述矿化活性蛋白基水凝胶复合材料，其可以应用于制备促进骨修复材料。
具体地，矿化活性蛋白基水凝胶复合材料，可以作为单一成分进行使用，也可以与其他成分相互配合使用。
本发明具有如下优点：
制备的矿化活性蛋白纳米颗粒基GelMA复合材料具有一定的力学强度和力学韧性，体内动物学实验提示其具有较优异的骨修复性能。
实施例3
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白纳米材料。
称取100mg碱性磷酸酶(ALP)加入到含有50mL高糖DMEM细胞培养基的离心管中，涡旋溶解，然后将其置于恒温振荡摇床内，调整恒温振荡摇床的参数为37℃，180r/min，使碱性磷酸酶与高糖DMEM细胞培养基孵育24小时；
配制1mol/L的CaCl2溶液，在上述体系孵育24小时后，取1mL配制好的CaCl2溶液加入其中进行生物矿化反应(37℃，180r/min)，设置反应时间为20分钟；
将矿化产物使用去离子水洗涤3遍，真空冷冻干燥即可得到对应的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒。
引入CaCl2溶液启动生物矿化前后的丁达尔效应如图1所示，基于碱性磷酸酶调控仿生矿化制备的产物可见明显光路，间接证明所得产物粒径较小，分散性较好。
所得矿化碱性磷酸酶纳米颗粒的结构、尺寸和物相表征如图2、图3所示，显示材料为表面粗糙的类球形纳米颗粒，直径约为50～100nm，选区电子衍射结果显示该复合材料中磷酸钙组分为非晶磷酸钙物相。
图4给出了该样品的元素面扫结果，表明该产物为有机-无机复合纳米颗粒。
图5给出了该样品的傅里叶变化红外光谱图，表明该复合材料成功负载ALP活性蛋白分子。
图6a给出了该样品的碱性磷酸酶酯酶定性染色结果，进一步表明活性蛋白分子ALP成功负载于材料中。图6b给出了该样品中活性蛋白分子ALP的定量检测结果，提示复合材料中活性蛋白分子ALP的质量含量为(5.05±0.63)％(w/w)。
图7给出了该样品在120小时时间内对应活性蛋白分子ALP的累积释放行为曲线，表明产物中磷酸钙组分构建了对应活性蛋白分子ALP的缓释体系。
图8给出了该样品中活性蛋白分子ALP的生物活性检测结果，提示矿化碱性磷酸酶复合纳米颗粒中释放的活性蛋白分子ALP相比对应的纯活性蛋白分子ALP仍维持着高生物活性，间接显示复合材料中磷酸钙组分构建了活性蛋白分子ALP的活性保护体系。
本发明利用常用的细胞培养基模拟生理环境，最大程度构建类天然生物材料，同时细胞培养基可以为体系提供磷酸根离子。生物矿化是一个涉及到细胞、离子、微环境等多因素受活性生物分子调控的复杂且有序过程，受自然生物矿化启发，该发明先将活性蛋白分子碱性磷酸酶与细胞培养基孵育相互作用，然后引入水溶性钙盐提供钙离子，体系中磷酸根离子和钙离子在碱性磷酸酶的调控下矿化生成纳米颗粒，碱性磷酸酶被吸附或者包裹于纳米颗粒之中。获得的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒具有较好的分散性，碱性磷酸酶作为有机成分提高了复合材料的生物活性，释放行为研究及活性检测研究显示磷酸钙构建了碱性磷酸酶的缓释体系和活性保护体系，发挥了药物递送作用。
实施例4
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白纳米材料。
称取10mg碱性磷酸酶(ALP)加入到含有5mL高糖DMEM细胞培养基的离心管中，涡旋溶解，然后将其置于恒温振荡摇床内，调整恒温振荡摇床的参数为37℃，180r/min，使碱性磷酸酶与高糖DMEM细胞培养基孵育24小时；
配制1mol/L的CaCl2溶液，在上述体系孵育24小时后，取0.1mL配制好的CaCl2溶液加入其中进行生物矿化反应(37℃，180r/min)，设置反应时间为2小时；
将矿化产物使用去离子水洗涤3遍，真空冷冻干燥即可得到对应的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒-2(MALPNs-2)。
图9所示为产物的透射电子显微镜表征结果及选区电子衍射结果图片。如图9所示，所得产物为直径50～100nm的类中空核壳非均匀类球形结构，选区电子衍射结果提示产物中磷酸钙组分为非晶相。
实施例5
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白纳米材料。
