CN117563045A - 用于软骨再生的天然可降解水凝胶及其制备方法 - Google Patents
用于软骨再生的天然可降解水凝胶及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117563045A CN117563045A CN202410058642.0A CN202410058642A CN117563045A CN 117563045 A CN117563045 A CN 117563045A CN 202410058642 A CN202410058642 A CN 202410058642A CN 117563045 A CN117563045 A CN 117563045A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cartilage
- gelatin
- hydrogel
- scaffold
- meha
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 64
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 230000003848 cartilage regeneration Effects 0.000 title abstract description 5
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims abstract description 60
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims abstract description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 33
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 33
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 33
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 33
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 33
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical class CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 31
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 29
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 19
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 claims description 18
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 claims description 18
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 claims description 18
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 claims description 14
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000010146 3D printing Methods 0.000 claims description 9
- -1 beta-cyclodextrin modified hyaluronic acid Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 7
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 claims description 7
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 claims description 4
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 abstract description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 6
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000013269 sustained drug release Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- SLUINPGXGFUMLL-UHFFFAOYSA-N 2-[(4-phenylphenyl)carbamoyl]benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)NC1=CC=C(C=2C=CC=CC=2)C=C1 SLUINPGXGFUMLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 13
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 10
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 8
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 6
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 4
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 4
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000012586 2D rotating frame Overhauser effect spectroscopy experiment Methods 0.000 description 3
- 229940090248 4-hydroxybenzoic acid Drugs 0.000 description 3