称取10mg碱性磷酸酶(ALP)加入到含有5mL高糖DMEM细胞培养基的离心管中，涡旋溶解，然后将其置于恒温振荡摇床内，调整恒温振荡摇床的参数为37℃，180r/min，使碱性磷酸酶与高糖DMEM细胞培养基孵育24小时；
配制1mol/L的CaCl2溶液，在上述体系孵育24小时后，取0.1mL配制好的CaCl2溶液加入其中进行生物矿化反应(37℃，180r/min)，设置反应时间为24小时；
将矿化产物使用去离子水洗涤3遍，真空冷冻干燥即可得到对应的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒-3(MALPNs-3)。
图10所示为产物的透射电子显微镜表征结果图片。如图10所示，所得产物为直径50～100nm的非均匀类球形颗粒。
实施例6
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白纳米材料。
称取5mg碱性磷酸酶(ALP)加入到含有50mL高糖DMEM细胞培养基的离心管中，涡旋溶解，然后将其置于恒温振荡摇床内，调整恒温振荡摇床的参数为37℃，180r/min，使碱性磷酸酶与高糖DMEM细胞培养基孵育24小时；
配制1mol/L的CaCl2溶液，在上述体系孵育24小时后，取1mL配制好的CaCl2溶液加入其中进行生物矿化反应(37℃，180r/min)，设置反应时间为20分钟；
将矿化产物使用去离子水洗涤3遍，真空冷冻干燥即可得到对应的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒-4(MALPNs-4)。
图11所示为产物的透射电子显微镜表征结果图片。如图11所示，所得产物为直径50～150nm的较均匀类球形颗粒。
实施例7
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白纳米材料。
称取10mg碱性磷酸酶(ALP)加入到含有1mL高糖DMEM细胞培养基的离心管中，涡旋溶解，然后将其置于恒温振荡摇床内，调整恒温振荡摇床的参数为37℃，180r/min，使碱性磷酸酶与高糖DMEM细胞培养基孵育24小时；
配制1mol/L的CaCl2溶液，在上述体系孵育24小时后，取0.1mL配制好的CaCl2溶液加入其中进行生物矿化反应(37℃，180r/min)，设置反应时间为20分钟；
将矿化产物使用去离子水洗涤3遍，真空冷冻干燥即可得到对应的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒-5(MALPNs-5)。
图12所示为产物的透射电子显微镜表征结果图片。如图12所示，所得产物为直径50～200nm的较均匀类球形颗粒。
实施例8
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白纳米材料。
称取10mg碱性磷酸酶(ALP)加入到含有5mL高糖DMEM细胞培养基的离心管中，涡旋溶解，然后将其置于恒温振荡摇床内，调整恒温振荡摇床的参数为37℃，180r/min，使碱性磷酸酶与高糖DMEM细胞培养基孵育24小时；
配制1mol/L的CaCl2溶液，在上述体系孵育24小时后，取0.05mL配制好的CaCl2溶液加入其中进行生物矿化反应(37℃，180r/min)，设置反应时间为20分钟；
将矿化产物使用去离子水洗涤3遍，真空冷冻干燥即可得到对应的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒-6(MALPNs-6)。
图13所示为产物的透射电子显微镜表征结果图片。如图13所示，所得产物为直径50～200nm的较均匀类球形颗粒。
实施例9
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白纳米材料。
称取10mg碱性磷酸酶(ALP)加入到含有5mL高糖DMEM细胞培养基的离心管中，涡旋溶解，然后将其置于恒温振荡摇床内，调整恒温振荡摇床的参数为37℃，180r/min，使碱性磷酸酶与高糖DMEM细胞培养基孵育24小时；
配制1mol/L的CaCl2溶液，在上述体系孵育24小时后，取5mL配制好的CaCl2溶液加入其中进行生物矿化反应(37℃，180r/min)，设置反应时间为20分钟；