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 description 3
- 208000003947 Knee Osteoarthritis Diseases 0.000 description 3
- 208000013201 Stress fracture Diseases 0.000 description 3
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012669 compression test Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 3
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 3
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 3
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- 241000353097 Molva molva Species 0.000 description 2
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 2
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 3-phenylpropionic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- 101001043596 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor-related protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 102100021917 Low-density lipoprotein receptor-related protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 240000000233 Melia azedarach Species 0.000 description 1
- 101100096242 Mus musculus Sox9 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009859 Osteochondrosis Diseases 0.000 description 1
- KLGDRWGOXDJNPH-UHFFFAOYSA-N P(=O)(O)(O)O.C1(=CC=CC=C1)C=1C(=C(C(=O)[Li])C(=CC1C)C)C Chemical compound P(=O)(O)(O)O.C1(=CC=CC=C1)C=1C(=C(C(=O)[Li])C(=CC1C)C)C KLGDRWGOXDJNPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000011 Syndecan-4 Human genes 0.000 description 1
- 108010055215 Syndecan-4 Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000009141 biological interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 208000015100 cartilage disease Diseases 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 230000008619 cell matrix interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000000968 fibrocartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 229940072322 hylan Drugs 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005065 subchondral bone plate Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002522 swelling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004233 talus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/222—Gelatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/20—Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
- B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
- B33Y70/00—Materials specially adapted for additive manufacturing
- B33Y70/10—Composites of different types of material, e.g. mixtures of ceramics and polymers or mixtures of metals and biomaterials
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
- B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
- B33Y80/00—Products made by additive manufacturing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
- A61L2300/602—Type of release, e.g. controlled, sustained, slow
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Ceramic Engineering (AREA)
- Civil Engineering (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Structural Engineering (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明提供了一种用于软骨再生的天然可降解水凝胶及其制备方法。所述天然可降解水凝胶，为由如下组分溶解于PBS中形成的超分子水凝胶：GelMA‑PH、MeHA‑CD、gelatin‑PH、HA‑CD和光引发剂。本发明还提供一种载成软骨小分子药物的超分子水凝胶支架。相较于传统支架，本发明的新型天然可降解支架不仅能为软骨修复提供增强的力学支持，还具有优异的可降解性、生物相容性以及软骨诱导能力。同时，还在兔软骨缺损中展现了优异的软骨修复能力。本发明的载KGN的超分子水凝胶支架通过药物缓释实验证实其相较于传统的GelHA支架具有更为持续的药物缓释能力，有望在软骨修复领域有更加广阔的应用。
Description
技术领域
在本发明属于医药领域，具体涉及一种用于软骨再生的天然可降解水凝胶及其制备方法。
背景技术
软骨损伤是世界范围内最常见的健康问题之一，其发生的原因多种多样，其中，外伤是最常见的病因。报告显示，一般人群中软骨损伤的患病率高达60%以上[ Lesage C,Lafont M, Guihard P, et al. Material-Assisted Strategies for OsteochondralDefect Repair[J]. Adv Sci (Weinh), 2022, 9(16): e2200050]。与体内其他大多数组织不同，软骨组织中的软骨细胞含量很低，并且几乎没有血管。由于缺乏适当的干细胞和足够的营养，软骨缺乏自愈能力，损伤后将导致关节疼痛，功能受限，如不及时治疗，甚至会引起骨关节炎，最终导致残疾[Sharma L. Osteoarthritis of the Knee[J]. N Engl JMed, 2021, 384(1): 51-59；Cao C, Shi Y, Zhang X, et al. Cholesterol-inducedLRP3 downregulation promotes cartilage degeneration in osteoarthritis bytargeting Syndecan-4[J]. Nat Commun, 2022, 13(1): 7139；Dai W, Leng X, Wang J,et al. Intra-Articular Mesenchymal Stromal Cell Injections Are No DifferentFrom Placebo in the Treatment of Knee Osteoarthritis: A Systematic Review andMeta-analysis of Randomized Controlled Trials[J]. Arthroscopy, 2021, 37(1):340-358]。
目前针对软骨损伤，临床上已经开发了多种治疗策略，其中包括微骨折、自体软骨移植和同种异体软骨移植等[Dai W, Sun M, Leng X, et al. Recent Progress in 3DPrinting of Elastic and High-Strength Hydrogels for the Treatment ofOsteochondral and Cartilage Diseases[J]. Front Bioeng Biotechnol, 2020, 8:604814]。尽管这些方法在临床上经常使用，但它们仍然存在显著的缺点和局限性。微骨折在软骨下骨上钻出小孔，让骨髓流入缺损区域以引入生长因子和干细胞，有望促进软骨的再生。然而，它通常会导致纤维软骨的形成。软骨移植虽然已经较多地应用于临床，但它仍然存在较大局限性，例如移植物储存、免疫排斥、组织供应有限、整合不足等缺点，导致修复效果不佳[Nakasa T, Ikuta Y, Sumii J, et al. Clinical Outcomes ofOsteochondral Fragment Fixation Versus Microfracture Even for SmallOsteochondral Lesions of the Talus[J]. Am J Sports Med, 2022, 50(11): 3019-3027.]。
组织工程，是指利用细胞技术、材料学方法、以及工程技术来构建生物活性物质，以修复或再生组织与器官的技术[Wang S, Zhao S, Yu J, et al. Advances inTranslational 3D Printing for Cartilage, Bone, and Osteochondral TissueEngineering[J]. Small, 2022, 18(36): e2201869；Zhao F, Cheng J, Zhang J, etal. Comparison of three different acidic solutions in tendon decellularizedextracellular matrix bio-ink fabrication for 3D cell printing[J]. ActaBiomater, 2021, 131: 262-275]。这项技术最初在1987 年由美国国家科学基金委员会提出，经过此后数十年迅速发展，这种方法构建的再生组织不仅能够提供力学和结构的支撑，还可以引导细胞定向分化并分泌细胞外基质，实现真正意义的组织修复。
鉴于目前临床上所使用的方法都无法修复这种异质性的软骨组织，使用组织工程的方法制备具有仿生结构的软骨支架，进而修复软骨组织，使其在修复后形成生理结构具有重要意义。
鉴于关节内复杂的力学环境，软骨组织工程支架不仅要具备足够的结构稳定性，还需要具有良好的生物亲和性和诱导组织分化能力，以促进细胞分泌细胞外基质从而重塑软骨的生理结构。
为了构建软骨组织工程支架，一些研究者使用人工合成材料制作支架，然而，这类人工合成支架多因为较差的生物相容性限制了其软骨修复能力。为了解决以上问题，研究者尝试在支架表面采用生物活性因子进行修饰，以提高支架的生物学性能。结果显示这种修饰方法可以提高软骨支架的生物活性。然而，这种方法只能在一定程度上提高支架的生物学功能，无法使细胞进入支架内部完成重建，并且由于支架降解缓慢，自体组织难以完全替代，其长期结果难以得到保证[Qiao Z, Lian M, Han Y, et al. Bioinspiredstratified electrowritten fiber-reinforced hydrogel constructs with layer-specific induction capacity for functional osteochondral regeneration[J].Biomaterials, 2021, 266: 120385]。