将矿化产物使用去离子水洗涤3遍，真空冷冻干燥即可得到对应的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒-7(MALPNs-7)。
图14所示为产物的透射电子显微镜表征结果图片。如图14所示，所得产物为直径50～100nm的较均匀类球形颗粒。
实施例10
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白纳米材料。
称取10mg酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)加入到含有5mL高糖DMEM细胞培养基的离心管中，涡旋溶解，然后将其置于恒温振荡摇床内，调整恒温振荡摇床的参数为37℃，180r/min，使酸性磷酸酶与高糖DMEM细胞培养基孵育24小时；
配制1mol/L的CaCl2溶液，在上述体系孵育24小时后，取0.1mL配制好的CaCl2溶液加入其中进行生物矿化反应(37℃，180r/min)，设置反应时间为20分钟；
将矿化产物使用去离子水洗涤3遍，真空冷冻干燥即可得到对应的矿化酸性磷酸酶纳米颗粒(MACPNs)。
图15所示为产物的透射电子显微镜表征结果。如图15所示，所得产物为直径在50～150nm的类球形颗粒。
实施例11
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白纳米材料。
称取10mg牛血清白蛋白(BSA)加入到含有5mL高糖DMEM细胞培养基的离心管中，涡旋溶解，然后将其置于恒温振荡摇床内，调整恒温振荡摇床的参数为37℃，180r/min，使牛血清白蛋白与高糖DMEM细胞培养基孵育24小时；
配制1mol/L的CaCl2溶液，在上述体系孵育24小时后，取0.1mL配制好的CaCl2溶液加入其中进行生物矿化反应(37℃，180r/min)，设置反应时间为20分钟；
将矿化产物使用去离子水洗涤3遍，真空冷冻干燥即可得到对应的矿化牛血清白蛋白纳米颗粒(MBSANs)。
图16所示为产物的透射电子显微镜表征结果。如图16所示，所得产物为直径在50～100nm的类球形颗粒。
实施例12
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白纳米材料。
称取10mg纤维蛋白原加入到含有5mL高糖DMEM细胞培养基的离心管中，涡旋溶解，然后将其置于恒温振荡摇床内，调整恒温振荡摇床的参数为37℃，180r/min，使纤维蛋白原与高糖DMEM细胞培养基孵育24小时；
配制1mol/L的CaCl2溶液，在上述体系孵育24小时后，取0.1mL配制好的CaCl2溶液加入其中进行生物矿化反应(37℃，180r/min)，设置反应时间为20分钟；
将矿化产物使用去离子水洗涤3遍，真空冷冻干燥即可得到对应的矿化纤维蛋白原纳米颗粒。
图17所示为产物的透射电子显微镜表征结果。如图17所示，所得产物为直径在50～100nm的类球形颗粒。
实施例13
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白纳米材料。
称取10mg明胶加入到含有5mL高糖DMEM细胞培养基的离心管中，涡旋溶解，然后将其置于恒温振荡摇床内，调整恒温振荡摇床的参数为37℃，180r/min，使明胶与高糖DMEM细胞培养基孵育24小时；
配制1mol/L的CaCl2溶液，在上述体系孵育24小时后，取0.1mL配制好的CaCl2溶液加入其中进行生物矿化反应(37℃，180r/min)，设置反应时间为20分钟；
将矿化产物使用去离子水洗涤3遍，真空冷冻干燥即可得到对应的矿化明胶纳米颗粒。
图18所示为产物的透射电子显微镜表征结果。如图18所示，所得产物为直径在50～100nm的类球形颗粒。
实施例14
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白基水凝胶复合材料。
将实施例3中冷冻干燥后制备的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒按照30％(w/w)的质量比与甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)前驱溶液混合，涡旋均匀；