透明质酸是一种常见的天然材料，并且是软骨细胞外基质的主要成分之一[Dai WL, Lin Z M, Guo D H, et al. Efficacy and Safety of Hylan versus HyaluronicAcid in the Treatment of Knee Osteoarthritis[J]. J Knee Surg, 2019, 32(3):259-268]。通过甲基丙烯酸对其进行修饰形成甲基丙烯酰透明质酸（MeHA）之后，可以进行光交联形成水凝胶。研究显示，MeHA水凝胶不仅具有良好的溶胀性能，还可以通过整合素与软骨细胞相互作用，从而增强软骨细胞增殖和细胞外基质的分泌[ Schuurmans C C L,Mihajlovic M, Hiemstra C, et al. Hyaluronic acid and chondroitin sulfate(meth)acrylate-based hydrogels for tissue engineering: Synthesis,characteristics and pre-clinical evaluation[J]. Biomaterials, 2021, 268:120602]。尽管具有以上优点，MeHA水凝胶支架的机械性能比周围的天然组织弱，并且其降解速度明显快于组织再生速度。以上情况限制了MeHA水凝胶在软骨修复中的使用。
明胶是胶原蛋白的变性产物，因其所具有的天然Arg-Gly-Asp（RGD）序列可促进细胞和支架之间的生物相互作用而受到研究人员的关注[Sheikhi A, De Rutte J,Haghniaz R, et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealablenaturally-derived protein microbeads[J]. Biomaterials, 2019, 192: 560-568]。然而，其机械刚度差和不可控的降解速率限制了它的应用。为了解决这个问题，研究人员用甲基丙烯酰基改性明胶，所得甲基丙烯酰明胶 (GelMA) 可以在光引发剂存在的情况下进行光交联形成水凝胶支架。交联的GelMA具有优异且可控的机械性能，可以满足不同条件下支架的要求[Martyniak K, Lokshina A, Cruz M A, et al. Biomaterial compositionand stiffness as decisive properties of 3D bioprinted constructs for type IIcollagen stimulation[J]. Acta Biomater, 2022, 152: 221-234]。然而，由于GelMA缺乏诱导组织分化能力和载药能力，通过单纯的GelMA难以构建出仿生的组织工程支架[YanX, Yang B, Chen Y, et al. Anti-Friction MSCs Delivery System Improves theTherapy for Severe Osteoarthritis[J]. Adv Mater, 2021, 33(52): e2104758]。
为了提升支架的生物学功能，一些研究者通过将生物组织进行脱细胞，以制备生物学功能更优良的脱细胞基质水凝胶[Zhao F, Cheng J, Zhang J, et al. Comparisonof three different acidic solutions in tendon decellularized extracellularmatrix bio-ink fabrication for 3D cell printing[J]. Acta Biomater, 2021, 131:262-275；Zhao F, Cheng J, Sun M, et al. Digestion degree is a key factor toregulate the printability of pure tendon decellularized extracellular matrixbio-ink in extrusion-based 3D cell printing[J]. Biofabrication, 2020, 12(4):045011. ]。相关研究证实这种脱细胞基质水凝胶具有较好的细胞亲和性及生物相容性，而且可以促进干细胞定向分化[De Santis M M, Alsafadi H N, Tas S, et al.Extracellular-Matrix-Reinforced Bioinks for 3D Bioprinting Human Tissue[J].Adv Mater, 2021, 33(3): e2005476]。然而这类水凝胶存在力学性能差，难以制备出固定形状的支架等问题，因此较少应用于体内修复。通过对其进行甲基丙烯酸修饰，从而使用共价交联增强其力学强度是其中的解决办法之一。然而，这种单纯的共价交联的成胶方式会显著限制支架内部的细胞-细胞、细胞-基质之间的相互作用，导致支架内的细胞难以发挥相应的功能[Chaudhuri O, Cooper-White J, Janmey P A, et al. Effects ofextracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour[J]. Nature, 2020,584(7822): 535-546]。
目前组织工程方面使用的天然支架因为较差的组织诱导能力以及较弱的机械强度往往难以达到满意效果，而单纯的合成材料虽然力学强度可以，但是其生物相容性和生物可降解性往往欠佳，最终导致其软骨修复能力有限。
发明内容
针对目前软骨修复支架的缺点，本发明开发一种具有增强的力学强度、优良的生物相容性、更好的软骨诱导能力、以及生物可降解的新型天然超分子水凝胶支架，以便更好地促进关节软骨修复。
本发明的目的之一是提供一种天然可降解水凝胶。
本发明所提供的天然可降解水凝胶，为由如下组分溶解于PBS中形成的超分子水凝胶（MeGH）：GelMA-PH、MeHA-CD、gelatin-PH、HA-CD和光引发剂，
其中，所述光引发剂具体可为LAP，
所述天然可降解水凝胶中，GelMA-PH的质量百分含量为2-4%，具体可为2.5%，MeHA-CD的质量百分含量为0.5-2%，具体可为1%，gelatin-PH的质量百分含量为2-4%，具体可为2.5%，HA-CD的质量百分含量为0.5-2%，具体可为1%，光引发剂的质量百分含量为0.3-1.0%，具体可为0.5%。
所述GelMA-PH表示酚修饰的甲基丙烯酰化明胶；
具体地，所述酚修饰的甲基丙烯酰化明胶（GelMA-PH）通过包括如下步骤的方法制备得到：将明胶与甲基丙烯酸反应，得到甲基丙烯酰化明胶GelMA；将甲基丙烯酰化明胶GelMA与对羟基苯丙酸发生缩合反应，即得酚修饰的甲基丙烯酰化明胶（GelMA-PH）；
其中，明胶与甲基丙烯酸的配比可为10g：0.6-3mL；
甲基丙烯酰化明胶GelMA与对羟基苯丙酸的质量比可为1.0g：20-100mg；
所述缩合反应在EDC和NHS催化下进行；
所述缩合反应在黑暗环境下进行，所述缩合反应的温度可为37-40°C，具体可为37°C，时间可为18-36h，具体可为24h。
所述gelatin-PH表示酚修饰的明胶；
具体地，所述酚修饰的明胶（gelatin-PH）通过包括如下步骤的方法制备得到：将明胶与对羟基苯丙酸发生缩合反应，即得酚修饰的明胶（gelatin-PH）；
其中，明胶与对羟基苯丙酸的质量比可为1.0g：20-100mg；
所述缩合反应在EDC和NHS催化下进行；
所述缩合反应在黑暗环境下进行，所述缩合反应的温度可为37-40°C，具体可为37°C，时间可为18-36h，具体可为24h。
所述MeHA-CD表示β-环糊精修饰的甲基丙烯酸透明质酸（β-CD 修饰的MeHA），
具体地，所述β-环糊精修饰的甲基丙烯酸透明质酸（MeHA-CD）通过包括如下步骤的方法制备得到：将透明质酸HA与甲基丙烯酸反应，得到甲基丙烯酸透明质酸（MeHA），阳离子交换树脂交换得到酸化的MeHA，使用TBA-OH滴定酸化的MeHA至pH 7.02-7.05以制备碱化的MeHA，将碱化的MeHA与β-CD反应，得到β-CD 修饰的MeHA（MeHA-CD）；
其中，所述透明质酸与甲基丙烯酸的配比可为5.0g：2.8-11.2 ml，所述反应在碱性条件下进行，具体地，在pH值=8.5进行；
碱化的MeHA与β-CD的质量比可为1.0g：0.4-1.6g。
所述HA-CD表示β-环糊精修饰的透明质酸（HA-CD）；
具体地，所述β-环糊精修饰的透明质酸（HA-CD）通过包括如下步骤的方法制备得到：将透明质酸HA与阳离子交换树脂交换得到酸化的HA，使用TBA-OH滴定酸化的HA至pH7.02-7.05以制备碱化的HA，将碱化的HA与β-CD反应，得到β-CD 修饰的HA（HA-CD）；
其中，碱化的HA与β-CD的质量比可为1.0g：0.4-1.6g。
上述天然可降解水凝胶通过将GelMA-PH、MeHA-CD、gelatin-PH、HA-CD和光引发剂溶解于PBS中制成。
上述天然可降解水凝胶即超分子水凝胶构建软骨组织工程支架中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种超分子水凝胶MeGH支架。
本发明所提供的超分子水凝胶MeGH支架，为通过对上述超分子水凝胶MeGH（天然可降解水凝胶）进行3D打印而成的网格状支架。
上述天然可降解水凝胶即超分子水凝胶，及超分子水凝胶MeGH支架在制备促进软骨修复的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种载成软骨小分子药物的超分子水凝胶支架。
本发明所提供的载成软骨小分子药物的超分子水凝胶支架，通过包括如下步骤的方法制备得到：将成软骨小分子药物加入到超分子水凝胶中，再进行3D打印。
所述成软骨小分子药物具体可为KGN。
所述成软骨小分子药物与超分子水凝胶的配比可为30-100μg：1 ml。
本发明提供一种合适的超分子水凝胶支架的合成方法，成功制作了以可降解天然材料-明胶和透明质酸为基础的新型软骨修复支架。
相较于传统支架，本发明的新型天然可降解支架不仅能为软骨修复提供增强的力学支持，还具有优异的可降解性、生物相容性以及软骨诱导能力。同时，还在兔软骨缺损中展现了优异的软骨修复能力。本发明的载KGN的超分子水凝胶支架通过药物缓释实验证实其相较于传统的GelHA支架具有更为持续的药物缓释能力，有望在软骨修复领域有更加广阔的应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中通过1H NMR确认MeHA-CD及HA-CD的成功修饰。
图2为本发明实施例1中通过1H NMR确认GelMA-PH及gelatin-PH的成功修饰。
图3为本发明实施例1中测得的2D ROESY NMR波谱，证实MeGH中β-CD和酚基之间的超分子络合效应（黑框中显示Overhauser峰效应）。
图4中A,B为MeGH水凝胶的流变学特征，其中，A为粘度-温度曲线，B为粘度-剪切速率曲线，C为通过3D打印的方法制备的MeGH支架。
图5中A为MeGH支架的反复折弯测试结果、B为力学模量以及C为循环压缩测试结果。
图6为降解实验结果，证实MeGH支架大约在25天降解完全，远小于传统GelHA支架的9天降解完全。
图7为细胞实验，证实MeGH支架优异的生物相容性。图7中A、B，细胞live/dead生存染色；图7中C、D，细胞Edu增殖染色。
图8为本发明实施例2中药物缓释实验结果，证实MeGH支架相对于传统的GelHA支架具有更为持续的药物缓释能力。
图9表明载KGN的MeGH支架相较于载KGN的GelHA支架可以更好地促进兔干细胞成软骨，其中A为免疫荧光检测成软骨相关蛋白[COL II和SOX9]的表达情况；B,C为免疫荧光强度的半定量检测第7天和14天的COLII和SOX9的表达量。
图10中A为大体观及MRI比较MeGH支架和传统的GelHA支架对软骨修复能力。B 为ICRS评分及C为MRI WORMS评分，显示MeGH支架较GelHA支架具有更优异的软骨修复效果。
图11为HE染色，显示载KGN的MeGH支架相较于载KGN的传统GelHA支架具有更强的软骨修复能力。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所采用的试剂包括透明质酸，明胶，磷酸盐缓冲溶液 （PBS），氢氧化钠（NaOH），阳离子交换树脂，甲基丙烯酸，四丁基氢氧化铵（TBA-OH），单(6-己二胺基-6-去氧)β-环糊精（β-CD），2-吗啉乙磺酸缓冲液 （MES），N-羟基丁二酰亚胺（NHS），1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC），二甲基亚砜（DMSO），对羟基苯丙酸，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐（LAP），Kartogenin （KGN）。
实施例1、超分子水凝胶支架的合成与制备