然后置于紫外光下照射5分钟使其交联自固化后冷冻干燥24小时形成复合骨修复支架(MALPNs/GelMA-1)。
图19给出了制备的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒/GelMA复合骨修复材料(MALPNs/GelMA-1)的扫描电子显微镜结果。如图19所示，可见冷冻干燥后的MALPNs/GelMA-1呈均匀多孔的支架结构，孔径约为200μm，MALPNs(图19c)及对照样CaP(图19b)均匀分布于GelMA水凝胶的孔壁中，具有一定力学特性的MALPNs/GelMA-1保证了其作为植入材料植入体内的支撑要求。
实施例15
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白基水凝胶复合材料。
将实施例3中冷冻干燥后制备的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒按照10％(w/w)的质量比与甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)前驱溶液混合，涡旋均匀；
然后置于紫外光下照射5分钟使其交联自固化后冷冻干燥24小时形成复合骨修复支架(MALPNs/GelMA-2)。
图20所示为复合骨修复支架MALPNs/GelMA-2的扫描电子显微镜表征结果。如图20所示，MALPNs/GelMA-2呈孔状支架结构，孔径约为100μm，MALPNs均匀分布于GelMA水凝胶的孔壁中。
实施例16
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及矿化活性蛋白基水凝胶复合材料。
将上述实施例3中冷冻干燥后制备的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒按照50％(w/w)的质量比与甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)前驱溶液混合，涡旋均匀；
然后置于紫外光下照射5分钟使其交联自固化后冷冻干燥24小时形成复合骨修复支架(MALPNs/GelMA-3)。
图21所示为复合骨修复支架MALPNs/GelMA-3的扫描电子显微镜表征结果。如图21所示，MALPNs/GelMA-3呈孔状支架结构，孔径约为100μm，MALPNs均匀分布于GelMA水凝胶的孔壁中。
实施例17
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及实施例3的矿化活性蛋白纳米材料的应用。
图22给出了制备的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒的生物相容性检测结果，表明该复合材料具有较优异的生物相容性，100μg/mL浓度的矿化碱性磷酸酶纳米颗粒在每个时间点都表现出促进骨髓间充质干细胞增殖的效果。
图23给出了与矿化碱性磷酸酶纳米颗粒共培养后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性检测结果，提示该复合材料可以显著提高骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性。
图24给出了与矿化碱性磷酸酶纳米颗粒共培养后骨髓间充质干细胞的钙结节形成结果，提示该复合材料可以显著促进骨髓间充质干细胞形成更多钙结节。
图25给出了与矿化碱性磷酸酶纳米颗粒共培养后骨髓间充质干细胞的成骨相关基因表达量的变化结果，提示该复合材料可以显著促进骨髓间充质干细胞表达成骨相关基因，成骨基因的表达量相比空白组最高可达四倍以上。结合图23-图25的结果，显示矿化碱性磷酸酶纳米颗粒可以显著促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。
实施例18
本实施例为本发明的一个具体实施例，涉及实施例14的矿化活性蛋白基水凝胶复合材料的应用。