将5.0 g透明质酸溶解在300 ml去离子水中。使用NaOH将溶液的pH值调整为8.5。滴加5.6 ml甲基丙烯酸，并在甲基丙烯酸添加过程中使用NaOH将pH维持至8.5。反应4小时后，将溶液转移到透析膜（7000D）中，使用去离子水透析7天，每天换水两次。透析后，将其在-80°C冰箱中冷冻过夜，并将样品冻干得到甲基丙烯酸透明质酸（MeHA）。将3.0 g MeHA溶解在150 ml去离子水中。向溶液中加入9.0 g 阳离子交换树脂（Dowex 50WX8），并通过真空过滤从树脂中收集酸化的MeHA。随后通过使用TBA-OH滴定酸化的MeHA至pH 7.02-7.05以制备碱化的MeHA。将1.0 g 碱化的MeHA溶解在200 ml无水DMSO中，并加入0.8 g β-CD，反应6小时后，加入冰水终止反应。在室温下透析5天，每天换水两次。透析完后，将样品放于-80°C冰箱中冷冻过夜，并将其冻干得到β-CD 修饰的MeHA（MeHA-CD）。将3.0 g HA溶解在150 ml去离子水中。向溶液中加入9.0 g 阳离子交换树脂（Dowex 50WX8），并通过真空过滤从树脂中收集酸化的HA。随后通过使用TBA-OH滴定酸化的HA至pH 7.02-7.05以制备碱化的HA。将1.0 g 碱化的HA溶解在200 ml无水DMSO中，并加入0.8 g β-CD，反应6小时后，加入冰水终止反应。在室温下透析5天，每天换水两次。透析完后，将样品放于-80°C冰箱中冷冻过夜，并将其冻干得到β-CD 修饰的HA（HA-CD）。使用1H NMR确认MeHA-CD和HA-CD的成功修饰（图1）。
将10 g明胶溶解在50°C的100 mL去离子水中，搅拌60分钟以促进明胶溶解。然后缓慢加入0.6 ml甲基丙烯酸并搅拌（300 RPM）。反应60分钟后，将溶液转移到50 ml管中，并通过高速离心3分钟（3000 RPM）除去未反应的甲基丙烯酸。用100 ml预热（40°C）的去离子水稀释上清液后，将溶液转移到透析膜（7000D）中，并在40°C下使用去离子水透析3天。最后，将纯化的溶液冻干，得到GelMA。将1.0 g GelMA溶解在37°C的 MES缓冲液（pH 4.5）中。然后，将50.0 mg对羟基苯丙酸、58.0 mg EDC和35.0 mg NHS溶解在80 mL MES缓冲液（pH4.5）中，搅拌20分钟后，将该溶液加入到GelMA溶液中。使混合物在37°C黑暗环境中反应24小时。所得溶液通过去离子水透析纯化，最后冻干得到酚修饰的GelMA (GelMA-PH)。将1.0g 明胶溶解在37°C的 MES缓冲液（pH 4.5）中。然后，将50.0 mg对羟基苯丙酸、58.0 mg EDC和35.0 mg NHS溶解在80 mL MES缓冲液（pH 4.5）中，搅拌20分钟后，将该溶液加入到明胶溶液中。使混合物在37°C黑暗环境中反应24小时。所得溶液通过去离子水透析纯化，最后冻干得到酚修饰的明胶（gelatin-PH）。使用1H NMR确认GelMA-PH及gelatin-PH的成功修饰（图2）。
将2.5%（质量浓度）GelMA-PH、1% MeHA-CD、2.5% gelatin-PH、1% HA-CD和0.5 %LAP作为光引发剂溶解在PBS中形成超分子水凝胶（MeGH）。为了确认β-CD和酚基之间的超分子络合效应，将制备的MeGH粉末溶解在氧化氘中，并使用2D ROESY NMR波谱证实MeGH中β-CD和酚基之间的超分子络合效应。图3为测得的2D ROESY NMR波谱，证实MeGH中β-CD和酚基之间的超分子络合效应（黑框中显示Overhauser峰效应）。
在流变学测试中，MeGH表现出良好的温敏性（图4中A）和剪切稀化（图4中B）能力，说明其具有良好的3D打印性。通过对MeGH进行3D打印成网格状支架（3D打印机：3DBioplotter [EnvisionTEC，Germany]；针头直径：51 um；水凝胶挤出温度：23℃；3D打印机平台温度：5℃；气压：0.8 bar；交联条件：蓝光交联 [405 nm，5 mW cm-2，15秒]，证实其可以形成结构稳定的3D支架（图4中C）。
对交联后的支架进行反复折弯，证实了MeGH在打印后具有良好的结构稳定性（图5中A），而传统的GelHA支架（制备方法：将5% GelMA、2% MeHA和0.5 % LAP作为光引发剂溶解在PBS中形成GelHA。通过对GelHA进行3D打印成网格状支架[3D打印机：3D Bioplotter,EnvisionTEC，Germany；针头直径：51 um；水凝胶挤出温度：23℃；3D打印机平台温度：5℃；气压：0.8 bar；交联条件：蓝光交联, 405 nm，5 mW cm-2，15秒]）则会因为力学强度不足而出现断裂。而压缩力学测试也证实了MeGH不仅压缩模量大约为传统GelHA支架（5% GelMA +2% MeHA）的两倍（图5中B），并且在反复压缩测试中未见明显的力学模量衰减，说明其适合用于反复承重的关节环境中（图5中C）。
图5中A为MeGH支架的反复折弯测试、B为力学模量以及C为循环压缩测试结果。
在降解测试中，将支架浸泡在降解液中（该降解液由包含2.0U/mLI型胶原酶和10U/mL透明质酸酶的PBS溶液组成，以在37℃下模拟体内关节环境。在所需时间点，用去离子水彻底清洗样品，冷冻干燥并称重。降解率计算如下：降解率=（Wo,dry-Wt,dry）/Wo，dry×100%，其中Wo,dry是降解前的干燥重量，Wt,dry是在每个降解时间点的干燥重量。结果发现其大约在25天降解完全，远小于传统GelHA（5% GelMA + 2% MeHA）支架的约9天降解完全（图6）。
图6为降解实验结果，证实MeGH支架大约在25天降解完全，远小于传统GelHA支架的9天降解完全。
通过混合水凝胶和兔脂肪干细胞打印网格状支架，发现在MeGH支架相较于传统的GelHA支架中具有更为优异的生物相容性（图7中A、B，细胞live/dead生存染色；图7中C、D，细胞Edu增殖染色）。
图7为细胞实验证实MeGH支架优异的生物相容性。相较于传统的GelHA支架，兔脂肪干细胞在MeGH支架中具有更好的存活率。
实施例2、载成软骨小分子药物KGN的超分子水凝胶支架的制备及性质研究
启发于既往文献报道的环糊精对小分子药物的吸附作用，本发明将成软骨小分子药物KGN加入到MeGH支架中（每50μg KGN加入1ml MeGH水凝胶中），并对通过药物缓释实验证实MeGH支架相较于传统的GelHA支架具有更为持续的药物缓释能力（图8）。
图8为药物缓释实验，证实MeGH支架相对于传统的GelHA支架具有更为持续的药物缓释能力。
使用MeGH水凝胶载兔脂肪干细胞和KGN打印网格状支架，在共培养7天和14天以后，发现载KGN的MeGH支架可以更好地促进干细胞中成软骨相关蛋白（COL II和SOX9）的表达（图9）。
图9表明载KGN的MeGH支架相较于载KGN的GelHA支架可以更好地促进兔干细胞成软骨，其中A为免疫荧光检测成软骨相关蛋白[COL II和SOX9]的表达情况；B,C为免疫荧光强度的半定量检测第7天和14天的COLII和SOX9的表达量。
为了验证新型支架的软骨修复能力，将3D打印的支架植入到兔软骨缺损内，并观察术后12周的软骨修复效果，从大体观（图10中A）和MRI（图10中B）发现，MeGH支架相较于传统的GelHA支架具有更好的软骨修复能力。通过HE染色进一步验证了MeGH支架在植入后具有更好的软骨修复能力（图11）。
图10中A为大体观及MRI比较MeGH支架和传统的GelHA支架对软骨修复能力。B 为ICRS评分及C为MRI WORMS评分，显示MeGH支架较GelHA支架具有更优异的软骨修复效果。
图11为HE染色，显示载KGN的MeGH支架相较于载KGN的传统GelHA支架具有更强的软骨修复能力。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种天然可降解水凝胶，为由如下组分溶解于PBS中形成的超分子水凝胶MeGH：GelMA-PH、MeHA-CD、gelatin-PH、HA-CD和光引发剂，
其中，GelMA-PH表示酚修饰的甲基丙烯酰化明胶；
gelatin-PH表示酚修饰的明胶；
MeHA-CD表示β-环糊精修饰的甲基丙烯酸透明质酸；
HA-CD表示β-环糊精修饰的透明质酸；
所述酚修饰的甲基丙烯酰化明胶通过包括如下步骤的方法制备得到：将明胶与甲基丙烯酸反应，得到甲基丙烯酰化明胶GelMA；将甲基丙烯酰化明胶GelMA与对羟基苯丙酸发生缩合反应，即得酚修饰的甲基丙烯酰化明胶；
所述酚修饰的明胶通过包括如下步骤的方法制备得到：将明胶与对羟基苯丙酸发生缩合反应，即得酚修饰的明胶；
所述β-环糊精修饰的甲基丙烯酸透明质酸通过包括如下步骤的方法制备得到：将透明质酸HA与甲基丙烯酸反应，得到甲基丙烯酸透明质酸MeHA，阳离子交换树脂交换得到酸化的MeHA，使用TBA-OH滴定酸化的MeHA至pH 7.02-7.05以制备碱化的MeHA，将碱化的MeHA与β-CD反应，得到β-环糊精修饰的甲基丙烯酸透明质酸；
所述β-环糊精修饰的透明质酸通过包括如下步骤的方法制备得到：将透明质酸HA与阳离子交换树脂交换得到酸化的HA，使用TBA-OH滴定酸化的HA至pH 7.02-7.05以制备碱化的HA，将碱化的HA与β-CD反应，得到β-环糊精修饰的透明质酸。
2.如权利要求1所述的天然可降解水凝胶，其特征在于，所述天然可降解水凝胶中，GelMA-PH的质量百分含量为2-4%，MeHA-CD的质量百分含量为0.5-2%，gelatin-PH的质量百分含量为2-4%，HA-CD的质量百分含量为0.5-2%，光引发剂的质量百分含量为0.3-1.0%。
3.权利要求1或2所述的天然可降解水凝胶在构建软骨组织工程支架中的应用。
4.一种超分子水凝胶支架，为通过对权利要求1或2所述的天然可降解水凝胶进行3D打印而成的网格状支架。
5.权利要求1或2所述的天然可降解水凝胶及权利要求4所述的超分子水凝胶支架在制备促进软骨修复的产品中的应用。
6.一种载成软骨小分子药物的超分子水凝胶支架，通过包括如下步骤的方法制备得到：将成软骨小分子药物加入到权利要求1或2所述的天然可降解水凝胶中，再进行3D打印。
7.如权利要求6所述的载成软骨小分子药物的超分子水凝胶支架，其特征在于,所述成软骨小分子药物为KGN，
所述成软骨小分子药物与天然可降解水凝胶的配比为30-100μg：1 ml。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410058642.0A CN117563045A (zh) | 2024-01-16 | 2024-01-16 | 用于软骨再生的天然可降解水凝胶及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410058642.0A CN117563045A (zh) | 2024-01-16 | 2024-01-16 | 用于软骨再生的天然可降解水凝胶及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117563045A true CN117563045A (zh) | 2024-02-20 |
Family
ID=89888518
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410058642.0A Pending CN117563045A (zh) | 2024-01-16 | 2024-01-16 | 用于软骨再生的天然可降解水凝胶及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117563045A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118384334A (zh) * | 2024-06-28 | 2024-07-26 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 一种用于关节软骨修复的超分子去细胞基质水凝胶及其制备方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113398332A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-09-17 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 一种含干细胞外泌体的3d仿生生物支架及应用 |
-
2024
- 2024-01-16 CN CN202410058642.0A patent/CN117563045A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113398332A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-09-17 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 一种含干细胞外泌体的3d仿生生物支架及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WENLI DAI ET AL: "enhanced osteochondral repairwith hyaline cartilage ofrmation using an extracellular matrix inspired natural scaffold", 《SCIENCE BULLETIN》, 1 August 2023 (2023-08-01), pages 1 - 2 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118384334A (zh) * | 2024-06-28 | 2024-07-26 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 一种用于关节软骨修复的超分子去细胞基质水凝胶及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhou et al. | Tough hydrogel with enhanced tissue integration and in situ forming capability for osteochondral defect repair | |