图26给出了矿化碱性磷酸酶纳米颗粒/GelMA复合骨修复材料(MALPNs/GelMA-1)体内骨修复性能的评价结果。该实施例中以SD大鼠颅骨缺损(5mm)作为体内模型评估植入体内MALPNs/GelMA-1促进骨修复的效果，采用的评估方法是Micro-CT扫描及三维重建。具体方法如下：在骨修复材料植入后的4周、8周和12周各个组分别过量麻醉处死相同数量的SD大鼠，取出颅骨标本进行Micro-CT扫描探究骨缺损区域的骨修复情况，可见在各个组间进行横向比较，在每个时间点，无论从三维重建图像来观察还是从冠状位图像来观察，MALPNs/GelMA-1都表现出了更优异的骨修复效果，特别是MALPNs/GelMA-1组12周的大鼠颅骨标本，其Micro-CT结果显示骨缺损区域几乎完全修复。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种矿化活性蛋白纳米材料的制备方法，其特征在于，包括：
将活性蛋白分子加入至细胞培养基进行孵育，以获得孵育溶液，其中，所述活性蛋白分子为碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、牛血清白蛋白、纤维蛋白原、明胶中的一种或几种的组合，所述细胞培养基为MEM培养基、高糖DMEM培养基、低糖DMEM培养基，所述活性蛋白分子与所述细胞培养基的质量/体积比为10：1 mg/mL~1：10 mg/mL，所述孵育的温度为0~39℃、振荡条件为10~200 r/min、时间为24 h；
将水溶性钙盐加入至所述孵育溶液进行矿化，以获得矿化溶液，其中，所述水溶性钙盐为氯化钙和/或其水合物、硝酸钙和/或其水合物、乙酸钙和/或其水合物中的一种或几种的组合，所述水溶性钙盐与所述孵育溶液的体积比为1：100~1：1，所述水溶性钙盐的摩尔浓度为0.001~5 mol/L，所述矿化的温度为0~39℃、振荡条件为10~200 r/min、时间为20 min~24h；
对所述矿化溶液依次进行分离、洗涤和冷冻干燥，以获得矿化活性蛋白纳米材料，其中，所述矿化活性蛋白纳米材料的尺寸为50~200 nm。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分离包括离心分离、过滤分离、静置沉淀分离中的任意一种或几种的组合；和/或
所述洗涤包括水洗和/或乙醇洗；和/或
所述矿化活性蛋白纳米材料的尺寸为50~150 nm。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，包括：
将活性蛋白分子加入至细胞培养基进行孵育，以获得孵育溶液，其中，所述活性蛋白分子与所述细胞培养基的质量/体积比为2：1 mg/mL，所述孵育的温度为37℃、振荡条件为140~180 r/min、时间为24 h；
将水溶性钙盐加入至所述孵育溶液进行矿化，以获得矿化溶液，其中，所述水溶性钙盐与所述孵育溶液的体积比为1：50，所述矿化的温度为37℃、振荡条件为140~180 r/min、时间为20 min；
对所述矿化溶液依次进行分离、洗涤和冷冻干燥，以获得矿化活性蛋白纳米材料，其中，所述矿化活性蛋白纳米材料的尺寸为50~100 nm。
4.一种矿化活性蛋白纳米材料，由权利要求1~3任一所述的制备方法制备得到。
5.一种如权利要求4所述的矿化活性蛋白纳米材料在制备促进骨修复材料的应用。
6.一种矿化活性蛋白基水凝胶复合材料的制备方法，其特征在于，包括：
将权利要求4所述的矿化活性蛋白纳米材料与GelMA水凝胶前驱体溶液混合，以获得混合液，其中，所述矿化活性蛋白纳米材料与所述GelMA水凝胶前驱体溶液的质量比为10%~50%；
对所述混合液依次进行紫外光固化、冷冻干燥，以获得矿化活性蛋白基水凝胶复合材料。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，紫外光固化的时间为5 min~1 h；和/或
冷冻干燥的时间为24 h~120 h。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，包括：
将所述矿化活性蛋白纳米材料与GelMA水凝胶前驱体溶液混合，以获得混合液，其中，所述矿化活性蛋白纳米材料与所述GelMA水凝胶前驱体溶液的质量比为30%；
对所述混合液依次进行紫外光固化5 min、冷冻干燥24 h，以获得矿化活性蛋白基水凝胶复合材料。
9.一种矿化活性蛋白基水凝胶复合材料，由权利要求6~8任一所述的制备方法制备得到。
10.一种如权利要求9所述的矿化活性蛋白基水凝胶复合材料在制备促进骨修复材料的应用。
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