| Pandit et al. | Periodate oxidized hyaluronic acid-based hydrogel scaffolds for tissue engineering applications | |
| US11633518B2 (en) | Graft scaffold for cartilage repair and process for making same | |
| Liu et al. | Injectable hydrogels for cartilage and bone tissue engineering | |
| US6378527B1 (en) | Cell-culture and polymer constructs | |
| Baei et al. | A tough polysaccharide-based cell-laden double-network hydrogel promotes articular cartilage tissue regeneration in rabbits | |
| Kim et al. | Protein-reactive nanofibrils decorated with cartilage-derived decellularized extracellular matrix for osteochondral defects | |
| Li et al. | A chondroitin sulfate based injectable hydrogel for delivery of stem cells in cartilage regeneration | |
| Yao et al. | A di-self-crosslinking hyaluronan-based hydrogel combined with type I collagen to construct a biomimetic injectable cartilage-filling scaffold | |
| CA2512730C (en) | Hydroxyphenyl cross-linked macromolecular network and applications thereof | |
| EP2345435B1 (en) | Method for manufacturing a porous three-dimensional support using powder from animal tissue, and porous three-dimensional support manufactured by same | |
| EP2794701B1 (en) | A peptide-hydrogel composite | |
| US8137696B2 (en) | Biomimetic composition reinforced by a polyelectrolytic complex of hyaluronic acid and chitosan | |
| Narayanan et al. | Biomimetic glycosaminoglycan-based scaffolds improve skeletal muscle regeneration in a Murine volumetric muscle loss model | |
| US20100233267A1 (en) | Composite hydrogel | |
| CN117563045A (zh) | 用于软骨再生的天然可降解水凝胶及其制备方法 | |
| Yu et al. | Anisotropic hydrogel fabricated by controlled diffusion as a bio-scaffold for the regeneration of cartilage injury | |
| Fang et al. | An injectable self-healing alginate hydrogel with desirable mechanical and degradation properties for enhancing osteochondral regeneration | |
| Zahedi Tehrani et al. | Natural based hydrogels promote chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells | |
| JP2004181121A (ja) | 軟骨組織再生用注入剤組成物 | |
| Liao et al. | Overview of decellularized materials for tissue repair and organ replacement | |
| Li et al. | Cartilage Decellularized Extracellular Matrix-Based Hydrogel with Enhanced Tissue Adhesion and Promoted Chondrogenesis for Cartilage Tissue Engineering | |
| Paul | Gelatin-methacryloyl-chitosan (GelMA-CS) hydrogel: a novel orthopaedic bioadhesive | |
| US20210393854A1 (en) | Skeletal muscle regeneration in volumetric muscle loss using biomimetic glycosaminoglycan-based hydrogel | |
| Liu et al. | Robust, self-lubricating and injectable dECM-loaded hydrogels based on rapid photo-crosslinking for articular cartilage regeneration |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |